KR101806129B1 - 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 식물 바이러스 항체 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물 바이러스에 특이적인 인간 scFv 항체를 생산하는 방법, 또는 상기 scFv 항체 또는 항체의 면역학적 활성을 가진 단편에 관한 것이다. 본 발명은 인간 scFv 라이브러리를 이용하므로 6개월에서 1년이 걸리는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리의 제작 시간을 단축하여 항체 개발의 시간이 1년 이상 단축될 수 있으며, 또한 인간 scFv 항체를 이용하기 때문에 식물체 단백질과 차이가 큰 바, 더 효과적인 항체 개발이 가능하다.
Description
본 발명은 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 식물 바이러스 항체 생산방법 및 이를 이용한 감자 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.
식물 바이러스 병은 감염 작물의 수량 및 품질을 급격히 감소시키므로 생산량 감소 등 경제적으로 큰 손실을 가져온다. 최근에도 민간업체에서 보급한 종서에서 걀쭉바이러스의 감염 사실이 뒤늦게 발견되어 종서 수거 및 감염 우려 지역에 5년간의 재배를 제한하는 등 큰 문제를 야기한 바 있다. 그럼에도 우리나라의 한해 수출입 물품의 검역이 3,500 ~ 4,200천 건에 이르고 있고, 또한 바이러스 병은 기주범위가 매우 넓고 접촉, 매개 또는 감염된 종서의 사용 등의 다양한 경로를 통해서 2차 감염이 가능하며, 효과적인 방제법이나 약제가 거의 없기 때문에 진단이나 방제가 어려운 실정이다. 따라서 식물 바이러스 병에 대한 조기진단 및 오염원 제거 시스템을 갖추는 것이 가장 효율적인 방제법이며 그 중요성이 점점 높아지고 있다.
그러나 일부 식물 바이러스는 이를 방제하기 위한 혈청을 제조하기에는 면역원(immunogen)으로 용이하지 않다고 알려져 있는데(Palukaitis et al., Adv Virus Res 41:281-348, 1992), 이와 같이 실험동물의 면역반응을 충분히 일으킬 수 없는 항원에 대한 특이적인 항체절편을 생산하기 위하여 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library) 방법이 사용되고 있다. 이 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리(scFv phage display library)는 인간이나 마우스 유래의 H 체인과 L 체인의 변이영역 유전자를 유동성(flexible)있는 폴리펩타이드 즉 링커(linker)로 연결하여 사상형(filamentous) 파아지의 표면에서 발현시키는 것이다. 결론적으로 scFv는 단일체인의 항원 결합 단백질로 항체 VH 와 VL 이 펩타이드 링커에 의해서 연결되어 있어서 단일클론 항체와 동일한 결합특이성을 가지게 된다.
기존의 하이브리도마 융합기술에 있어서 항원-결합 재조합 항체의 분리가 어렵다는 것이 보고되어 있는데 반하여(Morrison, Annu Rev Immunol 10:239-265 1992), 파아지 디스플레이 기술은 하이브리도마 융합 기술에 비해 조작이 간단하고 식물 조즙액에서 바이러스 입자를 빠르게 검출할 수 있으며 바이러스 저항성 형질전환식물의 개발에 있어서도 적용될 수 있는 잇점을 가진다.
따라서 scFv 항체 라이브러리(Human synthethic scFv libraries)를 이용하여 제작한 scFv 항체들이 보고되고 있다(한국특허공개공보 KR(2002-0067073).
한편, 일반적으로 식물체를 이용하여 scFv 항체 라이브러리를 만들어 사용하고 있고 이는 많은 시간과 노력이 필요하고 또한 각각의 바이러스에 대한 라이브러리를 만들어야 하는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 이미 합성되어 있는 인간 scFv 항체 라이브러리와 시각화 단백질이 재조합된 파지미드 벡터를 제조하고 파지 표면제시 시스템를 이용하여 식물에 감염하는 바이러스에 대한 인간 scFv 항체를 신속하게 개발할 수 있는 방법에 대한 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 1) 인간 scFv 항체 유전자 및 시각화 단백질(visible protein) 유전자를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리 제작용 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 파지미드 벡터를 숙주 균주에 형질전환 후 배양하는 단계;
3) 상기 2)단계의 형질전환된 숙주 균주에 보조파지(helper phage)를 감염시켜 인간 scFv 항체 및 시각화 단백질이 융합된 형태로 표면에 발현된 박테리오파지가 용출되는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제조하는 단계;
4) 효모 표면 발현 시스템을 이용하여 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질을 효모 표면에 발현시키는 단계;
5) 상기 3)단계에서 제조된 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리와 상기 4)단계에서 제조된 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 이용하여 바이오 패닝(bio-panning)을 수행하는 단계;
6) 바이오 패닝을 통해 상기 바이러스에 결합하는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 선발하는 단계; 및
7) 상기 6)단계에서 선발된 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리로부터 인간 scFv 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 PVY 에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 PVY에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 식물 PVY 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물 및 감염 진단용 라이브러리 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 식물 PVY 바이러스에 특이적인 항체 또는 이의 단편을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 식물 PVY 바이러스의 존재 여부의 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
1) 인간 scFv 항체 유전자 및 시각화 단백질(visible protein) 유전자를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리 제작용 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 파지미드 벡터를 숙주 균주에 형질전환 후 배양하는 단계;
3) 상기 2)단계의 형질전환된 숙주 균주에 보조파지(helper phage)를 감염시켜 인간 scFv 항체 및 시각화 단백질이 융합된 형태로 표면에 발현된 박테리오파지가 용출되는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제조하는 단계;
4) 효모 표면 발현 시스템을 이용하여 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질을 효모 표면에 발현시키는 단계;
5) 상기 3)단계에서 제조된 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리와 상기 4)단계에서 제조된 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 이용하여 바이오 패닝(bio-panning)을 수행하는 단계;
6) 바이오 패닝을 통해 상기 바이러스에 결합하는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 선발하는 단계; 및
7) 상기 6)단계에서 선발된 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리로부터 인간 scFv 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법을 제공한다.
상기 1) 단계의 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계는,
(A) 시각화 단백질 유전자 말단에 각각 제한효소 Xma I과 Age I 인식서열을 추가하는 단계;
(B) 모벡터(pCANTAB-5E)에 MCS(multiple clonning site)를 삽입하는 단계;
(C) MCS가 삽입된 모벡터를 Xma I 및 Age I 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계;
(D) 상기 (A) 단계에서 제조한 시각화 단백질 유전자를 상기 (C) 단계에서 제조된 모벡터에 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;
(E) 상기 (D)단계의 벡터를 Sfi I 및 Not I 제한효소로 처리하여 절단하는 단계; 및
(F) 상기 절단된 벡터에 인간 scFv 항체 유전자를 도입하는 단계; 를 통해서 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리 제조용 재조합 파지미드 벡터가 제작될 수 있다.
본 발명에서 식물에 감염되는 바이러스는 인간이 식용할 수 있는 모든 작물에 감염하는 바이러스를 포함하며, 바람직하게는 감자에 감염하는 감자 바이러스 Y(PVY)일 수 있다.
본 발명에서 용어 "scFv(Single chain fragment variable) 항체"는 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변도메인을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 연결부위(linker)로 연결한 단백질이다. 경쇄가변도메인(VL) - 연결부위 - 중쇄가변도메인(VH), 또는 중쇄가변도메인 - 연결부위 - 경쇄가변도메인의 순서 모두 가능하며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다. 연결부위는 주로 글리신(glycine)과 세린(serine)으로 이루어진 친수성의 유연한 펩타이드 사슬로서 "(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3"의 15개의 아미노산 서열 혹은 유사한 서열이 주로 사용된다. 본 발명에서는 인간으로부터 유래한 scFv(Single chain fragment variable) 항체를 이용하였다.
본 발명에서 "시각화 단백질"은 단백질 또는 특정 물질이 발현되었음을 형광 또는 발색 등으로 시각적으로 확인이 가능하도록 하는 단백질을 의미한다. 시각화 단백질에는 HRP(horseradish peroxidase), ALP(alkaline phosphatase), GFP(Green fluorescent protein) 및 인베르타아제(invertase) 등이 있으며, 이 기술분야에 널리 알려진 것이라면 어느 것이나 사용 가능하다. 상기 “HRP(horseradish peroxidase)”는 서양고추냉이에서 발견되는 퍼옥시다아제의 일종이다. 효소-기질 결합물을 형성하여 흡수스펙트럼의 변화가 생기는 것을 특징하는 시각화 단백질이다. “GFP(green fluorescent protein)”는 생체 내에서 칼슘에 의해 활성된 발광단백질(Photoprotein)이나 루시페레이스-옥시루시페린 복합체의 에너지를 운반하는 에너지 전달 수용체로 작용하며, 에쿼린(Aequorin)으로부터 에너지를 받아 508nm의 녹색 형광을 방출하는 2차 형광 단백질로서 작용한다. 본 발명의 일 실시예에서는 시각화 단백질로 HRP를 이용하였다.
본 발명에서 용어 "파지표면제시 (phage display)"는 박테리오파지의 유전자를 조작하여 그 표면단백질 중 하나의 유전자에 외부단백질의 유전자를 융합하고, 생산된 파지의 표면단백질에 외부단백질이 융합되어 파지의 표면에 제시되는 기법이다. 단백질을 표면에 제시하기 위해서는 흔히 gIII 유전자의 5' 쪽에 외부유전자를 융합한다.
본 발명에서 용어 "항체"는 목표항원에 특이적으로 결합하는 당단백질이다. 경쇄(light chain)과 중쇄(heavy chain)이 각각 2개 씩 모여 이루어지는 헤테로테트라머이며 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변도메인(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 고정도메인(constant domain)으로 이루어져 있다. 가변도메인의 3차원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성결정부위(complementarity determining region)들이 모여서 형성된다. 상보성결정부위는 가변도메인 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다.
본 발명에서 용어 "항체 라이브러리"는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 일반적으로 109- 1011개의 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체 라이브러리를 이루는 항체 유전자는 파지미드(phagemid) 벡터에 클로닝 되어 대장균에 형질전환 된다.
본 발명에서 용어 "파지미드(phagemid)" 벡터는 파지복제시작점(phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이다. 통상적으로 항생제내성유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지표면제시에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 혹은 그 일부가 포함되어 있으며, 라이브러리 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 대장균에서 융합단백질로서 발현된다. 본 발명에서 사용된 pCANTAB-5E 벡터는 파지미드 벡터의 예이다.
본 발명에서 용어 "보조파지(helper phage)"는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 형질전환된 대장균을 보조파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 보조파지에 감염된 대장균을 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 보조파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.
본 발명에서 용어 “효모 표면 발현 시스템”은 목적하는 효소 및 단백질을 효모의 표면에 발현시키는 기술로, 효모인 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 단백질의 세포 표면 발현에 관한 연구가 지속적으로 진행되고 있고 효모는 고등 진핵세포와 세포내 분비시스템을 이용하여 외래 단백질을 활성이 있는 형태로 배지로 분비시킬 수 있어, 유전자 재조합 기술을 이용해 유용한 외래 단백질을 생산하기 위한 숙주로서의 이용성이 증대되고 있다.
본 발명에서 용어 "바이오 패닝(bio-panning)"은 파지의 외벽(coat)에 펩타이드(단백질)를 발현(display)하는 파지 라이브러리로부터, 표적 분자(항원(바이러스 외피 단백질), 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
또한 본 발명은 상기 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 PVY 에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공하는 것이다. 상기 인간 scFv 항체는 서열번호 15 및 서열번호 16의 염기서열로 표시될 수 있다.
상기 5) 단계의 바이오 패닝을 수행하기 전 단계로, 식물에 감염하는 바이러스에 특이적인 1차 항체를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 식물에 감염하는 바이러스에 특이적인 알려진 1차 항체를 바이오 패닝 전에 결합시킴으로써 비특이적 항원-항체 반응을 줄여 바이오 패닝 횟수를 줄일 수 있다.
또한, 시각화 단백질이 재조합된 인간 scFv 항체 라이브러리를 이용함으로써 항체가 발현된 파지 표면에 시각화 단백질이 결합되어 있어 바이오 패닝 후 바로 항원-항체 결합의 역가를 시각적으로 바이러스에 결합한 항체를 확인할 수 있어, 별도의 항원-항체 결합 확인을 위한 항체처리나 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 과정이 필요없고 패닝 횟수 조절이 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 감자 Y 바이러스를 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리에 반응시켜 감자 Y 바이러스에 특이적으로 결합한 scFv-파지들을 바이오 패닝 기법을 이용해 항원-항체 특이성 발현실험을 수행하였다. 본 발명의 구체예에서, 패닝을 3차까지 수행하였으며, 선발 효율을 높이기 위하여 Capture antibody를 이용 바이러스 단백질을 순수 결합시켜 패닝의 효율을 증진시켰다. 본 발명의 구체예에서, 상기 3차 패닝한 항체군에서 ELISA 분석을 수행하여 단일클론항체를 선별하였다. 이와 같이 선별한 항체의 서열분석을 수행하였으며, 이를 통해, 선별된 항체의 VH 및 VL의 CDR 영역의 패턴 및 폴리펩티드 및 염기 서열을 확인하였다.
본 발명은 또한 상기 식물 PVY 바이러스에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 식물 PVY 바이러스 감염 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 식물 PVY 바이러스에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 식물 PVY 바이러스 감염 진단용 라이브러리 키트를 제공한다.
상기 식물 PVY 바이러스에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편은 감자 바이러스를 진단하기 위한 키트에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 감자 바이러스를 진단하기 위한 바이오칩으로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 바이러스 진단용 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항-메트립타아제 항체에 대한 항원을 분석함으로써 암의 예후를 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA(Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법(Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯(Western Blot), 면역블롯 분석(Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법(Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
항원-항체 결합 반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오스 막, PVDF막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate) 및 유리로 된 슬라이드 글라스(Slide glass)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 사용될 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 2차 항체는 발색반응을 하는 통상의 발색제로 표지되는 것이 바람직하며, HRP(Horseradish peroxidase), 알칼리성 인산분해효소(Alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(Coloid gold), FITC(Poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(Rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(Fluorescein) 및 색소(Dye)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 표지체가 사용될 수 있다.
발색을 유도하는 기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(ophenylenediamine)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 발색제 기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 2차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 항-메트립타아제 항체의 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.
세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 단일클론 항체 또는 이의 단편을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 식물 PVY 바이러스의 존재 여부의 검출 방법을 제공한다. 상기 생물학적 시료는 이에 제한되는 것은 아니나 식물에서 분리한 조직, 세포일 수 있으며, 바람직하게는 감자에서 분리한 것일 수 있다.
본 발명은 시각화 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용하므로 항체선발 과정을 단축함으로써, 6개월에서 1년이 걸리는 항체 개발의 시간을 절반이상 단축될 수 있고, 많은 바이러스 항체를 동시에 개발할 수 있어 우수한 효과를 제공한다. 또한 인간 scFv 항체를 이용하기 때문에 식물체 단백질과 차이가 큰 바, 더 효과적인 항체 개발이 가능하다. 뿐만 아니라, 패닝 기술의 개선을 통해 3~4 라운드 패닝을 1라운드로 끝낼 수 있어 시간적으로 1개월 정도의 단축 효과와 10배 이상의 선발 효율을 가져온다.
도 1은 말단에 Xma I, Age I 제한효소를 추가한 HRP 유전자 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 pCANTAB 파지미드 벡터에 MCS를 추가하기 위해 합성한 올리고의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 pCANTAB 파지미드 벡터에 MCS를 삽입하기 위하여 Not I, Kpn2 I 제한효소를 이용하여 자른 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 4는 파지미드 벡터인 pPhD-MCS와 HRP 유전자를 제한효소 Xma I, Age I로 절단 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 5는 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP의 주요 유전자 및 제한효소 인식 부위를 표시한 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP와 인간 scFv 항체 라이브러리를 제한효소 Sfi I, Not I으로 절단 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 8은 재조합 파지미드로 생산한 박테리오파지에 기질인 TMB 용액을 넣어 발색을 확인한 것이다.
도 9는 PVY 껍질 단백질(Coat protein; CP)유전자를 증폭하는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 10은 도 9에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 PVY 껍질 단백질이 증폭되었는지 확인하기 위하여 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동한 결과이다.
도 11은 PVY CP 유전자가 TA plasmid vector내에 삽입되었는지 여부를 확인한 것이다.
도 12는 PVY CP 유전자를 de-glycosylation를 시키기 위해 염기 서열을 치환하기 위한 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 13은 PVY CP유전자 염기 서열중 N-glycan 부분이 치환된 것을 확인한 것이다.
도 14는 PVY CP 유전자가 삽입된 TA 플라스미드 벡터 ‘pCTCON-PVYCP'의 모식도이다.
도 15는 pCTCON-PVYCP를 효모 균주(EBY100)에 형질전환 후, 유세포분석기를 이용하여 PVY CP의 효모 표면 발현의 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 분광광도계를 통해 60개의 무작위로 선발한 인간 scFv 항체의 패닝 역가가 증가하는 것을 정량적으로 측정한 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 도 16에서의 반응결과가 좋은 인간 scFv 파지 항체를 선발하여 건전주, PLRV이병주, PVY이병주에 대한 항원-항체 반응결과를 정량적으로 비교하고, 항체 농도에 따른 PVY 검출능력을 정량적으로 비교하여 나타낸 것이다.
도 18은 선발된 인간 scFv 항체 유전자를 공통적으로 증폭시키는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 19는 도 18에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 인간 scFv 항체 유전자의 complementarity determining region(CDR)위치를 추정하여 나타낸 것이다.
도 20은 2개의 선발된 각각의 인간 scFv 항체 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 21은 도 20에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 인간 scFv 항체 유전자가 증폭되었는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 pIg20-scFv의 모식도를 나타낸 것이다.
도 23은 pIg20-scFv를 대장균(BL21(DE3)pLysE)에 형질전환 시켜 인간 scFv 항체의 발현을 확인한 것이다.
도 24는 정제한 인간 scFv 항체를 이용하여 PVY 이병주를 검정한 결과를 정성적으로 나타낸 것이다.
도 25는 정제한 인간 scFv 항체를 이용하여 PVY 이병주를 검정한 결과를 정량적으로 나타낸 것이다.
도 26은 C3F 인간 scFv 항체의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 pCANTAB 파지미드 벡터에 MCS를 추가하기 위해 합성한 올리고의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 pCANTAB 파지미드 벡터에 MCS를 삽입하기 위하여 Not I, Kpn2 I 제한효소를 이용하여 자른 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 4는 파지미드 벡터인 pPhD-MCS와 HRP 유전자를 제한효소 Xma I, Age I로 절단 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 5는 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 6은 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP의 주요 유전자 및 제한효소 인식 부위를 표시한 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP와 인간 scFv 항체 라이브러리를 제한효소 Sfi I, Not I으로 절단 후 1% 전기영동으로 확인한 것이다.
도 8은 재조합 파지미드로 생산한 박테리오파지에 기질인 TMB 용액을 넣어 발색을 확인한 것이다.
도 9는 PVY 껍질 단백질(Coat protein; CP)유전자를 증폭하는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 10은 도 9에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 PVY 껍질 단백질이 증폭되었는지 확인하기 위하여 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동한 결과이다.
도 11은 PVY CP 유전자가 TA plasmid vector내에 삽입되었는지 여부를 확인한 것이다.
도 12는 PVY CP 유전자를 de-glycosylation를 시키기 위해 염기 서열을 치환하기 위한 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 13은 PVY CP유전자 염기 서열중 N-glycan 부분이 치환된 것을 확인한 것이다.
도 14는 PVY CP 유전자가 삽입된 TA 플라스미드 벡터 ‘pCTCON-PVYCP'의 모식도이다.
도 15는 pCTCON-PVYCP를 효모 균주(EBY100)에 형질전환 후, 유세포분석기를 이용하여 PVY CP의 효모 표면 발현의 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 분광광도계를 통해 60개의 무작위로 선발한 인간 scFv 항체의 패닝 역가가 증가하는 것을 정량적으로 측정한 그 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 도 16에서의 반응결과가 좋은 인간 scFv 파지 항체를 선발하여 건전주, PLRV이병주, PVY이병주에 대한 항원-항체 반응결과를 정량적으로 비교하고, 항체 농도에 따른 PVY 검출능력을 정량적으로 비교하여 나타낸 것이다.
도 18은 선발된 인간 scFv 항체 유전자를 공통적으로 증폭시키는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 19는 도 18에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 인간 scFv 항체 유전자의 complementarity determining region(CDR)위치를 추정하여 나타낸 것이다.
도 20은 2개의 선발된 각각의 인간 scFv 항체 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 21은 도 20에 개시된 프라이머 세트를 이용하여 인간 scFv 항체 유전자가 증폭되었는지 여부를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 pIg20-scFv의 모식도를 나타낸 것이다.
도 23은 pIg20-scFv를 대장균(BL21(DE3)pLysE)에 형질전환 시켜 인간 scFv 항체의 발현을 확인한 것이다.
도 24는 정제한 인간 scFv 항체를 이용하여 PVY 이병주를 검정한 결과를 정성적으로 나타낸 것이다.
도 25는 정제한 인간 scFv 항체를 이용하여 PVY 이병주를 검정한 결과를 정량적으로 나타낸 것이다.
도 26은 C3F 인간 scFv 항체의 염기서열을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리 제작
1-1. 서양고추냉이 과산화효소 (HRP) 유전자의 합성
본 발명에서 이용된 HRP유전자는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크 (Genbank)로부터 기존에 보고된 박테리아서 발현하여 활성을 갖는 HRP 유전자(서열번호 1)의 염기서열 정보 (진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): J05552.1)를 이용하여 추가로 클로닝을 위해 유전자 말단에 각각 제한효소 Xma I과 Age I 인식서열을 추가한 올리고머를 메신저바이오텍(주)를 통해 합성하였고 그 모식도는 도 1에 나타내었다. 합성된 올리고머는 “pIDT-SMART-HRP”라 명명된 플라스미드에 삽입된 형태로 받았다.
1-2. 멀티플 클로닝 사이트 (MCS)의 삽입
확보한 HRP 유전자를 박테리오파지 표면에 발현시키기 위해서는 파지미드 벡터인 pCANTAB-5E 벡터에 MCS를 삽입하는 과정을 수행하였다. MCS는 Not I, Xma I, Avr II, Age I, Sac II, Afl II, Kpn2 I 제한효소 사이트를 포함하여 작성하였으며, 합성한 올리고머의 서열은 도 2에 나타내었다. 합성한 MCS 절편 2 ug을 annealing buffer(10 mM Tris (pH 7.5), 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) 50 ul에 혼합한 후, 조성물을 95℃에서 2분 동안 반응시킨 후 25℃까지 45분 동안 서서히 냉각시켰다. pCANTAB-5E 벡터는 Not I과 Kpn2 I 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. 절단한 pCANTAB-5E 벡터의 10 ul의 반응물을 브로민화 에티듐 (Ethidium bromide; EtBr)이 포함된 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하여 유전자가 절단되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 절단된 벡터를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 DNA 절편을 분리하였다.
Annealing한 올리고머를 핵산분해효소가 없는 증류수에 1/10배로 희석한 후 올리고와 절단된 벡터를 6:1의 질량 비율로 섞었다. DNA 결찰(ligation) 조성물의 제조를 위하여 10 ul의 2X rapid ligation buffer (Tris-HCl (pH 7.8) 60 mM, MgCl2 20 mM, Dithiothreitol (DTT) 20 mM, ATP 2 mM, polyethylene glycol 10% (MW 8,000)), 0.5 ul의 T4 DNA ligase, 9.5 ul의 핵산 혼합물을 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 ligation 반응시켜 주었다. 상기 반응물을 대장균 균주중 하나인 DH5α에 형질전환시켜 주었다. -85℃에 보관된 DH5α 컴피턴트 세포(competent cell)를 상기 반응물과 4℃에 10분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1분 15초 동안 열 충격(heat shock)시켜 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1분 동안 둔 후, 200 ul의 Luria-Bertani (LB) broth 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30분 동안 회복시켜 주었다. 그 후 암피실린(Amp; 50ul/ml)이 포함된 LB 고형 배지 (LB agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16시간동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 3 ml의 Amp LB broth를 넣고 37℃ 교반배양기에서 9시간동안 배양시켜준 후, Bioneer사의 AccuPrep®Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 HRP 유전자가 삽입된 플라스미드 벡터를 분리하였다.
1-3. 재조합 파지미드의 클로닝
확보한 HRP 유전자를 박테리오파지 표면에 발현시키기 위해 합성한 유전자를 파지미드 벡터인 pPhD-MCS 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 실시예 1-1에서 합성한 pIDT-SMART-HRP 플라스미드 벡터와 pPhD-MCS 파지미드 벡터를 Xma I와 Age I 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. 절단한 HRP유전자와 pPhD-MCS 벡터의 각각 10 ul의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하여 유전자가 절단되었는지 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. HRP 유전자의 크기인 927 bp 크기의 DNA절편이 확인되었다.
도 4에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 DNA 절편을 분리하였다. 그 후, HRP유전자를 pPhD-MCS로 서브클로닝을 하였다. DNA 접합 조성물의 제조를 위하여 5 ul의 2X rapid ligation buffer, 0.5 ul의 T4 DNA ligase, 0.5 ul의 절단된 pPhD-MCS, 4 ul 절단된 HRP 절편을 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 접합 반응시켜 주었다. 상기 반응물을 대장균 균주 중 하나인 DH5α에 형질전환시켜 주었다. -85℃에 보관된 DH5α 컴피턴트 세포를 상기 반응물과 4℃에 10분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1분 15초 동안 열 충격(heat shock)시켜 주었다. 그 후 cell을 4℃에 1분 동안 둔 후, 200 ul의 LB broth 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30분 동안 회복시켜 주었다. 그 후 LB Amp(50 ul/ml)agar plate 에 도말하여 37℃ 박테리아 배양기에서 16시간동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 3 ml의 Amp LB broth를 넣고 37℃ 교반배양기에서 9시간동안 배양시켜준 후, Bioneer사의 AccuPrep®Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 HRP 유전자가 삽입된 파지미드 벡터를 분리하였다. 분리한 파지미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 HRP유전자가 pPhD-MCS 파지미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였고 이를 “pPhD-HRP”이라고 명명했다. pPhD-HRP 파지미드의 모식도는 도 5에 나타내었다(서열번호 2). 또한, 재조합 파지미드 벡터 pPhD-HRP에 포함된 인간 scFv 삽입부위, HRP 유전자 및 제한효소 인식자리를 도 6에 나타내었다.
1-4. 시각화 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리 제조용 파지미드 벡터의 제작
시각화 인간 scFv 항체 파지 라이브러리를 제작하기 위해 상기 실시예 1-1 내지 1-3을 통해 제작한 재조합 파지미드 벡터에 인간 scFv 항체 유전자를 삽입하는 실험을 진행했다. 본 발명에 사용된 인간 scFv 항체 유전자는 아주대학교 의과대학 미생물학교실의 권명희 교수 연구실로부터 제공받은 인간 scFv 항체 유전자가 포함된 pRGA-scFv(A)를 이용하였다(Kwon, Myung-Hee, et al. "A visible phagemid system for the estimation of Cre-mediated recombination efficiency." Journal of immunological methods 280.1 (2003): 165-173.). 재조합 파지미드 벡터인 pPhD-HRP와 인간 scFv 항체 유전자가 포함된 pRGA-scFv(A) 플라스미드 벡터를 Sfi I과 Not I 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. 인간 scFv 라이브러리 유전자와 재조합 파지미드 벡터의 각각 10 ul의 반응물을 브로민화 에티듐(Ethidium bromide; EtBr)이 포함된 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하여 유전자가 절단되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 8에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 그 후, 인간 scFv 라이브러리 유전자를 pCANTAB-5E로 서브클로닝을 하였다. DNA 접합 조성물의 제조를 위하여 5 ul의 2X rapid ligation buffer(Tris-HCl(pH 7.8) 60 mM, MgCl2 20 mM, Dithiothreitol(DTT) 20 mM, ATP 2 mM, polyethylene glycol 10% (MW 8,000)), 0.5 ul의 T4 DNA ligase, 0.5 ul의 절단된 각각의 pPhD-HRP, 4 ul 절단된 인간 scFv 항체 유전자 절편을 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 접합 반응시켜 주었다. 상기 반응물을 대장균 균주중 하나인 DH5α에 형질전환시켜 주었다. -85℃에 보관된 DH5α 컴피턴트 세포를 상기 반응물과 4℃에 10분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1분 15초 동안 열 충격(heat shock)시켜 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1분 동안 둔 후, 200 ul의 Luria-Bertani(LB) broth 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30분 동안 회복시켜 주었다. 그 후 암피실린(Amp; 50ul/ml)이 포함된 LB 고형 배지(LB agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16시간동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 3 ml의 Amp LB broth를 넣고 37℃ 교반배양기에서 9시간동안 배양시켜준 후, Bioneer사의 AccuPrep®Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 인간 scFv 항체 유전자가 삽입된 재조합 파지미드 벡터를 분리하였다. 분리한 시각화 인간 scFv 항체 재조합 파지미드 벡터를 “pPhD-scFv(HRP)”라고 명명했다.
1-5. 시각화 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리의 발현 및 확인
형질전환을 완료한 세포 주(DH5α pPhD-scFv(HRP))는 단일 콜로니를 분리한 후 5 ml의 2TY Amp(100 ug/ml)배지에 37℃에서 OD600 nm값이 0.6이 될 때까지 배양시켰다. 그 후 배양된 cell 500 ul를 50 ml의 1% 글루코오스가 포함된 2TY Amp 배지에 넣고 37℃에서 OD600 nm값이 0.4가 될 때까지 배양시켰다. 그 후 2x1011cfu/ml의 VSCM13 보조파지를 넣고 교반하지 않고 37℃에서 30분 동안 감염시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 100ml의 0.1%의 글루코오TM가 포함된 2TY Amp(100 ug/ml), kanamycin(50 ug/ml) 배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 24시간동안 배양시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉힌 후 80 ml의 상층액을 새 반응튜브에 넣고 20 ml의 PEG/NaCl(20% polyethylene glycol 6000, 2.5M NaCl)을 첨가하여 혼합한 후 얼음위에 1시간동안 방치했다. 그 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 가라앉힌 후 PEG/NaCl을 깔끔히 제거했다. 침전물을 4 ml의 PBS 용액으로 섞어준 후 원심분리기를 이용하여 남은 박테리아 찌꺼기를 가라앉혔다. 파지용액을 새 튜브에 넣고 15%의 글리세롤을 첨가하여 85℃에 보관했다. 재조합 박테리오파지의 인간 scfv 항체의 발현을 확인하기 위해 준비한 파지 100 ul를 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) 100 ul와 혼합하여 반응시킨 후 HRP의 활성을 확인하였다(도 8).
실시예 2. 효모 표면 발현 시스템을 이용한 감자 바이러스 Y의 외피 단백질 항원 제시
2-1. 감자 바이러스 Y(PVY) 유전자 수집
감자바이러스Y(Potato virus Y; PVY)를 감염시킨 감자(Solanum tuberosum)를 시료로 하여서 실험을 진행하였으며, 이는 현장에서 얻을 수 있는 감염 식물의 상태와 동일하다. 본 발명에서 이용된 효모표면발현용 프라이머는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information: NCBI)에서 제공하는 생물체 핵산 정보 데이터베이스인 진뱅크(Genbank)로부터 기존에 보고된 PVY의 5가지 주(strain)와 각각의 염기서열 정보(진뱅크 접근번호 (GenBank accession number): AB295477.1, JN795003.1, HQ603083.1, U25672.1, AY840082.1)의 분석을 통해 유사염기서열을 포함하는 부분을 중심으로 작성하였다. PVY 껍질 단백질 (Coat protein; CP)유전자를 증폭하는 프라이머 세트는 도 9에 나타내었다. 정방향 프라이머(pCTCON_PVY_F GCT AGC GGA GAC ACA ATC GAT ; 서열번호 3)와 역방향 프라이머(pCTCON_PVY_R GGA TCC CAT GTT CTT GAC TCC AAG TA ; 서열번호 4)엔 각각 클로닝을 위해 각각 NheI과 BamHI 제한효소 사이트를 추가하였다.
2-2. PVY CP 유전자의 cDNA 합성
PVY CP유전자를 확보하기 위해 PVY 이병주를 채집하였다. 본 발명에서는 바이러스에 감염된 식물시료로부터 전체 RNA를 분리한 후 역전사 중합효소 연쇄반응(RT (Reverse transcriptase)-PCR (Polymerase chain reaction))을 통해 전체 cDNA를 합성하였다. 전체 RNA 분리에 사용할 추출 버퍼(extraction buffer)는 MRC사의 'TRI REAGENT'(카탈로그 번호 : TR 118)을 이용하였다. 식물조직을 막자사발에 담고 액체질소를 넣은 후, 질소가 증발하면 즉시 조직을 고운 가루가 될 정도로 갈고 미리 액체질소에서 냉각시킨 약수저(spatula)를 사용하여 상기 조직을 추출 버퍼가 1ml 들어있는 튜브에 옮겨 담았다. 가루로 된 조직을 넣은 후 튜브 뚜껑을 닫고 4 ℃에 5분간 반응시킨 후 200ul의 클로로포름(chloroform)을 넣고 15초동안 심하게 흔들어 준 다음 실온에서 적어도 10분간 반응시켰다. 반응시킨후 4 ℃, 8,000 ×g의 조건에서 10분간 원심분리 한 후에 pipette을 사용하여 상층액 500ul만 수거하여 조심스럽게 새 튜브에 옮긴 다음 상층액과 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣어 실온에서 10분동안 반응시켰다. 반응시킨 튜브를 4 ℃, 8,000 ×g의 조건에서 10분간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. 침전물(pellet)을 에탄올(ethanol)과 DEPC treated water(0.1% diethyl pyrocarbonate 수용액)이 7.5:2.5 비율로 혼합된 용액으로 세척하고 다시 4 ℃, 8,000 ×g의 조건에서 10분간 원심분리 한 후에 상층액을 제거하여 튜브를 시험관 거치대에 거꾸로 방치하여 건조시킨 후 RNA pellet을 DEPC treated water 30ul에 녹였다. 분광 광도계(spectrophotometer)를 통해 추출한 RNA의 농도를 측정하였다. 위 실험을 통해 얻은 전체 RNA를 토대로 cDNA를 합성하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 M-MLV Reverse Transcriptase (Bioneer)와 랜덤 프라이머로 제조사의 지시사항에 따라 증폭하였다. RT-PCR은 3 단계 방법(3-step method)로 수행하였으며, 전체 RNA와 랜던 프라이머를 넣은 튜브를 70 ℃에서 10분 반응시킨 후, 온도를 4 ℃로 낮춰 dNTP와 버퍼를 넣은 후 37 ℃에서 10분간 반응시킨후, 온도를 4 ℃로 낮춰 M-MLV Reverse Transcriptase를 넣어준 후, 37 ℃에서 1시간동안 반응시킨 후, 마지막으로 70 ℃에서 10분간 효소 억제 과정을 시켜 주었다.
2-3. PVY CP의 유전자 증폭
PVY CP유전자를 증폭하기 위해 실시예 2-1에서 합성한 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호 4)와 실시예 2-2에서 합성한 cDNA를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행했다. 상기 증폭 반응 조성물의 제조를 위하여 10 uL의 2배(2X) PCR premix (Top DNA polymerase 1U, dNTPs(dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 250 uM, Tris-HCl(pH 9.0) 10mM, KCl 30mM, MgCl2 1.5mM), 1ul의 10pM 정방향 프라이머(서열번호 3), 2ul의 10pM역방향 프라이머(서열번호 4), 1ul의 실시예 2-2에서 합성한 cDNA, 및 증류수 7ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30초 (DNA 변성), 55℃에서 30초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35번 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ul의 반응물을 브로민화 에티듐(Ethidium bromide; EtBr)이 포함된 1% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다. PVY CP 유전자의 크기인 801bp size의 DNA절편이 확인되었다.
도 10에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 그 후, 증폭한 PVY CP 유전자를 클로닝하기 위해서 TA cloning을 수행하였다. DNA 접합(ligation) 조성물의 제조를 위하여 5ul의 2X rapid ligation buffer(Tris-HCl(pH 7.8) 60mM, MgCl2 20mM, Dithiothreitol(DTT) 20mM, ATP 2mM, polyethylene glycol 10% (MW 8,000)), 0.5ul의 T4 DNA ligase, 0.5ul의 pGEM T-easy 플라스미드 벡터(Promega), 4ul의 DNA 증폭산물을 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 접합 반응시켜 주었다. 상기 반응물을 대장균 균주중 하나인 DH5α에 형질전환시켜 주었다. -85℃에 보관된 DH5α 컴피턴트 세포를 상기 반응물과 4℃에 10분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1분 15초 동안 heat shock시켜 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1분동안 둔 후, 200ul의 Luria-Bertani(LB) broth 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30분동안 회복시켜 주었다. 그 후 암피실린(Amp; 50ul/ml)이 포함된 LB 고형 배지(LB agar plate)에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16시간동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 3ml의 Amp LB broth를 넣고 37℃ 교반배양기에서 9시간동안 배양시켜준 후, Bioneer사의 AccuPrep®Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 PVY CP 유전자가 삽입된 TA plasmid vector를 분리하였다. 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 PVY CP유전자 염기 서열(서열번호 5)이 증폭된 것을 확인하였고 그 결과는 도 11에 나타내었다. PVY CP 유전자가 삽입된 TA 플라스미드 벡터는 ‘pTA-PVYCP'라고 명명했다.
2-4. PVY CP의 de-glycosylation
효모표면에 발현되는 단백질의 당단백질은 항원의 발현의 효율을 떨어트릴 뿐만 아니라 바이오 패닝을 통해 바이러스 특이 반응 인간 scFv 항체를 선발할 때 항원결정부위가 될 수 있으므로 당단백질 (주로 N-glycan)을 제거하는 과정을 수행해야 하며 이를 de-glycosylation이라 한다. N-glycosylation은 아미노산 서열이 (아스파라긴)-(X: 무작위 아미노산)-(세린 또는 트레오닌) 배열이 될 때 발생하므로 PVY CP를 de-glycosylation시키기 위해서는 아스파라긴을 코딩하는 염기서열을 다른 아미노산으로 치환해 주어야 한다. 본 발명에서는 PVY CP 유전자 염기서열에는 두 군데에 N-glycan 이 존재하며 이 곳에 위치한 아스파라긴을 글라이신을 코딩하는 염기로 치환하였다.
유전자 염기서열을 치환하기 위해서 site-directed mutagenesis PCR을 수행하였다. Site-directed mutagenesis PCR 프라이머 세트는 Stratagene의 QuikChage®프라이머 디자인 프로그램을 이용하여 작성하여 서열번호 6 내지 서열번호 9에 나타내었다(도 12). 상기 증폭 반응 조성물의 제조를 위하여 2ul의 10X Pfu reaction buffer (25mM MgCl2), 1ul의 10pM 정방향 프라이머서(PVY_N2Q_F GAT TCG TAG GCT AGC GGA CAG GAC ACA ATC GAT GCA GGA G ; 서열번호 6 및 PVY_N122Q_F CTT ATG GTT TGG TGC ATT GAA CAG GGA ACC TCG CCA AAC ATC AAC ; 서열번호 8), 1ul의 10pM 역방향 프라이머(PVY_N2Q_R CTC CTG CAT CGA TTG TGT CCT GTC CGC TAG CCT ACG AAT C ; 서열번호 7 및 PVY_N122Q_R GTT GAT GTT TGG CGA GGT TCC CTG TTC AAT GCA CCA AAC CAT AAG ; 서열번호 9), 0.5ul의 2.5U Pfu polymerase(Solgent), 1ul의 pTA-PVYCP 플라스미드, 및 증류수 14.5ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 95℃에서 30초동안 반응시킨 후 95℃에서 30초 (DNA 변성), 55℃에서 1분 (프라이머의 결합), 68℃에서 4분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 16번 반복하여 DNA를 증폭하였다. DNA염기서열을 치환하는 증폭 반응 후에 1ul의 Dpn I 제한효소를 처리하여 DNA주형을 제하는 과정을 수행한 후, 반응물을 DH5α에 형질전환시켜 주었다. 대장균 형질전환 과정은 실시예 2-3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시했다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 PVY CP유전자 염기 서열중 N-glycan 부분이 치환된 것을 확인하였고 그 결과는 도 13에 나타내었다. PVY CP 유전자가 삽입된 TA 플라스미드 벡터는 ‘pTA-PVYCPM'이라고 명명했다.
2-5. PVY CP 효모표면발현벡터의 클로닝
확보한 PVY CP 항원의 유전자들을 효모 표면에 발현시키기 위해 PVY CP 유전자를 효모표면발현 플라스미드 벡터인 pCTCON 벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 실시예 2-4에서 제작한 pTA-PVYCPM 플라스미드 벡터와 pCTCON-EGFR 플라스미드 벡터를 각각 NheI과 BamHI 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. 절단한 PVY CP유전자와 pCTCON 벡터를 4:1로 혼합한 후 실시예 2-3에 명기된 T4 DNA ligase와 ligation buffer를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 접합 반응시켜 주었다. 반응물을 DH5α에 형질전환 시켜 주었으며 대장균 형질전환 과정은 실시예 2-3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시했다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 PVY CP유전자가 pCTCON 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. 재조합한 플라스미드 벡터는 도 14에 나타내었다. PVY CP 유전자가 삽입된 TA 플라스미드 벡터는 ‘pCTCON-PVYCP'이라고 명명했다.
2-6. 효모 형질전환과 효모의 배양
효모표면발현 시스템에 사용한 효모는 EBY100 균주이다. 효모를 형질전환하기 위해서 먼저 EBY100 컴피턴트 세포를 제작하였다. -85℃에 보관된 EBY100 glycerol cell stock을 YPDA plate에 스트리킹하여 30℃ 미생물배양기에서 3일 동안 배양시켰다. 단일콜로니를 5ml YPD 배지에 넣고 30℃의 교반배양기에서 24시간동안 배양했다. 배양 후 cell 500ul를 50ml의 YPD 배지에 넣고 30℃ 교반배양기에서 흡광도(Optical density; OD) 파장 600nm값이 0.8까지 배양한 후 원심분리기를 이용하여 세포를 수확하였다. 수확한 세포는 50ml의 증류수를 이용하여 수세 한 후, 다시 원심분리기를 이용해 세포를 가라앉혔다. 그 후 5ml의 LiAc buffer (0.1M Litium acetate(LiAc), 10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)와 50ul의 10mM DTT를 반응튜브에 첨가한 후 세포와 혼합하여 25℃에서 30분동안 반응시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포를 분리한 후 10ml의 1M sorbitol과 혼합하여 다시 원심분리기를 이용해 세포를 분리했다. 그후 1.5ml의 1M sorbitol로 3번 수세해 주어 EBY100 컴피턴트 세포을 제작했다. 80ul의 컴피턴트 세포와 5ul의 pCTCON-PVYCP를 반응튜브에 넣어 혼합한 후 얼음에 10분간 두었다. 미리 차게 해 둔 큐벳에 혼합물을 옮긴 후 전기천공법(electroporation: 1.5KV, 25Ω, 200mF)을 통해 효모를 형질전환 시켰다. 형질전환체는 YPDS 배지로 옮긴 후 30℃ 교반배양기에서 30분동안 회복시켜 주었다. 그 후 트립토판 dropout supplement minimal SD plate(-Trp SD plate)에 도말하여 30℃ 박테리아배양기에서 3일동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. 단일콜로니는 5ml의 SD-CAA배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 24시간동안 배양시켜준 후 원심분리기를 이용하여 세포를 가라앉혔다. 그 후 10ml의 SG-CAA(2% galactose)배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 3일동안 배양시켜 PVY CP의 효모표면발현을 진행했다. 효모표면에 발현한 세포는 OD600nm값이 0.4가 되도록 세포 양을 맞추어 항원의 발현을 확인했다. 1차 항체 처리 단계로 항 c-Myc 항체(anti-c-Myc antibody)를 PBS(0.1%BSA) 로 1:200 희석 후 25℃에서 1시간동안 반응을 시켰으며, TBST를 이용하여 수세한 뒤 2차 항체(anti-mouse IgG TRITC conjugated)를 1:200 으로 희석 후 4℃에서 30분동안 반응 시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 유세포분석기를 이용하여 효모 표면 발현의 정도를 측정했으며 그 결과를 도 15에 나타내었다.
실시예
3. 인간
scFv
항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 감자 바이러스 Y에 특이적인 인간 scFv 항체 선발
3-1 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 바이오 패닝 실시
재조합 휴먼 scFv 라이브러리로부터 PVY에 결합하는 phage scFv를 분리하기 위해 새로운 bio-panning 실험을 실시했다. pRGA-scFv(HRP) stock으로부터 phage 라이브러리를 준비하는 과정은 ‘Tomlinson I+J 라이브러리’ 프로토콜을 참고하여 준비하였으며 그 역가는 3.27x1013cfu/ml이었다. PVY capture antibody (Agdia)를 carbonate coating buffer (10 mM NaCO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6)에 1:200으로 희석한 후 96 well plate에 각 well당 100 ul씩 코팅시켰다. Antibody 코팅 과정은 25℃에서 4시간동안 진행했다. TBS-T (0.5% tween-20이 포함된 TBS)를 이용하여 수세한 후 PVY CP를 발현한 효모를 PBS 1ml에 OD600nm값이 2가 되도록 희석을 한 후 96well immunoplate의 60개 well에 세포의 well당 100ul씩 넣어 4℃에서 16시간동안 항원을 반응시켰다 (PVY well). 이와 동시에 PVY CP를 발현하지 않은 효모를 같은 과정을 통해 코팅시켰고 (Negative well), PBS만 넣은 well도 준비하였다(Blank well). 상층액을 제거한 후 각 well에 200ul의 3% BSA가 포함된 PBS(PBSB)를 넣어주어 37℃에서 2시간동안 blocking 시켜주었다. 1010cfu/ml의 라이브러리를 PBSM에 희석시킨 후 Blank well에 있던 blocking 용액을 버리고 well당 100ul씩 첨가시킨 후 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, Negative well에 있던 blocking 용액을 버리고 Blank well에 있던 용액을 100ul씩 Negative well에 옮겨 준 후 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 다음, PVY well에 있던 blocking 용액을 버리고 Negative well에 있던 용액을 100ul씩 PVY well에 옮겨 준 후 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. PVY well 상층액을 버린 후 TBS-T(0.5% tween-20이 포함된 TBS) buffer로 각 plate를 3회 수세한 후, well당 100ul의 100mM triethylamine을 넣어 25℃에서 10분 동안 elution시켜 주었다. 그 후 각 well당 50ul의 1M tris(pH 7.5)를 넣어준 후 새로운 튜브에 상층액을 모두 모았다. 여기까지의 과정을 바이오 패닝(bio-panning)이라고 한다.
바이오 패닝 이후 수확한 파지를 증폭하는 실험을 수행했다. 용출을 통해 얻은 파지를 대장균 균주중 하나인 5ml 부피의 XL1-Blue에 감염시켜 37℃에서 교반시키지 않고 1시간동안 배양했다. 배양 후 원심분리기를 이용해서 세포을 침전시킨 후 상층액을 버리고 세포만 모아서 tetracycline(Tet: 10ug/ml)과 Amp가 포함된 2TY plate에 도말하여 박테리아배양기에서 37℃에서 16시간동안 배양했다. Plate에 생성된 콜로니 군집을 모두 긁어모아서 50ml의 1% glucose가 포함된 2TY Amp(100ug/ml) 배지에 넣고 37℃에서 OD600nm값이 0.4가 될 때까지 배양시켰다. 그 후 2x1011cfu/ml의 VSCM13 보조 파지를 넣고 교반하지 않고 37℃에서 30분 동안 감염시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포을 가라앉힌 후 100ml의 0.1%의 glucose가 포함된 Amp(100ug/ml), kanamycin(50ug/ml)이 포함된 2TY배지를 넣고 30℃ 교반배양기에서 24시간동안 배양시켰다. 원심분리기를 이용하여 세포을 가라앉힌 후 80ml의 상층액을 새 반응튜브에 넣고 20ml의 PEG/NaCl(20% polyethylene glycol 6000, 2.5M NaCl)을 첨가하여 혼합한 후 얼음위에 1시간동안 방치했다. 그 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 가라앉힌 후 PEG/NaCl을 깔끔히 제거했다. 침전물을 4ml의 PBS 용액으로 섞어준 후 원심분리기를 이용하여 남은 박테리아 찌꺼기를 가라앉혔다. Phage용액을 새 튜브에 넣고 15%의 glycerol을 첨가하여 -85℃에 보관했다. 바이오 패닝 두 번째 라운드에서는 인간 scFv 항체 파지 라이브러리 대신 첫 번째 라운드에서 수확하여 증폭한 파지를 넣어주어 PVY CP에 대해 결합능력이 높은 파지의 농도를 증가시켜 주었다. 바이오 패닝은 3라운드까지 진행하였으며 각 라운드가 끝나고 하기에 기술한 실시예 3-2 방법으로 ELISA를 통해 60개의 무작위로 선발한 인간 scFv 항체 파지 라이브러리의 건전주(negative), PVY 이병주(positive) 대한 반응결과를 정량적으로 측정하였으며 그 결과를 도 16에 나타내었다. 패닝이 진행 될수록 항원에 대한 역가가 증가하였다. 바이오 패닝 3라운드를 거쳐 2.4x1013cfu/ml의 역가를 갖는 파지를 분리하였다.
3-2. Phage ELISA를 통한 PVY 감염주 판별 및 인간 scFv 항체 라이브러리 선발
실시예 3-1에서 확인한 scFv 파지 항체 중 역가가 높은 항체 파지를 선발하여 PVY의 감염주와 건전주를 판별하는 파지 ELISA분석을 진행했다. PVY capture antibody(Agdia)를 carbonate coating buffer(10mM NaCO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)에 1:200으로 희석한 후 96well plate에 각 well당 100ul씩 코팅시켰다. 대조군 바이러스인 Potato Leafroll Virus(PLRV)에도 파지가 반응하는지 확인하기 위해 PLRV caputre antibody(Agida)를 carbonate coating buffer에 1:200으로 희석한 후 96well plate에 각 well당 100ul씩 코팅시켰다. Antibody 코팅 과정은 25℃에서 4시간동안 진행했다. TBS-T를 이용하여 수세한 후 건전주, PLRV이병주, PVY이병주의 잎을 각각 착즙한 후 general extration buffer(11mM Na2SO4, 2% polyvinylpyrrolidone MW 24-40,000, 3mM NaN3, 0.2% powdered egg albumin(Grade II), 2% Tween-20을 TBS buffer에 녹인 용액)와 혼합하여 well당 100ul씩 넣고 4℃에서 16시간동안 바이러스를 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 수세한 후 모든 well에 100ul씩 3가지의 HRP가 융합된 인간 scFv 항체 파지를 25℃에서 1시간동안 바이러스와 반응시켰다. 기존에 PVY ELISA 검정에 이용한 ELISA detection antibody와 HRP conjugated antibody는 20ug/ml로 PBSB에 희석하여 반응시켜 선발한 scFv 항체 파지와 비교 분석하였다. TBS-T를 이용하여 수세한 뒤 각 well에 100ul의 3,5',5,5'-tetramethylbenzidine(TMB)용액을 넣어 발색반응을 진행했으며 15분 뒤 100ul의 1M H2SO4를 넣어 발색반응을 멈추었다. 분광광도계를 통해 3개의 선발한 인간 scFv 항체 파지 라이브러리의 건전주, PLRV이병주, PVY이병주에 대한 반응결과를 정량적으로 측정하였으며 그 결과를 도 17(A)에 나타내었으며, 파지 농도에 따른 결과를 측정하여 도 17(B)에 나타내었다. 대부분의 인간 scFv항체 파지가 비특이반응을 낮게 보였으며 PVY에 높은 반응결과를 나타내었다.
3-3. ScFv 항체 유전자 분리 및 분석
실시예 3-2에서 확인된 인간 scFv 항체 파지 클론들을 공통적으로 증폭시키는 프라이머 세트를 제작하여 서열번호 10 및 서열번호 11에 나타내었다(도 18). 인간 scFv 항체 파지가 감염된 30종의 XL1-Blue cell을 Bioneer사의 AccuPrep®Nano-plus Plasmid Mini Extraction Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 scFv 유전자가 삽입된 파지미드를 분리하였다. 분리한 파지미드는 PCR을 통해 scFv DNA를 증폭하였다. 상기 증폭 반응 조성물의 제조를 위하여 10 uL의 2X PCR premix, 1ul의 10pM 정방향 프라이머(pCANTAB5_S1 CAA CGT GAA AAA ATT ATT ATT CGC ; 서열번호 10), 2ul의 10pM역방향 프라이머(pCANTAB5_S6 GTA AAT GAA TTT TCT GTA TGA GG ; 서열번호 11), 1ul의 파지미드, 및 증류수 7ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30초 (DNA 변성), 55℃에서 30초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35번 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ul의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔 전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 1Kb내외의 scFv 유전자가 증폭된 것을 확인하였으며 증폭된 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 분리한 DNA 절편을 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 PVY CP유전자 염기 서열이 증폭된 것을 확인하였고 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 후 IgBLAST를 이용하여 scFv 절편의 상보성 결정부위(CDR)위치를 추정하여 도 19에 나타내었다.
3-4. ScFv 단독발현을 위한 클로닝
아미노산 서열 분석을 완료한 인간 scFv 항체 중 C3 인간 scFv 항체를 선발하여 유전자를 대장균에서 단편(C3 VH, C3 VL)발현시키는 플라스미드에 클로닝 하기 위해 이들을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제작하였고 도 20에 나타내었다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머엔 각각 클로닝을 위해 각각 XmaI과 AflII 제한효소 사이트를 추가하였다. 추가로 정방향 프라이머에는 단백질 정제를 위한 HisX6 태그 서열을 추가하였다(CAT CAT CAT CAC CAT CAC). 상기 증폭 반응 조성물의 제조를 위하여 10 uL의 2X PCR premix, 1ul의 10pM 정방향 프라이머(C3_VH_F CCC GGG ATC ATC ATC ATC ACC ATC ACC AGGTGC AGC TG ; 서열번호 12, C3_VL_F CCC GGG ATC ATC ATC ATC ACC ATC ACT CAGCTA GCA TAA TT ;; 서열번호 13) 10pM 역방향 프라이머(pIg20_HRP_R CTT AAG CAGAGTTGCTGTTGACCACT ; 서열번호 14), 1ul의 phagemid, 및 증류수 7ul를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 제조된 증폭 반응 조성물을 96℃에서 10분 동안 반응시킨 후 95℃에서 30초 (DNA 변성), 55℃에서 30초 (프라이머의 결합), 72℃에서 1분 (DNA의 합성) 반응시켰다. 이 세 단계 과정을 35번 반복하여 DNA를 증폭하였다. 총 20 ul의 반응물을 EtBr이 포함된 1% 아가로스 겔전기영동하여 유전자가 증폭되었는지 확인하였다. 그 결과는 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타난 DNA를 면도칼을 이용하여 자른 후, Intron 사의 MEGAquick-spin Total fragment DNA Purification Kit를 사용하여 제조사의 지시사항에 따라 DNA 증폭산물을 분리하였다. 그 후, 증폭한 PVY scFv 항체 유전자를 클로닝하기 위해서 TA 클로닝을 수행하였으며, TA 플라스미드를 DH5α에 형질전환시켜 주었다. TA 클로닝과 대장균 형질전환 과정은 실시예 2-3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시했다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 scFv 항체 유전자가 올바르게 증폭이 된 것을 확인하였다.
확보한 TA 플라스미드의 scFv 항체 유전자를 대장균에 발현시키기 위해 대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20벡터에 클로닝하는 과정을 수행하였다. 기존에 pIg20벡터에 존재하는 protein A서열은 ELISA 반응 시에 검출 항체와 비특이 반응을 보이는 결과를 확인하여 이 부분을 AflII 제한효소로 제거하는 과정을 포함하였다. 상기 실험에서 제작한 scFv 항체 유전자가 포함된 TA 플라스미드 벡터와 pIg20 플라스미드 벡터를 각각 XmaI과 AflII 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. DNA절단 과정은 제조사의 지시사항에 따라 진행하였다. 절단한 각각의 scFv 항체 유전자와 pIg20 벡터를 4:1로 혼합한 후 실시예 2-3에 명기된 T4 DNA ligase와 ligation buffer를 반응튜브에 첨가한 후 혼합하였다. 혼합물은 16℃에서 12시간동안 접합 반응시켜 주었다. 반응물을 DH5α에 형질전환 시켜 주었으며 대장균 형질전환 과정은 실시예 2-3에 기술한 것과 동일한 과정으로 실시했다. 형질전환된 대장균으로부터 플라스미드 벡터를 분리한 후 분리한 플라스미드 벡터를 Macrogen사의 DNA 염기서열 분석서비스를 의뢰하여 각각의 scFv 항체 유전자가 pIg20 플라스미드 벡터에 삽입된 것을 확인하였다. 플라스미드 벡터 pIg20-HisX6-scFv의 모식도는 도 22에 나타내었다.
3-5. ScFv 단백질의 발현 테스트 및 정제
대장균 발현 플라스미드 벡터인 pIg20은 phoA leader 서열이 존재하여 발현한 단백질이 periplasm에 위치하게 한다. 그 결과 발현한 단백질이 배지에 존재하게 된다. His tag는 정제를 위한 tagging 단백질로 이용할 수 있다. 서열이 확인된 pIg20-scFv 플라스미드 벡터는 단백질 발현 균주인 BL21(DE3)pLysE에 형질전환 하였다. -85℃에 보관된 BL21(DE3)pLysE 컴피턴트 세포를 상기 플라스미드와 4℃에 10분간 둔 후 반응튜브에 첨가한 후 혼합시켜 42℃에 1분 15초 동안 heat shock시켜 주었다. 그 후 세포를 4℃에 1분동안 둔 후, 200ul의 LB broth 배지를 넣고 37℃ 교반배양기에서 30분 동안 회복시켜 주었다. 그 후 Amp, chloramphenicol(Cam: 25ug/ml)이 포함된 LB agar plate에 도말하여 37℃ 박테리아배양기에서 16시간동안 배양시켜 단일콜로니를 형성시켰다. scFv 항체 발현 테스트는 발현유도체인 isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)의 농도에 따라 단백질의 발현 유무를 확인하였다. 단일콜로니는 3ml의 Amp Cam LB broth를 넣고 37℃ 교반배양기에서 9시간동안 배양시켜준 후 새로운 3ml의 Amp Cam LB broth에 1% 접종하여 OD600nm 값이 0.6이 되도록 37℃ 교반배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0, 0.1, 0.5, 1mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 26℃에서 16시간동안 단백질을 발현시켰다.
단백질 발현 확인을 위해 각각의 세포들을 1ml 취해 반응튜브에 옮겨 원심분리기를 통해 세포를 가라앉혔다. 상층액 40ul을 새 튜브에 옮긴 후 10ul의 5X sample buffer(60mM Tris-HCl(pH 6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue 수용액)을 혼합해 5분 동안 끓인 후 10% SDS-PAGE 전기영동을 하였다. 전기영동한 PAGE gel의 단백질을 웨스턴 블랏으로 분석하기 위해 PVDF blotting 멤브레인(GE healthcare)으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 멤브레인을 TBSM(5% skim milk와 TBS buffer의 혼합)을 이용하여 blocking 시켜주었다. 1차항체 처리 단계로 anti-HisX6 tag antibody를 TBSM buffer로 1:5000 희석 후 4℃에서 12시간 반응을 시켰으며, TBST를 이용하여 수세한 뒤 2차항체(anti-mouse IgG HRP conjugated)를 1:5000 으로 희석 후 25℃에서 1시간동안 반응 시켰다. TBST를 이용하여 수세한 뒤 퍼옥사이드(peroxide)와 ECL 용액을 이용하여 developing을 진행했으며 그 결과를 도 23(A)에 나타내었다. 0은 IPTG 유도를 하지 않은 세포이며 1,2,3은 각각 0.1, 0.5, 1mM IPTG로 단백질 발현한 것이다.
발현테스트를 통해 단백질 발현을 확인한 세포들을 500ml의 Amp Cam LB broth에 1% 접종하여 OD600nm 값이 0.6이 되도록 37℃ 교반배양기에서 배양하였다. 배양한 대장균에 각각 0.5mM의 IPTG를 넣어 단백질의 발현을 유도하였으며 26℃에서 16시간동안 단백질을 발현시켰다.
단백질 정제를 위해 각각의 세포들을 원심분리기를 통해 세포를 가라앉힌 후, 상층액을 0.22 μstericup (Millipore)을 이용하여 여과하였다. 여과액을 Ni-NTA agarose(Qiagen)레진을 이용하여 정제하였으며 centricon 10,000 NMWL (Merck)을 이용하여 단백질을 농축하였다. 정제한 scFv 항체는 상기 발현테스트와 같은 항체를 이용하여 western blotting을 수행하였으며 그 결과를 도 23(B)에 나타내었다.
실시예 4. 정제한 scFv를 이용한 PVY 이병주 검정
정제한 2가지 인간 scFv 단편 항체의 PVY에 대한 역가를 측정하기 위해 ELISA분석을 진행했다. PVY capture antibody(Agdia)를 carbonate coating buffer(10mM NaCO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6)에 1:200으로 희석한 후 96well plate에 각 well당 100ul씩 코팅시켰다. 대조군 바이러스인 Potato Leafroll Virus(PLRV)에도 파지가 반응하는지 확인하기 위해 PLRV caputre antibody(Agida)를 carbonate coating buffer에 1:200으로 희석한 후 96well plate에 각 well당 100ul씩 코팅시켰다. Antibody 코팅 과정은 25℃에서 4시간동안 진행했다. TBS-T를 이용하여 수세한 후 건전주, PLRV이병주, PVY이병주의 잎을 각각 착즙한 후 general extration buffer(11mM Na2SO4, 2% polyvinylpyrrolidone MW 24-40,000, 3mM NaN3, 0.2% powdered egg albumin(Grade II), 2% Tween-20을 TBS buffer에 녹인 용액)와 혼합하여 well당 100ul씩 넣고 4℃에서 16시간동안 바이러스를 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 수세한 후, 각각의 정제한 HRP가 융합된 항체단백질을 PBS에 희석하여 20ug/ml로 농도를 일치시킨 후 PBSB에 1:200으로 희석하여 25℃에서 1시간동안 바이러스와 반응시켰다. TBS-T를 이용하여 수세한 후 각 well에 100ul의 TMB용액을 넣어 발색반응을 진행했으며 15분 뒤 100ul의 1M H2SO4를 넣어 발색반응을 멈추어 발색반응을 확인하여 도 24에 나타내었다. 도 24의 96well plate를 분광광도계를 이용하여 정량적으로 역가를 측정한 결과를 도 25에 나타내었다 (3D8 scFv는 scFv 항체 대조군으로 실험 하였다). 정제한 2가지의 인간 scFv 단편 항체가 비특이반응을 낮게 보였다. 본 발명을 통해 선발한 C3 VH(서열번호 15)와 C3 VL(서열번호 16) 항체의 유전자서열은 도 26에 나타냈으며, 아미노산 서열 및 CDR은 도 19(B)에 나타내었다.
<110> Republic of Korea
RESERCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> A METHOD FOR PRODUCING OF PLANT VIRUS SPECIFIC ANTIBODY USING
HUMAN SCFV ANTIBODY PHAGE DISPLAY LIBRARY
<130> P16R12D0892
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HRP
<400> 1
atgcagttaa cccctacatt ctacgacaat agctgtccca acgtgtccaa catcgttcgc 60
gacacaatcg tcaacgagct cagatccgat cccaggatcg ctgcttcaat attacgtctg 120
cacttccatg actgcttcgt gaatggttgc gacgctagca tattactgga caacaccacc 180
agtttccgca ctgaaaagga tgcattcggg aacgctaaca gcgccagggg ctttccagtg 240
atcgatcgca tgaaggctgc cgttgagtca gcatgcccac gaacagtcag ttgtgcagac 300
ctgctgacta tagctgcgca acagagcgtg actcttgcag gcggaccgtc ctggagagtg 360
ccgctcggtc gacgtgactc cctacaggca ttcctagatc tggccaacgc caacttgcct 420
gctccattct tcaccctgcc ccagctgaag gatagcttta gaaacgtggg tctgaatcgc 480
tcgagtgacc ttgtggctct gtccggagga cacacatttg gaaagaacca gtgtaggttc 540
atcatggata ggctctacaa tttcagcaac actgggttac ctgaccccac gctgaacact 600
acgtatctcc agacactgag aggcttgtgc ccactgaatg gcaacctcag tgcactagtg 660
gactttgatc tgcggacccc aaccatcttc gataacaagt actatgtgaa tctagaggag 720
cagaaaggcc tgatacagag tgatcaagaa ctgtttagca gtccaaacgc cactgacacc 780
atcccactgg tgagaagttt tgctaactct actcaaacct tctttaacgc cttcgtggaa 840
gccatggacc gtatgggtaa cattacccct ctgacgggta cccaaggcca gattcgtctg 900
aactgcagag tggtcaacag caactct 927
<210> 2
<211> 5402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pPhD-HRP
<400> 2
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgct cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcataca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgccaagctt tggagccttt tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta 2280
ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc tatgcggccc agccggccgc ggccgcaccc 2340
gggatgcagt taacccctac attctacgac aatagctgtc ccaacgtgtc caacatcgtt 2400
cgcgacacaa tcgtcaacga gctcagatcc gatcccagga tcgctgcttc aatattacgt 2460
ctgcacttcc atgactgctt cgtgaatggt tgcgacgcta gcatattact ggacaacacc 2520
accagtttcc gcactgaaaa ggatgcattc gggaacgcta acagcgccag gggctttcca 2580
gtgatcgatc gcatgaaggc tgccgttgag tcagcatgcc cacgaacagt cagttgtgca 2640
gacctgctga ctatagctgc gcaacagagc gtgactcttg caggcggacc gtcctggaga 2700
gtgccgctcg gtcgacgtga ctccctacag gcattcctag atctggccaa cgccaacttg 2760
cctgctccat tcttcaccct gccccagctg aaggatagct ttagaaacgt gggtctgaat 2820
cgctcgagtg accttgtggc tctgtccgga ggacacacat ttggaaagaa ccagtgtagg 2880
ttcatcatgg ataggctcta caatttcagc aacactgggt tacctgaccc cacgctgaac 2940
actacgtatc tccagacact gagaggcttg tgcccactga atggcaacct cagtgcacta 3000
gtggactttg atctgcggac cccaaccatc ttcgataaca agtactatgt gaatctagag 3060
gagcagaaag gcctgataca gagtgatcaa gaactgttta gcagtccaaa cgccactgac 3120
accatcccac tggtgagaag ttttgctaac tctactcaaa ccttctttaa cgccttcgtg 3180
gaagccatgg accgtatggg taacattacc cctctgacgg gtacccaagg ccagattcgt 3240
ctgaactgca gagtggtcaa cagcaactct accggttatc cggatccgct ggaaccgcgt 3300
gccgcaatga ctgttgaaag ttgtttagca aaacctcata cagaaaattc atttactaac 3360
gtctggaaag acgacaaaac tttagatcgt tacgctaact atgagggctg tctgtggaat 3420
gctacaggcg ttgtggtttg tactggtgac gaaactcagt gttacggtac atgggttcct 3480
attgggcttg ctatccctga aaatgagggt ggtggctctg agggtggcgg ttctgagggt 3540
ggcggttctg agggtggcgg tactaaacct cctgagtacg gtgatacacc tattccgggc 3600
tatacttata tcaaccctct cgacggcact tatccgcctg gtactgagca aaaccccgct 3660
aatcctaatc cttctcttga ggagtctcag cctcttaata ctttcatgtt tcagaataat 3720
aggttccgaa ataggcaggg tgcattaact gtttatacgg gcactgttac tcaaggcact 3780
gaccccgtta aaacttatta ccagtacact cctgtatcat caaaagccat gtatgacgct 3840
tactggaacg gtaaattcag agactgcgct ttccattctg gctttaatga ggatccattc 3900
gtttgtgaat atcaaggcca atcgtctgac ctgcctcaac ctcctgtcaa tgctggcggc 3960
ggctctggtg gtggttctgg tggcggctct gagggtggcg gctctgaggg tggcggttct 4020
gagggtggcg gctctgaggg tggcggttcc ggtggcggct ccggttccgg tgattttgat 4080
tatgaaaaaa tggcaaacgc taataagggg gctatgaccg aaaatgccga tgaaaacgcg 4140
ctacagtctg acgctaaagg caaacttgat tctgtcgcta ctgattacgg tgctgctatc 4200
gatggtttca ttggtgacgt ttccggcctt gctaatggta atggtgctac tggtgatttt 4260
gctggctcta attcccaaat ggctcaagtc ggtgacggtg ataattcacc tttaatgaat 4320
aatttccgtc aatatttacc ttctttgcct cagtcggttg aatgtcgccc ttatgtcttt 4380
ggcgctggta aaccatatga attttctatt gattgtgaca aaataaactt attccgtggt 4440
gtctttgcgt ttcttttata tgttgccacc tttatgtatg tattttcgac gtttgctaac 4500
atactgcgta ataaggagtc ttaataagaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 4560
ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 4620
ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 4680
tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg 4740
catataaatt gtaaacgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 4800
ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagcc 4860
cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 4920
ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc 4980
acccaaatca agttttttgg ggtcgaggtg ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg 5040
gagcccccga tttagagctt gacggggaaa gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa 5100
gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac 5160
caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg tactatggtt gctttgacgg 5220
gtgcagtctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc 5280
aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc 5340
tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc 5400
ga 5402
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCTCON_PVY_F
<400> 3
gctagcggag acacaatcga t 21
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCTCON_PVY_R
<400> 4
ggatcccatg ttcttgactc caagta 26
<210> 5
<211> 801
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PVY_CP
<400> 5
ggaaacgaca caatcgatgc aggaggaagc actaagaagg atgcaaaaca agagcaaggt 60
agcattcaac caaatctcaa caaggaaaag gaaaaggacg tgaatgttgg aacatctgga 120
actcatactg tgccacgaat taaagctatc acgtccaaaa tgagaatgcc caagagtaaa 180
ggtgcaactg tactaaattt ggaacactta ctcgagtatg ctccacagca aattgacatc 240
tcaaatactc gagcaactca atcacagttt gatacgtggt atgaagcggt acaacttgca 300
tacgacatag gagaaactga aatgccaact gtgatgaatg ggcttatggt ttggtgcatt 360
gaaaatggaa cctcgccaaa catcaacgga gtttgggtta tgatggatgg agatgaacaa 420
gtcgaatacc cactgaaacc aatcgttgag aatgcaaaac caacacttag gcaaatcatg 480
gcacatttct cagatgttgc agaagcgtat atagaaatgc gcaacaaaaa ggaaccatat 540
atgccacgat atggtttagt tcgtaatctg cgcgatggaa gtttggctcg ctatgctttt 600
gacttttatg aggtcacatc acgaacacca gtgagggcta gggaagcgca cattcaaatg 660
aaggccgcag cattgaaatc agcccaatct cgacttttcg ggttggacgg tggcatcagt 720
acacaagagg agaacacaga gaggcacacc accgaggatg tctctccaag tatgcatact 780
ctacttggag tcaagaacat g 801
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PVY_N2Q_F
<400> 6
gattcgtagg ctagcggaca ggacacaatc gatgcaggag 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PVY_N2Q_R
<400> 7
ctcctgcatc gattgtgtcc tgtccgctag cctacgaatc 40
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PVY_N122Q_F
<400> 8
cttatggttt ggtgcattga acagggaacc tcgccaaaca tcaac 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PVY_N122Q_R
<400> 9
gttgatgttt ggcgaggttc cctgttcaat gcaccaaacc ataag 45
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCANTAB5_S1
<400> 10
caacgtgaaa aaattattat tcgc 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCANTAB5_S6
<400> 11
gtaaatgaat tttctgtatg agg 23
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3_VH_F
<400> 12
cccgggatca tcatcatcac catcaccagg tgcagctg 38
<210> 13
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3_VL_F
<400> 13
cccgggatca tcatcatcac catcactcag ctagcataat t 41
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pIg20_HRP_R
<400> 14
cttaagcaga gttgctgttg accact 26
<210> 15
<211> 405
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3VH
<400> 15
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctgctagagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctaatgg ctccatcagt actttctact ggacttggat ccggcagccc 120
cctgggaagg gactggagtg gattggctac atcgattaca gtgggaccac cgactacaac 180
ccctccctcg agagtcgagt caccatatca atagagacgt ccaagaaaca attttccctg 240
gaattgacct ctgtgaccga tgcagacacg gccatatatt actgtacgag aggactcccg 300
gagtctgact actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag cataatttcg 360
tataaggtat cctatacgaa gttatctgga ggtggcggtt ctaga 405
<210> 16
<211> 417
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C3VL
<400> 16
tcagctagca taatttcgta taaggtatcc tatacgaagt tatctggagg tggcggttct 60
agacagtctg ccctgactca gcctgcagtc tgccctgact cagcctgccc ccgtgtctgg 120
gtctcctgga cagtcgatca ccatctcctg actggaacca gcagtgacgt tggtgcttat 180
aactatgtct cctggtacca acagcaccca ggcaaagccc ccaaactcat gatttatgat 240
gtcagtaagc ggccctcagg ggtttctaat cgcttctctg gctccaagtc tggcaacacg 300
gcctccctga ccatctctgg gctccaggct gaggacgagg ctgattatta ctgcagctca 360
tatacaacca gcagcactta tgtcttcgga actgggaccc agctcaccgt tttaggt 417
Claims (9)
1) 인간 scFv 항체 유전자 및 시각화 단백질(visible protein) 유전자를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리 제작용 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 재조합 파지미드 벡터를 숙주 균주에 형질전환 후 배양하는 단계;
3) 상기 2)단계의 형질전환된 숙주 균주에 보조파지(helper phage)를 감염시켜 인간 scFv 항체 및 시각화 단백질이 융합된 형태로 표면에 발현된 박테리오파지가 용출되는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제조하는 단계;
4) 효모 표면 발현 시스템을 이용하여 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질을 효모 표면에 발현시키는 단계;
5) 상기 3)단계에서 제조된 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리와 상기 4)단계에서 제조된 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 이용하여 바이오 패닝(bio-panning)을 수행하는 단계;
6) 바이오 패닝을 통해 상기 바이러스에 결합하는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 선발하는 단계; 및
7) 상기 6)단계에서 선발된 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리로부터 인간 scFv 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법으로,
상기 단계 5)의 바이오 패닝은 상기 식물 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 상기 식물 바이러스에 특이적인 1차 항체와 결합시킨 후 수행하는 것인, 바이러스 항체 생산 방법.
2) 상기 재조합 파지미드 벡터를 숙주 균주에 형질전환 후 배양하는 단계;
3) 상기 2)단계의 형질전환된 숙주 균주에 보조파지(helper phage)를 감염시켜 인간 scFv 항체 및 시각화 단백질이 융합된 형태로 표면에 발현된 박테리오파지가 용출되는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 제조하는 단계;
4) 효모 표면 발현 시스템을 이용하여 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질을 효모 표면에 발현시키는 단계;
5) 상기 3)단계에서 제조된 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리와 상기 4)단계에서 제조된 식물에 감염하는 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 이용하여 바이오 패닝(bio-panning)을 수행하는 단계;
6) 바이오 패닝을 통해 상기 바이러스에 결합하는 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 선발하는 단계; 및
7) 상기 6)단계에서 선발된 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리로부터 인간 scFv 항체를 분리하는 단계;
를 포함하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법으로,
상기 단계 5)의 바이오 패닝은 상기 식물 바이러스의 외피 단백질이 표면에 발현된 효모를 상기 식물 바이러스에 특이적인 1차 항체와 결합시킨 후 수행하는 것인, 바이러스 항체 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 1) 단계의 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계는,
(A) 시각화 단백질 유전자 말단에 각각 제한효소 Xma I과 Age I 인식서열을 추가하는 단계;
(B) 모벡터(pCANTAB-5E)에 MCS(multiple clonning site)를 삽입하는 단계;
(C) MCS가 삽입된 모벡터를 Xma I 및 Age I 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계;
(D) 상기 (A) 단계에서 제조한 시각화 단백질 유전자를 상기 (C) 단계에서 제조된 모벡터에 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;
(E) 상기 (D)단계의 벡터를 Sfi I 및 Not I 제한효소로 처리하여 절단하는 단계; 및
(F) 상기 절단된 벡터에 인간 scFv 항체 유전자를 도입하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
상기 1) 단계의 재조합 파지미드 벡터를 제조하는 단계는,
(A) 시각화 단백질 유전자 말단에 각각 제한효소 Xma I과 Age I 인식서열을 추가하는 단계;
(B) 모벡터(pCANTAB-5E)에 MCS(multiple clonning site)를 삽입하는 단계;
(C) MCS가 삽입된 모벡터를 Xma I 및 Age I 제한효소로 처리하여 점착성 말단을 형성하는 단계;
(D) 상기 (A) 단계에서 제조한 시각화 단백질 유전자를 상기 (C) 단계에서 제조된 모벡터에 도입하고 리가아제(Ligase)로 연결하는 단계;
(E) 상기 (D)단계의 벡터를 Sfi I 및 Not I 제한효소로 처리하여 절단하는 단계; 및
(F) 상기 절단된 벡터에 인간 scFv 항체 유전자를 도입하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
제 1항에 있어서,
상기 식물에 감염하는 바이러스는 감자 바이러스 Y(PVY)인 것인, 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
상기 식물에 감염하는 바이러스는 감자 바이러스 Y(PVY)인 것인, 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
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제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 시각화 단백질은 HRP(horseradish peroxidase), ALP(alkaline phosphatase), GFP(Green fluorescent protein) 및 invertase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
상기 시각화 단백질은 HRP(horseradish peroxidase), ALP(alkaline phosphatase), GFP(Green fluorescent protein) 및 invertase로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 인간 scFv 항체 표면제시 라이브러리를 이용한 식물에 감염하는 바이러스 항체 생산 방법.
제 3항의 방법에 의해 생산되고 서열번호 15의 염기서열로 표시되는 중쇄 가변도메인 및 서열번호 16의 염기서열로 표시되는 경쇄 가변도메인으로 이루어진 감자 바이러스 Y에 특이적인 인간 scFv 항체.
제 6항의 감자 바이러스 Y에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 감자 바이러스 Y 감염 예방 및 치료용 조성물.
제 6항의 감자 바이러스 Y에 특이적인 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 감자 바이러스 Y 감염 진단용 키트.
제 6항의 감자 바이러스 Y 항체 또는 이의 단편을 목적하는 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 감자 바이러스 Y의 존재 여부의 검출 방법.
Priority Applications (1)
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ID=60920553
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| KR1020160081907A KR101806129B1 (ko) | 2016-06-29 | 2016-06-29 | 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 식물 바이러스 항체 생산 방법 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200026544A (ko) * | 2018-09-03 | 2020-03-11 | 성균관대학교산학협력단 | M13ko7 박테리오 파지를 포함하는 감자바이러스 y 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트 |
| KR102266878B1 (ko) * | 2019-12-12 | 2021-06-18 | 대한민국 | 감자 잎말림 바이러스 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도 |
-
2016
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Maryam Salavatifar 등. Hybridoma. Vol. 30, No. 3, 페이지 229-238 (2011.06.).* |
| 강솔. 성균관대학교 생명공학과 석사학위논문. (2013.).* |
Cited By (3)
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