KR102093125B1

KR102093125B1 - M13ko7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 y 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR102093125B1
Application number: KR1020180104618A
Authority: KR
Inventors: 이석찬; 조상호; 이영규
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2018-09-03
Filing date: 2018-09-03
Publication date: 2020-03-25
Also published as: US20200071775A1; US11098379B2; KR20200026544A

Abstract

본 발명은 M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지는 대장균을 이용하여 쉽게 생산 가능하며, 거대한 단백질의 집합체이기 때문에 외부 물리적인 요인이나 화학적인 요인에 노출되어도 항체에 비해 안정적이다. 따라서, 본 발명의 조성물은 PVY만을 특이적이고 정확하게 진단하는 효과가 있어, 관련 사업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트{The composition for detecting the Potato virus Y comprising M13KO7 bacteriophage and kit comprising the same}

본 발명은 M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.

감자 바이러스 Y(PVY, Potato virus Y)는 바이러스 그룹인 포티비리대(potyviridae)에 속하는데, 감자뿐만 아니라 다른 작물에 쉽게 감염되어 경제적으로 큰 손실을 유발하는 바이러스이다. PVY는 숙주가 되는 작물이 자랄 수 있는 모든 지역에서 기계, 운반체 또는 환경적 수단으로 쉽게 전이되며, 감자 재배종과 바이러스의 종류에 따라 감자 생산량에 대한 손실량은 30%에서 80%로 다양하게 나타난다. 감자 바이러스 균주는 일반적으로 PVY^O, PVY^C와 PVY^N으로 나뉜다. PVY^O는 감자를 생산하는 나라에서 대부분 감염되는 종류이다. 이러한 PVY의 감염으로 감자 식물체는 괴사, 얼룩, 잎의 황변을 나타낸다.

상기 감자 바이러스 Y (PVY)를 포함한 식물바이러스는 질병의 치료가 거의 불가능하며, 바이러스가 확산 시 작물의 상품성 감소 및 수확량 감소 등 국내 식량자원의 큰 피해를 입히거나 농가에 치명적인 손실을 가져온다(Potato, Viruses, and Seed Certification in the USA to Provide Healthy Propagated Tubers, Halterman at al., 2012, Agricultural Sciences). 이러한 식물 바이러스 연구 방향은 치료보다는 진단에 초점이 맞추어져 있으며 이러한 진단 기술은 초기대응이 중요하기 때문에 빠르고 정확한 진단기술을 요구한다. 식물바이러스를 진단하는 방법은 중합합효소연쇄반응 (PCR) 에 기반을 두어 바이러스의 핵산을 증폭하여 진단하는 방법과 효소면역측정법 (ELISA) 등과 같은 항체를 이용한 혈청학적 분석 방법이 있다. 하지만 이러한 항체는 생산하는데 실험동물의 희생을 필요로 하고, 외부 물리적인 요인이나 화학적인 요인에 의해 쉽게 활성을 잃을 수 있기 때문에, 식물바이러스를 연구하는 연구실이나, 진단이 필요한 현장에서는 생산하거나 다루기 어려운 단점이 있다.

박테리오 파지 M13KO7은 대장균을 이용하여 쉽게 생산 가능하며, 거대한 단백질의 집합체이기 때문에 외부 물리적인 요인이나 화학적인 요인에 노출되어도 항체에 비해 안정적이다. 하지만 M13KO7은 파지 디스플레이 라이브러리를 생산하기 위한 보조 수단으로 사용되는 것이 일반적인 방법이었다. 본 발명에서 제공하는 진단방법은 PVY와 M13KO7, 두 바이러스의 특이적 반응현상을 이용하여 감자 식물 샘플에서 PVY를 특이적이고 효과적으로 검출하고자 본 발명을 완성 하였다.

본 발명의 목적은 M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY) 검출용 조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 포함하는 PVY 검출용 키트를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 조성물을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, PVY 검출 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY) 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 PVY 검출용 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 조성물을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, PVY 검출 방법을 제공한다.

도 1은 M13KO7(a)와 기존 PVY 검출 항체(b)를 비교하여, PVY 이병주 검출 능력(c)을 확인한 도이다.
도 2는 진단 방법 간소화에 따라, M13KO7에 대한 PVY 이병주 검출 능력을 정량적으로 측정한 결과를 확인한 도이다(Separately는 파지와 검출 항체를 따로 따로 처리한 군, simultaneously는 파지와 검출 항체를 동시에 처리한 군이다).
도 3은 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지가 여러 potyvirus 중 PVY 이병주를 특이적으로 검출하는 것을 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 열을 가한 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지가 PVY 이병주 검출 능력을 상실하는 것을 정량적으로 측정한 그 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 M13KO7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY) 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 용어 "박테리오 파지"는 세균에 감염되어 그 세포 내에서만 증식하는 바이러스로 파지라고도 하는데 세균여과기를 통과하며 광학현미경으로는 직접 볼 수 없는 미소한 입자이고 살아 있는 세포내에서만 증식이 가능하다.

상기 검출은 감자(Solanum sp.), 가지(Solanum sp.), 담배 (Nicotiana sp.), 토마토(Lycopersicon sp.), 고추(Capsicum sp.), 다알리아(Dahlia sp.) 및 페튜니아(Petunia)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 시료에서 수행할 수 있고, 바람직하게는 감자이나 이에 제한되지 않는다.

상기 M13KO7 박테리오 파지는 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 코딩될 수 있다. 바람직하게는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 상기 아미노산은 M13KO7 박테리오 파지의 캡시드 단백질(capsid protein)이며 이에 제한되지 않는다.

상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산은 각 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에 의해 코딩될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 아미노산의 범위는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 상기 서열번호로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. 본 발명의 아미노산은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

아미노산의 변이체란 아미노산의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 또한, 테트라펩타이드 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상기 M13KO7 박테리오 파지를 구성하는 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 아미노산 또는 단백질을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 염기 서열은 이를 구성하는 염기 서열의 작용성 등가물, 예를 들어, 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 염기 서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 M13KO7 박테리오 파지를 구성하는 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지는 배지에대장균 균주를 접종하고 M13KO7 박테리오 파지를 감염시켜 증식시켰다. 그 후, 종래 PVY 항체와 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지의 PVY 결합 능력을 비교한 결과, 종래 항체보다 동일 농도 대비 더 향상된 민감도가 나타남을 확인하였다. 또한, potyvirus에 속하는 ChiVMV, PepMoV, PepSMV, PVA, PVV, PVMV, WMV 및 PPV와 비교하여 PVY에 대한 특이성 및 정확도가 우수함을 확인하였다. 또한, capture antibody 없이도 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지만으로도 PVY를 검출할 수 있는 효과가 있다.

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

본 발명의 M13KO7 박테리오 파지는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

상기 키트는 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 실시할 수 있으나, 바람직하게는 효소면역분석법(ELISA)이고, 이에 제한되지 않는다.

상기 효소면역분석법(ELISA)는 direct ELISA, indirect ELISA 또는 sandwich ELISA를 수행할 수 있으나, 상기 조성물을 이용하여 PVY 검출하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 시료는 감자(Solanum sp.), 가지(Solanum sp.), 담배 (Nicotiana sp.), 토마토(Lycopersicon sp.), 고추(Capsicum sp.), 다알리아(Dahlia sp.) 및 페튜니아(Petunia)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 감자이나 이에 제한되지 않는다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<준비예 1> M13KO7 박테리오파지의 증식

본 발명에 사용된 M13KO7 파지를 증식하기 위하여, Tetracycline (10 μg/ml)과 2% glucose(v/v)가 포함된 2TY broth 배지에 대장균 균주인 XL1-blue를 1% 접종 한 후 OD600 nm값이 0.6 이상이 될 때까지 37도 교반배양기에 배양시켰다. 그 후 M13KO7 파지를 50 multiplicity of infection (MOI)의 양으로 감염 시킨 후 37도에서 30분 동안 교반하지 않고 방치하였다. 원심분리기를 이용하여 cell을 가라앉힌 후 상층액을 버리고 pellet을 새로운 2TY broth배지에 배양하였다. 새 배지는 tetracycline(10 μg/ml), kanamycin(50 μg/ml), 0.2% glucose (v/v)를 포함하였으며 30도에서 24시간동안 교반배양기에서 배양 하였다. 배양을 마친 후 원심분리기를 이용하여 cell을 가라앉힌 후 상층액을 취해 0.22 μm stericup(Millipore)을 이용하여 여과시켰다. 여과액에 1/5 부피의 PEG/NaCl (20% polyethylene glycol 6000, 2.5 M NaCl)을 넣은 후 잘 섞어 1시간 동안 얼음 안에서 반응시켜 파지를 응집시켰다. 고속원심분리기를 이용하여 충분히 파지를 가라앉힌 후 상층액을 제거하고 phosphate-buffered saline(PBS; pH 7.4) 용액에 파지를 섞었다. 오랜 기간 보관을 위해 1 부피의 glycerol을 넣고 -20도에서 보관했다.

<준비예 2> PVY(Potato virus Y) 감자의 준비

감자 바이러스가 감염된 감자 식물 샘플은 국립식량과학원 고령지농업연구소에서 친절하게 제공받아 실험에 사용하였다. 식물 샘플은 -86도에서 동결 보관되었으며 검정 실험에 앞서 필요한 양 만큼 착즙한 후 general extraction buffer[PBS(pH 7.4)용액에 10 mM sodium sulfite, 2% (w/v) polyvinylpyrrolidone (MW 40,000), 0.2% (w/v) sodiumazide, 2% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 2% (v/v) tween-20 (Promega)을 혼합한 용액]와 혼합하였다.

<실시예 1> M13KO7 박테리오 파지를 이용한 PVY 결합 능력 확인 및 항체와 비교

M13KO7 박테리오 파지와 PVY의 결합 능력을 확인하기 위해서, ELISA 실험을 진행하였다. 96 well ELISA plate에 PVY capture antibody(Agdia)를 carbonate coating buffer(15 mM sodium carbonate, 35 mM sodium bicarbonate, pH 9.6)에 0.1 μg/ml의 농도로 희석하여 well에 100 μl씩 분주한 후 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 항체 코팅 반응 후 plate는 0.1% (v/v)의 tween-20을 포함한 tris-buffered saline(TBS; pH 7.4)을 washing buffer (TBS-T)로써 사용하여 3번 수세하였다. 그 후, 음성 대조군(general extraction buffer), 건전주, PVY 이병주 샘플을 준비예 2에 기술한 것과 같이 general extraction에 준비하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후 4도에서 16시간 동안 바이러스를 반응시켰다. 기존 항체와 결합 강도를 비교하기 위해 여분의 plate에 상기한 바와 같이 동일하게 PVY capture antibody 및, 식물 샘플을 준비하였다. TBS-T를 이용하여 모든 plate를 6번 수세한 후 하나의 plate에는 M13KO7 박테리오 파지를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하였다. 다른 plate에는 PVY detection antibody(Agdia)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하였고 모든 plate를 상온에서 1시간동안 바이러스와 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 모든 plate를 3번 수세한 후 M13KO7 박테리오 파지를 반응시켰던 plate는 anti-M13 HRP conjugated antibody (Sino biological)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하였다. 다른 plate에는 anti-mouse IgG HRP conjugated antibody (Cell signaling technology)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하였고 모든 plate를 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 모든 plate를 6번 수세한 후 모든 plate에 각 well에 100 μl의 3,5',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB)용액을 넣어 발색 반응을 진행했으며 10분 뒤 100 μl의 1M sulfuric acid를 넣어 발색 반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 M13KO7와 PVY의 결합 능력을 정량적으로 측정하였으며, 기존에 ELISA 검정에 사용되는 항체와의 결합 강도를 비교하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, M13KO7 박테리오 파지를 이용한 PVY 이병주 검출 능력이 기존 항체에 비해서 동일 농도 대비 약 25% 향상된 민감도를 보임을 확인하였다.

<실시예 2> M13KO7 박테리오 파지를 이용한 PVY 이병주 검정 방법의 최적화 조건 확인

M13KO7 박테리오 파지를 이용하여 PVY 이병주를 보다 효과적으로 검출하기 위하여 검정 방법을 최적화하였다. 보다 구체적으로, 96 well plate에 capture antibody를 반응시키지 않고 음성 대조군, 건전주, PVY 이병주 샘플을 준비예 2에 기술한 것과 같이 general extraction에 준비하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후 4도에서 16시간 동안 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 모든 plate를 6번 수세한 후, 하나의 plate에는 M13KO7 박테리오 파지를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 해당 plate를 3번 수세한 후 anti-M13 HRP conjugated antibody (Sino biological)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml 농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 다른 하나의 plate에는 M13KO7 박테리오 파지와 anti-M13 HRP conjugated antibody (Sino biological)를 각각 3 μg/ml농도로 희석한 후 혼합하여 각 well당 100 μl씩 분주하여 상온에서 2시간 30분 동안 반응시켰다. 모든 plate를 6번 수세한 후 모든 plate의 각 well에 100 μl의 TMB용액을 넣어 발색 반응을 진행했으며 10분 뒤 100 μl의 1M sulfuric acid를 넣어 발색 반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 M13KO7 박테리오 파지와 PVY의 결합 능력을 정량적으로 측정하였으며, HRP conjugated antibody를 파지와 따로 반응시킨 것과 파지와 동시에 반응시킨 실험을 비교하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, HRP conjugated antibody를 M13KO7과 따로 반응시킨 처리군이 더 정확하게 PVY 이병주를 검출 하였으며, capture antibody 없이도 정확한 검출 결과를 보임을 확인하였다.

<실시예 3> M13KO7 박테리오 파지의 PVY 이병주 특이적 검출 확인

M13KO7 박테리오 파지가 PVY 이병주를 특이적으로 검출하는 지 확인하기 위해서 PVY가 속한 potyvirus와의 검정 실험을 진행하였다. 구체적으로, 실험에 사용한 potyvirus는 서울여자대학교 소재의 식물바이러스은행(PVGB)에서 분양받아 실험을 진행하였으며, 분양받은 바이러스는 chili veinal mottle virus (ChiVMV; PV-0897), pepper mottle virus (PepMoV; PV-1113), pepper severe mosaic virus (PepSMV; PV-1191), potato virus A (PVA; PV-0827), potato virus V (PVV; PV-0827), tobacco vein mottling virus (PVMV; PV-0251), watermelon mosaic virus (WMV; PV-0393)를 동결 건조된 상태로 분양받았다. 추가로 본 연구실에서 보유중인 plum pox virus (PPV)에 대한 검정도 진행하였다. PVY를 포함한 모든 potyvirus들은 준비예 2에 기술한 것처럼 general extraction buffer에 준비하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후, 4도에서 16시간 동안 바이러스를 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 plate를 6번 수세한 후 M13KO7을 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 plate를 3번 수세한 후 anti-M13 HRP conjugated antibody (Sino biological)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하여 상온에서 1시간동안 반응시켰다. Plate를 6번 수세한 후 각 well에 100 μl의 TMB용액을 넣어 발색 반응을 진행했으며 10분 뒤 100 μl의 1M sulfuric acid를 넣어 발색 반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 M13KO7가 PVY를 특이적으로 검출하는지를 정량적으로 측정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, M13KO7 박테리오 파지는 다른 potyvirus에 속하는 ChiVMV, PepMoV, PepSMV, PVA, PVV, PVMV, WMV 및 PPV를 검출하지 않음을 확인하였다. 따라서, 특이적으로 PVY를 만을 검출하여 PVY에 대한 특이성 및 정확도가 우수함을 확인하였다.

<실시예 4> 열을 가한 M13KO7 박테리오 파지의 PVY 검출 능력 확인

일반적인 단백질 및 바이러스는 열을 가하면 불활성 되므로, 본 발명의 M13KO7 박테리오 파지에 열을 가하여 PVY 검출 능력이 변화하는지 확인하였다. 구체적으로 96 well plate에 음성 대조군, 건전주, PVY 이병주 샘플을 준비예 2에 기술한 것과 같이 general extraction에 준비하여 각 well당 100 μl씩 분주한 후 4도에서 16시간동안 반응시켰다. 열을 가한 파지와 그렇지 않은 파지를 비교하기 위해, 여분의 plate에 상기한 대로 동일하게 식물 샘플을 준비하였다. TBS-T를 이용하여 모든 plate를 6번 수세한 후 하나의 plate에는 30분 동안 물 중탕한 M13KO7을 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하였다. 다른 하나의 plate는 열을 가하지 않은 M13KO7을 동일하게 처리하고 모든 plate를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 모든 plate를 TBS-T를 이용하여 plate를 3번 수세한 후 anti-M13 HRP conjugated antibody (Sino biological)를 3% BSA가 포함된 TBS-T에 3 μg/ml농도로 희석하여 각 well당 100 μl씩 분주하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 모든 plate를 6번 수세한 후 각 well에 100 μl의 TMB용액을 넣어 발색 반응을 진행했으며 10분 뒤 100 μl의 1M sulfuric acid를 넣어 발색 반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 열을 가한 M13KO7가 PVY를 검출하는지를 정량적으로 측정하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, M13KO7 박테리오 파지에 열을 가할 시, 불활성화되어 PVY와 결합하지 않아 검출능이 상실함을 확인하였다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) Research and Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> The composition for detecting the Potato virus Y comprising M13KO7 bacteriophage and kit comprising the same <130> PN1807-241 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 424 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of M13KO7 bacteriophage gene 3 <400> 1 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 1 5 10 15 His Ser Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu 20 25 30 Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr 35 40 45 Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys 50 55 60 Thr Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu 65 70 75 80 Ala Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp 100 105 110 Thr Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr 115 120 125 Pro Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu 130 135 140 Glu Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg 145 150 155 160 Asn Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly 165 170 175 Thr Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys 180 185 190 Ala Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe 195 200 205 His Ser Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln 210 215 220 Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 245 250 255 Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 260 265 270 Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala 275 280 285 Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly 290 295 300 Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe 305 310 315 320 Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp 325 330 335 Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn 340 345 350 Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln 355 360 365 Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu 370 375 380 Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala 385 390 395 400 Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala 405 410 415 Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 420 <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of M13KO7 bacteriophage gene 6 <400> 2 Met Pro Val Leu Leu Gly Ile Pro Leu Leu Leu Arg Phe Leu Gly Phe 1 5 10 15 Leu Leu Val Thr Leu Phe Gly Tyr Leu Leu Thr Phe Leu Lys Lys Gly 20 25 30 Phe Gly Lys Ile Ala Ile Ala Ile Ser Leu Phe Leu Ala Leu Ile Ile 35 40 45 Gly Leu Asn Ser Ile Leu Val Gly Tyr Leu Ser Asp Ile Ser Ala Gln 50 55 60 Leu Pro Ser Asp Phe Val Gln Gly Val Gln Leu Ile Leu Pro Ser Asn 65 70 75 80 Ala Leu Pro Cys Phe Tyr Val Ile Leu Ser Val Lys Ala Ala Ile Phe 85 90 95 Ile Phe Asp Val Lys Gln Lys Ile Val Ser Tyr Leu Asp Trp Asp Lys 100 105 110 <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of M13KO7 bacteriophage gene 7 <400> 3 Met Glu Gln Val Ala Asp Phe Asp Thr Ile Tyr Gln Ala Met Ile Gln 1 5 10 15 Ile Ser Val Val Leu Cys Phe Ala Leu Gly Ile Ile Ala Gly Gly Gln 20 25 30 Arg <210> 4 <211> 73 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of M13KO7 bacteriophage gene 8 <400> 4 Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu 1 5 10 15 Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala 20 25 30 Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala 35 40 45 Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu 50 55 60 Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser 65 70 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid of M13KO7 bacteriophage gene 9 <400> 5 Met Ser Val Leu Val Tyr Ser Phe Ala Ser Phe Val Leu Gly Trp Cys 1 5 10 15 Leu Arg Ser Gly Ile Thr Tyr Phe Thr Arg 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tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 780 ggctctgagg gaggcggttc cggtggtggc tctggttccg gtgattttga ttatgaaaag 840 atggcaaacg ctaataaggg ggctatgacc gaaaatgccg atgaaaacgc gctacagtct 900 gacgctaaag gcaaacttga ttctgtcgct actgattacg gtgctgctat cgatggtttc 960 attggtgacg tttccggcct tgctaatggt aatggtgcta ctggtgattt tgctggctct 1020 aattcccaaa tggctcaagt cggtgacggt gataattcac ctttaatgaa taatttccgt 1080 caatatttac cttccctccc tcaatcggtt gaatgtcgcc cttttgtctt tagcgctggt 1140 aaaccatatg aattttctat tgattgtgac aaaataaact tattccgtgg tgtctttgcg 1200 tttcttttat atgttgccac ctttatgtat gtattttcta cgtttgctaa catactgcgt 1260 aataaggagt cttaa 1275 <210> 7 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13KO7 bacteriophage gene 6 <400> 7 atgccagttc ttttgggtat tccgttatta ttgcgtttcc tcggtttcct tctggtaact 60 ttgttcggct atctgcttac ttttcttaaa aagggcttcg gtaagatagc tattgctatt 120 tcattgtttc ttgctcttat tattgggctt aactcaattc ttgtgggtta tctctctgat 180 attagcgctc aattaccctc tgactttgtt cagggtgttc agttaattct 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<223> M13KO7 bacteriophage gene <400> 11 aacgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60 atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120 cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180 gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300 ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360 tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420 cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480 tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540 aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600 ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660 aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720 atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780 tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840 caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900 ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960 aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020 tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080 gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140 caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200 caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260 gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320 caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380 cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440 tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500 attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560 tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1620 tattctcact ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aaccccatac agaaaattca 1680 tttactaacg tctggaaaga cgacaaaact ttagatcgtt acgctaacta tgagggttgt 1740 ctgtggaatg ctacaggcgt tgtagtttgt actggtgacg aaactcagtg ttacggtaca 1800 tgggttccta ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtggctctga gggtggcggt 1860 tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg tgatacacct 1920 attccgggct atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg tactgagcaa 1980 aaccccgcta atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac tttcatgttt 2040 cagaataata ggttccgaaa taggcagggg gcattaactg tttatacggg cactgttact 2100 caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc aaaagccatg 2160 tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg ctttaatgag 2220 gatccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc tcctgtcaat 2280 gctggcggcg gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggtgg ctctgagggt 2340 ggcggttctg agggtggcgg ctctgaggga ggcggttccg gtggtggctc tggttccggt 2400 gattttgatt atgaaaagat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga aaatgccgat 2460 gaaaacgcgc tacagtctga cgctaaaggc aaacttgatt ctgtcgctac tgattacggt 2520 gctgctatcg atggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa tggtgctact 2580 ggtgattttg ctggctctaa ttcccaaatg gctcaagtcg gtgacggtga taattcacct 2640 ttaatgaata atttccgtca atatttacct tccctccctc aatcggttga atgtcgccct 2700 tttgtcttta gcgctggtaa accatatgaa ttttctattg attgtgacaa aataaactta 2760 ttccgtggtg tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt attttctacg 2820 tttgctaaca tactgcgtaa taaggagtct taatcatgcc agttcttttg ggtattccgt 2880 tattattgcg tttcctcggt ttccttctgg taactttgtt cggctatctg cttacttttc 2940 ttaaaaaggg cttcggtaag atagctattg ctatttcatt gtttcttgct cttattattg 3000 ggcttaactc aattcttgtg ggttatctct ctgatattag cgctcaatta ccctctgact 3060 ttgttcaggg tgttcagtta attctcccgt ctaatgcgct tccctgtttt tatgttattc 3120 tctctgtaaa ggctgctatt ttcatttttg acgttaaaca aaaaatcgtt tcttatttgg 3180 attgggataa ataatatggc tgtttatttt gtaactggca aattaggctc tggaaagacg 3240 ctcgttagcg ttggtaagat tcaggataaa attgtagctg ggtgcaaaat agcaactaat 3300 cttgatttaa ggcttcaaaa cctcccgcaa gtcgggaggt tcgctaaaac gcctcgcgtt 3360 cttagaatac cggataagcc ttctatatct gatttgcttg ctattgggcg cggtaatgat 3420 tcctacgatg aaaataaaaa cggcttgctt gttctcgatg agtgcggtac ttggtttaat 3480 acccgttctt ggaatgataa ggaaagacag ccgattattg attggtttct acatgctcgt 3540 aaattaggat gggatattat ttttcttgtt caggacttat ctattgttga taaacaggcg 3600 cgttctgcat tagctgaaca tgttgtttat tgtcgtcgtc tggacagaat tactttacct 3660 tttgtcggta ctttatattc tcttattact ggctcgaaaa tgcctctgcc taaattacat 3720 gttggcgttg ttaaatatgg cgattctcaa ttaagcccta ctgttgagcg ttggctttat 3780 actggtaaga atttgtataa cgcatatgat actaaacagg ctttttctag taattatgat 3840 tccggtgttt attcttattt aacgccttat ttatcacacg gtcggtattt caaaccatta 3900 aatttaggtc agaagatgaa attaactaaa atatatttga aaaagttttc tcgcgttctt 3960 tgtcttgcga ttggatttgc atcagcattt acatatagtt atataaccca acctaagccg 4020 gaggttaaaa aggtagtctc tcagacctat gattttgata aattcactat tgactcttct 4080 cagcgtctta atctaagcta tcgctatgtt ttcaaggatt ctaagggaaa attaattaat 4140 agcgacgatt tacagaagca aggttattca ctcacatata ttgatttatg tactgtttcc 4200 attaaaaaag gtaattcaaa tgaaattgtt aaatgtaatt aattttgttt tcttgatgtt 4260 tgtttcatca tcttcttttg ctcaggtaat tgaaatgaat aattcgcctc tgcgcgattt 4320 tgtaacttgg tattcaaagc aatcaggcga atccgttatt gtttctcccg atgtaaaagg 4380 tactgttact gtatattcat ctgacgttaa acctgaaaat ctacgcaatt tctttatttc 4440 tgttttacgt gctaataatt ttgatatggt tggttcaatt ccttccataa ttcagaagta 4500 taatccaaac aatcaggatt atattgatga attgccatca tctgataatc aggaatatga 4560 tgataattcc gctccttctg gtggtttctt tgttccgcaa aatgataatg ttactcaaac 4620 ttttaaaatt aataacgttc gggcaaagga tttaatacga gttgtcgaat tgtttgtaaa 4680 gtctaatact tctaaatcct caaatgtatt atctattgac ggctctaatc tattagttgt 4740 tagtgcacct aaagatattt tagataacct tcctcaattc ctttctactg ttgatttgcc 4800 aactgaccag atattgattg agggtttgat atttgaggtt cagcaaggtg atgctttaga 4860 tttttcattt gctgctggct ctcagcgtgg cactgttgca ggcggtgtta atactgaccg 4920 cctcacctct gttttatctt ctgctggtgg ttcgttcggt atttttaatg gcgatgtttt 4980 agggctatca gttcgcgcat taaagactaa tagccattca 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Claims

서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 아미노산 서열이 포함된 M13KO7 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 감자바이러스 Y(Potato virus Y, PVY) 검출용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 검출은 감자(Solanum sp.), 가지(Solanum sp.), 담배(Nicotiana sp.), 토마토(Lycopersicon sp.), 고추(Capsicum sp.), 다알리아(Dahlia sp.) 및 페튜니아(Petunia)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 시료에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1 항의 조성물을 포함하는 PVY 검출용 키트.
제 4 항에 있어서,
상기 키트는 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1 항의 조성물을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 PVY 검출 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 시료는 감자(Solanum sp.), 가지(Solanum sp.), 담배(Nicotiana sp.), 토마토(Lycopersicon sp.), 고추(Capsicum sp.), 다알리아(Dahlia sp.) 및 페튜니아(Petunia)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.