JP5544063B2 - 組換えポリペプチドの生産のための発現ベクター、形質転換宿主細胞及び発酵方法 - Google Patents

組換えポリペプチドの生産のための発現ベクター、形質転換宿主細胞及び発酵方法 Download PDF

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Description

本発明は、シュードモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のｇａｃ遺伝子のシグナル配列及び対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、このような発現ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞、及び前記宿主細胞と前記発現ベクターを使用する対象ポリペプチドの生産のための方法に関する。
原核生物宿主細胞における成熟組換えポリペプチドの効率的な直接生産のための方法を提供することが本発明の主題である。本発明に従った方法は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）の生産のために好都合に使用できる。
細菌細胞におけるヒト又は他の真核生物タンパク質の発現のような、原核微生物での組換えタンパク質の生産においては、できる限り１００％に近く均一である、明らかに定義されたＮ末端を得ることがしばしば困難である。これは、アミノ酸配列が、多くの場合ヒト／動物において天然に生じるアミノ酸配列と同一であるべきである組換え医薬タンパク質に特に当てはまる。何らかの不均一性又は天然配列からの逸脱は、しかしながら、これらの生成物がしばしば異なる免疫学的（例えば抗体形成の誘導）及び薬理的（半減期、薬物動態）特性を示すので、多くの場合許容されない。これらの理由から、ほとんどの場合、同一の性質の生成物（均一でＮ末端に外来アミノ酸を持たない）を生産することが必要である。
例えばヒトでの、天然発現時に、使用される多くの医薬タンパク質は細胞外間隙へと輸送され、この目的のために前駆体タンパク質中に存在するシグナル配列の切断が、明らかに定義されたＮ末端を生じさせる。このような均一なＮ末端は、例えば細菌細胞では、いくつかの理由から必ずしも容易には生産されない。
原核微生物における全ての細胞質タンパク質の合成は、翻訳開始部位であり、且つメチオニンのコドンである、開始コドンＡＴＧの故にメチオニンから出発する。Ｎ末端メチオニンの後の２番目のアミノ酸の構造に依存して、このメチオニンは、宿主細胞のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）によって切断遊離されて、Ｍｅｔ又は２番目のアミノ酸のいずれかから始まる生成物の混合物を導き得る。これら２つの種の分離は非常に困難であり、低い収率を導く。ポリペプチドの組換え細胞質生産では、無視できない割合の（１−５０％）のポリペプチドがＭＡＰによって影響されないままであることが通例である。故に、細胞質Ｍｅｔ発現系を用いた組換えポリペプチドの生産はしばしば極めて不都合である。
細胞質経路によって成熟組換えポリペプチドを生産するためのもう１つの可能性は、Ｎ末端融合タンパク質の生産と続く化学的又は酵素的インビトロ切断である。しかし、多くの場合融合タンパク質のＮ末端は酵素的切断では容易にアクセスできず、低い切断率又は全く切断不能をもたらす。これは、Ｎ末端が構造的にアクセスしにくいことによると考えられる。
加えて、組換えタンパク質は、原核微生物の細胞質において還元状態で発現され、これは、しばしば正しいタンパク質の折りたたみ及び機能のために必要なジスルフィド結合が形成されない又は正しく形成されないという作用を伴う。ジスルフィド結合を含む組換えポリペプチドは故に、困難なインビトロ酸化を必要とし得る。
また、細胞質発現はしばしば封入体の形成を導き、封入体は、実際の精製工程の前に、変性条件下で可溶化し、次いで天然構造へと再生しなければならない。
ペリプラズム発現は、他方で、所望特性を備えた生成物を直接生じ得る：
（ｉ）宿主細胞のシグナルペプチダーゼ機構によるペリプラズムシグナル配列の切断による正しい成熟Ｎ末端
（ｉｉ）正しい折りたたみによる可溶性発現
（ｉｉｉ）ヒト細胞外液（この分子が天然で認められる）中で認められるものと非常に類似したペリプラズム内の酸化環境による正しいジスルフィド結合の形成。
従って、原核生物宿主細胞における組換え対象ポリペプチドの生産に適したペリプラズム発現系を提供することが本発明の目的である。
今や意外にも、本発明の範囲内で、シュードモナス・ジミヌタのグルタリル７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子（ｇａｃ遺伝子）のシグナル配列及び対象ポリペプチドをコードする発現ベクターが、ポリペプチドの組換え生産のための工程における使用のために特に適することが見出された。
１つの側面では、本発明は、故に、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のシグナル配列及び（シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の）対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、対象ポリペプチドが宿主細胞のペリプラズム内に放出されるように連結されている、発現ベクターに関する。
本発明によれば、様々な対象ポリペプチドが前記発現ベクターの使用によって生産できる。例えば対象ポリペプチドは、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、サイトカイン、酵素、酵素阻害物質、抗体及び抗体フラグメント等、例えばインターフェロンα２Ａ、インターフェロンα２Ｂ、インターロイキン−３、インターロイキン−６、ヒト成長ホルモン、インスリン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロンβ１、ウシソマトロピン、ブタソマトロピン、インターロイキン−１１、インターロイキン−２、Ｆａｂフラグメント、及びカルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又はグルカゴンなどの低分子量ペプチドから成る群より選択することができる。好ましくは、本発明の範囲内で、対象ポリペプチドは、組換えヒトインターフェロン２、特にヒトインターフェロンα２Ａ又はヒトインターフェロンα２Ｂであり、後者が対象ポリペプチドであることが特に好ましい。
対象ポリペプチドである融合タンパク質の一部をコードするポリヌクレオチドに関して、ｃＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドが使用できる。天然に生じる遺伝子配列に対応する所与のｃＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドが不良にしか発現されない場合は、ｃＤＮＡ又は合成ポリヌクレオチドの構造をコドンの最適化によってそれぞれの宿主細胞に適合させ得る。
これに関して、本発明の好ましい実施態様内で、ｒｈＩＦＮα２Ｂである対象ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下のヌクレオチド配列（配列番号１）：
Figure 0005544063
 ［天然に生じるヒトインターフェロンα２Ｂの１６５コドンのうち４８個が、アミノ酸配列を変化させることなくヌクレオチド配列に関して変化している。］
を含む。
シュードモナス・ジミヌタ菌株に関しては、グルタリル−７−アミノセファロスポリン酸アシラーゼ活性を示すいかなるシュードモナス・ジミヌタ菌株も、適切なシグナル配列をコードするｇａｃ遺伝子を担持する。
例えばこのようなシュードモナス・ジミヌタ菌株は、指定番号ＣＣＭ３９８７の下でチェコ特許第ＣＺ２７８，５１５号に述べられている。
このようなシュードモナス・ジミヌタ菌株は、ｇａｃと略される、酵素グルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼをコードする遺伝子を担持する。
本発明の好ましい実施態様は、前記融合タンパク質の一部を形成する、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列がアミノ酸配列（配列番号２）：
Figure 0005544063
 を含む、本発明に従った発現ベクターに関する。
例えばこのようなアミノ酸配列は、以下のポリヌクレオチド配列（配列番号３）：
Figure 0005544063
 によってコードされ得る。
同様に、制限酵素部位を創造するようにヌクレオチドが変化しているポリヌクレオチドは、このような突然変異が沈黙している限り、すなわち上記で概説したようなｇａｓシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない限り、使用することができる。
従って、ｇａｃシグナル配列をコードする適切なポリヌクレオチド配列についてのもう１つの例は、（配列番号４）：
Figure 0005544063
 ［上述したポリヌクレオチド配列と比較して、続くクローニングにおいて使用し得る制限酵素部位（Ｓａｃ ＩＩ部位）を得るために、コドン２３の最後のヌクレオチドに関して単一突然変異（Ｃ→Ｇ）が導入されている。］
であり得る。
本発明のもう１つの好ましい実施態様は、プラスミドである、本発明に従った発現ベクターに関する。低（約１−１０コピー／細胞）、中（約１０−５０コピー／細胞）又は高（約＞５０コピー／細胞）コピープラスミドが使用し得る。これらの定義は、このようなプラスミドが好都合な環境で使用される場合に当てはまり、ある種の発酵条件下では、例えば低温条件下では、このようなコピー数はより低くなり得る。強力な誘導系については中コピー基本レプリコン（ｂａｓｉｃ ｒｅｐｌｉｃｏｎ）（例えばｐＢＲ３２２）が適切であると考えられ、低又は中の強さの発現エレメント（プロモーター、ＲＢＳ、構造遺伝子）からの強力な基底発現のためには高コピーレプリコン（例えばｐＵＣシリーズからのプラスミド）がよりよく適すると考えられる。本発明に関して、特にｒｈＩＦＮα２Ｂの生産に関しては、高コピープラスミドが好ましく使用される。従って、本発明のさらなる好ましい実施態様は、ベクターが高コピープラスミドである、本発明に従った発現ベクターに関する。
本発明に従った発現ベクターのさらなるエレメントは、転写及び翻訳エレメント、特にプロモーター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む。
ペリプラズム発現のためには、リボソーム結合部位は強すぎても弱すぎてもいけない。強すぎる場合はペリプラズムタンパク質輸送装置（トランスロカーゼ等）の過剰負担及び細胞質内への（しばしば不溶性の）切断されない融合タンパク質の沈着を導き得る。弱すぎると、低いタンパク質収率を導き得る。転写レベル（プロモーター）における状況は、翻訳レベル（ＲＢＳ）における状況と似ている。転写は、上述した減少を回避するためにやはり強すぎても弱すぎてもいけない。また、誘導性プロモーターを使用するとき、タンパク質産生の突然の開始は、輸送装置の「目詰まり（ｃｌｏｇｇｉｎｇ）」による問題を引き起こし得るか、又は少なくとも誘導工程と発酵パラメータの広汎な微細調節を必要とする。これはしばしば堅固でないプロセスをもたらす。
本発明に関して、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位は、転写及び翻訳調節エレメントとして使用するのに特に適することが認められた。
故に、好ましい実施態様は、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、本発明に従った発現ベクターを含む。
このさらなる好ましい実施態様では、プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号５）：
Figure 0005544063
 を含む。
このさらなる好ましい実施態様では、プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
Figure 0005544063
 を含む。
適宜に、本発明に従った発現ベクター内にさらなるエレメントが存在してもよい。
例えば、本発明に従った発現ベクターは、１又はそれ以上の転写ターミネーターを含むポリヌクレオチドを含み得る。
同様に、本発明に従った発現ベクターは、例えば形質転換宿主細胞の抗生物質耐性を与えるための、１又はそれ以上の選択マーカーを含み得る。適切な選択マーカーは当技術分野において広く公知である。本発明に関して、発現ベクターは、好都合にはテトラサイクリン耐性遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む。
加えて、適切な場合は、本発明に従った発現ベクター上にさらなる調節エレメントが存在してもよい。調節エレメントは、リプレッサー又はエンハンサーと同様、当技術分野において広く公知である。
さらなる側面では、本発明は、対象ポリペプチドの発現を生じさせるための、本発明に従った発現ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞に関する。
故に、本発明は、宿主細胞と適合性であり、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のシグナル配列及び（シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の）対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、対象ポリペプチドが宿主細胞のペリプラズム内に放出されるように連結されている発現ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞に関する。
適切な対象ポリペプチドの例は上述した通りである。この好ましい実施態様は、対象ポリペプチドがインターフェロンα２である、このような原核生物宿主細胞に関する。特に、このようなインターフェロンα２は、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択され、後者が好ましい。
もう１つの好ましい実施態様は、前記ベクターがプラスミド、好ましくは高コピープラスミドである、本発明に従った宿主細胞に関する。
本発明はさらに、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列が、アミノ酸配列（配列番号２）：
Figure 0005544063
 を含む、本発明に従った宿主細胞に関する。
さらなる側面では、本発明は、ベクターが、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、本発明に従った宿主細胞に関する。
プロモーター領域とリボソーム結合部位を含むこのようなポリヌクレオチドは、好ましくはヌクレオチド配列（配列番号５）：
Figure 0005544063
 を含む。
このさらなる好ましい実施態様では、プロモーター領域とリボソーム結合部位を含むこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
Figure 0005544063
 を含む。
原核生物宿主細胞に関して、好ましくは本発明に従った前記宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。好ましくはこのような細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種及びビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）種から成る群より選択され、大腸菌が特に好ましい。好ましくは、大腸菌Ｋ１２の誘導体を使用する。このような菌株は長年にわたって安全に使用されてきた歴史があり、ペリプラズム発現に特に適する。同様に、他の種の大腸菌、例えば大腸菌Ｂ誘導体も使用し得る。
本発明の好ましい実施態様では、原核生物宿主細胞は大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）に由来する。このような菌株は、指定番号ＰＴＡ−３１３２の下に、２００１年２月２８日にｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託された。
大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）及び寄託菌株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３１３２は、一般に以下のように特徴付けることができる：
大腸菌Ｋ−１２［Ｆ− ｍｃｒＡ ｍｃｒＢ ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）Ｉλ−］。
本発明のさらなる側面は、
（ｉ）宿主細胞と適合性であり、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のシグナル配列及びシュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、対象ポリペプチドが宿主細胞のペリプラズム内に放出されるように連結されている発現ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞を提供すること、及び
（ｉｉ）ポリヌクレオチドの発現を生じさせる条件下で原核生物宿主細胞を培養すること、これによって融合タンパク質の形成時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、対象ポリペプチドが宿主細胞のペリプラズム内に放出される、
を含む、対象ポリペプチドの生産のための方法に関する。
場合により、本発明に従った方法は、対象ポリペプチドの単離をさらに含む。
適切な対象ポリペプチドの例は上述した通りである。この好ましい実施態様は、対象ポリペプチドがインターフェロンα２である、このような原核生物宿主細胞に関する。特に、このようなインターフェロンα２は、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択され、後者が好ましい。
もう１つの好ましい実施態様は、前記ベクターがプラスミド、好ましくは高コピープラスミドである、本発明に従った方法に関する。
本発明はさらに、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列が、アミノ酸配列（配列番号２）：
Figure 0005544063
 を含む、本発明に従った方法に関する。
さらなる側面では、本発明は、ベクターが、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている、本発明に従った方法に関する。
プロモーター領域とリボソーム結合部位を含むこのようなポリヌクレオチドは、好ましくはヌクレオチド配列（配列番号５）：
Figure 0005544063
 を含む。
このさらなる好ましい実施態様では、プロモーター領域とリボソーム結合部位を含むこのようなポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
Figure 0005544063
 を含む。
原核生物宿主細胞に関して、好ましくは本発明に従った前記宿主細胞は大腸菌である；この意味するところは上記で詳述した通りである。
さらなる実施態様では、本発明は、本発明に従った形質転換宿主細胞を使用する方法の培養（又は発酵）部分に関する。
多くの因子が、組換え生物を使用する発酵工程の生産性に影響を及ぼし得る。適用する発酵戦略は、微生物生理学とプラスミドコピー数の間の敏感な関係、プラスミドの安定性及び遺伝子レベルだけでなく培地組成物及び工程条件によっても決定される遺伝子発現を考慮しなければならない。宿主菌株の安定性に加えて、生成物の安定性も組換えタンパク質の高レベル生産のために極めて重要である。
構成的発現系を用いる発酵工程の開発に関して、増殖条件と組換え産物の形成は互いに密接に関連する。故に、発酵工程全体の実施の間、最適増殖及び生成物形成に密接に関連する増殖条件の管理のための努力は誘導的発現系に比べてより高い。
組換えタンパク質の生産のための典型的な大腸菌発酵工程は、数時間から約１００時間の範囲内の培養という短い発酵時間によって特徴付けられる。ほとんどの場合、炭素源だけでなく様々な複合又は無機窒素源、種々の塩及び微量元素を大腸菌培養に供給する。炭素供給は、通常時間プロフィールに従い、供給速度を段階的に又は指数的に上昇させる。また時として、炭素源の混合物も大腸菌発酵において使用される。炭素源の供給は、通常、様々な制御戦略の使用によるバイオリアクターの酸素運搬能力に結びつく。
本発明のさらなる目的は、多大の窒素源供給を使用せず及び場合により発酵培地への微量元素の添加を伴わない、対象ポリペプチドの高収率のペリプラズム発現のための、本発明に従ったｇａｃ遺伝子発現系及び対応する形質転換宿主細胞に基づく、堅固で再現可能な発酵方法を提供することである。
本発明に従った方法は、原則として、これ自体公知の微生物学慣例に従い、最初に細菌宿主細胞、すなわち発現菌株を培養することによって実施する。菌株は一般に、栄養培地上の単一コロニーから出発して成育させるが、凍結保存細胞懸濁液（細胞バンク）を用いることも可能である。菌株は一般に、さらなる使用のための十分なバイオマスを得るために多段階工程で培養する。
小規模生産では、これは振とうフラスコにおいて実施することができ、ほとんどの場合複合培地（例えばＬＢブロス）を用いることが可能である。しかし、規定培地（例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。培養のために、宿主菌株の小容量前培養物（単一コロニー又は凍結保存培養からの細胞懸濁液を接種した）を増殖させるが、この培養のための温度は続く発現結果にとって一般に決定的に重要ではないので、常套的には比較的高温で（例えば３０℃又は３７℃）操作することができる。主培養は、より大きな容量（例えば５００ｍｌ）に調整し、ここでは、十分な通気を確保することが特に必要である（内容物の容量に比して大きな容量のフラスコ、高速回転）。発現が可溶性形態で起こることを意図しているので、主培養は、ほとんどの場合、幾分より低い温度（例えば２２℃又は２８℃）でも実施される。誘導系（例えばｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ又はｐｈｏＡプロモーター）及び構成系（ｇａｃプロモーターを含む本発明の好ましい系のような）の両方が、可溶性タンパク質を生産するのに適する。生じる細胞を収集し、さらに処理することができる。
大規模生産では、多段階システムは、好ましくは、工程のプロセス工学制御を改善するために規定栄養培地を用いる、又は微生物の増殖を強化し工程の堅固性を高めるために複合栄養培地を用いる、複数のバイオリアクター（発酵槽）から成る。加えて、特定栄養素の供給によって（フェドバッチ方式）バイオマス及び生成物形成を大きく上昇させることが可能である。例えば予備段階発酵槽と主段階発酵槽が使用される。予備段階発酵槽には、一般に振とうフラスコにおいて単一コロニー又は凍結保存培養から増殖させたいわゆる接種材料を接種する。発酵槽では、特に主段階では、良好な通気も確保しなければならない。生じた細胞は、再びさらなる処理のために供給送達される。
従って、好ましい実施態様では、ここで述べる本発明に従った方法の培養（又は培養法）は、前培養段階と主培養段階を含む多段階工程として実施される。あるいは、前培養段階を含まない一段階発酵も可能である。さらに一層好ましい実施態様では、ここで述べる本発明に従った方法は、振とうフラスコ段階、場合により前培養段階、及び主培養段階を含む多段階発酵工程として実施される。
特に、主培養段階での原核生物宿主細胞の前記培養は、培養時間の約９０％より多くの間、基質の飽和定数より低い基質濃度で、高レベルの溶解酸素濃度を伴い、及びさらに細菌宿主細胞の着実に低下する比成長速度を伴って、基質を含む培地中で実施され、前記方法は、宿主細胞の増殖のための最適温度より低い温度で実施される。
これに関して、飽和定数は、宿主細胞が最大比成長速度の５０％に等しい比成長速度で成長する基質（特に炭素源）の濃度である。
これに関して、比成長速度は、一定時間間隔内のバイオマス濃度の上昇を前記時間間隔の平均バイオマス濃度で除したものである。
好ましくは、主培養並びに、該当する場合は、前培養の培地は、複合窒素源、好ましくは酵母抽出物、様々な塩及び宿主細胞の初期増殖を支持するための炭素源を含む複合培地である。この好ましい実施態様では、前記炭素源は、接種後に前記炭素源を供給することによって主培地に添加するか又は、好ましくは、接種の時点で主培養中に存在する。
好ましくは、主培養段階における溶解酸素の濃度は、飽和の約２０％より高く、より好ましくは約４０％から約１００％までである。
好ましくは、主培養段階における着実に低下する成長速度は、約２ｈ−１から約０．００１ｈ−１である。
好ましい実施態様では、主培養段階における温度は、約２２℃から約３５℃の間、好ましくは約２５℃から約３１℃の間、最も好ましくは約２８℃である。
もう１つの好ましい実施態様では、前培養及び／又は主培養における前記培養法は、約６．７から約７．３までの範囲のｐＨ値で実施する。
本発明のさらなる好ましい実施態様では、基質は、グリセロール又は、好ましくは、炭水化物である。好ましくは、炭水化物はグルコースである。
ここで述べるように、適切な対象タンパク質の例は上述した通りである。好ましい実施態様は、対象ポリペプチドはインターフェロンα２である。特に、このようなインターフェロンα２は、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択され、後者が好ましい。
本発明の方法の全ての側面に関する最も好ましい実施態様では、宿主細胞は大腸菌細胞である。
対象ポリペプチドは、この後、当業者に公知のタンパク質精製方法によって単離することができる（例えばＭ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎより，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓＩｎｃ．，（１９９０），３０９−３９２参照）。一連の精製は、一般に細胞破壊段階、清澄化段階（遠心分離又は精密ろ過）及び様々なクロマトグラフィー段階、ろ過及び／又は沈殿を含む。本発明に従って生産された対象ポリペプチドの単離についての適切な例を以下に示す。
微生物の寄託：
大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）は、指定番号ＰＴＡ−３１３２の下に、２００１年２月２８日にｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託された。
以下の実施例は、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することなく、本発明を例示するためのものである。実施例の中で開示する主題は本発明の好ましい実施態様に関する。
（実施例）
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）の生産のための宿主細胞菌株の構築
１．１ 全般的適用事項
ポリペプチドｒｈＩＦＮα２ｂ（組換えヒトインターフェロンα２ｂ）を、ｒｈＩＦＮα２ｂをコードする最適化合成遺伝子を含むプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ−１２株Ｗ３１１０において生産する。ｒｈＩＦＮα２ｂは、組換え大腸菌Ｋ−１２の発酵により、シュードモナス・ジミヌタ ＣＣＭ３９８７からのグルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼ遺伝子（ｇａｃ）のプロモーター及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の制御下で生産される。ｒｈＩＦＮα２ｂは、同じ（ｇａｃ）遺伝子からのシグナル配列とのＮ末端融合タンパク質として発現され、シグナル配列の同時プロセシング（切断遊離）により前記タンパク質をペリプラズムへと差し向ける。発酵工程は、故に、天然に生じるヒトインターフェロンα２ｂのものと同じ一次配列を有する成熟ｒｈＩＦＮα２ｂを直接生成する。発現プラスミドをｐＭＧ４１４と称し、生産菌株をＷ３１１０［ｐＭＧ４１４］と称する。
１．２ 発現ベクターｐＭＧ４１４の構築
ｐＵＣ１９は、ベクタープラスミドの構築のための出発点として使用できる。ｐＵＣ１９は頻繁に使用され、十分に特性決定された高コピープラスミドである。極めて効率的な複製起点とアンピシリン耐性（ａｍｐ又はｂｌａ）遺伝子を含む（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら１９８５；ＶｉｅｉｒａとＭｅｓｓｉｎｇ，１９８２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０９１３７及びＸ０２５１４）。
ｐＵＣ１９は発現プラスミドの構築のために頻繁に使用されるが、ａｍｐ遺伝子は工業目的のためには理想的選択マーカーでないと考えられる。この理由から、ａｍｐ遺伝子のプロモーター及びコード領域を除去し、周知の安全なプラスミドｐＢＲ３２２からのテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ）のプロモーター及びコード領域に置き換える（Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７ａ，１９７７ｂ，１９７８；総説：Ｂａｌｂａｓら、１９８６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１７４９、Ｋ００００５、Ｌ０８６５４、Ｍ１０２８３、Ｍ１０２８６、Ｍ１０３５６、Ｍ１０７８４、Ｍ１０７８５、Ｍ１０７８６、Ｍ３３６９４、Ｖ０１１１９）。このクローニング作業は、ハイフィデリティーＰＣＲ手法を用いて実施する。
これを実施するために、ｐＵＣ１９の塩基対１７４３−６７９にわたるフラグメントを、ハイフィデリティーＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓからのＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼシステム）及び以下の５’−リン酸化オリゴヌクレオチド：
オリゴ２３５：５’−リン酸−
Figure 0005544063
 オリゴ２３６：５’−リン酸−
Figure 0005544063
 を用いて増幅する。
生じるＰＣＲフラグメントは、長さ１６２４塩基対で、ａｍｐプロモーター及びコード配列を欠くが、ａｍｐ遺伝子からの終結コドンと転写ターミネーターを含む、完全なｐＵＣ１９骨格を含む。
上述したように、ｔｅｔプロモーター及びコード配列（終結コドンを除く）をｐＢＲ３２２から増幅する。再びハイフィデリティーＰＣＲを使用して、ｐＢＲ３２２の塩基対４−１２７３を増幅した。この増幅のために以下の５’−リン酸化オリゴヌクレオチド：
オリゴ２３７：５’−リン酸−
Figure 0005544063
 オリゴ２３８：５’−リン酸−
Figure 0005544063
 を使用した。
生じたＰＣＲフラグメントは１２７０塩基対の長さである。２つのＰＣＲフラグメントを分取アガロースゲル電気泳動によって精製し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて連結した。連結したＤＮＡを精製し、大腸菌Ｋ−１２ ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞、遺伝子型：Ｆ−ｍｃｒＡΔ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＳ）φ８０ｄ／ａｃＺΔＭ１５ Δ１ａｃＸ７４ ｄｅｏＲ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７ ｇａｌＵ ｇａｌＫ λ−ｒｐｓＬ ｎｕｐＧ）に電気穿孔導入する。形質転換細胞をＬＢ寒天、１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン及び３ｇ／Ｌグルコースにプレートする。液体培養物を、１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン及び３ｇ／Ｌグルコースを含むＬＢブロスで増殖させ、標準ミニプレップ法を用いてこれらの培養物からプラスミドＤＮＡを単離する。ｐＵＣ１９骨格へのｔｅｔフラグメントの正しい組込みに関する制限酵素分析によってプラスミドＤＮＡを分析する。フラグメントの組込みは方向に関して非特異的であったので、クローンを含む全ての挿入物の約５０％だけが正しい方向に挿入されたフラグメント、すなわちｐＵＣ１９内のａｍｐ遺伝子と同じ方向に走るｔｅｔ遺伝子を有していた。数個のクローンの液体培養物からより多量のＤＮＡを単離し、より詳細な制限酵素分析に供する。正しい制限パターンを示すクローンのうちで、１個をさらなるクローニング作業のために選択する。
それぞれのプラスミドをｐＭＧ４０２と称した。これは全ての特徴及び機能においてｐＵＣ１９と同じであるが、アンピシリン含有培地ではなくテトラサイクリン含有培地で増殖しなければならない。このようにして工業目的に適するｔｅｔ耐性高コピーベクターが作製される。
プラスミドｐＭＧ４０２の特徴：
塩基対１９５４−６８０：ｐＵＣ１９骨格（＝ａｍｐプロモーター及び構造遺伝子を欠くｐＵＣ１９）
塩基対６８１−１９５３：ｐＢＲ３２２からのｔｅｔプロモーター及び構造遺伝子
ｒｈＩＦＮα２ｂは、宿主細胞のシグナルペプチダーゼ装置によるシグナル配列の同時プロセシング（切断遊離）によりタンパク質をペリプラズムへと差し向ける、シュードモナス・ジミヌタ ＣＣＭ３９８７からのグルタリル−７−ＡＣＡアシラーゼのシグナル配列（ｇａｃ１ｓｓ＝配列番号２）とのＮ末端融合として発現される。
ｇａｃ１ｓｓのアミノ酸配列（２７ａａ）：ＭＬＲＶＬＨＲＡＡＳ ＡＬＶＭＡＴＶＩＧＬ ＡＰＡＶＡＦＡ
ｇａｃ１ｓｓのコード配列の３’領域内に、沈黙突然変異（アミノ酸配列は変化しない）を生じさせる３’ＰＣＲプライマーによってＳａｃ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が導入される。このＳａｃ ＩＩ部位は、ｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子とｇａｃ１ｓｓコード領域の融合を可能にする。
ｒｈＩＦＮα２ｂについての構造遺伝子を化学合成する。これは、１６５コドンのうち４８個において天然ヒトｃＤＮＡ配列と異なり、脆弱でエラーを起こしやすいコドンを排除するように設計する。
以下の表において、コドンの変化を示す。表の中で、「天然コドン」は、Ｓｔｒｅｕｌｉら、１９８０によって公表されたｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｖ００５４８）を指す。アミノ酸番号は、成熟ｒｈＩＦＮα２ｂ（Ｃｙｓ１から始まる）を指す。合成遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｄａｔａｂａｓｅ，アクセッション番号Ｐ０１５６３／Ｐ０１５６４（アミノ酸２４−１８８）から取っている。
Figure 0005544063
生じる遺伝子は、大腸菌におけるｒｈＩＦＮα２ｂの効率的で正確な転写と翻訳を可能にする。前記遺伝子は細菌系における発現のために設計されているので、いかなる非翻訳配列（イントロン等）も含まない。
構造遺伝子を化学合成する。簡単に述べると、長さ約３０−５０ヌクレオチドの重複相補的オリゴヌクレオチドを、全くギャップを含まずに構造遺伝子配列の両方の鎖をカバーするように合成する。これらのオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。反応産物を制限エンドヌクレアーゼで切断し、ｐＵＣ１８ベクターにクローニングする。生じるプラスミドを配列決定し、これは正しい配列を示す。
このプラスミド上の合成遺伝子はｇａｃシグナル配列を含まない。コード領域のこのｇａｃシグナル配列部分を、プロモーター、ＲＢＳ及びシグナル配列を含むｇａｃフラグメントによって導入し、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子に融合させる。
ｇａｃフラグメントを化学合成によって作製する。例えば長さ約３０−５０ヌクレオチドの重複相補的オリゴヌクレオチドを、全くギャップを含まずにｇａｃフラグメントの両方の鎖の完全長（両側の制限エンドヌクレアーゼ認識部位プラス効率的な切断を可能にするための最小限６個の付加的な塩基対を含む）をカバーするように合成する。次に前記オリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせ（例えば加熱し、続いて冷却することによって）、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。反応産物をそれぞれの制限エンドヌクレアーゼ（ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ）で切断し、ｐＭＧ４０２ベクターにクローニングする（下記参照）。
あるいは、プロモーター、ＲＢＳ及びシグナル配列を含むｇａｃフラグメントは、かかるエレメントを含むプラスミドｐＫＳ５５のようなプラスミドから増幅することができ、前記プラスミドの構築はチェコスロバキア特許第２７８，５１５号に述べられている。この中でクローニングされたｇａｃ遺伝子は、シュードモナス・ジミヌタの菌株（ＣＣＭ３９８７）に由来している。増幅はハイフィデリティーＰＣＲシステムを用いて実施する。クローニングのために必要な制限エンドヌクレアーゼ部位は以下のＰＣＲプライマーによって導入する。
プライマー：
１．５’−リン酸−
Figure 0005544063
 ２．５’−リン酸−
Figure 0005544063
ハイフィデリティーＰＣＲ増幅によって生成されるｇａｃフラグメントと化学合成によって作製されるｇａｃフラグメントの間で性能には差がない。
このようにして作製したｇａｃフラグメントは、以下のヌクレオチド配列（配列番号１３）：
Figure 0005544063
 を有する。
ｇａｃフラグメント（合成又はＰＣＲによって作製する）とベクタープラスミドｐＭＧ４０２を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位を用いて連結する。このようにして発現ベクターｐＭＧ４１２を作製する。
発現ベクターｐＭＧ４１２は、ｇａｃシグナル配列の１−２３＋コドン２４の最初のヌクレオチドを含む。コドン２２−２４に、沈黙突然変異によってＳａｃ ＩＩ部位を導入する。ｐＭＧ４１２内のＳａｃ ＩＩ部位の下流はプライマー又はベクター配列である。
コドン２４の最後の２個のヌクレオチド＋コドン２５−２７を、標的構造遺伝子（ｒｈＩＦＮα２ｂ、上記参照）についての正ＰＣＲプライマーによって導入する。このようなプライマーは、故に、以下のエレメントを含む：
切断突出部（例えば６ヌクレオチド）−Ｓａｃ ＩＩ部位−ｔｃ ｇｃｃ ｔｔｔ ｇｃｇ（配列番号１４）−「成熟」標的遺伝子の５’末端に対応するハイブリダイズ領域。
特に、適切なプライマーは以下のヌクレオチド配列（配列番号１５）：
Figure 0005544063
 −ハイブリダイズ領域（Ｓａｃ ＩＩに下線を付している）を有する。
ｇａｃシグナル配列の最後のアミノ酸（２４−２７）は、ＶＡＦＡ（配列番号１６）である。
上述したプラスミド構築物から、ハイフィデリティーＰＣＲシステムを用いてｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子を増幅する。５’ＰＣＲプライマーは、前記遺伝子をｇａｃフラグメントと融合させるためのＳａｃ ＩＩ部位およびｇａｃシグナル配列の最後の４個のコドンを含む。３’プライマーは、ＴＡＡ（オーカー）終結コドン及びクローニングのためのＭｌｕＩ部位を含む。インターフェロンα構造遺伝子の増幅は、以下のフラグメント（配列番号１７）：
Figure 0005544063
 を生じる。
Ｓａｃ ＩＩ及びＭｌｕＩ部位を使用してこのｒｈＩＦＮα２ｂ ＰＣＲフラグメントとｐＭＧ４１２を連結する。このようにして最終産物／発現プラスミドｐＭＧ４１４を作成した。ｐＭＧ４１４の両方の鎖を配列決定し、予想配列と差がないことを示す。
プラスミドｐＭＧ４１４の特徴（総サイズ３６６８塩基対）：
塩基対２７２８−２５６：ｐＵＣ１９骨格、部分１
塩基対２５７−５４６：ｇａｃフラグメント（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列）
塩基対５４７−１０４４：合成ｒｈＩＦＮα２ｂ遺伝子（ＴＡＡ終結コドンを含む）
塩基対１０４５−１４５４：クローニング部位＋ｐＵＣ１０骨格、部分２
塩基対１４５５−２７２７：ｐＢＲ３２２からのｔｅｔ遺伝子（プロモーター／ＲＢＳ１４５５−１５３６、ＴＡＡ終結コドンを含むコード配列１５３７−２７２７）。
これにより、プロモーター、ＲＢＳ及びシグナル配列を含むｇａｃフラグメントを、ＰＣＲプライマーによって導入したｇａｃフラグメントの３’末端の制限エンドヌクレアーゼ部位を用いて、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子に融合させる。同じ部位を、同じくＰＣＲプライマーの方法によって、ｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子の５’末端に融合させる。このようにして両方のエレメント（ｇａｃフラグメント及びｒｈＩＦＮα２ｂ構造遺伝子）を基本ベクターにクローニングした後、ｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質をコードする遺伝子を作製する。この合計１９２コドン（５７６ヌクレオチド）のうちで、最初の２７個は、最終タンパク質中には存在しないｇａｃシグナル配列をコードし、アミノ酸２８−１９２は、成熟ｒｈＩＦＮα２ｂ（１６５アミノ酸、システイン１からグルタミン酸１６５まで）をコードする。
ｒｈＩＦＮα２ｂ発現プラスミドｐＭＧ４１４において使用される発現カセットのヌクレオチド配列（８０７塩基対）（下記参照）及びｇａｃ１ｓｓ−ｒｈＩＦＮα２ｂ融合タンパク質のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号１８）：
Figure 0005544063
Figure 0005544063
Figure 0005544063
示されている配列は、以下を含むサブパラグラフ／領域に分けられる：
１．ｇａｃプロモーター及びＲＢＳ（第１項、ｐＭＧ４１４の塩基対２５７−４６５、下記参照）、
２．ｇａｃシグナル配列コード領域（第２項、ｐＭＧ４１４の塩基対４６６−５４６、下記参照）、
３．ｒｈＩＦＮα２ｂについての合成遺伝子（第３項、ｐＭＧ４１４の塩基対５４７−１０４４（下記参照）−ＴＡＡ終結コドンを含む）、及び
４．３’クローニングリンカー（第４項、ｐＭＧ４１４の塩基対１０４５−１０６３、下記参照）。
ｐＭＧ４１４上で、これら４つの領域は互いに直接連結している。図面上では単に明瞭の理由だけからこれらを分けている。
オープンリーディングフレームの開始（ＡＴＧ）及び終結（ＴＡＡ）コドンは太字で示している。
成熟ｒｈＩＦＮα２ｂの最初（ＴＧＣ）及び最後（ＧＡＡ）のコドンには下線を付している。
クローニングのために使用される制限エンドヌクレアーゼ部位を箱で囲っている。これらは：
−ｇａｃフラグメント（プロモーター、ＲＢＳ、シグナル配列、Ｓａｃ ＩＩ、ＭｌｕＩ、ＳｐｅＩ部位）の導入のためのＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）及びＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）
−ｒｈＩＦＮα２ｂ ＰＣＲフラグメント（ｇａｃ１ｓｓの最後の４個のアミノ酸についての４個のコドン、成熟ｒｈＩＦＮα２ｂについての４９５塩基対の合成遺伝子及びＴＡＡ（Ｔ）終結コドンを含む）の導入のためのＳａｃ ＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）及びＭｌｕＩ（ＡＣＧＣＧＴ）
である。
ｇａｃプロモーターは高い構成的／基底活性を示し、化学的誘導物質の添加又は物理的刺激（培養条件の変化）は必要としない。
１．３ クローニング及び組換え細胞系の樹立
発現プラスミドｐＭＧ４１４を電気穿孔導入法によって宿主菌株ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３１３２（＝Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５））に導入する。標準プロトコールに従ってエレクトロコンピテント細胞を調製し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ ２５１０を使用して１８００Ｖで０．１ｍｍキュベットにおいて電気穿孔導入を実施する。
電気穿孔導入の後、液体媒質中で反応を一時停止させ、テトラサイクリンを含む寒天プレートに塗布する。
適切な細胞クローンの選択のための出発点は、このようにして得られた形質転換プレートである。このプレートからの様々なクローンを液体培養中で増殖させ、研究細胞バンクとして凍結保存する。これらの生産性を振とうフラスコ実験において試験し、比較する。最良クローン（Ｅ１／１１６）をさらなる開発のために使用する。
最良クローンは、良好な生産性を示し得るが、比較的増殖不良であり得る。この増殖不良は、様々な因子、例えば宿主細胞に対する生成物毒性、生成物合成による代謝負荷等から生じ得る。グルコースの添加は、グルコースが組換えタンパク質発現のために使用される多くのプロモーターを下方調節する（例えば異化代謝産物抑制によって）ので、しばしば多少の改善をもたらす。また、グルコースは、炭素源として直接代謝に導入され得るので、大腸菌の増殖に全般的なプラス作用を及ぼす。
Ｅ１／１１６の場合は、増殖へのグルコースの明らかなプラス作用が認められる。２−５ｇ／Ｌのグルコース濃度で最良の結果が達成される。細胞系を、生成物形成に対抗し、この結果としてグルコースの不在下でより良好に増殖するように適応させるために、菌株を数継代にわたって振とうフラスコ内の液体媒質中で増殖させる（「振とうフラスコカスケード」）。
より詳細には、Ｅ１／１１６の凍結バイアルを解凍し、細胞懸濁液を、テトラサイクリンを含むグルコース不含ＬＢ寒天プレートに線条接種する。コロニーが液体培養に接種するのに十分なサイズに達するまでプレートを３７℃でインキュベートする。コロニーをプレートから、テトラサイクリンを含むグルコース不含ＬＢブロス１５ｍＬを満たした小さな振とうフラスコに移す。培養物を、６００ｎｍで０．５以上（典型的には＞１．０）の光学密度に達するまで３７℃で振とうする。この第１回ラウンドのために、もとの単離物の低い増殖特性の故に４８時間を要する。
上記の項で述べた手順を、プレートに線条接種した前のラウンドの液体培養及び次の液体培養に接種するために用いるプレートからのコロニーに関して連続５回実施する。各々の液体培養について光学密度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ−ウエスタンブロットを用いた生成物力価の定量のために試料を採取した。増殖と生産性の最良の組合せを有する培養からのクローンを、次のラウンドを開始するために使用する。
この培養カスケード（すなわち多数の増殖と再単離段階）の種々のラウンドの間に、（亜）株の増殖特性が次第に改善する。各々のラウンドにおいて増殖と生産性の最良の組合せを有する菌株を選択することにより、力価も次第に上昇する。５回目のラウンド後、テトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上で再び単一コロニーを生成し、一次シードロット（ＰＳＬ）の作製のためにテトラサイクリンを含む液体培養に接種するのに使用する。培養物を３７℃で約１．５の光学密度に増殖させ、等量の無菌４０％ｗ／ｖグリセロールと混合して、凍結バイアルに分割し、−８０℃で凍結した。このＰＳＬを、インターフェロンα２ｂ産生株のＧＭＰ細胞バンク（マスター細胞バンク及び作業用細胞バンク）の作製のための出発点として使用する。この再単離物をＥ１／１１６ａと称する。上述したような再単離工程は再現可能な結果を生じることが証明される。
Ｅ１／１１６ａは、振とうフラスコ及び攪拌式バイオリアクター（発酵槽）において極めて良好な増殖特性を示す。バイオリアクターを開始するのに適した接種材料は、作業用細胞バンクバイアルから出発して約８時間で振とうフラスコにおいて増殖させることができる。
マスター細胞バンクは、上述した一次シードロットからｃＧＭＰ条件下で調製する。簡単に述べると、ＰＳＬバイアルを解凍し、テトラサイクリンを含む寒天プレートに塗布する。単一コロニーを採取し、マスター細胞バンク（ＭＣＢ）振とうフラスコ培養（テトラサイクリンを含むＬＢブロス培地）に接種するために使用する。対数増殖期からの細胞懸濁液を４０％ｗ／ｖグリセロールと１＋１で混合して、凍結バイアルに１．８ｍＬずつ分割し、凍結チューブで密封して、液体窒素タンクの液相内で凍結する。
作業用細胞バンクは、振とうフラスコ培養に解凍したＭＣＢバイアルからの細胞懸濁液を接種することを除いて、マスター細胞バンクと同じように作製する。
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）の生産のための発酵工程
発酵工程は、非プラスミド担持細胞の増殖を回避するために抗生物質、塩酸テトラサイクリンを添加したＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ−）培地中３７℃での振とうフラスコ培養において、上述した作業用細胞バンクから得られる大腸菌株Ｋ−１２ Ｗ３１１０を増殖させることから出発する。
次に、振とうフラスコ培養を使用してシード培養（＝前培養）培地に接種する（接種物サイズ＝０．４％）。この前培養のための培地は、唯一の炭素源としてグルコース及び複合窒素源として酵母自己分解物を含む脱イオン水に基づく。加えて、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏのような無機塩を培地に添加する。消泡剤としてポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）を使用する。特に、前培養培地は以下の組成物を有する：
前培養基礎培地：
Figure 0005544063
これらの培地成分を一緒に１２１℃で２０分間滅菌する。基礎培地の冷却後、抗生物質、塩酸テトラサイクリンの５ｇ／Ｌ無菌保存溶液のアリコートを基礎培地に添加する（滅菌はろ過（０．２２μｍフィルター）によって実施する）。
塩酸テトラサイクリン保存溶液（５ｇ／Ｌ）：
Figure 0005544063
シード培養のための培養時間は約１６時間である。シード培養の間、ｐＨ値を、硫酸と水酸化ナトリウム又は濃アンモニア溶液で７．０±０．２の設定点に調節する。溶解酸素の濃度は、攪拌機の速度を上昇させることによって飽和の２０％より大きなレベルに保持する。培養開始時の攪拌機速度は３００ｒｐｍ、容器内の背圧は０．３バールに設定し、通気率は３０Ｌ／分（「１ｖｖｍ」に等しい）に調節する。培養の間、温度は常に３７℃に保持する。ブロスを発酵工程の主段階に移す判定基準として、炭素源の消費後の溶解酸素濃度の上昇を使用する。
主培養については、脱イオン水、炭素源としてグルコース及び複合窒素源として酵母自己分解物に基づく培地を使用する。無機塩（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ及びＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏの添加のほかに、ＰＰＧ２０００を消泡剤として使用する。初期グルコースを別途に滅菌し、培地の残りの滅菌物に添加する。主発酵槽培地に対する接種物サイズは０．７５−３％の範囲であった。特に、主培養培地は以下の組成物を有する。
主培養基礎培地：
Figure 0005544063
これらの培地成分を一緒に１２１℃で２０分間滅菌する。冷却後、８００ｇ／Ｌの別途に加熱滅菌したグルコース保存溶液のアリコートを主培養基礎培地に添加する（滅菌は１２０℃で３０分間以上実施する）。
グルコース保存溶液、８００ｇ／ｌ。
Figure 0005544063
この培養の間の最も重要な点は、培地中に存在する初期グルコースの完全な消費の必要性である。これは、約９時間の増殖後に溶解酸素濃度の急激な上昇を導く。初期グルコースの完全な消費の前にグルコース供給を開始することにより、生成物形成が認められなくなる。一定速度でのグルコース溶液の供給によって調節されるグルコース制限は、故に、非常に重要である。培養の間の温度は約２８℃の一定値に制御する。初期攪拌機速度は３００ｒｐｍに設定し、通気率は１００Ｌ／分（「１ｖｖｍ」に等しい）に調節し、容器内の背圧は０．３バールに設定する。ｐＨ値は、硫酸と水酸化ナトリウム又は濃アンモニア溶液で７．１±０．３に調節する。初期供給グルコースの消費後は８．０までのｐＨ値のピークが許容される。
溶解酸素の濃度は、飽和の２０％以上の値に調節する。バイオリアクターの酸素運搬能力に依存して、最初に攪拌機の速度を最大値まで上昇させることにより、溶解酸素濃度を飽和の２０％以上、好ましくは飽和の約４０％−１００％のレベルに保持する。これが十分でない場合は、最初に通気率、及びこの後背圧をそれぞれ上昇させる。４８−１９２時間の培養時間後（培養時間の経過と共に生成物形成の直線上昇が認められる）、培養物を収集し、１５±５℃に冷却して、冷却浴にスクロース／ＥＤＴＡを添加することによって下流プロセシングのために予備処理する。
生成物の実験室又はパイロットプラントのペリプラズム抽出後、ウエスタンブロット手法又はＨＰＬＣ測定に基づいて発酵バッチの結果を分析する。
細胞破壊と抽出
細胞周辺腔に発現されたインターフェロンα２Ｂを含有する宿主細胞を含む、上述したようにして得た発酵ブロスを、発酵の直後に硫酸で５．０±０．１のｐＨに調整し、４℃±２℃に冷却する。低いｐＨと低い温度は内因性プロテアーゼを不活性化するのを助ける。
発酵ブロスを１０℃から２０℃に調整し、次いで細胞のいかなる濃縮又は洗浄も行わずに、固体又は液体スクロース（２００ｇスクロース／ｋｇ発酵ブロス）及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ濃度）を添加して、ｐＨを８．０に調整する。冷却水による浸透圧ショック（１：３希釈）を用いて選択的１段階細胞浸透プロトコールを実施し、これによってスクロースとＥＤＴＡを含む発酵ブロスを冷却（約４℃の温度）に注ぐか又は送り込んだ後、放出されたペリプラズム抽出物を清澄化する。ポリエチレンイミンを最終濃度０．０５％まで加え、酢酸でｐＨを約７．５に調整する。１５から４５分後、細胞デブリとＤＮＡを凝集させて、インターフェロンを含む透明な粗抽出物を残し、清澄性を改善するために前記抽出物を遠心分離に供してもよい。
この手順は、全タンパク質含量に関して＞２０％の純度を有する高収量の所望インターフェロンα２Ｂを含む透明なペリプラズム抽出物を導く。ポリエチレンイミンは可溶性タンパク質抽出物から細胞デブリを分離するのを助け、非常に純粋なインターフェロン溶液を導く。
組換えヒトインターフェロンα２Ｂ（ｒｈＩＦＮα２Ｂ）のクロマトグラフィー精製
４．１ 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）による捕獲
酢酸でｐＨを４．８−５．２に調整し、０．３ミクロンフィルターを用いてろ過工程を実施した後、実施例３の粗抽出物をＣＥＸカラム（ＳセラミックＨｙｐｅｒＤ Ｆ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。平衡緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム及び７０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０）による洗浄工程後、１７５ｍＭ ＮａＣｌの段階勾配でインターフェロンを溶出する。収集した分画を実施例４．２の処理工程によって直ちに処理する。
４．２ 陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー
実施例４．１からの分画を水酸化ナトリウムで７．３−７．７のｐＨに調整し、水で３．５−４．５ｍＳ／ｃｍの伝導率に希釈して精製し、ＡＥＸカラム（ＱセラミックＨｙｐｅｒＤ Ｆ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ））に適用する。洗浄後、約１５０ｍＭ ＮａＣｌの線形塩勾配（０−３００ｍＭ ＮａＣｌ）でインターフェロンを抽出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに従って９０面積％又はそれ以上の純度を有する分画を収集し、次の段階で直接使用する（実施例４．３参照）。
４．３ 疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
実施例４．２の分画を硫酸ナトリウムの保存溶液（０．５％硫酸ナトリウム）で希釈し（１：１）、ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ７．３から７．７に調整して、ＨＩＣカラム（Ｓｏｕｒｃｅ １５ＰＨＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用する。洗浄後、実施例３のインターフェロン分画を約４００ｍＭ硫酸ナトリウムの線形硫酸ナトリウム濃度（８００−０ｍＭ硫酸ナトリウム）で溶出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに従って９０面積％又はそれ以上の純度を有し、及び３％又はそれ以上の不純物を含まない分画を収集して、次の精製段階で直接使用する。
４．４ 陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
実施例４の収集分画を、水で７．５−８．５ｍＳ／ｃｍの最終伝導率に希釈し、９９−１００％酢酸でｐＨ４．３−４．７に調整して、ＣＥＸカラム（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ−６５０Ｓ（ＴｏｓｏＨａａｓ））に適用する。洗浄段階後、約２５０ｍＭ ＮａＣｌの線形ＮａＣｌ勾配（０−３００ｍＭ ＮａＣｌ）でインターフェロンを抽出する。ＩＰＣ逆相ＨＰＬＣに従って９５面積％又はそれ以上の純度を有し、及び３％又はそれ以上の不純物を含まない分画を収集して、次の精製段階で直接使用する。
４．５ サイズ排除クロマトグラフィー
最後の精製段階は、二量体及び他の凝集物を除去し、最終製剤のために緩衝液交換を実施するゲルろ過工程である。この段階で使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇは、高負荷容積（５％−１５％）であっても良好な分解能を示す。約７．３−７．７のｐＨで、２５ｍＭリン酸ナトリウム及び１３０ｍＭ ＮａＣｌ＋０．３ｍＭ ＥＤＴＡ中でＳＥＣを実施する。
最も高い純度（ＲＰ−ＨＰＬＣにおいて＞９５％主ピーク及び＞３％の副ピークなし）を有する分画をプールして、高収量で純粋な形態の所望組換えヒトインターフェロンα２Ｂを含む最終バルク溶液を得る。

Claims (35)

  1. シュードモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のｇａｃ遺伝子のシグナル配列及びシュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであって、
    シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列は、アミノ酸配列（配列番号２）：
    Figure 0005544063
     からなり、
    前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、大腸菌細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、均一なＮ末端を有する対象ポリペプチドが大腸菌細胞のペリプラズム内に放出されるように連結される、発現ベクター。
  2. 前記ベクターがプラスミドである請求項１に記載のベクター。
  3. 前記ベクターが高コピープラスミドである請求項１に記載のベクター。
  4. 対象ポリペプチドがインターフェロンα２である請求項１に記載のベクター。
  5. インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択される請求項４に記載のベクター。
  6. 前記ベクターが、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている請求項１に記載のベクター。
  7. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号５）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項６に記載のベクター。
  8. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項７に記載のベクター。
  9. 大腸菌細胞と適合性であり、シュードモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のｇａｃ遺伝子のシグナル配列及びシュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された大腸菌細胞であって、
    シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列は、アミノ酸配列（配列番号２）：
    Figure 0005544063
     からなり、
    前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、大腸菌細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、均一なＮ末端を有する対象ポリペプチドが大腸菌細胞のペリプラズム内に放出されるように連結されている、大腸菌細胞。
  10. 前記ベクターがプラスミドである請求項９に記載の大腸菌細胞。
  11. 前記ベクターが高コピープラスミドである請求項９に記載の大腸菌細胞。
  12. 対象ポリペプチドがインターフェロンα２である請求項９に記載の大腸菌細胞。
  13. インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択される請求項１２に記載の大腸菌細胞。
  14. 前記ベクターが、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている請求項９に記載の大腸菌細胞。
  15. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号５）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項１４に記載の大腸菌細胞。
  16. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項１４に記載の大腸菌細胞。
  17. （ｉ）大腸菌細胞と適合性であり、シュードモナス・ジミヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）のｇａｃ遺伝子のシグナル配列及びシュードモナス・ジミヌタのｇａｃ以外の対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターにより形質転換された大腸菌細胞を提供すること、
    ここで、前記シグナル配列と前記対象ポリペプチドは、大腸菌細胞におけるポリヌクレオチドの発現時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、均一なＮ末端を有する対象ポリペプチドが大腸菌細胞のペリプラズム内に放出されるように連結されており、
    シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子の前記シグナル配列は、アミノ酸配列（配列番号２）：
    Figure 0005544063
     からなる、及び
    （ｉｉ）前記ポリヌクレオチドの発現を生じさせる条件下で大腸菌細胞を培養すること、これによって融合タンパク質の形成時にシグナル配列が融合タンパク質から切断遊離されて、均一なＮ末端を有する対象ポリペプチドが大腸菌細胞のペリプラズム内に放出される、
    を含む、対象ポリペプチドの生産のための方法。
  18. 対象ポリペプチドの単離をさらに含む請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ベクターがプラスミドである請求項１７に記載の方法。
  20. 前記ベクターが高コピープラスミドである請求項１７に記載の方法。
  21. 対象ポリペプチドがインターフェロンα２である請求項１７に記載の方法。
  22. インターフェロンα２が、インターフェロンα２Ａ及びインターフェロンα２Ｂから成る群より選択される請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ベクターが、シュードモナス・ジミヌタのｇａｃ遺伝子のプロモーター領域とリボソーム結合部位を含むポリヌクレオチドをさらに含み、このポリヌクレオチドは、シグナル配列と対象ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている請求項１７に記載の方法。
  24. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号５）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項２３に記載の方法。
  25. プロモーター領域とリボソーム結合部位を含む前記ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド配列（配列番号６）：
    Figure 0005544063
     を含む請求項２３に記載の方法。
  26. 前記培養を、振とうフラスコ段階、場合により前培養段階、及び主培養段階を含む多段階発酵工程として実施する請求項１７に記載の方法。
  27. 主培養段階における大腸菌細胞の前記培養が、培養時間の約９０％より多くの間、基質の飽和定数より低い基質濃度で、高レベルの溶解酸素濃度を伴い、及びさらに大腸菌細胞の着実に低下する比成長速度を伴って、基質を含む培地中で実施され、前記方法が、大腸菌細胞の増殖のための最適温度より低い温度で実施される請求項２６に記載の方法。
  28. 主培養段階における溶解酸素の濃度が、飽和の約４０％から約１００％までである請求項２７に記載の方法。
  29. 主培養段階における着実に低下する成長速度が、約２ｈ−１から約０．００１ｈ−１である請求項２７に記載の方法。
  30. 主培養段階の温度が約２２℃から約３５℃の間である請求項２７に記載の方法。
  31. 主培養段階の温度が約２５℃から約３１℃の間である請求項３０に記載の方法。
  32. 主培養段階の温度が約２８℃である請求項３１に記載の方法。
  33. 前記方法を、前培養段階及び／又は主培養段階において約６．７から約７．３までの範囲のｐＨ値で実施する請求項２７に記載の方法。
  34. 基質が炭水化物又はグリセロールである、請求項２７に記載の方法。
  35. 炭水化物がグルコースである請求項３４に記載の方法。
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