KR102266878B1 - 감자 잎말림 바이러스 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도 - Google Patents
감자 잎말림 바이러스 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 인간 Scfv 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 상기 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하는 기술에 관한 것이다.
본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하고자 예의 연구한 결과, 서로 다른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 사용하면, 높은 정확도로 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단 가능함을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 간염 진단에 사용하면, 식물체의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 감염 여부를 높은 정확도로 진단할 수 있으므로, 식물 바이러스로 인한 피해를 최소화하여 생산량을 증진시키는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하고자 예의 연구한 결과, 서로 다른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 사용하면, 높은 정확도로 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단 가능함을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 간염 진단에 사용하면, 식물체의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 감염 여부를 높은 정확도로 진단할 수 있으므로, 식물 바이러스로 인한 피해를 최소화하여 생산량을 증진시키는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 인간 Scfv 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하고, 상기 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하는 기술에 관한 것이다.
식물 바이러스 병은 감염 작물의 수량 및 품질을 급격히 감소시키므로 생산량 감소 등 경제적으로 큰 손실을 가져온다.
한편, 우리나라의 한해 수출입 물품의 검역 건수는 3,500 내지 4,200천 건에 이르고 바이러스 병은 기주 범위가 매우 넓고, 접촉, 매개 또는 감염된 종서의 사용 등의 다양한 경로를 통해서 2차 감염이 가능할 뿐만 아니라, 효과적인 방제법이나 약제가 거의 없기 때문에 진단이나 방제가 어려운 실정이다. 이에, 효율적인 방제법은 식물 바이러스 병에 대한 조기진단 및 오염원 제거 시스템을 갖추는 것이며 그 중요성이 점점 높아지고 있다.
한편, 일부 식물 바이러스는 이를 방제하기 위한 혈청을 제조하기에는 면역원 (immunogen)으로서 용이하지 않다고 알려져 있고, 상기와 같이 실험동물의 면역반응을 충분히 일으킬 수 없는 항원에 대한 특이적인 항체 절편을 생산하기 위하여 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리 (scFv phage display library) 방법이 사용되고 있다.
이에, 식물 바이러스에 특이적으로 결합하는 scFv 항체에 관한 연구는 다수 이루어지고 있으나 (한국등록특허공보 제10-1806129호), 서로 다른 바이러스 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체 및 상기 항체들을 이용한 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단방법에 관한 연구는 미진한 실정이다.
본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하고자 예의 연구한 결과, 서로 다른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 사용하면, 높은 정확도로 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단 가능함을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 상기의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 (서열번호 1 내지 서열번호 6의 CDR을 포함하는 scFv 항체) 및/또는 상기의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 (서열번호 8 내지 서열번호 13의 CDR을 포함하는 scFv 항체), 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물 을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 상기 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 상기 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 검체 유래의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 존재 여부의 진단방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공한다.
또한, 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공한다.
또한, 상기의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 (서열번호 1 내지 서열번호 6의 CDR을 포함하는 scFv 항체) 및/또는 상기의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 (서열번호 8 내지 서열번호 13의 CDR을 포함하는 scFv 항체), 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 키트를 제공한다.
또한, 상기 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 검체 유래의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 존재 여부의 진단방법을 제공한다.
본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하고자 예의 연구한 결과, 서로 다른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 사용하면, 높은 정확도로 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단 가능함을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 간염 진단에 사용하면, 식물체의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 감염 여부를 높은 정확도로 진단할 수 있으므로, 식물 바이러스로 인한 피해를 최소화하여 생산량을 증진시키는데 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 선별하기 위해 사용된 인간 Scfv 항체 라이브러리를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 사용하여, 블랭크 (blank), 양성 대조구 및 음성 대조구에서의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 아미노산 서열 및 CDR 부위를 확인한 결과로서, 도 3a는 상기 항체의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 도 3b는 상기 항체의 CDR 부위의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위 및 항체의 특성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 사용하여, 블랭크 (blank), 양성 대조구 및 음성 대조구에서의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 아미노산 서열 및 CDR 부위를 확인한 결과로서, 도 3a는 상기 항체의 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 도 3b는 상기 항체의 CDR 부위의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체의 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위 및 항체의 특성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체를 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 진단용도로 사용하고자 예의 연구한 결과, 서로 다른 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 가지는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 특이적 Scfv 항체들을 사용하면, 높은 정확도로 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단 가능함을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 일 실시예에서, XL1 blue에 파아지 라이브러리 (phage library)를 넣고, scFv 항체를 만들 수 있도록 헬퍼 파아지 (Helper phage)를 넣어서 30 ℃에 밤새 배양시킨 후, 농축된 인간 scFv 항체 라이브러리 및 바이러스에 대한 특이적인 항체를 선별하는 패닝 (panning) 과정을 통해, O2-scFv 및 O5-scFv를 선별하였다 (실시예 1 참고).
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 선별된 항체의 ELASA 분석 결과, 상기 O2-scFv 및 O5-scFv는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 포함하는 양성 대조구에서 반응 수치가 높고, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 포함하지 않는 음성 대조구에서 반응 수치가 낮음을 확인하였다 (실시예 2 참고).
또한, 상기 O2-scFv 및 O5-scFv를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 유전자염기서열 분석 및 항체 특성을 분석한 결과, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 대해 서로 다른 결합 부위를 가짐을 확인하였다 (실시예 2 참고).
본 발명자들은 상기 실시예 결과들로부터, 본 발명에 따른 O2-scFv 및/또는 O5-scFv가 높은 정확도의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용도를 가짐을 제안한다.
이에, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체 및 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체를 제공한다.
본 발명에서 대상으로 하는 “감자 잎말림 바이러스 (Potato leafroll virus, PLRV)”는, 루테오바이러스 (luteovirus) 그룹에 속하는 구형의 바이러스로서, 입자 크기는 24 ㎚이며, 즙액 전염은 되지 않으며 진딧물에 의해 전염된다. 10종 이상의 진딧물이 전염하는 것으로 알려져 있으며, 복숭아혹진딧물, 감자수염진딧물, 싸리수염진딧물 등 3종이 주로 전염하는 것으로 알려져 있다. 복숭아혹진딧물은 십자화과, 가지과, 콩과, 명아주과 등 170 내지 180종 정도의 식물에 기생하고 있으며, 그 외의 진딧물은 기주가 이보다는 훨씬 적다. 복숭아혹진딧물은 감자 잎말림 바이러스의 획득 흡즙 기간이 약 1시간이고, 약 1일간의 잠복기간을 경과한 후에 건전식물을 5 내지 10분 흡즙하면 감염이 일어나는 것으로 보고된다. 방제방법으로는, 건전주 채종 감자를 종서로 사용하고 이병주는 즉시 제거하며, 감자는 진딧물 발생이 적은 곳에서 재배하고, 살충제를 살포하며, 바이러스의 잠재적인 보존원인 잡초나 중간기주를 제거하는 방법을 사용한다.
본 발명에서 용어, “scFv (Single chain fragment variable) 항체”는, 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변도메인을 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 연결부위 (linker)로 연결한 단백질을 지칭한다. 경쇄가변도메인 (VL)-연결부위-중쇄가변도메인 (VH), 또는 중쇄가변도메인 (VH)-연결부위-경쇄가변도메인 (VL)의 순서 모두 가능하며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원 특이성을 가진다. 연결부위는 주로 글리신 (glycine)과 세린 (serine)으로 이루어진 친수성의 유연한 펩타이드 사슬로서 “(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3”의 15개의 아미노산 서열 혹은 유사한 서열이 주로 사용된다. 본 발명에서 바람직하게는, 인간으로부터 유래한 scFv (Single chain fragment variable) 항체를 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어, “파아지 표면제시 (phage display)”는 박테리오파아지의 유전자를 조작하여 그 표면단백질 중 하나의 유전자에 외부단백질의 유전자를 융합하고, 생산된 파아지의 표면단백질에 외부단백질이 융합되어 파아지의 표면에 제시되는 기법을 지칭한다. 단백질을 표면에 제시하기 위해서는 흔히 gIII 유전자의 5' 쪽에 외부유전자를 융합한다.
본 발명에서 용어, “항체”는, 목표항원에 특이적으로 결합하는 당 단백질이다. 경쇄 (light chain)과 중쇄 (heavy chain)가 각각 2개씩 모여 이루어지는 헤테로테트라머이며, 각각의 사슬은 아미노산 서열이 변할 수 있는 가변도메인 (variable domain)과 일정한 서열을 가지는 불변도메인 (constant domain)으로 이루어져 있다. 가변도메인의 3차원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR)들이 모여서 형성된다. 상보성 결정부위 (CDR)는 가변도메인 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며, 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다.
본 발명에서 용어, “항체 라이브러리”는, 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 일반적으로 109 내지 1011개의 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체 라이브러리를 이루는 항체 유전자는 파아지미드 (phagemid) 벡터에 클로닝 되어 대장균에 형질 전환된다.
본 발명에서 용어, “파아지미드 (phagemid)”는, 파아지 복제 시작점 (phage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이다. 통상적으로 항생제 내성 유전자를 선택 마커 (selection marker)로 가지고 있다. 파아지 표면제시에 사용되는 파아지미드 벡터의 경우 M13 파아지의 gIII 유전자 혹은 그 일부가 포함되어 있으며, 라이브러리 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션 (ligation)되어 대장균에서 융합단백질로서 발현된다.
본 발명에서 용어, “헬퍼 파아지 (helper phage)”는, 파아지미드가 파아지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파아지를 지칭한다. 파아지미드에는 파아지 유전자 중 gIII 또는 그 일부만이 존재하므로 파아지미드로 형질 전환된 대장균을 헬퍼 파아지로 감염시켜 나머지 파어지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 사용될 수 있으며, 대부분 카나마이신 (kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파아지에 감염된 대장균을 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호 (packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파아지 유전자보다 파아지미드 유전자가 선별적으로 파아지 입자 속으로 조립된다. 본 발명에 따른 O2-scFv, O5-scFv의 선별에 있어서, VCSM13을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “패닝 (panning)”은, 파아지의 외벽 (coat)에 펩타이드 (단백질)를 발현 (display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자 (항원 (바이러스 외피 단백질), 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
또한, 상기 각각 또는 모두의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 포함하는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 키트를 제공한다. 상기 바이러스 진단용 키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmnoassay), 샌드위치 측정법 (Sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯 (Western Blot), 면역블롯 분석 (Immunoblot assay) 및 면역조직화학염색 방법 (Immnohistochemical staining)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 검체 유래의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 존재 여부의 진단방법을 제공한다. 상기 진단용 조성물을 검체 유래의 시료와 반응시키는 단계는 통상의 기술자가 공지기술로부터 선택할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 감자 잎말림 바이러스 (
Potato leafroll virus
, PLRV) 항체의 선별
인간 scFv 라이브러리 (Human scFv library)를 파아지미드 (phagemid)에 클로닝한 파아지 라이브러리 (phage library, 아주대 의대 2종, 시판 2종 (Tomlinson I, J))를 사용하여 PLRV 항체를 선별하였다. 본 실시예에서 사용한 파아지 라이브러리는 도 1에 나타낸 바와 같다.
1-1. 감자 잎말림 바이러스 (
Potato leafroll virus
, PLRV) 항체의 농축
먼저, XL1 blue에 파아지 라이브러리 (phage library)를 넣고 여기에 scFv 항체를 만들 수 있도록 헬퍼 파아지 (Helper phage, VCSM13)를 넣어서 30 ℃에 밤새 (overnight) 배양시켰다.
그 다음으로, 원심분리 (6,000 g, 10분)하여 상층액에 있는 scFv 항체 라이브러리를 분리하고, 이를 농축하기 위하여 PEG-NaCl 및 원심분리방법을 이용하였다.
1-2. 감자 잎말림 바이러스 (
Potato leafroll virus
, PLRV) 항체의 선별을 위한 패닝 및 배양과정
상기 1-1의 단계를 통해 농축된 인간 scFv 항체 라이브러리를 이용하여, 바이러스에 대하여 특이적인 항체를 선별하는 패닝 (panning) 과정을 거쳤다. 상기 언급한 패닝 과정은 하기와 같다.
먼저, 시판되는 포획 항체 (capture antibody, IgG)를 ELISA plate에 코팅을 하고 세척 후 추출 완충액 (Extraction buffer)을 넣는 블랭크 (blank), 바이러스가 감염되지 않은 건전한 감자 즙액 (음성 대조구), 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 감염된 감자 식물체 즙액 (양성 대조구)을 100 ㎕씩 넣었다.
그 다음으로, 다음날 ELISA plate을 세척한 후 블랭크 (Blank) 라인에 농축된 인간 scFv 항체 라이브러리를 PBSM으로 현탁 후 100 ㎕를 넣고 2시간 동안 반응을 수행하였으며, 음성 대조구와 양성 대조구 라인에는 PBSM을 200 ㎕씩 분주해 두었다.
그 다음으로, 상기 음성 대조구의 PBSM을 제거하고 블랭크 (blank)의 scFv 항체 라이브러리를 음성 대조구로 옮겨주었으며, 상기 과정을 반복하여 진행하였다. 비 특이적 반응을 유발하는 라이브러리를 완전히 제거하기 위하여 블랭크 (blank)를 2회 반복, 음성 대조구를 2 시간 2회 반복으로 처리하였다.
또한, 양성 처리구에 scFv 항체 라이브러리를 넣고 1 시간 후 PBST buffer로 5회 세척하였다. 여액을 완전히 제거하고 100 mM 트라이에틸아민 (Triethylamine) 100 ㎕를 넣고 10분 후 용리 (elution)하고, 상기 희석된 용리된 라이브러리에 1 M Tris-HCl, pH 8.0을 50 ㎕를 넣어 중화시켰으며, 10분 후 용리한 웰 (well)에 다시 100 ㎕ 100 mM 트라이에틸아민 (Triethylamine)을 넣고 10분 후에 같은 방법으로 용리하고 중화시켰다.
마지막으로, 추출된 scFv 라이브러리는 다시 XL1 Blue에 넣고 37 ℃에서 1시간 배양 (no shaking) 후 LA-Carb-Glu 고체 배지에 50 ㎕씩 도말하여 30 ℃에서 O/N 배양을 수행하였다. 상기의 배양된 단일 콜로니 (single colony)를 2TY-growth 배지에 넣고 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였으며, 상기 배양된 콜로니 (colony)에서 scFv 항체 라이브러리를 증식 분리하기 위하여 헬퍼 파아지 (helper phage)를 넣고 30 ℃에서 O/N 하여 svFv 항체 라이브러리를 배양하였다.
실시예 2. 선별한 감자 잎말림 바이러스 (
Potato leafroll virus
, PLRV) scFv 항체의 확인
상기 1-1 및 1-2의 단계를 거쳐 선별한 scFv 라이브러리가 제대로 반응하는지 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.
보다 구체적으로, 먼저 포획 항체 (Capture antibody)를 코팅하고 블랭크 (blank), 음성 대조구, 양성 대조구를 처리한 후 상기 1-1에서 배양된 단일 콜로니 (single colony)의 scFv 라이브러리를 2차 항체로 사용하고 파아지 (Phage)에 반응하는 항-M13 항체 (anti-M13 antibody, HRP conjugate)를 반응시켰다.
그 다음으로, 기질로 TMB solution을 100 ㎕/well 넣고 10 내지 15분 후 청색으로 변하면 효소-기질 반응 종결 용액 (stop solution)으로 1M H2SO4를 100 ㎕ 넣어 노란색으로 변하면 450 ㎚의 흡광도로 반응을 측정하였다.
여기서, 양성 대조구의 수치는 높고 음성 대조구와 블랭크 (blank)의 수치가 낮은 라이브러리를 선별하고, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 scFv 라이브러리의 특성을 파악하고, 유전자염기서열 분석을 실시하였으며, 상기의 선별된 라이브러리 중 ELISA 및 염기서열 분석을 통해 최적의 scFv 항체 재선정을 하였으며, 최종적으로 ELISA을 통해 양성반응 및 비 특이반응을 조사하여 양성 반응의 수치가 높고 비 특이적 반응의 수치가 낮은, 최적의 scFv 항체 라이브러리를 선정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 선별된 항체를 선별된 O2-scFv 및 O5-scFv로 명명하였으며, 양성 대조구의 반응 수치가 1 이상으로 측정되는 경우 노란색이 명확하게 확인되는바 오류 없이 양성 반응을 확인할 수 있는데, 선별된 O2-scFv 및 O5-scFv 모두 양성 대조구의 반응 수치가 1 이상으로 측정됨을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이 음성 대조구는 비 특이 반응을 나타내는 수치로 블랭크 (blank)의 수치와 비교하여 높게 나타나지 않는 것이 이상적인데, 선별된 O2-scFv 및 O5-scFv 모두 음성 대조구와 블랭크 (blank)의 반응 수치가 비슷한 수준으로 측정됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, 선별된 2개의 항체 (O2-scFv, O5-scFv)는 음성 대조구의 비 특이 반응이 없고 양성 대조구의 수치가 높아 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 항체로 사용하기 적합함을 알 수 있었다.
한편, 선별된 2개의 항체 (O2-scFv, O5-scFv)에 대하여, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 유전자염기서열 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이 각 항체의 아미노산 서열 및 CDR 영역의 서열을 확인하였다.
또한, 선별된 2개의 항체 (O2-scFv, O5-scFv)의 항원 결합부위를 확인하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 각 항체의 항원 결합부위를 확인하였는데, 서로 다른 2개의 항체를 사용하더라도 항원 결합 부위가 동일하면 상기 2개의 항체가 경쟁관계로 1개 항체를 사용한 효과와 동일하다.
그러나 본 발명의 선별된 O2-scFv, O5-scFv 항체에서 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 결합 부위를 확인한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 선별된 O2-scFv, O5-scFv 항체는 항원인 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)와의 결합 부위가 서로 다른바, 상기 2개의 항체를 동시에 사용하여 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)를 진단하는 경우 진단의 정확도 및 효율성이 증대됨을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Potato leafroll virus Specific Antibody from Human Scfv Antibody
Phage Display Library and Uses thereof
<130> PD19-234
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 1
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<220>
<223> O2_VH-CDR 2
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
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<220>
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<400> 14
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> O2 Scfv antibody
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Ala Tyr Arg His Leu Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Thr Ser Tyr Lys Val
115 120 125
Ser Tyr Thr Arg Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asp Val Val Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Thr Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr
145 150 155 160
Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Ile Leu Ser Ser Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
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Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 16
<211> 252
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> O5 Scfv antibody
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115 120 125
Ser Tyr Thr Arg Leu Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asp Val Val Met
130 135 140
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Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Ile Leu Ser Ser Ser Asn Asn Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu
180 185 190
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
Claims (5)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체.
- 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (complementarity determining region, CDR) 1, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 중쇄 가변영역 (V 영역); 및
서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 1, 서열번호 12로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 2, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상보성 결정부위 (CDR) 3을 포함하는 경쇄 가변영역 (V 영역)을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 인간 scFv 항체.
- 제1항의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 및 제2항의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)에 특이적인 항체 중 하나 이상의 항체를 포함하는 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물.
- 제3항의 조성물을 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 키트.
- 제3항의 감자 잎말림 바이러스 (PLRV) 진단용 조성물을 검체 유래의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, 감자 잎말림 바이러스 (PLRV)의 존재 여부의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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| KR1020190166084A KR102266878B1 (ko) | 2019-12-12 | 2019-12-12 | 감자 잎말림 바이러스 특이적 Scfv 항체 및 이의 용도 |
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| KR940004673A (ko) * | 1992-08-25 | 1994-03-15 | 황선두 | 적층세라믹 콘덴서의 자동 탈 바인터(Binder)장치 |
| KR101806129B1 (ko) * | 2016-06-29 | 2017-12-07 | 성균관대학교산학협력단 | 인간 scFv 항체 파지 표면제시 라이브러리를 이용한 식물 바이러스 항체 생산 방법 |
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2019
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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