JP5745846B2 - pVIIファージディスプレイ - Google Patents
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Description
本発明のある態様では,フィラメント状のファージに由来するpVII結合タンパク質であって,当該結合タンパク質は,外来ペプチドがpVIIのN末端に結合している結合タンパク質が提供される。そのような結合タンパク質は,例えば,ファージディスプレイのコンテキストで利用可能である。
通常,「相同性」といった場合,遺伝子やタンパク質がそれぞれヌクレオチドレベルやアミノ酸レベルで互いに一致しているときの配列の一致度合いをいう。
本発明の好ましい実施形態では,用語「ペプチド」は,抗体由来のドメインなどの折り畳みタンパク質のみを意味する。当業者は,以下を含む,折り畳みタンパク質が抗体やそのフラグメントであり得ることを認識するものである。Fv,scFv,Fab,単一のドメイン,タンパク質AのZドメイン(Affibody),アンキリンやそのフラグメント,T細胞受容体やそのフラグメント,MHC分類IやIIのフィブロネクチンやそのフラグメント,Avimer,Anticalin,PDZドメイン,IgNARやそのフラグメント,CTLA4やそのフラグメント,ImmE7,Knottin,GFP,及び,その他の遺伝子をコードした生物化学的な蛍光色素分子。
好ましくは,外来ペプチドは,任意のアミノ酸を介して又は介さずに,結合タンパク質のpVII配列のN末端に対して直接的に結合している。さらに別の好ましい実施形態では,pVII結合タンパク質は,N末端のリーダー(leader)配列を含まない。
これまでは,シグナル配列を用いないときのpVII結合は,ファージ粒子の産生を助長することに関して非機能的であると考えられてきた(Endemanら,1995年;Gaoら,1999年)。そのため,そのN末端に直接的に結合した外来ペプチドを持つpVII結合タンパク質は,ファージゲノム上の第2の遺伝子からのpVIIタンパク質の重量によって,又は,ヘルパーファージからの提供によって補完される必要があった。
処理後のタンパク質内において無用のエラーにつながるリーダーペプチドをかくまったままのタンパク質の機能性に影響を与える可能性がある。このことは,シグナルペプチドが存在しないことで回避される。
ある実施形態では,外来ペプチドは,所定のターゲットに結合する親和性標識(アフィニティータグ)である。親和性標識は,例えば,所定の抗体と結合し得るものである。親和性標識と所定のターゲットの組み合わせは,当業者にとっては周知である。
本発明の第2の側面は,本発明による結合タンパク質をコードする核酸である。この核酸は,ファージゲノム内又はファージミド内で構成されてもよい。
本発明の第3の側面は,本発明による結合タンパク質を含むフィラメント状のファージである。このフィラメント状のファージは,ファージゲノムを含むものであってもよいし,又はファージミドを含むものであってもよい。
好ましい実施形態では,ペプチドがpVIIのところと,pIII又はpVIIIのところで同時にディスプレイされる。
本発明の第5の側面は,ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって,ヘルパーファージが本発明によるpVII結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。
本発明の第7の側面は,ファージミドとヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムを有するキットであって,該ファージミドが本発明によるpVII結合タンパク質をコードする核酸を含んでいる。このキットは,コード領域においてN末端的に複数のクローニングサイトを持つ遺伝子をコードするpVIIを含むファージミドと,ヘルパーファージ(例えば,M13K07,VCSM13,又はその他)とを含む必要がある。このキットは,ファージクローンの感染,発現,固定,選択,及び検出に用いるプロトコルで補完される必要がある。また,このキットは,特定の試験を実行するためのバッファ用及びメディア用の必要なレシピが付属している必要がある。
FLAG−pVII,HIS6−pVII,及びAviTag(登録商標)−pVIIを持つ,改変後のヘルパーファージM13K07(配列ID番号31)とVCSM13(配列ID番号32)は,ファージディスプレイ技術の利用の拡大に適した非常に広い可能性を示すものであるが,結合タンパク質がヘルパーファージの機能性を危うくしないことが非常に重要であり,そのため,ファージの滴定量は,重要な検証パラメーターとなる。さらに,pVIIに結合するペプチドは,後続の検出及び/又は固定に利用しやすいものでなければならない。この実施例では,pVII修飾のヘルパーファージが検出目的及び/又は固定目的用のペプチドの多様性をかくまうことが可能であること,並びに,それらの結合タンパク質がファージの伝染性に影響を与えないという事実が支持される。
Sambrookら(Molecular cloning: a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))で説明されているように,基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチM13−HRP抗体,並びに,M2抗体及びM5抗体は,それぞれ,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala),及びSigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。制限酵素(RE)は,DpnIを除いて,New England Biolabs
(米国,MA州,Ipswich)から購入し,DpnIについては,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から入手した。DNAオリゴは,MWG Biotech AG(ドイツ,Ebersberg)から購入した。ダイナビーズMyOne(登録商標)(ストレプトアビジン磁気ビーズ)と,Talon(登録商標)のNi−NTA磁気ビーズは,いずれも,Invitrogen(ノルウェー,オスロ)ら購入した。BSAとTween20は,Sigma−Aldrich
(ノルウェー,オスロ)から購入した。PfuウルトラDNAと,Phusion DNAポリメラーゼは,それぞれ,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)及びSigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。水溶性TMBは,Chalbiochemのものであった。
大腸菌株XL1−Blueは,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。M13K07ヘルパーファージは,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala)から購入し,また,VCSM13(配列ID番号32)は,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。
CCGGCTAAGTAACATGGACTACAAAGATGACGATGACAAAATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCCATGTTACTTAGCCGG−3’)(それぞれ,配列ID番号7と配列ID番号8に相当する。)と,HIS6−pVII−frwd/ HIS6−pVII−rev(5’−CCGGCTAAGTAACATGCATCACCATCACCATCACATGGAGCAGGTCG−3’/5’−CGACCTGCTCCATGTGATGGTGATGGTGATGCATGTTACTTAGCCGG−3’)(それぞれ,配列ID番号10と配列ID番号11に相当する。)とをそれぞれ用いて,pVIIのORFのN末端に取り付けた。様々な構造体について,あらゆる場合で,DNAシークエンス(組織内でのABI lab DNA sequencing core facility,Dept. Molecular Biosciences,University of Oslo)によって検証した。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために,改変後のpVIIを含むBsrGI/SnaBIのREフラグメントを,標準技術を用いて適合REサイト上でM13K07野生型ゲノム又はVCSM13野生型ゲノムのいずれかに移動させた。電気穿孔法を用いて,DNA構造体を様々な大腸菌宿主に導入した。プライマーの設計は,ClustalWを用いて,M13K07(New England Biolabs sequence)(配列ID番号31)の配列とVCSM13(GenBank登録番号AY598820)(配列ID番号32)の配列の配列アライメントをベースとした。改変後のAviTag(登録商標)配列,HIS6配列,及びFLAG配列の配列を図2に示す。
基本的には上述したようにして(Scott及びSmith,PMID:1696028),M13K07(配列ID番号31)構造体,VCSM13(配列ID番号32)構造体を用いて形質転換した大腸菌XL1−Blueからファージを展開した。
A ヘルパーファージの滴定量
2つのYT各16mlを未使用のXL1−Blue培養液を用いて植菌し,37℃/250rpmで吸光度A405nmが0.4〜0.8となるまで培養した。希釈したファージ調合液各10μlを96ウェルのマイクロタイタープレートに移動させた。190μlのXL1−Blue培養液を,ファージ希釈剤を用いて各ウェルに移動させた。プレートを,50分間/37℃で培養した。BA82/20膜をLB−kan寒天皿の上にかぶせ,1つのサンプル当たり3μlの体積を膜上に滴下して,皿を37℃/ONで培養した。コロニーの数を数えた(図3)。
酵素免疫測定(ELISA)試験を実施すると,2種類のアンチFLAG抗体M2及びM5によるファージの捕捉によって,M13K07(配列ID番号31)内でのpVII結合としてFLAGタグの可触性が示される。試験結果には,野生型M13K07,M13K07−His,及びM13K07−AviTag(登録商標)が含まれている(図5)。
M13K07−HIS6とVCSM13−HIS6の双方について,ダイナルタロンビーズ(DynalTalon Beads)(IMAC matrix)に対する特定の結合を試験した。
簡単には,Talonビーズは,2%BSAを用いた30分間の回転培養によって阻害された。ビーズを,洗浄した後,ビーズに対してBSAを阻害するファージ浮遊物に一致する250μlの滴下量(これは,2×1010cfukanR/mlに相当する。)を添加し,さらに,ビーズを回転ホイール上で,30分間/室温下で培養した。PBST中のビーズを洗浄した後,アンチM13MAb−HRP(希釈後で1:2000)を各チューブに添加し,チューブをさらに,回転ホイール上で,45分間/室温下で培養した。洗浄後,ABTSを各チューブに添加して,15分間室温下で培養し,その後,磁石ラックに載置した。体積で100μlの各溶液を,MaxisorのELISAストラップに移動させた。TECANのELISA読み取り機を用いて,吸光度をA405nmで測定した。その結果は,HIS6−pVIIを含むビリオンがNi−NTA磁気ビーズに対して選択的に結合することを確実に示している。試験の最適化によって克服可能であるシグナルが低いにも関わらず,コグネートビリオンのNi−NTAマトリクスに対する異なる結合が確かに存在する。この特別なpVII結合の最も魅力的な用途は,例えばスピンコラムと組み合わせたNi−NTA精製に関してそれを引き出すという将来性にあるだけでなく,サイト特異性にあり,それによって,相同性があるとともに方向性のあるNi−NTAマトリクスの固定にある(図6)。
Sambrookら(Molecular cloning:a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press))で説明されているように,基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチM13−HRP抗体,並びに,M2抗体及びM5抗体は,それぞれ,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala),及びSigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。また,F23.2抗体とGB113抗体は,B.Bogen教授(Institute of Immunology,ノルウェー,オスロ)からの親切な贈呈物である。ダイナビーズMyOne(登録商標)(ストレプトアビジン磁気ビーズ)は,Invitrogen(ノルウェー,オスロ)ら購入した。BSAとTween20は,Sigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。BSAに接合するハプテン2−フェニルオキサゾール−5−オン(phOx)は,他の文献(Makelaら,PMID:722243)でも説明されているように基本的には購入した。
大腸菌株XL1−Blueは,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。M13K07ヘルパーファージは,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala)から購入した。pSEX81(配列ID番号29),ウシ血清アルブミン(BSA)に結合された2−フェニルオキサゾール−5−オン(phOx)選択性を持つscFvをかくまうファージミドは,Affitech AS(ノルウェー,オスロ)から親切にも提供を受けたものである。pFKPDN−scTCR Vαβ4B2A1(配列ID番号28)は,Losetらの文献(2007年,PMID:17925331)において記述されている。
M13K07ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを使用することによる大腸菌XL1−Blueからのファージミドレスキューを,Welschofらの文献(PMID:9050877)やKochらの文献(PMID:11126120)に記載されているような滴下滴定によってモニターした。
MAb M2,M5,F23.2,GB113,phOx−BSAを,PBS中2.5μg/mlから5μg/mlまでの濃度で,pH7.4で,かつ4℃で終夜にわたって,MaxiSorp(登録商標)のマイクロタイタープレートウェル(デンマーク,Roskilde, Nunc)に吸収させた。ウェル(well)は,PBS中2%(w/v)のスキムミルク(脱脂粉乳)又はPBS中2%(w/v)のBSAで,室温下で1時間にわたって阻害された。その後,添加されて,1〜2時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を,捕捉されるビリオンがアンチM13−HRP(1:5000)で検出されるまで室温下で1時間にわたって行った。各ステップ間で,ウェルをPBSTで3回洗浄した。ウェルは,ABST基質で展開され,30分後に吸光度をA405nmで読み取った。
A ヘルパーファージの滴定量
互いに異なる折り畳みドメインを持つ2種類のファージミドとして,それぞれ,scTCRとscFvをpIII結合としてディスプレイする,pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1と,pSEX−scFv anti−phOxとを採用した。双方を,3種類の修飾が施された野生型M13K07ヘルパーファージを用いてパッケージングした。簡略的には,2種類のファージミドクローンの終夜にわたる培養物を,修飾が施された野生型ヘルパーファージで感染させた。培養後,培養物を遠心分離して,細菌のペレットを,YTメディア内でアンピシリンとカナマイシンとを用いて再懸濁させ,さらに,30℃でオンとして培養を行った。大腸菌XL−1Blueをファージ希釈液で感染させて,それぞれ,アンピシリンプレート上及びカナマイシンプレート上に載置し,ファージミド及びヘルパーファージの滴定を行った(図7)。
ELISA試験を実施することで,pVII結合としてのFLAGタグの可触性が,2種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンについて示された。図9Aは,pFKPDNscTCR Vαβ4B2A1に関するものであり,2種類のアンチFLAG抗体M2とM5によってファージミドビリオンを捕捉することで得られたものである。図9Bは,pSEX−scFvアンチphOxに関して同様にして得られたものである。簡略的に説明すると,抗体を,4℃でオンの状態で,ELISAプレート上でコートした。プレートを洗浄した後,ファージミド調合液をプレート上で2時間にわたって室温下で培養した。プレートを洗浄後,さらに,アンチM13 HRPを組み込んだ抗体で培養した。プレートの洗浄,水溶性ABTSの添加,室温下/30分間での培養を経てシグナルが展開された(図9)。
2種類の互いに異なるファージミド由来のビリオンとしてのpFKPDNscTCR Vαβ4B2A1,及びpSEX−scFvアンチphOxの双方は,AviTag(登録商標)をディスプレイするものであり(図10),FLAGタグをディスプレイするものであり(図11),さらに,HIS6タグをディスプレイするものであり(図11),これらは,それぞれ,scTCR及びscFvとpIIIとの結合の機能的なディスプレイを試験したものである。
本発明は,pVIIタンパク質上でのディスプレイの性質を用いてゲノムのファージベクターの産生を許容するものである。そのようなディスプレイは,ビリオンの伝染性に影響を与えるものではない。さらに,本発明は,二重特異性を持つディスプレイをpVII及びpIII/pVIII上で,又は,3種類全てのコートタンパク質上でいっせいに促進させるものである。以下の実施例は,繁殖,ビリオンアッセンブリー,ビリオン集積,pIIIディスプレイの表現型に関して,構造体が完全に野生型ファージのように振る舞うこと,並びに,pVIIペプチド結合でインビボでのビオチン化が選択的に確実に行われることを示すものである。
Sambrookら(Molecular cloning: a
laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press))で説明されているように,基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチM13−HRP抗体は,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala)から購入した。また,F23.2抗体とGB113抗体は,B.Bogen教授(Institute of Immunology,ノルウェー,オスロ)からの親切な贈呈物である。制限酵素(RE)は,DpnIを除いて,New England Biolabs(米国,MA州,Ipswich)から購入し,DpnIについては,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から入手した。DNAオリゴは,MWG Biotech AG(ドイツ,Ebersberg)から購入した。ダイナビーズMyOne(登録商標)(ストレプトアビジン磁気ビーズ)は,Invitrogen(ノルウェー,オスロ)ら購入した。dm5CTPは,Fermentas(カナダ,バーリントン)からのものを用いた。BSAとTween20は,Sigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。PfuターボDNAポリメラーゼとPhusionDNAポリメラーゼは,それぞれ,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)及びSigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。QIAquick PCRクリーンアップキットは,Qiagen(ドイツ,Qiagen,Hilden)からのものを使用した。
大腸菌株XL1−Blueは,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。また,大腸菌株MC1061及びK91Kは,G.P.Smith博士(Division of Biological Sciences, University of Missouri,米国)からの親切な贈呈物である。pSEX81(配列ID番号29),ウシ血清アルブミン(BSA)に結合された2−フェニルオキサゾール−5−オン(phOx)選択性を持つscFvをかくまうファージミドは,Affitech AS(ノルウェー,オスロ)から親切にも提供を受けたものである。fUSE−scTCR Vαβ4B2A1 pIIIディスプレイベクターは,Losetらの文献(2007年,PMID:17925331)において記述されている。
AviTag(登録商標)(N−MSGLNDIFEAQKIEWHE−C)の読み取り枠(ORF)を,GCUAサーバー(http://gcua.schoedl.de/seqoverall.html)を用いて,大腸菌K12株内でコドン利用した場合と比較した。原核生物のコドンを最適化したバージョンであるAviTag(登録商標)のペプチド配列を,製造者のプロトコル(Stratagen,米国,CA州,LaJolla)にしたがって,QuikChange(登録商標)によるインビトロでの突然変異生成によって,プライマー対であるBirA−pVII_frwd/BirA−pVII_rev(5’−CCGGCTAAGTAACATGTCCGGCCTGAACGATATCTTTGAAGCGCAGAAAATTGAATGGCATGAAATGGAGCAGGTC−‘3/5’−GACCTGCTCCATTTCATGCCATTCAATTTTCTGCGCTTCAAAGATATCGTTCAGGCCGGACATGTTACTTAGCCGG−3’)(それぞれ,配列ID番号5と配列ID番号6に相当する。)を用いて,pVIIのORFのN末端に取り付けた。無菌のベクターバックグラウンドを確保するために,改変後のpVIIを含むBsrGI/SnaBIのREフラグメントを,標準技術を用いて適合REサイト上で,修飾が施されていないfUSE5−scTCR Vαβ4B2A1ゲノムへとクローン化した。電気穿孔法を用いて,DNA構造体を大腸菌MC1061に導入した。プライマーの設計は,公開されているfUSE5の配列(GenBank登録番号AF218364)(配列ID番号30)をベースとした。
基本的にはScott及びSmithの文献(PMID:1696028)で説明されているようにして,fUSE5ファージを,大腸菌MC1061から増幅した。ビリオンアッセンブリーを,Scott及びSmithの文献(PMID:1696028)及びKochらの文献(PMID:11126120)に記載されているように滴下滴定によってモニターした。当てはまる場合には,Sambrookらの文献(Molecular cloning:a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press)で説明されているように,PEG/NaClの滴下によってビリオンの精製と濃縮を行った。
F23.2抗体及びGB113抗体を,PBS中2.5μg/mlから5μg/mlまでの濃度で,pH7.4で,かつ4℃で終夜にわたって,MaxiSorp(登録商標)のマイクロタイタープレートウェル(デンマーク,Roskilde,Nunc)に吸収させた。ウェル(well)は,PBS中2%(w/v)のスキムミルク(脱脂粉乳)で,室温下で1時間にわたって阻害された。その後,添加されて,1〜2時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を,捕捉されるビリオンがアンチM13−HRP(1:5000)で検出されるまで室温下で1時間にわたって行った。各ステップ間で,ウェルをPBSTで3回洗浄した。ウェルは,ABST基質で展開され,30分後に吸光度をA405nmで読み取った。
Sambrookら(Molecular cloning:a laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press))で説明されているように,基本的なメディアやバッファの全てを用意した。アンチM13−HRP抗体は,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala)から購入した。GB113抗体は,B.Bogen教授(Institute of Immunology,ノルウェー,オスロ)からの親切な贈呈物である。制限酵素(RE)は,DpnIを除いて,New England Biolabs
(米国,MA州,Ipswich)から購入し,DpnIについては,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から入手した。DNAオリゴは,MWG Biotech AG(ドイツ,Ebersberg)から購入した。ダイナビーズMyOne(登録商標)(ストレプトアビジン磁気ビーズ)と,Talon(登録商標)のNi−NTA磁気ビーズは,いずれも,Invitrogen (ノルウェー,オスロ)ら購入した。BSAとTween20は,Sigma−Aldrich(ノルウェー,オスロ)から購入した。PfuターボDNAは,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。BSAに組み込まれるハプテン2−フェニルオキサゾール−5−オン(phOx)及び5−ニトロフェンアセチル(NIP)は,他の文献(Makelaら,PMID:722243;Michaelsenら,PMID:2125362)でも説明されているように基本的には調製した。イソプロピル−ベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)は,Fermentas(カナダ,バーリントン)から購入した。
大腸菌株XL1−Blueは,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)から購入した。M13K07ヘルパーファージは,GE Healthcare Bio−Sciences AB(スウェーデン,Uppsala)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)に結合された2−フェニルオキサゾール−5−オン(phOx)選択性を持つscFvをかくまう,pSEX81(配列ID番号29)ファージミドは,Affitech AS(ノルウェー,オスロ)から親切にも提供を受けたものである。pFKPDN−scTCR Vαβ4B2A1のpIIIディスプレイファージミドは,他の文献(Losetら,2007年,PMID:17925331)において記述されている。scFvアンチNIP(配列ID番号27)(未公開)をかくまう原核生物発現ベクターpSGIは,pHOG21(Kiprianovら,PMID:9005945)に基づいているとともに,pLNOH2及びpLNOK(Norderhaugら,PMID:9202712)に由来する抗体バリアブル遺伝子から社内的に製造されたものである。
ベクターバックボーン用の開始テンプレートとして,上述したpSEX81(配列ID番号29)ファージミドを選択した(GenBank登録番号Y14584)。まず,このベクター内のストレッチ(strech)をコードする原核生物のpelBシグナル配列(N−MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA−C)(配列ID番号33)を除去するために,QuickChange(登録商標)を利用して,プライマー対であるa41g−frwd/a41g−rev(5’−AGAGGAGAAATTAACCATGGAATACCTATTGCCTACGGC−3’/5−GCCGTAGGCAATAGGTATTCCATGGTTAATTTCTCCTCT−3’)(これらは,それぞれ,配列ID番号13,及び配列ID番号14に相当する。)を用いたインビトロでの突然変異生成で,NcoIのREサイトをN末端の極端に導入し,それにより,pelBのORFの第2コドン内にある第1のヌクレオチドを,AからGに変化させた。突然変異生成に続いて,ベクターをNcoI温浸し,再結合させ,その後,プライマー対であるpHOG_EcoRI_frwd/scTCR_rev(5’−TAGCTCACTCATTAGGCACCC−3’/5’−TTTGGATCCAGCGGCCGC−3’)(これらは,それぞれ,配列ID番号15,及び配列ID番号16に相当する。)を用いて,ベクターの関連部分を回復させる第2のPCRでのテンプレートとして用いた。その後,そのPCRのフラグメントを,標準技術を用いて,EcoRI/HindIIIのREサイト上で,原型のpSEX81(配列ID番号29)に移動させ,DNAシークエンシングで確認した。このステップにより,pelBシグナル配列をコードする部分を完全に除去したが,通常の転写と翻訳に重要であるだけでなく,原形のpSEX81(配列ID番号29)内に見られるNcoI/NotIのREサイトで定義される外来配列の前にたった1つのAla残渣を付加するのに重要なlacPO及びシャイン−ダルガノ配列(SD)のために開始コドンとその関連位置を維持した。その新しい構造体をpSEX81ΔLで示す。第2に,5’端部でREタグ化されたプライマー対であるpVII_EcoRV/ pVII_NheI(5’−ATATGATATCAGAATGGAGCAGGTCGCGGATTTCG−3’/5’−ATATGCTAGCTTATCATCTTTGACCCCCAGCGATTATACC−3’)(これらは,それぞれ,配列ID番号17,及び配列ID番号18に相当する。)を用いて,pVIIをコードする配列をM13K07から増幅した。その後,このPCRのフラグメントを,適合REサイト上で,pSEX81(配列ID番号29)ファージミドとpSEX81ΔLファージミドの双方に移動させ,これにより,双方においてpIIIをコードする領域を交換し,結果として,原型のpSEX81(配列ID番号29)内で,NcoI/NotIを定義するカセットのN末端イン・フレーム型pVII結合がもたらされた。これらの新しい構造体をDNAシークエンシングで確認して,それぞれ,pGALD7及びpGALD7ΔLとした。それぞれ,pFKPDN及びpSG1からのscTCR Vαβ4B2A1及びscFvアンチNIP(配列ID番号27)ユニットを用いて,上述したような様々なファージミド内でscFvアンチphOx(配列ID番号26)ユニットを切り替えるために,標準技術を用いて,NcoI/NotIのREサイトを定義するカセット交換を行った。本明細書で説明するファージミドの全てを,標準技術を用いた電気穿孔法で,大腸菌XL1−Blueに導入した。
M13K07ヘルパーファージとビリオンアッセンブリーを用いたXL1−Blueの大腸菌ファージミドレスキューを,上述したように滴下滴定でモニターした(Welschofら,PMID:9050877,及びKochら,PMID:11126120)。
MAb GB113,phOx−BSA,又はNIP−BSAを,PBS中2.5μg/mlから5μg/mlまでの濃度で,pH7.4で,かつ4℃で終夜にわたって,MaxiSorp(登録商標)のマイクロタイタープレートウェル(デンマーク,Roskilde, Nunc)に吸収させた。ウェル(well)は,PBS中2%(w/v)のスキムミルク(脱脂粉乳)又はPBS中2%(w/v)のBSAで,室温下で1時間にわたって阻害された。その後,添加されて,1〜2時間にわたって室温下での反応が許容されるビリオン調合液を,捕捉されるビリオンがアンチM13−HRP(1:5000)で検出されるまで室温下で1時間にわたって行った。各ステップ間で,ウェルをPBSTで3回洗浄した。ウェルは,ABST基質で展開され,30分後に吸光度をA405nmで読み取った。
試薬
Sambrookら(Molecular cloning: a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press))で説明されているように,基本的なメディアやバッファの全てを用意した。
大腸菌株XL1−Blue及びAVB100(MC1061に基づく)を,それぞれ,Stratagene(米国,CA州,LaJolla)及びAvidity(米国,CO州,Denver)から購入した。
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Claims (12)
- フィラメント状のファージに由来するpVII結合タンパク質をコードする核酸を含むファージゲノム又はファージミドであって,
前記結合タンパク質が,N末端のシグナル配列を含まない,
前記pVII結合タンパク質の外来ペプチドが,前記pVII結合タンパク質の配列の前記N末端の端部に直接結合する,
ファージゲノム又はファージミド。 - 請求項1に記載のファージゲノム又はファージミドであって,
前記pVII結合タンパク質が,
配列ID番号1の配列(MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR)の配列を含む,
ファージゲノム又はファージミド。 - 請求項1又は2に記載のファージゲノム又はファージミドであって,
前記pVII結合タンパク質の外来ペプチドが,配列ID番号4で示される配列を有するタグ,FLAGタグ(配列ID番号9),HISタグ(配列ID番号12),HATタグ,HAタグ,c−Mycタグ,V5タグ,抗体又はそのフラグメント,T細胞受容体又はそのフラグメント,MHC分類I及び分類II,アンキリン,IgNAR又はそのフラグメント,フィブロネクチン又はそのフラグメント,タンパク質AのZドメイン,CTLA4又はそのフラグメント,ImmE7,及びGFPからなる群から選択される,
ファージゲノム又はファージミド。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載のファージゲノム又はファージミドを含む,
フィラメント状のファージ。 - 野生型pVII及び/又は野生型pVIIタンパク質をコードする遺伝子をさらに含む,
請求項4に記載のフィラメント状のファージ。 - 請求項4に記載のフィラメント状のファージであって,
前記ファージが,野生型pVII及び/又は野生型pVIIタンパク質をコードする遺伝子を含まない,
フィラメント状のファージ。 - 請求項4〜6のいずれか1項に記載のフィラメント状のファージであって,
pIII結合タンパク質又はpVIII結合タンパク質をさらに含む,
フィラメント状のファージ。 - 請求項4〜7のいずれか1項に記載のフィラメント状のファージのライブラリーであって,
pIII,pVII,又はpVIIIへの結合としての外来ペプチドをディスプレイする,
フィラメント状のファージのライブラリー。 - 請求項8に記載のライブラリーであって,
ペプチドが,pVIIと,pIII及びpVIIIの一方又は双方とで同時にディスプレイされる,
ライブラリー。 - ファージミドと,ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって,
前記ヘルパーファージが,フィラメント状のファージに由来するpVII結合タンパク質をコードする核酸を含み,
前記pVII結合タンパク質は,N末端のシグナル配列を含まず,配列ID番号1の配列(MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR)の配列を含み,
前記pVII結合タンパク質の外来ペプチドが,前記pVII結合タンパク質の配列の前記N末端の端部に直接結合し,
前記ヘルパーファージは,前記ファージミドが前記フィラメント状のファージに感染されることを助けるものである,
ファージディスプレイシステム。 - ファージミドと,ヘルパーファージとを含むファージディスプレイシステムであって,
前記ファージミドが,フィラメント状のファージに由来するpVII結合タンパク質をコードする核酸を含み,
前記pVII結合タンパク質は,N末端のシグナル配列を含まず,配列ID番号1の配列(MEQVADFDTIYQAMIQISVVLCFALGIIAGGQR)の配列を含み,
前記pVII結合タンパク質の外来ペプチドが,前記pVII結合タンパク質の配列の前記N末端の端部に直接結合し,
前記ヘルパーファージは,前記ファージミドが前記フィラメント状のファージに感染されることを助けるものである,
ファージディスプレイシステム。 - 請求項10又は請求項11に記載のファージディスプレイシステムを含む,キット。
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