CN112552415B - B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。所述十二聚体是将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比偶联得到的。本发明提供的B淋巴细胞刺激因子十二聚体在刺激小鼠脾脏细胞增殖实验和人B细胞增殖实验中表现出明显优于BLyS蛋白的生物学活性，用于BLyS相关的中和抗体筛选时，具有检测窗口大，灵敏度高，实验重复性好等特点。

Description

B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体地说，涉及一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。
背景技术
B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator, BLyS/B-cell activatingfactor, BAFF)是肿瘤坏死因子超家族成员之一, 主要表达于骨髓家族细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、恶性B细胞等。B淋巴细胞刺激因子在这些细胞膜表面以三聚体形式表达，再经Furin蛋白酶切割后释放到微循环中，进而与B细胞膜表面的受体结合。BLyS主要有三个受体，跨膜活化子和CAML作用子(transmembrane Activator andCAML Interactor, TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)和B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor, BAFF-R)，这三个受体分别表达于不同发育时期的B细胞表面，BLyS与不同的受体结合介导着不同的生物学功能。BAFF-R主要表达过度期B细胞，包括滤泡(follic-lar，FO) B细胞、边缘区(marginal zone，MZ) B细胞上，BLyS与它的结合具有高度特异性和高亲和力，二者结合调节B细胞的存活，发育和分化。而BCMA和TACI 则主要表达在活化B细胞、记忆B细胞和浆细胞的膜表面，与BLyS能识别的同时还与TNF配体超家族的另一成员增殖诱导配体(APRIL)也能相互识别，并且结合的亲和力更高。与BAFF-R不同，BCMA和TACI与炎症反应和先天免疫相关。
研究表明，BLyS的过表达与系统性红斑狼疮、类风湿关节炎及干燥综合征等自身免疫疾病密切相关，在这些疾病患者血清中，BLyS水平明显上调。目前针对BLyS的抗体药已经应用于这些疾病的治疗，并取得显著治疗效果。例如GSK的Belimumab用于治疗红斑狼疮，治疗组有效比例超过50%，疾病复发更新减低50%，也可明显降低患者对糖皮质激素的依赖。诺华的Ianalumab是结合BAFF-R的，主要针对自身免疫性肝炎，类风湿关节炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮等适应症，已进入临床二期试验，针对慢性淋巴细胞性白血病适应症进入临床一期试验。在这些抗体药的筛选过程中，常用的体外筛选方法就是检测其对BLyS生物学功能的影响，如B细胞增殖实验，B细胞分泌细胞因子实验。尽管BLyS在天然状态下就是三聚体形式存在，但它与受体结合能力并不高，因此在这些分析实验中检测窗口较低且灵敏度差。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性的B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种B淋巴细胞刺激因子十二聚体（BLyS十二聚体），所述十二聚体是将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比偶联得到的。
其中，生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白是将如SEQ ID NO:1所示的B淋巴细胞刺激因子截短体蛋白的3个重复序列通过柔性Linker串联并在C端修饰生物素得到的。
优选地，本发明中使用的柔性Linker为GGGSGGG。
在本发明的一个具体实施方式中，B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii）i）或ii）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。
第二方面，本发明提供B淋巴细胞刺激因子十二聚体的制备方法，包括以下步骤：
1）将编码B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白的核酸序列构建到真核表达载体上，用所得重组表达载体转染哺乳动物细胞，并从细胞培养上清中分离纯化得到三聚体蛋白；
2）用生物素标记上述三聚体蛋白，得到生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白；
3）将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比进行偶联。
其中，所述B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白是由如SEQ ID NO:1所示的B淋巴细胞刺激因子截短体蛋白的3个重复序列通过柔性Linker串联而成，或者在其N端和/或C端连接纯化标签得到的。
优选地，所述真核表达载体为pcDNA3.1。
优选地，所用启动子为CMV。
优选地，所述哺乳动物细胞为HEK293（Expi293F细胞）。
前述的方法，步骤3）包括：用PBS缓冲液分别配制生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白溶液和链霉亲和素溶液，然后将链霉亲和素溶液分次加入到生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白溶液中，混匀后冷冻干燥，即得B淋巴细胞刺激因子十二聚体。
第三方面，本发明提供所述B淋巴细胞刺激因子十二聚体，或者按照上述方法制备的B淋巴细胞刺激因子十二聚体的以下任一应用（所述应用含非疾病诊断和治疗目的）：
1）用于抗B淋巴细胞刺激因子抗体筛选；
2）用于抗B细胞活化因子受体抗体筛选；
3）用于制备抗B淋巴细胞刺激因子抗体检测试剂或试剂盒。
4）用于制备抗B细胞活化因子受体抗体检测试剂或试剂盒。
研究显示，重组表达的BLyS蛋白与体内分泌的一样，是以三聚体形式存在的，在体外能够刺激B细胞增殖，但是刺激效果有限，用于筛选和检测中和活性抗体时，检测窗口不高，极易造成检测结果误差。本发明提供的BLyS十二聚体是以高纯度（MALS检测纯度大于90%）的重组表达BLyS三聚体蛋白为前体蛋白，四聚体形式的链霉亲和素为骨架，通过生物素和链霉亲和素之间高亲和力连接制备而成。四聚体形式的链霉亲和素骨架将BLyS三聚体蛋白聚集在一起，此结构非常稳定，并起到放大BLyS蛋白生物学活性的功能，因此能够增加刺激B细胞增殖实验的检测窗口，检测窗口足够大，用于中和抗体的阻断作用评估才不会造成检测误差，因此本发明的BLyS十二聚体可用于抗BLyS或抗BAFFR中和性抗体的筛选。
本发明的BLyS十二聚体在刺激小鼠脾脏细胞增殖实验和人B细胞增殖实验中表现出明显优于BLyS蛋白的生物学活性，用于BLyS相关的中和抗体筛选时，具有检测窗口大，灵敏度高，实验重复性好等特点。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中生物素化的BLyS三聚体的SEC-MALS验证结果。
图2为本发明较佳实施例中BLyS十二聚体刺激小鼠脾脏细胞增殖情况。
图3为本发明较佳实施例中BLyS十二聚体刺激人B细胞增殖情况。
图4为本发明较佳实施例中抗BLyS抗体曲线。
图5为本发明较佳实施例中抗BAFFR抗体曲线。
具体实施方式
针对BLyS在天然状态下与受体结合能力不高，因此在B细胞增殖和B细胞分泌细胞因子的等功能分析实验中检测窗口较低和灵敏度差的缺陷，特提出本发明，旨在提供一种高活性的B淋巴细胞刺激因子的十二聚体（BLyS 十二聚体）。
本发明的另一目的在于提供一种制备高活性的BLyS十二聚体的方法。
本发明的另一目的在于提供 BLyS十二聚在筛选抗BLyS中和性抗体中的应用。
本发明的另一目的在于提供 BLyS十二聚在筛选抗BAFFR中和性抗体中的应用。
本发明中BLyS十二聚体是通过生物素化的BLyS三聚体蛋白与链霉亲和素偶联获得的。
本发明中，生物素化的BLyS三聚体蛋白的单体的氨基酸序列为NCBI登录号AAH20674.1第134~285位氨基酸，此段序列为BLyS蛋白的功能区。使用柔性Linker（GGGSGGG）将3段重复的BLyS蛋白的功能区基因串联起来，并在序列C端加上标签 His&AviTag，将此表达基因序列构建到pcDNA3.1表达载体上，用重组表达载体转染HEK293细胞，从细胞培养上清中分离得到的，三聚体蛋白C端共表达的Avi Tag，在BirA酶作用下，Avi Tag的赖氨酸残基被连接上一个生物素，进而获得生物素标记的BLyS三聚体蛋白。
本发明中，生物素化的BLyS三聚体蛋白经多角度激光散射仪（MALS）测定纯度大于90%。
本发明中，链霉亲和素是与生物素有高亲和力的结合蛋白，以同源四聚体的形式存在，分子量为60KD，1分子链霉亲和素可同时结合4个生物素分子。
本发明中，BLyS十二聚体制备方法如下：将生物素化的BLyS三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1摩尔比混合，在室温避光条件下反应获得，所获得BLyS十二聚体可进行分装，冻干并置于-80℃冰箱保存备用。
本发明中，BLyS十二聚体用于抗BLyS中和性抗体中的筛选。
本发明中，BLyS十二聚体能够与人B细胞膜表面的受体BAFFR结合，进而刺激B细胞增殖。抗BLyS中和性抗体与BLyS十二聚体结合后会阻断由其引起的人B细胞增殖反应。具体方法为：将2×104~6×104个人CD19+ B细胞接种于96孔细胞培养板内，加入抗IgM抗体激活，再加入预混的BLyS十二聚体和抗BLyS中和性抗体的混合物，在37℃，5% CO2条件下培养48-96小时后，用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液试剂盒检测活细胞数。
本发明中，BLyS十二聚体用于抗BAFFR中和性抗体中的筛选。
本发明中，BLyS十二聚体能够与B细胞膜表面的受体BAFFR结合，进而刺激B细胞增殖，抗BFFR中和性抗体与B细胞膜表面的BAFFR结合后阻断了BLyS十二聚体与受体的结合，进而阻断B细胞增殖反应。具体方法为：将2×104~6×104个人CD19+ B细胞接种于96孔细胞培养板内，加入抗IgM抗体激活，再加入抗BAFF中和性抗体反应，再加入BLyS十二聚体，继续在37℃，5% CO2条件下培养48-96小时后，用CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液试剂盒检测活细胞数。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1 生物素化BLyS三聚体蛋白的制备
1、实验材料
TransT1感受态细胞（全式金，Cat. No. CD501-01）；胰蛋白胨（Sigma, Cat. No.T7293-1KG），酵母提取物(Sigma, Cat. No.Y1625-1KG)；琼脂（Sigma, Cat. No. A7002-1KG）；Max plasmid Kit（Promega，Cat. No. A2492）；细菌摇床（欧诺，HN211B）；细菌培养箱（天津泰斯特仪器有限公司，DH3600B） Nanodrop 2000；Expi293F细胞(Invitrogen，Cat.No.R790-07)；细胞表达培养基（CD 293 TGE Medium，1×，Acrobiosystems, Cat. No. CM-1156-11-1L）；pcDNA3.1质粒（ThermoFisher，Cat.No. V79520）；Polyethylenimine，PEI（Polysciences，Cat. No. 23966）。细胞摇床培养箱（欧诺，HNY-2102）。镍柱（NI SEPHAROSEHP，Cat. No. GE, 17-5268-01）。
2、溶液配制
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加水定容至1000ml，高压灭菌，冷却到室温加入Amp，终浓度为100ug/ml，备用。LB固体培养基：胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，氯化钠5g，琼脂7.5g，加水定容至500ml，高压灭菌或微波炉煮沸，待冷却后加入Amp(终浓度为100ug/ml)，超净台内铺平板，4℃保存备用。Polyethylenimine(PEI)，浓度1mg/ml，配制方法：将50mg的PEI粉末溶于45mL ddH2O中，用HCl将其pH值调至〈2.0，搅拌至PEI全溶，加入NaOH调pH至7.0，加入ddH2O定容体积至50mL，0.22um过滤器过滤除菌，分装成每管1.0mL，-80℃冻存备用。
3、生物素化的BLyS三聚体蛋白的制备
（1）pcDNA3.1-BLyS质粒的构建
根据NCBI登录号AAH20674.1第134位氨基酸（Ala）~285位氨基酸（Leu）对应的核酸序列，设计三条上游引物，分别为S1、S2和S3：
S1：5′-ccaggttccactggcCACCACCACCACCACCACGGTCTGAATGACATCTTTGAGGCTC-3′
S2: 5′-ACATCTTTGAGGCTCAAAAGATCGAATGGCATGAAGGGGGCGGCAGCGGTG-3′
S3: 5′-GGGGGCGGCAGCGGTGGAGGTTCCGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3′
下游引物AS：
AS: 5′-ATAGGGCCCTCTAGATTACAGCAGTTTCAATGCACCAAAAAATGTGAC-3′
信号肽：
5′-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGC-3′
His tag+AVI tag+linker序列：
5′-CACCACCACCACCACCACGGTCTGAATGACATCTTTGAGGCTCAAAAGATCGAATGGCATGAAGGGGGCGGCAGCGGTGGAGGTTCC-3′
BLyS的表达区间（Ala 134-Leu 285）对应的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
利用引物S1、S2、S3和AS，进行巢式PCR，扩增得到上述核酸序列。
将3段重复的BLyS的表达区间（Ala 134-Leu 285）用GGGSGGG（柔性Linker）串联起来，并在表达序列的C端加上标签His&Avi，构建到pcDNA3.1表达载体上。
（2）pcDNA3.1-BriA酶质粒的构建
根据NCBI登录号：NC_000913.3 (4173082..4174047)对应的核酸序列，设计上游引物和下游引物，分别为P1和P2：
P1:5′-GCGATATCGATGAAGGATAACACCGT-3′
P2:5′-GGCTCGAGTCATTTTTCTGCACTA-3′
BriA酶的表达区间对应的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，BriA酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
（3）质粒鉴定与扩增
将冻存的TransT1感受态细胞融化，再加入连接产物，混匀，冰浴30min，于42℃热激45s，冰浴2min，加入700 ul LB液体培养基，37℃，200rpm培养1h；涂菌，37℃培养过夜；次日挑取单菌落，接种含3ml LB培养基的摇菌管内，于37℃细菌摇床内，200rpm培养过夜；收菌液，按Promega公司的plasmid Kit说明提取质粒DNA。用Nanodrop2000进行定量，送测序公司测序，核对基因序列是否正确。将测序正确的质粒转化TransT1感受态细胞，扩大培养，提取质粒（含目的基因），供胞转染使用。
（4）生物素化的BLyS三聚体蛋白的表达与纯化
对Expi293F细胞进行计数，计算细胞密度和活率（细胞活率≥90%），并将细胞密度调整至1×106/ml，接种细胞培养三角瓶内。分别取相应量的pcDNA3.1-BirA质粒、pcDNA3.1-BLyS质粒与PEI混匀，室温孵育5min，再取相应的体积加入细胞培养三角瓶内；将转染后的细胞放置在摇床培养箱中培养，37℃，8% CO2条件下培养7天，收集细胞悬液，离心后收集细胞培养上清液，经镍柱纯化，收集样品，经G25脱盐纯化柱脱盐，置换缓冲液（PBS），保存在PBS缓冲液中。所获得BLyS三聚体蛋白经MALS检测为三聚体，纯度大于90%（图1）。
实施例2 BLyS蛋白十二聚体的制备
1、实验材料
生物素化的BLyS三聚体蛋白；链霉亲和素（Streptavidin，SA，Sigma，Cat. No.S0677-1MG)；磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液，Hyclone, Cat. No. SH30256.01)。
2、BLyS蛋白十二聚体制备
用PBS缓冲液配制1mL生物素化的BLyS三聚体蛋白溶液，浓度为400ug/ml。用PBS缓冲液配制1mL Streptavidin溶液，浓度为100ug/ml。将配制好的Streptavidin溶液分5次加入B淋巴细胞刺激因子蛋白溶液，每次加入200uL后放置水平摇床上在室温反应，加入时间的间隔为10min，最后一个200uL加完后将其放置水平摇床上继续反应30min。B淋巴细胞刺激因子蛋白与Streptavidin的反应摩尔比为4:1；获得BLyS蛋白十二聚体；分装于西林瓶内，100ul/瓶。放置冻干机内冻干成干粉状态，压盖贴标签后-80℃冰箱保存备用。以上所有实验步骤均要求无菌操作。
实施例3 BLyS蛋白十二聚体活性鉴定
1、实验材料
小鼠脾脏细胞（(ALLCELLS, Cat. No. MSPL-001F)；人CD19+ B细胞 (TPCS, Cat.No. CD19-N-Custom)；胎牛血清（Fetal bovine serum，CellMax, Cat. No. SA201.02)；RPMI1640培养基（RPMI1640 medium，Hyclone，Cat. No. SH30809.01)；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS，Sigma-Aldrich, Cat. No. L6529)；抗IgM抗体（Invitrogen，Cat. No.16-5099-85；生物素化的BLyS蛋白（Biotinylated Human BAFF Protein，HisAvitag™ active trimer，Acrobiosystems，Cat. No. BAF-H82Q2)；BLyS蛋白(HumanBAFF Protein active trimer，Acrobiosystems，Cat. No. BAF-H52D4)；CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒（CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promage, Cat. No. G7572)。
2、刺激小鼠脾脏细胞增殖
配制含10%胎牛血清和5ug/mL脂多糖的RPMI1640完全培养基；复苏小鼠脾脏细胞，无菌PBS洗涤1次，加入RPMI1640完全培养基重悬后取20uL细胞悬液加等体积的台盼蓝溶液染色计数；取相应数量的小鼠脾脏细胞，再加入RPMI1640完全培养基，配制终浓度为2.0×106/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，50uL/孔；用RPMI1640完全培养基将BLyS蛋白和BLyS十二聚体分别稀释成一系列浓度梯度后，加入含有细胞的96孔培养板内，50uL/孔；然后将96孔培养板放置二氧化碳培养箱内，在37℃，5% CO2条件下培养72h；每孔加入100uL按说明书配制好的CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液，酶标仪读数。GraphPadPrism5分析软件对数据进行分析。
实验结果表明（图2），在刺激小鼠脾脏细胞增殖实验中，BLyS十二聚体具有较高的生物学功能活性，与只加抗IgM抗体组实验组对比，BLyS十二聚体的刺激窗口高达3-4倍，而同浓度的物素化的BLyS蛋白（Biotin-BLyS)和BLyS蛋白（BLyS tag free）最大刺激窗口仅为1.3~1.4倍（高浓度组10ng/ml）。
3、刺激人B细胞增殖
配制含10%胎牛血清和5ug/mL脂多糖的RPMI1640完全培养基；复苏人CD19+B细胞，无菌PBS洗涤1次，加入RPMI1640完全培养基重悬后取20uL 细胞悬液加等体积的台盼蓝溶液染色计数；取相应数量的人CD19+B细胞，再加入RPMI1640完全培养基，配制终浓度为1.0×106/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，50uL/孔；用RPMI1640完全培养基将BLyS蛋白和BLyS十二聚体分别稀释一系列的浓度梯度后，加入含有细胞的96孔培养板内，50uL/孔；然后将96孔培养板放置二氧化碳培养箱内，在37℃，5% CO2条件下培养72h；每孔加入100uL按说明书配制好的CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液，酶标仪读数。GraphPadPrism5分析软件对数据进行分析。
实验结果表明（图3），在刺激人B细胞增殖实验中，BLyS十二聚体具有较高的生物学功能活性，与只加抗IgM抗体组实验组对比，BLyS十二聚体的刺激窗口高达5~7倍，而同浓度的物素化的BLyS蛋白（Biotin-BLyS)和BLyS蛋白（BLyS tag free）最大刺激窗口仅为1.7~2.0倍（高浓度组10ng/ml）。
实施例4 抗BLyS中和性抗体的筛选
1、实验材料
人CD19+B细胞 (TPCS, Cat. No. CD19-N-Custom)；胎牛血清（Fetal bovineserum，CellMax, Cat. No. SA201.02)；RPMI1640培养基（RPMI1640 medium，Hyclone，Cat.No. SH30809.01)；抗IgM抗体（Invitrogen，Cat. No.16-5099-85；BLyS十二聚体；抗BLyS抗体（CD268 (BAFF Receptor) Monoclonal Antibody (8A7)，Invitrogen，Cat. No. 16-9117-82）；CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒（CellTiter-Glo® LuminescentCell Viability Assay，Promage, Cat. No. G7572)。
2、抗BLyS中和性抗体筛选
复苏人源CD19+B细胞，无菌PBS洗涤1次，加入RPMI1640完全培养基重悬后取20uL细胞悬液加等体积的台盼蓝溶液染色计数；取相应数量的小鼠脾脏细胞，再加入RPMI1640完全培养基，配制终浓度为1.0×106/mL细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，50uL/孔；配制一系列浓度梯度的抗BLyS抗体，与等体积6ng/mL的BLyS十二聚体预混后，室温反应30min，加入含有细胞的96孔培养板内，50uL/孔；然后将96孔培养板放置二氧化碳培养箱内，在37℃，5% CO2条件下培养72h；每孔加入100uL按说明书配制好的CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液，酶标仪读数。GraphPad Prism5分析软件对数据进行分析。
BLyS十二聚体可用于抗BLyS中和性抗体在细胞水平的功能性筛选，在人B细胞增殖实验中，BLyS十二聚体使用浓度为3ng/ml时，抗BLyS抗体的IC50值为13.8ng/mL（图4）。
实施例5 抗BAFFR中和性抗体的筛选
1、实验材料
人CD19+B细胞 (TPCS, Cat. No. CD19-N-Custom)；胎牛血清（Fetal bovineserum，CellMax, Cat. No. SA201.02)；RPMI1640培养基（RPMI1640 medium，Hyclone，Cat.No. SH30809.01)；抗IgM抗体（Invitrogen，Cat. No.16-5099-85；BLyS十二聚体；抗人源BAFFR抗体（Human BAFFR/TNFRSF13C Antibody，RnD，Cat. No. AF1162）；CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒（CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay，Promage, Cat. No. G7572)。
二、抗BAFFR中和性抗体筛选
复苏人源CD19+B细胞，无菌PBS洗涤1次，加入RPMI1640完全培养基重悬后取20uL细胞悬液加等体积的台盼蓝溶液染色计数；取相应数量的小鼠脾脏细胞，再加入RPMI1640完全培养基，配制终浓度为1.0x106/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，50uL/孔；配制一系列浓度梯度的抗BAFFR抗体和抗BLyS抗体, 加入含有细胞的96孔培养板内，25uL/孔，在37℃，5% CO2条件下孵育30min；再加入12ng/ml 的 BLyS 十二聚体（终浓度为3ng/ml），然后将96孔培养板放置二氧化碳培养箱内，在37℃，5% CO2条件下培养72h；每孔加入100uL按说明书配制好的CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测液，酶标仪读数。GraphPadPrism5分析软件对数据进行分析。
BLyS十二聚体可用于抗BAFFR中和性抗体在细胞水平的功能性筛选，在人B细胞增殖实验中，BLyS十二聚体使用浓度为3ng/ml时，抗BAFFR抗体的IC50值为10.8ng/mL（图5）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京百普赛斯生物科技股份有限公司
<120> B淋巴细胞刺激因子十二聚体及其制备方法与应用
<130> KHP211110891.4YS
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 152
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe
20 25 30
Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys
35 40 45
Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly
50 55 60
Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln
65 70 75 80
Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu
85 90 95
Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys
100 105 110
Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu
115 120 125
Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr
130 135 140
Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
145 150
<210> 2
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe
20 25 30
Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys
35 40 45
Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly
50 55 60
Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln
65 70 75 80
Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu
85 90 95
Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys
100 105 110
Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu
115 120 125
Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr
130 135 140
Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala
145 150 155 160
Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile
165 170 175
Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val
180 185 190
Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu
195 200 205
Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gln
210 215 220
Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln Arg
225 230 235 240
Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe
245 250 255
Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr
260 265 270
Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala
275 280 285
Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr Phe
290 295 300
Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Val
305 310 315 320
Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala
325 330 335
Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro
340 345 350
Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn
355 360 365
Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val
370 375 380
Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys
385 390 395 400
Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg
405 410 415
Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser
420 425 430
Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile
435 440 445
Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe
450 455 460
Gly Ala Leu Lys Leu Leu
465 470
<210> 3
<211> 459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgttcagg gtccagaaga aacagtcact caagactgct tgcaactgat tgcagacagt 60
gaaacaccaa ctatacaaaa aggatcttac acatttgttc catggcttct cagctttaaa 120
aggggaagtg ccctagaaga aaaagagaat aaaatattgg tcaaagaaac tggttacttt 180
tttatatatg gtcaggtttt atatactgat aagacctacg ccatgggaca tctaattcag 240
aggaagaagg tccatgtctt tggggatgaa ttgagtctgg tgactttgtt tcgatgtatt 300
caaaatatgc ctgaaacact acccaataat tcctgctatt cagctggcat tgcaaaactg 360
gaagaaggag atgaactcca acttgcaata ccaagagaaa atgcacaaat atcactggat 420
ggagatgtca cattttttgg tgcattgaaa ctgctgtaa 459
<210> 4
<211> 966
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaggata acaccgtgcc actgaaattg attgccctgt tagcgaacgg tgaatttcac 60
tctggcgagc agttgggtga aacgctggga atgagccggg cggctattaa taaacacatt 120
cagacactgc gtgactgggg cgttgatgtc tttaccgttc cgggtaaagg atacagcctg 180
cctgagccta tccagttact taatgctaaa cagatattgg gtcagctgga tggcggtagt 240
gtagccgtgc tgccagtgat tgactccacg aatcagtacc ttcttgatcg tatcggagag 300
cttaaatcgg gcgatgcttg cattgcagaa taccagcagg ctggccgtgg tcgccggggt 360
cggaaatggt tttcgccttt tggcgcaaac ttatatttgt cgatgttctg gcgtctggaa 420
caaggcccgg cggcggcgat tggtttaagt ctggttatcg gtatcgtgat ggcggaagta 480
ttacgcaagc tgggtgcaga taaagttcgt gttaaatggc ctaatgacct ctatctgcag 540
gatcgcaagc tggcaggcat tctggtggag ctgactggca aaactggcga tgcggcgcaa 600
atagtcattg gagccgggat caacatggca atgcgccgtg ttgaagagag tgtcgttaat 660
caggggtgga tcacgctgca ggaagcgggg atcaatctcg atcgtaatac gttggcggcc 720
atgctaatac gtgaattacg tgctgcgttg gaactcttcg aacaagaagg attggcacct 780
tatctgtcgc gctgggaaaa gctggataat tttattaatc gcccagtgaa acttatcatt 840
ggtgataaag aaatatttgg catttcacgc ggaatagaca aacagggggc tttattactt 900
gagcaggatg gaataataaa accctggatg ggcggtgaaa tatccctgcg tagtgcagaa 960
aaataa 966
<210> 5
<211> 321
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Asp Asn Thr Val Pro Leu Lys Leu Ile Ala Leu Leu Ala Asn
1 5 10 15
Gly Glu Phe His Ser Gly Glu Gln Leu Gly Glu Thr Leu Gly Met Ser
20 25 30
Arg Ala Ala Ile Asn Lys His Ile Gln Thr Leu Arg Asp Trp Gly Val
35 40 45
Asp Val Phe Thr Val Pro Gly Lys Gly Tyr Ser Leu Pro Glu Pro Ile
50 55 60
Gln Leu Leu Asn Ala Lys Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Gly Gly Ser
65 70 75 80
Val Ala Val Leu Pro Val Ile Asp Ser Thr Asn Gln Tyr Leu Leu Asp
85 90 95
Arg Ile Gly Glu Leu Lys Ser Gly Asp Ala Cys Ile Ala Glu Tyr Gln
100 105 110
Gln Ala Gly Arg Gly Arg Arg Gly Arg Lys Trp Phe Ser Pro Phe Gly
115 120 125
Ala Asn Leu Tyr Leu Ser Met Phe Trp Arg Leu Glu Gln Gly Pro Ala
130 135 140
Ala Ala Ile Gly Leu Ser Leu Val Ile Gly Ile Val Met Ala Glu Val
145 150 155 160
Leu Arg Lys Leu Gly Ala Asp Lys Val Arg Val Lys Trp Pro Asn Asp
165 170 175
Leu Tyr Leu Gln Asp Arg Lys Leu Ala Gly Ile Leu Val Glu Leu Thr
180 185 190
Gly Lys Thr Gly Asp Ala Ala Gln Ile Val Ile Gly Ala Gly Ile Asn
195 200 205
Met Ala Met Arg Arg Val Glu Glu Ser Val Val Asn Gln Gly Trp Ile
210 215 220
Thr Leu Gln Glu Ala Gly Ile Asn Leu Asp Arg Asn Thr Leu Ala Ala
225 230 235 240
Met Leu Ile Arg Glu Leu Arg Ala Ala Leu Glu Leu Phe Glu Gln Glu
245 250 255
Gly Leu Ala Pro Tyr Leu Ser Arg Trp Glu Lys Leu Asp Asn Phe Ile
260 265 270
Asn Arg Pro Val Lys Leu Ile Ile Gly Asp Lys Glu Ile Phe Gly Ile
275 280 285
Ser Arg Gly Ile Asp Lys Gln Gly Ala Leu Leu Leu Glu Gln Asp Gly
290 295 300
Ile Ile Lys Pro Trp Met Gly Gly Glu Ile Ser Leu Arg Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys

Claims (7)

1.B淋巴细胞刺激因子十二聚体，其特征在于，所述十二聚体是将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比偶联得到的；
其中，生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白是将如SEQ ID NO:1所示的B淋巴细胞刺激因子截短体蛋白的3个重复序列通过柔性Linker串联并在C端修饰生物素得到的；
所述柔性Linker为GGGSGGG；
B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白的氨基酸序列如下所述：
i）如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或
ii）在i）的C端连接标签得到的氨基酸序列。
2.B淋巴细胞刺激因子十二聚体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将编码B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白的核酸序列构建到真核表达载体上，用所得重组表达载体转染哺乳动物细胞，并从细胞培养上清中分离纯化得到三聚体蛋白；
2）用生物素标记上述三聚体蛋白，得到生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白；
3）将生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白与链霉亲和素按4:1的摩尔比进行偶联；
其中，所述B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白是由如SEQ ID NO:1所示的B淋巴细胞刺激因子截短体蛋白的3个重复序列通过柔性Linker串联而成，或者在其C端连接纯化标签得到的；
所述柔性Linker为GGGSGGG。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1；和/或
所述哺乳动物细胞为HEK293。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤3）包括：用PBS缓冲液分别配制生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白溶液和链霉亲和素溶液，然后将链霉亲和素溶液分次加入到生物素化的B淋巴细胞刺激因子三聚体蛋白溶液中，混匀后冷冻干燥，即得B淋巴细胞刺激因子十二聚体。
5.权利要求1所述的B淋巴细胞刺激因子十二聚体，或者按照权利要求2-4任一项所述方法制备的B淋巴细胞刺激因子十二聚体的以下任一应用：
1）用于抗B淋巴细胞刺激因子抗体筛选；
2）用于抗B细胞活化因子受体抗体筛选；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的。
6.抗B淋巴细胞刺激因子抗体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的B淋巴细胞刺激因子十二聚体，或者按照权利要求2-4任一项所述方法制备的B淋巴细胞刺激因子十二聚体。
7.抗B细胞活化因子受体抗体检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的B淋巴细胞刺激因子十二聚体，或者按照权利要求2-4任一项所述方法制备的B淋巴细胞刺激因子十二聚体。
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