KR20090039027A - ＡｒｔＪ，ＯｓｍＹ 또는 ＦｋｐＡ를 이용한 목적 단백질의세포 외 분비생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 단백질의 분비·발현을 위한 신규 모티프에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 알지닌 전달 서브유닛(arginine transporter subunit: ArtJ)을 코딩하는 유전자, 고삼투압 유도 세포질 단백질(hyperosmotically inducible periplasmic protein: OsmY)을 코딩하는 유전자 또는 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis - trans isomerase: FkpA)를 코딩하는 유전자를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 세포 밖(배양액) 분비·생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 원하는 목적 단백질을 ArtJ, OsmY 혹은 FkpA 단백질과 융합된 형태로 세포 배양액으로 분비·생산할 수 있어 융합 단백질로부터 목적 단백질을 효율적으로 분리·정제할 수 있다.
대장균, 알지닌 전달 서브유닛, 고삼투압 유도 세포질 단백질, 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈, 세포 외 분비생산

Description

ＡｒｔＪ，ＯｓｍＹ 또는 ＦｋｐＡ를 이용한 목적 단백질의 세포 외 분비생산 방법{Method for Extracellular Production of Target Proteins Using ArtJ, OsmY or FkpA}
본 발명은 목적 단백질의 분비·발현을 위한 신규 모티프에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 알지닌 전달 서브유닛(arginine transporter subunit: ArtJ)을 코딩하는 유전자, 고삼투압 유도 세포질 단백질(hyperosmotically inducible periplasmic protein: OsmY)을 코딩하는 유전자 또는 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase: FkpA)를 코딩하는 유전자를 이용하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 세포 밖(배양액) 분비·생산방법에 관한 것이다.
유전자 조작 기술이 발전하면서 박테리아 및 여러 동식물들을 이용한 유용 단백질의 대량생산 연구가 많이 이루어지고 있다. 현재까지 대장균은 여러 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이며, 이에 관한 연구도 가장 많이 이루어지고 있다 (Choi et al., Chem . Eng . Sci ., 66: 876, 2006; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996).
그러나, 생산하고자 하는 유용 단백질이 대장균의 세포질 내에서 생성되는 경우 많은 문제점들이 도출되고 있다. 첫 번째로 세포질 내에 생산된 단백질을 순수 분리·정제하기 위해서는 상당히 복잡하고 많은 비용의 분리·정제과정을 거쳐야 하며, 세포질 내에 존재하는 여러 프로티아제(protease)에 쉽게 노출될 수 있기 때문에 수율이 낮아지는 원인이 된다. 또한, 세포질 내에 과다 발현된 단백질들은 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우가 대부분이다. 이 불용성 단백질은 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로, 이로부터 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질을 얻기 위하여 복잡하고 비용이 많이 드는 풀림(denaturation)과 재접힘(refolding) 과정이 필요하다 (Choi et al., Chem . Eng . Sci ., 66: 876, 2006; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996).
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법 중의 하나로 세포질 내에서 생산된 단백질을 주변세포질(periplasm) 혹은 배양액으로 분비(secretion)시키는 방법이 있다.
대장균에서 목적 단백질의 세포 외 분비·생산은 여러 가지 장점을 가지고 있다. 첫 번째로 대장균의 세포 내에 생산될 경우 세포 내 프로테아제에 의한 분해(proteolysis)를 근본적으로 방지할 수 있어 목적 단백질의 안정적인 생산을 기대할 수 있다.
두 번째로 분비 과정을 통하여 단백질의 올바른 접힘(folding)이 가능하여 활성을 갖는 단백질을 생산할 수 있으며, 부적절한 접힘에 의한 불용성 응집체(inclusion body) 형성을 방지할 수 있다.
세 번째로 분비 과정을 통하여 N-말단의 분비 신호 서열이 제거되기 때문에 세포 내 생산시 불가피하게 연결되는 N-말단의 메티오닌(methionine, Met) 잔기를 가지고 있지 않아 자연 상태에 존재하는 것과 동일한 아미노산 서열을 유지할 수가 있다.
마지막으로 정제 과정이 용이하다. 이는 자연 상태에서는 대장균은 배양액으로 분비하는 단백질이 거의 없기 때문에 원하는 단백질을 세포 배양액으로 분비·생산하였을 경우 높은 순도(purity)를 유지할 수 있고, 이로부터 원하는 단백질의 순수 분리 또한 매우 용이하기 때문이다.
비록 대장균의 주변세포질에 원하는 단백질을 분비하는 방법은 일반적인 분비·생산과 유사한 장점을 갖고 있지만, 산업적인 생산 측면에서 고려해 본다면 세포 외 분비·생산방법의 경우 상기에서 언급한 장점들이 훨씬 더 유효해진다고 볼 수 있다. 일단 한정된 주변세포질 내에서 생산하는 것이 아니라, 세포 밖으로 완전히 분비시키는 방법이기 때문에 단백질 과잉 생산에 따라 세포에 주는 부담이 훨씬 줄어들어 고농도 배양 및 연속배양을 통한 단백질 대량생산이 가능하고, 정제 과정에서도 비록 두 방법 모두 높은 순수도를 유지한 상태로 생산이 가능하지만, 주변세포질로의 분비·생산은 세포 외 분비·생산보다 훨씬 더 복잡한 정제 과정을 거쳐야 하므로, 산업적으로 활용하기에 용이하지 않다. 이와 같이 세포 외 분비·생산이 갖는 장점은 매우 뛰어나고 다양하며, 이러한 이유로 그동안 대장균에서 목적 단백질의 주변세포질 혹은 세포 외 분비·생산에 관하여 다양한 연구들이 진행되어 왔다.
대장균으로부터 합성된 유용 단백질을 주변세포질이나 배양액으로 분비시키는 방법은 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산 측면에서 여러 가지 장점이 있다. 우선 주변세포질이나 배지 내에는 세포질 내에 비해 상당히 적은 단백질이 존재하기 때문에 원하는 유용 단백질의 고순도 분리 및 정제가 매우 용이하다. 그리고, 대부분의 프로티아제가 존재하는 세포질로부터 분리가 되기 때문에 세포 내 프로티아제에 의한 분해를 사전에 막을 수 있어 수율면에서 좋은 결과를 얻을 수 있다. 또한, 주변세포질은 세포질 내보다 더욱 산화된 환경이기 때문에 다이설파이드(disulfide) 결합이 훨씬 쉽게 이루어지고, 결국 생성된 단백질의 올바른 접힘 (folding)이 형성되어 불용성 응집체의 형성이 현저히 줄어든다는 점이다 (Choi and Lee, Appl . Microbiol . Biotechnol., 64:625, 2004).
종전에는 대장균에서 분비되지 않는 외래 단백질을 분비시키기 위해 기존에 알려져 있는 분비 신호 서열(Endoxylanase, OmpA, OmpF, PhoA, SpA 등)을 외래 단백질의 N-말단에 연결하거나 혹은 이들 신호 서열을 약간 변형시켜 연결하여 분비시켰다 (Abrahmsen et al ., EMBO J., 4:3901, 1985; Choi and Lee, Appl . Microbiol . Biotechnol.. 64:625, 2004; Jobling et al ., Plasmid, 38:158, 1997; Klein et al., Protein Eng., 5:511, 1992; Utsumi et al ., Gene, 71:349, 1988).
그러나, 상기 방법은 신호 서열이나 단백질의 선택에 따라 분비 효율면에서 많은 차이를 보이며, 분비가 전혀 이뤄지지 않는 경우도 허다하다. 이는 아직까지 신호 서열과 대상 단백질과의 상호관계에 대해서 정확하게 규명되지 않았기 때문이다. 따라서, 대상 단백질을 좀 더 효율적으로 분비시킬 수 있는 새로운 신호 서열의 탐색에 관한 연구가 전 세계적으로 진행되고 있다. 또한, 분리·정제하는데 있어 세포질에서 분리·정제하는 방법보다는 보다 간편하지만, 이를 세포 외로 분비시키는 경우 분리·정제하는 방법이 보다 간편해질 수 있다.
지금까지 진행된 대장균에서 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법은 다음과 같이 분류할 수 있다.
(1) 분비 신호 서열(signal peptide)과의 융합방법으로 주로 대장균에서 주변세포질로의 분비·생산에 이용하는 signal peptide를 많이 이용한다. Toksoy 등은 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)과의 융합 방법으로 TaqI 단백질을 세포 외로 분비·생산하였다 (Toksoy et al., Biotechnol. Techniq., 3:803, 1999). 이는 대장균 XL1 균주를 이용하였으며, 1 mM IPTG를 이용한 유도발현한 경우, 배양액 1 L당 약 270 x 103 Unit의 TaqI 단백질이 세포 배양액에서 생산되었다. Lo 등은 고초균(Bacillus subtilis)에서 유래한 베타-1,4-엔도글루카나제(β-1,4-endoglucanase)를 대장균에서 발현한 결과, 세포 외 분비·생산이 일어났음을 확인하였다 (Lo et al., Appl . Environ . Microbiol ., 54:2287, 1988). Nagahari 등은 OmpF 단백질의 분비 신호 서열 및 N-말단 8개 아미노산과의 융합방법을 이용하여 베타-엔돌핀을 세포 외에서 분비·생산하였는바(Nagahari et al., EMBO J., 4:3589, 1985), 이는 대장균 N99, RRI, MC4100 및 mutant인 MH1461(envZ), MH1160(ompR)을 숙주세포로 사용하였으며, 이중 RR1 균주에서 가장 높은 분비 효율을 나타냈는데, 분비 생산 후 세포 외 프로테아제의 작용으로 급격히 베타-엔돌핀의 분해가 일어났다. 가장 안정적인 분비 효율은 N99 균주에서 나타났다. 반면에 Yamamoto 등은 상기와 같은 OmpF 분비 신호 서열과의 융합방법을 이용하여 Harvey murine sarcoma virus에서 유래한 p21 단백질의 분비·생산을 시도하였으나, 분비·생산되지 않고 세포질 내(cytoplasm)에서 불용성 응집체(insoluble inclusion body) 형태로 축적되었다고 보고하였다 (Yamamoto et al ., Appl. Microbiol . Biotechnol., 35:615, 1991).
(2) 대장균에서 단백질 분비에 관여하는 단백질의 동시 생산방법을 이용한다. Baneyx 등은 OmpA-TEM-β-lactamase 융합 단백질의 분비·생산에 대장균의 transmembrane 단백질인 TolAIII 단백질의 동시 생산방법을 이용하였다 (Baneyx and Eugene, Protein Expr . Purif ., 14:13, 1998). OmpA-TEM-β-lactamase 융합 단백질의 분비·생산에는 IPTG 유도체를 필요로 하는 lpp-lac 프로모터를 사용하였고, TolAIII의 발현에는 IPTG 유도체를 필요로 하는 T7lac 프로모터를 사용하였다. 대장균 BL21(DE3)을 사용하여 1 mM IPTG로 유도 발현한 결과, TolAIII를 동시 발현하지 않은 경우에 비하여 동시 발현하였을 경우에 세포 배양액에서 3.5배 정도 β-lactamase 활성이 증가되는 것을 확인하였다. Robbens 등은 interleukin-2(IL-2)의 생산에 있어 kil 유전자의 동시 발현방법을 사용하였는바(Robbens et al ., Protein Expr. Purif., 6:481, 1995), IL-2 유전자를 OmpA 분비 신호 서열과 융합한 뒤 IPTG 유도체를 필요로 하는 tac 프로모터를 이용하여 유도 발현하였으며, kil 유전 자의 경우 42℃의 heat shock을 필요로 하는 PL 프로모터를 사용하여 동시발현에 이용하였다. Heat shock에 의한 kil 유전자의 유도 발현 전에 대장균의 주변세포질에 생성된 IL-2 단백질이 kil 유전자의 유도발현 후, 대부분 세포 외막을 통과하여 세포 배양액으로 분비되었음을 확인하였다. van der Wal 등은 베타-락타마제(β-lactamase)의 세포 외 분비·생산에 대장균의 lipoporotein인 bacteriocin release protein(BRP)을 이용하였다 (van der Wal et al ., Appl . Environ . Microbiol., 64:392, 1998). 이는 기존의 BRP 유전자에 무작위 돌연변이(redome mutagenesis) 방법을 이용하여 변형된 BRP 유전자를 확보하였으며, 이들로부터 기존의 BRP 보다 안정적으로 세포 외 분비·생산이 가능한 시스템을 개발하였다. Aristidou 등은 BRP를 이용한 세포 외 분비·생산에서 배지 내에 글리신(glycine)의 첨가가 분비 효율을 높이는데 효과가 있다고 보고하였다 (Aristidou et al ., Biotechnol. Lett., 15:331, 1993). 대상 단백질로는 알파-아밀라제(α-amylase)와 베타-락타마제(β-lactamase)를 사용하였으며, BRP의 발현은 lpp/lac 프로모터에 의해 이루어졌다. 알파-아밀라제의 경우, 배지 내에 글리신을 1% 첨가하였을 경우 0.1 % 첨가한 경우에 비하여 세포 배양액에서 약 10배 정도의 높은 활성을 나타내었으며, 베타-락타마제의 경우 약 2.5배의 활성 증가를 나타내었다.
(3) 세포 외막이 없는 대장균을 이용하는 방법이다. 소위 L-form이라 불리우는 이 돌연변이체는 대장균의 세포 외막을 제거함으로써 주변세포질 없이 세포 내막으로만 세포가 형성되어 있는 상태이다. 즉, 기존의 널리 이용되어 왔던 주변세 포질로의 단백질 분비·생산 방법을 이용하였을 경우, 세포 내막만 통과하면 주변세포질 없이 바로 세포 배양액으로 노출이 되기 때문에 세포 외 분비·생산이 가능하다. Kujau 등은 L-form 대장균인 RV308 균주를 사용하여 miniantibody(miniAb)를 세포 외로 분비·생산하였다 (Kujau et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 49:51, 1998). MiniAb 유전자는 OmpA 분비 신호 서열과 융합하여 lac 프로모터에 의해 유도발현되었다. 26℃의 저온에서 배양하였을 경우, 37℃에서 배양했을 때보다 더 높은 세포 농도 및 단백질 생성 정도를 나타내었다.
(4) 세포 외막 단백질 F(OmpF)와 목적 단백질의 융합을 통해 세포 외로 분비시키는 방법이다. 이 방법은 세포 외막 단백질 F의 C-말단에 목적 단백질인 β-endorphin을 융합시켜 고농도로 배양하여 세포 외로 분비시켰다 (대한민국 특허등록 제10-0447530호; Jeong and Lee, Appl . Environ . Microbiol., 68:4979, 2002). 하지만, 이 방법의 경우 세포 외로 분비시켜 생산하기 위하여 반드시 고농도 배양을 수행하여야 하며, β-endorphin보다 큰 사이즈의 목적 단백질을 생산할 수 없다는 단점이 있다.
이와 같이 대장균에서 목적 단백질의 세포 외 분비·생산을 위해 다양한 방법들이 개발되어 왔으나, 여러 문제점들이 있다. 즉, 상기에서 기술한 방법들에 의해 원하는 단백질의 분비·생산이 가능하나, 대부분의 방법이 일정 부분 대장균의 용해(lysis)를 수반하기 때문에 세포 배양액에 적지 않은 양의 대장균의 세포 내 단백질이 포함되므로, 순도가 감소하고 정제과정이 어렵게 된다. 또한, 대장균의 용해를 수반하는 과정이기 때문에 고농도 배양이 어려운 단점이 있어 원하는 단백 질의 대량생산이 어려워지는 문제점이 있다. 특히 L-form 대장균의 경우, 대장균의 구조적인 문제점 때문에 저농도 배양만이 가능하다.
이에 본 발명자들은 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 효율적으로 분비·생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 목적 단백질의 분비 발현을 위한 신규 모티프인 알지닌 전달 서브유닛(arginine transporter subunit: ArtJ)을 코딩하는 유전자, 고삼투압 유도 세포질 단백질(hyperosmotically inducible periplasmic protein: OsmY) 및 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase: FkpA)를 코딩하는 유전자를 규명하고, 목적 단백질을 ArtJ, OsmY 또는 FkpA와 융합 발현시킬 경우, 목적 단백질이 세포 배양액으로 효율적으로 분비·생산되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 목적 단백질이 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비 촉진 모티프와 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 구조물을 함유하는 재조합벡터, 상기 유전자 구조물 또는 상기 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알지닌 전달 서브유닛(arginine transporter subunit: ArtJ)을 코딩하는 유전자, 고삼투압 유도 세포질 단백질(hyperosmotically inducible periplasmic protein: OsmY)을 코딩하는 유전자 및 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis - trans isomerase: FkpA)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 분비 촉진 모티프 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비 촉진 모티프와 목적 단백질이 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조물을 포함하는, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환되고, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 구조물이 크로모좀에 삽입되어 있는, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법을 제공한다.
본 발명은 목적 단백질을 세포 배양액으로 분비하는 대장균 및 이를 이용한 목적 단백질의 세포 외 분비·생산방법을 제공하는 효과가 있다. 종래의 기술에 의하여 재조합 단백질을 대장균에서 세포 배양액으로 분비·생산할 경우, 대장균의 용해(lysis)를 수반하기 때문에 세포 배양액에 적지 않은 양의 대장균의 세포 내 단백질이 포함되어 순수도가 감소하고 정제과정이 어렵게 되는데 비하여, 본 발명에 따르면 목적 단백질이 ArtJ, OsmY 또는 FkpA 단백질과 융합하여 세포가 성장하면서 융합 단백질을 세포 밖으로 발현시킴으로써, 순수한 목적 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 일 관점에서, ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비 촉진 모티프와 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질과 목적 단백질을 융합된 형태로 발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 프로모터는 Trc 프로모터인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 유전자 구조물을 함유하는 재조합벡터, 상기 유전자 구조물 또는 상기 재조합벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합벡터는 ColE1 오리진을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, pTrcArtJC, pTrcOsmYC 및 pTrcFkpAC로 구성된 군에서 선택되는 플라스미드에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 특징으로 할 수 있으며, pTrcArtJ-PhoA, pTrcOsmY-PhoA, pTrcFkpA-PhoA, pTrcOsmY-EGF, pTrcOsmY-ED, pTrcOsmY-obe, pTrcOsmY-gcsf, pTrcArtJ-obe 및 pTrcFkpA-obe로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질 을 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서 목적 단백질의 세포 밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b) 단계는 단백질 분해효소로 처리하여, ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질을 제거시켜 목적 단백질을 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 단백질 분해효소는 엔테로키나아제인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 재조합 단백질 생산에 널리 이용되는 대장균 W3110을 고농도로 배양한 다음, 배양액을 2D-PAGE 겔 전기영동으로 분석하여, 15가지 세포 외막 단백질이 배양액으로 분비·생산되는 것을 확인하였다. 이들 15가지 단백질들을 Trc 프로모터를 이용하여 과다발현시킨 결과, 알지닌 전달 서브유닛(ArtJ), 고삼투압 유도 세포질 단백질(OsmY) 및 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(FkpA)가 배양액으로 효율적으로 분비·생산되는 것을 확인하였다. 이들 ArtJ, OsmY 또는 FkpA을 목적 단백질과 융합시킬 경우, 목적 단백질을 ArtJ, OsmY 또는 FkpA와 융합된 형태로 세포 밖으로 분비시킬 수 있을 것으로 예상하고, ArtJ, OsmY 또는 FkpA을 코딩하는 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 목적 단백질을 효율적으로 세포 밖으로 분비시킬 수 있는 유전자 구조물 및 재조합벡터를 제작하였다.
상기 유전자 구조물 또는 재조합벡터가 도입된 재조합 대장균을 제작한 다 음, 상기 재조합 대장균을 배양한 결과, 목적 단백질이 ArtJ, OsmY 또는 FkpA과 융합된 형태로 대장균 세포 밖(배양액)으로 분비되는 것으로 확인하였다. 상기 목적 단백질로는 대장균에서 유래한 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 53개의 아미노산으로 이루어진 상피세포 성장인자, 바실러스(Bacillus sp.) 유래 아밀라아제, 인체 유래 비만 단백질인 렙틴, 인체 유래 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자인 G-CSF(Granulocyte colony stimulation factor)를 사용하였다.
또한, 상기 재조합 대장균을 배양하여 수득된 목적 단백질이 ArtJ, OsmY 또는 FkpA과 융합된 형태의 융합 단백질은 단백질 분해효소인 엔테로키나제를 통하여 목적 단백질만을 순수하게 수득할 수 있었다.
결국, 본 발명에서는 ArtJ, OsmY 또는 FkpA가 목적 단백질을 세포 밖으로 분비·생산하는 기능을 가진다는 것을 입증하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질과 목적 단백질이 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물을 함유하는 재조합벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하여 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산하는 것을 예시하였으나, ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질과 목적 단백질이 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물을 크로모좀에 도입한 재조합 미생물 역시 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있다는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 목적 단백질을 미생물의 주변세포질로 분비·발현시킬 수 있는 예시로서, 알칼라인 포스파타제, 상피세포 성장인자, 인체 유래 비만 단백질인 렙틴, 인체 유래 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자인 G-CSF, 베타 엔돌핀을 예시하였으나, 이에 국한되지 않는다는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예 1: 재조합 플라스미드 pTrcArtJH 6 의 제작
artJ 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110(derived from E. coli K-12, λ-, F-, prototrophic, KCTC 2223)로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 1: 5'-AAAAAGTTAGTTCTTGCCGCTTTACTTGC-3'
서열번호 2: 5'-CATTGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGCTGTGGGAAC CACTGGTCAC-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한 번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 68℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 757bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도 가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pTrc99A(Pharmacia Biotech Co., 미국)를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 이용하여 블런트 말단을 만든 다음, 제한효소 asalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'( proAB + lacI q lacZ ΔM15Tn(tet r )](Stratagene Co., 미국)에 도입하여 형질전환 재조합 플라스미드 pTrcArtJH6를 수득하였다 (도 1).
실시예 2: ArtJ 의 세포 외 분비·생산
대장균 W3110, BL21(DE3)[F- ompT hsdSB ( rB - mB -) gal dcm ( DE3 ) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene](Novagen Co., 미국), HB101[F- hsdS20 ( rk - , mk - ) recA13 ara -14 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 ( str ) xyl1 -5 mtl -1 supE44 λ - ](New England Biolabs, 미국)을 상기 실시예 1에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcArtJH6로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판 배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지(트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 37℃로 배양한 다음, ArtJ의 세포 외 분비 정도를 조사하였다.
상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간과 6시간 후에 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22μm 필터(Millipore Inc. 미국)에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시킨 후, 차가운 20 %(w/v) 트리클로로아세테이트(TCA)와 동일한 양으로 섞은 다음, -20℃에 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 4℃에서 21,910 g로 10분 동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획에서 TCA를 제거하기 위하여, 아세톤 용액으로 3번 세척한 후 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 현탁하여 단백질 분획 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 2). 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 약 27 kDa에 해당하는 ArtJ 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있 다는 것을 나타내는 것이다. 즉, 재조합 대장균에서 ArtJ 단백질의 분비가 일어났음을 알 수 있으며, 그 양을 Bradford 방법으로 정량한 결과, 배양액에서 알칼라인 포스파타제가 약 0.05 g/L로 수용성 형태로 생산된다는 것을 확인하였다.
실시예 3: 재조합 플라스미드 pTrcOsmYH 6 의 제작
osmY 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 3: 5'-ACTATGACAAGACTGAAGATTTCGAAAACT-3'
서열번호 4: 5'-CATTGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGCTTAGTTTTCAGATCATTTT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 56.7℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 631 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pTrc99A를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 이용하여 블런트 말단을 만든 다음, 제한효소 SalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산 물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmYH6를 수득하였다 (도 3).
실시예 4: OsmY 의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3)을 상기 실시예 3에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYH6로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지(트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY의 세포 외 분비 정도를 조사하였다.
상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 4). 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 약 22 kDa에 해당하는 OsmYH6 단백질(Yim and Villarejo, J. Bacteriol., 174:3637, 1992)을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다. 즉, 재조합 대장균에서 ArtJ 단백질의 분비가 일어났음을 알 수 있으며, 그 양을 Bradford 방법으로 정량한 결과, 배양액에서 OsmY 단백질이 약 0.7 g/L로 그 수치가 매우 높으며, 수용성 형태로 생산됨을 확인하였다.
실시예 5: 재조합 플라스미드 pTrcFkpAH 6 의 제작
fkpA 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 5: 5'-AAATCACTGTTTAAAGTAACGCTGCTGGC-3'
서열번호 6: 5'-CAGCGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGTTTTT TAGCAGAATCTGCGG-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 64.4℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 838 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도 가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라 스미드 pTrc99A(Pharmacia Biotech Co., 미국)를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 이용하여 블런트 말단을 만든 다음, 제한효소 SalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'( proAB + lacI q lacZ ΔM15Tn(tet r ))](Stratagene Co., 미국)에 도입하여 형질전환 재조합 플라스미드 pTrcFkpAH6를 수득하였다 (도 5).
실시예 6: FkpA 의 세포 외 분비·생산
대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 상기 실시예 5에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcFkpAH6로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, FkpA의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 6). 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 약 32 kDa에 해당하는 FkpAH6 단백질(Arie et al ., Mol. Microbiol ., 39:199, 2001)을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 7: 재조합 플라스미드 pTrcArtJC 의 제작
fkpA 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리된 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 1 및 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 7: 5'-ATTGTCGACCTGTGGGAACCACTGGTCACTG-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 56.7℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 736 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pTrc99A를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 이용하여 블런트 말단을 만든 다음, 제한효소 SalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcArtJC를 수득하였다 (도 7).
실시예 8: 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC 의 제작
osmY 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 3 및 서열번호 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 8: 5'-CATTGTCGACCTTAGTTTTCAGATCATTTT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 610 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pTrc99A를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 통하여 블런트 엔드를 만든 다음, 제한 효소 SalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이 션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질 전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 수득하였다 (도 8).
실시예 9: 재조합 플라스미드 pTrcFkpAC 의 제작
fkpA 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 5 및 서열번호 9의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 9: 5'-CTATGTCGACTTTTTTAGCAGAATCTGCGG-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 817 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 강력한 유도가능 프로모터인 trc 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pTrc99A를 제한효소 NcoI으로 절단한 후, 크레노우 효소를 통하여 블런트 엔드를 만든 다음, 제한 효소 SalI으로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcFkpAC를 수득하였다 (도 9).
실시예 10: 재조합 플라스미드 pTrcArtJ - PhoA 의 제작
phoA 유전자 확보하기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 10 및 서열번호 11의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 10: 5'-CATTGTCGACCGGACACCAGAAATGCCTGTT-3'
서열번호 11: 5'-CAGCAAGCTTTTATTATTTCAGCCCCAGAGCG GCTT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 80초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 1376 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 7에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcArtJC를 상기와 동일한 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-PhoA를 수득하였다 (도 10).
실시예 11: ArtJ - PhoA 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 상기 실시예 10에서 수득된 재조합 플라 스미드 pTrcArtJ-PhoA로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, ArtJ-PhoA의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 11). 그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 ArtJ-PhoA 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 12: 재조합 플라스미드 pTrcArtJ - obe 의 제작
인체 유래 비만 단백질인 렙틴 유전자를 확보하기 위하여, 재조합 플라스미드 pTrcKObD(Jeong and Lee, Biotechnol . Bioeng., 67:398, 2000)를 주형 DNA로 이용하고, 서열번호 12 및 서열번호 13의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 12: 5'-CATTGTCGACGTGCCCATCCAAAAAGTC C-3'
서열번호 13: 5'-CAGCAAGCTTTTATTAGCACCAGGGC TGA-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 3분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 64.4℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기 영동하여, 464 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 HindIII로 부분 절단한 후, 제한효소 SalI으로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-obe를 수득하였다 (도 12).
실시예 13: ArtJ - leptin 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3), BL101[BL21(DE3) ΔompF](Jeong and Lee, Biotechnol . Bioeng., 67:398, 2000)을 상기 실시예 12에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-obe로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, ArtJ-leptin의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터(Millipore Inc. 미국)에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시킨 후, 차가운 20%(w/v) 트리클로로아세테이트(TCA)와 동일한 양으로 섞은 다음, -20℃에 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 4℃에서 21,910 g로 10분 동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획에서 TCA를 제거하기 위하여, 아세톤 용액으로 3번 세척한 후, 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 현탁하여 단백질 분획 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 13). 그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 ArtJ-leptin 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 14: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - PhoA 의 제작
상기 실시예 10의 PCR을 통하여 수득된 1376 bp의 phoA 유전자 절편을 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다. 이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 상기와 동일한 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation) 시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA를 수득하였다 (도 14).
실시예 15: OsmY - PhoA 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 상기 실시예 14에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA로 각각 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-PhoA의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 15). 그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 OsmY-PhoA 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 16: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - obe 의 제작
상기 실시예 12의 PCR을 통하여 수득된 464 bp의 leptin 유전자 절편을 제한효소 HindIII로 부분절단한 후, 제한효소 SalI로 절단하였다. 이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-obe를 수득하였다 (도 16).
실시예 17: OsmY - leptin 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3) 및 BL101을 상기 실시예 16에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-obe로 각각 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-leptin의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터(Millipore Inc. 미국)에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시킨 후, 차가운 20%(w/v) 트리클로로아세테이트(TCA)와 동일한 양으로 섞은 다음, -20℃에 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 4℃에서 21,910 g로 10분 동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획에서 TCA를 제거하기 위하여 아세톤 용액으로 3번 세척한 후, 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 현탁하여 단백질 분획 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 17). 그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 OsmY-leptin 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 18: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - gcsf 의 제작
인체 유래 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자인 G-CSF 유전자를 확보하기 위하여, 재조합 플라스미드 pTHKCSFmII(Jeong and Lee, Protein Expres . Purif., 23(2):311, 2001)를 주형 DNA로 이용하고, 서열번호 14 및 서열번호 15의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 14: 5'-ATAGTCGACA CTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3'
서열번호 15: 5'-CAGCAAGCT TTTATTAGGGCTGGGCAAGGTG-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 3분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 547 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI 및 HindIII으로 동시에 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-gcsf를 수득하였다 (도 18).
실시예 19: ArtJ - csf 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL101[BL21(DE3) ΔompF](Jeong and Lee, Biotechnol . Bioeng., 67:398, 2000)을 상기 실시예 18에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-gcsf로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-csf의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후, 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터(Millipore Inc. 미국)에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시킨 후, 차가운 20%(w/v) 트리클로로아세테이트(TCA)와 동일한 양으로 섞은 다음, -20℃에 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 4℃에서 21,910 g로 10분 동안 원심분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획에서 TCA를 제거하기 위하여 아세톤 용액으로 3번 세척한 후, 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 현탁하여 단백질 분획 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 19). 그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 OsmY-csf 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 20: 재조합 플라스미드 pTrcFkpA - PhoA 의 제작
상기 실시예 10의 PCR을 통하여 수득된 1376 bp의 phoA 유전자 절편을 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다. 이와 동시에 상기 실시예 9에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcFkpAC를 상기와 동일한 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcFkpA-PhoA를 수득하였다 (도 20).
실시예 21: FkpA - PhoA 융합 단백질의 세포외 분비·생산
대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 상기 실시예 20에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-PhoA로 각각 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, FkpA-PhoA의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01 혹은 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 21). 그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 FkpA-PhoA 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 22: 재조합 플라스미드 pTrcFkpA - obe 의 제작
상기 실시예 12의 PCR을 통하여 수득된 464 bp의 leptin 유전자 절편을 제한효소 HindIII로 부분절단한 후, 제한효소 SalI로 절단하였다. 이와 동시에 상기 실시예 9에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcFkpAC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcFkpA-obe를 수득하였다 (도 22).
실시예 23: FkpA - leptin 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3) 및 BL101을 상기 실시예 22에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcFkpA-obe로 각각 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, FkpA-leptin의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터(Millipore Inc. 미국)에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시킨 후, 차가운 20%(w/v) 트리클로로아세테이트(TCA)와 동일한 양으로 섞은 다음, -20℃에 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 4℃에서 21,910 g로 10분 동안 원심 분리하여 불용상을 분획하였다. 이 불용상 분획에서 TCA를 제거하기 위하여 아세톤 용액으로 3번 세척한 후, 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액으로 현탁하여 단백질 분획 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 23). 그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이 FkpA-leptin 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 24: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - Amy 의 제작
아밀라제(amylase) 유전자 확보하기 위해서, Bacillus subtilis 168(KCTC 2457)로부터 분리된 염색체를 주형으로 이용하고, 서열번호 16 및 서열번호 17의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 16: 5'-CATATCATGTCGACTCGATCAAAAGCGGAACCA-3'
서열번호 17: 5'-ATTCTAAGCTTTTATTAATGAGGCGCTTTTGCAATA-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 80초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 1346 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI으로 부분 절단하고, HindIII로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-Amy를 수득하였다 (도 24).
실시예 25: OsmY - Amy 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3)을 상기 실시예 24에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-Amy로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, ArtJ-PhoA의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 25). 그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이 OsmY-Amy 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 26: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - EGF 의 제작
상피세포 성장인자(EGF: epidermal growth factor) 유전자를 확보하기 위하여, 한국 사이토카인 은행(전라북도 전주시 전북대학교 생물과학부)으로부터 분양받은 상피세포 성장인자 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 G82를 주형 DNA(template DNA)로 이용하고, 서열번호 18 및 서열번호 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 18: 5'-CATCGTCGACAATAGTGACTCTGAATGTCCC-3'
서열번호 19: 5'-CTACAAGCTTTTATTAGCGCAGTTCCCACCACT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 183 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EGF를 수득하였다 (도 26).
실시예 27: OsmY - EGF 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3)을 상기 실시예 26에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EGF로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-EGF의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 27). 그 결과, 도 27에 나타난 바와 같이 OsmY-EGF 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 28: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - ED 의 제작
베타-엔돌핀은 31개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이를 암호화하는 유전자는 총 93개의 뉴클레오타이드로 구성되어 있다 (Takahashi H. et al ., FEBS Lett., 135:97, 1981). 이를 클로닝하기 위하여, 재조합 플라스미드 pOmpF6βE(Jeong and Lee, Appl . Environ . Microbiol., 68:4979, 2002)를 주형 DNA로 이용하고, 서열번호 20 및 서열번호 21의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 20: 5'-ACATTAGTCGACATCGAGGGAAGGTATGG-3'
서열번호 21: 5'-CGCCACAAGCTTCTATTATTCGCCTTTTT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교잡(annealing)은 61℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 135 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고, 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-ED를 수득하였다 (도 28).
실시예 29: OsmY - ED 융합 단백질의 세포 외 분비·생산
대장균 BL21(DE3)을 상기 실시예 28에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-ED로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-ED의 세포 외 분비 정도를 조사하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.01, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 4시간 후, 배양액을 1 mL를 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 29). 그 결과, 도 29에 나타난 바와 같이 OsmY-ED 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 이는 본 시스템이 목적 단백질을 매우 효율적으로 배양액에 분비시킬 수 있다는 것을 나타내는 것이다.
실시예 30: 재조합 플라스미드 pTrcOsmY - EPhoA 의 제작
상기 실시예 14에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA에서 분비 발현되는 OsmY-PhoA 융합 단백질로부터 순수한 alkaline phosphatase 단백질을 얻기 위하여, OsmY 유전자와 PhoA 유전자 사이의 엔테로키나제(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)에 목적 단백질인 PhoA 단백질을 회수하기 위한 새로운 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EPhoA를 제작하였다.
phoA 유전자의 N-말단 부위에 엔테로키나제에 해당하는 유전자 서열을 삽입한 PCR 절편을 얻기 위하여, 대장균 W3110로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 22 및 서열번호 11의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.
서열번호 22: 5'-ATTGTCGACGACGACGACGACAAGCGGACACCAGAAA TGCCTGT-3'
PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 4분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성(denaturation)은 95℃에서 20초간, 교 잡(annealing)은 59℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 90초간 수행하였으며, 이를 27회 반복하였다. 이후 72℃에서 10분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 1390 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였다.
이와 동시에 상기 실시예 8에서 제작된 재조합 플라스미드 pTrcOsmYC를 제한효소 SalI 및 HindIII로 절단하였으며, 이 플라스미드와 상기 PCR 산물을 혼합하여 T4 DNA 리가아제로 연결(ligation)시키고 이를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EPhoA를 수득하였다.
실시예 31: OsmY - EPhoA 융합 단백질의 세포 외 분비·생산 및 PhoA 의 순수 분리
대장균 BL21(DE3)에 상기 실시예 30에서 수득된 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EPhoA로 형질전환하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며, 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다.
이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃로 배양한 다음, OsmY-EPhoA의 세포 외 분비 정도를 확인하고 순수한 PhoA 단백질을 분리하였다. 상기 형질전환된 균주를 액체 배지에 접종한 후 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.05 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도발현 4시간 후, 배양액을 저온 쇼크를 방지하기 위해 상온에서 채취하였 다. 채취된 배양액은 0.22 μm 필터에 통과하여 남아 있는 세포를 제거시켜 단백질 시료 용액을 얻었다. 상기 단백질 시료 용액은 Amicon Ultra-15 30K 원심분리용 필터(Millipore, 미국)를 이용하여 단백질을 농축하면서, 동시에 엔테로키나제 반응 용액(50 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7.6)으로 버퍼를 바꾸었다.
OsmY-PhoA 용합 단백질로부터 PhoA 단백질을 얻기 위하여, 단백질 분해효소인 엔테로키나제(New England Biolabs, 미국)를 1:10,000(w/w) 비율로 융합 단백질과 혼합한 다음, 25℃에서 16시간 동안 반응시켰다.
이렇게 얻어진 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석하였다 (도 30). 그 결과, 도 30에 나타난 바와 같이 OsmY-EPhoA 융합 단백질을 확인할 수 있었으며, 또한, 엔테로키나제에 의해 순수한 PhoA 단백질을 분리할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 1은 플라스미드 pTrcArtJH6의 유전자 지도이다.
도 2는 플라스미드 pTrcArtJH6로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 2의 A는 유도발현 4시간 후, 도 2의 B는 유도발현 6시간 후에 얻어진 단백질 샘플을 나타낸다 (M: 단백질 표준 분자량; 레인 2~6: 0.05 mM IPTG로 유도발현 후에 재조합 플라스미드 pTrcArtJH6로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 각각 배양한 후, 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과; Ctr은 IPTG로 유도발현하지 않은 대조군; J: 정제된 ArtJ).
도 3은 플라스미드 pTrcOsmYH6의 유전자 지도이다.
도 4는 플라스미드 pTrcOsmYH6로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 1: 0.01 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcOsmYH6로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 5는 플라스미드 pTrcFkpAH6의 유전자 지도이다.
도 6은 플라스미드 pTrcFkpAH6로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2~4: 각각 0.01 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcFkpAH6로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 7은 플라스미드 pTrcArtJC의 유전자 지도이다.
도 8은 플라스미드 pTrcOsmYC의 유전자 지도이다.
도 9는 플라스미드 pTrcFkpAC의 유전자 지도이다.
도 10은 플라스미드 pTrcArtJ-PhoA의 유전자 지도이다.
도 11은 플라스미드 pTrcArtJ-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2~4: 각각 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 12는 플라스미드 pTrcArtJ-obe의 유전자 지도이다.
도 13은 플라스미드 pTrcArtJ-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3), BL101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; BL21(DE3) 및 BL101: 각각 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcArtJ-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 및 BL101을 배양한 다음, 그 배양액을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 14는 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA의 유전자 지도이다.
도 15는 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; W3110, BL21(DE3) 및 HB101: 각각 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 16은 플라스미드 pTrcOsmY-obe의 유전자 지도이다.
도 17은 플라스미드 pTrcOsmY-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3), BL101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2~5: 각각 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 및 BL101과 대조군(Ctrl)으로, 상기 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 및 BL101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 18은 플라스미드 pTrcOsmY-gcsf의 유전자 지도이다.
도 19는 플라스미드 pTrcOsmY-gcsf로 형질전환된 대장균 BL101을 배양한 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 1: 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후, 재조합 플라스미드 pOsmY-gcsf로 형질전환된 대장균 BL101을 배양한 후, 그 배양액을 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 20은 플라스미드 pTrcFkpA-PhoA의 유전자 지도이다.
도 21는 플라스미드 pTrcFkpA-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3), HB101을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2~7: 0.01 혹은 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후, 재조합 플라스미드 pTrcFkpA-PhoA로 형질전환된 대장균 W3110, BL21(DE3) 및 HB101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 22는 플라스미드 pTrcFkpA-obe의 유전자 지도이다.
도 23은 플라스미드 pTrcFkpA-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3), BL101을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2 및 3: 각각 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcFkpA-obe로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 및 BL101을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 24는 플라스미드 pTrcOsmY-Amy의 유전자 지도이다.
도 25는 플라스미드 pTrcOsmY-Amy로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2 및 3: 각각 0.01 및 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후, 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-Amy로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 26은 플라스미드 pTrcOsmY-EGF의 유전자 지도이다.
도 27은 플라스미드 pTrcOsmY-EGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2 및 3: 각각 0.01 및 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후, 재조합 플라스 미드 pTrcOsmY-EGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 다음, 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 28은 플라스미드 pTrcFkpA-ED의 유전자 지도이다.
도 29는 플라스미드 pTrcFkpA-ED로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 2 및 3: 각각 0.01 및 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후, 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-ED로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 다음, 그 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
도 30은 플라스미드 pTrcOsmY-EPhoA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)를 배양한 배양액 및 엔테로키나제 반응 후 순수하게 얻어진 PhoA 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다 (Mr: 단백질 표준 분자량; 레인 1 및 3: 0.05 mM IPTG로 유도발현 4시간 후에 재조합 플라스미드 pTrcOsmY-EPhoA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양한 다음, 그 배양액을 10배 농축한 배양액; 레인 2: 50배 농축한 배양액; 레인 4: 엔테로키나제에 의해 반응시킨 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과).
<110> KAIST <120> METHOD FOR EXTRACELLULAR PRODUCTION OF TARGET PROTEIS USING ArtJ, OsmY OR FkpA <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aaaaagttag ttcttgccgc tttacttgc 29 <210> 2 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cattgtcgac ttaatgatga tgatgatgat gctgtgggaa ccactggtca c 51 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actatgacaa gactgaagat ttcgaaaact 30 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cattgtcgac ttaatgatga tgatgatgat gcttagtttt cagatcattt t 51 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaatcactgt ttaaagtaac gctgctggc 29 <210> 6 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cagcgtcgac ttaatgatga tgatgatgat gttttttagc agaatctgcg g 51 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 attgtcgacc tgtgggaacc actggtcact g 31 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cattgtcgac cttagttttc agatcatttt 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctatgtcgac ttttttagca gaatctgcgg 30 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> priemr <400> 10 cattgtcgac cggacaccag aaatgcctgt t 31 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cagcaagctt ttattatttc agccccagag cggctt 36 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cattgtcgac gtgcccatcc aaaaagtcc 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cagcaagctt ttattagcac cagggctga 29 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 atagtcgaca ctccgttagg tccagccagc 30 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cagcaagctt ttattagggc tgggcaaggt g 31 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 catatcatgt cgactcgatc aaaagcggaa cca 33 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 attctaagct tttattaatg aggcgctttt gcaata 36 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 catcgtcgac aatagtgact ctgaatgtcc c 31 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ctacaagctt ttattagcgc agttcccacc act 33 <210> 20 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acattagtcg acatcgaggg aaggtatgg 29 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 cgccacaagc ttctattatt cgccttttt 29 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 attgtcgacg acgacgacga caagcggaca ccagaaatgc ctgt 44

Claims (19)

  1. 알지닌 전달 서브유닛(arginine transporter subunit: ArtJ)을 코딩하는 유전자, 고삼투압 유도 세포질 단백질(hyperosmotically inducible periplasmic protein: OsmY)을 코딩하는 유전자 및 펩티딜 프롤릴 아이소머레이즈(peptidyl-prolyl cis - trans isomerase: FkpA)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 분비 촉진 모티프 유전자와 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비 촉진 모티프와 목적 단백질이 세포 내에서 융합된 형태로 발현되어, 세포 밖(배양액)으로 분비되는 특성을 가지는 유전자 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질과 목적 단백질을 융합된 형태로 발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로모터는 Trc 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 구조물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전자 구조물을 포함하는, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합벡터.
  5. 제4항에 있어서, ColE1 오리진을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
  6. 제4항에 있어서, pTrcArtJC, pTrcOsmYC 및 pTrcFkpAC로 구성된 군에서 선택되는 플라스미드에 목적 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 특징으로 하는 재조합벡터.
  7. 제6항에 있어서, pTrcArtJ-PhoA, pTrcOsmY-PhoA, pTrcFkpA-PhoA, pTrcOsmY-EGF, pTrcOsmY-ED, pTrcOsmY-obe, pTrcOsmY-gcsf, pTrcArtJ-obe 및 pTrcFkpA-obe로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
  8. 제4항의 재조합벡터로 형질전환되고, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 유전자 구조물이 크로모좀에 삽입되어 있는, 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  12. 다음의 단계를 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법:
    (a) 제8항의 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및
    (b) 상기 배양액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 목적 단백질의 세포 밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, (b) 단계는 단백질 분해효소로 처리하여, ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질을 제거시켜 목적 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 엔테로키나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 다음의 단계를 포함하는 목적 단백질의 세포 외 분비·생산 방법:
    (a) 제10항의 재조합 미생물을 배양하여 목적 단백질을 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및
    (b) 상기 배양액으로부터 목적 단백질을 회수하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 목적 단백질의 세포 밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, (b) 단계는 단백질 분해효소로 처리하여, ArtJ, OsmY 및 FkpA로 구성된 군에서 선택되는 분비용 단백질을 제거시켜 목적 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 엔테로키나아제인 것을 특징으로 하는 방법.
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Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20091130

Effective date: 20101230