JP2007502609A - 組換えポリペプチドを調製するための方法 - Google Patents
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米国特許第4,845,032号
米国特許第4,315,852号
組換え技法を使用して粗製ポリペプチドの高い収率を生み出すことはできるが、ポリペプチドの単離および精製は精巧かつ包括的な手順を必要とする。
a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法に関する。
a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ発酵生産物回収培養液をステップb)の前に濃縮する、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含み、かつ組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である、組換えポリペプチドを調製するための方法を提供する。
実施例中では、以下の略語を使用する:
aa=アミノ酸
A=ピーク領域
AEX=アニオン交換クロマトグラフィー
BH=床高
C=伝導率(mS/cm)
CAP.P=捕捉プール
CE=清澄化粗製抽出物
CP=遠心分離後のペレット
CR=細胞再懸濁
CV=カラム体積
DBE=直接の培養液抽出
DR=ダイアリテンテート(diaretentate)
DSP=下流工程処理
EBA=拡張床吸着
EXT=抽出
Fab’=抗体Fab’断片
GAC=グルタリル−7−ACA−アシラーゼ
HB=回収培養液
HCP=宿主細胞タンパク質
HG=ホモジェネート
HIC=疎水性相互作用クロマトグラフィー
IPC=方法中の対照
MBR=マスターバッチの記録
MF=マイクロ濾過
N=理論プレート
p=圧力(バール)
P=タンパク質
PCM=パッケージ細胞塊
PEI=ポリエチレンイミン
PS=一次分離
(a)RPC=(酸性)逆相クロマトグラフィー
rpm=1分間当たりの回転数
Rs=解像度
SDS−PAGE=ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
SEC=サイズ排除クロマトグラフィー
ss=ステンレス鋼
T=温度(℃)
t=時間(h)
TMP=膜間圧力差
UF/DF=限外濾過/ダイアフィルトレーション
V=体積(L)
W=重量(kg)
wBM=湿潤バイオマス(=BFM)
WBR=精製水
WFI=注射水
(WO01/94585中に開示された)ヒト腫瘍壊死因子αに関する特異性を有する人化抗体Fab’断片の軽鎖および重鎖をクローニングし、大腸菌K12中で発現させた。適切なプロモーターの共通の制御下においてシグナル配列とのN末端融合体として、それぞれ軽鎖および重鎖の連続的な発現を可能にするベクターを使用する。
ヒト成長ホルモンの構造遺伝子をクローニングし、適切なプロモーターの制御下においてシグナル配列とのN末端融合タンパク質として、rhGHの発現を可能にするベクターを使用して大腸菌K12中で発現させる。シグナル配列は宿主細胞の周辺質空間中への輸送中に切断され、周辺質中に元のポリペプチド配列はそのまま残す。
rhIFNα−2Bを、Pgacプロモーターの制御下での組換え大腸菌K12W3110菌株の発酵生産によって生成させる。標的タンパク質は、(CS278515、CS260068中に記載された)シュードモナスディミニュータCCM3987由来の細菌グルタリル−ACA−アシラーゼ(GAC)のシグナルペプチドとのN末端融合体として発現される。
その後、EDTA/スクロースストック溶液を洗浄した細胞ペーストまたは回収培養液に加えて、10mMのEDTA、200g/Lのスクロースの最終濃度および10〜20%の湿細胞重量に到達させ、スラリーはNaOHを用いてpH8.0に調節する。2〜8℃での穏かな攪拌による1時間のインキュベーションの後、条件付けした細胞懸濁液を冷水に希釈し(1+4希釈による浸透圧衝撃)、インキュベーションをさらに1時間続け、次いでポリエチレンイミン凝集によってrhGH実験(実施例2)中と同様に清澄化し、その後の遠心分離および濾過によって、抽出物1mL当たり約0.005〜0.025mgのrhIFNα−2Bを有する透明なタンパク質溶液を生成させる(デンシトメトリーSDS−PAGEおよびウエスタン検出によって測定)。生成物捕捉用に、この透明な抽出物を3.5〜4.5mS/cmに調節し(あるいは希釈によって、あるいは5〜10kDのBiomax膜、Milliporeでのダイアフィルトレーションによって)、希釈CH3COOHを用いてpH5に調節し、平衡状態のS Ceramic HyperD Fカラム(S Ceramic HyperD F、Biosepra、装荷量30〜70mg(タンパク質)/1ml(樹脂)、2〜6cm/分、EQ−バッファー20mMの酢酸ナトリウム+70mMのNaCL pH5.0)に充填する。平衡状態のバッファーを用いた洗浄ステップ後、rhIFNα−2Bは約2CVの溶出バッファー(20mMの酢酸ナトリウム+175mMのNaCL pH5.0)を用いて溶出させる。捕捉プールにおいて、標的タンパク質はaRPCによって定量化し、ブラッドフォード法で測定した全タンパク質に対する生成物含量によって純度を推定する。
Claims (23)
- a)周辺質を含み、ポリペプチドの周辺質中への分泌を行うことができる組換え発現系で形質転換された原核生物宿主細胞に発酵生産させ、前記発酵生産は、ポリペプチドが宿主細胞の周辺質中に分泌されるような条件下で発酵生産培地において行うステップ、および
b)発酵生産物回収培養液のさらなる処理を中断し、および抽出前に温度およびpHの明確な条件下で発酵生産物回収培養液を保つステップ
を含む、組換えポリペプチドを調製するための方法。 - 発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、少なくとも約1時間の長さ中断する請求項1に記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約1時間〜約72時間の長さ中断する請求項1または2に記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約12時間〜約48時間の長さ中断する請求項1から3のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理を、約12時間、約24時間または約48時間の長さ中断する請求項1から4のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約2℃〜約65℃の温度で行う請求項1から5のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約4℃〜約25℃の温度で行う請求項1から6のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理の中断を、約4℃、約10℃、約15℃、約20℃または約25℃の温度で行う請求項1から7のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のpH値をステップb)の間約4〜約10の間に保つ請求項1から8のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のpH値をステップb)の間約5〜約9の間に保つ請求項1から9のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のpH値をステップb)の間約6〜約8の間に保つ請求項1から10のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のpH値をステップb)の間約7に保つ請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液のさらなる処理を約12時間、約24時間または約48時間の長さ、約4℃、約10℃、約15℃、約20℃または約25℃の温度で中断する請求項1から12のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液をステップb)の前に濃縮する請求項1から13のいずれかに記載の方法。
- 発酵生産物回収培養液を、ステップb)の前に遠心分離またはマイクロ濾過によって濃縮する請求項1から14のいずれかに記載の方法。
- ステップb)を発酵槽中で行う請求項1から15のいずれかに記載の方法。
- 原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である請求項1から16のいずれかに記載の方法。
- グラム陰性菌が大腸菌種、シュードモナス菌種、腸内細菌種、エルビニア菌種、カンピロバクター菌種、プロテウス菌種、アエロモナス菌種およびビトレオシラ菌種からなる群から選択される請求項17に記載の方法。
- グラム陰性菌が大腸菌である請求項17に記載の方法。
- 組換えポリペプチドが抗体、ホルモンまたは免疫調節剤である請求項1から19のいずれかに記載の方法。
- 組換えポリペプチドが成長ホルモン、成長因子、インターフェロン、サイトカイン、酵素、酵素阻害剤または抗体断片である請求項1から20のいずれかに記載の方法。
- 組換えポリペプチドがFab断片、ヒト成長ホルモン、インターフェロンα−2bまたは顆粒球コロニー刺激因子である請求項1から21のいずれかに記載の方法。
- 実施例への個々の参照と共に本明細書に実質的に記載された通りの方法。
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