KR100844992B1 - ＯｍｐＦ와 인체 유래 상피세포성장인자의 동시 발현을통한 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법 - Google Patents
ＯｍｐＦ와 인체 유래 상피세포성장인자의 동시 발현을통한 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인체 유래 상피세포성장인자(human epidermal growth factor: hEGF)를 세포 배양액으로 분비·생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 대장균 유래 세포외막에 단백질 F (OmpF) 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터와 세포 배양액으로 분비하고자 하는 인체 유래 상피세포성장인자를 함유하는 재조합 발현벡터로 동시에 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포성장인자를 세포배양액으로 분비·생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 고농도의 인체 유래 상피세포성장인자를 순수한 상태로 세포 배양액으로 분비시킬 수 있어, 매우 효율적인 분리·정제가 가능하다.
대장균, 세포외막 단백질 F (OmpF), 인체 유래 상피세포성장인자(human epidermal growth factor: hEGF), 세포외 분비생산
Description
도 1은 플라스미드 pACYC-OmpF의 유전자 지도이다.
도 2는 플라스미드 psEGF의 유전자 지도이다.
도 3은 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 CuCl2로 염색하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 고농도로 배양한 결과를 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 고농도로 배양하여 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타낸다.
본 발명은 인체 유래 상피세포성장인자(human epidermal growth factor: hEGF)를 세포 배양액으로 분비·생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 대장균 유래 세포외막에 단백질 F (OmpF) 유전자를 함유하는 재조합 발현벡터와 세포 배양액으로 분비하고자 하는 인체 유래 상피세포성장인자를 함유하는 재조합 발현벡터로 동시에 형질전환된 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포성장인자를 세포배양액으로 효율적으로 분비·생산하는 방법에 관한 것이다.
인간 상피 세포 인자 (human epidermal growth factor: hEGF)는 53개의 아미노산으로 구성되어 있고, 3개의 이황화물 결합(disulfide bond : Cys6-Cys20, Cys14-Cys31, Cys33-Cys42)을 가진 인체내 단백질(폴리 펩타이드)로서 각종 상피 및 피부 세포, 즉 피부, 각막, 소화기관 표피세포 등의 재생에 관여하는 성장인자로서 상처의 치료 등의 분자 수준에서의 조절에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, hEGF는 상피세포의 분화촉진 능력과는 별도로 위장관네에서 위산의 분비 억제 능력도 가지고 있어 위궤양 혹은 당뇨성 궤양 등의 질병 치료에도 매우 유용하게 이용될 수 있는 것으로 보고되고 있다. 또한, 생체내에 소량 분포되어 있는 각종 표피조직에 상처가 생겼을 경우 이를 치유하는 작용을 가지는 내인성 인자로 인정되어 상처치료에 대한 효과로서 창상, 화상, 외과수술시의 절개부위 치료 등의 치료효과가 인정되고 있다.
그러나, 1975년 스타키(starkey) 등이 인간의 뇨에서 hEGF를 분리 및 정제하여 그 성질을 확인한 이후, hEGF를 고수율로 생산하는 연구가 진행되어 왔다. 이러한 연구 결과로 스미스(Smith)는 유전공학 기술을 이용하여 hEGF 유전자를 클로닝하는데 성공하였으마, 이러한 유전공학적 기술을 이용하여 제조된 hEGF는 산업적으로 이용가능할 만큼 충분한 활성을 가지고 효율적으로 생산하지 못하고 있다.
유전자조작 기술이 발전하면서 박테리아 및 여러 동식물들을 이용한 유용 단백질의 대량생산 연구도 많이 이뤄지고 있다. 현재까지 대장균은 여러 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이며, 이에 관한 연구도 가장 많이 이뤄지고 있다 (Hodgson, Bio / Technology, 11:887, 1993; Lee, Trends Biotechnol., 14:98, 1996). 그러나, 생산하고자 하는 유용 단백질이 대장균의 세포질내에 생성되는 경우 많은 문제점들이 도출되고 있다. 첫 번째로 세포질내에 생산된 단백질을 순수 분리 및 정제하기 위해서는 상당히 복잡하고 많은 비용의 분리정제과정을 거쳐야한다. 그리고 세포질내에 존재하는 여러 가지 프로티아제(protease)에 쉽게 노출될 수 있기 때문에 수율이 낮아지는 원인이 된다. 또한 세포질내에 과다 발현된 단백질들은 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 활성을 잃은 상태의 불용성 응집체(inclusion body)를 형성하는 경우가 대부분이다. 이 불용성 단백질은 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로 이로부터 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질을 얻기 위하여 복잡하고 비용이 많이 드는 풀림(denaturation)과 재접힘(refolding) 과정이 필요하다 (Kane and Hartley, Trends Biotechnol ., 6:95, 1988).
이러한 문제점들을 해결하기 위한 방법 중의 한가지로 세포질 내에서 생산된 단백질을 주변 세포질(periplasm) 혹은 배양액으로 분비(secretion)시키는 방법이 있다. 대장균에서 목적단백질의 세포외 분비·생산은 여러 가지 장점을 갖고 있다. 첫 번째로 대장균 세포내에 생산될 경우 일어날 수 있는 세포내 프로테아제에 의한 분해(proteolysis)를 근본적으로 방지할 수 있어 원하는 단백질의 안정적인 생산을 기대할 수 있다. 두번째로 분비과정을 통하여 단백질의 올바른 접힘 (folding)이 가능하여 활성을 갖는 단백질을 생산할 수 있으며 부적절한 접힘에 의한 불용성 응집체 (inclusion body) 형성을 방지할 수 있다. 세번째로 분비과정을 통하여 N-말단의 분비신호서열이 제거되기 때문에 세포내 생산시 불가피하게 연결되는 N-말단의 메티오닌(methionine, Met) 잔기를 갖고 있지 않는 자연상태에 존재하는 것과 동일한 아미노산 서열을 유지할 수가 있다. 마지막으로 정제과정이 용이하다. 이는 자연상태에서 대장균에서 배양액으로 분비하는 단백질은 거의 없기 때문에 원하는 단백질을 세포배양액으로 분비 생산 하였을 경우 높은 순도(purity)를 유지할 수 있고, 이로부터 원하는 단백질의 순수분리 또한 매우 용이하기 때문이다. 비록 대장균의 주변세포질에 분비하는 일반적인 분비생산과 유사한 장점을 갖고 있지만 산업적인 생산측면에서 고려해 본다면 세포외 분비 생산방법은 앞에서 언급한 장점들이 훨씬 더 유효해진다고 볼 수 있다. 일단 한정된 주변 세포질내에 생산하는 것이 아니라, 세포밖으로 완전히 분비시키는 방법이기 때문에 단백질 과잉생산에 따른 세포에 주는 부담이 훨씬 줄어들어 고농도 배양 및 연속배양을 통한 단백질 대량생산이 가능하며, 정제과정에서도 비록 두 방법 모두 높은 순수도를 유지한 상태로 생산이 가능하지만 주변세포질로의 분비·생산은 세포외 분비생산보다 훨씬 더 복잡한 정제과정을 거쳐야 하며, 이는 산업적으로 활용하기에도 용이하지 않다. 이와 같이 세포외 분비·생산이 갖는 장점은 매우 뛰어나고 다양하며 이러한 이유로 그 동안 대장균에서 목적 단백질의 주변세포질 혹은 세포외 분비생산에 관하여 다양한 연구들이 진행되어 왔다.
대장균으로부터 합성된 유용 단백질을 주변 세포질이나 배양액으로 분비시키는 방법은 대장균을 이용한 재조합 단백질의 생산 측면에서 여러 가지 장점이 있다. 우선 주변 세포질이나 배지내에는 세포질 내에 비해 상당히 적은 단백질이 존재하기 때문에 원하는 유용 단백질의 고순도 분리 및 정제가 매우 용이하다. 그리고 대부분의 프로티아제가 존재하는 세포질로부터 분리가 되기 때문에 세포내 프로티아제에 의한 분해를 사전에 막을 수 있어 수율면에서 좋은 결과를 얻을 수 있다. 또한 주변 세포질은 세포질 내보다 더욱 산화된 환경이기 때문에 다이설파이드 (disulfide) 결합이 훨씬 쉽게 이루어지고, 결국 생성된 단백질의 올바른 접힘 (folding)이 형성되어 불용성 응집체의 형성이 현저히 줄어든다는 점이다 (Choi and Lee, Appl . Microbiol . Biotechnol., 64:625, 2004).
대장균에서 분비되지 않는 외래 단백질을 분비시키기 위해 기존에 알려져 있는 분비 신호 서열을 (OmpA , OmpF , PhoA , SpA 등) 외래 단백질의 N-말단에 연결하거나 혹은 이들 신호 서열을 약간 변형시켜 연결하여 분비시켰다 (Abrahmsen et al., EMBO J., 4:3901, 1985; Choi and Lee, Appl . Microbiol . Biotechnol .. 64:625, 2004; Jobling et al ., Plasmid , 38:158, 1997; Klein et al ., Protein Eng., 5:511, 1992; Utsumi et al ., Gene , 71:349, 1988).
그러나 이러한 신호서열이나 단백질의 선택에 따라 분비 효율면에서 많은 차이를 보이고 있으며 또한 분비가 전혀 이뤄지지 않는 경우도 허다하다. 이는 아직까지 신호서열과 대상 단백질과의 상호관계에 대해서는 정확하게 규명되지 않았기 때문이며, 따라서 대상 단백질을 좀더 효율적으로 분비시킬 수 있는 새로운 신호 서열에 대한 탐색에 관한 연구가 지금도 전세계적으로 진행되고 있다.
또한, 분리· 정제하는데 있어 세포질에서 분리·정제하는 방법보다는 보다 간편하지만, 이를 세포외로 분비시키는 경우 분리·정제하는 방법이 보다 간편해 질 수 있다.
지금까지 진행되어온 대장균에서 목적단백질의 세포외 분비생산 방법은 다음과 같이 크게 세 가지로 분류할 수 있다.
(1) 분비신호서열 (signal peptide)과의 융합방법으로 주로 대장균에서 주변세포질로의 분비생산에 이용하는 signal peptide를 많이 이용한다. Toksoy 등은 말토오스 결합 단백질 (maltose binding protein, MBP)과의 융합 방법으로 TaqI 단백질을 세포외로 분비생산한 바 있다 (Toksoy et al ., Biotechnol Techniq ., 3:803, 999). 대장균 XL1 균주를 이용하였으며 1 mM IPTG를 이용한 유도발현 후 배양액 1 L당 약 270 x 103 Unit의 TaqI 단백질이 세포배양액에 생산되었다. Lo 등은 고초균 (Bacillus subtilis)에서 유래한 베타-1,4-엔도글루카나제 (β-1,4-endoglucanase)를 대장균에서 발현한 결과, 세포외 분비생산이 일어났음을 확인하였다 (Lo et al., Appl . Environ . Microbiol ., 54:2287, 1988). Nagahari 등은 OmpF 단백질의 분비신호서열 및 N-말단 8개 아미노산과의 융합방법을 이용하여 베타-엔돌핀을 세포외 분비생산하였다 (Nagahari et al ., EMBO J., 4:3589, 1985). 대장균 N99, RRI, MC4100 및 mutant인 MH1461 (envZ), MH1160 (ompR)을 숙주세포로 사용하였으며, 이중 RR1 균주에서 가장 높은 분비효율을 나타냈는데, 분비 생산 후 세포외 프로테아제의 작용으로 급격히 베타-엔돌핀의 분해가 일어났다. 가장 안정적인 분비효율은 N99균주에서 나타내었다. 반면에 Yamamoto 등은 앞에서와 같은 OmpF 분비신호 서열과의 융합방법을 이용하여 Harvey murine sarcoma virus에서 유래한 p21 단백질의 분비생산을 시도하였으나, 분비생산되지 않고 세포질내(cytoplasm)에 불용성 응집체 (insoluble inclusion body)형태로 축적되었다고 보고하였다 (Yamamoto et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 35:615, 1991).
(2) 대장균에서 단백질 분비에 관여하는 단백질의 동시 생산방법을 이용한다. Baneyx 등은 OmpA-TEM-β-lactamase 융합 단백질의 분비생산에 대장균의 transmembrane 단백질인 TolAIII 단백질의 동시 생산방법을 이용하였다 (Baneyx and Eugene, Protein Expr . Purif ., 14:13, 1998). OmpA-TEM-β-lactamase 융합 단백질의 분비생산에는 IPTG 유도체를 필요로 하는 lpp-lac 프로모터를 사용하였고, TolAIII의 발현에는 역시 IPTG 유도체를 필요로 하는 T7lac 프로모터를 사용하였다. 대장균 BL21(DE3)을 사용하여 1 mM IPTG로 유도발현한 결과, TolAIII를 동시 발현하지 않은 경우에 비하여 동시 발현하였을 경우에 세포배양액에서 3.5 배정도의 β-lactamase 활성 증가를 확인하였다. Robbens 등은 interleukin-2 (IL-2)의 생산에 있어 kil 유전자의 동시발현방법을 사용하였다 (Robbens et al ., Protein Expr. Purif ., 6:481, 1995). IL -2 유전자를 OmpA 분비신호서열과 융합한뒤 IPTG 유도체를 필요로 하는 tac 프로모터를 이용하여 유도발현하였으며, kil 유전자의 경우 42℃의 heat shock을 필요로 하는 PL 프로모터를 사용하여 동시발현에 이용하였다. Heat shock에 의한 kil 유전자의 유도발현 전에 대장균의 주변세포질에 생성된 IL-2 단백질이 kil 유전자의 유도발현 후 대부분 세포외막을 통과하여 세포배양액으로 분비되었음을 확인하였다. van der Wal 등은 베타-락타마제 (β-lactamase)의 세포외 분비생산에 대장균의 lipoporotein인 bacteriocin release protein (BRP)을 이용하였다 (van der Wal et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 64:392, 1998). van der Wal 등은 기존의 BRP 유전자에 무작위 돌연변이 (redome mutagenesis) 방법을 이용하여 변형된 BRP 유전자를 확보하였으며, 이들로부터 기존의 BRP 보다 안정적으로 세포외 분비·생산이 가능한 시스템을 개발하였다. Aristidou 등은 BRP를 이용한 세포외 분비·생산에서 배지내에 글리신 (glycine)의 첨가가 분비효율을 높이는데 효과가 있다고 보고하였다 (Aristidou et al ., Biotechnol. Lett ., 15:331, 1993). 대상단백질로는 알파-아밀라제 (α-amylase)와 베타-락타마제 (β-lactamase)를 사용하였으며 BRP의 발현은 lpp/lac 프로모터에 의해 이루어졌다. 알파-아밀라제의 경우 배지내에 글리신을 1% 첨가하였을 경우에 0.1 % 첨가하였을 경우와 비교하여 세포배양액에 약 10배정도의 높은 활성을 나타냈으며, 베타-락타마제의 경우 약 2.5배의 활성증가를 나타내었다.
(3) 세포외막이 없는 대장균을 이용하는 방법이다. 소위 L-form이라 불리우는 이 돌연변이체는 대장균의 세포외막을 제거함으로써 주변세포질 없이 세포내막으로만 세포가 형성되어 있는 상태이다. 즉, 기존의 널리 이용되어 왔던 주변세포질로의 단백질 분비·생산 방법을 이용하였을 때 세포내막만 통과하면 주변세포질 없이 바로 세포 배양액으로 노출이 되기 때문에 세포외 분비·생산이 가능하다. Kujau 등은 L-form 대장균인 RV308 균주를 사용하여 miniantibody (miniAb)를 세포외로 분비생산하였다 (Kujau et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 49:51, 1998). MiniAb 유전자는 OmpA 분비신호서열과 융합하여 lac 프로모터에 의해 유도발현 되었다. 26℃의 저온에서 배양하였을 때가 37℃에서 배양했을 때보다 더 높은 세포농도 및 단백질 생성정도를 나타내었다.
(4) 세포 외막 단백질 F(OmpF)와 목적 단백질의 융합을 통해 세포외로 분비시키는 방법이다. 이 방법은 세포 외막 단백질 F의 C-말단에 목적 단백질인 β-endorphin을 융합시켜 고농도로 배양하여 세포외로 분비시켰다 (한국특허 10-0447530; Jeong and Lee, Appl . Environ . Microbiol ., 68:4979, 2002). 하지만, 이 방법의 경우 세포외로 분비 시켜 생산하기 위하여 반드시 고농도 배양을 수행하여야 하며 생산된 목적 단백질은 OmpF 단백질과 융합되어 있기 때문에 여러 종류의 프로테아제를 이용하여 절단하여 목적 단백질을 분리·정제하는 단계가 들어가는 단점이 있다.
이와 같이 대장균에서 목적단백질의 세포외 분비·생산을 위해 다양한 방법들이 개발이 되어왔으나, 아직도 여러 가지 문제점들이 남아있다. 앞에서 기술한 방법들에 의해 원하는 단백질의 분비생산이 가능한 반면 대부분의 방법이 일정부분 대장균의 용해 (lysis)를 수반하기 때문에 세포배양액에 적지 않은 양의 대장균 세포내 단백질이 포함되게 되어 순도가 감소하고 결국 세포외 분비생산의 최대 장점인 쉬운 정제과정이 어렵게 된다. 또한 대장균의 용해를 수반하는 과정이기 때문에 고농도 배양이 어려운 단점이 있어 원하는 단백질의 대량생산 또한 어려워지는 문제점이 있다. 특히 L-form 대장균의 경우 대장균의 구조적인 문제점 때문에 저농도 배양만이 가능하다.
이에 본 발명은 산업적으로 이용가능할 정도의 충분한 활성을 보유하면서 효율적으로 hEGF를 생산하기 위하여 연구노력한 결과, 대장균에서 hEGF를 효율적으로 배양액으로 생산 할 수 있는 기술을 개발하였다.
이에 본 발명자는 대장균에서 인체 유래 상피세포성장인자를 세포밖(배양액)으로 효율적으로 분비·생산하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 대장균의 세포외막 단백질 F (OmpF)과 인체 유래 상피세포성장인자를 동시 발현시켰을 때 인체 유래 상피세포성장인자가 대장균으로부터 세포배양액으로 효율적으로 분비생산되며, 세포 배양액에는 순수한 형태의 인체 유래 상피세포성장인자만이 존재하기 때문에 원하는 인체 유래 상피세포성장인자를 매우 간단한 방법으로 분리·정제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 OmpF와 인체 유래 상피세포성장인자를 동시 발 현시켜 인체 유래 상피세포성장인자를 세포밖으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포성장인자를 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터로 동시에 형질전환되고, OmpF를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어, 인체 유래 상피세포성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, OmpF를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있도록 OmpF를 코딩하는 유전자와 그 프로모터를 크로모좀에 도입한 재조합 미생물에 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포성장인자를 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터를 도입하여 수득되고, OmpF를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어, 인체 유래 상피세포성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비·생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명에 있어서, OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 실질적으로 같은 조건에서 발현되는 오리진을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터의 오리진은 p15A이고, 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터의 오리진은 ColE1이다.
상기 OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 OmpF 자체 프로모터를 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 pACYC-OmpF이다.
한편, 인체 유래 상포세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 인체 유래 상피세포성장인자를 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 것이 바람직한데, 이러한 특성을 가지는 재조합벡터와 OmpF를 코딩하는 유전자로 동시에 미생물을 형질전환시킨 다음, 배양할 경우, 인체 유래 상피세포성장인자를 배양액으로 분비시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포성장인자를 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및 (b) 상기 배양액으로부터 인체 유래 상피세포성장인자을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 세포외 분비생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포성장인자를 미생물의 주변 세포질로 분비발현시킬 수 있는 벡터에 OmpF를 코딩하는 유전자를 도입하여 제작되고, 발현시 OmpF를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어 목적단백질을 세포밖(배양액)으로 분비시킬 수 있는 특성을 가지는 재조합벡터를 제공한 다.
본 발명은 또한, 상기 재조합벡터로 형질전환된 미생물 및 상기 형질전환 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포성장인자를 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비생산 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 목적단백질의 세포밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 대장균 OmpF를 동시 발현하기 위하여 재조합 플라스미드 벡터 pACYC-OmpF를 제조하였다. 본 재조합 플라스미드는 대장균 OmpF 유전자 및 프로모터와 클로람페니콜 저항 유전자를 포함하고 p15A 오리진을 가지고 있어 대부분의 발현 벡터에서 사용되는 ColE1 오리진과 용이하게 동시 발현되도록 하였다. OmpF 유전자 및 프로모터는 대장균 BL21(DE3) 염색체로부터 PCR 방법을 이용하여 수득하였다.
다음으로 인체 유래 상피세포성장인자를 생산하고 세포외로 분비하는 형질전환된 대장균을 제조하였다. 53개의 아미노산으로 이루어진 상피세포 성장인자를 사용하여 배양액으로의 분비능을 확인하였다. 상기 단백질이 형질전환 대장균에서 배양액으로 효율적으로 분비시킴을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 인체 유래 상피세포성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 동시에 형질전환된 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비생산하는 것을 예시하였으나, 인체 유래 상피세포성장인자이외의 다른 여타 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 목적단백질을 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터에 OmpF를 코딩하는 유전자를 도입하여 제작된 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 사용하여도 목적단백질을 세포밖(배양액)으로 분비생산할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다. 뿐만 아니라, OmpF를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터 이외에, OmpF를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있도록 OmpF를 코딩하는 유전자와 그 프로모터를 크로모좀에 도입한 재조합 미생물에 상피세포 성장인자을 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 목적단백질을 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터를 도입하여 재조합 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 목적단백질을 세포밖(배양액)으로 분비생산할 수 있다는 것 역시 당업자에게 자명하다 할 것이다.
실시예
1:
OmpF
유전자 발현시스템의 개발
대장균 BL21(DE3)로부터 염색체를 분리한 다음, OmpF 유전자 및 그 프로모터 영역을 클로닝 하기 위하여, 프라이머 1 (5'-CGGAATTCTGGATTATACCGACGCAG-3': 서열번호 1)과 프라이머 2 (5'-GCGGATCCTTAGAACTGGTAAACGATAC-3': 서열번호 2)를 합성하였다. 프라이머 1과 2를 이용한 PCR을 수행하여, 2160 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 HidIII과 BamHI으로 절단한 다음, pACYC184 (New England Biolabsd, 미국)에 cloning하였다. 이를 대장균 XL1-Blue [supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'( proAB + lacI q lacZ Δ M15Tn ( tet r ))]에 형질전환하여 재조합 플라스미드 pACYC-OmpF를 수득하였다 (도 1).
실시예
2: 재조합 플라스미드
psEGF
의 제조
한국 사이토카인 은행(전라북도 전주시 전북대학교 생물과학부)으로부터 분양받은 상피세포 성장인자 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 G82를 주형 DNA(template DNA)로 이용하고, 상피세포 성장인자 (EGF: epidermal growth factor) 유전자를 확보하기 위하여 프라이머 3 (5'-GAACTGCAGCTAATAGTGACYCTGAATGTCCC-3': 서열번호 3)과 프라이머 4 (5'-GCGGATCCTTATTAGCGCAGTTCCCACCACT-3': 서열번호 4)을 합성하고, 이를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며 이후 두 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 45초간, 교 잡(annealing)은 56℃에서 45초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간씩 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장(extension)을 한번 하였다. 상기 PCR에 의해 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 증폭된 상피세포 성장인자 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하였다. 이와 동시에 재조합 플라스미드 pJS101ΔP (Choi, J.H. et al ., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 53:640, 2000)를 두 가지의 제한효소 PstI과 B amHI으로 절단하여 엔도자일라나제 유전자를 제거한 다음, 이를 앞에서 얻은 DNA 절편과 함께 섞은 후 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결시켜 재조합 플라스미드 psEGF를 수득하였다 (도 2).
실시예
3: 상피세포 성장인자의
세포외
분비 생산
대장균 BL21(DE3)에 재조합 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF를 동시에 도입하였다. 형질전환 방법으로는 electroporation 방법을 이용하였으며 형질전환 균주는 항생제 엠피실린(50μg/L)과 클로람페니콜 (34μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선택되었다. 이렇게 형질전환된 균주를 LB 액체배지(트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 상피세포성장 인자의 세포외 분비정도를 조사하였다. 액체배지에 접종한 후 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 0.1 및 1.0 mM의 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 12시간 후에 배양액 1 mL를 채취하여 Tricine SDS-PAGE (Shagger, H. and von Jogot, G., Anal . Biochem ., 166:368, 1987) 겔 상에서 분석하였다. SDS-PGAE 후 일반적인 염색 방법으로 염색한 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에서, M은 단백질 표준 분자량이고, 1은 0.1 mM IPTG로 유도발현 12시간 후에 pACYC-OmpF와 psEGA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과이며, 2는 1 mM IPTG로 유도발현 12시간 후에 pACYC-OmpF와 psEGA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 약 36kDa의 세포외막 단백질 F와 동시에 약 5kDa에 해당하는 상피세포 성장인자 단백질(화살표)을 SDS-PGAE를 통하여 확인할 수 있었다. 또한, IPTG의 농도가 1mM일 때는 약간의 세포가 lysis 됨을 확인하였으며, 0.1mM일 때는 발현양의 감소없이 세포가 lysis 되지 않음을 확인하였다. 하지만, 단백질 특성으로 푸른색으로 염색되지 않음을 확인하였다.
이에, 일반적으로 쓰이는 쿠마시블루 방법 대신 300mM CuCl2 용액으로 5분간 염색(Lee, C. et al ., Anal . Biochem ., 166:308, 1987)하여 동일한 샘플을 다시 확인하였다 (도 4). 도 4에서, M은 단백질 표준 분자량이고, 1은 0.1 mM IPTG로 유도발현 12시간 후에 pACYC-OmpF와 psEGA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3) 배양액을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 상피세포 성장인자 단백질(화살표)이 배양액으로 효율적으로 분비됨을 확인할 수 있었다. 즉, 대장균에서 상피세포 성장인자 단백질 분비가 일어났음을 알 수 있었으며, 그 양을 Bradford 방법으로 정량한 결과, 배양액에서 상피세포 성장인자 단백질이 약 0.07 g/L로 수용성 형태로 생산됨을 확인하였다.
실시예
4: 고농도 배양을 통한 상피세포 성장인자의
세포외
분비 생산
인체 유래 상피세포 성장인자 단백질을 고농도 생산을 위해 재조합 플라스미드 pACYC-OmpF와 psEGF를 동시에 가지고 있는 재조합 대장균 BL21(DE3)을 사용하였다.
상기의 형질전환 균주에 대해서 고농도 배양은 다음과 같이 수행하였으며, 형질전환 균주를 이용한 고농도 배양 및 인체 유래 상피세포 성장인자 생산시 나타나는 성장속도 및 단백질 함량에 대해서 분석하였다.
재조합 대장균의 고농도 배양에는 6.6 L 규모의 Bioflo 3000 발효조가 사용되었다. 고농도 배양에 사용한 초기 배지는 표 2와 같으며 1.8L를 제조하여 이용하였다.
[표 1] 초기배지의 성분 및 조성
| 성분 | 조성비 ( 1 liter 당) | |
| 기본배지 | (NH4)2HPO4 | 2.0 g |
| KH2PO4 | 6.75 g | |
| MgSO47H2O | 0.7 g | |
| citric acid | 0.85 g | |
| Trace metal solution* | 5 mL | |
| 첨가물 | yeast extract | 2.0 g |
| 포도당 (glucose) | 20 g | |
| 항생제 | 엠피실린 (ampicillin) | 50 mg |
| 카나마이신(kanamycin) | 25 mg |
Trace metal solution* (per L):
FeSO47H2O 10.0 g, ZnSO47H2O 2.25 g, CuSO45H2O 1.0 g, MnSO44-5H2O 0.5 g,
CaCl22H2O 2.9 g, Na2B4O710H2O 0.23 g, (NH4)6Mo7O24 0.1 g, 35% HCl 10mL
상기 표 1의 조성에서 항생제는 대장균 BL21(DE3) (pACYC-OmpF, psEGF) 의 경우 엠피실린과 클로람페니콜 두가지를 모두 사용하였다. 고농도 배양은 유가식 배양 (fed-batch)방법을 사용하였으며, 기질 공급방식은 pH의 변화에 따라 기질이 공급되는 pH-stat 방식을 취하였다. 사용한 기질은 포도당 (700 g/L), MgSO47H2O (20 g/L) 및 yeast extract (20 g/L) 혼합액을 사용하였다. pH는 6.8을 유지하였으며 pH 6.78 이하에서는 암모니아수가, pH 6.88 이상에서는 기질이 발효조의 프로그램을 통하여 자동으로 공급되었다. 발효 온도는 37℃로 유지되었으며 용존산소량 (DO)은 40%로 유지되었다. 초기 임펠러 속도는 200 rpm으로 시작하였으며 대장균의 배양에 따라 감소하는 용존산소량을 40%로 유지하기 위해 임펠러 속도를 점차적으로 1,000 rpm까지 증가하였으며 1,000 도달 이후부터는 순수산소 (pure oxygen)을 공급하였다.
고농도 세포배양을 14시간 30분 동안 수행하였을 때 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 121이고 세포건조 중량은 53.1 g/L였다 (도 5). 고농도 배양 중 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 40에 도달하였을때, IPTG를 0.1 mM 농도로 유도발현 하였다. 이후 1시간 간력으로 배양액을 모아 원심분리를 통하여 대장균을 침전시켜 제거하였다. 세포배양액으로 분비된 단백질을 확인하기 위하여 상층액 2㎕씩 취하여 실시예 3에서와 같은 방법으로 SDS- PAGE 겔 전기영동을 수행하였다. (도 6). 도 6에서 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1은 유도발현 전일때, 레인 2는 유도발현 2시간 후, 레인 3은 유도발현 3시간 후, 레인 4는 유도발현 4시간 후일때의 결과이다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 약 6 kDa 크기의 상피세포 성장인자 단백질이 세포배양액으로 분비되어 축적되고 있음을 확인할 수 있었으며 축적되는 양은 세포의 농도가 높아질수록 점점 증가하여 최종적으로 세포배양액에 존재하는 전체단백질의 30%에 해당하는 0.4 g/L의 상피세포 성장인자 단백질이 축적되어 있음을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 상피세포 성장인자를 세포배양액으로 분비하는 대장균 및 이를 이용한 상피세포 성장인자의 세포외 분비 생산방법을 제공하는 효과가 있다. 종래의 기술에 의하여 재조합 단백질을 대장균에서 세포 배양액으로 분비·생산하고자 할 때, 원하는 단백질의 분비·생산이 가능한 반면 대부분의 방법이 일정부분 대장균의 용해 (lysis)를 수반하기 때문에 세포배양액에 적지 않은 양의 대장균 세포내 단백질이 포함되게 되어 순수도가 감소하고 결국 정제과정이 어렵게 된다. 이에 반해 본 발명은 OmpF 자체 프로모터를 이용한 항시적 발현을 통하여 세포가 성장하면서 상피세포 성장인자를 동시에 발현시킴으로써, 세포 농도가 높아짐에 따라 분비생산되는 양이 함께 꾸준히 증가하는 동시에 순수한 상피세포 성장인자를 매우 효율적으로 생산하는 방식으로 종래의 기술에 비해 훨씬 간단하다. 따라서, 본 발명을 통해 다양한 상피세포 성장인자를 대장 균을 이용하여 배양액으로 분비생산할 수 있다.
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Claims (16)
- 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포 성장인자를 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터로 동시에 형질전환되고, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어, 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물.
- 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있도록 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자와 그 프로모터를 크로모좀에 도입한 재조합 미생물에 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포 성장인자를 미생물의 주변세포질로 분비발현시킬 수 있는 재조합벡터를 도입하여 수득되고, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어, 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비생산할 수 있는 특성을 가지는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 인체 유래 상피세포 성장인자을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 실질적으로 같은 조건에서 발현되는 오리진을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터는 각각 p15A 및 ColE1 오리진을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF) 자체 프로모터를 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항에 있어서, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터는 pACYC-OmpF인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자는 대장균 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 다음의 단계를 포함하는 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포외 분비생산 방법:(a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및(b) 상기 배양액으로부터 인체 유래 상피세포 성장인자를 회수하는 단계.
- 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 인체 유래 상피세포 성장인자의 세포밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자를 함유하고 상기 인체 유래 상피세포 성장인자를 미생물의 주변 세포질로 분비발현시킬 수 있는 벡터에 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자를 도입하여 제작되고, 발현시 대장균 유래 세포외막 단백질 F(OmpF)를 코딩하는 유전자와 인체 유래 상피세포 성장인자를 코딩하는 유전자가 동시에 발현되어 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포밖(배양액)으로 분비시킬 수 있는 특성을 가지는 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
- 제13항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
- 다음의 단계를 포함하는 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포외 분비생산 방 법:(a) 제13항 또는 제14항의 미생물을 배양하여 인체 유래 상피세포 성장인자를 세포 밖(배양액)으로 분비시키는 단계; 및(b) 상기 배양액으로부터 인체 유래 상피세포 성장인자를 회수하는 단계.
- 제15항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 인체 유래 상피세포 성장인자의 세포밖 분비시 미생물의 용해(lysis)를 실질적으로 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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| KR1020070000177A KR100844992B1 (ko) | 2007-01-02 | 2007-01-02 | ＯｍｐＦ와 인체 유래 상피세포성장인자의 동시 발현을통한 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020070000177A KR100844992B1 (ko) | 2007-01-02 | 2007-01-02 | ＯｍｐＦ와 인체 유래 상피세포성장인자의 동시 발현을통한 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20080063592A KR20080063592A (ko) | 2008-07-07 |
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Family Applications (1)
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| KR1020070000177A KR100844992B1 (ko) | 2007-01-02 | 2007-01-02 | ＯｍｐＦ와 인체 유래 상피세포성장인자의 동시 발현을통한 인체 유래 상피세포성장인자의 세포외 분비·생산 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100844992B1 (ko) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS64999A (en) * | 1987-06-23 | 1989-01-05 | Fujitsu Ltd | Pitch position extracting system |
| JPH024A (ja) * | 1987-02-04 | 1990-01-05 | Asahi Optical Co Ltd | カメラの自動焦点検出装置 |
| US5223407A (en) | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| KR20070009029A (ko) * | 2005-07-15 | 2007-01-18 | 한국과학기술원 | ＯｍｐＦ와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 |
-
2007
- 2007-01-02 KR KR1020070000177A patent/KR100844992B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH024A (ja) * | 1987-02-04 | 1990-01-05 | Asahi Optical Co Ltd | カメラの自動焦点検出装置 |
| JPS64999A (en) * | 1987-06-23 | 1989-01-05 | Fujitsu Ltd | Pitch position extracting system |
| US5223407A (en) | 1988-08-31 | 1993-06-29 | Allelix Inc. | Excretion of heterologous proteins from e. coli |
| KR20070009029A (ko) * | 2005-07-15 | 2007-01-18 | 한국과학기술원 | ＯｍｐＦ와 목적단백질의 동시 발현을 통한 목적 단백질의세포외 분비·생산 방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 논문 1999 |
| 논문 2004 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20080063592A (ko) | 2008-07-07 |
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