KR102606210B1 - 올리고머 입자 시약 및 이의 사용 방법 - Google Patents

올리고머 입자 시약 및 이의 사용 방법 Download PDF

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톰 코우스키
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주노 테라퓨틱스 게엠베하
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Abstract

스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 올리고머 시약을 비롯한 올리고머 시약, 및 이의 조성물과, 원하는 크기의 올리고머 입자 시약을 안전하게 제품화하는 방법을 비롯한 올리고머 시약의 제품화 방법을 제공한다. 일부 경우에, 이러한 시약은 시제(agent)에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머 입자 시약이며, 따라서 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합함으로써 다합체화되어(multimerized), 예를 들어, 이에 다합체화된 자극제를 가지는 다합체화된 올리고머 입자 시약을 생성한다. 또한 림프구 집단과 같은 세포 조성물의, 예를 들어 팽창 (증식), 활성화, 공동자극 및/또는 생존의 자극을 유도하는 인큐베이션 또는 배양을 위한 올리고머 시약의 사용 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포 표면의 분자에 시제를 결합시켜, 하나 이상의 신호를 세포에 제공하여, 세포 집단의 자극, 예를 들어, 팽창 (증식), 생존 또는 지속성, 활성화, 공동자극, 또는 다른 효과를 자극하는 시약 및 방법을 제공한다.

Description

올리고머 입자 시약 및 이의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 4월 27자, 발명의 명칭이 “올리고머 입자 시약 및 이의 사용 방법”인 미국 가출원 제62/491,245호의 우선권을 주장하며, 상기 특허의 전문은 그 전체가 참조로서 포함된다.
서열 목록의 참조에 의한 포함
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 출원된다. 서열 목록은 2018년 4월 26일 작성된, 110,426 byte 크기의 파일명 735042008540SeqList.TXT으로 제공된다. 전자 형식의 서열 목록에 있는 정보는 본 출원에 그 전체가 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 올리고머 시약을 비롯한 올리고머 시약, 및 이의 조성물과, 원하는 크기의 올리고머 입자 시약을 안전하게 제품화하는 방법을 비롯한 올리고머 시약의 제품화 방법을 제공한다. 일부 경우에, 이러한 시약은 시제(agent)에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머 입자 시약이며, 따라서 하나 이상의 시제, 예를 들어, 하나 이상의 선별제 또는 자극 시약은 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합함으로써 다합체화되어(multimerized), 예를 들어, 이에 다합체화된 자극 또는 선별제를 가지는 다합체화된 올리고머 입자 시약을 생성한다. 본 발명은 또한 림프구 집단과 같은 세포 조성물의, 예를 들어 팽창 (증식), 활성화, 공동자극 및/또는 생존의 자극을 유도하는 인큐베이션 또는 배양을 위한 올리고머 시약의 사용 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 세포 표면의 분자에 시제를 결합시켜, 하나 이상의 신호를 세포에 제공하여, 세포 집단의 자극, 예를 들어, 팽창 (증식), 생존 또는 지속성, 활성화, 공동자극, 또는 다른 효과 (예를 들어 친화도 선택)를 자극하는 시약 및 방법을 제공한다.
시험관 내에서 T 세포 집단을 자극하기 위한 다양한 전략이 이용가능하며, 예를 들어, 항원-특이적 T 세포를 주입하면 종양-보유 숙주에서 항-종양 반응성을 가지는 것으로 나타남에 따라, 이러한 T 세포를 시험관 내에서 팽창시켜 입양 세포 면역요법 또는 암 치료법에서의 사용하거나, 또는 바이러스 감염 치료에서 사용하는 것을 포함한다. 연구, 진단 및 치료의 목적을 포함하여, 시험관 내 세포 집단을 팽창시키기 위해 개선된 전략이 필요하다.
복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약이 본 명세서에 제공되며, 이러한 올리고머 입자 시약의 크기는 i) 반경, 예를 들어, 유체역학적 반경이 25 nm를 초과하고, ii) 분자량이 적어도 5 x 106 g/mol이고; 및/또는 (iii) 올리고머 입자 시약 당, 적어도 100개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 (예를 들어 데스싸이오비오틴, 이미노비오틴)에, 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (예를 들어 Strep-tagII (WSHPQFEK, 서열 번호 8))에 결합하거나, 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체에, 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드 (예를 들어 Strep-tagII (WSHPQFEK, 서열 번호 8))에 가역적으로 결합하거나, 가역적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하며, 이러한 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 44 내지 47 위치에 해당하는 서열 위치에, 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인, 및/또는 이의 생물학적 활성 단편에 결합하거나, 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인, 및/또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하거나, 가역적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하며, 이러한 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 44 내지 47 위치에 해당하는 서열 위치에, 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 다음을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함한다: a) 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열; b) 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는 및/또는 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴 또는 이의 생물학적 활성 형태, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드)에 결합하는 아미노산 서열, 비오틴 또는 이의 생물학적 활성 형태, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하거나 및/또는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편; 또는 c) 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 서열 번호 6 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 117, 120 및/또는 121에 해당하는 위치에 아미노산 치환 또는 치환들을 추가로 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서: 아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 또는 Phe121 중에서 선택되거나; 또는 아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121 중 하나 이상으로부터 선택되거나; 또는 아미노산 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121으로부터 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 다음을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함한다: a) 서열 번호 27 또는 28에 제시된 아미노산 서열; b) 서열 번호 28에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하는 아미노산 서열; 또는 c) 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서: 아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 또는 Phe121 중에서 선택되거나; 또는 아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121 중 하나 이상으로부터 선택되거나; 또는 아미노산 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121으로부터 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 다음을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함한다: a) 서열 번호 27 또는 28에 제시된 아미노산 서열; b) 서열 번호 28에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는 c) 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 결합 파트너를 통해 하나 이상의 시제에 결합되거나, 또는 결합할 수 있으며, 이러한 하나 이상의 시제는 결합 파트너, 예컨대 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘 결합 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하며, 이러한 결합 파트너는 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 결합 부위에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 결합 파트너는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나, 이에 추가적으로 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 항체, 선택적으로 Fab 또는 nanobody®예를 들어 단일 도메인 항체 (sdAb)를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나, 이에 결합할 수 있는 수용체 결합제이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 수용체 결합제는 표적 세포의 표면의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하여, 표적 세포에 신호를 유도 또는 조절한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고 올리고머 입자 시약은 제2 수용체-결합제를 포함하며, 상기 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 상기 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는 상기 리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는 상기 리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 상기 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 상기 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 표적 세포는 T 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 반경이 25 nm 초과, 50 nm 초과, 60 nm 초과, 70 nm 초과, 80 nm 초과, 또는 90 nm 초과이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 반경이 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 115 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm를 포함하거나, 또는 90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ± 20-25nm이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 반경이 150 nm 미만이다. 구체적인 구현예에서, 상기 반경은 유체역학적 반경이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 분자량이 적어도 1 x 107 g/mol, 적어도 5 x 107 g/mol, 또는 적어도 1 x 108 g/mol이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 분자량이 1 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 적어도 100개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 1,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 적어도 2,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 100 내지 50,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 1,000 내지 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 1,000 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 올리고머 입자 시약의 특정 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 라이신 잔기를 포함하며, 상기 라이신 잔기의 20%, 10%, 5%, 1% 미만은 N-치환된 이미노싸이올란(iminothiolane)을 포함한다.
본 명세서에는 하나 이상의 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물이 제공된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 하나 이상의 올리고머 입자 시약은 복수의 올리고머 입자 시약이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 구체적인 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 i) 평균 반경이 70 nm를 초과하고; ii) 평균 분자량이 적어도 1 x 108 g/mol이고; 및/또는 iii) 올리고머 입자 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수는 적어도 2,000개이고 및/또는 iv) 반경 크기 분포는 복수의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%가 10 nm 내지 150 nm의 반경을 포함한다. 특정 구현예에서, 반경 크기 분포는 유체역학적 반경 크기 분포이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 특정 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 25 nm 초과, 50 nm 초과, 60 nm 초과, 70 nm 초과, 80 nm 초과, 90 nm 초과, 또는 100 nm 초과이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 110 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm를 포함하거나, 또는 90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ± 20-25 nm이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 구체적인 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 50 내지 150 nm, 70 nm 내지 140 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 및/또는 100 nm 내지 120 nm이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 복수의 올리고머 입자 시약의 평균 및/또는 중앙 반경의 ± 50%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, 및/또는 ± 5% 사이이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 80 nm 내지 115 nm이며, 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 평균 반경의 ± 25% 사이이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 구체적인 구현예에서, 복수의 입자는 평균 분자량이 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol을 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 특정 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 올리고머 입자는 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수가 적어도 100개, 적어도 500개, 적어도 1,000개, 적어도 1,500개, 또는 적어도 2,000개를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 복수의 올리고머 입자 시약은 올리고머 입자는 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수가 각각 100 내지 50,000개, 1,000 내지 20,000개, 1,000 내지 10,000개, 또는 2,000 내지 5,000개를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 구체적인 구현예에서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 -80 ℃ 이하, 약 -20 ℃ 이하, 및/또는 약 4 ℃ 이하에서 적어도 1 주간 저장되었을 때 25%를 초과하지 않는다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 특정 구현예에서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 1 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 일부 구현예에서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 3주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는다. 본 명세서에 제공되는 임의의 조성물의 특정 구현예에서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 9 주, 적어도 27 주, 또는 적어도 46 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는다. 구체적인 구현예에서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 -20 ℃, -30 ℃, -40 ℃, -50 ℃, -60 ℃, -70 ℃, 또는 -80 ℃ 이하에서, 적어도 1 주간, 3 주, 9 주, 27 주, 또는 46 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는다.
본 명세서에는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 올리고머 입자 시약의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: 싸이올 작용기와 반응할 수 있는 싸이올-반응성 작용기를 포함하는 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 하나 이상의 싸이올 작용기를 포함하는 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 인큐베이션하여, 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 입자를 생성하는 단계; 올리고머 입자를 단량체 및/또는 작은 올리고머 분자로부터 분리하는 단계; 및 올리고머 입자와 안정화제를 접촉시켜, 올리고머 입자 시약을 제조하는 단계.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 하나 이상의 아민을 싸이올-반응성 작용기로 전환시킬 수 있는 활성화제를 사용하여 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 배양시킴으로써 생성된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 싸이올 작용기를 하나 이상의 라이신 잔기에 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 싸이올화제를 사용하여 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 인큐베이션함으로써 생성된다.
또한 본 명세서에는 올리고머 입자 시약의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (a) 하나 이상의 아민을 싸이올 작용기와 반응할 수 있는 싸이올-반응기로 전환시킬 수 있는 조건하에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 활성화제와 함께 인큐베이션하여, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계; (b) 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 싸이올 작용기를 하나 이상의 라이신 잔기에 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 싸이올화제와 함께 인큐베이션하여, 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계; 및 (c) 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 인큐베이션하여, 올리고머 입자 시약을 포함하는 입자 조성물을 생성하는 단계; 여기서 상기 방법은 단계 (c)에서 인큐베이션을 개시할 때 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는, 평균적으로, 라이신의 적어도 60%가 싸이올 작용기를 포함하도록, 및/또는 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체 당, 평균적으로, 적어도 10개의 라이신이, 싸이올 작용기를 포함하도록 하는 조건하에서 수행된다.
특정 구현예는 단량체 및/또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 올리고머 입자 시약을 분리하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 활성화 시약의 몰비가 1:1 내지 1:10인 몰비에서 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 활성화 시약의 몰비가 1:2 ± 2%인 몰비에서 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 활성화제는 이종이작용성(heterobifunctional) 가교제를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 활성화제는 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포 SMCC) 및/또는 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 싸이올-반응성 작용기는 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 싸이올-반응성 작용기는 말레이미드 기이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 중성 pH에서 인큐베이션된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 pH 6.8 내지 7.5에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 pH 7.0 내지 7.4, 선택적으로 또는 약 7.2에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃의 온도에서 인큐베이션된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 15 분 내지 6 시간 동안, 또는 30 분 내지 2 시간 동안 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 45 분 내지 1.5 시간, 선택적으로 또는 약 1 시간 동안 인큐베이션된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 싸이올화 시약 대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비가 10:1 내지 1:1인 몰비에서 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 싸이올화제의 몰비가 1:50 내지 1:500인 몰비에서 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 활성화 시약의 몰비가 약 1:100인 몰비에서 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 싸이올화제는 2-이미노싸이올란이거나, 이를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 pH 7.0 이상, 선택적으로 pH 7.0 내지 8.0에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 약 pH 7.7에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제의 인큐베이션은 pH 8.0 이상, 선택적으로 pH 8.0 내지 9.0의 완충액의 존재하에 개시된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제의 인큐베이션은 약 pH 8.5의 완충액의 존재하에 개시된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 완충액은 보레이트(borate)를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 완충액은 10 mM 내지 200 mM 보레이트 또는 50 mM 내지 100 mM 보레이트, 선택적으로 약 100 mM 보레이트를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 또는 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 15 분 내지 2 시간 동안, 또는 15 분 내지 1.5 시간 동안 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 15 분 내지 2 시간 동안, 또는 25 분 내지 1 시간 동안 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 분자 및 싸이올화제는 약 1 시간 동안 인큐베이션된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 약 25 분간 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 인큐베이션하는 동안 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 대 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 X:1의 몰비이며, 여기서 X는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 분자 당 싸이올화될 수 있는 라이신 잔기의 개수이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 상기 몰비는 1:1 내지 8:1 또는 2:1 내지 6:1, 또는 선택적으로 약 4:1이다. 특정 구현예에서, 상기 몰비는 1:1 내지 1:8 또는 1:2 내지 1:6, 또는 선택적으로 약 1:4이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 pH 6.8 내지 7.5에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 pH 7.0 내지 7.4에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 약 pH 7.2에서 인큐베이션된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 또는 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자 및 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자는 15 분 내지 6 시간 동안, 또는 30 분 내지 2 시간 동안 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자 및 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자는 45 분 내지 1.5 시간 동안, 또는 선택적으로 약 1 시간 동안 인큐베이션된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션은 상기 분자들을 N-에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide, NEM)와 반응시킴으로써 종료된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 적어도 일부와 활성화제의 인큐베이션 단계의 및 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 적어도 일부와 싸이올화제의 인큐베이션 단계는 동시에 개별적으로 수행된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계 및 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션 단계는 실질적으로 동일한 시간 동안 수행 및/또는 실질적으로 동시에 완료된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션 단계 이전에, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다: (i) 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 활성화제를 제거하는 단계; 및/또는 (ii) 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 싸이올화제를 제거하는 단계.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션 단계는 제2 복수의 스트렙타비딘 분자와 싸이올화제의 인큐베이션 단계가 종료된 후 15 분 이내 및/또는 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 싸이올화제의 제거 단계 이후에 개시된다.
본 명세서에는 올리고머 입자 시약의 제조 방법이 제공되며, 다음의 단계를 포함한다: 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)와 약 pH 7.2에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 말레이미드 싸이올-반응성 작용기를 포함하는 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계; 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 2-이미노싸이올란과 pH 7.5 내지 8.5에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 하나 이상의 싸이올 작용기를 포함하는 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자를 생성하는 단계; 및 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자와 약 pH 7.2에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물을 생성하는 단계; 여기서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자와 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자의 인큐베이션 단계는 제2 복수의 스트렙타비딘 분자와 2-이미노싸이올란의 인큐베이션이 종료된 후 10 분 이내에 개시된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 올리고머 입자 시약과 안정화제를 접촉시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 안정화제는 올리고머 입자 시약 중 라이신 잔기에 존재하는 N-치환된 이미노싸이올란의 양을 감소시킨다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 안정화제는 올리고머 입자 시약 중 라이신 잔기에 존재하는 N-치환된 이미노싸이올란의 양을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시킨다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 안정화제는 하이드록실아민을 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서 올리고머 입자 시약은 반경이 150 nm 미만이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예는 올리고머 입자 시약을 필터 멸균하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서 올리고머 입자 시약은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체 또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 분리된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 크기 배제 한계는 약 100 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1000 kDa 또는 2000 kDa 이상이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 크기 배제 한계는 약 500 kDa 내지 1000 kDa이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 크기 배제 한계는 750 kDa 또는 약 750 kDa이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예는 공극 부피를 포함하는 하나 이상의 분획을 수집하여, 단량체 또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 올리고머 입자 시약을 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 약 4 ℃ 이하, 약 -20 ℃ 이하, 또는 약 -80 ℃ 이하의 온도에서 올리고머 입자 시약을 저장하는 단계를 추가적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합시키기 위한 조건하에서 올리고머 입자 시약을 하나 이상의 시제와 혼합하는 단계를 추가적으로 포함한다.
또한 본 명세서에는 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 다합체화하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합시키기 위한 조건하에서 본 명세서에 제공된 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약을 하나 이상의 시제와 혼합하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하며, 이러한 결합 파트너는 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 결합 부위에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 결합 파트너는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 항체, 선택적으로 Fab를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나, 이에 결합할 수 있는 수용체 결합제이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체 결합제는 표적 세포의 표면의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하여, 표적 세포에 신호를 유도 또는 조절한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고, 상기 방법은 제2 수용체-결합제를 포함하는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 상기 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는 상기 리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는 상기 리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 상기 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 상기 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 표적 세포는 T 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO이다.
구체적인 구현예는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 구체적인 구현예는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 방법에 의해 제조된 복수의 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 구현예는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 올리고머 입자 시약 또는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 조성물을 포함하는 제품화 물품에 관한 것이다.
본 명세서에는 세포 조절 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 올리고머 입자 시약의 존재하에 또는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 조성물의 존재하에, 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을 인큐베이션하여 표적 세포를 조절하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포의 조절 단계는 표적 세포의 활성화, 농축 및/또는 팽창을 포함한다.
본 명세서에는 세포 배양 방법이 제공되며, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 올리고머 입자 시약의 존재하에 또는 본 명세서에 제공된 임의의 구현예의 조성물의 존재하에, 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제에 가역적으로 결합된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 항체, 선택적으로 Fab를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나, 이에 결합할 수 있는 수용체 결합제이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체 결합제는 표적 세포의 표면의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하여, 표적 세포에 신호를 유도 또는 조절한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고, 상기 방법은 제2 수용체-결합제를 포함하는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택된다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 상기 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는 상기 리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 상기 리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는 상기 리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 상기 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 상기 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 면역 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 T 세포이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO이다. 특정 구현예에서, 표적 세포는 혈액 세포, 백혈구, 림프구, B 세포, B 세포 집단, T 세포, T 세포 집단, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포를 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 표적 세포는 재조합 수용체를 발현한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 재조합 T 세포 수용체 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 표적 세포는 질병 및/또는 암과 관련된 항원에 결합하는 CAR를 발현한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 상기 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절두된 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100 (gp100), G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접합 분자 (L1CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 서열 8 패밀리 구성원 A 함유 (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접합 분자 (NCAM), 종양 태아 항원, 종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 오펀 수용체 1 (RORl), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 항원 또는 보편적인 표지(tag)와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예는 하나 이상의 시제와 올리고머 입자 시약 사이의 가역적 결합을 파괴하는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 상기 파괴 단계는 하나 이상의 시제와 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전시킬 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 표적 세포에 도입하는 것을 포함한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 상기 물질은 유리 결합 파트너 및/또는 경쟁 시제이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 상기 파괴 단계는 표적 세포, 선택적으로 T 세포에서 하나 이상의 시제에 의해 유도되거나 또는 조절되는 신호를 종결 또는 감소시킨다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 선택적으로 D-비오틴, 또는 비오틴 유사체 (또는 생물학적 활성 단편)을 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 상기 물질은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드이다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, 상기 파괴 단계는 상기 인큐베이션의 개시 이후 5 일 내에 수행된다.
도 1은 100 mM 보레이트 존재하에 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2와 2-이미노싸이올란과의 시간 경과 인큐베이션 동안 스트렙타비딘 뮤테인 사합체에 부착된 싸이올 작용기의 수준을 도시한다.
도 2는 pH 8.3 또는 8.5의 25 mM 보레이트 존재하에 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2와 2-이미노싸이올란과의 인큐베이션 동안 스트렙타비딘 뮤테인 사합체에 부착된 싸이올 작용기의 수준을 도시한다.
도 3은 2-이미노싸이올란과 인큐베이션된 스트렙타비딘 뮤테인의 SEC 용출 프로파일을 도시한다. 분자량 표준에 대한 용출 피크는 158,000 Da, 44,000Da, 17,000 Da 또는 1350 Da에 대한 분자량에 대한 실선으로 도시된다. 비-싸이올화 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2의 용출 프로파일은 점선으로 도시된다. 나머지 용출 프로파일은 10 분, 50 분 또는 390 분간, pH 8.3 또는 pH 8.5의 25 mM 보레이트 완충액의 존재하에 인큐베이션한 다양한 싸이올화 STREP-TACTIN®M2 스트렙타비딘 뮤테인의 용출 프로파일을 도시한다. 구체적으로, 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2을 2-이미노싸이올란과 10 분간 pH 8.3의 25 mM 보레이트 완충액, 50 분간 pH 8.3의 25 mM 보레이트 완충액, 390 분간 pH 8.3의 25 mM 보레이트 완충액, 또는 10 분간 pH 8.5의 25 mM 보레이트 완충액, 50 분간 pH 8.5의 25 mM 보레이트 완충액, 또는 390 분간 pH 8.5의 25 mM 보레이트 완충액의 존재하에 인큐베이션한 뒤의 용출 프로파일이 도시된다.
도 4는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2와 2-이미노싸이올란을 pH 8.3, 8.5, 및 8.7의 25 mM 보레이트 완충액에서 1 시간 동안 또는 3 시간 동안 인큐베이션 한 뒤의 싸이올 작용기 (SH 함량)의 농도를 도시한다.
도 5는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN®M2을 2-이미노싸이올란과 인큐베이션하고 PD10 컬럼으로 겔 여과한 뒤 상이한 시점에서, 싸이올 작용기 (SH 함량)의 손실을 도시한다.
도 6A 및 6B 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 STREP-TACTIN® M2으로 구성된 올리고머 시약의 상이한 배치에 다합체화된 항-CD3/항-CD28와 함께 인큐베이션된 3가지 상이한 공여체로부터의 T 세포의 WST 대사 분석 결과를 도시한다 도 6A은 평균 유체역학적 반경이 36 nm 또는 101 nm인 올리고머 백본에 다합체화된 항-CD3/항-CD28를 포함하는 기준 배치에 대하여 시험된 모든 배치 (모아진 배치)에 대한 WST 대사 활성을 요약한다. 시험된 개별 배치 및 기준 시약에 대한 상이한 공여체로부터의 T 세포 간의 평균 WST 대사 활성이 도 6B에 도시된다.
도 7은 도 7A-7E를 포함하며, 예시적인 구현예의 개략도를 제공한다.
도 7A는 시제에 가역적 결합을 위해 복수의 결합 부위를 가지는 시약 (또는 이의 대표적인 부분), 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약의 개략도를 도시한다. 이러한 경우에, 시약은 두 가지 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 것으로 나타나며, 상기 시제 각각은 세포 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 시약은 결합 부위, Z1를 포함하는 복수의 결합 부위를 가지고, 각각은 시제에 가역적으로 결합할 수 있다. 제1 및 제2 시제는, 일부 경우에, 동일할 수 있으며, 도시된 개략도에서 각각은 적어도 하나의 결합 파트너 C1를 포함한다. 결합 파트너 C1은 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합한다. 제1 및 제2 시제 각각은 또한 세포 표면 상의 분자, 일부 경우에, 동일한 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위, B2를 포함한다. 여기서, 제1 및 제2 시제는 동일한 세포 상의 분자에 특이적으로 결합하는 것으로 도시된다.
도 7B는 제1 및 제2 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 가지는 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약의 개략도를 도시하며, 상기 시제는 각각 제1 및 제2 세포 상의 분자에 각각 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 시약은 복수의 결합 부위 Z1를 가지며, 각각은 시제에 가역적으로 결합할 수 있다. 제1 및 제2 시제는, 일부 경우에, 동일할 수 있고, 각각 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합하는 결합 파트너 C1를 포함한다. 제1 및 제2 시제 각각은 세포 표면 상의 분자, 일부 경우에, 동일한 세포 또는 상이한 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위, B2를 포함한다. 여기서, 제1 시제는 제1 세포의 표면 상의 분자에 결합되고 제2 시제는 제2 세포의 표면 상의 분자에 결합된다.
도 7C는 제1 및 제2 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약을 도시하며, 상기 시제는 각각 제1 및 제2 세포 상의 분자에 각각 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 시약은 동일하거나 상이할 수 있는 복수의 결합 부위 Z1 및 Z2를 가지며, 각각은 하나의 시제 또는 두 시제 모두에 가역적으로 결합할 수 있다. 제1 시제는 Z1에 가역적으로 결합하는 결합 파트너 C1를 포함하며; 제2 시제는 Z2에 가역적으로 결합하는 결합 파트너 C2를 포함한다. 일부 경우에, C1 및 C2는 상이하다. 일부 경우에, C1 및 C2는 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 제1 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위 B1을 포함하고, 제2 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 부위 B3을 포함한다. 결합 부위 B1 및 B3는 일부 경우에 2 개의 상이한 세포 표면 분자, 또는 단일 분자 상의 상이한 에피토프, 또는 상이한 세포의 표면 상의 동일한 또는 상이한 분자에 결합한다. 여기서, B1을 통해 결합되어 있는 것으로 도시된 제1 시제는 제1 세포의 표면 상의 분자에 결합되고 제2 시제는 제2 세포의 표면 상의 분자에 결합된다.
도 7D는 제1 및 제2 시제, 예컨대 선별제에 가역적으로 결합할 수 있는 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약을 도시하며, 상기 시제 각각은 세포 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 시약은 동일하거나 상이할 수 있는 Z1 및 Z2를 포함하는 복수의 결합 부위를 가지며, 각각은 시제에 가역적으로 결합할 수 있다. 제1 시제는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1을 포함하고, 제2 시제는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 파트너 C2를 포함한다. 일부 경우에, C1 및 C2는 상이하다. 일부 경우에, C1 및 C2는 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 제1 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위 B1을 포함하고, 제2 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 부위 B3을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 시제 및 제2 시제는 선별제일 수 있다. 결합 부위 B1 및 B3는 세포 표면 상의 동일한 또는 상이한 분자 (예를 들어 수용체), 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프, 또는 상이한 세포의 표면 상의 동일한 또는 상이한 분자에 결합할 수 있다. 여기서, 제1 시제는 세포의 표면 상의 제1 분자에 결합되고 제2 시제는 동일한 세포의 표면 상의 제2 분자에 결합된다.
도 7E는 제1 및 제2 시제에 가역적으로 결합된 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약을 도시하며, 상기 시제는 각각 세포 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 시약은 동일하거나 상이할 수 있는 Z1 및 Z2를 포함하는 복수의 결합 부위를 가지며, 각각은 시제에 가역적으로 결합할 수 있다. 제1 시제는 시약의 Z1에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1를 포함하고, 제2 시제는 Z2에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C2를 포함한다. 일부 경우에, C1 및 C2는 상이하다. 일부 경우에, C1 및 C2는 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 제1 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 부위 B2을 포함하고, 제2 시제는 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 부위 B4을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 시제 및 제2 시제는 자극제일 수 있다. 결합 부위 B2 및 B4는 세포 표면 상의 동일한 또는 상이한 분자, 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프, 또는 상이한 세포의 표면 상의 동일한 또는 상이한 분자에 결합할 수 있다. 여기서, 제1 시제는 세포의 표면 상의 제1 분자에 결합되고 제2 시제는 동일한 세포의 표면 상의 제2 분자에 결합된다.
도 8은 도 8A-8E를 포함하며, 도 7A-7E에 도시된 예시적인 구현예의 개략도를 제공하되, 각각, 도시된 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약은 지지체, 예컨대 고정상에 고정되어 있는 것으로 도시된다.
도 9는 올리고머 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약이 자극제를 다합체화하도록 사용되고, 생성된 복합체는 신호를 세포에 전달하기 위해 세포와 함께 인큐베이션되고, 이어서 결합의 역전이 일어나는 예시적인 구현예의 개략도를 제공한다. 패널 A는 올리고머 시약 1을 도시하며, 이는 임의의 지지체에 결합되지 않으며 가요성인 것으로 도시된다. 자극제 2는, 여기서 Fab 단편으로서 도시되며 세포 표면 상의 분자특이적으로 결합할 수 있고, 시약과 조합된다. 상기 시제는 시약의 결합 부위 (예를 들어 결합 부위 Z)에 가역적으로 결합하여, 시제를 다합체화할 수 있는 결합 파트너 (예를 들어, 결합 파트너 C)를 포함한다. 패널 B는 시약의 결합 부위에 가역적으로 결합한 결합 파트너를 도시한다. 세포 3가 시스템에 첨가된다. 패널 C는 세포 표면 3 상의 분자 4에 특이적으로 결합하는 다합체화된 시제 (Fab 단편)를 도시한다. 패널 C에서, 도시된 시제는 자극 수용체-결합제, (예를 들어 제1 수용체-결합제 및/또는 제2 수용체-결합제)이며, 이는 세포 상의 분자에 대한 시제의 결합 시에 세포에서 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 패널 D에 도시된 바와 같이, 물질 5, 예컨대 경쟁 시약 (예를 들어 비오틴)이 조성물에 첨가되며, 이러한 시약은 상기 시제 상의 결합 파트너보다 시약 상의 결합 부위에 대한 더 높은 결합 친화도를 나타내어, 시약 1과 상기 시제 2 사이에 가역적인 결합을 파괴할 수 있는 물질이다. 일부 경우에, 상기 시제는, 예를 들어, Fab 단편은 또한 세포 3 상의 분자 4와 이의 상호 작용으로부터 해리될 수 있다. 일부 경우에, 이것은 세포에서 신호 전달을 방해, 감소 및/또는 종료시킬 수 있다.
도 10은 지지체, 예컨대 고체 지지체 또는 고정상을 비롯한, 표면에 부착된, 올리고머 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약을 포함하는 가역적 시스템의 예시적인 구현예의 개략도를 제공한다. 패널 A는 시약 1을 포함하는 지지체 6를 도시한다. 세포 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 시제 2, 예컨대 Fab 단편은 시스템에 첨가된다. 시제2, 예컨대 Fab 단편은 시약의 결합 부위 (예를 들어 결합 부위 Z)에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 (예를 들어, 결합 파트너 C)를 포함한다. 패널 B는 시약의 결합 부위에 가역적으로 결합한 결합 파트너를 도시한다. 세포 3가 시스템에 첨가된다. 패널 C는 세포 표면 3 상의 분자 4에 결합하는 시제 2, 예를 들어 Fab 단편을 도시한다. 일부 구현예에서, scFvs는 수용체-결합제 또는 선별제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시제, 예를 들어 Fab 단편은 수용체-결합제 또는 선별제일 수 있다. 패널 C는 예시적인 수용체-결합제 또는 시제 (예를 들어 제1 수용체-결합제 및/또는 제2 수용체-결합제)를 도시하며, 이는 세포 상의 분자에 대한 시제, 예를 들어 Fab 단편의 결합 시에, 세포에서 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 물질 5, 예컨대 경쟁 시약 (예를 들어 비오틴)이 첨가되며, 이러한 시약은 상기 시제 상의 결합 파트너보다 시약 상의 결합 부위에 대한 더 높은 결합 친화도를 나타내어, 시약과 상기 시제 사이에 결합을 파괴할 수 있는 물질이다. 패널 D는 상기 시제 2, 예를 들어 Fab 단편과 시약 사이의 결합을 파괴하여, 그 결과 상기 시제로부터, 및 이에 따라 세포로부터 시약이 해리되는 것을 도시한다. 일부 경우에, 상기 시제는, 예를 들어, Fab 단편은 또한 세포 3 상의 분자 4와 이의 상호 작용으로부터 해리될 수 있다. 일부 경우에, 이것은 세포에서 신호 전달을 방해, 감소 및/또는 종료시킬 수 있다.
도 11은 -80 ℃, 4 ℃, 또는 37 ℃에서 저장한 후 다양한 시점에서 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 동적 광산란에 의해 측정된 크기 변화의 그래프를 나타낸다.
도 12A 및 B는 세포를 발현시키는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 T 세포 조성물 생성을 위한 예시적인 조작 공정 동안 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 개별 로트와 함께 인큐베이션하는 동안 시간에 따른 전체 세포 (도 12A) 및 생존 세포의 백분율 (도 12B)을 나타낸다.
도 13은 CAR T 세포 조성물의 생성을 위한 예시적인 조작 공정 동안 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 개별 로트와 함께 인큐베이션된 T 세포 조성물의, 전체 CAR+, CD4+CAR+, 및 CD8+CAR+ 세포의 백분율, 뿐만 아니라 CD4+ T 세포 중의 CAR+CD4+ T 세포의 백분율 및 CD8+ T 세포 중의 CAR+CD8+ T 세포 백분율을 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 14는 Fab 컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 개별 로트와 함께 인큐베이션된 세포 조성물 중 잔류 Fab 염색 (상단 패널) 또는 잔류 스트렙타비딘 뮤테인 (하단 패널)에 대해 양성인 세포의 백분율을 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 15는 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 개별 로트와의 인큐베이션을 수반하는, 예시적인 조작 공정에 의해 생성된 CAR T 세포를 포함하는 T 세포 조성물의 세포 용해 활성을 도시하는 그래프를 나타낸다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 기술 및 과학 용어 또는 전문 용어는, 청구되는 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 가지는 용어는 명확성 및/또는 즉답형 참조를 위해 본 발명에 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의를 포함한다고 해서 해당 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 예를 들어 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스는 각각의 개별 간행물이 개별적으로 참조 문헌으로서 포함된 것과 마찬가지로, 동일하게 그 전체가 모든 목적을 위해 참조로 포함된다. 본 명세서에 기재된 정의가 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 출원에 기재된 정의와 상반되거나 일치하지 않는 경우, 본 명세서에 기재된 정의는 본 명세서에 참조 문헌으로 포함된 정의보다 우선한다.
본 출원에서 사용되는 구획 제목은 단지 구조화를 위한 것이며 기재된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
1. 개요
본 명세서에는 올리고머 입자 시약의 생성, 제조 및/또는 제품화 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 1 백만 Da 내지 100 백만 Da, 1 백만 Da 내지 10억 Da, 1 백만 Da 내지 100억 Da, 및/또는 1 백만 Da 내지 1000억 Da 범위의 올리고머 입자 시약으로 올리고머화하는데 유용하다. 구체적인 구현예는 제공된 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약의 크기 분포가 하나 이상의 다양한 단계의 상이한 반응 조건의 변화에 영향을 받는 것으로 고려한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 시기, 시약의 농도 및 몰비, 및 용액의 pH와 같은 조건은 정확하게 제어되고 일정하게 유지된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 배치 또는 로트 사이에 일정한 크기를 가지는 올리고머 입자 시약을 유도하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법의 하나 이상의 단계 또는 스테이지의 조건은 하나 이상의 상이한 원하는 크기의 올리고머 입자 시약을 생성, 또는 제조, 제품화하도록 조절될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조 및/또는 제조화 방법은, 싸이올 작용기가 부착된 복수의 분자 (또한 싸이올화된 분자로서 지칭됨, 예를 들어 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자)를, 싸이올-반응성 작용기가 부착된 복수의 분자 (예를 들어 활성화된 분자, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자), 예컨대 말레이미드 작용기와 반응시킴으로써, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 같은 분자를 가교한다.
구체적인 구현예는 하나 이상의 특정 크기의 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 다합체화하면 세포 조절에 사용하기에 특히 효과적일 수 있는 것으로 고려한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 특정 크기의 올리고머 입자 시약는, 하나 이상의 자극제에 가역적으로 결합된 경우, 세포 집단의 팽창, 활성화, 및/또는 농축에 특히 효과적이다. 본 명세서에서 발견되는 바와 같이, 자극제에 가역적으로 결합된 올리고머 입자 시약으로서,구체적으로 더 큰 크기의, 예를 들어 평균 반경, 예를 들어, 유체역학적 반경이 32 nm 초과하며, 일반적으로 평균 반경이 60 nm를 초과하는, 예컨대 평균 반경이 약 90 nm, 95 nm 또는 100 nm 이상의 올리고머 입자 시약은 작은 크기의 올리고머 입자보다 더 큰 정도로 세포를 활성화시키며, 이는 예를 들어 도 6에 도시되어 있다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 한정된 크기 및 크기 분포의 올리고머 입자 시약, 및 원하는 크기 및 크기 분포를 가지는 올리고머 입자 시약을 일관되게 제품화하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 올리고머 입자 시약의 제품화 방법은 가변성을 감소시키고 일반적으로 더 큰 크기의 올리고머 시약을 일관적으로 생성하면서 조성물 내 올리고머의 크기 분포를 최소화한다. 일부 구현예에서, 올리고머화 반응을 위한 반응성 싸이올 기는 라이신 잔기 및 분자의 N-말단에 존재하는 아민의 이미노싸이올란 활성화에 의해 분자에 첨가된다. 일부 구현예에서, 싸이올화 반응의 시기, 및 싸이올화 반응의 완료와 올리고머화 반응의 시작 사이의 시간은 반응마다 일정하게 유지되며, 이것은 일부 경우에, 유리 싸이올이 이성질체화로 인해, 즉, N-치환된 이미노싸이올란의 형성으로 인해 손실될 수 있기 때문이다. 일부 양태에서, 상기 시기는 싸이올의 손실 및 N-치환된 이미노싸이올란 형태의 생성을 최소화해야하고, 이러한 형태는, 일부 경우에, 재이성질체화(re-isomerization) 시에 올리고머의 합성-후 성장을 야기할 수 있는 SH 작용기의 숨겨진 공급원이기 때문이다. 일부 구현예에서, 말레이미드-함유 분자와의 반응에 대한 싸이올 기의 가용성을 제어하고, N-치환된 이미노싸이올란의 축적을 최소화하는 것은 올리고머 크기의 일관성에 영향을 미칠 수 있는 파라미터이다.
게다가, 일부 구현예에서, 싸이올 활성화 및 또한 다른 화학 반응의 동역학은 일부 경우에 pH 의존적일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학 반응 (활성화 및 커플링 완충액)에 대한 하나 이상의 완충액의 pH, 특히 싸이올화제에 대한 완충액의 pH는 사전에 결정된 범위 또는 수준 이내에 있으며 일반적으로 정밀하게 측정 및 조정된다. 더욱이, 일부 구현예에서, 싸이올화 및 활성화제 및 분자 사이의 화학량론은 재생산가능한 평균 크기의 다합체를 수득하기 위해 작은 허용 오차 (± 2%) 내에서 농도를 조정함으로써 고도로 정밀하게 조정된다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고머 시약이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 시약에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합될 수 있으며, 이것은 일부 경우에 하나 이상의 시제가 올리고머 입자 시약에 다합체화된 다합체화 시제이다. 하나 이상의 시제, 예컨대 다합체화 시제에 결합된 올리고머 시약은 1차 세포, 예컨대 T 세포를 포함하는 표적 세포와 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 하나 이상의 시제, 예컨대 수용체-결합 시약 및/또는 자극 시약에 결합된 또는 가역적으로 결합된 (예를 들어, 다합체화된) 올리고머 입자 시약이 본 명세서에 제공된다. 구체적인 구현예에서, 제공된 올리고머 입자는 올리고머화된 분자, 예를 들어, 가교된 스트렙타비딘 뮤테인으로 구성되며, 세포 표면에 결합 및/또는 결합할 수 있는 자극 및/또는 수용체-결합제에 결합된다. 일부 양태에서, 상기 시제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 결합 파트너를 가지는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어, Strep-tagII와 같은 스트렙타비딘 결합 펩타이드이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 올리고머화된 입자 시약은 반경이 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 115 nm이거나, 또는 반경이 약 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, 또는 ± 0.1%이다. 일부 양태에서, 복수의 올리고머 입자 시약, 예를 들어 하나 이상의 시제에 결합된 또는 가역적으로 결합된 (예를 들어 다합체화된) 시약을 포함하는 조성물은, 복수의 시약 중에서 올리고머 입자 시약의 평균 반경이 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 115 nm이거나, 또는 반경이 또는 약 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5%, ±2%, ±1%, 또는 ± 0.1%으로 제공된다. 일부 양태에서, 올리고머화된 입자 시약은 표적 세포 상의 세포 표면 분자에 각각, 선별제 또는 자극제의 결합을 통한 세포의 선별 및/또는 자극에 특히 유용하다. 일부 예시에서, 경쟁 시약이 존재하거나 이를 첨가하면 올리고머 입자 시약과 상기 시제, 예를 들어, 수용체 결합 시약 사이가 해리되며, 이것은 일부 예시에서, 올리고머 입자 시약에 의한 세포 자극을 빠르게 종결하거나, 종료하거나 또는 파괴할 수 있다.
본 명세서에는 제공된 올리고머 시약을 사용하여 표적 세포, 예컨대 T 세포의 조성물을 팽창시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포 표면 상의 분자, 예컨대 수용체 결합 분자에 결합하여 세포에 신호를 제공할 수 있는 가역적 시약 시스템에 관한 것이며, 일부 경우에, 이것은 1차 활성화 신호일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법에 사용된 올리고머 입자 시약은 세포에 신호, 예컨대 1차 활성화 신호 및/또는 액세서리 또는 공동자극 신호를 제공하는 하나 이상의 시제, 예를 들어 제1 시제, 제2 시제, 등에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 1차 활성화 신호는 세포가 팽창/증식하도록 활성화시키기에 충분할 수 있다. 이러한 제1 시제는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 또는 또한 비가역적으로 결합될 수 있다. 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 세포 표면의 액세서리 분자를 자극하는 제2 시제에 또한 결합될 수 있다. 제2 시제는, 세포 표면의 표면의 액세서리 분자에 결합하는 경우, 활성화된 세포가 팽창하도록 자극할 수 있다. 또한 이러한 제2 시제는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로, 또는 또한 비가역적으로 결합될 수 있다. 다합체화 시약 및/또는 올리고머화된 입자 시약은 고체 지지체 상에 고정되거나, 또는 가용성일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 림프구의 완전한 집단이 자극/팽창된 세포 집단의 연속적인 팽창이고, 이러한 팽창에 필요한 시약은 이후 적합한 고정상 상의 크로마토그래피에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 배양된 세포인 팽창/자극된 세포는 예를 들어 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 선택적으로 형질감염되며, 일부 양태에서, 도입된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체에 결합하는 상이한 자극 분자로 제2 자극 팽창 처리될 수 있다.
표적 세포, 예컨대 T 세포의 조성물을 팽창시키는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 표적 세포의 표면 상의 분자, 예컨대 수용체 결합 분자에 결합하여 세포에 신호를 제공할 수 있는 가역적 시약 시스템에 관한 것이며, 일부 경우에, 이것은 1차 활성화 신호일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 시약, 예컨대 올리고머 입자 시약을 사용하며, 이러한 시약은 세포에 신호, 예컨대 1차 활성화 신호 및/또는 액세서리 또는 공동자극 신호를 제공하는 하나 이상의 시제, 예를 들어 제1 시제, 제2 시제, 등에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약일 수 있다. 일부 구현예에서, 1차 활성화 신호는 세포가 팽창/증식하도록 활성화시키기에 충분할 수 있다. 이러한 제1 시제는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 또는 또한 비가역적으로 결합될 수 있다. 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 세포 표면의 액세서리 분자를 자극하는 제2 시제에 또한 결합될 수 있다. 제2 시제는, 세포 표면의 액세서리 분자에 결합하는 경우, 활성화된 세포가 팽창하도록 자극할 수 있다. 또한 이러한 제2 시제는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로, 또는 또한 비가역적으로 결합될 수 있다. 다합체화 시제는 고체 지지체 상에 고정되거나, 또는 가용성일 수 있다. 하나의 양태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 림프구의 완전한 집단이 자극/팽창된 세포 집단의 연속적인 팽창이고, 이러한 팽창에 필요한 시약은 이후 적합한 고정상 상의 크로마토그래피에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 배양된 세포인 팽창/자극된 세포는 예를 들어 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 선택적으로 형질감염되며, 일부 양태에서, 도입된 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체에 결합하는 상이한 자극 분자로 제2 자극 팽창 처리될 수 있다.
외인성 성장 인자가 부재하거나 또는 소량의 외인성 성장 인자 하에서 시험관 내 T 세포 집단의 팽창 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다(예를 들어 미국 특허 6,352,694 B1 및 유럽 특허 EP 0 700 430 B1 참조). 일반적으로, 이러한 방법은 다양한 결합제 (예를 들어 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체)가 고정되어 있는, 1 μm 초과 직경의 고체 상 표면을 사용한다. 예를 들어, Dynabeads®CD3/CD28 (Invitrogen)은 T 세포 팽창을 위하여 상업적으로 입수 가능한 시약이며, 인간 T 세포상의 CD3 및 CD28 세포 표면 분자에 대하여 친화 정제된(affinity purified) 단일클론 항체의 혼합물로 코팅된 균일한, 4.5 μm 직경의, 초상자성, 멸균, 비발열성 폴리스타이렌 비드이다. 그러나, 환자에게 팽창된 T 세포를 투여하기 전에 이러한 자성 비드가 완전히 제거되어야 하기 때문에, 일부 경우에 이러한 자성 비드는 예를 들어, 임상 시험 또는 치료학적 목적에 요구되는 조건하에서 세포를 팽창시키는 방법으로 통합하기 어렵다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법이 이러한 우려를 해소한다. 일부 양태에서, 제공된 시약은 가역적이며, 따라서 자극 시제가 세포 조성물로부터 제거될 수 있다. 또한, 일부 양태에서, 시약, 예를 들어 자극 시제에 결합된 다합체화 시약 또는 올리고머 입자 시약은 지지체에 고정되지 않으며, 예컨대 고체 지지체 또는 표면 상에 고정되지 않는다. 이에 따라, 일부 양태에서, 시약, 예를 들어 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 가요성을 가지며 강성이 아니다. 일부 구현예에서, 시약은 세포 표면에 적응하거나 순응할 수 있다. 일부 구현예에서, 지지체, 예컨대 고정상을 비롯한, 고체 지지체에 시약을 고정시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 하나 이상의 표적 세포가 선별되어, 자극제에 동시에 또는 순차적으로 노출될 수 있는, 유사한 선별제를 사용하는 선별 방법과 함께 사용될 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 특정 세포 또는 세포의 서브세트의 자극은 자극과 함께 선별 및 분리에 의해 편향될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 배양 단계, 예를 들어 세포 조성물을 하나 이상의 수용체-결합제 (예를 들어 자극제)에 결합된 시약, 예를 들어 다합체화 시약 또는 올리고머 입자 시약과 접촉시키는 단계를 포함한다 (예를 들어 도 10A 및 10B 참조). 일부 구현예에서, 세포 조성물을 하나 이상의 결합된 수용체-결합제를 가지는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉시키고, 일반적으로 세포 집단을 하나 이상의 결합된 수용체-결합제을 가지는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 인큐베이션 한 뒤, 세포 집단은 복합체를 형성하거나, 제1 시제를 통해 다합체화 시제에 결합된다. 초기 샘플에 포함된 특이적 세포 표면 분자를 가지지 않는 다른 세포 집단은 하나 이상의 결합된 수용체-결합제을 가지는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합하지 않는다. 이와 관련하여, 세포 집단은 일반적으로 이의 표면에 다수의 세포 표면 분자의 복제본을 가지며, 이러한 다수의 복제본의 결합은 일반적으로 자극 또는 활성화에 필요함에 유의한다.
이에 따라, 다합체화 시제는 일반적으로 1개 초과의 결합 부위, 예를 들어 Z1를 제공하며, 일부 경우에, 복수의 시제는 예를 들어 하나 이상의 결합 부위, 예를 들어 Z1에 대한 하나 이상의 시제의 결합 파트너, 예를 들어 C1의 결합을 통해 가역적으로 결합될 수 있다. 이러한 일부 양태에서, 이는 제1 시제, 제2 시제 및/또는 다른 시제를 세포 집단에 충분한 밀도로 제공한다. 이와 관련하여, 다합체화 시제는 다중 결합 부위, 예를 들어, Z1를 가질 수 있고, 예를 들어, 천연 상태의 스트렙타비딘 뮤테인 (동종-사합체)은 4 개의 이러한 결합 부위, 예를 들어 Z1를 가지며, 추가적으로 올리고머화될 수 있음에 유의한다. 일부 경우에, 시약은 결합 파트너, 예를 들어 C1의 가역적 결합에 대해 오직 하나의 결합 부위, 예를 들어 Z1를 가질 수 있다. 이러한 예시로는 다합체의 칼모듈린이 있다. 칼모듈린은 칼모듈린 결합 펩타이드에 대하여 오직 하나의 결합 부위를 가진다. 그러나, 칼모듈린은 비오틴화된 후, 스트렙타비딘-올리고머와 반응하여 (또한 하기 참조), 다중 칼모듈린 분자가 “스캐폴드”에 고밀도로 존재하는 다합체화 시약을 제공함으로써, 다합체의 칼모듈린을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 이후, 또는 자극이 중단되기 원하는 다른 적합한 시점에, 가역적으로 결합된 시제의 결합 파트너 C로서 지칭되는 결합 파트너, 또한 예를 들어 C1과, 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 사이의 결합은, 각각의 가역적 결합을 파괴함으로써 파괴된다. 일부 경우에, 상기 파괴 단계는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합되어 있는 세포 집단을 포함하는 인큐베이션/반응 혼합물에 대한 경쟁자를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 가역적으로 결합된 시제의 결합 파트너 C, 예를 들어 C1과, 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 사이의 가역적 결합의 경쟁적인 파괴 (경쟁적인 용출로서 이해될 수 있음) 단계에서, 인큐베이션 혼합물/세포 집단은 유리 제1 결합 파트너 C, 예를 들어 C1, 또는 제1 결합 파트너와 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 사이의 결합을 파괴할 수 있는 상기 제1 결합 파트너 C의 유사체와 접촉할 수 있다. 결합 파트너 C, 예를 들어 C1의 예시로는, 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합하는 스트렙타비딘 결합 펩타이드가 있으며, 제1 유리 파트너는 상응하는 유리 스트렙타비딘 결합 펩타이드 또는 경쟁적으로 결합하는 유사체일 수 있다. 이러한 유사체는, 예를 들어, 비오틴 또는 비오틴 유도체 또는 데스싸이오비오틴과 같은 유사체일 수 있다.
일부 구현예에서, 유리 파트너 또는 이의 유사체를 첨가하면 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약으로부터 결합 파트너 C, 예를 들어 C1을 변위시키는데, 이는 결합 파트너가 가역적으로 결합된 시제에 포함되어 있음에 따라, 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약으로부터 이러한 시제의 변위가 달성된다. 상기 시제의 이러한 변위는, 제1 시제와 세포 표면 수용체 사이 결합의 결합 친화도이 10-2 M 내지 10-13 M 범위의 해리 상수 (Kd)를 가짐으로써 또한 가역적인 경우 세포 표면 분자로부터 제1 시제를 결국 해리시킨다. 이러한 해리로 인해, 일부 양태에서, 세포 집단의 자극이 또한 종결된다.
일부 구현예에서, 항원에 대한 항체 분자, 예를 들어, 세포 표면 수용체 분자의 결합 친화도는 일반적으로 Kd가 10-7 M 내지 10-13 M인 친화도 범위에 있다. 이에 따라, 종래의 단일클론 항체는 시제 (제1 또는 제2, 수용체-결합, 예를 들어 자극제, 또는 선별제)로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 더 강한 결합을 야기하는 임의의 원하지 않는 결합력 효과를 피하기 위해, 단일클론 항체는 또한 1가 항체 단편, 예컨대 Fab-단편 또는 단일 사슬 Fv 단편의 형태로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면 분자로부터 가역적으로 결합된 시제 또는 시제들의 해리로 인해, 제공된 방법은 이점 자극된 세포 집단이 자극 기간의 말기에 자극 시제를 가지지 않는 추가의 이점을 가진다. 또한, 일부 구현예에서, 상기 방법에 사용되는 다른 모든 시약, 즉 상기 시제 (예를 들어 제1 또는 제2, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제, 또는 선별제) 뿐만 아니라 결합 파트너 C, 예를 들어 C1의 경쟁 시약, 또는 이의 유사체는 “제거 카트리지”를 통해 자극된 세포 집단으로부터 용이하게 제거될 수 있다 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 2013/124474에 기재된 기술 참조). 일부 경우에, 예를 들어 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이 바이오리액터 표면 또는 자성 비드와 같은 고체 지지체 상에 고정되면, 이는 저지된다. 이에 따라, 유리 시제 및 경쟁 시약의 제거를 위한 제거 카트리지의 사용은 제2 크로마토그래피 컬럼에 용출 샘플 (예를 들어 가역적 결합 또는 결합의 파괴 이후 수득되는 샘플)을 로딩하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 크로마토그래피 컬럼은 친화성 크로마토그래피 매트릭스인, 동시에, 겔 투과 매트릭스로서 작용할 수 있는 적합한 고정상을 가진다. 일부 양태에서, 이러한 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 이에 고정된 친화성 시약을 가진다. 일부 구현예에서, 친화성 시약은, 예를 들어, 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 이의 혼합물일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시제 (예를 들어 제1 또는 제2, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제, 또는 선별제), 결합 파트너 C, C1의 경쟁 시약은 친화성 시약에 결합하여, 크로마토그래피 매트릭스에 고정된다. 결과적으로 단리 및 팽창된 세포 집단을 포함하는 용출 샘플은 상기 시제 (예를 들어 제1 또는 제2, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제, 또는 선별제) 및 경쟁 시약이 고갈된다. 일부 구현예에서, 배양된 조성물은 어떠한 반응물도 가지지 않으며, 이것은 일부 양태에서 진단 용도 (예를 들어, 추가적인 FACSTM 분류)와 관련된 사용 또는 임의의 세포에 기초한 치료적 용도에 유리하다.
일부 구현예에서, 상기 조성물로부터 시약 및 다른 성분을 제거하는 능력은 자성 비드와 같은 임의의 고체 지지체를 피할 수 있는 추가적인 이점을 가진다. 일부 구현예에서, 이것은, 이러한 자성 비드에 의한 활성화된 T 세포의 오염 위험이 최소한이거나, 가지지 않음을 의미한다. 일부 구현예에서, 이것은 또한 GMP 표준에 부합하는 공정이, 최종 팽창된 T 세포 집단이 자성 비드를 가지지 않도록 추가적인 조취가 취해져야 하는 Dynabeads®의 사용과 같은 다른 방법과 비교하여 더욱 용이하게 확립될 수 있음을 의미한다. 더욱이, 일부 구현예에서, 가용성 다합체화 시제를 사용하면 활성화된 세포 집단 (T 세포, B 세포 또는 또한 자연 살해 세포)로부터 이를 제거하기가 더욱 쉬워지는데, 이것은 이러한 세포가 원심분리에 의해 단순 침전될 수 있고, 가용성 다합체화 시제를 포함하는 상청액은 폐기될 수 있기 때문이다. 택일적으로, 가용성 다합체화 시제는 상기 기재된 바와 같이 제거 카트리지의 겔 투과 매트릭스에서 팽창된 세포 집단으로부터 제거될 수 있다 (예를 들어 국제 특허 출원 WO 2013/124474). 일부 구현예에서, 고체상 (예를 들어 자성 비드)이 존재하지 않기 때문에, 본 발명은 또한 공지된 세포 팽창 시스템, 예컨대 GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom)로부터 입수 가능한 Xuri Cell Expansion System W25 및 WAVE Bioreactor 2/10 System 또는 TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO,　USA)로부터 입수 가능한 QUANTUM®Bioreactor 2/10 System에 통합될 수 있는, 세포 팽창을 위한 자동화된 폐쇄 시스템을 제공한다.
일부 양태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 적어도 두 개의 특정 세포 표면 분자를 보유하는 세포 집단을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 세포 표면 분자는 세포 집단에 대한 1차 활성화 신호에 포함되는 반면, 제2 세포 표면 분자는 세포에 자극을 제공하는데 포함되는 세포 표면 상의 액세서리 분자이다. 구체적인 구현예에서, 세포 집단은, 세포에 1차 활성화 신호을 제공하는 제1 시제 및 세포 표면 상의 액세서리 분자를 자극하는 것과 같이 추가의 신호를 유도 또는 조절하는 제2 시제에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은, 세포에 1차 활성화 신호을 제공하는 제1 시제 및 세포 표면 상의 액세서리 분자를 자극하는 것과 같이 추가의 신호를 유도 또는 조절하는 제2 시제에 가역적으로 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉한다. 세포 집단은, 예를 들어, 세포 표면 분자가 TCR/CD3 복합체이고 세포 표면 분자는 액세서리 분자 CD28인 T 세포 집단일 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 다른 액세서리 분자를 통한 자극은 CD28을 통한 종래의 자극과 비교하여 덜 분화되고, 일부 경우에, 수명이 긴 집단 T 세포, 예컨대 수명이 긴 기억 T 세포를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 1차 활성화 신호로서 TCR/CD3 복합체의 결합 및 액세서리 분자 (예를 들어 CD28 또는 다른 액세서리 분자)의 결합은 T 세포의 팽창/증식에 필요할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 또한 제1 또는 제2 수용체-결합제 (예를 들어 자극제) 중 하나 또는 양자 모두와 동일한 시약, 예를 들어 동일한 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합된 적어도 하나의 선별제를 포함하도록 추가적으로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 인큐베이션 또는 배양으로부터 생성되는 하나 이상의 특징, 예컨대 하나 이상의 자극제의 존재하에 또한 일어나는 인큐베이션 또는 배양에서 적어도 하나의 이상 선별제의 존재하에 가역적으로 선별될 수 있는, T 세포의 서브세트에서의 팽창 (증식), 활성화, 공동자극, 및/또는 생존의 자극을 증강 또는 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예에 나타나는 바와 같이, T 세포 조성물의 팽장 정도는 이러한 세포가 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 자극제에 더하여 항-CD8 항체에도 가역적으로 결합된 다합체화된 시제와 함께 인큐베이션되는 경우 CD8+ 세포에서 선택적으로 증가하였다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 배양으로 생성되는 하나 이상의 특징, 예컨대 팽창 (증식), 활성화, 공동자극, 및/또는 생존의 자극은, 배양된 조성물 내 T 세포의 서브세트에서 적어도 1.5 배, 적어도 2.0 배, 적어도 3.0 배, 적어도 4.0 배, 적어도 5.0 배, 적어도 6.0 배, 적어도 7.0 배, 적어도 8.0 배, 적어도 9.0 배, 적어도 10 배 이상 증가할 수 있으며, 이러한 서브세트는 선별제 없이 오직 하나 이상의 자극제의 존재하에 인큐베이션된 경우와 비교하여 하나 이상의 자극제 및 선별 마커에 특이적으로 결합하는 선별제의 존재하에서 인큐베이션된 경우 선별 마커에 대해 양성이다. T 세포와 같은 세포의 이러한 편향성 또는 선별적 특징은 T 세포의 특정 서브세트 또는 집단의 종점 특징을 제어할 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 본 명세서에 기재된 임의의 선별 마커일 수 있다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO 중에서 선택된다.
일부 구현예에서, 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 제1 시제의 가역적 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1을 포함하며, 제1 시제는 또한 적어도 하나의 결합 파트너 C, 예를 들어 C1를 포함하고, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1은 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1에 가역적으로 또는 비가역적으로 결합할 수 있다. 이에 따라, 제1 시제는 다합체화 시제와 접촉하거나 인큐베이션되는 경우, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1과 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 사이에 형성된 가역적 결합을 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 또한, 제2 시제는 결합 파트너 C, 예를 들어 C2를 포함할 수 있고, 결합 파트너 C2는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z2에, 각각 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 시제는 다합체화 시제와 접촉하거나 인큐베이션되는 경우, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1과 결합 부위 Z, 예를 들어 Z2 사이에 형성된 가역적 결합을 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에, C1 및 C2는 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있고, 및/또는 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, Z1 및 Z2는 동일하거나 또는 실질적으로 동일할 수 있고, 및/또는 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합 파트너로서 C1 및 C2를 사용하여, 다합체화 시제의 동일한 결합 부위에 결합하는 모이어티는 (제1 결합 파트너 C1의, 및 또한 제2 결합 파트너 C2의) 동일한 경쟁 시약 또는 이의 유사체가 표적 세포 (예를 들어 T 세포) 집단의 팽창을 파괴하고, 일부 경우에는 종결시켜, 다합체화 시제로부터 이러한 표적 세포 (예를 들어 T 세포) 집단을 방출하도록 사용될 수 있는 이점을 가진다.
일부 경우에 결합 파트너 C를 포함하는 결합제 (예를 들어 예를 들어 제1 또는 제2, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제, 또는 선별제)를 제조하기 위해서, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 또는 C2는 상기 시제 (예를 들어 항체 단편)의 재조합 제조에 사용되는 개별적인 발현 벡터에 의해 제공되어, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 또는 C2가 N-말단 또는 C-말단에서 상기 시제와 함께 융합 펩타이드의 일부가 될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편인 시제와 관련하여, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 또는 C2는 경쇄 또는 중쇄의 C-말단에 존재할 수 있다. 또한, 항체 분자의 가변 도메인과 같은 재조합 단백질을 클로닝하고, 개별 단백질, 예를 들어 항체 단편을 재조합으로 제조하는 이러한 방법론은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Skerra, A. (1994)를 참조한다. 일부 구현예에서, 항체 분자는 파지 디스플레이 (예를 들어, Kay, B.K. et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual, 1st Ed., Academic Press, New York NY; Lowman, H.B. (1997) Annu . Rev. Biophys . Biomol . Struct . 26, 401-424, 또는 Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr . Opin . Biotechnol . 10, 87-93 검토), 리보솜 디스플레이 (Amstutz, P. et al. (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12, 400-405 검토) 또는 Wilson, D.S. et al. (2001) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98, 3750-3755에 보고된 mRNA 디스플레이와 같은 잘 알려진 진화적 방법에 의해, 주어진 표적, 예컨대 CD3 또는 CD28 또는 기재된 바와 같은 다른 액세서리 또는 자극제 분자에 대해 항체 유사 특성을 가지는 인공 결합 분자로 생성될 수 있다.
II. 가역적 시약 시스템 및 관련 용도
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 표면 상의 분자 (세포 표면 분자)에 결합할 수 있는 적어도 하나의 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)가 시약과 회합, 예를 들어, 가역적으로 회합되는, 가역적 시스템을 사용한다. 일부 경우에, 시약은 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 결합, 예를 들어, 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 시약은 적어도 하나의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 부위 B를 포함하며, 또한 시약의 적어도 하나의 결합 부위 Z에 특이적으로 결합하며 본 명세서에서 결합 파트너 C로 또한 지칭되는 결합 파트너를 포함한다. 일부 경우에, 결합 파트너 C와 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호 작용은 비공유 상호 작용이다. 일부 경우에, 결합 파트너 C와 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호 작용은 공유 상호 작용이다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C와 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호 작용, 예컨대 비공유 상호 작용은 가역적이다.
일부 구현예에서, 가역적 회합은 (용출 시약로도 불리는) 경쟁 시약과 같은 적어도 하나의 결합 부위 Z에 결합할 수 있는 결합부위이거나 이를 포함하는 물질의 존재하에 매개될 수 있다. 일반적으로, 상기 물질 (예를 들어 경쟁 시약)은 경쟁자 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 파트너 C는 이의 분리의 결과로서 적어도 하나의 결합 부위 Z로부터 해리된다. 특정 양태에서, 해리 이후, 결합 파트너 C는 (i) 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대해 다시 결합할 수 있거나, 또는, 일부 양태에서, 상기 물질, 예를 들어, 경쟁 시약이, 하나 이상의 결합 부위 Z에 먼저 결합하는 경우 (ii) 적어도 하나의 결합 부위 Z에 다시 결합하는 것이 방지될 것이다. 일부 양태에서, 상기 물질은 결합 파트너 C보다 더 높은 농도로 존재하기 때문에 높은 결합 친화도를 가지거나 및/또는 시약 내 존재하는 결합 부위 Z에 대해 높은 및/또는 충분한 농도로 존재할 수 있어, 하나 이상의 결합 파트너 C로부터 부착된 및/또는 회합된 결합 파트너 C의 양을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 상기 물질 (예를 들어 경쟁 시약)의 친화도는 적어도 하나의 결합 부위 Z에 대한 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 결합 파트너 C의 친화도보다 더 높다. 특정 구현예에서, 시약의 결합 부위 Z와 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 결합 파트너 C 사이의 결합은 물질 (예를 들어 경쟁 시약)을 첨가함으로써 제거 또는 감소될 수 있어, 일부 양태에서 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 및 시약의 회합이 효과적이게 가역적이게 만든다.
이러한 가역적 시스템에 사용될 수 있는 시약은 기술 분야 내 기술 및 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; 및 국제 공개 PCT 출원 WO2013/124474 및 WO2014/076277를 참조한다. 가역적 상호 작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 뿐만 아니라 이러한 결합을 역전시킬 수 있는 물질 (예를 들어 경쟁 시약)의 비제한적인 예시가 하기에 기재된다.
A. 시약
일부 구현예에서, 상기 시약은 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함된 결합 파트너 C에 가역적으로 결합할 수 있는 하나의 또는 복수의 결합 부위 Z를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함된 결합 파트너 C에 특이적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위 Z를 포함하여, 상기 시약이 복수의 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 가역적으로 결합할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 결합된 시약을 가지는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 개별 분자 (예를 들어 단량체) 또는 개별 분자 (예를 들어 사합체)를 구성하는 복합체의 올리고머 또는 중합체이며, 각각은 적어도 하나의 결합 부위 Z를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 적어도 2개의 결합 부위 Z, 적어도 2개의 결합 부위 Z, 적어도 4개의 결합 부위 Z, 예컨대 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72개 이상의 결합 부위 Z를 포함한다. 결합 부위가 모두 동일할 수 있거나, 또는 복수의 결합 부위가 하나 이상의 상이한 결합 부위 (예를 들어, Z1, Z2, Z3, 등)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 올리고머 입자 시약이며, 적어도 72, 120, 140, 200, 240, 280, 320, 360, 400, 440, 480, 520, 560, 600, 640, 680, 720, 760, 800, 900, 1,000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10,000, 또는 적어도 100,000개의 결합 부위 Z를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는, 상기 시약에, 예컨대 시약에 존재하는 하나의 또는 복수의 결합 부위 Z를 통해, 가역적으로 결합되는 것과 같이 회합한다. 일부 경우에, 이것은 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)가 서로 근접하게 배치되도록 하여, (적어도 2개의 복제본의) 세포 표면 분자를 가지는 표적 세포가 특정 분자에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위 B를 가지는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)와 접촉하게 되는 경우, 결합 효과가 일어날 수 있다.
일부 구현예에서, 동일한, 즉, 동일한 결합 부위 B를 가지는 2개 이상의 상이한 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 시약에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 구현예에서, 동일한 결합 부위 B를 포함하는 2개 이상의 상이한 시제는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 (종류의) 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)를, 일부 경우에, 3개 또는 4개의 상이한 (종류의) 시제, 예를 들어 2개 이상의 상이한 수용체-결합제 및/또는 선별제를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시약은 결합 부위 B1, B2, B3 또는 B4, 등을 포함하는 제1 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 및 또 다른 결합 부위, 예를 들어 또 다른 결합 부위 B1, B2, B3 또는 B4를 포함하는 제2 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 가역적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에, 제1 시제 및 제2 시제의 결합 부위는 동일할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 적어도 2개의 시제 (예를 들어 수용체-결합제 또는 선별제) 각각은 동일한 분자에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 제1 시제 및 제2 시제의 결합 부위는 상이할 수 있다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 시제 (예를 들어 수용체-결합제 또는 선별제) 각각은 상이한 분자, 예컨대 제1 분자, 제2 분자 등에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자는 동일한 표적 세포에 존재할 수 있다. 다른 경우에, 세포 표면 분자와 같은 상이한 분자는 동일한 세포 집단 내 존재하는 상이한 표적 세포에 존재할 수 있다. 일부 경우에, 제3, 제4 등의 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)가 동일한 시약과 회합될 수 있으며, 각각 상이한 결합 부위를 추가적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 동일한 결합 파트너 C를 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 상이한 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 상이한 결합 파트너를 포함한다. 일부 양태에서, 제1 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 시약에 존재하는 결합 부위 Z1에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 파트너 C1을 가질 수 있고, 제2 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 결합 부위 Z1 또는 시약에 존재하는 결합 부위 Z2에 특이적으로 결합하는 결합 파트너 C2을 가질 수 있다. 이에 따라, 일부 예시에서, 시제에 포함되는 복수의 결합 부위 Z는 결합 부위 Z1 및 Z2을 포함하고, 이는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 각각 포함되는 결합 파트너 C1 및 C2에 가역적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 동일하고, 및/또는 Z1 및 Z2는 동일하다. 다른 양태에서, 하나 이상의 복수의 결합 부위 Z는 상이할 수 있다. 다른 예시에서, 하나 이상의 복수의 결합 파트너 C는 상이할 수도 있다. 결합 파트너 C 각각이 결합 부위 Z 중 하나와 상호 작용, 예컨대 특이적으로 결합할 수 있는 한 결합 부위 Z를 포함하는 시약과 상용성이 있는 상이한 결합 파트너 C의 임의의 조합을 선택하는 것은, 당업자의 수준 내에 있다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대 뉴트라비딘) 또는 이의 혼합물이며, 이러한 시약은 결합 파트너 C와의 가역적인 회합을 위한 하나 이상의 결합 부위 Z를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드 또는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 다른 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘의 유사체 또는 뮤테인, 또는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 이의 생물학적 활성 단편에 가역적으로 결합하는 아비딘의 유사체 또는 뮤테인이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘의 유사체 또는 뮤테인 또는 아비딘의 유사체 또는 뮤테인이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 물질 (예를 들어 경쟁 시약)은 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 결합 파트너 C와 결합을 경쟁할 수 있는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C 및 상기 물질 (예를 들어 경쟁 시약)은 상이하고, 이러한 물질 (예를 들어 경쟁 시약)은 하나 이상의 결합 부위 Z에 대해 결합 파트너의 친화도와 비교하여 더 높은 결합 친화도를 나타낸다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 예컨대 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드일 수 있다. 마찬가지로, 아비딘은, 일부 양태에서, 야생형 아비딘 또는 뮤테인 또는 유사체 예컨대 뉴트라비딘, 일반적으로 더욱 중성의 pi를 나타내고 천연 아비딘의 대안으로 이용 가능한 개질된 아르기닌을 가지는 탈글리코실화된(deglycosylated) 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 탈글리코실화된, 아비딘의 중성 형태, 예를 들어 Sigma Aldrich를 통해 상업적으로 입수 가능한 "Extravidin", 또는 Thermo Scientific 또는 Invitrogen을 통해 수득 가능한 "NeutrAvidin"을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체이다. 일부 구현예에서, 야생형 스트렙타비딘 (wt-스트렙타비딘)은 Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882에 개시된 아미노산 서열 (서열 번호 1)을 가진다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 동일한 4개의 서브유닛의 사합체로서 자연 발생하며, 즉, 동종-사합체이고, 각각의 서브유닛은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대해 단일 결합 부위를 포함한다. 스트렙타비딘 서브유닛의 예시적인 서열은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열이지만, 이러한 서열은 또한 다른 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종으로부터 이의 상동체에 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각 서브유닛은 약 10-14 M의 해리 상수 (Kd)를 가져 비오틴에 대하여 강한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘은 4 개의 결합 부위 중 오직 하나가 기능적인 1가 사합체로서 존재할 수 있거나 (Howarth et al. (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang et al. (2015) Biochem . Biophys . Res. Commun., 463:1059-63)), 4 개의 결합 부위 중 2 개가 기능적인 2가 사합체로서 존재할 수 있거나 (Fairhead et al. (2013) J. Mol . Biol., 426:199-214), 또는 단량체 또는 이합체의 형태로 존재할 수 있다 (Wu et al. (2005) J. Biol . Chem., 280:23225-31; Lim et al. (2010) Biochemistry, 50:8682-91).
일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 임의의 형태, 예컨대 야생형 또는 비개질된 스트렙타비딘, 예컨대 스트렙토마이세스 종으로부터의 스트렙타비딘 또는 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 기능적 서브유닛을 포함하는 이의 기능적 활성 단편, 예컨대 일반적으로 서열 번호 1에 제시된 스트렙토마이세스 아비디니로부터의 야생형 스트렙타비딘 또는 이의 기능적 활성 단편의 적어도 하나의 기능적 서브유닛을 포함하는 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 N- 및/또는 C-말단이 짧아진 야생형 스트렙타비딘의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 미니멀 스트렙타비딘은 서열 번호 1의 아미노산 위치 10 내지 16의 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열 번호 1아미노산 위치 133 내지 142의 영역에서 C-말단으로 종결하는 임의의 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘의 기능적인 활성 단편은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열 번호 2에 제시된 것과 같은 스트렙타비딘은 서열 번호 1에 제시된 넘버링으로 Ala13에 상응하는 위치에 N-말단 메티오닌을 추가적으로 포함할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 위치에 대한 기준은 잔기 서열 번호 1의 잔기 넘버링을 참조한다.
일부 양태에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가에 의한 비개질된 또는 야생형 스트렙타비딘의 서열로부터 구분되지만, 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 대한 결합 부위를 포함하는 적어도 하나의 기능적 서브유닛을 포함하는 폴리 펩타이드를 포함한다. 일부 양태에서, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드 및 스트렙타비딘 뮤테인은 본질적으로 야생형 스트렙타비딘과 면역학적으로 동등한 폴리펩타이드일 수 있으며, 특히 wt-스트렙타비딘과 동일한 또는 상이한 친화도로 비오틴, 비오틴 유도체 또는 비오틴 유사체와 결합할 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 일부가 아닌 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 유사 폴리펩타이드는 숙주에 의해 생성된(host-produced) 폴리펩타이드를 야생형 스트렙타비딘의 구조로 변형시키기 위해 필요한 효소를 가지지 않기 때문에 야생형 스트렙타비딘과 동일하지 않은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 또한 스트렙타비딘 사합체 및 스트렙타비딘 이합체, 특히 스트렙타비딘 동종사합체, 스트렙타비딘 동종이합체, 스트렙타비딘 이종사합체 및 스트렙타비딘 이종이합체로서 존재할 수 있다. 일반적으로, 각 서브유닛은 통상적으로 비오틴 또는 비오틴 유사체에 대한, 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 대한 결합 부위를 가진다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 예는, 예를 들어, WO 86/02077, DE 19641876 Al, US 6,022,951, WO 98/40396 또는 WO 96/24606에 언급되어 있다.
일부 구현예에서, 비오틴은 일반적으로 이의 천연의 d-입체 이성질체, 즉, D-비오틴으로 사용된다. 일부 구현예에서, 비오틴은 D-비오틴이다. 구체적인 구현예에서, 비오틴 유사체 및/또는 유도체의 예로는, D-비오틴, N-케톤 비오틴 유사체, 케톤 비오틴 유사체, N-아자이드 비오틴 유사체, 아자이드 비오틴 유사체, N-아실 아자이드 비오틴 유사체, NBD-GABA 비오틴 유사체, 1,2-다이아민 비오틴 유사체, N-알카인 비오틴 유사체, 테트라싸이올 비오틴 유사체, N-하이드록시석신이미드-이미노비오틴, 이미노비오틴, 아마이도비오틴 N-하이드록시석신이미드-이미노비오틴, 아마이도비오틴, 데스싸이오비오틴, 비오틴 설폰, 카프로일아마이도비오틴 및 비오시틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 비오틴 유사체는 비오틴 설폰, 2'-싸이오비오틴, 2'-이미노비오틴, d-데스싸이오비오틴, 다이-데스싸이오비오틴, 다이-데스싸이오비오틴 메틸 에스터 및 다른 이미다졸리돈 유도체 및 문헌 Green, N.M., (1975) in Advances in Protein Chemistry (Anson, M.L. and Edsell, J.T., Eds), Vol. 29, pp. 85-133, Academic Press, New York에 기재된 것들이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 비오틴 유사체 또는 유도체는 D-비오틴, 데스싸이오비오틴, 및/또는 이미노비오틴이다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 비개질된 또는 야생형 스트렙타비딘의 이부가 아닌 아미노산을 포함할 수 있거나, 또는 야생형 또는 비개질된 스트렙타비딘의 일부만을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 비개질된 또는 야생형 스트렙타비딘의 서브 유닛과 비교하여, 예컨대 서열 번호 1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 서브유닛 또는 예를 들어 서열 번호 2에 제시된 이의 기능적 활성 단편과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환 (대체)를 가질 수 있는 적어도 하나의 서브유닛을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 스트렙타비딘 뮤테인의 서브유닛은 야생형 또는 비개질된 스트렙타비딘과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이 상이할 수 있고 및/또는 서열 번호 1, 2 또는 59에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 적어도 하나의 서브유닛을 포함할 수 있으며, 이러한 스트렙타비딘 뮤테인은 결합 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 기능적인 활성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 아미노산 대체 (치환)은 보존적 또는 비보존적 돌연변이이다. 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 기술 분야 내 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 5,168,049; 5,506,121; 6,022,951; 6,156,493; 6,165,750; 6,103,493; 또는 6,368,813; 또는 국제 공개 PCT 출원 WO2014/076277을 참조한다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 대해 하나 이상의 결합 부위 Z를 포함하는 하나 이상의 기능적 서브유닛, 예컨대 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 및, 일부 경우에, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 기능적 서브유닛을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 단량체; 이합체, 예를 들어 이종이합체 또는 동종이합체; 사합체, 예를 들어 동종사합체, 이종사합체, 1가 사합체 또는 2가 사합체를 포함할 수 있거나; 또는 고차 다합체 또는 이의 올리고머를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 펩타이드 리간드 결합 파트너에 대한 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 친화도, 예컨대 해리 상수 (Kd)는 1 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-5 M, 5x 10-5 M, 1 x 10-6 M, 5 x 10-6 M 또는 1 x 10-7 M 미만이지만, 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M 초과이다. 예를 들어, 미국 특허 5,506,121에 개시된 펩타이드 서열 (Strep-태그)은 비오틴 모방체로서 작용할 수 있고, 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도는, 예를 들어, 대략 10-4 내지 10-5 M의 Kd으로 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 결합 친화도는 스트렙타비딘 분자 내에 돌연변이를 만들어서 더욱 향상될 수 있으며, 예를 들어 미국 특허 6,103,493 또는 국제 공개 PCT 출원 WO2014/076277를 참조한다. 일부 구현예에서, 결합 친화도는 기술 분야 내 공지된 방법, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인과 같은 시약은 펩타이드 리간드 결합 파트너에 대한 결합 친화도를 나타내며, 펩타이드 리간드 결합 파트너는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 내 존재하는 결합 파트너 C일 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 서열 번호 9에 제시된 일반식을 가지는 서열, 예컨대 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 서열 번호 11에 제시된 일반식, 예컨대 서열 번호 12에 제시된 일반식을 가진다. 한 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (또한 Strep-tag®로도 불리며, 서열 번호 7에 제시됨)이다. 한 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (또한 Strep-tag®II로도 불리며, 서열 번호 8에 제시됨)이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 적어도 2개의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 포함하고, 두 모듈 사이의 거리는 적어도 0 내지 50 개의 아미노산이며, 하나의 결합 모듈은 3 내지 8개의 아미노산을 가지며 적어도 서열 His-Pro-Xaa (서열 번호 9)을 포함하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴, 또는 메티오닌, 다른 결합 모듈은 동일한 또는 상이한 스트렙타비딘 펩타이드 리간드, 예컨대 서열 번호 11에 제시된 서열을 가진다(예를 들어, 국제 공개 PCT 출원 WO02/077018; 미국 특허 7,981,632를 참조한다). 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 서열 번호 13 또는 14 중 어느 하나에 제시된 일반식을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 서열 번호 15-19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가진다. 대부분의 경우에, 상기 모든 스트렙타비딘 결합 펩타이드는 동일한 결합 부위에, 즉 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합한다. 하나 이상의 이러한 스트렙타비딘 결합 펩타이드가 결합 파트너 C, 예를 들어 C1 및 C2로서 사용되는 경우, 결합 파트너 C를 통해 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 일반적으로 하나 이상의 스트렙타비딘 뮤테인으로 구성된다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 스트렙타비딘 뮤테인이거나, 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘 제시된 서열 번호 1 또는 이의 생물학적 활성 부분과 비교하여 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어 아미노산 치환)을 포함한다. 예를 들어, 스트렙타비딘의 생물학적 활성 부분은 N- 및/또는 C-말단이 단축된 스트렙타비딘 변이체를 포함할 수 있으며, 일부 경우에 미니멀 스트렙타비딘으로 불린다. 일부 구현예에서, 임의의 돌연변이가 생성될 수 있는 N-말단 단축의 미니멀 스트렙타비딘은 아미노산 위치 10 내지 16 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열 번호 1에 제시된 서열과 비교하여 아미노산 위치 133 내지 142 영역에서 C-말단으로 종결된다. 일부 구현예에서, 임의의 돌연변이가 생성될 수 있는 N-말단 단축의 스트렙타비딘은 서열 번호 2 또는 59에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 미니멀 스트렙타비딘은 위치 Ala13 내지 Ser139로부터의 아미노산 서열을 포함하고, 선택적으로 Ala13 대신 N-말단 메티오닌 잔기를 가진다. 본 명세서의 목적을 위해, 아미노산 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 제시된 wt-스트렙타비딘의 넘버링을 기준으로 한다 (예를 들어 Argarana et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871 -1882, 및 또한 도 9 참조).
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미국 특허 6,103,493에 기재된 바와 같은 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열, 예컨대 서열 번호 1에 제시된 서열을 기준으로 아미노산 위치 44 내지 53 영역 내에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 잔기 44, 45, 46, 및/또는 47에 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 위치 44에서 Glu를 소수성 지방족 아미노산, 예를 들어 Val, Ala, Ile 또는 Leu, 위치 45의 임의의 아미노산, 지방족 아미노산, 예컨대 위치 46의 소수성 지방족 아미노산으로의 치환 및/또는 위치 47에서 Val를 염기성 아미노산, 예를 들어 Arg 또는 Lys, 예컨대 일반적으로 Arg으로의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Ala는 위치 46에 있고 및/또는 Arg는 위치 47에 있고 및/또는 Val 또는 Ile는 위치 44에 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 돌연변이체는 예컨대 서열 번호 3 또는 서열 번호 4 또는 60에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 (스트렙타비딘 돌연변이체 1, SAM1으로도 알려짐)에 제시된 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 5, 6, 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인(SAM2로도 알려짐)에 제시된 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 이러한 스트렙타비딘 뮤테인은, 예를 들어, 미국 특허 6,103,493에 기재되어 있으며, 상표명 Strep-Tactin®으로 상업적으로 입수 가능하다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 국제 공개 PCT 출원 WO 2014/076277에 기재된 바와 같은 돌연변이체이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 위치를 기준으로 아미노산 위치 44 내지 53 영역에 적어도 두 개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스테인 잔기는 위치 45 내지 52에 존재하여 이러한 아미노산을 연결하는 이황화 결합을 생성한다. 이러한 구현예에서, 아미노산 44는 일반적으로 글리신 또는 알라닌이며, 아미노산 46은 일반적으로 알라닌 또는 글리신이고, 아미노산 47은 일반적으로 아르기닌이다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 1에 제시된 아미노산 위치를 기준으로 아미노산 잔기 115 내지 121 영역에 적어도 하나의 돌연변이 또는 아미노산 차이를 포함한다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 아미노산 위치 117, 120 및 121에 적어도 하나의 돌연변이 및/또는 아미노산 118 및 119에서의 결실 및 적어도 아미노산 위치 121에서의 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 위치 117에 상응하는 위치에 돌연변이를 포함하며, 이러한 돌연변이는 큰 소수성 잔기인 Trp, Tyr 또는 Phe 또는 하전된 잔기인 Glu, Asp 또는 Arg, 또는 친수성 잔기인 Asn 또는 Gln, 또는, 일부 경우에, 소수성 잔기인 Leu, Met 또는 Ala, 또는 극성 잔기인 Thr, Ser 또는 His일 수 있다. 일부 구현예에서, 위치 117에서의 돌연변이는 위치 120에 상응하는 위치에서 작은 잔기인 Ser 또는 Ala 또는 Gly일 수 있는 돌연변이, 및 위치 121에 상응하는 위치에서 소수성 잔기, 예컨대 벌키한 소수성 잔기인 Trp, Tyr 또는 Phe일 수 있는 돌연변이와 조합된다. 일부 구현예에서, 위치 117에서의 돌연변이는 서열 번호1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 또는 이의 생물학적 활성 단편의 위치 120에 상응하는 위치에서 소수성 잔기인 Leu, Ile, Met, 또는 Val 또는, 일반적으로, Tyr 또는 Phe일 수 있는 돌연변이, 및 서열 번호1에 제시된 야생형 스트렙타비딘 또는 이의 생물학적 활성 단편의 위치와 비교하여 위치 121에 상응하는 위치에서 작은 잔기인 Gly, Ala, 또는 Ser인 돌연변이, 또는 Gln, 또는 소수성 잔기인 Leu, Val, Ile, Trp, Tyr, Phe, 또는 Met와 조합된다. 일부 구현예에서, 이러한 뮤테인은 또한 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 잔기 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 Val44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 뮤테인 스트렙타비딘은 서열 번호27 또는 서열 번호28에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 서열 번호 27 또는 서열 번호 28에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열은, Val44, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121 잔기를 포함하며, 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하는 기능적 활성을 나타낸다.
일부 구현예에서, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인과 같은 분자는 약 5 내지 30개의 1차 아민을 가지며, 이는 일부 경우에, N-말단 아민 및/또는 하나 이상의 라이신 잔기를 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 분자는 기재된 임의의 스트렙타비딘 뮤테인을 비롯하여 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 사합체이며, 이러한 분자는, 사합체로서, 5개 초과의 1차 아민, 예컨대 일반적으로 5 내지 40 개, 또는 15 내지 35개, 예컨대 일반적으로 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 14, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32개 이상의 1차 아민을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 절두된 이의 단편, 예컨대 상기 기재된 임의의 분자이다. 구체적인 구현예에서, 상기 분자는 서열 번호 2, 4, 6, 27, 59, 60 또는 61 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 사합체이며, 이는, 사합체로서, 단량체 당 1개의 N-말단 아민 및 4개의 라이신을 비롯하여 20개의 1차 아민을 포함하는 분자이다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 상기 돌연변이 중 임의의 하나를 임의의 조합으로 포함할 수 있으며, 생성된 스트렙타비딘 뮤테인은 펩타이드 리간드 (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불림, 서열 번호 7에 제시됨)에 대해 3.7 x 10-5 M 이하인 해리 상수 (Kd) 및/또는 펩타이드 리간드 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag®II로도 불림, 서열 번호 8에 제시됨)에 대하여 7.1 x 10-5 M 이하인 해리 상수 및/또는 서열 번호7-19 중 어느 하나에 제시된 펩타이드 리간드 중 어느 하나에 대해 7.0 x 10-5 M, 6.0 x 10-5 M, 5.0 x 10-5 M, 4.0 x 10-5 M, 3.0 x 10-5 M, 2.0 x 10-5 M, 1.0 x 10-5 M, 9.0 x 10-6 M, 8.0 x 10-6 M, 7.0 x 10-6 M, 6.0 x 10-6 M, 5.0 x 10-6 M, 4.0 x 10-6 M, 3.0 x 10-6 M, 2.0 x 10-6 M, 1.0 x 10-6 M, 9.0 x 10-7 M, 8.0 x 10-7 M, 7.0 x 10-7 M, 6.0 x 10-7 M, 5.0 x 10-7 M, 4.0 x 10-7 M, 3.0 x 10-7 M, 2.0 x 10-7 M 또는 1.0 x 10-7 M 이하이지만, 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M 이상인 해리 상수를 특징으로 하는 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 상기 돌연변이 중 임의의 하나를 임의의 조합으로 포함할 수 있으며, 생성된 스트렙타비딘 뮤테인은 펩타이드 리간드 (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®로도 불림, 서열 번호 7에 제시됨)에 대해 2.7 x 104 M-1 이상의 회합 상수 (Ka) 및/또는 펩타이드 리간드 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II로도 불림, 서열 번호 8에 제시됨)에 대하여 1.4 x 104 M-1 이상의 회합 상수 및/또는 서열 번호7-19 중 어느 하나에 제시된 펩타이드 리간드 중 어느 하나에 대해 1.43 x 104 M-1, 1.67 x 104 M-1, 2 x 104 M-1, 3.33 x 104 M-1, 5 x 104 M-1, 1 x 105 M-1, 1.11 x 105 M-1, 1.25 x 105 M-1, 1.43 x 105 M-1, 1.67 x 105 M-1, 2 x 105 M-1, 3.33 x 105 M-1, 5 x 105 M-1, 1 x 106 M-1, 1.11 x 106 M-1, 1.25 x 106 M-1, 1.43 x 106 M-1, 1.67 x 106 M-1, 2 x 106 M-1, 3.33 x 106 M-1, 5 x 106 M-1, 1 x 107 M-1 이상이지만, 일반적으로 1 x 1013 M-1, 1 x 1012 M-1 또는 1 x 1011 M-1 이하인 회합 상수를 특징으로 하는 결합 친화도를 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내며, 펩타이드 리간드 (Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; STREP-TAG®로도 불림, 서열 번호 7에 제시됨)에 대해 3.7 x 10-5 M 이하인 해리 상수 (Kd) 및/또는 펩타이드 리간드 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; STREP-TAG®II로도 불림, 서열 번호 8에 제시됨)에 대해 7.1 x 10-5 M 이하인 해리 상수 및/또는 서열 번호7-19 중 어느 하나에 제시된 펩타이드 리간드 중 어느 하나에 대해 7.0 x 10-5 M, 6.0 x 10-5 M, 5.0 x 10-5 M, 4.0 x 10-5 M, 3.0 x 10-5 M, 2.0 x 10-5 M, 1.0 x 10-5 M, 9.0 x 10-6 M, 8.0 x 10-6 M, 7.0 x 10-6 M, 6.0 x 10-6 M, 5.0 x 10-6 M, 4.0 x 10-6 M, 3.0 x 10-6 M, 2.0 x 10-6 M, 1.0 x 10-6 M, 9.0 x 10-7 M, 8.0 x 10-7 M, 7.0 x 10-7 M, 6.0 x 10-7 M, 5.0 x 10-7 M, 4.0 x 10-7 M, 3.0 x 10-7 M, 2.0 x 10-7 M 또는 1.0 x 10-7 M이하이지만, 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M 이상인 해리 상수를 특징으로 하는 결합 친화도를 나타내는 아미노산 서열을 나타낸다.
일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 또한 다른 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비제한적으로 비오틴, 이미노비오틴, 리포산, 데스싸이오비오틴, 다이아미노비오틴, HABA (하이드록시아조벤젠-벤조산) 및/또는 다이메틸-HABA과 같은 대한 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 또 다른 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비오틴 또는 데스싸이오비오틴에 대하여 결합 친화도를 나타내며, 이러한 친화도는 서열 번호 7-19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 비오틴 모방체 펩타이드 리간드에 대하여 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 친화도보다 크다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 또 다른 스트렙타비딘 리간드, 예컨대 비오틴 또는 데스싸이오비오틴에 대하여 결합 친화도를 나타내며, 이러한 친화도는 서열 번호 7-19 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 비오틴 모방체 펩타이드 리간드에 대하여 스트렙타비딘 뮤테인의 결합 친화도가 동일하거나, 이와 거의 동일하거나, 이보다 작다. 일부 구현예에서, 비오틴 또는 비오틴 유사체 또는 유도체 (예를 들어 데스싸이오비오틴)는 제공된 방법에서 경쟁 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 예시로서, Strep-tactin® 으로 명명된 뮤테인 스트렙타비딘 (예를 들어 서열 번호 4 또는 60에 제시된 서열을 포함)과 STREP-TAG ® II 으로 명명된 펩타이드 리간드 (예를 들어 서열 번호 8에 제시됨)의 상호작용은 비오틴-스트렙타비딘 상호 작용에 대한 대략 10-13 M와 비교하여 대략 10-6 M의 Kd를 가지는 결합 친화도를 특징으로 한다. 일부 경우에, Strep-Tactin®에 대해 약 10-10 내지 10-13 M의 Kd의 높은 친화도 결합할 수 있는 비오틴은, 결합 부위에 대해 STREP-TAG ® II와 경쟁할 수 있다.
일부 경우에, 상기 시약은 전이 금속 이온에 대해 결합할 수 있는 적어도 두 개의 킬레이트 그룹 K를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약은 올리고히스티딘 친화도 태그, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 칼모듈린 또는 이의 유사체, 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP), FLAG-펩타이드, HA-태그, 말토스 결합 단백질 (MBP), HSV 에피토프, myc 에피토프, 및/또는 비오틴화된 담체 단백질에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 단량체의 개별 분자 또는 개별 분자를 구성하는 서브 유닛의 복합체를 직접적으로 또는 간접적으로 연결함으로써, 자연적으로 존재하는 단백질의 개별 분자를 직접적으로 또는 간접적으로 연결하여 (예를 들어 자연적으로 존재하는 단백질의 이합체, 삼합체, 사합체, 등을 직접적으로 또는 간접적으로 연결하여) 생성될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 사합체성 스트렙타비딘 또는 아비딘은 각각의 올리고머 또는 중합체의 개별 분자 또는 가장 작은 빌딩 블록으로 지칭될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘의 사합체성 동종이합체 또는 이종이합체는 각각의 올리고머 또는 중합체의 개별 분자 또는 가장 작은 빌딩 블록으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 적어도 2개의 단백질 개별 분자의 연결부를 포함할 수 있고 (예를 들어 2-합체이고), 또는 단백질 개별 분자의 적어도 3-합체, 4-합체, 5-합체, 6-합체, 7-합체, 8-합체, 9-합체, 10-합체, 11-합체, 12-합체, 13-합체, 14-합체, 15-합체, 16-합체, 17-합체, 18-합체, 19-합체, 20-합체, 25-합체, 30-합체, 35-합체, 40-합체, 45-합체 또는 50-합체 (예를 들어, 단량체, 사합체)일 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고머는 단백질 개별 본자의 적어도 100-합체, 200-합체, 300-합체, 400-합체, 500-합체, 1,000-합체, 1,500-합체, 2,000-합체, 2,500-합체, 3,000-합체, 또는 적어도 3,500-합체일 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 섹션 II(A)(1) 또는 (2)에 기재된 올리고머 입자 시약이거나, 또는 섹션 II(B)(3)에 기재된 방법에 의해 제품화된 올리고머 입자 시약이다.
올리고머는 기술 분야 내 공지된 임의의 방법, 예컨대 공개된 미국 특허 출원 US2004/0082012에 기재된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 예컨대 다당류 또는 이작용성 링커에 의해 가교될 수 있는 둘 이상의 개별 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 다당류의 존재하에 개별 분자 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛의 복합체를 가교함으로써 수득된다. 일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 카복실 잔기를 다당류, 예를 들어 덱스트란 내로 도입함으로써 제조될 수 있다. 일부 양태에서, 시약의 개별 분자 (예를 들어, 단량체, 사합체)는 종래의 카보다이이미드 화학반응을 사용하여 내부 라이신 잔기의 1차 아미노 기 및/또는 유리 N-말단을 통해 덱스트란 백본의 카복실 기에 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, 커플링 반응은 덱스트란의 몰 당 약 60 몰의 시약의 개별분자 (예를 들어, 단량체, 사합체)의 몰비로 수행된다.
일부 구현예에서, 상기 시약은 하나 이상의 스트렙타비딘 또는 아비딘, 또는 스트렙타비딘의 임의의 유사체 또는 뮤테인, 또는 아비딘의 유사체 또는 뮤테인 (예를 들어 뉴트라비딘)의 올리고머 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 결합 부위 Z는 아비딘 또는 스트렙타비딘의 천연 비오틴 결합 부위이고, 개별 분자 내 최대 4개의 결합 부위가 존재할 수 있으며 (예를 들어 사합체는 4개의 결합 부위 Z를 포함하며), 여기서 동종-사합체는 최대 4개의 동일한 결합 부위, 즉, Z1을 포함할 수 있는 반면, 이종-사합체는 최대 4개의 상이한 결합 부위, 예를 들어 Z1 및 Z2를 포함하는 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 동일한 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 복수의 개별 분자 (예를 들어 복수의 동종-사합체)로부터 생성 또는 제조되며, 이러한 경우에서 올리고머의 각각의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1은 동일하다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고머는 복수의 결합 부위 Z1, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50개 이상의 결합 부위 Z1를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 이종-사합체일 수 있는 복수의 개별 분자로부터 및/또는 결합 부위 Z가 상이한, 예를 들어 Z1 및 Z2인 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인의 복수의 2개 이상의 상이한 개별 분자 (예를 들어 상이한 동종-사합체)로부터 생성 또는 제조되며, 이러한 경우에서 복수의 상이한 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 및 Z2는 올리고머에 존재할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 올리고머는 복수의 결합 부위 Z1 및 복수의 결합 부위 Z를 포함할 수 있고, 이는 조합하여, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50개 이상의 조합된 결합 부위 Z1 및 Z2를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 개별 올리고머 또는 중합체는 다당류에 의해 가교될 수 있다. 하나의 구현예에서, 스트렙타비딘, 또는 아비딘, 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 유사체 (예를 들어, 뉴트라비딘)의 올리고머 또는 중합체는 본질적으로 문헌 Noguci, A, et al, Bioconjugate Chemistry (1992) 3,132-137에 기재된 바와 같이 제1 단계에서, 다당류, 예를 들어 덱스트란 내로 카복실 잔기를 도입함으로써 제조될 수 있다. 이러한 일부 양태에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 이의 유사체는 이후 제2 단계에서 종래의 카보다이이미드 화학반응을 사용하여 내부 라이신 잔기의 1차 아미노 기 및/또는 유리 N-말단을 통해 덱스트란 백본의 카복실 기에 연결될 수 있다. 일부 경우에, 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 임의의 유사체의 가교된 올리고머 또는 중합체는 또한 글루타다이알데하이드와 같이 링커의 역할을 하는 이작용성 분자를 통해 가교하거나, 또는 기술 분야 내 공지된 다른 방법에 의해 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체는 이작용성 링커 또는 다른 화학적 링커, 예컨대 글루타다이알데하이드를 사용하여 개별 분자 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛의 복합체를 가교하거나, 또는 기술 분야 내 공지된 다른 방법에 의해 수득된다. 일부 양태에서, 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 아비딘의 임의의 뮤테인 또는 유사체의 가교된 올리고머 또는 중합체는 글루타다이알데하이드와 같이 링커의 역할을 하는 이작용성 분자를 통해 개별 스트렙타비딘 또는 아비딘 분자를 가교하거나, 또는 기술 분야 내 공지된 다른 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 싸이올 기를 스트렙타비딘 뮤테인 내로 도입하고 (이는, 예를 들어, 스트렙타비딘 뮤테인과 2-이미노싸이올란 (Trauts 시약)을 반응시킴으로써 수행될 수 있음), 예를 들어 별도의 반응으로, 아미노 기 스트렙타비딘 뮤테인 내 이용 가능한 아미노 기를 활성화시킴으로써 스트렙타비딘 뮤테인의 올리고머를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 아미노 기의 활성화는 스트렙타비딘 뮤테인과 상업적으로 입수 가능한 이종이작용성 가교제, 예컨대 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포 SMCC) 또는 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)를 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 일부 이러한 구현예에서, 수득되는 두 개의 반응 생성물이 함께 혼합되어, 일반적으로 개질된 스트렙타비딘 뮤테인의 하나의 배치에 포함된 싸이올 기와 개질된 스트렙타비딘 뮤테인의 다른 배치 중 (예컨대 말레이미드 기능에 의해) 활성화된 아미노산의 반응을 유도한다. 일부 경우에, 이러한 반응에 의해, 스트렙타비딘 뮤테인의 다합체/올리고머가 형성된다. 이러한 올리고머는 임의의 적합한 개수의 개별 분자, 예컨대 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000개 이상의 개별 분자를 가질 수 있으며, 올리고머화 정도는 반응 조건에 따라서 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 또는 중합체 시약은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분리될 수 있고, 임의의 원하는 분획은 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 개질된 스트렙타비딘 뮤테인을 2-이미노싸이올란 및 이종이작용성 가교제, 예컨대 설포 SMCC의 존재하에 반응시킨 후, 올리고머 또는 중합체 시약은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분리될 수 있고, 임의의 원하는 분획은 시약으로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 단일 분자량을 가지지 않지만 (가질 필요가 없지만) Gaussian 분포와 같은 통계적 중량 분포를 관찰할 수 있다. 일부 경우에, 3개 초과의 스트렙타비딘 또는 뮤테인 사합체, 예를 들어, 동종사합체 또는 이종사합체, 예컨대 일반적으로 3 내지 50개의 사합체, 예를 들어, 동종사합체 또는 이종사합체, 10 내지 40개의 사합체, 예를 들어, 동종사합체 또는 이종사합체, 또는 25 내지 35개의 사합체, 예를 들어, 동종사합체 또는 이종사합체를 가지는 임의의 올리고머는 시약으로서 사용될 수 있다. 올리고머는, 예를 들어, 3 내지 25개의 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 예를 들어, 동종사합체 또는 이종사합체를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 스트렙타비딘 뮤테인에 대해 분자량이 약 50 kDa인 올리고머는 분자량이 약 150 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 150 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 150 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 150 kDa 내지 1000 kDa, 약 150 kDa 내지 약 500 kDa 또는 약 150 kDa 내지 약 300 kDa, 약 300 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 300 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 300 kDa 내지 1000 kDa, 약 300 kDa 내지 약 500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 500 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 500 kDa 내지 1000 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 2000 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 1500 kDa, 약 1000 kDa 내지 약 1250 kDa, 약 1250 kDa 내지 약 2000 kDa 또는 약 1500 kDa 내지 약 2000 kDa일 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 분자량이 2,000 kDa 초과일 수 있다. 일반적으로, 각각의 스트렙타비딘 분자/뮤테인이 4개의 비오틴 결합 부위를 가지기 때문에, 이러한 시약은 12 내지 160개의 결합 부위 Z, 예컨대 12 내지 160 이상 결합 부위 Z를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머는 가용성 시약이다.
1. 올리고머 입자 시약
본 명세서에는 복수의 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성된 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 가용성 시약이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 적어도 하나의 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은, 예를 들어, 하나 이상의 시제에 부착되는 결합 파트너, 예를 들어, 결합 파트너 C의 부위에서, 하나 이상의 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제에 가역적으로 결합된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 섹션 II(B)에 기재된 임의의 방법에 의해 생성, 제조, 또는 제품화된 올리고머 입자이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 및/또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 분자인 올리고머화된 분자로 구성되고 및/또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 수용체-결합제에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머화된 분자를 포함하고 및/또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 섹션 II(B)(4) 및/또는 섹션 II(B)(5)에 기재된 시제에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제에 부착되는, 결합 파트너, 예를 들어, 결합 파트너 C 내의 위치에서 하나 이상의 시제에 결합하거나, 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 올리고머화된 분자는 섹션 II(A)에 기재된 결합 파트너 C에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다.. 일부 구현예에서, 올리고머화된 분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대 뉴트라비딘)이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘은 천연 상태의 사합체이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 상기 분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대 뉴트라비딘)의 사합체이다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 섹션 II(A)에 기재된 임의의 시약 중 복수의 하나 이상의 시약을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 크기는 기술 분야 내 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 질량 및/또는 분자량은 비제한적으로 전기영동법, 예를 들어, SDS-PAGE, 크로마토그래피, 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피 또는 SEC, 또는 질량 분석법을 포함하는 기술 분야 내 임의의 적합한 수단에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 크기, 예를 들어 반경은 동적 광산란 기법 (DLS)에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 크기, 예를 들어, 반경은 유동장 유동 분류 (F4) 기법에 의해 결정된다. 특정 구현예에서, F4는 입자 밀도에 의존하지 않는 크기에 기초하여 입자를 분리하고 측정하도록 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 입자 크기는 비대칭 유동장 유동 분류 (AF4)에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 입자 크기는 입자의 직경 또는 반경을 측정함으로써 결정될 수 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 입자 크기는 입자의 유체역학적 반경 또는 회전 반경을 측정함으로써 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 반경은 동적 광산란 기법을 사용하여 결정된다. 특정 구현예에서, 반경, 예를 들어, 유체역학적 반경 및/또는 Stokes 반경은 크로마토그래피 기법, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 SEC)로부터 결정될 수 있다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 반경이, 예를 들어, 평균 반경이, 적어도 5 nm, 적어도 10 nm, 적어도 15 nm, 적어도 20 nm, 적어도 25 nm, 적어도 30 nm, 적어도 35 nm, 적어도 40 nm, 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm, 적어도 60 nm, 적어도 65 nm, 적어도 70 nm, 적어도 75 nm, 적어도 80 nm, 적어도 85 nm, 적어도 90 nm, 적어도 95 nm, 적어도 100 nm, 적어도 105 nm, 적어도 110 nm, 적어도 115 nm, 적어도 120 nm, 적어도 125 nm, 적어도 130 nm, 적어도 135 nm, 또는 적어도 140 nm이다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 반경이 5 nm 내지 150 nm, 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 140 nm, 85 nm 내지 135 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 반경이 약 85 nm, 약 86 nm, 약 87 nm, 약 88 nm, 약 89 nm, 약 90 nm, 약 91 nm, 약 92 nm, 약 93 nm, 약 94 nm, 약 95 nm, 약 96 nm, 약 97 nm, 약 98 nm, 약 99 nm, 약 100 nm, 약 101 nm, 약 102 nm, 약 103 nm, 약 104 nm, 약 105 nm, 약 106 nm, 약 107 nm, 약 108 nm, 약 109 nm, 약 110 nm, 약 111 nm, 약 112 nm, 약 113 nm, 약 114 nm, 또는 약 115 nm이다. 특정 구현예에서, 입자는 반경이 80 nm 내지 115 nm이다.
일부 구현예에서, 반경은 유체역학적 반경, 회전 반경, Stokes 반경, Stokes-Einstein 반경, 및/또는 용액에서의 유효 수화된 반경이다. 특정 구현예에서, 반경은 유체역학적 반경이다. 일부 구현예에서, 반경은 Stokes 반경이다. 구체적인 구현예에서, 유체역학적 반경은 Stokes 반경이다. 일부 구현예에서, 반경은 복수의 입자의 평균(mean), 중앙, 및/또는 평균(average) 반경이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 분자량이 적어도 2 x 106 g/mol, 3 x 106 g/mol, 5 x 106 g/mol, 1 x 107 g/mol, 적어도 5 x 107 g/mol, 적어도 1 x 108 g/mol, 적어도 1.25 x 108 g/mol, 적어도 1.5 x 108 g/mol, 적어도 2 x 108 g/mol 또는 적어도 5 x 108 g/mol이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 분자량이 1 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 2 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 7.5 x 107 g/mol 내지 2.5 x 108 g/mol, 2.5 x 107 g/mol 내지 2.75 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 7.5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 분자량이 약 7.5 x 107 g/mol, 약 8.0 x 107 g/mol, 약 9.0 x 107 g/mol, 약 1.0 x 108 g/mol, 약 1.1 x 108 g/mol, 약 1.2 x 108 g/mol, 약 1.3 x 108 g/mol, 약 1.4 x 108 g/mol, 약 1.5 x 108 g/mol, 약 1.6 x 108 g/mol, 약 1.7 x 108 g/mol, 약 1.8 x 108 g/mol, 약 1.9 x 108 g/mol, 약 2.0 x 108 g/mol, 약 2.1 x 108 g/mol, 약 2.2 x 108 g/mol, 약 2.3 x 108 g/mol, 약 2.4 x 108 g/mol, 또는 약 2.5 x 108 g/mol이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 분자량이 5 x 107 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,100, 적어도 1,200, 적어도 1,300, 적어도 1,400, 적어도 1,500, 적어도 1,600, 적어도 1,700, 적어도 1,800, 적어도 1,900, 적어도 2,200, 적어도 2,300, 적어도 2,400, 적어도 2,500, 적어도 2,600, 적어도 2,700, 적어도 2,800, 적어도 2,900, 적어도 3,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 또는 적어도 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 100 내지 50,000, 500 내지 10,000, 1,000 내지 20,000, 500 내지 5,000, 300 내지 7,500, 1,500 내지 7,500, 500 내지 3,500, 1,000 내지 5,000, 1,500 내지 2,500, 1,500 내지 2,500, 2,000 내지 3,000, 2,500 내지 3,500, 2,000 내지 4,000, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하거나 및/또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 약 2,000 내지 3,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 반경이 25 nm 내지 150 nm이고; 분자량이 2 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol이고; 및/또는 500 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다.
구체적인 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 반경이, 예를 들어, 평균 반경이 70 nm 내지 125 nm이고; 분자량이 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol이고; 및/또는 1,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 세포 표면의 분자, 예를 들어 수용체에 결합하는 시제와 같은 하나 이상의 시제에 결합, 예를 들어, 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 본 명세서에 기재된 시제, 예를 들어, 섹션 II-C-3에 기재된 시제이다. 일부 구현예에서, 시제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 결합 파트너를 포함하는 이의 항체 또는 항원 단편, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tag®II이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하는 항-CD3 및/또는 항 CD28 Fab, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tag®II이다.
일부 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 반경, 예를 들어, 평균 반경이 80 nm 내지 120 nm이고; 분자량, 예를 들어, 평균 분자량이 7.5 x 106 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이고; 및/또는 양, 예를 들어, 평균량으로 500 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 세포 표면의 분자, 예를 들어 수용체에 결합하는 시제와 같은 하나 이상의 시제에 결합, 예를 들어, 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 본 명세서에 기재된 시제, 예를 들어, 섹션 II-C-3에 기재된 시제이다. 일부 구현예에서, 상기 시제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab, 예컨대 결합 파트너를 포함하는 Fab, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tag®II이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하는 항-CD3 및/또는 항 CD28 Fab, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tag®II이다.
2. 올리고머 입자 시약의 조성물
본 명세서에는 복수의 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성된 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약, 예를 들어, 복수의 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 복수의 올리고머 입자 시약을 포함한다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 섹션 II(A)(1)에 기재된 임의의 복수의 올리고머 입자 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 섹션 II(B)에 기재된 임의의 방법에 의해 생성, 제조, 및/또는 제품화된 복수의 올리고머 입자 시약을 포함한다.
구체적인 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean) 및/또는 중앙 크기를 가지는 올리고머 입자 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 적어도 25 nm, 적어도 30 nm, 적어도 35 nm, 적어도 40 nm, 적어도 45 nm, 적어도 50 nm, 적어도 55 nm, 적어도 60 nm, 적어도 65 nm, 적어도 70 nm, 적어도 75 nm, 적어도 80 nm, 적어도 85 nm, 적어도 90 nm, 적어도 95 nm, 적어도 100 nm, 적어도 105 nm, 적어도 110 nm, 적어도 115 nm, 적어도 120 nm, 적어도 125 nm, 적어도 130 nm, 적어도 135 nm, 적어도 140 nm인 올리고머 입자 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 5 nm 내지 150 nm, 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 140 nm, 85 nm 내지 135 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm인 올리고머 입자 시약을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 90 nm ± 25 nm, 90 nm ± 20 nm, 90 nm ± 15 nm, 90 nm ± 10 nm, 90 nm ± 5 nm, 95 nm ± 25 nm, 95 nm ± 20 nm, 95 nm ± 15 nm, 95 nm ± 10 nm, 95 nm ± 5 nm, 97 nm ± 20 nm, 97 nm ± 15 nm, 97 nm ± 10 nm, 97 nm ± 5 nm인 올리고머 입자 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 약 85 nm, 약 86 nm, 약 87 nm, 약 88 nm, 약 89 nm, 약 90 nm, 약 91 nm, 약 92 nm, 약 93 nm, 약 94 nm, 약 95 nm, 약 96 nm, 약 97 nm, 약 98 nm, 약 99 nm, 약 100 nm, 약 101 nm, 약 102 nm, 약 103 nm, 약 104 nm, 약 105 nm, 약 106 nm, 약 107 nm, 약 108 nm, 약 109 nm, 약 110 nm, 약 111 nm, 약 112 nm, 약 113 nm, 약 114 nm, 또는 약 115 nm인 올리고머 입자 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 80 nm 내지 115 nm인 올리고머 입자 시약을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 적어도 2 x 106 g/mol, 3 x 106 g/mol, 5 x 106 g/mol, 1 x 107 g/mol, 적어도 5 x 107 g/mol, 적어도 1 x 108 g/mol, 적어도 1.25 x 108 g/mol, 적어도 1.5 x 108 g/mol, 적어도 2 x 108 g/mol 또는 적어도 5 x 108 g/mol이다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 1 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 2 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 7.5 x 107 g/mol 내지 2.5 x 108 g/mol, 2.5 x 107 g/mol 내지 2.75 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 7.5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다. 구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 약 7.5 x 107 g/mol, 약 8.0 x 107 g/mol, 약 9.0 x 107 g/mol, 약 1.0 x 108 g/mol, 약 1.1 x 108 g/mol, 약 1.2 x 108 g/mol, 약 1.3 x 108 g/mol, 약 1.4 x 108 g/mol, 약 1.5 x 108 g/mol, 약 1.6 x 108 g/mol, 약 1.7 x 108 g/mol, 약 1.8 x 108 g/mol, 약 1.9 x 108 g/mol, 약 2.0 x 108 g/mol, 약 2.1 x 108 g/mol, 약 2.2 x 108 g/mol, 약 2.3 x 108 g/mol, 약 2.4 x 108 g/mol, 또는 약 2.5 x 108 g/mol이다. 특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 5 x 107 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다.
일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 각각 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양이 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1,000, 적어도 1,100, 적어도 1,200, 적어도 1,300, 적어도 1,400, 적어도 1,500, 적어도 1,600, 적어도 1,700, 적어도 1,800, 적어도 1,900, 적어도 2,200, 적어도 2,300, 적어도 2,400, 적어도 2,500, 적어도 2,600, 적어도 2,700, 적어도 2,800, 적어도 2,900, 적어도 3,000, 적어도 4,000, 적어도 5,000, 적어도 10,000, 또는 적어도 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양이 100 내지 50,000, 500 내지 10,000, 1,000 내지 20,000, 500 내지 5,000, 300 내지 7,500, 1,500 내지 7,500, 500 내지 3,500, 1,000 내지 5,000, 1,500 내지 2,500, 1,500 내지 2,500, 2,000 내지 3,000, 2,500 내지 3,500, 2,000 내지 4,000, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하거나 및/또는 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양이 약 2,000 내지 3,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 크기 분포를 가지는 올리고머 입자 시약을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%가 조성물의 올리고머 입자 시약의 중앙 또는 평균 크기의 ± 100%, ± 90%, ± 80%, ± 70%, ± 60%, ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1 %, ± 0.01%, ± 0.001% 내인 크기를 가지는 크기 분포를 가진다. 특정 구현예에서, 크기는 올리고머 입자 시약 중 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 반경, 분자량, 또는 개수에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약의 중앙 또는 평균 반경의 ± 100%, ± 90%, ± 80%, ± 70%, ± 60%, ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1 %, ± 0.01%, ± 0.001% 내의 반경을 가진다. 구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 10 nm 내지 250 nm, 25 nm 내지 200 nm, 50 내지 150 nm, 70 nm 내지 140 nm, 70 내지 130 nm, 70 내지 100 nm, 80 nm 내지 110 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 내지 120 nm, 90 nm 내지 110 nm, 100 nm 내지 120 nm, 또는 85 및/또는 115 nm 내의 반경을 가진다. 구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약의 평균 반경의 ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1% 내의 반경을 가진다.
구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약의 중앙 또는 평균 분자량의 ± 100%, ± 90%, ± 80%, ± 70%, ± 60%, ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1 %, ± 0.01%, ± 0.001% 내의 분자량을 가진다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 분자량이 2 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 106 g/mol 내지 1 x 108 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 1 x 109 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 x 108 g/mol, 7.5 x 107 g/mol 내지 2.5 x 108 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 2.5 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 3 x 108 g/mol, 7.0 x 107 g/mol 내지 3.0 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol이다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약의 평균 분자량의 ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1% 내의 분자량을 가진다.
특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되며, 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 올리고머 입자 시약 당 사합체의 중앙 또는 평균 양의 ± 100%, ± 90%, ± 80%, ± 70%, ± 60%, ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1 %, ± 0.01%, ± 0.001% 내의 사합체의 양으로 구성된다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 100 내지 50,000, 500 내지 10,000, 1,000 내지 20,000, 1,000 내지 5,000, 5,000 내지 10,000, 10,000 내지 15,000, 1,500 내지 4,000, 2,000 내지 4,500, 2,500 내지 5,000, 3,000 내지 5,000, 3,500 내지 5,500, 4,000 내지 6,000, 또는 1,500 내지 3,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성된다. 일부 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약의 평균 분자량의 ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1%의 사합체 양으로 구성된다.
일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 조성물은 예를 들어 올리고머 입자 시약이 생성, 제조, 및/또는 제품화되어, 시제, 예를 들어, 수용체 결합제를 첨가하기 전 일정 기간 동안 저장된다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 조성물은 중성 pH의 완충액에 저장된다. 일부 구현예에서, 조성물은 별도의 분뤼액으로 저장된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 조성물은 실온 이하, 4 ℃ 이하, -20 ℃ 이하, 또는 -80 ℃ 이하에서 저장된다. 특정 구현예에서, 조성물은 일정 기간, 약, 또는 적어도 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 14 일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 18 주, 20 주, 22 주, 24 주, 26 주, 27 주, 28 주, 30 주, 32 주, 34 주, 36 주, 38 주, 40 주, 42 주, 44 주, 46 주, 48 주, 50 주, 52 주, 60 주, 70 주, 80 주, 90 주, 12 개월, 16 개월, 18 개월, 24 개월, 30 개월, 36 개월 또는 36 개월 이상 동안 저장된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 조성물은 약, 또는 적어도 1 주간 9 주, 27 주, 또는 46 주간 4 ℃ 이하에서 저장된다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 조성물은 약, 또는 적어도 1 주간 9 주, 27 주, 또는 46 주간 -80 ℃ 이하에서 저장된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자의 크기는 저장 동안 안정하며, 예를 들어, 크기는 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5%를 초과하여 변하거나 증가하지 않는다.
구체적인 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약은 저장 동안 평균, 예를 들어, 평균, 입자 크기의 증가를 겪지 않는다. 특정 구현예에서, 조성물은 일정 기간 동안 저장되고, 올리고머 입자 시약은 평균 크기의 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 또는 50% 초과 증가를 경험하지 않는다. 구체적인 구현예에서, 조성물은 적어도 9, 27, 또는 46 주간 약 4 ℃ 이하, 약 -20 ℃ 이하, 또는 약 -80 ℃ 이하에서 저장되며, 1%, 5%, 또는 10% 초과의 평균 크기 증가를 경험하지 않는다. 특정 구현예에서, 조성물은 약 -80 ℃에서 저장된다.
일부 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하는 올리고머 입자 시약의 조성물이 본 명세서에 제공된다. 특정 구현예에서, 조성물 각각의 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합하거나 또는 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 25 nm 내지 150 nm이고; 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 2 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol이고 ; 및/또는 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양으로 500 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다. 특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 70%, 80%, 90%, 또는 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약 중 사합체의 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경, 분자량, 또는 양의 ± 100%, ± 90%, ± 80%, ± 70%, ± 60%, ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1% 내의 사합체의 반경, 분자량, 또는 양을 가진다.
구체적인 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하며, 하나 이상의 시제, 예를 들어, streptag를 가지는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab와 같은 수용체 결합제에 가역적으로 결합하는 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머 입자 시약의 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 50 nm 내지 150 nm이고; 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol이고; 및/또는 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양으로 1,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다. 특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약 중 사합체의 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경, 분자량, 또는 양의 ± 50%, ± 40%, ± 30%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1% 내의 사합체의 반경, 분자량, 또는 양을 가진다.
일부 구현예에서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 구성되거나 및/또는 이를 포함하며, 하나 이상의 시제에 가역적으로 결합하는 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머 입자 시약의 조성물이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경이 50 nm 내지 150 nm이고; 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 분자량이 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol이고; 및/또는 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 양으로 2,000 내지 4,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 가진다. 특정 구현예에서, 조성물의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 조성물의 올리고머 입자 시약 중 사합체의 평균(average), 평균(mean), 또는 중앙 반경, 분자량, 또는 양의 ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1% 내의 사합체의 반경, 분자량, 또는 양을 가진다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 적어도 9, 27 주, 또는 46 주간 -80 ℃에서 저장될 때 10% 초과의 크기 증가를 겪지 않는다.
일부 구현예에서, 임의의 제공된 올리고머 시약은 하기 섹션 II.B에 기재된 올리고머 시약의 생성 및 제품화 방법에 의해 제조된다.
B. 올리고머 입자 시약의 제품화
본 명세서에는 올리고머화된 시약, 즉, 올리고머 입자 시약으로 구성된 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법이 제공된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 시제, 예를 들어, 자극제에 가역적으로 결합할 수 있는 다중 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 세포에 발현되는 하나 이상의 분자를 인식 및/또는 결합하는 시제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선별제에 가역적으로 결합할 수 있는 다중 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에는 원하는 또는 표적 크기의 올리고머 입자 시약을 생성, 제조, 및/또는 제품화하는데 유용한 방법이 제공된다.
본 명세서에는 올리고머 입자 시약인 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에는 복수의 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하거나 및/또는 이로 구성된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화에 유용한 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에는 가용성 시약인 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 올리고머화하기 적합한 조건하에서 분자를 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약을 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 특성, 예를 들어, 입자 크기를 안정화시키는 단계를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자를 올리고머화하는 단계, 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머화된 분자의를 제거하는 단계, 및/또는 올리고머 입자 시약의 특성을 안정화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자에 작용기, 예를 들어, 가교 또는 올리고머화 반응에 적합한 작용기를 첨가하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자에 작용기를 첨가하는 하나 이상의 단계 및 분자를 올리고머화하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자에 하나 이상의 작용기를 첨가하는 단계, 분자를 올리고머화하는 단계, 및 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자를 분리하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 올리고머화된 분자는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 및/또는 하나 이상의 아미노산을 포함하는 분자이다. 일부 구현예에서, 올리고머화된 분자는 시제, 예를 들어, 수용체-결합제에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머화된 분자는 섹션 II(C)(3)에 기재된 시제에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고머화된 분자는 결합 파트너, 예를 들어, 결합 파트너 C에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 올리고머화된 분자는 섹션 II(A)에 기재된 결합 파트너 C에 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머화된 분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대 뉴트라비딘)이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘은 천연 상태의 사합체이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 상기 분자는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체 (예컨대 뉴트라비딘)의 사합체이다. 구체적인 구현예에서, 분자는 섹션 II(A)에 기재된 임의의 시약이다. 특정 구현예에서, 분자는 섹션 II(A)에 기재된 시약 중 사합체이다.
구체적인 구현예는 본 명세서에 제공된 방법에 의해 생성, 제조, 및/또는 제품화된 올리고머 입자 시약의 특성이, 예를 들어, 크기가, 다양한 단계, 절차, 및 인큐베이션의 시기, 뿐만 아니라 절차의 상이한 단계 또는 스테이지에서 pH 및 온도 및 시약의 농도와 같은 조건에 의존하는 것으로 고려한다. 이에 따라, 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법의 하나 이상의 단계 또는 스테이지는 정확한 시간 및 측정으로 수행 및/또는 기록되어, 예를 들어 본 명세서에 제공된 방법이 반복될 때, 생성된 제품화된 올리고머 입자 시약은 본 명세서에 제공된 방법에 의해 제조된 다른 배치 또는 로트와 동일한 또는 유사한 크기 및 특성을 가지도록 보장한다. 예를 들어 일부 구현예에서, 완충액 및 시약은 표적 또는 원하는 양 또는 농도의 ± 10%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, ± 1%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 내에 있는 것으로 측정된다. 특정 구현예에서, 반응, 예를 들어, 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 원하는 또는 표적 pH 내의 pH ± 1, ± 0.5, ± 0.1, ± 0.05, ± 0.04, ± 0.03, ± 0.02, ± 0.01, ± 0.001, 또는 ± 0.0001에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 표적 또는 원하는 일정 시간의 30 분, 15 분, 10 분, 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 90 초, 60 초, 45 초, 30 초, 15 초, 10 초, 5 초 이내로, 또는 1 초 이내로 수행된다. 구체적인 구현예에서, 단계, 스테이지, 및/또는 반응, 예를 들어, 인큐베이션 또는 처리 사이의 시간은, 설정된 표적 또는 원하는 시간의 30 분, 15 분, 10 분, 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 90 초, 60 초, 45 초, 30 초, 15 초, 10 초, 5 초 이내에, 또는 1 초 이내로 수행된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 또는 제품화 방법의 특정한 특징은 올리고머 입자 시약의 일관된 제품화에 중요하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 예를 들어 싸이올화제와 함께 분자를 인큐베이션함으로써 분자를 싸이올화하는 단계를 포함하며, 인큐베이션의 시간, pH, 및/또는 시약의 농도 및 양 모두는 올리고머 입자 시약의 일관된 제조를 달성하기 위해 표적 또는 원하는 값의 ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 이내에 속한다. 특정 구현예에서, 분자의 싸이올화 단계 종료와, 예를 들어 활성화 및 싸이올화된 분자를 인큐베이션함으로써 분자의 올리고머화 단계 사이의 일정 시간은 원하는 또는 표적 시간의 ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 이내에 속한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은, 예를 들어 활성화제와 함께 분자를 인큐베이션하여 분자에 작용기를 첨가하는 분자를 활성화하는 단계를 포함하며, 인큐베이션의 시간, pH, 및/또는 시약의 농도 및 양 모두는 올리고머 입자 시약의 일관된 제조를 달성하기 위해 표적 또는 원하는 값의 ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 이내에 속한다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계를 위한 시간, pH, 및/또는 시약의 농도 및 양 모두는 올리고머 입자 시약의 일관된 제조를 달성하기 위해 표적 또는 원하는 값의 ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 이내에 속한다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약의 일관된 제조는 일관된 배치 또는 로트의 제조를 야기하거나 이를 포함한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 올리고머 입자 시약의 일관된 배치 또는 로트를 야기한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 평균(average), 예를 들어, 평균(mean), 입자 크기가 본 명세서의 방법에 의해 생성, 제조, 또는 제품화된 로트 또는 배치의 평균(average), 예를 들어 평균(mean), 입자 크기의 ± 50%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001% 이내에 속하는 올리고머 입자 시약의 배치 또는 로트를 야기한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 활성화제와 함께 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시킴으로써, 분자를 활성화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화제는 가교 반응에서 반응하거나, 또는 반응할 수 있는 작용기를 분자에 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화제는 분자의 하나 이상의 아민에 작용기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화제는 분자에 아민-반응기, 설프하이드릴-반응기 또는 싸이올-반응기, 알데하이드-반응기, 광반응기, 및/또는 하이드록실-반응기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 활성화제는 분자에 설프하이드릴-반응기 또는 싸이올-반응기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화제는 분자에 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화제는 분자에 말레이미드 기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화제는 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포 SMCC) 및/또는 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)이거나, 또는 이를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는, 분자를 활성화하는, 즉, 하나 이상의 작용기를 분자에 첨가하기 적합한 조건하에서 활성화제와 함께 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 중성 pH에서 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 pH 5.0 내지 9.0, 6.0 내지 8.0, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.5에서 수행된다. 특정 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 pH 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5에서 수행된다. 일부 구현예에서, pH는 약 7.2이다. 구체적인 구현예에서, pH는 7.2 ± 0.1, ± 0.05, ± 0.02, ± 0.01, ± 0.005, 또는 ± 0.0001이다.
일부 구현예에서, 활성화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 일정한 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 적어도 4 ℃, 적어도 8 ℃, 적어도 12 ℃, 적어도 16 ℃, 적어도 20 ℃, 적어도 24 ℃, 적어도 28 ℃, 적어도 32 ℃, 적어도 37 ℃, 적어도 39 ℃, 적어도 50 ℃, 적어도 60 ℃, 적어도 70 ℃, 적어도 80 ℃, 적어도 90 ℃, 또는 적어도 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 37 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 39 ℃, 또는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 또는 약 24 ℃에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분자를 활성화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 24 ℃ ± 2 ℃, ± 1 ℃, ± 0.5 ℃, ± 0.2 ℃, ± 0.1 ℃, ± 0.05 ℃, 또는 ± 0.01 ℃에서 수행된다.
특정 구현예에서, 활성화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 일정 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 5 분 내지 1 시간, 15 분 내지 2 시간, 30 분 내지 90 분, 1 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 24 시간, 또는 24 시간 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 5 분, 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 1 시간 동안 수행된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 1 시간 ± 5 분, ± 2 분, ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초 동안 수행된다.
구체적인 구현예에서, 활성화제는 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 함께, 활성화제 대 분자의 몰비로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 분자 대 활성화제의 몰비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 구체적인 구현예에서, 분자 대 활성화제의 몰비는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%이다. 특정 구현예에서, 몰비는 1:2, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%. 일부 구현예에서, 몰비는 1:2 ± 5%이다. 구체적인 구현예에서, 몰비는 1:2 ± 2%이다.
특정 구현예에서, 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 활성화제의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 분자로부터 활성화제를 제거함으로써 종료된다. 일부 구현예에서, 활성화제는 크로마토그래피에 의해 분자로부터 제거된다. 특정 구현예에서, 활성화제는 겔 여과 크로마토그래피에 의해, 예를 들어, 탈염 컬럼으로 분자로부터 제거된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 싸이올화제와 함께 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시켜, 분자를 싸이올화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 싸이올화제는 분자에 싸이올 작용기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 시제이다. 일부 구현예에서, 싸이올화제는 하나 이상의 유리 아민에 싸이올 작용기를 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 시제이다. 일부 구현예에서, 싸이올 작용기는 분자의 라이신 잔기에 존재하는 N-말단 아민 기 및/또는 유리 아민에 첨가된다. 특정 구현예에서, 싸이올화제는 사이클릭 싸이오이미데이트(thioimidate) 화합물이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제는 2-이미노싸이올란 (Traut's 시약) 이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 싸이올화제는 2-이미노싸이올란이거나, 또는 이를 포함하며, 하기 도시된 바와 같은 반응에서 싸이올 작용기를 유리 아민에 첨가한다:
구체적인 구현예에서, 싸이올화제, 예를 들어, 2-이미노싸이올란은, 염산 염으로서, 예를 들어, 2-이미노싸이올란-HCl 염으로서 구매, 저장, 및/또는 수득된다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 2-이미노싸이올란을 용액에 첨가하면 용액의 pH를 현저하게 저하된다. 특정 구현예에서, 용액은 pH 저하를 예방하거나 감소시키도록 완충될 수 있다. 구체적인 구현예는 산성 pH 및/또는 pH 7.0 이하에서 수행되는 싸이올화 반응이 라이신 잔기의 가용성, 예를 들어, 라이신 잔기의 유리 아민의 가용성을 제한하여, 싸이올화 시약에 의해 분자에 첨가되는 싸이올 작용기의 양을 제한하는 것으로 고려한다. 특정 구현예에서, 라이신 잔기의 아민 기는 산성 pH 값 및/또는 7.0 미만의 pH 값에서 싸이올화 및/또는 아민 기에 싸이올 작용기를 첨가하는 능력을 감소 또는 예빵하는 정도로 양성자화될 수 있다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 싸이올화제를 함유하는 용액의 산성은 싸이올화 반응의 효율을 증가시키기 위해 조정 및/또는 중성화된다.
일부 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 싸이올화제와 분자를 인큐베이션, 처리, 또는 접촉하기 전 또는 시작할 때, 싸이올화제를 염기성 pH 7.0 이상의 pH의 완충액에 첨가하는 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제는 싸이올화제와 분자를 인큐베이션, 처리, 또는 접촉하기 전 또는 시작할 때, pH가 적어도 7.0, 적어도 7.2, 적어도 7.4, 적어도 7.6, 적어도 7.8, 적어도 8.0, 적어도 8.1, 적어도 8.2, 적어도 8.3, 적어도 8.4, 적어도 8.5, 적어도 8.6, 적어도 8.7, 적어도 8.8, 적어도 8.9, 적어도 9.0, 적어도 9.5, 또는 적어도 10.0인 완충액에 첨가된다. 특정 구현예에서, 싸이올화제는 싸이올화제와 분자를 인큐베이션, 처리, 또는 접촉하기 전 또는 시작할 때 약 pH 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1, 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 약 9.0, 약 9.1, 약 9.2, 약 9.3, 약 9.4, 또는 약 9.5인 완충액에 첨가된다. 일부 구현예에서, 완충액의 pH는 약 8.5이다. 구체적인 구현예에서, 완충액의 pH는 8.5 ± 0.1, ± 0.05, ± 0.02, ± 0.01, ± 0.005, 또는 ± 0.0001이다. 일부 구현예에서, 완충액은 실온에서의 pKa가 7.0 초과, 7.5 초과, 8.0 초과, 8.5 초과, 또는 9.0 초과인 완충제를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 완충제는 TES, HEPES, DIPSO, MOBS, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, tricine, Gly-gly, bicine, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, 및/또는 보레이트이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 완충액은 보레이트 완충액이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 보레이트 완충액은 적어도 25 mM 보레이트, 적어도 50 mM 보레이트, 적어도 75 mM 보레이트, 또는 약 또는 적어도 100 mM 보레이트를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 완충액은 100 mM ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001% 보레이트이거나, 또는 이를 포함한다.
특정 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 염기성 pH 또는 pH 7.0 이상에서 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 싸이올화제 및 분자가 첨가될 때 용액의 pH는 염기성 pH 또는 pH 7.0 이상이다. 일부 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계 동안 pH는 7.0 내지 11.0, 7.0 내지 9.0, 7.5 내지 8.5, 또는 7.5 내지 8.0이다. 특정 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 pH 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 또는 약 8.0에서 수행된다. 일부 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계 동안 pH는 7.7 또는 약 7.7이다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계 동안 pH는 7.7 ± 0.1, ± 0.05, ± 0.02, ± 0.01, ± 0.005, 또는 ± 0.0001이다.
특정 구현예에서, 활성화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 일정 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 5 분 내지 1 시간, 15 분 내지 2 시간, 30 분 내지 90 분, 1 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 24 시간, 또는 24 시간 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 5 분, 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 1 시간 동안 수행된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 1 시간 ± 5 분, ± 2 분, ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 약 25 분간 수행된다. 구체적인 구현예에서, 활성화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 25 분 ± 5 분, ± 2 분, ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초간 수행된다.
구체적인 구현예는 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉은 원하는 싸이올 작용기를 첨가하는 제1 반응을 야기하는 것으로 고려한다. 그러나, 일부 구현예에서, 원하는 싸이올 작용기는 더욱 안정하지만 불활성의 N-치환된 형태로 재-이성질체화될 수 있다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 2-이미노싸이올란에 의한 분자의 싸이올화는 싸이올 작용기와 동일한 반응성을 가지지 않는 더욱 안정한 N-치환된 형태로 재이성질체화할 수 있는 분자에 싸이올 작용기를 첨가한다 (Singh et al. Anal Biochem 236(1): 114-1125 (1996)). 이러한 반응의 묘사는 하기에 도시된다:
그러므로, 일부 구현예에서, 2-이미노싸이올란을 사용한 분자의 싸이올화는 표준 포화 곡선을 야기해서는 안되며, 그 대신에 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체에 존재하는 싸이올 작용기의 농도 또는 양이, 최고 또는 최대 농도에 도달하고, 최대에 도달한 후 다시 감소해야 하는 곡선을 야기해야 할 것이다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기의 반감기는 139 분이다.
일부 구현예에서, 싸이올화 반응 동안 달성되는 분자에 부착된 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 반응이 일어나는 용액의 pH에 영향을 받는다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 싸이올화제가 덜 염기성인 완충액에 첨가되는 경우보다, 싸이올화제가 더욱 염기성의 완충액에 첨가되는 경우 더 높다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 싸이올화제가 덜 염기성인 완충액에 첨가되는 경우보다, 싸이올화제가 더욱 염기성의 완충액에 첨가되는 경우 더욱 짧은 시간 내에 달성된다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 싸이올화제가 덜 염기성인, 예를 들어, 약 pH 8.3의 염기성인 완충액에 첨가되는 경우보다 싸이올화제가 약 pH 8.5의 완충액에 첨가되는 경우 더 높다. 일부 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 싸이올화제가 덜 염기성인, 예를 들어, 약 pH 8.3의 염기성인 완충액에 첨가되는 경우보다 싸이올화제가 약 pH 8.5의 완충액에 첨가되는 경우 더욱 짧은 시간 내에 달성된다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는, 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉 단계가 반응 동안 용액의 pH가 pH 7.7 미만의 용액, 예를 들어, 약 pH 6.9의 용액에서 일어나는 경우보다, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계가 반응 동안 약 pH 7.7인 경우에 더 높다. 일부 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는, 인큐베이션, 처리 및/또는 접촉 단계가 반응 동안 용액의 pH가 pH 7.7 미만의 용액, 예를 들어, 약 pH 6.9의 용액에서 일어나는 경우보다, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계가 반응 동안 약 pH 7.7인 경우에 더욱 짧은 시간 내에 달성된다.
일부 구현예에서, 분자에 첨가된 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 분자에 첨가되는 싸이올 작용기의 평균 (예를 들어, 평균(mean)) 양으로 표현된다. 일부 구현예에서, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 싸이올 작용기이다. 일부 구현예에서, 각 분자에 첨가된 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 부착된 또는 첨가된 싸이올 작용기를 가지는 분자 당 라이신 잔기의 평균 (예를 들어, 평균(mean)) 백분율이다. 특정 구현예에서, 최대 또는 최고 농도는 부착된 또는 첨가된 싸이올 작용기를 가지는 라이신 잔기의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 구체적인 구현예에서, 분자는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체이고, 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도는 사합체 당 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 이올 작용기이다.
일부 구현예에서, 분자는 분자에 첨가되는 싸이올 작용기의 최대 또는 최고 농도를 달성하기에 충분한 시간 동안 싸이올화제와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 최대 또는 최고 농도는 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉의 1 분 이내, 2 분 이내, 5 분 이내, 10 분 이내, 15 분 이내, 20 분 이내, 25 분 이내, 30 분 이내, 45 분 이내, 60 분 이내, 90 분 이내, 또는 120 분 이내에 도달한다.
구체적인 구현예에서, 싸이올화제는 분자와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉되고, 분자에 첨가 또는 부착되는 싸이올 작용기의 양은 최고 또는 최대 농도에 도달하며, 최대 또는 최고가 달성된 이후 감소하기 시작한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 접촉, 및/또는 처리 단계는 최고 또는 최대 농도가 달성된 이후 종료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 분자에 부착된 싸이올 작용기의 양이 최대 또는 최고 농도보다 50% 감소, 40% 감소, 30% 감소, 25% 감소, 20% 감소, 15% 감소, 10% 감소, 5% 감소, 또는 1% 감소될 때 또는 감소되기 전에 종료된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 평균 (예를 들어, 평균(mean)) 싸이올 작용기의 양이 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 또는 적어도 50 개의 싸이올 작용기가 되는 시점에 종료된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 접촉, 및/또는 처리는 라이신 잔기의 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, at 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%가 부착 또는 첨가된 싸이올 작용기를 가지는 시점에 종료된다. 구체적인 구현예에서, 분자는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체이며, 인큐베이션, 접촉, 및/또는 처리는 사합체 당 싸이올 작용기의 양이 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 또는 적어도 16 개의 싸이올 작용기인 시점에 종료된다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제 및 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 1 시간 후 종료된다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제 및 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 25 분 후 종료된다.
일부 구현예에서, 싸이올화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 일정한 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 적어도 4 ℃, 적어도 8 ℃, 적어도 12 ℃, 적어도 16 ℃, 적어도 20 ℃, 적어도 24 ℃, 적어도 28 ℃, 적어도 32 ℃, 적어도 37 ℃, 적어도 39 ℃, 적어도 50 ℃, 적어도 60 ℃, 적어도 70 ℃, 적어도 80 ℃, 적어도 90 ℃, 또는 적어도 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 37 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 39 ℃, 또는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 또는 약 24 ℃에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분자를 싸이올화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 24 ℃ ± 2 ℃, ± 1 ℃, ± 0.5 ℃, ± 0.2 ℃, ± 0.1 ℃, ± 0.05 ℃, 또는 ± 0.01 ℃에서 수행된다.
구체적인 구현예에서, 싸이올화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 함께, 싸이올화제 대 분자의 몰비로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 싸이올화제 및 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 싸이올화 시약 대 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비가 1:1 내지 10:1인 몰비에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제 및 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 싸이올화 시약 대 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비가 5:1인 몰비에서 수행된다. 특정 구현예에서, 싸이올화 시약 대 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비는 약 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1이다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화 시약 대 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비는 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 또는 1:1, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%이다. 특정 구현예에서, 몰비는 1:5, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%. 특정 구현예에서, 싸이올화제 대 분자의 몰비는 1:1 내지 1,000:1, 1:1 내지 500:1, 10:1 내지 200:1, 또는 100:1 내지 1,000:1이다. 구체적인 구현예에서, 활성화제 대 분자의 몰비는 약 100:1이다. 특정 구현예에서, 몰비는 100:1, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%.
특정 구현예에서, 싸이올화제와 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 분자로부터 싸이올화제를 제거 또는 분리함으로써 종료된다. 분자, 예를 들어, 단백질 또는 폴리펩타이드 분자 예컨대 스트렙타비딘을 제거 또는 분리하는 방법은 기술 분야 내에서 통상적이며, 크로마토그래피 및/또는 겔 여과와 같은 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 싸이올화제는 크로마토그래피에 의해 분자로부터 제거된다. 특정 구현예에서, 활성화제는 겔 여과 크로마토그래피에 의해, 예를 들어, 탈염 컬럼으로 분자로부터 제거된다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자를 올리고머화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 분자는 개별 분자 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛의 복합체를 가교 함으로써 올리고머화된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 분자와 올리고머화를 촉진하는 시제를 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시키는 하나 이상의 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분자는 분자와 시제, 예를 들어, 링커 또는 가교제, 예를 들어, 이작용성 링커 또는 가교제 또는 다른 화학적 링커인 활성화제를 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시킴으로써 올리고머화된다. 일부 구현예에서, 링커 또는 가교제는 이작용성 링커이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커, 예를 들어, 적어도 두 개의 동일한 작용기 및/또는 반응기를 가지는 링커이다. 구체적인 구현예에서, 링커는 이종이작용성 링커, 예를 들어, 적어도 두 개의 상이한 작용기 및/또는 반응기를 가지는 링커이다. 특정 구현예에서, 분자는 올리고머화하거나 또는 올리고머화할 수 있는 링커와 인큐베이션된다. 분자를 올리고머화하기에 적합한 링커는 기술 분야 내에 공지되어 있으며, 글루타르알데하이드, 다이메틸 아디피이미데이트 (DMA), 다이메틸 수베리미데이트 (DMS), 다이메틸 피멜리미데이트 (DMP), N- 하이드록시석신이미드 (NHS), 다이싸이오비스(석신이미딜프로피오네이트 (DSP), 다이싸이오비스(설포석신이미딜프로피오네이트) (DTSSP), 에틸렌 글리콜 비스[석신이미딜석시네이트], NHS 에스터, N-ε말레이미도카프로산, N-[ε말레이미도카프로산]하이드로아자이드, N-석신이미딜 S-아세틸싸이오아세테이트, N-석신이미딜 S-아세틸싸이오프로피오네이트, 2-이미노싸이올란 (Traut's 시약), 4-석신이미딜옥시카보닐-메틸-(2-피리미딜다이싸이오)-톨루엔 설포석신이미딜, 4- [N-말레이미도메틸]-사이클로헥산- 1 -카복실레이트, N- [감마- 말레이미도뷰티릴옥시] 설포-석신이미드 에스터, N-(K-말레이미도운데카노일옥시) 설포석신이미드 에스터, 말레이미도아세트산 N-하이드록시석신이미드 에스터, N-(엡실론- 말레이미도카프로산) 하이드라자이드, N-(K-말레이미도운데카논산) 하이드라자이드, N-(베타- 말레이미도프로피온산) 하이드라자이드, 및 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피오닐 하이드라자이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 개질된, 예를 들어, 화학적으로 개질된 분자를 올리고머화하는 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 개질된 분자가 올리고머화된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 분자가 활성화된다. 특정 구현예에서, 개질된 분자는 가교 및/또는 올리고머화 반응을 하거나, 반응할 수 있는 작용기의 첨가 및/또는 부착에 의해 활성화되어 있는, 활성화된 분자이다. 일부 구현예에서, 작용기는 아민, 예를 들어, 이용 가능한 분자의 1차 아민, 예를 들어, 및/또는 유리 아민에 첨가 또는 부착된다. 일부 구현예에서, 아민, 예를 들어, 1차 아민은 N-말단 아민이다. 구체적인 구현예에서, 아민, 예를 들어, 1차 아민은 라이신 잔기 상에 있다. 일부 구현예에서, 활성화된 분자는 아민-반응기 (예를 들어, N-하이드록시석신이미드 에스터, 이미도에스터, 펜타플루오로필 에스터, 또는 하이드록시메틸 포스핀), 설프하이드릴-반응기 또는 싸이올-반응기 (예를 들어, 말레이미드, 할로아세틸, 피리딜다이설파이드, 싸이오설포네이트, 또는 바이닐설폰), 알데하이드-반응기 (예를 들어, 하이드라자이드 또는 알콕시아민), 광반응기 (예를 들어, 다이아지린 또는 아릴 아자이드), 및/또는 하이드록실-반응기 (예를 들어, 아이소시아네이트)이거나, 또는 이를 포함하는 작용기의 첨가 및/또는 부착에 의해 개질되었다. 일부 구현예에서, 활성화된 분자는 설프하이드릴-반응기 또는 싸이올-반응기의 첨가 및/또는 부착에 의해 활성화되었다. 특정 구현예에서, 활성화된 분자는 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제의 첨가 및/또는 부착에 의해 활성화되었다. 특정 구현예에서, 활성화된 분자는 말레이미드 기의 첨가 및/또는 부착에 의해 활성화되었다.
특정 구현예에서, 개질된 분자는 싸이올화된 분자이다. 구체적인 구현예에서, 개질된 분자는 싸이올화, 예를 들어, 싸이올 (즉, 싸이올 기, 싸이올 기능, 또는 싸이올 작용기)의 첨가에 의해 개질되었다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화된 분자는 하나 이상의 라이신 잔기에 싸이올 작용기를 부착 및/또는 첨가하여 싸이올화되었다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 활성화된 분자와 싸이올화된 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 싸이올화된 분자와 활성화된 분자 사이를 올리고머화하거나 및/또는 올리고머화 반응을 야기한다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머는 싸이올화된 분자와 활성화된 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉에 의해 형성된다. 특정 구현예에서, 활성화된 분자는 하나 이상의 부착된 말레이미드 기를 가진다. 구체적인 구현예에서, 활성화된 분자는 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 하나 이상의 부착된 말레이미드 기를 가지는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자이거나, 또는 이를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화된 분자는 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자이다. 일부 구현예에서, 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 하나 이상의 싸이올 작용기를 가지는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자이다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 올리고머화하기 위한, 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 분자는 가교 반응에 의해 올리고머화된다. 일부 구현예에서, 분자의 일부는 분자에 하나 이상의 싸이올 작용기를 첨가함으로써 싸이올화되었다. 특정 구현예에서, 싸이올 기는 분자의 유리 아민 기, 예를 들어, 라이신 잔기의 아민, 예를 들어, 1차 아민 기 및/또는 N-말단 아민, 예를 들어, N-말단 1차 아민에 첨가된다. 일부 구현예에서, 싸이올화된 분자로부터 분리된 분자의 일부는 말레이미드 기의 첨가 또는 부착에 의해 활성화된다. 일부 구현예에서, 활성화된 분자는 시스테인 잔기 및/또는 싸이올 작용기를 함유하지 않는다. 그러므로, 일부 구현예에서, 활성화된 분자는 다른 활성화된 분자와 반응성을 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 활성화 및 싸이올화된 분자는 인큐베이션되고, 활성화된 분자의 말레이미드 작용기와 싸이올화된 분자의 싸이올 작용기 사이에서 가교 반응이 일어난다. 예를 들어, 분자 R의 말레이미드 작용기와 분자 P의 싸이올 (SH) 작용기 사이의 가교 반응은 하기 도시된다:
일부 구현예에서, 싸이올 작용기와 말레이미드 작용기 사이의 반응은 올리고머를 형성하는 가교 분자에 적합하다. 특정 구현예에서, 분자는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체이다.
구체적인 구현예에서, 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 분자를 올리고머화하기에 적합한 조건하에서 인큐베이션 및/또는 처리된다. 구체적인 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 중성 pH에서 수행된다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 pH 5.0 내지 9.0, 6.0 내지 8.0, 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.5에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 약 pH 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5에서 수행된다. 일부 구현예에서, pH는 약 7.2이다. 구체적인 구현예에서, pH는 7.2 ± 0.1, ± 0.05, ± 0.02, ± 0.01, ± 0.005, 또는 ± 0.0001이다.
일부 구현예에서, 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 분자를 올리고머화하기 적합한 조건하에서 인큐베이션 및/또는 처리되며, 이러한 적합한 조건은 온도를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 적어도 4 ℃, 적어도 8 ℃, 적어도 12 ℃, 적어도 16 ℃, 적어도 20 ℃, 적어도 24 ℃, 적어도 28 ℃, 적어도 32 ℃, 적어도 37 ℃, 적어도 39 ℃, 적어도 50 ℃, 적어도 60 ℃, 적어도 70 ℃, 적어도 80 ℃, 적어도 90 ℃, 또는 적어도 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 37 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 39 ℃, 또는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 수행된다. 구체적인 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 실온에서 수행된다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 또는 약 24 ℃에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 24 ℃ ± 2 ℃, ± 1 ℃, ± 0.5 ℃, ± 0.2 ℃, ± 0.1 ℃, ± 0.05 ℃, 또는 ± 0.01 ℃에서 수행된다.
특정 구현예에서, 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 분자를 올리고머화하기에 적합한 조건하에서 일정 시간 동안 인큐베이션 및/또는 처리된다. 일부 구현예에서, 분자는 분자를 올리고머화하기에 적합한 조건하에서 5 분 내지 1 시간, 15 분 내지 2 시간, 30 분 내지 90 분, 1 시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 24 시간, 또는 24 시간 이상 동안 인큐베이션 및/또는 처리된다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 약 5 분, 15 분, 약 30 분, 약 45 분, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 또는 약 24 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 1 시간 또는 약 1 시간 동안 수행된다. 구체적인 구현예에서, 분자를 올리고머화하는 인큐베이션 및/또는 처리 단계는 1 시간 ± 5 분, ± 2 분, ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초간 수행된다.
구체적인 구현예에서, 활성화 및 싸이올화된 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 분자를 올리고머화하기 위해 활성화된 분자 대 싸이올화된 분자의 몰비로 인큐베이션 및/또는 처리된다. 구체적인 구현예에서, 활성화된 분자 대 싸이올화된 분자의 몰비는 1:X이다. 일부 구현예에서, X는 싸이올화된 분자 상의 라이신 및 N-말단 아민의 수, 즉 합이다. 일부 구현예에서, X는 분자 상의 유리 또는 이용 가능한 아민 기의 수이다. 일부 구현예에서, X는 싸이올 작용기를 첨가하기 전 싸이올화된 분자 상의 라이신의 수이다. 구체적인 구현예에서, 활성화된 분자 대 싸이올화된 분자의 몰비는 약 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10이다. 구체적인 구현예에서, 활성화된 분자 대 싸이올화된 분자의 몰비는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%이다. 특정 구현예에서, 몰비는 1:4, ± 10%, ± 5%, ± 2%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.05%, 또는 ± 0.001%이다.
특정 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉단계는 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 올리고머화하는 조건하에서, 올리고머화 반응을 종료시키거나 및/또는 종료시킬 수 있는 하나 이상의 시제, 예를 들어, 화학적 시제를 첨가함으로써 종료된다. 일부 구현예에서, 상기 시제는 하나 이상의 작용기, 예를 들어, 말레이미드 또는 싸이올 작용기를 개질하거나, 가교 또는 올리고머화 반응으로부터 방지하는 시제이다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 활성화 및 싸이올화된 분자이고, 하나 이상의 시제는, 예컨대 싸이올 기를 첨가 및/또는 부착함으로써 이용 가능한 말레이미드 기를 포화시키거나, 또는 분자로부터 말레이미드 기를 절단 및/또는 분리하는 시제이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응하지 않은 말레이미드 기는 pH를 상승시키는 시제에 의해 제거될 수 있다. 특정 구현예에서, 상승된 pH는 반응하지 않은 말레이미드 기를 제거 및/또는 분리하는 반면, 가교된 말레이미드 기는 안정할 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는, 예를 들어, 고리 열림 반응에 의해 말레이미드 고리 시스템의 가수분해에 촉매작용을 하는 시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 분자는 활성화 및 싸이올화된 분자이고, 하나 이상의 시제는 싸이올 작용기를 개질 및/또는 포화시키는 시제이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 싸이올 작용기의 포화 및/또는 개질은 말레이미드 기와의 올리고머화 및/또는 가교 반응을 방지한다. 일부 구현예에서, 활성화 및 싸이올화된 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 N-에틸말레이미드 (NEM)와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉되어 올리고머화 및/또는 가교 반응을 종료시킨다.
일부 구현예에서, 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 올리고머화 및/또는 가교 반응을 종료시키거나 및/또는 종료시킬 수 잇는 시제와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 올리고머화 및/또는 가교 반응을 종료시키거나 및/또는 종료시킬 수 있는 시제는 분자와 4 ℃ 내지 39 ℃, 4 ℃ 내지 25 ℃, 4 ℃ 내지 10 ℃, 또는 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 초기에 실온에서 수행되고, 이후 약 4 ℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계는 초기에 약 24 ℃에서 수행되고, 이후 약 4 ℃에서 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 초기에 실온 및/또는 약 24 ℃에서 약 5 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 30 분, 약 60 분, 약 90 분, 또는 약 120 분 동안 수행되고, 약 4 ℃에서 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 12 시간, 약 16 시간, 약 24 시간, 또는 24 시간 이상 동안 인큐베이션, 접촉, 및/또는 처리된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 초기에 실온 및/또는 약 24 ℃에서 약 15 분간 수행된 후, 약 4 ℃에서 약 16 시간 동안 수행된다. 특정 구현예에서, NEM와의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 초기에 실온 및/또는 약 24 ℃에서 약 15 분간 수행된 후, 약 4 ℃에서 약 16 시간 동안 인큐베이션, 접촉, 및/또는 처리된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자를 싸이올화하는 단계 및 분자를 활성화하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상이한 집단 또는 복수의 분자는 활성화된 집단 또는 복수의 분자로부터 싸이올화된다. 일부 구현예에서, 활성화 및 싸이올화 단계는, 예를 들어, 싸이올화 및 활성화된 분자 모두가 다른 공정이 수행되는 동안 싸이올화 또는 활성화된 분자를 저장할 필요 없이 인큐베이션 반응이 가능하도록 거의 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계 및 분자와 활성화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계의 적어도 일부는 동시에 수행된다.
특정 구현예에서, 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 분자와 활성화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계 동안 수행된다. 특정 구현예에서, 분자와 활성화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계의 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 분자와 활성화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계의 적어도 1 분, 적어도 5 분, 적어도 10 분, 적어도 15 분, 적어도 30 분, 적어도 45 분, 적어도 60 분, 적어도 90 분, 적어도 120 분, 적어도 4 시간, 적어도 6 시간, 적어도 8 시간, 적어도 12 시간, 적어도 16 시간, 또는 적어도 24 시간의 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계 동안 수행된다. 구체적인 구현예에서, 분자와 싸이올화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계의 적어도 1 분, 적어도 5 분, 적어도 10 분, 적어도 15 분, 적어도 30 분, 적어도 45 분, 적어도 60 분, 적어도 90 분, 적어도 120 분, 적어도 4 시간, 적어도 6 시간, 적어도 8 시간, 적어도 12 시간, 적어도 16 시간, 또는 적어도 24 시간의 분자와 활성화화제의 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉 단계 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 분자와 싸이올화제와의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계 및 활성화제와의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 거의 동시에 시작된다. 특정 구현예에서, 분자와 싸이올화제와의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계 및 활성화제와의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 서로 30 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 5 분 이내, 1 분 이내, 30 초 이내, 15 초 이내, 10 초 이내, 5 초 이내, 1 초 이내에 시작된다. 일부 구현예에서, 분자와 싸이올화제와의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계 및 활성화제와의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 거의 동시에 종료된다. 구체적인 구현예에서, 분자와 싸이올화제와의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계 및 활성화제와의 인큐베이션, 처리, 또는 접촉 단계는 서로 30 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 5 분 이내, 1 분 이내, 30 초 이내, 15 초 이내, 10 초 이내, 5 초 이내, 1 초 이내에 종료된다.
구체적인 구현예는 싸이올 작용기가 분자에 부착 또는 첨가되는 경우, 싸이올 작용기는 더욱 안정하지만 불활성인 N-치환된 형태로 이성질화할 수 있는 것으로 고려한다. 일부 양태에서, 싸이올 작용기는 2-이미노싸이올란 (Trauts 시약)의 존재하에 첨가 또는 부착된다. 특정 구현예는 싸이올 작용기가 분자에 부착 또는 첨가되는 경우, 싸이올 작용기는 2-이미노싸이올란 (Trauts 시약)의 존재하에 더욱 안정하지만 불활성인 N-치환된 형태로 이성질화할 수 있는 것으로 고려한다. 특정 구현예에서, 싸이올 작용기는 싸이올화제의 제거 후 반감기 또는 약 139 분으로 이성질체화한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 분자 상의 싸이올 작용기의 양은 싸이올화제와의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 이후 시간이 지남에 따라 감소된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자의 싸이올화, 분자의 활성화, 및 분자의 올리고머화 단계, 예를 들어, 올리고머화에 적합한 조건하에서 활성화 및 싸이올화된 분자를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계가 종료 또는 완료된 후 정확한 시간 내에 또는 정확한 시간에 시작하도록 시간이 정해진다. 일부 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 및 활성화 단계가 종료 또는 완료된 후 정확한 시간 내에 또는 정확한 시간에 시작하도록 시간이 정해진다.
구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계, 예를 들어, 올리고머화에 적합한 조건하에서 활성화 및 싸이올화된 분자를 인큐베이션하는 단계는, 싸이올화 단계의 종료 이후, 예를 들어, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션이 종료된 이후 일정 시간 이내에 시작된다. 특정 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계의 종료 시 분자에 부착된 싸이올 작용기의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.01%, 0.001%, 또는 0.0001%가 손실, 감소 또는 붕괴하기 전 시작 또는 개시된다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계의 종료 시 분자에 부착된 싸이올 작용기의 10%가 손실, 감소 또는 붕괴하기 전 시작 또는 개시된다. 일부 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계의 종료 이후 24 시간 이내, 16 시간 이내, 12 시간 이내, 8 시간 이내, 6 시간 이내, 4 시간 이내, 2 시간 이내, 90 분 이내, 60 분 이내, 45 분 이내, 30 분 이내, 15 분 이내, 10 분 이내, 5 분, 또는 1 분 이내에 시작 또는 개시된다. 특정 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 6 시간, 5 시간, 4 시간, 3 시간, 2 시간, 90 분, 60 분, 45 분, 30 분, 15 분, 10 분, 5 분, 또는 1 분 ± 5 분, ± 2 분, ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초 이내에 시작 또는 개시된다. 특정 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계의 종료 이후 15 분 이내에 시작 또는 개시된다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계는 싸이올화 단계의 종료 이후 10 분 ± 1 분, ± 30 초, ± 15 초, ± 10 초, ± 5 초, 또는 ± 1 초에 시작 또는 개시된다.
구체적인 구현예에서, 싸이올화 단계의 종료, 예를 들어, 싸이올화제와 분자의 인큐베이션은, 싸이올화제가 분자로부터 제거될 때, 또는 싸이올화제의 제거 공정이 시작 또는 개시될 때 이거나, 이 때 발생한다. 일부 구현예에서, 싸이올화 단계의 종료는 싸이올화제의 제거 공정이 시작 또는 개시될 때이거나, 이 때 발생한다. 구체적인 구현예에서, 싸이올화제의 제거 공정은 크로마토그래피, 예를 들어 겔 여과 크로마토그래피이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 싸이올화 단계의 종료는 분자로부터 싸이올화제를 제거 또는 분리하기 위해, 싸이올화제 및 분자를 함유하는 샘플 또는 용액이 크로마토그래피 컬럼, 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피 컬럼으로 부어질 때, 또는 그 순간에 발생한다. 구체적인 구현예에서, 분자의 올리고머화 단계의 시작은 활성화된 분자가 싸이올화된 분자와 접촉, 첨가 및/또는 혼합도리 때 시작 및/또는 개시된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 올리고머화되지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약 및/또는 올리고머화된 분자를 제거 및/또는 분리하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 올리고머화되지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약 및/또는 올리고머화된 분자를 제거 및/또는 분리하는 단계는 분자의 올리고머화 단계가 완료 또는 종료된 후 발생한다.
일부 구현예에서, 분자의 올리고머화된 입자 시약 및/또는 올리고머는 올리고머화되지 않은 분자로부터, 및 임계 크기 미만 또는 이하의 올리고머 입자로부터 제거 및/또는 분리된다. 일부 구현예에서, 크기에 대한 임계치는 반경이 적어도 5 nm, 적어도 10 nm, 적어도 15 nm, 적어도 20 nm, 적어도 25 nm, 적어도 30 nm, 적어도 40 nm, 적어도 50 nm, 적어도 60 nm, 적어도 70 nm, 적어도 75 nm, 적어도 80 nm, 적어도 85 nm, 또는 적어도 90 nm이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 크기에 대한 임계치는 분자량이 적어도 100 kDa, 적어도 500 kDa, 적어도 1,000 kDa, 적어도 2,000 kDa, 적어도 5,000 kDa, 적어도 10,000 kDa, 적어도 50,000 kDa, 또는 적어도 100,000 kDa 이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 임계 크기는 본 명세서에 제공된 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약의 평균 (예를 들어, 평균(mean)) 크기 및/또는 크기 분포에 영향을 미치지 않는다.
일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 올리고머는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 올리고머화되지 않은 입자로부터 제거 및/또는 분리된다. 일부 구현예에서, SEC는 분자를 손상시키거나 파괴하지 않고 크기에 따라 분자를 분리할 수 있는 기법으로서, 배제 한계보다 작은 분자는 컬럼에 포획되고, 배제 한계보다 큰 분자는, 예를 들어, 지연 없이 컬럼을 통과한다. 특정 구현예에서, 배제 한계는 1 kDa 내지 100,000 kDa, 100 kDa 내지 10,000 kDa, 500 kDa 내지 1,000 kDa, 500 kDa 내지 5,000 kDa, 5,000 kDa 내지 20,000 kDa, 10,000 kDa 내지 50,000 kDa, 또는 50,000 내지 100,000 kDa의 크기이다. 특정 구현예에서, 배제 한계는 분자의 단량체 및/또는 사합체의 분자량보다 크다. 일부 구현예에서, 배제 한계는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 분자량보다 크다. 구체적인 구현예에서, 예를 들어, 공극 부피의, 지연 없이 SEC 컬럼을 통과하는 모든 입자, 예를 들어, 올리고머 입자가 수집된다.
구체적인 구현예에서, SEC는 분자가 컬럼을 나가는 순서는 분자의 크기와 관련되어 수행됨에 따라, 일부 구현예에서, 컬럼의 용출액이 상이한 분획으로 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, 분획은 특정 크기의 입자를 제거하도록 조합 또는 폐기될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분획은 입자, 예를 들어, 100 kDa 미만, 500 kDa 미만, 1,000 kDa 미만, 2,000 kDa 미만, 5,000 kDa 미만, 10,000 kDa 미만, 50,000 kDa 미만, 또는 100,000 kDa 미만의 크기인 올리고머 입자 시약을 제거하도록 폐기될 수 있다. 특정 구현예에서, SEC는 올리고머화되지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약을 제거하지만, 본 명세서에 제공된 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약의 평균 (예를 들어, 평균(mean)) 크기 및/또는 크기 분포에 영향을 미치지 않는다.
특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약 예를 들어, 올리고머화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는, 올리고머화를 위한 분자의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉이 종료 또는 완료된 후, 가교 및/또는 올리고머화를 지속할 수 있다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 올리고머의 크기를 안정화하는 안정화 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머의 안정화 단계는 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 안정화제의 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉 단계이거나, 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 안정화제는 입자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약, 크기의 변화를 방지하거나, 또는 방지할 수 있는 임의의 시제이다. 일부 구현예에서, 안정화제는 올리고머화 및/또는 가교 반응에서 반응을 하거나, 할 수 있는 분자 또는 올리고머 입자 상의 작용기를 개질하는 임의의 시제이다. 특정 구현예에서, 안정화제는 올리고머화 및/또는 가교 반응에서 반응하거나, 또는 반응할 수 있는 분자 또는 올리고머 입자 상의 작용기를 생성하기 위한 형성, 이성질체화, 및/또는 전환을 방지하는 임의의 시제이다. 일부 구현예에서, 안정화 시약은 분자 또는 올리고머 입자에 부착된 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제를 개질하거나, 또는 개질할 수 있는 임의의 시제이다. 구체적인 구현예에서, 안정화 시약은 분자 또는 올리고머 입자에 부착된 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제를 생성하기 위한 형성, 이성질체화, 및/또는 전환을 방지하는 임의의 시제이다.
일부 구현예에서, 안정화제는 올리고머 입자와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 복수의 싸이올화된 분자 및 활성화된 분자, 예를 들어, 활성화 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하는 올리고머 입자 시약이다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자는 부착된 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 더 많은 싸이올화된 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, NEM과의 인큐베이션 및/또는 처리는 이용 가능한 모든 싸이올 작용기를 포화 및/또는 개질시켜 가교 및/또는 올리고머화 반응을 중단한다. 그러나, 일부 구현예에서, N-치환된 이미노싸이올란은 NEM과 반응성을 가지지 않으며 이러한 이성질체는 NEM과의 인큐베이션 이후 분자 및 올리고머 입자 상에 남아있다. 일부 구현예에서, N-치환된 이미노싸이올란을 싸이올 이성질체로 재이성질체화시키면, 예컨대 다른 올리고머 입자 상에 남아있는 이용가능한 말레이미드 기와 예를 들어 추가의 가교 및/또는 올리고머화 반응에 의해 올리고머 입자 시약의 합성-후 성장을 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 안정화제는 N-치환된 이미노싸이올란을 개질, 제거 및/또는 싸이올 작용기로의 재이성질체화를 방지하거나, 방지할 수 있는 시제이다. 일부 구현예에서, 안정화제는 하이드록실아민이거나, 또는 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 부착된 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 올리고머 입자 및/또는 분자는 N-치환된 이미노싸이올란의 개질, 제거 및/또는 싸이올 작용기으로의 재이성질체화를 방지하거나, 방지할 수 있는 안정화제와 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 부착된 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 올리고머 입자 및/또는 분자는 하이드록실아민과 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 예컨대 안정화 반응을 수행하기 위해 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은, 싸이올 작용기와 말레이미드 작용기 사이의 가교 반응이 수행 및/또는 종료된 후 올리고머화된 분자에 첨가된다. 구체적인 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은, 올리고머화된 분자에 NEM을 첨가하여 가교 반응이 완료, 종료 및/또는 종결된 후, 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은, 올리고머화된 분자에 NEM을 첨가하여 가교 반응이 완료, 종료 및/또는 종결된 후, 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된 후, 장기간의 저장, 예를 들어, 약 실온 이하, 4 ℃, -20 ℃, 또는 -80 ℃에서 적어도 1 일, 1 주, 3 주, 9 주, 27 주, 46 주, 또는 1 년 이상 저장된다. 일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자가 컬럼, 예컨대 크로마토그래피 컬럼 및/또는 SEC 컬럼에 로딩, 통과, 및/또는 용출된 후 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자가 SEC 컬럼에 로딩, 통과, 및/또는 용출된 후 올리고머화된 분자와 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자가 SEC 컬럼에 로딩, 통과, 및/또는 용출되는 임의의 단계 이전에 올리고머화된 분자와 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 약 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 90 분, 120 분, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 또는 24 시간 동안 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 1 분 내지 12 시간, 1 분 내지 1 시간, 1 분 내지 30 분, 5 분 내지 30 분, 10 분 내지 60 분, 10 분 내지 20 분, 1 시간 내지 3 시간, 1 시간 내지 2 시간, 또는 6 시간 내지 12 시간 동안 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 5 분 내지 30 분 동안, 또는 약 15 분간 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 처리, 접촉, 및/또는 인큐베이션은 혼합, 및/또는 흔들기, 예를 들어, 약한 흔들기 및/또는 혼합으로 수행된다.
일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 약 4 ℃, 8 ℃, 12 ℃, 16 ℃, 20 ℃, 24 ℃, 28 ℃, 32 ℃, 37 ℃, 39 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 90 ℃, 또는 100 ℃의 온도에서 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 37 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 39 ℃, 또는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 구체적인 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 실온에서 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 안정화 시약은 올리고머화된 분자와 약 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 또는 26 ℃ ± 2 ℃, ± 1 ℃, ± 0.5 ℃, ± 0.2 ℃, ± 0.1 ℃, ± 0.05 ℃, 또는 ± 0.01 ℃에서 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약으로부터 제거 및/또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 안정화 반응은 올리고머화된 입자로부터 안정화 시약을 분리 및/또는 제거하여 종료 및/또는 종결된다. 일부 구현예에서, 안정화 시약은 크로마토그래피 단계에 의해 올리고머화된 입자로부터 제거 및/또는 분리된다. 구체적인 구현예에서, 크로마토그래피 단계는 SEC이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 안정화 시약은 컬럼 및/또는 필터를 사용하여 올리고머화된 분자로부터 분리 및/또는 제거된다. 일부 구현예에서, 컬럼 또는 필터는 탈염 컬럼이다. 특정 구현예에서, 탈염 컬럼은 수지, 예를 들어, 세파덱스(sephadex), 덱스트란, 및/또는 에피클로로하이드린이거나, 또는 이를 포함하는 수지를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과, 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 또는 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 1 분 내지 1 시간 동안 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 안정화 시약, 예를 들어, 하이드록실아민은 올리고머화된 분자, 예를 들어, 올리고머 입자 시약과 10 ℃ 내지 25 ℃의 온도에서 5 분 내지 30 분 동안 접촉, 처리, 및/또는 인큐베이션된다.
구체적인 구현예에서, 안정화제와 인큐베이션, 처리, 또는 접촉되는 올리고머 입자 시약, 예를 들어, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하는 올리고머 입자 시약은 크기와 관련하여 안정하다. 일부 구현예에서, 안정화제와 인큐베이션, 처리, 또는 접촉되는 올리고머 입자 시약은 이러한 입자가 실온, 또는 약 4 ℃ 또는 이하, 또는 약 -20 ℃ 또는 이하, 또는 약 -80 ℃ 또는 이하에서 저장될 때, 시간의 경과에 따른 크기 변화, 즉 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 또는 50% 초과의 크기 변화, 예를 들어, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 14 일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 또는 이상 16 주의 시간 경과에 따른, 반경 또는 분자량의 변화와 같은, 크기 변화를 격지 않는다. 일부 구현예에서, 안정화제와 인큐베이션, 처리, 또는 접촉되는 올리고머 입자 시약은 시간 경과에 따른 크기 증가, 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 14 일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 또는 이상 16 주에 걸친, 1% 초과, 5% 초과, 10% 초과, 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 40% 초과, 또는 50% 초과의 크기 증가를 겪지 않는다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 상기 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 및/또는 올리고머 입자 시약을 필터 멸균하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 필터 멸균된다. 일부 구현예에서, 분자 또는 올리고머 입자 시약은 활성화제 또는 싸이올화제와의 인큐베이션 전 또는 후, 활성화 및 싸이올화된 분자가 가교 및/또는 올리고머화되기 전 또는 후, 올리고머화되지 않은 분자, 예를 들어, 사합체로부터 올리고머 입자 시약을 제거하기 위해 SEC를 수행하기 전 또는 후, 및/또는 올리고머 입자 시약이 안정화제와 인큐베이션되기 전 또는 후에 필터 멸균될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 필터 멸균되거나, 될 수 있다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 필터 멸균의 공정을 응집하거나, 막거나, 그렇지 않으면 방해하거나 방지하지 않는다. 일부 구현예에서, 필터 멸균은 다공성 필터 또는 멤브레인을 통해 분자 또는 올리고머 입자 시약을 함유하는 용액을 통과시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 다공성 필터 또는 멤브레인은 직경이 적어도 약 0.02 μm, 약 0.05 μm, 약 0.1 μm, 약 0.15 μm, 약 0.2 μm, 약 0.22 μm, 약 0.3 μm, 약 0.4 μm, 약 0.45 μm, 또는 약 0.5 μm인 공극을 포함한다. 일부 구현예에서, 공극의 크기는 0.01 μm 내지 1.0 μm, 0.1 μm 내지 .05 μm, 0.2 μm 내지 0.25 μm, 0.4 내지 0.45 μm, 또는 0.2 μm 내지 0.45 μm이다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자는 반경 및/또는 평균 반경이 150 nm 이하이다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자는 반경 및/또는 평균 반경이 약 125 nm, 110 nm, 또는 100 nm 이하이다.
일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 본 명세서에 제공된 방법에 의해 생성, 제조, 및/또는 제품화된 후, 저장된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 시제, 예를 들어, 수용체 결합제를 올리고머 입자 시약에 결합시키는 임의의 처리 또는 인큐베이션 전에 일정 시간 동안 저장된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 시제, 예를 들어, 수용체 결합제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합시키는 하나 이상의 처리 또는 인큐베이션 후에 일정 시간 동안 저장된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 둘 이상의 분취액에 저장된다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 완충액에 저장된다. 일부 구현예에서, 완충액은 중성 pH 및/또는 pH 6.5 내지 7.5, 6.8 내지 7.4, 또는 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 또는 약 7.3이다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 약 pH 7.2의 완충액에 저장된다. 특정 구현예에서, 완충액은 포스페이트 완충액, 예를 들어, 소듐 포스페이트 완충액이다. 특정 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 실온, 또는 약 4 ℃ 또는 이하, 또는 약 -20 ℃ 또는 이하, 또는 약 -80 ℃ 또는 이하에서 저장된다. 구체적인 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 10 일, 14 일, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 10 주, 11 주, 12 주, 13 주, 14 주, 15 주, 16 주, 또는 이상 16 주 동안 저장된다. 일부 구현예에서, 올리고머 입자 시약은 중성 pH의 완충액에 배치되고 약 -80 ℃의 온도에서 저장된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 분자, 예를 들어, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 분자를 올리고머화하기 적합한 조건하에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시키는 단계, 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약을 SEC에 의해 분리하는 단계, 및 안정화제와 함께 입자를 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 분자를 올리고머화하기 적합한 조건하에서 분자를 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉시키는 단계는 하나 이상의 부착된 싸이올 작용기를 가지는 싸이올화된 분자와 하나 이상의 부착된 말레이미드 작용기를 가지는 활성화된 분자를 인큐베이션하는 것이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 다음의 단계를 포함한다: 15 내지 90 분의 일정 시간 동안 염기성 pH의 완충액에서 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 싸이올화제와 인큐베이션하여 사합체를 싸이올화하는 단계, 30 분 내지 90 분의 일정 시간 동안 별개의 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 활성화 시제를 인큐베이션하여 하나 이상의 말레이미드 작용기를 사합체에 첨가하는 단계, 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션을 동시에 또는 거의 동시에 종료하는 단계, 활성화 및 싸이올화 인큐베이션이 종료된 후 5 내지 15 분의 일정 시간 내에 싸이올화 및 활성화된 사합체를 인큐베이션하는 단계, 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약을 SEC에 의해 분리하는 단계, 및 상기 입자를 안정화제와 인큐베이션하여 올리고머 입자 시약의 크기를 안정화하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 약 -80 ℃ , -20 ℃, 또는 4 ℃ 이하에서 중성 pH의 완충액 용액에 올리고머 입자 시약을 저장하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 다음을 포함한다: pH 7.7 내지 8.5의 염기성 완충액 중의 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 2-이미노싸이올란을 약 24 ℃의 온도에서 60 분간 인큐베이션하여 사합체를 인큐베이션하는 단계, 중성 pH 7.2 중의 별개의 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 SMPH를 약 24 ℃의 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 하나 이상의 말레이미드 작용기를 사합체에 첨가하는 단계, 사합체로부터 크로마토그래피, 예를 들어, SEC로 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션을 분리함으로써 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션을 동시에 종료하는 단계, 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션이 종료된 후 싸이올화 및 활성화된 사합체를 10분 간 인큐베이션하는 단계, 사합체와 NEM을 인큐베이션함으로써 60 분 후 싸이올화 및 활성화된 사합체 사이의 올리고머화 반응을 종료시키는 단계, 올리고머화하지 않은 분자로부터 올리고머 입자 시약을 SEC에 의해 분리하는 단계, 및 상기 입자와 하이드록실아민을 인큐베이션하여 올리고머 입자 시약의 크기를 안정화하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 -80 ℃에서 중성 pH의 완충액 용액에 올리고머 입자 시약을 저장하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 2-이미노싸이올란은 pH 8.5의 염기성 완충액에 첨가된다. 특정 구현예에서, 완충액은 100 mM 보레이트 완충액이거나, 또는 이를 포함한다.일부 구현예에서, 입자는 안정하며, 예를 들어, 적어도 46 주 동안 10% 초과의 크기 변화를 겪지 않는다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 제공된 올리고머 입자 시약의 생성, 제조, 및/또는 제품화 방법은 다음의 단계를 포함한다: pH 7.7 내지 8.5의 염기성 완충액 중의 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 2-이미노싸이올란을 약 24 ℃의 온도에서 60 분간 인큐베이션하여 사합체를 인큐베이션하는 단계; 중성 pH 7.2 중의 별개의 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체와 SMPH를 약 24 ℃의 온도에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 하나 이상의 말레이미드 작용기를 사합체에 첨가하는 단계; 사합체로부터 크로마토그래피, 예를 들어, SEC로 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션을 분리함으로써 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션을 동시에 종료하는 단계; 2-이미노싸이올란 및 SMPH 인큐베이션이 종료된 후, 싸이올화 및 활성화된 사합체를 선택적으로 10분 내로 인큐베이션하는 단계; NEM 사합체와 NEM을 인큐베이션함으로써 약 60 분 후 싸이올화 및 활성화된 사합체 사이의 올리고머화 반응을 종료시키는 단계, 상기 입자를 하이드록실아민과 인큐베이션하는 단계; SEC 단계, 및 선택적으로 입자를, 예를 들어, 약 0.45 μm 및/또는 0.2 μm의 직경의 공극 크기를 가지는 멤브레인 및/또는 필터를 통해 여과하는 단계. 일부 구현예에서, 상기 방법은 -80 ℃에서 중성 pH의 완충액 용액에 올리고머 입자 시약을 저장하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 입자는 안정하며, 예를 들어, 적어도 46 주 동안 10% 초과의 크기 변화를 겪지 않는다.
C. 시약의 형식
1. 지지체
일부 구현예에서, 시약은 지지체, 예컨대 고체 지지체 또는 표면, 예를 들어, 비드, 또는 고체상 또는 고정상 (크로마토그래피 매트릭스) 상에 포함된다. 일부 이러한 구현예에서, 시약은 지지체 상에 가역적으로 고정된다. 일부 경우에, 시약은 공유 결합을 통해 지지체에 고정된다. 일부 양태에서, 시약은 지지체에 비공유적으로 가역적으로 고정된다.
일부 구현예에서, 지지체는 고체 지지체이다. 임의의 고체 지지체 (표면)는 시약의 가역적인 고정에 사용될 수 있다. 시약이 고정될 수 있는 고체 지지체의 구체적인 예로는 자성 비드, 중합체 비드, 세포 배양 플레이트, 마이크로타이터 플레이트, 멤브레인, 아가로스 비드, 폴리스타이렌 비드 또는 중공 섬유를 포함한다. 일부 양태에서, 중공 섬유는 TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA)로부터 입수 가능한 Quantum®세포 팽창 시스템에서 바이오리액터로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 고체 지지체에 공유적으로 부착된다. 다른 구현예에서, 비공유 상호작용이 또한, 예를 들어, 플라스틱 기질 상에 고정을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드를 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 또는 아비딘 뮤테인일 수 있다. 이러한 스트렙타비딘 뮤테인은 임의의 표면, 예를 들어, 크로마토그래피 정제에 사용되는 수지 (비드)에 공유적으로 부착될 수 있으며, IBA GmbH, Gottingen로부터 상업적으로 입수 가능한 형태, 예를 들어, Strep-Tactin®Sepharose, Strep-Tactin® Superflow®, Strep-Tactin® Superflow® high capacity 또는 Strep-Tactin®MacroPrep®가 있다. 상업적으로 용이하게 입수 가능한 다른 구체적인 예로는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 수지, 예컨대 결합 파트너 C로서 올리고히스티딘 태그 예컨대 펜타- 또는 헥사-히스티딘 태그를 포함하는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 가역적 결합을 위해, 예컨대 올리고-히스티딘 태그된 (his-태그된) 단백질의 가역적 고정에 사용될 수 있는 TALON®수지 (Westburg, Leusden, The Netherlands)가 있다. 다른 예로는 GE Life Sciences로부터 입수 가능한 칼모듈린 세파로스를 포함하며, 이는 글루타치온이 커플링되는 결합 파트너 C 또는 세파로스로서 칼모듈린 결합 펩타이드를 포함하는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 와 함께 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에, 결합 파트너 C는 글루타치온-S-트랜스퍼라제이다.
일부 구현예에서, 지지체는 고체상 또는 고정상을 포함한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 시약은 고체상 또는 고정상 (또한 크로마토그래피 매트릭스로도 불림) 상에 포함된다. 이러한 일부 구현예에서, 시약은 고체상 또는 고정상 상에 가역적으로 고정된다. 일부 경우에, 시약은 공유 결합을 통해 고정상에 가역적으로 고정된다. 일부 양태에서, 시약은 고정상에 비공유적으로 가역적으로 고정된다.
임의의 재료가 크로마토그래피 매트릭스로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 적합한 크로마토그래피 재료는 본질적으로 무해하며, 즉, 원하는 조건하에서 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 사용되는 경우에 세포 생존력에 해롭지 않다. 일부 구현예에서, 고정상은 미리 정해진 장소, 예컨대 미리 정해진 위치에 유지되는 반면, 샘플의 위치는 변경된다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 고정상은 이동상이 (배치를 통해 또는 배치 모드로) 유동하고, 상 사이에 (용해 또는 분산된) 액체상에 함유된 성분의 분포가 발생하는 크로마토그래피 시스템의 일부이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 고체 또는 반고체상의 형태를 가지는 반면, 단리/분리되어야 하는 표적 세포를 포함하는 샘플은 유체상이다. 크로마토그래피 매트릭스는 (임의의 적합한 크기 및 형상의) 미립자 재료 또는 일체형(monolithic) 크로마토그래피 재료, 예를 들어 종이 기판 또는 멤브레인일 수 있다. 이에 따라, 일부 양태에서, 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피 뿐만 아니라 평면 크로마토그래피 양자 모두일 수 있다. 일부 구현예에서, 표준 크로마토그래피 컬럼 이외에도, 양방향 유동이 가능한 컬럼, 예컨대 PhyNexus, Inc. San Jose, CA, U.S.A.로부터 입수 가능한 PhyTip®　컬럼, 또는 피펫 팁이 컬럼 기반/유동 모드 기반의 방법에 사용될 수 있다. 이에 따라, 일부 경우에, 피펫 팁 또는 양방향 유동 가능 컬럼이 또한 본 방법에 유용한 크로마토그래피 컬럼에 포함된다. 일부 경우에, 예를 들어 미립자 매트릭스 재료가 사용되는 경우, 미립자 매트릭스 재료는, 예를 들어, 평균 입자 크기가 약 5 μm 내지 약 200 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 400 μm, 또는 약 5 μm 내지 약 600 μm일 수 있다. 일부 양태에서, 크로마토그래피 매트릭스는, 예를 들어, 중합체 수지 또는 금속 산화물 또는 준금속 산화물일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 예를 들어 평면 크로마토그래피가 사용되는 경우, 매트릭스 재료는 평면 크로마토그래피에 적합한 임의의 물질, 예컨대 종래의 셀룰로스-기반의 또는 유기 중합체 기반의 멤브레인 (예를 들어, 종이 멤브레인, 나이트로셀룰로스 멤브레인 또는 폴리바이닐리덴 다이플로라이드 (PVDF) 멤브레인) 또는 실리카 코팅 유리 플레이트일 수 있다. 하나의 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스/고정상은 비자성 물질 또는 자화 불가능한 물질이다.
일부 구현예에서, 본 방법에 적합한 비자성 또는 자화 불가능 크로마토그래피 고정 또는 고체상은 유도체화된 실리카 또는 가교된 겔을 포함한다. 일부 양태에서, 가교된 겔은 천연 중합체, 예컨대 자연에서 발생하는 중합체 부류를 기초로 할 수 있다. 예를 들어, 크로마토그래피 고정상이 기초할 수 있는 천연 중합체는 다당류이다. 일부 구현예에서, 고체상 또는 고정상은 폴리스타이렌 비드이다. 일부 경우에, 각각의 다당류는 일반적으로 가교된다. 다당류 매트릭스의 예로는, 아가로스 겔 (예를 들어, 상이한 비드 공극 크기로 상업적으로 입수 가능한 Superflow™아가로스 또는 Sepharose®재료, 예컨대 Superflow™Sepharose®또는 가교된 덱스트란(들)의 겔을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 구체적인 예로는 덱스트란이 공유 결합된 미립자 가교된 아가로스 매트릭스이며, 이는 (다양한 비드 크기 및 다양한 공극 크기로) 상업적으로 입수 가능하며, 예컨대 GE Healthcare로부터 입수 가능한 Sephadex®또는 Superdex®가 있다. 이러한 크로마토그래피 재료의 또 다른 구체적인 예로는 Sephacryl®이 있으며, 이는 또한 GE Healthcare로부터 상이한 비드 및 공극 크기로 입수 가능하다. 이러한 크로마토그래피 재료의 또 다른 구체적인 예로는 CytoSorb 폴리스타이렌 비드이다.
일부 구현예에서, 가교된 겔은 또한 합성 중합체, 예컨대 자연에서 발생하지 않는 중합체 부류를 기초로 할 수 있다. 일부 양태에서, 크로마토그래피 고정 또는 고체상이 기초로 하는 합성 중합체 극성 단량체 단위를 가지는 중합체이며, 따라서 그 자체가 극성인 중합체이다. 이에 따라, 일부 경우에, 극성 중합체는 친수성이다. 소유성(lipophobic)으로도 불리는 친수성 분자는 일부 양태에서 물 분자와 쌍극자-쌍극자 상호작용을 형성할 수 있는 모이어티를 포함한다. 일반적으로, 친유성으로도 불리는 소수성 분자는 물로부터 분리되는 경향을 가진다.
　적합한 합성 중합체의 구체적인 예로는 폴리아크릴아마이드(들), 스타이렌-다이바이닐벤젠 겔 및 아크릴레이트 및 다이올의 공중합체, 또는 아크릴아마이드 및 다이올의 공중합체가 있다. 폴리메타크릴레이트 겔의 구체적인 예로는, 상업적으로 입수 가능한 Fractogel®가 있다. 에틸렌 글리콜 및 메타크릴레이트의 공중합체의 추가의 예로는, 상업적으로 입수 가능한 Toyopearl®가 있다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 고정상은 또한 천연 및 합성 중합체 성분, 예컨대 다당류 및 아가로스의 복합 매트릭스 또는 복합체 또는 공중합체, 예를 들어 폴리아크릴아마이드/아가로스 복합체, 또는 다당류 및 ΝΝ메틸렌비스아크릴아마이드의 복합 매트릭스 또는 복합체 또는 공중합체를 포함할 수 있다. 덱스트란 및 ΝΝ메틸렌비스아크릴아마이드 공중합체의 구체적인 예로는 상기 언급된 Sephacryl® 시리즈 재료가 있다. 일부 구현예에서, 유도체화된 실리카는 합성에 또는 천연 중합체에 커플링된 실리카 입자를 포함할 수 있다. 이러한 구현예의 예로는 다당류 그래프트된 실리카, 폴리바이닐피롤리돈 그래프트된 실리카, 폴리에틸렌 옥사이드 그래프트된 실리카, 폴리(2-하이드록시에틸아스파타마이드) 실리카 및 폴리(N-아이소프로필아크릴아마이드) 그래프트된 실리카를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제거 카트리지에 사용되는 경우 겔 여과 매트릭스이다. 일반적으로, 겔 여과는 수행하도록 설계된 성질에 의해 특징지어질 수 있다. 그러므로, 겔 여과 매트릭스는 일부 양태에서 주로 크기에 기초하여 세포 또는 다른 생물학적 실체를 분리시킨다. 이러한 일부 양태에서, 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 일반적으로 상기 언급된 바와 같은 미립자 다공성 재료이다. 크로마토그래피 매트릭스는 특정 배제 한계를 가질 수 있으며, 이는 일반적으로 분자가 공극으로 진입하는 것을 완전히 배제하는 분자량 이상의 관점에서 정의된다. 일부 구현예에서, 크기 배제 한계를 정의하는 각각의 분자량은 표적 세포의 중량에 상응하는 중량 이하가 되도록 선택될 수 있다. 이러한 구현예에서, 표적 세포가 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스의 공극에 진입하는 것이 방지된다. 마찬가지로, 고정상은 선택된 표적 세포의 크기보다 작은 크기의 공극을 가질 수 있다. 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 평균 공극 크기가 0 내지 약 500 nm이다.
일부 구현예에서, 샘플 내 존재하는 성분, 예컨대 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 또는 경쟁 시약은 공극의 배제 한계 이하의 크기를 가질 수 있으며 따라서 크로마토그래피 매트릭스의 공극에 진입할 수 있다. 일부 양태에서, 부분적으로 또는 완전히 공극 부피 내로 진입할 수 있는 이러한 성분 가운데, 공극 부피에 대한 접근이 적은 큰 분자가 먼저 용출될 수 있는 반면, 가장 작은 분자는 일반적으로 마지막으로 용출된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피 매트릭스의 배제 한계는 표적 세포의 최대 폭 이하가 되도록 선택된다. 그러므로, 일부 양태에서, 공극 부피에 접근하는 성분은 표적 세포보다 크로마토그래피 매트릭스에/매트릭스 상에 더 오래 머물 수 있다. 이에 따라, 일부 경우에, 표적 세포는 샘플의 다른 물질/성분으로부터 별도로 크로마토그래피 컬럼의 용출물에 수집될 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)와 같은 성분, 또는 해당되는 경우 경쟁 시약은, 표적 세포보다 겔 여과 매트릭스로부터 더 늦은 시점에 용출될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 효과는, 예컨대, 겔 투과 매트릭스가 샘플 내 존재하는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 및/또는 경쟁 시약에 결합할 수 잇는 결합 부위 Z를 포함하는 (예컨대 매트릭스에 공유 결합된) 시약을 포함하는 경우 더욱 증가할 수 있다. 일부 경우에, 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 및/또는 경쟁 시약은 시약의 결합 부위 Z에 결합되어 매트릭스에 고정될 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 방법은 제거 카트리지에서 수행된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 크로마토그래피 매트릭스는 또한 자기 인력(magnetically attractable) 물질, 예컨대 하나 이상의 자기 인력 입자 또는 자성유체(ferrofluid)를 포함할 수 있다. 각각의 자기 인력 입자는 표적 세포에 결합할 수 있는 결합 부위를 가지는 시약을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 자기 인력 입자는 반자성, 강자성, 상자성 또는 초상자성 물질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 초상자성 물질은 생성되는 영구적인 자화 없이 유도 자기장으로 자기장에 반응한다. 철 산화물 기반의 자성 입자로는, 예를 들어 Dynal Biotech로부터 상업적으로 입수 가능한 Dynabeads®Miltenyi Biotec의 자성 마이크로비드, CPG Inc., 뿐만 아니라 다양한 다른 공급원으로부터, 예컨대 Roche Applied Science, BIOCLON, BioSource International Inc., micromod, AMBION, Merck, Bangs Laboratories, Polysciences, 또는 Novagen Inc. 등으로부터의 자성 다공성 유리 비드가 있다. 초상자성 Co 및 FeCo기반의 자성 나노입자, 뿐만 아니라 강자성 Co 나노결정이, 예를 들어 Hutten, A. et al. (J. Biotech. (2004), 112, 47-63)에 기재되어 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 크로마토그래피 매트릭스는 임의의 자기 인력 물질을 가지지 않는다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 고정상, 예컨대 세포의 선별을 위한 크로마토그래피 컬럼 (선별 카트리지) 및 시약의 제거를 위한 제2 크로마토그래피 컬럼 (제거 카트리지)의 적어도 하나의 배열을 포함하는 장치가 제공된다. 장치는 직렬로 유체 연결된 제1 및 제2 고정상 (크로마토그래피 컬럼)의 복수의 배열을 포함할 수 있다. 장치는 제1 및 제2 고정상의 제1 배열 중 제1 고정상에 유체 연결된 샘플 입구를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 장치는 또한 세포용 샘플 출구를 포함할 수 있으며, 샘플 출구는 크로마토그래피를 위한 제1 및 제2 고정상의 적어도 하나의 배열의 마지막의 제2 고정상에 유체 연결되어 있다. 일부 양태에서, 장치는 또한 제1 및 제2 고정상의 배열 중 적어도 하나의 제1 고정상에 유체 연결된 경쟁 시약 용기를 포함할 수 있다.
2. 가용성 시약
일부 구현예에서, 시약은 고체 지지체에 결합되지 않고, 즉, 가용성 형태로 존재하거나 또는 가용성이다. 원칙적으로, 고체 지지체 또는 고정상과 같은 지지체에 고정된 시약의 경우와 동일한 시약을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 임의의 예시적인 시약은 이러한 시약을 지지체에 고정 또는 부착하지 않고, 예를 들어 고체 지지체 또는 고정상에 부착하지 않고 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 결합 파트너, C와의 상호 작용을 통해 결합제에 가역적으로 결합하기 위한, 복수의 결합 부위, Z를 포함한다. 일부 경우에, 시약은 개별 분자의 올리고머 또는 중합체, 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛의 복합체의 올리고머 또는 중합체 (예를 들어 이합체, 삼합체 또는 사합체 단백질의 올리고머 또는 중합체)이다. 일부 구현예에서, 시약은, 예를 들어, 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머, 칼모듈린 올리고머, 적어도 두 개의 킬레이트 그룹 K를 제공하는 화합물 (올리고머)일 수 있으며, 여기서 적어도 두 개의 킬레이트 그룹은 전이 금속 이온에 결합할 수 있어, 이에 따라 상기 시약이 올리고히스티딘 친화도 태그, 다합체의 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 또는 비오틴화된 담체 단백질에 결합할 수 있도록 한다.
일부 구현예에서, 시약은 시약에 부착된 고체 지지체 (표면)의 부재를 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시약은 입자, 비드, 나노입자, 미세구형 또는 다른 고체 지지체를 포함하지 않거나, 이에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착되지 않는다. 일부 구현예에서, 상기 시약은 비강성의, 비가요성 또는 경질이거나, 또는 강성의, 비가요성, 또는 경질 표면을 포함하지 않거나, 이에 부착되지 않는다. 일부 구현예에서, 시약은 가요성 또는 실질적으로 가요성이다. 일부 경우에, 시약은 세포 표면의 형태를 조정하거나, 이에 적응할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 구형 또는 실질적으로 구형인 형상이 아니거나, 이를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 실질적으로 모든, 즉, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 시약은 유기 물질로 구성되거나, 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 시약은 지질, 탄수화물, 단백질, 펩타이드 또는 이의 혼합물로 구성되거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 시약은, 무기 재료, 무기 코어, 예를 들어 금속, 예를 들어 철, 합성 또는 무기 중합체, 예컨대 스타이렌 중합체, 예를 들어 폴리스타이렌, 라텍스, 실리카 또는 자성 코어가 필수적으로 부재하거나, 이로 구성되거나, 이를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시약 중 무기 재료, 또는 또는 시약의 일부로서 포함되는 무기 재료의 상대적인 백분율은 20%, 15%, 10%, 5% 미만이다.
일부 구현예에서, 수용액 내 시약의 전체 부피의 대부분 (즉, 50% 초과), 예컨대 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상은 시약을 포함하는 개별적인 단백질 분자, 예컨대 개별 분자의 올리고머 또는 중합체 또는 개별 분자를 구성하는 서브유닛의 복합체 (예를 들어 사합체 분자)로 구성된다. 일부 구현예에서, 가용성 시약의 전체 밀도는 1.2 g/cm3, 1.1 g/cm3, 1.0 g/cm3 미만이다.
일부 구현예에서, 예를 들어 지지체 또는 고체 지지체에 부착되지 않는 (예를 들어 비드에 부착되지 않는) 가용성 시약은, 상대적으로 작은 크기, 예컨대 일반적으로 약 20 nM 이하의 크기, 예컨대 약 15 nM 이하, 약 10 nM 이하, 약 5 nM 이하의 크기를 가진다.
일부 구현예에서, 예를 들어 지지체 또는 고체 지지체에 부착되지 않는 (예를 들어 비드에 부착되지 않는) 가용성 시약은 생물학적으로 불활성이며, 즉, 살아있는 세포에 대해 독성을 가지지 않는다. 일부 구현예에서, 시약은 생분해성일 수 있으며, 예를 들어, 효소 활성에 의해 분해되거나 식균 세포에 의해 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약 (예를 들어 스트렙타비딘 또는 뮤테인, 예컨대 사합체 스트렙타비딘 뮤테인)을 담체, 예컨대 유기 담체에 반응시킬 수 있다. 일부 양태에서, 또한 다당류와의 반응 이외에도, 또한 담체 단백질로서 생리학적으로 또는 약제학적으로 허용되는 단백질, 예컨대 혈청 알부민 (예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA))을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 시약, 예컨대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 (개별적인 사합체 또는 또한 올리고머의 형태)은 비공유 상호 작용을 통해 담체 단백질에 결합될 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 비오틴화된 BSA (ThermoFisher Scientific, Sigma Aldrich 또는 Vectorlabs 등의 다양한 공급업체로부터 상업적으로 입수 가능)는 시약 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인)과 반응될 수 있다. 일부 양태에서, 시약 올리고머 (예를 들어 스트렙타비딘 올리고머)의 일부는 하나 이상의 결합 부위 Z를 통해 비오틴화된 담체 단백질에 비공유적으로 결합할 수 있으며, 올리고머의 결합 부위 Z의 대부분이 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제) 및 본 명세서에 기재된 임의의 추가의 시제에 결합하는데 이용 가능하다. 이에 따라, 이러한 접근법에 의해 다수의 결합 부위 Z를 가지는 가용성 시약이 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 시약, 예컨대 (개별적인 사합체 또는 올리고머의 형태로의) 스트렙타비딘 뮤테인은 합성 담체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 분자에 공유 결합될 수 있다. 임의의 적합한 PEG 분자는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어, PEG 분자 및 각각의 시약은 가용성일 수 있다. 일반적으로, 최대 1000 Da의 분자량을 가지는 PEG 분자는 물 또는 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 배양 배지에 가용성이다. 일부 경우에, 이러한 PEG 기반의 시약은 스트렙타비딘 뮤테인의 아미노 기와 함께 상업적으로 입수 가능한 활성화된 PEG 분자 (예를 들어, 미국, 캘리포니아, 어바인 소재의 NOF North America Corporation로부터 입수 가능한 PEG-NHS 유도체, 또는 미국, 노스 캘리포니아, 채플 힐 소재의 Creative PEGWorks로부터 입수 가능한 활성화된 PEG 유도체)를 사용하여 제조될 수 있다.
3. 시제
일부 구현예에서, 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 세포 표면 상의 분자, 예를 들어 세포 표면 분자에 결합하기 위한 하나의 또는 복수의 결합 부위, B를 가진다. 이에 따라, 일부 예시에서, 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 결합 부위 B 또는 복수의 결합 부위 B를 포함하며, 상기 시제 (수용체-결합제 또는 선별제)와 표적 세포의 표면 상의 분자 사이의 특이적 결합은 B와 분자 사이의 상호 작용을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 시제는 오직 단일 결합 부위를 포함하며, 즉, 1가이다. 일부 구현예에서, 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 세포 표면 분자에 결합할 수 있는적어도 2개의, 예컨대 3, 4 또는 5개의 결합 부위 B를 포함하는 복수의 결합 부위 B를 가진다. 이러한 일부 양태에서, 적어도 2개의 또는 복수의 결합 부위 B는 식별될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 또는 복수의 결합 부위 B 중 하나 이상은 상이할 수 있다 (예를 들어 B1 및 B2).
일부 구현예에서, 하나 이상의 상이한 시제 (예를 들어 하나 이상의 상이한 수용체-결합제, 선별제 또는 세포 상의 분자에 결합하는 다른 시제)는 시약에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 시약은 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 적어도 2, 3, 4 개 이상의 상이한 시제는 동일한 시약에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 적어도 2 개의 상이한 시제는 동일한 시약에 가역적으로 결합되며, 각각의 시약은 상기 시제와 분자 사이의 특이적 결합에 대한 결합 부위 B 또는 복수의 결합 부위 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 이상의 시제는 예를 들어 동일한 또는 실질적으로 동일한 분자에 대한 결합을 위한 동일한 결합 부위 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2개 이상의 시제는 예를 들어 상이한 분자에 대한 결합을 위한 상이한 결합 부위 B를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 시제 (예를 들어 제1 수용체-결합제 또는 제1 선별제)는 결합 부위 B1, B2, B3, B4, 등을 포함하며, 제2 시제 (예를 들어 제2 수용체-결합제 또는 제2 선별제)는 또 다른 결합 부위 B1, B2, B3, B4, 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 시제 (예를 들어 제1 선별제)는 합 부위 B1를 포함하고 제2 시제 (예를 들어 제2 선별제)는 결합 부위 B3를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 시제 (예를 들어 제1 수용체-결합제)는 결합 부위 B2를 포함하고 제2 시제 (예를 들어 제2 수용체-결합제)는 결합 부위 B4를 포함한다. 이러한 임의의 구현예에서, 제1 시제 및 제2 시제는 결합 파트너, C1 또는 C2를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 동일할 수 있다. 일부 구현예에서, C1 및 C2는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 시제 및 제2 시제는 동일한 결합 파트너, C1을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 상기 시제와 (예를 들어, 결합 부위 B를 통한) 시약의 결합 부위 Z 사이의 결합에 대한 해리 상수 (Kd)는 약 10-2　M 내지 약 10-13　M 또는 약 10-3　M 내지 약 10-12　M 또는 약 10-4　M 내지 약 10-11M, 또는 약 10-5M 내지 약 10-10M 범위 내의 값을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제와 분자 사이의 결합에 대한 해리 상수 (Kd)는 낮은 친화도를 가져, 예를 들어, Kd가 약 103 내지 약 107 M의 범위이다. 일부 구현예에서, 결합제와 분자 사이의 결합에 대한 해리 상수 (Kd)는 높은 친화도를 가져, 예를 들어, Kd가 약 107 내지 약 1010 M의 범위이다.
일부 구현예에서, 시제와 결합 부위 B를 통한 분자의 결합의 해리는, 예를 들어, 표적 세포가 일시적으로 염색되거나 또는 시약과 시제 사이의 가역적 결합이 파괴된 후 시제와 연관될 수 있도록 충분히 빠르게 일어난다. 일부 경우에, 상기 시제와 (결합 부위 B를 통한) 분자 사이의 결합에 대한 koff　속도(또한 해리 속도 상수로도 불림)의 관점에서 표현되는 경우, koff　속도는 약 0.5×104　초1　이상, 약 1×104　초1　이상, 약 2×104　초1　이상, 약 3×104　초1　이상, 약 4×104　초1　이상, 약 5×104　초1　이상, 약 1×103　초1　이상, 약 1.5×103　초1　이상, 약 2×103　초1　이상, 약 3×103　초1　이상, 약 4×103　초1, 약 5×103　초1　이상, 약 1×102　초 이상, 또는 약 5×101　초1　이상이다. 특정 시제 및 세포 분자 상호 작용에 대한 적합한 koff 속도 범위를 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 수준 이내이다 (예를 들어 미국 특허 출원US2014/0295458 참조). 예를 들어, 높은 koff　속도의, 예를 들어, 4.0×104　초1　초과의 시제는, 상기 결합 복합체의 파괴 단계 이후, 시제 대부분이 1 시간 이내에 제거 또는 해리될 수 있도록 사용될 수 있다. 다른 경우에서, 낮은 koff　속도의, 예를 들어, 1.0×104　초1의 시제는, 상기 결합 복합체의 파괴 단계 이후, 시제 대부분이 3 시간 반 이내에 제거 또는 해리될 수 있도록 사용될 수 있다.
　일부 구현예에서, 상기 결합의 Kd　뿐만 아니라 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 결합 부위 B와 세포 표면 분자 사이에 형성된 결합의 Kd, koff　및 kon　속도는 임의의 적합한 수단에 의해, 예를 들어, 형광 적정, 평형 투석 또는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
일부 양태에서, 세포 표면 분자는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)가 향할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, 세포 표면 분자는 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 수용체, 예를 들어, 멤브레인 수용체 단백질이다. 일부 구현예에서, 수용체는 지질, 다당류 또는 핵산이다. 일부 구현예에서, 단백질인 세포 표면 분자는 말초 멤브레인 단백질 또는 일체형 멤브레인 단백질일 수 있다. 세포 표면 분자는 일부 구현예에서 멤브레인에 걸쳐있는 하나 이상의 도메인을 가질 수 있다. 몇 가지 구체적인 예시로서, 멤브레인 횡단 도메인을 가지는 멤브레인 단백질은 후각 수용체 등의 G-단백질 결합 수용체, 로돕신 수용체, 로돕신 페로몬 수용체, 펩타이드 호르몬 수용체, 미각 수용체, GABA 수용체, 아편 수용체, 세로토닌 수용체, Ca 2+ 수용체, 멜라놉신, 예컨대 리간드 개폐형, 전압 개폐형 또는 기계적 개폐형 수용체 등의 아세틸콜린, 니코틴산, 아드레날린, 노르에피네프린, 카테콜아민, L-DOPA-, 도파민 및 세로토닌 (생체 아민, 엔도르핀/엔케팔린) 뉴로펩티드 수용체를 비롯한 신경전달물질 수용체, 세린/트레오닌 키나아제 등의 수용체 키나아제, 티로신 키나아제, 염소 채널 등의 포린/채널, 칼륨 채널, 나트륨 채널, OMP 단백질, 아미노산 수송체 등의 ABC 수송체 (ATP-Binding Cassette-Transporter), Na-글루코스 수송체, Na/요오드화물 수송체, 집광성복합체 (Light Harvesting Complex) 등의 이온 수송체, 사이토크롬 c 옥시다아제, ATPase Na/K, H/K, Ca, 메탈로프로테아제 등의 세포 부착 수용체, 인테그린 또는 카드헤린일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 세포 표면 분자는 원하는 세포의 집단 또는 부분집단, 예를 들어 혈액 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, T 세포, 보조 T 세포, 예를 들어, CD4+ 보조 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵구, 또는 줄기 세포, 예를 들어 CD34-양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포의 집단 또는 부분집단을 한정하는 항원일 수 있다. T-세포의 예로는 CMV-특이적 CD8+ T-림프구, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포 및 조절 T-세포 (Treg)와 같은 세포를 포함한다. Treg의 구체적인 예로는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포가 있으며, 기억 T-세포의 구체적인 예로는 CD62L CD8+ 특이적 중심 기억 T-세포가 있다. 세포 표면 분자는 또한 종양 세포에 대한 마커일 수도 있다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 구현예에서, 상기 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는, 세포 표면 분자에 결합할 수 있는 결합 부위 B 이외에도, 결합 파트너 C를 가진다. 일부 양태에서, 이러한 결합 파트너 C는 시약의 결합 부위 Z에 결합할 수 있고, 이러한 시약은 결합 파트너 C에 대해 하나 이상의 결합 부위를 가진다. 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C와 시약의 결합 부위(들) Z 사이에 형성될 수 있는 비공유 결합은 임의의 원하는 강도 및 친화도를 가질 수 있으며, 상기 방법이 수행되는 조헌하에서 파괴될 수 있거나 가역적일 수 있다. 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 적어도 하나를 비롯하여 2 개, 3 개 이상의 추가결합 파트너 C를 포함할 수 있고, 시약은 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C에 대한 적어도 2개, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8개 이상의 결합 부위 Z를 포함할 수 있다. 미국 특허 7,776,562, 미국 특허 8,298,782 또는 국제 특허 출원 WO 2002/054065에 기재된 바와 같이, 결합 파트너 C 및 하나 이상의 상응하는 결합 부위 Z를 가지는 시약의 임의의 조합이 선택될 수 있으며, 예를 들어, 결합 파트너 C 및 결합 부위 Z는 복합체에 가역적으로 결합하여, 예컨대 결합 효과를 야기할 수 있다.
시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함된 결합 파트너 C는 예를 들어 (중합체를 비롯하여) 탄화수소 기반일 수 있으며, 질소-, 인-, 황-, 카벤-, 할로겐- 또는 슈도할로겐 기를 포함한다. 일부 양태에서, 알코올, 유기 산, 무기 산, 아민, 포스핀, 싸이올, 다이설파이드, 알케인, 아미노산, 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질, 당류, 올리고당류, 또는 다당류일 수 있다. 추가적인 예로서, 또한 양이온, 음이온, 다가양이온, 다가음이온, 다가양이온, 전해질, 다가전해질, 탄소 나노튜브 또는 탄소 나노폼일 수 있다. 일반적으로, 이러한 결합 파트너 C는 시약의 결합 부위에 대해 다른 물질 보다 더 높은 친화도를 가진다. 각각의 결합 파트너 C는 , 크라운 에터, 면역글로불린, 이의 단편 및 항체-유사 기능을 가지는 단백질성 결합 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 비오틴을 포함하며 시약은 비오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘에 가역적으로 결합하는 비오틴 유사체를 포함하고, 시약은 각각의 비오틴 유사체에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드를 포함하고, 시약은 각각의스트렙타비딘 또는 아비딘 결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 아비딘 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 시약은 스트렙타비딘, 예컨대 상기 기재된 임의의 스트렙타비딘 뮤테인 (예를 들어 제시된 서열 번호 3-6 또는 60-61)을 비롯한 스트렙타비딘 뮤테인, 및 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 스트렙타비딘-결합 펩타이드는 서열 번호 9에 제시된 일반식을 가지는 서열, 예컨대 서열 번호 10에 제시된 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드 서열은 서열 번호 11에 제시된 일반식, 예컨대 서열 번호 12에 제시된 일반식을 가진다. 한 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (또한 Strep-tag®로도 불리며, 서열 번호 7에 제시됨)이다. 한 예에서, 펩타이드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (또한 Strep-tag®II로도 불리며, 서열 번호 8에 제시됨)이다. 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 적어도 2개의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 포함하고, 두 모듈 사이의 거리는 적어도 0 내지 50 개의 아미노산이며, 하나의 결합 모듈은 3 내지 8개의 아미노산을 가지며 적어도 서열 His-Pro-Xaa (서열 번호 9)을 포함하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴, 또는 메티오닌, 다른 결합 모듈은 동일한 또는 상이한 스트렙타비딘 펩타이드 리간드, 예컨대 서열 번호 11에 제시된 서열을 가진다(예를 들어, 국제 공개 PCT 출원 WO02/077018; 미국 특허 7,981,632를 참조한다). 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 서열 번호 13 또는 14 중 어느 하나에 제시된 일반식을 가지는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩타이드 리간드는 서열 번호 15-19 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 결합 파트너 C는 친화도 태그로서 당업자에게 공지된 모이어티를 포함한다. 이러한 구현예에서, 시약은 상응하는 결합 파트너, 예를 들어, 친화도 태그에 결합하는 것으로 알려진 항체 또는 항체 단편을 포함할 수 있다. 공지된 친화도 태그의 일부 구체적인 예로서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 다이나이트로페놀 또는 다이곡시게닌, 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역글로불린 도메인, 말토스-결합 단백질, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP) 또는 싸이오레독신, 칼모듈린 결합 펩타이드 (CBP), FLAG '-펩타이드, HA-태그 (서열: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) (서열 번호 20), VSV-G-태그 (서열: Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys) (서열 번호 21), HSV-태그 (서열: Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp) (서열 번호 22), T7 에피토프 (Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly) (서열 번호 22), 말토스 결합 단백질 (MBP), 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D의 서열 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp의 HSV 에피토프 (서열 번호 24), 서열 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu의 전사 인자 c-myc의 "myc" 에피토프 (서열 번호 25), V5-태그 (서열: Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr) (서열 번호 26), 또는 글루타치온-S-트랜스퍼라제 (GST)를 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 항체 또는 항체 단편일 수 있는 하나 이상의 시약의 결합 부위 Z와 항원 사이에 형성된 복합체는 유리 항원, 즉, 유리 펩타이드 (에피토프 태그) 또는 유리 단백질 (예컨대 MBP 또는 CBP)를 첨가함으로써 경쟁적으로 파괴될 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 태그는 또한 올리고뉴클레오타이드 태그일 수 있다. 일부 경우에, 이러한 올리고뉴클레오타이드 태그는, 예를 들어, 시약에 연결 또는 포함된, 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화하는데 사용될 수 있다.
적합한 결합 파트너 C의 추가의 예로는 렉틴, 단백질 A, 단백질 G, 금속, 금속 이온, 나이트롤로 트라이아세트산 유도체 (NTA), RGD-모티프, 덱스트란, 폴리에틸렌이미드 (PEI), 산화환원 중합체, 당단백질, 압타머, 염료, 아밀로스, 말토스, 셀룰로스, 키틴, 글루타치온, 칼모듈린, 젤라틴, 폴리마이신, 헤파린, NAD, NADP, 라이신, 아르기닌, 벤즈아미딘, 폴리 U, 또는 올리고-dT를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Concavalin A와 같은 렉틴은 다당류 및 글리코실화 단백질에 결합하는 것으로 공지되어 있다. 염료의 구체적인 예로는 트라이아진 염료, 예컨대 NADH-의존적 효소에 특이적으로 결합하는 Cibacron 블루 F3G-A (CB) 또는 Red HE-3B가 있다. 일반적으로, Green A는 Co A 단백질, 인간 혈청 알부민, 및 탈수소효소에 결합한다. 일부 경우에, 염료 7-아미노액티노마이신 D 및 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌은 DNA에 결합한다. 일반적으로, Ni, Cd, Zn, Co, 또는 Cu와 같은 금속의 양이온은 일반적으로 친화도 태그, 예컨대 서열을 포함하는 올리고히스티딘을 비롯한, 헥사히스티딘 또는 His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys 태그 (MAT 태그) (서열 번호 35), 및 N-메타크릴로일-(L)-시스테인 메틸 에스터에 결합하도록 사용된다.
일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C와 하나 이상의 시약의 결합 부위 Z 사이의 결합은 2가, 3가 또는 4가 양이온의 존재하에 일어난다. 이와 관련하여, 일부 구현예에서, 시약은 적합한 킬레이트제에 의해 일반적으로 포획된, 예를 들어 착화된, 2가, 3가 또는 4가 양이온을 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 예를 들어 복합체, 2가, 3가 또는 4가 양이온을 포함하는 모이어티를 포함할 수 있다. 각각의 금속 킬레이트제의 예로는 에틸렌다이아민, 에틸렌-다이아민테트라아세트산 (EDTA), 에틸렌 글리콜 테트라아세트산 (EGTA), 다이에틸렌트라이아민펜트아세트산 (DTPA), N,N-비스(카복시메틸)글리신 (나이트릴로트라이아세트산, NTA으로도 불림), l,2-비스(o-아미노페녹시)에테인-N,N,N',N'-테트라아세트산 (BAPTA), 2,3-다이머-캅토-l-프로판올 (다이머캅프롤), 포르핀 및 헴(heme)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예로서, EDTA는 대부분의 1가, 2가, 3가 및 4가 금속 이온, 예를 들어 은 (Ag+), 칼슘 (Ca2 +), 망간 (Mn2 +), 구리 (Cu2+), 철 (Fe2 +), 코발트 (Co　+) 및 지르코늄 (Zr4 +)과 복합체를 형성하는 반면, BAPTA는 Ca2 +에 대해 특이적이다. 구체적인 예로서, 기술 분야에서 사용되는 표준 방법은 올리고히스티딘 태그와 구리 (Cu2 +), 니켈 (Ni2 +), 코발트 (Co2 +), 또는 아연 (Zn2+) 이온 사이의 복합체 형성이며, 이러한 방법은 킬레이트제 나이트릴로트라이아세트산 (NTA)에 의해 제시된다.
일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 칼모듈린 결합 펩타이드를 포함하고, 시약은 예를 들어 미국 특허 5,985,658에 기재된 다합체의 칼모듈린을 포함한다. 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 FLAG 펩타이드를 포함하고, 시약은 FLAG 펩타이드에 결합하는 항체, 예를 들어, 미국 특허 4,851,341에 기재된 단일클론 항체 4E11에 결합하는 FLAG 펩타이드에 결합하는 항체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C는 올리고히스티딘 태그를 포함하고, 시약은 올리고히스티딘 태그에 결합하는 항체 또는 전이 금속 이온을 포함한다. 일부 경우에, 이러한 모든 결합 복합체의 파괴는 금속 이온 킬레이트화, 예를 들어 칼슘 킬레이트화에 의해, 예를 들어 EDTA 또는 EGTA를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 칼모듈린, 항체 예컨대 4E11 또는 킬레이트화된 금속 이온 또는 유리 킬레이트제는 종래의 방법에 의해, 예를 들어 스트렙타비딘 또는 아비딘 또는 이의 올리고머와의 비오틴화 및 복합체화에 의해, 또는 본질적으로 Noguchi, A, et al. Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137의 제1 단계에 기재된 바와 같이, 카복실 잔기를 다당류, 예를 들어 덱스트란으로 도입하고, 제2 단계에서 종래의 카보다이이미드 화학반응을 사용하여 칼모듈린 또는 항체 또는 킬레이트화된 금속 이온 또는 유리 킬레이트제를 1차 아미노 기를 통해 다당류, 예를 들어 덱스트란 백본의 카복실 기에 연결함으로써 다합체화될 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)에 포함되는 결합 파트너 C와 하나 이상의 시약의 결합 부위 Z 사이의 결합은 금속 이온 킬레이트화에 의해 파괴될 수 있다. 금속 킬레이트화는 예를 들어 EGTA 또는 EDTA의 첨가에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 예를 들어 항체, 이의 단편, 또는 항체 유사 기능을 가지는 단백질성 결합 분자에 의해 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 시제의 결합 부위 B는 항체 조합 부위이며, 예컨대 하나 이상의 항체의 상보성 결정 영역 (CDR)이거나, 또는 이를 포함한다. (재조합) 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv 단편 (scFv), 2가 항체 단편, 예컨대 (Fab)2'-단편, 다이아바디, 트리아바디 (Iliades, P., et al, FEB S Lett (1997) 409, 437-441), 데카바디 (Stone, E., et al, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94) 및 다른 도메인 항체 (Holt, L.J., et al, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490), 단일 도메인 항체 (nanobodies®를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 2가 단백질성 인공 결합 분자, 예컨대 "듀오칼린"으로도 공지되어 있는 이합체성 리포칼린 뮤테인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 단일 결합 부위 B를 가질 수 있으며, 즉, 1가일 수 있다. 1가 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)의 예로는 1가 항체 단편, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 결합 분자 또는 MHC 분자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 1가 항체 단편의 예로는 Fab 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 예를 들어, 낙타과 유래의 나노바디® 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)을 비롯한 2가 단일-사슬 Fv 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 상기 시제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예컨대 Fab 단편, Fv 단편, 단일-사슬 Fv 단편 (scFv), 단일 도메인 항체, 예를 들어, 낙타과 유래의 나노바디® 2가 항체 단편 예컨대 (Fab)2'-단편이다. 일부 구현예에서, 상기 시제는 해당 세포 분자에 결합하는 것으로 공지되어 있는 부모계 항체이거나, 또는 이로부터 유도된다. 세포 표면 분자에 대한 다양한 항체 분자 또는 이의 단편은 기술 분야 내 공지되어 있으며 임의의 다양한 항체 분자가 본 발명의 방법에서 시제로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 시제는 부모계 또는 기준 항체의 가변 중쇄에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하여 예를 들어 변형된 친화도를 가지는 항체를 생성하거나, 또는 상기 기재된 바와 같이 충분히 빠른 분리를 나타내는 항체 또는 이의 단편이다. 예를 들어, 이러한 예시적인 돌연변이는 항-CD4 항체 13B8.2의 돌연변이체의 맥락으로 공지되어 있으며 (예를 들어, 미국 특허 7,482,000, 미국 특허 출원 번호 US2014/0295458 또는 국제 특허 출원 WO2013/124474 참조), 이러한 임의의 돌연변이는 또 다른 부모계 또는 기준 항체에서 생성될 수 있다.
일부 양태에서, 1가일 수 있는 시제 (예를 들어, 수용체-결합제 또는 선별제)는 예를 들어 1가 항체 단편 또는 1가 인공 결합 분자 (단백질성 또는 기타) 예컨대 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반의 뮤테인 (또한 "안티칼린®으로도 알려짐), 또는 F(ab')2　단편과 같이 양 결합 부위 모두가 유지되는 2가 분자 예컨대 항체 또는 단편을 포함한다.
항체 유사 기능을 가지는 단백질성 결합 분자의 예로는 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반의 뮤테인을 포함한다 (예를 들어, WO 03/029462, Beste et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903 참조). 일반적으로, 빌린 (bilin) 결합 단백질, 인간 호중구 젤라티나제-관련 리포칼린, 인간 Apo 지단백질 D 또는 인간 눈물 리포칼린 등의 리포칼린은, 주어진 표적을 결합하도록 변형될 수 있는 천연 리간드-결합 부위를 가진다. 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 시제 (예컨대, 수용체 결합 제제 또는 선택 제제)로서 사용될 수 있는 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백성 결합 분자의 추가적인 예로는, 소위 글루바디 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 96/23879호 참조), 안키린 스캐폴드에 기초한 단백질 (Mosavi, L.K., et al., Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448) 또는 크리스탈린 스캐폴드 (예를 들어, 국제 특허 출원 WO 01/04144 참조) 문헌 Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187에 기술된 단백질, 아드넥틴 (AdNectins), 테트라넥틴 및 아비머를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 인간 수용체 도메인 패밀리의 엑손 셔플링에 의해 진화된 다가 아비머 단백질을 비롯한 아비머는, 여러 세포 표면 수용체에서 다중 도메인 줄(string)로부터 발생하는 소위 A-도메인을 함유한다 (Silverman, J., et al., Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561). 일반적으로 인간 파이브로넥틴 도메인으로부터 유래된 아드넥틴은, 전형적으로 표적에 대한 면역 글로불린-유사 결합을 위하여 조작될 수 있는 3개의 루프를 함유한다 (Gill, D.S. & Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658). 일반적으로 개별적인 인간 동종삼합체 단백질로부터 유래된 테트라넥틴은, 마찬가지로 전형적으로 원하는 결합을 위하여 조작될 수 있는 C-형 렉틴 도메인에 루프 영역을 포함한다. 일부 경우에서 단백질 리간드로 작용할 수 있는 펩토이드는, 전형적으로 측사슬이 탄소 원자보다는 아미드 질소에 연결된다는 점에서 펩티드와 상이한 올리고(N-알킬) 글리신이다. 펩토이드는 전형적으로 프로테아제 및 기타 조작 효소에 대하여 내성이며, 펩타이드보다 훨씬 높은 세포 투과성을 가질 수 있다 (예를 들어, 문헌 Kwon, Y.-U., and Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509 참조).
적합한 단백성 결합 분자의 추가적인 예로는 EGF-유사 도메인, Kringle-도메인, 파이브로넥틴 I형 도메인, 파이브로넥틴 II형 도메인, 파이브로넥틴 III형 도메인, PAN 도메인, Gla 도메인, SRCR 도메인, Kunitz/Bovine 췌장 트립신 저해제 도메인, 텐다미스탯 (tendamistat), Kazal-형 세린 프로테아제 저해제 도메인, Trefoil (P-형) 도메인, 폰 빌레브란트 (von Willebrand) 인자 C형 도메인, 아나필라톡신-유사 도메인, CUB 도메인, 티로글로블린 I형 반복, LDL-수용체 클래스 A 도메인, 스시 도메인, 링크 도메인, 트롬보스폰딘 I형 도메인, 면역 글로불린 도메인 또는 면역 글로블린-유사 도메인 (예를 들어, 도메인 항체 또는 낙타 중사슬 항체), C-형 렉틴 도메인, MAM 도메인, 폰 빌레브란트 인자 A형 도메인, 소마토메딘 B 도메인, WAP-형 4 다이설파이드 코어 도메인, F5/8 C형 도메인, 헤모펙신 (Hemopexin) 도메인 , SH2 도메인, SH3 도메인, 라미닌(Laminin)-형 EGF-유사 도메인, C2 도메인, "카파바디 (Kappabodies)" (Ill et al. Protein Eng (1997) 10, 949-57), 소위 “미니바디 (minibody)”et al., EMBO J (1994) 13, 5303-5309), 다이어바디 (Holliger et al., PNAS USA (1993)90, 6444-6448), 소위 “자누시스 (Janusis)”r et al., EMBO J (1991) 10, 3655-3659 또는 Traunecker et al., Int J Cancer (1992) Suppl 7, 51-52), 나노바디, 마이크로바디, 아필 린 (affilin), 아피바디 (affibody), 크노틴 (knottin), 유비퀴틴 (ubiquitin), 징크-핑거 단백질, 자가 형광 단백질 또는 류신-풍부 반복 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 항체 유사 기능을 가지는 핵산 분자는 압타머일 수 있다. 일반적으로, 앱타머는 정의된 3차원 모티프로 접혀 주어진 표적 구조에 대해 높은 친화성을 나타낸다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 시제, 예를 들어, 결합 파트너, 예컨대 결합 파트너 C를 포함하는 시제는, 올리고머 입자 시약에 부착, 연결, 및/또는 결합된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 부착, 연결, 및/또는 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 하나 이상의 시제를 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉함으로써 올리고머 입자 시약에 부착, 연결, 및/또는 결합된, 예를 들어, 가역적으로 결합된다. 특정 구현예에서, 처리, 접촉, 및/또는 인큐베이션은 혼합, 및/또는 흔들기, 예를 들어, 약한 흔들기 및/또는 혼합으로 수행된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 약 또는 적어도 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 60 분, 90 분, 120 분, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간, 16 시간, 또는 24 시간 동안 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 1 분 내지 12 시간, 1 분 내지 1 시간, 1 분 내지 30 분, 10 분 내지 60 분, 10 분 내지 20 분, 1 시간 내지 3 시간, 1 시간 내지 2 시간, 또는 6 시간 내지 12 시간 동안 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 리고머 입자 시약과 5 분 내지 30 분, 또는 약 15 분 동안 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다.
구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 리고머 입자 시약과 약 또는 적어도 4 ℃, 8 ℃, 12 ℃, 16 ℃, 20 ℃, 24 ℃, 28 ℃, 32 ℃, 37 ℃, 39 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 90 ℃, 또는 100 ℃의 온도에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 37 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 20 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 39 ℃, 또는 40 ℃ 내지 100 ℃의 온도에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 실온에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 약 23 ℃, 24 ℃, 25 ℃, 또는 26 ℃ ± 2 ℃, ± 1 ℃, ± 0.5 ℃, ± 0.2 ℃, ± 0.1 ℃, ± 0.05 ℃, 또는 ± 0.01 ℃에서 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 0.5μg, 1.0 μg, 1.5 μg, 2.0 μg, 2.5 μg, 3.0 μg, 4.0 μg, 5.0 μg, 6 μg, 7 μg, 8 μg, 9 μg 또는 10 μg의 올리고머 입자 시약 당, 약, 또는 적어도 0.1μg, 0.2μg, 0.3μg, 0.4μg, 0.5μg, 0.6μg, 0.7μg, 0.8μg, 0.9μg, 1.0 μg, 1.2 μg, 1.4 μg,1.6 μg, 1.8 μg, 2.0 μg, 2.2 μg, 2.4 μg, 2.6 μg, 2.8 μg, 또는 3.0 μg 시제의 양으로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 올리고머 입자 시약의 2 μg, 3 μg, 4 μg, 또는 5 μg 당 약 1.0 μg, 시제의 양으로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시제, 예를 들어, 결합 파트너, 예컨대 결합 파트너 C를 포함하는 시제는, 하나 이상의 시제와 인큐베이션, 처리, 및 또는 접촉시킴으로써 올리고머 입자 시약에 부착, 연결, 및/또는 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 4 ℃ 내지 39 ℃, 10 ℃ 내지 25 ℃, 또는 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 1 분 내지 1 시간 동안 올리고머 입자 시약의 2 μg, 3 μg, 4 μg, 또는 5 μg 당 약 1.0 μg 시제의 양으로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 올리고머 입자 시약과 10℃ 내지 25℃의 온도에서 5분 내지 30분간 올리고머 입자 시약의 3 μg 당 약 1.0 μg의 시제의 양으로 인큐베이션, 처리, 및/또는 접촉된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 시제는 본 명세서에 기재된 시제, 예를 들어, 섹션 II-C-3에 기재된 시제이다. 일부 구현예에서, 시제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 결합 파트너를 포함하는 이의 항체 또는 항원 단편, 예를 들어, streptag이다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하는 항-CD3 및/또는 항 CD28 Fab, 예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩타이드, 예를 들어 Strep-tagII이다.
a. 수용체-결합제
일부 구현예에서, 상기 시제는 수용체-결합제이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 세포 표면 상의 분자 (예를 들어 수용체)에 결합하며, 시제와 분자 사이의 이러한 결합은 세포에서 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 일부 예시에서, 세포 표면 분자 (예를 들어 수용체)는 신호 전달 분자이다. 이러한 일부 경우에, 수용체-결합제는 하나 이상의 세포에 의해 발현되는 신호 전달 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 예시에서, 수용체-결합제는 세포 표면 분자, 예컨대 수용체에 결합할 때 세포 (예를 들어 T 세포)에 신호를 유도할 수 있는 임의의 시제일 수 있는, 자극제이다. 일부 구현예에서, 신호는 면역자극성일 수 있으며, 이러한 경우 수용체-결합제 또는 자극제는 세포 (예를 들어 T 세포)에 의한 면역 반응에 관여하거나 이를 자극하는, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 팽창, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 기능적 활성을 증가시키는 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호는 저해성일 수 있으며, 이러한 경우 수용체-결합제 또는 자극제는 세포 (예를 들어 T 세포)에서 면역 반응에 관여하거나 이를 억제하는, 예를 들어 면역 세포 증식 또는 팽창, 면역 세포 활성화, 면역 세포 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 활성 또는 면역 세포의 하나 이상의 다른 기능적 활성을 억제 또는 감소시키는 신호를 유도 또는 조절할 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제이다. 일부 양태에서, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 세포 표면 상의 수용체 분자에 결합한다. 이에 따라, 일부 경우에, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 신호를 유도 또는 조절한다. 일부 양태에서, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제에 의한 신호의 유도 또는 조절은 세포의 활성화, 자극, 및/또는 팽창 (증식)에 영향을 미친다. 이에 따라, 일부 경우에, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 1차 활성화 신호를 세포에 제공하여 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 세포 집단은 림프구 집단일 수 있으며, B 세포 집단, T 세포 집단 또는 자연 살해 세포 집단을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세포 집단의 구체적인 예로는 CD40 또는 CD137을 운반하는 B 세포 (두 세포 집단은 모두 활성화 신호를 제공하는 오직 제1 시제, 예컨대 4-1BB 리간드의 결합 시 증식될 수 있음); 또는 αCD40 항체 분자 또는 αCD137 항체 분자가 있다 (예컨대, 문헌 Zhang et al., 2010, J Immunol, 184:787-795 참조). B 세포의 팽창에 사용될 수 있는 (제1 또는 제2) 시제의 또 다른 구체적인 예로는 IgG, CD19, CD28 또는 CD14에 결합하는 시제, 예컨대 αCD19, αIgG, αCD28 또는 αCD14 항체 분자 또는 이의 항원 결합 부분이 있다. 또한, B 세포의 팽창을 위한 제1 또는 제2 시제는 IL-21과 같은 톨 유사 수용체 또는 인터류킨에 대한 리간드를 포함할 수 있다 (예컨대, 문헌 Dienz O, et al. 2009. J. Exp. Med. 206:69 참조). 리포다당류가 또한 제1 시제로서 사용될 수 있고 본 명세서에서 사용 시 결합 파트너 C1로 장착될 수 있기 때문에, B 세포의 리포다당류 의존적 활성화가 또한 본 발명에 포함된다.
적절한 세포 집단의 기타 구체적인 예로는 TCR/CD3에 대한 제1 시제의 결합 및 CD28과 같은 T 세포 상의 액세서리 분자에 대한 제2 시제의 결합에 의해 활성화된 후에 팽창하는 T 세포 집단이 있다. 이러한 경우에, 상기 제1 시제는 상기 T 세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극하고, 상기 제2 시제는 액세서리 분자로서 CD28을 결합시킴으로써 2차 자극을 제공한다. T 세포의 팽창을 위하여 사용될 수 있는 시제는 예컨대 IL-2, IL-7, IL-15 또는 IL-21 등의 인터류킨을 포함할 수 있다 (예를 들어 Cornish et al. 2006, Blood. 108(2):600-8, Bazdar and Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674, Battalia et al, 2013, Immunology, 139(1):109-120 참조). T 세포 팽창에 사용될 수 있는 시제에 대한 다른 구체적인 예로는 CD8, CD45 또는 CD90에 결합하는 시제, 예컨대 αCD8, αCD45 또는 αCD90 항체가 있다. T 세포 집단의 구체적인 예로는 항원-특이적 T 세포, 보조 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포 (기억 T-세포의 구체적인 예는 CD62L+CD8+ 특이적 중심 기억 T 세포) 또는 조절 T 세포 (Treg의 구체적인 예는 CD4+CD25+CD45RA+ Treg 세포)를 포함한다.
적합한 세포 집단의 또 다른 구체적인 예로는 자연 살해 세포 (NK 세포)를 포함하며, 이는 예를 들어 CD16 또는 CD56에 결합하는 시제, 예를 들어 αCD16 또는 αCD56 항체를 사용하여 팽창될 수 있다. 이러한 αCD16 항체의 구체적인 예로는, 서열 번호　52에 제시된 VH 서열 및 서열 번호　53에 제시된 VL 서열을 가지는 항체 3G8이 있다 (예를 들어 Hoshino et al, Blood. 1991 Dec 15;78(12):3232-40 참조). NK 세포의 팽창에 사용될 수 있는 또 다른 시제는 IL-15일 수 있다 (예를 들어 Vitale et al. 2002. The Anatomical Record. 266:87-92 참조). 적합한 세포 집단의 또 다른 구체적인 예로는 단핵구를 포함하며, 이는 예를 들어 CD14에 결합하는 시제, 예컨대 αCD14 항체 분자를 사용하여 팽창될 수 있다.
일부 양태에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는, 표적 세포의 표면 상에 발현된 분자를 특이적으로 표적화하며, 이러한 분자는 TCR 또는 키메라 항원 수용체이다. 예를 들어, 표적 세포의 표면 상에 발현된 분자는 T 세포 또는 B 세포 항원 수용체 복합체, CD3 사슬, CD3 제타, T 세포 수용체 또는 B 세포 수용체의 항원-결합 부분, 또는 키메라 항원 수용체로부터 선택된다. 일부 경우에, 수용체 결합제는 펩타이드:MHC 클래스 I 복합체를 표적화한다.일부 양태에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는, 재조합 수용체, 예를 들어, CAR의 항체 부분에 특이적으로 결합한다. 일부 경우에, 재조합 수용체의 항체 부분은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 예컨대 힌지 영역, 예를 들어, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은, 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1이다. 일부 경우에, 시약에는 IgG4 스페이서를 인식하는 αIgG가 로딩된다.
일부 구현예에서, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 세포, 예를 들어, T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 자극할 수 있다. 일부 양태에서, 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 CD3에 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다. 일부 경우에, CD3에 특이적으로 결합하는 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제는 항-CD3-항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 나노바디 (sd항체) 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD3 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴, DARPin, 또는 아비머일 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3에 의해 생성된 CD3 결합 단일클론 항체로부터 유도될 수 있다 (ATCC®CRL-8001™또한 미국 특허 4,361,549 참조). 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄의 가변 도메인 및 경쇄의 가변 도메인은 문헌 Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)에 기재되어 있으며, 각각 서열 번호 31 및 32에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제이다. 일부 경우에, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 세포 표면 상의 분자, 예컨대 세포 표면 분자, 예를 들어, 수용체 분자에 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 제1 분자를 통해 전달되는 신호를 강화, 감쇠, 또는 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 신호, 예를 들어, 제2 또는 추가의 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 제1 수용체-결합제, 예를 들어, 제1 자극제에 의해 유도되는 신호를 강화 또는 증가시킬 수 있다 일부 구현예에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 액세서리 분자에 결합하고, 및/또는 세포에서 액세서리 또는 보조 신호를 자극 또는 유도할 수 있다. 일부 양태에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제는 공동-자극 분자에 결합하고 및/또는 공동자극 신호를 제공한다.
일부 구현예에서, 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는, 제2 분자에 결합, 예를 들어 특이적으로 결합할 수 있으며, 이러한 제2 분자는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체, 면역 체크포인트 분자, 또는 TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 수용체 패밀리일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD28에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD28에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD28-항체, 항-CD28 항체의 2가 항체 단편, 항-CD28-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD28 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴 또는 아비머일 수 있다. 일부 경우에, 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 시제의 결합 시, T 세포 활성화 신호 2, 예를 들어, 공동-자극 신호를 자극 또는 활성화하는 수용체, 예를 들어, 세포 표면 분자에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제는 내인성 리간드, 동족체 리간드, 합성 리간드 및/또는 이의 일부분, 변형체 또는 개질된 형태이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BBL, CD30L 및 LIGHT 중 임의의 하나 이상에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 항체, 2가 항체 (예를 들어 F(ab')2-단편 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편), 1가 항체 (예를 들어 Fab 단편, Fv 단편, 또는 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)) 또는 CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BBL, CD30L 및 LIGHT 중 임의의 하나 이상에 대한 리간드일 수 있으며, 이러한 시제는 분자에 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 결합할 때 세포에 신호를 유도 또는 모델링할 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BBL, CD30L 및 LIGHT 중 임의의 하나 이상에 대한 리간드일 수 있으며, 이러한 시제는 분자에 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 결합할 때 세포에 신호를 유도 또는 모델링할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ICOS-L, PD-L1, OX40L, CD27, 4-1BB (CD137) 및/또는 CD30의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 CD28, CD3, CD137 또는 CD40 이외의 표적 세포의 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 CD28, CD3, CD137 또는 CD40 이외의 표적 세포의 표면 상의 분자에 결합하면 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하여 및/또는 표적 세포의 기능을 변화시켜, 배양된 표적 세포를 생성한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 TNF 패밀리 또는 TNF 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어, TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원, 및/또는 Wnt 수용체 또는 공동-수용체, 예를 들어, 수용체의 Frizzled (Fz) 패밀리의 구성원 중 임의의 하나 이상에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 상의 분자는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구성원, 예컨대 종양 괴사 인자 수용체 1 (CD120a), 종양 괴사 인자 수용체 2 (CD120b), 림포톡신 베타 수용체 (CD18), OX40 (CD134), CD40 (Bp50), Fas 수용체 (Apo-1, CD95), Decoy 수용체 3 (TR6, M68), CD27 (S152, Tp55), CD30 (Ki-1), 4-1BB (CD137), Death 수용체 4 (TRAILR1, Apo-2, CD261), Death 수용체 5 (TRAILR2, CD262), Decoy 수용체 1 (TRAILR3, LIT, TRID, CD263), Decoy 수용체 2 (TRAILR4, TRUNDD, CD264), RANK (CD265), 오스테오프로테게린 (OCIF, TR1), TWEAK 수용체 (Fn14, CD266), TACI (IGAD2, CD267), BAFF 수용체 (CD268), 헤르페스바이러스 도입 매개자 (Herpesvirus entry mediator) (ATAR, TR2, CD270), 신경 성장 인자 수용체 (p75NTR, CD271), B 세포 성숙 항원 (TNFRSF13A, CD269), 글루코코르티코이드-유도된 TNFR 관련 (AITR, CD357), TROY (TAJ, TRADE), Death 수용체 6 (CD358), Death 수용체 3 (Apo-3, TRAMP, LARD, WS-1) 또는 엑토디스플라신 (Ectodysplasin) A2 수용체 (XEDAR)이다.
일부 경우에, TNF 수용체 슈퍼패밀리 단백질에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다. 일부 구현예에서, TNF 수용체 슈퍼패밀리 단백질에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 수용체에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드, 및/또는 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는 TNFα, 림포톡신 베타 (TNF-C), OX40L, CD154, FasL, FasL, LIGHT, TL1A, CD70, Siva, CD153, 4-1BB 리간드, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, CAMLG, BAFF, LIGHT, NGF, BDNF, NT-3, NT-4, BAFF, GITR 리간드, TL1A 또는 EDA-A2, 또는 임의의 멤브레인통과 단백질의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 상의 분자는 Wnt 수용체 또는 공동-수용체, 수용체, 예컨대 Frizzled (Fz) 패밀리 수용체, 지단백질 수용체-관련 단백질 (LRP)-5/6, 수용체 티로신 키나아제 (RTK), 및 수용체-관련 고아 수용체 2 (ROR2)이다. 일부 구현예에서, 세포 상의 분자는 예를 들어, Frizzled-1 (FZD1), Frizzled-2 (FZD2), Frizzled-3 (FZD3), Frizzled-4 (FZD4), Frizzled-5 (FZD5), Frizzled-6 (FZD6), Frizzled-7 (FZD7), Frizzled-8 (FZD8), Frizzled-9 (FZD9) 또는 Frizzled-10 (FZD10)이다.
일부 경우에, Wnt 수용체 또는 co-수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다. 일부 구현예에서, Wnt 수용체 또는 co-수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 수용체에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는, 예를 들어, WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11 또는 WNT16이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 및 HVEM 중 임의의 하나 이상에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 항체, 2가 항체 (예를 들어 F(ab')2-단편 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편), 1가 항체 (예를 들어 Fab 단편, Fv 단편, 또는 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)) 또는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 및 HVEM 중 임의의 하나 이상에 대한 리간드일 수 있으며, 이러한 시제는 분자에 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 결합할 때 세포에 신호를 유도 또는 모델링할 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 CD28, 4-1BB (CD137), CD40, CD40L, T 세포 활성화 링커 (LAT), CD27, OX40 (CD134) 및 헤르페스바이러스 도입 매개자 (HVEM) 중 임의의 하나 이상에 대한 리간드일 수 있으며, 이러한 시제는 분자에 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 결합할 때 세포에 신호를 유도 또는 모델링할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BBL, CD40, CD40L, CD27L (CD70) 및/또는 OX40L의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD28에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD28일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD28에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD28에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD28-항체, 항-CD28 항체의 2가 항체 단편, 항-CD28-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD28 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 F(ab')2-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 나노바디 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3으로부터 유도될 수 있고 (GenBank 수탁번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 구조물로서 기탁됨; 문헌 Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570 참조) 이의 중쇄 및 경쇄는 각각 서열 번호 33 및 34를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD90일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD90에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD90에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD90-항체, 항-CD90 항체의 2가 항체 단편, 항-CD90-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD90 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 항-CD90 항체 G7 (Biolegend, cat. no. 105201)를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD95일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD95에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD95에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD95-항체, 항-CD95 항체의 2가 항체 단편, 항-CD95-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD95 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 항-CD90 항체는 단일클론 마우스 항-인간 CD95 CH11 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)일 수 있거나 또는 예컨대 Paulsen et al. Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631에 기재된 항-CD95 mAb 7C11 또는 항-APO-1일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 또는 B 세포 상의 분자는 CD137일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD137에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD137에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD137-항체, 항-CD137 항체의 2가 항체 단편, 항-CD137-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD137 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항-CD137 항체는 문헌 Taraban et al. Eur J Immunol. 2002 Dec;32(12):3617-27에 기재된 LOB12, IgG2a 또는 LOB12.3, IgG1일 수 있다. 또한 예를 들어 US6569997, US6303121, Mittler et al. Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208를 참조한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, B 세포 상의 분자는 CD40일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD40에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD40에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD40-항체, 항-CD40 항체의 2가 항체 단편, 항-CD40-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD40 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항-CD40 항체는 키메라 단일클론 항-인간 CD40 항체 테넬릭시맙(Teneliximab) 및 항-인간 CD40 (Affymetrix cat. no. 14-0409-80), 또는 예를 들어, US 2002/0142358, US 2007/0077242, WO 2001/083755, Zhang et al., 2010, J Immunol, 184:787-795에 기재된 임의의 항체일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD40L (CD154)일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 CD40L에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD40L에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항-CD40L-항체, 항-CD40L 항체의 2가 항체 단편, 항-CD40L-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD40L 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 항-CD40L 항체는 일부 양태에서 문헌 Blair et al. JEM vol. 191 no. 4 651-660에 기재된 Hu5C8일 수 있다. 또한, 예를 들어 WO1999061065, US20010026932, US7547438, WO2001056603를 참조한다.일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 유도 가능한 T 세포 공동 자극자 (inducible T cell Costimulator, ICOS), T 세포 활성화 링커 (LAT), CD27, OX40 (CD134), 헤르페스바이러스 도입 매개자 (HVEM), CD90, 및/또는 CD95일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 각각 ICOS, LAT, CD27, CD134, HVEM, CD90, 및/또는 CD95에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, ICOS, LAT, CD27, CD134, HVEM, CD90, 및/또는 CD95에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 제2 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 자극제일 수 있음)는 항체, 2가 항체 이의 단편, 1가 항체 이의 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 기술 분야 내 공지된 임의의 것으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 또는 추가의 수용체-결합제일 수 있는 수용체-결합제가 표면 분자에 결합하는 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 시제의 결합 시에 사이토카인 신호, 케모카인 신호, 세포 접합 신호, T 세포 활성화 신호 또는 추가의 신호, 예를 들어, 환경 신호를 자극 또는 활성화한다. 일부 구현예에서, 제2 또는 추가의 수용체-결합제일 수 있는 수용체-결합제가 특이적으로 결합하는 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 사이토카인 수용체 또는 케모카인 수용체이다. 일부 경우에, 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 수용체-결합제는 접합 분자이거나, 또는 이를 포함하거나, 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 접합 분자의 발현을 유도하는 인자이고, 및/또는 액세서리 신호 및/또는 추가의 신호, 예를 들어, 환경 신호의 자극 자극 및/또는 조절에 관여한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 수용체, 예를 들어, 세포 표면에 발현된 수용체에 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이며, 예를 들어, 시제의 결합 시에 사이토카인 신호, 케모카인 신호, 세포 접합 신호, T 세포 활성화 신호 또는 추가의 신호, 예를 들어, 환경 신호를 자극 또는 활성화하는 세포 표면 분자에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 경우에, 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항-수용체 항체, 항-수용체 항체의 2가 항체 단편, 항-수용체 항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 수용체 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 F(ab')2-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 수용체 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴, DARPin, 또는 아비머일 수 있다. 일부 경우에, 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 수용체에, 예를 들어, 시제의 결합 시에 사이토카인 신호, 케모카인 신호, 세포 접합 신호, T 세포 활성화 신호 또는 추가의 신호, 예를 들어, 환경 신호를 자극 또는 활성화하는 세포 표면 분자에 결합하는, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제는 내인성 리간드, 동족체 리간드, 합성 리간드 및/또는 이의 일부분, 변형체 또는 개질된 형태이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 사이토카인 수용체의 리간드, 예를 들어, 사이토카인 또는 이의 일부분이거나, 이를 포함한다. 예시적인 사이토카인 수용체로는 IL-2R, IL-7R, IL-21R, CD132 (IL 수용체 공동 감마 사슬), IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 리간드, 예를 들어, 사이토카인은, IL-2, IL-7, IL-21, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, I형 인터페론 (예를 들어, IFNα 및/또는 IFNβIL-12, IL-17, IL-9 및 TNF, 및 생물학적 활성 이의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이다. 일부 경우에, 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 항-(사이토카인 수용체) 항체, 항-(사이토카인 수용체) 항체의 2가 항체 단편, 항-(사이토카인 수용체) 항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 사이토카인 수용체 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 F(ab')2-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 수용체-결합제는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 케모카인 수용체의 리간드, 예를 들어, 케모카인 또는 이의 일부분이거나, 이를 포함한다. 예시적인 케모카인 수용체로는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 리간드, 예를 들어, 케모카인은 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25 또는 생물학적 활성 이의 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이다. 일부 경우에, 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 항-(케모카인 수용체) 항체, 항-(케모카인 수용체) 항체의 2가 항체 단편, 항-(케모카인 수용체) 항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 케모카인 수용체 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 F(ab')2-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에, 접합 분자 또는 사이토카인을 유도하는 인자에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다. 일부 구현예에서, 접합 분자 또는 사이토카인을 유도하는 인자에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제는 수용체에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드일 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 접합 분자 및/또는 수용체의 내인성 리간드, 동족체 리간드, 합성 리간드 및/또는 일부분, 변형체 또는 이의 개질된 형태이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는 그 자체로 세포-표면 또는 멤브레인통과 단백질인 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분일 수 있다.
일부 예시에서, 세포 상의 분자, 예를 들어, 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1; 각각 서열 번호 36 및 37에 제시된 전장 알파 및 베타 사슬 서열), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴; 서열 번호 38에 제시된 전장 서열), CD29/CD49d (VLA-4; 서열 번호 40에 제시된 전장 서열), CD106 (VCAM-1; 서열 번호 39에 제시된 전장 서열)이거나 또는 이의 생물학적 활성 단편이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 접합 분자, 예를 들어, CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 또는 이의 생물학적 활성 단편에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 접합 분자, 예를 들어, CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1)에 결합, 예를 들어, 특이적으로 결합하는 리간드 또는 이의 일부분이다. 이러한 수용체-결합제는 접합 분자의 내인성 리간드 및/또는 동족체 리간드의 세포 외 도메인 (ECD) 또는 이의 일부분이거나, 이를 포함하는 시제를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체-결합제는 접합 분자의 세포 외 도메인 또는 이의 일부분이며, 세포 표면 상의 하나 이상의 접합 분자에 결합할 수 있다. 이러한 예시적인 수용체-결합제로는 LFA-1α (서열 번호 54에 제시된 ECD); LFA-1β(서열 번호 55에 제시된 ECD); L-셀렉틴 (서열 번호 57에 제시된 ECD); VCAM-1 (서열 번호 56에 제시된 ECD); 및 VLA-4 (ECD 제시된 서열 번호 58)의 세포 외 도메인, 또는 이의 임의의 부분을 포함한다.
일부 구현예에서, 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자는 핵 인자, 예컨대 레티노산 수용체-관련 고아 수용체 감마 (ROR감마) 또는 ROR알파이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제2 또는 추가의 수용체-결합제는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이거나, 또는 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는, IL-2R, IL-7R (CD127), IL-21R (CD360), IL 수용체 공통 감마 사슬 (γ또는 CD132), IL-1R (CD121) 예컨대 IL-1R1 또는 IL-1R2, IL-15R (CD215), 인터페론 감마 수용체 (IFNγCD119), 종양 괴사 인자 알파 수용체 (TNFαR) 예컨대 TNFR1 (CD120a) 및 TNFR2 (CD120b), IL-4R, IL-10R, 인터페론 I형 수용체, 예를 들어, IFNα 수용체 (IFNAR), 예컨대 IFNAR1 및 IFNAR2, IL-17R (CD217), 및/또는 IL-12R, 및 분자에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제일 수 있다. 일부 양태에서, 세포 상의 분자에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 항체, 2가 항체 단편, 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 세포에서 신호를 유도할 수 있는 자극 수용체 또는 다른 수용체의 리간드, 예컨대 IL-2 리간드, IL-7 리간드, IL-21 리간드, IL-1 리간드, IL-15 리간드, IL-9 리간드, IFNγ리간드, TNFα 리간드, IL-4 리간드, IL-10 리간드, IL-12 리간드, IL-17 리간드, 또는 생물학적 활성 부분 또는 이의 변형체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 부분 또는 변형체는 수용체에 결합하는 활성 및/또는 수용체에 하나 이상의 신호를 조절하는 기능적 활성을 유지한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 세포에서 신호를 유도할 수 있는 자극 수용체 또는 다른 수용체의 리간드, 예컨대 I형 인터페론, 예를 들어, IFNα, IFNβIFNκδετω및 IFNζ(또한 리미틴(limitin)으로 알려짐) 또는 이의 생물학적 활성 부분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CXCR3, CCR7, CXCR1, 또는 CXCR4일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 CXCR3, CCR7, CXCR1, 또는 CXCR4에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CXCR3, CCR7, CXCR1, 또는 CXCR4에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제 (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 항체, 2가 항체 단편, 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 세포에서 신호를 유도할 수 있는 자극 수용체 또는 다른 수용체의 리간드, 예컨대 CXCL9 리간드, CXCL10 리간드, CCL19 리간드, CCL21 리간드, CCL25 리간드, 또는 이의 생물학적 활성 부분을 포함할 수 있고, 이러한 생물학적 활성 부분은 수용체에 결합하는 활성 및/또는 수용체에 하나 이상의 신호를 조절하는 기능적 활성을 유지한다.
일부 경우에, 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 수용체-결합제는 접합 분자이거나, 또는 이를 포함하거나, 사이토카인 제조, 케모카인 제조, 접합 분자의 발현을 유도하는 인자이고, 및/또는 액세서리 신호 및/또는 추가의 신호의 자극 자극 및/또는 조절에 관여한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 CD62L일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 CD62L에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 RORγ일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 RORγ에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 세포, 예를 들어, T 세포 상의 분자는 RORα일 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제, (예를 들어 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 추가의 자극제일 수 있음)는 RORα에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BBL, CD30L 및 LIGHT 중 임의의 하나 이상에 결합할 수 있고, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제는, 항체, 2가 항체 (예를 들어 (Fab)2'-단편 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편), 1가 항체 (예를 들어 Fab 단편, Fv 단편, 또는 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)) 또는 CD28, CD5, CD4, CD8, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BBL, CD30L 및 LIGHT 중 임의의 하나 이상에 대한 리간드일 수 있고, 여기서 이러한 시제는 분자에 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 결합할 때 세포에서 신호를 유도 또는 모델링할 수 있다.
일부 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 CD28, CD3, CD137 또는 CD40 이외의 표적 세포의 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 경우에, 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제가 CD28, CD3, CD137 또는 CD40 이외의 표적 세포의 표면 상의 분자에 결합하면 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하여 및/또는 표적 세포의 기능을 변화시켜, 배양된 표적 세포를 생성한다.
상기 임의의 예시에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 임의의 예시에서, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴, 나노바디, DARPin 및 아비머일 수 있다.
b. 선별제
일부 구현예에서, 상기 시제는 선별제이다. 일부 구현예에서, 선별제는 세포 표면 상의 분자, 예컨대 세포 표면 분자에 결합한다. 일부 예시에서, 세포 표면 분자는 선별 마커이다. 이러한 일부 경우에, 선별제는 하나 이상의 세포에 의해 발현되는 선별 마커에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약에 가역적으로 결합되는 선별제 또는 시제는 세포의 선별 또는 단리를 용이하게 하?f네 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공되는 임의의 구현예에서, 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 수용체, 예를 들어, 세포 표면에 발현된 수용체에 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다. 일부 경우에, 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항-수용체 항체, 항-수용체 항체의 2가 항체 단편, 항-수용체 항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 수용체 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 2가 항체 단편은 F(ab')2-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 수용체 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴, 나노바디, DARPin, 또는 아비머일 수 있다. 일부 경우에, 수용체에 특이적으로 결합하는 수용체-결합제, 예를 들어, 제1, 제2 및/또는 추가의 수용체-결합제, 예를 들어, 자극제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편, 예를 들어, Fab 단편이다.
일부 구현예에서, 세포 표면 분자, 예를 들어, 선별 마커는 원하는 세포의 집단 또는 부분집단, 예를 들어 혈액 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, T 세포, 보조 T 세포, 예를 들어, CD4+ 보조 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포), 단핵구, 또는 줄기 세포, 예를 들어 CD34-양성 말초 줄기 세포 또는 Nanog 또는 Oct-4 발현 줄기 세포의 집단 또는 부분집단을 한정하는 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 선별 마커는 T 세포 또는 T 세포의 서브세트 표면 상에 발현되는 마커, 예컨대 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO일 수 있다. T-세포의 예로는 CMV-특이적 CD8+ T-림프구, 세포독성 T-세포, 기억 T-세포 및 조절 T-세포 (Treg)와 같은 세포를 포함한다. Treg의 구체적인 예로는 CD4 CD25 CD45RA Treg 세포를 포함하며, 기억 T-세포의 구체적인 예로는 CD62L CD8+ 특이적 중심 기억 T-세포를 포함한다. 세포 표면 분자, 예를 들어, 선별 마커는 또한 종양 세포에 대한 마커일 수도 있다.
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD4일 수 있고, 선별제는 CD4에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD4에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD4-항체, 항-CD4 항체의 2가 항체 단편, 항-CD4-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD4 결합 분자 (예를 들어 안티칼린 또는 나노바디)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD4-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD4 Fab 단편)은 항체 13B8.2 또는 CD4에 대한 특이적 결합을 유지하는 13B8.2의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 항체 13B8.2 또는 m13B8.2의 예시적인 돌연변이체는 미국 특허 7,482,000, 미국 특허 출원 US2014/0295458 또는 국제 특허 출원 WO2013/124474; 및 문헌 Bes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)에 기재되어 있다. "ml3B8.2"으로 명명된 돌연변이체 Fab 단편은 미국 특허 7,482,000에 기재된 바와 같이 CD4 결합 쥐과 항체 13B8.2의 가변 도메인 및 중쇄에 대해 감마형의 불변 인간 CH1 도메인을 포함하는 불변 도메인 및 카파형의 불변 인간 경쇄 도메인을 운반한다. 일부 구현예에서, 항-CD4 항체, 예컨대 항체 13B8.2의 돌연변이체는 각각 Kabat 넘버링에 의하여, 가변 경쇄에서의 아미노산 치환 H91A, 가변 경쇄에서의 아미노산 치환 Y92A, 가변 중쇄에서의 아미노산 치환 H35A 및/또는 가변 중쇄에서의 아미노산 치환 R53A를 포함한다. 일부 양태에서, ml3B8.2의 13B8.2 Fab 단편의 가변 도메인과 비교하여, 경쇄의 위치 91 (서열 번호 30에서 위치 93)에서의 His 잔기는 Ala로 변이되고, 상기 중쇄의 위치 53 (서열 번호 29에서 위치 55)의 Arg 잔기는 Ala로 변이된다. 일부 구현예에서, 항-CD4 또는 그의 단편에 가역적으로 결합되는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나, 상업적으로 이용 가능한 시약으로부터 유도된다 (예컨대, 카탈로그 번호 6-8000-206 또는 6-8000-205 또는 6-8002-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD8일 수 있고, 선별제는 CD8에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD8에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD8-항체, 항-CD8 항체의 2가 항체 단편, 항-CD8-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD8 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD8 Fab 단편)은 항체 OKT8 (예를 들어 ATCC CRL-8014) 또는 CD8에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD8 또는 그의 단편에 가역적으로 결합되는 시약은 상업적으로 이용 가능하거나, 상업적으로 이용 가능한 시약으로부터 유도된다 (예컨대, 카탈로그 번호 6-8003 또는 6-8000-201 또는 6-8002-201; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD8일 수 있고, 선별제는 CD3에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD3에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD3 항체, 항-CD3 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD3 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD8 Fab 단편)은 항체 OKT3 (예를 들어 ATCC CRL-8001; 예를 들어, 문헌 Stemberger et al. PLoS One. 2012; 7(4): e35798 참조) 또는 CD3에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-201, 6-8001-100; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD25일 수 있고, 선별제는 CD25에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD25에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD25 항체, 항-CD25 항체의 2가 항체 단편, 항-CD3-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD25 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD25-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD25 Fab 단편)은 항체 FRT5 (예를 들어, Stemberger et al. 2012 참조) 또는 CD25에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD4 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-205 또는 6-8000-207 또는 6-8004-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD62L일 수 있고, 선별제는 CD62L에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD62L에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD62L 항체, 항-CD62L 항체의 2가 항체 단편, 항-CD62L-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD62L 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD62L-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD62L Fab 단편)은 항체 DREG56 (예를 들어, ATCC HB300; Stemberger et al. 2012 참조) 또는 CD62L에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD62L 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-204 또는 6-8005-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD45RA일 수 있고, 선별제는 CD45RA에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD45RA에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD45RA 항체, 항-CD45RA 항체의 2가 항체 단편, 항-CD45RA-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD45RA 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD45RA-항체, 예컨대 2가 항체 단편 또는 1가 항체 단편 (예를 들어 CD45RA Fab 단편)은 항체 MEM56 (예를 들어, Millipore 05-1413; Stemberger et al. 2012 참조) 또는 CD45RA에 대한 특이적 결합을 유지하는 이의 기능적 활성 돌연변이체로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD45RA 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-208 또는 6-8007-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD45RO일 수 있고, 선별제는 CD45RO에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD45RO에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD45RO 항체, 항-CD45RO 항체의 2가 항체 단편, 항-CD45RO-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD45RO 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD45RO 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-209 또는 6-8012-020; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD154일 수 있고, 선별제는 CD154에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD154에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD154 항체, 항-CD154 항체의 2가 항체 단편, 항-CD154-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD154 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD154 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다 (예를 들어 카탈로그 번호 6-8000-202 또는 6-5510-050; IBA GmbH, Gottingen, Germany).
일부 구현예에서, 선별 마커는 CD16일 수 있고, 선별제는 CD16에 특이적으로 결합한다. 일부 양태에서, CD16에 특이적으로 결합하는 선별제는 항-CD16 항체, 항-CD16 항체의 2가 항체 단편, 항-CD16-항체의 1가 항체 단편, 및 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD16 결합 분자로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD16 또는 이의 단편에 가역적으로 결합된 시약은 상업적으로 입수 가능하거나, 또는 상업적으로 입수 가능한 시약으로부터 유도된다. 일부 양태에서, CD16 결합 분자는 각각 서열 번호 52 및 53에 제시된 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함한다.
상기 임의의 예시에서, 2가 항체 단편은 (Fab)2'-단편, 또는 2가 단일-사슬 Fv 단편일 수 있는 반면, 1가 항체 단편은 Fab 단편, Fv 단편, 및 단일-사슬 Fv 단편 (scFv)으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 임의의 예시에서, 항체 유사 결합 특성을 가지는 단백질성 CD28 결합 분자는 압타머, 리포칼린 패밀리의 폴리펩타이드 기반이 뮤테인, 글루바디, 안키린 스캐폴드 기반 단백질, 결정성 스캐폴드 기반의 단백질, 아드넥틴, 나노바디, DARPin 및 아비머일 수 있다.
III. 세포 배양 방법
본 명세서에는 조성물 내 표적 세포 (예를 들어 T 세포)의 표면 상의 분자에 결합할 수 있으며, 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약에 가역적으로 결합되는 시제 (예를 들어 제1 또는 제2, 수용체-결합제, 예를 들어 자극제, 또는 선별제)의 존재하에 표적 세포 (예를 들어 T 세포)를 포함하는 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 시약은 올리고머 입자 시약, 예컨대 상기 기재된 임의의 시약이다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 단계는 시제가 세포 상의 분자에 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다. 일부 경우에, 특정 수용체-결합제 (예를 들어 자극제)에 대하여, 이러한 결합은 조성물 내 표적 세포 (예를 들어 T 세포)에서 신호, 예컨대 상기 기재된 1차 신호 또는 액세서리 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 시제가 분자에 결합하면 조성물 내 표적 세포의 자극, 활성화, 팽창 (증식) 및/또는 분화 중 하나 이상을 야기한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 집단 예컨대 B 세포, T 세포 또는 자연 살해 세포의 생체 외 팽창을 선택적으로 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 자극은 림포카인 (lymphokines) 등의 외인성 성장 인자 및 액세서리 세포의 부재하에서 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 세포, 예컨대 B 세포 또는 T 세포의 증식은 항원의 필요 없이 유도될 수 있고, 따라서 항원 반응성에 대하여 다클론성인 T 세포 집단과 같은 팽창된 세포 집단을 제공한다. 본 명세서에 개시된 방법은 연장된 기간에 걸쳐 T 세포, 예컨대 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 선택된 집단의 지속적인 증식을 제공하여 원래의 T 세포 집단에 비하여 이러한 세포의 수를 다중-배수 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같은 림프구 집단의 (클론성) 팽창의 경우, 모든 자손은 팽창을 위하여 선택된 세포 집단과 동일한 항원 특이성을 공유할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 항원 특이적 T 세포 집단을 팽창시키는 것에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포의 집단을 생성하기 위하여, T 세포는 상기 T 세포에서 1차 활성화 신호를 유발하는데 적합한 형태의 항원과 접촉하며, 즉 상기 항원이 T 세포에 제시되어 T 세포에서 TCR/CD3 복합체를 통해 신호가 유발된다. 예를 들어, 상기 항원은 MHC 분자와 함께 항원 제시 세포에 의해 T 세포에 제시될 수 있다. 항원 제시 세포, 예컨대 B 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포, 랑게르한스 세포 또는 항원을 T 세포에 제시할 수 있는 기타 세포는 상기 항원 (예컨대, 가용성 항원)의 존재하에서 상기 T 세포와 함께 배양되어, 상기 항원 제시 세포가 상기 항원을 상기 T 세포에 제시할 수 있도록 한다. 택일적으로, 해당 항원을 발현하는 세포는 상기 T 세포와 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 종양-관련 항원을 발현하는 종양 세포는 종양-특이적 반응을 유도하도록 T 세포와 함께 배양될 수 있다. 이와 유사하게, 바이러스 등의 병원체 항원을 제시하는, 병원체에 감염된 세포는 T 세포와 함께 배양될 수 있다. T 세포 집단의 항원 특이적 작용 이후, 상기 세포들은 제공된 방법에 따라 팽창될 수 있다. 예를 들어, 항원 특이성이 확립된 이후, T 세포는 본 명세서에 기술된 방법에 따라 항-CD3 항체 (제1 시제로서 사용됨) 및 항-CD28 항체 (제2 시제로서 사용됨)와 함께 배양됨으로써 팽창될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제1 시제는 항원 특이적 T 세포 집단에 결합하는 MHC I: 펩타이드 복합체일 수 있다. 이러한 구현예에서, 개별 MHC I 분자와 복합체화될 수 있는 공지된 임의의 항원 특이적 펩타이드가 사용될 수 있다. 택일적으로, 세포 팽창을 유발하는 수용체의 천연 리간드를 제1 시제로서 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, CD19의 세포 외 도메인은 키메라 CD19 결합 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 형질 도입된 세포의 세포 내 신호 전달 캐스케이드 활성화를 일으키는데 사용될 수 있다. 상기의 예시적인 양태는 실시예에 나타나 있다.
일부 구현예에서, 복수의 세포를 포함하는 조성물을 포함하는 샘플을 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 집단의 시험관 내 배양 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 다합체화 시약은 올리고머 입자 시약이다. 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 세포의 선별, 자극, 팽창 및/또는 분화에 사용될 수 있는 시제 (제1 또는 제2, 수용체-결합, 예를 들어 자극제, 또는 선별제) 상에 가역적으로 고정된 (이에 결합된) 가역적으로 고정된다. 일부 구현예에서, 제1 시제는 세포에 1차 활성화 신호를 제공하며, 여기서 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 제1 시제의 가역적 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위 Z1를 포함한다. 제1 시제는 적어도 하나의 결합 파트너 C1을 포함하며, 결합 파트너 C1은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합할 수 있고, 이러한 제1 시제는 결합 파트너 C1과 결합 부위 Z1 사이에 형성된 가역적 결합을 통해 다합체화 시약에 결합된다. 제1 시제는 세포 표면 상의 수용체 분자에 결합하여, 세포에 1차 활성화 신호를 제공하며, 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 지지체, 예컨대 고체 표면 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 지지체에 결합되지 않으며, 예컨대 고체 표면 또는 고정상에 결합되지 않는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 집단을 포함하는 샘플을 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 집단의 시험관 내 팽창 방법이 제공되며, 이러한 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 고체 지지체 상에 고정되지 않으며, 즉, 가용성 형태이고, 세포의 선별, 자극, 팽창 및/또는 분화에 자극될 수 있는 시제 (제1 또는 제2, 수용체-결합, 예를 들어 자극제, 또는 선별제)에 결합된다. 일부 구현예에서, 세포에 1차 활성화 신호를 제공하는 제1 시제는 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합된다. 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 제1 시제의 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 Z1을 포함하고, 이러한 제1 시제는 적어도 하나의 결합 파트너, 예를 들어 C1을 포함하며, 결합 파트너 C1은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z1에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 시제는 결합 파트너 C1과 결합 부위 Z1 사이에 형성된 결합을 통해 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합되고, 제1 시제는 세포 표면 상의 수용체 분자 상에 결합하여, 세포에 1차 활성화 신호를 제공하며 세포를 활성화시킨다. 일부 구현예에서, 가용성 다합체화 시제가 사용되는 경우, 결합 파트너 C, 예를 들어 C1과 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1 사이의 결합이 가역적일 필요는 없다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 제공된 방법은 또한 제2 시제에 결합된 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약, 예컨대 세포 표면 상의 액세서리 분자를 자극하는 액세서리 또는 공동-자극 분의 사용을 포함한다. 일부 경우에, 다합체화 시제는 지지체, 예를 들어 고체 지지체, 고체상, 또는 고정상에 고정된다. 일부 구현예에서, 다합체화 시제는 지지체 상에 고정되지 않으며, 즉, 가용성 형태이다. 일부 구현예에서, 제2 시제는 결합 파트너, 예를 들어 C2를 포함하며, 결합 파트너, 예를 들어 C2는 결합 부위, 예를 들어 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 Z2에 가역적으로 결합될 수 있고, 이러한 제2 시제는 결합 파트너 C2와 결합 부위 Z2 사이에 형성된 가역적 결합을 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합된다. 일부 구현예에서, 결합 파트너 C1과 결합 부위 Z1 사이에 형성된 결합은 가역적일 수 있고, 결합 파트너 C2와 결합 부위 Z2 사이에 형성된 결합은 가역적일 수 있다. 이러한 경우에, 상기 결합 부위 Z1와 상기 결합 파트너 C1 사이의 가역적 결합 및/또는 상기 결합 부위 Z2와 상기 결합 파트너 C2 사이의 가역적 결합에 대한 해리 상수 (Kd)는 10-2 M 내지 10-13 M의 범위일 수 있다. 일부 양태에서, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이 지지체에 결합되지 않을 경우 (예를 들어 고체 지지체 또는 고정상상에 결합되지 않을 경우), 결합 파트너 C1과 결합 부위 Z1 사이에 형성된 결합은 비가역적일 수 있고 및/또는 또한 결합 파트너 C2와 결합 부위 Z2 사이에 형성된 결합은 비가역적일 수 있다.
일부 경우에, 제2 시제는 세포 표면 상의 표면 상의 액세서리 분자에 결합하여, 활성화된 세포를 자극한다. 이러한 구현예에서, 제1 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 자극할 수 있고, CD3에 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다. 이러한 구현예에서, T 세포 상의 액세서리 분자는 CD28일 수 있고, 액세서리 분자에 결합하는 제2 시제는 CD28에 특이적으로 결합하는 결합 시약이다. 택일적으로, 일부 구현예에서, 배양된 세포의 하나 이상의 특징, 성질 또는 특성을 경우에 따라 변형, 예컨대 개선시킬 수 있는 기타 액세서리 분자를 표적화하는 단계 또한 사용될 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 일부 구현예에서, 액세서리 분자는 IL-12R, IFNγIL-4R, IL-17R, RORγα, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 또는 CXCR4 중 하나 이상 (예를 들어, 각각 항-IL-12R 항체, 항- IFNγ항체, 항- IL-4R 항체, 및 항- IL-17R 항체, 항-RORγ항체, 항- RORα 항체, 항-CXCR3 항체, 항-CCR7 항체, 항-CD62L 항체, 항-CXCR1 항체 또는 항-CXCR4 항체)일 수 있다. 예시적인 시제, 이러한 수용체-결합제 (예를 들어 자극제)는 하기 기재된다.
일부 구현예에서, 세포 집단의 생존력이 적어도 본질적으로 손상되지 않는 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 또는 배양 단계가 수행되는 조건은 적어도 본질적으로 유해하지 않고 해롭지 않거나, 또는 적어도 본질적으로 손상시키지 않는 임의의 조건을 포함하며, 상기 조건하에서 완전 생존력으로 팽창될 세포 집단의 백분율은 적어도 70 %, 예컨대 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 92 %, 적어도 95 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99.5 %이다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 약 20 ℃ 이상의 온도에서 수행된다. 팽창되는 세포 집단에 따라 적합한 온도 범위는 예를 들어 약 20 ℃ 내지 약 45 ℃, 예컨대 약 25 ℃ 내지 약 40 ℃, 또는 약 32 ℃ to 37 ℃일 수 있다. 일부 구현예에서 본 발명에 따르는 방법은 일정한 온도 값, 또는 선택된 온도 값의 ± 약 5 ℃, ± 약 4 ℃, ± 약 3 ℃, ± 약 2 ℃, ± 약 1 ℃, 또는 ± 약 0.5 ℃에서 수행된다. 당업자는 세포의 성질 및 팽창 조건을 고려하여 적합한 온도를 경험적으로 선택할 수 있다. 일반적으로 인간 세포는 예컨대 37 ℃의 온도에서 팽창된다.
본 명세서에 따라, 또한 세포 집단을 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 포함하는 다합체화된 시제, 또는 조성물이 제공된다. 세포 집단을 팽창시킬 수 있는 이러한 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화된 시제 및/또는 올리고머 입자 시약은 지지체에 결합되지 않은 (예를 들어 가용성 형태의) 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이며, 세포에 1차 활성화 신호를 제공하는 제1 시제의 가역적 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위 Z, 예를 들어 Z1를 포함하고, 이러한 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 세포에 1차 활성화 신호를 제공하는 상기 제1 시제에 가역적으로 결합되고; 이러한 제1 시제는 적어도 하나의 결합 파트너 C, 예를 들어 C1을 포함하며, 결합 파트너 C1은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 적어도 하나의 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합할 수 있고, 제1 시제는 결합 파트너 C1과 결합 부위 Z1 사이에 형성된 가역적 결합을 통해 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합된다. 이러한 다합체화 시제는 본 명세서에 기재된 임의의 제1 시제에 고정될 수 있음에 유의한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 다합체화된 시약은 세포 표면 상의 액세서리 분자를 자극하는 제2 시제의 가역적 결합을 위한 적어도 하나의 결합 부위, 예를 들어 Z2를 추가적으로 포함할 수 있고, 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약 세포 표면 상의 액세서리 분자를 자극하는 제2 시제에 가역적으로 결합되며, 이러한 제2 시제는 결합 파트너, 예를 들어 C2를 포함하며, 결합 파트너 C2는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 적어도 하나의 결합 부위 Z2에 결합할 수 있다. 이러한 구현예에서 제2 시제는 결합 파트너 C2와 결합 부위 Z2 사이에 형성된 결합을 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 시제는 IL-12R, IFNγIL-4R, IL-17R, RORγα, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 또는 CXCR4 (예를 들어, 각각 항-IL-12R 항체, 항- IFNγ항체, 항- IL-4R 항체, 및 항- IL-17R 항체, 항-RORγ항체, 항- RORα 항체, 항-CXCR3 항체, 항-CCR7 항체, 항-CD62L 항체, 항-CXCR1 항체 또는 항-CXCR4 항체)에 결합?G 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 세포 (예컨대, T 세포)를 포함하는 조성물을 다합체화된 시제 (예컨대, 항-CD3/항-CD28 돌연변이체 스트렙타비딘 또는 이의 올리고머)와 함께 배양하는 단계는 바이오리액터, 예컨대 중공 섬유 바이오리액터 (예컨대, Quantum®세포 팽창 시스템의 중공 섬유 바이오리액터) 또는 플라스틱 백 바이오리액터 (예컨대, GE Healthcare의 Xuri Cell Expansion System W25에서 사용되는 Cellbag®에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 반응 혼합물 (예를 들어 예를 들어, 제1 시제 및 제2 시제를 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합된 표적 세포, 예를 들어 T 세포를 포함하는) 중의 배양된 표적 세포 (예를 들어 T 세포)와 (i) 제1 결합 파트너, 예를 들어 C1와 결합 부위, 예를 들어 Z1 및/또는 (예컨대 필요한 경유) 사이의 결합을 파괴할 수 있는 경쟁 시약 (예를 들어 유리 제1 결합 파트너 C, 예를 들어 C1) 또는 이의 유사체 (ii) 제2 결합 파트너 C2와 결합 부위 Z2 사이의 결합을 파괴할 수 있는 제2 경쟁 시약, 예를 들어 유리 제2 결합 파트너, 예를 들어 C2, 또는 이의 유사체를 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 제1 시제의 상기 결합 파트너 C1과 상기 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 상기 결합 부위 Z1 사이의 가역적 결합, 뿐만 아니라 제2 시제의 상기 결합 파트너 C2와 상기 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 상기 결합 부위 Z2 사이의 가역적 결합이 파괴됨으로써, 제1 시제 및 제2 시제를 통해 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약에 결합된 T 세포를 용리시키고 T 세포의 자극 및/또는 팽창을 중단시킨다.
일부 구현예에서, 경쟁 시약 (예를 들어 제1 및/또는 제2 경쟁 시약)은 인큐베이션의 개시 이후 14, 일, 10 일, 7 일, 또는 5 일 이내에, 예컨대 인큐베이션 개시 이후 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일 또는 1 일 이내에 첨가된다. 구체적인 구현예에서, 경쟁 시약은 인큐베이션의 개시 이후 5 일 이내에, 예컨대 인큐베이션의 개시 이후 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 이내에 첨가된다. 특정 구현예에서, 경쟁 시약은 인큐베이션의 개시 이후 1 일 이내에, 인큐베이션의 개시 이후 18 시간, 16 시간, 12 시간, 8 시간, 6 시간, 4 시간, 3 시간, 2 시간, 90 분, 60 분, 또는 30 분 이내에 첨가된다. 그러므로, 자극이 중단되는 시간을 제어함으로써, 다합체화된 시제로부터 용리된 배양된 T 세포의 하나 이상의 구체적인 특징이 본 명세서에 기재된 바와 같이 변경될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 인큐베이션 개시 이후 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 내에 경쟁 시약을 첨가하면 하나 이상의 배양된 세포의 자극, 활성화, 확장, 팽창, 선택, 및/또는 증식을 증가시킬 것이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 성분의 가역적 해리 이후 잔류하는 하나 이상의 성분을 분리 또는 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 배양된 표적 세포 (예를 들어 T 세포) 내 임의의 결합되지 않은 또는 잔여 비오틴은 제거 또는 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 배양된 표적 세포 조성물 중의 세포로부터 제거 또는 분리된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분리/제거 단계는 제2 고정상을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 표적 세포 (예를 들어 T 세포)을 포함하는 혼합물 및 하나 이상의 시제에 결합된 가용성 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 상기 기재된 제1 고정상에 도포되기 전 또는 후에, 적합한 제2 고정상 상에서 크로마도 크래피에 노출된다. 이러한 2차 고정상은 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스일 수 있으며, 겔 여과 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 친화성 시약을 포함한다. 크로마토그래피 수지에 포함되는 친화성 시약은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의, 결합 부위 Z1 및/또는, 존재하는 경우, 결합 부위 Z2에 (특이적으로) 결합하는 결합 파트너 D를 포함하며, 이에 따라 고정상 상에 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 고정한다. 하나 이상의 시제에 결합된 스트렙타비딘 기반의 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이 사용되고 제1 및 제2 시제 모두가 스트렙타비딘 결합 펩타이드를 결합 파트너 C1 또는 C2로서 가지는 경우, 제2 고정상의 친화성 시약에 포함되는 결합 파트너 D는 비오틴일 수 있다. 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약으로서 사용되는 스트렙타비딘의, 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 가용성 올리고머는 일반적으로 크로마토그래피 매트릭스에 공유 결합된 비오틴, 예컨대 상업적으로 입수 가능한 비오틴-세파로스TM에 결합한다. 이러한 일부 구현예에서, 배양된 세포 (예를 들어 배양된 T 세포)는 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약으로부터 제거될 수 있다.
A. 세포
표적 세포를 포함하는 조성물에 함유된 세포는 일반적으로 진핵 세포, 예컨대 포유류 세포이고, 전형적으로 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 혈액, 골수, 림프 또는 림프 기관으로부터 유래되거나, 면역계의 세포, 예컨대 선천성 또는 적응 면역 세포, 예컨대 림프구를 비롯한 골수 또는 림프계 세포, 전형적으로 T 세포 및/또는 NK 세포이다. 다른 예시적인 세포는 줄기 세포, 예컨대 다분화능 (multipotent) 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 비롯한 및 만능 (pluripotent) 줄기 세포를 포함한다. 세포는 전형적으로 1차 세포, 예컨대 대상체로부터 직접 단리된 세포 및/또는 대상체로부터 단리되어 냉동된 세포이다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 다합체화된 시제와 같은 가역적으로-결합된 시제는, 림프구 집단 또는 림프구 집단에 포함된 부분 집단을 팽창시킬 수 있다. 팽창되는 림프구 집단은 임의의 적합한 집단, 예를 들어 B 세포 집단, T 세포 집단 또는 자연 살해 세포 집단일 수 있다. T-세포 집단은 항원-특이적 T 세포 집단, 보조 T 세포 집단, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 또는 자연 살해 T 세포 집단일 수 있다. 따라서, 이러한 다합체화된 시약의 구현예에서, 제1 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 자극할 수 있다 따라서, 다합체화된 시제에 존재하는 제1 시제는 CD3에 특이적으로 결합하는 결합 시약일 수 있는 반면, 액세서리 분자에 결합하는 제2 시제는 CD28, CD137, IL-12R, IFNγIL-4R, IL-17R, RORγα, CXCR3, CCR7, CD62L, CXCR1 또는 CXCR4에 특이적으로 결합하는 결합제일 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 예컨대 기능, 활성화 상태, 성숙도, 분화 능력, 팽창, 재순환, 부위, 및/또는 지속 능력, 항원 특이성, 항원 수용체의 유형, 특정 장기 또는 구획에서의 존재, 마커 또는 사이토카인 분비 프로파일 및/또는 분화 정도에 의해 정의된 것과 같은, T 세포 또는 전체 T 세포 집단, CD3+, CD4+ 세포, CD8+ 세포 및 이러한의 서브 집단과 같은 기타 세포 유형의 하나 이상의 서브세트를 포함한다. 치료되는 대상체와 관련하여, 세포는 동종이계 및/또는 자가일 수 있다. 상기 방법들 중에는 기성 방법이 포함된다. 기성 기술 등에 대한 일부 양태에서, 세포는 다분화능 및/또는 다능, 예컨대 유도 다능 줄기 세포 (iPSC) 등의 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 대상체로부터 세포를 단리하고, 이를 제조, 가공, 배양 및/또는 조작하고, 이를 냉동 보존 전 또는 이후에 동일한 환자에게 다시 도입시키는 단계를 포함한다.
T 세포 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 서브 유형 및 서브 집단 중에는 나이브 T (TN) 세포, 이펙터 T 세포 (TEFF), 기억 T 세포 및 이러한의 서브 유형, 예컨대 줄기 세포 기억 T (TSCM), 중심 기억 T (TCM), 이펙터 기억 T (TEM) 또는 최종 분화된 이펙터 기억 T 세포, 종양-침윤성 림프구 (TIL), 미성숙 T 세포, 성숙 T 세포, 헬퍼 T 세포, 세포 독성 T 세포, 점막 관련 불변 T (MAIT) 세포, 자연 발생 및 적응 조절 T (Treg) 세포, TH1 세포, TH2 세포, TH3 세포, TH17 세포, TH9 세포, TH22 세포 등의 T 보조 세포, 여포성 헬퍼 T 세포, 알파/베타 T 세포 및 델타/감마 T 세포가 포함된다.
일부 구현예에서, 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포는 단핵구 또는 과립구, 예컨대 골수 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만 세포, 호산구 및/또는 호염기구이다.
1. 세포의 제조
일부 구현예에서, 세포의 제조는 하나 이상의 배양 단계 및/또는 제조 단계를 포함한다. 세포는 샘플, 예컨대 대상체로부터 수득되거나 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플로부터 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포가 단리되는 대상체는 질환 또는 병태를 가지거나 세포 요법을 필요로 하는, 또는 세포 요법을 받을 개체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 특정 치료적 개입, 예컨대 세포가 단리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 요법을 필요로 하는 인간이다.
따라서, 일부 구현예에서 세포는 1차 세포, 예컨대 1차 인간 세포이다. 샘플은 조직, 유체 및 상기 대상으로부터 직접 채취한 기타 샘플뿐만 아니라 하나 이상의 가공 단계, 예컨대 분리, 원심 분리, 유전자 조작 (예컨대, 바이러스 벡터를 이용한 형질 도입), 세척 및/또는 배양 단계에서 초래된 샘플을 포함한다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원 또는 가공된 샘플에서 직접 수득한 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀 등의 체액, 이로부터 유래된 가공 샘플을 비롯한 조직 및 기관 샘플을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 세포가 유래되거나 단리되는 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 또는 성분채집술 (apheresis) 또는 백혈구성분채집술 (leukapheresis) 산물이거나 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관 및/또는 이로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플은 세포 요법, 예컨대, 입양 세포 요법의 맥락에서, 자가 및 동종이계 공급원으로부터 유래된 샘플을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 세포주 (예컨대, T 세포주)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 세포는 이종 공급원, 예컨대 마우스, 래트, 비인간 영장류 또는 돼지로부터 수득된다.
일부 구현예에서, 세포의 단리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성에 기초한 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 예시에서, 세포는 세척되고, 원심 분리되며 및/또는 하나 이상의 시약 존재하에서, 예컨대 원치 않는 성분을 제거하고 원하는 성분을 풍부하게 하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위하여 인큐베이션된다. 일부 예시에서, 세포는 하나 이상의 성질, 예컨대 밀도, 부착 성질, 크기, 민감성 및/또는 특정 성분에 대한 내성에 기초하여 분리된다.
일부 예시에서, 환자의 순환 혈액의 세포는, 예컨대 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득된다. 일부 양태에서, 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 양태에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체로부터 채취된 혈액 세포는, 예컨대 혈장 부분을 제거하고 세포를 후속 공정 단계를 위해 적절한 완충액 또는 배지에 위치시키기 위하여 세척된다. 일부 구현예에서, 세포는 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 다수의 또는 모든 2가 양이온을 가지지 않는다. 일부 양태에서, 세척 단계는 반-자동 "플로우-스루" 원심 분리기 (예컨대, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter)를 제조사의 지침에 따라 수행된다. 일부 양태에서, 세척 단계는 상기 제조사의 지침에 따른 접선 유동 여과 (tangential flow filtration; TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 세포는 세척 후 다양한 생체 적합성 완충액, 예를 들어 Ca++/Mg++ 없는 PBS에 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분은 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 적혈구를 용해시켜 퍼콜 (Percoll) 또는 피콜 (Ficoll) 구배를 통해 원심 분리하여 말초 혈액으로부터 백혈구를 제조하는 것과 같은 밀도-기반 세포 분리 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리 방법은 표면 마커, 예컨대 표면 단백질, 세포 내 마커 또는 핵산과 같은 하나 이상의 특정 분자의 세포에서의 발현 또는 존재에 기초한 상이한 세포 유형의 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 마커에 기초한 임의의 공지된 분리 방법이 사용될 수 있다. 분리 방법은 가역성 시약 시스템, 예컨대 본 명세서에 기재된 시제 (수용체 결합제 또는 선별제) 및 시약을 사용하는 방법을 포함하여, 본 명세서에 개시된 임의의 방법을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 분리는 친화성- 또는 면역친화성- 기반 분리이다. 예를 들어, 일부 양태에서, 상기 단리는 세포의 발현 또는 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커의 발현 수준에 기초한 세포 및 세포 집단의 분리를 포함하며, 예컨대 상기 분리는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 파트너와의 배양에 의해 이루어지고, 뒤이어 일반적으로 세척 단계 및 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포를 상기 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포로부터 분리하는 단계를 거친다.
이러한 분리 단계는 시약에 결합된 세포가 추가적인 사용을 위해 유지된 양성 선별, 및/또는 항체 또는 결합 파트너에 결합되지 않은 세포가 유지된 음성 선별에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 두 분획은 모두 추가적인 사용을 위해 유지된다. 일부 양태에서, 음성 선택은 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 이용 가능한 항체가 없는 경우에 특히 유용하여, 분리는 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현되는 마커에 기초하여 수행되는 것이 가장 바람직하다.
분리는 특정 마커를 발현하는 특정 세포 집단 또는 세포의 100% 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예를 들어, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선별 또는 농축은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 것을 의미하지만, 마커를 발현하지 않는 세포의 완전한 부재를 초래할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 세포와 같은 특정 유형의 세포의 음성 선별, 제거 또는 고갈은, 이러한 세포의 수 또는 퍼센트를 감소시키는 것을 의미하지만, 이러한 모든 세포의 완전한 제거를 초래할 필요는 없다.
일부 예시에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획이 연속된 양성 선별 또는 음성선택과 같은 또 다른 분리 단계를 거치는 분리 단계의 다중 라운드가 수행된다. 일부 예시에서, 단일 분리 단계는 예컨대 세포를 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 다중 마커를 동시에 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있으며, 각각은 음성선택에 대해 표적화된 마커에 특이적이다. 마찬가지로, 여러 세포 유형은, 세포를 다양한 세포 유형에서 발현되는 다수의 항체 또는 결합 파트너와 함께 배양함으로써 동시에 양성 선택될 수 있다.
예를 들어, 일부 양태에서, 하나 이상의 표면 마커, 예를 들어, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+, 및/또는 CD45RO+ T 세포의 높은 수준을 발현하는 세포 또는 양성 세포와 같은 T 세포의 특정 서브 집단은 양성 선별 또는 음성선택 기술에 의해 단리된다.
예를 들어, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이션 자성 비드 (예를 들어, DYNABEADS®M-450 CD3/CD28 T Cell Expander)를 사용하여 양성 선별될 수 있다.
일부 구현예에서, 단리는 양성 선별에 의한 특정 세포 집단의 농축, 또는 음성선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 선별 또는 음성선택은 세포를 각각 양성 또는 음성으로 선택된 세포상에 발현 (marker+) 또는 상대적으로 높은 수준으로 발현 (markerhigh)된 하나 이상의 표면 마커와 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 기타 결합제와 함께 배양함으로써 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-T 세포, 예컨대 B 세포, 단핵구 또는 CD14 등의 기타 백혈구에서 발현된 마커의 음성선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 양태에서, CD4+ 또는 CD8+ 선별 단계는 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T 세포를 분리하도록 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은 하나 이상의 나이브, 기억 및/또는 이펙터 T 세포 서브 집단에서 발현 또는 상대적으로 높은 정도로 발현된 마커에 대한 양성 선별 또는 음성선택에 의해 서브 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 예컨대 상기 각각의 서브 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 선별 또는 음성 선택에 의하여, 나이브, 중심 기억, 이펙터 기억 및/또는 중추 기억 줄기 세포가 더욱 풍부해지거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 예컨대 투여 이후의 장기 생존, 팽창 및/또는 생착을 개선시키 위한 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 일부 양태에서 이러한 서브 집단에서 특히 강력하다. Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother . 35(9):689-701를 참조한다. 일부 구현예에서, TCM-농축 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 결합은 효능을 더욱 증강시킨다.
구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. PBMC는 예컨대 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하여, CD62L-CD8+ 및/또는 CD62L+CD8+가 풍부해지거나 고갈될 수 있다.
일부 구현예에서, 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 양태에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임 B를 발현 또는 고도로 발현하는 세포에 대한 음성 선별에 기초한다. 일부 양태에서, TCM 세포가 풍부한 CD8+ 집단의 단리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈에 의해, 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선별 또는 농축에 의해 수행된다. 하나의 양태에서, CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선별 및 CD62L에 기초한 양성 선별을 받는, CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 분획으로 시작하여 중심 기억 T (TCM) 세포의 농축이 수행된다. 이러한 선별은, 일부 양태에서는 동시에 수행되며, 또 다른 양태에서는 어떠한 순서로든 순차적으로 수행된다. 일부 양태에서, CD8+ 세포 집단 또는 부분 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반의 선택 단계는 또한 CD4+ 세포 집단 또는 서브 집단을 생성하는데에도 사용되어, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획은 모두 경우에 따라 하나 이상의 추가적인 양성 또는 음성 선별 단계에 이어서, 상기 방법의 후속 단계에서 유지되고 사용된다.
CD4+ 보조 T 세포는 세포 표면 항원을 가지는 세포 집단을 동정함으로써 나이브, 중심 기억 및 이펙터 세포로 분류된다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중심 기억 CD4+ 세포는 CD62L+ 및 CD45RO+이다. 일부 구현예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
하나의 실시예에서, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포들을 농축시키기 위하여, 단일클론성 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 양성 및/또는 음성 선별을 위한 세포의 분리를 허용하기 위해, 자성 비드 또는 상자성 비드와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역 자기성 (또는 친화성 자기성) 분리 기법 (reviewed in Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒHumana Press Inc., Totowa, NJ에서 검토됨)을 사용하여 분리 또는 단리된다.
일부 양태에서, 분리될 세포의 샘플 또는 조성물은 상자성 비드 (예컨대, Dynalbeads 또는 MACS 비드)와 같은 자기적 반응 입자 또는 미세 입자 등의 작고 자화가능하거나 자기적 반응 물질과 함께 배양된다. 자기적 반응 물질, 예컨대 입자는 일반적으로 세포, 세포들 또는 세포 집단상에 존재하는 분자, 예컨대 표면 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너, 예컨대 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착되고, 이는 분리, 예컨대 음성적으로 또는 양성적으로 선택하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 특이적 결합 구성원, 예컨대 항체 또는 기타 결합 파트너에 결합된 자기적 반응 물질을 포함한다. 자성 분리 방법에서 사용되는 공지된 자기적 반응 물질들이 많이 있다. 적합한 자성 입자는 Molday의 미국 특허 4,452,773, 및 유럽 특허 EP 452342B에 기술된 입자를 포함하며, 상기 특허는 본 명세서에 참조로 포함된다. Owen의 미국 특허 4,795,698 및 Liberti et al.의 미국 특허 5,200,084에 기술된 입자와 같은 콜로이드 크기의 입자가 기타 예시이다.
인큐베이션 단계는 일반적으로, 항체 또는 결합 파트너, 또는 자성 입자 또는 비드에 부착된 그러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 기타 시약 등의 분자가, 샘플 내 세포에 존재한다면 세포 표면 분자에 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다.
일부 양태에서, 샘플은 자기장 내에 배치되고, 자기적 반응 또는 자화 가능 입자들이 부착된 세포는 자석에 끌려서 표지되지 않은 세포들부터 분리될 것이다. 양성 선별의 경우, 자석에 끌리는 세포들이 유지되고; 음성 선별의 경우, 끌리지 않는 세포들 (표지되지 않은 세포)이 유지된다. 일부 양태에서, 양성 선별 및 음성 선별의 조합은 양성 및 음성 분획이 유지되고 추가로 가공되거나 추가적인 분리 단계에 종속되는 동일한 선택 단계 중에 수행된다.
특정 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 1차 항체 또는 기타 결합 파트너, 2차 항체, 렉틴, 효소 또는 스트렙타비딘에서 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자들은 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포들에 부착된다. 특정 구현예에서, 비드보다는 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지되고, 이어서 세포-유형 특이적 2차 항체- 또는 기타 결합 파트너 (예컨대, 스트렙타비딘)-코팅된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘-코팅된 자성 입자는 비오틴화된 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, 자기적 반응 입자들은 후속적으로 배양 및/또는 조작되는 세포들에 부착된 채로 남고; 일부 양태에서, 입자들은 환자에게 투여되기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화 가능 또는 자기적 반응 입자들은 세포들로부터 제거된다. 세포로부터 자화 가능한 입자들을 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대 경쟁적 비표지된 항체, 자화 가능한 입자 또는 절단 가능한 링커에 접합된 항체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 자화 가능한 입자들은 생분해성이다.
일부 구현예에서, 친화성-기반의 선별은 자성-활성화된 세포 분류 (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통해 이루어진다. Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) 시스템은 자성 입자가 부착된 세포들을 고순도로 선별할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 종 및 표적 종이 외부 자기장의 적용 이후 순차적으로 용출되는 모드로 작동한다. 즉, 자화된 입자들에 부착된 세포들은 부착되지 않은 종들이 용출되는 동안 제 위치에 유지된다. 이어서, 이 제1 용출 단계가 완료된 이후, 자기장에 포획되어 용출되는 것이 방지된 종은 용출 및 회수할 수 있는 어떤 방법으로 유리된다. 특정 구현예에서, 비-표적 세포는 표지되고 세포의 이종 집단으로부터 고갈된다.
특정 구현예에서, 단리 또는 분리는 단리, 세포 제조, 분리, 가공, 인큐베이션, 배양 및/또는 제형 단계 중 하나 이상을 수행하는 시스템, 기구 또는 장치를 사용하여 수행된다. 일부 양태에서, 시스템은 밀폐되거나 멸균 환경에서 이러한 각 단계를 수행하기 위해, 예컨대 에러, 사용자 처리 및/또는 오염을 최소화하기 위해 사용된다. 한 예시에서, 한 예에서, 시스템은 국제 특허 출원 WO2009/072003 또는 US 20110003380 A1에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 시스템 또는 장치는 통합 또는 자체 내장 시스템에서, 및/또는 자동화되거나 프로그램 가능한 방식으로, 예컨대 모든 분리, 가공, 조작 및 제형 단계 중 하나 이상을 수행한다. 일부 양태에서, 시스템 또는 장치는 사용자가 가공, 단리, 조작 및 제형 단계들의 결과를 프로그램, 제어, 평가하고, 및/또는 다양한 양상들을 조정할 수 있도록 하는 시스템 또는 장치와 통신하는 컴퓨터 및/또는 컴퓨터 프로그램을 포함한다.
일부 양태에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS 시스템 (Miltenyi Biotic)을 사용하여 수행되고, 예컨대 닫힌 무균 시스템에서 임상 규모 수준의 세포의 자동 분리를 위해 수행된다. 구성 요소들은 통합 마이크로컴퓨터, 자기 분리 유닛, 연동 펌프 및 다양한 핀치 밸브을 포함할 수 있다. 통합 컴퓨터는 일부 양태에서 기구의 모든 구성 요소를 제어하고, 표준화된 순서로 반복적인 절차를 수행하도록 시스템에 지시하다. 자기 분리 유닛은 일부 양태에서 이동 가능한 영구 자석 및 선택 칼럼을 위한 홀더를 포함한다. 연동 펌프는 튜빙 세트 전체의 유속을 제어하며, 핀치 밸브와 함께 시스템을 통한 완충액의 제어된 흐름 및 세포의 지속적인 서스펜션을 보장한다.
CliniMACS 시스템은 일부 양태에서 멸균된 비-발열성 용액으로 공급되는 항체 결합 자화 가능 입자를 사용한다. 일부 구현예에서, 자성 입자로 세포를 표지한 이후 세포를 세척하여 과량의 입자를 제거한다. 세포 제조 백은 이후 튜빙 세트에 연결되고, 완충액과 세포 채취 백에 차례로 연결된다. 튜빙 세트는 예비-칼럼과 분리 칼럼을 포함하여 미리 조립된 무균 튜빙으로 구성되어 있으며 일회용으로만 사용된다. 분리 프로그램의 개시 후, 시스템은 자동으로 세포 샘플을 분리 칼럼에 도포시킨다. 표지된 세포들은 칼럼 내에 유지되는 반면, 표지되지 않은 세포들은 일련의 세척 단계에 의해 제거된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되지 않고 칼럼에 유지되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 표지되고 칼럼에 유지된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 함께 사용하기 위한 세포 집단은 자기장의 제거 이후 칼럼으로부터 용출되어 세포 채취 백 내에 수집된다.
특정 구현예에서, 분리 및/또는 기타 단계는 CliniMACS Prodigy 시스템 (Miltenyi Biotec)을 사용하여 수행된다. CliniMACS Prodigy 시스템은 일부 양태에서 원심 분리에 의한 세포의 자동화된 세척 및 분류를 가능하게 하는 세포 처리 일체로 장착되어 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한 공급원 세포 생성물의 육안으로 보이는 층을 식별함으로써 최적의 세포 분획 종점을 결정하는 내장 카메라 및 이미지 인식 소프트웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액은 적혈구, 백혈구 및 혈장 층으로 자동 분리될 수 있다. CliniMACS Prodigy 시스템은 또한, 예컨대 세포 분화 및 팽창, 항원 로딩 및 수명이 긴 세포 배양 등의 세포 배양 프로토콜을 수행하는 통합 세포 배양 챔버를 포함할 수 있다. 입력 포트는 멸균 제거 및 배지의 보충을 허용할 수 있으며 통합 현미경을 사용하여 세포를 모니터할 수 있다. 예를 들어, Klebanoff et al. (2012) J Immunother . 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, and Wang et al. (2012) J Immunother . 35(9):689-701를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 유동 세포 분석법을 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)되고, 여기서 여러 세포 표면 마커에 대해 염색된 세포는 유체 줄기로 운반된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 예비 크기 (FACS) 분리를 통해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 세포 집단은 FACS-기반 검출 시스템과 함께 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩의 사용에 의해 채취 및 농축 (또는 고갈)된다 (예컨대, 문헌 WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; 및 Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376 참조). 두 경우 모두 세포를 여러 마커로 표지할 수 있어 명확한 T 세포는 고순도로 단리된다.
일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 하나 이상의 검출 가능한 마커로 표지되어, 양성 및/또는 음성 선별을 위한 분리를 용이하게 한다. 예를 들어, 분리는 형광 표지된 항체와의 결합에 기초할 수 있다. 일부 예시에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적인 항체 또는 기타 결합 파트너의 결합에 기초한 세포의 분리는 유체 줄기에서, 예컨대 예비 크기 (FACS) 및/또는 마이크로 전기 기계 시스템 (MEMS) 칩을 포함하는 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를, 유동 세포 검출 시스템과 함께 조합하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 동시에 여러 마커에 기초한 양성 선별 및 음성 선별을 허용한다.
일부 구현예에서, 제조 방법은 단리, 인큐베이션, 배양 및/또는 조작 전 또는 후에, 세포를 동결, 예컨대 동결 보존하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 세포 집단 내의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 혈장 및 혈소판을 제거하기 위한 세척 단계 후에, 세포는 동결 용액에서 현탁된다. 임의의 다양한 공지된 동결 용액 및 파라미터가 경우에 따라 사용될 수 있다. 한 예시로는 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 포함하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 그런 다음 DMSO와 HSA의 최종 농도가 각각 10%와 4%가 되도록 배지와 1:1로 희석된다. 이어서, 세포는 분당 1°의 속도에서 -80 ℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에 저장된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전자 조작에 선행하여 또는 이와 관련하여 인큐베이션 및/또는 인큐베이션된다. 인큐베이션 단계는 배양, 구축, 자극, 활성화 및/또는 증식을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극제의 존재하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하며, 및/또는 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 유전자 조작을 위해 세포를 준비하도록 고안된 것들을 포함한다.
조건은 하나 이상의 특정 배지, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 시제 (예컨대, 영양제, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자 (예컨대, 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화하도록 고안된 임의의 기타 시제))를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 조건 또는 시제는 TCR 복합체의 세포 내 신호 전달 도메인을 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 시제, 예컨대 리간드를 포함한다. 일부 양태에서, 시제는 T 세포에서 TCR/CD3 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 작동시키거나 개시한다. 이러한 시제는 항체, 예컨대 TCR 성분 및/또는 공동 자극 수용체에 특이적인 (예컨대, 항-CD3, 항-CD28), 비드와 같은 고체 지지체에 결합된 항체, 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 포함할 수 있다. 선택적으로, 팽창 방법은 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체를 배양 배지에 (예컨대, 적어도 약 0.5 ng/ml의 농도로) 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 IL-2 및/또는 IL-15, 예컨대, 적어도 약 10 units/mL 농도의 IL-2를 포함한다.
일부 양태에서, 인큐베이션 단계는 Riddell et al의 미국 특허 6,040,1 77, Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기재된 기법에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, T 세포는 비-분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 같은 조성물 피더 세포에 첨가함으로써 (예컨대, 결과적으로 생성된 세포 집단은 팽창될 초기 집단 내 각각의 T 림프구에 대하여 적어도 약 5, 10, 20 또는 40개 이상의 PBMC 피더 세포를 함유함); 및 배양물을 배양함으로써 (예컨대, T 세포의 수를 팽창시키기에 충분한 시간 동안) 팽창될 수 있다. 일부 양태에서, 비-분할 피더 세포는 감마선 조사된 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rads 범위의 감마선으로 조사된다. 일부 양태에서, 피더 세포는 T 세포 집단의 첨가에 선행하여 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 적어도 약 25 ℃, 일반적으로 약 30 ℃, 및 일반적으로 약 37 ℃를 포함한다. 선택적으로, 인큐베이션 단계는 피더 세포로서 비-분할 EBV-형질 전환 림프아구 세포 (LCL)를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rads 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 일부 양태에서 임의의 적합한 양으로, 예컨대 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포의 비율이 적어도 약 10:1인 양으로 제공된다.
구현예에서, 항원 특이적 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포는 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 수득된다. 예를 들어, 항원 특이적 T 세포주 또는 클론은 T 세포를 감염된 대상체로부터 단리하고 시험관 내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써, 사이토메갈로바이러스 항원에 생성될 수 있다.
B. 제품화 장치 및 물품
일부 구현예에서, 제품화 장치 또는 물품이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 크로마토그래피를 위한 바이오리액터 및 제1 고정상의 배열이 제공된다. 바이오리액터는 세포의 팽창에 적합하고, 고정상은 세포 분리 및 시약의 제거에 적합하다. 제1 고정상은 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스이고, 이러한 겔 여과 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 친화성 시약을 포함하며, 친화성 시약은 제1 시제에 포함된 결합 파트너 C1에 특이적으로 결합하는 결합 부위 Z1를 포함하고 및/또는 친화성 시약은 제2 시제에 포함된 결합 파트너 C2에 특이적으로 결합하는 결합 부위 Z2를 포함한다. 제1 고정상은 이에 따라 제1 시제 및/또는 제2 시제, 제1 결합 파트너 C1 및/또는 유리 제2 결합 파트너 C2를 고정시키는데 적합하다. 또한, 바이오리액터 및 고정상은 유체적으로 연결된다. 이러한 배열은 설명한 바와 같이 연속적인 팽창에 사용될 수 있으며 Quantum®세포 팽창 시스템 또는 Xuri Cell Expansion System W25와 같은 공지된 세포 팽창 시스템에 통합될 수 있다.
이러한 배열에서, 제1 고정상은 크로마토그래피 칼럼에 포함되거나 평면 고정상이다. 배열은 제1 고정상에 유체적으로 연결된 제2 고정상을 추가로 포함할 수 있다. 2차 고정상은 겔 여과 매트릭스 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스일 수 있으며, 겔 여과 및/또는 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 친화성 시약을 포함한다. 이러한 친화성 시약은 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약의 결합 부위 Z1에 (특이적으로) 결합하는 결합 파트너 D를 포함함으로써, 고정상에 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 고정하기에 적합할 수 있다.
본 발명은 또한 세포 조성물의 정제 (예컨대, 선택) 및 배양, 예컨대 자극 또는 팽창을 위한 장치에 관한 것이며, 상기 장치는 바이오리액터와 상기 정의된 크로마토그래피의 제1 고정상 및/또는 제2 고정상 중 적어도 하나의 배열을 포함한다.
장치는 바이오리액터 및 고정상이 연속하여 유체적으로 연결된 다수의 장치를 추가로 포함할 수 있다.
장치는 바이오리액터 배열의 바이오리액터 및 크로마토그래피의 고정상에 유체적으로 연결되는 샘플 주입구를 포함할 수 있다. 장치는 또한 정제 및 팽창된 표적 세포에 대한 샘플 유출구를 포함할 수 있으며, 샘플 유출구는 바이오리액터의 적어도 하나의 배열의 마지막 고정상 및 크로마토그래피의 고정상에 유체적으로 연결된다.
특정 구현예에서, 장치는 기능적으로 닫힌 시스템으로 고안될 수 있다.
C. 배양된 세포의 예시적인 특징
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 방법에 따라 생성되거나 생산된 배양된 세포를 포함할 수 있는 배양된 표적 세포 (예를 들어, 배양된 T 세포)는, 하나 이상의 특정 표현형 및/또는 기능적 특징을 나타내며, 이는 증식 능력, 표면 마커 발현, 분화 상태, 활성화 상태 및/또는 대사 프로파일에 기초하거나 이와 관련이 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법 중 임의의 것에 따른 표적 세포의 배양 (예컨대, T 세포의 배양)은, 본 명세서에 제공된 방법에 따른 배양 전의 조성물 내 세포의 상응하는 또는 개별 기능 또는 표현형에 비하여, 세포의 기능 (예컨대, 기능적 활성의 증가 또는 감소) 또는 표현형 (예컨대, 마커 또는 마커들의 높거나 낮은 발현)과 관현된 파라미터의 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포는 팽창 및/또는 증식 능력, CD4+/CD8+ T 세포 분포 또는 비율, 표면 마커 발현, 기능적 활성 또는 대사 프로파일 중 하나의 파라미터에 대한 변화를 나타낸다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포에서 측정된 바와 같은 파라미터의 변화는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서 측정된 동일하거나 유사한 파라미터와 비교되거나 이를 참고로 한다. 일반적으로, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물 내 T 세포는 가역적으로 결합된 시제와의 인큐베이션 (예컨대, 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이전의 T 세포의 동일하거나 실질적으로 동일한 조성물을 포함하거나 이로부터 유래되지만, 이러한 세포는 인큐베이션 되지 않거나 상이한 인큐베이션의 대상이 된다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 제조물은 적어도 하나의 양태를 제외하고는 실질적으로 동일한 프로토콜 또는 조건 (예컨대, 자극제 또는 시제의 유형, 자극제 또는 시제의 형태, 실질적으로 동일한 초기 세포수, 세척, 추가적인 시약의 존재 또는 부재, 인큐베이션 시기, 인큐베이션 온도)을 사용하는 배양의 대상이 되고, 일부 경우에 오직 하나의 양태에서, 이러한 기준 T 세포 제조물에서의 이러한 인큐베이션은 배양된 T 세포를 생산하는 인큐베이션과 상이하다.
일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물은 가역적으로 결합된 시제와의 인큐베이션 (예컨대, 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이전의 T 세포를 포함하는 조성물이다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포는 가역적으로-결합된 시제와의 28 일, 21 일, 14 일, 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 미만 동안 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션)에 의해 생성되고 및/또는 세포 상의 하나 이상의 분자와 이러한 시제의 회합은 (예를 들어 경쟁 시약, 예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체의 존재하에), 예컨대 이러한 시제와 인큐베이션 개시의 28 일, 21 일, 14 일, 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일, 4 일, 3 일, 2 일, 또는 1 일 이내에 파괴된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제와의, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 도는 제조되며, 이러한 인큐베이션은 인큐베이션 개시 이후 28 일, 21 일, 14 일, 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일 이내에 (예컨대 약 4, 3, 2, 또는 1 일 이하 이내에) 종료 및/또는 파괴되고, 및/또는 세포로부터 가역적으로-결합된 시제를 해리하는 경쟁 시제 (예를 들어 비오틴)는 이러한 인큐베이션의 개시 이후 28 일, 21 일, 14 일, 10 일, 9 일, 8 일, 7 일, 6 일, 5 일 이내에 (예컨대 또는 약 4, 3, 2, 또는 1 일 이하 이내에) 인큐베이션된 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 제조물은 동일한, 또는 실질적으로 동일한 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되지만, 인큐베이션은 5 일 이상 수행되고, 세포에서 유도 또는 조절된 신호를 감소 또는 종결시키기 위해 종결 및/또는 중단되지 않으며, 및/또는 T 세포 제조물은 세포로부터 시약을 해리시키는 경쟁 시제 (예를 들어 비오틴 또는 비오틴 유사체)를 첨가하지 않고 제조된다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포는 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션)에 의해 생성되고, 수용체-결합제 (예를 들어 자극제)는 CD28에 결합하지 않고 및/또는 신호 전달을 유도하지 않는 것이며, 즉, 항-CD28 항체 또는 이의 단편이 아니다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 배양된 T 세포는 가역적으로-결합된 시약과 함께 인큐베이션한 후 제조 또는 생성되고, 하나 이상의 자극제는 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합되며, 적어도 하나의 자극제는 CD3 (예를 들어 항-CD3 항체 또는 이의 단편)에 대해 특이적이며, 제2 자극제는 CD90, CD95, CD137, CD154, ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM 중 하나 이상에 대해 특이적일 수 있다(예를 들어 항-CD90 항체, 항-CD95 항체, 항-CD137 항체, 및 항-CD154 항체, 항-ICOS 항체, 항-LAT 항체, 항-CD27 항체, 항-OX40 항체 또는 항-HVEM 항체, 각각, 또는 항원-결합 이의 단편). 일부 구현예에서, 기준 T 세포 제조물은 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조된 T 세포 배양물이지만, 시약은 CD28에 특이적으로 결합하고 및/또는 CD28 신호 전달은 유도 또는 조절하는 시제를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 기준 T 세포 제조물은 T 세포 조성물을 항-CD3/항-CD28 Dynabeads®항-CD3/항-CD28 ExPact®비드 또는 다른 항-CD3/항-CD28 자극제와 인큐베이션한 이후 생성 또는 제조된다. 일부 구현예에서, 이러한 다른 항-CD3/항-CD28 자극제는 항체 시약이 지지체 (예를 들어 고체 지지체), 예를 들어 비드, 입자, 자성 입자 또는 비드, 나노입자 또는 미세구형에 결합된 것이다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포는 가용성인, 즉, 지지체 (예를 들어 고체 지지체)에 결합되지 않은, 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션)에 의해 제조된다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제작물과 비교하여 향상된 팽창 및/또는 증식 능력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 증강된 팽창 및/또는 증식 능력은 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 각각의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 수 또는 백분율의 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)의 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 배양물과 비교하여 CD3+ T 세포의 향상된 팽창 및/또는 증식 능력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 증강된 팽창 및/또는 증식 능력은 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD3+ T 세포 각각의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 CD3+ T 세포의 수 또는 백분율의 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)의 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 CD4+ T 세포의 향상된 팽창 및/또는 증식 능력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 증강된 팽창 및/또는 증식 능력은 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD4+ T 세포 각각의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 CD4+ T 세포의 수 또는 백분율의 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)의 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 CD8+ T 세포의 향상된 팽창 및/또는 증식 능력을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 증강된 팽창 및/또는 증식 능력은 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD8+ T 세포 각각의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 CD8+ T 세포의 수 또는 백분율의 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)의 증가를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 변형된 CD8+/CD4+ T 세포 분포 또는 표준화된 T 세포 분포, 예컨대 변형된 CD8+/CD4+ 비율 또는 표준화된 CD8+/CD4+ T 세포 비율을 특징으로 한다. CD8+/CD4+ 비율 또는 표준화된 비율은 증가 또는 감소할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 CD8+/CD4+ T 세포 비율은 기준 조성물 또는 제조물에서의 표준화된 수 또는 백분율 또는 표준화된 수 또는 백분율과 비교하여 또는 상대적으로, 배양된 T 세포에서의 CD8+ T 세포의 수 또는 백분율 또는 표준화된 수 또는 백분율의 증가로부터 초래된다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD8+ T 세포의 수 또는 백분율 또는 CD8+ T 세포의 표준화된 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 CD8+ T 세포의 수는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 그 이상 중 임의)로 증가한다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 CD8+/CD4+ T 세포의 비율 또는 CD8+/CD4+의 표준화된 비율과 비교하여, CD8+/CD4+ T 세포의 비율 또는 CD8+/CD4+의 표준화된 비율은 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포 또는 조성물 또는 제조물에서의 수, 백분율 또는 비율은 인큐베이션에 선행하여 T 세포를 포함하는 초기 조성물의 수, 백분율 또는 비율에 표준화된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 가역적으로-결합된 시제와의 인큐베이션 (예를 들어 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 인큐베이션) 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 변형된 표면 마커 발현 프로파일을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 변형된 표면 마커 발현 프로파일은 CD45RA, CD45RO, CD62L, CD69, CCR7, CD27, CD28, CD122, t-bet, IL-7Rα, CD95, IL-2RβCXCR3, LFA-1, KLRG1로부터 선별된 하나 이상의 표면 마커에 대해 양성, 음성 또는 낮은 T 세포의 하나 이상의 서브세트의 수 또는 백분율의 변화에 기인한다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물에서의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포에서의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율은 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트 (예컨대, 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여 배양된 T 세포에서의 증가된 T 세포 서브세트)는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 감소되거나 줄어든 분화 또는 활성 상태를 나타낸다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 이펙터 T 세포 (TE) 또는 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 표현형이 아니거나, 이를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포의 서브세트는 CD62L+, CCR7+, CD27+, CD28+, 또는 KLRG1low / 중 하나 이상인 표면 표현형을 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트 (예컨대, 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여 배양된 T 세포에서의 증가된 T 세포 서브세트)는 CD62L 및/또는 IL-7Rα (CD127)에 대해 양성이고, 및/또는 t-bet에 대해 음성이거나 낮다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 CD45RA에 대해 양성이고 및/또는 CD45RO에 대해 음성이거나 낮다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 CCR7, CD45RA, CD62L, CD27, CD28, IL-7Rα (CD127), CD95, IL-2Rβ및 LFA-1 중 하나 이상에 대해 양성이고, 및/또는 CD45RO에 대해 음성이거나 낮다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트 (예컨대, 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여 배양된 T 세포에서의 증가된 T 세포 서브세트)는 CD62L에 대해 양성인 세포 (CD62L+)이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트 (예컨대, 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여 배양된 T 세포에서의 증가된 T 세포 서브세트)는 CD62L+, a) CD45RA low/+, CD45RO low/+, CCR7+ 및 CD27+ 중 임의의 하나 이상 및 b) t-betlow, IL-7Rα+ (CD127+), CD95+, IL-2Rβ및 LFA-1+ 중 임의의 하나 이상인 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 또한 CD3+, CD4+ 또는 CD8+일 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트, 예컨대 CD62L+ T 세포 서브세트는 기억 T 세포 또는 이의 특정 서브세트, 예컨대 수명이 긴 기억 T 세포와 표현형 특성을 포함하거나 공유한다. 일부 구현예에서, 이러한 기억 T 세포는 중심 기억 T 세포 (Tcm) 또는 T 기억 줄기 세포 (Tscm) 세포이다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 Tscm 세포이다. Tscm 세포는 기타 기억 T 세포 서브세트 또는 나이브 T 세포와 비교하여 하나 이상의 표현형 차이 또는 기능적 특징을 가지는 것으로, 예컨대 덜 분화되거나 더 나이브한 것으로 기술될 수 있다 (예를 들어, Ahlers and Belyakov (2010) Blood, 115:1678); Cieri et al. (2015) Blood, 125:2865; Flynn et al. (2014) Clinical & Translational Immunology, 3, e20; Gattinoni et al. (2012) Nat. Med., 17:1290-1297; Gattinoni et al. (2012) Nat. Reviews, 12:671; Li et al. (2013) PLOS ONE, 8:e67401; 및 공개된 PCT 특허 출원 WO2014/039044) 참조. 일부 경우에, Tscm 세포는 이펙터 T 세포 및 기억 T 세포의 3가지 서브세트 (Tscm, Tcm, 및 Tem) 모두를 생성할 수 있는 유일한 기억 T 세포로 여겨진다. 일부 양태에서, Tscm 세포는 세포는 모든 기억 T 세포 서브세트의 항원성 또는 항상성 자극에 대해 가장 높은 생존 및 증식 반응을 나타내며, 동족 항원이 없는 경우 가장 낮은 감소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 덜 분화된 Tscm 세포는 기타 기억 T 세포보다 입양 전달 이후 더 큰 팽창, 장기 생존 및 표적 세포 파괴를 나타낼 수 있으며, 이에 따라 Tcm 또는 Tcm 세포에서 가능한 경우보다 더 적은 전달된 세포로 더욱 효과적인 처리를 매개할 수 있다.
일부 양태에서, TSCM 세포에 대해 보고되거나 공지된 표현형 또는 기능적 특징의 예시로는, 예컨대, a) CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Rα+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+, 및 LFA-1+인 세포; b) CD45RA+, CCR7+, CD62L+, 및 CD95+인 세포; c) CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, 및 IL-2Rβ+인 세포; d) CD45RO-, CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+, 및 CD95+인 세포; e) CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rβ+, CD28+, CD43-, KLRG1-, 퍼포린-, 및 그랜자임B-인 세포; f) 높은 수준의 CCR7, CD62L, CD27 및 CD28, 중간 수준의 CD95 및 IL-2Rβ낮은 수준의 CD45RA를 발현하고, CD45RO 또는 KLRG-1을 발현하지 않는 세포; 또는 g) 높은 수준의 CD62L, 낮은 수준의 CD44 및 t-bet을 발현하고, Sca-1+인 세포; 및/또는 중간 IL-2 생산 능력, 낮은 IFNγ생산 능력, 낮은 세포 독성 및 높은 자가 재생 능력을 가지는 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트 (예컨대, 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여 배양된 T 세포에서의 증가된 T 세포 서브세트)는 기억 T 세포, 예컨대 수명이 긴 기억 T 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 중심 기억 (Tcm) T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RA-, CD45ROlow /+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+ CD122+ 및/또는 KLGR1low을 가진다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, 기억 T 세포는 줄기 중심 기억 (Tscm) T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RAlow /+, CD45ROlow /+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ 및/또는 KLGR1-을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RAlow /+, CD45RO-, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, CD122+ 및/또는 KLGR1-을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RO-, CCR7+, CD45RA+, CD62L+, CD27+, CD28+, IL-7Rα+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+, 및/또는 LFA-1+을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RA+, CCR7+, CD62L+, 및/또는 CD95+을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RA+, CD45RO+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD95+, 및/또는 IL-2Rβ+을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RO-, CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD28+, CD127+, 및/또는 CD95+을 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 표현형 특성 CD45RA+, CD44+/-, CD62L+, CD127+, IL-2Rβ+, CD28+, CD43-, KLRG1-, 퍼포린-, 및/또는 그랜자임B-를 가진다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 높은 수준의 CCR7, CD62L, CD27 및/또는 CD28, 중간 수준의 CD95 및/또는 IL-2Rβ낮은 수준의 CD45RA를 발현하고, 및/또는 CD45RO 및/또는 KLRG-1를 발현하지 않는다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 높은 수준의 CD62L, 낮은 수준의 CD44 및 t-bet를 발현하고, 및/또는 Sca-1+이다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 중간 IL-2 생산 능력, 낮은 IFNγ생산 능력, 낮은 세포 독성 및/또는 높은 자가 재생 능력의 표현형 특징을 가진다. 일부 구현예에서, 기준 T 세포 조성물 또는 배양물의 T 세포 서브세트의 수 또는 백분율과 비교하여, 배양된 T 세포의 그러한 T 세포 서브세트는 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 증가한다.
일부 구현예에서, T 세포 서브세트, 예컨대 전술한 T 세포 중 임의의 서브세트는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여, 배양된 T 세포에서 총 T 세포의 더 큰 백분율 또는 배양된 T 세포에서 총 T 세포의 더 많은 수로 존재한다. 일부 구현예에서, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포의 T 세포 서브세트의 백분율은, 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, 배양된 세포의 T 세포 서브세트, 예컨대 전술한 임의의 T 세포 서브세트의 백분율은, 인큐베이션 또는 배양 없이, 표현형을 포함하는 하나 이상의 마커의 표면 발현에 기초하여 인간 대상체로부터 직접 단리되거나 농축된 T 세포 조성물의 T 세포 내 세포 서브세트의 상응하는 백분율에 비하여, 예컨대 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 그 이상 더 크다. 일부 구현예에서, 배양된 세포의 T 세포 서브세트, 예컨대 전술한 임의의 T 세포 서브세트의 총 수, 상대적인 수 또는 표준화된 수는, 기준 T 세포 조성물 또는 제조물, 예컨대 상기 기재된 임의의 기준 T 세포 조성물 또는 제조물, 예를 들어 본 명세서에서 제공된 임의의 방법에 따라 가역적으로 결합된 시제와의 배양 (예컨대, 다합체화된 시제, 예컨대 올리고머 뮤테인 스트렙타비딘에 가역적으로 결합된 자극제와의 배양) 전의 T 세포 조성물의 수, 상대적인 수 또는 표준화된 수와 비교하여, 예컨대 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 그 이상 더 크다. 일부 구현예에서, T 세포 배양물 내 존재하는 T 세포 서브세트에 상응하는 T 세포의 수는 적어도 약 1 x106 세포, 2 x106 세포, 3 x 106 세포, 4 x 106 세포, 5 x 106 세포 이상이다.
일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 CD62L+ 및/또는 IL-7Rα+ (CD127+)이고, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포 내 CD62L+ 및/또는 IL-7Rα+ (CD127+) 서브세트의 백분율은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 CD45RA-, CD45ROlow /+, 및/또는 KLRG1low이고, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포 내 CD45RA-, CD45ROlow /+, 및/또는 KLRG1low 서브세트의 백분율은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 CD45RA low/+, CD45ROlow/+, 및/또는 KLRG1- 이고, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포 내 CD45RA low/+, CD45ROlow /+, 및/또는 KLRG1- 서브세트의 백분율은 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다.
일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 Tcm 세포이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포의 Tcm 서브세트의 백분율은, 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다.
일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 Tscm 세포이거나, 또는 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 배양물의 총 T 세포 또는 총 세포의 백분율로서 배양된 T 세포의 Tscm 서브세트의 백분율은, 적어도 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이다.
일부 구현예에서, T 세포, 예컨대 CD62L+ T 세포의 서브세트는, a) 낮은 수준의 TCR 재배열 절제 서클 (TREC)을 가지거나 나타내고; 및/또는 b) 증식 마커 (예컨대, Ki-67)를 발현하며; 및/또는 c) 자극제의 존재하에서 증식 능력을 나타내고; 및/또는 d) 자극제의 존재하에서 IFN-감마, TNF 및 IL-2 중에서 선택되는 사이토카인을 생산하는 능력을 나타내며; 및/또는 e) 자극제의 부재하에서 감소에 대한 내성 (refractory to attrition)이 없고; 및/또는 f) Tscm, Tcm, Tem, 및 Teff 세포를 생성할 수 있으며; 및/또는 g) 낮은 세포 독성을 가지고; 및/또는 h) TCM 또는 TEM 세포보다 적은 수의 세포의 입양 전달 후에 동일하거나 더 큰 반응을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 항원, 항상성 사이토카인 (예컨대, IL-15 또는 IL-17)이거나, T 세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 개시할 수 있는 시제이다. 일부 구현예에서, 사이토카인을 생성하는 능력은 IFNγ를 생성하는 낮은 능력 및/또는 IL-2를 생성하는 중간 능력을 포함한다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포, 예컨대 본 명세서에 제공되는 임의의 방법에 따라 제조된 배양된 T 세포가 제공되며, 이러한 배양된 T 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 인큐베이션 이후 생성 또는 제조되고, 배양된 T 세포는 기준 T 세포 조성물 또는 제조물과 비교하여 개질된 기능적 활성 프로파일을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 배양물에 존재하는 배양된 T 세포 또는 T 세포의 특정 서브세트는 기준 조성물 또는 제조물과 비교하여, 또는 기준 조성물 또는 제조물 내 T 세포 서브세트와 비교하여 변형된 기능적 활성 프로파일을 나타내며, 예컨대 기능적 활성은 적어도 1.5배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 변형 (예컨대, 증가 또는 감소)된다. 일부 구현예에서, 기능적 활성은 a) 낮은 수준의 TCR 재배열 절제 서클 (TREC); 및/또는 b) 증식 마커 (예컨대, Ki-67)의 발현; 및/또는 c) 자극제의 존재하에서 증식하는 능력; 및/또는 d) 자극제의 존재하에서 IFN-감마, TNF 및 IL-2 중에서 선택되는 사이토카인을 생산하는 능력; 및/또는 e) 자극제의 부재하에서 감소에 대한 내성이 없음; 및/또는 f) Tscm, Tcm, Tem, 및 Teff 세포를 생성할 수 있음; 및/또는 g) 낮은 세포 독성 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자극제는 항원, 항상성 사이토카인 (예컨대, IL-15 또는 IL-17)이거나, T 세포에서 TCR/CD3 복합체 관련 신호를 개시할 수 있는 시제이다. 일부 구현예에서, 사이토카인을 생성하는 능력은 IFNγ를 생성하는 낮은 능력 및/또는 IL-2를 생성하는 중간 능력을 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 서브세트는 배양된 T 세포 내 기억 T 세포, 예컨대 수명이 긴 기억 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 Tscm 세포이다.
일부 구현예에서, 배양물에 존재하는 배양된 T 세포 또는 T 세포의 특정 서브세트는 기준 조성물 또는 제조물에 의해, 또는 기준 조성물 또는 제조물 내 T 세포 서브세트에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 적은 수의 세포의 입양 전달 후 동일하거나 더 큰 반응을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 그러한 반응은 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 적은 수의 세포로 달성된다. 일부 구현예에서, 반응은 증가하거나 적어도 약 2배 (예컨대, 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배 또는 이상 중 어느 하나)로 더 크다.
일부 구현예에서, 배양된 세포의 T 세포 서브세트, 예컨대 전술한 임의의 T 세포 서브세트의 백분율은, GSK-P 저해제의 존재하에서 배양된 T 세포의 제조물 내 세포의 상응하는 서브세트보다, 예컨대 적어도 1.5배 이상, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 그 이상 더 크다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 조성물은 GSK-P 저해제를 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양된 세포의 T 세포 서브세트, 예컨대 상기 기재된 임의의 T 세포 서브세트의 백분율은, 재조합 항상성 사이토카인, 선택적으로 IL-7 또는 IL-15의 존재하에서 인큐베이션된 세포의 상응하는 서브세트보다, 예컨대 적어도 1.5배 이상, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배 또는 그 이상 더 크다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 조성물은 재조합 (예컨대, 외인성) IL-7 사이토카인 또는 재조합 (예컨대, 외인성) IL-15 사이토카인을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 조성물은 본 명세서에 제공된 임의의 방법에 따라 생성되거나 생산되었으며, 여기서 물질, 예컨대 경쟁 시제는 자극제 또는 시제들의 신호 전달을 중단, 예컨대 감소 및/또는 종결시키기 위하여 T 세포에 첨가되었다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 조성물은 경쟁 시제, 예컨대 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴과 같은 물질의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쟁 시제, 예컨대 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴과같은 물질은, 인큐베이션 동안 외인성으로 물질이 첨가되지 않은 배양된 T 세포의 기준 조성물 또는 제조물 내의 물질의 양보다 적어도 1.5배 이상, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 100배 또는 그 이상 더 많은 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 배양된 T 세포의 조성물 내 경쟁 시제, 예컨대 비오틴 또는 비오틴 유사체, 예를 들어 D-비오틴과 같은 물질의 양은 약 10 μM 내지 100 μM, 100 μM 내지 1 mM, 100 μM 내지 500 μM 또는 10 μM 내지 100 μM이다.
IV. 배양된 세포, 항원 수용체 및 유전자 조작된 세포의 유전자 조작 방법
일부 구현예에서, 배양된 세포는 조작된 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 T 세포 수용체 (TCR)와 같은 조작된 항원 수용체를 포함하거나 포함하도록 조작된다. 또한 이러한 세포의 집단, 이러한 세포를 포함 및/또는 이러한 세포가 풍부한 조성물, 예컨대 T 세포, 또는 CD8+ 또는 CD4+ 세포와 같은 특정 유형의 세포가 농축 또는 선택된 조성물이 제공된다. 조성물 중에는 입양 세포 요법과 같은 투여용 약제학적 조성물 및 제형이 있다. 또한, 대상체, 예컨대 환자에게 세포 및 조성물을 투여하는 치료 방법이 제공된다.
이에 따라, 일부 구현예에서, 배양된 세포는 유전자 조작을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함하고, 이로써 그러한 핵산의 재조합 또는 유전자 조작된 산물을 발현한다. 일부 구현예에서, 유전자 도입은 예컨대 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 증식, 생존 및/또는 활성화 등의 반응을 유도하는 자극과 결합하여, 배양된 세포를 먼저 자극함으로써, 뒤이어 활성화된 세포의 형질 도입 및 임상적 적용에 충분한 수의 배양으로의 팽창에 의해 달성될 수 있다.
자극 인자 (예컨대, 림포카인 또는 사이토카인)의 과발현은 대상체에 유독할 수 있다. 이에 따라, 일부 상황에서, 조작된 세포는, 예컨대 입양 면역 요법에서 투여시 세포를 생체 내에서의 음성 선별에 민감성이 되도록 유도하는 유전자 조작을 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 배양된 세포는 조작되어, 투여되는 환자의 생체 내 조건 변화의 결과로 제거될 수 있다. 음성 선별 가능한 표현형은 투여된 시제, 예컨대 화합물에 민감성을 부여하는 유전자의 삽입으로부터 초래될 수 있다. 음성 선별 가능한 유전자는 간시클로비르(ganciclovir) 민감성을 부여하는 단순 헤르페스 바이러스 I형 티미딘 키나제 (HSV-1 TK) 유전자 (Wigler et al., Cell 2: 223,1977); 세포 하이포잔틴 포스프리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자, 세포 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (APRT) 유전자, 박테리아 시토신 데아미나제를 포함한다 (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)). 일부 양태에서, 배양된 세포는 사이토카인 또는 기타 인자의 발현을 촉진하도록 추가로 조작된다.
A. 항원 수용체, 예를 들어 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산
유전자 조작된 세포를 생산하는 방법, 핵산, 조성물 및 키트가 제공된다. 유전자 조작은 일반적으로, 예컨대 레트로바이러스 형질 도입, 트랜스펙션 또는 형질 전환에 의해 배양된 세포를 포함하는 조성물에 재조합 또는 조작된 성분을 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산은 이종성이며, 즉 통상적으로 세포 또는 세포로부터 수득한 샘플, 예컨대 조작된 세포 및/또는 그러한 세포가 유래된 유기체에서 일반적으로 발견되지 않는 기타 유기체 또는 세포로부터 수득한 샘플에 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 핵산은 자연적으로 발생하지 않으며, 예컨대 자연에서 발견되지 않는 핵산은 여러 상이한 세포 유형으로부터의 다양한 도메인을 코딩하는 핵산의 키메라 조합물을 포함한다.
1. 키메라 항원 수용체 (CAR)
세포는 일반적으로 재조합 수용체, 예컨대 기능적 비-TCR 항원 수용체 (예컨대, 키메라 항원 수용체 (CAR)) 및 형질전환 T 세포 수용체 (TCR) 등의 기타 항원-결합 수용체를 비롯한 항원 수용체를 발현한다. 수용체 중에는 또한 기타 키메라 수용체도 있다.
CAR을 비롯한 예시적 항원 수용체, 및 이러한 수용체를 조작하고 세포 내로 도입시키는 방법으로는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061 미국 특허 출원 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 및 유럽 특허 출원 EP2537416에 기재된 수용체 및 방법, 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr . Opin . Immunol ., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 개시된 항원 수용체 및 방법을 포함한다. 일부 양태에서, 항원 수용체로는 미국 특허 7,446,190에 개시된 CAR, 및 국제 특허 출원 공보 WO/2014055668 A1에 개시된 수용체를 포함한다. CAR의 예로는 전술한 공보, 예컨대 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 미국 특허 8,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med . 2013 5(177) 중 어느 하나에 개시된 CAR를 포함한다. 또한 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190, 및 미국 특허 8,389,282를 참조한다. 키메라 수용체, 예컨대 CAR는, 일반적으로 세포 외 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 분자의 일부분, 일반적으로 가변 중쇄 (VH) 영역 및/또는 가변 경쇄 (VL) 영역 of the 항체, 예를 들어, scFv 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 세포 또는 비-표적화된 세포 또는 조직과 비교하여, 질환 또는 증상 세포, 예컨대 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포상에서 발현되고 및/또는 조작된 세포상에서 발현된다.
일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 고아 티로신 키나아제 수용체 RORl, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, 메소텔린, CEA, 및 B형 간염 표면 항원, 항-엽산 수용체, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3, 또는 4, FBP, 태아 아세틸콜린 e 수용체, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13R-알파2, kdr, 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 접합 분자, MAGE-A1, 메소텔린, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, MART-1, gp100, 종양 태아 항원, ROR1, TAG72, VEGF-R2, 암배아 항원 (CEA), 전립선 특이 항원, PSMA, Her2/neu, 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 에프린 B2, CD123, c-Met, GD-2, 및 MAGE A3, CE7, Wilms 종양 1 (wt-1), 사이클린, 예컨대 사이클린 A1 (CCNA1), 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자를 포함한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 특정 구현예에서, 표적 세포는 질병 및/또는 암과 관련된 항원에 결합하는 CAR를 발현한다. 본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 구체적인 구현예에서, 상기 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절두된 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100 (gp100), G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접합 분자 (L1CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 서열 8 패밀리 구성원 A 함유 (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접합 분자 (NCAM), 종양 태아 항원, 종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 오펀 수용체 1 (RORl), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 항원 또는 보편적인 표지(tag)와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자이다.
일부 구현예에서, CAR는 병원체-특이 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, CAR은 바이러스성 항원 (예컨대, HIV, HCV, HBV 등), 박테리아 항원 및/또는 기생 항원에 특이적이다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체 (예컨대, CAR)의 항체 부분은 면역 글로불린 불변 영역, 예컨대 힌지 영역 (예컨대, IgG4 힌지 영역) 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역의 적어도 일부를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 일부분은, 인간 IgG, 예컨대 IgG4 또는 IgG1이다. 일부 양태에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예컨대 scFv와 멤브레인통과 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없는 경우와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이의 것일 수 있다. 예시적 스페이서, 예컨대 힌지 영역은 국제 특허 출원 공보 WO2014031687에 기술된 힌지 영역을 포함한다. 일부 예시에서, 스페이서는 길이가 약 12개의 아미노산이거나 그 이하이다. 예시적 스페이서는 적어도 약 10 내지 229개의 아미노산, 약 10 내지 200개의 아미노산, 약 10 내지 175개의 아미노산, 약 10내지 150개의 아미노산, 약 10 내지 125개의 아미노산, 약 10 내지 100개의 아미노산, 약 10 내지 75개의 아미노산, 약 10 내지 50개의 아미노산, 약 10 내지 40개의 아미노산, 약 10 내지 30개의 아미노산, 약 10 내지 20개의 아미노산 또는 약 10 내지 15개의 아미노산을 가지는 것들, 및 나열된 범위 중 임의의 종점들 사이의 임의의 정수를 포함하는 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 약 12 개 또는 그 이하의 아미노산, 약 119개 또는 그 이하의 아미노산, 또는 약 229개 또는 그 이하의 아미노산을 가진다. 예시적 스페이서는 IgG4 힌지 단독, CH2 및 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지, 또는 CH3 도메인에 연결된 IgG4 힌지를 포함한다.
이러한 항원 인식 도메인은 일반적으로 하나 이상의 세포 내 신호 전달 성분, 예컨대 CAR의 경우 TCR 복합체 등의 항원 수용체 복합체 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호를 통한 활성화를 모방하는 신호 전달 성분에 연결된다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분 (예컨대, 항체)은 하나 이상의 멤브레인통과 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인에 연결된다. 일부 구현예에서, 멤브레인통과 도메인은 세포 외 도메인에 융합된다. 한 구현예에서, 수용체 (예컨대, CAR)의 도메인 중 하나에 자연적으로 결합된 멤브레인통과 도메인이 사용된다. 일부 경우에서, 멤브레인통과 도메인은 동일하거나 상이한 표면 막 단백질들의 막경유 도메인들에 이들 도메인들이 결합하지 않도록 하여, 해당 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 선택되거나 아미노산 치환하여 변형된다.
일부 구현예에서 멤브레인통과 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유도될 수 있다. 천연 공급원인 경우, 도메인은 일부 양태에서 임의의 멤브레인-결합된 또는 멤브레인통과 단백질로부터 유도될 수 있다. 멤브레인통과 영역은 (즉, 적어도 멤브레인통과 영역(들)을 포함하는) T-세포 수용체, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유도된 영역을 포함한다. 택일적으로 멤브레인통과 도메인은 일부 구현예에서 합성이다. 일부 양태에서, 합성 멤브레인통과 도메인은 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함한다. 일부 양태에서, 삼중의 페닐알라닌, 트립토판 및 발린은 합성 멤브레인통과 도메인의 각 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 결합은 링커, 스페이서 및/또는 멤브레인통과 도메인(들)에 의한 것이다.
세포 내 신호 전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동 자극 수용체와 조합하여 그러한 수용체를 통한 신호 및/또는 공동 자극 수용체만을 통한 신호를 모방하거나 이와 비슷한 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대 글리신 및 세린 (예컨대, 이중 글리신-세린)을 포함하는 것과 같은 길이가 2 내지 10개 사이의 아미노산인 링커가 존재하며, 이는 멤브레인통과 도메인과 CAR의 세포질 신호 전달 도메인 사이의 결합을 형성한다.
수용체, 예를 들어, CAR는 일반적으로 적어도 하나의 세포 내 신호 전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체는 TCR 복합체의 세포 내 성분, 예컨대 T 세포 활성화 및 세포 독성을 매개하는 TCR CD3 사슬, 예를 들어, CD3 제타 사슬을 포함한다. 이에 따라, 일부 양태에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 전달 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 전달 모듈은 CD3 멤브레인통과 도메인, CD3 세포 내 신호 전달 도메인 및/또는 기타 CD 멤브레인통과 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예를 들어, CAR는 Fc 수용체 γCD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가적인 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, CAR 또는 기타 키메라 수용체는 CD3-제타 (CD3-ζ또는 Fc 수용체 γ및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 기타 키메라 수용체의 연결시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포 내 신호 전달 도메인은 정상 이펙터 기능 또는 면역 세포, 예를 들어 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예를 들어, 일부 상황에서, CAR은 세포 용해 작용 또는 보조 T 작용, 예컨대 사이토카인 또는 기타 인자의 분비와 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동 자극 분자의 세포 내 신호 전달 도메인의 절두된 부분은, 예컨대 이펙터 기능 신호를 전달하는 경우에 손상되지 않은 면역 자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 양태에서, 항원 수용체 결합 이후 신호 전달을 개시하기 위하여 자연적인 상황에서 그러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동 수용체의 서열도 또한 포함한다.
천연 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호 전달뿐만 아니라 공동 자극 신호도 필요로 한다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 완전한 활성화를 촉진시키기 위하여, 2차 또는 공동 자극 신호를 발생시키는 성분이 또한 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공동 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 추가적인 CAR은 동일한 세포에서 발현되며, 2차 또는 공동 자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
T 세포 활성화는 일부 양태에서 다음의 두 종류의 세포질 신호 전달 서열에 의해 매개되는 것으로 설명된다: TCR을 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 서열 (1차 세포질 신호 전달 서열), 및 2차 또는 공동 자극 신호를 제공하기 위해 항원-독립적인 방식으로 작용하는 서열 (2차 세포질 신호 전달 서열). 일부 양태에서, CAR은 이러한 신호 전달 성분들 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일부 양태에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함한다. 자극하는 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 전달 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 전달 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호 전달 서열을 포함하는 ITAM의 예시로는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CDS, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR의 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 전달 도메인, 이의 일부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 신호 전달 도메인 및/또는 멤브레인통과 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 동일한 CAR은 활성화 및 공동자극 성분을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 또 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 활성화 또는 자극 CAR, 공동자극 CAR을 포함하며, 모두 동일한 세포상에 발현된다 (WO2014/055668 참조). 일부 양태에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 억제 CAR (iCAR, 문헌 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참조), 예컨대 질환-표적화 CAR을 통해 전달된 활성화 신호가 예컨대 오프-표적화 효과를 감소시키기 위해 억제 CAR이 이의 리간드에 결합함으로써 감소하거나 억제되는, 질환 또는 증상과 관련되고 및/또는 질환 또는 증상에 특이적 것 외의 항원을 인식하는 CAR을 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 (예컨대, CD3- 제타) 세포 내 도메인에 연결된 CD28 멤브레인통과 도메인 및 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3 제타 세포 내 도메인에 연결된, 키메라 CD28 및 CD137 (4-1BB, TNFRSF9) 공동자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 하나 이상의, 예컨대 2개 이상의 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대 1차 활성화 도메인을 세포질 부분에 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28 및 4-1BB의 세포 내 성분을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 기타 항원 수용체는 세포 표면 수용체의 절두된 버전, 예컨대 절두된 EGFR (tEGFR)과 같은 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질 도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있는, 세포 표면 마커 등의 마커를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 마커는 CD34, NGFR 또는 상피 성장 인자 수용체 (예컨대, tEGFR)의 전부 또는 일부 (예컨대, 절두된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예컨대 T2A와 같은 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된다. WO2014031687를 참조한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포상에서 자연적으로 발견되지 않거나 T 세포의 표면상에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예컨대 세포 표면 단백질 또는 이의 일부이다.
일부 구현예에서, 분자는 비-자체 분자, 예컨대 비-자체 단백질이며, 즉 세포가 입양 전달될 숙주의 면역 시스템에 의해 "자체"로 인식되지 않는다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않으며 및/또는 예컨대, 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 유전자 조작용 마커로서 사용되는 것 이외의 효과를 발생시키지 않는다. 기타 구현예에서, 마커는 치료용 분자, 또는 그렇지 않으면 입양 전달 및 리간드와의 접촉시 세포의 반응을 증강 및/또는 감쇠시키기 위한 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은, 생체 내에서 접촉하게 될 세포에 대한 리간드 등의 원하는 효과를 발휘하는 분자일 수 있다.
일부 경우에서, CAR은 제1, 제2 및/또는 제3 세대 CAR로 지칭된다. 일부 양태에서, 제1 세대 CAR은 항원 결합시 단독으로 CD3-사슬 유도 신호를 제공하는 것이고; 일부 양태에서, 제2 세대 CAR은 CD28 또는 CD137 등의 공동자극 수용체로부터의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 양태에서, 제3 세대 CAR은 상이한 공동자극 수용체의 여러 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 양태에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 세포 외 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함하고, 세포 내 도메인은 ITAM을 포함한다. 일부 양태에서, 세포 내 신호 전달 도메인은 CD3-제타 (CD3ζ사슬의 제타 사슬의 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 도메인 및 세포 내 신호 전달 도메인을 연결하는 멤브레인통과 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, 멤브레인통과 도메인은 CD28의 멤브레인통과 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포 내 도메인을 포함한다. 일부 양태에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 상호 교환 적으로 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 제공된 수용체 및 기타 폴리펩타이드 (예컨대, 링커 또는 펩타이드)를 비롯한 폴리펩타이드는, 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 비롯한 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예컨대 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함한다. 일부 양태에서, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 나이브 또는 천연 서열에 대한 조작을 포함할 수 있다. 이러한 조작은 부위 특이적 돌연변이 유도를 통한 것과 같이 의도적일 수 있고, 또는 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이나 PCR 증폭으로 인한 오류를 통한 것과 같이 우연적일 수 있다.
일부 구현예에서, 연속된 투여량의 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, CAR는 제1 투여량의 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, CAR로서 적어도 하나의 면역 반응성 에피토프를 포함한다. 일부 양태에서, 연속된 투여량으로 투여된 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, CAR는 제1 투여량에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, CAR와 동일하거나, 제1 투여량으로 투여된 세포에 의해 발현되는 수용체, 예를 들어, CAR와 실질적으로 동일하다.
대상체에 다양한 투여량으로 투여된 세포에 의해 발현되는 재조합 수용체, 예를 들어, CAR는 일반적으로 치료되는 질환 또는 증상 또는 세포에서 발현되고, 이와 관련되며 및/또는 이에 특이적인 분자를 인식하거나 분자에 특이적으로 결합한다. 분자, 예컨대 항원에 특이적으로 결합시, 수용체는 일반적으로 ITAM-형질 도입 신호와 같은 면역 자극 신호를 세포 내로 전달함으로써, 질환 또는 증상을 표적으로 하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 투여량의 세포는 질환 또는 증상을 가지거나 질환 또는 증상과 관련된 세포 또는 조직에 의해 발현되는 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
2. TCR
일부 구현예에서, 유전자 조작된 항원 수용체는 재조합 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 자연 발생 T 세포로부터 클로닝된 TCR을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 항원 (예컨대, 암 항원)에 대한 고-친화성 T 세포 클론은 동정되고, 환자로부터 단리되며, 세포 내로 도입된다. 일부 구현예에서, 표적 항원에 대한 TCR 클론은 인간 면역 시스템 유전자 (예컨대, 인간 백혈구 항원 시스템, 즉 HLA)로 조작된 형질전환 마우스에서 생성되었다. 예를 들어, 종양 항원은 (예를 들어, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 및 Cohen et al. (2005) J Immunol . 175:5799-5808을 참조한다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, 파지 디스플레이는 표적 항원에 대한 TCR을 단리하는데 사용된다 (예를 들어, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med . 14:1390-1395 및 Li (2005) 　Nat Biotechnol . 23:349-354 참조).
일부 구현예에서, T 세포 클론이 수득된 후, TCR 알파 및 베타 사슬은 단리되고 유전자 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 구현예에서, TCR 알파 및 베타 유전자는 피코르나바이러스 2A 리보솜 스킵 펩타이드를 통해 연결되어 양 사슬이 동시 발현일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR의 유전적 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 통해 또는 트랜스포존을 통해 수행된다 (예를 들어, Baum et al. (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063; Frecha et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757; an Hackett et al. (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683 참조.
3. 다중- 표적화
일부 구현예에서, 상기 세포 및 방법은 세포 상에 2개 이상의 유전자 조작된 수용체의 발현과 같은 다중 표적화 전략을 포함하며, 각각은 상이한 항원의 동일한 것을 인식하고 전형적으로 각각은 상이한 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 이러한 다중 표적화 전략은 예컨대, 국제 특허 출원 공보 WO 2014055668 A1 (예컨대, 오프-표적 (예컨대, 정상 세포)상에 개별적으로 존재하지만 치료하고자 하는 질환 또는 증상 세포에서만 함께 존재하는, 2개의 상이한 항원을 표적으로 하는 활성화 및 공동자극 CAR의 조합을 기술함) 및 문헌 Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) (활성화 및 억제 CAR을 발현하는 세포들, 예컨대 활성화 CAR은 정상 또는 비-질환성 세포 및 치료될 질환 또는 증상 세포 모두에서 발현되는 하나의 항원에 결합하고, 억제 CAR은 정상 세포 또는 치료를 원하지 않는 세포상에서만 발현되는 또 다른 항원에 결합하는 것인 세포들을 기술함)에 기술되어 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제1 수용체에 의해 인식되는 항원 (예컨대, 제1 항원)에 특이적으로 결합시, 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있는 제1 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)를 발현하는 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 일반적으로 제2 수용체에 의해 인식되는 제2 항원 항원에 특이적으로 결합시, 면역 세포에 공동자극 신호를 유도할 수 있는 제2 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR), 예컨대 키메라 공동자극 수용체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 항원 및 제2 항원은 상이하다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 유전자 조작된 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)는 세포에 활성화 신호를 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 수용체에 의해 유도된 활성화는 신호 전달 또는 세포 내 단백질 발현의 변화를 포함하고, 이는 면역 반응의 개시, 예컨대 ITAM 인산화 및/또는 ITAM-매개 신호 전달 캐스케이드의 개시, 면역 시냅스의 형성 및/또는 결합된 수용체 (예컨대, CD4 또는 CD8) 근처 분자의 클러스터링, NF-κ및/또는 AP-1과 같은 하나 이상의 전자 인자의 활성화, 및/또는 사이토카인과 같은 인자의 유전자 발현, 증식 및/또는 생존의 유도를 초래한다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 CD28, CD137 (4-1BB), OX40 및/또는 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 수용체는 상이한 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 수용체는 CD28 공동자극 신호 전달 영역을 포함하고, 제2 수용체는 4-1BB 공동자극 신호 전달 영역을 포함하며, 또는 그 반대이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인 및 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 모두 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 수용체는 ITAM 또는 ITAM-유사 모티프를 포함하는 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하고, 제2 수용체는 공동자극 수용체의 세포 내 신호 전달 도메인을 포함한다. 동일한 세포에서 유도된 활성화 신호와 조합하여 공동자극 신호는 면역 반응, 예컨대 증가된 유전자 발현, 사이토카인 및 기타 인자들의 분비 및 세포 살해와 같은 T 세포 매개 이펙터 기능 등의 강력하고 지속적인 면역 반응을 야기하는 신호이다.
일부 구현예에서, 제1 수용체의 결찰 단독으로 또는 제2 수용체의 결찰 단독으로는 모두 강력한 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 양태에서, 오직 하나의 수용체만이 결찰된다면, 세포는 항원에 내성을 가지거나 무반응성이 되거나 억제되고, 및/또는 인자를 증식 또는 분비하거나 이펙터 기능을 수행하도록 유도되지 않는다. 그러나, 일부 그러한 구현예에서, 제1 및 제2 항원을 발현하는 세포의 만남과 같이 다수의 수용체가 결찰될 때, 예컨대 하나 이상의 사이토카인의 분비, 증식, 지속 및/또는 표적 세포의 세포 독성 살해와 같은 면역 이펙터 기능의 수행에 의해 지시되는 바와 같이, 완전 면역 활성화 또는 자극 등의 원하는 반응이 달성된다.
일부 구현예에서, 두 수용체는 각각 세포에 대한 활성화 및 억제 신호를 유도하여, 수용체 중 하나에 의한 이의 항원에 대한 결합은 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만, 두 번째 억제 수용체에 의한 이의 항원에 대한 결합은 반응을 억제하거나 감쇠시키는 신호를 유도한다. 예시로는 활성화 CAR과 억제 CAR, 즉 iCAR의 조합이 있다. 이러한 전략은 예컨대, 활성화 CAR은 질환 또는 증상에서 발현되지만 정상 세포에서도 발현되는 항원과 결합하고, 억제 수용체는 정상 세포에서 발현되지만 질환 또는 증상의 세포에서는 발현되지 않는 별도의 항원과 결합하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 다중 표적화 전략은 특정 질환 또는 증상과 관련된 항원이 비-질환 세포상에서 발현되는 경우 및/또는 일시적으로 (예컨대, 유전자 조작과 관련된 자극시) 또는 영구적으로 조작된 세포 자체에서 발현되는 경우 사용된다. 이러한 경우, 2개의 분리된 개별 항원 수용체의 결찰을 필요로 함으로써, 특이성, 선택성 및/또는 효능이 개선될 수 있다.
일부 구현예에서, 다수의 항원, 예컨대 제1 및 제2 항원은 세포, 조직, 또는 암세포와 같이 표적화되는 질병 또는 증상 세포상에서 발현된다. 일부 양태에서, 세포, 조직, 질병 또는 증상 세포는 다발성 골수종 또는 다발성 골수종 세포이다. 일부 구현예에서, 다수의 항원 중 하나 이상은 일반적으로 정상 또는 비-질환 세포 또는 조직, 및/또는 조작된 세포 자체와 같은 세포 요법으로 표적화하는 것이 바람직하지 않은 세포상에서 또한 발현된다. 이러한 구현예에서, 세포의 반응을 달성하기 위해 다수의 수용체의 결찰을 필요로 함으로써, 특이성 및/또는 효능이 달성된다.
B. 유전자 조작을 위한 벡터 및 방법
유전자 조작된 성분, 예컨대 항원 수용체 (예컨대, CAR 또는 TCR)의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적 방법에는 바이러스, 예컨대 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 형질 도입, 트랜스포존 및 일렉트로포레이션 등을 통한 수용체를 코딩하는 핵산의 전달 방법들이 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예컨대 시미안 바이러스 40 (SV40), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (AAV) 등으로부터 유래된 벡터를 사용하여, 배양된 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포로 전달된다 (예를 들어, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 몰로니 쥐과 백혈병 바이러스 (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스 (MPSV), 쥐과 배아 줄기 세포 바이러스 (MESV), 쥐과 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 비장 병소 형성 바이러스 (SFFV) 또는 아데노 연관 바이러스 (AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터와 같은 긴 말단 반복 서열 (LTR)을 가진다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐과의 레트로바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 조류 또는 포유류 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 레트로바이러스는 전형적으로 양친매성이며, 이는 인간을 비롯한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 구체적인 레트로바이러스 시스템은 기술되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; 및 Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109 참조.
렌티바이러스 형질 도입 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은, 예를 들어, Wang et al. (2012) J. Immunother . 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol . 506: 97-114; 및 Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 일렉트로포레이션을 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T 세포에 전달된다 (예를 들어, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입하고 발현시키는 기타 방법들은 칼슘 포스페이트 트랜스펙션 (예컨대, 문헌 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기재된 트렌스펙션), 원형질 융합, 양이온성 리포좀 매개 트랜스펙션; 텅스텐 입자-촉진 미세 입자 충격 (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동 침전 (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 코딩하는 핵산의 전달을 위한 기타 접근법 및 벡터는, 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO2014055668, 및 미국 특허 7,446,190에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대 T 세포는 팽창 도중 또는 팽창 후에 T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메라 항원 수용체 (CAR)로 트랜스펙션될 수 있다. 원하는 수용체 유전자의 도입을 위한 이러한 트랜스펙션은, 예컨대 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터로 수행될 수 있다. 유전자 조작된 세포 집단은 초기 자극 (예컨대, CD3/CD28 자극)으로부터 유리된 후, 이어서 제2 유형의 자극, 예컨대 새로 (de novo) 도입된 수용체를 통한 자극으로 자극될 수 있다. 이러한 제2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자, 유전적으로 도입된 수용체의 동족 (교차 결합) 리간드 (예컨대, CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에서 (예컨대, 수용체 내의 불변 영역을 인식함으로써) 직접 결합하는 임의의 리간드 (예컨대, 항체) 형태의 항원 자극을 포함할 수 있다. 예를 들어, “antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)를 참조한다.
추가적인 핵산, 예컨대 도입 유전자 중에는 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진시킴으로써 치료의 효능을 개선시키는 것; 생체 내 생존 또는 국소화를 평가하는 것과 같은 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 문헌 Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)에 기재된 바와 같이 세포가 생체 내 음성 선별에 민감성을 갖도록 함으로써 안정성을 개선시키는 유전자가 있으며, 예컨대 우성 양성 선택 마커와 음성 선별 마커를 융합시킴으로써 유래된 이작용성 선택 융합 유전자의 용도를 기술하고 있는 Lupton 등의 공보 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601도 참조한다. 예를 들어, Riddell et al의 미국 특허 6,040,177 중 14-17 열을 참조한다.
일부 경우에서, 세포, 예컨대 T 세포가 활성화될 것을 필요로 하지 않는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에서, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질 도입될 수 있다. 이에 따라, 세포는 본 명세서에 기술된 바와 같은 세포의 배양 단계에 선행하여, 또는 배양 단계 후에, 경우에 따라 배양 단계와 동시에 또는 배양 단계의 적어도 일부 기간 동안에 조작될 수 있다. 일부 구현예에서, 조작될 세포는 배양된 세포이거나, 일부 경우에서 세포는 본 명세서에 기술된 배양 단계를 수행하기 전에 형질 도입될 수 있다.
C. 세포 형질도입 방법
일부 구현예에서, 바이러스를 세포 내로 전달하는 방법은 임의의 제공된 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인) 시약을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 제공된 형질도입 방법에 따라 사용되는 올리고머 단백질 시약은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 세포는 세포 치료, 예를 들어, 입양 세포 치료에 사용하기 위한 예컨대 자가 또는 동종 전달을 위해 제조된 1차 세포이다. 일부 구현예에서, 시약은 또한 조작된 세포 조성물의 제조와 관련된 하나 이상의 다른 가공 단계, 예컨대 세포의 선택 또는 조절, 활성화 및/또는 자극 중 하나 이상의 단계를 용이하게 하는 방법에서 이용될 수 있다. 상기 방법은 추가의 세포 가공 단계, 예컨대 세포 세척, 단리, 분리, 제형화 또는 세포 조성물의 제조와 관련된 다른 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 바이러스 벡터 입자, 예컨대 레트로바이러스 벡터 입자를, 세포, 예컨대 T 세포를 비롯한 면역 세포 내로 도입하도록 사용된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 항원 수용체, 예컨대 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 형질전환 T 세포 수용체 (TCR)를 코딩하는 핵산을 포함하는 게놈을 가진다. 그러므로, 일부 구현예에서, 제공된 방법은 면역 세포, 예컨대 T 세포에서, 유전자 조작된 항원 수용체, 예컨대 형질전환 TCR 또는 CAR를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 또한 이러한 입자에 의해 형질도입된 세포 및 이러한 세포를 포함하는 조성물 및 방법, 및 이의 사용 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자 및 방법은 입양 면역요법에서 사용하기에 바람직한 면역 세포 및/또는 특정 집단 및/또는 이의 부분집단의 형질도입을 증가시키는 특징을 포함한다. 제공된 형질도입 방법 및 바이러스 벡터 입자의 일부 구현예에서, 형질도입되는 집단에서 세포, 예를 들어, T 세포는 세포와 제공된 레트로바이러스 벡터 입자의 접촉 또는 인큐베이션 이전 및/또는 이와 함께 자극 및/또는 활성화되지 않으며, 될 필요가 없다.
a. 세포와 바이러스 벡터 입자의 인큐베이션
일부 구현예에서, 제공된 방법은 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물 (본 명세서에서 “인풋 조성물”로도 불림)을 (1) 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약 및 2) 바이러스 입자와 접촉, 예를 들어 인큐베이션함으로써, 세포를 형질도입하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 시약 및 바이러스 입자와 동시에 또는 순차적으로 혼합시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 바이러스 입자와 시약을 함께 미리 혼합한 후, 세포 조성물을 시약과 관련된 바이러스 입자의 혼합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 30 분 내지 72 시간, 예컨대 30 분 내지 48 시간, 30 분 내지 24 시간 또는 1 시간 내지 24 시간, 예컨대 약 적어도 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 36 시간 이상이다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, (i) 인큐베이션 단계는 표적 세포를 시약과 혼합, 및/또는 표적 세포를 바이러스 입자와 혼합하는 단계를 어떠한 순서로든, 순차적으로 포함하며, 선택적으로 (a)의 혼합 및 (b)의 혼합은 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 또는 72 시간을 초과하지 않는 기간 내에 수행되며 및/또는 (a)의 혼합은 (b)의 혼합과 별개로 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 수행되고; (ii) 인큐베이션 단계는 표적 세포, 시약, 및 바이러스 입자를 혼합하는 단계를 포함하며, 상기 혼합 동시에 또는 실질적으로 동시에 수행되고; (iii) 인큐베이션 단계는 표적 세포 및 바이러스 입자를 포함하지만, 시약을 포함하지 않는 조성물을 혼합하는 단계를 포함하며, 선택적으로: 표적 세포 및 시약을 포함하는 조성물 내 표적 세포의 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 또는 40 % 미만은 활성화된 세포이며, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB으로 구성된 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현시키고; IL-2, IFN감마, TNF-알파로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현을 포함하고, 및/또는 증식시킬 수 있고; 및/또는 조성물 내 표적 세포 및 바이러스 입자의 혼합 이후 혼합 단계는 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 수행되고; (iv) 인큐베이션 단계는 표적 세포 및 시약을 포함하지만, 바이러스 입자를 포함하지 않는 조성물과, 바이러스 입자를 혼합하는 단계를 포함하며, 선택적으로: 표적 세포 및 시약을 포함하는 조성물 내 표적 세포의 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 또는 40 % 미만은 활성화된 세포이며, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB으로 구성된 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현시키고; IL-2, IFN감마, TNF-알파로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현을 포함하고, 및/또는 증식시킬 수 있고; 및/또는 혼합 단계는 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 수행되고; 및/또는 (v) 인큐베이션 단계는 바이러스 입자 및 시약을 포함하는 조성물과 표적 세포를 포함하지만 바이러스 입자 및/또는 시약을 포함하지 않는 조성물을 혼합하는 단계를 포함하며, 선택적으로: 표적 세포 및 시약을 포함하는 조성물 내 표적 세포의 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 또는 40 % 미만은 활성화된 세포이며, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및 4-1BB의 표면 마커로 구성된 군으로부터 선택된 표면 마커를 발현시키고; IL-2, IFN감마, TNF-알파로 구성된 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포 내 발현을 포함하거나, 및/또는 증식시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 단계는 세포를 시약과, 및 바이러스 입자와, 동시에 또는 어떤 순서로든지 순차적으로 혼합하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 단계의 적어도 일부 동안, 시약 및 바이러스 입자는 세포와 동시에 존재하거나 또는 세포와 동시에 접촉된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 (a) 바이러스 입자를 올리고머 단백질 시약과 접촉시켜, 바이러스 입자 및 시약을 포함하는 조성물을 생성하는 단계로서, 이러한 바이러스 입자는 선택적으로 시약과 관련되는 단계; 및 (b) (a)의 조성물을 표적 세포를 포함하는 복수의 세포와 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 하나 이상의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 바이러스 입자 및 올리고머 단백질 시약을 포함하는 조성물을 표적 세포를 포함하는 복수의 세포와 혼합하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 하나 이상의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 (a) 바이러스 입자를 스트렙타비딘 또는 뮤테인 또는 임의의 전술한 생물학적 활성 단편을 포함하는 올리고머 단백질 시약, 및/또는 임의의 전술한 다중 서브유닛과 접촉시켜, 바이러스 입자 및 시약를 포함하는 조성물을 생성하는 단계로서, 이러한 바이러스 입자는 선택적으로 시약과 관련되는 단계; 및 (b) (a)의 조성물을 복수의 세포와 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 하나 이상의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 바이러스 입자 및 단백질 시약을 포함하는 조성물을 표적 세포를 포함하는 복수의 세포와 혼합하는 단계로서: 이러한 단백질 시약은 스트렙타비딘, 아비딘, 스트렙타비딘 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체, 뮤테인 또는 임의의 전술한 생물학적 활성 단편, 및/또는 임의의 전술한 다중 서브유닛을 포함하는 단계를 포함하며; 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 하나 이상의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 시약 및/또는 단량체 유닛 각각 및/또는 다합체 유닛 각각은, 순 양전하 또는 전체 양전하를 가진다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 표적 세포를 포함하는 복수의 세포를 다음과 인큐베이션하는 단계를 포함한다: 1) 결합제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 올리고머 단백질 시약, 여기서 하나 이상의 결합 부위는 결합제에 가역적으로 결합된 시약; 및 2) 바이러스 입자, 여기서 (1)에서의 인큐베이션의 적어도 일부는 (2)와 동시에 일어나며, 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 하나 이상의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 (1) (a) 하나 이상의 바이러스 입자를 포함하는 조성물 및 (b) 바이러스-결합제인 결합제를 접촉시키는 단계로서, 이러한 결합제는 (i) 바이러스 입자의 표면 상의 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, ii) 바이러스-결합제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약에 가역적으로 결합되며; 및 (2) 하나 이상의 바이러스 입자의 존재하에 적어도 표적 세포를 포함하는 복수의 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하며, (1)의 접촉 단계 및 (2)의 인큐베이션 단계는 동시에 또는 어떠한 순서로든 순차적으로 수행되며, 상기 방법은 바이러스 입자로 형질도입된 복수의 세포를 포함하는 아웃풋 조성물을 생성한다.
본 명세서에 제공되는 임의의 방법의 일부 구현예에서, (1)의 접촉 단계 및 (2)의 인큐베이션 단계는 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 또는 72 시간을 초과하지 않는 기간 내에 수행되며 및/또는 (a)의 혼합은 (b)의 인큐베이션과 별개로 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 수행된다.일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 재조합 항원 수용체, 선택적으로 키메라 항원 수용체를 코딩하는 게놈을 포함한다.
형질도입 단계 동안 바이러스 벡터 입자 및 세포를 포함하는 조성물은 하나 이상의 추가의 시제, 예컨대 형질도입 효율을 촉진하기 위한 시제, 예컨대 프로타민 (예를 들어 프로타민 설페이트), 헥사다이메트린 브로마이드 (POLYBRENE®Abbott Laboratories Corp), 및 CH-296 (RETRONECTIN®Clontech)를 포함하는 다가양이온을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 다가양이온은 인풋 조성물 내에 1 μg/mL 내지 100 μg/mL, 예컨대 5 μg/mL 내지 50 μg/mL의 최종 농도로 존재할 수 있다. 조성물은 또한 예를 들어 무혈청 배지 등 조혈줄기세포 배지와 같은, 가공하고자 하는 세포 유형의 배양을 위해 설계된 배지를 비롯한 세포 배양 배지를 포함하는 배지를 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, 인풋 조성물 중 세포의 농도는 약 1.0 x 105 세포/mL 내지 1.0 x 108 세포/mL, 예컨대 적어도 약 1.0 x 105 세포/mL, 5 x 105 세포/mL, 1 x 106 세포/mL, 5 x 106 세포/mL, 1 x 107 세포/mL, 5 x 107 세포/mL 또는 1 x 108 세포/mL이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는 인풋 조성물 내 전체 세포 수 (IU/세포) 또는 형질도입될 전체 세포 수 당 바이러스 벡터 입자 또는 이의 감염 단위 (IU)의 특정 비율의 카피로 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 접촉 단계 동안 바이러스 입자는 세포 하나 당 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 IU의 바이러스 벡터 입자로 존재한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 약 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 약 5 x 10 6 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x107 IU/mL이다.
일부 구현예에서, 형질도입은 100 미만의 다수의 감염 (MOI), 예컨대 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하의 감염으로 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 접촉 단계는 용액에서, 예컨대 가용성 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약 또는 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약을 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 세포, 올리고머 시약 및 바이러스 입자는 약 0.5 mL 내지 500 mL의 부피로, 예컨대 약 0.5 mL 내지 200 mL, 0.5 mL 내지 100 mL, 0.5 mL 내지 50 mL, 0.5 mL 내지 10 mL, 0.5 mL 내지 5 mL, 5 mL 내지 500 mL, 5 mL 내지 200 mL, 5 mL 내지 100 mL, 5 mL 내지 50 mL, 5 mL 내지 10 mL, 10 mL 내지 500 mL, 10 mL 내지 200 mL, 10 mL 내지 100 mL, 10 mL 내지 50 mL, 50 mL 내지 500 mL, 50 mL 내지 200 mL, 50 mL 내지 100 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 200 mL 또는 200 mL 내지 500 mL의 부피로 접촉된다.
일부 구현예에서, 접촉 단계가 용액에서, 예를 들어 가용성 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약을 사용하여 수행되는 경우, 접촉 단계는 접촉의 적어도 일부가 원심분리, 예컨대 회전 접종 (예를 들어 원심분리적 접종)로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 포함하넌 조성물은 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속력으로, 예컨대 세포를 펠릿화하기 위해 사용되는 속도보다 낮은 속도, 예컨대 약 600 rpm 내지 1700 rpm (예를 들어 약 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 예를 들어 챔버 또는 캐비티의 내벽 또는 외벽에서 측정된 약 100 g 내지 3200 g (예를 들어 적어도 약 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g), 예를 들어, 상대적 원심력과 같은 힘으로 수행된다. "상대적 원심력" 또는 RCF라는 용어는 일반적으로 회전축과 비교하여 공간 내 특정 지점에서, 지구 중력에 상대적으로, 객체 또는 물질 (예컨대 회전되는 챔버 또는 기타 컨테이너 내의 세포, 샘플, 또는 펠렛 및/또는 지점)에 가해지는 유효력으로 이해된다. 이러한 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경 (RCR가 측정되는 위치의 객체, 물질 또는 입자와 회전축 간의 거리)을 고려하여 공지된 공식을 이용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 지지체에 결합되지 않으며, 예컨대 고체 표면 또는 고정상에 결합되지 않는다.
일부 구현예에서, 올리고머 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 지지체, 예컨대 고체 표면 또는 고정상 상에 고정된다. 일부 구현예에서, 접촉 단계는 고정상에서, 예컨대 크로마토그래피 매트릭스를 사용하여 수행되며, 이러한 고정상에 단백질 (스트렙타비딘 뮤테인), 예컨대 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약이 고정된다. 제공된 방법과 관련하여 사용하기 위한 예시적인 형식은 본 명세서에 기재되어 있다. 이에 따라, 일부 구현예에서, 온-컬럼 형질도입이 제공된 방법에 따라 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포와 접촉되는 인풋 조성물은 활성화된 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 인풋 조성물 내 세포, 예를 들어 T 세포의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 활성화되며, 예컨대, 일부 경우에, HLA-DR, CD25, CD69, CD71, CD40L 및/또는 4-1BB 중 하나 이상에 대해 표면 양성이다. 일부 구현예에서, 세포는 활성화제를 사용하여, 예컨대 항-CD3/항-CD28의 존재하에, 접촉 개시 이전에, 예를 들어 형질도입의 개시 이전에 활성화된다. 외인성 성장 인자가 부재하거나 또는 소량의 외인성 성장 인자 하에서 시험관 내 T 세포 집단의 팽창 방법은 기술 분야 내에 공지되어 있다(예를 들어 미국 특허 6,352,694 B1 및 유럽 특허 EP 0 700 430 B1 참조). 일반적으로, 이러한 방법은 다양한 결합제 (예를 들어 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체)가 고정되어 있는, 1 μm 초과의 고체 상 표면을 사용한다. 예를 들어, Dynabeads®CD3/CD28 (Invitrogen)은 T 세포 팽창을 위하여 상업적으로 입수 가능한 시약이며, 인간 T 세포상의 CD3 및 CD28 세포 표면 분자에 대하여 친화 정제된(affinity purified) 단일클론 항체의 혼합물로 코팅된 균일한, 4.5 μm의, 초상자성, 멸균, 비발열성 폴리스타이렌 비드이다. 일부 구현예에서, 활성화제, 예를 들어 항-CD3 및/또는 항-CD28는 비드, 예컨대 자성 비드 상에 고정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 활성화 단계는 또한 IL-2 (예를 들어 약 50 IU/mL 내지 200 IU/mL, 예컨대 또는 약 100 IU/mL)의 존재하에 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화 단계는 약 1 시간 내지 96 시간, 1 시간 내지 72 시간, 1 시간 내지 48 시간, 4 시간 내지 36 시간, 8 시간 내지 30 시간 또는 12 시간 내지 24 시간, 예컨대 적어도 약 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간 또는 72 시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 활성화 단계는 약 25 º초과의 온도, 예컨대 일반적으로 약 32 º35 º또는 37 º초과, 예를 들어 약 37 º± 2 º예컨대 약 37 º의 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 활성화제를 사용하여, 예컨대 항-CD3/항-CD28의 존재하에, 접촉 개시 이전에, 예를 들어 형질도입의 개시 이전에 활성화되지 않는다. 일부 구현예에서, 세포와 접촉되는 인풋 조성물은 복수의 휴지 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 집단 내 T 세포의 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상은 세포 주기의 G0 또는 G0G1a 단게에 있는 휴지 T 세포, 예컨대 T 세포 활성화 마커, 예컨대 표면 마커 또는 세포 내 사이토카인 또는 다른 마커를 가지지 않는 T 세포, 및/또는 T 세포이다.
특히 양태, 제공된 방법은 올리고머 단백질 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약과 접촉하기 전 및/또는 인큐베이션 전에 활성화할 필요 없이 T 세포에서 형질도입이 일어날 수 있게 한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 제공된 방법에 따라, 먼저, 즉, 형질도입 이전에, T 세포를 활성화 및/또는 자극하지 않고, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘) 시약의 존재하에 휴지 또는 나이브 T 세포를 포함하는 T 세포 집단을 바이러스 벡터로 형질도입하는 단계를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 제공된 방법은 T 세포 활성 및/또는 자극 단계를 포함하지 않는 입양 요법을 위한 면역 세포, 예컨대 T 세포를 제조하도록 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예컨대 스트렙타비딘 뮤테인)은 네이키드이다.
일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인)은 표적 세포 (예를 들어 T 세포) 표면 상의 분자에 또는, 일부 경우에, 조성물 내 바이러스 입자의 표면 상에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합제에 결합된 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이다. 일부 구현예에서, 결합제는 시제에 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 포함하는 시약에 가역적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 단계는 시제가 세포 또는 바이러스 입자 상의 분자에 결합, 예컨대 특이적으로 결합하는 조건하에서 수행된다. 상기 기재된 일부 구현예에서, 올리고머 시약은 가역적으로 고정된 (결합된) 시제 또는 시제 (예를 들어 제1 또는 제2 또는 제3, 등)를 가지며, 이러한 시제는 수용체-결합제, 예를 들어 자극제 또는 액세서리 시제, 선별제 또는 바이러스-결합제를 포함할 수 있으며, 세포의 선별, 자극, 팽창 및/또는 분화 또는 세포의 형질도입 조절을 위해 사용될 수 있다.
일부 경우에, 특정 수용체-결합제 (예를 들어 자극제 또는 액세서리 시제)에 대하여, 이러한 결합은 조성물 내 표적 세포 (예를 들어 T 세포)에서 신호, 예컨대 상기 기재된 1차 신호 또는 액세서리 신호를 유도 또는 조절할 수 있다. 일부 구현예에서, 시제가 분자에 결합하면 조성물 내 표적 세포의 자극, 활성화, 팽창 (증식) 및/또는 분화 중 하나 이상을 야기한다. 일부 구현예에서, 시약은 세포에 1차 활성화 신호를 제공하는 자극제를 포함하며, 이러한 자극제는 적어도 하나의 결합 파트너 C (예를 들어 C1, C2 또는 C3, 등)를 포함하고, 이러한 결합 파트너 C는 시제의 가역적 결합을 위한 올리고머 시약의 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 세포에 액세서리 신호를 제공하는 액세서리 시제를 포함하며, 이러한 액세서리 시제는 적어도 하나의 결합 파트너 C (예를 들어 C1, C2 또는 C3, 등)를 포함하고, 이러한 결합 파트너 C는 시제의 가역적 결합을 위한 올리고머 시약의 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 시약은 특정 세포 표면 분자 또는 마커에 대한 결합을 특이적으로 표적화하는 선별제를 포함하며, 선별제는 적어도 하나의 결합 파트너 C (예를 들어 C1, C2 또는 C3, 등)을 포함하고, 이러한 결합 파트너 C는 시제의 가역적 결합을 위한 올리고머 시약의 결합 부위 Z1에 가역적으로 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 인풋 조성물 내 세포 활성화는 인풋 조성물의 세포와 올리고머 단백질 시약 및/또는 바이러스 입자와 접촉하는 동안 개시된다. 이러한 예시에서, 올리고머 단백질 시약은 세포, 예컨대 T 세포에서 신호를 유도 또는 조절할 수 있는 수용체 결합제, 예를 들어 자극제 및/또는 액세서리 시제를 시약 상에 고정시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 자극제는 MHC I:펩타이드 복합체 또는 이의 기능적 부분, MHCII:펩타이드 복합체 또는 이의 기능적 부분을 포함할 수 있고, 및/또는 T 세포 내 TCR/CD3 복합체, T 세포 내 D3-함유 복합체, 및/또는 T 세포 내 TAM-함유 분자를 통해 자극 신호를 전달할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 시약은 세포, 예컨대 T 세포에 액세서리 신호를 제공할 수 있는 악세서리 시제를 시약 상에 고정시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 수용체 결합제, 예를 들어 자극제 및/또는 액세서리 시제는 본 명세서에 기재된 임의의 시제, 예컨대 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 (예를 들어 Fab)이다. 택일적으로, 자극제로서 리간드, 예컨대 세포 팽창을 유발하는 수용체의 천연 리간드를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들어, CD19의 세포 외 도메인은 키메라 CD19 결합 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 형질 도입된 세포의 세포 내 신호 전달 캐스케이드 활성화를 일으키는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘) 시약은 접촉 및, 선택적으로 추가의 인큐베이션 동안 세포 형질도입을 조절하고 세포를 활성화, 예컨대 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시제를 포함하는 올리고머 시약의 결합은 예컨대 경쟁 시제, 예를 들어 비오틴의 존재하에 가역적이다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포의 특정 집단 예컨대 B 세포, T 세포 또는 자연 살해 세포의 및/또는 생체 외 팽창을 선택적으로 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이며 이러한 시약은 형질도입 조절에 사용되는 동일한 시약에 가역적으로 결합된 적어도 하나의 선별제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 (예를 들어 스트렙타비딘 뮤테인) 시약은 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약이며, 이러한 시약은 동일한 시약 상에 제1 또는 제2 수용체 결합제 (예를 들어 자극제 또는 액세서리 시제) 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘) 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은, 세포 형질도입을 조절하고, 우선적으로 표적 선별된 또는 표적화된 세포의 특정 부분집단에 형질도입을 우선적으로 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 단백질 (예를 들어 스트렙타비딘) 시약, 예컨대 하나 이상의 시제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 세포 형질도입을 조절하고, 우선적으로 표적 선별된 또는 표적화된 세포의 특정 부분집단에 형질도입을 우선적으로 표적화하고, 접촉 및, 선택적으로 추가의 인큐베이션 동안 세포 형질도입을 조절하고 세포를 활성화, 예컨대 자극할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제, 예를 들어 선별제 및/또는 자극제를 포함하는 올리고머 시약의 결합은 예컨대 경쟁 시제, 예를 들어 비오틴의 존재하에 가역적이다. 하기 기재된 바와 같이, 일부 양태에서, 상기 방법은 세포, 바이러스 입자 및 올리고머 시약 (예를 들어 하나 이상의 결합제에 결합된 다합체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약)을 포함하는 조성물을 경쟁 물질과 함께 첨가하거나 이와 함께 인큐베이션하여, 세포 또는 바이러스 입자에 대한 하나 이상의 결합제의 결합을 역전, 해리 또는 파괴시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 역전, 해리 또는 파괴 이후, 조성물 중 하나 이상의 성분, 예컨대 해리된 올리고머 시약, 하나 이상의 결합제 및/또는 경쟁 물질은 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법에 의해 제조된 세포 (본 명세서에서 “아웃풋 조성물” 또는 “인큐베이션된 조성물”로도 불림)는 이종성 단백질, 예컨대 재조합 수용체, 예를 들어 CAR를 코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터, 예컨대 바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 포함한다. 상기 맥락에서 이종성(heterologous)은 통상적으로 바이러스로부터 발현되지 않는 및/또는 바이러스 게놈에 의해 코딩되지 않는 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 이후 바이러스 벡터 입자의 게놈에 포함되는 핵산에 의해 코딩된 이종성 단백질과 같은 재조합 단백질의 발현 수준을 측정함으로써, 바이러스 벡터의 숙주 게놈 내로의 통합을 평가할 수 있다. 재조합 분자의 발현 수준을 평가하는 다수의 공지된 방법, 예컨대 친화도-기반의 방법, 예를 들어, 면역친화성-기반의 방법, 예를 들어, 세포 표면 단백질의 맥락에서, 예컨대 유세포 분석에 의한 검출이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 발현은 형질도입 마커 및/또는 리포터 작제물의 검출에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 절두된 표면 단백질을 코딩하는 핵산은 벡터 내에 포함되고 발현 마커 및/또는 이의 향상으로서 사용된다.
V. 조성물, 제형 및 투여 방법
또한, CAR 또는 TCR과 같은 조작된 수용체 (예컨대, 조작된 항원 수용체)를 포함하는 조성물, 및 조작된 세포를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 비롯한 조성물이 제공된다. 또한, 항원이 발현되는 질환, 병태 및 장애의 치료 또는 발견, 진단 및 예후 방법에서와 같은 조성물의 사용 방법 및 용도가 제공된다.
A. 조성물/제형
용어 “약제학적 제형(pharmaceutical formulation)”이란 이러한 조성물 안에 포함된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과가 있도록 하기 위한 형태의 조제물을 지칭하며, 제형이 투여되는 대상에게 수용 불가능한 독성을 주는 추가 성분은 포함하지 않는다.
“약제학적 수용가능한 운반체(pharmaceutically acceptable carrier)”란, 대상에게 비독성이며, 활성 성분 이외의 약학 제제에 포함된 성분을 지칭한다. 약제학적으로 수용가능한 운반체는 완충액, 부형제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 양태에서, 담체의 선택은 부분적으로 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제로는, 예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 벤조산나트륨 및 벤즈알코늄 클로라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 둘 이상의 보존제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.0001% 내지 약 2%의 양으로 존재한다. 담체는 예를 들어, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 일반적으로 사용된 복용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 포스페이트, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량의 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨 등의 슈가; 나트륨 등의 염-형성 반대 이온; 금속 복합체 (예컨대, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면 활성제.
일부 양태에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제로는 예를 들어, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 기타 산 및 염을 포함한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 전형적으로 총 조성물 중량의 약 0.001% 내지 약 4%의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약제학적 조성물의 제조 방법은 공지되어 있다. 예시적인 방법은 예컨대, 문헌 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 더욱 상세히 기재되어 있다.
제형 또는 조성물은 또한, 세포로 치료되는 특정 징후, 질환 또는 병태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포에 상호 보완적인 활성을 가지고 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는 활성 성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합하여 적절하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 기타 약제학적으로 활성인 시제 또는 약물, 예컨대 화학요법 시제, 예컨대 아스파라기나제, 부술판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 히드록시유레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맵, 빈블라스틴 등을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 항체는 염의 형태로, 예컨대 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여된다. 적합한 약제학적으로 허용 가능한 산 첨가제 염에는 염산, 브롬화수소산, 인산, 메타인산, 질산 및 황산 등의 무기산, 및 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 말산, 젖산, 푸마르산, 벤조산, 글리콜산, 글루콘산, 석신산 및 아릴술폰산, 예컨대 p-톨루엔술폰산 등의 유기산으로부터 유래된 것들을 포함한다.
활성 성분은 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예컨대, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 매크로에멀젼에 포집될 수 있다. 특정 구현예에서, 약제학적 조성물은 시클로덱스트린 내포 복합체, 또는 리포좀 등의 내포 복합체로 제형화된다. 리포좀은 숙주 세포 (예컨대, T 세포 또는 NK 세포)를 특정 조직에 표적화하는 작용을 할 수 있다. 리포좀을 제조하기 위한 많은 방법, 예컨대 문헌 Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980), 및 미국 특허 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 및 5,019,369에 기재된 방법이 이용 가능하다.
약제학적 조성물은 일부 양태에서, 조성물의 전달이 치료될 부위의 민감성을 유발하기에 앞서 일어나도록, 그리고 민감성을 유발하기에 시간이 충분하도록 지효성, 지연 분비 및 서방출형 전달 시스템을 사용할 수 있다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용 가능하며 공지되어 있다. 이러한 시스템은 조성물의 반복된 투여를 피할 수 있고, 이로써 대상체 및 의사의 편의를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 질환 또는 증상을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양, 예컨대 치료적 유효량 또는 예방적 유효량의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료적 또는 예방적 효능은 치료된 대상체의 주기적인 평가에 의해 모니터링된다. 조건에 따른 며칠 또는 며칠 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 치료는 질병 증상이 바람직하게 억제될 때까지 반복된다. 그러나, 기타 복용량 요법이 유용할 수 있으며 결정될 수 있다. 원하는 복용량은 조성물의 단일 볼루스 투여, 조성물의 다중 볼루스 투여 또는 조성물의 지속 주입 투여에 의해 전달될 수 있다.
세포는 표준 투여 기법, 제형 및/또는 장치를 사용하여 투여될 수 있다. 조성물의 저장 및 투여를 위한 주사기 및 바이알과 같은 제형 및 장치가 제공된다. 세포의 투여는 자가 또는 이종일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응 세포 또는 전구 세포는 한 대상체로부터 수득될 수 있으며, 동일한 대상체 또는 상이한, 호환이 되는 대상체에 투여될 수 있다. 말초 혈액 유래의 면역 반응 세포 또는 그 후대 (예컨대, 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 유래됨)은 카테터 투여, 전신 주사, 국소 주사, 정맥 내 주사 또는 비경구 투여를 비롯한 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 치료적 조성물 (예컨대, 유전자 조작된 면역 반응 세포를 포함하는 약제학적 조성물)을 투여하는 경우, 이는 일반적으로 단위 복용량 주사 가능한 형태 (용액, 현탁액, 에멀젼)로 제형화될 것이다.
제형은 경구, 정맥 내, 복강 내, 피하, 폐, 경피, 근육 내, 비강 내, 협측, 설하 또는 좌약 투여를 위한 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 비경구적으로 투여된다. 용어 “비경구”는, 본 명세서에서 사용 시, 정맥 내, 근육 내, 피하, 직장, 질 및 복강 내 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 집단은 정맥 내, 복강 내 또는 피하 주사에 의한 말초 전신 전달을 사용하여 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서 조성물은, 일부 양태에서 선택된 pH로 완충될 수 있는 멸균 액체 제조물, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공된다. 액체 제조물은 일반적으로 겔, 기타 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기 용이하다. 또한, 액체 제조물은 특히 주사에 의해 투여하기에 더욱 편리하다. 한편, 점성 조성물은 특정 조직과의 연장된 접촉 시간을 제공하기 위해 적합한 점도 범위 내에서 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예컨대 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 폴리올 (예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사 가능한 용액은 세포를 적합한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 같은 부형제와 혼합한 것과 같은 용매에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 또한 동결 건조될 수 있다. 조성물은 원하는 투여 및 제조 경로에 따라 습윤제, 분산제 또는 에멀젼화제 (예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 증강 첨가제, 보존제, 향료제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 적합한 제조물을 제조하기 위하여 표준 텍스트를 참고할 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 비롯하여, 조성물의 안정성 및 무균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 제약 형태의 흡수는, 흡수를 지연시키는 시제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 연장될 수 있다.
서방출형 제조물은 제조될 수 있다. 서방출형 제조물의 적합한 예시로는, 항체를 포함하는 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 있으며, 매트릭스는 성형체, 예컨대 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다.
생체 내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 무균성이다. 무균성은, 예컨대 무균성 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
B. 투여 방법
세포, 집단 및 조성물을 투여하는 방법, 및 암을 비롯한 질환, 병태 및 장애를 치료 또는 예방하기 위한 그러한 세포, 집단 및 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질환 또는 병태를 가지는 대상체 또는 환자에게, 예컨대 입양 T 세포 요법 등의 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 배양 단계 및/또는 기타 처리 단계 이후 조작된 조성물 및 최종 생산 조성물과 같은, 제공된 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물은 질환 또는 병태를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체 등의 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 이로써 방법은, 예컨대 조작된 T 세포에 의해 인식되는 항원을 발현하는 암에서의 종양 부담을 줄임으로써, 질환 또는 병태 중 하나 이상의 징후를 치료, 예컨대 개선시킨다.
입양 세포 요법를 위한 세포의 투여 방법은 공지되어 있으며, 제공된 방법 및 조성물과 관련되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 입양 T 세포 요법은 예컨대, Gruenberg 등의 미국 특허 출원 공보 2003/0170238; Rosenberg의 미국 특허 4,690,915; 문헌 Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol . 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338를 참조한다.
본 명세서에서 사용 시, "대상체"는 인간 또는 기타 동물과 같은 포유류이며, 일반적으로는 인간이다. 일부 구현예에서, 세포, 세포 집단 또는 조성물이 투여되는 대상체, 예컨대 환자는 포유류, 전형적으로는 인간과 같은 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있으며, 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하여 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 설치류와 같은 영장류가 아닌 포유류이다.
본 명세서에서 사용 시, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료의"와 같은 문법적인 변형)는 질환 또는 병태 또는 장애, 또는 징후, 부작용 또는 결과, 또는 이러한과 관련된 표현형의 완전한 또는 부분적인 개선 또는 감소를 의미한다. 치료의 바람직한 효과에는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질환 진행 속도 감소, 상기 질환 상태의 개선 또는 경감, 그리고 차도 또는 개선된 예후가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 용어는 질환의 완치, 또는 모든 징후나 결과에 대한 임의의 징후나 효과(들)의 완전한 제거를 의미하지는 않는다.
본 명세서에서 사용 시, "질환 발달 지연"은 질환 (예컨대, 암)의 발달을 연기, 저해, 둔화, 지체, 안정화, 억제 및/또는 미루는 것을 의미한다. 지연은 치료될 질환 및/또는 개인의 병력에 좌우하여 다양한 길이의 시간이 될 수 있다. 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 충분한 또는 현저한 지연은 사실상 개인이 질환을 발달시키지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 예를 들어, 말기 암, 예컨대 전이의 발달은 지연될 수 있다.
본 명세서에서 사용 시, "예방"은 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질환을 진단받지 않은 대상체에서, 질환의 발병 또는 재발과 관련된 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 둔화시키는데 사용된다.
본 명세서에서 사용 시, 기능 또는 활성을 "억제"하는 것은 관심있는 조건 또는 파라미터를 제외한 다른 동일한 조건과 비교하였을 때, 또는 또 다른 조건과 비교하여, 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예를 들어, 종양 성장을 억제하는 세포는, 세포가 없는 경우에서의 종양의 성장 속도와 비교하여 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 맥락에서, 약학 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량/투여량으로 치료적 또는 예방적 결과 등의 원하는 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다.
시제, 예컨대 약학 제형 또는 세포의 "치료적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 치료적 결과, 예컨대 질환, 병태 또는 장애의 치료, 및/또는 치료의 약동학 또는 약역학 효과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 치료적 유효량은 대상체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 투여되는 세포 집단 등의 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 및/또는 조성물을 유효량으로, 예컨대 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
"예방적 유효량"은, 필요한 시간 동안 복용량으로 원하는 예방적 결과를 효과적으로 달성하기 위한 양을 의미한다. 그러나, 전형적으로 반드시 그런 것은 아니지만, 예방적 투여량(dose)은 질환 전 또는 초기 단계에 이용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적을 것이다.
치료되는 질환 또는 병태는 항원의 발현이 질환, 상태 또는 장애의 병인과 관련되고 및/또는 병인에 관여하는, 예컨대 그러한 질환, 병태 또는 장애를 유발하거나, 악화시키거나 또는 그렇지 않으면 이에 관여하는 임의의 것일 수 있다. 예시적인 질환 및 병태는 세포의 악성 또는 형질 전환 (예컨대, 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 기타 병원체에 의해 야기된 감염성 질환과 관련된 질환 또는 병태를 포함할 수 있다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 병태와 관련된 항원을 비롯한 예시적 항원들은 전술하였다. 특정 구현예에서, 키메라 항원 수용체 또는 형질 전환 TCR은 질환 또는 병태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
이에 따라, 제공된 방법 및 용도는 입양 세포 요법을 위한 방법 및 용도를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 질환, 병태 또는 장애를 가지거나 가질 위험이 있거나, 또는 가지는 것으로 의심을 받는 대상체, 조직 또는 세포에, 세포 또는 세포를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 집단 및 조성물은 치료될 특정 질환 또는 병태를 가지는 대상체에게, 예컨대 입양 T 세포 요법과 같은 입양 세포 요법을 통해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 또는 조성물은 대상체, 예컨대 질환 또는 병태를 가지거나 가질 위험이 있는 대상체에게 투여되어, 질환 또는 병태 중 하나 이상의 징후를 개선시킨다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 자가 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받을 대상체 또는 그러한 대상체로부터 유래된 샘플로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이에 따라, 일부 양태에서, 세포는 치료가 필요한 대상체, 예컨대 환자로부터 유래되고, 단리 및 가공 후의 세포는 동일한 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 요법, 예컨대 입양 T 세포 요법은 동종이계 전달에 의해 수행되며, 여기서 세포는 세포 요법을 받거나 또는 궁극적으로 받는 대상체 이외의 대상체, 예컨대 제1 대상체로부터 단리되고 및/또는 그렇지 않으면 이로부터 제조된다. 이러한 구현예에서, 이후 세포는 동일한 종의 상이한 대상체, 예컨대 제2 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 대상체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 대상체는 제1 대상체와 동일한 HLA 클래스 또는 수퍼타입을 나타낸다. 세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 복용 및 투여는 부분적으로 투여가 짧은 또는 만성인지 여부에 따라 좌우된다. 다양한 복용 스케쥴은 다양한 시점, 볼루스 투여 및 맥박 주입에 대한 단일 또는 다중 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포 서브 유형의 개별 집단은 대상체에게, 약 100만 내지 약 1000억개의 세포 범위 및/또는 체중 kg당 세포의 양으로, 예컨대 약 100만 내지 약 500억개의 세포 (예컨대, 약 500만개의 세포, 약 2500만 개의 세포, 약 5억 개의 세포, 약 10억 개의 세포, 약 50억 개의 세포, 약 200억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 400억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 예컨대 약 1000만 내지 약 1000억개의 세포 (예컨대, 약 2000만 개의 세포, 약 3000만 개의 세포, 약 4000만 개의 세포, 약 6000만 개의 세포, 약 7000만 개의 세포, 약 8000만 개의 세포, 약 9000만 개의 세포, 약 100억 개의 세포, 약 250억 개의 세포, 약 500억 개의 세포, 약 750억 개의 세포, 약 900억 개의 세포 또는 값 중 임의의 두 값으로 한정된 범위), 및 경우에 따라 약 1억 내지 약 500억 개의 세포 (예컨대, 약 1억 2000만 개의 세포, 약 2억 5000만 개의 세포, 약 3억 5000만 개의 세포, 약 4억 5000만 개의 세포, 약 6억 5000만 개의 세포, 약 8억개의 세포, 약 9억개의 세포, 약 30억 개의 세포, 약 300억 개의 세포, 약 450억 개의 세포) 또는 이러한 범위 사이의 임의의 값 및/또는 체중 kg당 값으로 투여된다. 또한, 복용량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 기타 치료에 특수한 속성에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 시제 (예컨대, 세포 독성제 또는 치료제) 등의 또 다른 치료적 개입과 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 조합 치료의 일부로서 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께, 또는 또 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 병용 투여된다. 일부 상황에서, 세포 집단이 하나 이상의 추가적인 치료제의 효과를 증강시키도록 또는 그 반대의 경우를 위하여, 세포는 또 다른 요법과 시간적으로 충분히 가까이 병용 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제에 선행하여 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가적인 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가적인 시제는 예컨대 지속성을 증강시키기 위한, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학 요법 시제의 투여를 포함한다.
세포의 투여 이후, 일부 구현예에서, 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예컨대 다수의 공지된 방법 중 임의의 방법에 의해 측정된다. 생체 내, 예컨대 이미징에 의해 또는 생체 외, 예컨대 ELISA 또는 유동 세포 측정 분석에 의해 평가할 파라미터는, 항원에 대한 조작된 T 세포 또는 천연 T 세포 또는 기타 면역 세포의 특이적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴시키는 능력은, 예컨대 문헌 Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)에 기술된 세포 독성 분석과 같은 해당 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 특정 구현예에서, 조작된 세포는 그 치료적 또는 예방적 효능이 증가되도록 임의의 수의 방법으로 추가로 조작된다.
일부 양태에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하의 감소와 같은 임상적 결과를 평가함으로써 측정된다. 예를 들어, 집단에 의해 발현된, 조작된 CAR 또는 TCR은 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 표적 부분에 컨쥬게이션될 수 있다. 화합물, 예컨대 CAR 또는 TCR을 표적 부분에 컨쥬게이션시키는 관행은 해당 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) 및 미국 특허 5,087,616를 참조한다.
정의
본 명세서에서 사용 시, 단수 용어(“a”“an,”및 “the”)는 문맥이 명백하게 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예를 들어, "a" 또는 "an"은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다. 본 명세서에 기술된 양태 및 변형은, 양태 및 변형으로 "구성하는" 및/또는 "본질적으로 구성된"을 포함하는 것으로 이해된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 청구되는 발명의 다양한 양태가 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의 및 간결화를 위한 것이며, 청구되는 발명의 범위에 대한 변경할 수 없는 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 그러한 범위에 속하는 개별적인 수치, 뿐만 아니라 모든 가능한 하위범위가 명시적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개재된 값 및 언급된 범위 내의 임의의 기타 언급되거나 개재된 값이 청구된 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이러한 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위 내에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 특별히 배제된 한계값에 따라 청구된 발명 범위에 포함될 수도 있다. 언급된 범위가 한계값의 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 포함된 하나 또는 두 한계값을 제외한 범위 또한 청구된 발명 범위에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본 명세서에 사용 된 용어 "약(about)"이란 이 기술 분야의 당업자에게 잘 공지된 바와 같이, 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 나타낸다. 본 명세서의 값 또는 매개변수에 대한 "약(about)"의 언급은 그 값 또는 매개변수 그 자체(per se)를 나타내는 구현예를 포함 (및 설명)한다. 예를 들어, "약 X"에 대한 기술은 "X"에 대한 기술을 포함한다. 구체적인 구현예에서, “약”은 ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, ± 0.1%, ± 0.01%, 또는 ± 0.001%이다.
본 명세서에서 사용 시, 조성물은 세포를 포함하는 둘 이상의 산물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 이러한의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용 시, 하나 이상의 특정 세포 유형 또는 세포 집단을 언급 할 때 "풍부하게"한다는 것은, 조성물의 총 세포수 또는 체적과 비교하여, 또는 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기초한 양성 선택에 의하거나, 소진될 세포 집단 또는 세포상에 존재하지 않는 마커에 기초한 음성 선별에 의한 것과 같이 기타 세포 유형과 관련하여, 세포 유형 또는 집단의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 의미한다. 이러한 용어는 조성물로부터 기타 세포, 세포 유형 또는 집단의 완전한 제거를 필요로 하지 않으며, 농축된 세포가 농축된 조성물에서 100% 또는 그 근처로 존재할 것을 필요로 하지 않는다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커가 세포 상의 또는 세포 내의 검출 가능하도록 존재하는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출된 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포보다 실질적으로 높은 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출 가능하다.
본 명세서에 사용 시, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 설명은, 특정 마커, 전형적으로 표면 마커의 세포 상의 또는 세포 내의 실질적으로 검출 가능한 존재가 없다는 것을 의미한다. 표면 마커를 지칭할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 항체를 검출함으로써, 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되는 표면 발현이 없음을 의미하며, 여기서 염색은 동일한 조건하에서 이소타입-매치된 대조군을 사용한 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 알려진 세포보다 현저히 낮은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서 유동 세포 측정 분석에 의해 검출되지 않는다.
본 명세서에 사용 시, "발현"이란 용어는 폴리펩타이드가 유전자 등의 핵산 분자의 코딩 서열에 기초하여 생산되는 공정을 의미한다. 공정은 전사, 전사 후 조절, 전사 후 변형, 번역, 번역 후 조절, 번역 후 변형 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다
본 명세서에서 사용 시, 대상체는 임의의 유기체, 예컨대 인간 및 다른 포유동물을 포함한다. 포유동물에는, 인간, 및 비인간 동물, 예를 들어 가축, 경기용 동물, 및 애완동물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용 시, 대조군은 테스트 파라미터로 처리되지 않는다는 것을 제외하고, 테스트 샘플과 실질적으로 동일한 샘플을 지칭하거나, 또는 그것이 혈장 샘플인 경우, 해당 조건에 영향을 받지 않은 정상 자원자로부터의 것일 수 있다. 대조군은 또한 내부 대조군이 될 수 있다.
VI. 예시적인 구현예
[1] 제공되는 구현예는 다음과 같다:
1. 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 올리고머 입자 시약으로서, 올리고머 입자 시약의 크기는 i) 반경이 25 nm 초과하고, ii) 분자량이 적어도 5 x 106 g/mol; 및/또는 (iii) 올리고머 입자 시약 당, 적어도 100개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체인 것을 포함하는 올리고머 입자 시약.
2. 구현예 1에 있어서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인, 및/또는 이의 생물학적 활성 단편, 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 결합하거나, 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
3. 구현예 2에 있어서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 아비딘, 비오틴 유사체 또는 뮤테인, 아비딘 유사체 또는 뮤테인, 및/또는 이의 생물학적 활성 단편, 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하거나, 가역적으로 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
4. 구현예 1-3 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하며, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 44 내지 47 위치에 해당하는 서열 위치에, 아미노산 서열 Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47 를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
5. 구현예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 다음을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자인 올리고머 입자 시약:
a) 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열;
b) 서열 번호 3-6, 27, 28, 60, 또는 61 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144-Thr45-Ala46-Arg47 또는 lle44-Gly45-Ala46-Arg47에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴 또는 이의 생물학적 활성 형태, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는
c) 비오틴 또는 이의 생물학적 활성 형태, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편.
6. 구현예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 서열 번호 6 또는 61에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
7. 구현예 4-6 중 어느 하나에 있어서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 117, 120 및/또는 121에 해당하는 위치에 아미노산 치환 또는 치환들을 추가로 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
8. 구현예 7에 있어서,
아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Asp117, Arg117, Ser120, Ala120, Gly120, Trp121, Tyr121 또는 Phe121 중에서 선택되거나; 또는
아미노산 치환 또는 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121 중 하나 이상으로부터 선택되거나; 또는
아미노산 치환들은 Glu117, Gly120 또는 Tyr121으로부터 선택되는 것인 올리고머 입자 시약.
9. 구현예 1-8 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 다음을 포함하는 복수의 스트렙타비딘 뮤테인 분자인 올리고머 입자 시약:
a) 서열 번호 27 또는 28에 제시된 아미노산 서열;
b) 서열 번호 28에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, Va144, Thr45, Ala46, Arg47, Glu117, Gly120 및 Tyr121에 해당하는 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 아미노산 서열; 또는
c) 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 비오틴 유사체 또는 뮤테인 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편.
10. 구현예 1-9 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제에 결합되거나 또는 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
11. 구현예 10에 있어서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하며, 결합 파트너는 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 결합 부위에 결합할 수 있거나, 선택적으로 가역적으로 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약
12 . 구현예 11에 있어서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
13. 구현예 11 또는 12에 있어서, 결합 파트너는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
14. 구현예 10-13 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
15. 구현예 10-14 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이거나, 이를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
16. 구현예 15에 있어서, 하나 이상의 시약은 1가 항체 단편이거나, 이를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
17. 구현예 15 또는 구현예 16에 있어서, 하나 이상의 시제는 Fab이거나, 이를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
18. 구현예 10-17 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 수용체-결합제인 것인 올리고머 입자 시약.
19. 구현예 10-18 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 표적 세포의 표면 상의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하며, 이러한 결합은 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 것인 올리고머 입자 시약.
20. 구현예 18 또는 구현예 19에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
21. 구현예 18-20 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
22. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합하는 것인 올리고머 입자 시약.
23. 구현예 22에 있어서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고 올리고머 입자 시약은 제2 수용체-결합제를 포함하며, 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 이러한 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
24. 구현예 23에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
25. 구현예 22 또는 구현예 23에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하고, 이러한 공동자극 분자는 CD28인 것인 올리고머 입자 시약.
26. 구현예 10-25 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 선택적으로 항-CD3 Fab 및 항-CD28 Fab인 것인 올리고머 입자 시약.
27. 구현예 18-21 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
28. 구현예 18-21, 23, 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택되는 것인 올리고머 입자 시약.
29. 구현예 18-21, 23, 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택되는 것인 올리고머 입자 시약.
30. 구현예 18-21, 23, 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택되는 것인 올리고머 입자 시약.
31. 구현예 18-21, 23, 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 이러한 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 올리고머 입자 시약.
32. 구현예 31에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며,
리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는
리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF으로부터 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 올리고머 입자 시약.
33. 구현예 30에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며,
리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택되는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는
리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25로부터 선택되거나 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 올리고머 입자 시약.
34. 구현예 18-21, 23, 또는 24 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 올리고머 입자 시약.
35. 구현예 10-34 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 올리고머 입자 시약.
36. 구현예 35에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
37. 구현예 35 또는 구현예 36에 있어서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
38. 구현예 35-37 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
39. 구현예 35-38 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 올리고머 입자 시약.
40. 구현예 35-39 중 어느 하나에 있어서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 것인 올리고머 입자 시약.
41. 구현예 1-40 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 반경이 25 nm 초과, 50 nm 초과, 60 nm 초과, 70 nm 초과, 80 nm 초과, 또는 90 nm 초과인 것인 올리고머 입자 시약.
42. 구현예 1-41 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 반경이 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 115 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm를 포함하거나, 또는 90 nm ±15 nm, 또는 95 nm ± 20-25nm를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
43. 구현예 1-42 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약 반경이 150 nm 미만인 것인 올리고머 입자 시약.
44. 구현예 41-43 중 어느 하나에 있어서, 상기 반경은 유체역학적 반경인 것인 올리고머 입자 시약.
45. 구현예 1-44 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 분자량이 적어도 1 x 107 g/mol, 적어도 5 x 107 g/mol, 또는 적어도 1 x 108 g/mol인 것인 올리고머 입자 시약.
46. 구현예 1-45 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 분자량이 1 x 106 g/mol 내지 1 x 1010 g/mol, 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol, 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol인 것인 올리고머 입자 시약.
47. 구현예 1-46 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 적어도 100개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 1,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 적어도 1,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 적어도 2,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
48. 구현예 1-47 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 100 내지 50,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 1,000 내지 20,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 1,000 내지 10,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
49. 구현예 1-48 중 어느 하나에 있어서, 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인은 라이신 잔기를 포함하며 중 어느 하나에 있어서, 라이신 잔기의 20%, 10%, 5%, 1% 미만은 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 것인 올리고머 입자 시약.
50. 구현예 1-49 중 임의의 하나 이상의 올리고머 입자 시약을 포함하는 것인 조성물.
51. 구현예 50에 있어서, 하나 이상의 올리고머 입자 시약은 복수의 올리고머 입자 시약인 조성물.
52. 구현예 51에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약은 i) 평균 반경이 70 nm를 초과하고; ii) 평균 분자량이 적어도 1 x 108 g/mol이고; 및/또는 iii) 올리고머 입자 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수는 적어도 2,000개이고 및/또는 iv) 반경 크기 분포는 복수의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%가 10 nm 내지 150 nm의 반경을 포함하는 것인 조성물.
53. 구현예 51 또는 52에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 25 nm 초과, 50 nm 초과, 60 nm 초과, 70 nm 초과, 80 nm 초과, 90 nm 초과, 또는 100 nm 초과인 것인 조성물.
54. 구현예 51-53 중 어느 하나에 있어서,
복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 25 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 150 nm, 75 nm 내지 125 nm, 80 nm 내지 110 nm, 또는 90 nm 내지 110 nm를 포함하거나; 또는
복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 90 nm ±15 nm, 95 nm ± 20-25nm 또는 97 ± 10 nm를 포함하는 것인 조성물.
55. 구현예 51-54 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 50 내지 150 nm, 70 nm 내지 140 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 및/또는 100 nm 내지 120 nm를 포함하는 것인 조성물.
56. 구현예 51-55 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 평균 및/또는 중앙 반경이 복수의 올리고머 입자 시약의 ± 50%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, 및/또는 ± 5% 사이인 것인 조성물.
57. 구현예 51-56 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약은 평균 반경이 80 nm 내지 115 nm이며, 올리고머 입자 시약의 적어도 95%는 반경이 평균 반경의 ± 25% 사이인 것인 조성물.
58. 구현예 51-57 중 어느 하나에 있어서, 복수의 입자는 평균 분자량이 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol를 포함하는 것인 조성물.
59. 구현예 51-58 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약은 올리고머 입자 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수가 적어도 100, 적어도 500, 적어도 1,000, 적어도 1,500, 또는 적어도 2,000개를 포함하는 것인 조성물.
60. 구현예 51-59 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자 시약은 올리고머 입자 시약 당 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 사합체의 평균 개수가 100 내지 50,000, 1,000 내지 20,000, 1,000 내지 10,000, 또는 2,000 내지 5,000를 포함하는 것인 조성물.
61. 구현예 51-60 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 -80 ℃ 이하, 약 -20 ℃ 이하, 및/또는 약 4 ℃ 이하에서 적어도 1, 3, 9, 27, 또는 46 주간 저장되었을 때 25%를 초과하지 않는 것인 조성물.
62. 구현예 51-61 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 1 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는 것인 조성물.
63. 구현예 61-62 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 3 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는 것인 조성물.
64. 구현예 51-53 중 어느 하나에 있어서, 복수의 올리고머 입자의 평균 반경은 약 4 ℃ 이하에서 적어도 9 주간 저장되었을 때 10%를 초과하지 않는 것인 조성물.
65. 다음의 단계를 포함하는, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 올리고머 입자 시약의 제조 방법:
싸이올 작용기와 반응할 수 있는 싸이올-반응성 작용기를 포함하는 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 하나 이상의 싸이올 작용기를 포함하는 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 인큐베이션하여, 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 입자를 포함하는 입자 조성물을 생성하는 단계;
올리고머 입자를 단량체 및/또는 작은 올리고머 분자로부터 분리하는 단계; 및
올리고머 입자를 안정화제와 접촉시켜, 올리고머 입자 시약을 제조하는 단계.
66. 구현예 65에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 하나 이상의 아민을 싸이올-반응성 작용기로 전환시킬 수 있는 활성화제를 사용하여 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 배양시킴으로써 생성되는 것인 방법.
67. 구현예 65 또는 구현예 66에 있어서, 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 싸이올 작용기를 하나 이상의 라이신 잔기에 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 싸이올화제를 사용하여 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 인큐베이션함으로써 생성되는 것인 방법.
68. 다음의 단계를 포함하는, 올리고머 입자 시약의 제조 방법:
(a) 하나 이상의 아민을 싸이올 작용기와 반응할 수 있는 싸이올-반응기로 전환시킬 수 있는 조건하에서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 활성화제와 함께 인큐베이션하여, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계;
(b) 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 싸이올 작용기를 하나 이상의 라이신 잔기에 첨가하거나, 또는 첨가할 수 있는 싸이올화제와 함께 인큐베이션하여, 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계; 및
(c) 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 인큐베이션하여, 올리고머 입자 시약을 포함하는 입자 조성물을 생성하는 단계;
여기서 상기 방법은 단계 (c)에서 인큐베이션을 개시할 때 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는, 평균적으로, 라이신의 적어도 60%가 싸이올 작용기를 포함하도록, 및/또는 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체 당, 평균적으로, 적어도 10개의 라이신이, 싸이올 작용기를 포함하도록 하는 조건하에서 수행되는 것인 방법.
69. 구현예 68에 있어서, 특정 구현예는 단량체 및/또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 올리고머 입자 시약을 분리하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인 방법.
70. 구현예 65-69 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 활성화 시약의 몰비가 1:1 내지 1:10인 몰비에서 수행되는 것인 방법.
71. 구현예 66-70 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 대 활성화 시약의 몰비가 1:2 ± 2%인 몰비에서 수행되는 것인 방법.
72. 구현예 66-71 중 어느 하나에 있어서, 활성화제는 이종이작용성 가교제를 포함하는 것인 방법.
73. 구현예 66-72 중 어느 하나에 있어서, 활성화제는 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 (설포 SMCC) 및/또는 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)를 포함하는 것인 방법.
74. 구현예 65-73 중 어느 하나에 있어서, 싸이올-반응성 작용기는 할로아세틸 기, 말레이미드 기, 아지리딘 기, 아크릴로일 기, 아실화제, 바이닐설폰 기, 피리딜 다이설파이드, TNB-싸이올 또는 다이설파이드 환원제인 것인 방법.
75. 구현예 65-74 중 어느 하나에 있어서, 싸이올-반응성 작용기는 말레이미드 기인 것인 방법.
76. 구현예 65-75 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 중성 pH에서 인큐베이션되는 방법.
77. 구현예 65-76 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 pH 6.8 내지 7.5에서 인큐베이션되는 방법.
78. 구현예 65-77 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 pH 7.0 내지 7.4, 또는 선택적으로 약 7.2에서 인큐베이션되는 방법..
79. 구현예 65-78 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션되는 방법.
80. 구현예 65-79 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃에서 인큐베이션되는 방법.
81. 구현예 65-80 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 15 분 내지 6 시간 또는 30 분 내지 2 시간 동안 인큐베이션되는 방법.
82. 구현예 65-81 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화제는 45 분 내지 1.5 시간, 또는 선택적으로 약 1 시간 동안 인큐베이션되는 방법.
83. 구현예 66-82 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 싸이올화 시약 대 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 당 각각의 1차 아민의 몰비가 10:1 내지 1:1인 몰비에서 수행되는 것인 방법.
84. 구현예 66-83 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체 대 싸이올화제의 몰비가 1:50 내지 1:500인 몰비에서 수행되는 것인 방법.
85. 구현예 66-84 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체 대 활성화 시약의 몰비가 약 1:100인 몰비에서 수행되는 것인 방법.
86. 구현예 66-85 중 어느 하나에 있어서, 싸이올화제는 2-이미노싸이올란이거나, 이를 포함하는 것인 방법.
87. 구현예 66-86 중 어느 하나에 있어서, 2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 pH 7.0 이상, 선택적으로 pH 7.0 내지 8.0에서 인큐베이션되는 것인 방법.
88. 구현예 66-87 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 약 pH 7.7에서 인큐베이션되는 것인 방법.
89. 구현예 66-88 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제의 인큐베이션은 pH 8.0 이상, 선택적으로 pH 8.0 내지 9.0의 완충액의 존재하에 개시되는 것인 방법.
90. 구현예 66-89 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제의 인큐베이션은 약 pH 8.5의 완충액의 존재하에 개시되는 것인 방법.
91. 구현예 89 또는 90에 있어서, 완충액은 보레이트를 포함하는 것인 방법.
92. 구현예 89-91 중 어느 하나에 있어서, 완충액은 10 mM 내지 200 mM 보레이트 또는 50 mM 내지 100 mM 보레이트, 선택적으로 약 100 mM 보레이트를 포함하는 것인 방법.
93. 구현예 65-92 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션되는 것인 방법.
94. 구현예 65-93 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 또는 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃에서 인큐베이션되는 것인 방법.
95. 구현예 66-94 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 15 분 내지 2 시간 또는 15 분 내지 1.5 시간 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
96. 구현예 66-95 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 15 분 내지 2 시간 동안, 또는 25 분 내지 1 시간 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
97. 구현예 66-96 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 분자 및 싸이올화제는 약 1 시간 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
98. 구현예 66-97 중 어느 하나에 있어서, 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화제는 약 25 분 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
99. 구현예 65-98 중 어느 하나에 있어서, 인큐베이션하는 동안 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 대 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 X:1의 몰비이며, 여기서 X는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 분자 당 싸이올화될 수 있는 라이신 잔기의 개수인 것인 방법.
100. 구현예 65-99 중 어느 하나에 있어서, 몰비는 1:1 내지 1:8 또는 1:2 내지 1:6, 또는 선택적으로 약 1:4인 것인 방법.
101. 구현예 65-100 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 pH 6.8 내지 7.5에서 인큐베이션되는 것인 방법.
102. 구현예 65-101 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 pH 7.0 내지 7.4에서 인큐베이션되는 것인 방법.
103. 구현예 65-102 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 약 pH 7.2에서 인큐베이션되는 것인 방법
104. 구현예 65-103 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 4 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서 인큐베이션되는 것인 방법.
105. 구현예 65-104 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 실온, 선택적으로 20 ℃ 내지 25 ℃, 또는 선택적으로 약 23 ℃, 또는 약 24 ℃에서 인큐베이션되는 것인 방법.
106. 구현예 65-105 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자 및 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자는 15 분 내지 6 시간 또는 30 분 내지 2 시간 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
107. 구현예 65-106 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자 및 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자는 45 분 내지 1.5 시간, 또는 선택적으로 약 1 시간 동안 인큐베이션되는 것인 방법.
108. 구현예 65-107 중 어느 하나에 있어서, 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션은 상기 분자들을 N-에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide, NEM)와 반응시킴으로써 종료되는 것인 방법.
109. 구현예 68-108 중 어느 하나에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 적어도 일부와 활성화제의 인큐베이션 단계의 및 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 적어도 일부와 싸이올화제의 인큐베이션 단계는 동시에 개별적으로 수행되는 것인 방법.
110. 구현예 109에 있어서, 제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 활성화제의 인큐베이션 단계 및 제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자와 싸이올화제의 인큐베이션 단계는 실질적으로 동일한 시간 동안 수행 및/또는 실질적으로 동시에 완료되는 것인 방법.
111. 구현예 68-110 중 어느 하나에 있어서, 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 배양 단계 이전에, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 방법:
(i) 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 활성화제를 제거하는 단계; 및/또는
(ii) 싸이올화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 싸이올화제를 제거하는 단계.
112. 구현예 68-111 중 어느 하나에 있어서, 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자 및 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 인큐베이션 단계는 제2 복수의 스트렙타비딘 분자와 싸이올화제의 인큐베이션 단계가 종료된 후 15 분 이내 및/또는 싸이올화 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 포함하는 조성물로부터 싸이올화제의 제거 단계 이후에 개시되는 것인 방법.
113. 다음의 단계를 포함하는, 올리고머 입자 시약의 제조 방법:
제1 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도)헥사노에이트 (SMPH)와 함께 약 pH 7.2에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 말레이미드 싸이올-반응성 작용기를 포함하는 복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 생성하는 단계;
제2 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 2-이미노싸이올란과 pH 7.5 내지 8.5에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 하나 이상의 싸이올 작용기를 포함하는 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자를 생성하는 단계; 및
복수의 활성화된 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자를 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자와 약 pH 7.2에서 약 1 시간 동안 인큐베이션하여, 입자 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물을 생성하는 단계;
여기서 복수의 활성화된 스트렙타비딘 분자와 복수의 싸이올화 스트렙타비딘 분자의 인큐베이션 단계는 제2 복수의 스트렙타비딘 분자와 2-이미노싸이올란의 인큐베이션단계가 종료된 후 10 분 이내에 개시되는 것인 방법.
114. 구현예 68-113 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 올리고머 입자 시약을 안정화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
115. 구현예 65-67 또는 114 중 어느 하나에 있어서,안정화제는 올리고머 입자 시약 중 라이신 잔기에 존재하는 N-치환된 이미노싸이올란의 양을 감소시키는 것인 방법.
116. 구현예 65-67 또는 114-115 중 어느 하나에 있어서, 안정화제는 올리고머 입자 시약 중 라이신 잔기에 존재하는 N-치환된 이미노싸이올란의 양을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시키는 것인 방법.
117. 구현예 65-67 및 114-116 중 어느 하나에 있어서, 안정화제는 하이드록실아민을 포함하는 것인 방법.
118. 구현예 65-67 및 114-117 중 어느 하나에 있어서, 안정화제는 올리고머 입자 시약으로부터 크로마토그래피에 의해, 선택적으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 제거되는 것인 방법.
119. 구현예 65-118 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 반경이 150 nm 미만인 것인 방법.
120. 구현예 65-119 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약을 필터 멸균하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
121. 구현예 65-67 및 69-120 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체 또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 분리되는 것인 방법.　
122. 구현예 113에 있어서, 크기 배제 한계는 약 100 kDa, 500 kDa, 750 kDa, 1000 kDa 또는 2000 kDa 이상인 것인 방법.
123. 구현예 121 또는 구현예 122에 있어서, 크기 배제 한계는 약 500 kDa 내지 1000 kDa인 것인 방법.
124. 구현예 121-123 중 어느 하나에 있어서, 크기 배제 한계는 약 75 kDa인 것인 방법.
125. 구현예 65-67 및 69-124 중 어느 하나에 있어서, 공극 부피를 포함하는 하나 이상의 분획을 수집하여, 단량체 또는 작은 올리고머 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자로부터 올리고머 입자 시약을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
126. 구현예 65-125 중 어느 하나에 있어서, 약 4 ℃ 이하, 약 -20 ℃ 이하, 또는 약 -80 ℃ 이하의 온도에서 올리고머 입자 시약을 저장하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
127. 구현예 65-126 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합시키기 위한 조건하에서 올리고머 입자 시약을 하나 이상의 시제와 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
128. 구현예 65-127 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약.
129. 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 다합체화하는 방법으로서, 상기 방법은 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합시키기 위한 조건하에서 구현예 1-49 중 어느 하나의 올리고머 입자 시약, 구현예 50-64 중 어느 하나의 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물, 또는 구현예 65-128 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약을 하나 이상의 시제와 혼합하는 단계를 포함하는 것인 방법.
130. 구현예 127 또는 구현예 129에 있어서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하며, 이러한 결합 파트너는 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 결합 부위에 결합할 수 있는 것인 방법.
131. 구현예 130에 있어서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
132. 구현예 130 또는 구현예 131에 있어서, 결합 파트너는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
133. 구현예 130-132 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 방법.
134. 구현예 130-133 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편을 포함하는 것인 방법.
135. 구현예 134에 있어서, 하나 이상의 시제는 1가 항체 단편이거나 이를 포함하는 것인 방법.
136. 구현예 134 또는 구현예 135에 있어서, 하나 이상의 시제는 Fab이거나 이를 포함하는 것인 방법.
137. 구현예 130-136 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나, 이에 결합할 수 있는 수용체 결합제인 것인 방법.
138. 구현예 137에 있어서, 수용체 결합제는 표적 세포의 표면 상의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하며, 이러한 결합은 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 것인 방법.
139. 구현예 137 또는 구현예 138에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 방법.
140. 구현예 137-139 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
141. 구현예 137-140 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
142. 구현예 141에 있어서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고, 상기 방법은 제2 수용체-결합제를 포함하는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합하는 단계를 추가적으로 포함하며, 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있는 것인 방법.
143. 구현예 142에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 방법.
144. 구현예 142 또는 구현예 143에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하고, 이러한 공동자극 분자는 CD28인 것인 방법.
145. 구현예 127 및 129-144 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 선택적으로 항-CD3 Fab 및 항-CD28 Fab인 것인 방법.
146. 구현예 137 또는 구현예 138 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 방법.
147. 구현예 137, 138, 143, 또는 144 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택되는 것인 방법.
148. 구현예 137, 138, 143, 또는 144 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택되는 것인 방법.
149. 구현예 137, 138, 143, 또는 144 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택되는 것인 방법.
150. 구현예 137, 138, 143, 또는 144 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 상기 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
151. 구현예 150에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며,
리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는
리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF으로부터 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
152. 구현예 151에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며, 리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택된 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는
리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25로부터 선택되거나 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
153. 구현예 137, 138, 143, 또는 144 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 상기 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
154. 구현예 127-153 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 방법.
155. 구현예 154에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 방법.
157. 구현예 154 또는 구현예 155에 있어서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포인 것인 방법.
158. 구현예 154-156 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포인 것인 방법.
159. 구현예 154-158 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
160. 구현예 154-159 중 어느 하나에 있어서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 것인 방법.
161. 구현예 65-160 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물.
162. 구현예 65-161 중 어느 하나의 방법에 의해 제조된 복수의 올리고머 입자 시약을 포함하는 조성물.
163. 구현예 1-49 중 어느 하나의 올리고머 입자 시약 또는 구현예 50-64 또는 161-162 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 것인 제품화 물품.
164. 세포의 조절 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1-49 중 어느 하나의 올리고머 입자 시약 존재하에, 또는 구현예 50-64 중 어느 하나 또는 161-163 중 어느 하나의 조성물의 존재하에 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을 인큐베이션하여, 표적 세포를 조절하는 단계를 포함하는 것인 방법.
165. 구현예 164에 있어서, 표적 세포의 조절 단계는 표적 세포의 활성화, 농축 및/또는 팽창을 포함하는 것인 방법.
166. 세포의 배양 방법으로서, 상기 방법은 구현예 1-49 중 어느 하나의 올리고머 입자 시약 존재하에, 또는 구현예 50-64 중 어느 하나 또는 161-163 중 어느 하나의 조성물의 존재하에 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을 인큐베이션는 단계를 포함하는 것인 방법.
167. 구현예 164-166 중 어느 하나에 있어서, 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 시제에 가역적으로 결합되는 것인 방법.
168. 구현예 167에 있어서, 하나 이상의 시제는 결합 파트너를 포함하며, 결합 파트너는 올리고머 입자 시약의 하나 이상의 결합 부위에 결합할 수 있어, 하나 이상의 시제를 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합 시킬 수 있는 것인 방법.
169. 구현예 168에 있어서, 결합 파트너는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
170. 구현예 168 또는 구현예 169에 있어서, 결합 파트너는 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.
171. 구현예 167-170 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 분자에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 방법.
172. 구현예 167-171 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항체, 선택적으로 Fab를 포함하는 것인 방법.
173. 구현예 167-172 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하거나, 이에 결합할 수 있는 수용체 결합제인 것인 방법.
174. 구현예 173에 있어서, 수용체 결합제는 표적 세포의 표면의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하여, 표적 세포에 신호를 유도 또는 조절하는 것인 방법.
175. 구현예 173 또는 구현예 174에 있어서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
176. 구현예 175에 있어서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고, 상기 방법은 제2 수용체-결합제를 포함하는 올리고머 입자 시약에 가역적으로 결합하는 단계를 추가적으로 포함하며, 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있는 것인 방법.
177. 구현예 176에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 방법.
178. 구현예 176 또는 구현예 177에 있어서, 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 방법.
179. 구현예 174, 175, 177, 또는 178 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 공동자극 또는 액세서리 분자에 결합하고, 공동자극 또는 액세서리 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM으로부터 선택되는 것인 방법.
180. 구현예 174, 175, 177, 또는 178 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 사이토카인 수용체는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2 중에서 선택되는 것인 방법.
181. 구현예 174, 175, 177, 또는 178 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하고, 케모카인 수용체는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택되는 것인 방법.
182. 구현예 174, 175, 177, 또는 178 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 또는 케모카인 제조를 유도하는 인자이며, 상기 인자는 사이토카인 또는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
183. 구현예 182에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 사이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며,
리간드는 IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, I형 IFNR, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 및 TNFR2에 특이적으로 결합하고; 및/또는
리간드는 IL-2, IL-1, IL-15, IFN-감마, TNF-알파, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 및 TNF으로부터 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
184. 구현예 183에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드이며,
리간드는 CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 및 CXCR4 중에서 선택되는 케모카인 수용체에 특이적으로 결합하거나; 또는
리간드는 CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 및 CCL25로부터 선택되거나 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
185. 구현예 174, 175, 177, 또는 178 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제 (제2 수용체-결합제)는 접합 분자이며, 상기 접합 분자는 CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-셀렉틴), 및 CD29/CD49d (VLA-4), CD106 (VCAM-1) 중에서 선택되거나, 또는 이의 생물학적 활성 단편인 것인 방법.
186. 구현예 164-185 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 선별제를 포함하며, 선별제는 표적 세포의 표면에 발현된 선별 마커에 결합하거나 또는 이에 결합할 수 있는 것인 방법.
187. 구현예 186에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 방법.
188. 구현예 186 또는 구현예 187에 있어서, 표적 세포는 림프구 또는 항원-제시 세포인 것인 방법.
189. 구현예 186-188 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포 또는 수지상 세포인 것인 방법.
190. 구현예 186-189 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
191. 구현예 186-190 중 어느 하나에 있어서, 선별 마커는 CD25, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO인 것인 방법.
192. 표적 세포는 혈액 세포, 백혈구, 림프구, B 세포, B 세포 집단, T 세포, T 세포 집단, NK 세포, 수지상 세포 및/또는 대식세포를 포함하는 것인 방법.
193. 구현예 186-192 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 재조합 수용체를 발현하는 것인 방법.
194. 구현예 186-193 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 재조합 T 세포 수용체 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 것인 방법.
195. 구현예 186-194 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 질병 및/또는 암과 관련된 항원에 결합하는 CAR를 발현하는 것인 방법.
196. 구현예 195에 있어서, 항원은 αvβ인테그린 (avb6 인테그린), B 세포 성숙화 항원 (BCMA), B7-H6, 탄산 무수화효소 9 (CA9, 또한 CAIX 또는 G250으로도 알려짐), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B (CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2으로도 알려짐), 암배아 항원 (CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4 (CSPG4), 표피 성장 인자 단백질 (EGFR), 절두된 표피 성장 인자 단백질 (tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이 (EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40 (EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2 (EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5 (FCRL5; 또한 Fc 수용체 상동체 5 또는 FCRH5로도 알려짐), 태아 아세틸콜린 수용체 (태아 AchR), 엽산 결합 단백질 (FBP), 엽산 수용체 알파, 태아 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화 GD2 (OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100 (gp100), G 단백질 연결 수용체 5D (GPCR5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), erbB 이합체, 인간 고분자량-흑색종-관련 항원 (HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1 (HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Ra), IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접합 분자 (L1CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 풍부 반복 서열 8 패밀리 구성원 A 함유 (LRRC8A), 루이스 Y, 흑색종-관련 항원 (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린, c-Met, 쥐과 거대세포바이러스 (CMV), 뮤신 1 (MUC1), MUC16, 자연 살해 그룹 2 구성원 D (NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 접합 분자 (NCAM), 종양 태아 항원, 종양에서 우선적으로 발현되는 흑색종 항원 (PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원 (PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 오펀 수용체 1 (RORl), 서바이빈, 영양막 당단백 (TPBG 또한 5T4로도 알려짐), 종양-관련 당단백 72 (TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), Wilms 종양 1 (WT-1), 병원체-특이 항원 또는 보편적인 표지(tag)와 관련된 항원, 및/또는 비오틴화된 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병원체에 의해 발현되는 분자인 것인 방법.
197. 구현예 186-196 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제와 올리고머 입자 시약 사이의 가역적 결합을 파괴하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
198. 구현예 197에 있어서, 상기 파괴 단계는 하나 이상의 시제와 올리고머 입자 시약 사이의 결합을 역전시킬 수 있는 물질을 포함하는 조성물을 표적 세포에 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
199. 구현예 198에 있어서, 상기 물질은 유리 결합 파트너 및/또는 경쟁 시제인 것인 방법.
200. 구현예 197-199 중 어느 하나에 있어서, 상기 파괴 단계는 표적 세포, 선택적으로 T 세포에서 하나 이상의 시제에 의해 유도되거나 또는 조절되는 신호를 종결 또는 감소시키는 것인 방법.
201. 구현예 197-200 중 어느 하나에 있어서, 상기 물질은 스트렙타비딘-결합 펩타이드, 비오틴 또는 생물학적 활성 단편, 선택적으로 D-비오틴, 또는 비오틴 유사체 (또는 생물학적 활성 단편)을 포함하는 것인 ㅂ아법.
202. 구현예 201에 있어서, 상기 물질은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　18) 및 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호　19)으로 구성된 군으로부터 선택된 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하는 것인 방법.203. 구현예 197-202 중 어느 하나에 있어서, 파괴 단계는 상기 인큐베이션의 개시 이후 5 일 내에 수행되는 것인 방법.
204. 구현예 164-203 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 수용체-결합제는 항체 또는 항원-결합 이의 단편이거나 이를 포함하는 것인 방법.
205. 구현예 204에 있어서, 하나 이상의 수용체-결합제는 1가 항체 단편이거나 이를 포함하는 것인 방법.
206. 구현예 204 또는 구현예 205에 있어서, 하나 이상의 시제는 Fab이거나 이를 포함하는 것인 방법.
207. 구현예 164-206 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 면역 세포인 것인 방법.
208. 구현예 164-207 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
209. 구현예 176-208 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 표적 세포의 표면 상의 분자에 결합할 수 있는 자극제이거나, 이를 포함하며, 이러한 결합은 표적 세포에서 신호를 유도 또는 조절하는 것인 방법.
210. 구현예 176-209 중 어느 하나에 있어서, 수용체-결합제는 T 세포에서 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있고, TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하고; 및/또는 CD3에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
211. 구현예 209 또는 구현예 210에 있어서, 자극제는 제1 수용체-결합제이고 올리고머 입자 시약은 제2 수용체-결합제를 포함하며, 제2 수용체-결합제는 표적 세포의 표면의 제2 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 제2 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 신호를 선택적으로 유도 또는 조절할 수 있는 것인 방법.
212. 구현예 211에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자, 액세서리 분자, 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하며, TNF 패밀리의 구성원 또는 TNF 패밀리 수용체, 사이토카인 수용체, 케모카인 수용체이거나, 또는 접합 분자를 포함하거나 또는 사이토카인 제조, 케모카인 제조 및/또는 접합 분자의 발현을 유도하는 인자를 포함하는 것인 방법.
213. 구현예 211 또는 구현예 212에 있어서, 제2 수용체-결합제는 공동자극 분자에 특이적으로 결합하고, 공동자극 분자는 CD28인 것인 방법.
214. 구현예 176-213 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 시제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 선택적으로 항-CD3 Fab 및 항-CD28 Fab인 것인 방법.
VIII. 실시예
다음의 실시예는 오직 설명의 목적으로 제공되는 것이며 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1: 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 올리고머 시약의 제조 방법.
STREP-TACTIN®M2으로 명명된 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인 (서열 번호61 제시된 뮤테인 아미노산 서열을 포함하는 스트렙타비딘 동종-사합체, 예를 들어 미국 특허 6,103,493 및 Voss and Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982 참조)을 중합하여 올리고머 시약을 제조하였다. 올리고머화를 위한 스트렙타비딘 뮤테인을 제조하기 위해, 하나 이상의 반응성 싸이올 기를 포함하는 스트렙타비딘 뮤테인을 말레이미드 활성화된 스트렙타비딘 뮤테인과 인큐베이션하였다. 싸이올화 스트렙타비딘 뮤테인을 제조하기 위해, 약 100 mg의 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 2-이미노싸이올란 클로라이드와 100 mM 보레이트 완충액에서 전체 2.6 mL의 부피로 1 시간 동안 24 ℃에서 약 pH 8.5에서 1:100의 몰비로 인큐베이션에 의해 싸이올화하였다. 말레이미드를 도입하는 활성화 반응을 위해, 약 400 mg의 스트렙타비딘 뮤테인 사합체를 석신이미딜-6-[(β-말레이미도프로피온아마이도) 헥사노에이트 (SMPH)와 소듐 포스페이트 완충액에서 전체 약 10.4 mL의 부피로 1 시간 동안 24 ℃에서 약 pH 7.2에서 1:2의 몰비로 인큐베이션하였다. 싸이올화 및 말레이미드 활성화 반응은 거의 동시에 시작하도록 조정하였고, 반응 기간을 제어하였다.
반응 후, STREP-TACTIN®M2와 반응하지 않은 2-이미노싸이올란 클로라이드 및 SMPH는, 저분자량 반응 부산물 (주로 NHS)와 함께, PD-10 탈염 컬럼 (GE Healthcare)으로 샘플의 겔 여과를 개별적으로 수행함으로써 샘플로부터 제거되었다. 각 2.5 mL 부피의 샘플에 대하여, PD-10 컬럼 (8.3 ml 베드 부피)을 평형화시키고 싸이올화 뮤테인 스트렙타비딘 또는 말레이미드 뮤테인 스트렙타비딘과 함께 로딩하여 3.5 mL의 커플링 완충액 (100 mM NaH2P4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.2)을 첨가하여 용출을 수행하였다. 말레이미드 뮤테인 스트렙타비딘의 겔 여과는 >10 mL 부피에 대해 설명하기 위해 4개의 컬럼에서 수행하였고 용출액을 모았다. 활성화 및 싸이올화 반응의 시기, 및 활성화 및 싸이올화 반응의 종료와 올리고머화 반응의 시작 사이의 시기를 신중하게 제어하였다. 일반적으로, 겔 여과의 시작으로부터, 즉, 활성화 및 싸이올화 반응의 종료로부터, 올리고머화 반응이 개시될 때까지 대략 10분이 경과하도록 하였다.
올리고머화를 위해, 말레이미드 스트렙타비딘 뮤테인 및 싸이올화된 스트렙타비딘 뮤테인 샘플을 전체 약 17.5 mL의 부피로 조합하고 약 600 rpm에서 교반하는 조건하에서 24 ℃의 pH 7.2에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 4배 이상의 스트렙타비딘 뮤테인이SMPH와, 이후 2-이미노싸이올란 클로라이드와 인큐베이션 하기 때문에, 올리고머화 반응 동안 싸이올화 스트렙타비딘 뮤테인 및 말레이미드 스트렙타비딘 뮤테인의 몰비는 1:4 이었다. 반응 이후, 올리고머화된 스트렙타비딘 뮤테인 시약 중 잔여의 SH 기를 N-에틸말레이미드 (NEM)와 교반 (약 600 rpm) 하면서 24 ℃에서 15 분간 인큐베이션한 뒤, 추가로 4 ℃에서 16-20 시간 동안 인큐베이션함으로써 포화시켰다.
NEM와의 인큐베이션 이후, 올리고머화된 Strep-Tactin 뮤테인을 포함하는 샘플을 원심분리하고 상청액을 0.45 μm 멤브레인 (Millex-HP 0.45 μm, Merck Millipore)을 통해 여과시켰다. 여과된 용액을 AKTA Explorer 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare)으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 위해 컬럼 (Sephacryl S-300 HR HiPrep 26/60, GE Healthcare)에 로딩하였다. 수집 말미에 밀리 흡광 단위 (mAU)가 1500 mAU 이상인 분획을 모았다.
올리고머 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 모아진 샘플을 실온에서 15 분간 890 mM pH 6.35의 첨가에 의해 100 mM 하이드록실아민으로 처리하였다 처리 이후 하이드록실아민을 제거하기 위해, 샘플을 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.2으로 평형화시킨 PD10 컬럼에 로딩하고 (컬럼 당 2.5 mL) 3.5 mL의 동일한 완충액 (100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.2)으로 용출하였다. PD10 용출액을 모으고 0.45 μm 필터, 이어서 0.22 μm 필터로 멸균 여과한 뒤, 샘플을 동결시키고 -80 ℃에서 저장하였다. 동결하기 전, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 최종 농도를 측정하고 동적 광산란 (DLS)에 의해 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 크기를 결정하였다.
올리고머화 공정의 일관성을 평가하기 위해, 5개의 상이한 스트렙타비딘 뮤테인 (SAM) 로트로부터 상기 기재된 방법을 사용하여 10개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 제조하였다. 올리고머의 평균 크기, 수율 백분율 (기준선 보정없이 280 nm에서 흡광도를 측정하여 결정) 및 올리고머의 활성 (비오틴 결합)을 평가하고 결과를 표 E1에 나타냈다. 결과는 생성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약이 이러한 파라미터에서 97 nm ± 10 nm의 평균 반경 및 40 nmol/mg ± 3 nmol/mg의 비오틴 결합과 일관된 것을 나타냈다.
표 E1: 상이한 배치로부터 올리고머화된 STREP- TACTIN의 비교.
상기 기재된 바와 같이 생성된 3 개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 평균 분자량 (MW)을 UV 검출기 (MALLS DAWN HELEOS (Wyatt)가 결합된 Agilent UV 검출기)를 가지는 HPLC 시스템 (AGILENT 1100 및 Wyatt ECLIPSE DUALTEC)으로 수행되는 비대칭 유동장 유동 분류법(AF4)에 의해 측정하였다. AF4에 의한 측정은 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 평균 분자량을 52,500 g/mol (52.5 kDa)으로 가정하여 각 올리고머 시약 내 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 평균 개수를 계산하도록 하였다 (표 E2).
표 E2: 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 크기 및 분자량
실시예 2: 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 올리고마화에 영향을 주는 파라미터의 평가.
실시예 1에 기재된 방법의 다양한 파라미터를 평가하여, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 생성하는 절차의 상이한 측면에 대한 영향을 평가하였다.
A. pH 수준
올리고머 크기 및 생성물 수율에 대하여 상이한 pH에서의 싸이올화 반응을 수행하는 효과를 평가하였다. 이미노싸이올란은 클로라이드로서 구매하였고, 이를 pH 8.5에서 100 mM 보레이트 완충액에 100 mg/mL의 농도로 용해하여 pH 7.8까지 pH ± 0.7 단위로 감소를 유도하였다. 보레이트 완충액이 더욱 낮은 강도로, 즉, 25 mM으로 사용되는 경우, 이미노싸이올란 클로라이드를 100 mg/mL의 농도로 첨가하여 pH 6.9까지 더 큰 1.6 단위의 pH 강하를 유도하였다. 싸이올화 반응은 25 mM 보레이트 완충액에서 100 mg의 스트렙타비딘 뮤테인과 2-이미노싸이올란 클로라이드를 상이한 pH인, pH 7.5, pH 8.5, 및 pH 9.5에서 1:100의 몰비로 인큐베이션하여 수행하였다. 싸이올화 스트렙타비딘 뮤테인을 말레이미드 활성화된 스트렙타비딘 뮤테인과 조합하고 올리고머화 공정은 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 표 E3에 나타난 바와 같이, 싸이올화 반응에 사용된 보레이트 완충액의 pH가 감소하면 올리고머 크기 및 수율이 감소하는 반면, pH가 증가하면 크기 및 수율이 증가한다. pH 9.5 조건으로의 실험 동안 발생한 부주의한 재료 손실로, 수율이 감소하였다. 표 E3에서 괄호 안의 값은 손실이 발생하지 않은 경우의 계산된 수율을 반영한다.
표 E3: 상이한 pH에서의 싸이올화 이후 STREP-TACTIN 올리고머 크기 및 수율
보다 강한 완충액 (즉, 최종 반응 혼합물에서 pH 증가를 수반하는 25 mM와 비교하여 100 mM 보레이트 완충액)이 반응 동역학을 변화시키는지 평가하기 위해, 이미노싸이올란 활성화 반응을 실시예 1 기재된 바와 같이 수행하였다. 순 싸이올 작용 함량은 반응 동안 여러 시점에서 엘만 시약(Ellman's reagent)에 의해 결정하였다. 100 mM 보레이트 완충액에서의 반응 속도가 도 1에 도시되어 있으며, 보레이트 완충액에서 수행되는 경우보다 더욱 빠르며 더욱 많은 SH 기를 도입하는 것을 관찰되었다. 이미노싸이올란 활성화 반응은 싸이올 작용의 피크 농도를 25mM 보레이트 완충액에서 수행될 때 50 내지 150 분과 비교하여 100 mM 보레이트 완충액에서 시작된 후 25분 일찍 달성하였으며, 이것은 25 mM 완충액 대신에 100 mM 완충액을 사용할 때 반응이 일어나는 더 높은 최종 pH의 결과이다.
올리고머화 공정의 다른 단계에 대한 pH의 영향을 또한 평가하였다. 상이한 pH, pH 8.3 및 8.5에서의 반응 완충액 (25 mM 보레이트)으로, 및 상이한 pH, pH 7.0 및 7.2에서의 커플링 완충액 (100 mM 포스페이트)으로 올리고머화 반응을 수행하였다. 더 낮은 pH (pH 8.5를 대신하여 pH 8.3)에서의 싸이올화 반응을 수행하면, 더 낮은 pH (pH 7.3를 대신하여 pH 7.0)에서의 활성화 또는 커플링 반응을 수행하는 것 보다 올리고머 크기에 더 큰 영향을 미친다. 그러나, pH 7.0에서 활성화 반응 또는 커플링 반응을 수행하면 pH 7.2에서 상기 반응들을 수행하는 것과 비교하여 올리고머 크기가 감소되었다.
B. 싸이올화 반응에 대한 시기 및 pH의 영향
이미노싸이올란-활성화된 (싸이올화된) 스트렙타비딘 뮤테인의 분석을 수행하여 싸이올 작용 붕괴가 (말레이미드와 결합할 수 없는) 다이설파이드 형성에 기인한 것인지, 또는 N-치환된 이미노싸이올란으로의 이성질체화에 기인한 것인지 결정하였다.
하나의 실험에서, 이미노싸이올란과의 싸이올화 반응 이후 412 nm에서의 흡광도를 측정하여 엘만 시약으로 상이한 시점에 순수 싸이올 작용 함량을 검출하였다. 반응은 pH가 pH 8.3 또는 8.5인 25 mM 보레이트 완충액에서 수행하였지만, 반응 동안의 실제 pH는 7보다 약간 더 낮았다. 도 2에 도시된 바와 같이, 싸이올 작용 함량은 50 내지 150 분에 (전자는 pH 8.5 사용 및 후자는 pH 8.3 사용) 최대에 도달하였고, 높이는 pH 의존적이었다 (pH 8.3를 사용할 때와 비교하여 pH 8.5를 사용할 때 더 높았다). 3 시간 후 두 가지 pH 모두에서 반응 동안 스트렙타비딘 뮤테인 중 싸이올 작용 함량은, 3 시간 이후, 더 높은 pH 8.5를 사용하여 생성된스트렙타비딘 뮤테인이 더 많은 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 것을 입증하였다. 추가의 실험은 다이설파이드 형성이 SH 작용기의 감소의 원인이 되는 경우 역전될 수 있는 SH 작용기의 감소가 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)의 첨가에 의해 영향을 받지 않음을 나타냈다.
또한, 스트렙타비딘 뮤테인을 이미노싸이올란과 함께 pH 8.3 및 8.5에서 25 mM 보레이트 완충액을 사용하여 10 분, 50 분 또는 390 분간 인큐베이션함으로써 싸이올화하고, 반응 생성물을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 통해 Agilent Bio SEC-3 3 μm 300Å 컬럼을 사용하여 100 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.0으로 0.4 mL/분의 유속을 사용하여 분석하였다. 크기를 결정하기 위해, 분자량 표준을 사용하였다 (도 3에서 158,000 Da, 44,000 Da, 17,000 da 또는 1,350 Da에서의 피크로 표시). SEC 분석은 도 3에 도시되며, 여기서 비-활성화된 스트렙타비딘 뮤테인 사합체는 점선으로 도시된다. 비-활성화된 뮤테인 사합체는 가장 낮은 체류 시간을 가지는 것으로 발견된 반면, 싸이올화된 샘플은 이미노싸이올란과 더욱 오래 반응하게 될수록 느리게 이동하는 것을 발견하였다 (더 작은 분자량과 일치한다). 이미노싸이올란과 반응하는 관찰된 샘플 피크는 본질적으로 크기가 동일하였으며 더 낮은 체류 시간을 가지는 피크는 관찰되지 않았다. 이에 따라, 분석으로부터, 다이설파이드 형성의 경우에, 이미노싸이올란과 장기간 반응 동안 이합체 또는 고차 올리고머가 생성되지 않은 것으로 결론지을 수 있다.
SH 함량 붕괴에 대한 시기의 효과를 평가하기 위해, 25 mM 보레이트 완충액 중의 상이한 pH (pH 8.3, 8.5, 또는 8.7)에서 스트렙타비딘 뮤테인의 1 시간 또는 3 시간 이미노싸이올란 활성화의 말미에 순 싸이올 작용 함량을 평가하였다. 반응 및 PD10 겔 여과 이후, 엘만 시약 5,5′다이싸이오비스-(2-나이트로벤조에이트) (DTNB)를 첨가한 후 412 nM에서 흡광도를 측정하여 SH 함량을 결정하였다. 반응은 412 nm에서 최대 흡수를 가지는 5-싸이오를 방출한다. 412 nm에서의 흡광도 증가를 측정하고 412 nm에서 TNB2 이온의 몰 흡광계수로 나누면, 분자의 유리 설프하이드릴 함량이 산출될 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 1 시간 반응 후 싸이올 작용 함량은 pH 의존적인 반면, 3 시간 반응 후 싸이올 작용 함량에 대한 pH의 영향은 거의 없었다. 더 긴 활성화 반응은 싸이올 작용 함량에 대한 pH의 영향을 감소시킬 수 있고, 따라서, pH 의존적 크기 변화의 측면에서 반응을 더욱 견고하게 만들 수 있지만, 재이성질체화로 인해 장기간 크기 불안전성의 근원이 될 수 있는 N-치환된 이미노싸이올란을 또한 증가시킬 수도 있다는 가설이 있다.
싸이올 형성이 부재한 가운데 싸이올 작용기 붕괴를 측정하기 위해, 싸이올화 반응이 종료된 후, 즉, 이미노싸이올란 시약을 제거한 후, 여러 시점에서 싸이올 작용 함량을 측정하였다. PD10 겔 여과에 의해 2-이미노싸이올란을 제거한 후 다양한 시점에 엘만 시약으로 싸이올화 스트렙타비딘의 SH 함량을 측정하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 싸이올 작용의 5% 붕괴는 반응 종료 후 10 분 뒤 검출되었고, 싸이올 작용의 26% 붕괴는 반응 후 60 분 뒤에 검출되었고, 45% 붕괴는 반응 후 120 분에 검출되었다. SH 손실의 반감기는 139 분으로서 산출되었다. 이것은 이미노싸이올란의 종료와 SMPH 활성화 및 다합체화 반응의 시작 사이에 상이한 시간을 사용하는 효과를 나타낸다.
C. 스트렙타비딘 뮤테인과 SMPH의 몰비
스트렙타비딘 뮤테인의 올리고머화에 대한 SMPH 활성화 반응에서 SMPH 및 스트렙타비딘 뮤테인 농도의 영향을 평가하기 위해, 올리고머화 절차를 상이한 농도 (± 10% 범위)의 SMPH 및 스트렙타비딘 뮤테인으로 수행하였다. SMPH 또는 스트렙타비딘 농도의 10% 증가 또는 감소는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 크기의 차이를 검출할 수 있게 하였다. 일부 양태에서, 이러한 파라미터 (Strep-Tactin 및 SMPH의 농도)의 정확도가 ± 2% 보다 높아야 한다.
D. 올리고머의 안정화
싸이올화로부터 반응하지 않은 N-치환된 이미노싸이올란은 라이신 잔기 및 스트렙타비딘 뮤테인의 유리 N-말단에 잔류하여 올리고머의 합성 후 크기 증가에 기여할 수 있다. 합성 후 올리고머 성장에 대한 하이드록실아민 처리의 효과를 평가하기 위해, 올리고머화 절차 실시예 1에 도시된 바와 같이 수행하되, 절차는 이미노싸이올란과의 1 시간 활성화 반응 (샘플 1 및 2) 또는 이미노싸이올란과의 3.5 시간 활성화 반응 (샘플 3 및 4)을 수반하였다. 또한, 이러한 연구에서, SEC를 수행한 후, 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약을 포함하는 샘플은 실온에서 15 분간 pH 6.35 에서 100 mM 하이드록실아민 (HA)으로 처리를 받았거나 (샘플 1 및 3) 또는 하이드록실아민 처리를 받지 않았다 (샘플 2 및 4). 샘플을 분획으로 분할하고 -80 ℃, 4 ℃, 또는 37 ℃에서 저장하였다. 합성 직후 (제0일) 및 합성 후 1 주, 3 주, 및 9 주에 DLS으로 올리고머 크기를 측정하였다. 그 결과를 표 E4에 나타냈다.
표 E4:합성 후 성장에 대한 저장 온도 및 하이드록실아민 처리의 효과
표 E4에 나타난 바와 같이, 하이드록실아민 처리는 4 ℃ 및 37 ℃ 온도에서 저장하는 동안 올리고머의 성장을 감소시켰다. 크기는 하이드록실아민 처리와 관계없이 -80 ℃에서의 저장 동안 안정한 것으로 관찰되었다. 샘플 3 및 4는 3.5 시간 동안 활성화되었고, 더욱 뚜렷한 올리고머의 합성 후 성장을 나타내었다. 일부 양태에서, 3.5 시간의 활성화 시간은 1 시간의 활성화 시간만큼 pH 변화에 민감하지 않지만 (실시예 2B 참조), N-치환된 이미노싸이올란의 높은 함량을 초래할 수 있으나, 이러한 이론에 구속되고자 하는 것은 아니다. 이와 함께, 결과는 하이드록실아민 처리는 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머의 합성-후 성장을 감소시키는 것을 나타냈다. 데이터는 또한 -80 ℃에서의 저장이 올리고머의 안전성을 향상시키는 것을 입증하였다. 이에 따라, 일부 양태에서, 하이드록실아민 처리와 이에 이어서 -80 ℃ 온도에서의 저장 두 가지 모두를 조합하면, 장기간 저장 동안을 포함하여 일관된 크기를 유지하기 위해 향상된 안정성을 제공할 수 있다.
실시예 3: 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합된 올리고머화된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편을 포함하는, 가용성 자극 시약의 생성.
자극제 (항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편)는 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약에 가역저그로 결함함으로써 다합체화된다. 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편은 각 Fab 단편에 접합된 스트렙타비딘 펩타이드-결합 파트너를 통해 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합되었다. 항-CD3 Fab 단편은 하이브리도마 세포주 OKT3에 의해 생성된 CD3 결합 단일클론 항체로부터 유도되며 (ATCC®CRL-8001™또한 미국 특허 1,996 참조), 문헌 [Arakawa et al J. Biochem. 120, 657-662 (1996)]에 기재된 항-CD3 항체 OKT3의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 포함하였다. 이러한 서열은 각각 서열 번호 31 및 32에 제시된다. 항-CD28 Fab 단편은 항체 CD28.3으로부터 유도되며 (GenBank 수탁번호 AF451974.1 하에 합성 단일 사슬 Fv 구조물로서 기탁됨; 문헌 Vanhove et al., BLOOD, 15 July 2003, Vol. 102, No. 2, pages 564-570 참조) 각각 서열 번호 33 및 34에 제시된 항-CD28 항체 CD28.3의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 를 포함한다. Fab 단편을 이의 중쇄의 카복시-말단에서 아미노산 서열 SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (서열 번호 16)을 가지는 두 개의 스트렙타비딘 결합 모듈의 순차적인 배열을 포함하는 스트렙타비딘 펩타이드-결합 서열에 개별적으로 접합시켰다. 펩타이드-태그된 Fab 단편은 재조합적으로 생산되었다 (국제 특허 출원 공보 WO 2013/011011 및 WO 2013/124474).
가역적 결합을 수행하기 위해, 펩타이드-태그된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편을 대략 실온에서 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약과 함께 혼합하여, 시약 상의 결합 부위에 가역적으로 결합할 수 있는 결합 파트너인 Fab 단편 상의 트윈-strep-태그 사이의 상호 작용을 통해 이들을 시약에 가역적으로 결합시켰다. 일부 경우에, 펩타이드-태그된 Fab 단편을 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 상에 고정하기 전에 미리 혼합하였고, 이는 일부 예시에서, 상이한 Fab 분자의 더욱 균일한 분포를 초래할 수 있었다.
실시예 4: 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합된 올리고머화된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편의 활성 평가
실시예 1에 기재된 공정에 의해 표 E1에 기재된 배치 각각으로부터 다양한 올리고머 스트렙타비딘 시약에 가역적으로 결합된 항-CD3 및 항-CD28 Fab 단편에 대해 T 세포 자극 능력을 평가하였다. 이러한 올리고머 스트렙타비딘 시약은 평균 반경이 약 95 nm이었다. 안정한 테트라졸륨 염 WST-1의 가용성 포마잔 염료 복합체로의 절단의 비색 모니터링하여, 세포 증식의 지표로서 세포의 대사 안전성을 평가하였다.
세 가지 상이한 공여체로부터의 T 세포를, 올리고머 스트렙타비딘 시약에 가역적으로 결합된 항-CD3/항-CD28 다합체화된 Fab 단편과 함께 인큐베이션하였다. 또한, 평균 반경이 101 (내부 기준) 또는 36 nm이며, 또한 항-CD3/항-CD28 Fab 단편에 가역적으로 결합된 대조군 올리고머 시약과 세포를 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후, WST-1 시약을 세포에 적용하고, 판독으로서 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 대사 활성 수준을 평가하였다. 결과를 분석되는 배양물 내 세포 수로 정규화하고 세포 수 당 WST-1의 비율로서 도시하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 시험된 시약 각각으로 자극된 T 세포의 평균 WST-1 활성은 비슷하였다. 게다가, 자극의 정도는 시험된 모든 시약에 대해 유사하였고, 유사한 크기의 내부 기준 시약과 비슷하였다 (일반적으로 ±2 표준 편차 내에서 가변적). 도 6A는 각각의 시약에 대한 별도의 데이터 포인트로서 묘사된 WST-1 활성을 도시한다. 도 6A 및 도 6B는, T 세포의 자극이, WST-1 활성에 의해 관찰된 바와 같이, 더 작은 36 nm 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 백본 상에 다합체화된 항-CD3/항-CD28 Fab를 사용하여 더 낮음을 나타낸다.
실시예 5: 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 제조의 예시적인 방법.
올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약으은 실시예 1에 기재된 방법과 유사하지만 약간의 변형으로 예시적인 방법에 의해 생성되었다. 구체적으로, NEM과의 인큐베이션 후, 올리고머화된 스트렙타비딘 뮤테인을 포함하는 샘플을 원심분리하고 상청액을 0.45 μm 멤브레인을 통해 여과시켰다. 이후 여과된 용액을 실온에서 15 분간 pH 6.35에서 100 mM 하이드록실아민으로 처리하였다. 샘플을 AKTA Explorer 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare)으로 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 위해 컬럼에 로딩하였다. 1500 mAU 이상의 밀리 흡광도 단위 (mAU)를 가지는 분획을 모으고 0.45 μm 필터에 이어 0.22 μm 필터로 멸균 여과하였다. 올리고머화된 스트렙타비딘을 -80 ℃에서 저장하였다. 이에 따라, 실시예 1에 기재된 방법과는 달리, 추가적인 PD-10 기반의 겔 여과는 수행하지 않았다.
예시적인 방법에 따라 제조된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 크기 및 안정성을 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제조된 올리고머와 비교하였다. 올리고머를 분획으로 분할하고 -80 ℃, 4 ℃, 또는 37 ℃에서 저장하였다. 합성 직후 (제0일) 및 합성 후 여러 시점에 DLS으로 올리고머 크기를 측정하였다. 두 방법 모두, 하이드록실아민이 SEC 이후 또는 SEC 이전에 제거되었는지 여부와 관계없이, 유사한 크기 및 안정성의 올리고머를 제조하였다. 도 11에 도시된 바와 같이, -80 ℃, 또는 4 ℃에서 저장된 올리고머는 합성 후 46 주의 긴 시간 동안 10% 미만의 평균 크기 변화를 나타냈다. 37 ℃에서 저장된 올리고머는 합성 후 9 주 후 대략 50%의 크기 증가를 나타냈다.
실시예 6:올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 제품화된 로트의 평가
상이한 원료 배치로 구성된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 로트를 키메라 항원 수용체 (CAR)로 T 세포를 조작하는 공정의 일부로서 평가하였다. 3 가지 별개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 로트는 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 개별 로트 STREP-TACTIN®M2으로부터 생성되었다. 동일한 제품화 로트로부터 접합된 스트렙타비딘 펩타이드-결합 파트너를 포함하는 항-CD3 및 항-CD28 Fab는 실질적으로 상기 기재된 바와 같은 각각의 로트로부터의 개별 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머에 가역적으로 결합되었다. 3 가지 별개의 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 로트는 평균 직경이 100 nm 내지 109 nm이다.
스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약에 컨쥬게이션된 항-CD3/항-CD28 Fab의 3 가지 개별 로트는 1차 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극하도록 사용되었다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 3 가지 개별적인 공여체로부터의 성분 채집 샘플로부터 개별적으로 선별된 후, 선별된 세포를 구체적인 CD4+ 대 CD8+ T 세포 비율로 조합하였다. 조합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 이후 예시적인 조작 공정에 의해 키메라 항원 수용체 (CAR)로 조작되었으며, 이러한 조작은 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약의 로트와 함께 인큐베이션하고, 렌티바이러스로 형질 전환 시킨 후, 팽창을 위해 배양하는 단계를 포함한다. 팽창이 완료되기 전, 스트렙타비딘 올리고머 시약으로부터 항-CD3/항-CD28 Fab를 해리시키기 위해 세포를 비오틴으로 처리하였다. 인큐베이션, 형질도입 및 배양을 위한 조건은 항-CD3/항-CD28 Fab 컨쥬게이션된 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 시험된 모든 로트에 대해 동일하였으며, 각각의 로트는 3 가지 공여 샘플 각각에 대해 최대 4회의 반복 시험으로 시험하였다. 조작된 T 세포의 형질도입 효율을 모니터링하기 위해, 렌티바이러스는 CAR 발현을 검출하기 위한 대리 마커로서 사용하기 위해 리보솜 스킵 서열에 의해 절두된 수용체로부터 분리된 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하였다.
예시적인 조작 공정 중 다양한 단계에서 생존 세포의 총 개수를 정량화하였다. Fab 컨쥬게이션된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약의 첨가 이전에 (제0일), 및 공정 중의 여러 일에 세포를 생존성 염색으로 표지하였다. 도 12A 및 12B에 도시된 바와 같이, 조작 공정 중 상의한 스테이지에서 측정된 생존 세포의 총량 및 생존 세포의 백분율은 상이한 공여체에로부터 Fab-컨쥬게이션된 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머 시약의 상이한 로트를 사용하여 획득한 수득한 세포 사이와 일치하였다.
예시적인 조작 공정으로부터 수집된 세포에서 형질도입 효율을 측정하였다. 세포를 CD4, CD8, 및 대리 마커에 특이적인 항체로 표지하고 유세포 분석에 의해 분석하였다. 전체 생존 T 세포 가운데 CAR+, CAR+CD4+, CAR+CD8+ 세포의 백분율이 도 13에 도시된다. 형질도입 효율은 상이한 Fab-컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약 로트 사이에 일관되었고, 관찰된 가변성은 주로 공여체 공급원에 의존적이었다.
조작된 CAR+ T 세포를 또한 기억 또는 고갈 표현형과 관련된 상이한 마커에 대해 검사하였다. T 세포를 CD3, CD4, CD8, 및 대리 마커, 뿐만 아니라 기억-관련 마커 CCR7, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, 및 CD62L 또는 고갈-관련 마커 CCR7, LAG3, PD-1, 및 TIM3에 특이적인 항체로 표지한 후 유세포 분석에 의해 분석하였다. 기억 관련 또는 고갈 관련 마커에 대한 염색에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 기억 관련 및 고갈 관련 표현형 마커에 따른 주요 성분 분석을 수행하였다. Fab-콘쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 개별 로트보다는 공여체에 따라 분리된 누적 데이터 비교로부터 유래된 클러스터는 조작 공정 동안 일어날 수 있는 T 세포의 기억 및 고갈 관련 표현형에 대한 시약의 일관성과 일치하였다.
StrepTactin-PE 염색에 의한 잔류하는 항-CD3 및 항-CD28 Fab의 검출, 또는 StrepTactin에 특이적인 항체를 가지는 잔류하는 뮤테인 스트렙타비딘의 검출에 의해, 세포 표면 상에 잔류하는 Fab 또는 뮤테인 스트렙타비딘의 존재에 대하여 조작된 CAR+ T 세포를 분석하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 1% 미만의 생존 T 세포는 Fab 또는 뮤테인 스트렙타비딘에 대해 양성이었다.
CAR-의존적 항원 활성은 조작된 CAR+ T 세포를 CAR의 표적 항원을 발현시키는 조사된 세포와 함께 공동-배양하여 평가하였다. 조사된 항원 발현 세포의 부재하에 배양된 T 세포는 음성 대조군으로서 작용하였다. 4 시간의 공동-배양 후, T 세포를 세포 내 사이토카인 염색법(ICS)에 의해 세포 내 IL-2, IFN-감마, 및 TNF-알파에 대해 평가하고, CAR 발현 및 CD3를 나타내는 대리 마커에 대해 염색하고, 유세포 분석에 의해 평가하였다. 상이한 공여체로부터 유래한 CAR+ CD3+ T 세포들 및 Fab-컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 로트의 존재하에 제조된 세포에서 IL-2, IFN-감마, 및 TNF-알파에 대해 양성인 유사한 세포 백분율, 뿐만 아니라 2 또는 3 개의 사이토카인을 발현시키는 세포 백분율이 관찰되었다.
5:1의 이펙터 세포 대 표적 세포의 비율로 CAR의 표적 항원을 발현하는 표적 세포와 세포를 공동 배양한 후 조작된 CAR + T 세포에서 세포 용해 활성을 평가하였다. 부착 성 표적 세포를 전자 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 시딩하고, 부착된 전극 사이의 전류 임피던스를 측정함으로써 표적 세포 수를 정량화하였다. 대조를 위해, 표적 세포를 단독으로 또는 기준 항-CD3/항-CD28 항체 컨쥬게이션된 상자성 비드 시약과 함께, 예시적인 엔지니어링 공정 동안 배양된 T 세포와 함께 배양하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, CAR+ T 세포는 검정에서 효과적인 사멸을 입증하였다. 관찰된 세포 용해 활성은 상이한 개별 공여자로부터 수득된 T 세포 및 제품화된 Fab-컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 상이한 제품화된 로트 사이에서 유하사였다.
종합해보면, 이러한 데이터는 제공된 방법에 의해 생성된 Fab-컨쥬게이션된 올리고머 스트렙타비딘 뮤테인 시약의 높은 수준의 일관성을 유지한다.
본 발명은 예를 들어 본 발명의 다양한 양태를 예시하기 위해 제공되는 특정 개시된 구현예로 범위가 제한되도록 의도된 것이 아니다. 기재된 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본 명세서의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 이러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> JUNO THERAPEUTICS GMBH SCHMIDT, Thomas STEMBERGER, Christian KOWSKI, Tom PRENTICE, Ken <120> OLIGOMERIC PARTICLE REAGENTS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 735042008540 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/491,245 <151> 2017-04-27 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> misc_feature <223> Streptavidin <400> 1 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His 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Extracellular Domain (ECD) <400> 55 Gln Glu Cys Thr Lys Phe Lys Val Ser Ser Cys Arg Glu Cys Ile Glu 1 5 10 15 Ser Gly Pro Gly Cys Thr Trp Cys Gln Lys Leu Asn Phe Thr Gly Pro 20 25 30 Gly Asp Pro Asp Ser Ile Arg Cys Asp Thr Arg Pro Gln Leu Leu Met 35 40 45 Arg Gly Cys Ala Ala Asp Asp Ile Met Asp Pro Thr Ser Leu Ala Glu 50 55 60 Thr Gln Glu Asp His Asn Gly Gly Gln Lys Gln Leu Ser Pro Gln Lys 65 70 75 80 Val Thr Leu Tyr Leu Arg Pro Gly Gln Ala Ala Ala Phe Asn Val Thr 85 90 95 Phe Arg Arg Ala Lys Gly Tyr Pro Ile Asp Leu Tyr Tyr Leu Met Asp 100 105 110 Leu Ser Tyr Ser Met Leu Asp Asp Leu Arg Asn Val Lys Lys Leu Gly 115 120 125 Gly Asp Leu Leu Arg Ala Leu Asn Glu Ile Thr Glu Ser Gly Arg Ile 130 135 140 Gly Phe Gly Ser Phe Val Asp Lys Thr Val Leu Pro Phe Val Asn Thr 145 150 155 160 His Pro Asp Lys Leu Arg Asn Pro Cys Pro Asn Lys Glu Lys Glu Cys 165 170 175 Gln Pro Pro Phe Ala Phe Arg His Val Leu Lys Leu Thr Asn Asn Ser 180 185 190 Asn Gln Phe Gln Thr Glu Val Gly Lys Gln Leu Ile Ser Gly Asn 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Thr 405 410 415 Val Gln Val Leu Pro Gln Cys Glu Cys Arg Cys Arg Asp Gln Ser Arg 420 425 430 Asp Arg Ser Leu Cys His Gly Lys Gly Phe Leu Glu Cys Gly Ile Cys 435 440 445 Arg Cys Asp Thr Gly Tyr Ile Gly Lys Asn Cys Glu Cys Gln Thr Gln 450 455 460 Gly Arg Ser Ser Gln Glu Leu Glu Gly Ser Cys Arg Lys Asp Asn Asn 465 470 475 480 Ser Ile Ile Cys Ser Gly Leu Gly Asp Cys Val Cys Gly Gln Cys Leu 485 490 495 Cys His Thr Ser Asp Val Pro Gly Lys Leu Ile Tyr Gly Gln Tyr Cys 500 505 510 Glu Cys Asp Thr Ile Asn Cys Glu Arg Tyr Asn Gly Gln Val Cys Gly 515 520 525 Gly Pro Gly Arg Gly Leu Cys Phe Cys Gly Lys Cys Arg Cys His Pro 530 535 540 Gly Phe Glu Gly Ser Ala Cys Gln Cys Glu Arg Thr Thr Glu Gly Cys 545 550 555 560 Leu Asn Pro Arg Arg Val Glu Cys Ser Gly Arg Gly Arg Cys Arg Cys 565 570 575 Asn Val Cys Glu Cys His Ser Gly Tyr Gln Leu Pro Leu Cys Gln Glu 580 585 590 Cys Pro Gly Cys Pro Ser Pro Cys Gly Lys Tyr Ile Ser Cys Ala Glu 595 600 605 Cys Leu Lys Phe Glu Lys Gly Pro Phe Gly Lys Asn Cys Ser Ala Ala 610 615 620 Cys Pro Gly Leu Gln Leu Ser Asn Asn Pro Val Lys Gly Arg Thr Cys 625 630 635 640 Lys Glu Arg Asp Ser Glu Gly Cys Trp Val Ala Tyr Thr Leu Glu Gln 645 650 655 Gln Asp Gly Met Asp Arg Tyr Leu Ile Tyr Val Asp Glu Ser Arg Glu 660 665 670 Cys Val Ala Gly Pro Asn 675 <210> 56 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1 Extracellular Domain (ECD) <400> 56 Phe Lys Ile Glu Thr Thr Pro Glu Ser Arg Tyr Leu Ala Gln Ile Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Thr Cys Ser Thr Thr Gly Cys Glu Ser Pro Phe 20 25 30 Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Asn Gly Lys Val Thr 35 40 45 Asn Glu Gly Thr Thr Ser Thr Leu Thr Met Asn Pro Val Ser Phe Gly 50 55 60 Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Ala Thr Cys Glu Ser Arg Lys Leu 65 70 75 80 Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Ile Tyr Ser Phe Pro Lys Asp Pro Glu 85 90 95 Ile His Leu Ser Gly Pro Leu Glu Ala Gly Lys Pro Ile Thr Val Lys 100 105 110 Cys Ser Val Ala Asp Val Tyr Pro Phe Asp Arg Leu Glu Ile Asp Leu 115 120 125 Leu Lys Gly Asp His Leu Met Lys Ser Gln Glu Phe Leu Glu Asp Ala 130 135 140 Asp Arg Lys Ser Leu Glu Thr Lys Ser Leu Glu Val Thr Phe Thr Pro 145 150 155 160 Val Ile Glu Asp Ile Gly Lys Val Leu Val Cys Arg Ala Lys Leu His 165 170 175 Ile Asp Glu Met Asp Ser Val Pro Thr Val Arg Gln Ala Val Lys Glu 180 185 190 Leu Gln Val Tyr Ile Ser Pro Lys Asn Thr Val Ile Ser Val Asn Pro 195 200 205 Ser Thr Lys Leu Gln Glu Gly Gly Ser Val Thr Met Thr Cys Ser Ser 210 215 220 Glu Gly Leu Pro Ala Pro Glu Ile Phe Trp Ser Lys Lys Leu Asp Asn 225 230 235 240 Gly Asn Leu Gln His Leu Ser Gly Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ala 245 250 255 Met Arg Met Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Val Cys Glu Gly Val Asn Leu 260 265 270 Ile Gly Lys Asn Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Val Gln Glu Lys Pro 275 280 285 Phe Thr Val Glu Ile Ser Pro Gly Pro Arg Ile Ala Ala Gln Ile Gly 290 295 300 Asp Ser Val Met Leu Thr Cys Ser Val Met Gly Cys Glu Ser Pro Ser 305 310 315 320 Phe Ser Trp Arg Thr Gln Ile Asp Ser Pro Leu Ser Gly Lys Val Arg 325 330 335 Ser Glu Gly Thr Asn Ser Thr Leu Thr Leu Ser Pro Val Ser Phe Glu 340 345 350 Asn Glu His Ser Tyr Leu Cys Thr Val Thr Cys Gly His Lys Lys Leu 355 360 365 Glu Lys Gly Ile Gln Val Glu Leu Tyr Ser Phe Pro Arg Asp Pro Glu 370 375 380 Ile Glu Met Ser Gly Gly Leu Val Asn Gly Ser Ser Val Thr Val Ser 385 390 395 400 Cys Lys Val Pro Ser Val Tyr Pro Leu Asp Arg Leu Glu Ile Glu Leu 405 410 415 Leu Lys Gly Glu Thr Ile Leu Glu Asn Ile Glu Phe Leu Glu Asp Thr 420 425 430 Asp Met Lys Ser Leu Glu Asn Lys Ser Leu Glu Met Thr Phe Ile Pro 435 440 445 Thr Ile Glu Asp Thr Gly Lys Ala Leu Val Cys Gln Ala Lys Leu His 450 455 460 Ile Asp Asp Met Glu Phe Glu Pro Lys Gln Arg Gln Ser Thr Gln Thr 465 470 475 480 Leu Tyr Val Asn Val Ala Pro Arg Asp Thr Thr Val Leu Val Ser Pro 485 490 495 Ser Ser Ile Leu Glu Glu Gly Ser Ser Val Asn Met Thr Cys Leu Ser 500 505 510 Gln Gly Phe Pro Ala Pro Lys Ile Leu Trp Ser Arg Gln Leu Pro Asn 515 520 525 Gly Glu Leu Gln Pro Leu Ser Glu Asn Ala Thr Leu Thr Leu Ile Ser 530 535 540 Thr Lys Met Glu Asp Ser Gly Val Tyr Leu Cys Glu Gly Ile Asn Gln 545 550 555 560 Ala Gly Arg Ser Arg Lys Glu Val Glu Leu Ile Ile Gln Val Thr Pro 565 570 575 Lys Asp Ile Lys Leu Thr Ala Phe Pro Ser Glu Ser Val Lys Glu Gly 580 585 590 Asp Thr Val Ile Ile Ser Cys Thr Cys Gly Asn Val Pro Glu Thr Trp 595 600 605 Ile Ile Leu Lys Lys Lys Ala Glu Thr Gly Asp Thr Val Leu Lys Ser 610 615 620 Ile Asp Gly Ala Tyr Thr Ile Arg Lys Ala Gln Leu Lys Asp Ala Gly 625 630 635 640 Val Tyr Glu Cys Glu Ser Lys Asn Lys Val Gly Ser Gln Leu Arg Ser 645 650 655 Leu Thr Leu Asp Val Gln Gly Arg Glu Asn Asn Lys Asp Tyr Phe Ser 660 665 670 Pro Glu <210> 57 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> L-selectin Extracellular Domain (ECD) <400> 57 Trp Thr Tyr His Tyr Ser Glu Lys Pro Met Asn Trp Gln Arg Ala Arg 1 5 10 15 Arg Phe Cys Arg Asp Asn Tyr Thr Asp Leu Val Ala Ile Gln Asn Lys 20 25 30 Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Glu Lys Thr Leu Pro Phe Ser Arg Ser Tyr 35 40 45 Tyr Trp Ile Gly Ile Arg Lys Ile Gly Gly Ile Trp Thr Trp Val Gly 50 55 60 Thr Asn Lys Ser Leu Thr Glu Glu Ala Glu Asn Trp Gly Asp Gly Glu 65 70 75 80 Pro Asn Asn Lys Lys Asn Lys Glu Asp Cys Val Glu Ile Tyr Ile Lys 85 90 95 Arg Asn Lys Asp Ala Gly Lys Trp Asn Asp Asp Ala Cys His Lys Leu 100 105 110 Lys Ala Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Gln Pro Trp Ser Cys Ser 115 120 125 Gly His Gly Glu Cys Val Glu Ile Ile Asn Asn Tyr Thr Cys Asn Cys 130 135 140 Asp Val Gly Tyr Tyr Gly Pro Gln Cys Gln Phe Val Ile Gln Cys Glu 145 150 155 160 Pro Leu Glu Ala Pro Glu Leu Gly Thr Met Asp Cys Thr His Pro Leu 165 170 175 Gly Asn Phe Ser Phe Ser Ser Gln Cys Ala Phe Ser Cys Ser Glu Gly 180 185 190 Thr Asn Leu Thr Gly Ile Glu Glu Thr Thr Cys Gly Pro Phe Gly Asn 195 200 205 Trp Ser Ser Pro Glu Pro Thr Cys Gln Val Ile Gln Cys Glu Pro Leu 210 215 220 Ser Ala Pro Asp Leu Gly Ile Met Asn Cys Ser His Pro Leu Ala Ser 225 230 235 240 Phe Ser Phe Thr Ser Ala Cys Thr Phe Ile Cys Ser Glu Gly Thr Glu 245 250 255 Leu Ile Gly Lys Lys Lys Thr Ile Cys Glu Ser Ser Gly Ile Trp Ser 260 265 270 Asn Pro Ser Pro Ile Cys Gln Lys Leu Asp Lys Ser Phe Ser Met Ile 275 280 285 Lys Glu Gly Asp Tyr Asn 290 <210> 58 <211> 943 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VLA-4 Extracellular Domain (ECD) <400> 58 Asn Val Asp Thr Glu Ser Ala Leu Leu Tyr Gln Gly Pro His Asn Thr 1 5 10 15 Leu Phe Gly Tyr Ser Val Val Leu His Ser His Gly Ala Asn Arg Trp 20 25 30 Leu Leu Val Gly Ala Pro Thr Ala Asn Trp Leu Ala Asn Ala Ser Val 35 40 45 Ile Asn Pro Gly Ala Ile Tyr Arg Cys Arg Ile Gly Lys Asn Pro Gly 50 55 60 Gln Thr Cys Glu Gln Leu Gln Leu Gly Ser Pro Asn Gly Glu Pro Cys 65 70 75 80 Gly Lys Thr Cys Leu Glu Glu Arg Asp Asn Gln Trp Leu Gly Val Thr 85 90 95 Leu Ser Arg Gln Pro Gly Glu Asn Gly Ser Ile Val Thr Cys Gly His 100 105 110 Arg Trp Lys Asn Ile Phe Tyr Ile Lys Asn Glu Asn Lys Leu Pro Thr 115 120 125 Gly Gly Cys Tyr Gly Val Pro Pro Asp Leu Arg Thr Glu Leu Ser Lys 130 135 140 Arg Ile Ala Pro Cys Tyr Gln Asp Tyr Val Lys Lys Phe Gly Glu Asn 145 150 155 160 Phe Ala Ser Cys Gln Ala Gly Ile Ser Ser Phe Tyr Thr Lys Asp Leu 165 170 175 Ile Val Met Gly Ala Pro Gly Ser Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Leu Phe 180 185 190 Val Tyr Asn Ile Thr Thr Asn Lys Tyr Lys Ala Phe Leu Asp Lys Gln 195 200 205 Asn Gln Val Lys Phe Gly Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val Gly Ala Gly 210 215 220 His Phe Arg Ser Gln His Thr Thr Glu Val Val Gly Gly Ala Pro Gln 225 230 235 240 His Glu Gln Ile Gly Lys Ala Tyr Ile Phe Ser Ile Asp Glu Lys Glu 245 250 255 Leu Asn Ile Leu His Glu Met Lys Gly Lys Lys Leu Gly Ser Tyr Phe 260 265 270 Gly Ala Ser Val Cys Ala Val Asp Leu Asn Ala Asp Gly Phe Ser Asp 275 280 285 Leu Leu Val Gly Ala Pro Met Gln Ser Thr Ile Arg Glu Glu Gly Arg 290 295 300 Val Phe Val Tyr Ile Asn Ser Gly Ser Gly Ala Val Met Asn Ala Met 305 310 315 320 Glu Thr Asn Leu Val Gly Ser Asp Lys Tyr Ala Ala Arg Phe Gly Glu 325 330 335 Ser Ile Val Asn Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Gly Phe Glu Asp Val 340 345 350 Ala Ile Gly Ala Pro Gln Glu Asp Asp Leu Gln Gly Ala Ile Tyr Ile 355 360 365 Tyr Asn Gly Arg Ala Asp Gly Ile Ser Ser Thr Phe Ser Gln Arg Ile 370 375 380 Glu Gly Leu Gln Ile Ser Lys Ser Leu Ser Met Phe Gly Gln Ser Ile 385 390 395 400 Ser Gly Gln Ile Asp Ala Asp Asn Asn Gly Tyr Val Asp Val Ala Val 405 410 415 Gly Ala Phe Arg Ser Asp Ser Ala Val Leu Leu Arg Thr Arg Pro Val 420 425 430 Val Ile Val Asp Ala Ser Leu Ser His Pro Glu Ser Val Asn Arg Thr 435 440 445 Lys Phe Asp Cys Val Glu Asn Gly Trp Pro Ser Val Cys Ile Asp Leu 450 455 460 Thr Leu Cys Phe Ser Tyr Lys Gly Lys Glu Val Pro Gly Tyr Ile Val 465 470 475 480 Leu Phe Tyr Asn Met Ser Leu Asp Val Asn Arg Lys Ala Glu Ser Pro 485 490 495 Pro Arg Phe Tyr Phe Ser Ser Asn Gly Thr Ser Asp Val Ile Thr Gly 500 505 510 Ser Ile Gln Val Ser Ser Arg Glu Ala Asn Cys Arg Thr His Gln Ala 515 520 525 Phe Met Arg Lys Asp Val Arg Asp Ile Leu Thr Pro Ile Gln Ile Glu 530 535 540 Ala Ala Tyr His Leu Gly Pro His Val Ile Ser Lys Arg Ser Thr Glu 545 550 555 560 Glu Phe Pro Pro Leu Gln Pro Ile Leu Gln Gln Lys Lys Glu Lys Asp 565 570 575 Ile Met Lys Lys Thr Ile Asn Phe Ala Arg Phe Cys Ala His Glu Asn 580 585 590 Cys Ser Ala Asp Leu Gln Val Ser Ala Lys Ile Gly Phe Leu Lys Pro 595 600 605 His Glu Asn Lys Thr Tyr Leu Ala Val Gly Ser Met Lys Thr Leu Met 610 615 620 Leu Asn Val Ser Leu Phe Asn Ala Gly Asp Asp Ala Tyr Glu Thr Thr 625 630 635 640 Leu His Val Lys Leu Pro Val Gly Leu Tyr Phe Ile Lys Ile Leu Glu 645 650 655 Leu Glu Glu Lys Gln Ile Asn Cys Glu Val Thr Asp Asn Ser Gly Val 660 665 670 Val Gln Leu Asp Cys Ser Ile Gly Tyr Ile Tyr Val Asp His Leu Ser 675 680 685 Arg Ile Asp Ile Ser Phe Leu Leu Asp Val Ser Ser Leu Ser Arg Ala 690 695 700 Glu Glu Asp Leu Ser Ile Thr Val His Ala Thr Cys Glu Asn Glu Glu 705 710 715 720 Glu Met Asp Asn Leu Lys His Ser Arg Val Thr Val Ala Ile Pro Leu 725 730 735 Lys Tyr Glu Val Lys Leu Thr Val His Gly Phe Val Asn Pro Thr Ser 740 745 750 Phe Val Tyr Gly Ser Asn Asp Glu Asn Glu Pro Glu Thr Cys Met Val 755 760 765 Glu Lys Met Asn Leu Thr Phe His Val Ile Asn Thr Gly Asn Ser Met 770 775 780 Ala Pro Asn Val Ser Val Glu Ile Met Val Pro Asn Ser Phe Ser Pro 785 790 795 800 Gln Thr Asp Lys Leu Phe Asn Ile Leu Asp Val Gln Thr Thr Thr Gly 805 810 815 Glu Cys His Phe Glu Asn Tyr Gln Arg Val Cys Ala Leu Glu Gln Gln 820 825 830 Lys Ser Ala Met Gln Thr Leu Lys Gly Ile Val Arg Phe Leu Ser Lys 835 840 845 Thr Asp Lys Arg Leu Leu Tyr Cys Ile Lys Ala Asp Pro His Cys Leu 850 855 860 Asn Phe Leu Cys Asn Phe Gly Lys Met Glu Ser Gly Lys Glu Ala Ser 865 870 875 880 Val His Ile Gln Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ile Leu Glu Met Asp Glu 885 890 895 Thr Ser Ala Leu Lys Phe Glu Ile Arg Ala Thr Gly Phe Pro Glu Pro 900 905 910 Asn Pro Arg Val Ile Glu Leu Asn Lys Asp Glu Asn Val Ala His Val 915 920 925 Leu Leu Glu Gly Leu His His Gln Arg Pro Lys Arg Tyr Phe Thr 930 935 940 <210> 59 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> MISC_FEATURE <223> Minimal streptavidin <400> 59 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30 Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 60 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> MISC_FEATURE <223> Mutein Streptavidin Val44-Thr45-Ala46-Arg47 <400> 60 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val 20 25 30 Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 61 <211> 126 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> MISC_FEATURE <223> Mutein Streptavidin Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47 <400> 61 Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe 1 5 10 15 Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly 20 25 30 Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp 35 40 45 Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val 50 55 60 Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser 65 70 75 80 Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu 85 90 95 Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 100 105 110 Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125

Claims (121)

  1. 가용성 형태이고,
    (i) 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein) 분자로 이루어진 사합체 1,500개 내지 7,500개로 이루어진 올리고머 및
    (ii) 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하는 수용체-결합제를 포함하는, 다합체화된 올리고머 입자 시약으로서,
    올리고머는 75 nm 내지 125 nm의 반경을 포함하고;
    수용체-결합제는 올리고머의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 하나 이상의 결합 부위에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하고; 및
    수용체-결합제는 자극제이고, 수용체-결합체의 수용체에 대한 결합은 표적 세포에서의 자극 신호를 유도하는, 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  2. 제1항에 있어서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 비오틴, 비오틴 유사체 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  3. 제1항에 있어서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 44 내지 47 위치에 해당하는 서열 위치에, 아미노산 서열 Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47를 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  4. 제1항에 있어서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 다음을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약:
    a) 서열 번호 3-6, 27, 28, 및 60 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열;
    b) 서열 번호 3-6, 27, 28, 및 60 중 어느 하나에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고, 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열에서 스트렙타비딘의 위치를 참조하여 44 내지 47 위치에 해당하는 서열 위치에, Val44-Thr45-Ala46-Arg47 또는 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47에 해당하는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열; 또는
    c) 비오틴, 비오틴 유사체, 또는 스트렙타비딘-결합 펩타이드에 가역적으로 결합하는 a) 또는 b)의 기능적 단편.
  5. 제1항에 있어서, 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 서열 번호 3-6, 27, 28, 및 60 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  6. 제1항에 있어서, 올리고머는 80 nm 내지 115 nm 또는 90 nm 내지 110 nm의 반경을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  7. 제1항에 있어서, 올리고머는 5 x 107 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol의 분자량을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  8. 제1항에 있어서, 올리고머는 2,000 내지 5,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 2,000 내지 4,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 2,000 내지 3,500개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체, 또는 2,000 내지 3,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 이루어진 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  9. 제1항에 있어서, 올리고머의 라이신 잔기의 20%, 10%, 5%, 또는 1% 미만은 N-치환된 이미노싸이올란을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  10. 제1항에 있어서, 올리고머의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자는 이종이작용성(heterobifunctional) 가교제에 의해 가교되는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  11. 제10항에 있어서, 이종이작용성 가교제는 아민에서 싸이올로의 가교제(amine-to-thiol crosslinker)인 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  12. 제1항에 있어서, 스트렙타비딘-결합 펩타이드는
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 18),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 19), 및
    Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 16)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  13. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  14. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  15. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 Fab를 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  16. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 TCR/CD3 복합체-관련 신호를 개시할 수 있는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  17. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 TCR/CD3 복합체의 구성원에 결합하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  18. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 CD3에 특이적으로 결합하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  19. 제1항에 있어서, 수용체-결합제는 제1 수용체-결합제이고, 다합체화된 올리고머 입자 시약은 표적 세포의 표면의 공동자극 분자에 결합하는 제2 수용체-결합제를 포함하며,
    제2 수용체-결합제는, 올리고머의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 하나 이상의 결합 부위에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하고; 공동자극 분자에 대한 결합은 표적 세포에서 공동자극 신호를 유도하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  20. 제19항에 있어서, 공동자극 분자는 CD28, CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 또는 HVEM인 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  21. 제19항에 있어서, 공동자극 분자는 CD28인 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  22. 제19항에 있어서, 제1 수용체-결합제는 항-CD3 항체 또는 항체 단편을 포함하고, 제2 수용체-결합제는 항-CD28 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 다합체화된 올리고머 입자 시약.
  23. 제19항에 있어서, 제1 수용체-결합제는 항-CD3 Fab를 포함하고, 제2 수용체-결합제는 항-CD28 Fab를 포함하는 것인 다합체화된올리고머 입자 시약.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다합체화된 올리고머 입자 시약을 복수 개 포함하는 조성물로서, 복수 개의 다합체화된 올리고머 입자 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체로 이루어진 복수 개의 올리고머 및 복수 개의 수용체-결합제를 포함하는 것인, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머는
    80 nm 내지 110 nm 또는 90 nm 내지 110 nm의 평균 반경을 포함하는 것인 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머는
    90 nm ±15 nm 또는 97 ± 10 nm의 평균 반경을 포함하는 것인 조성물.
  27. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머의 적어도 95%는 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 115 nm, 80 nm 내지 100 nm, 90 nm 내지 110 nm, 또는 100 nm 내지 120 nm의 반경을 포함하는 것인 조성물.
  28. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머의 적어도 95%는 상기 복수 개의 올리고머의 평균 반경의 ± 50%, ± 25%, ± 20%, ± 15%, ± 10%, 또는 ± 5% 사이인 반경을 포함하는 것인 조성물.
  29. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머는 80 nm 내지 115 nm의 평균 반경을 포함하고, 올리고머의 적어도 95%는 상기 평균 반경의 ± 25% 사이인 반경을 포함하는 것인 조성물.
  30. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머는 1 x 108 g/mol 내지 5 x 108 g/mol, 또는 1 x 108 g/mol 내지 2 x 108 g/mol의 평균 분자량을 포함하는 것인 조성물.
  31. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머는 각각 2,000 내지 5,000개, 2,000 내지 4,000개, 또는 2,000 내지 3,500개, 또는 2,000 내지 3,000개의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사합체의 평균 개수를 포함하는 것인 조성물.
  32. 제24항에 있어서, 복수 개의 올리고머의 평균 반경은 -80 ℃이하, -20 ℃ 이하, 및/또는 4 ℃이하에서 적어도 1 주간 저장되었을 때 25% 또는 10%를 초과하여 증가하지 않는 것인 조성물.
  33. 수용체-결합제를 올리고머 입자 시약에 다합체화하여 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다합체화된 올리고머 입자 시약을 생성하는 방법으로서,
    상기 방법은,
    (i) 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 스트렙타비딘 뮤테인(streptavidin mutein) 분자로 이루어진 사합체 1,500개 내지 7,500개로 이루어진 올리고머를, (ii) 수용체-결합제와, 올리고머에 수용체-결합제를 가역적으로 결합시키기 위한 조건하에서 혼합하여, 그에 의해 가용성 형태인 다합체화된 올리고머 입자 시약을 생성하는 단계를 포함하고,
    올리고머는 75 nm 내지 125 nm의 반경을 포함하고;
    수용체-결합제는 올리고머의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 분자의 하나 이상의 결합 부위에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘-결합 펩타이드를 포함하고;
    수용체-결합제는 표적 세포의 표면에 발현된 수용체에 결합하고; 및
    수용체-결합제는 자극제이고, 수용체-결합체의 수용체에 대한 결합은 표적 세포에서의 자극 신호를 유도하는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 스트렙타비딘-결합 펩타이드는
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 8),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 17),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 18),
    Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 19), 및
    Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (서열 번호 16)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  36. 제33항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 1가 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  37. 제33항에 있어서, 수용체-결합제는 수용체에 결합하는 Fab를 포함하는 것인 방법.
  38. 제품화 물품으로서,
    제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다합체화된 올리고머 입자 시약
    을 포함하는 것인 물품.
  39. 세포 조절 방법으로서, 상기 방법은 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을,
    제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다합체화된 올리고머 입자 시약의 존재하에 인큐베이션하여, 그에 의해 표적 세포를 조절하는 단계를 포함하며,
    상기 방법은 생체 외 또는 시험관 내 방법인 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    표적 세포를 조절하는 것은 표적 세포의 활성화 또는 증식을 포함하는 것인 방법.
  41. 세포 배양 방법으로서, 상기 방법은 표적 세포를 포함하는 세포 조성물을,
    제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 다합체화된 올리고머 입자 시약의 존재하에 인큐베이션하는 단계를 포함하며,
    상기 방법은 생체 외 또는 시험관 내 방법인 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
  43. 제39항에 있어서, 수용체-결합제와 올리고머 사이의 가역적 결합을 파괴하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 파괴는 수용체-결합제와 올리고머 사이의 결합을 역전시키거나 그와 경쟁할 수 있는 물질을 표적 세포에 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 물질은 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 비오틴 유사체는 데스싸이오비오틴 또는 이미노비오틴인 것인 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 물질은 D-비오틴을 포함하는 것인 방법.
  47. 제41항에 있어서, 표적 세포는 T 세포인 것인 방법.
  48. 제41항에 있어서, 수용체-결합제와 올리고머 사이의 가역적 결합을 파괴하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 파괴는 수용체-결합제와 올리고머 사이의 결합을 역전시키거나 그와 경쟁할 수 있는 물질을 표적 세포에 도입하는 것을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 물질은 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 비오틴 유사체는 데스싸이오비오틴 또는 이미노비오틴인 것인 방법.
  51. 제48항에 있어서, 상기 물질은 D-비오틴을 포함하는 것인 방법.
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