KR100283677B1 - 합성 분비 신호서열 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 합성 분비 신호서열(artificial secretory signal sequence) 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 23개의 아미노산으로 구성된 신규의 합성 분비 신호서열, 그를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균(Escherichia coli)에 도입하여 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균의 세포질 밖으로 효율적으로 분비된 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 여러 대장균 및 여러 발현 시스템에서 매우 높은 단백질 분비효율을 나타내는 바, 이러한 점을 이용하여 특정 외래 단백질을 대량생산한다면, 주변 세포질으로의 분비가 가능하기 때문에 분리 및 정제 과정에서의 경비와 시간을 상당히 줄이는 효과를 얻을 수 있어, 산업적인 측면에서 재조합 단백질의 경제적인 생산이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 재조합 플라스미드는 합성 분비 신호서열과 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 링커(linker) 없이 바로 연결할 수 있으므로, 분비되는 외래 단백질에 불필요한 아미노산이 삽입되지 않아 의료용 단백질 생산에 매우 유리할 것이다.

Description

합성 분비 신호서열 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법

본 발명은 합성 분비 신호서열(artificial secretory signal sequence) 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 신규의 합성 분비 신호서열, 그를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균(Escherichia coli)에 도입하여 형질전환체를 배양하고 발현을 유도함으로써, 재조합 대장균의 세포질 밖으로 효율적으로 분비된 외래 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

대장균은 여러 유용 단백질을 대량 생산하는데 가장 널리 이용되고 있는 숙주 세포이다. 지금까지 재조합 대장균을 이용하여 수많은 재조합 유용 단백질이 생산되어 왔으며, 유가식 배양을 통한 고농도 배양기술도 개발되어 원하는 목적 단백질을 대량생산할 수 있게 되었다(참조: Hodgson, J., Bio/Technology, 11: 887-893(1993); Lee, S.Y., Trends Biotechnol., 14:98-105(1996)).

그러나, 생산하고자 하는 유용 단백질이 대장균에서 필요 이상으로 과다 발현되었을 때, 상당수의 단백질들은 완전한 접힘(folding)을 이루지 못하고 다양한 기작에 의해 활성을 잃은 상태의 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하게 된다. 이 불용성 단백질은 초기 분리단계가 용이하여 순도가 높은 순수 단백질을 얻을 수 있는 경우도 있지만, 단백질로서의 활성을 가지지 못하므로 이로부터 생물학적 활성을 가진 수용성 단백질을 얻기 위하여서는 복잡하고도 비용이 많이 소요되는 변성(denaturation)과 재접힘(refolding) 과정이 필요하다(참조: Kane and Hartley, Trends Biotechnol., 6:95-1014(1988)).

전술한 문제점을 해결하기 위한 방법 중의 한가지로서, 재조합 대장균의 세포질 내에서 과다 생산된 유용 단백질이 세포질 내에서 불용성 봉입체로 형성되기 전에 주변 세포질(periplasm)이나 배양액으로 분비시킴으로써, 수용성의 활성 단백질을 대량 제조하려는 방법이 개발되었는 바, 이 방법은 다음과 같은 여러 가지 장점들을 가지고 있다: ① 주변 세포질이나 배지 내에는 세포질 내에 비해 상당히 적은 종류의 단백질이 존재하기 때문에, 원하는 유용 단백질의 고순도 분리 및 정제가 용이하며(참조: Nossal, N.G. et al., J. Biol. Chem., 241:3055-3062(1966)), ② 주변 세포질이나 배양액으로 분비된 유용 단백질은 대부분의 프로테아제(protease)가 존재하는 세포질로부터 분리되기 때문에, 세포질내 프로테아제에 의한 분해를 사전에 막을 수 있어 유용 단백질의 수율을 증진시킬 수 있으며(참조: Meerman, H.J. and Georgiou, G., Ann. N. Y. Acad. Sci., 721:292-302(1994)), ③ 주변 세포질은 세포질 내보다 더욱 산화된 환경이기 때문에 다이설파이드(disulfide) 결합이 훨씬 용이하게 이루어지고, 결국 생산된 단백질의 올바른 접힘이 형성됨으로써 불용성 봉입체의 형성이 현저히 줄어든다(참조: Hockney, R.C., TIBTECH., 12:456-463(1994)).

대장균에서 주변 세포질 혹은 세포 밖으로 분비되는 단백질은 특정 N-말단(N-terminal) 서열을 가지고 있는데, 이 특정 서열을 분비 신호서열이라고 명명한다. 세포질 밖으로 수송 가능한 모든 단백질은 모두 자기만을 위한 신호서열을 가지고 있으며, 이 신호서열은 세포막에서 시그널 펩티데이즈(signal peptidase)에 의해 잘려지게 된다. 따라서, 이 특정 신호서열은 대장균에서 단백질을 분비하는데 있어 필수적인 것이다.

대장균에서 분비되는 각각의 단백질이 가지는 신호서열 사이에는 많은 유사성(homology)은 없지만, 다음의 몇 가지 공통되는 특징이 있다. 즉, 각 신호서열은 약 18개 내지 30개의 아미노산으로 구성되는데, 보통 N-말단쪽에는 극성이며 양전하를 띄는 아미노산이 존재하고, 그 다음에는 알라닌이나 루이신 같은 소수성 아미노산이 주로 존재하며, 그리고 시그널 펩티데이즈에 의해 인식되고 절단되는 서열도 존재한다. 시그널 펩티데이즈가 정확하게 어느 부위를 절단하는지에 대해서는 알려진 바가 없지만, 일반적으로 알라닌-X-알라닌(X는 어떤 아미노산이나 가능) 다음을 절단하는 것으로 알려져 있다(참조: Pugsley, Microbiol. Rev., 57:50-108(1993); von Heijine, EMBO J. 3:2315-2318(1984)).

지금까지는 대장균에서 분비되지 않는 외래 단백질은 공지된 분비 신호서열을 외래 단백질의 N-말단에 연결하거나 혹은 이들 신호서열을 약간 변형시켜 연결하여 발현시킴으로써, 주변 세포질이나 배양액으로 분비시키고 있다(참조: Klein, B.K. et al., Protein Eng., 5:511-517(1992); Utsumi, S., Gene, 71:349-358(1988)). 그러나, 단백질의 분비효율은 선택된 신호서열이나 유용 단백질의 종류에 따라 많은 차이를 나타내며, 분비가 전혀 이뤄지지 않는 경우도 흔히 있다. 왜냐하면, 이제까지 사용된 신호서열은 그것이 발견되었던 원래 유전자가 코딩하는 단백질을 분비시키기에 진화적으로 최적화되었다고 볼 수 있어, 의약용 단백질 등의 외래 단백질을 생산하고자 할 때는 그 단백질에 의해서도 분비효율이 영향을 받기 때문이다. 따라서, 대상 단백질을 효율적으로 분비시킬 수 있는 보다 일반적인 분비 신호서열이 당업계에서 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 외래 단백질을 보다 효과적으로 재조합 대장균의 세포 밖으로 분비할 수 있는 신호서열에 대한 탐색을 수행한 결과, 대장균에서 분비되는단백질들이 가지는 신호서열들 사이의 상술한 공통적인 특징을 기초로 하여 23개의 아미노산을 코딩하는 69bp 염기서열의 신규 신호서열을 합성하였고, 이 신호서열을 채용한 재조합 플라스미드를 개발하여, 그 플라스미드에 목적하는 외래 단백질의 유전자를 삽입한 다음, 다양한 대장균 균주를 형질전환시켰을 때, 다량의 외래 단백질이 세포질 밖으로 효율적으로 분비되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 합성된 신규의 분비 신호서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 분비 신호서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 재조합 플라스미드에 원하는 외래 단백질의 유전자를 삽입하고 그를 대장균에 도입한 다음, 전기 형질전환체를 배양하여 발현을 유도하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에서 제조한 합성 분비 신호서열의 아미노산 서열과 DNA 서열을 나타낸다.

도 2는 재조합 플라스미드 pJSA301의 유전자 지도이다.

도 3은 재조합 플라스미드 pJSA301로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 4는 재조합 플라스미드 pJSA101의 유전자 지도이다.

도 5는 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP의 유전자 지도이다.

도 6은 재조합 플라스미드 pJSA102의 유전자 지도이다.

도 7은 재조합 플라스미드 pJSA301K의 유전자 지도이다.

도 8은 재조합 플라스미드 pJSA302K의 유전자 지도이다.

도 9는 재조합 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 10은 재조합 플라스미드 pJHlacK의 유전자 지도이다.

도 11은 재조합 플라스미드 pJSA402K의 유전자 지도이다.

도 12는 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 13은 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균 FMJ123로부터 분획한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명에서는 대장균에서 외래 단백질을 효율적으로 분비할 수 있는 새로운 신호서열을 개발하고자, 대장균에서 분비되는 공지 단백질들이 가지는 신호서열들 사이의 상술한 공통적인 특징을 기본으로 하여, 23개의 아미노산을 코딩하는 69bp 염기서열로 구성된 새로운 분비 신호서열을 합성하였다(서열번호 1 및 서열번호 2).

상기한 합성 분비 신호서열의 분비 효율을 알아보기 위하여, 각기 다른 3종류의 프로모터를 가진 하기와 같은 재조합 플라스미드를 제조하였다. 우선, 매우 강력하고 유도가능한(inducible) 프로모터인 T7 프로모터하에서의 발현 및 분비정도를 알아보기 위하여, T7 프로모터를 가진 플라스미드 pET3a(참조: Conner G.E. and Udey J.A., DNA Cell Biol., 9(1):1-9(1990))를 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여 얻어진 4.6 kb DNA 단편에, 합성 분비 신호서열을 삽입하고 외래 단백질로서 자신이 가지고 있는 신호서열을 제거한 엔도자일라나제(endoxylanase) 유전자를 삽입하여 약 5.2 kb 크기의 재조합 플라스미드 pJSA301을 제조하였다.

전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA301에서 외래 단백질로 사용된 엔도자일라나제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이용하여, 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 다른 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.

또한, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터하에서의 발현 및 분비정도를 알아보기 위하여, trc 프로모터를 가진 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann, E., Gene, 69:301-309(1988))를 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여 얻은 약 4.2 kb DNA 단편에, 합성 분비 신호서열과 엔도자일라나제 유전자를 삽입하여 약 4.8 kb 크기를 가진 재조합 플라스미드 pJSA101을 제조하였다.

전기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA101에서 외래 단백질로 사용된 엔도자일라나제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI 또는 HindIII 절단부위 중 하나를 이용하여, 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 다른 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.

이 외에도, 유도가능하고 강력한 lac 프로모터하에서의 발현 및 분비정도를 알아보기 위하여, 우선 플라스미드 pUC19(참조: Yanisch-Perron C., Vieire J. and Messing J., Gene, 33:103-119(1985))로부터 중합효소 연쇄반응에 의해 lac 프로모터와 lacI 유전자를 포함하는 약 347 bp 크기의 DNA 절편을 얻고, 이를 제한효소 NdeI과 AflIII으로 절단한 다음, 제한효소 NdeI과 AflIII로 절단한 pET3a 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 pJHlacK을 수득하였다. 이 pJHlacK 플라스미드를 제한효소 DraI과 EcoRI으로 절단하여, PstI 사이트가 내포된 엠피실린 유전자를 제거하는 대신에 카나마이신 유전자를 삽입한 다음, 합성 분비 신호서열과 알칼라인 포스파타제 유전자를 삽입하여 재조합 플라스미드 pJSA402K를 제조하였다.

이 재조합 플라스미드 pJSA402K에서 외래 단백질로 사용된 알칼라인 포스파타제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI 절단부위와 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI 절단부위를 이용하여 알칼라인 포스파타제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 다른 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.

아울러, 상기에서 제조된 재조합 플라스미드 중 pJSA301과 pJSA101의 경우, 합성 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 사이의 PstI 사이트 이외에, 플라스미드 내에 또다른 PstI 사이트가 존재하므로, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 있어 불편한 점이 있었다. 이에, 외래 단백질 유전자의 보다 용이한 삽입을 위하여, 플라스미드 내에 존재하는 또 다른 PstI 사이트를 제거하여, 재조합 플라스미드 pJSA301K와 pJSA101ΔP를 제조하였다.

전기 재조합 플라스미드 pJSA301K와 pJSA101ΔP에 존재하는 엔도자일라나제 유전자를 제거하고, 또 다른 외래 단백질로 선정된 알칼라인 포스파타제의 유전자를 삽입하여, 재조합 플라스미드 pJSA302K와 pJSA102를 제조하였다.

상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP 또는 pJSA102에서 외래 단백질로 사용된 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI 또는 XbaI 절단부위 중 하나를 이용하여, 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 다른 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.

또한, 재조합 플라스미드 pJSA301K 또는 pJSA302K에서 외래 단백질로 사용된 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제의 유전자 대신에, 다른 외래 단백질을 분비하기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI 절단부위를 이용하여, 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 다른 외래 단백질의 유전자를 삽입시킬 수 있다.

한편, 본 발명의 합성 분비 신호서열이 우수한 분비 효율을 나타내는지 확인하기 위하여, 상기에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA301, pJSA301K, pJSA302K, pJSA101, pJSA101ΔP, pJSA102, pJSA402K들을 여러 종류의 대장균에 도입하고, 각 형질전환체를 배양하여, 발현유도인자, 예를 들면 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 발현을 유도한 다음, 배양액을 일정량 채취하여 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 각각 분획하였다. 이때, 외래 단백질로서 알칼라인 포스파타제가 사용된 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균은, 알칼라인 포스파타제가 대장균에서 발현되어 주변 세포질로 분비될 때에만 효소 활성을 갖는다(참조: Manoil, C. et al., Science, 233:1403-1408(1986))는 점을 고려하여, 알칼라인 포스파타제의 활성도를 측정하여 분비 정도를 확인하였다. 전기한 분획 단백질들은 SDS-PAGE(sodium-dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 겔 전기영동으로 분석한 결과, 본 발명의 합성 분비 신호서열을 이용하여 외래 단백질을 분비 생산할 경우, 전체적으로 그 분비 효율이 매우 우수하였다.

종래의 분비 신호서열을 가진 외래 단백질을 강한 프로모터를 사용하여 다량 발현시킬 경우, 일반적으로 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 사이에 링커(linker)를 두어 전기 두가지를 서로 연결시킨다. 그러나, 전술한 본 발명의 재조합 플라스미드는 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위에 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 링커없이 직접 연결시킴으로써, 합성 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자 서열에 변화를 초래하지 않는다. 이때, 분비 신호서열과 외래 단백질의 유전자를 연결시킬 경우, 외래 단백질 유전자의 5'-말단은 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI 절단부위와 직접 연결되도록 하는 PstI 절단부위 이외에도, 또 다른 제한효소 BsaI, BbsI, BbvI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, SfaNI 등을 사용하여도 유전자 서열의 변화없이 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 바로 연결가능하도록 유전자 조작을 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 재조합 플라스미드는 분비하고자 하는 단백질의 N-말단에 링커에 해당하는 아미노산의 첨가없이, 도입한 외래 단백질만을 분비할 수 있는 장점이 있는 바, 이는 산업적으로 유용한 단백질의 생산에 매우 유효하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 플라스미드 pJSA301, pJSA101, pJSA101ΔP, pJSA102, pJSA301K, pJSA302K, pJSA402K는 외부 유전자로서 하기 실시예에서 기술하고 있는 엔도자일라나제 유전자 또는 알칼라인 포스파타제 유전자 뿐만 아니라, 각종 외래 단백질의 유전자를 도입하여 그의 발현에 이용될 수 있다. 따라서, 외래 단백질의 유전자로서 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제 유전자가 삽입된 전술한 각 재조합 플라스미드 뿐만 아니라, 그들 재조합 플라스미드에 각종의 다른 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드도 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.

실시예 1: 신규한 분비 신호서열의 합성

원하는 단백질을 고효율로 세포 밖으로 분비시키기 위하여, 새로운 합성 분비 신호서열을 다음과 같이 제조하였다. 우선, 대장균에서 분비되는 단백질들이 가지는 신호서열들 사이의 공통적인 특징 즉, 약 18개 내지 30개의 아미노산으로 구성되는 신호서열의 N-말단쪽에는 극성이며 양전하를 띄는 아미노산이 존재하고, 그 다음에는 알라닌이나 루이신 같은 소수성 아미노산이 주로 존재하며, 그리고 시그널 펩티데이즈에 의해 인식되고 절단되는 서열(시그널 펩티데이즈가 일반적으로 알라닌-X-알라닌(X는 어떤 아미노산이나 가능) 다음을 절단)도 존재한다는 점에 근거하여, N-말단쪽에는 라이신과 같이 양전하를 띠는 아미노산이, 중간 부분에는 루이신이나 알라닌과 같이 소수성 아미노산이, C-말단쪽에는 Ala-Ser-Ala으로 구성된 아미노산 서열이 존재하도록, 신규의 분비 신호서열을 디자인하였다. 이렇게 디자인된 분비 신호서열의 아미노산 서열(서열번호 1) 및 염기서열(서열번호 2) 은 도 1에 나타내었다.

이와 같은 서열을 가진 DNA 단편은 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하였다.

상기의 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡(annealing)은 52℃에서 45초간, 연장(extension)은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 약 90bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 NdeI과 PstI으로 절단하여 약 69bp의 DNA 절편을 얻었다.

도 1에서 보듯이, 상기와 같이 증폭된 합성 분비 신호서열은 23개의 아미노산을 코딩하는 69bp DNA 서열로 구성되어 있으며, G+C 구성비는 65%이었다. 또한, Ala-Ser-Ala 순서로 구성되어 있는 뒷부분은 분비시키고자 하는 단백질과 연결하는 부분이며, 그 DNA 서열은 GCG TCT GCA로 구성되어 있다. 여기에는 제한효소 PstI 사이트(CTGCAG)가 존재하며, 이 사이트를 이용하여 합성 분비 신호서열의 변화 없이 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자와 링커없이 직접 결합할 수 있게 하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드 pJSA301의 제조

실시예 1에서 합성한 분비 신호서열의 유전자가 우수한 분비효율을 나타내는지 알아보기 위하여, 전기 신호서열 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 다음과 같이 제조하였다.

먼저, 발현 대상 단백질로 선정된, 고초균(Bacillus subtilis)에서 유래된 560kb의 엔도자일라나제(endoxylanase) 유전자를 얻기 위하여, 재조합 플라스미드 pKJX4(참조: Jeong, et al., Enzyme Micob. Technol., 22:599-605(1998))를 주형 DNA(template DNA)로, 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 48℃에서 45초간, 연장은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 약 650 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 BsaI과 BamHI으로 절단하여 약 495 bp DNA와 155 bp DNA 절편을 얻었다. 이와는 별도로, 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A(참조: Amann, Gene, 69:301-309(1988))는 두 가지의 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하였다.

상기에서 절단된 플라스미드 pTrc99A에 상기의 두가지 DNA 절편들(495 bp DNA 절편과 155 bp DNA 절편)을 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJS101를 제조하고, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션(electroporation) 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 항생제 엠피실린(ampicillin, 50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pJS101 재조합 플라스미드를 수득하였다(참조: 대한민국 특허출원 제 98-56563호). 이렇게 얻어진 pJS101 재조합 플라스미드를 두 가지 제한 효소 PstI과 BamHI으로 절단하여, 약 560 bp 크기를 가진 DNA 절편을 얻었는데, 이는 자신이 가지고 있는 분비 신호서열이 제거된 성숙(mature) 형태의 엔도자일라나제 유전자이었다.

상기에서 얻은 약 560 bp 엔도자일라나제 유전자, 및 실시예 1에서 합성한 분비 신호서열을 두가지 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여 얻은 약 69 bp의 DNA 절편을, 유도가능하고 강력한 T7 프로모터를 가지고 있는 플라스미드 pET3a(참조: Conner G.E. and Udey J.A., DNA Cell Biol., 9(1):1-9(1990))를 두 가지의 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여 얻은 DNA 단편에 삽입한 다음, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 새로운 합성 분비 신호서열이 포함된 약 5.2 kb 정도의 크기를 가진 재조합 플라스미드 pJSA301를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA301의 유전자 지도는 도 2에 나타내었다.

실시예 3: 재조합 플라스미드 pJSA301로 형질전환된 재조합 대장균의 단백질 분비능 비교

실시예 2에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA301로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)[F- ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene]에서 엔도자일라나제의 분비능을 알아보고자 하였다. T7 프로모터를 이용하여 단백질을 발현시킬 경우, 대장균 BL21(DE3)과 같이 T7 RNA 중합효소유전자가 염색체에 삽입되어 있거나, 다른 형태로 발현 가능하도록 존재하는 대장균을 숙주세포로 이용하여야 한다. T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되므로, pJSA301로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 경우 다음과 같이 분비능을 알아보았다.

전기 재조합 대장균들을 LB 액체 배지 50 mL가 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, pJSA301 재조합 플라스미드는 T7 프로모터를 가지고 있으므로 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였는데, 이는 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다.

유도발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 1 mL씩을 채취하여, 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 다음과 같이 각각 분획하였다: 전체 단백질은 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물을 0.5 mL TE 완충용액(1 mM EDTA를 포함한 10 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 한번 세척한 다음, 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 그를 0.2 mL TE 완충용액에 현탁하여 초음파 파쇄함으로써 제조하였다.

주변세포질 단백질 및 세포질 단백질을 제조하기 위하여, 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물에 20% 수크로스를 포함한 30 mM Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액을 0.4 mL 넣고 충분히 섞어준 후, 1 mM EDTA를 첨가하여 약 10분 동안 상온에서 교반하였다. 이어, 다시 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 차가운 5 mM MgSO₄용액을 0.4 mL 넣어 조심스럽게 섞은 후 얼음 속에서 약 10분 동안 교반한 다음, 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 및 침전물을 각각 취하였다. 이때, 상층액은 세포의 주변 세포질에 있는 단백질로 하였으며, 침전물은 0.2 mL TE 완충용액에 현탁하고 초음파 파쇄하여 세포질 단백질로 하였다(참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(1989)).

상기에서 얻은 단백질 함유 용액을 64㎕씩 취하여 SDS-PAGE 샘플 버퍼(25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올 및 0.1% 브로모페놀블루(bromophenol blue)를 포함한 60 mM Tris-HCl) 16㎕와 혼합하고 10분간 끓인 다음, 이를 12% 분리용 겔(separating gel)에서 SDS-PAGE 겔 전기영동하였다. 이어, 겔을 염색 용액(메탄올 40%, 아세트산 10% 및 쿠마시에 브릴리언트 블루 R(Coomassie brilliant blue R) 0.25 g/L으로 구성된 용액)에 2시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액(메탄올 40% 및 아세트산 7%로 구성된 용액)에 2시간 이상씩 두 번 담가두어 탈색하였다(참조: 도 3).

도 3에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20kDa, 14kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 내지 4는 pJKX4 플라스미드로 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질, 세포질 단백질 및 주변세포질 단백질을 각각 나타내며; 레인 5는 형질전환되지 않은 대장균 BL21(DE3)의 전체 단백질을 나타내고, 레인 6 내지 8은 pJSA301 플라스미드로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)의 전체 단백질, 세포질 단백질 및 주변세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 엔도자일라나제 단백질을 나타낸다.

도 3에서 보듯이, 본 발명에서 합성한 신호서열을 이용하여 분비된 엔도자일라나제는 자신이 가지고 있던 신호서열을 이용하여 분비된 엔도자일라나제와 그 위치가 동일하며, 분비능은 오히려 더 높음을 알 수 있었다.

상기 SDS-PAGE 겔 전기영동 결과는 덴시토메터(densitometer; ImageMaster^TM, Pharmacia Biotech, Sweden)를 이용한 단백질의 정량에 이용하였으며, 그 정량 결과로부터 엔도자일라나제의 분비 정도(분비 신호서열이 절단된 성숙 엔도자일라나제의 함량)를 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.

재조합 플라스미드 pJSA301로 형질전환된 대장균에서 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량

형질전환된 대장균	전체 단백질 중에서 분비된 엔도자일라나제단백질의 함량
BL21(DE3)	5.30%

상기 표 1에서 보듯이, T7 프로모터 조절하에 본 발명의 합성 분비 신호서열을 이용하여 엔도자일라나제 단백질을 분비 생산할 경우, 그 분비 효율이 5.30%임을 알 수 있는데, 이는 도 3에서 보는 바와 같이 자신이 가지고 있는 프로모터의 분비 신호서열을 이용한 분비 효율과 비교하면 매우 높은 편이다. 그러나, 주변세포질 분획에 내포된 엔도자일라나제 단백질 함량은 상대적으로 적은 편인데, 이는 주변세포질 분획 방법의 효율에 원인을 둘 수 있다. 본 실험에 사용한 주변세포질 분획방법은 가장 일반적으로 사용되는 방법으로, 이는 목적의 단백질이 주변세포질에 수용성 상태로 존재할 때 이를 쉽게 분획하기 위한 방법이며, 만약 상대적으로 크기가 커진 불용성 봉입체로 존재하는 단백질이라면 본 방법으로 분획하기에는 효율이 매우 떨어진다. 즉, 실제 엔도자일라나제가 분비되어 주변세포질에 존재는 하지만 이들이 불용성 응집체를 형성함으로써, 본 주변세포질 분획방법으로는 분비된 대부분의 엔도자일라나제가 분획되지 않아, 주변세포질 분획에 내포된 단백질의 함량이 적게 나타났다. 일반적으로, 분비 신호서열을 가진 단백질을 강한 프로모터를 사용하여 다량 발현시킬 경우, 세포의 성장이 매우 저해되거나 경우에 따라서 죽는 경우도 많은데, 이에 비하면 상술한 5.30%의 분비 효율은 매우 높은 수치임을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 합성 분비 신호서열은 재조합 외래 단백질의 분비 생산에 매우 유용함을 확인하였다.

실시예 4: 재조합 플라스미드 pJSA101의 제조

재조합 플라스미드 pJSA101을 제조하기 위하여, 우선 유도가능하고 강력한 trc 프로모터를 갖고 있는 플라스미드 pTrc99A를 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단하여, 약 4.2 bp DNA 절편을 수득하였다.

이와는 별도로, 본 발명의 합성 분비 신호서열과 대상 단백질로 선정된 엔도자일라나제 유전자를 얻기 위하여, 재조합 플라스미드 pJSA301을 주형 DNA로, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하는 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 48℃에서 45초간, 연장은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여 약 635 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 BsaI과 BamHI으로 절단하여 약 480 bp DNA와 155 bp DNA 절편을 얻었다. 이 DNA 절편은 신규 합성 분비서열과 대상 단백질인 엔도자일라나제가 제한효소 PstI에 의해 연결되어 있다.

상기에서 절단된 플라스미드 pTrc99A에 상기의 두가지 DNA 절편들(480 bp DNA 절편과 155 bp DNA 절편)을 클로닝하여, 재조합 플라스미드 pJSA101을 제조하고, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 항생제 엠피실린(50㎍/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 pJSA101 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA101의 유전자 지도는 도 4에 나타내었다.

실시예 5: 재조합 플라스미드 pJSA101로 형질전환된 재조합 대장균의 단백질 분비능 비교

실시예 4에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA101로 형질전환된 대장균 XL1-Blue[supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi relA1 lacF'(proAB⁺lacI^qlacZΔM15Tn(tet^r))], 대장균 MC4100[F^-araD139 Δ(argF^-lac)U169 rpsL150(str^r) relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25 rbsR], 대장균 BL21(DE3) 및 대장균 TG1[F' traD36 lacI_qΔ(lacZ)M15 proA⁺B⁺/supEΔ(hsdM^-mcrB)5(r_k ^-m_k ^-McrB^-) thiΔ(lac-proAB)]에서 엔도자일라나제의 분비능을 알아보고자 하였다. trc 프로모터 역시 IPTG에 의해서 유전자 발현이 유도되므로, pJSA101로 형질전환된 대장균들의 경우도 전기 실시예 3과 동일한 조건에서 재조합 균주를 배양하여, 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량을 분석하였다(참조: 표 2).

재조합 플라스미드 pJSA101로 형질전환된 대장균에서 분비된 엔도자일라나제 단백질의 함량

형질전환된 대장균	전체 단백질 중에서 분비된 엔도자일라나제단백질의 함량
XL1-Blue	0.76%
TG-1	0.54%
BL21(DE3)	1.57%
MC4100	0.50%

상기 표 2에서 보듯이, 분비하고자 하는 단백질을 본 발명의 신호서열을 이용하여 trc 프로모터하에서 분비 생산할 경우, 그 분비 효율은 전체적으로 0.50% 내지 1.57%로서 그다지 우수하다고 할 수는 없지만, 본 발명의 합성 분비 신호서열이 목적하는 외래 단백질을 분비시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6: 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP의 제조

실시예 4에서 제조한 pJSA101 재조합 플라스미드는 본 발명의 합성 분비 신호서열과 대상 단백질로서 사용된 엔도자일라나제 유전자가 제한 효소 PstI 사이트에 의해서 연결되어 있다. 이 재조합 플라스미드 pJSA101에서 대상 단백질을 제거시키고 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키기 위해서는 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI과 대상 단백질 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI, HindIII 중 어느 하나의 제한 효소로 플라스미드를 절단하고 삽입시킬 유전자를 연결시키면 된다. 그러나, 도 4의 유전자 지도에서 보듯이, pJSA101 재조합 플라스미드의 경우 분비 신호서열과 대상 단백질 유전자의 3'-말단에 각각 1개씩의 PstI 절단부위가 존재하기 때문에, 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 많은 불편이 초래된다.

이를 보다 간편하게 하기 위해서, 재조합 플라스미드 pJSA101은 제한효소 XbaI과 HindIII로 절단한 후에 DNA 폴리머라제(polymerase) I을 이용하여 평활말단화(blunt end)하고, T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP를 제조하고, 전기 재조합 플라스미드를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린 50μg/L이 첨가된 LB 평판배지에서 선별되었고, 이로부터 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP의 유전자 지도는 도 5에 나타내었다.

상기의 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 대장균 XL1-Blue/pJSA101 delta P(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA101 delta P)라 명명하고, 그를 1998년 11월 27일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0559BP로 기탁하였다.

전기 pJSA101ΔP 재조합 플라스미드는 매우 쉽게 분비하고자 하는 단백질 유전자를 삽입시킬 수 있다. 이 벡터에 사용된 신규의 합성 분비 신호서열의 3'-말단에는 제한 효소 PstI 사이트가 존재하며, 이 사이트 뒤에 분비코자 하는 단백질 유전자를 연결시킨다. 이렇게 연결될 경우, 합성 분비 신호서열과 분비하고자 하는 단백질의 유전자 서열 변화없이 직접 연결할 수 있다. 따라서, 분비하고자 하는 대상 단백질을 분비 발현벡터 pJSA101ΔP에 삽입하기 위해서는, 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 있는 제한 효소 PstI 사이트와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI 사이트 중 하나를 절단하여 엔도자일라나제 유전자를 제거한 후, 분비하고자 하는 외래 단백질을 삽입하면 된다. 이때, 신규 합성 분비서열의 3'-말단에 존재하는 PstI 사이트에 외래 단백질을 삽입할 때, PstI 제한효소 뿐만 아니라 BsaI, BbsI, BbvI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, SfaNI 제한효소를 사용하여도 서열 변화 없이 바로 연결시킬 수 있다.

실시예 7: 재조합 플라스미드 pJSA102의 제조

대장균의 알칼라인 포스파타제 유전자를 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자로 사용하여 발현시키기 위하여, 우선 대장균이 갖고 있는 알칼라인 포스파타제 유전자를 다음과 같이 확보하였다. 즉, 대장균 K-12로부터 유도된(derived) 대장균 W3110(λ^-, F^-, 원영양균(prototroph))의 염색체(chromosomal DNA)를 주형 DNA로, 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

상기의 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 52℃에서 45초간, 연장은 72℃에서 1분 10초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.

이와 같은 중합효소 연쇄반응 방법으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 알칼라인 포스파타제 유전자를 포함한 약 1360 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두가지의 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하였다. 이어, 실시예 6에서 제조된 플라스미드 pJSA101ΔP를 두가지의 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하여 엔도자일라나제 유전자를 제거한 다음, 전기에서 절단된 알칼라인 포스파타제 유전자 함유의 DNA 절편을 T4 DNA 리가아제로 연결시켜 재조합 플라스미드 pJSA102를 제조하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA102의 유전자 지도는 도 6에 나타내었다.

실시예 8: 재조합 플라스미드 pJSA102로 형질전환된 재조합 대장균에서 생산 된 알칼라인 포스파타제의 활성도 측정

실시예 7에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA102로 형질전환된 각각의 대장균 XL1-Blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 HB101, 대장균 FMJ123[W1485, Δpfl::cam], 대장균 DC1368[thr-1 leu-6 thi-1 LacY tonA22 rpsL Δpfl::Cam Δldh::kan]에서 알칼라인 포스파타제의 분비능을 후술하는 바와 같이 알아보고자 하였다.

즉, 재조합 플라스미드 pJSA102를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 전기의 5가지 대장균에 도입한 다음, 형질전환된 대장균 균주는 엠피실린 50μg/L이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이어, 각각의 형질전환 균주에서 알칼라인 포스파타제의 분비능이 우수한 균주를 선별하기 위하여, BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)(10 mg/mL)가 첨가된 LB 평판배지에 각 균주를 도말한 다음, 37 ℃ 항온 배양기에서 14시간 배양하였다. 이때, 만약 알칼라인 포스파타제가 발현되고 주변 세포질로 분비되었다면 효소활성을 갖게 되며, 이는 평판배지에 포함되어 있는 BCIP를 분해하여 푸른색을 띄게 된다. 즉, 분비능이 우수한 균주일수록 푸른색이 더 진하게 나타나게 되므로, 각 형질전환 균주에서 분비능이 우수한 균주만을 선별할 수가 있었다. 이 방법을 이용하여 각 형질전환 균주에서 분비능이 우수한 균주 2개씩을 선별하였으며, 각각을 다시 LB 액체배지에 접종하여 알칼라인 포스파타제의 활성을 측정함으로써 알칼라인 포스파타제의 분비정도를 알아보았다.

알칼라인 포스파타제의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다(참조: E. Brickman and J. Beckwith, J. Mol. Biol., 96:307-316(1975)). 즉, 플라스미드 pJSA102로 형질전환된 재조합 대장균 각각을 50 mL LB 액체 배지가 담겨있는 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 그런 다음, 분광광도계로 600nm 파장에서 측정한 광학밀도(O.D.)가 0.7일 때, 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유전자 발현을 유도하였으며, 유도 발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 0.1 mL씩을 채취하고, 4℃ 및 6,000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액은 버리고 균주만을 취하였다.

전기에서 수득한 대장균은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액 1 mL에 현탁시키고, 여기에 클로로포름 0.1 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 0.4 % PNPP(p-nitrophenyl phosphate) 0.1 mL를 첨가하고 다시 37℃에서 5분간 반응시킨 다음, 1M K₂HPO₄용액 0.1 mL로 반응을 정지시키고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 이 상층액은 50 mM Tris-HCl 용액으로 희석시키고 분광광도계로 420nm와 550nm의 두 파장에서 흡광도를 측정하였다. 알칼라인 포스파타제의 활성도(U/mL)는 다음과 같은 계산식에 의해 산출하여, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다:

상기에서, 대조구는 플라스미드 pJSA102로 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue, 대장균 BL21(DE3), 대장균 HB101, 대장균 FMJ123, 대장균 DC1368의 배양액을 전술한 바와 같은 방법으로 처리하여 측정한 알칼라인 포스파타제의 활성으로 하였다.

각 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제의 활성도

재조합 대장균	알칼라인 포스파타제 활성도 (U/mL)
대장균 HB101	1.4
pJSA102로 형질전환된 대장균 HB101	504.41
대장균 XL1-Blue	4.13
pJSA102로 형질전환된 대장균 XL1-Blue	1877.23
대장균 BL21(DE3)	1.57
pJSA102로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)	943.26
대장균 FMJ123	5.45
pJSA102로 형질전환된 대장균 FMJ123	1361.82
대장균 DC1368	1.94
pJSA102로 형질전환된 대장균 DC1368	912.90

상기 표 3에서 보듯이, 플라스미드 pJSA102로 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제들은 모두 높은 활성을 나타냈으며, 형질전환되지 않은 대장균들은 거의 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 알칼라인 포스파타제는 세포내에서는 활성을 갖지 못하고 반드시 주변 세포질로 분비되어야만 활성을 갖게 되는 점을 감안하여 볼 때, 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제는 주변 세포질로의 분비가 성공적으로 일어났음을 알 수 있으며, 그 분비효율 역시 우수함을 알 수 있었다.

실시예 9: 재조합 플라스미드 pJSA301K의 제조

전기한 실시예 2에서 제조된 재조합 플라스미드 pJSA301에는 본 발명의 합성 분비 신호서열과 대상 단백질로서 사용된 엔도자일라나제 유전자가 제한효소 PstI 사이트에 의하여 연결되어 있다. 이 재조합 플라스미드 pJSA301에서 대상 단백질을 제거시키고 분비코자 하는 외래 단백질 유전자를 삽입시키기 위해서는 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI과 대상 단백질의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI로 절단한 후, 외래 유전자를 연결시키면 된다.

그러나, 플라스미드 pJSA301의 유전자 지도(참조: 도 2)에서 보듯이, 플라스미드 pJSA301에는 선택표지(selection marker)인 엠피실린 코딩 유전자 내에 제한효소 PstI 사이트가 존재하기 때문에, 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키는데 많은 불편이 따른다. 이를 보다 간편하게 하기 위하여, 재조합 플라스미드 pJSA301내에 있는 엠피실린 코딩 유전자를 제한효소 EcoRI과 DraI으로 절단하여 선택표지가 없는 약 3513 bp 길이의 DNA 절편을 수득하였다. 여기에 제한효소 PstI 사이트가 없는 다른 선택표지인 카나마이신(kanamycin) 유전자를 삽입시켰다. 이때, 카나마이신 유전자는 플라스미드 pACYC177(참조: Chang, A.C.Y. and Cohen, S.N., J. Bacteriol., 134:1141-1156(1978))를 주형 DNA로, 서열번호 11 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 수득하였다.

상기의 중합효소 연쇄반응에서, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 51℃에서 50초간, 연장은 72℃에서 50초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 930 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였다.

전기 약 930 bp DNA 절편을 두 가지 제한효소 EcoRI과 DraI으로 절단한 후, 상기에서 얻은 약 3513 bp의 DNA 절편에 연결시킨 다음, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하였다. 이렇게 형질전환된 균주는 항생제 카나마이신(10 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였고, 이로부터 pJSA301K 재조합 플라스미드를 수득하였으며, 그의 유전자 지도는 도 7에 나타내었다. 결국, 합성 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한효소 PstI과 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한효소 BamHI으로 재조합 플라스미드 pJSA301K를 절단하고, 분비코자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시키면 된다.

실시예 10: 재조합 플라스미드 pJSA302K의 제조

알칼라인 포스파타제 유전자를 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자로 사용하여 발현시키기 위하여, 실시예 7에서 수득한 약 1360 bp의 알칼라인 포스파타제 유전자는 두 가지 제한효소 PstI과 BamHI으로 절단하고, 이와는 별도로 실시예 9에서 제조한 재조합 플라스미드 pJSA301K 역시 전기 제한효소로 절단한 다음, 이 둘을 함께 섞은 후 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결시켜, 재조합 플라스미드 pJSA302K를 제조하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA302K의 유전자 지도는 도 8에 나타내었다.

실시예 11: 재조합 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 재조합 대장균에서의 알칼라인 포스파타제의 분비능 비교

실시예 10에서 제조된 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)에서 분비되는 알칼라인 포스파타제의 정도를 알아보기 위하여, 플라스미드 pJSA302K를 대장균 BL21(DE3)에 도입하고, 형질전환 균주를 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이어, 상기 실시예 8과 동일한 방법으로 그 형질전환 균주를 BCIP가 첨가된 LB 평판배지에 배양하여, 알칼라인 포스파타제의 분비능이 우수한 균주를 선별한 다음, 다시 LB 액체배지에 접종하여 알칼라인 포스파타제의 분비정도를 알아보았다. 또한, 유도 발현 후 4시간 후에 배양액 1 mL씩을 채취하여, 상기 실시예 3의 방법에 따라 전체 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 각각 분획하였다.

도 9는 재조합 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 9에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20kDa, 14kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 BL21(DE3)의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2 내지 4는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 세포질 단백질, 주변세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다. 도 9에서 보듯이, 대장균 내에서 분비작용이 일어난 후 분비 신호서열이 절단된 크기에 해당하는 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 주변세포질 분획에서 수득되었으며, 또한 분비 생산된 대부분의 알칼라인 포스파타제는 불용성 봉입체 형태로 존재하지 않고 수용성 단백질로서 존재하였다. 아울러, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 덴시토메터를 이용하여 결정하였는 바, 그 비율은 약 33.67%이었다. 따라서, 본 발명의 합성 분비 신호서열은 외래 단백질인 알칼라인 포스파타제를 매우 효율적으로 세포 밖으로 분비시킴을 확인하였다.

상기의 재조합 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 대장균 XL1-Blue/pJSA302K(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA302K)라 명명하고, 그를 1998년 11월 27일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0558BP로 기탁하였다.

실시예 12: 재조합 플라스미드 pJHlacK의 제조

lac 프로모터 하에서 발현되는 본 발명의 합성 분비서열을 가진 단백질의 분비능을 알아보기 위하여, lac 프로모터를 가진 재조합 플라스미드 pJHlacK를 제조하였다. 먼저, lac 프로모터와 lac 프로모터를 보다 효율적으로 조절하기 위한 lacI 유전자를 다음과 같은 방법으로 얻었다: lac 프로모터와 lacI 유전자를 가지고 있는 플라스미드 pUC19(참조: Yanisch-Perron C., Vieire J. and Messing J., Gene, 33:103-119(1985))를 주형 DNA로, 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때, 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간 1회 수행하였고; 이후 두 번째 변성은 94℃에서 45초간, 교잡은 50℃에서 50초간, 연장은 72℃에서 1분 10초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였고; 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. 이와 같은 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 347 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지 제한효소 NdeI과 AflIII으로 절단하였다. 이와는 별도로, pET3a 플라스미드를 NdeI과 AflIII로 절단하여 2438 bp의 DNA 절편을 얻었다.

전기 두 DNA 절편 즉, 약 347 bp 크기의 DNA 절편 및 2438 bp의 DNA 절편을연결시켜 약 2765 bp의 재조합 플라스미드 pJHlac을 수득하였다. 이 pJHlac 플라스미드 역시 선택 표지인 엠피실린 유전자에 PstI 사이트가 존재하므로, 상기 실시예 9와 동일한 방법으로 다른 선택표지인 카나마이신 유전자를 삽입하였다. 즉, pJHlac 재조합 플라스미드를 제한효소 DraI과 EcoRI으로 절단하고, 실시예 9에서 중합효소 연쇄반응을 이용하여 수득한 카나마이신 유전자를 제한효소 EcoRI과 DraI으로 절단하여 얻은 절편과 혼합하여, T4 DNA 리가아제로 연결시키고 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 형질전환 균주는 항생제 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였고, 이로부터 약 2.7kb의 크기를 가진 pJHlacK 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJHlacK의 유전자 지도는 도 10에 나타내었다.

실시예 13: 재조합 플라스미드 pJSA402K의 제조

실시예 12에서 제조한 재조합 플라스미드 pJHlacK를 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단하여 얻은 약 2528 bp의 DNA 절편, 실시예 1에서 제한효소 NdeI과 PstI으로 절단하여 얻은 약 69 bp의 합성 분비 신호서열의 DNA 절편, 실시예 7에서 얻은 약 1360 bp의 알칼라인 포스파타제 유전자를 두 가지 제한 효소 PstI과 BamHI으로 절단하여 얻은 DNA 절편을 혼합하여, T4 DNA 리가아제로 연결시키고, 이를 일렉트로포레이션 방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 형질전환하였다. 형질전환 균주는 항생제 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였고, 이로부터 pJSA402K 재조합 플라스미드를 수득하였다. 이 재조합 플라스미드 pJSA402K의 유전자 지도는 도 11에 나타내었다.

실시예 14: 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균에서의 알칼라인 포스파타제의 분비능 비교

실시예 13에서 제조된 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균에서 분비되는 알칼라인 포스파타제의 정도를 알아보기 위하여, 플라스미드 pJSA402K를 대장균 FMJ123[W1485, Δpfl::cam], 대장균 XL1-Blue에 각각 도입하고, 형질전환 균주를 카나마이신(10μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. 이어, 상기 실시예 11과 동일한 방법으로 전체 단백질을 제조하여, 알칼라인 포스파타제의 분비정도를 알아보았다.

도 12는 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균 XL1-Blue로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 12에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20kDa, 14kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 XL1-Blue의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질을 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.

도 12에서 보듯이, 대장균 내에서 분비작용이 일어난 후 분비 신호서열이 절단된 크기에 해당하는 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제를 확인할 수 있었다. 만약, 알칼라인 포스파타제가 분비되지 않았다면, 알칼라인 포스파타제에 붙어 있는 합성 분비 신호서열이 절단되지 않으므로 50 kDa보다 3 kDa 정도 크기가 더 큰 단백질이 분석될 것이다. 아울러, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 덴시토메터를 이용하여 결정하였는 바, 그 비율은 약 8.51%이었다.

상기의 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 대장균 XL1-Blue는 대장균 XL1-Blue/pJSA402K(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA402K)라 명명하고, 그를 1998년 11월 27일 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 0557BP로 기탁하였다.

도 13은 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균 FMJ123로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 겔 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 13에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량(66kDa, 45kDa, 36kDa, 29kDa, 24kDa, 20kDa, 14kDa)을 나타내며, 레인 1은 형질전환되지 않은 대장균 FMJ123의 전체 단백질을 나타내고, 레인 2는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질을 나타낸다. 또한, 화살표( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.

도 13에서 보듯이, 약 50 kDa 크기의 알칼라인 포스파타제의 발현을 확인할 수 있었다. 이 크기의 알칼라인 포스파타제는 분비된 형태로서, 만약 알칼라인 포스파타제가 분비되지 않은 형태로 발현되었다면 합성 분비 신호서열이 절단되지 않았을 것이며, 결국 발현된 알칼라인 포스파타제의 크기가 약 5.3 kDa 정도의 크기로 확인될 것이다. 아울러, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 덴시토메터를 이용하여 결정하였는 바, 그 비율은 약 10.25%이었다.

따라서, 본 발명의 합성 분비 신호서열은 lac 프로모터하에서 발현되는 외래 단백질인 알칼라인 포스파타제를 매우 효율적으로 세포 밖으로 분비시킴을 확인하였다.

실시예 15: 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균에서 생 산된 알칼라인 포스파타제의 활성도 측정

상기 실시예 14에서 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성은 실시예 8과 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

각 재조합 대장균에서 분비된 알칼라인 포스파타제의 활성도

재조합 대장균	알칼라인 포스파타제 활성도 (U/mL)
대장균 XL1-Blue	2.49
pJSA402K로 형질전환된 대장균 XL1-Blue	1005.28
대장균 FMJ123	3.12
pJSA402K로 형질전환된 대장균 FMJ123	1286.97

상기 표 4에서 보듯이, 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제들은 모두 높은 활성을 나타냈으며, 형질전환되지 않은 대장균들은 거의 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 알칼라인 포스파타제는 세포내에서는 활성을 갖지 못하고 반드시 주변 세포질로 분비되어야만 활성을 갖게 되는 점을 감안하여 볼 때, 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제는 주변 세포질로의 분비가 성공적으로 일어났음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 23개의 아미노산으로 구성된 신규의 합성 분비 신호서열, 그를 포함한 재조합 플라스미드 및 전기 플라스미드를 이용한 외래 단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 재조합 플라스미드는 여러 대장균 및 여러 발현 시스템에서 매우 높은 단백질 분비효율을 나타내는 바, 이러한 점을 이용하여 특정 외래 단백질을 대량생산한다면, 주변 세포질으로의 분비가 가능하기 때문에 분리 및 정제 과정에서의 경비와 시간을 상당히 줄이는 효과를 얻을 수 있어, 산업적인 측면에서 재조합 단백질의 경제적인 생산이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 재조합 플라스미드는 합성 분비 신호서열과 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 링커(linker) 없이 바로 연결할 수 있으므로, 분비되는 외래 단백질에 불필요한 아미노산이 삽입되지 않아 의료용 단백질 생산에 매우 유리할 것이다.

(서열목록)

〈110KR〉 한국과학기술원

〈110〉 Korea Advanced Institute of Science and Technology

〈120KR〉 합성 분비 신호서열 및 그를 이용한 외래 단백질의 제조방법

〈120〉 Artificial Secretory Signal Sequence and A Process for Preparing Heterologous Proteins by Employing the Same

〈160〉 14

〈210〉 1

〈211〉 23

〈212〉 PRT

〈220〉

〈221〉 sig_-peptide

〈400〉 1

Met Lys Lys Ala Lys Leu Leu Ala Leu Leu Val Ala Leu Ala Val

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ser Thr Ala Ser Ala

20

〈210〉 2

〈211〉 69

〈212〉 DNA

〈220〉

〈221〉 sig_-peptide

〈400〉 2

ATG AAA AAG GCG AAA CTG TTG GCG CTG CTG GTG GCG CTG GCG GTG 45

GCG CTG GCG AGC ACC GCG TCT GCA 69

〈210〉 3

〈211〉 54

〈212〉 DNA

〈400〉 3

GGAATTCCAT ATGAAAAAGG CGAAACTGTT GGCGCTGCTG GTGGCGCTGG CGGT 54

〈210〉 4

〈211〉 54

〈212〉 DNA

〈400〉 4

GCATTCGCTG CAGACGCGGT GCTCGCCAGC GCCACCGCCA GCGCCACCAG CAGC 54

〈210〉 5

〈211〉 36

〈212〉 DNA

〈400〉 5

GCTCAGCCGG TCTCCCATGT TTAAGTTTAA AAAGAA 36

〈210〉 6

〈211〉 30

〈212〉 DNA

〈400〉 6

CGCGGATCCG AGCTGTTACC ACACAGTTAC 30

〈210〉 7

〈211〉 37

〈212〉 DNA

〈400〉 7

GCTCAGCCGG TCTCCCATGA AAAAGGCGAA ACTGTTG 37

〈210〉 8

〈211〉 30

〈212〉 DNA

〈400〉 8

CGCGGATCCG AGCTGTTACC ACACAGTTAC 30

〈210〉 9

〈211〉 32

〈212〉 DNA

〈400〉 9

GGACTGCAGC ACGGACACCA GAAATGCCTG TT 32

〈210〉 10

〈211〉 33

〈212〉 DNA

〈400〉 10

GCGGGATCCT TATTATTTCA GCCCCAGAGC CGG 33

〈210〉 11

〈211〉 32

〈212〉 DNA

〈400〉 11

GCGGTACCTT TAAAGCCACG TTGTGTCTCA AA 32

〈210〉 12

〈211〉 27

〈212〉 DNA

〈400〉 12

CGAATTCTTA GAAAAACTCA TCGAGCA 27

〈210〉 13

〈211〉 34

〈212〉 DNA

〈400〉 13

GGAATTCCAT ATGTGTTTCC TGTGTGAAAT TGTT 34

〈210〉 14

〈211〉 20

〈212〉 DNA

〈400〉 14

TGCTCACATG TTCTTTCCTG 20

Claims (22)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 분비 신호서열(secretion signal sequence)의 유전자.
2. 제 1항에 있어서,

   유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는

   분비 신호서열의 유전자.
3. 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 분비 신호서열의 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
4. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA301:
5. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA101:
6. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA101ΔP:
7. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA102:
8. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA301K:
9. 제 3항에 있어서,

   하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

   재조합 플라스미드 pJSA302K:
10. 제 3항에 있어서,

    하기와 같은 유전자 지도를 갖는 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드 pJSA402K:
11. 제 3항에 있어서,

    재조합 플라스미드 pJSA301에서 제 1항의 분비 신호서열의 3'-말단에 존 재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이중 절단하여 엔도자일라나제 의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽 입시킨 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
12. 제 3항에 있어서,

    재조합 플라스미드 pJSA101에서 제 1항의 분비 신호서열의 3'-말단에 존 재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI, XbaI, SalI, PstI 또는 HindIII 절단부위 중 하나를 이중 절단하여 엔도자일라나제의 유전자를 제거시키고, 분 비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
13. 제 3항에 있어서,

    재조합 플라스미드 pJSA101ΔP 또는 pJSA102에서 제 1항의 분비 신호서 열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 또는 XbaI 절단부위 중 하나로 이중 절단하여, 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외 래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
14. 제 3항에 있어서,

    재조합 플라스미드 pJSA301K 또는 pJSA302K에서 제 1항의 분비 신호서열 의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 엔도자일라나제 또 는 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이중 절단하여, 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제 의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽 입시킨 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
15. 제 3항에 있어서,

    재조합 플라스미드 pJSA402K에서 제 1항의 분비 신호서열의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 PstI 절단부위와 알칼라인 포스파타제 유전자의 3'-말단에 존재하는 제한 효소 BamHI 절단부위를 이중 절단하여 알칼라 인 포스파타제의 유전자를 제거시키고, 분비하고자 하는 외래 단백질의 유전자를 삽입시킨 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
16. 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,

    외래 단백질의 유전자의 5'-말단은 제한효소 PstI, BsaI, BbsI, BbvI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI 및 SfaNI로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종에 의해 절단되도록 유전자 조작되어 있는 것을 특징으로 하는

    재조합 플라스미드.
17. 제 3항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드로 형질전환된 대장균(Escherichia coli).
18. 재조합 플라스미드 pJSA101ΔP로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pJSA101 delta P(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA101 delta P)(KCTC 0559BP).
19. 재조합 플라스미드 pJSA302K로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pJSA302K(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA302K)(KCTC 0558BP).
20. 재조합 플라스미드 pJSA402K로 형질전환된 대장균 XL1-Blue/pJSA402K(Escherichia coli XL1-Blue/pJSA402K)(KCTC 0557BP).
21. 제 3항 내지 제 20항 중 어느 한 항의 재조합 플라스미드를 대장균에 도입하여 형질전환체를 배양하고, 단백질의 발현을 유도하여 재조합 대장균의 세포질 밖으로 분비된 외래 단백질을 수득하는 공정을 포함하는 외래 단백질의 제조방법.
22. 제 21항에 있어서,

    외래 단백질은 엔도자일라나제 또는 알칼라인 포스파타제인 것을 특 징으로 하는

    외래 단백질의 제조방법.