JPH05508076A - 特異的結合対の構成員を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

４０、前記欠陥のあるキャプシドタンパク質がファージｆｄの遺伝子ＩＩＩまた は他のフィラメント状ファージの中のその対応物である、請求項３８または３９ に記載の細菌宿主細胞。 ４１、組み換え大腸菌ＴＧＩ　Ｍ１３に０７　ｇＩＩＩ　Ｎｏ−３（ＮＣＴＣ１ ２４７Ｂ）　。 ４２、特異的結合対またはその結合ドメインの構成員を機能的形態でその表面上 に表示する型の複製可能な遺伝的表示パッケージを有するファージ。 ４３、上記１〜３４項のいずれかに記載の方法の実施において使用される、 （ｉ）一本領のバタテリオファージのための複製起点、前記ｓｂｐ構成員をコー ドする核酸の挿入のための制限部位またはファージのキャプシドタンパク質の成 熟コード配列の５′末端領域においてそのポリペプチド成分を有し、そしてキャ プシドタンパク質およびｓｂｐポリペプチドの融合体を細菌宿主のベリプラスミ ンク空間に向ける分泌リーダー配列を前記部位の上流にもつ、少なくとも１つの ベクター、および （ｉｉ）前記方法を実施するために要求される補助的成分、を含んでなるキット 。 明細書 特異的結合対の構成員を製造する方法 本発明は、特異的結合対の構成員を製造する方法に関する０本発明は、また、こ れらの方法により製造された生物学的結合分子に関する。 所定の抗原に対するそれらの高い特異性のために、モノクローナル抗体の出現（ Ｋｏｈｅｒ、Ｇ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ；Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５ ）は、有意な技術的進歩を代表し、科学的および商業的の両方の面で重要な結果 をもたらした。 モノクローナル抗体は、伝統的には永久分裂能をもつ哺乳動物の細胞系を確立す ることによってつくられ、この細胞系は特定の特異性をもつ生物学的に機能的な 抗体分子の１つの形態を分泌する、単一の免疫グロブリン産生細胞から誘導され る。抗体を分泌する哺乳動物の細胞系は永久分裂能を有するので、抗体の特性は バッチ毎に再現性がある。モノクローナル抗体の主要な性質は、特定の抗原に対 するそれらの特異性およびそれらを産生ずることができる再現性である。 構造的には、最も簡単な抗体（ＩｇＧ）は、４つつのポリペプチド鎖、すなわち ２つのヘビー（Ｈ）鎖および３つのライト（Ｌ）Ｉからなり、これらはジサルフ ァイド結合により相互に接続されている（第１図参照）、ライ）ＩＩはカッパ（ に）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの別個の形態で存在する。各鎖は定常領 域（Ｃ）および可変領域（Ｖ）を有する。各鎖は１連のドメインに組織化される 。ライト鎖は２つのドメイン、すなわちＣｆｊＩ域対応するドメインおよびＶ領 域に対当するドメインを有する。ヘビー鎖は４つのドメインをもち、１つはＶＢ 域に対応しそして３つのドメイン（１，２および３）はｃｌ域の中に存在する。 抗体は２つのアーム（各アームはＦａｂ　領域である）を有し、それらの各々は 互いに関連するＶＬおよびＶＨｆｆｆ域を有する。１つの抗体を他の抗体と区別 しくアミノ酸配列の変動のために）そして−緒になって抗糸を認識しそして抗原 結合部位（ＡＢＳ）を提供するのは、■領域のこの対（ＶＬおよびＶＢ）である 、なお一層詳細には、各ｖｌ域は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成され 、これらの領域は４つのフレームワーク（ＰＲ）により分離されている。 ＣＤＲは可変領域の最も可変的部分であり、そしてそれらは重要な抗原結合機能 をはたす、　ＣＤｌ１　ｉ域は多数の潜在的シャームライン（ｇｅｒ園１ｉｎｅ ）から、組み換え、突然変異および選択を包含する複雑なプロセスを経て誘導さ れる。 抗原に結合する機能は全抗体の断片により果たされうろことが示された。結合性 断片の例は、次の通りである：　（ｔ）ＶＬ、　ＶＨ，ＣＬおよびＣＨ２ドメイ ンから成るＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶｌｌおよびＣＨＩドメインから成るＦｄ断片 ；　（ｉ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ ｉｖ）ＶＨドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ　＋　Ｅ　、　Ｓ、ら、Ｎａ ｔｕｒｅ　３４１，５４４−５４６（１９８９）　；　（Ｖ　）分離されたＣＤ ＲＷｔ域；およびＦ（ａｂ’　）ｚ断片、すなわちヒンジ領域においてジサルフ ァイド架橋により連鎖された２つのＦａｂ断片を含んでなる２価の断片。 Ｆｖ断片の２つのドメインは別々の遺伝子によりコードされているが、それらを 単一のタンパク質頓として組み換え方法によりつくることができるようにする、 合成リンカ−をつくことが可能であることが証明された（単一の１ｌＦｖ（ｓｃ ＦＶ）として知られている；　Ｂｉｒｄ、Ｒ，Ｅ。 ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．４２３−４２６（１９８８）　［Ｉｕｓｔｏｎ、 Ｊ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５．５８７９−５８８３（１９８Ｂ））　、これらの５ｃＦ ｖ断片は、前取て分離したモノクローナルからの遺伝子から組立てられた。この 出願において、出願人は、前取て分離された抗体の一部分ではないＶＨおよびＶ Ｌドメインから５ｃＦｖ断片を組み立てる方法を記載する。 モノクローナル抗体、それらの断片および誘導体はきわめて有利であるが、それ にも拘らず、多数の制限がそれらに関係付けられる。 第１に、ヒト永久分裂能細胞系により産生されたモノクローナル抗体の療法的応 用は広い範囲病気の処置のための非常にを望である（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐ ｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、［ ＋、Ｓ、Ｌｏｎｎｏｘ編、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 　１９８４．　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ発行）。 不都合なことには、永久分裂能の抗体産生ヒト細胞系は樹立することが非常に困 難であり、そして抗体の非常に低い収量を与える（はぼ１μｇ／ｍｌ）　、対照 的に、同等の冨歯類の細胞系は高い量の抗体を生じた（はぼ１００　μｇ／■ｌ ）、シかしながら、それらの外来の冨歯類のタンパク質をヒトに反復投与すると 、有害な過敏反応に導くことがある。したがって、主に、それらの翳歯類由来の モノクローナル抗体は制限された療法的用途を有する。 第２に、モノクローナル抗体の分離における主要な観点は、所望の特異性をもつ 抗体を産生ずる細胞を分離するために理論的にどれだけ多くのサンプリングをす る必要性あるかにではなく、異なる特異性をもつ抗体産生細胞のどれだけ多くの 異なるクローンを実際に樹立しかつサンプリングすることができるかということ である（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，、Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ、Ｃｒｏｏｎｉａｎ　Ｌ ｅｃｔｕｒｅ＋Ｐｒｏｃ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ。 ２３９；　１−１６（１９９０））　、例えば、任意の１回でネズミ免疫系のリ ンパ球により発現される異なる特異性の数はほぼ１０？であると考えられ、そし てこれは特異性の潜在的レパートリ−のわずかに小さい比率である。しかしなが ら、所望の特異性をもつ典型的な抗体産生細胞の分離の間に、研究者は１０３〜 １０４の個々の特異性をサンプリングすることができるのみである。この問題は ヒトにおいて悪く、ここでほぼ１０１富のリンパ球の特異性が存在し、１０３〜 １０’のサンプリングについての制限が伴う。 この問題は実験室動物において免疫化法の使用によりある程度軽減されてきてい る。すなわち、特定のエピトープに対する特異性を有するモノクローナル抗体を 産生しようとする場合、動物をそのエピトープを発現する免疫原で免疫化する０ 次いで動物を免疫原に対して免疫応答をマウントし、そしてエピトープに対して 特異性を有するリンパ球の増殖が存在するであろう、所望の特異性をもつリンパ 球のこの増殖のために、サンプリング手順においてそれらを検出することはより 容易になる。しかしながら、このアプローチは、適当な免疫原が入手可能ではな いので、すべての場合において成功するわけではない、さらに、ヒトモノクロー ナル抗体を製造しようとする場合（例えば、従来記載されたように療法学的投与 のために）、このようなアプローチは実際的に、あるいは倫理的に可能ではない 。 最近の数年において、これらの問題は、一部分、組み換え［ｌＮＡ方法を、バク テリア、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）において、例えば、抗原結合能力を もつ抗体および抗体の断片の分離および産生に適用することによって提出された 。 永久分裂能を与えられた細胞を「工場」としての細菌細胞で単に置き換えること によって、大量の結合性分子を調製する方法がかなり簡素化される。さらに、組 み換え産生糸は注文通りの抗体およびその断片を産生ずる機会を可能とする０例 えば、結合およびエフェクター機能の新しい組み合わせをもつキメラ分子、ヒト 化抗体（例えば、ヒトの一定のドメインと組み合わせたネズミ可変領域またはヒ トＰＲにグラフトしたネズミ抗体のＣＤＲ）および新規な抗原結合性分子を製造 することが可能である。さらに、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｓａｉ ｋｉ、Ｒ，に、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９，４８７−４９０１９８８）を使用 して細胞（例えば、ハイブリドーマおよびＢ細胞）から抗体産生配列を分離する ことは、特異性を分離することができるタイムスケールをスピードアップする、 大きい可能性を有する。増幅されたＶＨおよびνＬ遺伝子は、細菌または哺乳動 物細胞の中での発現のために、ベクターの中にクローニングされる（Ｏｒｌａｎ ｄｉ、Ｒ，ら、１９８９．　Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、ＵＳＡ、　８６．３８３３−３８３７；ＷａｒｄＥ、Ｓ 、ら、１９８９　前掲；　Ｌａｒｒｉｃｋ。 ＪＪ、ら、１９８９．　Ｂｔｏｃｈｅｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ　、Ｇｏ ｍｓ、　１６０＋　１２５０−１２５５　；ｓａｓ　ｔｒｙ@。 Ｌ、ら、１９８９．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６．５ ７２８−５７３２）　、次いで、細菌から分泌された可溶性抗体断片を結合活性 についてスクリーニングする。 しかしながら、永久分裂能を与えられた細胞に基づく産生糸と同様に、組み換え 産生糸は、なお、前述の選択の問題に悩まされ、したがって所望の特異性をもつ 細胞の産生を増加するために動物の免疫化に顧る。さらに、これらの技術のいく つかはスクリーニングの問題を一層悪くする０例えば、大きなＨおよびＬ鎖のラ イブラリーが免疫化されたマウスから形成され、そしてスクリーニングに先立っ てランダム組み合わせ法で一緒に組み合わせされた（Ｈｕｓｅ、Ｗ、Ｄ、ら、１ ９８９．５ｃｅｎｃｅ　２４６，１２７５−１２８１．ＷＯ９０／１４４４３； ［９０／１４４２４および一０９０／１４４３０　）　、　Ｌかしながら、きわ めて重大なことには、各細胞内に保持された情報、すなわち、１つのＬｌｌｊと １つのＨ饋とのもとの対形成は損失される。これは、動物において免疫化のプロ トコルを使用することによって獲得される利点のいくつかを失う。現在、単一の ＶＨドメインから誘導されたライブラリーのみがこの欠点に悩まされない（ｄＡ ｂｓＨＷａｒｄ、Ｅ、Ｓ、　ら、１９８９．前掲）、シかしながら、すべての抗 体のＶＨドメインが抗原と結合することができるわけではないので、より多くを スクリーニングしなくてはならない、さらに、原核生物において多数の異なる特 異性を直接スクリーニングする問題を解決することが残っている。 こうして、上記のまたは他の問題の１または２以上を軽減または克服するスクリ ーニング系が必要とされている。理想的な系は、非常に多数の特異性（例えば、 １０＠またはそれより高い）のサンプリング、各クローニングラウンドにおける 急速な分別、および産生プロセスの１つの段階から次の段階への結合性分子をコ ードする遺伝学的物質の急速な転移を可能とするであろう。 このタイプのスクリーニングのための最も魅力的な候補は、それらの表面に機能 的ドメイン、例えば、抗体、レセプター、酵素などを発現および表示する原核生 物（それらは急速に増殖し、操作が比較的簡単であり、そして多数のクローンを つくることができるので）であろう、英国特許第ＧＢ２１２７６３１　Ｂ号にお いて、単一の宿主細胞の中で免疫グロブリンの可変ＨおよびＬ鎖の遺伝子を同時 に発現する方法が開示された。しかしながら、タンパク質は細胞内に発現され、 そして不溶性であった。さらに、タンパク質は結合活性をもつ抗体断片を発生さ せるために広範なプロセシングを必要とし、そしてこれはこの濃度において抗体 断片に期待される結合活性の一部分のみをもつ物質を発生した。抗体断片は適当 なシグナルペプチドを用いて細菌の膜を通して分泌させることができ（Ｓｋｅｒ ｒａ、Ａ、およびＰｌｕｃｋｔｂｕｎ、Ａ、１９８Ｂ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０ １０３８−１０４０；　Ｂｅｔｔｅｒ、Ｍ、ら、１９８８゜５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４０＋１０４１−１０４３　）その結果抗体断片の結合活性を増加することがで きることは、既に示されている。これらの方法は、マウスのモノクローナル抗体 と同一方法において、個々のクローンを結合活性についてスクリーニングするこ とを必要とする。 しかしながら、機能的結合ドメイン、例えば、抗体、抗体断片、レセプター、酵 素などが、例えば、その抗原結合性質のサンプリングおよび所望の性質をもつク ローンの選択を可能とする配置で、細画表面に保持することができる方法が示さ れていない、多くの場合において、これは、細菌表面が複雑な構造であり、そし てグラム陰性微生物において、位置をさらに複雑にする外壁が存在するためであ る。さらに、細菌またはバクテリオファージの表面タンパク質との融合体として 発現されるとき、例えば、抗体ドメインが正しくフォルディングするであろうこ とが示されていない。 バクテリオファージは、このタイプのスクリーニングに魅力的な原核生物関連生 物体である。一般に、それらの表面は比較的簡単な構造であり、それらは容易に 多数に増殖することができ、それらは多数の潜在的大量スクリーニングのプログ ラムに関する実際の取り扱いに適合し、そしてそれらは小さい、簡単なパッケー ジ内にそれら自身の遺伝情報を有する。困難なことは、この方法でバクテリオフ ァージをいかに使用するかという問題と実際に解決することであった。ジェネソ クス・コーポレーシヨン（Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の特許出願第 １１０８８１０６６３０号はバクテリオファージラムダが抗体分子の発現に適当 なベヒクルであろうことを提案したが、それらは一般的アイデアを実施を可能に する教示を提供していない０例えば、ＷＯ３８１０６６３０は次の事実を実証し ていない：配列が（ａ）遺伝子Ｖとの融合体として発現されていること；　（ｂ ）ラムダの表面上で発現されていること；および（Ｃ）タンパク質が生物学的活 性を保持するように発現されていること、さらに、適当な融合体についてスクリ ーニングする方法が教示されていない、また、ラムダのヴイリオンは細胞内でア センブリングされるので、融合タンパク質は細胞内に発現され、そして不活性で あることが予測されるであろう、　Ｂａ５ｓらは、１９９０年１２月において（ この出願の最も早い優先権８後）フィラメント状バクテリオファージＭ１３の遺 伝子ＩＩＩの一部分の除去およびこの遺伝子のＮ末端部位中へのヒト成長ホルモ ン（ｈＧＨ）のコード配列の挿入を記載している０Ｍ１３により発現された成長 ホルモンは機能的であることが示された。　（Ｂａｓｓ、Ｓ、ら、Ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ、５ｔｒｕｃｔｕｒｅ＋Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　（ １９９０）　影３０９−３１４）　＊この融合体が発現されるとき、遺伝子ＩＩ Ｉの機能的コピーも、さらに常に存在した。 プロティン・エンジニアリング・コーポレーシヨン（ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の特許出［１１０９０１０２８０９号 は、ウシ膵臓トリプシン阻害因子（ＢＰＴＩ）をｌ’ｌ１３の遺伝子ＩＩＩの中 に挿入することを提案している。しかしながら、この提案は機能することが示さ れていない０例えば、タンパク質Ｖｌｌｌとの融合体としてのＢＰＴＩ配列の発 現およびＭ１３の表面上の表示の証明が存在しない、さらに、この特許出願が教 示するように、遺伝子ＩＩＩと共に融合体を作るとき、多少の非変更の遺伝子Ｉ ＩＩタンパク質が存在するように遺伝子ＩＩＩの第２合成コピーを必要とする。 この出願の実施態様はこれを実施していない、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ ）がＭ１３ＫＯ７遺伝子ＩＩＩの欠失ファージでレスキューされる１１＄Ｉｌに おいて、非変更の遺伝子ＩＩＩは存在しない。 ＷＯ９０１０２８０９がさらに教示するように、Ｍ１３の全ゲノムを含有せずそ してヘルパーファージとの同時感染によるレスキューを必要とするファージミド は、同時感染が組み換えを導くことがあるので、これらの目的に不適当である。 この出願がファージミドを使用したすべてのＢ様において、ヘルパーファージが 使用され、そしてファージミドの中のフィラメント状バクテリオファージから誘 導された配列のみが複製起点および遺伝子ＩＮ配列である。 ＷＯ９０１０２８０９がさらに教示するように、それらの方法は、出発分子のヌ クレオチド配列およびその３次元の構造のごとき情報を必要とした。結合構成員 （例えば、ここに記載するような）について選択するための結合分子の前辺て存 在するレパートリ−の使用、例えば、動物の免疫グロブリン遺伝子の使用は、開 示されていない。さらに、改良された分子の発生を促進しがっ不都合な変動を防 止するために、変動の天然ブロック、例えば、免疫グロブリンのＣＤＨにおいて 、それらの結合分子の多様性を好適にすることを開示されていない。 前述の特許（賀０８８１０６６３０および−０９０１０２８０９）の各々におい て、表示のために提案されたタンパク質は単一のポリペプチド鎖である。 一方のモノマーをキャプシドタンパク質との融合体としてかつ他方のタンパク質 を遊離の形態で発現することによって、ダイマーの分子を表示する方法の開示は 存在しない。 １９９１年５月（この出願の最も早い優先権８後）に発行された他の開示は、抗 体のＦａｂ部分の２つの鎖の一方のためのコード配列を６１３の遺伝子ｖｍの中 に挿入すると同時に、他方をプラスミドがら同時発現することを記載している。 ２つの鎖はファージの表面上の機能的Ｆａｂ断片として発現されると証明された ０［ａｎｇ＋Ａ−５−ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　８８　ｐ４３６３−４３６６　）　、遺伝子ＶＩＩＩ　Ｏ中への挿入 部位およびファージに対してよりむしろ抗体のしＩＩに対して特異的である試薬 を使用したＥＬＩＳＡにょるｐＡｂ結合活性についてのアッセイは開示されてい ない、　１９９１年３月（この出願の最も早い優先権８後）に発行された他の開 示は、エイズウィルスのタンパク質ｇａｇをバクテリオファージｆｄの遺伝子Ｉ ＩＩのＮ末端部分の中に挿入することを開示している０ｇａタンパク質断片の発 現は免疫学的方法により検出されたが、タンパク質が機能的形態で発現されたが 否かはを示されていない（τｓｕｎｅｔｓｕｇｕ−Ｙｏｋｏｔａら（１９９１） 　Ｇｅｎｅ　９９　ｐ２６１−２６５）。 この方法においてバクテリオファージをいかに使用するがという問題は、事実、 困難な問題である。タンパク質は、ファージの中に、ファージの皮膜の一体性が 傷付けられないように挿入しなくてはならず、そしてタンパク質それ自体は抗原 の結合に関してその生物学的活性が機能的に保持されるべきである。こうして、 選択したタンパク質が抗体である場合、それは効率よくかつ正しくフォルディン グし、そして抗原の結合のために提示されるべきである。抗体分子および断片に ついての問題を解決することは、また、特異的結合対の構成員、例えば、レセプ ター分子および酵素である、任意の生物学的分子のための一般的方法を提供する であろう。 驚くべきことには、大きな生物学的に機能的な結合分子（例えば、抗体断片、お よび酵素およびレセプター）をその表面に発現そして表示し、そして無傷であり 且つ感染性のままであるバクテリオファージを構成することを本発明者は可能に した０本出願人は、ウィルス粒子およびそのウィルス表面に表示された結合分子 を含んでなる構造を「パッケージ」と呼んでいる。結合分子が抗体、抗体の誘導 体または断片、または免疫グロブリンのドメインに対して相同性であるドメイン である場合、発明者はそのパッケージを「ファージ抗体Ｊ　（ｐＡｂ）と呼ぶ、 しかしながら、文朦がそれ以外を要求する場合を除外して、用語ファージ抗体を 一般的に使用する場合、それはウィルス粒子および該ウィルスの表面に表示され た生物学的に機能的な結合分子を含んでなる任意のパッケージに言及しているも のとして解釈すべきである。 ｐＡｂは、抗原結合活性をコードする抗体遺伝子を選択するとき、ある範囲の応 用を有する０例えば、ｐａｂはハイブリドーマのクローニングおよびレスキュー のために（Ｏｒｌａｎｄｉ、　Ｒ，ら、（１９８９）　ＰＮＡＳ　８６ｐ３８３ ３−３８３７）　、および大きな組み合わせライブラリーのスクリーニングにお いて（例えば、Ｈｏ５ｅＪ、Ｄ、　ら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１ ２７５−１２８１に見いだされる）使用することができる。とくに、ｐａｂを使 用する選択のラウンドはより高い親和性の抗体を後者のライブラリーからレスキ ューすることを助けることができる。抗原選択された細胞から誘導された小さい ライブラリー（Ｃａｓｌｊ、Ｐ、ら、（１９８６）Ｓｃｅｉｎｃｅ２３４　ｐ４ ７６−４７９）をスクリーニングして抗体のＦｖ領領域含んでなるもとのＶＨ／ ＶＬ対をレスキューすることが好ましい、　ｐａｂの使用はまた、完全合成抗体 の作製を可能とする。さらに、多少の合成配列、例えば、ＣＤＲ１および多少の 天然由来配列を有する抗体をつくることができる０例えば、■−遺伝子のレパー トリ−は、再配列されていないＶ遺伝子をＤおよびＪセグメントと組み合わせる ことによって試験管内で作ることができるであろう０次いで、ｐＡｂのライブラ リーを抗原への結合により選択し、試験管内で抗原結合ループまたは■ドメイン のフレームワーク領域において超突然変異しくｈｙｐｅｒ曽ｕ　ｔａ　ｔｅ）、 そして遺灰および変異原の更なるラウンドにかけることができるであろう。 前述したように、別々のＨおよびＬ鎖のライブラリーは鎖の間のもとの対形成を 損失している。ＨおよびＬ［のとくに有利な組み合わせについて十分に大きいラ イブラリーを作りそしてスクリーニングすることは困難である。 例えば、マウスにおいて、はぼ１０’の可能なＨ［および１ｏ）の可能なＬｌｌ が存在する。したがって、ＨおよびＬｆｆｌの１０”の可能な組み合わせが存在 し、そしてこの数の組み合わせについて試験するためには、約１０目のクローン のライブラリーを作り且っスクリーニングしな（ではならないであろう、これは 従来実際に可能ではなかった。 本発明は、この問題を軽減する多数のアプローチを提供する。 第１のアプローチ（ランダム組み合わせのアプローチ、実施例２゜および２１を 参照のこと）において、できるだけ多くの１０”の潜在的組み合わせを発現する 、実際に可能なできるだけ大きいライブラリーを作る。しかしながら、ファージ の表面上のＨおよびＬｉ［の発現のおかげで、所望の組み合わせを、すべての発 生した組み合わせから、親和性技術により選択することが合理的に実施可能であ る（選択のフォーマントの記載について後記参照のこと）。 第２のアプローチ（本発明者は２重組み合わせのアプローチと呼ぶ、実施例２６ を参照のこと）において、大きいライブラリーを所望の組み合わせの選択のため に２つの小さいライブラリーから作る。 これは問題点を更に軽減する。このアプローチは次のライブラリーをつくること を包含する：例えば、第１ライブラリー、例えば、テトラサイクリンに対して耐 性であるバクテリオファージ上に表示される例えば１０７のＨｌｌｔ（遺伝子Ｉ ＩＩによりコードされるタンパク質出の融合体として）の第一ライブラリ−；お よび（ｊ）例えば１０’のし鎖の第２ライブラリー（ここで、これらのＬｍのた めのコード配列は、例えば、アンピシリン（すなわち、異なる抗生物質）に対し て耐性であるバクテリオファージ（ファージミド〕の複製起点を含有するプラス ミドベクター内にあり、そして宿主細菌のペリプラズム空間に発現される）６次 いで、第１ライブラリーを使用して第２ライブラリーを含有する細菌を感染させ て、細菌の上澄み液の中の生ずるファージの表面上にＨおよびＬ鎖の１０４の組 み合わせを得る。 このアプローチの利点は、例えば、１０？の２つの別々のライブラリーを作って １０１４の組み合わせを産生ずることである。１０フのライブラリーをつくるこ とは実際に可能である。 次いで、１０′４の組み合わせをこの出願により開示するように選択にかける（ 後の選択のフォーマットの説明を参照のこと）。次いで、この選択は、所望の特 異性を有するＨおよびＬ鎖の特定の組み合わせを表示するファージの集団を産生 ずるであろう、しかしながら、選択されたファージは対になったＨおよびＬＨの 一方の相手（ファージまたはファージミドに由来する）をコードするＤＮＡを含 有するだけである。次いで、この集団を含有する試料の溶出液を２つの部分に分 割する。第１部分を、例えば、テトラサイクリンプレート上で増殖させて、所望 の抗原結合に関係するＨ鎖をコードするＤＮＡを含有するバクテリオファージを 選択する。第２部分を、例えば、アンピシリンプレート上で増殖させて、所望の 抗原結合に関係するし鎖をコードするファージミドのＤＮＡを含有するバクテリ オファージを選択する０次いで、個々に分離したクローンから、例えば、テトラ サイクリンのプレートからの１組のコロニーを使用して、例えば、アンピシリン のプレートからの特異的コロニーに感染させる。これはＨおよびＬｔＪｉの特定 の組み合わせを発現するバクテリオファージを生じ、次いでこれを抗原の結合に ついてアッセイすることができる。 第３のアプローチ（発明者は階層的（ｈｊｓｒａｒｃｈｉｃａｌ）　２重組み合 わせのアプローチと呼ぶ）において、抗生物質のプレート上で増殖させることに よって選択したＨまたはＬＨのクローンからの個々のコロニーを使用して、他の Ｉ（）（またはＬ）をコードするクローンの完全なライブラリーを感染させる。 これは最も好適な組み合わせの分離のために好ましい。 第４のアプローチ（発明者は階層的アプローチと呼ぶ、実施例２２および４６を 参照のこと）において、両者の鎖を同一ベクターの中にクローニングする。しか しながら、所望の性質を有することが既に知られている鎖の１つを固定して保持 する。相補的鎖のライブラリーを同一ベクターの中に挿入する。バクテリオファ ージの表面の表示後に、固定した鎖のために適当な相手を選択する。 第５のアプローチ（実施例４８を参照のこと）において、もとの対の回復の機会 を改良するために、所望の抗原への結合について選択されたＢ−リンパ球の小さ いＢ集団を使用することによって、組み合わせライブラリーの複雑さを減少する ことができる。細胞は１つのファージ上の表示のための抗体の遺伝子のライブラ リーをｕｊｉ製するために、例えば、■［ｌＮＡまたはＤＮＡを提供する。この 技術は、抗体の特異性を選択する前述の４つのアプローチと組み合わせて使用す ることができる。 ファージミドは前述した。出願人は、多くの場合において、ファージミドは、免 疫レパートリ−のより包括的なライブラリーを発生させるために使用が容易であ るので、抗体のクローニングのためのファージより好ましいことを認識しそして 実証した。なぜなら、ファージミドのＤＮＡは細菌を形質転換するときバクテリ オファージのＤＮＡよりほぼ１００倍効率よいからである（実施例１９を参照の こと）。 また、ファージミドを使用すると、バクテリオファージの表面上に表示される遺 伝子ＩＩＩ結合性分子の融合タンパク質の数を変化させることができる（実施例 １７を参照のこと）、例えば、遺伝子ＩＩＩ融合融合タンパクコードするファー ジミドを含存しそしてヘルパーファージで感染されたａｔ菌細胞を含んでなる系 において、遺伝子ＩＩＩ融合融合タンパクコ現を異なる程度に誘発すると、重感 染後の内側および外側の細菌膜の間に定められる空間の中に存在する遺伝子ＩＩ Ｉ融合タンパク質の数が決定される。これは遺伝子ＩＩＩ融合融合タンパクチ／ アセンブリングたファージにより表示される天然遺伝子ＩＩＩタンパク質の比を 決定する。 ヴイリオン当り単一の融合タンパク質の発現は、「結合活性」（ａｖｉｄｔｔｙ ）効果を回避することによって、親和性を基準とする抗体特異性の選択を助ける 。ここで、結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）効果とは、低い親和性の抗体の２コピー を発現するファージはより高い親和性の１コピーを発現するファージと同一の見 掛けの親和性を有することをいう、しかしながら、幾つかの場合には、ファージ ミドを含有する細胞の重感染により誘導されるすべての遺伝子１１１分子を表示 して融合を得ることは重要であろう（例えば、低い親和結合性の分子を選択する か、あるいはＩ！ＬＩＳＡへの感受性を改良するため）、これを実施する１つの 方法は欠陥のある遺伝子ＩＩＩを含有するバクテリオファージで重感染すること である。したがって、出願人は遺伝子ＩＩＩが欠失したファージを開発しそして 使用した。これは完全に新規である。 機能的抗原結合性ドメインをファージの表面上に表示することができるという証 明は、新規な抗体の作製を越えた含蓄を有する０例えば、他のタンパク質ドメイ ンをファージの表面で表示することができれば、ファージのベクターを使用して 、表示されたタンパク質の結合性により遺伝子をクローニングし、そして選択す ることができるであろう、さらに、タンパク質の表面の中に構築されたエピトー プライブラリーを包含する、タンパク質の変異型をつくり、そして結合活性につ いて容易に選択することができるであろう。事実、他のタンパク質の人工構築物 は「新規な」抗体として働くことができるであろう。 この技術は、抗原の結合ループがその上にフォルディングする構造フレームワー クの利点を用いて第１原理から抗体を構築する可能性を提供する。一般に、これ らのループは、択一的なループの組み合わせによりかつ多様な側鎖により、種々 の結合部位を発生する限られた数のコンフォメーシテンを有する。抗原結合部位 のモデル化における最近成功は新規な設計をよく予言する。いずれの場合におい ても、抗原の高い分解能構造が必要とされる。しかしながら、このアプローチは 、例えば、とくに小さい基質のための、触媒的抗体を作るために魅力的である。 ここで、基質の過渡状態に選択的に結合するばかりでなく、結合の形成または破 壊に直接に参加するように、側鎖または補欠分子後のための結合部位が導入され る。唯一の問題は、結合のために特殊化された抗体の人工構築物が触媒の作製の ために最もよい出発点であるかどうがである。真性の酵素の人工構築物、例えば 、トリオースホスフェートイソメラーゼ（ＴＩＭ）のバレルはいっそう適当であ ろう、抗体に似て、７１Ｍ酵素もまた基質に結合するためにフレームワーク構造 （β−鎖およびα−らせんのバレル）およびループを存する０種々の触媒性質を もつ多数の酵素はこの人工構築物に基づき、そしてループは新しい触媒性質およ び結合性質の設計のためにフレームワーク上で独立に操作することができる０本 発明の開示により提供されるようなファージ選択系を使用して抗原結合活性につ いて選択し、そしてこうして選択されたＣＤＩ？ループを抗体のフレームワーク または７１Ｍバレルフレームワーク上で使用することができる０例えば、７１Ｍ バレルフレームワーク上に配置されたループは、さらに、突然変異誘発により修 飾し、そしてさらに選択にかけることができる。こうして、単一の工程において 親和性結合活性について選択する必要がない、低親和性を高親和性に進化させる 免疫系の方法はいっそう現実的であり、そして本発明を使用して模倣することが できる。 このタイプの応用において有用でありうる分子の１つのクラスはレセプターであ る０例えば、特異的レセプターをファージの表面上で表示し、こうしてそれがそ のリガンドに結合するようにすることができる０次いで、レセプターを、例えば 、試験管内突然変異誘発により修飾し、そしてリガンドについてより高い結合親 和性を有する変異型を選択することができる。この選択は第２図（とくにｐＡｂ について言及する）を参照して後述するフォーマットの１または２以上に従い実 施することができ、ここではｐＡｂ抗体がファージのレセプターにより置き換え されており、そして抗原がリガンド１により置き換えられている。 あるいは、ファージ−レセプターをリガンド、変更されたリガンドまたは潜在的 薬物の候補の結合のための迅速なスクリーニング系の基礎として使用することが できる。この系の利点、すなわち、簡単なりローニング、便利な発現、標準的試 薬および容易な取り扱いの利点は、薬物のスクリーニングへの応用をとくに魅力 的とする。 この検討の文魔において、レセプターは特異的リガンドまたは特異的リガンドの 群に結合する分子を意味する。天然のレセプターは細胞集団の表面上で発現され ることができるか、あるいはそれはこのような分子の細胞外ドメイン（このよう な形態が自然に存在するが否かにかかわらず）、あるいは血漿の中で、あるいは 細胞または生物体内で、天然の結合機能的をはたす可溶性分子である。 他の可能性はファージの表面上の酵素分子または活性部位の表示である（実施例 １１．１２．３０．３１．３２および３６を参照のこと）、いったんファージの 酵素が発現されると、それはアフィニティークロマトグラフィー、例えば、過渡 状態の類似体で誘導体化されたカラム上のアフィニティークロマトグラフィーに より選択することができる。異なるまたは修飾された酵素を望む場合、バクテリ オファージ上で融合体として表示される酵素を変異させ、次いで所望の修飾され た特異性をもつ酵素についてより高い親和性を有するように選択された類似体で 誘導体化されたカラムで選択することが可能である。 この発明を通じて、ｐＡｂのより高い親和性の変異型についてのアニーリングの 可能性を論するが、認識されるように、ある応用、例えば、低い親和性のクロマ トグラフィ（Ｏｈｌｓｏｎ、Ｓ、ら、Ａｎａｌｙｔ。 Ｂｉｏｃｈｅ−、１６９，ｐ２０４−２０８（１９８８））において、より低い 親和性の変異型を分離することが望ましいことがある。 実施例２１および２３が示すように、本発明は低い親和性（−次免疫応答または 非免疫化動物において見られるような）をもつ抗体を製造する方法を提供する。 これは、遺伝子ＩＩＩタンパク質と関連してファージの表面上に抗体の多数のコ ピーを表示することによって可能にされる。こうして、ｐＡｂはこれらの抗体の ための遺伝子を単離しそして、必要に応じて、突然変異させて改良された抗体を 得ることを可能とする。 １）Ａｂはまた、改良された安定性について抗体の選択を可能とする。 多数の抗体について、抗体を３７℃よりむしろ３０”Ｃにおいて発現させるとき 、収量および安定性が改良されることが認められた。　ｐＡｂが３７℃において 表示される場合、安定性であるもののみが親和性の選択に利用可能であろう、抗 体を生体内で治療または診断の目的で使用すべきとき、増加した安定性が循環に おいて抗体の半減期を延長するであろう。 安定性はファージを使用して選択したすべての抗体および抗体のドメインにとっ て重要であるが、それはＶＨおよびＶＬ断片の非共有結合的会合により形成され るＦｖ断片の選択についてとくに重要である。 Ｆｖ断片は解離する傾向を有し、そして全抗体と比較して循環において非常に減 少した半減期を有する。　Ｆｖ断片は、可溶性断片として発現された相補的鎖と 遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質として発現された１つの鎖との会合により、ファー ジの表面上に表示される。ｉＩの対が解離する高い傾向を有する場合、それらは ｐａｂとして選択される可能性が非常に低いであろう、したがって、集団は安定 に会合する対について濃縮されるであろう、解離はＦａｂ断片については問題が 少ないが、選択はまた安定に会合するＦａｂ断片について起こるであろう、　ｐ Ａｂはプロテアーゼの攻撃に対する選択を可能とし、プロテアーゼにより切断さ れないｐＡｂのみがそれらのリガンドに結合することができ、したがってファー ジの集団は安定な抗体ドメインを表示するものについて濃縮されるであろう。 ファージ表面上で結合性分子を表示する技術はまた、−次クローニング系として 使用することができる０例えば、ｃＤＮＡライブラリーを構成し、バクテリオフ ァージの中に挿入し、そしてこのファージのライブラリーをリガンドと結合する 能力についてスクリーニングすることができる。リガンド／結合性分子の組み合 わせは、他の分子に特異的に結合する能力を有する分子の任意の対、例えば、レ セプター／リガンド、酵素／基質（または類似体）、核酸結合性タンパク質／核 酸などを包含することができる。相補的対の１つの構成員が利用可能である場合 、これはその対の他の構成員のためのクローンを分離する好ましい方法であろう 。 ファージ上のそれらのタンパク質の表示についてクローニングされる遺伝子の集 団の多様性を増加するか、あるいは個々のヌクレオチド配列を変異させることは 、しばしば必要である。試験管内または生体内の突然変異誘発をいずれの目的に も使用することができるが、とくに適当な方法はミニーチーター株を使用するこ とである。 ミューチーター株は、その中で複製されたＤＮＡをその親のＤＮＡに間して突然 変異させる遺伝学的欠陥を含有する菌株である。それゆえ遺伝子の集団が遺伝子 ＩＩＩ融合体として導入される場合、それはさらに多様性とされ、次いで、必要 に応して、表示および選択のために、非ミューチーター菌株に転移することがで きる。実施例３８はファージの抗体とともにミューチーター菌株を使用すること を包含する（試験管内の突然変異誘発およびファージ抗体の選択の例は実施例４ ５に記載されている）。 −−・　ド゛　−の 応用の有用なかつ新規な組は、ファージ上の結合性タンパク質を使用して、ファ ージのゲノムを特定の細胞または細胞の群にターゲツティングする０例えば、細 胞表面分子に対して特異的なｐＡｂを使用して、該表面分子を経て標的細胞に結 合させることができる０次いで、ファージを、レセプターそれ自体の作用を通し て、あるいは他の事象（例えば、電気放電、例えば、エレクトロボレイシッンの 技術において）の結果として、内部に入れることができる０次いで、関係するコ ントロールシグナル（転写およ、び翻訳および可能ならば複製のための）が存在 する場合、ファージのゲノムは発現されるであろう、ファージのゲノムが標的細 胞においてその発現をのぞむ配列を含有する（適当な発現コントロール配列と一 緒に）場合、これはとくに有用である。有用な配列は、受容細胞に抗生物質耐性 を与えるか、あるいはその産生物の発現によりその細胞を標識する（例えば、配 列が検出可能な遺伝子産生物、例えば、ルシフェラーゼを発現する場合、参照、 Ｗｈｉｔｅ＋Ｍ−ら、丁ｅｃｈｎｉｇｕｅｓ２（４）　＋　ｐ１９４−２０１（ １９９０）　）か、あるいは標的細胞に特定の性質を与える（例えば、標的細胞 が腫瘍細胞であり、そして新しい配列が腫瘍抑制遺伝子の発現を指令する場合） か、あるいは標的細胞の中の遺伝子または遺伝子の組をターンオフするように設 計されたアンチセンス構成体、あるいは標的細胞に対して毒性であるように設計 した遺伝子または遺伝子産生物を発現することができる。 あるいは、標的細胞においてその発現を望む配列をファージミド上にコードする ことができる０次いで、ファージミドＤＮＡを、細胞表面のレセプターに対して 特異的な抗体を表示するファージの中に組み込むことができる０例えば、組み込 みは、標的細胞に対して特異的な抗体断片をコードするゲノムをもつヘルパーフ ァージにより、ファージミドを含有する細菌を重感染することによって行うこと ができる０次いで、パッケージを使用してファージミドを標的細胞に向ける。 「ターゲツティングの転移」のこの技術ば、研究並びにさらに治療および診断に おいて多数の用途を有する０例えば、遺伝子治療は、しばしば、その活性を欠如 する特定の細胞型に置換遺伝子をターゲツティングすることを目的とする。ター ゲツティングｐＡｂはこれを達成する手段を提供する。 診断において、特定の細菌または細菌群に対して特異的なファージは、マーカー 遺伝子を、例えばルシフェラーゼを細菌宿主にターゲツティングするために使用 されてきている（例えば、Ｕ１ｉｔｚｅｒ＋Ｓ。 およびＫｕｈｎ、　Ｊ、　、　ＥＰＡ８５３０３９１３Ｊを参照のこと）、ファ ージの宿主範囲が適当である場合、被験細菌のみがファージにより感染され、ル シフェラーゼ遺伝子を発現し、そしてそれらが放射する光により検出することが できる。この系はサルモネラ属（Ｓａｌｓｏｎｅｌｌａ）の存在を検出するため に使用されている。このアプローチを使用するときの１つの主要な問題は、正し い宿主範囲をもつバクテリオファージの初期の分離および引き続くルシフェラー ゼ遺伝子のカセットをそのファージの中にクローニングして、それを機能的とす ることである。 ｐＡｂ系はルシフェラーゼのカセットをよく特性決定された系（フィラメント状 ファージ）の中にクローニングさせ、そしてｐＡｂがコードする抗体（または他 の結合性分子）の特異性を修飾することによって、適当な宿主範囲の簡単な選択 を可能とする。 本発明においてはまた、これらの複製可能な遺伝学的表示パッケージ、例えばｐ Ａｂ　、の独特の性質に依存する、新規な選択系およびアッセイのフォーマット を開発することができた。 ■ この節において論する用語のほとんどは、適当な場合、この明細書中で述べられ ている。 豊且煎菫金対 これは天然に由来するか、あるいは合成的に産生される分子の対（各々は特異的 結合対の構成員である）を記載する。この分子の対の一方は、その表面上にある 区域、あるいは特異的に結合するキャビティーを有し、したがって他方の分子の 特定の空間的および極性的組織との相補的であるとして定義され、従ってこの対 は互いに特異的に結合する性質を存する。特異的結合対の型の例は、抗原−抗体 、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、レセプター−リガンド 、酵素−基質、■ｇＧ−プロティンＡである。 マルチマーの これは、ポリペプチドが遊離の形態でおよび／または基質の表面上に発現される とき、少なくとも１つの第２ポリペプチドと会合する第１ポリペプチドを記載す る。基質はバクテリオファージにより提供されることができる。２つの会合する ポリペプチドが存在する場合、会合したポリペプチド複合体は２量体（ダイマー ）であり、３つ存在する場合は３量体（トリマー）である、２量体（ダイマー） 、トリマー、マルチマーなどまたはマルチマーの構成員は特異的結合対の構成員 からなることができる。 マルチマーの構成員の例は、免疫グロブリン分子に基づくヘビードメイン、免疫 グロブリン分子に基づくライトドメイン、Ｔ細胞レセプターのサブユニットであ る。 複里月ｒな゛　云　７パツ　−ジ（ｒｄＰ）これは、複製する能力を粒子に提供 する遺伝情報を有する生物学的粒子を記載する。この粒子はその表面上にポリペ プチドの少なくとも一部分を表示することができる。このポリペプチドはこの粒 子に対して生来的な遺伝情報によりコードされることができそして／またはこの 粒子の中にもしくはその祖先の中に人工的に配置されることができる０表示され たポリペプチドは特異的結合対の任意の構成員、例えば、免疫グロブリン分子に 基づくヘビー鎖もしくはライト鎮のドメイン、酵素またはレセプターなどである ことができる。 この粒子はウィルス、例えば、バクテリオファージ、例えば、ｆｄまたはＭ１３ であることができる。 バヱ欠二ノ これは、粒子がその表面に特異的結合対の構成員を表示している、複製可能な遺 伝的表示パッケージを記載する。このパッケージは、その表面に抗原結合ドメイ ンを表示するバクテリオファージであることができる。このタイプのパッケージ はファージ抗体（ｐＡｂ）と呼ばれた。 抜止 これは、天然に産生されるかまたは部分的にもしくは完全に合成的に産生される かどうかにかかわらず、免疫グロブリンを記載する。 この用語は、また、免疫グロブリンの結合ドメインに対して相同的である結合ド メインを有する任意のタンパク質を包含する。これらのタンパク質は天然源に由 来することができるか、あるいは部分的または完全に合成的に産生ずることがで きる。 抗体の例は免疫グロブリンのアイソタイプおよびＦａｂ、　Ｆ（ａｂ’　）ｚ。 ５ｃＰｖ、　Ｆｖ、　ｄＡｂ、　Ｆｄ断片である。 ｍロブ１ンのスーパーフしＬ婁二 これはポリペプチドのファミリーを記載し、その構成員は免疫グロブリン分子の 可変ドメインまたは定常ドメインの構造に関係する構造をもつ少なくとも１つの ドメインを有する。このドメインは２つのβ−シートおよび通常保存されたジサ ルファイド結合を含有する（＾、ＦＪｉｌｌｉａｍｓおよびＡ、Ｎ、Ｂａｒｃｌ ａｙ　１９８８　Ａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、旦３８１−４０５を参照のこと）。 免疫グロブリンのスーパーファミリーの構成員の例はＣＯ４、血小板由来成長因 子レセプター（ＰＤＧＦＲ）　、細胞間付着分子（ＩＣＡＭ）である。 特記しない限り、この明細書における免疫グロブリンおよび免疫グロブリン相同 体は免疫グロブリンのスーパーファミリーおよびその相同体の構成員を包含する 。 ■異化 この用語は、それらの−次、二次および三次構造において対応する位置に同一ま たは保存された残基を有するポリペプチドを示す。 この用語はまた、相同性のポリペプチドをコードする２またはそれ以上のヌクレ オチド配列に拡張される。 相同性のペプチドの例は免疫グロブリンのアイソタイプである。 盈胤敗 ｒｇｄｐの表面上に表示されたｓｂｐ構成員に関して次のことを意味する。すな わち、ｓｂｐ構成員がフォルディングされた形態で表され、ここでその相補的ｓ ｂｐ構成員に対するその特異的結合ドメインはその天然の配置と同一であるか、 あるいは密接に類似し、これにより、それは相補的ｓｂｐ構成員に関して同様な 特異性を示す、これに関して、それは、Ｓ＋５ｉｔｂ　ら、前掲のペプチド、す なわち、明確なフォルトと異なる。 ゛　−・に　な　・ ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分に関して、これは細胞または生物体の 天然の集団の中に存在することができる多様性のみならず、試験管内または生体 内の人工的変異により作ることができる多様性をも意味する。 試験管内の変異は、例えば、変化させようとする配列のランダム変異を有するオ リゴヌクレオチドを使用する、ランダム変異誘発を包含することができる。生体 内の変異誘発は、例えば、ＤＮＡを収容するために宿主微生物のミューチーター 菌株を使用することができる（後に実施例３８を参照のこと）。 上Ｌヱｌ ドメインはそれ自体内でかつ同一タンパク質の他の部分から独立してかつ相補的 結合構成員から独立してフォルディングされるタンパク質の一部分である。 フォル−゛インクレタユニ・ト これはα−らせんおよび／またはβ−鎖および／またはβ−ターン構造の特定の 組み合わせである。ドメインおよびフォルディングされたユニットは、−次構造 において隣接しないアミノ酸を一緒にする構造を含有する。 遊夏■長履 これは、復製可能な遺伝的表示パフケージにより表示されないポリペプチドの状 態を記載する。 ・に　の　る これは、１組の条件下に特定のポリペプチドを発現しないが、他の組の条件下に それを発現する遺伝子を記載する。１つの例は、それぞれ、非抑制的宿主または 抑制的宿主において発現されたアンバー突然変異を含有する遺伝子である。 あるいは、遺伝子は、１組の条件下に欠陥があるが、他の組の条件下にそうでは ないタンパク質を発現することができる。１つの例は温度感受性突然変異をもつ 遺伝子である。 コ゛ン これは１岨の条件下にそのコドンの下流のヌクレオチド配列の翻訳を可能とする が、他の組の条件下に翻訳はそのコドンにおいて終わる。抑制可能な翻訳停止コ ドンの例は、アンバー、オーカーおよびオパルのコドンである。 ｌ五ニデニ久二Ｉ抹 これは、その中で複製されたＤＮＡをその親のＤＮＡに比して突然変異させる遺 伝学的欠陥を有する宿主細胞である。ミューチーター菌株の例は、ＮＲ９０４６ ｍｕｔＤ５およびＮＲ９０４６ｍｕｔＴｌである（実施例３８を参照のこと）。 ヘルパーファージ これは、欠陥のあるファージゲノムを含有する細胞の感染に使用され、そしてそ の欠陥を補足する機能をするファージである。欠陥のあるファージゲノムは、い くつかの機能をコードする遺伝子の配列が除去されたファージまたはファージミ ドであることができる。 ヘルパーファージの例は、Ｍ１３ＫＯ７，Ｍ１３ＫＯ７遺伝子１■Ｉ　ｎｏ、　 ３　；およびキャプシドタンパク質へ融合された結合分子を表示またはコードす るファージである。 二ＬＬ二 これは、遺伝子の挿入により組み換えＤＮＡ分子を構成する、宿主有生物の中で 複製することができるＤＮ八へ子である。 ヱエニ２丘Ｕ二 これは、バクテリオファージのための複製起点を含有するが、プラスミドのため のそれを含有しない、ファージゲノムの修飾により誘導されたベクターである。 フ　−ジミドのベタ　− これは、バクテリオファージの複製起点およびプラスミド由来の複製起点を含有 する、プラスミドゲノムの修飾により誘導されたベクターである。 公叉工並立 これは、ｒｇｄｐまたはｒｇｄｐ上で表示されたｓｂｐの構成員と会合する分子 を記載し、ここでｓｂｐの構成員および／または該分子はフォルディングされて おり、そしてパッケージは細胞の細胞質ゾルに対して外部でアセンブリングされ ている。 え゛れた（ｒｅａｒｒａｎｅｄ）　グロブ１ン゛　−のレバー　１−動物におい て発現される免疫グロブリン遺伝子をコードする天然ヌクレオチド、例えば、Ｄ ＮＡ配列の集まり、これらの配列は、例えば、ＨｌのＶ、ＤおよびＪセグメント 、並びに例えば、Ｌｌｌｉの■およびＪセグメントの生体内組み換えにより発生 する。あるいは、配列は細胞系から発生させることができ、この場合試験管内で 免疫化されそしてその免疫化に応答する組み換えが細胞内で起こる。 −イブーリー クローン内のヌクレオチド例えばＤＮＡ配列の集まり。 工・に　え゛れた　グロブ１ン゛　−のレパートリ−動物からの組み換えられた 免疫グロブリン配列以外の源から完全にまたは部分的に誘導されたヌクレオチド 例えばＤＮＡ配列の集まり。 これは、例えば、組み換えられていないＶセグメントとＤおよびＪセグメントと を組み合わせることによるＶｌ＋ドメインをコードする［ｌＮＡ配列、並びに■ およびＪセグメントを組み合わせることによるＶＬドメインをコードするＤＮＡ 配列を包含する。 ＤＮＡ配列の一部分またはすべてはオリゴヌクレオチドの合成により誘導するこ とができる。 ［−ダーペプチド これは、ポリペプチドのＮ末端に結合しそして細胞質ゾルの中から外へのポリペ プチドの動きを指令するアミノ酸配列である。 １限丘 これは、２つの分子の間の連鎖を破壊するために使用する溶液である。この連鎖 は１または２以上の非共有結合または共有結合であることができる。２つの分子 はｓｂｐの構成員であることができる。 豆１生 これは、選択されたｒｇｄｐ内のＤＮＡによりコードされたポリペプチドに由来 する物質である。誘導体ポリペプチドは、コードされたポリペプチドと、アミノ 酸の付加、欠失、置換または挿入により、あるいはコードされたポリペプチドへ の他の分子の連鎖により異なる。 これらの変化はヌクレオチドまたはタンパク質のレベルで作ることができる０例 えば、コードされたポリペプチドはＦａｂ断片であることができ５、次いでこの 断片を他の源からのＦｃテイルに連鎖する。 あるいは、マーカー、例えば、酵素、フルオレセインなどを、例えば、Ｆａｂ　 、　５ｃＦｖ断片に連鎖することができる。 本発明は： ａ）特異的結合対の構成員、例えば、結合分子をコードするヌクレオチド配列を ウィルスのゲノム内に挿入し、ｂ）前記結合分子がウィルスによりその表面にお いて発現および表示されるように、前記ヌクレオチド配列を含有するウィルスを 培養する、 段階を含んで成る、複製可能な遺伝的表示パッケージまたはこのようなｒｇｄｐ の集団を産生ずる方法を提供する。 本発明はまた、前述したようなｒｇｄｐの集団を産生じ、そして前記集団を特定 のエピトープと接触させ、こうして所望の特異性をもつ個々のｒｇｄｐが前記エ ピトープに結合するようにさせることによって、前記結合分子について選択する 追加の工程を含んで成る、特定のエピトープに対して特異的なｒｇｄｐを選択す る方法を提供する。この方法は次の追加の工程の１または２以上を含むことがで きる：　（ｉ）任意の結合したｒｇｄｐをエピトープから分離する；（ｉｉ）任 意の分離されたｒｇｄｐを回収する、および（ｉｔｉ）任意の分離されたｒｇｄ ｐからの挿入されたヌクレオチド配列を組み換え系において使用して、ウィルス から分離した結合分子を産生ずる０選択工程は、前記コードする核酸を含有する ウィルスの表面と会合して発現される前記結合分子により、所望の特異性をもつ 結合分子をコードするヌクレオチド配列を分離することができる。 本発明はまた、特異的結合対（ｓｂｐ）のマルチマーの構成員を製造する方法を 提供し、この方法は、組み換え宿主生物体において、分泌される複製可能な遺伝 的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分に融合された該ｓｂｐの構成員またはそ のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集団の第１ポリペプチド鎖を発現し、これに より前記ｒｇｄｐは前記ポリペプチドをパッケージの表面に表示し、そして組み 換え宿主生物体において、前記マルチマーの第２ポリペプチド饋を発現し、そし て前記ポリペプチド鎖を一緒にさせて前記マルチマーを前記ｒｇｄｐの一部分と して形成させることを含んでなり、ポリペプチド鎖の少なくとも１つはそのため の前記成分を使用してパッケージングさることができる核酸から発現され、これ により前記ｒｇｄｐの各々の遺伝物質が前記ポリペプチド鎖をコードしている。 前記鎖の両者は同一宿主の中で発現することができる。 前記マルチマーの第１および第２Ｍはそれらのそれぞれの核酸を含有する単一の ベクターから別々の鎖として発現されることができる。 前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つはファージベクターから発現させることが できる。 前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つはファージミドから発現させることができ 、前記方法はへルバーファージ、または補完するファージ遺伝子を発現するプラ スミドを使用して、前記ファージミドのゲノムのパッケージングを促進すること を包含し、そしてｒｇｄｐの前記成分はそのためのキャプシドタンパク質である 。キャプシドタンパク質はへルバーファージの中に存在しないか、欠如している か、あるいは条件的に欠如していることができる。 この方法は、前記第１ポリペプチド鎖を発現することができるベクターを前記第 ２ポリペプチド鎖を遊離の形態で発現する宿主生物体の中に導入するか、あるい は前記第２ポリペプチドを遊離の形態で発現することができるベクターを前記第 １ポリペプチド鎖を発現する宿主生物体の中に導入することを含んでなることが できる。 ポリペプチド鎖の各々は、前記成分の融合産物を使用してｒｇｄｐとしてパッケ ージングされることができる核酸から発現されることができ、これにより両者の 前記ポリペプチド鎖をコードする核酸はそれぞれのｒｇｄｐの中にパッケージン グされる。 前記第１および第２ポリペプチド饋の少なくとも１つをコードする核酸は、前記 鎮または前記鎖の変異体の集団をコードする核酸を包含する核酸のライブラリー から得られる。第１および第２のポリペプチド鎖の両者は、核酸のそれぞれの前 記ライブラリーから得ることができる。 本発明は、また、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員またはその型のｓｈｐ構成員 の遺伝学的に多様性の集団をコードする核酸を包含する核酸のライブラリーから 特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員を製造する方法を提供し、この方法は、組み換 え宿主細胞において、分泌される複製可能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ ）の成分に融合されているか、あるいは前記ｒｇｄｐの成分への融合体として発 現される前記ｓｂｐ構成員のポリペプチド成分との会合のための遊離の形態で、 前記核酸のライブラリーによりコードされたポリペプチドを発現することを含ん でなり、こうしてｒｇｄｐは前記ｓｂｐ構成員を機能的形態でパッケージの表面 に表示し、前記ライブラリーの核酸は前記ｒｇｄｐの成分を使用してパッケージ ングされることができる形態で宿主細胞内に含有され、これによりｓｂｐ構成員 を表示するｒｇｄｐの遺伝的物質は前記ｓｂｐの構成員またはそのポリペプチド 成分をコードする核酸を含有する。 ライブラリーのヌクレオチド配列は、例えば、動物の肺細胞または末梢血液のリ ンパ球から誘導することができる。あるいは、ヌクレオチド配列は存在する抗体 のコード配列の試験管内の変異誘発により誘導することができる。 本発明はまた、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員の製造方法を提供し、この方法 は、組み換え宿主細胞において、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員またはその型 のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集団をコードする核酸を発現することを含ん でなり、ここで前記または各ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分は前記ｓ ｂｐ構成員をパッケージの表面に表示する分泌される複製可能な遺伝的表示のパ ッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体として発現され、前記ｓｂｐ構成員また はそのポリペプチド成分をコードする核酸は前記ｒｇｄｐ成分を使用してパッケ ージングされることができる形態で宿主細胞内に含有され、これによって前記ｓ ｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの遺伝的物質は前記ｓｂｐ構成員またはそのポリ ペプチド成分をコードし、前記宿主生物体は、遺伝的多様性を前記ｓｂｐ構成員 の中に導入して前記混合集団を産生ずるミューチーターの菌株である。 本発明はまた、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員を製造する方法を提供し、この 方法は、組み換え宿主細胞において、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員またはそ の型のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集団をコードする核酸を発現することを 含んでなり、ここで前記または各ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分は、 前記ａｂｐ構成員をパッケージの表面に機能的な形で表示する分泌される複製可 能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体として発現され、前 記ｓｂｐ構成員またはそのボタペプチド成分をコードする核酸は前記ｒｇｄｐ成 分を使用してパフケージングされることができる形態で宿主細胞内に含有され、 これによりｓｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの遺伝的物質は前記ｓｂｐ構成員ま たはそのポリペプチド成分をコードし、前記融合体はバクテリオファージのキャ プシドタンパク質とのものであり、そしてｒｇｄｐは野生型で発現される前記キ ャプシドタンパク質の不存在下に前記融合体とともに形成される。 本発明はまた、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員を製造する方法を提供し、この 方法は、組み換え宿主細胞において、特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員またはそ の型のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集団又はそのポリペプチド成分をコード する核酸を発現することを含んでなり、ここで前記ｓｂｐ構成員またはその型の ｓｂｐ構成員分の遺伝的に多様性の集団またはそのポリペプチド成分は、前記ｓ ｂｐ構成員をパッケージの表面に機能的形で表示する分泌される複製可能な遺伝 的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体としており、前記ｓｂｐ構成 員またはそのポリペプチド成分をコードする核酸は前記ｒｇｄｐ成分を使用して パフケージングされることができる形態で宿主細胞内に含有され、これによりｓ ｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分を表示するｒｇｄｐの遺伝的物質は前記 ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードし、前記ｓｂｐ構成員または そのポリペプチド成分はキャプシド融合体としてファージミドから発現され、そ してヘルパーファージ、または補完するファージ遺伝子を発現するプラスミドを 前記キャプシド融合体と一緒に使用してファージミドの核酸をパフケージングす る。 ライブラリーまたは遺伝学的に多様性の集団は、（ｉ）相補的ｓｂｐ構成員で免 疫化された動物の組み換えられた（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）免疫グロブリンの遺 伝子のレパートリ−１（ｉｉ）相補的ｓｂｐ構成員で免疫化されていない動物の 組み換えられた免疫グロブリンの遺伝子のレパートリ−２（ｉｆ）人工的に組み 換えられた免疫グロブリンの１または２以上の遺伝子のレパートリ−１ （ｉｖ）免疫グロブリンの相同体の１または２以上の遺伝子のレパートリ−１ま たは （ｖ）前記（ｉ）、（ｊ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の任意の混合物、から得 られる。 キャプシドタンパク質はへルバーファージ中で存在しないか、欠陥があるか、又 は条件的に欠陥があることができる。 宿主細胞は、ｓｂｐ構成員の核酸の中に遺伝的多様性を導入するミューチーター 菌株であることができる。 ｓｂｐ構成員は免疫グロブリンのドメインであるか、あるいはそれに対して相同 性であるドメインを含んでなることができる。 ｒｇｄｐはバクテリオファージであることができ、宿主はバクテリアであること ができ、そしてｒｇｄｐの前記成分はバクテリオファージのためのキャプシドタ ンパク質であることができる。ファージはフィラメント状ファージであることが できる。ファージはクラス■のファージｆｄ、　Ｍ１３．　ｆｌ、　ｌｆｌ、　 Ｉｋｅ、ＺＪ／Ｚ、　ＦｆおよびクラスＨのファージＸｆ、　ＰｆｌおよびＦｆ ３から選択することができる。ファージはｆｄまたはｆｄの誘導体であることが できる。誘導体はテトラサイクリン耐性であることができる。前記ｓｂｐ構成員 またはそのポリペプチド鎖はファージｆｄの遺伝子ＩＩＩキャプシドタンパク質 または他のフィラメント状ファージ中のその相手との融合体として発現されるこ とができる。　ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド鎖は分泌リーダーペプチド の下流の成熟キャプシドタンパク質のＮ末端領域に挿入されることができる。配 列は成熟タンパク質のアミノ酸＋１の後に挿入することができる。挿入のための 部位は、挿入すべき核酸の各末端に存在する配列に相当する短い配列により挟ま れることができる。 例えば、４つのタンパク質ドメインが免疫グロブリンのドメインである場合、フ ァージの中で挿入部位は１ｇドメインの最初の５アミノ酸および最後の５アミノ 酸をコードするヌクレオチド配列により挟まれることができる。このようなフラ ンキングヌクレオチド配列は第４（２）図ＢおよびＣに示されており、ここで部 位−フランキングヌクレオチド配列はＶＨドメインのいずれかの端に存在するア ミノ酸配列ＱＶＱＬ、Ｑおよびｖｉｖｓｓ　、あるいはＦｖ（組み合わせたＶｌ ’ｌ　＋　ＶＬ　）ドメインのいずれかの端に存在するＱＶＱＬＩＩおよびＬＥ ＥＲをコードする。 挿入部位を挟むこれらの配列の各々は、第４図に示すような、適当な切断部位を 包含することができる。 あるいは、前述したように第４図（２）図ＢおよびＣに示すフランキングヌクレ オチド配列を使用して、核酸が免疫グロブリンをコードするか否かにかかわらず 、挿入すべき任意の核酸のための挿入部位を挟むために使用することができる。 宿主は大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）であることができる。 ｓｂｐ構成員のペプチドをコードする核酸は、抑制可能な翻訳停止コドンを通し てウィルスのキャプシドタンパク質に対して下流に連鎖することができる。 前述したように、本発明はまた、新規な選択系およびアッセイのフォーマットを 提供する。これらの系およびフォーマットにおいて、所望の特異性の結合分子（ 例えば、抗体）をコードする遺伝子配列は、ある範囲の特異性を有するｒｇｄｐ の一般的集団から、特定の標的（例えば、抗原またはエピトープ）に結合すると いう事実により分離される。こうして、前記発現により形成されたｒｇｄｐは、 個々のｓｂｐ構成員を提供するように、または前記ｓｂｐ構成員もしくはそのポ リペプチド鎖をコードする核酸とそれらのそれぞれのｒｇｄｐにおいて会合した 前記ｓｂｐ構成員の混合した集団を提供するように、選択またはスクリーンされ る＊　ｒｇｄｐは前記ｓｂｐ構成員に対して相補的な構成員との親和性により選 択することができる。 前記第２構成員に結合した任意のｒｇｄｐは溶離液で洗浄することによって回収 することができる。洗浄条件を変化させて、前記エピトープについて異なる結合 親和性をもつｒｇｄｐを得ることができる。あるいは、例えば、高い親和性のｒ ｇｄｐを得るために、相補的構成員（例えば、エピトープ）は結合構成員に既に 結合したｒｇｄｐの集団（例えば、ｐＡｂ　）に提示することができ、この場合 において、エピトープに対してより高い親和性をもつｐＡｂは既に結合した結合 構成員を置換するであろう、こうして、溶離液は相補的ｓｂｐ構成員への結合に ついて前記ｒｇｄｐと競争する分子を含有することができる＊　ｒｇｄｐは、前 記相補的ｓｂｐ構成員への結合について前記パッケージと競争する分子の存在下 に、前記相補的ｓｂｐ構成員に適用することができる０選択またはスクリーニン グされたｒｇｄｐに由来する核酸を使用して、組み換え宿主生物の中で前記ｓｂ ｐ構成員またはその断片または誘導体を発現することができる。ｌまたは２以上 のｒｇｄｐからの核酸を取りそして使用して、それ以上の前記方法において、コ ードする核酸を提供して、個々のｓｂｐ構成員またはｓｂｐ構成員の混合した集 団、またはそのコードする核酸を得ることができる０発現最終産生物を修飾して その誘導体を産生ずることができる。 発現最終産生物またはその誘導体を使用して、治療もしくは予防用医薬または診 断用製品を調製することができる。 本発明はまた、特異的結合対（ｓｂｐ）のある型の構成員の遺伝的に多様性の集 団をコードする断片を含んでなる核酸断片のライブラリーを収容する組み換え宿 主細胞を提供し、ここで各ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分は、分泌さ れる複製可能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体として発 現され、こうして前記ｓｂｐ構成員は前記ｒｇｄｐの表面上に機能的形態で表示 され、そして前記ｒｇｄｐの遺伝的物質は会合したｓｂｐ構成員またはそのポリ ペプチド成分をコードする。　ｓｂｐ構成員の前記型は免疫グロブリンまたは免 疫グロブリンの相同体であり、その第１ポリペプチド鎖はｒｇｄｐの成分との前 記融合体として発現され、そしてその第２ポリペプチド鎖は遊離の形態で発現さ れ、そしてｒｇｄｐＯ中の融合した第１ポリペプチド鎖と会合する。 本発明はまた、ヘルパーファージを提供し、そのゲノムはそのキャプシドタンパ ク質の１つをコードする核酸を欠如するか、あるいはそのコードする核酸は条件 的に欠陥があるか、あるいは欠陥のある形態または条件的に欠陥のある形態の前 記キャプシドタンパク質をコードしている。 本発明は、また、そのキャプシドタンパク質を欠如するフィラメント状ファージ ゲノムを含有する細菌宿主細胞を提供し、この細胞は前記欠如を補完するキャプ シドタンパク質を発現することができ、こうして感染性ファージ粒子をそれから 得ることができる。補完するキャプシドタンパク質は前記宿主の中でその中に含 有される他のベクターから発現されてもよい、欠陥のあるキャプシドタンパク質 はファージｆｄの遺伝子ＩＩＩまたは他のフィラメント状ファージの中のその相 手であることができる。 本発明はまた、組み換え大腸菌（Ｌ匹旦）　ＴＧＩ　Ｍ１３ＫＯ７ｇｌｌｌ麹３ （ＮＣＴＣ１２４７８）を提供する。 本発明はまた、特異的結合対の構成員またはその特異的結合ドメインを機能的形 態でその表面上に表示する型の複製可能な遺伝的表示バフケージの形を有するフ ァージ抗体を提供する。 上記の方法において、結合分子は抗体または免疫グロブリンに対して相同性であ るドメインであることができる。抗体および／またはドメインは天然に由来する か、あるいは合成的であるかまたは両者の組み合わせであることができる。ドメ インはＦａｂ、　５ｃＦｖ＋　ＦｖｄＡｂまたはＦｄ分子であることができる。 あるいは、結合分子は酵素またはレセプターまたは断片、任意のこのような酵素 またはレセプターの誘導体または類似体であることができる。あるいは、結合分 子は免疫グロブリンのスーパーファミリーの、免疫グロブリン分子に基づく構造 の形態を有する構成員であることができる。 本発明はまた、前述の方法のいずれかにより得ることができる、前述のｒｇｄｐ および特異的結合対の構成員、例えば、結合分子、例えば、抗体、酵素、レセプ ター、それらの断片および誘導体を提供する。誘導体は、他の分子、例えば、酵 素またはＦｃテイルに融合された特異的結合対の構成員を含んでなることができ る。 本発明は、また、ここにおける方法を実施するキットを包含する。 キットは必要なベクターを包含するであろう、１つのこのようなベクターは典型 的には一零値バクテリオファージのための複製起点を有しそしてｓｂｐ構成員の 核酸を含有するか、あるいはファージのキャプシドタンパク質の成熟コード配列 の５′末端領域にその挿入のための制限部位を有し、そしてキャプシドタンパク 質と外因性ポリペプチドとの融合体をペリプラスミンク空間に向ける前記部位の 上流に分泌リーダーコード配列をもつであろう。 ベクターの中の制限部位は、好ましくは、タンパク質コード配列中をまれにのみ 切断する酵素の制限部位である。 キットは、好ましくはファージミドベクターを含み、このファージミドベクター は、前記の特徴を有することができるか、あるいは遊離の形態でコードされたポ リペプチドの発現のためのｓｂｐ構成員の核酸を含むか又はその挿入のための部 位を有することができる。 キットはまた、この方法を実施するために要求される付属成分を含有し、このよ うな成分の性質は、もちろん、使用する特定の方法に依存する。 有用な付随成分は、ヘルパーファージ、ＰＣＩ？プライマー、および種々の緩衝 剤および酵素を含んでなることができる。 ｓｂｐ構成員が抗体である場合に、使用するためのＰＣＲプライマーおよび関連 試薬は、次の特性を有することができる：（ｉ）プライマーは抗体のドメインを コードする配列のセンスまたはアンチセンス鎖の５′末端に対する相同性を有す る；そして（ｉｉ　）プライマーは、ベクターの中への挿入を可能とする制限部 位を組み込んだ、これらの相同性配列に対して５′のｔａｇ配列；ならびに増幅 されたＶｆｌおよびｖｔｇ域をアセンブリソゲしてＦｖ、　ｓ’ｃＦνまたはＦ ａｂ断片として発現させることを可能にする配列を包含する。 緩衝剤および酵素は、典型的には、ここに記載する方法に従い組み換えられたま たは組み換えられていない免疫グロブリン遺伝子から誘導されたＦｖ、　５ｅＦ ｖまたはＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列の調製を可能とするために使 用する。 本発明において、結合分子、例えば、抗体および抗体断片およびそれらの誘導体 をそれらの表面上に表示するためのベヒクルを提供しそして引き続く選択および 操作を促進することができるファージの型の例として、フィラメント状Ｆ−特異 的バクテリオファージを選択した。 Ｆ−特異的ファージ（例えば、ｆｌ、　ｆｄおよびＭ２Ｓ）は宿主細胞を殺さな い増殖方法を発展させ、そしてそれらは組み換えＤＮＡのためのベヒクルとして 普通に使用される（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、Ａ、＋　ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏ ｎｔＨ，Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、＋サンフランシスコ、１９８０） 　、　ｆｄの一本鎖ＤＮＡゲノム（はぼ６．４）ｌｂ）は細菌の膜を通して押出 され、ここでそれはキャプシドのサブユニットを包封して成熟したヴイリオンを 産生ずる。 これらのヴイリオンは直径６ｎｓ、長さｌｔｔｍであり、そして各々はウィルス 遺伝子ＩＩＩによりコードされるほぼ２．８００分子の主要コートタンパク質お よび４分子の吸着分子の遺伝子ＩＩＩタンパク質（ｇ３ｐ　）を含有し、後者は ヴイリオンの１端に位置する。この構造は次の文献に概観されている：　Ｗｅｂ ｓｔｅｒ　ら、１９７８．　Ｔｈｅ　Ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ Ｐｈａｇｅｓ、　５５７−５６！Ｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、遺伝子ＩＩＩ産生物は細石のＦ−線毛への ファージの結合に関係する。 これらのファージは正常の複製の間にそれらの宿主を殺さないが、それらの遺伝 子のいくつかの崩壊は細胞の死に導くことがある（にｏｒｎｂｅｒｇ＋　Ａ、　 ＋　１９８０前掲）、このことはそれらの使用に多少の抵抗性を与える。ファー ジｆｄの遺伝子■ＩＴが生物学的に活性な外来配列の挿入の魅力的な可能性を有 することを本発明者は認識した。しかしながら、例えば、遺伝子ＶＴｒｌおよび 遺伝子ＶＩを包含する他の候補の部位が存在する。 タンパク質それ自体はファージのコートの少量成分であり、そして遺伝子の崩壊 は細胞の死に導かない（Ｓａ＋ｉｔｈ、Ｇ、１９８８．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ−１ ６７：１５６−１６５）　、さらに、いくつかの外来物質（生物学的機能をもた ない）をこの遺伝子内の種々の位置の中に挿入することができる（Ｓｗｉｔｈ、 Ｇ、　１９８５５ｃｉｅｎｃｅ　２２８：１３１５−１３１７．　Ｐａｒｖｌｅ ｙ、Ｓ、Ｆ、およびＳｍｘｔｈ＋Ｇ、Ｐ、Ｇｅｎｅ：　７３（１９８８）　ｐ、 ３０５−３１８；およびｄｅ　Ｉａ　Ｃｒｕｚ、＋Ｖ、Ｆ、ら、１９８Ｂ。 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６３：４３１８−４３２２）　、　Ｓ＋＋ｉｔ ｂ　らはファージの外側表面上のペプチドの表示を記載したが、タンパク質のド メインの表示を記載しなかった。ペプチドは、例えば、抗体に結合しているとき 、あるいはタンパク質の一部分を形成しているときよりも、遊離の溶液の中にあ るときに、異なることができるある範囲の構造に適合することができる（Ｓｔａ ｎｆｉｅｌｄ、Ｒ，ｌｅｔ　ａｌ、（１９９０）　５ｃｉｅｎｃｅ　３４ｆｉ、 　ｐ７１２−７１９）　、タンパク質は、一般に、よく定義された三次構造を有 し、そしてこの構造に適合するときにのみその生物学的機能を発揮する。 例えば、抗体Ｄ１．３の構造は遊離の形態で、および抗原に結合した場合に解明 された（Ｂｈａｔ、τ、Ｎ、ら（１９９０）　Ｎａｔｕｒｅ　３４７．　ｐ４８ ３−４８５）、タンパク質の全体構造は各場合において同一であり、抗原の結合 部位付近において小さい変動があるのみである。他のタンパク質、例えば酵素へ キソキナーゼおよびピルベートデヒドロゲナーゼは、リガンドの結合において、 それらの触媒サイクルの間に、より実質的なコンフォメーシテンの変化を有する が、それらはそれらのフォルディングの全体のパターンをなお保持する。この構 造の統合性は全タンパク質に限定されず、タンパク質のドメインにより示される 。これは、タンパク質の一部分であるフォルディングされたユニット、しばしば 、よく定義された一次、二次および三次構造を有しかつ結合相手に結合している か否かにかかわらず同一の全体のフォルディングパターンを保持するドメインの 概念を導く、あるドメイン（最小多分５０アミノ酸）をコードするために十分な 大きさであるＳｍｉ　ｔｈらが記載した、唯一の遺伝子構造は、β−ガラクトシ ダーゼ遺伝子配列の中のヌクレオチド８６１−１１９５（Ｐａｒｓｌｅｙ、Ｓ、 　＋５ａｉｔｈ、Ｇ、Ｐ、１９８８５ｕｐｒａ）に相当するβ−ガラクトシダー ゼの３３５　ｂｐ断片であった。これは非常により大きい３８０アミノ酸のドメ インのうちの１１２アミノ酸をコードするであろう、したがって、この出願の前 に、実質的に完全なドメインまたはフォルディングされたユニットはファージ上 で表示されなかった。これらの場合において、ヴイリオンの感染性は破壊された が、挿入された配列は、例えば、抗体を使用することによって、ファージの表面 上で検出することができたであろう。 遺伝子ＩＩＩによりコードされるタンパク質は次のものを包含するいくつかのド メインを有する（Ｐｒａｔｔ、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、、１９６９　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 　３９：４２−５３．Ｇｒａｎｔ、Ｒ，Ａ、ｅｔ　ａｌ、１９８１．Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｗ、　２５６：５３９−５４６およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｊ　ら、 ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、１３５：１６７−１７２１９８１）　：　（ｉ　）タンパ ク質を細胞膜に向け、次いで切断されるシグナル配列；（ｉｉ）成熟タンパク質 を細菌細胞膜の中に定着させるドメイン；および（ｉｔｉ）ファージレセプター である宿主細菌のＦ−線毛に特異的に結合するドメイン、タンパク質分子に由来 する短い配列が成熟分子内の２つの場所に挿入された（Ｓｗｉｔｈ、Ｇ、１９８ ５前掲、並びにＰａｒｓｌｅｙ、Ｓ、Ｆ、およヒｓｍｉ　ｔｈ、　Ｇ、Ｐ、　１ ９８８　前掲）。すなわち、ドメイン間領域におよびまたＮ末端におけるアミノ 酸２および３の間に、Ｎ末端における挿入部位は、遺伝子ＩＩＩタンパク質の構 造の統合性の維持およびファージの表面上のペプチドの表示において、いっそう 好結果であった。 ペプチドに対して特異的な抗血清の使用により、この位置の中に挿入されたペプ チドはファージの表面上に存在することが示された。 これらの著者らはまた、この性質を使用してファージを精製することができた。 しかしながら、ファージにより発現されたペプチドはそれら自身の測定可能な生 物学的機能をもたなかった。 ある分子の生物学的機能を保持することは、それがその自然の状態に対して基本 的に異なる関係で発現されるとき、困難である。その分子の構造に対する要求は 重い、対照的に、特定の抗血清により結合される能力を保持することは、分子の 構造上にかなり低い厳格さを要求する受動のプロセスである６例えば、ポリクロ ーナル抗血清がウェスタンプロット上で完全に変性した、生物学的に不活性なタ ンパク質を認識するのは、例外ではなくむしろ通常のことである（例えば、Ｈａ ｒｌｏｗ、Ｅ、およびＬａｎｅ＋Ｄ−＋＾ｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　１９８８を参照のこと）。 したがって、ペプチドの構造を抗血清でプロービングすることを可能にする領域 中にペプチドを挿入することは、その領域が挿入された配列を暴露させるという ことを教示するだけであり、そしである生物学的または結合的機能的をもつ分子 の表示のために、要求する構造的拘束をもつ大きい配列の挿入にその領域が適当 であることを教示するものではない、と（に、タンパク質のドメインまたはフォ ルディングされたユニットがこの領域に挿入された配列から表示されることがで きることをそれは教示していない。 ウェスタンプロットを使用するこの経験は、特定の抗血清により結合される能力 を保持することが生物学的機能の保持のためのフォルディングよりかなり低い厳 格さをポリペプチドの構造要求することを示すグラフィックな実際の実証である 。 大腸菌を操作してタンパク質β−アドレナリン作動性レセプターを外膜タンパク 質ＩａｓＢとの融合体として発現する研究が実施された。 β−アドレナリン作動性レセプターは、結合活性の存在により決定された場合、 機能的形態で発現された。しかしながら、同等の抗体の融合体をＩａｍＢと共に 作ったとき、抗体の融合体は宿主細胞に対して毒性であった。 生物学的に活性な抗体断片のために遺伝子のｃｄｓをｆｄの遺伝子ＩＩＩ領域の 中に挿入して、大きい融合タンパク質を発現する可能性を本発明者らは研究した 。前の検討から明らかなように、このアプローチは融合タンパク質の機能性につ いての厄介な要求を行う、挿入は大きく、少なくとも１００〜２００アミノ酸の 抗体断片をコードするものであり；抗体由来ドメインは効率よくかつ正しくフォ ルデイングして抗原結合を表示しなくてはならない；そして遺伝子■■ｒの機能 の大部分は保持されなくてはならない、融合分子の構成に対する本発明者らのア プローチは、これらの機能を破壊する危険を最小にするように設計された０本発 明の１つの態様において、使用された初期のベクターは、ｄ４−ｔｅｔ（Ｚａｃ ｈｅｒ、Ａ、Ｎ、ら、１９８０．Ｇｅｎｅ　旦、１２７−１４０）、すなわち、 感染した大腸菌宿主にテトラサイタリン耐性を与えるプラスミドとして増殖する ことができる。　ｆｄバクテリオファージのテトラサイクリン耐性バージテンで あった０本発明者らは、いくつかの理由で、ｆｄ遺伝転子ＩＩタンパク質のシグ ナル配列の後に挿入することを選択した。とくに、本発明者らは、成熟タンパク 質のアミノ＃１１の後に挿入するように選択して、シグナルペプチドの切断のた めの関係を保持した。遺伝子ＩＩＩそれ自体の構造および機能を保持するために 、もとのアミノ酸の大部分は、挿入された免疫グロブリン配列の後に合成される 。挿入された免疫グロブリン配列は、Ｖ）ｌ−ＶＬをＣＨＩ−ＣＬの連鎖するス イッチ領域からの残基を含むように設計した（Ｌｅｓｋ、Ａ、およびＣｈｏｔｈ ｉａ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ　３３５．１８８−１９０．１９８８）　。 驚くべきことには、バクテリオファージｆｄの遺伝子ＩＩＩを操作することによ って、安全性および感染性を残しながら表面上に大きな生物学的に機能的な抗体 、酵素およびレセプターの分子を表示するバクテリオファージを本発明者らは作 製することができた。さらに、所望の特異性の抗体を有するファージをこの特異 性を示さないファージのバックグラウンドから選択することができる。 抗体分子の集団をコードしておりそしてベクターの中に挿入してファージ表面上 に抗体結合機能を発現するための配列を、種々の源、例えば、免疫化したまたは 免疫化しない冨歯類またはヒトから、および器官、例えば膵臓および末梢血液リ ンパ球から誘導することができる。コード配列はこれらの源から、当業者に知ら れている技術（Ｏｒｌａｎｄｉ、Ｒ，ら、１９８９　前掲；Ｌａｒｒｃｋ、Ｊ、 ＄１．ら、１９８９　前掲；Ｃｈｉａｎｇ。 Ｙ、Ｌ、ら、１９８９．１９８９　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ヱｐ、３６ ０−３６６；Ｗａｒｄ、Ｅ、Ｓ、ら、１９８９　前掲Ｈ５ａｓｔｒｙ＋　１．ら 、１９８９　前掲）によるか、あるいは実施例１４、３３．４０および４２に記 載されている新規な連鎖方法により誘導される。２量体の分子、例えば、Ｆａｂ およびＦｖ断片をファージの表面上に表示する新規な方法は実施例７．２５．３ ３．３９および４０に記載されている。　ｐＡｂの生ずるライブラリーの中の各 個々のｐＡｂは、それらの抗原結合特性に関してモノクローナルである抗体また は抗体由来断片を発現するであろう。 本発明者らがなした開示は重要であり、そして組み換え法を使用することによっ て生物学的結合分子、それらの断片および誘導体を産生ずることに関する技術に おける有意な顕著な進歩を提供する。 抗体を製造するための標準的組み換え技術において、抗体のポリペプチド鎖をコ ードする配列を含有する発現ベクターを使用して、例えば、大腸菌を形質転換す る。抗体ペプチドが発現されそして標準的スクリーニング系を使用して検出され る。このスクリーンが所望の特異性の抗体ポリペプチドを検出したとき、所望の 抗体ポリペプチドを発現する特定の形質転換された大腸菌に戻らなくてはならな い、さらに、所望の抗体ポリペプチドのためのコード配列を含有するベクターを 、それ以上のプロセシング工程において使用するために、大腸菌から分離しなく てはならない。 しかしながら、本発明において、所望の抗体ポリペプチドは、発現されると、そ の遺伝子コード配列により既にパフケージングされている。これが意味するよう に、所望の特異性の抗体ポリペプチドが選択されるとき、その配列の分離のため にもとの培養物に戻る必要性は存在しない。さらに、標準的組み換え技術におけ る従来法においては、抗体を発現する各クローンを個々にスクリーニングするこ とが必要である０本発明は、所望の性質をもつ抗体を発現するクローンの選択を 提供し、こうして濃縮されたプールからのクローンのスクリーニングのみを必要 とする。 ｒｇｄｐ　（例えば、ｐＡｂ）は、特異的結合対の構成員（例えば、モノクロー ナルの抗原結合特異性の抗体）を、その構成員をコードする遺伝情報をやはり含 有する比較的簡単な複製可能な構造体の表面において表示する新規な構造体であ るので、特異的結合対の相補的構成員（例えば、抗原）に結合するｒｇｄｐ、例 えば、ｐＡｂは、例えばジエチルアミン、高い塩などを用いて相補的構成員を溶 出しそして適当な細菌を感染させることにより、あるいはその構造体を変性し、 そしてＰＣＲ，を使用してその構成員をコードする配列を特異的に増幅すること によって、非常に効率よく回収することができる。すなわち、ｐＡｂを生ずるも との細菌クローンにもどる必要はない。 いくつかの目的、例えば、免疫沈澱およびいくつかの診断の試薬のために、ポリ クローナル抗体または抗体断片を使用することは育利である。本発明は、所望の 性質をもつｐＡｂの濃縮したプールを選択するか、あるいは所望の性質をもつ個 々に分離したクローンを混合することによって、この達成を可能とする０次いで 、抗体または抗体断片を、必要に応じて、可溶性の形態で発現することができる 。 このような選択されたポリクローナルｐＡｂの集団を、ファージ、ファージミド を含有する細菌または選択されたポリクローナル集団に由来する可溶性断片を発 現する細菌のストックから成長させることができる。こうして、動物を使用しな い培養において複製しかつ日常的に調製することができる、ポリクローナル抗血 清と同等の試薬が作られる。 】　のフォーマントおよび　軌 所望の特異性、例えば、抗原に対する、を発現する個々のｒｇｄｐ、例えば、ｐ Ａｂを複雑なライブラリーから、普通のスクリーニング技術を使用して分離する ことができる（例えば、次の文献に記載されているもの：　Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ、 およびＬａｎｅ、０．１９８８　、前掲、Ｇｈｅｒａｒｄｉ、Ｅら、１９９０、 Ｊ、Ｉｍｇ＋ｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、）　ｓ本発明者らはまた、ｒｇｄｐの独特の 性賀故にのみ実施可能である、一連の新規な選択技術を案出した。いくつかのス クリーン手順の全体的外観は、ｒｇｄｐの例示的型としてｐＡｂを使用して第２ 図に示されている。 スクリーニングすべきｐａｂの集団および／またはライブラリーを免疫化した動 物または他の動物から発生させることができる；あるいは既存のファージの抗体 を突然変異誘発することによって試験管内でつくることができる（この分野にお いてよく知られている技術、例えば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を 使用して（Ｓａｓｂｒｏｏｋ、Ｊ、ら、　１９８９　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ） 、この集団は第２図を参照して下に記載する１または２以上のフォーマントにお いてスクリーニングして、抗原結合性質が試料Ｃと異なる個々のｐＡｂを誘導す ることができる。 蔓金症班 第２図（ｉ）は１または２以上の固体表面に結合した抗原（ａｂ）を示し、■ま たは２以上の固体表面はベトリ皿、クロマトグラフィー用ビーズ、磁気ビーズな どにより提供することができる０次いで、ｐＡｂの集団／ライブラリーがａｇの 上に通され、そして結合する個々のｐは洗浄後保持され、そして必要に応じて検 出系ｄで検出される。 抗ｆｄ抗血清に基づく検出系を実施例４においてより詳細に説明する。 結合した集団ｐの試料を増加するストリンジェントの条件下に除去する場合、各 試料において表される結合親和性は増加するであろう。 ストリンジエンシイが増加した条件は、例えば、浸漬時間を増加するか、あるい は浸漬溶液のｐＨを変化するなどすることによって得ることができる。 葺土 第２図（ｉｉ）を参照すると、抗原ａｇが固体の支持体Ｓに結合され、そしても との結合分子Ｃにより飽和にまで結合され得る。変異体ｐＡｂの集団（例えば、 １組の無関係のｐＡｂ）が複合体に提供される場合、抗原に対する親和性がＣよ り高いもののみが結合するであろう、はとんどの実施例において、集団Ｃの小さ い部分のみが集団ｐからの個体により置換されるであろう、Ｃが伝統的抗体分子 である場合、すべての結合した物質が回収されることができ、そして結合したｐ を適当な細菌の感染によっておよび／または標準的技術、例えば、ＰＣＲを使用 することによって回収され得る。 有利な応用は、ａｇをレセプターとしてそしてＣを対応するりガントとして使用 する場合である０次いで、回収され結合した集団ｐはレセプター結合部位および ／またはリガンドに構造的に関係づけられる。この型の特異性は製剤工業におい て非常に有用であることが知られている。 他の有利な応用は、ａｇが抗体でありそしてＣがその抗原である場合である０次 いで、回収され結合した集団ｐは抗アイソタイプの抗体であり、これは研究およ び診断および製剤工業において多数の用途を有する。 現在、抗アイソタイプ抗体について直接選択することは困難である。　ｐＡｂは 、ｐＡｂ　ライブラリー（例えば、天然ライブラリー）をＢ細胞（これらはそれ らの表面上で抗体を発現する）結合させ、そしてよく結合したファージを分離す ることによって、これを直接実施する能力を与えるであろう。 ある場合において、集団ｐを前以て選択することが有利であることを証明するこ とができよう０例えば、上の抗アイソタイプの例において、Ｐは抗原と結合しな い関連ある抗体に対して唆収され得る。 しかしながら、ＣがｐＡｂである場合、Ｃおよびｐのいずれかまたは両者を有利 にある方法でマーキングして、結合したＰを結合したＣと区別しかつ選択するこ とができる。ここのマーキングは、例えば、ｐをビオチンで前以て標識すること によって物理学的であることができるか、あるいはより有利には、遺伝子学的で あることができる０例えば、ＣはＥｃｏＢ制限部位でマーキングすることができ 、他方ｐはＥｃｏｋｌｌｌｉ部位でマーキングすることができる（Ｃａｒｔｅｒ 、Ｐ、ら、１９８５、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３．４４３１−４４４ ３を参照のこと）、結合したｐ十〇を抗原から溶出し、そしてそれを使用して適 当な細菌を感染させるとき、集団Ｃの制限（そしてそれ故に増殖なし）が存在す る（すなわち、この例において、ＥｃｏＢがｓａｔｍを制限する）、増殖したフ ァージはより高い結合親和性をもつｐからの個体について大いに濃縮されるであ ろう、あるいは、遺伝的マーキングはｐを新規な配列でマーキングすることによ って達成することができ、この新規な配列はｐを混合物からＰＣＢを使用して特 異的に増幅するために使用することができる。 結合したｐＡｂは、例えば、ＰＣＲまたは細菌感染を使用して増幅することがで きるので、不十分な個体が常用技術による検出を可能とするように結合される場 合さえ、所望の特異性をレスキューすることができる。 所望の特異性または親和性をもつタンパク質分子を表示するファージを選択する 好ましい方法は、しばしば、リガンドによる親和性マトリックスからの溶出であ ろう（例えば、実施例２１）　、　１度が増加するりガントを使用する溶出は、 増加する親和性の結合分子を表示するファージを溶出するであろう、しかしなが ら、例えば、ｐＡｂが高い親和性または結合活性をもつその抗原（またはその結 合相手に対する他のタンパク質）に結合するとき、抗原に関係する分子により親 和性マトリックスからｐａｂを溶出することはできないであろう、あるいは、十 分に高い濃度で調製できる適当な特異的溶出分子は存在しないであろう、これら の場合において、例えば、抗原−抗体複合体に対して特異的でない溶出方法を使 用することが必要である。一般に使用される非特異的溶出方法のいくつがば、フ ァージの生存性を減少し、例えば、ファージの生存性はｐＨ１２において経時的 に減少する（Ｒｏｓｓｏ＊ａｎｄｏＪ、Ｆ、およびＺｉｎｄｅｒ　Ｎ、Ｄ、、Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、３６３８７−３９９．１９６８）、例えば、ファージの感 染性を完全に除去することなくしては破壊することができない相互作用が抗体と 親和性マトリックスとの間に存在することがある。これらの場合においては、例 えば抗体−抗原相互作用の破壊に鰭らないでファージを溶出する方法が要求され る。したがって、ファージの構造を破壊しない温和な条件（ジチオスレイトール を使用するジチオール基の還元）下に結合したｐＡｂの溶出を可能とする方法が 案出された。 この溶出手順は温和な条件下での溶出法のちょうど１つの例である。とくに有利 な方法は、挿入された外来遺伝子（この場合は抗体断片の遺伝子と遺伝子ｍの残 部の配列との間に、高度に特異的なプロテアーゼによる切断のための認識部位を 構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を導入することであろう、この ような高度に特異的なプロテアーゼの例は因子Ｘおよびトロンビンである。 ファージを親和性マトリックスに結合しそして溶出により非特異的結合のファー ジおよび弱い結合性のファージを除去した後、強く結合したファージは、切断部 位における消化のために適当な条件下にカラムをプロテアーゼで洗浄することに よって溶出されるであろう。 これはファージ粒子から抗体断片を切断してファージを除去するであろう、これ らのファージは感染性であることが期待される。なぜなら、プロテアーゼ部位の みが特異的に導入されたものであろうからである０次いで、強く結合したファー ジは、例えば、大腸ＩＩＴＧ１細胞を感染することによって回収することができ る。 前述の手順に対する別の手順は、強く結合したｐＡｂを保持している親和性マト リックスを取り、そして例えばＳＯ３溶液の中に沸騰させることによってＤＮＡ を抽出することである０次いで、抽出されたＤＮＡを使用して大腸菌宿主細胞を 直接形質転換することができるか、あるいは抗体をコードする配列を、例えば、 適当なプライマー、例えばここに開示するもの、を使用するＰｃｔ？により増幅 し、次いでそれ以上の研究のために可溶性抗体として、あるいはそれ以上の選択 のラウンドのためにｐＡｂとして発現するための発現ベクターの中に挿入するこ とができる。 親和性に従う他の好ましい選択方法は、少量のリガンドを含有する親和性マトリ ックスへの結合であろう。 そのリガンドに対して高い親和性をもつタンパク質分子を表示するファージの集 団から選択しようとする場合、好ましい方法はファージの集団を少量のリガンド を含有する親和性マトリックスに結合させることである。高い親和性および低い 親和性のタンパク質を表示するファージの間に、マトリックス上のりガントへの 結合について競争が存在する。高い親和性のタンパク質を表示するファージは優 先的に結合し、そして低い親和性のタンパク質は洗浄除去される。 次いで、高い親和性のタンパク質を親和性マトリックスから、リガンドを用いて 溶出するか、あるいはファージを溶離する他の手順（実施例３５はこの手順を示 す）により回収する。 次いで要約すると、親和性工程からのパフケージングされたＤＮＡの回収のため 、パッケージを単に溶離することができ、それは相補的ｓｂｐ構成員への結合に ついて前記パフケージングと競争する相同性ｓｂｐ構成員の存在下に溶出するこ とができる；それは沸騰により除去することができ；それはタンパク質のプロテ アゼ切断により除去することができる；そして他の方法は当業者にとって明らか であろう０例えば、基質と相補的ｓｂｐ構成員との間の連鎖を破壊して前記パフ ケージングされたＤＮＡおよびｓｂｐ構成員を回収する。いずれにせよ、目的は パッケージからＤＮＡを得て、こうしてそれを直接または間接的に使用して、そ れによりコードされたｓｂｐ構成員を発現することができる。 ｐＡｂについてのこの選択方法の効能および非常に大きいライブラリーを作製す ることができることは、注目の抗体を産生ずるスクリーニングされた細胞の集団 を増加するために展開された免疫化技術が絶対的な要件ではないことを意味する 。この技術は、常用技術、例えば、触媒的または抗デデオタイブの抗体により困 難であるかあるいは得ることが不可能でさえあったものを包含する、結合特異性 、例えば、抗原結合特異性の迅速な分離を可能とする。いったん免疫レパートリ −の完全なライブラリーが構成されると、動物の完全な除去が今や可能である。 ｐＡｂ分子の新規な構造は多数の他の応用において使用することができ、それら のいくつかの例は次の通りである：之グ±酉二１唱 新規な分子の実在物それ自体として働くとき、ｒｇｄｐ、例えば、ｐＡｂは、主 要コートタンパク質が他方の実在物を取り付けるために作用される場合、増幅と 共に特異的分子、例えば、抗原と結合する能力を兼備する。この実在物は、免疫 学的、化学的、または他の手段を経て取り付けることができ、そして、例えば、 生体内または試験管内で使用するための検出試薬または細胞障害性分子により複 合体を標識するために使用することができる。 璽理負検責 ｒｇｄｐ、例えば、ｐＡｂの大きさは、とくに検出の物理的方法、例えば、電子 顕微鏡検査および／またはいくつかのバイオセンサー、例えば、表面のプラスモ ン共鳴に関してマーカーとして使用することｒｇｄｐ、例えば、ｐＡｂはまた、 診断アッセイにおいて、とくにそれらの物理的性質、例えば、遠心、濾過などを 使用して分離を実施できる場合に、有利な用途を有する。 本発明をいっそう完全に理解するために、今や具体的態様を下に記載する図面を 参照して、実施例によりいっそう詳細に記載するが、これらに限定されない。 第１図は、最も簡単な抗体分子１ｇＧの基本的構造を示す。 第２図は、ｐＡｂの独特の性質を利用する選択技術の概略を示す；２ｉ）は結合 ／溶出系を示す；そして（２■）は競争系を示す（ｐ＝ｐＡｂ　；ａｇ−抗原、 これへのｐＡｂの結合が要求される；Ｃ＝競争集団、例えば、抗体、ｐＡｂ　、 リガンド；Ｓ＝支持体（例えば、プラスチックビーズなど）；ｄ＝検出系。 第３図は、ベクターｆｄ−Ｌｅｔ、並びにベクターｆｄＴＰｓ　／Ｂｓ　（ＶＨ コード配列の挿入のため）およびｆｄＴＰｓ　／Ｘｂ　（ｓｃＦｖコード配列の 挿入のため）の作製の概要を示す。 第４図は、オリゴヌクレオチドおよびベクターのヌクレオチド配列を示す、すべ ての配列は５′→３′で描写されており、そしてＢｅｃｋら、１９７８．　Ｎｕ ｃｌ、Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、　５：４４９５−４５０３に従い番号が付されてい る。４．１は変異誘発（オリゴ１および２）または配列決定（オリゴ３）に使用 したオリゴヌクレオチドの配列を示す、示された配列はアプライド・バイオシス テムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ■Ｓ）のオリゴヌクレオチド合成装 置で合成され、そしてｆｄ−ｔｅｔの一本鎖の形態に対して相補的である（それ らは遺伝子ＩＩＩに関してアンチセンス形である）　、　４．２は遺伝子ＩＩＩ 挿入部位付近の種々の構成物の配列を示す。 これらの配列は遺伝子ＩＩＩに間してセンス向きで描写されているり（Ａ）　ｆ ｄ−ｔｅｔ　（およびｒｄＴ６Ｂｓｔ）、（Ｂ　）　ｆｄＴＰｓ　／Ｂｓおよび （Ｃ）ｆｄＴＰｓ　／Ｘｈ。主要な制限酵素部位はベクターにより寄与される免 疫グロブリンのアミノ酸と一緒に示されている（アミノ酸の単一の文字のコード を使用する、■ａｒｌｏｗ、　Ｅ、およびＬａ＋＋ｅ、０．１９８８前掲を参照 のこと）。 第５図は、ベクター５ｃＦｖ１．３ｍｙｃの中の５ｃＦｖについてのヌクレオチ ドおよびアミノ酸配列を示す。これは５ｃＦｖ１．３ｗｙｃの中の抗リゾチーム の一零値Ｆνの配列および対応する配列を与え、Ｎ末端のｐｅｌＧシグナルペプ チドの配列およびＣ末端のｓｙｃ　ｔａｇ配列を示す（Ｗａｒｄ、Ｅ、Ｓ。 ら、１９８９．前掲）、またνＦｉｑ域およびｖｔ、ｆｉＩ域を連結するペプチ ド配列が示されている。アミノ酸配列はヌクレオチド配列の上に単一文字のコー ドで表されている、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ、およびＬａｎｅ、　０．１９８８前掲を 参照のこと）。 第６図は、ｐＡｂのリゾチームへの結合および変化する量の上澄み液の効果を示 す、各点は二重反復実験の試料の平均である。リゾチームは５０ｍＭの１ＩＨＪ ｃＯｊ中１−ｇ／■ｌでコートされた。 第７図は、ｐＡｂのりゾチームへの結合に対するリゾチームまたはウシ血清アル ブミンの変化する濃度の効果をグラフで示す。各点は二重反復実験の試料の平均 である。 第８図は、ｆｄ−ＣＡＴ２の遺伝子ＩＩＩのクローニング部位付近の配列を示す 、制限酵素部位ならびに抗体由来の配列にエンコードされるアミノ酸を示す。こ れらは５′未満において遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドにより、そして３′未 満において３個のアラニン残基（Ｎｏｔｌ制限部位によりコードされる）および 成熟遺伝子ＩＩＩタンパク譬の残部によりは挟まれている。矢印はシグナルペプ チドの切断のための切断部位を示す。 第９図は、リゾチームへのｐＡｂ（１，３）の結合を示す、　ＥＬＩＳＡにより 検出されたファージの結合の相手は次の通りである：　（ａ）ニワトリ卵白リゾ チーム（ＢＥＬ）、（ｂ）シチメンチ目つの卵白リゾチーム（置）、（ｃ）ヒト リゾチーム（ＨＵＬ）、（ｄ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、（ｅ　）　Ｉ ＩＥＬ　ヘのｆｄＴＰｓ　／Ｂｓの更なる対照。 第１０図は、ｐＵｃ１９中のＦａｂＤｌ、３の地図を示す。 第１１図は、ファージ−Ｆａｂおよびファージ−５ｃＰｖによるリゾチーム結合 の比較を提供するＥＬＩＳＡの結果を示す、ベクター−ｆｄＣＡＴ２（★施例５ 　）　ｉ　ｆｄｓｃＦｖ（ＯＸ）”ｐＡｂＮＱＩＩ（実施例９　）　；ｆｄＶＨ ＣＨｌ（Ｄｌ、３）＝正常細胞の中で増殖させた（すなわち、Ｌｌなし、参照、 実施例７　）　；　ｆｄＦａｂ（０１，３）　、すなわち、Ｄｌ、３のＬ［を含 有する細胞の中で増殖させた；　ｆｄｓｃＦｖ（０１，３）　＝ｐＡｂＤ１．３ 　。 第１２図は、アフィニティー精製したファージのオリゴヌクレオチドのブロービ ングを示す、　４　Ｘ１０’ｆｄＴＰｓ／Ｂｓフアージ中の１ｐＡｂ　（０１， ３）の比における１０′！フアージをアフィニティー精製し、そしてｐＡｂ（Ｄ ｌ、３）対して特異的なオリゴヌクレオチドでブロービングした。Ａはｌラウン ドのアフィニティー精製後のフィルター（合計の９００コロニー）であり、そし てＢは２ラウンド後のフィルター（合計の３２７コロニー）である。 第１３図は、抗オキサシロン抗体断片ＮＱＩＩ　ｓｃＦνの配列を示す、リンカ −により寄与される配列は小文字で示されている。　ＶＨの配列はリンカ−配列 の前にあり、そしてＶＬの配列はリンカ−の後にある。 第１４図は、ＮＱｌｌおよび９Ａｂ　０１．３並びにベクターｆｄＴＰｓ　／ｘ ｈの特定した抗原への結合のＥＬＩＳＡの結果を示す。 第１５図は、ｆｄ−ｐｈｏＡ１ａ１６６中のｐｈｏ＾挿入部を取り囲む配列を示 す。 クローニングに使用した制限部位および挿入部位付近のｐｈｏＡによりコードさ れるアミノ酸を示す、成熟融合体の最初の５アミノ酸は遺伝子ＩＩＩから来る。 第１６図（１）は、遺伝子ＩＩＩの構造および実施例１３において５ｃＦｖコ一 ド配列が挿入された天然Ｂａｉ＋Ｈ１部位を示し、そして第１６図（２）は、５ ｃＦｖコ一ド配列の可能な挿入のための天然ペプチドリンカ一部位ＡおよびＢを 示す。 第１７図は、実施例１４に記載するファージの表示のためのマウスＶｌ（および ＶＬにレパートリ−のＰＣ！？アセンブリーのプロトコルを概略的に示す。 第１８図は、実施例１４の手順を使用して得られた最終産生物の例を示す、レー ンａおよびｂは、それぞれ、ヘビー鎖およびライト鎖プライマーを使用する初期 のＰＣＲの産生物を示す；レーンＣは、ＮｏｔｌおよびＡｐａＬｌによる消化前 の完全にアセンブリングした７００１）ｐの産生物を示す；Ｍｌ、Ｍ２は、それ ぞれ、マーカー１７４　Ｈａｅｌｌｌ消化物および１２３塩基対のラダー（ＢＲ Ｌ　Ｌｉ■ｔｅｄ　、スコツトランド、バイスレイ、ワシントンロード、郵便私 書箱３５）を示す。 第１９図は、免疫沈澱アッセイにおけるｆｄ　ｈ−ＰＤＧＦＢ−Ｒファージへの ”’Ｔ−ＰＤＧＦ−ＢＢの結合、並びにｆｄＴＰｓ　／Ｂｓおよびファージなし の対照に対する比較を示す；結合はインキュベーションに添加した合計の’　” Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢに対する百分率として示す。 第２０図は、免疫沈澱アッセイにより測定した、非標識ＰＤＧＦ−ＢＢを使用し てのｆｄ　ｈ−ＰＤＧＦＢ−Ｒファージに結合した’　”Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの 置換を示す、結合はインキュベーションに添加した合計の’　”Ｉ−ＰＤＧＦ− ＢＢに対する百分率として示す。 第２１図は、免疫沈澱アッセイにより測定した、非標識ＰＤＧＦ−ＢＢを使用し てのｆｄ　ｂ−ＰＤＧＦＢ−Ｒファージに結合した”Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの置換 を示す、添加した非標識ＰＤＧＦの不存在下でのベクターファージｆｄＴＰｓ／ Ｂｓへの”’Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢの非特異的結合は各点がら推定された。 第２２図は、実施例１７に記載する、ｐＣＡ？−３５ｃＦｖ　０１．３フアージ ミドとｐＣＡ７３ベクター（両者はＭ１３ＫＯ７によりレスキューされた）およ びｆｄＣＡＴ２５ｃＦｖ　０１．３とによるリゾチーム結合のＥＬＩＳＡのアッ セイの結果の比較を示す、　ＥＬＩＳＡは、実施例１８に詳細に説明する変法を 使用して、実施例６に記載するように実施した。 第２３図は、免疫化されたマウスに由来する一本１ｉＦｖ抗体遺伝子のライブラ リーから不作為に選択された個々のクローンをＢｓｔＮｌで消化したとき見られ る消化のパターンを示す。 第２４図は、実施例２１において組み合わせライブラリーおよび実施例２２にお いて階層的ライブラリーに由来するＶＨおよびＶＬ遺伝子配列を示す。 第２５図は、ランダム組み合わせライブラリーに由来するクローンについてのＥ ＬＩＳＡシグナルのマトリックスを示す、クローンの表示は第２４図における通 りである。各組み合わせを使用して見いだされるクローンの数は数字で示されて いる。 第２６図は、ａ）実施例２４に記載するｐＵｃ１１９の誘導体であるファージミ ドｐＨＥＮ１　；およびｂ）ファージミドＧＩＨＥＮ中のクローニング部位を示 す。 第２７図は、ファージの表面上の表示のためにｆｄ−ＣＡＴ２およびｐＨＥＮｌ の中にクローニングされた抗体構成物、構成物１．　ＩＩ、　ＩＩＩおよびＩＶ をｆｄ−ＣＡＴ２（ＡｐａＬｌ−Ｎｏｔｌ断片として）およびｐＨＥＮｌ（Ｓｆ ｉＩ−Ｎｏｔｌ断片として）にクローニングした。すべての構成物は、マウス抗 ｐｈｏχ抗体ＮＱＩ０．１２．５のヘビー饋（ＶＦＩ）およびライト鎖（ＶＫ） 可変領域を音響した。定常ドメインはヒトＣＫおよびＣＨ２（ｒｌ型）であった 。 第２８図、遺伝子目Ｉタンパク質への融合によりファージの表面上に抗体断片を 表示する３つの方法。 第２９図、大腸菌１（Ｂ２１５１におけるｐｉ（ＥＮＩ−１１（＋　）またはｐ ）ＩＥＮＩ　（−）培養物から取った上澄み液のウェスタンプロットであり、ｐ ＨＥＮ１４ｒからのＦａｂ断片の分泌のみを示す、抗ヒ）　ＦａｂはＨおよびＬ ｌｊの両者を検出する。取り付けられたｃ−ｍｙｃ　ｔａｇのために、抗ｃ−ｓ ＋ｙｃ　ｔａｇおよび抗ヒＩ−ＣＫ抗血清の両者により強調されているし鎖は、 Ｈ饋（計夏されたＭｒ２３１５４）よりわずかに大きい（計夏されたＭｒ２４６ ２５）。 第３０図は、ａｐＤｌ、３または可溶性５ｃＦｖＤ１．３を使用して得られたＥ ＬＩＳＡのシグナルの比へのリゾチームの希釈の効果を示すプロットである。 第３１図は、ｆｄＴｓｃＦｖｌｌｌ、３および可溶性５ｃＦｖ［１１，３を使用 して得られたＥＬＩＳＡのシグナルへのりゾチームの希釈の効果を示すプロット である。 第３２図は、ゴストリオールに対して向けられたモノクローナル抗体を発現する 細胞系０１３に由来する５ｃＦｖ断片を表示するファージのＥＬＩＳＡスクリー ンからの陽性の結果を示すプロットである。 第３３図は、エストリオールに対して向けられたモノクローナル抗体を発現する 細胞系０１４に由来する５ｃＦｖ断片を表示するファージのＥＬＩＳＡスクリー ンからの陽性の結果を示すプロットである。 第３４図は、アルカリ性ホスファターゼ−遺伝子３融合体の発現を示すウェスタ ンプロットである。各ファージ試料の５０倍の濃縮物１６μｌが、坑道転子３抗 血清（ｅ−ｆ）またはアルカリ性ボスファターゼ抗血清（ｃ　−ｆ　）を使用す るウェスタンプロット上で検出された。 ａ）丁Ｇ１細胞中で増殖したｆｄ−ｐｈｏＡ１６６ｂ　）　ＫＳ２７２細胞中で 増殖したｆｄ−ｐｈｏＡ１６６ｃ　）　ＴＧＩ細胞中で増殖したｆｄｃｃＡ丁２ ｄ　）　ＴＧＩ細胞中で増殖したｆｄＣＡＴ２であって、１３ｎｇの精製したア ルカリ性ホスファターゼと混合したもの ｅ　）　ＴＧＩ細胞中で増殖したｆｄ−ｐｈｏＡ１６６ｆ　）　ＴＧＩ細胞中で 増殖したｆｄＣＡＴ２゜第３５図は、ファージ−酵素の限外濾過を示すウェスタ ンプロットである。ファージの５０倍ａｍ物１００μｍ（５■ｌの培養上澄み液 を代表する）を、３００．０００ダルトンの公称分子量保持の限外濾過膜を通し て遠心した。流通する両分および保持された百分のウェスタンプロットを、抗ア ルカリ性ホスファターゼ抗血清で検出した。もとの培養上澄み液の８００ｕｌ相 当量をゲル上で展開した。 Ａ、ファージをＴＧＩ細胞の中で増殖させた。ａ）限外濾過前のｆｄ−ｐｈｏ＾ １６６（短い暴露）、ｂ）限外濾過前のｆｄ−ｐｈｏＡ１６６、　ｃ　）限外濾 過膜上に保持されたｆｄ−ｐｈｏＡ１６６物質。Ｂ、ファージをＫＳ２７２細胞 の中で増殖させた。ａ）限外濾過前のｆｄ−ＰｈｏＡ１６６、　ｂ　）限外濾過 膜上に保持されたｆｄ−ＰｈｏＡ１６６物質、ｃ）ｆｄＣＡτ２．ｄ）限外濾過 前の精製されたアルカリ性ホスファターゼと混合したｆｄＣＡＴ２．　ｅ）試料 ｄがらの保持物質、ｆ）試料ｄから流通物質。 第３６図は、Ｆａｂアセンブリーの段階からの試料の電気泳動を示す。 実施例３３に記載するＰＣＲのＦａｂアセンブリーの工程における異なる段階か らの試料を、１％のＴＡＥ−アガロースゲルの電気泳動にかけた０匹敵するｓｃ Ｆシアセンブリ−の工程からの試料（実施例１４におけるような）を比較のため に示す、試料は左から右へ次の通りである：Ｍ−マーカー ＶＩＩＣＨＩ　＝ＰＣＲによる増幅されたＶＩＩＣＩＩＩ　ドメインをコードす る配列ＶＫＣＫ　−ＰＣＲにより増幅されたＶＩ［ＧＫドメインをコードする配 列Ｌ　−リンカ−の不存在下に実施したＦａｂアセンブリー反応＋Ｌ　＝Ｐａｂ 　ノＰＣＩ！　７センブリ一反応産生物ＶＨＣＨＩ　＋ＶＫＣＫ＋　ＩＪ　ンカ ＶＫ　−ＰＣＩｌにより増幅されたＶＫドメインをコードする配列ＶＬ　−Ｐｃ ｔ？により増幅されたＶｌｌドメインをコードする配列−ＬＩ−リンカ−の不存 在下の５ｃＦｖアセンブリーの反応＋Ｌ　−−リンカ−の存在下の５ｃＦｖアセ ンブリーの反応Ｍ　冨マーカー 第３７図、　ｆｄ−ＣＡＴ２（ｆｄ）またはｐＣＡＴ−３の中にクローニングさ れた５ｃＦｖＤ１．３についてのＥＬＩＳＡのシグナルの比較、　ｐＣＡＴ−３ ｓｃＦｖ１．３は１１１３ＫＯ７（ＫＯ７）、　Ａ１３−に０７δｇＩＩ１１１ １［Ｌ３（ｇｌＩＩ阻３）またはＡ１３ＫＯ７ｇＩＩＩΔＮｌ１２Ｎ１１２（Ｎ ｔｘ２）によりレスキューされた。ファージ抗体を一夜の増殖後の上澄み液中の 濃度に関して１０倍（ＩＯＸ）　、１倍（１×）または０．１倍（０，ＩＸ）の 濃度で比較した。　ｆｄＣＡＴ２およびｐＣＡＴ−３の非組み換えベクターのシ グナルは１０×濃度において＜０．０１であった。１１１３ＫＯ７ｇｌｌｌΔＮ ＩＩＬＬは、このＥＬＩＳＡにおけるバックグラウンドより上のシグナルの不存 在により判定して、まったくレスキューしなかった。 第３８図、抗ｇ３ｐでプロービングしたＥＬＩＳＡにおいて使用されたＰＥＧ沈 澱したファージのウェスタンプロット、遊Ｉｔ　ｇ　３　ｐおよびｇ３ｐ−ｓｃ Ｆν１．３　ｍ合体のバンドに矢印が付されている。 試料１−ｆｄ　５ｃＦｖ１．３ 試料２−ｐＣＡ７３ベクター 試料３−Ａ１３ＫＯ７でレスキューされたｐＣＡＴ３５ｃＰｖ１．３．　ＩＰＴ Ｇ不含試料４−？１１３ＫＯ７でレスキューされたｐＣＡＴ３５ｃＦｖ１．３． ５０　ａｍ　ＩＰＴＧ試料５−Ａ１３ＫＯ７でレスキューされたｐＣＡＴ３５ｃ Ｆｖ１．３．１００μｍ　ＩＰＴＧ試料６−Ｍ１３ｄ０７ｇｒＩＩΔＮＩＬ３で レスキューされたｐＣＡＴ３５ｃＦｖ１．３（ＩＰＴＧ不含） 試料７−Ａ１３ＫＯ７ｇｌｌｌΔ患２でレスキューされたｐＣＡＴ３５ｃＦｖＤ １．３（ＩＰＴＧ不合） パネルＡの試料は８μｌ相当量のファージミド培養上澄み液／トラック、および ８０μｌのｆｄ上澄み液を含有した（ファージミドより１０倍低いファージの収 量）、パネルＢのファージミドの試料は、親Ｍ１３ＫＯ７でレスキューされた試 料の中の融合体のバンドの可視化を可能とするために、５倍高い試料の負荷（４ ０μｌの培養上澄み液／トラックに等しい）でパネルＡにおいて使用したもので ある。 第３９図は、１ラウンドのパニングによりｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３および ｆｄｃＡＴ２ＴＰＢ１の混合物から産生されたｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３の 濃縮を示すグラフである。 第４０図は、１ラウンドのパニングによりｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３および ｆｄｃＡＴ２ＴＰＢ１の混合物から産生されたｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３の 濃縮を示すグラフである。 第４１図、抗ｇ３ｐ抗血清を使用してのｆｄＣＡＴ２（１）およびｆｄ−ｔｅｔ −５Ｎアーゼ（２）のファージタンパク質のウェスタンプロット、マーカーの分 子量バンドが示されている（ｋＤ）　。 第４２図、１０倍希釈系列（１〜３または４）における可溶性ＳＮアーゼ（３ｎ ｇ）（Ａ−１）、　ｆｄ−ｔｅｔ−ＳＮアーゼ（４Ｘ１０”ＴＵ（Ｂ−１）、　 ｆｄ−ＣＡＴ２（２Ｘ１０Ｉ０ＴＵ）　（Ｃ−１）、並びにＰＥＧ沈澱したｆｄ ＣＡＴ２およびＳＮアーゼの混合物（２Ｘ１０”ＴＯおよび０．７　μｇ）（Ｄ ｌ）のヌクレアーゼアッセイ。マーカー（Ｍ）はλ−ＤＮＡ　にュー・イングラ ンド・バイオラプス（ＮｅｔｉＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））の［ｌ１ｎ ｄｌｌＩ消化物である。 第４３図、　ｆｄ−ｔｅｔ、　ｆｄ−ＣＤ４−Ｖｌおよびｆｄ−ＣＤ４−ＶＩＶ ２を使用して得られたＥＬＩＳＡのシグナル、３つの各群において、試料は左か ら右にファージ濃縮物（ＳＮ）　；ファージ濃縮物＋可溶性ＣＤ４　（ＳＮ　＋ 　５ＣＤ４）　；ファージ濃縮物＋ａｐ１２０（ＳＮ＋ｇｐ１２０）である。 第４４図は、５ｃＦｖＢ１８（抗ＮＰ）のＤＮＡ配列を示す。 第４５図は、ｆｄ−ｔｅｔ　ＦａｂＤｌ、３の中に存在するＦａｂＤｌ、３をコ ードする配列の挿入部のマツプを示す（実施例３９）　、　ｒｂｓはリポソーム 結合部位を表示する。遺伝子ＩＩＩはここでその全長で示されている。 第４６図は、リゾチームでコーティングされたプレートに結合させることによる Ｆｖ１．３または５ｃＦｖＤ１．３を表示するファージのＥＩＪＳＡアッセイを 示す０種々の希釈倍数で得られたシグナルを示す。Ｆｖを発現しないＦａｂＤｌ 、３（ΔＳ−５ｔｕｆｆｅｒ）を対照として使用した。 第４７図は、ヒトＦａｂ断片をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲアセンブリ ーに関係する工程の概略的表示を示す、実施例４０に詳細に説明されている。 第４８図。Ａ、可溶性ヒ）　Ｆａｂ断片の発現のためにおよびＰａｂアセンブリ ーのためのリンカ−ＤＮＡの合成の鋳型として使用するプラスミドＰＪＭＩ−Ｆ ａｂＤ１．３のマツプ、　Ｂ、　Ｆａｂ構成物をコードする配列の概略的表示、 　Ｃ，Ｆａｂアセンブリーのリンカ−ＤＮＡの合成のためのＤＮＡ鋳型の配列。 第４９図は、ヒト５ｃＦｖ断片をコードするヌクレオチド配列のＰＣＲアセンブ リーに関係する工程の概略的表示を示す、実施例４２に詳細に説明されている。 第５０図、シチメンチョウ卵リゾチームでコーティングしたプレートを使用する ファージ抗体のＥＬＩＳＡアンセイ。変異誘発およびｐＡｂＤｌ、３からの選択 により誘導された２つのクローンＢ１およびＡ４を示す（実施例４５）、濃度（ Ｘ軸）は培養上澄み液の中の濃度に対する各試料についてのファージの濃度であ る。　ＢｌはＤｌ、３と比較してシチメンチジウ集合体リゾチームへの結合を発 生した。　Ａ４はＤｌ、３と比較してニワトリ卵リゾチームへの結合を減少した 。 第５１図、　ＨＥＬおよび置への結合のファージ抗体のＥＬＩＳＡ　、クローン １はｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３である。クローン２〜１０は選択後にライブ ラリー（実施例４６）から得た。これらのクローンのＢＳＡへの結合により定義 されるバックグラウンドの値を差引いた。 第５２図は、実施例４６における階層的ライブラリーからの選択に由来するライ ｌ−１［Ｄｌ、３　ＭＩＦおよびＡ２１のＤＮＡ配列を示す。 第５３図は、ｐＵｃ１１９から誘導されたＦｖラムダ発現ベクター（実施例４８ ）を示す、それは組み換えられたラムダのジャームライン遺伝子を含有する。ヘ ビー鎖およびライト鎖のカセットの各々はｐｅｌＢ’Ｊ　−グーの上流にリポソ ーム結合部位を含有する（制限部位は次のように示す：　Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ　 ；　５ｐ−ＳｐｈＩ　；　Ｂ　＝ＢａｍＨＩ、　Ｅ　＝ＥｃｏＲＩ）。 材料１よび力抜 本発明において使用する次の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、１９８９前 掲に記載されている：制限消化、連結、コンピテント細胞の調製（ｈａｎａｂａ ｎ法）、形質転換１．アガロースゲル上での制限酵素消化産生物の分析、フェノ ール／クロロホルムを使用するＤＮＡの精製、オリゴヌクレオチドの５′末端の 標識、細菌コロニーのフィルタースクリーニング、２ＸＴＹ培地およびプレート の調製、テトラサイクリンストック溶液の調製、リン酸塩緩衝液の調製。 すべての酵素は、特記しない限り、二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＣＰラボラトリーズ、英国ハートモン スー、とショップソートフォード、郵便私書箱２２）により供給され、そして製 造業者の指示に従い使用した。 ベクターｆｄ−ｔｅｔ（Ｚａｃｈｅｒ＋　Ａ、Ｎ、　ら、１９８０、前掲）はア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　 Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ−ｔｉｏｎ）から入手しくＡＴＣＣＮｎ３７００ ０）そしてコンピテントＴＧＩ細胞（遺伝子型二に１２δ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、 　５ｕｐＥ、　ｔｂｉ＋　ｈｓｄＤ５　／Ｆ　ｔｒａＤ３６．　ｐｒＯＡ＋Ｂ＋ 、　Ｌａｃｌ”　、　Ｉａｃ　＋ＨＩ１５）に形質転換した。 ウィルス粒子は、１５Ｍｇ／■１のテトラサイクリンを有する１０−１００−１ の２×τｙ培地の中で所望の構成物を含有するＴＧＩ細胞を１６〜２４時間増殖 させることによって調製した。培養上澄み液を、８×５ｏ■−のローター、５ｏ ｒｖａｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心機により１０．０００ｒｐ−で１ｏ分間遠心すること によって集めた。ファージ粒子は１１５体積の２０％のポリエチレングリコール （ＰＥＧ）　／２．５ＭＮａＣ１を添加し、そして４℃において１時間放！する ことによって沈澱させた。これらを前述したように１５分間回転シ、ソシテ沈澱 物を１０ｍＭ）！ＪスＨＣＩ（ｐＨ８）、１ｍＭＥＤＴＡノ中にもとの体積の１ 　／１００倍に再懸濁した。残留する細菌および溶解しない物質をマイクロ遠心 機で２分間回転することによって除去した。 変異誘発またはスクリーニングのための一本ｌＤＮＡを、濃縮したファージから Ｓａ讃ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、１９８９、前掲に従い調製した。 亥１１ｒ１じ化乙ムＬへ 実ＪＬｆｉＬ−善人点ｐユ之ｐ二勿毀■膚オニ８優しシニ悲１製この実施例は、 ファージベクターｆｄ−ｔｅｔの２つの誘導体の作製を包含する：ａ）ＶＨコー ド配列の挿入のためのｆｄＴＰｓ　ＩＤ３　Ｆおよびｂ）ｓｃＦｖコード配列の 挿入のためのｆｄＴＰｓ　／Ｘｈｏ誘導体ベクターは配列の挿入のための新しい ＢｓｔＥ１１部位を有する。 １施１↓−逸食ｌニブニアＦｖ５カフ叫スニニ乏少主ユ＠遵入この実施例は、抗 リゾチーム抗体Ｄ１．３に由来するｓｃＦシコード配列をｆｄＴＰｓ　／χｈの 中に挿入して構成物ｆｄＴｓｃＦｖＤ１．３を得ることを包含する。 大施刊ニーｆｌ失Ｚ叩上ノイクｊじり！づ８陳払ユΔ捧入この実施例は、抗リゾ チーム抗体０１．３に由来するＶＨコード配列をｆｄＴＰｓ　／Ｂｓの中に挿入 して構成物ｆｄＴＶＨＤ１．３を得ることを包含する。 ４．７−ジ　の人　の この実施例は、構成物ｆｄＴｓｃＦｖＤ１．３およびｆｄＴＶ［ＩＤ１．３の結 合特異性を研究する。 ５、ｆｄＣＡＴ２の この実施例は、ファージベクターｆｄＴＰｓ　／Ｘｈの誘導体ｆｄｃＡＴ２の作 製を包含する。誘導体はＤＮＡをそれほど頻繁には切断しない酵素のための制限 部位を有する。 ６、　ファージ　（Ａｂ）の　への　・　ムこの実施例は、ＥＬＩＳＡによるリ ゾチームへのｐＡｂのｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３の結合を示す。 ？、　ＦａｂＤｌ、３の この実施例は、ファージ表面における抗体Ｆａｂ断片の表示に関する。　ＶＬＣ Ｉｌｌｌｌ［がｆｄｃＡＴ２ニより発現される。　ＶＬ−ＣＬ鎖は、やはりｆｄ ｃＡＴ２で感染した細菌宿主細胞においてｐＵｃ１９により発現される。 この実施例は、結合分子を表示するファージ（例えば、ｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３ ）がベクターファージからいかにしてアフィニティー技術により分離され得るか を示す。 ９、ハブテン　するＡｂの　敦 この実施例は、抗オキサシロン抗体ＮＱＩＩに由来する５ｃＦｖコ一ド配列をｆ ｄＴＰｓ　／χｈの中に挿入して構成物ｐＡｂＮＱ１１を発生させることに関す る。この実施例は、ｐＡｂＮＱｌｌのオキサシロンへの結合をＥＬＩＳＡ［Ｌ至 装置 この実施例は、１種類の結合分子を表示するファージ（例えば、ｐＡｂＤｌ、３ ）が他の種類の結合分子を表示するファージ（例えば、ｐＡｂＮＱｌｌ）からい かにして分離され得るかを示す。 １皇　１１．　７丑Ｊユ１主λスＪ二上Ｙ（ユニ上工支這猛子ｐ旦Ω兵仝皇獲人 この実施例は、酵素のコード配列をベクターｆｄＣＡＴ２の中に挿入してファー ・ジ酵素ｆｄｐｈｏＡ１ａ１６６を得ることに関する。 １２、　］］１１活−１≦ＬＬ−疋ｋＬ１す１定この実施例は、ファージ表面（ ｆｄｐｈｏＡ１ａ１６６）において表示された場合の酵素（アルカリ性ホスファ ターゼ）の機能性を示す。 １１Ｍ−じ−−１にラツリ町λ呟従生主企及麓立分子」入この実施例は、ａ）抗 リゾチーム抗体０１．３　；およびｂ）抗オキサシロン抗体ＮＱＩＩに由来する ５ｃＦｖコ一ド配列をｆｄＴＰｓ　／ＸｈのＢａ−旧部位の中に挿入して、ＮＱ ＩＩ挿入部を有する構成物ｆｄＴＢａｓＩを得ることを包含する。 ス−１４，ファージの鷹ネのためのマ文＾訓赳ｊ」ΔＬＫ　レパートリ−のＰＣ Ｒアセンブリー この実施例は、マウスによりコードされるすべてのＶＨおよびＶＬＫレパートリ −のファージ上の表示のための系に関する。この系は次の工程を包含する。１） 牌臓からのＩ？ＮＡの調製、２）ＩＩＮＡからのｃＤＮＡの調製、３）抗体配列 に対して特異的なプライマーを使用しての、すべてのＶＨおよびＶＬＫのｃＤＮ Ａコード配列のＰＣＲ増幅。４　）　ＰＣＲを使用しての、ＶＨおよびＶＬＫ配 列のリンキング対からのリンカ−分子の形成、５）ＰＣＲを使用しての、各々が Ｖｌｌ配列、リンカ−およびＶＬＫ配列を含んでなる、連続的ＤＮＡ分子をアセ ンブリング、特異的ＶＨ／ＶＬＫの組み合わせがランダムに誘導される。６）Ｐ ＣＨの使用による制限部位の導入。 ス１１旦ユ１沙　（ＰＤＧＦ）アイソフオームＢＢに−るヒこの実施例は、ＰＤ ＧＦに対するヒトレセプターの細胞外ドメインのコード配列をベクターｆｄｃＡ Ｔ２の中に挿入して、構成物ｆｄｈＰＤＧＦＢＲを得ることに関する。 １６、　ｆｄファージの　上に　只　れたＰＤＧＦアイソフ　−ムＢＢに・　る ヒトレセプ　−の　ドメインへの”’ｒ−ＰＤＧＦ−ＢＢの　ム　゛　ア・セイ 　しての゛ この実施例は、ヒトレセプターＰＤＧＦアイソフオームＢＢがファージの表面上 に、そのリガンドに結合する能力を有する形態で表示されることを示す。 この実施例は、ｆｄＣＡＴ２から遺伝子１１１および遺伝子ｌｌｌ５ｅＦν融合 体ｆｄＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３を別々に含有する、ｐＨＣ１１９に基づく２つ のファージミドを構成して、それぞれ、ｐＣＡＴ２およびｐＣＡＴ３ｓｃＦνＤ １．３を発生させることに間する。 この実施例は、Ｍ１３ＫＯ７ヘルバーフアージの増殖によるｐＣＡＴ３ｓｃＦｖ Ｄ１．３からの遺伝子ｌ１１ｓｃＦｖ融合体のコード配列のレスキューを記載し 、ファージはＥＬＩＳＡにより５ｃＦｖ抗リゾチーム活性を表示することが示さ れた。 １９．０ＡＴ−３およびＣＡＴ−３ｓｃＦｖＤ１．３フ　−ジミドのノ　の簸墨 この実施例は、大腸菌を形質転換するファージミドｐＬＩＣ１１９，ｐＣＡＴ− ３およびｐＣＡＴ３ｓｃＦｖＤ１．３並びにファージｆｄＣＡＴ２の効率を比較 した。 ２０、　たマウス）゛の−Ｆｖ−イブ−１−のＰＣＲヱｊ」≦乙し： この実施例は、実施例１４において概説する基本的技術（ｃＤＮＡの調製および マウスＶ［ＩおよびＶＬＫ　レパートリ−のＰＣＩＩアセンブリー）を使用して 、免疫化されたマウスからの５ｃＦｖ　（ＶＨおよびＶＬを含んでなる）をファ ージ上に表示する系、並びにＰｃｔ？アセンブリングした配列をｆｄＣＡＴ２の 中に結合して１０Ｓクローンのファージのライブラリーを作製することに関する 。 ２１、　れたマウス１′のレパートｉ−か゛の２−フェニル−５−オキサシロン 　し　・な　のこの実施例は、実施例２０において樹立されたライブラリーから 増殖したファージをｐｈＯＸを使用するアフィニティー選択にかけ、所望の特異 性をもつ５ｃＦｖを表示するファージを選択することができることを示す。 ２２、　・（ｈｉｅｒａｒｃｂｉａｌ）　−イプーリーのアセンブリーによる　 なる　の この実施例は、階層的ライブラリーの作製に関し、この場合所定のＶＨ配列を完 全なＶＬＫ　レパートリ−と組み合わせ、そして所定のＶＬＫ配列を完全なＶＨ レパートリ−と組み合わせ、そして新規なＶＨおよびＶＬ対をこれらのライブラ リーから選択する。 ２３．２−フェニル−５−オキサシロンについて　なるつバクテリオファージ上 に　六　れた　のアフィニティークロマトグーフィーによる゛ この実施例は、所定の抗原について異なる結合親和性をもつ５ｃＦｖ断片を表示 するファージのアフィニティー技術による分離に関する。 ２４、感　の′にバクテリオファージの　上に　れるの　のためのファージミド ＨＥＮＩの この実施例は、ｐｌＩＣ１１９から誘導されるファージミドｐｔｌＥＮ１の作製 に関する。　ｐＨＥＮｌは第２６図に示す特徴を有する。 ２５．１ＩＥＮ１およびｆｄＣＡＴ２シての　バクー■オフ　−ジｆｄ上にお番 る　オキサシロン　ＮＱＩｏ、　１２．５に　る−ＦｖおよびＦａｂ　の　７ この実施例は、ρｈＯｘに対する特異性をもつ５ｃＦｖ断片およびＦａｂ断片の バクテリオファージの表面上での表示を記載する。　ｓｃＦνの表示のために、 ファージミドｐＨＥＮ１は、ファージＶＳＭ１３またはｆｄＣＡＴ２によるレス キューのための５ｃＦｖをコードする配列（Ｖｌ（およびＶＬ）を含んでなる。 　Ｆａｂの表示のために、ファージｆｄＣＡＴ２は、ｇｓｐとの融合体としてＨ またはＬＩ［のための配列を含んでなり、そしてファージミドｐｌ’１ＥＮ１は 適当なＨまたはＬｌ［の相手のための配列を含んでなる。 ２６、）　−ジ上に　−　れる　・　コード　るファージによる　のヘビー　た は−イト　との゛　−■Ｉ■ンバク　との　ム　コード　るファージミドのレス キュー　びに二　ムわせ一イブーリー　つ　るためのこの　′の この実施例は、抗体のヘビー饋またはライト鎖をコードするファージ抗体を使用 して相補的饋と遺伝子３タンパク質との融合体をコードするファージミドをレス キューすること、およびＥＬＩＳＡにおけるファージ上に表示されたＦａｂ断片 のアッセイを包含する。二重組み合わせライブラリーの調製におけるこの技術の 使用を論する。 ２７、ファージミドＨＥＮＩ　しての口゛５ｃＦｖおよびＦａｂ逝片■ＨＩ この実施例は、アンバー変異を抑制しない大腸菌株におけるｐＨＥＮｌ中のクロ ーンの発現により、５ｃＦｖおよびＦａｂ断片をコードする配列と遺伝子ＩＩＩ 　との融合体から可溶性５ｃＦｖおよびＦａｂ断片を発生させることを包含する 。 ２８．１”　５ｃＦｖＤ１．３と　した　−　としてｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３る リゾチームのＥＬＩＳＡにおしる感　のこの実施例は、ＥＬＩＳＡにおけるｆｄ ＴｓｃＦｖＤｌ、３の使用を包含し、可溶性５ｃＦｖＤ１．３を使用するのに比 べてファージ抗体ｆｄＴｓｃＦｖＤ１．３を使用して、より少ない量のリゾチー ムを検出できることを示す。 ２９、バク−ミオファージｆｄＯ上の−　Ｆａｂ　としてのマウスモノクローナ ル　の　レスキューおよび　−この実施例は、エストリオールに対して向けられ たモノクローナル抗体を発現する細胞から直接誘導された２つのクローンの機能 的ｓｃＦν断片としてのファージ上の表示を包含する。 ３０、バクーＩオフ　−ジｆｄＯ上に　只　れたアルカリホスファ　−ゼの　ｉ Ａ・ この実施例は、ファージ上に表示された酵素アルカリ性ホスファターゼの反応速 度論的性質が、溶液の中にあるときの同一酵素のそれらに定量的に類似すること を実証する。 ３１、クローニングされたアルカリ　ホスファ　−ゼがウィルス、　の−。　と して゛ることの　゛し工坐延■ この実施例は、ファージ酵素ｆｄｐｈｏＡｌａ１６６の作製、並びに作られた融 合タンパク質および観測された触媒活性の両者がファージ粒子に由来することの 証明に関する。 ３２、ファージアルカ１　ホスファター亙Ω鳳事ＶノどＬＥグｊ２」二重 この実施例は、ファージ上に表示されたアルカリ性ホスファターゼのアルゼネー トーセファローズ（ａｒｓｅｎａｔｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）アフィニティーカ ラムへの結合、および反応生成物ホスフェートを使用してのこれらのファージの 特異的溶離に関する。 ３３、オキサシロンに・してＵけられた　のＦａｂ　コード　るＤＮＡのＰＣＲ アセンプＴ− この実施例は、ヘビー鎖およびライト鎖のＤＮＡ配列の別々の増幅および引き続 くアセンブリーによる、Ｆａｂ断片をコードするＤＮＡ挿入部の作製に関する０ 次いで、この構成物をファージベクターｆｄＣＡ↑２およびファージミドベクタ ーｐ［ＩＥＮｌの中に挿入し、そして表面上に表示されたＦａｂ断片は機能的で あることが示された。 裏旌五努ユ止旦ｌＩ　Ｉ　Ｉ　ヘルパーファージのこの実施例は、遺伝子ＩＩＩ の中の配列の欠失による、Ｍ１３に０７由来のへルバーファージの作製を記載す る。　ｐＣＡＴ３−ｓｃＦｖＤｌ、３のレスキューを記載する。　５ｃＦｖＤ１ ．３は欠失ファージを使用して融合体として高いレベルで発現され、ｆｄｃＡＴ ２−ｓｃＦｖＤｌ、３を使用しての発現と同等である。 ３５、パニング　を　しての、　に　゛、Ａ　−か−仮のリゾチームに・して０ 番　”」υい貝＼１兇烹１ユｍバクー１オファージの この実施例は、それらの表面上に発現されるリゾチームに対して向けられた５ｃ Ｆｖ断片の親和性に従う、バクテリオファージの選択に関する。異なる親和性の ファージをリゾチームでコーティングしたペトリ皿に結合させ、次いで洗浄し、 結合したファージをトリエチルアミンで溶離する。それと混合したファージより ５倍高い親和性をもつファージについて実質的なｆｌｌｖＭを得ることができる 条件が見いだされた。 ３６．バク−１オフ　−ジｆｄの　上での　・に・　なスフ　ロコ・カスヌクレ アーゼの この実施例は、スタフィロコッカスヌクレアーゼを発現するファージ酵素の作製 、およびファージ酵素がヌクレアーゼ活性を保持することの証明に関する。 ３７、　ｆｄフ　−ジの　上でのヒトＣＤ４の２つのアミノ　ドｌイ詠３先良丞 この実施例は、ＣＤ４のドメイン、細胞表面のレセプターおよび免疫グロブリン スーパーファミリーの構成員のバクテリオファージｆｄ中へのクローニングを包 含する。レセプターは、ＨＩシタンパク質ｇｐ１２０への結合によりペプチドの 表面上で機能的であることが示される。 ！Ｊｌ浜−且ユーテー１−株３［使用ニー２碧７アージ上に発Ｊ［きカ□ｌ五１ Ｅヒドロキシニ七二玉上ユバ矛ｆｆｉツ鹿生久変１尊９．又１旦〜よ」 この実施例は、ＤＮＡ複製の欠如のためにＤＮＡをランダムに変異させる菌株に おいて、ファージを増殖させることによって、ファージ中でクローニングされた 抗体の遺伝子中に突然変異を導入することに関する。いくつかの突然変異がファ ージ中に導入され、次いでこれらが親ファージから選択され得る。 Ｘ差貫叩＝吋−お用ｖＬトメ爪！！すＬ■１粘名家よる／ＮクテリｔｚＬ−ニジ の　上のＦａｂ　の この実施例は、機能的Ｆａｂ断片をｖ■およびＶＬドメインの非共有結合的会合 によりバクテリオファージの表面上に発現することができることを示す、νＨド メインは遺伝子Ｉ１１重合体として発現され、そしてＶＬドメインは可溶性粒子 として発現される。抗リゾチーム抗体Ｄ１．３からこれらのドメインをこの形態 で発現させる配列をファージ中に導入し、そして生ずる表示されたＦａｂ断片は ＥＬＩＳＡにより機能的であることが示された。 ０、　Ｆａｂ　シ　のヒ　ｖ−゛　−の１エ　りｏ−＝７グのためのＰＣＲに　 づ　′ この実施例は、抗体の遺伝子からのＦａｂ断片のアセンブリーの方法を記載する 。この実施例は、ヒトハイブリドーマおよびポリクローナルリンパ芽球細胞系に おけるＲｈｅｓｕｓ−８に対して向けられた抗体の遺伝子についてである。 ４１、　ＲｂｅｓｕｓＤ　上に　−　る　への　ムによる［１ｂｅｓｕｓＤ　に ・してｌ＋し”れたヒ　Ｆａｂ　ス玉１に≦シ１１区 この実施例は、ＲｈｅｓｕｓＤ抗原に対して向けられたヒトＦａｂ断片をコード するファージミドの作製及びそれからのファージ抗体の表示に関する０次いで、 この抗原を表示するファージを、５ｃＦｖＤ１．３抗リゾチームを表示するファ ージのバックグラウンドから、ＲｈｅｓｕｓＤ陽性赤血球への結合に基づいてア フィニティー選択した。 ！施■Ｃエヒ１−ｓｃＦｖ　の１エ　クローニングのためのＰＣＲ−４乏ふ返盃 この実施例は、免疫化されないヒトに由来する５ｅＦｖ断片のライブラリーの発 生を記載する。この実施例は、ＪｇＧおよびＩｇ？Ｉ配列に由来する５ｅＦｖ断 片のファージミド中のライブラリーのファージ表示のための調製についてである 。 ４３、しないヒトか°の５ｅＦｖの一イブラリーかゲｑ結査濯ばしく社）１除 この実施例は、免疫化されないヒトのＩｇＭ遺伝子に由来する５ｅＦｖ断片のラ イブラリーから、ＢＳＡ　、リゾチームおよびオキサシロンに対して向けられた ファージ抗体のクローンを分離することを記載する０選択は、パニングまたはア フィニティークロマトグラフィーおよびＥＬＩＳＡによる結合特異性の分析によ った。クローンの配列決定はそれらがヒト由来であることを示した。 ｍ朝−１私矛１ＬＣＦ上久１工粂ヘルパー７−７エ区（使月↓ヱ辺よ」ユ吐＝粁 仁７１ｊ火コのレス先五二この実施例は、免疫化されないヒト１ｇＭ遺伝子の５ ｅＦｖ断片のライブラリーから、千ログロブリンおよびオキサシロン対して特異 的なファージ抗体のクローンのファージ抗体のクローンを分離することを記載す る。この実施例において、Ｍ１３に０７ｇ１１１階３（ＮＣＴＣ１２４７８）、 遺伝子ＩＩＩを欠如するヘルパーファージ、を使用してレスキューを実施した。 門１３に０７でレスキューしたものと比較して、このファージでレスキューした ファージミドライブラリーについては、よりすくない選択のラウンドが必要であ るように思われた。 裏旌糎長−免段囮さ一貼−？ｌノ！Ｊ−１ウリゾチームに・する・　沃兄上を匹 ８１＆匿よ多、ファニジ」劣」し良ぎ株７：５ｃＦｖＤ１．復勿貰が公豊異Δ■ 麦叉 この実施例は、シチメンチョウ卵リゾチームを越えるニワトリ卵リゾチームの５ ｃＦｖＤ１．３による優先的認識において重要性をもつことが知られている残基 でランダムアミノ酸を置換することによって、ｐｃＡＴｓｃＦｖＤｌ、３を試験 管内変異誘発することを包含する。シチメンチョウ卵リゾチームを認識するファ ージ抗体について親和クロマトグラフィーにより選択した後、クローンをＥＬＩ ＳＡにより特異性について分析した。クローンの２つの群はニワトリおよびシチ メンチョウのりゾチームのいっそう等しい認識をもち、１つはシチメンチゴウ酵 素でＥＬＩＳＡシグナルを増加し、そして１つはニワトリ酵素についてのシグナ ルを減少した。 友施炎住工免交　しないマウス）”憬　れたνＬＫ″イブーリーによ　１メイン 　ることよる　の　の 珪 この実施例は、ニワトリ卵白リゾチーム（ｔｌＥＬ）に対して特異的な５ｃＦｖ Ｄ１．３のＶＬドメインをＶＬドメインのライブラリーで置換すると、シチメン チツウ卵白リゾチーム装置＞にも結合する５ｅＦｖ断片を選択することができる ことを示す、　５ｅＦｖ断片はファージ上に表示され、そして置でコーティング した管上のパニングにより選択を実施した。　ＥＬＩＳＡにより分析は、ＩＩＥ Ｌと比較して置への結合が増大したクローンを示した。　ＩＩＥＬへの最高の結 合をもつものを配列決定した。 Ｍユ旦玉ｙユＸ泣塁　弓　゛れた　への　人によるファージ　の　の　Ａしたフ 　−ジの　な での゛　口　に　る　の この実施例は、穏和な条件下での結合したファージの解放を可能にするためのア フィニティー選択法における切断可能な結合の使用を包含する。磁気ビーズに結 合したビオチン化０ｘ−ＢＳＡを使用する選択により、ｐＡｂ［）１．３を用い て混合物からｐＡｂＮＱｌｌをほぼ６００倍に濃縮した。ＢＳＡとビオチンとの 間の結合の切断はファージの溶出を可能とする。 叉施貫郵工五厘１男・　゛　−の゛　れたプール　るための　の゛　バク−ｌオ フ　−ジの　上に　スれた　のレパートを−の　小　るための笈朋 この実施例は、４−ヒドロキシ−３−二トロフェニル酢酸に対して閏けられた抗 体をコードする遺伝子の濃縮されたプールを生成するための細胞選択の使用を包 含し、そしてこの技術を使用してバクテリオファージ表面上に表示された抗体の レパートリ−の複雑さを減少することができる方法を記載する。 １．　占奮ンカーの一゛　およびベク　ｆｆ１Ｊｉベクターｆｄ−Ｌｅｔはテト ラサイクリン耐性遺伝子を挟む２つのＢｓｔＥＩＩ制限部位を有する（第３図） 、ＶＯ断片を挿入する法策は遺伝子ＩＩＩ内の新しく挿入されたＢｓｔＥＩＩ部 位にそれらを連結することであったので、もとのＢｓｔＥ１１部位をｆｄ−ｔｅ ｔから除去することは有利であった。 これは次のようにして達成された。　ｆｄ−ｔｅｔを制限酵素ＢｓｔＥＩＩで消 化し、５′オーバーハングをフィルインし、そして再連結してベクターｆｄＴδ Ｂｓｔを発生させた。　ｆｄ−ｔｅｔのＢｓｔＥＩＩ（０，５単位／μｌ）によ る消化は、Ｉ　ＸＫＧＢ　ＩＥ衝液（１００ｓＭグルタミン酸カリウム、２３ｍ １Ｍトリス−アセテート（ｐ［１７，５）、１０−Ｍ酢酸マグネシウム、５０μ ｇ／霧ｌのＢＳＡ　、　０．５ｍＭジチオスレイトール（Ｓａｓｂｒｏｏｋｔ　 Ｊ、　ら、１９８９、前掲）中でＤＮＡを２５ｎｇ／μｍの濃度において使用し て実施した。５′オーバーハングは、２　ＸＫＧＢ　ＩＩ衝液、２５０ｕＭの各 ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、。 Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｈｏｕｓｅ＋　Ｍｉｄｓｕ＋５ｓｅｒ　Ｂｏｕｌｅｖａｒ ｄ、　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ、　Ｂｕｃｋｓ、。 ＵＫ）およびクレノー断片（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ＋ 　Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐｌａｃｅ。 Ｇｒｅｅｎ　Ｅｖｄ、　Ａｙｌｅｓｂｒｕｙ、　Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）を０．０４ 単位／μｌにおいてを使用してフィルインした。室温において１時間インキュベ ーションした後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール 沈澱させた。 結合は５０ｎｇ／μＩのＤＮＡ濃度において実施した。結合体をコンピテントＴ ＧＩ細胞中に形質転換し、そして１５μｇ／−１のテトラサイタリンを補充した ＴＶプレート上にプレイティングした。これはベクターについて選択し、ここで テトラサイクリン耐性タンパク質の遺伝子は結合工程の間にベクターの中に再挿 入された。コロニーを１５μｇ／−１のテトラサイタリンを補充した２５１の２ ＸＴＹ培地の中に取り上げて入れ、そして３７℃において増殖させた。 二本ｇｉＤＮＡを、生ずるクローンから、ｇｅｎｅ−ｃｌｅａｎｌ　Ｉキット（ ＢｉｏｌＯ１１ｎＣ０＋米国カリフォルニア州ラジッラ、郵便私書箱２２８４） を使用しそしてそこに記載されている小規模の迅速プラスミドＤＮＡ分離手順に 従い精製した。５つの生ずるクローンの向きを制限酵素Ｃ１ａｌを使用してチェ ックした。Ｃ１ａｌによりｆｄ−ｔｅｔと同一の制限パターンを与えるが、Ｂｓ ｔＥＩＩ部位をもたないクローンを選択した。 ｆｄＴ　６　Ｂｓｔの試験管内変異誘発を使用して、遺伝子ＩＩＩ　シグナルペ プチドの下流にかつ遺伝子ＩＩＩ　コード配列とフレームを合わせて抗体断片を クローニングすることを促進する、適当な制限部位をもつベクターを発生させた 。変異誘発系バージ四ン２を指令するオリゴヌクレオチド（Ａａ＋ｅｒｓｈａｍ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）をオリゴ１（第４図）とともに使用して、ｆｄ ＴＰｓ　／Ｂｓを作った（Ｖ１１１００クローニングを促進するために）　、　 ｆｄＴＰＳ／Ｂｇの配列（第４図）は、配列バージョン２．０キツト（ＵＳＢ　 Ｃｏｒｐ、、米国オハイオ州タレブランド、郵便私書箱２２４００）をプライマ ーとしてオリゴ３（第４図）とともに使用して確認された。 第２ベクターｆｄＴＰｓ　／ｘｈ　（一本［Ｆａｂ断片のクローニングを促進す るために）は、Ｖｅｎｋｉｔａｒａｍａｎ、　Ａ、Ｒ０＋　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１７＋　ｐ３３１４の方法に従い、ｆｄＴＰｓ　／Ｂｓをオリゴ ２で変異誘発することによって発生させた。　ｆｄＴＰｓ　／Ｘｂの配列（第４ 図）がセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージ式ン２．０キット（ＵＳＢ　 Ｃａｒｐ、）をプライマーとしてのオリゴ３と共に使用して確認された。 明らかなように、別の構成は当業者にとって明らかであろう０例えば、Ｍ１３お よび／またはその宿主細菌を修飾し、こうしてその遺伝子ＩＩＩが過剰な細胞の 死の開始を伴わないで崩壊するようにすることができる；修飾されたｆｄ遺伝転 子ＩＩまたは他の修飾されたタンパク質は、−末鎖ファージ複製起点を含有する プラスミド、例えば、ｐＵｃ１１９中に組み込むことができ、引き続く修飾され たファージ、例えば、ＫＯ７を使用する重感染は、部分的にヘルパーファージに 由来しそして部分的にファージ抗体遺伝子ＩＮ構成体に由来するコート中へのフ ァージ抗体ゲノムの封入を生じさせるであろう。 ベクター、例えば、ｆｄＴＰｓ　／Ｂｓの詳細な構成はファージ抗体の目的を達 成する単なる１つの方法である０例えば、粘着フィートクローニング／変異誘発 （Ｃ１ａｃｋｓｏｎ、　Ｔ、および一１ｎｔｅｒ、　Ｇ、１９８９．　Ｎｕｃｌ 。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１７．　ｐ１０１６３−１０１７０）のごとき技法を使用 して、制限酵素消化および／または連結工程の使用を回避することができる。 Ｚ　フ　−ジの　への　グロブリンＦｖドメインのプラスミド５ｃＦｖＤ１．３ ｍｙｃ（ＧＪｉｏｔｅｒおよびＡ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓから入手）は、ペプチド リンカ−配列を経て融合して抗体Ｄ１．３の一本１ｉＦｖバージ５ンを形成する 抗体Ｄ１．３からのＶＢおよびＶＬ配列を含有する。　５ｃＦｖＤ１、ａｗｙｃ 中のｓｃＦνの配列および取り囲む配列を第５図に示す。 ０１．３抗体はニワトリ卵リゾチームに対して向けられており（Ｈａｒｐｅｒ。 河、ら、１９８７、Ｍｏ１ｅｃ、ｒ＋ｕｗｕｎｏ１．２４．９７−１０８）　、 そして大腸菌中で発現された５ｃＦｖ形態は同一の特異性を有する（Ａ、Ｇｒｉ ｆｆｉｔｈｓおよびＧＪｉｎｔｅｒの私信）。 ５ｃＦｖＤ１．３ｍｙｃをＰｓｔＩおよびＸｈｏｌ　（これらの制限部位は第５ 図に示されている）で消化することにより、５ｃＦｖの全体をコードする６９３ ｂｐの断片が生ずる。この断片をＰｓｔＩおよびＸｈｏｌで切断したｆｄＴＰｓ 　／Ｘｈ中に連結すると、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドおよび完全なり１． ３ｓｃＦνに融合した最初のアミノ酸をコードする構成体ｆｄＴｓｃＦｖＤ１． ３が生じ、次いでアミノ酸２から成熟遺伝子ＩＩＩタンパク質が生じた。 ベクターｆｄＴＰｓ　／Ｘｈは、連結のために、ＰｓｔＩおよびＸｈｏｌで２時 間消化し、次いで仔つシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ ａｎｎｈｅｉｓ＋　ＵＫ　Ｌｔｄ、、　Ｂｅ１ｌ　Ｌａｎｅ、　Ｌｅｗｅｓ＋　 Ｅａｓｔ　５ｕｓｓｅｘ、　ＢＮ７１ＬＧ）で１単位／μｌにおいて３０分間３ ７℃において消化することによって調製された。新鮮な子ウシ腸アルカリ性ホス ファターゼを２単位／μｌの合計の濃度で添加し、そして３７℃においてさらに ３０分間インキュベージぢンした０反応混合物をフェノール／クロロホルムで３ 回抽出し、エタノール沈澱し、そして水中に溶解した。　５ｃＦｖＤ１．３ｍｙ ｅからの挿入部を適当な制限酵素（ＰｓｔｌおよびＸｈｏＩ）で切り出し、フェ ノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈澱し、そして水中に溶解した 。連結は実施例１に記載するように実施したが、ただしベクターおよび挿入部の 試料の両者は各々５＋＋ｇ／Ｉ！１の最終濃度であった。正しい構成物の形成が 実施例１に記載するように配列決定することによって確認された。 期待した大きさのタンパク質が産生したことを証明するために、ヴイリオンを前 述し、たようにＰＥＧ沈澱により濃縮した。試料をＳａ■ｂｒｏｏｋ　Ｊ、ら１ ９８９前掲に記載するように電気泳動のために！ｌｉ製した。２−１の上澄み液 相当量を１８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に負荷した。電気泳動後、ゲ ルを２０％のメタノールを含むゲル展開用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　３８ ０ｍＭグリシン、０．１％の５ＤＳ）中に１５分間浸漬した。ニトロセルロース フィルターへの転移は、新鮮なＩＸ展開用緩衝液／２０％メタノール中でＴＥ７ ０セミ・フォール（Ｓｅｍｉ　Ｐｈｏｒ）半乾燥プロッティング装置（Ｉｌ［ｏ ｅｆｆｅｒ、米国カリフォルニア州９４１０７、サンフランシスコ、郵便私書箱 ７７３８７　、ミネソタストリート６５４）を使用して実施した。 転移後、フィルターをリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中でミルク粉末（Ｍａｒｖｅｌ ）の２％溶液中で１時間インキュベーションすることによってプロフキングした 。ファージ抗体融合タンパク質の中の５ｃＦｖおよびＶＨタンパク質の検出は、 アフィニティー精製され細菌により発現された５ｃＦｖ断片（ＧＪｔｎｔｅｒか ら入手した）に対してレイズされたつサギポリクローナル抗血清の１　／１００ ０希釈物（２％のミルク粉末）でフィルターを１時間浸漬することによって実施 した。　ＰＢＳで洗浄（３×５分の洗浄）した後、結合した一次抗体をセイヨウ ワサビペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ、　Ｆａｎｃｙ　 Ｒｏａｄ＋　Ｐｏｏｌｅ。 Ｄｏｒｓｅｔ、　Ｂ［１１７７Ｎ＋Ｉ、　Ｕに）により１時間検出した。フィル ターをＰＢＳｌｏ、１％ノドリド７Ｘ−１００中で洗浄し、そしてＰＢＳ中０． ５Ｂ　／、１ｔ７）３．３′−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライ）’ 　（ＤＡＢ）、０．０２％の塩化コバルト、０．０３％の過酸化水素で展開した 。 結果が示すように、クローンｆｄＴＶ１（０１，３（実施例３がら、Ｖｌｌをコ ードする配列を組み込んでいる）およびｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３（ｓｅＦｖをコ ードする配列を組み込んでいる）を使用すると、６９，０００〜９２，５００ダ ルトンのタンパク質が抗Ｆｖ血清により検出される。これは構成された融合タン パク質について期待された大きさである。この産生物はｆｄ−ｔｅｔ。 ｓｄＴδＢｓｔまたはｆｄＴＰｓ　／Ｘｈに由来する上澄み液の中に観測されな い。 ！Ｊｉ１１−」ジーニオ抗！　主さくＤ免　グロブリンＶＨドメインのＤｌ、３ から＋７）Ｖ）１断片をプラスミドｐｓ１１１−Ｖ）１０１．３−ＴＡＧＩ（Ｗ ａｒｄ、　Ｅ、Ｓ、ら、１９８９前掲）から発生させた。このプラスミドをＰｓ ｔｌおよびＢｓｔεＩＩで消化すると、第５図において位置１１３と４３２との 間に示す断片が発生する。この断片をｆｄＴＰｓ　／ＢｓのＰｓｔＩおよびＢｓ ｔＥ１１部位の中にクローニングすると、構成物ｆｄＴＶＨＤ１．３が生じ、こ れは成熟遺伝子ＩＩＩタンパク譬（アミノ酸２は欠失している）の第１および第 ３アミノ酸の間に挿入された完全なりＨドメインをもつ融合タンパク質をコード する。 使用した方法は正確に実施例２におけるようなものであるが、ただし使用したベ クターはＰｓｔＩおよびＢｓｆＥＩＩで消化したｆｄＴＰｓ　／Ｂｓであった。 ４、　フ　−ジ　の　ム　の 特異的抗原リゾチームへの種々のファージ抗体の結合をＥＬＩＳ＾技術を使用し て分析した。ファージ抗体（例えば、ｆｄＴＶＨＤｌ、３およびｆｄＴｓｃ　／ ＦｖＤ１．３）を大腸菌中で増殖させ、そして材料および方法に記載するように ＰＥＧで沈澱させた。結合したファージ抗体粒子を、密接に関係するファージＭ １３に対してレイズされたポリクローナルヒツジ血清を使用して検出した。 ＥＬＩＳＡ　プレートは、９６ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ　Ｍｉｃｒｏｔｅ ｓｔ　ＩＩＩ柔軟性プレー）、　Ｆａｌｃｏｎ　：　Ｂｅｃｔ　ｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ　、米国カリフォルニア州９３０３０　、オックス フォード、ライリアミスドライブ１９５０）を２００　ｕ　ｌの５０ｓ＋Ｍ　Ｎ ａＨＣＯｓ中リゾチーム溶液（特記しない限り、１■ｇ／■Ｉ）で１６〜２４時 間コーティングすることによって調製した。使用前に、この溶液を除去し、プレ ートをＰＢｓの中で数回すすぎ、そして２００μＩの２％ミルク粉末／ＰＢＳと 共に１時間インキュベーションした。　ＰＢＳで数回すすいだ後、１００　Ｉｌ ｌの試験試料を添加し、そして１時間インキュベージジンした。プレートを洗浄 した（０．０５％のツイーン２０／ＰＢＳの中で３回すすぎ、次いでＰＢＳ単独 の中で３回すすいだ）、結合したファージ抗体は、２００ｕｌ／ウエルの２％ミ ルク粉末／ＰＢＳ中ヒツジ抗体Ｍ１３ポリクローナル抗血清（Ｇ、Ｗｉｎｔｅｒ から入手したが、同等の抗体を当業者は標準方法を使用して容易に調製すること ができる）の１　／１０００希釈物を添加しそして１時間インキュベーションす ることによって検出した。前述したように洗浄後、プレートをビオチン化抗ヒツ ジ抗体（Ａｓｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）と共に３０分間イン キエベーシッンした。プレートを前述したように洗浄し、そしてストレプトアビ ジン−セイヨウワサビベルオキシダーゼ複合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ）と共にインキエベーシタンした。前述したような最後の洗浄 後、クエン酸塩緩衝液中０．５ｍｇ　７■ｌの＾ＢＴＳ蟇賀を添加した（ＡＢＴ Ｓ＝　２　’　、２　’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸 ）；クエン酸塩緩衝液”　５０ｍＭクエン酸、５０−Ｍクエン酸三ナトリウム、 ５４　：　４６の比、過酸化水素を０．００３％の最終濃度に添加し、そしてプ レートを１時間インキュベーションした。　４０５ｎ園における光学密度をタイ ターチク（Ｔｉ　ｔｅｒｔｅｋ）マルチスキャンプレートリーダーで読んだ。 第６図は変化する量のファージ抗体の効果を示す、　１００μｌのＰＥＧ沈澱し たファージの種々の希釈物を適用し、そして量はそれが由来するもとの培養物の 体積により表した。　５ｃＦｖを含有するファージ抗体（ｆｄＴｓｅＦｖＤｌ、 ３）およびＶ）Ｉを含有するファージ抗体（ｆｄＴＶＨＤｌ、３）の両者並びに Ｖｆｌを含有するファージ抗体に由来するシグナルは、ファージ抗体ベクター（ ｆｄＴＰｓ／Ｘｈ）に由来するものより高かった。最高のシグナル／ノイズ比は １．３■ｌの培養物の当量を使用して起こる。 第７図は、プレートを変化する濃度のりゾチームまたはウシ血清アルブミン（Ｂ ＳＡ）でコーティングした結果を示す、１■ｌのもとのファージ抗体培養上澄み 液相当量を使用した。　ｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３に由来する上澄み液からのシグ ナルは、やはりリゾチームでコーティングしたウェルを使用したとき、ｆｄＴＰ ｓ　／Ｘｈに由来するものより高かった。 プレートをＢＳＡでコーティングしたとき、これらの２つの型の上澄み液の間に 有意差は存在しなかった。広く述べると、プレート上のシグナルのレベルはコー ティングしたりゾチームの量に比例する。 これらの結果は、検出された結合は抗原としてのリゾチームに対して特異的であ ることを示している。 ５、ｆｄＣＡＴ２の ＤＮＡを頻繁に切断せず、こうしてそれらのコード配列内の抗体遺伝子の挿入部 の不必要な消化を回避する制限酵素の使用を可能にするベクターを設計すること は有用であろう、８塩基認識配列をもっ酵素、例えば、ＮｏｔＩおよび５ｔｉｒ はこの面においてとくに有用である。 Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（ＰＮＡＳ　８７　ｐ１０６６−１０７０．１９９０）は 、抗体の可変遺伝子の中にまれに存在する多数の制限部位を同定した８本発明者 は、これらの部位の２つを利用するベクターを、この型の酵素を使用することが できる例として、設計しそして作製した。酵素ＡｐａＬ１およびＮｏｔｌのため に必須な部位をｆｄＴＰｓ　／Ｘｈ中に操作してｆｄＣＡＴ２をつくった。 ｆ　ＩＪゴ、；ＣクレｔチＦ　：　５　’　ＡＣＴ　ＴＴＣＡＡＣＡＧＴ　ＴＴ ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＣＣＴＧ　Ｃ ＡＧ　ＴＴＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＴＧＣＡＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＡＧＡＡ３ ’を合成しく前記の第４図の凡例）そして実施例１に示すように使用して、試験 管内変異誘発キット（Ａｓｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）により ｆｄＴＰｓ　／Ｘｈを変異誘発してｆｄ−ＧＡＴ２を作製した。　ｆｄ−ＧＡＴ ２の配列をＤＮＡ配列決定により操作した部位付近においてチェックした。 遺伝子Ｉｌｌ内の挿入点付近の最終的配列を第８図に示す。 注：　ｆｄＣＡＴ２は、この明細書中で別の名称ｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧＩおよび ｆｄＤＯＧｌとも称される。 ６、　に・するファージ　（Ａｂ）の　、　ムリゾチームへのｐＡｂＤｌ、３　 （実施例２のｆｄＴｓｃＦｖＤｌ、３）の結合をＥＩｊＳＡにより分析した。 ファージにより形質導入した細菌の培養物を、ｌＯ〜１００ｓ＋１の１５μｇ７ ７ａＩのテトラサイクリンを含有する２ＸＴＹ培地中で調製し、そして震盪しな がら３７℃において１６〜２４時間増殖させた。ファージの上澄み液を培養物の 遠心により調製した（１０．０００ｒｐ柵において１ｏ分、８　Ｘ５０ｍ１のロ ーター、５ｏｒｖａｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心機）、この段階において、ファージのタ イターは１〜５Ｘ１０＋・／■ｌ形賞導入単位であった。ファージは１１５体積 の２０％ＰＥＧ及び２．５Ｍ　ＮａＣ１を添加し、４℃において１時間放置し、 そして遠心することによって沈澱させた（上を参照）、ファージの沈澱物を１０ ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）中にもとの体積の１ 　／１００に再懸濁し、そして残留する細菌および凝集したファージをベンチ型 マイクロ遠心機で２分間遠心することによって除去した。 且旦Ｌ プレートを、実施例４に記載するように、抗原（１回ｇ／冒ｌの抗原）でコーテ ィングし、そしてブロッキングした。２Ｘ１０１６フア一ジ形賞導入単位を、２ ％のスキムミルク粉末（ＭＰＢＳ）を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）中で抗 原でコーティングしたプレートに添加した。プレートを、各工程の間で、ＰＢＳ 中０．５％のツイーン２０による３回のすすぎおよび引き続＜　ＰＢＳによる３ 回のすすぎにより洗浄した。結合したファージはヒツジ抗Ｍ１３抗血清と共にイ ンキュベーションすることによって顕現し、そしてセイヨウワサビペルオキシダ ーゼ（ＨＲＰ）結合抗ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ、　Ｐｏｏｌｅ＋　Ｄｏｒｓｅｔ、 　ＵＫ）で検出した。この血清はまた、ヒツジ免疫グロブリンおよびＡＢＴＳ　 （２’　、２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリルスルホン酸）をも検 出する。 適当な期間後、４０５ｎ−において読み取った。結果（第９図）が示すように、 抗体を有するファージはもとのＤｌ、３抗体と同一の反応性パターンを有しくＨ ａｒｐｅｒ、　Ｍ、、　Ｌｅｓａ、　Ｆ、＋　Ｂｏｕｌｏｔ、　Ｇ、およびＰｏ １ｊａｋ。 ＦＪ、（１９８７）Ｍｏｌｅｃ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、２４．９７−１０８）　、そ してニワトリ卵白リゾチームに結合したが、シチメンチョウ卵白リゾチーム、ヒ トリゾチームまたはウシ血清アルブミンに結合しなった。ファージの特異性は、 ニワトリ卵白リゾチームと７アミノ酸だけ異なるシチメンチョウ卵白リゾチーム への結合の欠如によりとくに示される。 ７、　ＦａｂＤｌ、３００　− この実施例の目的は、実施例２において使用したＦｖフォーマツｌ、がｐＡｂ系 において抗体断片を表示する単に１つの方法であることを証明することであった 。より普通に使用される抗体断片はＦａｂ断片（第１図）であり、そしてこの実 施例はＦａｂ様断片をその表面上に発現するｐＡｂの作製を記載し、そしてそれ がその抗原に特異的に結合することを示す、　ｐＡｂそれ自体内のコード配列が らのＶ［ＩおよびＣ１１ｌドメインから成る抗体断片のヘビー鎮を発現し、そし てｐａｂで感染した細菌宿主細胞中でライト饋を発現するように、本発明は選択 した。抗リゾチーム抗体Ｄ１．３のＶｌｌおよびＣＨＩ　ｆｆ埴をｆｄＣＡＴＺ 中にクローニングし、そして対応するライト鎖をプラスミドｐＵｃ１９中にクロ ーニングした。５ｋｅｒａａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（Ｓｃｔｅｎｃｅ　２４ ０．　ｐ１０３８〜１０４０（１９Ｅｉ８）およびＢｅ　ｔ　ｔｅｒら１９１１ １８前掲の研究が証明しているように、抗体分子のマルチマーの抗原結合断片を 、適当なシグナル配列を使用して機能的形態で細菌細胞のペリプラズムの中に分 泌させることができた。しかしながら、これらの刊行物において、細胞から結合 タンパク質を回収するために特別の手段を必要とすると記載されており、例えば 、５ｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈａ纏はアフィニティークロマトグラフィー によりＦｖ断片をペリプラズムから回収することが必要であった。 本発明において、結合分子をファージ粒子上の細胞の外側に向けることができ、 これはいくつかの事象が起こることを必要とするプロセスである：結合分子の正 しい分泌およびフォルディング；結合分子の鎖の会合；ファージ粒子の正しいア センブリー；および細胞からの完全なファージ粒子の輸送。 あるいは、しかしながら、例えば、発現カセットをファージゲノム中の適当な位 置にクローニングすることによって、ｐＡｂのゲノム内からライト鎖を発現する ことができる。このような適当な位置は、関係するファージＭ１３の誘導体中に 操作したマルチクローニング部位を収容する遺伝子開領域であろう（例えば、Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ。 ら、Ｇｅｎｅ　３３．　ｐ１０３−１１９（１９８５）を参照のこと）。 この実施例の出発点はｐＵｃ１１９中のクローンＦａｂＤ１．３であり、そのマ ツプは第１０図に示されている。下記のオリゴヌクレオチドＫＳＪ６Ｊよび７と ハイブリダイゼーションする領域は第１０図において下線で示されている。　ｖ ｕ−ｃＨｔｌ域をコードする配列（下記のオリゴヌクレオチドＫＳＪ６および７ により５′および３′縁において定義される）を、５′末端にＰｓｔＩ部位を保 持しかつ３′末端にＸｈｏ１部位を導入してｆｄＣＡＴＺ中へのクローニングを 促進するオリゴヌクレオチドＫＳＪ６および７を使用して、ρＵＣ１９中のＦａ ｂＤｌ、３からＰＣＲ増幅した。オリゴヌクレオチドＫＳＪ６および７のための 配列を下に示す、　ＫＳＪ７の下線が引かれている領域は、Ｄｌ、３の配列とハ イブリダイゼーションする部分を示す。 ＫＳＪ６：　５’　ＡＧＧ　ＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧ　ＡＧＴ　ＣＡＧ　Ｇ３ ’ＫＳＪ７：　５’　ＧＧＴＧＡＣＣＴＣＧＡＧ　ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＴＴＴＧＧ Ｇ　ＣＴＣＡＡＣＴＴＴ　Ｃ３’ＰＣＲの条件は実施例ＩＩに記載する通りであ ったが、ただしＰＣＲ増幅の３０サイクルを９２°Ｃで４５秒間の変性、５５° Ｃにおける１分間のアニーリングおよび７２°Ｃにおける１分間の伸長で実施し た。使用した鋳型はｐＵＣ１９中にＦａｂＤｌ、３を含有するＴＧＩ細胞からの ＤＮＡであり、水の中に再？Ａ濁させ、そして沸騰させた。鋳型ＤＮＡは、コロ ニーから、いくつかのコロニー物質を１００　ｕ　Ｉの蒸留水中に取り、そして １０分間沸騰させることによって調製した。１μｌのこの混合物を２０μｍのＰ ＣＩ＋において使用した。この方法は約６００ｂｐの期待した断片の増幅をもた らした。この断片をＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで切断し、アガロースゲルから精製 し、そしてＰｓｔｌ／ＸｈｏＩ切断したｆｄＣＡＴ２の中に連結した。 Ｐｃｔ？　ｉｌ１合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール 沈Ｒ（Ｓａｗｂｒｏｏｋら、前掲）させた後、ＰｓｔｌおよびＸｈｏｌ（Ｎｅｗ 　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で製造業者の指示に従い消化した。断片を１ ％のトリス−アセテートＥＤＴＡアガロースゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲） 上で分割し、そしてシーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（ＢＩＯ１０１＋　 Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、米国カリフォルニア州すンジエゴ、ラジゴラ）を使用して 製造業者の指示に従い精製した。 ｆｄ−ＣＡ７２ベクターＤＮ＾をＰｓｔｌおよびＸｈｏｌ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａ ｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で製造業者の指示に従い消化し、フェノール／クロロホ ルムで抽出しそしてエタノール沈澱させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）。 ７５ｎｇのＰｓｔｌ／Ｘｈｏｌ消化したベクター［ＩＮＡを、１２μｌの結合緩 衝液（６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）、５　ｍＭ　ＭｇＣｈ、５閣 阿ジチオスレイト−７し、１１００ｕ／ｍｌのウシ血清アルフ″ミン、０．５ｓ ＋Ｍ　ＡＴＰ　、　０．５ｓＭスパーミジン）中で４０ｎＨのＰｃｔ？増幅した ＰｓｔＩ／Ｘｈｏｌ消化ｈＥＧＦ−１？断片および４００単位のＴ４ＤＮＡ　リ ガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）と１６℃において１６時間 結合した。 ２−１の連結混合物を２０（ｈｌのコンピテント大腸菌ＭＣ１０６１細胞中に形 質転換し、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２７Ｙ寒天上にプレイ ティングし、そして３０℃において２０時間インキュベーションした。結合反応 混合物の一部分を大腸＠　ＭＣｌ０６１（例えば、ＣＩｏ＋＋ｔｅｃｈＬａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、カリフォルニア州パロアルト、から入手可能であ る）の中に形質転換し、そして実施例１０に記載するようにオリゴヌクレオチド Ｄ１．３ＣＤＩ２３Ａ　とハイブリダイゼーションさせることによってコロニー を同定した。同様に、ＶＦＩＣＨＩ遺伝子断片の存在をＰＣＨによりオリゴヌク レオチドにＳＪ６および７を使用して確認した０代表的なりローンをｆｄｃＡＴ ２ＶＨｃＨＩＤ１．３と呼んだ、ヘビー鎖はｐＵｃ１９中のＦａｂＤｌ、３から 、ＦａｂＤｌ、３プラスミドＤＮＡのＳｐｂ　Ｉ切断により欠失させた。ライト 鎖の遺伝子を含有するｐＵｃ１９の２．７ｋｂの断片をＴＡεアガロースゲルか ら精製し、そして１０ｎｇのこのＤＮＡを自己連結させ、そしてコンピテント大 腸１ｉＴＧｌ中に形質転換した。細胞をアンピシリン（１００ｕ　ｇ　／　ｍｌ ）を含有する２７Ｙ寒天上にプレイティングし、そして３０℃において一夜イン キエベーシタンした。生ずるコロニーを使用してミニブレブＤＮＡ　（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋら、前掲）をつくり、そしてヘビー饋遺伝子の不存在を５ｐｈｒおよび 旧ｎｄｌｌｌで消化することによって確認した０代表的なりローンをＬＣＤ１． ３Ｄ）ＩＣと呼んだ。 ｆｄＣＡＴ２ＶＨ（Ｊｌ［１１，３）−夜の培養物を１３，０ＯＯＸ　ｇ　テｌ ｏ分間マイクロ遠心し、そして５０μＩのファージ粒子を含有する上澄み液を、 ５０μｌのＬＣＤ１．３ＤＨＣ細胞の一夜培養物に添加した。細胞を３７℃にお いて１０分間インキュベージタンし、そしてアンピシリン（１００ｕｇ／園ｌ） および１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ＴＹ寒天上にプレイティ ングした。生ずるコロニーのいくつかからファージを調製し、そして実施例６に 記載するようにリゾチームと結合する能力につぃてアッセイした。 結果（第１１図）が示すように、もとの抗体Ｄ１，３がらのヘビー鎖およびライ ト鎖のＦａｂ誘導体が存在するとき、ｐＡｂはリゾチームに結合した。　ｆｄＶ ＨｃＨ１断片を発現するｐＡｂは、ライト鎖をも発現する細胞中で増殖させない かぎり、リゾチームと結合しない。これが示すように、機能的Ｆａｂ断片は、遺 伝子ＩＩＩに融合されそしてｐａｂの表面上で発現されたりＨＣＨＩ断片と遊離 ライトＩを会合させることによって産生された。 １ｉｉｉ瀾盈−ｊツタ−７７−’、；　（７）−混、１ｈ叡方■符１力ｍλ乙乙 二乏■牙居 本発明者は、抗原親和性カラムを使用して、混合物がらｐＡｂ（０１，３）（実 施例２において本来ｆｄＴｓｅＦｖＤ１．３と呼んだ）を精製した。ｐＡｂ（Ｄ ｌ、３）をベクターｆｄファージ（表１参照）と混合し、そしてほぼ１０′２の ファージをリゾチーム−セファローズカラム（臭化シアン活性化セファロース４ Ｂ（Ｐｈａｍａｃｉａ、　Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｍｅｓ、　Ｂｕｃｋｓ、　ＵＫ ）がら製造業者の指示に従い調製したもの）に通過させた。　ＴＧＩ細胞を溶出 液の適当な希釈物で感染させ、そして誘導されたコロニーをｐＡｂ（０１，３） のみを検出するオリゴヌクレオチドでブロービングすることによって分析した０ 表１および第１２図を参照のこと、　ｐＡｂ（０１，３）の１０００倍の濃縮が カラムの１回通過で見られた。濃縮したファージを増殖させそしてそれをカラム に再び下方に通過させることによって、１００万倍までの濃縮が見られた。 濃縮はまた、純粋に免疫学的基準を使用して実証された０例えば、１０Ｉ！のフ ァージ（１ｐＡｂ（０１，３）　／　４　Ｘ１０’ｆｄＴＰｓ／Ｂｇの比で）を ２ラウンドのアフィニティー選択にかけ、次いで２６コロニーを取り、そして− 夜増殖させた０次いでファージをリゾチーム結合についてＥＬＩＳＡによりアッ セイした（実施例６におけるように）、５つのコロニーかりゾチーム結合活性を もつファージをもたらしく表１を参照のこと）、そしてこれらはＰＣＲスクリー ニングにより５ｃＦｖ（Ｄｌ、３）をコードすることが示された（実施例１３． ９２℃で１分、６０”Ｃで１分、７２゛ｃで１分の３０サイクルを使用し、プラ イマーとしてＣＤＲ３ＲＣＲ１およびオリゴ３（第４図）を使用する）。 こうして、非常に希なｐＡｂを、抗原を使用して選択し次いでファージをスクリ ーニングすることにより大きい集団がら取り出すことができる。 この実施例において、ｐＡｂのアフィニティークロマトグラフィーおよびオリゴ ヌクレオチドによるブロービングを後述するように実施した。 １ｍｌの−ＰＢＳ中約１０目のファージ粒子を、ＭＰＢＳ中で前取て洗浄した。 リゾチーム−セファローズアフィニティーカラム１１上に負荷した。 このカラムを引き続いて１０ｍ１のＰＢＳ　、次いで１０ｍ１ノ５０ｍＭ　Ｔｒ ｉｓ４ＣＩ。 ５００５Ｍ　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，５）　；次いで１０ｍ１の５０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ−ＨＣｌ、　５００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ８，５）　ｉ次いで５１の５０ｓ＋ Ｍ　Ｔｒｉｓ−）１ｃＩ、　５００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ９，５）　（トリエチ ルアミンで調節した）で洗浄し、次いで５ｍｌの１００ｍＭ　［−リエチルアミ ンで溶出した。溶出液を０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１６．８）で中 和し、そしてファージを分析のためにプレイティングした。第２ラウンドのアフ ィニティークロマトグラフィーのために、第１カラムの溶出液を約３０．０００ 　石ロニー／ペトリ皿にプレイティングした。 −夜の増殖の後、次いでコロニーを５−１の２ＸＴＹ培地中に引っ掻いて入れ、 そして２０μｌのアリコートを１０ｍ１の新鮮な培地中に希釈し、そして−夜増 殖させた。ファージを前述したようにＰＥＧ沈澱させ、１＋＋１の？ＩＰＢＳ中 に再懸濁し、そしてカラム上負荷し、そして上のように溶出した。 、ｔ’Ｊ：ｆヌｌｚ、ｔチ）−ＣＤＲ３ＰＣＲ１５’　ＴＧＡ　ＧＧＡ　Ｃ（Ａ またハＴ）　Ｃ（ＡまたはＴ） ＧＣＣＧＴ　ＣＴＡ　ＣＴＡ　ＣＴＧ　ＴＧＣ３’を合成した。 ｐＡｂ（Ｄｌ、３）に対して特異的な４０ピコモルのオリゴヌクレオチドＶＨＩ ＦＯＲ（Ｗａｒｄ、　Ｅ、Ｓ、ら（１９８９）　Ｎａｒｔｕｒｅ　３４１．５４ ４−５４６）を、１００　μＣ４のα−２３Ｐ ＡＴＰでリン酸化し、６×塩類溶液クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）　（Ｓａｗ− ｂｒｏｏｋら前掲）ｌｌ衝液中でニトロセルロースフィルターに６７℃において ３０分間ハイブリダイゼーションしく１ピコモル／■１）そしテ室温に３０分間 冷却し、３Ｘ１分６０″Ｃにおいて０．Ｉ　Ｘ５ＳＣの中で洗浄した。 ９、ハブーン′　るＡｂの オキサシロンは免疫応答の詳細を研究するために普通に使用されるハブテンであ る。抗オキサシロン抗体ＮＱＩＩは従来記載されている（ε、ｇｈｅｒａｒｄｉ 、Ｒ，Ｐａｎｎｅｌｌ＋　Ｃ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｊ、Ｉｍｗｕｎｏｌ、Ｍｅｔ ｈｏｄ　１２６　６１６８）　、　Ｖ）ＩおよびＶＬ遺伝子の間に５ｃＦｖＤ１ ．３ｍｙｃのＢｓｔＥＩＩ／５ｐｈｌ断片（第５図のヌクレオチド４３２−４９ ９）を挿入することによって、ＮＱＩＩのＶＨおよびＶＬ遺伝子を含有するプラ スミドをｓｃＦν形態に転化してｐＡｂＮＱｌｌを発生させ、その配列を第１３ 図に示す、この５ｃＦｖをＦｄＴＰｓ　／ＸｈのＰｓｔｌ／Ｘｈｏ１部位中にク ローニングして（前述したように）　ｐＡｂＮＱｌｌを発生させた。　ｐＡｂＮ Ｑｌｌは内部のＰｓｔ１部位を有し、それゆえｐｓｃＦｖＮＱｌｌをＸｈｏｌで 完全消化し、次いでＰｓｔＩで部分消化することが必要であった。 ｐＡｂＮＱｌｌの特異的結合はＥＬＩＳＡを使用して確認した。ＥＬＩＳＡプレ ートを３７°Ｃにおいて５０ｍＭ　ＮａＦＩＣＯｓ中で２００　ｔｔ　ｇ／ｍｌ のタンパク質濃度でコーティングした。プレートをニワトリ卵リゾチーム（■Ｅ Ｌ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、またはオキサシロンに結合したＢＳＡ 　（ＯＸ−ＢＳＡ）でコーティングした（結合の方法、Ｍａｋｅｌａ　Ｏ，、Ｋ ａｒｔｉｎｅｎ　Ｍ、＋Ｐｅ１ｋｏｎｅｎ　Ｊ、に、Ｔ、、　Ｋａｒｊａｌａｉ ｎｅｎ　Ｋ、（１９７８）　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４８１６４４）。 ファージの調製、ＥＬＩＳＡプレートへの結合、洗浄および検出を実施例６に記 載する通りであった。試料を二重反復実験においてアッセイし、そして１０分後 の平均吸収を第１４図に表す。 この結果が示すように、ｐＡｂＮＱｌｌは正しい抗原と結合する。第１４図はま た、ｐＡｂＤｌ、３およびｐＡｂＮＱｌｌは、もとの抗体がそれに対してレイズ された抗原のみに結合することを示している。 １０、のＡｂのム　からのＡｂＤｌ、３のアフィニーイー　１尺よ工皇檀 表２　ニ示ｔｐＡｂＤ１．３　／ＰＡｂＮＱ１１　（７）比におイア１１０ｍ１ （ＤＰＢＳ中３Ｘ１０ＩＯのファージを、１ｍｌのりゾチームセファローズ力ラ ムに通過させた。 特記しない限り、洗浄、溶出および他の方法は実施例８に記載する通りであった 。カラムからの溶出液を使用してＴＧＩ細胞を感染させ、次いでこの細胞をプレ イティングした。コロニーをｐＡｂＤｌ、３　＋！：ｐＡｂＮＱ１１とを区別す るプローブでブロービングした。このオリゴヌクレオチド（Ｄｌ、３ＣＤＲ３Ａ ）の配列は次の通りである：５　’　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＡＴＡ　 ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＣ３’！？２はこの実験からのデータを表す、はとんど１０ ０部の−ａ縮が１ラウンドで達成され、そして１００万倍を越える濃縮が２ラウ ンドの精製で達成された。これは実施例８において得られた結果に匹敵する。 １１、　ｆｄ−ＣＡＴ２　への　、　アルカリ　ホスファターゼ　コード　る゛ 　−の バクテリオファージの表面上での機能的酵素の発現の例として、本発明者らは細 菌アルカリ性ホスファターゼ、すなわち、通常２量体として機能する酵素を選択 した（ＭｃＧｒａｃｋｅｎ、　Ｓ、およびＭｉｇｈｅｎ、　Ｅ、＋Ｊ、Ｂｉｏ１ ．Ｃｈｅｓ＋、２５５．　ｐ、２３９６−２４０４（１９８０））　、オリゴヌ クレオチドは、ｐｈｏＡ遺伝子の５′末端にＡｐａＬ１部位をもちかつ３′末端 にＮｏｔＩ部位をもつＰＣＲ産生物を発生し、こうしてｆｄ−ＣＡＴ２中にクロ ーニングして遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質を作ることを促進するように設計した 。 合成したオリゴヌクレオチドは次の通りであった：Ｉ）ｈｏＡｌ：　５　’　Ｔ ＡＴ　ＴＣＴ　ＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＣＧ Ｇ　ＡＣＡ　ＣＣＡＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　３　’　、　及 びｐｈｏＡ２：　５　’　ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＡＣＡ　ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴ 　ＣＡＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＧＧＣＴＴＴ　Ｃ３’ ｐｈｏ＾遺伝子の配列はＣｈａｎｇ　Ｃ，Ｎ、ら、Ｇｅｎｅ　４４．　ｐ１２１ −１２５（１９８６）に表されている。増幅されたプラスミド（ｐＥＫ８６）は 、位置１６６におけるアルギニンをアラニンに転化する突然変異によりＣｈａｎ ｇらの配列と異なるアルカリ性ホスファターゼ遺伝子を含有する。 ＰＣＩ＋反応は、５（ｈＭ　ＫＣｌ、５＊ＭｄＮＴＰ、　２．５ｔ＊Ｍ　ＭｇＣ Ｉｚ、０．０１％のゼラチン、０．２５単位／μ！のＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅ ｔｕｓ　／　Ｐｅｒｋｆｎ　Ｅｌｍｅｒ）および０．５　ｔｔ　ｇ／ｍｌの鋳型 を含有する１００　ｐ　１の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／ＨＣＩ（ｐＨ８，３）中で 実施した。鋳型はｐＥＫ８６ブラスミドであった（Ｃｈａｉｄａ−ｒｏｇｌｏｕ ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７　ｐ８３３８−８３４３．１９８８に記載 されている）。 Ｐｃｔ？は、Ｔｅｃｈｎｅ（Ｔｅｃｂｎｅ　、英国ケンブリッジ、ダックスフオ ード）Ｐ［ＩＧ−２ドリーｂｌｏｃｋの中で９２℃で１分、５０℃で２分、７２ ℃で３分の３０サイクルを使用して実施した。 生ずる産生物をフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、そして 沈澱物を３５μｌの水中に溶解した。０．３単位／μｌのＡｐａＬｌによる消化 を、１５０μｍの体積中で製造業者の指示に従い３７℃におい′Ｃ２時間実施し た。酵素を６５°Ｃに加熱して不活性化した後、ＮａＣ１を１５０５Ｍの最終濃 度に添加し、そして０．４単位／μＩのＮｏｔｌ酵素を添加した。３７℃におい て２時間インキユベーシゴンした後、消化物をフェノール：クロロホルムで抽出 しそして前述したように沈澱させた後、３０μｍの水中に溶解した。ベクターｆ ｄ−ＣＡＴ２を順次にＡｐａＬｌおよびＮｏｔｌにより製造業者の指示に従い消 化し、そして実施例２に記載するように子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処 理した。試料をフェノール：クロロホルムで３回抽出し、そして水中に溶解した 。連結を、切断したｆｄ−ＣＡＴ２および消化したＰＣＲ産生物の両者の最終Ｄ ＮＡ濃度１〜２ｎｇ／μｌで実施した。連結体をコンピテントＴＧＩ細胞中に形 質転換し、そして２　ＸＴＹｔｅｔプレート上でプレイティングした。所望の挿 入部を含有するクローンの同定を上の条件およびプライマーを使用して実施され る分析的ＰＣＨにより、生ずるクローンの沸騰した試料について行った。遺伝子 ＩＩＩにインフレームで融合したｐｂｏ＾遺伝子を含有する正しいクローンをｆ ｄ−ｐｈｏＡ１ａ１６６と呼んだ、クローニング領域の接合新における配列は第 １５図に記載されている。 １２、）　−ジー　の　゛　の ｆｄ−ｐｈｏＡ１６６またはｆｄ−ＣＡＴ２を含有するＴＧＩまたはＫＳ２７２ 　（ｐｈｏＡを欠如する大腸菌！ＩＩ胞、　５ｔｒａｕｃｈ　Ｋ、Ｌ、およびＢ ｋｅｃｋｖｊｔｈ　Ｊ、ＰＮＡＳ　８５１５７６−１５８０、１９８８）の−夜 の培養物を、１５μｇ／鋤ｌのテトラサイタリンを含む２ＸＴＹの中で３７℃に おいて増殖させた。濃縮されＰＥＧ沈澱されたファージを前述したように調製し た。酵素アッセイ（Ｍａｌａｙ、　Ｍ、Ｈ。 およびＨｏｒｅｃｋｅｒ　Ｂ、Ｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３．ｐ１８ ９３−１８９７．　（１９６４））を２４℃において１ＭＴｒｒｓ／ＨＣＩ（ｐ Ｈ８，０）、１ｍＭ　４　＝トロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ）、　１　 ｍＭ　ＭｇＣｌ□の最終濃度で実施した。この反応混合物の２倍濃縮物１００　 μｌを９６ウエルプレート中で１００　、１の試験試料と混合した。吸収の読み を３０分毎に４０５１−の波長でタイターチク（Ｔｋ　ｔｒｅ　ｔｅｋ）門に２ プレートリーダーにより実施した。初期反応速度を吸収の変化の速度から１７０ ００　リンドル１モル／ｃｍのモル吸収を使用して計算した。 標準曲線（酵素の量／吸収の変化の速度）を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／ＨＣＩ（ ｐＨ８，０）　、Ｉ　ｍＭ　ＥＤＴＡ中の精製した細菌のアルカリ性ホスファタ ーゼ（Ｓｉｇｍａ　ＩＩＩ型）を使用して作成した。ファージ試料の吸収の実際 の変化速度およびこの標準曲線との比較から、ファージ試料中の酵素分子の数が 推定された。 表３における結果が示すように、アルカリ性ホスファターゼの活性はｆｄ−ｐｈ ｏＡ１６６を含有する試料の中のＰＥＧ沈澱した物質において検出されたが、ｆ ｄ−ＣＡＴ２では検出されなかった。さらに、この活性のレベルは酵素の１〜２ 量体分子／ファージの期待した数と一致した。 検出された活性のレベルは増殖のために使用した宿主に依存しなかった。とくに 、ｐｈｏＡをもたない宿主で増殖させたｆｄ−ｐｌ＋ｏＡ１６６はアルカリ性ホ スファターゼの活性を示した。 したがって、ファージは活性なアルカリ性ホスファターゼを、ｐｈｏＡ−遺伝子 ＩＩＩ融合体から、ファージ表面上に発現した。 １３、ファージ　の　の　への　八　の結合分子の挿入のためのファージ中の別 の部位の利用可能性は、単一のｐＡｂ中での複数の結合分子、例えば抗体断片を いっそう容易に発現する可能性を開くであろう、これを使用して単一のまたは多 数の結合特異性を発生することができる。単一分子上の２つの異なる結合活性の 存在は、この分子の特異性の実用性を大きく増加するであろう、これは、高い突 然変異速度をもつウィルス、例えば、ヒト免疫不全ウィルスの結合において有用 であろう、さらに、それを使用して抗原を密接に近接させることができる（例え ば、薬物のターゲツティングまたは細胞の融合）か、あるいはそれは化学的、免 疫学的または酵素的プロセスにおいて「分子クランプ」として作用することがで きる。 ここに記載するベクターｆｄ−ｔｃｔおよび誘導体は、遺伝子３中に単一のＢａ ｍｆ（１部位を有する。これは従来フィラメント状バクテリオファージの表面上 のペプチド断片の発現に使用されてきている（ＳｗｉｔｈＧＰ、（１９８５）　 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２８　ｐ１３１５−１３１７　、およびｄｅ　Ｉａ　Ｃｒｕ ｚら（１９８８）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ、２６３　ｐ４３１８−４３２２）、 これは抗体断片の挿入のための潜在的な別の部位を提供する。 １）１．３またはＮＱＩＩからの５ｃＦｖをコードするＤＮＡ断片を下に示すプ ライマーを使用してＰＣＲにより発生させた。それらのプライマーは両端付近に Ｂａ１ｌ旧部位をもつ断片を発生させて、遺伝子３のＢａｇ旧部位の中へのクロ ーニングを可能とするように設計されている（第１６図（１））を参照のこと） 、使用するオリゴヌクレオチドはまた、生ずるＰＣＢ産生物が５ｃＦｖの振作に 通常使用されるＰｓＬＩおよびＸｈｏｌ制限部位を欠如することを保証する（第 １６図（１）を参照のこと）。これは引き続く第２抗体断片を通常の方法で遺伝 子３のＮ末端において操作するのを促進するであろう、使用したオリゴヌクレオ チドは次の通りであった： Ｇ３Ｂａ＊Ｉ　５’　ＴＴＴ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＧＴ Ｇ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　３’Ｏ３Ｂａｍ２　５’　ＡＡＣＧＡＡ 　ＴＧＧ　ＡＴＣＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣＡＡＧ　ＣＴＴ　３’　。 ベク　−およびＰＣＲの量 ＰＣＩＩ反応は、実施例１１に記載するように８０μｌの反応において、ｌｎｇ ／μｍの鋳型および０．２５７単位／μＩＴａｑポリメラーゼ、並びに９４℃で １分、６０℃で１分および７０℃で２分のサイクルを使用して３０サイクルにわ たって実施した。この鋳型はｐｓｃＦｖＮＱｌｌ（実施例９）または５ｃＦｖＤ １．３ｓ＋ｙｃ（実施例２）であった０反応産生物をフェノール：クロロホルム で抽出し、沈澱させ、水中に溶解し、そして製造業者の指示に従いＢａｓ＋ＨＩ で消化した。消化物をフェノール：クロロホルムで再抽出し、沈澱させ、そして 水中に溶解した。 ベクターｆｄＴＰｓ　／Ｘｈを、実施例２に記載するように、ＢａｍＨＩで切断 し、仔つシ腸ホスファターゼで処理し、そして精製した。連結は約６ｎｇ／μｌ のベクター濃度およびほぼ３　ｎｇ／μｍのＰＣＲ挿入部濃度で開始しまた。こ れらは室温において２．５時間連結した後、コンピテントＴＧＩ細胞中に形質転 換し、そしてＴＹｔｅｔプレート上にプレイティングした。生ずるクローンを実 施例８に記載するようにしてブロービングした。多数のコロニーからＤＮＡを調 製し、そして正しい方向および挿入部の大きさを、分離において）ＩｉｎｄＩＩ ＩによりまたはＢａｗｌ（＋　との組み合わせにより制限消化することによって 確認した。 （一方の旧ｎｄ［１１部位はプライマーの１つにより寄与され、そして他方の部 位はヘクターにより寄与される）。 Ｄｌ、３挿入部を含有する２つのクローン（ｆｄＴＢａｓｌおよびｆｄＴＢａｍ ２）並びにＮＱＩＩインサートを含有する１つ（ＮＯｌｌＢａｍｌ）を前述した ように増殖させ、そしてファージを調製した。実施例６に記載されたようにして ＥＬＩＳＡを行った。特異的シグナルはこれらのクローンのいずれについても見 いだされず、天然Ｈａ−旧部位は機能的抗体の挿入に適当な部位でないことを示 唆する（結果は示されない）。 別の部位中にクローニングして結合活性を保持することができる。 遺伝子用中に存在するペプチドの反復はこのような部位を提供することができる （第１６図ブロックＡおよびＢ）、これはＢａ５ｆ１１部位を挿入しそして前述 のＰＣＲ産生物を使用することによって実施することができる。これを促進する ために、天然ＲａｍＨ１部位を下に示すオリゴヌクレオチドＧ３ｍｕ　ｔ　６　 Ｂａ−による変異誘発により除去した（試験管内変異誘発キット（Ａｍｅｒｓｈ ａｓ＋　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用する）ニーＧ３ｍｕｔδＢａｇ　 ５　’　ＣＡ　ＡＡＣＧＡＡ　ＴＧＧ　＠ＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＴ　Ａ　３　’ 下線の残基はＡ残基を置換し、これによりＢａｍＨＩ部位を除去する。 ＤＮＡを多数のクローンから調製し、そしてＢａ園旧部位を欠如するいくつかの 突然変異体を制限消化により同定した。 オリゴヌクレオチドＧａＢａ園１ｉｎｋは、ペプチドリンカ一部位ＡおよびＢ内 の多数の可能な部位にＢａｍＨＩ部位を導入するように設計された。第１６図（ ２）を参照のこと、リンカ−の配列は次の通りである二Ｂａ＊１ｉｎｋ　５　’ 　ＣＣ（ＧまたはＡ　）　ＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＡ　ＴＣＣ（ＧまたはＡ）ＣＣ Ａｃｅ　ＣＴＣ３’ 遺伝子ＩＩＩ中のペプチドの反復に対するその関係は第１６図に示される。 ｌＬ［Ｍ　１４．ファ五の　只のためのマウスＶＨおよびＶＬカッパ（ＶＬＫ） レパートリ−のＰＣＲアセンブ寥− この原理は第１７図に例示されている。詳細は下の節Ａ−Ｆに記載されているが 、広い概略を最初に検討する。 １、ｃＤＮＡを適当なマウスからの牌１１ＲＮＡから調製し、そしてＶＨおよび ＶＬＫのレパートリ−を個々に増幅する。別々に、ＶＨＩＦＯＲ−２（ドメイン ｌ）およびＶＬＫ２ＢＡＣＫ　（ドメイン２）を使用して、存在する５ｅＦｖを 含有するＤＮＡをＰＣＲにより増幅する。（用語ＦＯＩ？は、例えば、アンチセ ンスコード配列をもたらすセンス謹上で配列を増幅するためのプライマーに関す る。用語ＢＡＣＫは、例えば、センスコード配列をもたらすアンチセンス鎖上で の増幅のためのプライマーに関する）、これは、２つの一次（ｖＨおよびＶＬＫ ）　ＰＣＲ産生物とオーバーラツプするアミノ酸配列（１文字のコード）　（Ｇ ＧＧＧＳ）　ｓをもつリンカ−をコードする「リンカ−」分子を発生する。 ２、　別々の増幅されたＶＨ，νＩＪおよびリンカ−の配列は、ここで、「アセ ンブリーＪ　ＰＣＲの使用により連続的［ＩＮ＾分子にアセンブリングしなくて はならない、二次「アセンブリーＪ　Ｐｃｔ？において、Ｖ）ｌ、　ＶＬＫおよ びリンカ−のバンドを前述のオーバーラツプにより組み合わせそしてアセンブリ ングする。これは、ＶＨおよび１つのＶｌ、Ｋ　ドメインの発現を指令するアセ ンブリングされたＤＮＡ断片を発生する。特定のＶＨ／ＶＬにの組み合わせは、 前述の別々のＶ）ｌおよびＶＬにのレパートリ−からランダムに誘導される。 このアセンブリーＰＣＲは２つの段階で実施される。 まず、ＰＧＩ２の中に存在するちょうど３つのバンドを使用する７ラウンドのサ イクリング、引き続くフランキングプライマーＶＢＩＢＡＣＫ（Ｖｌ＋のドメイ ンｌと呼ぶ）およびＶＫＦＯＲの存在下でのさらに２０ラウンド、これらのオリ ゴヌクレオチドブライマーのヌクレオチド配列は、下の「プライマーの配列」と 題する節に与えている。この２段階のプロセスは、アラセンプリングされるべき 最初の組み合わせの優先的増幅という潜在的な問題を回避する。 ファージ系中にクローニングするために、アセツブリングしたレパートリ−を適 当な制限部位で「標識」する、下に記載する実施例において、これは連続的［Ｉ Ｎ＾分子のＶＨ末端にＡｐａＬ１制限部位を設けそしてこの分子のＶＬＫ末端に Ｎｏｔ１部位を設けることによって例示される。これは、標識したプライマーを 使用して第３段階のＰＣＲにより実施される。これらのオリゴヌクレオチドブラ イマーのヌクレオチド配列もまた、下の「プライマーの配列」と題する節に記載 されている。しかしながら、４つの可能なカッパライト鎖の配列が存在する（こ こで単一のコンセンサスカンパヘビー鎖を使用することができる）、シたがって 、４つのオリゴヌクレオチドブライマーの配列がＶＬＫのために与えられる。 この第３段階のＰＣＲのために、新しい制限部位をつくりそしてこの制限部位の ５′側に更なるｌＯヌクレオチドを有するプライマーの組が使用された。しかし ながら、長い標識はよりすぐれた切断を与えることができ、この場合において１ ２〜２０ヌクレオチドのオーバーハングを使用することができる。 慎重には、きれいな手順をＰＣＲの間に常時使用して汚染を回避しなくてはなら ない、　ＤＮＡを含有しない陰性対照を常に含めて汚染についてモニターしなく てはならない、ゲルボックスを脱プリンしなくてはならない、献呈されたシーン クリ−（Ｇｅｎｅｃｌｅａａ）キット（Ｂ１０１０１＋　Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、 米国カリフォルニア州すンジエゴ、ラジララ）を製造業者の指示に従い使用して ＤＮＡをアガロースゲルから抽出することができる。ビーズ、Ｎａｌおよびニュ ー（ＮＩＪ）洗浄液のアリコートを取るべきである。 特記しない限り、すべての酵素はＣＰ　ラボラトリーズ（ハーフＣＭ２Ｏ３０Ｈ ，ビショッスストートフォード、ｐｏｘ２２）から人手し、そして製造業者が推 奨しかつ供給した緩衝液を使用した。 ＲＮＡは当業者によ（知られている多数の手順を使用して調製することができる 、１例として、次のプロトコル（トリトンＸ−１００ｆＪ菌、フェノール／ＳＤ Ｓ　ＲＮアーゼの不活性化）は、ＩｊｌＩＩＩ！およびハイブリドーマ細胞を使 用してきわめてすぐれた結果を与える（ＲＮアーゼ阻害因子が牌臓細胞のために 必要であるので、ＶＲＣ（ベロナルリボシル複合体）を添加する）、グアニジウ ムイソチオシアネート／ＣｓＣ１の手順（全細胞性ＲＮＡを生ずる）もまた、す ぐれた結果を与えるが、いっそう時間を消費する。 １、　ベンチ型遠心機で８００Ｘｇで１０分間４℃において遠心することによっ て、５Ｘ１０’細胞を収穫する。　５０ｍ１の冷ＰＢＳ緩衝液中におだやかに再 懸濁させ、そして上澄みを廃棄する。 ２　氷上で、１ｍｌの氷冷した溶菌緩衝液を沈澱物に添加し、そしてそれを１ｍ ｌのジルソン（ｇｉｌｓｏｎ）ピペットでおだやかに上下にピペッティングする ことによって再懸濁する。氷上に５分間放置する。 ３、ｆ＃菌後、マイクロヒュージ中で４℃において前以て冷却した管中で１３０ ０ｒｐ−で遠心することによって、細胞破片を除去する。 ４、　０．５ｍｌの上澄み液を、６０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＯ３および２５ ０μｌのフェノール（前以て１ｏｏｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０） で平衡化したもの）を含有する２本のエッペンドルフの各々に移す、２分間強く 渦形成し、次いで室温において５分間マイクロ遠心（１３０００ｒｐａｉ）する 、上の水性相を新しい管に移す。 ５、水性の上相を０．５＋ｗｌのフェノールで５回再抽出する。 ６、　１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリうムおよび２．５体積のエタノールで２０ ゛Ｃにおいて一夜またはドライアイス−イソプロパツールで３０分間沈澱させる 。 ７、ＲＮＡ沈澱物を洗浄し、そして５０μｍ中に再懸濁させて、００２６０によ りチェックし、そして２ｚ１ｇを１％のアガロースゲル上でチェックする。４０ μｇのＲＮＡがマウス由来の肺細胞から得られた。 溶菌緩衝液は〔１抛Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１＋＊Ｍ　１１ｇｃ １ｚ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１゜１０ｓ＋Ｍ　ＶＲＣ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｉａｎｄ 　Ｂｉｏｌａｂｓ）、　０．５％の（Ｗ／Ｖ））リドンＸ−１００１であり、新 しく調製した。 溶菌緩衝液は（１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　ＭｇＣ１ ｚ、　１５０ｍＭ　ＮａＣ１゜１０ｓ＋Ｍ　ＶＲＣ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）＋　０．５％の（Ｗ／Ｖ））リドンＸ−１００１であり、新し く調製した。 旦−工匣酊」１製 ｃＤＮＡは当業者によ（知られている多数の手順を使用して調製することができ る。１例として、次のプロトコルを使用することができる： １、下記の逆転写混合物を構成する： Ｌ± ＨｌＯ（ＤＢＰＣ処理した）２０ ５ＭＭ　ｄＮＴＰ　１０ ｉｏｘ第１鎖緩衝液　１０ ０．１ＨＤＴＴ　１０ ＦＯＲプライマー（ｌ又は複数の） （１０ピコモル／μＩ）２（各々）（下記参照）ＲＮａｓ３ｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ 　；　４０単位／ａ１）　４庄 ｉ　）　ＤＥＰＣはジエチルピロカーボネートであり、その機能はＤＮＡまたは ＲＮＡを分解しうる酵素を不活性化することである。 ｉｉ　）　ｄＮＴＰはデオキソヌクレオチドトリホスフェートである。 ｉ〕Ω丁丁はジチオスレイトールであり、その機能は酸化防止剤としての酵素の 機能に必要な還元的環境をつくることである。 ｉｖ）　ＲＮａｓｉｎはプロメガ・コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒ ｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ウィスコンシン州マジソン、ウソトポロウロード２８０ ０　）から入手したりボヌクレアーゼ阻害剤である。 ２．１０μｇのＲＮＡをＤＢＰＣ処理した水で４０μｍの最終体積に希釈する。 ６５℃に３分間加熱し、そして氷上に１分間保持する（二次構造を除去するため に）。 ３、ＲＮＡに逆転写混合？１（５８μｌ）および４μｌのクローニングした逆ト ランスクリブターゼｒｓｕｐｅｒ　ＲＴＪ　（Ａｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ 　Ｌｔｄ、＋エセックス、コルチェスター、ホワイトホールロード、ホワイトホ ールハウス）を添加し、そして４２℃において１時間インキュベーションする。 ４、　反応混合物を３分間沸騰させ、氷上で１分間冷却し、次いでマイクロヒュ ジ中で回転して破片をベレット化する。上澄み液を新たな管に移す。 １０×第１鎖緩衝液は［１，４Ｍ　ＭＣＩ、　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ ｐＨ８，１，４２℃）。 ８０＋＋Ｍ　ＭｇＣｈ）である。 プライマーを３′末端に７ニールする。カンパライト鎖のプライマー配列はＭＪ ＫＩＦＯＮＸ、　Ｉ’１ＪＫ２ＦＯＮＸ、　ＭＪＫ４ＦＯＮＸおよび？ＩＪＫ５ ＦＯＮＸ　（下記の「プライマーの配列」に記載されている）であり、そしてヘ ビー鎖ブーｙイマ−（７）例ハＭＩＧＧ！、２（ＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＧ　ＧＡＴ 　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＴＴＣＣＡ）およびＭＩＧＧ３（ＣＴＧ　ＧＡＣＡＧＧ　Ｇ Ｃ：Ｔ　ＣＣＡ　ＴＡＧ　ＴＴＣＣＡ）　テあり、これはＣＨＩ　ニアニールす る。 あるいは、可変頭板ＶＨ，ＶＬＸ、　ＶＬの３′末端に、あるいは定常領域ＣＨ Ｉ、　（ＪまたはＣ１に結合する任意のプライマーを使用することができる。 旦−二欣−にＲ− 各ＰＣＲおよび陰性対照について、次の反応を構成する（例えば、４つのＶＬＫ および４つのＶｌｌ　ＰＣＲの各々について１つの反応）、下記において、Ｖｅ ｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ，Ｐ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｌｔｄ、（Ｎ ｅｗ　Ｂｎｇ−１ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）住所は前に記ｉｔ）により販売され ている）を使用した。Ｗ衝液はＣ，Ｐ、ラボラトリーズによ／）提供される。 亙↓ Ｈ，０３２，５ １０×νｅｎｔ緩衝液　５ ２０ＸＶｅｎｔ　ＢＳＡ　２．５ ５−阿　ｄＮＴＰ　１．５ ＦＯＲプライマー（１０ピコモル／μＩ）　２．５ＢＡ（Ｊプライマー（１０ピ コモル／μｌ）　２．５ＦＯＲおよびＢＡＣＫプライマーは後記の「プライマー 配列」と題するの節に記載されている。ＶＨについて、ＦＯＩ？プライマーはＶ ＨＩＦＯＲ−２であり、そしてＢＡＣＫプライマーはνＨＩＢＡＣＫである。　 ＶＬＫについて、ＦＯＲプライマーはＭＪＫＩＦＯＮＸ、　ＭＪＫ２ＦＯＮＫ、 　ＭＪＫ４ＦＯＮＸおよびＭＪＫ５ＦＯＮＸ　（４つのそれぞれのカッパライト 鎖について）であり、そしてＢＡＣＫプライマーはＶＫ２ＢＡＣＫである。１つ のカッパライトＩＢＡ（Ｊプライマーのみが必要である。なぜなら、結合は４つ のカッパライト鎖に共通のヌクレオチド配列に対してであるからである。 この混合物を５分間紫外線照射する。２μｌのｃＤＮＡａｌ製物（上記Ｂから） 、２滴のパラフィン油（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国ドーセット、プ ール）を添加する。９４℃にプリセットしたサイクリング加熱ブロック、例えば 、ＰＩ（Ｃ−２（Ｔｅｃｂｎｅ　Ｌｔｄ、英国ヅクスフを一ド製）上に配置する 。１μｍのＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼをパラフィンの下に添加する。９４℃ で１分、７２゛Ｃで２分の２５サイクルを使用して増幅する。　６０℃において ５分間後処理する。 ２％の１＋＊ｐ（低融点のアガロース／ＴＡＢ（１−リス−アセテートＥ［ｌＴ Ａ）ゲル上で精製し、そしてＤＮＡをもとのＰＣＲ当り２０μｍのＨｚＯにシー ンクリ−キット（上を参照）を製造業者の指示に従い使用して抽出する。 Ｄ　リンカ−の バルクで構成する（例えば、１０倍） Ｌよ Ｈ□０　３４．５ １ＱＸＶｅｎｔ緩衝液　５ ２０ＸＶｅｎｔ　ＢＳＡ　２．５ ５ｍＭｄＮＴＰ　２ ＬＩＮＫＦＯＲプライマー（１０ピコモル／μＩ）　２．５ＬＩＮＫＢＡＣＫプ ライマー（１０ピコモル／μｌ）　２．５ＦａｂＤ１．３（実施例２）からのＤ ＮＡ　１νｅｎｔ酵素　０．２ ＦＯＲおよびＢＡＣＫプライマーは後記の「プライマーの配列」と題する節に記 載されている。　ＦＯＲプライマーはＬＩＮＫＦＯＲであり、そしてＢＡＣにプ ライマーはＬＩＮＫＢＡＣＫである。パラフィンで覆い、そして９４°Ｃのサイ クリング加熱ブロック（前記参照）上に配置する。９４°Ｃで１分、７２°Ｃで ２分の２５サイクルを使用して増幅する。６０℃において５分間後処理する。 ２％の１１１１１／ＴＡＢゲル（９３ｐの断片が望ましいので、ブロモフェノー ルブルーを含まない負荷色素を使用する）上で精製し、そして５ＰＩＮ−Ｘカラ ム（Ｃｏｓｔａｒ　Ｌｉ＋ａｉｔｅｄ　、米国マサチュセソッ州ケンブリッジ、 グロートウーウェイ）で溶出し、そして沈澱させる。　ＰＣＲ反応当り５μｌの Ｈ，Ｏ中に取る。 旦−１」長夕臼辷ｍｌ工し 各ＰＣＲ反応産生物の１／４　（５μｍ）を各アセンブリーに使用する０合計の 体積は２５μｍである。 ４つのＶＬＫプライマーの各々について、次のものを構成する＝１１ｆｆｉ０　 ４．９５ １０ＸＶｅｎｔｉｌ衝液　２．５ ２０ＸＶｅｎｔ　ＢＳＡ　１．２５ ５５Ｍ　ｄＮＴＰ　０．８ この混合物を５分間紫外線照射する。５μｌの一次ＰＣＲのｖｈおよびＶｋバン ドの各々および１．５　ｕ　ｌの調製用ゲルから分層しがっ前記ＣおよびＤに記 載するようにシーンクリーンキットを使用して抽出したリンカ−を添加する。パ ラフィンで覆う、９４℃にプリセットしたブロック上に配！する。ＩｔｌｌのＶ ｅｎ　ｔをパラフィンの下に添加する。９４℃で２分、７２°Ｃで４分の７サイ クルを使用して増幅する。次に温度を９４℃にもどす。 １．５　ｕ　ｌずツ（７）ＶＨＩＢＡＣＫおよび適当なＶＫＦＯＲブライ７−Ｍ ＪＫＩＦＯＮＸ。 ＭＪＫ２ＦＯＮχ、　ＭＪＫ４ＦＯＮＸまたはＭＪＫ５ＦＯＮＸ　（１０ｐｍｏ ｌ／ｍｌ　）を９４℃にて添加する。プライマーは前記のごと＜Ｕｖ処理される べきである。９４℃にて１．５分間および７２°Ｃにて２．５分間の２０サイク ルを用いて増幅する。 ２％１−ｐ／ＴＡＥゲル上で精製し、そしてＤＮＡをアセンブリーＲＣＩＩ当り ２０１１の水に、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキント（前記参照のこと）を製造者の指示 に従って使用して抽出した。 ヱーＵ皿拉坐仕放 各アセンブリーおよび対照について、次のものを構成する：Ｚ！ ａｇｏ　３６．５ １０　Ｘ　Ｔａｑポリメラーゼ　５ ５ｍＭｄＮＴＰ　２ ＦＯＲプライマー（１０ピコモル／μＩ）　２．５ＢＡＣＫプライマー（１０ピ コモル／μｌ　）　２．５アセンブリー産生物　Ｉ ＦＯＲまたはＢＡＣにプライマーを後記の「プライマーの配列」と題する節に記 載する。　ｐｏＲプライマーは、ＶＬに末端にＨｏｔｌ＠限部位を配置するため にＪＩ［ｌＮ０Ｔ１０．　Ｊに２ＮＯＴ１０．　ＪＫ４ＮＯｆＩＯまたはＪＫ５ ＮＯＴ１０　（４つのそれぞれのカッパライト鎖について）のいずれかのもので ある。 ＢＡＣｌ［プライマーはν日東端にＡｐａＬＩ　１１１ｐ１部位を配置するため にＨＭＡＰＡＩＯである。 パラフィンでカバーし、そして９４℃にプリセットしたサイクリング加熱ブロッ ク上に配置する。０．５μ！のＣｅｔｕｓ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｅ ｔｕｓ／ｐｅｒｋｉｎ−１：１ｅｅｒ、英国パツキンガムシャイア−州ビーコン スフイールド）をパラフィンの下に添加する。増幅を９４℃１分、７２℃で２分 の１１〜１５サイクルを使用して実施する。６０°Ｃにおいて５分間後処理する 。 １０　Ｘ　Ｔａｑ緩衝液は［０，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，３，２５℃ ）、　０．５Ｍ　ＭＣＩ。 １５ｍＭ　ＭｇＣｌ□、ＩＢ／ｍｌのゼラチン〕である。 旦−立上ザ ＣＨＣｌ５　／ＩＡＡ（イソアミノアルコール）で１回、フェノールで１回、Ｃ ＨＣｌ１　／ＩＡＡで１回そしてすべてを逆抽出して、最小の損失を保証する。 沈澱させそして７０％のＥｔＯＨ中で２回洗浄する。７０μｌのＩ（ｔＯの中に 溶解する。３７℃においてＮｏｔｌで一夜消化する；ＤＮＡ　（接合配列）７Ｏ ＮＥＢ　Ｎｏｔ　Ｉｔ衝液Ｘ　１０　１ＯＮＥＢ　ＢＳＡ　ｘｌＯ１Ｏ ＮｏｔＩ　（１０単位／／７１）　１０上記ＤＮＡ　（接合配列）は、５′→３ ′方向において、ＡｐａＬ１制限部位 ＶＨ配列 リンカ−配列 ＶＬＫ配列 Ｎｏｔｌ制限部位 からなるアセンブリソゲしたＤＮＡ配列を意味する。 ＶＬ）［配列は４つの可能なカッパ鎖の配列のいずれかである。 上の酵素Ｎｏｔｌ、下のＡｐａＬｌおよび緩衝液ＮＥＢ　Ｎｏｔｌ、　ＮＥＢ　 ＢＳＡ　ｉｌｌ衝液４（下）は、前述のｃｐラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）、ニュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手することができる。 再沈澱物を８０μｍのＨ２Ｏの中に取る。これに１０μｍのＮＥＢ緩衝液４およ び１０μｍのＡｐａｌｌを添加する。 酵素ＡｐａＬ１を１日を通じてアリコートで添加する。なぜなら、それは３７℃ において短い半減期を有するからである。 ２％のｉｍｐ／丁ＡＥゲル上で精製しそしてＧｅｎｅｃｌｅａｎキットを使用し て製造業者の指示に従い［ｌＮＡを抽出する。必要に応じて、再消化する。 ＨＪＩＡＭＭ＾ 最終１）ＨＡ産生物は、リンカ−により連鎖されたランダムに会合したヘビー鎖 およびライト鎖からなるＡｐａＬｌおよびＮｏｔｌ適合性の末端をもつほぼ７０ ０ｂρの断片である。この型の典型的な分子は、実施例３に記載するｆｄＴｓｃ ＦｖＤｌ、３の中に組み込まれた５ｃＦｖＤ１．３分子である。 次いで、これらの分子は適当なｆｄ誘導ベクター、例えば、ｆｄＣＡＴ２（Ｘ施 例５）中に標準的技術により連結することができる。 工孟エヱニ皇ｙ死 一次ＰＣＲオリゴ（制限部位に下線が引かれている）：ＶＨＬＦＯＲ−２ＴＧＡ 　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＣＣＶ ＨＩＢＡＣＫ　ＡＧＧ　ＴＳＭ　ＡＲＣＴＧＣＡＧＳ　ＡＧＴ　ＣＷＧ　Ｇ？Ｉ ＪＫＩＦＯＮＸ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　Ｇ ＣＣＭＪＫ２ＦＯＨＸ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴ（：　ＣＡＧ　ＣＴＴ　 ＧＧＴ　ＣＣＣＭＪＫ４ＦＯＮＸ　ＣＣＧ　ＴＴＴＴＡＴ　ＴＴＣＣＡＡ　ＣＴ Ｔ　ＴＧＴ　ＣＣＣ門ＪＫ５ＦＯＮＸ　ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ 　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＣＣＣＶＫ２ＢＡＣＫ　ＧＡＣＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＣ ＣＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ多義コードＭ＝ＡまたはＣ，Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｓ＝Ｇ またはＣ３Ｗ＝ＡまたはＴ ＰＣＲオリゴは次のリンカ−をつくる：ＬＩＮＫＦＯＲＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣ ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣ＾＾Ｔ　ＧＴＣＬＩＮＫＢＡＣＫ　ＧＧＧ　ＡＣＣＡＣ Ｇ　ＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ制限部位の付加のため： ＨＢＫＡＰＡＩＯＣＡＴ　ＧＡＣＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＴＳ　ＭＡ ［ｉ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＳＡＧ　ＴｆＪＧ ＪＫＩＮＯＴＩＯＧＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＴ　 ＧＡＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＴＴＧＧＴ　ＧＣＣ ＪＫ２ＮＯＴ１０　ＧＡＧ　ＴＣＡ　丁子ＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＴ 　ＴＡＴ　ＴＴＣＣＡＧ　ＣＴＴＧＧＴ　ＣＣＣ ＪＫ４ＮＯＴ１０　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＧ　ＴＴＴ 　ＴＡＴ　ＴＴＣＣＡＡ　ＣＴＴＴＧＴ　ＣＣＣ ＪＫ５ＮＯＴ１０　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＣ７匹」坦（仰；ＣＣＣＧ　ＴＴＴ　 ＣＡＧ　ＣＴＣＣＡＧ　ＣＴＴＧＧＴ　ＣＣＣ ｌ３゜　ハ　迩１［子（Ｐ［１ＧＦ）アイ又１」二−り則Δ丸へ９坦トレセブ　 −の　ドメインのｆｄＣＡＴ２ニコ因４人血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）アイ ソフオームＢＢのためのヒトレセプターの細胞外ドメインをコードする遺伝子断 片（ｈ　−ＰＤＧＦＢ−ｉｌｌ）を、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、プラス ミドＲＰ４１　（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシクン、カタログ８ １１５０７３５から）　、ＰＤＧＦ−ＢＬ／セブターのアミノ酸４３−９２５を コードするｃＤＮＡクローン（Ｇｒｏｎｗａｌｄ。 １？、Ｇ、Ｉ［、らＰＮＡＳ　８５　ｐ３４３５−３４３９））の増幅により分 離した。ｂ−ＰＩＩＧＦＢ−Ｒのアミノ酸１−３２はシグナルペプチドを構成す る。オリゴヌクレオチドのプライマーは、コードされたタンパク質のアミノ酸４ ３−５３１に相当するｂ−ＰＤＧＦＢ−Ｒ遺伝子の領域を増幅するように設計し た。Ｎ末端領域のためのプライマーＰＲＤＧＦ３もまた、ｈ−ＰＤＧＦＢ−Ｒタ ンパク質のアミノ酸３３−４２をコードする塩基を含んで、完全な細胞外ドメイ ンの発現を可能としている。プライマーはまた、断片のＮ末端にユニークＡｐａ Ｌ１部位およびＣ末端にユニークＸｈｏｌを含んでいて、ベクターｆｄＣＡＴ２ の中へのクローニングを促進する。プライマーの配列は次の通りである： ＲＰＤＧＦ３　５　’　ＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＴＣＡＣＡ　 ＣＣＣＣＣＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡ　ＧＡＧＣＴＴ　ＧＴＣＣＴＣＡＡＴ　ＧＴＣＴ ＣＣＡＧＣＡＣＣＴＴＣＧＴＴ　ＣＴＧ　３　’ＲＰＤＧＦ２　５’　ＧＡＴ　 ＣＴＣＧＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　Ｃ ＡＣ３’ＰＣＲの増幅は、高い忠実度の条件を使用して実施した（Ｅｃｋｃｒｔ 、　Ｋ。 Ａ、およびＫｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、１９９０　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、１８３７３９−３７４４）　、　ＰＣＲ混合物は次の成分を含有した：　２０ ＊Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，３，７０℃）、　５０ｍＭＫＣｌ、　４ｓ＋ Ｍ塩化マグネシウム、０．０１％のゼラチン、１１ずつのｄＡＴＰ。 ｄＣＴＰ、　ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、　５００ｎｇ　／＋ｗｌのＲＰ４１　Ｄ ＮＡ、１ｓ＋Ｍの各プライマーおよび５０単位／　ｐ　ＩＴａｑポリメラーゼ（ Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｎ　Ｅｌｍｅｒ　、英国パツキンガムシャイア−州ビーコ ンスフイールド）　、　ＰＣＲの３０サイクルを９２°Ｃで１分間の変性、６０ ℃で１分間のアニーリングおよび７２°Ｃで１．５９分間の伸長で実施した。こ の反応は期待するように約１５．０００ｂｐの断片の増幅を生じた。 ｆｄＣＡＴ２ベクターＤＮＡ（実施例５を参照のこと）をＡｐａＬｌおよびＸｂ ｏｌ（Ｎｅｗ　［！ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で製造業者の指示に従い消 化し、フェノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱させた（Ｓａｓ ｂｒｏｏｋら前掲）、増幅したＩ？Ｐ４１のＤＮＡのこのベクター中へのクロー ニングおよび所望のクローンの同定は本質的に実施例７におけるように実施した が、ただしＰＣＲ産生物の消化はＡｐａＬｌおよびＸｈｏｌを用いて実施した。 　ｈ−ＰＩＩＧＦＢ−ＲのＤＮＡを含有するコロニーを３２Ｐで標識したＲＰＤ ＧＦ２でブロービングすることによって同定し、そしてハイブリダイズするコロ ニー中の挿入部の存在を分析用ＰＣＩ＋によりＲＰＤＧＦ３およびＲＰＤＧＦ２ を使用して実施例７に記載する条件下に確認した。 ｎ貫磨ユ違ロ！−ジの　上に　ス　れた　ハ　ｑアイソフオームＢＢのためのヒ トレセブ　−の　ドＬインへの’　！Ｊ−ＰＤＧＦ−ＢＢの　人　ｌｊ」し−ど １進臣よ与盪冗旦人− ヒト血小板由来成長因子のアイソフオームＢＢのレセプターの細胞外ドメインを 発現するファージ粒子（ｆｄ　ｈ−ＰＤＧＦＢ−Ｒ）は、ｆｄ　ｈ−ＰＤＧＦＢ −Ｒで形質転換された大腸菌ＭＣｌ０６１細胞を、１５ｕｇ／ｍｌのテトラサイ クリンを含む５０１の２ＸＴＹ培地中で１６〜２０時間増殖させることによって 調製した。ファージ粒子を実施例６に記載するようにポリエチレングリコールで 濃縮し、そしてＰＤＧＦ結合緩衝液（２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，４）、 　０．１５ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ塩化マグネシウム、０．２５％のＢＳＡ）中 にもとの体積の１／３３に再懸濁した。残留細菌および溶解しない物質をマイク ロ遠心機により２分間回転することによって除去した。遺伝子ＩＩＩタンパク質 に対してレイズされた抗血清（１，Ｒａ５ｈｅｄ博士、ドイツ国コンスタンッ） を使用してのイムノプロットは、ｈ−ＰＤＧＦＢ−１？の外部ドメイン（５５， ０００ダルトン）と遺伝子ｍ　（ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル上で見掛けの 分子量７０，０００）との間の融合体に相当する分子量１２５．０００の遺伝子 Ｉ　Ｉ　Ｉ−ｂ−ＰＤＧＦＢ−Ｒタンパク質のこのようなファージ調製物の存在 を示す。 ３５ｕ　Ｉ　ノｆｉｉｉＬり７　ｙ−’；（ＤＨｌｌ−反復実Ｍ）試Ｒヲ”’ｘ −ｐｏｃｐ−ＢＢ（７８，５ｆモル、７０ｎＣｉ　、８８２Ｃｉ　／ミリモル： 　Ａｍｅｒｓｂａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｐｌｃ　、パツキンガムシャ イア−州アマージャム）と共に３７℃において１時間インキュベーションした。 対照が含められ、この対照においてはｆｄ　ｈ−ＢＤＧＦＢ−Ｒファージがｆｄ ＴＰｓ　／Ｂｓベクターファージ（第４図）により置換されているか、あるいは ファージで置換されていない、このインキュベーション後、１０μｌのヒツジ抗 Ｍ１３ポリクローナル抗血清（Ｍ、ＦＩｏａｒｔから入手した）を添加し、そし て２０℃において３０分間インキュベーションした。各試料に、ＰＤＧＦ結合緩 衝液中で平衡化したタンパクｔＧセファローズファースト・フロー（Ｆａｓｔ　 Ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ミルトンケインス）　４０ｕ　ｌ　（２０μ ｌのパックド体積）を添加した９回転ミキサーを転倒ることによって混合しなが ら、２０°Ｃにおいて３０分間インキュベーションした。アフィニティーマトリ ックスをマイクロ遠心機で回転して２分間沈澱させ、そして上澄み液を吸引によ り取り出した。沈澱物を０．５　ｍｌのＰＤＧＦ結合緩衝液中に再懸濁し、５分 間の回転により混合し、そしてＪ：澄み液杏吸引し、次いで０．５■１の０．１ 　％のＢＳＡ　、０．２％のトリトンＸ−１００でさらに洗浄することによって 、非特異的に結合した’　！５Ｉ−ＰＤＧＦ−８８を除去した。 最終的に得られた沈澱物を１００μｌのＰＤＧＦ結合緩衝液中に再懸濁させ、そ してパフカードガンマカウンターでカウントした。置換研究のために、非接１１ ＰＤＧＦ−ＢＢ（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、Ｉ　ｔ ＳＩ−ＰＤＧＦ−ＢＢとファージとのインキュベーションのために前述の濃度に 添加した。 ｆｄｈ−ＰＤＧＦＢ−Ｒ７ｙ−シニ結合シタ”’Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢヲ：（７） ７ｙセイニおいて免疫沈澱させた。レセプターファージへの特異的結合は、ベク ターファージｆｄＴＰｓ　７８ｇとの、またはファージを伴わない非特異的結合 より３．５〜４倍高かった（第１９図）、目’Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢのこの結合は 、３７℃におけるファージとのインキュベーションに非接ｆｉＰＤＧＦ−ＢＢを 含めることによって排除することができる（第２０図）　、　５０ｎＭの非標識 ＰＤＧＦ−ＢＢにおいて、”’ｒ−ＰＩＩＧＦ−ＢＢの結合はｆｄＴＰｓ　／Ｂ ｓおよびファージなり、の対照と同一レベルに減少した。第２１図は同一データ を示すが、ベクターへおの非特異的結合が差引がれている。 これらの結果が示すように、’　”Ｉ−ＰＤＧＦ−ＢＢに対する特異的飽和可能 な部位は、クローニングされたｈ−ＰＤＧＦＢ−１？のＤＮＡを含有するファー ジ上で発現される。こうして、ファージは細胞表面レセプターの機能的細胞外ド メインを表示することができる。 刀Ｌｕ１ｋ瀦且−仲λ二Ｉ川１１は１だ■Ｄ１幻ｊ−江」ｌ ファージ結合分子系のトランスフェクションの効率を改良すること、およびさら に同一バクテリオファージの表面上に異なる数および特異性の結合分子を表示す る可能性を有することが有用であろう。 本発明者らは両者の目的を達成する方法を案出した。 このアブ口・−チはｐＨｃ１１９に基づくファージミド系から誘導される〔ν１ ｅｉｒａ、　Ｊおよびｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ ｎｚｙ＋ｍｏ１．１５３：３）。 簡単に述べると、ｆｄ−ＣＡＴ２がらの遺伝子ＩＩＩ（実施例３）およびｆｄｃ ＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３からの遺伝子１１１ｓｃＦｖ融合体（実施例５）をｐＵ ｃ１１９の別々の試料中のｌａｃプロモーターの下流にクローニングし、こうし て挿入された遺伝子ＩＩＩおよび遺伝子ＩＩＩ融合体をＳａｍｂｒｏｏｋら１９ ８９前掲に従い調製したＭ１３ＫＯ７ヘルパーフアージによりレスキューことが できるようにした。レスキューされたファージの大部分は、結合分子−遺伝子Ｉ ＩＩの融合体を含有するｐｔｌｃ１１９がら誘導されたゲノムを含有することが 期待され、そして表面上に野生型ファージの表面の遺伝子ＩＩＩの通常の最高３ 〜５分子までの変化する数の結合分子を発現するであろう、この系は結合分子と して抗体を使用して下に例示されている。 Ｄｌ、３抗リゾチ一ム抗体の一本鎖Ｆｖ形態を含有するｆｄＣＡＴ２は、ｆｄＴ ｓｃＦｖＤｌ、３（実施例２）をＰｓｔｌおよびχｈｏｌで消化し、５ｃＦｖ断 片を含有する断片を精製し、そしてこれをＰ３ｔＩおよびＸｈｏ　Ｔ消化したｆ ｄＣＡＴ２の中に連結することによって形成された。　ｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ １．３と呼ぶ適当なりローンを２ＸＴＹテトラサイクリン（１５ｇｇ／■ｌ）上 にプレイティングした後選択し、そして制限酵素および配列の分析により確認し た。 ｆｄ−ＣＡＴ２からの遺伝子ＩＩＩ（実施例５）およびｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＤ １．３がらの遺伝子１１１ｓｃＦｖ融合体を、下に示すプライマーＡおよびＢを 使用してＰＣＲ増幅したニ ブライ７−Ａ　：　ＴＧＣＧＡＡ　ＧＣＴ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　 ＴＴＴ　ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＣ’７’　ライ？　−Ｂ　：　ＣＡＧ　 ＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡＣＧ ＣＡ　ＧＴＡＴＧＴ　ＴＡＧ　Ｃ プライマーＡはリポソーム結合部位を含む遺伝子ＩＩＩの５′末端にアニーリン グし、位置し、そして旧ｎｄＩＩＩ部位組み込んでいる。 プライマーＢはＣ末端における遺伝子ＩＩＩの３′末端にアニーリングし、そし て２つのＵＡＡ停止コドンおよびＥｃｏＲ１部位を組み込んでいる。　１０ｎｇ のｆｄ−ＣＡＴ２およびｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖｌ１１．３を実施例７に記載す るように５０μｍの合計反応体積でＰＣＩ＋増幅の鋳型として使用したが、ただ し２０サイクルの増幅を実施した８９４℃で１分、５０゛ｃで１分、７２℃で３ 分。これは期待したｆｄ−ＣＡＴ２からの１．２Ｋｂの断片およびｆｄ−ＣＡＴ ２ｓｃＦｖＤ１．３からの１．８Ｋｂの断片の増幅を生じた。 ＰＣＲ断片をＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌｌＩで消化し、ゲル精製し、そしてＥｅ ｏＲＩおよび旧ｎｄＩＩＩ切断しそして脱リン酸化したｐＵｃ１１９の１）ＮＡ 中に連結し、そして標準的技術を使用して大腸ＩＴＧＩ中に形質転換した（Ｓａ ｓｂｒｏｏｋら前掲）、形質転換された細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン および２％のグルコースを含有するＳＯＢ寒天（Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９前 掲）上にブレーティングし、そして生ずるクローンをｐＣＡＴ−３（ｆｄ−ＣＡ Ｔ２に由来する）およびｐＣＡＴ−３ｓｃＦｖＤ１．３（ｆｄ−ＣＡＴ２ｓｅＦ ｖＤ１．３に由来する）と呼ぶ。 単一のｐＣＡＴ−３およびｐＣＡＴ−３ｓｃＦｖＤ１．３のコロニーを１００　 ｔｔ　ｇ　／ｍｌのアンピシリンおよび２％のグルコースを含有する１、５ｍｌ の２ＴＹ中に拾い入れ、そして３０”Ｃにおいて６時間増殖させた。３０μｌの これらの満足すべき細胞を５０ｍ１のポリプロピレン管（Ｆａｌｃｏｎ、　Ｂｅ ｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａｂｗａｒｅ、　１９５０米国カリフォルニア 州オックスフォード、ウィリアムスドライブ）中の１１００Ｉｊ／ｍｌのアンピ シリンおよび２％のグルコースを含有する６ｍｌの２ＹＴに添加し、そして二ニ ー・ブルンスウィック・オービタル・シエイカ−（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ 　ＯｒｂｉｔａｌＳｈａｋｅｒ）（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃ　Ｌｔｄ、、英国ハツトフィールド、ノースミンス、ジクソンスヒルロ ード１６３エディソンハフス）中で３０°Ｃ１３８０ｒｐ−において１．５時間 増殖させた。細胞を５，０００　ｇで２５分間遠心することによって沈澱させ、 そして管をティシュ−ペイパー上に排液した０次いで、細胞の沈澱を、添加され た１、２５Ｘ１０”ｐｆｕ／１のＭＩ３ＫＯ７を含有する６−１の２ＴＹ中に懸 濁させた。この混合物を氷上に４５分間放１し、次いで３５℃、４５０ｒｐ−に おいて４５分間増殖させた。 次いで、４　ａ　１　ノ１００　ｕ　ｇ　／ｓｌアンピシリン、０．５　ｔｔ　 Ｉ　（７）０．１　ＭＩＰＴＧおよび５０μＩのｌｏｎｇ／ｍｌカナマイシンを 含有するカクテルを添加し、そして培養物を３５℃、４５０ｒｐ■において一夜 増殖させた。 次の日に、培養物を遠心し、そしてファージの粒子を実に例６　ニ記載するよう に沈澱させた。ファージの沈澱物を１００　μｍのＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ、実 施例６参照）中に再懸濁させ、そしてファージを大腸菌ＴＧＩにより力価検定し た。ｉ染した細胞のアリコートを１００μｇ／■１のアンピシリンを含有するＺ ＴＹ上にプレイティングしてｐｔｌｃ１１９ファージ粒子について選択するが、 あるいは５０ｇｇ／−１のカナマイシンを含有する２ＴＹ上にプレイティングし てＭ１３ＫＯ７ヘルパーフアージについて選択した。プレートを３７℃において 一夜インキュベーションし、そして抗生物質耐性のコロニーをカウントした：Ｄ ＮＡ　ａｍｐ”　ｋａｎ” ｐＣＡＴ−３１，８Ｘ１０”：２ｅｌニー　１．２Ｘ１０’コｏ＝　−ｐＣＡＴ −３ｓｃＦｖ　０１．３　２．４Ｘ１０”コロニー　２．０Ｘ１０’コロニーこ れが示すように、ａｓｐ　”ファージミド粒子は感染性であり、そしてレスキュ ーされたファージ集団中にｋａｎ　”　Ｍ１３ＫＯ７ヘルバーフアージに対して １００倍の過剰量で存在する。 ファージを抗リゾチーム活性について実施例６に記載するようにＥＬＩＳＡによ り次の変更を伴ってアッセイした：１　）　ＥＬＩＳＡプレートを２％のマーベ ル（Ｍａｒｖｅｌ）／ＰＢＳで３時間プロフキングした。 ２）５０μ１（７）７ｙ−’；、４００　ｔｔ　Ｉ　（７）Ｉ　ＸＰＢＳ　オヨ び５０ｔｔ　ｌ　（Ｄ２０％のマーベルを２０分間室温において転倒混合した後 、１５０μｍ／ウェルで添加した。 ３）ファージを室温において２時間結合させた。 ４）ファージ結合後のすべての洗浄は次の通りであった：急速すすぎ、ＰＢＳ　 １０．５％のツイーン２０３×２分の洗浄、ＰＢＳ　１０．５％のツイーン２０ ２回の急速すすぎ、ＰＢＳ　、洗浄剤なし３×２分の洗浄、ＰＢＳ　、洗浄剤な しこのＥＬＩＳＡの結果を１！２２図に示し、これが示すように、抗体の特異性 は実際に効率よくレスキューされ得る。 変異体および野生型タンパク質が同一細胞において同時に発現されるとき、野生 型タンパク質は同一細胞において同時に発現され、野生型タンパク質は優先的に 使用されることは細菌遺伝学の自明の理であると考えられる。これは上に場合に 類似し、ここで変異体（すなわち、抗体融合体）および野生型遺伝子ＩＩＩタン パク質（Ｍ２Ｓに０７からの）はｐＵｃ１１９ファージミド粒子の一部分として アセンブリソゲすることについて競争する。したがって、生ずるｐｔｌｃ１１９ ファージ粒子の大部分は、例えば、実施例２に記載する純粋にファージ系につい ての場合より、少ない遺伝子ＩＩＩ　−抗体融合分子をそれらの表面上に存する であろうことが考えられる。したがって、このようなファージミド抗体は、それ らの表面上に抗体融合体の３またはそれ以上のコピーをもつｆｄファージ（例え ば、実施例２に記載する系において、野生型遺伝子ＩＩＩは存在しない）より低 い結合活性をもつ抗原に結合するようであり、そして異なる数の同一の結合分子 （そしてそれ故にリガンド／抗原について異なる酸性度）または多数の異なる結 合特異性をそれらの表面上にもつファージ粒子を、ヘルパーファージ例えば）＋ １３ＫＯ７を使用することによって産生じ、２またはそれ以上の遺伝子ＩＩＩ　 −抗体融合体を発現する細胞をレスキューするルートを提供する。 また、それらのゲノムにおいて機能的遺伝子ＩＩＩをコードしないヘルパーファ ージを得ることができる（例えば、遺伝子ＩＩＩ配列またはその一部分を欠失す るか、あるいはアンバー変異を遺伝子内に組み込むことによって）。 これらの欠陥のあるファージは適当な細胞（例えば、機能的遺伝子ＩＩＩをトラ ンスに（ｔｎ　ｔｒａｍｓ）提供するか、あるいはアンバーサプレッサー遺伝子 を含有する）上でのみ増殖するが、ファージ抗体をレスキューするために使用さ れるとき、ファージミドによりコードされる遺伝子ＩＩＩ抗体融合体を放出され たファージ粒子中にはじめて組み込むであろう。 １９、ＣＡＴ−３およびＣＴＡ−３ｓｃＦｖＤ１．３フアージミドのノーノ法！ ｐＵｃ１９．　ｐＣＡＴ−３およびＰＣＡＴ−３ｓｃＦｖＤ１．３プラスミドの ＤＮＡ　、並びにｆｄＣＡＴ−２フアージＤＮＡを調製し、そして大腸菌ＴＧＩ を形質転換するために使用した。　ｐＣＡＴ−３およびｐＣＡＴ−３ｓｃＦｖＤ １．３の形質転換物を、１００μｇ／■ｌのアンピシリンおよび２％のグルコー スを含有するＳＯＢ寒天上にプレイティングし、そして３０℃において一夜イン キュベーションした。　ｆｄＣＡＴ−２の形質転換物を１５μｇ／−１のテトラ サイクリンを含有するＴＶ寒天上にプレイティングし、そして３７℃において一 夜インキエベーシゴンした。形質転換の効率をコロニー７４ｇ入力ＤＮＡとして 表す。 ＤＮＡ　形質転換効率 ｐＣＡＴ−３ｓｃＦｖ　０１．３　１．１０’ｆｄ　ＣＡＴ−２８，１０’ 期待通りに、ファージミドベクターの形質転換は親のｆｄＣＡＴ−２ベクターよ りほぼ１００倍効率がよい。さらに、５ｃＦｖ抗体断片の存在は効率と妥協しな い、形質転換効率におけるこの改良は、異なる結合特異性の大きなレパートリ− を有するファージ抗体のライブラリーの発生において実際に有用である。 裏蓋■並、逸及進　れたマウス）°の−ＩＪ３−イブ−１−のＰｃ１２１文２プ ユニ レパートリ−からの抗体の選択のためのファージの実用性を実証するために、第 １の要件は動物の抗体のレパートリ−の多様な代表的なライブラリーをａｌ製し 、そしてこのレパートリ−をバタテリオファージｆｄの表面上に表示することが できることである。 細胞質性１２ＮＡを、実施例１４に従い、ニワトリ血清アルブミンにカップリン グした２−フェニル−５−オキサシロン（ｐｈＯＸ）で−次免疫化後８週に追加 免疫した５匹のＢａ１ｂ／ｃマウスのプールした牌臓がら分離した。　ｃＤＮＡ の調製並びにファージの表示のためのマウスＶＨおよびＶＬカッパレパートリ− のＰｃｔ？アセンブリーは、実施例１４に記載する通りであった。こうして得ら れた分子をｆｄＣＡＴ２中に連結した。 ベクターｆｄＣＡＴ２をＮｏｔＩおよびＡｐａＬＩにより十分に消化し、電気溶 出により精製しくＳａｍｂｒｏｏｋら１９８９前掲）、そして１μｇを８０００ 単位のＴ４ＤＮＡ　リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用 いて１ｍｌ中で０．５μｇ（階層的ライブラリーのために５μｇ、実施例２参照 ）のアセンブリングしたｓｃＦν遺伝子に連結した。連結は１６°Ｃにおいて一 夜実施した。精製した結合混合物を６つのアリコートでＭＣ１０６１細胞中にエ レクトロポレイションしくＷ、Ｊ、Ｄｏｗｅｒ、　Ｊ、Ｆ、Ｍｉｌｌｅｒおよび ＣＪ。 Ｒａｇｓｄａｌｅ　Ｎｕｃｌ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、１６６１２７−６１４５１ ９８８）そして２４３　Ｘ　２４３ｍｍの皿（Ｎｕｎｃ）中で１５μｇ／ｍｌの テトラサイクリンを有するＮＺＹ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、１９８ ９５ｕｐｒａ）上にプレイティングした：　Ｉ’ＣＲスクリーニングにより、９ ０−９５％のクローンがｓｃＦν遺伝子を含有してぃた。＆［ｌみ換えコロニー をＰＣＲ（実施例７に記載するような条件）によリプライ？−ｖＨＩＢＡＩＪお よびＦＩＪＫＩＦＯＮＸ、　ＭＪＫ２ＦＯＮＸ、　Ｆ４ＪＫ４ＦＯＮＸおよび？ ＩＪＫ５ＦＯＮＫ　（実施例１４を参照のこと）を使用してスクリーニングし、 次いで頻繁に切断する酵素ＢｓｔＮ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　８ｉｏ１ａｂ ｓ　、製造業者の指示に従い使用した）で消化した。２ＸＩＯ’クローンのライ ブラリーは、第２３図において見られる変化に冨む消化パターンから判断して多 様であると思われ、そして配列決定は大部分のＶＷグループ（Ｒ，Ｄｉｌｄｒｏ ｐ、　Ｉｔｕａｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　５８５−８６１９８６）およびＶＬサブ グループ（Ｘａｂａｔ、Ｂ、Ａ、　ら１９８７前掲）（データは示されていない ）の存在を明らかにした。試験した５６８のクローンのいずれも、実施例９にお けるようにＥＬＩＳＡにより検出したとき、ｐｈＯＸに結合しなかった。 こうして、ファージ抗体の使用により提供される抗体を選択する可能性（実施例 ２におけるように）は、抗体結合活性をもつ抗体をランダムに組み台わされたＶ ＨおよびＶＬドメインから容易に分離するために必須である。　Ｒｕ５ｅら１９ ８９　（前掲）のランダム組み合わせを使用する場合、抗原結合断片を分離する ために非常に広範なスクリーニングが要求されるであろう。 ２１、　れたマウスが”６　九人」ノ８：ＬＬ二虹旦匁２−フェニル−５−オキ サゾロ２５男山１１１釣１正藤■這訳 実施例２０において調製したライブラリーを使用して、それらの抗体特異性に基 づいて抗体を選択するファージ系の能力を証明した。 選択されないライブラリーからの試験した５６８のクローンのいずれも、ＥＬＩ ＳＡにより検出したとき、ｐｈｏｘに結合しなかった。 ハプテンへのファージの結合についてのスクリーニングをＥＬＩＳＡにより実施 した：９６ウエルプレートをリン酸塩緩衝液（ＰＢ　Ｓ　）の中で１０ｇｇ／ｍ ｌのｐｈｏｘ−８５Ａまたは１０℃ｇ／ｍｌのＢＳＡにより室温において−夜コ ーティングした。ファージで形質導入した細２のコロニーを、９６ウエルプレー ト（「セルウェルＪ　、Ｎｕｃｌｏｎ）中で１２．５．ｕｇ／ｍｌのテトラサイ タリンを有する２００μｌの２ＸＴＹの中に接種し、そして震盪しながら３７℃ において２４時間増殖させた。この段階において、培養物は飽和し、そしてファ ージの力価は再現性があった（１０’・ＴＵ／ｍｌ）　、　５０μｌのファージ 上澄み液を４％のスキムミルク粉末を含有する５０μｍのＰＢＳと混合し、次い でコーティングしたプレートに添加した。更なる詳細は実施例９におけるようで ある。 ファージのライブラリーをｐｈＯｘアフィニティーカラムに下方に通しく表４Ａ ）、そしてハブテンと共に溶出した。実施例２２において調製したライブラリー からのコロニーを５０１１の２ＸＴＹ培地の中にこすり落として入れ、そして３ ７℃において３０分間震盪した。遊離したファージをポリエチレングリコールで ２回沈澱させ、そして水中に１０”ＴＲＩ　（形質導入単位）／ｍｌに再懸濁さ せた（実施例日におけるように力価検定した）、アフィニティー選択のために、 ｐｈｏｘ−ＢＳＡ−セフ１０−ズ（０，Ｍａｋｅｌａ、　Ｍ、Ｋａａｒｔｔｎｅ ｎ、　Ｊ、Ｌ、Ｔ、ＰｓｌｏｎｅｎおよびＫ。 Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１４８１６４４−１６６０．１ ９７８）の１１０カラムを３００ｍ１のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）　、および２ ％のスキムミルク粉末を含有すル２（１＋＋Ｉ（７）ＰＢＳ（ＭＰＢＳ）　テ洗 浄しり、１０”ＴＵ（’）　７　データを１０ｍ１＜７１ＭＰＢＳ中に負荷し、 １抛ｌの？ＩＰＢＳで洗浄し、そして最後に２００　ｍｌのＰＢＳで洗浄した。 結合したファージを５抛ｌの１１４−ε−アミノ−カプロン酸ノチレン２−フェ ニル−５−オキサゾルー５−オン（ｐｈｏｘ−ＣＡＰ；０゜Ｍａｋｅｌａら１９ ７８、前掲）により抽出した。約１０’Ｔ［＋の溶出されたファージを、１１の 対数期の大腸菌子ＧＩを感染さ七そして上記のようにしてプレイティングするこ とによって増幅した。更なるラウンドの選択のために、コロニーを１０１の２Ｘ ＴＹ培地の中にこすり落として入れ、次いで上のようにして処理した。溶出した クローンのうちで、１３％は第１ラウンドの選択後にｐｈＯｘに結合ことが見出 され、モしてＥＬＩＳＡにおいて劣った〜強い結合の範囲であった。 クローンを配列決定するために、２４時間増殖させたｆｏｗｌの培養物の上澄み 液から鋳型ＤＮＡを調製し、そしてジデオキシ法およびセクエナーゼ（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ）キット（ＵＳＢ）により、νＨ遺伝子のためにプライマーＬＩＮＫ ＦＯＲ（実施例１４参照）およびＶＫ遺伝子のためにプライマーｆｄｓＥＱ１（ ５’　−ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＴＧＡ　［；Ｇ）を使用シテ配列決 定シタ。 これらのハブテン結合クローンのうちの２３クローンを配列決定し、そして８つ の異なるＶ１１遺伝子（Ａ−Ｈ）は７つの異なるＶｋ遺伝子（ａ−ｇ）との種々 の対合において見いだされた（第２４図）、ドメインの大部分、例えば、ＶＨ− ８およびＶｋ−ｄは「無差別的」であり、いくつかの相手の任意のものと共にハ ブテンを結合することができた。 ■遺伝子の配列はｐｈｏｘに対する二次応答において見られるものに関係するが 、差が存在した（第２４図）、こうして、二次応答からのｐｈＯｘハイブリトー マは、Ｖｋ遺伝子−Ｖｋｏｘｌ、ｒ　Ｖｋｏｘ様」およびＶｋ４５．　Ｉ遺伝子 の３つの型の体細胞突然変異した誘導体を使用する（Ｃ，Ｂｅｒｅｋ。 Ｇ、Ｍ、ＧｒｉｆｆｉｔｈｓおよびＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｎａｔｕｒｅ　３１ ６４１２−４１８（１９８５）　、これらはいくつかの群からの遺伝子と対を形 成することができ、ＶｋｏｘｌからのＶＨ遺伝子はより普通にはＶＢｏｓ　１遺 伝子（ｖｎ群２、Ｒ，Ｄｉｌｄｒｏｐ前掲）とを形成する。　Ｖｋｏｘｌ遺伝子 は常に、そしてＶｋｏｘ様遺伝子はしばしば、ヘビー鎖（ＶＨｏｘｌを包含する ）との会合状態で見いだされ、そして配列のモチーフＡｓｐ−χ−Ｇｌｙ−に一 χをもつ短い５つの残基Ｃ［ｌＲ３を含有し、ここで中央のグリシンはｐｈｏｘ のためのキャビティをつくるために要求される。しかしながら、ランダム組み合 わせのライブラリーにおいて、Ｖｌ（遺伝子のほとんどすべてはグループに属し 、そしてＶｋ遺伝子の大部分はｏｘ様であり、そして５残基ＣＤＲ３、モチーフ Ａｓｐ／　Ａｓｎ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−ＸをもツＶＨドメインと会合した（第２４ 図）。 ＶｋｏｘｌおよびＶＨｏｘｌ　は１回だけ見いだされ（Ｖｋ−ｆおよびシトＥ） 、そして互いに組み合っていなかった。事実、νに−ｆはｐｈＯｘの結合に関係 するＴｒｐ９Ｉを欠如し、そして６残基ＣＤＲ３をもつν）Ｉ（ＶＨ−Ｃ）と対 を形成した。 ＶＨおよびＶＫ遺伝子のマトリックス組み合わせは、このランダム組み合わせの ライブラリーから選択されたｐｈＯｘ結合クローンにおいて同定された。各組み 合わせをもって見いだされたクローンの数は第２５図に示されている。　ｐｈＯ ｘ−ＢＳＡへの結合は、ＥＬＩＳＡのシグナルから判断して、多様であるように 思われる（第２５図に陰影でしるされている）　、　ＢＳＡ単独への結合は見ら れなかった。 免疫マウスからのもとのランダム組み合わせライブラリーの選択の第２ラウンド は、ｐｈＯｘと結合する溶出されたクローン９３％をもたらした（表４）、これ らのクローンの大部分はνに−ｄの組み合わせであり、そしてＥＬＩＳＡにおい てｐｈＯｘに強く結合したくデータは示されていない）、わずかの弱い結合物が 見られた。これが示唆するように、アフィニティークロマトグラフィーは結合物 について濃縮したのみならず、最良であった。 蛍光クエンチング検定により、ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡ　ニツイテ（７）Ｖ）Ｉ−Ｂ ／Ｖｋ−ｄのＫｄが１０−１モルであるとして決定され、二次応答を代表する親 和性をもつ抗体は二次応答から選択することができ、２つのみ（特性決定された １１のうちの）がＶｌ（−Ｂ／Ｖｋ−ｄ（Ｃ，Ｂｅｒｅｋら１９８５前掲）より 高い親和性の抗体を分泌することが示された。　ｐｈｏｘ−ＧＡＢＡについての シＨ−Ｂ／νに−ｄのＫｄは１０−Ｓモルであるとして決定された（実施例２３ ）。 こうして、弱い親和性をもつ５ｅＦｖ断片を有するファージは、多分ファージ上 の多数抗体ヘッドの結合活性のために、抗原により選択することができる。 この実施例が示すように、免疫化されたマウスに由来するライブラリーから抗原 特異性を分離することができる。これらの抗体を、更なる研究のために並びに療 法的および診断的応用における使用のために可溶性の形態で発現させることがし ばしば望ましいであろう。 実施例２３は、ファージ抗体を使用して選択した可溶性ｓｃＦν断片の親和性の 決定を示す、実施例２７は、可溶性断片がファージ上で表示されるそれらに類似 する性質を有することを示す、多数の目的で、ヘビー鎖のＦｃ部分を含有し、そ して多分免疫グロブリンのアイソタイプを異にする抗体分子を構成しそして発現 させることが望ましいであろう、これを達成するためには、ファージ選択系を使 用して同定された抗原結合部位を、哺乳動物細胞における発現のためにベクター 中に、０ｒｌａｎｄｉ、　Ｒ，ら（１９８９、前掲）が記載する方法に類似する 方法を使用して、サブクローニングすることが必要である０例えば、ＶＨおよび ＶＬ遺伝子を別々に、ＰＣＲにより、適当な制限部位を含有するプライマーを使 用して増幅し、そしてベクター、例えばｐＳシーｇｐｔＨｕＩｇＧＩ　（１，Ｒ ｉｅｃｂｍａｎｎらＮａｔｕｒｅ　３３２３２３−３２７）、　１９８８）　（ これはヘビー鎖ＩｇＧＩアイソタイプの一部分としてＶ＋＋ドメインの発現を可 能にする）、およびｐｓｖ−ｈｙｇ　ＨｕＣＫ　（これはにライト鎖定常領域に 取り付けられたＶＬドメインの発現を可能とする）に挿入することができる。さ らに、ＶＨおよびＶＬドメインの融合体は、非免疫グロブリンタンパク質、例え ば酵素をコードする遺伝子を使用してつくることができる。 階層的アプローチを用いて実施例２０及び２１において調しそしてスクリーニン グしたライブラリーから更なる抗体特異性を誘導した。 ＶＨ−ＢｏｙＶｋ−ｄドメインの無差別性（ｐｒｏｓｉｓｃｕｉｔｙ）は、Ｖｋ またはＶＨのいずれかが同一の免疫化されたマウスからのものである場合、これ らの遺伝子を全体のレパートリ−とアセンブリングすることによって、更なる対 形成をするように本発明者らを仕向けた。生ずる［階層的（ｈｉｅｒａｒｃｈｉ ｃａｌ）　Ｊライブラリー（ＶＬ８　ＸＶｋ−ｒｅｐおよびＶｌ（−ｒｅｐＸν に−ｄ）（各々は４Ｘ１０’の構成員をもつ）を、１ラウンドの選択にかけ、そ してハブテン結合性クローンを分離した（表４　）　、ＥＬＩＳＡにより示され るように、大部分は強い結合物であった。各ライブラリーからの２４のクローン を配列決定することによって、Ｖｌ（−８について１４の新しい相手、およびＶ ｋ−ｄについて１３の相手が同定された（第２４図）　、　ＶＨ−８およびＶｋ −ｃを別として、ランダム組み合わせライブラリーからの以前の相手（または事 実他のクローン）のいずれも再び分離されなかった。再び、Ｖｋ遺伝子は主とし てＯＸ様であり、そしてＶＨ遺伝子は主としてグループ１である（Ｄｉｌｄｒｏ ｐ、　Ｒ，１９８４前掲において定義されるように）が、Ｖｋｏｘｌの唯一の例 （Ｖｋ−ｂ、　−９，−ｑおよび−ｒ）はＴｒｐ９１を有し、そしてＶＨ−ＣＤ Ｒ３ｎｏモチーフＡｓｐ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｘはここで優勢である。こうして、 ｐｈｏｘハイブリドーマのいくつかの特徴は階層的ライブラリーにおいていっそ う強く発生するように思われた。新しい相手は互いに主としてＣＤＲ中の小さい 変更により異なり、微妙な多様性の多くはランダム組み合わせのアプローチによ りまだ未開発のままであったことが示される。より一般的には、関係する抗体の スペクトルは相手の一方のを固定して保持しそして他方を変化させることによっ てつくることができることが示され、そしてこれは抗体の親和性および特異性の 繊細な調整には価値がないことを証明することができるであろう。 したがって、再び、ファージ抗体は、所望の性質についてより大きい範囲の抗体 分子の分析を可能とする。 この実施例および実施例２１は、ファージ表面上の表示を通して個々の抗体の特 異性の分離することを実証する。しがしながら、いくつかの目的のために、ポリ クローナル抗血清と同等の抗体の混合物を得ることは一層望ましいことがある（ 例えば、免疫沈澱のために）。 抗体の混合物をｌｌ製するため４：、クローンを混合し、そして可溶性の抗体ま たは抗体断片を発現するか、あるいはライブラリーからクローンを選択して、問 題のりガントに対して向けられた抗体または抗体断片をコードする遺伝子の高度 に濃縮したプールを形成し、そしてこれらのクローンから抗体を発現させること ができる。 実施例２１に示すＥＬＩＳＡのデータは、アフィニティークロマトグラフィーが 結合物を濃縮するばかりでなく、最もよく濃縮することを示唆した。これをｆ１ 認するために、強い結合性および弱い結合性のファージの結合親和性を決定し、 次いでそれらをアフィニティークロマトグラフィーにより分割ができることを実 証した。 りＣ１−７ＶＨ−Ｂ／Ｖｋ−ｂおよびＶＨ−Ｂ／Ｖｋ−ｄを、ｌ’１ＪＩＦＯＮ Ｘ、　ＭＪ２ＦＯＮＸ。 ＭＪ４ＦＯＮＸおよび？ＩＪ５ＦＯＮＸ　（実施例１４参照）並びニＶＨＩＢＡ ＣＫ−Ｓｆｉ＋（５’　−ＴＣＧ　ＣＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＣＧＧ　ＣＣＡ　ＴＧ Ｇ　ＣＣ（Ｇ／Ｃ）ＡＧＧ　Ｔ（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）　Ａ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧＣＡ Ｇ（Ｃ／Ｇ）　ＡＧＴ　Ｃ（Ａ／Ｔ）ＧＧ）、　ＶＨ遺伝子の５′末端ニ５ｆｉ １部位（下線が引かれている）を導入するプライマー、を使用して再増幅した。 ＶＦＩ−Ｂ／Ｖｋ−ｂを、５ｆｉＩ−Ｎｏｔｌ　：）’７　セットとし”Ｃ７ｙ −シミｔ’、例えば、ｐＪＭｌ（Ｇｒｉｆ４ｉｔｈｓおよびＪ、Ｍａｒｋｓから 入手した）の中に、ペリプラズム分泌のためのｐｅｌＢリーダー（Ｍ、Ｂｅｔｔ ｅｒら前掲）の下流に、検出のためにＣ末端のペプチド標識を使用して（実施例 ２４および図面参照）かつＰ、プロモーター（Ｈ，５ｈｉｓａｔａｋｅおよびＭ 、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　Ｎａｔｕｒｅ　２９２１２８−１３２１９８１）のコン トロール下にクローニングした。ファージミドは次の特徴もつべきであるｉ　ａ 　）　ｐｅｌＢ’Ｊ−グーの下流のユニークＳｆＨおよびＮｏｔｌｌｌｌ限部位 ；ｂン検出のためにＣ末端のペプチド標識をコードする配列；およびＣ）発現を コントロールするλＰＬプロモーター。各ファージミドを収容する大腸菌Ｎ４８ ３０−１（Ｍ、Ｅ、Ｇｏｔｔｅｓ■ａｎ＋Ｓ、ＡｄｈｙａおよびＤａｓ　Ｊ、門 ｏ１．Ｂｉｏ１．１４０５７−７５１９８０）の１０１培養物を、Ｋ、Ｎａｇａ ｉおよびＨ，Ｃ，Ｔｈｏｇｅｒｓｏｎ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５ ３４６１−４８１１９８７）におけるように誘導し、そして上澄み液を５０％の 硫酸アンモニウムで沈澱させた。再！ＩＡ濁した沈澱をＰＢＳ　＋０．２ｍＭ　 ＥＤＴＡ（ＰＢＳＥ）中で透析し、１．５１のｐｈｏｘ　：セファローズのカラ ム上に負荷し、そしてこのカラムを順次に１００ｍ１　のＰＢＳ：１００ｍ１　 の０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、０．５　ＭＮａＣｌ（ｐＨ８，０）　：１ ０ｍ１の５０＠Ｍクエン酸塩（ｐＨ５，０）　；ｌＯｍ＋の５０−門クエン酸塩 （ｐｉ４４．０）　、および２０−１の５０−門グリシン（ｐＨ３，０）で洗浄 した。５ｃＦｖ断片を５０＋ｍＭグリシン（ρＥＩ２．０）で溶出し、Ｔｒｉｓ 塩基で中和し、そして）’ＢＳＥで透析した。シＨ−Ｂ／νに−ｂを、同一シグ ナルをコードするｐＨｃ１１９およびｐＪｌ’ｌｌに対する標識配列に基づ（フ ァージミドベクター中にクローニングし、そして発現を３０゛Ｃにおいて、Ｄ、 ｄｅ　Ｂｅ１ｌｉｓおよびＩ。 Ｓｃｈｗａｒｔｚ（１９８０Ｎｕｅｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８１３１１）に おけるように、このファージミドを収容する大腸菌ＴＧＩの培養物１０リツトル 中で誘導した。 クローンＶｌ（−Ｂ／Ｖｋ−ｂの低い親和性はｐｈＯｘ〜セファローズによるそ の精製を不可能にした。したがって、限外濾過（Ｆｉｌｔｒｏｎ、　Ｐｌｏｗｇ ｅｎ）による濃縮後、前記ペプチド標識を認識するモノクローナル抗体９Ｅ１０ （Ｅｖａｎ、　Ｇ、　！、らＭｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５３６１０−３６１ ６１９８５）にカップリングしたプロティンＡ−セファローズ（Ｅ、Ｈａｒｌｏ ｗおよびり、Ｌａｎｅ　１９８０前掲）のＬｎｌのカラム上に、上澄み液（６０ ０ｍｌのうちの１００ｍ１）を負荷した。 このカラムを２００ｍ　ｌ　のＰＢＳおよび０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含む５０ｍ １のＰＢＳで洗浄したａ　５ｃＦｖ断片を１００ａ＋１　の０．２　Ｍグリシン （ｐＨ３，０）で溶出し、中和および透析を前のように実施した。 りｏ−７ＶＨ−Ｂ／Ｖｋ−ｄニツイ７（１’）Ｋｄ（１，Ｏ＋０．２　Ｘｌ０− ”−Ｔ−ル）は、４−Ｅ−アミノ−醋酸メチレン２−フェニル−５−オキサゾル ー５−オン（ｐｈｏｘ−ＧＡＢＡ　Ｃｏ、Ｍａｋｅｌａら１９７８前掲）による 蛍光クエンチ検定により決定した。励起は２８０ｎ−においてであり、放射を３ ４ｏｎ−においてモニターし、そしてＫｄを計算した。低い親和性のクローンＶ Ｈ−Ｂ／Ｖｋ−ｂのＫｄは１．８±１０−５モルとして決定された（示さない） 、要求されるρｈｏχ−ＧＡＬＡのより高い濃度による光の吸収を最小にするた めに、励起は２６０ｎｉ＋においてであり、そして放射は３０４ｒ＋＋ｓにおい てモニターした。さらに、蛍光の値をリゾチームに結合するＦａｂ断片Ｄ１．３ の平行した検定からの値で割った。この値はＨ，Ｎ、Ｅｉｓｅｎ　Ｍｅｔｈ、Ｍ ｅｄ、Ｒｅｓ。 １０１１５−１２１１９６４におけるように計算した。　２０ＶＨ−Ｒ／ｖｋ− ｂ：ＩＶＨ−Ｂ／Ｖｋ−ｄ（７）比におけルク１：ｌ−：／Ｖ［Ｉ−Ｂ／Ｖｋ− ｂおよびＶＫ−Ｂ／Ｖｋ−ｄの混合物、７　ｘｌｏ”Ｔｔｌファージを、ｌ０ｗ １の？ＩＰＢＳ中でｐｈＯｘ−８ＳＡ−七）７Ｃ１−ズのカラムに負荷し、そし て上記のように溶出した。溶出されたファージを使用して大腸菌ＴＧＩを再感染 させ、そしてファージを産生じ、そして前述のようにして収穫した。はぼＩＱＩ Ｉ↑Ｕのファージを第２アフイニテイーカラム上に負荷し、そしてこの方法を反 復して合計３回カラムを通過させた。各段階における溶出されたファージの希釈 物を二重反復実験においてプレイティングし、そしてＶｋ−ｂに対して特異的な オリゴヌクレオチド（５’　ＧＡＧ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＡＣＣＡＣＴ　ＧＴＡ　 ＣＴ）またはＶｋＪに対して特異的なオリゴヌクレオチド（５’　−ＧＡＡ　Ｔ ＧＧ　ＴＡＴＡＧＴ　ＡＣＴ　ＡＣＣＣＴ）で別りにブロービングした。これら の２ラウンド後、本質的にすべての溶出されたファージはＶＨ−Ｂ／Ｖｋ−ｄで あった（表４）、したがって、ファージ抗体は表示された抗体の抗原親和性に基 づいて選択することができる。 ファージミドｐ１１ＥＮ１（第２６図）はｐＨｃ１１９誘導体である（Ｖｉｅｉ ｒａ、　Ｊ。 およびＭｅｓｓｊｎｇ、　Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚｙｍｏｌ、１５６　Ｐ９ ３−１１）６　シグナルベブチドおよびクローニング部位を包含するｆｄｃＡＴ ２からのｇ３ｐのコード領域を、ＰＣＨにより、プライマーＧ３ＦＵＦＯおよび Ｇ３ＦＵＢＡ　（下に記載する）（これらはそれぞれＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ｌ１１部位を含有する）を使用して増幅し、そして旧ｎｄ１１１〜ＥｃｏＲＩ断 片としてｐ［Ｉｃ１１９中にクローニングした。　ｇ３９シグナル配列をコード する旧ｎｄｌｌｌ−Ｎｏｔｌ断片を、内部のＳｆｉｌ部位をもつｐｅｌＢシグナ ルペプチド（Ｂｅｔｔｅｒ、　Ｍ、ら５ｃｉｅｎｃｅ２４０１０４１−１０４３ ．１９８８）により置換し、抗体遺伝子をｆｉｌ−ＮｏｔＩ断片としてクローニ ングすることを可能とした。ペプチド標１１ｅ−ｓｙｃ（Ｍｕｎｒｏ。 Ｓ、およびＰｅｌｈａｍ、　Ｈ，Ｃｅ１ｌ　４６２９１−３００．１９８６）を Ｎｏｔ１部位のすぐ後にオリゴヌクレオチドカセットのクローニングにより導入 し、次いでアンバーコドンを部位特異的変異誘発により試験管内変異誘発キット （Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して導入した（第２ ６図ｂ）。 Ｇ３ＦｔｌＦ０．５’　−ＣＡＧ　ＴＧＡＡＴＴＣＴＴ　ＡＴＴ　ＡＡＧ　ＡＣ Ｔ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＡＧ　ＧＣＡ　ＧＴＡＴＧＴ　ＴＡＧ　Ｃ； Ｇ３ＦＵＢＡ、５’　−ＴＧＣＧｆｉＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＴＴＴ　 ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＣＡＡＣＧ。 ス１」軒Σ−ｐＨＥＮ１およびｆｄＣＡＴ２　してのバクーリオファージｆｄ上 での　オキサシロン　ＮＱ１０．１２．５　の−　ＦνおよびＦａｂ　の　六 ある範囲の構成物（参照、第２７図）を、マウス抗ｐｈｏｘ　（２−フェニル− ５−オキサシロン）抗体ＮＱ１０．１２．５（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ｇ、Ｍ、 　らＮａｔｕｒｅ３１２、２７１−２７５．１９８４）からの可溶性Ｆａｂ断片 （Ｂｅｔｔｅｒら１９８８前掲）の細菌中での発現のために設計したクローン（ 本質的にｐｔｌｃ１１９の中の構成体ＩＩ）から作った。構成物ＩＩにおいて、 Ｖ８Ｎ域はＮＱ１０．１２．５に由来し、そしてヒトＧＫおよびｃＨｌ（ｒアイ ソタイプ）定常ドメインに取り付けた０通常ライト抗体頓とヘビー抗体鎖との間 の共有連結を形成するＣ末端のシスティン残基を、両者の定常ドメインから除去 した。ファージの表示のためにヘビー鎖およびライト鎖の遺伝子を一緒にＦａｂ 断片（構成体Ｉ）としであるいは別々の１［（構成体ＩＩおよびｒｖ）としてク ローニングするために、構成体ＩＩがらＰｃｔ？によりＤＮＡを増幅して、Ｎｏ ｔＩ＠限部位を３末端に、そして５′末端にＡｐａＬ１部位（ｆｄ−ＣＡＴ２中 にクローニングするために）またはＳｆｉｌ部位（ｐＨＥＮｌ中にクローニング するために）を導入した。プライマーＰＡＢＮＯＴＦＯＫおよびＶＩＩＩＢＡＣ ＫＡＰＡ　（またはＶｌｌＩＲＡＩＪＳＦ１１５）を使用して、Ｆａｂ断片をコ ードする遺伝子（構成体Ｉｆ）のＰＣＲ増幅を行い、プライマーＰＡＢＮＯＴＦ ＯＩＩおよびＶＨＩＢＡＣＫＡＰＡ　（またはＶＩＩＩＢＡＣ：ＫＳＦ１１５） を使用して、ヘビーＨ（構成体ＩＩＩ）のＰＣＲ増幅を行い、そしてプライマー ＦＡＢＮＯＴＦＯＫおよびＭＶＫＢＡＡＰＡ　（またはＭＶＫＢＡＳＦＩ）を使 用シテ、ライトＭ（構成体Ｉｖ）のＰＣＩｌ増幅を行った。 ＮＱ１０．１２．５の一本値Ｆｖバージョン（構成体Ｉ）は、柔軟性リンカ−（ ＧｌｙａＳｅｒ）ｓ（）ｌｕｓｔｏｎ、Ｊ、Ｓ、らＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５５８７９−５８８３、１９８８）　ニより連結された ヘビーＩｔ（（ＶＨ）およびライトｖＡ（ｖｋ）ノ可変ドメインを有しており、 そして構成体ＩＩから「オーバーラツプ伸長によるスプライシング」により実施 例１４におけるようにして作製した。アセンブリングされた遺伝子をプライマー ＶＫ３Ｆ２ＮＯＴおよびＶＨＩＢＡＣＫＡＰＡ　（またはＶｌ（１１１１ＡＣＫ ＳＦ１１５）　テ再増幅し７ｆｄ−ＣＡＴ２（ＡｐａＬｌ−Ｎｏｔｌ）またはｐ ＨＥＮｌ（Ｓｆｉｌ−Ｎｏｔｌ）中にクローニングするための制限部位を付加し た。 ＶＨＩＢＡ（ＪＡＰＡ、５’　−ＣＡＴ　ＧＡＣＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ 　Ｇ丁（Ｃ／Ｇ）　（Ａ／Ｃ）Ａ（Ａ／Ｇ）ＣＴＧ　ＣＡＧ　（Ｃ／Ｇ）ＡＧ　 ＴＣ（Ａ／Ｔ）　ＧＧ；ＶＨＩＢＡＣＫＳＦ１１５，５’　−ＣＡＴ　ＧＣＣＡ ＴＧ　ＡＣＴ　ＣＧＣＧＧＣＣＣＡ　ＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣ（Ｃ／Ｇ）Ａ 　ＧＧＴ　（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｃ）Ａ　（Ａ／Ｇ）ＣＴ　ＧＣＡＧ（Ｃ／Ｇ）Ａ　 ＧＴＣ（Ａ／Ｔ）Ｇ［；。 ＦＡＢＮＯＴＦＯＨ，５’　−ＣＣＡ　ＣＧＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧ Ａ　ＡＧ＾ＴＴＴ　ＧＧＧ　ＣＴＣＡＡＣ丁ＴＴ　ＣＴＴ　ＧＴＣＧＡＣ；ＦＡ ＢＮＯ丁ＦＯＫ、５’　−ＣＣＡ　ＣＧＡ　ＴＴＣＴ［；ＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡ 　ＣＴＣＴＣＣＧＣＧ　ＧＴＴＧＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＴＧＴ　ＧＡＣ。 ＭＶＫＢＡＡＰＡ、５’　−ＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＴＣＧＡＣＡＴＴ　ＧＡ Ｇ　ＣＴＣＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴＣＣＡ。 ＭＶＫＢＡＳＦＩ、５’　−ＣＡＴ　ＧＡＣＣＡＣＧＣＧ　ＧＣＣＣＡＧ　ＣＣ Ｇ　ＧＣＣＡＴＧ　ＧＣＣＧＡＣＡＴＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴ 　ＣＣＡ。 ｖＫ３Ｆ２ＮＯｒ、５’　−ｔＴｃ　ｔＧｃ　ｔｓＧＣＣＧＣｃＣに　ＴＴＴ　 ＣＡＧ　Ｃｒｃ　ＧＡＧ　ＣＴＴ　ＧＧＴＣＣＣ。 制限部位には下線が引かれている。 １１ニノおよび）ｌ−ジミーロγ玉ΩΣ＆先五二構成体１〜ＩＶ（第２７図）を ｆｄ−ＣＡＴ２およびｐｉ！Ｅｌｉｌの両者に導入した。７　ｙ　＝　シｆｄ− ＣＡＴ２（オよびｆｄ−ＣＡＴ２−１．　ＩＩ、　ＩＩＩまたはｒｖ）を、１２ ．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む２ＸＴＹ培地で３７°Ｃにおいて一夜 震盪した後の感染した大腸菌ＴＧＩの上澄み液から取り、そしてＥＬＩＳＡにお いて直接使用した。大腸菌ＴＧＩ　（ｓｕＥ）の中のファージミドｐＨＥＮ１　 （およびｐＨＥＮｌ−Ｉおよび１１）を、２−１の２ＸＴＹ培地、１００μｇ／ ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコース（グルコースを含まないと、８３ｒ ｌの発現かへルバーファージによる後の重感染を防止する）の中で一夜増殖させ た。１０μｌの一夜培養物を使用して２１の２×ＴＶ培地、１００　μｇ／ｍｌ のアンピシリン、１％のグルコースに接種し、そして３７℃において１時間震盪 した。細胞を洗浄し、２ＸＴＹ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン中に再＠濁さ せ、そしてファージミド粒子を２　ｔ！　ｌ　（１０’ｐｆｕ）のｖＳＭ１３ヘ ルパーファージ（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｓｎｅ）の添加によりレスキューした。１ 時間増殖させた後、４μｍのカナマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、そして 培養物を一夜増殖させた。ファージミド粒子を、ＥＬＩＳＡのために、ポリエチ レングリコールを使用スる沈澱により１０倍濃縮した。 Ｌ１組 ２−フェニル−５−オキサシロン（ｐｈＯｘ）へ結合するファージの検出を実施 例９におけるように実施した。９６ウエルプレートをＰＢＳ中で１１）μｇ／ｓ ｌのｐｈＯｘＯＢＳＡまたは１０ｕｇ／ｍｌのＢＳＡにより室温において一夜コ ーティングし、そして２％のスキミミルク粉末を含有するＰＢＳＳでブロッキン グした。　５０μｍの４％スキミミルク粉末を含有するＰＢＳと混合したファー ジ（ミド）上澄み液（５０μｍ）をウェルに添加し、そしてアッセイした。　ｐ ［ＩＥＮｌから分泌される可溶性５ｃＦｖまたはＦａｂ断片の結合を検出するた めに、ＭｕｒａおよびＰｅ１ｈａｓ　１９８６前掲が記載するｃ−ｓｙｃペプチ ド標識を抗ｍｙｃモノクローナル９Ｅ１０（Ｅｖａｒ＋。 Ｇ、１．らＭｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、５３６１０−３６１６．１９８５）を 使用して検出し、次いでペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリンで検 出した。 他の詳細は実施例９における通りである。 ｆｄＣＡＴ２およびｐＦＩＥＮｌの中の構成体はフィラメント状ファージの表面 上で抗体断片を表示する。ファージベクターｆｄ−ＣＡＴ２（第８ｒｊ！Ｊ）は ベクターｆｄ−ｔｅｔ（Ｚａｃｈｅｒ＋　Ａ、Ｎ、　らＧｅｎｅ　９１２７−１ ４０．１９８０）に基づいており、そしてファージコートタンパク質ｇ３ｐのＮ 末端への融合体として発現するための抗体遺伝子をクローニングするか、あるい は（他のタンパク質の）遺伝子をクローニングするための制限部位を有する。　 ｆｄ−ＣＡＴ２における抗体−ｇ３ｐ融合体の転写は遺伝子ＩＩＩのプロモータ ーから誘導され、そして融合タンパク質はｇ３ｐ　リーダーによりベリブラスム に向けられる０表示のためにｆｄ−ＣＡＴ２の中にクローニングされたＮ０ＩＯ ，１２，５のＦａｂおよび５ｃＦｖ断片は、ｐｈＯｘ−ＢＳＡ結合する（がＢＳ Ａに結合しない）ことがＥＬＩＳＡにより示された（表５）。 試料のＡ４゜、がＥＬＩＳＡにおいてバックグラウンドのそれより少なくとも１ ０倍である場合、ファージは結合性であると考えた。 ファージミドベクターｐＢＥＮ１．（第２６図）はρＵＣ１１９に基づいており 、そして融合タンパク質をクローニングするための制限部位（Ｓｆ　ｆ　１およ びＮｏＬＩ）を含有する。ここで、抗１３ｐ融合体の転写は誘導可能なｌａＺプ ロモーターから誘導され、そしてこの融合タンパク質はｐｅｌＢリーダーにより ペリブラスムに向けられる。ファージミドはグルコースまたはＩＰＴＧを含有す る２ＸＴＹ培地の中でＶＳｌ’ｌ１３ヘルパーファージでレスキューされた：こ れらの条件下に抗ｇ３ｐの十分な発現が存在する０表示のために９１１ＥＮ１の 中にクローニングされた！１１１１１０．１２．５のＦａｂおよび５ｃＦｖ断片 は、ＥＬＩＳＡＣ表５）により上記と同一基準を使用して、ｐｈｏｘ−ＢＳＡ　 （ＢＳＡではない）に結合することが示された。 ファージ表面上に発現されるＦａｂ断片のライブラリーを調製する別の方法は次 の通りである： １、ファージゲノム中の挿入部からヘビー１　（ＶＨＣＨ）遺伝子を発現するフ ァージライブラリーを調製する。 ２、大腸菌中のプラスミドを発現するベクター、好ましくはファージミド中でラ イト鎖遺伝子のライブラリーを調製し、そしてこのライブラリーから発現された 可溶性タンパク質の分離する。 ３、このライブラリーからの可溶性タンパク質のライト鎖をファージ上で表示さ れたヘビー鎖のライブラリーに結合する。 ４、親和性および特異性の所望の性質をもつファージを選択する。 これらはヘビーＭ　（Ｖ）ＩＣ）Ｉ）遺伝子をコードするであろう。 ５、選択されたヘビー鎖と組み合わせて適当な抗原結合部位を形成するライト鎖 をコードするライト額遺伝子を分離し、ここで、好ましくは、ライト鎖を発現す るファージミドを含有する細菌重感染を、選択したヘビー鎖を発現するファージ （実施例２０に記載するように）とともに使用し、次いで抗原結合性について７ ノセイする。 引目孔−及二」Ｓ１社Ｎ」１函１１工２二け−１乙乙ランダム組み合わせのライ ブラリーでは、細菌細胞の形質転換の効率のために、表示されたＦａｂ断片の潜 在的多様性に制限が存在する。この問題を克服し、１０７のファクターで調査さ れるファージの数を潜在的に増加する方法（二重組み合わせのライブラリー）を ここに記載する。 異なるベクターから発現されたヘビー鎖およびライト鎖のアセンブリーのために 、７フージミド（ｐＨＥＮ１−　ＩＩ　Ｉまたはｍを大腸菌８Ｂ２１５１（非サ プレッサー菌株）中で増殖させて可溶性鎖の産生を可能とし、そして上記のよう にして（実施例２７）レスキューするが、ただしｇ３ｐに対する融合体として相 手の鎖を発現するヘルパーファージを使用しくそれぞれ、１０”ＴＵ　（７）ｆ ｄ−ＣＡＴ２４Ｖまたは■■Ｉ）ソシテカナマイシンの代わりに２μｌのテトラ サイクリンを使用した。 Ｆａｂのヘビー　および−イト　コード　るための　のベク　−Ｆａｂ断片のヘ ビーＩＩおよびライト鎖は同一ベクター（実施例２５）または異なるベクターに おいて一緒にコードされることができる。 これを実証するために、ヘビー鎖（構成体ＩＩＩ）をｐＨＥｌｊｌ中にクローニ ングして（可溶性断片を産生じ）そしてライト鎖（構成体ＩＶ）をｆｄ−ＣＡＴ ２中にクローニングして＜ｇ３ｐをもつ融合体をつくった）、大腸菌ＨＢ２１５ １　（非サプレッサー）中で増殖したファージミドｐＨＥＮ１−１１１はｆｄ− ＣＡＴ２−　ＩＶファージによりレスキューされ、そしてファージ（ミド）はｐ ｈＯχ：　ＢＳＡに結合するが、ＢＳＡに結合しないことが示された（表５）。 これは、ヘビー鎖またはライト饋は単独では抗原と結合しないので、可溶性鎖は ｇ３Ｐに定着したヘビー鎖と正しく会合することを示している（表５）。 同様な結果は逆の実験（ファージミドｐＨＥＮ〜１−ＩＶおよびｆｄ−ＣＡＴ２ −１１１を使用する）において得られ、ここでヘビー鎖は可溶性分子として産生 され、そしてライト鎖はｇ３ｐに定着する（表５）、それゆえＦａｂ断片はファ ージの表面上にライト鎖またはヘビー鎖のｇ３ρへの融合によりアセンブリング されるが、ただし他方の鎖は同一または他のベクターを使用して分泌される（第 ２８図）。 生ずるファージの集団はファージとレスキューされたファージミドとの混合物で ある。２つの型の粒子の比は、対数期の大腸菌ＴＧＩを感染させ、そして１５μ ｇ／ｓｌのテトラサイクリン（ｆｄ−ＣＡＴ２について選択するために）または １００　ｕ　ｇ／＊ｉのアンピシリン（ｐＨＥＮｌについて選択するために）を 有するＴＹＥプレート上にプレイティングすることによって評価した。ｆｄ−Ｃ ＡＴ２ファージの力価は５　Ｘｌ０ＩＩＴＵ／ｌｌｌであり、そしてｐＨＥＮｌ の力価は２　ＸＩＯ”ＴＵ／ｍｌであり、２５フアージ／フアージミドのパッケ ージング比を示す。 ファージの表面上のヘドロ２量体抗体Ｆａｂ断片の表示を包含する別の方法がこ こにおいて実証される。鎖の一方ばｇ３９に融合され、そして他方は可溶性の形 態で大腸菌のベリプラスミンク空間中に分泌され、ここでそれはｇ３ｐと非共有 結合的に会合し、そして抗原に特異的に結合する。ライト鎖またはヘビー鎖のい ずれもｇ３ｐに融合することができる：それらはＦａｂ断片としてファージ上に 表示され、そして抗原と結合する（第２８図）。表面の表示のためのファージお よびファージミドの両者のベクターを記載する。ファージミドは多分、大きいフ ァージ表示ライブラリーの発生についてファージヘクターよりすぐれる。とくに それらのより高いトランスフェクション効率（２〜３桁の大きさで高い）にかん がみて、より大きいライブラリーの作製を可能とする。ファージミドベクターｐ ＨＥＮ１はまた、非サプレッサー大腸菌中での可溶性Ｆａｂ断片の発現を可能と する。 また、同一ベクター（構成体ＩＩ）または異なるベクター（構成体ＩＩＩおよび ｍ　上にコードされたヘビー鎖およびライトＭはＦａｂ断片として表示され得る ことをここで実証する。これは表示のためにランダム組み合わせライブラリーを つくる２つの別々の方法を提供する。　ＰＣ［ｌにより増幅されたヘビー鎖およ びライト鎖の遺伝子のライブラリーは、「オーバーラツプ伸長によるスプライシ ング」に基づ＜　ｒＰＣＲアセンブリー」法（実施例１４）によりランダムに連 鎖され、ファージ（ミド）表示ベクター中にクローニングされ、そして上記のよ うに同一のプロモーターから同一の転写体（Ｉ成体ＩＩ）の一部分として発現さ れるか、あるいは実際に異なるプロモーターから別々の転写体として発現される ことができる。ここでファージ（ミド）ベクターは両者の鎖をコードしそして表 示する。１０７のヘビー饋および１０？のライト鎖の組み合わせライブラリーに ついて、表示されたＦａｂ断片（１０”）の潜在的多様性はベクターによる細菌 細胞のトランスフェクション効率により１１７１１１される（！も良くて約１０ ９クローン／μｇの切断されそして連結されたプラスミド）　（Ｗ、Ｊ、Ｄｏｗ ｅｒらＮｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６６１２７−６１４５．１９８８）、 こうして調製されたライブラリーは、［Ｉｕｓｅ＋　Ｗ、Ｄ、ら５ｃｉｅｎｃｅ 　２４６１２７５−１２８１（１９８９）に記載されているランダム組み合わせ ライブラリー法に類似するが、ファージ表面上の表示が多数の発生したクローン から抗体特異性を選択する強力な方法を与えるという重要な追加のｖＦ徴を有す る。 あるいは、ヘビー額およびライト鎖のライブラリーを同一細胞における発現のた めに異なるベクター中に、ｇ３１）融合体をコードするファージのベクターおよ び可溶性鎖をコードするファージミドを使用して、クローニングすることができ る。ファージはヘルパーとして作用し、そして感染したａｉｍはパッケージング したファージおよびファージミドの両者を産生した。各ファージまたはファージ ミドは両者の鎖を表示するが、一方の鎖のみをコードし、こうして抗原結合部位 の半分についての遺伝情報のみをコードする。しかしながら、両者の抗体饋の遺 伝子は選択的培地上にプレイティングすることによって回収することができ、抗 原と結合するヘビー鎖およびライ）Ｉの組み合わせの相互に相補的な対をランダ ム組み合わせライブラリーから選択することができる手段を示唆する０例えば、 ｆｄフプージ上のライト饋のレパートリ−を使用して、ファージミド上に可溶性 ヘビー鎖のライブラリーを収容する細胞を感染させることができる０次いで、ア フィニティー精製したファージミドのライブラリーを使用して大腸菌を感染させ 、アフィニティー精製したファージライブラリーをレスキューし、そして新しい 組み合わせライブラリーを更なる選択のラウンドにかけることができる。こうし て、抗体のヘビー鎖およびライ）［の遺伝子は精製の各ラウンド後に再び無差別 にまぜられる。最後に、いくつかのラウンド後、感染した細菌をプレイティング し、そして抗原結合性ファージについて個々にスクリーニングすることができる 。このような「二重」組み合わせライブラリーは単一のベクター上にコードされ るものより潜在的にいっそう多様性である。１０１の→イトのファージ（ミド） の別々のライブラリーを組み合わせることによって、表示されたＦａｂ断片（潜 在的に１０”）の多様性は細菌の数（１０′！／リツトル）によってのみ制限さ れる。より蘭学には、２つのベクターの使用はまた、ｒｉ層Ｊライブラリーの構 成を促進し、ここで固定されたヘビー鎖またはライｌ−鎖をライブラリーまたは 相手と対にされ（実施例２２）、抗体の親和性および特異性を［＠細に同調する ４手段が提供される。 ２７　）　−ジミド８２Ｎ１　る口′５ＣＦｖおよびＦａｂ片！Ｉ（１ ファージの表面上に発現された抗体の更なる研究は、それが溶液中の発現に簡単 に切り替えられる場合、大きく促進されるであろう。 大腸菌１１８２１５１をｐＨＥＮファージミド（ｐＨＥＮｌ−１またはＩＩ）で 感染させ、そしてＹＴＥ　、　１００μｇ／醜ｌのアンピシリンのプレート上に プレイティングした。コロニーを３７℃において２ｘｒｙ培地、１００μｇ／５ ｌ（７）アンピシリン、１％のグルコース中で０Ｄｓｓａ　＝０．５〜１．０に 震優した。細胞を沈澱させ、２ＸＴＹ培地中で１回洗浄し、１００μｇ／■ｌの アンピシリン、１鵬Ｈイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含 有する培地の中に再懸濁させ、そしてさらに１６時間増殖させた。 細胞を沈澱させた。そして上澄み液は分泌された鎖を含有し、これを直接ＥＬＩ Ｓ＾において使用した。 ファージミドｐＨＥＮ１はファージｆｄ−ＣＡＴ２を越えた利点を有する。 すなわち、抗体はファージの表示のために（大腸菌の５ｕｒＥＥｉｉ株中の増殖 により）あるいは標識された可溶性断片として（非サブレ・フサ−菌株中で増殖 により）、ペプチド標識として（実施例２４）産生ずることができ、そしてアン バーコドンを抗体とｇ３ｐとの間に導入された。ｐＨＥＮｌ−ＩＩからの可溶性 Ｆａｂ断片またはｐｉ（ＥＮＩ−１からの５ｃＦｖ断片の分泌は、大腸菌ｆｌＢ ２１５１中の増殖およびＩＰＴＧによる誘発後にウェスタンプロットを使用して 実証された（第２９図）６分泌されたタンパク質の検出のために、誘発された培 養物の１０μｍの上澄み液を５Ｏ５−ＰＡＧＥにかけ、そしてタンパク質をイモ ピロン（ＩｍｍｏｌｉｂｉｌｏｎＬＰ（Ｍｉｌｌｉｏｐｒｅ）へのエレクトロブ ロッティングにより転移した。可溶性のヘビー鎖およびライト鎖をヤギポリクロ ーナル抗ヒトＦａｂ抗血清（Ｓｉｇｍａ）およびペルオキシダーゼ結合ウサギ抗 ヤギ免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ）で検出し、各々は１１０００の希釈であった 。ｔｌｍしたＶＫドメインを９Ｆ、１０抗体（１二１０００）およびペルオキシ ダーゼ結合ヤギ抗免疫グロブリン（Ｐｃ特異性）（１：　１１０００）（Ｓｉ層 ａ）またはペルオキシダーゼ標識抗ヒトＧＫ抗血清（口ａｋｏ）で検出した。３ ．３’　−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｓｉｇｍａ）をペルオキシダーゼの基 質として使用した（Ｈａｒｒｏｗ　ｒ！、ら１９８８前掲）　、　５ｅＦｖでは 、断片を９Ｅ１０抗ｍｙｃ　８１識抗体で検出した（データは示されていない） 。Ｆａｂでは、ライト鎖のみが９Ｅ１０　（または抗ヒトＣＫ）抗体で検出され たが、期待するように、抗ヒトＦａｂ抗血清はヘビー饋およびライト鎖の両者を 検出したｅ　１）ｈＯｘ−ＢＳＡ（ＬかしＢＳＡではない）への可溶性５ｅＦｖ およびＦａｂ断片の結合はまた、ＢＬＩＳＡにより実証された（表５Ｂ）、こう して、５ｃＦｖおよびＦａｂ断片はファージ上に表示するか、あるいは同一ファ ージミドベクターから可溶性断片として分泌させることができる。 ■ 原理的には、ファー・ン抗体の使用は可溶性抗体を使用するより感受の高いイム ノアッセイの実施を可能とするであろう、ファージの抗体は、特異的抗原と結合 する能力と、各ヴイリオン上の主要コートタンパク質（ｇ８ｐ）の多数の（約２ ８００）コピーの存在下の増幅の可能性とを兼備する。これは、ｈ１３に対して 向けられた抗体分子を各ヴイリオンへの取り付けを可能とし、そして引き続くペ ルオキシダーゼ結合抗一種（ｓｐｅｃｉｅｓ）抗体（下の場合において抗ヒツジ ＩｇＧ）のいくつかの分子の取り付けを可能とする。こうして、抗原に結合した すべてのファージ抗体について、いくつかのペルオキシダーゼ分子を取り付ける 可能性が存在するが、可溶性抗体を一次抗体として使用するとき、この増幅は起 こらないであろう。 ＥＬＩＳＡのプレートを、室温において、５０ｍＭ　Ｎａ）ＩＣＯｓ（ｐＨ９， ６）中ニワトリ卵リゾチーム（１０００，１００，１０，０，１および０．０１ μｓ／ｍｌ）の１０倍希釈物２００　μｍを使用して一夜コーティングした。　 ＥＬＩＳＡは実施例４に記載するように実施したが、ただしくｉ）抗リゾチーム 抗体とのインキュベーシヨンはＦＤＴｓｃＦｖＤｌ、３（ｐＡｂ；１０”ファー ジ／ウェル；１．６モル）または可溶性のアフィニティー精製した５ｃＦｖＤ１ ．３　（１８μｇ／ウェル；０．７ｎモル）を用い、（ｉｆ）第２抗体とのイン キュベーシヨンはＦＤＴｓｃＦｖＤｌ、３の試料についてヒツジ抗Ｍ１３血清の １／１００希釈物または可溶性５ｃＦｖＤ１．３の試料についてラビット抗５ｃ ＦｖＤ１．３血清（Ｓ、Ｗａｒｄから）の１　／１００希釈物を用いて実施し、 （ｉｉｉ）ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ　； 　１１５０００）をＦＤＴｓｃＦｖＤｌ、３の試料について使用し、そしてペル オキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ　；　１１５０００ ）を可溶性５ｃＦｖＤ１．３の試料について使用した。　４０５ｎ−における吸 収を１５時間後に測定した。結果を第３０図および第３１図に示す、これらの図 面において、コーティングのためのりゾチームのｌ１ｉｉ物を１μｇ、／ａｌに 関して対数目盛りで示す、（すなわち、ｌｏｇ　＝−３−１ｍｇ／ｍｌ；ｔａｇ 　＝２＝０．ＯＬμ　ｓ　／ｍｌ　） ＦＤＴｓｃＦｖＤｌ、３ではリゾチームのすべての濃度においてより高いシグナ ルが得られる（第３１図）が、抗原の量は最も限定的である最大の希釈において 差が非常に顕著である（第３０図および第３１図）、これが示唆するように、フ ァージ抗体はサンドインチ型アッセイについてとくに価値があることがあり、こ の場合、異なるエピトープに対して向けられたファージ抗体を第２抗原結合抗体 として使用するとき一次抗体による少量の抗原の捕捉が増幅されたシグナルを発 生する。 ２９　バク″「オフ　−ジｆｄの　上での−Ｆａｂ　としてのマウスモノクロ− ル　の　のレスキューおよ一版見曵 この原理は実施例１４に記載するものに非常に類似する。それはマウスモノクロ ーナルから調製したｃＤＮＡからの一本鎖抗体のＰＣＲアセンブリーから成る。 １例として、ステロイド系ホルホンのエストリオールに対して向けられた抗体を 発現するモノクローナルからの２つのこのような抗体のレスキューおよび発現を 記載する。 Ａ、ハＬ夏斑１ ＲＮＡは当業者によく知られている多数の手順を使用して調製することができる 。この実施例において、トリトンＸ−１００による溶菌、フェノール／ＳＤＳに よるｌ？Ｎアーゼの不活性化はきわめてすぐれた結果を与えた。 １、ここで使用したマウスモノクローナル細胞を遠心により収穫し、そして血清 不合培地中に再懸濁した０次いでそれらを遠心し、生理的塩類溶液の中に再懸濁 し、最終の遠心工程の後、無菌水中にｌＸｌ０’細胞／＋ｗｌで再懸濁させた。 （通常、細胞をＰＢＳ　ｗｉ衝液液中洗浄し、そして最後にＰＢＳ　ＩＩ衝液液 中再懸濁させるが、これらの特定の細胞は記載したように水中の凍結物として本 発明者らに供給された）。 ２．７５０μｌの細胞に、２５０μｌの氷冷４×溶菌緩衝液（４０ｍＭＴｒｉｓ −ＨＣＩ　（ｐ）１７．４）　／　４　ｍＭ　ＭｇＣＩｇ／６００ｍＭ　ＮａＣ ｌ　／４０ａ＋Ｍ　ＶＲＣ（ヴエロニルリボシル複合体）７２％のトリトンＸ− １００）を添加した。この懸濁液をよく混合し、そして氷上に５分間放置した。 ３、遠心を、４°Ｃにおいてマイクロヒュージ中で４°Ｃ，１３０００ｒｐｎ＋ において５分間実施した０次いで、上澄み液を、材料および方法の欄に記載する ように、フェノールで３回抽出し、フェノール／クロロホルムで抽出し、そして ＃ｕｋにエタノール沈澱させた。沈澱を５０μｌの水中に再懸濁させた。 ４．１■ｌの水中の２．５μｌの試料を使用して２６０ｎａにおいてＲＮＡの光 学密度を測定した。ＲＮＡを、１％のアガロースゲルの電気泳動により２μｇの 試料についてチェックした。３２μｇ／４０μｇの範囲のＲＮＡがこの方法によ り得られた。 Ｂ−並■至講ｌ 使用した方法は実施例１４に記載する方法を同一である。２つのｃＤＮＡ調製物 を作った。これらは細胞系０１３および０１４として知られているモノクローナ ルから抽出したＲＮＡからのものであり、これらの細胞系の両者はステロイド系 ホルモンのエストリオールに対する抗体を発現する。 Ｃ・二丞ヱ岨 使用した方法は実施例１４に記載する方法と本質的に同一である。 ＶＨ領領域プライマーＶＨＩＢＡＣＫおよびＶｌｉｌＦＯＩ？−１により増幅し た。■カッパ領域について、４つの別々の反応を実施し、このときプライマーＶ Ｋ２ＢＡＣＫ　とＭＪＫＩＦＯＮＸ、　ＭＪＫ２ＦＯＮＸ、　ＭＪＫ４ＦＯＮＸ またはＭＪＫ５ＦＯＮＫ　（７）　イずれかとを使用した。試料（５μＩ）を１ ．５％のアガロースゲル上でチェックした。これから、２個のエストリオールモ ノクローナルから調製したｃＤＮＡについて、プライマーＶＫ２ＢＡＣ！［およ び旧にＩＦＯＮＸが■カッパ領域の最良の増幅を与えることが観察された。　Ｖ Ｋ２ＢＡＣＫ　／ＭＪＫＩＦＯＮ！で増幅したＶカッパのバンドを各モノクロー ナルについて２％の低融点のアガロースゲル上で精製した。　ＤＮＡのバンドを ゲルから切除し、そして実施例１４に記載するように献呈されたシーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）キットを使用して精製した。 Ｄ−ユヱ左二■貞ｌ 使用した方法は実施例１４に記載する方法と本質的に同一である。 この場合において、増幅したリンカ−ＤＮＡを２％のアガロースゲルで精製し、 そして献呈された「マーメイド（Ｍｅｒ■ａｉｄ）　Ｊキット（ＢＩＯｌｏｌ、 　Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、米国カリフォルニア州すンディエゴ、ラジョラ）を使用 して製造業者の指示に従いゲルから回収した。 Ｅ、アセンブリーＰｃｔ？ 使用した方法は実施例１４に記載する方法と本質的に同一である。 この場合において、アセンブリングしたＰＣＲ産生物を２％のアガロースゲルで 精製し、そして献呈された「マーメイド（Ｍｅ＋ｖａｊｄ）　Ｊキットゲルから 回収した。 Ｆ、１ｌＩＩＬ部コーの・　および　上げアセンブリングした産生物をＡｐａＬ ＩおよびＮｏｔｌ制限部位で「標識（ｔａｇ）　Ｊ　シた。次いでＤＮＡをＡｐ ａＬＩおよびＮｏｔＪで消化して、クローニングに適当な粘着末端を与え、次い で２％の低融点のアガロースゲルで精製し、そしてシーンクリーンキットを使用 して抽出した。 使用した方法は実施例１４に記載されている方法と同一である。 Ｇ、ベクターｆｄ−ＣＡＴ２の　へのクローニング合計１５μｇのＣｓＣ１精製 したｆｄ−ＣＡＴ２のＤＮＡを、ＩＸＮＥＢアセチル化ＢＳＡを含有する合計の 体積２００μｌのＩＸＮＥＢのＮｏｔｌｌｌ衝液の中で１００単位の制限酵素Ｎ ｏｔｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により合計３＃間、３７° Ｃにおいて消化した。ベクターのＤＮＡを１５μｌのストラタクリ−（Ｓｔｒａ ｔａｃｌｅａｎ）　（タンパク質を除去するための商業的に入手可能な樹脂）で 製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　、米国カリフォルニア州うジョラ、ノースト レイパインズロード１１０９９）の指示に従い２回処理した。次いでＤＮＡをエ タノール沈澱させ、そしてＴＥ緩衝液（Ｓａ■ｂｒｏｏｋら１９８９前掲）中に 再溶解した０次いで、ＤＮＡを合計体積２００μｌのＩＸＮＥＢ緩衝液中で１０ ０単位の制限酵素ＡｐａＬＩ（ＮｅＨＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）によっ て−夜３７℃において消化した０次いでベクターをクロマ・スピン（Ｃｈｒｏｍ ａ　５ｐｉｎ）１０００カラムで製造業者（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、米国カリフォルニア州バロアルト、ファビアウェイ４０ ３０）の指示に従い精製した。この工程はＡｐａＬＩ　／Ｎｏｔｌ断片を除去し て、最大の結合効率のために切断されたベクターＤＮＡをもたらす。 連結反応は合計体１ＩＩｌｌ）ｕＪのｌ×ＮＥＢリガーゼ菱衝液および１ｕｌの １１Ｅ８　リガーゼ（Ｎｅｗ　［！ｎｇｌａｎｄ　Ｂｔｏｌａｂｓ）中で２−５ 〜ＬｏｎｇのＤＮＡ挿入部およびＬｏｎｇのベクターを使用して１６℃において 一夜（はぼ１６時間）実施した。 Ｈ１彫ｌ耘且圭孟互１１ 大腸菌株ＴＧＩをコンピテントにし、そしてＳａｗｉｂｒｏｏｋら１９８９前掲 に記載されているようにｆｄＣＡＴ２組み換えＤＮＡで形質転換した。細胞をＬ Ｂ　ｔｅ　ｔプレート（１０ｇのトルブトン、５ｇの酵母エキス、１０ｇのＮａ Ｃ１，１５ｇのバクトーアガ／１、プレートを注ぐ直前に１５Ｈｚｇ／μｍのテ トラサイクリンを添加した）上にプレイティングし、そして−夜増殖させた。 次いで、単一のウェルから分離されたコロニーを５０−１の管中の１０−１のＬ Ｂｔｅｔブロス（１５ｇｇ／μｌのテトラサイクリンを含むＬＢ培地）の中に接 種した。ベンチトップ型遠心機の中で３５℃／３５０ｒｐ−において一夜増殖さ せた後、上澄み液を１５ｍ１の遠心機管に移し、そして２１１１の２０％のＰＥ Ｇ３０００　／２．５　ＭのＮａＣ１を各々に添加した。室温において２０〜３ ０分間インキュベーションした後、組み換えファージをソーヴアル（Ｓｏｒｖａ ｌ）５Ｍ２４０−ターで９０００ｒｐｍにおいて３０分間遠心して沈澱させた。 　ＰＥＧの上澄み液を廃棄した。短時間（２分）の遠心工程後、残留するＰＥＧ をパスツールピペットで除去した。この最後の工程を反復してＰＥＧが残留しな いようにした０次いでファージの沈澱物を５００μｍのＰＢＳ緩衝液の中に再懸 濁させた。これをマイクロ遠心機の管に移し、そして１３０００ｒｐ−で回転し て残留する細胞を除去した、ファージの上澄み液を新鮮な管に移した。 １．舊迷■１１輩二公工二ヱｌ皇ヱ バクテリオファージｆｄ組み換え体を、エストリオールに対する抗体の発現につ いてＥＬＩＳ＾によりスクリーニングした。この方法は実施例６に記載されてい る。この場合において、次の別法が関係する。 １、マイクロタイタープレートを４ＱＪｇ／ａｔのエストリオール−６カルオキ シメチルオキシムーＢＳＡ（Ｓｔｅｒａｌｏｄｓ、　３１Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ　 Ｒｏａｄ。 Ｃｒｏｙｄｏｎ、　ＣＲＯ５ＱＪ、英国）で−夜コーティングした。 ２．１次抗体は推定上のファージ抗エストリオール抗体であった。 ０．２５％のゼラチンを含む２００μｍの無菌ＰＨ３中の５０＃ｌのファージを 各ウェルに添加した。 ３．２次抗体は１：１０００希釈のヒツジ抗層１３であった。 ４．３次抗体はペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリンであった。 発色性基質２’、２’−アキジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸 ）と共にインキュベーションすることによって、機能的抗体を発現する組み換え 体を検出した。結果を第３２図および第３３図に示す。 １１ｉ１Ｌ　バクテリオファージｆｄの　に　れたアルカリ渉ｌ」−一りニガの 　・　１Ａ・ この実施例は、ファージ上に発現された酵素の反応速度論的性質が、溶液の中の それらに量的に類似することを証明する。位置１６６に天然アルギニン（実施例 ３１参照）または変異残基アラニン（実施例１１参照）をもつ遺伝子３のアルカ リ性ホスファターゼ融合体を、材料および方法に記載されているように、ＰＥＧ 沈澱により調製した。 ｆｄファージの表面上に発現されたアルカリ性ホスファターゼの反応速度論のパ ラメーターを、基質として４−ニトロフェニルホスフェートを使用してＩ　Ｍ　 Ｔｒｉｓ　／ＨＣＩ（ｐＨ８，０）中で研究した。 反応は１００　ａ　１のファージ−アルカリ性ホスファターゼの融合調製物、も との培養上澄み液に関して５０倍の濃縮物を添加することによって開始した。吸 収の変化速度を４１ｏｎ−でフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）８７３０分光光度 計を使用してモニターし、そして初期の反応速度を１６２００　リットル１モル ／Ｃ■のモル吸収を使用して計算した。 ｆｄｐｂｏＡｒｇ１６６についてではなく、ｆｄｐ）１０＾１ａ１６６酵素につ いて、ｌａｇファージはこの添加後に見られ、反応速度は定常状態がほぼ６０〜 ９０秒後に得られるまで加速した。この定常状態速度を反応速度論的パラメータ ーの決定に使用した。ミカエリス・メンテン（ＭｉｃｈａｅｌｉｓＭｅｎｔｅｎ ）反応速度論からの偏りはいずれのファージ酵素についても明らかではなかった 　Ｋ　、およびｋ　ｃａｔをＳに対するｓ　／　ｖのプロットから誘導し、そし て表６に示す。 ファージ粒子の数、ファージ上に形成される活性酵素の数の間の関係を確立する ことが困難であるので、ｋ　ｃａｔ値は絶対値ではな（，２つの酵素の形態の間 の相対値として表される。この実験において使用したファージ酵素調製物のウェ スタンプロット（実施例３１におけるように抗ｇ、３ｐ抗血清を使用して実施し た）は、遺伝子３に対して向けられた抗体を使用して検出したとき、Ａｒｇ１６ ６およびＡＩａ１６６酵素との全長の融合体のバンドについて、はぼ等しい強度 を示した。 これらの調製物において、完全な融合体は検出された物質のほぼ３０％を代表す る。したがって、２つの調製物は同一濃度の完全な融合体を発現すると思われた 。 表６は、この実験から得られた反応速度論的データを要約し、そして野生型およ び変異型酵素の形態の可溶性調製物を使用して得られた、Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌ ｏｕ＋　Ａ、ら（Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒｙ　２７．８３３８−８３４３（１９ ８８））からのデータとそれを比較する。同一の基質およびアッセイの条件を両 者の実験において使用した。可溶性アルカリ性ホスファターゼもまた、われわれ の実験において平行に試験した（Ｋ、＝８．５μモル；ｋｃｍ−３４８０モルの 基質変換モル酵素−１分−１）。 位置１６６におけるアルギニンをアラニンに変異させる効果は可溶性酵素のよう にファージ酵素について量的に類似する　Ｋ　、は約１５倍増加し、そして相対 的ｋ　ｃａｔは野性型のそれの３６％に低下する。 これはＡｒｇ１６６の突然変異のときのファージ酵素における基質の親和性の減 少を反映するであろう、これは、同一の反応速度論のメカニズムが適用されると 仮定して、可溶性酵素（Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｏｕら、１９８８前掲）と反対で ある。しかしながら、ファージ酵素のに、の挙動において多少の定量的差が存在 する。　ｆｄｐｂｏＡｒｇ１６６について観察された７３μモルのに、は遊離酵 素についての１２．７μモルのに、に匹敵する；ｆｄｐｈｏＡＩａ１６６につい てのに、は１０７０μモルであるが、遊離の変異酵素は１６２０μモルのに、を 有する。可溶性酵素と比較して、ｆｄｐｈｏＡｒｇ１６６についての高いに、お よびｆｄｐｈｏＡＩａ１６６についての低いにヨは、ｒ定着した」アルカリ性ホ スファターゼが遊離の溶液の中の酵素と異なる方法で相互作用して２量体を形成 することによると考えることができる。 しかしながら、Ａｒｇ１６６およびＡＩａ１６６の形態についてのｋ　ｃａｔの 相対値は、ファージ酵素および可溶性酵素の両者について非常に類似し、天然酵 素についての値の３５〜４０％への変異後の減少が起こる。 可溶性ｐｈｏＡｒｇ１６６についてのｋ　ｃａｔを決定する律速段階は、酵素か らの非共有結合したホスフェートの解離であると考えられる（Ｈｕｌｌ−０Ｓ、 らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１５＋　１５４７−１５６１＋　１６７６）　、 　Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｏｕら、１９８８前掲が示唆するように、可溶性酵素に ついて、Ａｒｇ１６６のＡｌａへの変異は追加の段階を変更し、それらの１つの ホスホ酵素中間体の加水分解であろう、ファージ酵素についての＾ｒｇ１６６の Ａｌａへの変異の際のｋｃｍの減少の類似性が示唆するように、同一段階を、突 然変異の可溶性酵素と同様な方法で、突然変異のファージ酵素において定量的に 変更することができる。 こうして、ファージとに表示された酵素は可溶性酵素と定量的に同様な特性を示 す。 ｉ叉藍 構成体ｆｄｐｈｏＡ１ａ１６６（実施例１１において誘導された）を、下記プリ ンターを使用する試験管内変異誘発（Ａｍｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ ｎａｌ）により、位置１６６において野生型残Ｓ（アラニン）に変換して戻した 。 ＡＰＡＲＧ１６６　：　５　’　ＴＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＣＧＡＧＧＴＣＡＣＡ ３’野生型挿入部をもつこの構成体をｆｄｐｈｏＡｒｇ１６６と呼ぶ、　ｆｄ− ｐｈｏＡＩａ１６６゜ｆｄｐｈｏＡｒｇ１６６またはｆｄ−ＣＡＴ２を含有する 大腸菌ＴＧＩまたはに５２７２の細胞（内因性戸旦遺伝子の中に欠失をもつ細胞 、５ｔｒａｕｃｈおよびＢｅｃｋｉｔｈ、　１９８８前掲）を、ＩＥＨｚｇ／ａ ＋１のテトラサイクリンを含有する２ＸＴＹの中で３７℃において１６時間増殖 させた。濃縮したファージを次のようにして調製した。ファージ−酵素培養物を 遠心により清浄にした（１５分、１０，０００ｒｐｍ　、８　Ｘ５０ｍ１のロー ター、５ｏｒｖａｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心機）、１１５体積の２０％のポリエチレン グリコール、２．５ＭＮａＣ１を添加し、４℃において１時間放置（７、そして 遠心する（上のようにして）ことによって沈澱させた。ファージの沈澱物を１０ ａ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）中にもとの体積の１　／１００に再懸 濁させ、そして残留する細菌および凝集したファージをベンチ型マイクロ遠心機 で１３００Ｏｒｐｍ、　４℃において１０〜１５分間遠心することによって除去 した。 ＳＤＳ　／ポリアクリルアミドゲルの電気泳動およびウェスタンブロッティング は基本的には従来記載された通りであった（実施例２）。 １６μｌのファージの５０倍の濃縮物から成る変性した試料を１０％のＳＤＳ／ ポリアクリルアミドゲルを使用して分離し、そして大腸菌アルカリ性ホスファタ ーゼに対して（Ｎｏｒｔｈｕｓｂｒｆａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　５ｏｕｔ ｈＮｅｌｓｏｎ　Ｉｎｄｕｓｒｉａｌ　Ｅｓｔａｔｅ、　Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏ ｎ＋　Ｎｏｒｔｈｕｓｂｅｒｌａｎｄ＋　Ｎｌ！２３９肛）または遺伝子３によ りコードされる少量のコートタンパク質（１，Ｒａ５ｃｈｅｄ教授から、ｌ１ｎ ｉｖｅｒｓｉｔａｔ　Ｋｏｎｓｔａｎｚ、参照、Ｓｔｅｎｇｅｌｅら、１９９０ ）に対してレイズされたポリクローナル抗血清を１　：　１０００の希釈で使用 して検出した０次いで、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（Ｓ ｔｇｗａ、ｉ　：　５０００）と共にインキュベーションし、そしてＥＣＬウェ スタンプ０７テイング系（Ａｍｅｒｓｂａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で 検出した。 融合タンパク質の存在は、ｆｄ−ｐｈｏＡ１ａ１６６（ファージ−酵素）または ｆｄ−ＣＡＴ２（ベクターファージ）から誘導されたファージ粒子からのタンパ ク質のウェスタンブロッティングにより確認された。遺伝子３タンパク質に対し てノイズされた抗血清を使用する検出は、ベクターファージの中の６３．０００ の見掛けの分子量（Ｍｒ）の産生物を示す。 これはアミノ酸配列に基づく予測された分子量（４２，０００）と異なるが、遺 伝子３の天然産生物は電気泳動の間に移動度の減少を示すことが報告されている （Ｓｔｅｎｇｅｌｅ　ら、１９９０）　。 ｆｄ−ｐｈｏＡ１６６の試料において、最大のバンドは１１５，０００の見掛け のＭｒを有する（第３４図）、融合体の遺伝子３部分の異常な移動度を考慮する と、これは４７ｋＤのアルカリ性ホスファターゼのドメインとの融合から期待さ れる大きさに近似する。この分析はまた、このファージ−酵素の調製物中の遺伝 子３反応性物質のある比率は天然遺伝子３産生物の大きさで存在することを示し 、分離が起こることを示唆する。第３５図に示す調製において、遺伝子３融合体 のほぼ５〜１０％は完全である。より最近の調製物においておよびこの実施例お よび実施例３２において使用したすべての調製物において、融合体のほぼ３０〜 ６０％は全長である。 Ｍｒｌ１５．０００のタンパク質は、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼに対し てレイズされた抗血清（抗−ＲＡＰ）でブロービングしたとき、ＴＧＩ細胞から 誘導されたファージ−酵素のウェスタンプロットにおいて観察される主要なタン パク質であり、このバンドが完全な融合体に帰属されることが確認される。さら に、ファージ酵素を、内因件部遺伝子中に欠失をもつ（ＳｔｒａｕｃｈおよびＢ ｅｃｋｗｉｔｂ、　１９８８、前掲）ＫＳ２７２細胞を使用して調製するとき、 それはまた主要なバンドである。抗ＢＡＰ抗血清と反応性のＭｒ９．５００およ び６０．０００における追加のバンドが存在し、これらは融合産生物の分離を示 すものであろう。 抗ＢＡＰ抗血清はまた、色素前面と共に泳動する物質およびＭｒ４５．０００の 分子と反応するが、証拠が示唆するところによればこの物質がアルカリ性ホスフ ァターゼではない、このパターンはＰ肛沈澱したベクターのファージの試料（第 ３４図Ｃ）において検出され、したがって、クローニングされたｐｈｏＡ遺伝子 から発現されたタンパク質により寄与されない、これらのバンドはｆｄ−ＣＡＴ ２を有する細胞の培養上澄み液において検出されるが、非感染の細胞の上澄み液 において検出されず（示されていない）、それゆえファージがコー＝ドする物質 と、あるいは感染した細胞から漏れるＰＥＧ沈澱可能な細胞成分と交差反応性を 表す（Ｂｏｅｋｅら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１８６．１８５−１９２． １９８２）。Ｍｒ４５．０００の断片は遊離のアルカリ性ホスファターゼの大き さく４７，０００）に近いが、それはｐｈｏＡ遺伝子座に欠失を有するＫＳ２７ ２細胞からのファージ調製物の中に存在する。さらに、その移動度は精製された アルカリ性ホスファターゼと異なり、そしてそれらは電気泳動により区別するこ とができる（第３４図ｄ）。 融合タンパク質は、ファージ粒子に結合した酵素について予想されるように、そ れがより大きい構造体の一部分であるように挙動することが、限外濾過を使用し てｆ１認される。ファージ試料（５０倍のｉｌ！縮物１００μｍ）を、最小分子 量限界が３００００ダルトンである限外濾過フィルター（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ− ＭＣフィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、ＭＳＥ　フイクロセンタウアーマイ クロヒ」、−ジで１３，０００ｒｐ勇で１５分間遠心することによって通過させ た。保持された物質を１００μｍの１０ｗＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０）中に再懸 濁させることによって回収した。 ファージ−酵素または遊離のアルカリ性ホスファターゼ（８３ｎｇ）をベクター のファージと混合し、３００，０００ダルトンの公称分子量限界をもつフィルタ ー（［１ｔ、ｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルター、Ｍ　ｉ　Ｉ　１１ｐｏｒｅ）に通 過させた。第３５図Ａは再び、Ｍｒ、　１１５．０００のバンドが抗ＢＡＰ抗血 清と反応性の主要な産生物であることを示す、この産生物および抗ＨＡＰと反応 性の他の産生物は、限列瀘過膜により保持される物質の中に存在する。　ＫＳ２ ７２から誘導されたファージ調製物の保持された分画および流通した分画は、異 なる分子量の種が限外濾過膜により分割されることを示す、第３５図すが示すよ うに、Ｍｒ、１１５，０００のタンパク質はフィルターにより保持されるが、Ｋ Ｓ２１２から誘導されたファージ調製物の中に見いだされるＭｒ、９５，０００ 〜６０．０００の推定上の分解産生物は保持されない。 アルカリ性ホスファターゼおよびベクターのファージの混合物（第３５図ｃ　− ｆ　）において、遊離のアルカリ性ホスファターゼ（９４、０００ダルトンの２ 量体の大きさ）が流通物中に、変性ポリアクリルアミドゲル上でＭｒ、４７．０ ０００をもつバンドとして検出される（第３５図Ｂ）が、ベクターファージの調 製物の中に見いだされる交差反応性分子（Ｍｒ、４５，０００）はフィルター上 に保持される（第３５図）、これは、交差反応性分子がファージ粒子の一部分で あることを示唆し、そして限外濾過膜が分割を行うという事実を強調する。こう して、二のファージ−酵素における期待される融合体のバンドは、限外濾通膜上 に保持される物質中に存在し、ウィルス結合酵素に・ついて期待されるように、 それがより大きい構造体の一部分であることを証明する。 触媒活性はアルカリ性ホスファターゼ発現するファージ粒子上に証明されている 。表７が示すようにファージ（ｆｄ−ｐｈｏＡｒｇ６６）上に発現された野生型 アルカリ性ホスファターゼ遺伝子は３．７００　／分の比活性（転化された基質 のモル数７１モルのウィルス粒子）を有する。 これは、ＭａｌａｍＶおよびＨｏｒｅｃｋｅｒ、Ｂｉｏｅｈｅ＋５ｉｓｔｒｙ　 ３．　］８９３−１８９７１９６４）により精製したアルカリ性ホスファターゼ について見いだされた４５４０／分のターンオーバー値に近い。 Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｏｕら、１９８８前掲は、活性部位（残１１６６）におい てアルギニンをアラニンで置換すると、触媒反応速度が減少することを示した。 ＴＧＩおよびＫＳ２７２から誘導されたこの変異を有するアルカリ性ホスファタ ーゼを表示するファージの調製物は、それぞれ、３８０および１４００モルの転 化された基質１モルのファージ７分の減少された比活性を示す、第３５回に示す 、限外濾過により調製された、°保持された分画および流通した分画において酵 素活性を測定した。ファージ−酵素からの活性のほとんどはフィルター上に保持 されたが、３つの酵素からの活性の大部分は流通した。したがって、ウィルスに 会合した酵素について期待されるように、これらの融合体における酵素活性は挙 動した（示されていない）　、　ＴＧＩまたばＫＳ２７２細胞からのベクターフ ァージの調製物において触媒活性はほとんどまたはまったく測定されず（表７） 、上記の触媒活性が細菌のファージのためであり、そして細菌ホスファターゼの 汚染によるものではないことが示された。可溶性酵素にファージ粒子を添加する ことは活性に有意に効果を与えない（表７）。 したがって、アルカリ性ホスファターゼの触媒活性および免疫学的活性の両者は 、ファージ粒子の一部分である酵素のためであることが証明された。 ２、フ　−ジのアルカ盲　ホスフ　−ゼのアゾ　ニー　−クロマ　ブーツ　− 酵素の特異的結合活性を使用するアフィニティークロマトグラフィーは、それら の精製のために非常に強方な方法であること証明した。このアプローチによるフ ァージ−酵素の精製は、酵素をコードする遺伝物質を酵素それ自体を使用して分 離することを可能とする。 こうして、フィラメント状バクテリオファージ表面上に発現されたクローニング された酵素の変異誘発は、酵素変異型の全集団を導き、これから所望の結合性を もつ変異型を分離することができるであろう。 可溶性アルカリ性ホスファターゼ（子ウシの腸から）は、固定化されたヒ酸塩（ 競争的阻害剤）への結合、および無機ホスフェート（これは酵素反応の産生物（ および競争的阻害剤である）である）を使用する溶出により精製された（Ｂｒｅ ｎｎａ、Ｏ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１５１２９１−１９７５）、大腸菌から の可溶性アルカリ性ホスファターゼはまた、このマトリックスにより保持される ことを、本発明者らは決定した（示されていない）、この実施例において、大腸 菌アルカリ性ホスファターゼを表示するファージはヒ酸塩−セファローズに結合 し、そして特異的に溶出され得ることが証明される。 ヒ酸塩−セファローズは、４−（ｐ−アミノフェニルアゾ）フェニルヒ酸をナラ ミニルーセファローズに、Ｂｒｅｅｎａら（１９７５；前ｊり　（７）方法に従 いカップリングすることによって調製された。ファージ酵素ｆｄｐｈｏＡｒｇ６ ６　（実施例３１）のアフィニティークロマトグラフィーは、０．５１のカラム 体積の使い捨てクロマトグラフィーカラムにおいて実施した。カラムを１００体 積のカラム緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｌ（８，４）、１ｍＭ　Ｍｇｃｉ 、、０，１　ｍＭ　ＺｎＣＩｚ、０．１　％のツイーン２０．　Ｂｒｅｎｎａら １９７５前掲）により前取て洗浄しておいた。ファージ−酵素の４０倍濃縮物（ カラムの緩衝液の中；実施例３１におけるように調製した）Ｌｍｌを負荷し、そ して１００体積のカラム緩衝液で洗浄した。結合したファージ−酵素を５ｍｌの ２０１１Ｍ　ＮａｔＨＰＯａを含有するカラム緩衝液で溶出した。溶離液および 洗浄の分画をニトロセルロース上ヘドフトブロッティングし、そして既知量のフ ァージ−酵素と比較することによって定量した。プロットはヒツジ抗Ｍ１３抗血 清（Ｍ、Ｈｏｂａｒｔから入手した）、抗ヒツジペルオキシダーゼ（Ｓｉｇ＋ｗ ａ）および増強された化学発光基質（Ａｓｅｒｓｈａｓ）を使用して検出した。 ある範囲の暴露を行った。 表８は、ヒ酸塩−セファローズ上にアルカリ性ホスファターゼを表示するアフィ ニティークロマトグラフィーの結果を示す、別の実験において、変異体を発現す るファージ粒子（ｆｄｐｂｏＡＩａ１６６、実施例１１）および野生型を発現す るファージ粒子（ｆｄｐｈｏＡｒｇ１６６）の形態はヒ酸塩−セファローズ上に 保持され、そして無機ホスフェートで溶出される。添加したファージ酵素粒子の 負荷物（「入力ファージ」）のほぼ０．５〜３％がホスフェートで溶出され（「 出力ファージ」）が、これに対してベクター粒子は０．０５％のみである。ヒ酸 塩は４−ニトロフェニルホスフェートに関して２０μモルのＫｔをもつ競争的阻 害剤である。ファージ粒子の抗体は類似する親和性による相互作用に基づいてす でに分離されている（実施例２３）、この会合は多数の酵素−リガントの相互作 用の範囲内にあり、このアプローチのための広い応用性が示唆される。 表８がまた示すように、酵素を発現するファージ粒子の感染性はベクターファー ジ粒子と比較して減少する。これは感染性粒子の検定を、ファージ酵素粒子の数 を定量するための不適当な手段とする。 二の理由で、ファージの数はドツトプロッティングにより測定し、そしてファー ジを抗Ｍ１３抗血清により上記のようにして検出した。 触媒活性の全体回収は酵素の精製における重要な考慮であるが、コレはファージ −酵素の場合決定的ではない。低いレベルのみのファージ−酵素がアフィニティ ーカラムに結合しかつそれから特異的に溶出される場合でさえ、これは引き続い てファージ−酵素として大量に増殖させることができるクローンを発生するか、 あるいは可溶性産生物を生ずる発現ベクターに転換することができる。 ３３、オキサシロンに・して０番　−れた　のＦａｂ　をヨー上まｊ１駐Ｊリ− ＣＲ７丸Ｚグユニ 実施例２５が示すように、Ｆａｂ断片をコードする遺伝子をヘクターｆｄＣＡＴ ２およびｐＨＥＮｌ中にサブクローニングすることができ、そしてタンパク質ド メインは結合機能を保持しながらファージの表面上に表示された。この実施例は 、Ｖｌ（ＣＨおよびＶＫＣＫドメインを別々の増幅し、次いで、ライト鎖を遺伝 子ＩＩＩタンパク質融金融合体てそしてＶＨＣＨ断片を可溶性分子として発現さ せるリンカ−により接合することができることを示す０次いで、機能的Ｆａｂ断 片を、これらのドメインの会合によりファージ上に表示する。この実施例に記載 するアセンブリー法は、免疫のレパートリ−に由来するＦａｂ断片のライブラリ ーの表示のために要求され、この場合ヘビー鎖およびライト鎖の両者は単一のベ クター内にコードされる。 ２−フェニル−５−オキサシロンに対して向けられた抗体ＮＱＩＯ。 １２．５に由来する構成体（実施例２５；ｐＵｃ１９中の構成体ＩＩ）のνＨＣ ）１１およびＶＫＣＫドメインをＰＣＲにより増幅した。ベクターｆｄＣＡＴＺ 中のクローニングするために、オリゴヌクレオチドＶｌ（ＩＢＡＣＫＡＰＡ　（ 実ｍ例２５）およびＨｕＩｇＧｌ−４ＣＨＩＦＯＲ（実施例４０）を使用して、 ｖｏｃｕｉ　ドメインを増幅した。　ｐ）ＩＥＮＩ中にクローニングするために 、Ｖ）ＩＩＢＡＣＫＳＦＩ（５（実施例２５）をこの増幅のためにＶＨＩＢＡＣ ＫＡＰＡと置換した０両者のベクター中にクローニングするために、ＶＫＣＫド メインをＶＫＣＫ２８ＡＣＫ　（実施例２５）およびＣＫＮＯＴＦＯＲ（実施例 ４０）を使用して増幅を行った。バクテリオファージｆｄ遺伝子８ターミネータ −およびｆｄ遺伝子３プロモーターを含有するオリゴヌクレオチドの断片を、オ リゴヌクレオチドを使用するＰＣＲにより、ベクターからのそれらを含有する領 域を増幅することによって調製した。 ＶＫ−ＴＥｌ？Ｍ−ＦＯＲ ５’　ＴＧＧ　ＡＧＡ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＡＴ　ＧＴＣＧＧＡ 　ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＧＡＡＡＧＧ　３’　（ＶＫ２ＢＡＩＪ　（実施例 １４〕とオーバーラフピングする）並びに Ｃ１ｌｌ−ＴＥＣｌｌｌ−ＴＥ Ｒ′＾ＡＧ　ＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧ　ＧＴＧ　ＧＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ 　ＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＣＣＡＡＡＴＣＴ　ＡＧＣＴＧＡ　ＴＡＡ　ＡＣＣＧＡＴ 　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＧＧＣ３’　（ＨｕｌｇＧｌ−４ＣＨＩ−ＦＯＲと オーバーラッピングする） 増幅されたＶ）ＩＣＨＩおよびＶＫＣＫドメインからのＦａｂ断片および上記の ようにして調製されたリンカ−のアセンブリーを実施例１４Ｈに記載するように して調製したが、ただしプライマーＶＨＩＢＡＣＡＫＰＡ　（ｆｄＣＡＴ２の中 にクローニングするとき）またはＶ［ＩＩＢＡＣＫＳＦＩ５　（ｐＨＥＮｌの中 にクローニングするとき）およびＣＫＮＯＴＦＯＲを最後に再増幅のために使用 し、これによりｆｄＣＡＴ２（Ａｐａｌｌ−Ｎｏｔｌ）またはｐＨＥＮｌ（Ｓｆ ｔｌ−ＮｏｔＩ）の中へのクローニングのために制限部位を導入し、アセンブリ ングしたＦａｂ断片を第３５図に示す。アセンブリングされた産生物はリンカ− の不存在下に見られなかった。実施例１４に従い！！製したアセンブリングされ た５ｃＦｖ断片を比較のために示す。 ファージの抗体を実施例２５におけるように調製し、そしてＥＬＩＳ＾を実施例 ６に従い抗原としてオキサシロンを使用して実施した。結果はｆｄｃＡＴ２およ びｐｏｓｔの両者の試料においてクローニングしたＦａｂ断片について期待した 通りであり、ファージ粒子は陽性ＥＬＩＳＡシグナルにより検出されるようにオ キサシロンに結合した。 ４、−■ＩＩ　るヘルパーフ　−ジの ファージミドを含有するクローニング系の可能性を完全に実現するために、遺伝 子ＩＩＩを欠如するヘルパーファージが望ましい、このようなヘルパーファージ と遺伝子ＩＩＩ　との融合体のレスキューは、それらのキャプシド上に遺伝子Ｉ ＩＩの融合体を有するすべての子孫ファージミドを生じさせる。なぜなら、野生 型カラムとの競争は存在しないであろうからである。 各ファージ上に含有される融合分子の数のコントロールは、とくに有用であろう ０例えば、遺伝子ＩＩＩを欠如するヘルパーファージを使用して、天然レパート リ−から低い親和性の抗体をレスキューすることができ、ここで正しい抗体の特 異性を有するファージを分離するために、高い結合活性が必要とされる０次いで 変異しないヘルパーファージを使用することができ、このときより高い親和性の バージョンが構成され、これにより結合活性化合物は減少し、そして純粋に親和 性に基づく選択を可能となる。これは天然のライブラリーから抗体を分離しそし て親和性を変異させるための驚くべき有効な方法であることが証明される。 ヘルパーファージの作製のために選択した方法は、エンドヌクレオチドＢａ１３ １を使用して？１１３ＫＯ７の遺伝子ＩＩＩを部分的に欠失することであった。 しかしながら、遺伝子ＩＩＩタンパク譬を欠如するファージは非感染性であるの で、遺伝子ＩＩＩを発現する大腸菌菌株が作製された。野生型？１１３遺伝子１ １１を、正確に実施例２４に記載するようにして、プライマーＩＩＩＦｔｌＦＯ および遺伝子１１１ＦＵＢＡを使用してＰＣＲ増幅した。　ＰＣＲ産生物をＥｃ ｏＲｌおよび）ＩｉｎｄＨＩで消化し、そしてＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌｌｌで 切断されたｐＵｃ１９（それはＳＳ　ＩＩＮＡのフィラメント状ファージ複製起 点を欠如するのでファージミドではない）中にＩａｃプロモーターのコントロー ル下に挿入した。プラスミドを大腸菌ＴＧＩの中に形質転換し、そして生ずる菌 株をＴＧＩ　／ｐＵｃ１９ｇｌＩＩと呼んだ、この菌株はへルバーファージに対 してトランスの形態の遺伝子ＩＩＩタンパク質を提供する。 Ｍ１３ＫＯ？中には単一のユニークＢａｍＨＩが存在し、これはｇＩＩＩのほぼ 中央に位置する。　Ｍ１３ＫＯ７の二本１ｉｔ）ＮＡを、アルカリ溶菌および塩 化セシウムの遠心により調製した（Ｓａｓ＋ｂｒｏｏｋら１９８９前掲）；２０ μｇのＤＮＡをＢａｍ１ｌＩで切断し、フェノール抽出し、そしてエタノール沈 澱させ、次いで５０．ｃｒｌのＢａ１３１緩衝液（６００ｓＭ　ＮａＣｌ　、２ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（：１（ｐＨ８，０）　、１２’ｗＭ　ＣｄＣ１ｇ、　１ ２ｍＭ　ＭｇＣｂおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡ）の中に再＠濁させ、そして１単位の Ｂａ１３１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で４分間消化した。こ の処理は約ＩＫｂのＤＮＡを除去した。　ＥＧＴＡを２０１１Ｍに添加し、そし て反応混合物をフェノール抽出し、そしてエタノール沈澱させた後、末を切断し たゲノムをアガロースゲルで精製した。　ＤＮＡをＫｌｅｎｏｗ酵素で修復し、 そしてＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ＥｎｇＩａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で自己 連結させた。 連結反応物のアリコートをコンピテントＴＧＩ　／ｐＵｃ１９ｇｌｌｌの中に形 質転換し、そして１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌのカナ マイシンを含有するＳＯＢ培地上にプレイティングした。コロニーをプライマー ｇＩＩＩＦＵＢＡおよびＫＳＪ１２　（ＣＧＧＡＡＴＡＣＣＣＡＡＡＡＧＡＡＣ ＴＧＧ）を使用するＰＣＲにより欠失の存在についてスクリーニングした。 ＫＳＪ１２を遺伝子Ｖｌにアニールする。この遺伝子Ｖｌはファージのゲノムの 中のｇｌＩＩのすぐ下流に存在するので、ヘルパーファージ上のｇｉｌｌはプラ スミド上に存在するものと区別される。３つのクローンは約２００．４００およ び８００ｂｐの欠失に相当する末が切れたＰＣＲ産生物を与えた。これらのクロ ーンを、それぞれ、Ｍ１３ＫＯ７ｇｌ　ＩＩΔＮｏ、１゜２および３と呼んだ。 クローンはより早いＢａ１３１時点から分離されず、これらがある態様で宿主細 胞に対して致死的であることを示唆する。いくつかのクローンは遅い時点から分 離されたが、これらのいずれもＰｃｔ？産生物を与えず、欠失反応がそれ以上進 行しなかったことを示す。 Ｍ２Ｓに０７ｇ１ｌｌ八Ｎｏ、１．　２および３を培養し、そして生ずるヘルパ ーファージを、実施例１８に記載するのと正確に同様のＥＬＩＳＡにより、抗体 ｇＩＩＩ融合体（ｓｃＦｖＤｌ　、　３）をレスキューするそれらの能力につい て試験した。第３７図に示すように、ただ１つのクローンＭ１３に０７ｇ１ｌＩ ΔＮｏ、　３が抗体をよくレスキューすることが見出された一事実、このヘルパ ーを使用するシグナルは親の旧３に０７を使用して観察されたものより大きかっ た。　ｑ１３ｉ＋ｏ７．ｙｏΔＮｏ、　３がレスキューしたファージミドは、そ れらの表面上に非常により高い密度の抗体融合体を有するであろう、これが事実 そうであることは、このＥＬＩＳＡにおいて使用したファージが抗εＩＩＩタン パク質の抗血清を使用するウェスタンブロッティングにより分析されたときに証 明された（第３８図）、この分析は、ｇｌＩＩ融合タンパク譬／遊離ｇｌＩＩタ ンパク質（ファージ（ミド）粒子上に存在する）の推定を可能とする。 ＭＩ３ＫＯ７でレスキューされた物質上のｇｌｌＩタンパク質のほんの小さい部 分が完全な融合体として存在する（第３８図）、融合タンパク質のバンドはＩ　 ＰＴＧにより誘発されるので、それがファージミドにより合成されたことは明白 である。予想されるように、ｇｌＩＩ融合タンパク質の合成を推進するＩａｃプ ロモーターが完全に誘発されるときでさえ（１００μモルのＩＰＴＧ）　、野生 型ｇｌＩＩタンパク質は、より低いコピー数でそしてさらに弱いプロモーターか ら推進され、優勢である。 これはＭ１３ＫＯ７ｇｌＩＩΔＮ０．３でレスキューされた同一クローンにより 発生するパターン、およびｆｄＣＡＴ２−ｓｅＦｖＤｌ、３により発生ずるパタ ーンと対照的である。これらの後者の場合の双方において、野生型ｇＩＩＩとの 競争は存在せず、そして融合タンパク賀のバンドはそれに応じてより強い。 Ｍ１３ＫＯ７ｇｌ　Ｉ　ＩΔＮｏ、　３の作製は非常に非効率的であることに注 意することは価値がある＝２０μｇの出発ＤＮＡからの１つのクローン、そのう え、−夜培養物からのｇｌｌｌヘルパーファージの収量は極めて低く、約１０’ ｃｆｕ／■Ｉであり、これに対して親ファージについて約１０＋１ｃｆｕ　／ｍ ｌである。この）１１３ＫＯ７ａｌｌｌΔＮ０．３は、−夜の増殖後に産生され たファージミド粒子の数により判断して、親のファージと同様によ（ファージを レスキューする。これが示すように、ヘルパーのトランス複製およびパンケージ ング機能は完全（ｉｎｔａｃｔ）であり、そしてそれ自体の複製は欠陥があるこ とを示唆する。それゆえ、ｇｌｌＮの不活性化は正常宿主細胞に対して毒性であ ることがあり、そしてＭ２Ｓ）［０７ｇＩ　ＩＩΔＮ０．３は、例えば複製に影 響を与える変異を補償するために分離された可能性がある。宿主細胞に対して通 常致死的である構造遺伝子の中の突然変異に耐える点において、ファージｆｄ− ｔｅｔは異常である。なぜなら、それは毒性ファージ産生物の蓄積を遅くする複 製欠陥を有するからである。 Ｍ２Ｓに０７ｇＩＩＩΔＮ０．３は、１９９１年６月２８日に、ブタベスト条約 の規定に従いナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（Ｎａｔ ｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ）、英 国ＮＷ９６ＨＴ　、　ｏンドン、コリンダーレアヴエニュ６１、に受託された（ 受は入れ番号ＮＣＴＣ１２４７８）　、それは塩基１９７９−２７６８のＭ１３ ゲノムの欠失を含有する（参照、Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ、Ｐ、Ｇ、Ｍ、Ｆ 、ら、Ｇｅｎｅ　ＩＩ　Ｇ＋１２９−１４８．１９８０゜Ｍ２ＳのゲノムのＤＮ ＾配列について）。 ｍ−パニング　る　に　」」イ１１巴伝吠九Ｉ±二ｊ、ｃ月ｏ　！　；　たＦａ ｂ　るバク′″ｉオフ　−ジ豊１訳 所望の高い親和性をもつ抗体の分離のため、集団の残りよりわずかに数倍高い親 和性をもつ抗体を選択することが必要である。これは、不十分な親和性をもつ抗 体が、例えば免疫化された動物から誘導されたのレパートリ−から分離されてお りそしてランダム突然変異を使用して潜在的に増加した親和性をもつ誘導体がＩ ＩＩされる場合に特に重要である。この実施例において、ニワトリ卵リゾチーム に対して向けられた異なる親和性の抗体を発現するファージの混合物をパニング 手順にかけた。ファージ抗体は２ナノモルのに４をもつ抗体を１３ナノモルのに ４をもつものに対して選択する能力を与えることが実証される。 この実施例において使用するオリゴヌクレオチドを、下のリストに示す： 第１ゴヌクレオチド ＶＨＢＨＤ１３ＡＰＡ：５’　−ＣＡＣＡＧＴ　ＧＣＡ　ＣＡＧ　ＧＴＣＣＡＡ 　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＡＧＣＧＧＴＶＩＩＦ）１０１３　：５’　−ＣＧ Ｇ　ＴＧＡ　ＣＧＡ　ＧＧＣＴＧＣＣＴＴ　ＧＡＣＣＣＣＨＤ１３ＢＬＩＮ　： ５’　−ＧＧＧ　ＧＴＣＡＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＣＴＣＧ　ＴＣＡ　ＣＣＧＨＤ１ ３ＦＬＩＮ３　：５’　−丁ＧＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　 ＧＡＴ　ＧＴＣＣＧＡ　ＴＶＫＢＨＤ１３　：５’　−ＧＡＣＡＴＣＣＡＧ　Ａ ＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＣＡＶＫＦ）ＩＯ１３ＮＯＴ：５’　−ＧＡＧ　 ＴＣＡ　ＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣＣＡＣＣＴ Ｔ　ＧＧＴ　ＣＣＣ ＭＩＩＲ［１１３ＳＥＱ　：５’　−ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＡＴＴ　ＴＴＣＣＣＴ　 ＧＴＨＵＭＤ１３ＳＥＱ　：５’　−ＴＴＧ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＡＣＣＴＧ　 ＧＣＦ［１ＰＣＲＦＯＲ：５’　−ＴＡＧ　ＣＣＣＣＣＴ　丁ＡＴ　ＴＡＧ　Ｃ ＧＴ　ＴＴＧ　ＣＣＡＦＤＰＣＲＩ３ＡＫ　：５’　−ＧＣＧ　ＡＴＧ　ＧＧＴ 　ＧＴＴ　ＧＴＣＡＴＴ　ＧＴＣＧＧＣリゾチームに対して向けられたＦａｂ断 片を表示するファージは、プラスミド中にクローニングされたＦａｂ断片から誘 導した。 ヘビー鎖およびライト鎖の可変領域は、Ｆａｂ断片の産生に適当なヒト化ＶＨ− ＣＨＩまたはＶＫ−ＣＫ挿入部を含有するプラスミド（Ｊ、Ｆｏｏｔｅから入手 した）から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。 ヘビー鎖プラスミド　ライト鎖プラスミド　ＫｄＨＵＢ−Ｉ　ＨＵＫ−３５２ｎ Ｍ ｌｌＵｆｌ−１■ＩＪＫ−４１８Ｏｎ１１ＨＵＨ−２Ｈ［ＩＫ−３１３ｎＭ ！ＩＵＨ−２［ＩＵＫ−４（決定せず）二次匹り 可変領域の一次ＰＣＲは次を組み合わせることによって実施した＝３６．５μｌ の水 ５μｌのＰＣＲｌｌｌ液液ＩＯＸ） ２　μ　ｌ　のｄＮＴＰ（５閣Ｍ） ２．５　ｕ　ｌのバック（Ｂａｃｋ）オリゴ（１０ピコモル／　ａ　１　）（Ｖ ＨＢＨＤ１３ＡＰＡまたはＶＨＢＨＤ１３） ２．５　ｕ　１のフォワード（Ｆｏｒｗａｒｄ）オリゴ（１０ピコモル／　ｔｔ 　１　）（ＶＨＦＨ０１３またはＶＫＢＦ［１Ｄ１３ＮＯＴ）この反応は５分間 ＯＶ照射して外来ＤＮＡを破壊することによって汚染物質を除去し、そしてｌｕ ｌのプラスミドのＤＮＡを添加する（０．１μｇ／μｍ）　、　ＰＣＲ混合物を ２滴のパラフィン油でカバーし、そして９４℃のＰＣＲＣロブロック上分間配置 した後、０．５　μｍのＴａｑポリメラーゼをパラフィンの下に添加した。使用 したサイクリング条件は、９４℃で１分、４０℃で１分、７２°Ｃで１．５分の １７サイクルであった。 リンカ−（Ｇｌｙｎ−Ｓｅｒ）　３を、抗ｐｈＯＸ（２−フェールオキサゾルー ５−オン）クローンｆｄ−ＣＡＴ２−ｓｃＦｖＮＱ１１から、オリゴＨＤ１３Ｂ ＬＩＮおよびＨＤ１３ＦＬＩＮ１３を０．１　μｇのプラスミドＤＮＡとともに 使用して増幅した。 使用したＰＣＲのサイクリングは、９４℃で１分、４０℃で１分、２５℃分で１ ．５分の１７サイクルであった。 増幅したＤＮＡは、試料を２％の低融点のアガロースゲル上に９０ｍＡで展開し 、適当なバンドを切り出し、そしてシーンクリーンＩ■キット（ＩＯ１０１Ｉｎ ｃ、）をＶＨまたはＶＫのために使用するか、あるいはスピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ フィルターユニット（Ｃｏｓｔａｒ）をリンカ−のために使用することによって Ｉ）ＮＡを抽出して精製した。抽出されたＤ）ｆＡは１０μｍの最終体積を使用 して再懸濁させた。 基Ｒ７センブリー ４つの一本１１［Ｆｖヒト化０１．３（ｓｃＦｖＤｌ、３＞構成体は、「オーバ ーラツプ伸長によるアセンブリー」実施例１４の方法により、アセンブリングし た０次の成分を組み合わせた： ３４．５μｍの水 ５μｌのＰｃｔｒ　Ｍ液液（１０Ｘ） ２μｌのｄＮＴＰ　（５ｍＭ） ２．５　ｕ　Ｉのバック（Ｂａｃｋ）オリゴ（１０ピコモル／　ａ　Ｉ　）（Ｖ ＨＢＨＤ１３ＡＰＡ）２．５　ｕ　Ｉの７ｒ’７−ド（Ｆｏｒｗａｒｄ）オリゴ （１０ピコモル／ｕ　Ｉ）（ＶＫＢＦＨＤ１３ＮＯＴ） もう一度、この反応混合物を５分間ＵＶ処理して汚染物を除去した後、１μｍの 一次ＰＣＲノ産生物、　ＶＨ−１またはＶＨ−２、ＶＫ−３またはＶＫ−４、＋ リンカーＤＮＡを添加する。反応混合物を２滴のパラフィン油でカバーし、そし て９４゛Ｃに５分間加熱した後、０．５μＩのＴａｑポリメラーゼを添加した。 使用したＰＣＲサイクリング条件は、９４℃で１分、６０℃で１゜５分、７２℃ で２．５分の２０サイクルであった。 パラフィン下の水性層をフェノールで１回、フェノール：クロロホルムで１回、 エーテルで１回抽出し、エタノール沈澱させ、そして３６μｍの水の中に再懸濁 させた。これに、５μｌの１０ＸＮｏｔＩ用緩衝液、５μｌのＩｍｇ／ｍｌのＢ ＳＡ　、および４　ｕ　ｌ　（４０Ｕ）のＮｏｔｌｏｌｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）を添加した。制限酵素処理混合物を３７℃において一夜インキユ ベーションした。 ＤＮ八をエタノール沈澱させ、そして３６μｌの水、および５μＩの１０×緩衝 液４．５μｌのｌａｇ／ｍｌのＢＳＡ　、および２μｌ　（４０Ｕ）のＡｐａＬ Ｉ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）中に再懸濁した。これを３７℃ で５時間インキエベーシッンした；さらに２μｍのＡｐａＬＩを添加し、そして 反応混合物を３７℃において一夜インキユベーシッンした。 切断したＤＮＡを１．３％の低融点のアガロースゲル上のゲル精製および引き続 くシーンクリーンで処理することによって抽出して、クローニングのための挿入 ＤＮＡを生成した。 ベクターｆｄＣＡＴ２　（実施例２０にお番）るように調製し、そしてＡｐａＬ ＩおよびＮｏｔｌで消化したもの）および５ｃＦｖのＤＮＡを実施例２０におけ るように連結した。 一久！：」≦Ｌ主梶 連結からのコロニーをまずＰＣＲのスクリーニングにより挿入部についてスクリ ーニングした。　ＰＣＲ混合物は、１４．８ａＸのＩ　ＸＰＣＲ！ｌ衝液、１ａ ＸのｄＮＴＰ　（５ｍＭ）、ｌ　／／　Ｉのバックオリゴ（ＦＤＰＣＲＢＡＫ） 、１μｍのフォワードオリゴ（ＦＤＰＣＲＦＯＲ）、および０．２　ｕ　ｌのＴ ａｑポリメラーゼ／スクリーニングしたコロニーを組み合わせることによって精 製した。２０μｍのこのＰＣＲ混合物のアリコートを９６ウエルのテクネ（Ｔｅ ｃｂｎｅ）プレート中に入れた。コロニーの上部をつまようじで接触し、そして 急速に渦形成してＰＣＲ混合物の中に入れ、そして２５０μｌの２ＸＴＹ培地を 含有するセルウェル（Ｃｅｌｌｗｅｌ）プレート（Ｎｕｎｃ）の中につまようじ で入れることによってコロニーへをレスキエーした。 ＰＣＲ混合物を１滴のパラフィンでカバーし、そしてプレートを９４℃のブロッ ク上に５分間配置させた後、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２．５分で サイクリングした。 こうして誘導されたクローンを下記のように命名する。　Ｆａｂ断片に由来する ５ｃＰｖ断片の親和性は決定されなかったが、前の結果はこれらが密接に関係す るが、必ずしも同一ではないこと示唆する（Ｒ，Ｅ。 ＢｉｒｄおよびＢＪＪａｌｋｅｒ　ＴＩＴＥＣＨ９１３２−１３７，１９９１） 。 構成体の名称　組　成　Ｆａｂの親和性（Ｋｄ）ＴＰＢＩ　シＨ−ＨｕＨ２−（ Ｇｌｙａ−５ｅｒ）ｓ−ＶＫ−ＨｕＫ３　１３　ｎＭＴＰＲ２シＢ−Ｈｕｌｌ− （Ｇｌｙ、−５ｅｔ）ｓ−ＶＫ−１’［ｕＫ４　１８０　ｎＭＴＰＢ３　ＶＨ− Ｈｕｔ１２−　（Ｇｌｙａ−５ｅｒ）　５−ＶＫ−ＨｕＫ４　（未知）ＴＰＢ４ 　ＶＨ−ＨｕＨｌ−（Ｇｌｙａ−３ｅｒ）ｓ−ＶＫ−［１ｕＫ３　５２　ｎｒＩ ファージの調製およびＥＬＩＳＡは実施例６に記載されている通りであった。ｆ ｄＣＡＴ２の中で発生したクローンは予想通つりゾチームに結合することが示さ れた。 親木−性１−沢 最高の親和性結合ファージの選択 混合実験を実施し、ここでｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３フアージ（実施例１ ９）をｆｄ−ＣＡＴ２　ＴＰＢＩ、　ｆｄ−ＣＡＴ２　ＴＰＢ２、またはｆｄ− ＣＡＴ２　ＴＰＢ３と混合し、そして１ラウンドのパニングにおいて使用した。 パニングにより親和性の選択のために使用した一般的方法は、下に詳述する方法 である。このプロトコルからの任意の偏りは関係する点において記載する。操作 の間にパニングのプレートをロッキングプラットフォーム上に配置した。 ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）の３５ｍｍの組織培養皿を１ｕＩの５０ｍＭ炭酸水 素ナトリウム（ｐ）１９．６）　、中に溶解したりゾチーム（種々の濃度）で− 夜コーティングし、そして２ｓ＋１の２％のＩ’ＩＰＢＳで２時間ブロックした 。 ファージを１ｕＩのＭＰＢＳの中で調製し、そして室温において２時間ロッキン グした。プレートを２■ｌの次の溶液で５分間洗浄した：　ＰＢＳ。 ＰＢＳ−ツイーン、５０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）により５回； ５００５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ（１）Ｈ８，５）；５ ００ｓ＋Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９，５）；５ ００　ｍＭ塩化ナトリウム、５０−一炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９，６）；５０ ０　ａ＋Ｍ炭酸水素ナトリウム、次イテ、１　ｍｌ（７）１００　ｓ＋Ｍ　ト’ Ｊ　１　＋ルアミンを添加し、そして５分間ロッキングすることによってファー ジを溶出した後、溶出液を除去し、これを１００μＩの１．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ　（ｐＨ７，４）で中和した。 プレートを下に記載する濃度においてリゾチームで一夜コーティングした。 １ラランドのパニングからのコロニーを、ＭＩＪＲＤＳＥＱ（ｆｄｃＡＴ２ｓｃ ＦｖＤ１．３について）またはｆｌＵＭ［１１３ｓＥＱ（ｆｄＣＡＴ２　ＴＰＢ 構成体について）でブロービングした。 ニトロセルロースのサークル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ、Ｂ Ａ、０．４５　ｕｒｎ）を鉛筆で標識し、そしてパニング実験から誘導されたコ ロニーの上におだやかに降し、そして１分間放置した。次いでフィルターを１つ のへりから急速に引き上げ、そして変性溶液（５００ｍＭ水酸化ナトリウムｉ　 １．５Ｍ塩化ナトリウム）の中に５分間浸漬した１枚の３問紙０１ｈａｔｍａｎ ）上にコロニー側を配置した０次いでそれらを中和溶液（３，０Ｍの塩化ナトリ ウム；　５００　ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５））　＋７）中で１分間 浸漬した３問に転移し、次いで５　Ｘ５ＳＣ；　２５０　ｍＭ酢酸アンモニウム の中で浸漬した３Ｍ？Ｈこ転移した０次いでフィルターを空気乾燥した後、８０ ℃の真空炉内で３０分間ベーキングした。 オリゴヌクレオチドプローブを次の成分を組み合わせることによって調製した。 ２μｌのオリゴヌクレオチド（１ピコモル／μ１）２ｕＩのｒ　−３２Ｐ　ＡＴ Ｐ（３０００Ｃ４／ミリモル）（Ａｍｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ ｌ）２ｕｒのＩＯＸキナーゼ緩衝液（０，５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５ ）；１００ｍＭ塩化マグネシウム；１０　ｍＭ　ＩＩＴＴ）　２μｌのポリヌク レオチドキナーゼ（２０単位） これを３７゛Ｃにおいて１時間インキュページテンＬ・た争ハイブリダイゼーシ ョンを、テクネＩＩＢ−１ハイブリダイザ−により実施した。ベーキングしたフ ィルターを３７℃において４０−■のハイプリダイゼーシッン凝液液（１０ｍｌ の１００　ｍＭのビロリン酸性ナトリウム；１８０　ｍｌの５．〇−塩化ナトリ ウム；２０ｍ１の５０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄ　ｔ）溶液；　９０ｍ１の １．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）；２４　ｍｌの２５０　ｍＭ　ＨＤ ＴＡ；５０１＋１の１０％のＮＰ４０；水で１リットルした；　６０．３ｍｇの ｒＡＴＰＨ２００ｍｇの酵母菌のＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ））の中で１５分間予備ハ イブリダイゼーシヲンした後、２０μＩのキナーゼオリゴを添加した。フィルタ ーを３７°Ｃにおいて少なくとも１時間インキエベーシコンし、次いで３回５０ −１の６ＸＳＳＣで３７℃において１０分間洗浄した（低いストリンジエンシー の洗浄）。フィルターを空気乾燥し、サランラップでカバーし、そしてコダック （Ｋｏｄａｋ）Ｘ−ＡＲフィルムで一夜露光した。 ｆｄ−ＣＡＴ２　ＴＰＢ４からのｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３の選択第３８ 図は、高い親和性のｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３（Ｋｄ−２ｎＭ）およびｆ ｄ−ＣＡＴ２ＴＰＢ４ＩＩ！成体（Ｋｄ−５２ｎＭ）の混合物を使用するパニン グ実験からの結果を要約する。 ３０００μｇ／ｍｌのリゾチームのコーティング濃度において、濃縮はほとんど あるいは全く得ることができなかった。しかしながら、プレートのコーティング により一層低い濃度のりゾチームを使用したとき、ｓｃＦνＯ１，３フアージに ついて濃縮を得ることが可能であった。 得られた最良の濃縮は、３０μｇ／ｍｌのりゾチームで一夜コーティングしたプ レート上で、出発混合物中１．５％のｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３から、溶 出した分画中３３％のｆｄ−ＣＡτ２ｓｃＦｖＤ１．３であった。 ｆｄＣＡＴ２　ＴＰＢＩからのｆｄ−ＣＡＴ２ｓｃＦｖＤ１．３の選択ｆｄＣＡ Ｔ２　ＴＰＢＩファージ（Ｋｄ−１５ｎＭ）を越えた高い親和性の５ｃＦｖＤ１ ．３フアージの濃縮は、第４０図に示すように、プレートを低い濃度のりゾチー ムで一夜コーティングした実験からのみ示すことができた。 要約すると、ｌ連のヒト化したＤｌ、３抗体の一本１ｊＦｖのバージョンをファ ージｆｄ−ＣＡＴ２中で構成した。小さいペトリ皿中でのパニングにより、ｆｄ −ＣＡＴ２ファージ混合物のアフィニティー選択によって、高い親和性の５ｃＦ ｖＤ１．３フアージをより低い親和性の！ＩＣＦＶＨＩＩＤ１．３ファージのバ ックグラウンドに対して優先的に選択することができたことが示された。 実施例１１および１２は、大腸菌からのアルカリ性ホスファターゼがバクテリオ ファージｆｄ上で触媒的に活性な酵素として発現させることができることを示し た。ここで、われわれは、連鎖球菌のヌクレアーゼもまた触媒的に活性な形態で 発現させることができることを示し、この方法が一般的であり得ることを示唆す る。 酵素スタフィロコッカスヌクレアーゼ（ＳＮアーゼ）の遺伝子を、内部のＡｐａ ＬＩ（５’　−ＡＡＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡ ＡＡＡＡＡＴＴＡＣ−３’　）およびＮｏｔｌ（５’　−ＧＧＧＡＴＣＣＧＣＧ ＧＣＣＧＣＴＴＧＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＣＧＴＴＧＴＣＴＴＣＧ−３’　）の 制限部位をもつプライマーを使用してＰＣＨにより、Ｍ１３ｍｐ１８−３Ｎアー ゼ（Ｎｅｕｅｂｅｒｇｅｒ＋　Ｍ、　Ｓ、ら、Ｎａｒｕｒｅ　３１２６０４−６ ０８．１９８４）から増幅し、ＡｐａＬＩ−Ｎｏｔｌ制限酵素で消化後、ファー ジベクターｆｄ−ＣＡＴ２中にクローニングし、そしてＳＮアーゼ遺伝子のヌク レオチド配列および遺伝子ＩＩＩ　との接合をＤＮＡの配列決定によりチェック した。　ｆｄ−ｔｅｔ−５Ｎアーゼフアージを、感染した大腸菌ＴＧＩの培養上 澄み液から３ラウンドのＰＥＧ沈澱により調製し、そして、実施例２７に記載す るように、５ＤＳ−ゲル電気泳動およびウサギ抗ｇ３ｐ抗血清（１，Ｒａｓｃｇ ｅｄ教授、に。。、−ｔａｎｚ）およびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体 （Ｓｉｇ＠ａ）を使用するウェスタンブロッティング（第４１図）により融合タ ンパク質を証明した。融合タンパク質のバンド（計冨されたＭｒ、５９７９０、 しかし異常なｇ３ｐの挙動のためにより高い位置）と共に、より小さい（タンパ ク質分解？）産生物が見られる。 融合タンパク質は、Ｃａ、、の存在下に３７℃においてｆｄ−ｔａｔ−５Ｎアー ゼのファージ（４Ｘ１０”のテトラサイクリン耐性コロニー（ＴＵ）　）を一本 ｇＤＮＡ（ｌμｇ）と１時間インキュベーションし、そして消化物をアガロース ゲル電気泳動により分析することによって、触媒的に活性であることが示された （第４２図）、ヌクレアーゼ活性は、親のｆｄ−ＧＡＴ２（２Ｘ　１０’・ＴＵ ）ファージ単独で、あるいはｆｄ−ＧＡＴ２（２Ｘ１０”　ＴＯ）とＳＮアーゼ （０，７ｇｇ）との混合物のＰＥＧ再沈澱の３ラウンド後に、検出されなかった 。こうして、ヌクレアーゼ活性は、ファージの表面上の酵素の表示から生じ、そ して共沈したＳＮアーゼまたは融合タンパク質の分解により遊離とされたＳＮア ーゼから生じない。 ｆｄ−ｔｅｔ−ＳＮアーゼのヌクレアーゼ活性（第４２図）は、等モル量のＳＮ アーゼ（０，０３ｎｇまたは１０９粒子）と同一程度の大きさく２Ｘ１０”ＴＵ そして３コピーのＳＮアーゼ／ＴＯを仮定する）にあり、そして真性のＳＮアー ゼに似て、Ｃａ”に依存した。なぜなら、４０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇおよび２５ｓ＋ Ｍ　ＥＧＴＡとのインキュベーシヨンは活性をブロックしたからである（示され ていない）。 ３７、　ｆｄファージの　上でのヒトＣＤ４の２つのアミノ　ド１ゴユヴλ表丞 ファージＣＤ４、すなわち、免疫グロブリンスーパーファミリー１員、は、Ｍ） ＩＣクラスＩＩで制限された免疫認識に関係する細胞表面レセプターである。こ れはまた、ヒト免疫不全ウィルス（エイズウィルス）に由来するタンパク質ｇｐ １２Ｑにより認識される０表面抗原ＣＤ４の最初の２つのドメイン（Ｖｌおよび ｖ２と名付ける、残基１−１７８）を、ＴＡＧ　ＣＡＣＣＡＣＧＡＴ　ＧＴＣＴ ＡＴ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＣＴＣ−３’　）制限部位をもつプライマーを使用する ＰＣＲにより、ＣＤ４のヒトｃＤＮ＾を含有するｐＵｃ１３−７４（τ、Ｓｉｍ ｏｎから入手した）から増幅した。これらの２つの酵素で消化した後、ＰＣＩｌ 産生物をｆｄＣＡτ２中にクローニングし、そしテＣＤ４−ｖｌｖｚのＤＮＡの 完全なヌクレオチド配列および遺伝子ＩＩＩとの接合部をオリゴヌクレオチドｆ ｄ−ｓｅｑｌ　（５’　−ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＴＧＡ　ＧＧ）、 ＣＤ４−ｓｅｑｌ（５’　−ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＴＣＣＴτＧ　ＧＴＣＣＣ−３’ 　）およびＣＤ４−ｓｅｑ２（５’−ＡＣＴＡＣＣＡＧＧ　ＧＧＧ　ＧＣＴ　Ｃ Ｔ−３’　）を使用するジデオキシ配列決定によりチェックした。同一の方法で 、増幅のために前述のプライマーおよびオリゴヌクレオチＦ　５’　−ＧＧＧ　 ＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＴＴＧＧＣＡＧＴ　ＣＡＡ 　ＴＣＣＧＡＡ　ＣＡＣ−３’を使用して、残基１４０７を遺伝子ＩＩＩのＮ末 端に連鎖するｆｄ−ＣＤ４−Ｖｌバージョンをつくり、Ｐｃｔ？条件およびクロ ーニングは本質的に実施例１５に記載する通りであったが、ｓｇはＡｐａＬＩお よびＮｏｔｌ　（製造業者の指示に従い使用した）で実施した。 ｆｄ−ＣＤ４−Ｖｌおよびｆｄ−ＣＤ４−ＶＩＶ２７　ｙ−ジは、感染した大腸 菌ＴＧＩの上澄み液から３ラウンドのＰＥＧ沈澱により調製し、これにより試料 をＥＬＩＳ＾分析のために１００倍に濃縮した。融合タンパク質はウサギ坑道伝 子ＩＩＩ抗血清を使用するウェスタンプロット（結果は示されていない）におい て検出され、そして期待したバンドを示した。 可溶性ｇｐ１２０（エイズ・ブイレフテッド・プログラム（Ａｉｄｓ　Ｄｉｒｅ ｃｔｅｄＰｒｏｇｒａｍｅ＋Ｎａｔｆｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　％英 国ポッターズアー、サウスミンス）から入手したＣＩＯ細胞ＡＤＰ６０４からの 組み換えＨＩＶ−１１１Ｂ　ｇｐ１２０）　ニ対するＣＤ４成分の結合性を、Ｅ ＬＩＳＡにおいて、コーティングのために（−夜、ＰＯ５中で）５μｇ／ｍｌの ｇｐ１２０を使用して分析した。抗Ｍ１３抗血清を使用して結合したファージを 検出した；すべでの他の条件は実施例９における通りであった。第４３図は野生 型ファージ（ｆｄ−ｔｅｔ）および両者のＣＤ４−ファージのＥＬＩＳＡの分析 を示す０両者のＣＤ４−ファージはｇｐ１２０に結合したが、ｆｄ−ＣＤ４−Ｖ ＩＶ２はｆｄ−ＣＤ４−Ｖｌより強＜ａｐ１２０ニ結合した。結合の競争物質で ある可溶性ＣＤ４　（バキユロウィルスからの組み換え可溶性ＣＤ４．ＡＤＰ６ ０８　；エイズ・ブイレフテッド・フログラムから）（２５／７　ｇ　／ｓｌ） または可溶性ｇｐ１２０（２０μｇ　／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡ　ノ間に５０μＩ のファージのストックの試料と一緒に添加すると、バックグラウンドのレベルに 対するシグナルは減少した。これらの結果が示すように、ｇｐ１２０へのファー ジの結合はその表面において表示されたＣｒ１４分子により仲介され、そして、 ＣＤ４の２つのアミノ末端ドメインが提示されるとき、結合はより強い。 こうして、ＣＤ４は細胞表面レセプター分子であり、これはバクテリオファージ ｆｄ上に表示されたとき活性である。　ＰＤＧＦ−ＢＢ　レセプターと同様に、 その機能的表示は実施例１５および１６に記載されており、ＣＤ４は免疫グロブ リンスーパファミリーの１員であり、そしてこの結果は、このクラスの分子は一 般にファージの表面上の表示に適当であることを示唆している。 光注老よＵ】−沢 ファージ中でクローニングされた遺伝子のプール、例えば、抗体遺伝子のプール の多様性を増加すること、あるいは単一のクローニングされた遺伝子の多数の変 異型を産生ずることは、時として望ましいであろう、多数の適当な試験管内突然 変異誘発方法が存在する。 しかしながら、魅力性な方法、とくに抗体遺伝子のライブラリーのより多様性の 集団をつ（る方法は、ミューチーター菌株を使用することである。これは、非常 に多数の突然変異体を発生するという利点を有し、取り扱うことができるファー ジの数によりのみ本質的に制限される。このファージの表示系は、この数の完全 な利点を用いて、この改良されたまたは変更されたクローンの分離することを可 能とする。 ＮＰに対して向けられたモノクローナル抗体から、実施例１４におけるように誘 導された、４−ヒドロキシ−３−二トロフェニル酢酸（ＮＰ）に対して向けられ た抗体の５ｃＦｖ断片をコードするヌクレオチド配列５ｃＦｖＢ１８を、実施例 １１におけるようにＡｐａｌ、■およびＮｏｔｌの制限部位を使用してｆｄＣＡ ＴＺ中にクローニングしてｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＢ１８をつくるか、あるいはＰ ｓｔｌおよびＮｏｔｌの制限部位を使用してｆｄＤＯＧＫａｎ　（そのテトラサ イクリン耐性遺伝子を除去しそしてカナマイシン耐性遺伝子と置換したｆｄＣＡ Ｔ２）中にクローニングしてｆｄＤＯＧＫａｎｓｃＦｖＢ１８をつくるか、ある いは制限部位５ｆｊＩおよびＮｏｔｌを使用して遺伝子ＩＩＩとの融合タンパク 質としてファージミドベクターｐＨＥＮＩ中にクローニングしてｐＨＥＮ１ｓｃ Ｆｖ８１Ｂをつくった。 次のミューチーター菌株（Ｒ，Ｍ、　５ｃｈａａｐｅｒおよびＲ，Ｌ、Ｄｕｎｎ 　Ｊ、Ｍｏｌ。 Ｂｉｏｌ、２６２１６２７−１６２７０．１９８７；Ｒ，Ｍ−５ｃｈａａｐｅｒ 　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 υ−３，Ａ、８５８１２６−８１３０１９８８）を使用した：ＮＲ９２３２：ａ ｒａ、ｔｈｌ、５ｕｔＤ５−ｚａｆ１３：：ＴｒｉＩＯ＋ｐｒｏｌａｅ、　Ｆ’ 　ｐｒｏｌａｃＮＲ９６７０：ａｒａ、　ｔｈｌ＋ａｚｉ＋ｍｕｔＴＩ＋　Ｉｅ ｕ：：ＴｎｌＯ，ｐｒｏｌａｃＮＲ９２９２：ａｒａ、ｔｈ１４ｕｔｔ１１０１ ．ｐｒｏｌａｃ、　ｐｌ　ｐｒｏｌａｅＮＲ９０８４：ａｒａ、ｔｈｌ、ｍｕｔ 、Ｔ１．ａｚｔ、ｐｒｏｌａｃ、ｐｌ　ｐｒｎｌａｃＩ−Ｚ−−Ｍ２Ｓ　Ｍ１５ ＮＲ９０４６：ａｒａｌ　ｔｈｌ、　５ｕｐＥ＋　ｒｉｆ　、　ｎａｌＡ＋　ｍ ｅｔＢ、　ａｒｇＥ　（ａｍ）　。 ｐｒｏｌａｃ、　Ｆ　’　ｐｒｏｌａｃは、Ｒ，Ｍ、５ｃｈａａｐｅｒ博士（Ｄ ｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｌｔｈ！　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｃｅｓ、ＮＩ Ｈ，Ｎ、Ｃ，２７７０９、リサーチトリアングルバーク、郵便私書箱１２２３３ ）からの親切な贈り物であった。 ＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５：ＮＲ９０４６ｗｕｔＤ５：：ＴｎｌＯＮＲ９０４６ｍ ｕｔＴ１：ＮＲ９０４６ｓｕｔ↑１：：ＴｎＩＯを、標準的手順に従うＰ１形賞 導入により構成した。ミューチーター菌株をｆｄＤＯＧＩ［ａｎｓｃＦｖＢ１８ またはｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＢ１８でトランスフエフシランし、そしてトランス フェクシゴン体を抗生物質耐性について選択Ｌｆ、）ランスフエフシラン体を３ ７℃において２４時間増殖させた後、変異体ファージをＰＥＧ沈澱により収穫し た。変異体ファージは、２００１のＰＢＳで前取て洗浄しそして２０ｍ１のＭＰ ＢＳによりブロックした１ｍｌのＮＩＰ（４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニ トロフェニル酢酸）ＢＳＡ−セファローズアフィニティーカラム（製造業者の指 示に従い調製した）上で選択した。ファージを１ｏ■１のＭＰＢＳ中でカラム上 に負荷し、そして結合しない物質を再び適用して完全な結合を保証した。 引き続いてカラムを１０１のＭＰＢＳおよび５００　ｍｌのＰＢＳで洗浄した。 アフィニティーマトリックスに結合したファージを５力ラム体積の０゜３３ｄ　 ＮＴＰ−Ｃａｐ　（実施例４８）で溶出した。 ファージ溶出物を、抗生物質による選択を行わないで数期（２×１０８細胞／− １）の大腸菌ミューチーター菌株と３０分〜１時間インキュベーションした。次 いで感染した細胞を２ＸＴＹ中にに１００に希釈し、そして抗生物質による選択 を伴−７で（それぞれ、ｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＢ１８またはｆｄＤＯＧＫａｎｓ ｃＦｖＢ１８について１５μｓ／ｍｌのテトラサイクリンまたは３０μｇ　／　 ｓ　ｌのカナマイシン）２４時間成長させた。この培養からのファージを他のラ ウンドのアフィニティー選択および変異のために使用した。 ファージ抗体の結合を実施例９におけるようにＥＬＩＳＡによりアッセイしたが 、ただしＥＬＩＳＡプレートをＮＩＰ−ＢＳＡ（４−ヒトｏ＋　シー　３−ヨー ド−５−ニトロフェニルアセチル−ＢＳＡ；０．４■ｇ　／　ｍ　ｌ　）でコー ティングした。培養の上澄み液を実施例２１に記載するようにセルウェル（Ｃｅ ｌｌｗａｌｌ）中での増殖の後に調製し、そして２０μｌの培養の上澄み液をＭ ＰＢＳにより２００μＩに希釈して各ウェルに添加した。 バックグラウンドの２倍以上のシグナルをＥＬＩＳＡにおいて与えるファージ試 料を、上のようにしてＥＬＩＳＡにより、リゾチーム、ＢＳＡまたは０ｘ−ＢＳ Ａ（実施例９）に対する特異的結合について試験した。 さらに、ＮＩＰに対する特異性をＥＬＩＳＡにより確証し、ここでＮＩＰ−ＣＡ Ｐの系統的希釈物をファージ抗体と一緒に添加した。増加する濃度のＮＩＰ−Ｃ ＡＰの添加は、ＥＬＩＳＡのシグナルをバックグラウンドのレベルにまで減少し た。 ＢＬＩＳＡにおいて陽性のシグナルを与えるファージを配列決定し、そして２つ の異なる変異体をｐＨＥＮ１ファージミド中にサブクローニングし、そして可溶 性発現のためにＨＢ２１５１中に、そしてファージの表示のためにＴＧＩ中に形 質転換した（実施例２７）。 可溶性５ｅＦｖ断片の発現のために、大腸菌ＨＢ２１５１中の形質転換体を３７ °Ｃにおいて１リツトルの２　ＸＴＹ、　０．２％のグルコース、０．１　ｓａ ｇｌ調１のアンピシリンの中で００６００が１になるまで増殖させ、そしてＩＰ ＴＧを１＋＋Ｍに添加することによって可溶性５ｃＦｖ断片の発現を誘発した。 培養物を３０℃において１６時間震盪した。 可溶性５ｃＦｖＢ１８を粗製の細菌上澄み液からＦＬＯＷＧＥＮ限外濾過装置に おいて２００１の体積に濃縮した。 この濃縮物を、２００■ｌのＰＢＳで予備洗浄したＮＩＰ−ＢＳＡ−セファロー ズの２−１のカラムに２回通過させた。このカラムを５００１ｍｌのＰＢＳおよ び２００　ｍｌの０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）　、０．５Ｍ　ＮａＣ１ で洗浄し、そしてファージ抗体を５０ｍＭクエン酸塩緩衝液で溶出した。溶出液 をＩＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）で中和した。溶出液を１リツトルのＰＢＳ　、０．２ 　ｍＭ　ＥＤＴＡに対して２回の交換して透析した。沈澱したタンパク譬を１０ ０００　ｇで遠心することによって除去し、そして上澄み液の２８００■におけ る吸収を測定することによってタンパク質の収量を決定した。 ４ラウンドの変異および選択の後、分離されたクローンをスクリーニングし、そ して１または２つの希な例において、強く陽性のＥＬＩＳ＾シグナルが、Ｅｌ、 ＩＳＡにおいてｆｄｃＡＴ２ｓｃＦｖＢ１ＢおよびｆｄＤＯＧＫａｎｓｃＦν８ １８の各々の変異に由来するファージ抗体から得られた０強く陽性のＥＬＩＳ＾ シグナルを与えるこれらのファージ抗体を、更なるラウンドにおいて、およそ２ ．５倍／ラウンドだけ濃縮した。強く陽性のＥＬＩＳＡシグナルを与える４０の ファージの抗体を配列決定し、そしてそれらの各々は５ｃＦｖＢ１８のヌクレオ チド配列の中の６つの異なる位置において単一の変異を表示し、それらのうちの ５つはライト鎖の中に存在する。変異体の７０％より多くは位置７２４および７ ２５において起こり、ライト鎖のＪセグメントにおける最初のグリシン（フレー ムワーク４）をセリン（２１のケースにおいて）またはアスパラギン（３ケース において）に変化させた。見いだされた変異を表９に示す、　５ｃＦｖＢ１８の 配列を第４４図に示す。 上記のグリシンからセリンへの変異をもつフレームワークの変異体ならびにライ ト鎖のＣＤＲ３のＴｙｒがアスパラギン酸に変異した変異体のｓｃＦν断片をコ ードするヌクレオチド配列を、ファージ抗体のクローンからＰＣＲにより増幅し 、そしてｐＨＥＮ１ファージミド中にサブクローニングした（本質的に実施例２ ５におけるように）、これはミューチーター菌株により引き起こされる遺伝子Ｉ ＩＩの変異に伴う起こりうる問題を回避する。上記のようにファージゲノムから 発現される場合に変異がアッセイされるときのように、同一のＥＬＩＳＡシグナ ルのパターンは、ヘルパーファージによりファージミドがレスキエーされた（実 施例２５に記載するように）後、ファージ上に突然変異が表示される見られた。 ５ｃＦｖＢ１８からのｓｃＦν断片並びに、それぞれグリシン−セリンおよびチ ロシン−アスパラギン酸の変異を含有する５ｃＦｖ断片は５．３０°Ｃにおいて 溶液の中で発現された（実施例２７におけるように大腸菌ＨＢ２１５１の中に形 質転換された後）、それらは野生型８１８とフレームワーク変異体との間でＥＬ ＩＳＡシグナルの差を示さなかった。　５ｃＦｖＢ１８のＣＤＲ３中のＴｙｒが アスパラギン酸に変異したファージ抗体から得られたシグナルは約１０×強かっ た。発現の収量はｇ３１）に対してレイズされた抗血清を使用するウェスタンブ ロッティングにより判定して、匹敵することが見出された（前述したように）、 親和性の測定は、実施例２３に記載するように、蛍光クエンチングを使用して実 施した。 しかしながら、アフィニティー精製した５ｃＦｖ断片の親和性の測定は、５ｃＦ ｖＢ１８　、並びに５ｃＦｖＢ１８（Ｇｕｙ　−４Ｓａｒ）および５ｃＦｖ８１ ８（Ｔｙｒ　−＋Ａｓｐ）の変異体のすべてがＮＩＰ−ＣＰについて２０ｎＭの 匹敵する親和性を有することを示した。 坑道転子ＩＩＩ抗体を使用するウェスタンプロットは、フレームワーク変異体が ５ｃＦｖＢ１８より有意のタンパク質分解的切断に悩まされることを示した。 それゆえ、ミューチーター菌株の使用は、それらを遺伝子ＩＩＩ融合体のための クローンの宿主として使用するとき、ファージ抗体中に多様な範囲の変異を生ず る。この場合において、クローンのいくつかは、多分タンパク質分解的攻撃に対 する安定性の増加のために、より高いＥＬＩＳ＾シグナルを示す、したがって、 ミューチーター菌株を使用して、クローンまたはクローンの集団の中に多様性を 導入することができる。この多様性は、望ましい特性、例えば、より高い親和性 または特異性をもつクローンを発生するであろう０次いで、このようなりローン はファージ上のタンパク質の表示後に選択することができる。 ｍおよびｖＬ′メインの　此　ム・ＵによルハクーＬａｙ−ジの　上ｍ＝片３２ 犬Ｊｉ この実施例は、機能的Ｆν断片をＶｌｌおよびＶＬドメインの非共有結合的会合 によりバクテリオファージの表面上に発現することができることを示す、こうし て、Ｆｖ断片は、二重の組み合わせのライブラリー（実施例２６）を包含するＦ ａｂ断片について考察した方法のすべてのために使用することができる。 安定に会合したＦｖ断片のために有用な遺伝的選択系は、ファージ表面上に融合 タンパク質としてのＰｖ断片の発現が可能である場合に確立することができ、こ うして、一方の■ドメインをｇＩＩＩタンパク譬に融合し、そして他方の■ドメ インを別個に分泌された形態で発現し、相互作用の強さが十分に高い場合、それ は融合タンパク質上のＶドメインと会合する。この考えを、モデル実験において 、抗ニワトリ卵リゾチーム抗体Ｄ１，３がらのＶドメインを使用して、Ｄｌ、３ のＶＫ遺伝子を遺伝子用融合させそしてＤｌ、３のＶＨドメインを別々に発現さ せることによって試験した。 実験的に、これは次のようにして達成された：ベクターｆｄ−ｔｅｔを制限酵素 ＰｓｔＩおよびＸｈｏＩで消化した。　Ｆｖ発現プラスミドｐｓＷ１−ＶＦＩＤ ｌ、３ｍｙｃバージョン３　／ＰＬＩＣ１１９（Ｗａｒｄｅａ、　１９８９．前 掲）がら、Ｐｓｔｌ／Ｘｈｏｌ消化された制限断片を分離した。これはＶ）Ｉド メインコード配列（２つの停止コドンにより停止した”）　、ＶＫ遺伝子の発現 のためのリポソーム結合部位、ｐｅｌＢリーダー配列、およびフレームを合わせ てＶＫ遺伝子を包含するＶＨおよびＶＫ遺伝子の間のスペーサー領域を有する。 この断片を消化したｆｄ−ＤＯＧベクター中にクローニングして、構成体ｆｄ− ｔｅｔＦνＤ１．３を発生させた。第４５図におけるマツプに示すように、ジシ ストロニック（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ＶＨ／ＶＫ遺伝子転子Ｉ　ノオヘロン ハ遺伝子ＩＩＩのプロモーターから転写される；ｖＨドメインの分泌はｇｌｌｌ ｌｌｌタンバクーダーにより達成され、ＶＫ−遺伝子ＩＩＩの融合タンパク質の 分泌はｐｅｌＢのリーダー配列により達成される。対照の目的で、名称ｆｄ−ｔ ｅｔＦｖＤ１．３　（ΔＳ−３ｔｕｆｆｅｒ）をもつ第２構成体を、前述したよ うに、同様なレートによりをつくった：この構成体に使用されたＶＨはＶｌｌ　 ＣＤＲ３／ＦＲ４（７）接合部における５ｔｙｒ制限部位中ニ２００ｂｐの断片 の挿入を有し、こうしていくつかのインフレーム停止コドンによりＶＨが中断さ れる。従来の研究から知られているように、この挿入は、可溶性Ｆｖまたは一層 １ｊＦｖ断片としであるいは一本［Ｆｖ断片としてファージ表面上に発現すると き、Ｖ［Ｉ構造を破壊して抗原リゾチームへの結合を潰滅させる。この構成体を 対照として使用した。　ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、３　、ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、 ３　（ΔＳ−５ｔｕｆｆｅｒ）または−末鎖野生型対照としてのｆｄ−ｔｅｔＦ ｖＤｌ、３のプラスミドを有するτＧ１細菌を、液体培養地（１５μｇ／ｍｌの テトラサイクリンを含有する培地２ＸＴＹ）中で２４時間増殖させて、上澄み液 中にファージ粒子を産生させた。遠心により細菌細胞を除去した後、指数的に増 殖するＴＧＩ細胞を上澄み液の希釈物で再感染させ、そしてテトラサイクリンプ レート上でプレイティング後、テトラサイクリン耐性のコロニーを記録すること によって、上澄み液の中のファージの力価を決定した。達成された感染性ファー ジの力価は、−末鎖野生型対照ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤ１．３についてＩＸ　１０” 　ｔｅｔＲ形質導入単位／ｍｌおよびＦｖファージ構成体ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ 、３およびｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、３　（ΔＳ−５ｔｕｆｆｅｒ）について２　 Ｘｌ０１ｆ′ｔｅｔＲ形質導入単位／閤ｌであった。 ニワトリ卵リゾチームのＥＬＩＳＡを実施例２におけるように実施した。 結果を第４６図に示す、Ｆν構成体ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、３を有しかつ発現す る細菌から誘導されたファージは、固定化されたニワトリ卵リゾチームに結合し 、そしてファージの力価を考慮するとき、事実ｆｄ−ｔｅｔＦｖＤ１．３を有す る細菌により産生された一本１１Ｆｖを有するファージより明らかにすぐれる。 この反応の特異性および機能的Ｖ［（ドメインについての要件は、ｆｄ−ｔｅｔ ＦｖＤｌ、３　（ΔＳ−５ｔｕｆｆｅｒ）の対照により実証された。ここでｖＨ ドメインの破壊および次にＦｖ断片の会合の崩壊はりゾチームへの結合を排除す る。 Ｖｌ［／遺伝子ＩＩＩの融合タンパク質の予想される構造体の最後の対照として 、ウェスタンプロットを実施した。　ＰＥＧで２回順次の沈澱させることにより １００倍濃縮した２０μＩのファージ懸濁液を１０％の５０５−ＰＡＧＥゲルに 適用し、電気泳動的に分割し、次いで半乾燥のウェスタン転移装置（Ｈｏｅｆｅ ｒ）においてＰＶＤＦ膜（Ｉｗｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した 。フィルター上の残りの結合部位をＰＢＳ中３％のＢＳＡとのインキュベーショ ンによってブロックし、そしてｇｌｌｌｌｌｌタンバク出を１：１０００に希釈 したウサギ坑道転子ＩＩＩ抗血清と２時間インキュベージランし、ＰＢＳ　１０ ．１％のツイーン２０中で数回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ラット免疫 グロブリン抗体とインキュベージ１ンし、洗浄し、そして発色性基質のジアミノ ベンジジン／ＣｏＣＩｚ１０．０３％のＨ！Ｏ，で展開した。　Ｆｖファージｆ ｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、３は遺伝子ＩＩＩの融合タンパク質のバンドを生じ（デー タは示されていない）、これはｆｄ−ＤＯＧＩからの野生型ｇＩＩＩタンパク質 およびｆｄ−ｔｅｔＦｖＤｌ、３からの３ＣＦシー遺伝子ＩＩＩの融合タンパク 質に・ついて得られたバンドの間の中間であり、こうして遺伝子ＴＩＩの産生物 ｉｒ＋ｔ　ｈｅ　Ｆｖファージに共有結合的に融合した単一の免疫グロブリンの ドメインの存在が証明される。 要約すると、一方のＶドメインがｇｌｌＩタンパク譬に融合し、そして他方のＶ ドメインが非共存結合的に会合するＦｖ−遺伝子ＩＩＮ融合体を、機能的に活性 な形態でフィラメント状ファージの表面上に掲示することができる。これは、フ ァージ中に発現された■遺伝子のライブラリーから、定められた結合特異性をも つ安定に会合したＦν断片を遺伝的に選択する可能性を開く。 ４０、　Ｆａｂ　としてのヒト■二ｌ仇ぞ夙上工ｌのクローニングのＰＧＩ１に 　づ　′ この実施例は、ヘビー饋およびライト鎖のＤＮＡを「リンカ−Ｊ　［ｌＮＡの別 の片と一緒にスプライシングによりヒトＦａｂを「アセンブリング」するＰＣＲ に基づく技術を記載する。この技術をすべてのヒトＶ−遺伝子に適用可能とする 汎用プライマーの混合物を使用する。 Ｆａｂ構成体をつくるヒトＶ−遺伝子のＰＣＲアセンブリーのための一般の技術 を記載する。この技術の効率を、ＩｇＧ−にモノクローナルハイブリドーマから ヒト抗しスス（ｒｈｅｓｕｓ）−〇（Ｒｈ−Ｄ）Ｆａｂを「アセンブリング」、 クローニングおよび発現することによって評価した。 われわれはまた、ポリクローナルリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）からＩｇＧ−ラム ダモノクローナル抗−Ｒｈ−Ｄ　Ｆａｂをアセンブリングし、クローニングし、 発現および分離することによって、ポリクローナル細胞の集団からヒトモノクロ ーナル抗体を、レスキューする可能性を実証する。 ＰＣＲアセンブリーのための全体の方法は第４７図に示し、そして下に一層詳細 に記載する。Ｆａｂアセンブリーのために、ＶＨ−Ｃ旧およびＶＫ−ＣＫまたは ■ラムダーＣラムダのライト鎖を第１１ｃＤＮＡから増幅し、そしてゲル精製し た９次いで、ヘビー鎖およびライト鎖のＤＮＡを、新しいＰＣＲ反応において、 リンカ−ＤＮＡおよびフランキングオリゴヌクレオチドと一緒に組み合わせる。 これは全長Ｆａｂ構成体を生ずる。なぜなら、リンカ−ＤＮＡの５′末端はＣＨ Ｉ　ドメインの３′末端に対して相補的であり、そしてリンカ−の３′末端はラ イト鎖ドメインの５′末端に対して相補的であるからである。リンカ−ＤＮＡは ヒトＣＨＩドメインの末端の残基、ライト鎖のための細菌リーダー配列（ｐｅｌ Ｂ）およびｖＫまたはＶラムダライト鎖の最初の残基を含有する（第２図）、最 後に、ゲル精製後、Ｆａｂ構成体をクローニングのための制限部位を含有するフ ランキングオリゴヌクレオチドテ再増幅する。 ｔ１ユ困久乞主土上■工旦エユユ：ヒトｖ遺伝子のＰＣＲクローニングを開発す るために、新しい一連のヒト特異的オリゴヌクレオチドブライマーを設計するこ とが必要であった。 Ｖ）ＩおよびＶＫの５′末端におけるＰＣＲプライマーおよびＶラムダ遺伝子の エクソン（ＢＡＣにプライマー）はカバット（Ｋａｂａｔ）データベース（にａ ｂａｔ、Ｅ、Ａ、ら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉ ａｓ＋ｕｎｏｌｏＨｉｃａｌ　Ｉｎｔ−ｅｌ”ｅＳＬ第４版、ＵＳ　Ｄｅｐａｒ ｔｍｅｎｔ　ｏｆ　）ｌｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ、１ ９８７）、ＥＭＬデータベース、文献（Ｃｈｕｃｈａｎａ、　Ｐ、ら、Ｅｕｒ、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０＋　２０：１３１７）から抽出した配列のデータ および未発表のデータに基づく。 νＨ，ＶＫおよび■ラムダのプライマーの配列を表１に記載する。さらに、５′ 末端に５ｆｉＩ部位をもつ伸長したＶｌｌプライマーもまた、アセンブリー後に 制限部位を付加するために設計した（表１０）。 表１０はまた、ヒト■遺伝子のＰＣＲに基づくクローニングのために設計した３ ′プライマー（ＦＯＲＷＡＲＤプライマー）を示す、　ＦａｂまたはｓｃＦνの いずれを産生ずるかに依存してこれらの２組が存在する。Ｆａｂアセンブリーに ついて、フォワードブライマーはｃＨｌ　ドメイン、ｆＪドメインおよびＣラム ダドメインの３′末端に基づいた。さらに、ＧＫおよびＣ２Ｆ０［１ＷＡＲＩ） プライマーもまた、それらの５′末端にＮｏｔ１部位をもつ拡張されたバージョ ンとして合成した。 Ｃ旧フォワードプライマー並びにＶｋｋおよび■ラムダバックプライマーに対し て相補的なプライマーを、Ｆａｂ　リンカ−を含有するプラスミド鋳型のＰＣＲ 増幅により合成して、リンカ−ＤＮＡの発生を可能にした（表１０）、適切な増 幅を保証するために、プライマーを実際のリンカ−配列の中に伸長した。 人」旦皇貞Ｉ これは実施例１４に記載されているものと本質的に同一であるが、ヒト由来の材 料を使用する。この実施例に記載する結果において、ヒトハイプリドーマおよび ヒトポリクローナルリンパ芽球細胞系を使用した。 旦■墜ト膿１に ２０μｌの水中で約４μｇの全ＲＮＡを６５℃にて３分間加熱し、氷上で急冷し 、そして３０μｌの反応混合に添加して、１４０　ｍＭ　ＫＣＩ、５０ｍＭＴｒ ｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，１，４２℃）　、８　ｓＭ　ＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭのＤ ＴＴ　、　５００　ｍＭデオキシグアノシントリホスフェート、８０単位のヒト 胎盤１？Ｎアーゼ阻害因子および１０ピコモルの適当なフォワードブライマー（ ）ｌｕｌｇＧｌ−４ｃＨＩＦＯＲ，ＨｕｌｇＭＦＯＲ，ｌ１ｕＣＫＦＯＲ，Ｈｕ ＣＬＦＯＲ）を含有する５０μｍの反応混合物を生成させた。２μｌ　（５０単 位）のトリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を添加し、反応混合物を４ ２゛Ｃにおいて１時間インキユヘーションし、１００℃に３分間加熱し、氷上で 急冷し、そして５分間遠−次ＰＣｔ？の増幅のため、適当なファミリーに基づ（ ＢＡＣＫおよびＦＯＲＷＡＲＤプライマーの等モルの混合物を使用した。（この 実施例において後に記載する特定の実施例４０ａおよび４０ｂを参照のこと）。 ５０μｍの反応混合物を調製した。これは５μｌのｃＤＮＡ合成からのと澄み液 、２０ピコモルの合計の濃度のＦＯＲＷＡＲＤプライマー、２５０μＭｄＮＴＰ 、５０ｍＭ　ＫＣＬ　１００　ｍＭ　丁ｒｉｓ　ＨＣＩ（ｐＨ８，３）、　１． ５　ｍＭ　ＭｇＣｈ、１７５μｇ／園１のＢＳＡおよび１μｌ（５単位）のサー マス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）　ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ、カリフォルニア州エメリヴイレ）を含有した。この 反応混合物をパラフィン油でカバーし、そしてテクネ（Ｔｅｃｈｎｅ）サーマル サイクラ−を使用して３゜サイクルの増幅にかけた。このサイクルは９４℃で１ 分間（変性）、５７°Ｃで１分間（アニーリング）および７２℃で１分間（伸長 ）であった、産生物５μｍを２％のアガロースゲル上で展開することによって１ した。残部をエーテルで２回、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノ ール沈澱させ、そして５０μｍのＨＪ中に再懸濁させた。 旦去乙丸二Δ渥Ｉ Ｆａｂリンカ−ＤＮＡをつくるために、１３の別々のＰＣＲ反応を、ＨｕｌｇＧ ｌ−４Ｃ）ＩＩＦＯＩ？および逆νＫまたはＶラムダオリゴヌクレオチドの各々 を使用して実施した。鋳型は約１ｒ＋ｇのｐＪＭ−ＩＦａｂＤｌ、３　（第４８ 図）であった。 ＰＣＲ反応の試薬は前述した通りであり、そしてサイクルは９４’７１分、４５ °　：１分および７２°　：１分であった。リンカ−を４％のアガロースゲル上 で分析し、２％のアガロースゲルで精製し、スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘカラムのゲ ルから溶出し、そしてエタノール沈澱させた。 Ｅアセンブｌ ヒトＦａｂのＰＣＲアセンブリーのために、１μｇの一次ヘビー鎖の増幅物およ び１μＩの一次うイト饋の増幅物をプライマーを含まないＰｃｔ？混合物中の２ ５０ｎｇの適当なリンカ−ＤＮＡと混合し、７回（９４”　：２分、７２°：２ ．５分）サイクリングして断片を連結した。次いで、反応混合物を、２５ピコモ ルの適当なフランキングＢＡＣ）（およびＦＯｌｉＷＡＲ［ｌプライマーの添加 後、２５サイクル（９４°　：１分、６８°〜７２”：１分、７２°　：２．５ 分）増幅した。 Ｌ！■里址皇仕皿 アセンブリングした産生物をゲル精製し、そして追加された制限部位を含有する フランキングオリゴヌクレオチドを使用して２５サイクル（９４°　：１分、５ ５°　：１分、７２°　：２３分）にわたり再増幅した。 ＰＣＲ＠液液およびＮＴＰは前述した通りであった。 クローナル抗１？ｈ−Ｄ細胞系Ｆｏｇ−１（１ｇＧ４）を、ｌ１ｈ−Ｄ陽性の血 液で免疫化したＲｈ−Ｄ陰性の血液ドナーのＰＢＬのＥＢＶ形質転換から誘導し 、そしてこれは従来記載されている（Ｍｅｌａｍｉｄ、阿、Ｄ、ら、Ｉｓｉ＋ｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９８７，１０４：１０４：２４５）（ Ｈｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓ　Ｎ、Ｃ，ら、　Ｂｉｏｃｈｅｓｊ、１９９０゜２６ ８：１３５）　（Ｇｏｒｉｃｋ、　、Ｂ、Ｄ、ら、Ｖｏｘ、Ｓａｎｇ、１９８８ ，５５：１６５）　、全ＲＮＡを約１０７のハイプリドーマ細胞から調製した。 第１鎖ｃＤＮＡの合成は、前述したように、プライマー１１ｕ２ｇＧｌ−４Ｃ旧 ＦＯＲおよびＨｕＣＫＦＯＲを使用して実施した。−次ｐｃｇは、Ｖ［Ｉ−Ｃ旧 について６ＨｕＶＨＢＡＣＫプライマーとＨｕｌｇＧｌ−４ＣＧＩＦＯＲとの混 合物を使用し、そしてＶＫ−ＣＫについて６ＨｕＶＫＢＡＩＪプライマーとｔｌ ｕｃＫＦＯＲとの混合物を使用して実施した。　Ｆａｂ構成体は前述したように アセンブリングし、５ｆｉＩおよびＮｏｔｌで制限酵素処理し、ゲル精製し、そ して５ｆｉｌおよびＮｏｔｌで制限酵素処理したｐＪＭ−ＩＦａｂＤｌ、３中に 連結した。この連結混合物を使用してコンピテント大腸菌Ｅ、Ｍ、Ｇ、細胞を形 質転換した。９６クローンをつまようじでマイクロタイタープレートのウェル中 に入れ、３０℃において対数中期まで増殖させ、次いでＦａｂの発現を４２℃に おける加熱ショックにより誘発させ、次いで３７℃において４時間増殖させた０ 次いで、９６のクローンを抗Ｒｈ−Ｄ活性について後述するようにスクリーニン グした。 ｂ　ボテクロー　ル（ＬＣＬ）か°のヒトＦａｂのアセンブリー：ポリクローナ ルＬＣＬ　ｒＯＧＪを、Ｉ？ｈ−Ｄ陽性の赤血球で免疫化したＲｈ−〇陰性のド ナーからの約１０？の末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）のＥＢＰ形賀転換から誘導し た。細胞を約１０’細胞／ウエルの濃度でプレイティングした。収穫した細胞を スクリーニングすることによって陽性つエルを同定し、次いで１回サブクローニ ングした。ウェルのタイプ分けはＩｇＧ−ラムダ抗体が産生されていることを示 した。この段階において、全ＲＮＡを約ｌｏ−ウェルから調製した。第１鎖ｃＤ Ｎへの合成を、前述したように、プライ７−ＨｕｌｇＧｌ−４ＣＧＩＦＯＲおよ びＨｕＣＬＦＯＲを使用して実施した。−次ＰＣＲハ、Ｖｌ’１−ＣＩＩＮＣつ ＆’　テロＨｕＶｌｌＢＡｃＫ２７”　ライ７−とＨｕｌｇＧｌ　４ＣＧＩＦＯ Ｒとの混合物を使用し、そして■ラムダーＣラムダについて７ＨｕＶＩ［ＢＡＣ にプライマーとＨｕＣＦＯＲとの混合物を使用して実施した。制限酵素処理クロ ーニングおよびスクリーニングは前記のように進行させた。クローンの多様性を 決定するために、１５クローンの％ｌＩおよびＶラムダ遺伝子をＰｃｔ？増幅し 、頻繁に切断する制限酵素ＢａｔＮＩで制限し、そして４％のアガロースゲルで 分析した（実施例２０参照）。 Ｒｈ−０゛ニツイテ（１）７−　セイおよび　ノｗ：　Ｒｈ−Ｄ陽性（ＯＲ２Ｒ ２）またはＲｈ−Ｄ陰性（Ｏｒｒ）の赤血球のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ、　ｐＨ ７，３）中６％（ｖ　／　ｖ　）懸濁液を、パパイン溶液と共に３７℃において １０分間インキュベーションした。赤血球をＰＢＳ中で３回洗浄し、そして赤血 球の１％（ｖ　／　ｖ　）懸濁液を１％（Ｖ／Ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ）を補充したＰＢＳ中で構成した。５０ｕＩのパパイン処理した赤血球懸濁液 および５０μｍのファージ上澄み液を丸底マイクロタイタープレートのウェルの 中に入れ、そしてプレートをタイターチクのプレート震盪器上に２分間配置した 。３７°Ｃにおいて１５分間インキュベーションした後、プレートを２００　ｇ で１分間遠心し、そして上澄み液を廃棄した。赤血球を残りのＰＢＳ　／ＢＳＡ 中に再懸濁させ、そしてｍｙｃペプチド標ｍ（Ｗａｒｄ、Ｅ、Ｓ、ら、Ｎａｔｕ ｒｅ　１９８９　、前掲）に対して向けられた９Ｅ１０モノクローナル抗体（ペ ルオキシダーゼ／ＢＳＡ中のＩｕｇ／ｍｌの溶液）の添加により架橋した。プレ ートを室温（ＲＴ）において、沈降が起こるまで１いた。赤血球の凝集は赤血球 の拡散ボタン（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｂｕｔｔｏｎ）を引き起こし、そして結果を顕 微鏡的に評価した。すべての臨床的に関係する赤血球の血液群同種抗原のホモ接 合性発現を有することが知られているＰＢＳ中の９赤血球の懸濁液（すべての懸 濁液、群０．４Ｄ陽性および５Ｄ陰性）の標準的前パパイン化した（上のように して）パネルにより、特異性を確認した。 Ｄ陽性細胞上のＤ抗原のコピー数は、Ｒｈの遺伝子型に依存して１０，０００〜 ２０．０００／赤血球の間で変化した。簡単に述べると、２％（ｖ　／　ｖ　） のスキムミルクを補充したＰＢＡ中の５μｌのファージ上澄み液をガラス管中の ＰＢＡ中５０μｌの２％の赤血球の懸濁液と混合し、そして３７℃において１５ 分間インキュベーションした。　ＰＢＳ　／ＢＳＡで１回洗浄した後、赤血球を 沈澱させ、そして５０μｌのロバ抗ヒトラムダライトＩＩ（Ｓｉｇｍａ　１９５ ２７、ＰＢＳ　／ＢＳＡの中で１：４０に希釈した）中に再懸濁させた。管を２ ００ｇで１分間遠心し、そして凝集を顕微鏡に「チップ・アンド・ロール」法を 使用して読んだ。 結果 ａ　ヒトバイブ１　ドーマか“のＦａｂのＰＣＲアセンプＬ−；正しい大きさの 単一のバンドが増幅後に得られた。スクリーニングした９６のクローンのうちの ３８　（４０％）はＲｈ−Ｄ陽性の赤血球を特異的に凝集したが、Ｒｈ−Ｄ陰性 赤血球を凝集しなかった。結果は、アセンブリー法における首尾よいスプライシ ングの高い頻度およびヒトハイブリドーマの１工程のクローニングのこの技術の 可能性を実証する。 ｂ　ポ１クロー　ルリンパ　、（ＬＣＬ）１゛のヒトＦａｂのアセンブリー：ク ローンの多様性の分析は、３つの異なるヘビー鎖のファミリーおよび２つの異な るライト鎖のファミリーが存在ごとを示した。５つの抗Ｒｈ−Ｄ特異的クローン が９６のスクリーニングしたクローンのうちから同定された。　ＶＨおよび■λ 鎖は各クローンにおいて同一のヌクレオチド配列を有し、そして抗Ｒｈ−ＤのＶ 遺伝子に典型的なものであった（発表しない結果）、結果は、クローンをアセン ブリングし、そしてポリクローナル細胞集団からヒト抗体断片を分離するための 、この技術の可能性を実証する（「免疫化しない」ヒトライブラリーからの特異 的結合活性の分離についての節（実施例４２および４３も参照のこと）。 夫施舅４１．レスヌＪ社朋−リ）Ｄ　をそれらの　上に　７　る仝９１ｊ１ンし ；ζ臣よユ１、レススＤ　に６１シて０旦ｊｄ口「

【上Ｆａｂ　ス　る７ｕ尺 多数の重要な抗原は細胞表面の膜の一体の成分である、すなわち、それらは細胞 表面抗原である。それらは腫瘍特異抗原、赤血球および白血球の細胞表面抗原を 包含する。多くの場合において、これらの抗原に対する抗体を分離することは重 要である０例えば、赤血球上のレスス（Ｒｈｅｓｕｓ）Ｄ（Ｒｈ−Ｄ）抗原に対 して向けられた抗体は、診断的および療法的の両者の場合において使用される。 これらの抗原の多くは精製が困難であり、そしであるものは、Ｒｈ−Ｄに似て、 膜から分離されたとき生物学的に活性でない。こうして、細胞表面抗原上で直接 にバクテリオファージの表面上に表示された抗体断片をアフィニティー精製する ことは有用であろう、細胞表面抗原上でのアフィニティー精製の可能性を試験す るために、抗Ｒｈ−Ｄヒトモノクローナル抗体Ｆｏｇ−Ｂをバクテリオファージ ｆｄの表面上にＦａｂ断片として表示させた。表示されたＦｏｇ−ＢのＦａｂ断 片は凝集アッセイにより決定した場合に抗原に結合し、そしてＲｈ−Ｄ陽性の赤 血球の表面上のその結合に基づいてアフィニティー精製することができるが、１ ｉｈ−Ｄ陰性の赤血球では不可能であった。 林打方λμ方店− ファージミドｐＨＥＮｌ中の抗Ｒｈ−ＤのＦａｂ断片をコー・ドするクローンの 構成およびバクテリオファージｆｄの表面上のＦａｂ断片の表示ヒトバイブリド −７Ｆｏｇ−８は従来記載された（Ｎ、Ｃ，Ｈｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、Ｊ、２６８１３５（１９９０）　、それは［ｌｈ−［１抗原に結合 するＩｇＧ−１／ラムダ抗原を産生ずる。　ＲＮＡを１０７のハイブリドーマ細 胞からカサラ（Ｃａｔｈａｌａ）の変法により（実施例１４に記載されているよ うに）、そして第１鎖ｃＤＮＡを、実施例１４に記載するように特異的免疫グロ ブ　′リンのヘビー鎖およびライト鎖のプライマー（ＨｕＶ［ＩＩＦＯＲ［実施 例４０］およびＨｕＣλＦＯＲ（５’　−ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　Ａ ＡＧ　ＡＴＴ　ＣＴＧ　ＴＡＧ　ＧＧＧ　ＣＣＡＣ−３’　））を使用して合成 した。引き続いてＶｌｌ遺伝子第１鎖ｃＤＮＡのアリコートからＨｕＶＨ４ａＢ ＡＣＫおよびＨｕＶＨＩＦＯＲを使用して増幅した。■λｉｌ伝子ヲ転子ｇ−Ｂ 　対し　テ特ｌ−的なりλブライ？−（ＩｌλＦｏｇ−８，５’　−ＡＡＣＣＡ Ｇ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＣＣＡＧＴ　ＣＴＧ　ＴＧＴ　ＴＧＡ　ＣＧＣＡＧＡ　Ｃ −３’　）を使用して増幅した。　ＰＣ）ｉの条件は実施例４０に記載する通り であった。　ＰＣＲ産生物を２％のアガロースゲル上で５μｌを展開することに よって分析した。残部をエーテルで２回、フェノール／クロロホルムで２回抽出 し、エタノール沈澱させ、そして５０μｌのＨ，Ｏの中に再懸濁させた。 増幅したＶＨのＤＮＡを、順次に、ＰｓｔｌおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、そし て増幅した■λ−ＣλのＤＮＡをＮｃｏｌおよびＥｅｏＲＩで消化した。断片を ２％のアガロースゲル上で精製し、シーンクリーンを使用して抽出し、そして可 溶性発現ベクターｐＪＭ−Ｉ　Ｆａｂ　０１．３の中に連結した（第４８図）。 正しい挿入部を含有するクローンを最初に制限分析により同定し、そして発現さ れた可溶性Ｆａｂのアッセイにより評価した（誘発条件については実施例２３を 参照のこと）　、　Ｆｏｇ−Ｂ　Ｆａｂカセットを、ｐＪＭ−１から、ＰＣＲに よりＨｕＶＨ４ＢＡＣＫ−５ｆ　ｉおよびＨｕＣλ−Ｎｏｔを使用して増幅し、 適当な制限酵素で消化し、そしてｐｉ（ＥＮＩＯ中に結合した。正しい挿入部を 含有するクローンを最初に制限分析により、引き続いてアッセイにより同定した （誘発条件については実施例２５を参照のこと）。 可溶性Ｆｏｇ−Ｂ　Ｆａｂ断片およびファージに表示されたＦｏｇ−Ｂ　Ｆａｂ 断片の抗Ｒｈ−Ｄ活性についてのアッセイおよび特異性の記載発現された可溶性 のＦａｂのアッセイを濃縮しない大腸菌の上澄み液について実施した。ファージ 表面上に表示されたＦｏｇ−８のアッセイを、ＰＥＧ沈澱により１０倍に１ｌｉ ｌｉシ、次いでＰＢＳの中に再懸濁させたファージについて実施した。活性およ び特異性についてのアッセイは実施例に記載されている通りである。 Ｆｏｇ−Ｂ抗Ｒｈ−ＤのＦａｂ断片の細胞表面アフィニティー精製精製したＦｏ ｇ−８フアージを、抗リゾチーム５ｃＦｖＤ１．３（ｐＡｂＤｌ、３）を表示す る精製したファージＦｄ−Ｔｅｔ　ＣＡＴ−１と、はぼＩＦｏｇ−Ｂ：５０ｓｃ ＦｖＤ１．３の比で混合した。前取てパパイン化した赤血球（ＯＲ２Ｒ２（レス ス陽性〕または叶ｒ　〔レスス陰性〕）を、２％のスキムミルク粉末を補充した ＰＢＳの中に４　ＸＩＯ’　／ｍｌの濃度に懸濁させた。この懸濁液１ｍｌを、 ２％のスキムミルクを補充した２１のＰＢＳＯ中に懸濁されたＩＱｌｌのファー ジと混合し、そして室温において連続的条件下に３０分間インキュベーションし た。赤血球を過剰の水冷したＰＢＳ（１０ｎ＋１／洗浄）で３回洗浄し、引き続 いて沈澱させた。２００μｍのＰＢＳ中７６５１Ｍクエン酸（ｐＨ２，８）中に １分間再懸濁させることによってファージを細胞から溶出した９次いで、細胞を ３００Ｏｒｐｍで１分間遠心することによって沈澱させ、そして溶出されたファ ージを含有する上澄み液を２００　ｕ　ｌの１％ｗ　／　ｖのアルブミン中２４ ０　ｍＭ　トリス−塩基、２２ＩＩＩＭリン酸水素二ナトリウムを添加すること によって中和した。溶出液の系統的希釈を使用してＴＧＩ細胞を感染させた。Ｆ ｏｇ−Ｂ　Ｆａｂファージをアンピシリンプレート上で、そして５ｃＦｖＤ１． ３フアージをテトラサイクリンプレート上で選択し、そして各々の力価を選択前 に、並びにレススＤ陰性細胞上での選択後およびレススＤ陽性細胞上での選択後 に決定した。 ■ ファージミドｐＨＥＮクローンから誘導されたファージの表面上に表示されたＦ ｏｇ−ＢのＦａｂ断片は、レススＤ陽性の赤血球を特異的に凝集したが、レスス Ｄ陰性赤血球を凝集しなかった。　Ｉ？ｈ−Ｄ陽性の赤血球上のＦｏｇ−ＩＦａ ｂファージミドのアフィニティー精製は１：５ｏがら１５００：１への濃縮を生 じた（Ｆｏｇ−Ｂ　Ｆａｂ：５ｃＦｖＤ１．３）が、Ｒｈ−Ｄ陰性の赤血球上の 精製は濃縮を本質的に示さなかった（１０倍）。 選択前　１．０ｘｌＯ’　５．ＯｘｌＯ”　１：５０Ｒｈ−１１陰性細胞で上の 選択２．０Ｘ１０’　１．ＯＸＩＯ’　１：５Ｒｈ−Ｄ陽性細胞で上の選択６． ０Ｘ１０”　４．ＯＸＩＯ’　１５００：１４２、ヒ）　ｓｃＦν　の１工　タ ！ローニン勿ｑｋ美！伊並−泣ｌユ左荻癒 ヒト５ｃＦｖのアセンブリーは、実施例１４に記載するマウス５ｃＦｖのアセン ブリーに類似する。ヒトＶ遺伝子のＰＣＲクローニングを開発するために、新し い一連のヒト特異的オリゴヌクレオチドのプライマーを設計することが必要であ った（表１０）。ヒトＦａｂの発生のためのこれらのプライマーの使用は、実施 例４０に記載されている。ヒト５ｃＦｖのアセンブリーは本質的に同一であるが 、ｖｎ　、ＶＫおよび■ラムダの遺伝子のＪセグメントに対して相補的なＦＯＲ ＷＡＲＤプライマーの組を必要とする＊　（Ｆａｂについて、定常領域に対して 相補的なＦＯＲＷＩＩＲＤプライマーを使用する。）Ｊセグメント特異的プライ マーは、発表されたＪＨ，ＪＫおよびＪラムダの配列に基づいて設計した（Ｋａ ｂａｔ、　Ｅ、Ａ。 ら、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉ＋ｗｍｕｎｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ＋第４版、ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　 Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅ、１９８７）　＊さらに、 ｓｃＦνのためにＦａｂについてと異なるリンカ−が必要であるので、ヒト５ｃ Ｆｖのために、リンカ−の調製のために新たな組のプライマーが必要であった。 ＪＨフォワードブライマーに対して相補的なプライマー並びにνにおよび■ラム ダバックプライマーを、５ｅＰｖ　’Ｊンカーを含有するプラスミド鋳型のＰＣ Ｒ増幅により合成して、リンカ−ＤＮＡの生成を可能とした（表１０、第４９図 ）、適切な増幅を保証するために、プライマーを寞際のリンカ−の配列の中に伸 長させた。 これらのプライマーを使用してｓｃＦシリンカーＤＮＡをつくるとき、４つの逆 Ｊｌｌプライマーの各々を１３の逆ＶＫおよびＶラムダのオリゴヌクレオチドの 各々と組み合わせて使用して、５２の別々のＰＣＲ反応を実施した。鋳型は約ｌ μｇの短いペプチド（Ｇ１ｙ４Ｓｅｒ）３（ＨｕｓｔｏｎＪ、Ｓ、　ら、Ｇｅｎ ｅ　１９Ｂ９．７７：６１）を含有するｐｓＷ２ｓｃＤ１．３（Ｗａｒｄ、Ｅ、 Ｓ、１９８９前掲）であった。 八−去」１ば鴎ヒ仁濾九火二Δ匹しヱ土ｙ！］ニゴｌＩ【（社）（ｌ桝この実施 例は、免疫化しないヒトからの５ｃＦｖのヒトライブラリーの形成を記載する： ５００　ｍｌの約１０１のＢ細胞を含有する血液を、健康なボランティアの血液 ドナーから入手した。白血球をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）上で分離し、そして ＲＮＡを実施例１４に記載するように調製した。 約２Ｘ１０’のＢ細胞からの遺伝物質を含有するＲＮＡの２０％を、実施例４０ に記載するようにｃＤＮＡの調製のために使用した。ＩｇＧおよびＩｇ？Ｉ抗体 に由来するヘビー鎖は、ＩｇＧ特異的プライマー（ＨｕｌｇＧｌ−４Ｃ）１１Ｆ ＯＲ）または１ｇＭ特異的プライマー（ＨｕＩｇＭＦＯＲ）でｃＤＮＡの合成を ブライミングすることによって別々に保持された。　ｃＤＮＡのアリコートを、 実施例４０に記載するように使用して、４つの別々の５ｃＦｖライブラリー（Ｉ ｇＧ−に、　ＩｇＧ−ラムダ、ＩｇＭ−におよびＩｇＭ−ラムダ）を発生させた 。生ずるライブラリーを１．５％のアガロース上で精製し、電気溶出し、そして エタノール沈澱させた。引き続くクローニングのために、Ｋおよびラムダ粒子を 組み合わせて、別々のＩｇＧおよびＩｇＭのライブラリー形成した。 −ｉイニ乙う巳し工！Ｌ色！二重丑ユ白乙：精製した５ｃＦｖ断片（１〜４μｇ ）を制限酵素Ｎｏｔｌおよび５ｆｉｌまたはＮｏｔｌで消化した。消化後、断片 をフェノール／クロロホルムで抽出しそしてエタノール沈澱させた。消化した断 片を、５ｆｉ１−ＮｏｔＩまたはＮｏｔｌ−ＮｏｔＩ消化し、ア１ｏ−ｘゲル電 気泳動精製したｐＨＥＮＩ　ＤＮＡ（６μｇ）（実施例２４参照）中に、２．０ ０００の７４ＤＮＡ　リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を 使用する１００　ｕ　ｌの連結混合物中で室温において一夜連結した。連結混合 物をフェノール抽出により精製し、そしてエタノール沈澱させた。連結されたＤ ＮＡを１０μｌの水中に再懸濁させ、そして２．５μＩの試料を大腸菌ＴＧＩ（ ５０μｌ）中にエレクトロポレイシヨンした。細胞を１＋ｅｌのＳＯＣの中で１ 時間増殖させ、次いで２４３　Ｘ２４３　ｍ−の皿（Ｎｕｎｅ）中１００μｇ／ ｌのアンピシリンおよび１％のグルコース（ＡＭＰ−ＧＬυ）を有する２×ＴＹ 培地上にプレイティングした。−夜の増殖の後、クローンをプレートからこすり 落としてＡＭＰ−ＧＬＬＩおよび１５％のグリセロールを含有する１０ｍ１の２ ＸＴＹの中に入れ、ライブラリーのストックとして一７０°Ｃで貯蔵した。 ５ｆｉＩ−ＮｏｔｌおよびＮｏｔｌ−Ｎｏｔｌ消化したｐＨＥＮＩ中へのクロー ニングは、それぞれ、ＩｇＭのライブラリーについて１０’および２Ｘ１０’ク ローンおよび２つのＩｇＧのライブラリーの各々について約５Ｘ１０’クローン のライブラリーを生じた。 ４３、シないヒトか゛の５ｃＦｖの一イブーリー）゛の　ム亙二公立星 ファージの表面上に表示されたヒト抗体のライブラリーから結合活性を選択する 能力は、ネズミのライブラリーからの結合活性の分離より、なおいっそう重要で あることが明らかである。なぜなら、ハイプリドーマ技術を経て抗体を発生させ る標準的方法は、マウスでは達成されたがヒト抗体では成功しなかったからであ る。ある場合において、免疫化されたヒトからライブラリーをつくることが可能 であるが、多（の場合において、毒性または適当な免疫源の入手可能性の欠如ま たは倫理的考慮のために、免疫化が可能でないことが明らかであろう、あるいは 、結合活性は病気をもつ個体からつくられたライブラリーから分離することがで き、ここでは治療学的抗体が免疫応答により発生させられる。しかしながら、多 くの場合において、抗体産生細胞は肺臓の中に位！し、そして末梢血液のリンパ 球（ライブラリーの発生のために最も容易にアクセス可能な材料）の循環するプ ールにおいて入手可能でないであろう、さらに、免疫抑制に関連する病気におい ては治療学的抗体を産生ずることができない。 別のアプローチは、免疫化しない個体からつくられたライブラリーから結合活性 を分離することであろう、このアプローチは、１０’の異なる抗体の一次レパー トリーが１０’　１モルまたはそれ以上の親和性定数をもつエピトープの９９％ 以上を認識するであろうという推定に基づ（。（Ｐｅｗｒｅｌｓｏｎ、Ａ、Ｓ、 Ｉｓｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、（１９８９）１１０：５）　＊　これは高い親和性の 抗体を産生じないであろうが、親和性は■遺伝子を変異することによって、およ び／またはライト鎖のライブラリーを使用する階層的アプローチにおいて分離さ れたＶＨドメインを使用する（またはその逆）ことによって促進することができ る。この節において、免疫化しないヒトからの５ｃＦｖのライブラリーから３つ の異なる抗原に対して特異的な抗原結合活性を分離することによって、このアプ ローチが可能であることをわれわれは実証する。 林料胞未墾力抜 この実施態様に記載する結合活性の分離に使用するヒ）　ｓｃＦシライブラリ− の発生は、実施例４２に詳細に記載されている。 との−イブー奪−および　Ｊ込うΔｊ］Ｊ：９多３ヱ９−進足：選択の前後に、 組み換えクローンをスクリーニングし、プライマーＬＭＢ３　（これはｐｅｌＢ リーダー配列の５′に位置し、そしてｐＵｃ１９の逆配列決定プライマー（−４ ０ｎ）と同一である）およびｆｄ−５ＥＱＩ（実施例３７参照）を使用するＰＣ Ｒ（実施例２０）により選択を実施し、次いで頻繁に切断する酵素ＢｓｔＮ１で 消化する。各非選択のライブラリーからの４８のクローンの分析はクローンの９ ０％がインセット（ｉｎｓｅｔ）を有することを示し、そしてライブラリーは、 ＢｓｔＮ１制限パターンにより判定され、極端に多様性であるように思われた。 ゛　のためのファージミドの一イプーリーのレスキュー：ライブラリーからファ ージミドの粒子をレスキューするために、ＡＭＰ−ＧＬＵを含有する１００　ｍ ｌの２ＸＴＹ（実施例４２参照）にライブラリー（実施例４２においてｇ４製し た）（約ｌＯμＩ）から取った１０”の細菌を接種し、そしてこれを３７℃にお いて震盪しながら１．５時間増殖させた。細胞を回転して沈降させ（ＩＥＣ−遠 心機、４Ｋ、１５分）そして１００■ｌの前取て加温した（３７℃）　２　ＸＴ Ｙ−ＡＭＰ（実施例４１参照）培地中に再懸濁させ、２　ＸＩＯ”ｐｆｕのＶＣ ５−Ｍ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）粒子を添加し、そして震盪しないで３７℃ において３０分間インキエベーシヲンした０次いで細胞をアンピシリン（１００ μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ　／ｍｌ）（ＡＭＰ−ＫＡＮ）を含 有する９００　ｍｌの２ＸＴＹに移し、そして３７°Ｃにおいて震盪しながら一 夜増殖させた。ファージ粒子を精製し、そして３回のＰＥＧ沈澱により濃縮し、 （材料および方法の欄を参照のこと）、ソシテＰＢＳ　中ニＩＯ”ＴＵ／閣ｌに 再懸濁させた（アンピシリン耐性りＣｌめに、７５　Ｘ　１２ｍｍのＮｕｎｃ− イムノチューブ（阿ａｃ１ｓＯｒＰｉカタログＮｏ、　４−４４２０２）をｐｈ ｏｘ：ＢＳＡ（１ｍｇ／＋＋Ｉ；１４ｐｈＯｘ　／ＢＳＡ　、５０ｍＭ　ＮａＨ ＣＯｓ（ｐＨ９，６）ＩＩ衝液中）で室温においてＰＢＳで一夜コーティングし た。　ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキングのためにこの管を３７℃において ２％のマーヴエル（Ｍａｒｖｅｌ）　（２％のＰＢＳ）を含有するＰＢＳと２時 間インキユヘーシッンした。３回のＰＢＳによる洗浄後、４１の２％のＭＰＢＳ 中のファージミド粒子（１０ＩｆｆＴｔｌ）を添加し、回転ターテーブル上で室 温において３０分間インキエベーシコンし、そして１，５時間さらに放置した。 次いで管をＰＢＳ　、　０．１％のツイーン２０で２０回洗浄し、そしてＰＢＳ で２０回洗浄した（各洗浄工程は緩衝液を注ぎ入れ、そして直ちに注ぎ出すこと によって実施した）、結合したファージ粒子を管から、１■ｌの１００　ｍＭ　 ）リエチルアミン（ｐＨ１１，５）を添加し、そして１５分間回転することによ って溶出した。溶出した物質を０．５　ｍｌの１．ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ’＋（ ｐ）１７．４）の添加により直ちに中和し、そして渦形成した。ファージを４℃ において貯蔵した。 溶出したファージ（１，５ｇ＋１中）を使用して、１５ｍ１の２ＸＴＹ培地中で 対数増殖中の８■ｌの大腸菌ＴＧＩ細胞を感染させ、そして上記のようにしてＡ ＭＰ−ＧＬＵプレート上にプレイティングして、平均１０’のファージ感染コロ ニーを産生した。 ｐｈｏｘ：ＢＳＡ結合物の選択のために、レスキュー−管の濃縮−プレイティン グのサイクルを４回反復し、次いでファージミドのクローンをＥＬＩＳＡにより 結合について分析した。 バ三ヱ−グぶ本−４抗とプ泉ｌ−在上ｐＪツ１ソーに接合−１濃１−：ベトリ皿 （３５Ｘ　１０ｖ＋ｍのＦａ　１ｃｏｎ３００１の組織培養皿）をパニングによ る濃縮のために使用した。すべての工程の間に、プレートをＡ６００ロッキング プレート（Ｒａｖｅｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でロックした。プレートを５ ０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９，６）中の１■ｌのシチメンチゴウ卵白リゾ チーム（３鍾ｇ／ｌ）で−夜コーティングし、２１のＰＢＳで３回洗浄し、そし て２１の２％のＭＰＢＳで室温において２時間プロフキングした。３回のＰＢＳ による洗浄の後、１■ｌの２％のＭＰＢＳ中の約１０”ＴＵファージ粒子／プレ ートを添加し、そして室温において２時間口、りした。 プレートを２■ｌの次の溶液で５分間洗浄した：５回ＰＢＳ　、　ＰＢＳ−ツイ ーン（０，０２％のツイーン２０）　、５０５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７， ５）＋５００　ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＢＣＩ（ｐＨ８，５）＋５ ００　ｍＭ　ＮａＣ１、５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，５）　＋５０ ０　ｓＭ　ＮａＣ１および最後に５０ｇ＋Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９，６） 　。 あるいは、１■ｌのシチメンチョウ卵白リゾチームのカラムをアフィニティー精 製のために使用した（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、ら、Ｎａｔｕｒｅ　１９９ ０゜３４８：５５２）。カラムをＰＢＳで十分に洗浄し、１５−１の２％の１Ｂ Ｓでブロッキングし、そして１１の２％のＭＰＢＳ中のファージ（１０”Ｔ［Ｉ ）を負荷した。　５０ｍ１のＰＢＳで洗浄後、１０■ｌのＰＢＳ−ツイーン（０ ，０２％のツイーン２０）　、　５■ｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７ ，５）　−５００ｍＭ　ＮａＣ１、５ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，５）＋ ５００　ｍＭ　ＮａＣ１、５■ｌの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ９，５） ＋５００　ｍＭＮａＣＩおよび最後に５■ｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐ Ｈ９，６）　、結合したファージを１．５　ｍｌの１００　ｍｌのトリエチルア ミンで溶出し、そしてＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ（ｐＨ１７，４）で中和した 。 シチメンチョウ卵白リゾチームの結合物の選択のために、レスキュー−管の濃縮 −プレイティングのサイクルまたはレスキュー−カラム−プレイティングのサイ クルを４回反復し、次いでファージミドのクローンをＥＬＩＳＡによる結合につ いて分析した。 ＪｊＬＩＳＡ　（７）た４（７）ｉＬ＆（７）７ｙ　Ｊ　：：　Ｙｌｌ）’）　 ａ　ニア０）ＬｘＺ’ｔ−ｘ二：　４　ラウンドのｆＡ縮後後溶出た再感染しそ してプレイティングしたファージ粒子から生ずるクローンを９６ウエルのプレー ト（ｔｉｉ胞のつＪ、ル、Ｎｕｃｌｏｒ＋）中の１５０　μｍの２　ＸＴＹ−Ａ ＭＰ−ＧＬ［Ｉの中に接種し、３７°Ｃにおいて震盪（２５０ｒｐｓ＋）　シな がら一夜増殖させた。９６ウエルのプレートのレプリケータ−（「プランジャー 」）を使用して、マスタープレート上の約４μｌの一夜培養物を２００μｍの新 鮮な２　ＸＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬｕ中に接種した。１時間後、１０’　ｐｒｕのＶ Ｃ５−？１１３を含有する５μｌの２×ＴＹ−＾ＨＰ−ＧＬｔｌを各々ウェルに 添加し、そしてプレートを３７℃において４５分間インキエベーシッンし、次い でプレートを３７℃において１時間震盪した０次いで細胞を回転しく４Ｋ、１５ 分）、そして上澄み液をガラス製吸出しパスツールピペットで吸引することによ ってグルコースを除去した。細胞を２００μｍの２　ＸＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ（ カナマイシンＳｏＩ１ｇ　／ｍｌ）の中に再懸濁させ、そして２０時間３７℃に おいて震盪しながら増殖させた。ファージを含有する未濃縮の上澄み液をＥＬＩ ＳＡによる分析のために取った。 ル格Ｌ ｐｈｏｘ　：　ＢＳＡ　、　ＢＳＡまたはりゾチームへの結合の分析を、ＥＬＩ ＳＡ（実施例９参照）により、１００　ｔｔ　ｇ　／ｍｌのｐｈＯｘ：ＢＳＡま たはＢＳＡ　、またはコーティングのために使用する３μｇ／−１のシチメンチ ヲウ卵白リゾチームを使用して実施した０分離したクローンを使用しての無関係 の抗原に対する交差反応性の決定もまた、１００μｇ／ｍｌの無関係の抗原（キ ーホールリンベットヘモシアニン（ＫＬ）ｌ）　、オバルブミン、キモトリプシ ノゲン、サイトクロムＣ，チログロブリン、ＧＡＰ−ＤＨ（グリセルアルデヒド −３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、またはトリプシン阻害因子）でコーテ ィングしたプレート上のＥＬＩＳＡにより決定した。 Ｅｗｉ、ＪＩ！Ｊ１ノーと」−決１：分離したすべての抗原特異的クローンを、 前述したように無関係の抗原のパネルに対する交差反応性についてチェックした 。クローンの多様性は前述したようにＰＣＲのスクリーニングにより決定し、そ して各制限パターンがらの少なくとも２つのクローンをジデオキシヌクレオチド チェインターミネーション法により配列決定した。 ｈＯｘ：ＢＳＡム　の　および　：４ラウンドの選択後、ＥＬＩＳＡ陽性のクロ ーンをｐｈｏｘ：ＢＳＡについて分離した。すべてのクローンは１８Ｍライブラ リーに由来した０分析した９６クローンのうちで、４３クローンをｐｈｏｘ　： 　ＢＳＡおよびＢＳＡに対して結合性であり、０口は０．４〜１．３の範囲であ った（バックグラウンド０．１２５）　、これらのクローンをＢＳＡ結合結合表 示する。　ＢＳＡへの結合は特異的であると思われた。なぜなら、ＫＬＨ、オバ ルプミン、キモトリプシノゲン、サイトクロムＣ、リゾチーム、千ログロブリン 、ＧＡＰ−Ｄ［Ｉ、またはトリプシン阻害因子とともにＥＬＩＳＡにおいて使用 するとき、分析した１１クローンのいずれもバックグラウンドより上のシグナル を与えなかったからである。すべてのＢＳＡ結合クローンは同一のＢｓｔＮ１制 限パターンを有し、そして１４クローンは完全配列決定された。１４クローンの うちの１３は同一の配列を有し、Ｖｌ（はヒトＶｌ１３ファミリーの遺伝子から 、そしてＶＬはヒト■ラムダ３ファミリーの遺伝子に由来した（表１）、他のバ インダーはヒトＶＨ４ファミリーの遺伝子およびヒトＶｋｌファミリーの遺伝子 に由来した（データは示されていない）。 ｐｈＯｘ　：　ＢＳＡのみに結合する１つのクローンが分離され（ＯＤｏ、３） 　、そして結合したファージは競争相手としての０．０２ｍＭ−４−ε−アミノ −カプロン酸メチレン２−フェニル−５−オキサゾルー５−オン（ｐｈｏｘ−Ｃ ＡＰ）の添加により完全に競争除去された。また、バックグラウンドより上の結 合は前述の無関係のタンパク質のパネルに対して検出することができなかった。 配列はＶＨがヒトＶＨＩファミリーの遺伝子に由来し、そしてＶＬがヒト■ラム ダ１ファミリーの遺伝子に由来することを明らかにした（表１１）。 リゾチーム　八　の　およｕ葺ユ火定：　４ラウンドの選択後、５０のＥＬ［Ｓ Ａ陽性のクローンをシチメンチョウリゾチームについて分離した。クローンの大 部分（９５％より多く）は、ＩｇＭからのものであった。リゾチームへの結合は 特異的であると思われた。なぜなら、）ｉＬＩＩ　、オバルブミン、キモトリプ シノゲン、サイトクロムＣ、リゾｆ−４、チログロブリン、ＧＡＰ−ＤＩ（、ま たはトリプシン阻害因子とともにＥＬＩＳＡにおいて使用するとき、分析したク ローンのいずれもバンクグラウンドより上のシグナルを与えなかったからである 。リゾチームに結合するクローンは３つの異なるＢｓ　ｔＮ１制限パターンを有 し、そ（ＩＣ各制限パターンからの少なくとも２つのクローンは完全に配列決定 された。配列は４つのユニークヒトＶＨ−ＶＬの組み合わせの存在を示した（表 １１）。 結果が示すように、特異的に免疫化されていないヒトのボランティアからのｒｇ ＦＩのｃＤＮＡから調製された５ｃＦｖから抗原の結合活性を分離することがで きる。 交差１−４ル二ｌ伝王１ぶｎ■」じ１町（（ユ土ベニファーＬ【便肛鉦工■竺上 口１１−４１’−’Ｊ−（Ｄ±スキューこの実施例は、遺伝子３の欠失をもつヘ ルパーファージを使用してヒトライブラリーから遺伝子３融合体をレスキューす ることを記載する。 ５Ｘ１０＠の細菌を含有する、前記載のようにして（実施例４２）ｔｌｉ製した １００１のＩｇＭファージミドのライブラリーの細菌ストックを、１００　ｐ　 ｇ　／ｍｌのアンピシリン、２％のグルコース（ＴＹ／Ａｍｐ　／Ｇｌｕ）を含 有する１００■１の２ＸＴＹ培地に接種した。これを３７℃において２．５時間 増殖させた。この培養物の１０ｍ１を９０■ｌの前取て加温したＴＹ／Ａｓｐ　 ／Ｇｌｕに添加し、そして遺伝子３を欠如するに０７ヘルパ一フアージＣＭ１３ ＫＯ７ｇＩＩＩΔＮｏ、　３）の２００倍の濃縮物１０ｍ１を添加し、そして３ ７℃において震盪しないで１時間インキュベーションすることによって、感染を 実施した。Ｍ１３ＫＯ７ａｌｌＩＮｏ、　３の調製は実施例３４に記載する通り であった＊　４＋００Ｏｒｐｍ＋において１０分間遠心した後、１００μｇ／ｓ ＋１のアンピシリン（グルコースなし）を含有する２ＸＴＹ培地１００　ｍｌ中 に！ＩＩＮＩＩを再懸濁した。この時点において、培養物を力価検定すると、ア ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（５０μｇ　／＋＋＋１　 ）の両者を含有するプレート上で増殖するそれらの能力により判定して、１．９ 　ＸＩＯ”の感染した細菌が存在することが明らかにされた。震盪しながら１時 間インキュベーションした後、５本の２．５リツトルのフラスコの中に収容され る１００μｇ／−１のアンピシリン、５０μｇ／霞ｌのカナマイシンを含有する ２、５リツトルの２ＸＴＹ培地に移した。この培養物を１６６時間インキュベー ション、そして遠心により上澄み液を調製した。　（１０〜１５分、１０．００ Ｏｒｐｍ　、４℃、ソーヴアル（Ｓｏｒｖａｌｌ）ＲＣ５Ｂ遠心機）、１１５体 積の２０％のポリエチレングリコール、２．５Ｍ　ＮａＣ１を添加し、４℃にお いて３０分間放置し、そして上のようにして遠心することによって、ファージ粒 子を収穫した。生ずる沈澱物を４０ｍ１の１０＠Ｍ　Ｔｒｉｓ　、０．１　ｓ＋ Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）中に再懸濁させ、そして細菌の破片を上のようにし て遠心により除去した８次いでパッケージングしたファージミドの調製物を再沈 澱させ、上記のようにして集め、そして１０−１の１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、０． １　ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，４）中に再懸濁させた。この調製物の力価は４． Ｉ　ＸＩＯ”形賞導入単位／ｍｌ　（アンピシリン耐性）であった。 ０Ｘ−ＢＳＡでコーティングした管を、実施例４５に記載するようにして、実施 例４２からのファージミドライブラリーをパニングするために調製した。レスキ ューされたライブラリーをまた、ウシチログロブリン（Ｓｉｇ霞ａ）でコーティ ングした管に対してパニングした。これらを５（ｌｓＭ　ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ９ ，６）中ｌａｇ／ｍｌ濃度のチログロブリンで３７℃において一夜コーティング した。管を２％のミルク粉末を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ／Ｍ）でブロッキングし 、そして３ｍｌのＰＢＳ　７Ｍと混合した１ｍｌのレスキューされたファージミ ドライブラリー（培養上澄み液の２５０ｍ１の当量）と３時間インキエベーシ５ ンＬ７た。洗浄、溶離、中和お゛よび感染を実施例４５に記載する通りであった 。 ：オキザゾロンーＢＳＡに１　るパニング第１ラウンドの０Ｘ−ＢＳＡに対する パニングは２．８　ＸＩＯ”のファージを生じた。この溶出液から誘導された１ 、４　ＸＩＯ”のコロニーをもつ大きい細菌プレートを、１０■ｌの２ＸＴＹ、 ２０％のグリセロールの中にこすり落として入れ、１０分間震盪し、アリコート と取り、そして貯蔵した。これを使用して、Ｍ１３ＫＯ７ｇＩＩＩ　Ｎｏ、３に よりレスキューするため新鮮な培養物に接種した。　（ＯＫ−８５Ａに対する第 １ラウンドのパニングから誘導された細菌およびレスキューされたファージを０ ＸＰＡＮＩと名付ける。第２および第３ラウンドのパニングから誘導されたバク テリアまたはレスキューされたファージを、それぞれ、０ＸＰＡＮ２および０Ｘ ＰＡＮ３と名付ける。）各ラウンドのパニング後Ｍ１３ＫＯ７ｇｉｒｌＮｏ、３ を使用するファージミドのレスキューは、本質的に前述した通りであったが、Ｔ Ｙ／Ａｓｐ　／Ｇｌｕ中の初期の培養のために５−１の体積を使用し、１ｍｌの へルバーファージを使用し、そして１００　ｕ　ｇ　／ｓｌのアンピシリン、５ ０ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１０〜５００■ｌの２ＸＴＹ培地に移し た。第２および第３のラウンドの工程は第１ラウンドついて前述した通りであっ たが、０．８〜１．０　ｍｌの１００倍濃縮したファージ（８０〜１００　ｍｌ の培養上澄み液の当量）を使用した。第２パニングからの溶出液は８Ｘ１０’の 感染性粒子を含有し、そして第３ラウンドのパニングからの溶離液を３．３　Ｘ ＩＯ’の感染性粒子を含有した。 チログロブリンに・　るパニング 第１ラウンドのチログロブリンに対するパニングは２．５２Ｘ１０’の感染性粒 子を生じた。溶出液の半分を使用して、大きいプレート上に１．２６　Ｘ　１０ ’の細菌コロニーを発生させた。これらのコロニーを１゜膳ｌの２×τＹ、２０ ％のグリセルロールの中にこすり落として入れ、１゜分間震盪し、アリコートを 取り、そして貯蔵した。それらから誘導されたこれらのバクテリアおよびレスキ ューされたファージをＴＹＰ八Ｎへと表示し、そしてＭ１３ＫＯ７ｇｌｌＩＮｏ 、　３を使用するレスキューのための新鮮な培養物に接種して、ポリクローナル にレスキューされたファージ調製物を得た。同様に第２および第３ラウンドのパ ニングから誘導された材料を、それぞれ、ＴＨＹＰＡＮ２およびＴＨＹＰＡＮ３ と表示する。クログロブリンを使用する第２および第３ラウンドのパニングは、 第２および第３ラウンドの０Ｘ−ＢＳＡのパニングについて記載した通りであっ た。第２ラウンドのパニングからの溶出液は８Ｘ１０’の形質導入単位を含有し 、そして第３ラウンドのパニングからの溶出液は６Ｘ１０’の感染性粒子を含有 した。 パニングか”憬　れたクローンのＥＬＩｓＡスクリーニングチログロブリンに対 する第３ラウンドのパニングから誘導された４０コロニー（ＴｆｌＹＰＡＮ３） を取り上げて９６ウエルのプレート中入れ、そして２００　ｔｔ　ｌのＴＹ／Ａ ｓｐ　／Ｇｌｕ中で３７℃において一夜増殖させた。 同様に、０Ｘ−ＢＳＡに対してのパニングの２ラウンドからの４８コロニーおよ び第３ラウンドからの４８コロニーを増殖させた（ＯＸ−ＰＡＮ２および０Ｘ− ＰＡＮ３）。ポリクローナルファージを同時に調製した０次の日に、各培養物か らの５μｌを１００μｌの新鮮な前取て加温したＴＹ／Ａ■ｐ／Ｇｌｕに移し、 １．５時間増殖させ、そしてＭ１３ＫＯ７ｇｌｌＩＮｏ、　３を添加した（１０ ０μｌのＴＹ／　Ａｉ＋ｐ　／　Ｇ　ｌ　ｕ中の２Ｘ１０’の感染性ファージ／ ウェル）。これらを震盪しないで３７℃において１時間インキエベーシッンし、 ４，０００　ｒｐｍで１０分間遠心し、１１００ｕ／■ｌのアンピシリンを含有 する１５０μＩの２ＸＴＹ培地の中に再懸濁し、そして震盪しながらさらに１時 間インキエベーシジンした後、１００μｇ／−１のアンピシリン、５０１！ｇ／ ｍｌのカナマイシンを含有する２ｍｌの培地に添加した。−夜増殖させた後、培 養物を４．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、そして上澄み液を集めた。　ＴＹＩ （ＰＡＮ３クローンをスクリーンするために使用すルＥＬＩＳＡ　７’Ｌ、　− トを、５０ｓＭＮａ）ＩＣＯｚ（ｐＨ９，６）中２００　ａ　ｇ　／ＩＩＩ（７ ）チログロブリンで３７℃において一夜コーティングした。　０ＸＰＡＮ２およ び０ＸＰＡＮ３ニ使用するプレートをＰＢＳ中の１００　ａ　ｇ／＋ｉｌの０Ｘ −ＢＳＡで３７°Ｃにおいて一夜コーティングした。 １２０μｌの培養上澄み液を３０μｌの５　ＸＰＢＳ　、　１０％のミルク粉末 と混合し、そして室温において２時間インキエベーシゴンした。 ＥＬＩＳＡを実施例１８に記載するように実施した。 チログロブリンについて、４０クローンのうちで１８は陽性であった（３０分後 、０．３〜２．Ｏ（７）００）　、（７ｙ−ジ対照（ベクターｐＣＡＴ３）は０ ．０７のＯＤを与えた）、さらに、陽性は、もとのパニングしないファージミド のライブラリーから誘導されたファージ（０，０６９の００）　と比較して、ポ リクローナルファージ調製物ＴＹＨＰＡＮＩ（０，３１４の００）およびＴＹ） ＩＰＡＮ２　（０，１８９の００）について見られた。すべてのポリクローナル ファージをＰＥＧ沈澱させ、そして１０倍濃縮で使用した。 ＰＣＲ反応およびＢｓ　ｔＮｌの消化を、前述したように陽性のクローンについ て実施し、そしてＤＮＡ断片の６つの異なるパターンが得られ、少なくとも６つ の異なるクローンが分離されたことが示された。 ０Ｘ−ＢＳＡについて２ラウンドのパニング後、ＥＬＩＳＡにより４８クローン のうちの３０は陽性であり、そして３ラウンド後、４８のうちの４２が陽性であ った。別の実験において、陽性のシグナルは、３０分後のもとのパニングしない ファージミドのライブラリーから誘導されたファージ（０，１，８６の００）　 と比較して、ポリクローナルファージ調製物ＯＸＰＡＭＩ　（０，９８８のＯＤ ）および０ＸＰＡＮ２（１，７１７の００）から得られた。 チログロブリン　たは０Ｘ−ＢＳＡに・　るクローンの　−異なるＢｓｔＮ１制 限消化パターンの各々を代表する選択されたクローン（１１の抗チログロブリン 、５つの抗０Ｘ−ＢＳＡ）を、無関係の抗原のパネルに対する結合についてアッ セイした。　ＥＬＩＳＡプレートを抗原（５０ｓＭ　ＮａＨＣＯｓ（ｐＨ９，６ ）の中の１００　ｔｔ　ｇ／ｍｌ）で３７℃において一夜のインキュベーシヨン によりコーティングした。抗原のパネルは、キーホールリンペットヘモシアニン 、ニワトリ卵リゾチーム、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、サイトクロムＣ １キモトリプシノゲン、トリプシン阻害因子、ＧＡＰ−Ｄｌｌ（グリセルアルデ ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ウシチログロブリンおよびオキシ ゾロン−ＢＳＡから成っていた。ファージ上澄み液の二重反復実験の試料（８０ μｍ＋２０μｌの５　ＸＰＢＳ　、１０％のミルク粉末）を各抗原に添加し、そ して室温において１時間インキエベーシランした。　ＥＬＩＳＡを実施例１８に 記載するように実施した。 チログロブリン特異性のクローン（１１から１１）の各々はチログロブリンに対 して陽性（０，１２〜０．７６の００）であったが、６０分後、９つの無間係の 抗原のいずれに対しても結合を示さなかった（ＯＤり０．０３）　。 同様に５つの０Ｘ−ＢＳＡ特異性のクローンのうちで３つは０．０７〜０．５２ を有し、これに対して無関係の抗原に対して００＜０．０２であった。５つのク ローンのいずれもＢＳＡ単独に対する結合性をもたなかった。 こうして、陽性のクローンは、わずかに２ラウンドのパニング後、Ｍ１３ＫＯ７ ｇｌＩＩＮｏ。３でレスキューすることによって分離することができる。さらに 、このヘルパーが複数の完全な抗体分子をもつファージ粒子を発生するという一 層大きい可能性が存在する。これはファージ−抗体の結合活性を潜在的に増加し 、そしてより弱い親和性のクローンの分離を可能にするであろう。 ４５、パ　によるファージ上に　７　れた５ｃＦｖＤ１．３の　１い　の　およ び　れたシチメンチツウリゾチーム上で夏１択 Ｄｌ、３抗体はニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）　と４．５　ＸＩＯ’　１モル の親和性定数で結合するが、それはシチメンチョウ卵リゾチーム（τＥＬ）と＜ ｌＸｌ０’１モルの親和性定数で結合する（Ｈａｒｐｅｒら、（１９８７）Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｓｎｕｎｏｌｏｇｙ　２４　ｐ９７−１０８、Ａｍ１ｔら、 （１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３ｐ７４７−７５３）　。 この理由は、ＨＩｌ’Ｌの位置に存在するグルタミン残基（ｇｌｎ１２１）が置 の中の同一位置においてヒスチジン残基で再表示されることにあることが示唆さ れた。こうして、ＨＥＬのｇｌｎ１２１と相互作用するＤｌ、３抗体の残基を変 異させることは、ＴＥＩ、への結合を促進するであろう。 Ａｍｉｔら、前掲に従うと、ライト鎖の位１３２におけるアミノ酸、位２９１に おけるフェニルアラニンおよび位置９２におけるトリプトファンはＩＩＥＬのｇ ｌｎ１２１と相互作用する。さらに、ヘビー鎖の位置１０１におけるチロシンも また相互作用する。これらの残基のいずれも、抗体の可変領域の主要な鎖のコン フォメーションの決定に関係することは予測されていない（Ｃｈｏｔｈｉａおよ びＬｅｓｋ（１９８７）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ ｏｇＶ　１９６．ｐ９０１−９１７）。 ｐ、（、Ｍｈげｙ−厖ぢＬ９Ｊｊｕル発ライト鎖の位置９１（Ｌ９１）における フェニルアラニンおよび位置９２（Ｌ　９２　）におけるトリプトファンをラン ダムすることによりオリゴヌクレオチド＊ｕｔＬ９１．９２を調製した。ライト 鎖の位２３２（Ｌ３２）における千ロジンをランダム化することによりオリゴヌ クレオチドｍｕｔＬ３２を調製し、そしてヘビー鎖の位置１０１　（ＨＩＯＩ） におけるチロシンをランダム化することによりオリゴヌクレオチド−ｕｔ）１１ ０１を調製した。 ｍｕｔＬ９１，９２： ５’　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＡＧＧ　ＡＧＴ　ＡＣＴ　ＮＮＮ　ＮＮＮ　ＡＴＧ　Ｔ ＴＧ　ＡＣＡ　ＧＴＡ　ＡＴＡ　３’ｓ＋ｕｔＬ３２： ５’　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＣＣＡ　ＴＧＣＴＡＡ　ＮＮＮ　ＡＴＴ　ＧＴＧ　ＡＴ Ｔ　ＡＴＴ　ＣＣＣ３’ｍｕｔＨ１０１： ５’　ＣＣＡ　ＧＴＡ　ＧＴＣＡＡＧ　ＣＣＴ　ＮＮＮ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＣ ＴＣＴ　ＧＧＣ３’（Ｎは等しい量のＡ、Ｃ，ＧまたはＴのランダム挿入を表す ）オリゴヌクレオチドｗｕｔＬ９１．９２を使用するファージミドベクターｐＣ ＡＴ３ｓｅＦｖＤ１．３の試験管内変異誘発は、試験管内変異誘発キラ）（Ａｍ ｅｒｓｈａｗ）を使用して実施した。生ずるＤＮＡを、バイオ−ラド（Ｂｉｏ− Ｒａｄ）エレクトロボレーターを使用してＴＧＩ細胞中にエレクトロボレーター ンすることによって形質転換した。　７８，０００のコロニーが得られ、そして これらを１５■ｌの２　ＸＴＹ／２０％のグリセロールの中にこすり落として入 れた。このプールをＤｌ、３Ｌ９１Ｌ９２と呼んだ、一本９１　ＤＮＡを、Ｓａ ｍｂｒｏｏｋら、１９８９前掲に記載するようにＭ１３ＫＯ？でレスキューする ことによって調製し、そしてセクエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）配列決定キッ ト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ）を使用してプライマーＦＤＴＳＥＱＬで配列決定した。 これにより、Ｌ９１およびＬ９をコードするヌクレオチド位置におけるすべての ４つのＤＮＡ配列決定トラックの中のバンドの存在により判定して、ＤＮＡは首 尾よく突然変異誘発されたことが明らかにされた。この変異誘発した一本１１Ｏ ＮＡを、上記のようにして、ｍｕｔ、Ｌ３２または鵬ｕｔＨ１０１オリゴヌクレ オチドを使用して、さらに変異誘発した。−ｕ　ｔＬ３２を使用する変異誘発は ７１．０００のクローンを生じた（プールを０１．３Ｌ３２と呼ぶ）が、＋５ｕ ｔＨ１０１は１０２．００のクローンを生じた（プールを０１．３）１１０１と 呼ぶ）。これらのクローンを２　ＸＴＹ／２０％のグリセロール中にこすり落と して入れた。各プールから誘導された一本鎖ＤＮＡを、前述したように、それぞ れ、オリゴヌクレオチドＤ１．３Ｌ４０およびＬＩＮＫＳＥ［１１で配列決定し 、そして正しくランダム化されたことが示された。 Ｄｌ、３Ｌ４０　： ５’　ＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＴＧ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＴＴＴ　ＴＣＣ３’ＬＩＮＫ ＳＥＱ１： ５’　ＴＣＣＧＣＣＴＧＡ　ＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣ３’Ｌス工と土ニー　０ ）ｆＷ）ｔλにスキューさＪ　ｈ　ｋ　７　ｙ　−づごλ遁製各変異誘発したプ ール（プレートのこすり落としたもの）から誘導された細菌１０〜２０μ！を使 用して、５ｍｌのＴＹ／Ｇｌｕ　／Ａｍｐに接種した。すべての細菌を３７℃に おいて増殖させた。２〜３時間の増殖させた後、１ｍｌを５ｓｉ１の前取て加温 したＴＶ／Ｇｌｕ　／Ａ■ｐ中に希釈し、そして実施例３４に記載するＭｌ、３ ＫＯ７ｇｌｌｌΔＮｏ、　３調製物の２００倍濃縮物０．５　ｍｌの添加により 感染させた。１時間の感染後、培養物を４．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、２ 　ＸＴＹ、　１００　ｕ　ｇ　／ｓｌのアンピシリン中に再懸濁させ、さらに１ 時間インキユベーシゴンし、１００μｇ／ｓｏ１のアンピシリン、５０Ｍｇ／ｍ ｌのカナマイシンを含有する５００　ｍｌの２ＸＴＹ培地に移し、そして１６時 間増殖させた。ファージ調製物の残りの工程は実施例４４に記載されている通り であった。ファージを最後に１０５Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　１−Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ ７）中にもとの培養体積の１　／１００に溶解した。 アフィニティー ０１Ｍ　ＮａＨＣＯｉ、０．５Ｍ　ＮａＣ１（ｐＨ８，３）中で１０ｍｇ／ｍｌ の濃度のシチメンチョウ卵リゾチーム１０１を、等しい体積の、共有結合しかつ 製造業者の指示に従い洗浄した、膨潤した臭化シアン活性化セファローズ４Ｂ（ Ｐｈａｒ■ａｃｉａ）と混合した。使用前に、このマトリックス（置−セファロ ーズ）を１００体積のＰＢＳで洗浄し、次いで１０体積のＰＢＳＭで洗浄した。 置−セファローズを等しい体積のＰＢＳＭ中に再！！濁させ、そして１ｍｌをＰ ＢＳＭ中でファージの５０倍ｉｌｌ縮物ｌｌｌ１に添加し、そして室温において 回転するプラットフォーム上で３０分間インキエベーシゴンした。この段階で実 際に使用したファージは、３つのランダム化したプールの独立の調製物の等しい 体積を混合することによって調製した（Ｄｌ、３Ｌ９１９２、Ｄｌ、３Ｈ１０１ およびＤｌ、３Ｌ３２）、この結合工程後、上澄み液を使い捨てポリプロピレン のカラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に負荷し、そして０ ．１％のツイーン２０を含有するＰＢＳの２００体積で洗浄した。結合したファ ージを１ｍｌの１００雪ｈトリエチルアミンで溶出し、そして０．５　ｓ＋Ｉの Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）で中和した。系統的希釈物を溶出液から調製し 、ＴＧＩ細胞の感染に使用し、そして１１００１ｚ／ｍｌのアンピシリン、２％ のグルコースを含有するＴＹプレート上にプレイティングした。約１０６のコロ ニーを有するプレートを３ｍｌの２ＸＴＹ、２０％のグリセロールの中にこすり 落として入れ、そして−７０℃において貯蔵した。この１０μｌを使用して第２ ラウンドの培養を開始し、これを前述したようにＭ１３ＫＯ７ｇｌｌＩΔＮｏ、 　３でレスキューした（１００ｍ＋の最終培養体積を使用する）。第２および第 ３ラウンドのアフィニティーカラムによる精製を第１ラウンドについて前述した ように実施した。 ■μ人四−Ｌ贋生近 置−セファローズによるカラム精製の第３ラウンドから誘導された４０コロニー を取り上げて９６ウエルのプレートに入れ、そして２００μｌのＴＹ／Ａｍｐ　 ／Ｇｌｕの中で３７°Ｃにおいて一夜増殖させた。ファージミド粒子を、実施例 １８に記載するようにしてレスキューし、そしてＥＬＩＳＡのために調製した。 　ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃において５０ｓ＋ＭＮａＨＣＯｓ（ｐＨ９，６ ）中２００　ｕ　ｇ／ｍＩの濃度のニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）またはシチ メンチテウ卵リゾチーム（置）で−夜コーティングした。 ＥＬＩＳＡを実施例１８に記載するように実施した。 基質中で１５５分間インキュページンした後、１３クローンは陰性であるとこが 見出された（ＩＩＥＬおよび置について０［１＜０．０５）　、　ｔべての陽性 のものにおいて、０．１〜０．７８のシグナルが［ｌＥＬについて記録され、１ つの例外において、ＨＥＬについてのシグナルは０．０７８であったが、置につ いてのシグナルは陽性のグループに入った。対照ファージミド調製物は２２％の シグナル置：ＨＥＬの百分率の比を有した。　置：ＩＩＥＬの比が４０％より小 さい場合、クローンは変化のない結合性を有すると思われた。９クローンはこの カテゴリーに入った。 １８の試料は４０〜２００％の置：ＩＩＥＬについてのシグナルの比をもつ、変 更された結合を有すると記録された。 系統的希釈物を１０クローンについてつくり、ＥＬＩＳＡにより分析し、これら のクローンのうちにおいて、Ｉ（ＥＬへの結合のプロフィルはもとのクローン（ ｐｃＡＴ３ｓｃＦｖＤ１．３）と同一であったが、置についてのシグナルは増加 した（参照、第５０図クローンＢ）、残りの４クローンにおいて、置についての シグナルの増加はＨＥＬについてのシグナルの減少が伴った。 ０泊　との 分離したクローンのすべてはＨＥＬに対する結合を程度は異るが保持している。 可溶性抗原が固定化された抗原と競争することができるかどうかを決定するため に、平行実験を上記のようにして実施したが、ニワトリ卵リゾチーム（１ｍｇ／ ｍｌ　）を置〜セファローズに添加した後にファージ調製物とインキュベーショ ンした。この実験は３ラウンドのカラム精製を通して実施し、そして４０コロニ ーを取り上げた。これらのクローンのいずれもＨＥＬまたはＧＥＬに結合せず、 固定化した抗原への結合についての競争において可溶性抗原が成功したことを実 証する。 ４６、シないマウス　の−■１うΔ二乙乞丈二に鷹Ｊ」基−ドメイン　ることに よる　の　の・ 抗体の特異性を分離するとき、その性質のいくつか、と（にその親和性または特 異的を変更することが望ましいことが、しばしばある、この実施例が実証するよ うに、抗体特異性はＶＫドメインのレパートリ−に由来する異なるＶＬドメイン を使用することによって変更することができる。ファージ上の表示を使用するこ の方法は、存在するモノクローナル抗体ならびにファージの抗体を使用して誘導 された抗体の特異性の改良に適用可能であろう、この実施例が示すように、ニワ トリ卵リゾチーム（置）対して特異的な５ｃＦｖ口１．３ドメインをＶＬドメイ ンのライブラリーで置換すると、シチメンチゴウ卵リゾチーム（置）にも結合す る５ｃＦｖ断片を選択することができる。より一般的には、この実験のアプロー チは、抗体の特異性可変ドメインの置換により変更することができることを示し 、そして抗体の特異性を分離するための階層的アプローチの他の例を提供する。 Ｄｌ、３のヘビー鎖を、現存する構成体（ｐｓｌｌｌ−ＶＨＤｌ、３、Ｗａｒｄ ら、１９８９前掲）から、ＰＣＲニより、ブライ？−ＶＨＩＢＡＣ）ＴおよびＶ ＨＩＦＯＲを使用して増幅し、ライト鎖のライブラリーを免疫化しないマウスの 膵臓から誘導されたｃＤＮＡライブラリーから増幅し、後者は、実施例１４にお けるように、第１鎖についてＭＪＫＦＯＮＸプライマー１．２，４．５を使用し て合成した。引き続く増幅は同一のフォワードブライマーおよびＶＫ２ＢＡＣＫ プライマーを使用して実施した。　０１．３ヘビー鎖とライト鎖ライブラリーと のＰｃｔ？アセンブリーは、実施例１４に記載するように一本１１Ｆシリンカー により仲介された。 アセンブリングされたＰＣＲ産生物（ｓｃＦｖ配列）のクローニングは、追加の ＰＣＲ工程（ブルースルー（ｐＨ１Ｉ−ｔｈｒｏｕｇｈ）後に、実施例１４に記 載するようにＡｐａＬ１部位を提供するＢＡＣＫプライマーおよびＮｏｔ１部位 を含有するフォワードブライマーを使用して実施した。ＡｐａＬＩ　／Ｎｏｔｌ 消化したＰｃｔ？プライマーを、実施例１１に記載するように、同様に消化した ベクターｆｄＣＡＴＺ中にクローニングした。５Ｘ１０’の形質転換体が、？Ｉ Ｃ１０６１細胞への連結反応物のエレクトロボレイション後に得られた。 置結合物についてのファージライブラリーのスクリーニングをパニングにより実 施した。ポリスチレンのフアシヨン（Ｆａ　１ｃｏｎ）　２０５８管を２ｍｌの 置−ＰＢＳ（３ｍｇ／ｓｌ）でコーティング（１６時間）し、そして４ｍｌのＭ ＰＢＳ（２％のスキミミルク粉末を含有するＰＢＳ）で２時間ブロッキングした 。２１のＭＰＢＳ（２％）中でライブラリー（５Ｘ１０”形質導入単位）に由来 するファージを、これらの管中で室温において２時間インキエベーシジンした。 管を次のもので洗浄した：３×ＰＢＳ　、　Ｉ　Ｘ５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ４Ｃ１（ ｐＨ７，５）、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ；　Ｉ　Ｘ５０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐｌ（８，５）　、０．５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１（ｐ ［（９）、５ＭＨＣｌ、最後に、ファージを１００　ｍＭ　トリエチルアミンで 溶出した。溶出したファージを取ってＴＧＩ細胞を感染させ、細胞を１５μｇ／ ｍｌのテトラサイクリンを含有する２ＸＴＹプレート上にプレイティングし、そ して１６時間増殖させた。コロニーを２５ｍ１の２ＸＴＹ培地の中にこすり落と して入れ、そしてファージをＰＥＧ沈澱により回収した。　置結合物について第 ２ラウンドの選択後、前記したようにして（実施例２　）　ＥＬＩＳＡを実施し た。 ＴＥＩ、でコーティングしたプレート上でのＥＬＩＳＡによる親和性選択の前の 、ライブラリーからの１００クローンの分析は結合物を示さなかった。対照的に 、置を結合するファージについての２ラウンドの選択の後、ファージクローンの 約１０％は陽性のＥＬＩＳＡ　シグナルを示した。　ＥＬＩＳＡのシグナルは、 挿入部を含まないｆｄＣＡＴ２ベクターより少なくとも２倍高い値で陽性と記録 された。　置結合性ファージの結合性のより詳細な分析を第５１図に示す。 第５１図に示すように、はとんどもっばらＩ（ＥＬに結合するもとのＤｌ、３ｓ ｃＦνと対照的に、いくつかのクローンは置およびＩＩＥＬに等しく結合するこ とが見出された。クローンのいずれもＢＳＡに結合しなかった。これらの発見が 示すように、これらのｓｃＦνの特異性は０１．３比較していっそう広かった。 なぜなら、両リゾチーム（［ＩＥＬおよび置）は認識されるが、他方のＢＳＡは 認識されないので、リゾチームに対する特異性は保持されたからである。第５１ 図におけるクローン３および９に相当する。クローンＭＦＩおよびＭ２Ｒからの ２つのライト鎖の推定されたアミノ酸配列（ＤＮＡの配列決定から誘導された） を第５２図に示す。 単離された抗体の場合において、異なるが密接に関係する抗原のいっそう広い範 囲の認識を望む場合、この研究に記載するような実験的アプローチはとくに有用 であろう０例えば、ウィルス抗原、例えば、ＨＩＶ−１ｇ１２０のｖ３ループの ようなウィルス抗原に対するモノクローナル抗体は、旧Ｖ−１ｅｎｖ遺伝子のこ の部分における変動性のために、はとんどの場合において１つの特定のウィルス の単離体に対して非常に特異的である。この態様において記載した方法でこのよ うな抗体を修飾すると、広い範囲の旧Ｖ−１単離体と交差反応し、したがって潜 在的により高い治療学的または診断的価値を有するであろう抗体を得ることがで きる。 所望の性質のライト饋可変ドメインが固定して保持されておりそしてヘビー鎖の 可変ドメインのライブラリーの組み合わせた、同様なアプローチを用いることが できるであろう。いくつかのヘビー鎖、例えば、ＶＨＤｌ、３は単一のドメイン として結合活性を保持する。これにより、νｌ（ドメインをファージ上で発現さ れるときに結合活性についてスクリーニングし、次いで適当な相手方ライト饋の 選択のために結合性ドメインをＶＬドメインのライブラリーと組み合わせるとい う方策が可能となる。 ４７、　ビーズに　・番　”れた　への　ムによるファー区抗婆坐若遺ヱの　ム したフ　−ジの゛　な　に口　と　る　ａ　な〜」【胚８文ノ１ ファージ抗体が高い親和性または結合活性をもってその抗原に結合するとき、こ の抗原に関係する分子によって親和性マトリックスからファージ抗体を溶出する ことは不可能である。あるいは、十分に高濃度で調製することができる、適当な 特異的溶出分子は存在しないであろう、これらの場合において、抗原−抗体複合 体に対して特責的ではない溶出方法を使用することが必要である。不都合なこと には、非特異的溶出方法のいくつがば、ファージの構造を破壊する。例えば、フ ァージの生存能力はｐＨ１２において経時的に減少する（Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏ ＋　Ｅ、Ｆ、およびＺｉｎｄｅｒ、Ｎ、Ｊ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、３６３ ８７−３９９１９６８）。 したがって、ファージの構造を破壊しない温和な条件（ジチオスレイトールによ るジチオール基の還元）下に、結合したファージ抗体の溶出を可能とする方法が 案出された。 標的抗原は切断可能なビオチン化試薬を使用してビオチン化された。２−フェニ ル−５−オキサシロン（０，Ｍａｋｅｌａら、前掲）と結合したＢＳＡを、切断 可能なジチオール基をもつビオチン化試薬（スルホスクシニミジル２−（ビオチ ンアミド）ｅｔｌ−１，３−ジチオプロピオネート、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）か ら）を使用して製造業者の指示に従い修飾した。このビオチン化抗原をストレプ トアビジンコーティング１．た磁気ビーズに結合させ、そしてこの複合体を使用 してファージを結合した。ストレプトアビジンコーティングした１■ｌのＰＢｓ 中６５０　μｇのビオチン化０Ｘ−ＢＳＡを２００　μｌの磁気ビーズと室温に おいて少なくとも１時間混合することによって、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）　ヲ 抗原で前取てコーティングした。遊離の抗原をＰＢＳ中で洗浄して除去した。１ ／４０の複合体＜５μｇのビーズおよび１７．５７７　ｇ　（７）ＯＸ−ＢＳＡ の入力に等しい）を、リゾチームに対して向けられたｐＡｂＤｌ、３（実施例２ 　）　／２−フェニル−５−オキサシロンに対して向けられたｐＡｂＮＱｌｌ（ 実施例１１）の表１２に示す比で混合した１、９　ＸＩＯ”のファージ粒子を含 有するＰＢＳＭ（２％のスキミミルク粉末を含有するＰＢＳ）中のファージ０． ５■１に添加した。 室温において混合しながら１時間インキュベーションした後、磁気ビーズをダイ ナル（Ｄａｙｎａｌ）ＭＰＣ−Ｅ　Ｍ１気デスバレイジョン（ｄｅｓｐｅｒｔ− ｉｏｎ）装夏を使用して回収した０次いで、それらを０．５％のツイーン２０を 含有するＰＢＳの中で洗浄し、そして１０ｍＭジチオスレイトールを含有する５ ０μｍのＰＢＳ中で５分間インキュベーションすることによってファージを溶出 した。この溶出液を使用してＴＧ！細胞を感染させ、そして生ずるコロニーをオ リゴＮＱ１１ＣＤＲ３（５’　ＡＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＡＧ ＣＣ３’　）でプロービングした。このオリゴＮＱ１１ＣＤＲ３はＭｏ１１抗体 （これはｐＡｂＮＱｌｌ　とハイブリダイゼーションするが、ｐＡｂＤｌ、３と しない）のＣＤＲ３から誘導された。 １７．５μｇ相当量のビオチン化０Ｘ−ＢＳＡを使用して単一のラウンドの精製 においてｐＡｂ［１１，３のバックグラうンドからｐＡｂＮＱｌ　１の６７０倍 の１縮（表１２）が達成された。 この溶出手順は温和な条件下での溶出手順のちょうど１つの例である。とくに有 利な方法は、挿入された外来遺伝子（この場合において抗体断片のための遺伝子 ）および遺伝子ＩＩＩの残部の間に、高度に特異性のプロテアーゼによる切断の ためのｖ！、識部位を構成するアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を導入す ることである。このような高度に特異性のプロテアーゼの例は、因子Ｘおよびト ロンビンである。ファージをアフィニティーマトリックスに結合し、そして溶出 して非特異的結合のファージおよび弱い結合のファージを除去した後、強く結合 したファージは、切断部位における消化のために適当な条件下で、カラムをプロ テアーゼで洗浄することによって除去されるであろう、これはファージ粒子から 抗体断片を切断してファージを溶出するであろう、これらのファージは感染性で あることが期待される。なぜなら、プロテアーゼ部位のみが特異的に導入される 部位であるからである１次いで、強く結合するファージを、例えば、大腸菌ＴＧ Ｉ細胞に感染することによって回収することができる。 桑爾凡袋並ｌ 免疫化マウスの肺臓に由来するヘビー鎖およびライト鎖の約１ＯＩ４の異なる組 み合わせが存在する。ランダム組み合わせのアプローチを使用してヘビー鎖およ びライト鎖の断片を単一のベクターの中にクローニングして５ｃＦｖ、　Ｆｖま たはＦａｂをファージ上に表示する場合、すべての１０１′の組み合わせを表示 することは実際的な提案ではない。 複雑さを減少するための、この実施例に記載されている１つのアプローチは、抗 原選択した細胞のみから遺伝子をクローニングすることである。（複雑さを処理 する別のアプローチは実施例２６に記載する二重組み合わせライブラリーである ）。 免疫系は、表面免疫グロブリンによる抗原の結合を用いて、特異的抗体を産生ず るように応答する細胞の集団を選択する。この抗原結合性抗体を選択する方法は 、組み合わせの可能性の数を減少し、こうしてヘビー鎖およびライト饋のもとの 組み合わせを回復するチャンスを増加するために、研究されてきている。 ハブテンである４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢酸（ＮＰ） に対する免疫学的応答は広範に研究されてきている。 ＮＰに対する一次免疫応答は単一のライト鎖のみを使用するので、本発明者らは 固定されたライト鎖とヘビー鎖のライブラリーとの組み合わせ法の使用を検査す ることにより、ＮＩＰ（４−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロフェニル酢Ｍ ）に結合する抗体をコードする遺伝子の頻度を検査することができた。こうして 、本発明者らは、この系を使用して、ファージ上の表示のために組み合わせライ ブラリーをつくるの前に、細胞の集団を選択する価値を研究した。 皿 ２１ハブ尤Ｚ紅合体 ヒョコＴ−グロブリン（ＣＧＣ＋　Ｓ　ｉ　ｇｅａａ　、英国ブーレ）およびウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｏｅｈｒｉｒ＋ｇｅｒ　Ｉｌａｎｎｈｅｉｍｘ　 ドイツ国）を、プロランストーン（Ｂｒｏｗｎｓｔｏｎｅ）　（Ｂｒｏｗｎｓｔ ｏｎｅ、　Ａ、　、　Ｍｉ　ｔｃｈｉｎｓｏｎ＋　Ｎ、Ａ、およびＰｉｔｔ−Ｒ ｉｖｅｒｓ＋　Ｒ１，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９６６．１０：４６５−４９５ ）により記載されている方法に基づいて、ＮＰ−〇−スクシンイミドまたはＮＩ Ｐ−カプロニー１−−０−スクシンイミド（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国ノースウィッチ）と結合させた。この活 性化された化合物をジメチルホルムアミド中に溶解し、そして０．２ｈ炭酸水素 ナトリウム中のタンパク質に添加した。それらを一定に撹拌しながら４℃におい て１６６時間混し、次いで数回の交換で０．２ｉ炭酸水素ナトリウムに対して透 析した。それらを最後にリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ））中に透析した。形成した結 合体はＮＰ＋□ＣＧＣ，ＮＩＰ＋　ｏＢｓＡであった。引き続いて、ＮＩＰＩ＊ ＢＳＡ誘導体をアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｓ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ 　、英国アマ−ジャム）から購入したビオチン化キットを使用してビオチン化し た。 ２２　および １０週齢の系統Ｃ５７ＢＬ　／６のマウスを完全ソロインドアジュバント中で１ ００μｇのＮＰ−ＣＧＧの腹腔内注射により免疫化した。 ３Ｊ１１１１糎 免疫化後７日に、膵臓からの細胞をＧａ１ｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｓｉｎ（Ｇａ ｌｆｒｅ。 Ｇ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ＋Ｃ，、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１９８ １．７３ニア３−４６）が記載するように調製した。赤血球を塩化アンモニウム で溶解しくＢｏ　ｙ　ｌ　ｅ　＋　１＋Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　１９ ６８．６：７１）そして細胞の選択を実施し、死亡した細胞をｖｏｎ　Ｂｏｅｈ ｍｅｒおよびＳｈｏｒｔｍａｎ　Ｃｖｏｎ　Ｂｏｅｈｓ＋ｅｒ＋Ｈ，およびＳｂ ｏｒ−ｔｍａｒ、　Ｋ、、Ｊ、１ｓ＋ｓ＋ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｅｔｈｏｄ ｓ　１９７３：１：２７３）が記載する方法により除去した。細胞をリン酸塩緩 衝（ＰＢＳ）　、１％のウシ血清アルブミン、０．０１％のアジ化ナトリウムの 中に懸濁させた。すべての細胞の選択手順を通じて、細胞をこの培地の中に４℃ において保持した。 Ｉ−土豊ｎ産丘 ビオチン化ＮＩＰ−ＢＳＡをストレプトアビジンがカップリングした磁気ビーズ （Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ２Ｂ５５ｔｒｅｐｔａｖｊｄｉｎ、ＤｙｎａＬ、ノー ルウェイ国オスロ）に、時々撹拌しながら１時間インキュベーションすることに よって１０８個のビーズを１１００Ｉｊのビオチニル化タンパク質にカップリン グし、次いで５回洗浄して、結合しなかった抗原を除去した。 カップリングしたビーズを４℃において培地中で必要となるまで貯蔵した。抗原 結合性細胞の選択のために、細胞（２〜４　ＸＩＯ’　／ｍｌ）をまずカップリ ングしないビーズと、１：１のビーズ：細胞の比で、３０分間インキュベージコ ンして、非特異的結合の程度を検査した。 次いで、管を磁気装置（ＭＰＣ−Ｅ　Ｄｙｎａｌ）中に３〜５分間配置すること によって、ビーズを分離した。結合しない細胞を除去し、次いでＮＩＰ−ＢＳＡ カップリングした磁気ビーズと、ｏ、ｉ：１のビーズ：細胞の比で、時々撹拌し ながら６０分間インキュベージコンした。ビーズおよびロゼツト細胞を前述した ように分離した０次いで、ビーズを１１の培地中に再懸濁させ、そして分離を反 復した：血球計でカウントしたときに結合しない細胞が検出することができなく なるまで、この方法を５〜７回反復した。 表面免疫グロブリン陽性の細胞の消耗のために、細胞を２０ｕｇのビオチン化ヤ ギ抗マウス多価免疫グロブリン（Ｓｉｇｍａ、英国プール）とインキエベーシッ ンした０次いで細胞を培地で２回洗浄し、そして３０：１のビーズ／細胞の比で ストレプトアビジンがカップリングした磁気ビーズに添加した。２０分のインキ エベーシ町ン後、ビーズおよびロゼツト細胞を磁気装置に３回適用し、各回上澄 み液を取ることによって分離した。 ２　４ＤＮＡ　ｃＤＮＡの量、ＰＧＩ１　およびクローニング少数の細胞のため にとくに便利な、簡単なプロティナーゼに消化方法（ＰＣＲプロトコル：　Ａ　 Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。 Ｉｎｎ１ｓ　Ｍ、Ａ、＋Ｇｅ１ｆａｎｄ　Ｄ、Ｈ，，５ｎｉｎｓｋｙ　Ｊ、Ｊ、 および−ｈｉｔｅ　Ｔ、Ｊ、Ｍｊｘ＾ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）により、ＤＮ Ａを調製した。　ＲＮＡの調製および引き続（ｃＤＮＡの合成は、Ｇｈｅｒａｒ ｄｉら、（Ｇｈｅｒａｒｄｉ　Ｅ、、Ｐａｏｎｅｌｌ　Ｒ，およびＭｉｌｓｔｅ ｉｎＣ，、Ｊ、Ｉｖｗｕｒ＋ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９００．１ ２６：６ｌ−６８）が記載してし）るようにして実施した。　ＰＣＲおよびヘビ ー鎖ライブラリーのクローニングは、Ｗａｒｄら、（Ｗａｒｄ、　Ｅ、Ｓ、　、 　Ｇｕｓｓｏｗ＋　Ｄ、　＋　Ｇｒｉ　ｆｆ　１ｔｈｓ、　ａ、ｎ、　、　Ｊｏ ｎｅｓ、　o、　Ｔ。 および−１ｎｔｅｒ、Ｇ、　、Ｎａｔｕｒｅ、　１９８９，３４１：５４４−５ ４６）が記載しているプライマーおよび条件を使用して実施した。４０サイクル のＰＣＲ増幅を実施した。使用したＶＨおよびＦｖの発現ベクターを−ａｒｄら が従来記載したものから適応した。それらの両者をｐＬｌｃ１１９（Ｖｅｉｒａ および−ｅｓｓｉｇ、後記参照）中にサブクローニングし、そしてＦν発現ベク ターを修飾して、ジ−サムラインーラムダ−１ライト１ｊ（Ｔ、Ｓｉｍｏｎから 贈られた（本来Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ　Ｗｅｉｓによりクローニングされた、Ｂａ ５ｅｌ　Ｉｎ５ｔｉｔ−ｕｔｅ　ｏｆ　Ｉ■■ｕｎｏｌｏｇｙ））を含むように した。このベクターを第５３図に示す。 ２５　およびＥＬＩＳＡ スクリーニングのために、単一コロニーを２００−■の２ＸＴＹ／アンピシリン １００　μｇ／ｍ１１０．１％のグルコース中に拾い入れ、次いで３７°Ｃにお いて撹拌しながら５〜６時間インキュベージ、ンし、次いでイソプロピル−β− Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、　Ｓｉｇ＋ｉａ、英国データ）を１ｓ ＋Ｈの最終濃度に添加し、そして３０℃においてさらに１６時間インキュベーシ ョンした後、上澄み液を収穫した。ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）ＥＬＩＳＡプレ ート（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　、米国−ｓ−ジャーシイ州）のウェ ルを）ＩＩＰＩ。ＢＳＡ　ＣＰＢｓ中４０μｇ／ｍｌ）で−夜コーティングし、 次いでＰＢＳ中２％のスキムミルク粉末で室温において２時間ブロンキングした 。細菌上澄み液を添加し、室温において１時間インキュベーションし、次いでプ レートをＰＢＳで３回洗浄した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスラムダ［（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　％米国アーギンガム）を添加 し、再び室温において１時間インキュベーションした後、ＰＢＳで６回洗浄し、 次いで２．２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸 ）　（Ｓｉｇｍａ　、英国データ）をペルオキシダーゼ基質として使用して展開 した。　３０分後、４０５ｎ−における光学密度をサーモマックス（Ｔｈｅｒｍ ｏｓ＋ａｘ）マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅ　 、英国メンロパーク）で測定した。Ｃ末端の−ｙｃ　１ｍを使用するウェスタン ブロッティングを実施例２７に記載するように実施した。 立−↓ハ尤−／ＤＮＬｕ本グバ厘１訳−い鵞覇９１七抗原選択の結果を表１３に 示す、１％未満の細胞がＮＩＰ−ＢＳＡコーティングしたビーズに結合し、そし て非特異的結合は非常に低い、ウェスタンブロッティングを使用しての各ｖＨラ イブラリーから発現された遺伝子の比率の評価によればＲＮＡを出発物質として 使用するとき、全長のＶＨドメインはすべてのクローンの９５％（１９／２０） において発現されたが、ＤＮＡ　（選択された細胞からまたは全肺臓から）を出 発物質として使用したとき、クローンの６０％（１２／２０）のみにおいて発現 された。この差は多分多数の組み換えられた（ｒｅａｒｒａｎｅｄ）偽遺伝子が 本発明のプライマーで増幅され得るという事実から生じ、そして転写のレベルに おいて、機能的遺伝子についである程度の選択が存在しなくてはならないと思わ れる。 冬型のライブラリーから変動する数のクローンをＮＩＰするＦｖ断片の産生につ いてスクリーニングした。初期のスクリーニングＥＬＩＳＡを実施し、そしてバ ックグラウンドの少なくとも２倍の光学密度をもつものを含めるようにして陽性 のものを取った。初期の陽性のものを再形質転換し、そして結合を二重反復実験 においてチェックした；結合はＮＩＰに対して特異的であるが、ＢＳＡに対して 特異的でないことが確認された。各出発物質について確認された陽性のＮＩＰ結 合性クローンの頻度を表１４に示す、　ＰＣＲ増幅のための出発物質としてＤＮ ＾を使用することは、存在する細胞のサンプリングとほぼ同等である。なぜなら 、ただ１つの機能な組み換えられたヘビー饋遺伝子および最大１つの組み換えら れた偽遺転子／Ｂ細胞が存在するからである。動物のＩ？ＮＡからの増幅は、も ちろん、レパートリ−を反応性Ｂ細胞にバイアスし、そして量適免疫化した動物 において、これは免疫原に向かう多少のバイアスを与えることが予想されるであ ろう０表１４のデータが明瞭に示すように、−次免疫化後１週で作られたＲＮＡ を出発物質として使用するとき抗原特異的遺伝子の数が少なくとも９６倍に濃縮 され、この選択は非常に強力である。データがさらに示すように、抗原結合性細 胞の選択もまた、要求される遺伝的出発物質について選択する別の強力な方法提 供する。 ３２　１談ｌニブニア１五１１Ω几五 ＲＮＡを出発物質として使用することによって達成される選択の細胞的基礎を検 査するために、ビオチン化抗多価免疫グロブリンおよびストレプトアビジン結合 磁気ビーズを使用して、表面免疫グロブリン陽性細胞を肺臓から消耗した。事前 のＦＡＣ３分析により、この方法が９６％を超える表面免疫グロブリン陽性細胞 を除去することが証明されている。肺臓の表面免疫グロブリンが消耗した分画お よび消耗しない分画の両者からＲＮＡを調製し、そしてＶＨライブラリーを各々 からつくった。　ＥＬＩＳＡの結果（表１４）に示すように、陽性の数はこの消 耗により確かに減少せず、ＲＮＡを使用しての選択効果の主要な部分は表面免疫 グロブリン陰性のＧ細胞（多分プラズマ細胞）から来るであろうことが示唆され る。 ｉｊｉ 本発明者らは、免疫化により産生された特異的ＲＮＡを増幅して、組み合わせラ イブラリーから合理的頻度で、結合活性を得ることを可能にすることの重要性を 実証した０本発明者らはまた、免疫系それ自体のプロセスをまねる別法を実証し た。抗原結合性細胞について選択する簡単な方法を使用すると、匹敵する′ａ縮 が得られ、そしてより広い範囲の遺伝子を使用するという追加の利点が得られる 。 −見すると、ランダム組み合わせのアプローチは、免疫グロブリン遺伝子の極端 な多様性のために、ヘビー鎖およびライト鎖のもとの組み合わせを産生しないよ うに思われるであろう。しかしながら、本発明者らがここで示すように、良好な 抗原による免疫化の後、分離された全肺臓ＲＮＡからのＶＨ遺伝子の１０％は抗 原特異的細胞から来るので、レパートリ−の有効な大きさは大きく減少される。 これは、ヘビー鎖およびライト鎖の雑多性が起こるという事実（実施例２１およ び２２）と共に、組み合せ系が合理的頻度で抗原結合性クローンを産生ずるとい う事実を説明している。データがまた示唆するように、抗原特異的ＲＮ＾の大部 分は、プラズマ細胞であると考えられる表面免疫グロブリン陰性細胞から来る。 また、データが示すように、抗原選択のこの簡単な方法は、組み合わせライブラ リーの複雑さを減少するのに有用であろう、この場合において、少なくとも５６ 倍の抗原特異的遺伝子の濃縮が達成され、これはヘビー鎖およびライト額が未知 である通常の場合において、組み合わせライブラリーの複雑さを３０００以上係 数をもって減少するであろう、抗原選択した細胞を使用する（そしてＤＮＡから 増幅して、細胞の状態のためのバイアスを減少する）という他の利点は、増幅さ れる抗体遺伝子の範囲をいっそう広くすることである。簡単な細胞選択、例えば 、本発明者らがファージ選択との組み合わせにおいてここに記載するものは理想 的であろう、この実施例から理解できるように、細胞およびファージ選択法を組 み合わせることによって、ヘビー鎖およびライト鎖の組み合わせのすべて（はぼ ４Ｘ１０”）をスクリーニングすることを合理的に期待することができ、こうし てすべての結合の組み合わせをスクリーニングすることができるが、これは、現 在まで、全肺臓からは不可能であった（はぼ４Ｘ１０”の組み合わせ、５０％の Ｂ細胞を仮定する）。 表１．ベクター集団からのｐＡｂ（０１，３）の濃縮脚注：　ａ　）　（Ｄｌ、 ３）：ＦＤＴＰｓ　／Ｂｓの上記の比率の約ＩＱＩＫのファージを１■ｌのリゾ チーム−セファローズのカラムに適用し、洗浄し、そして溶出した。ｂ）ｉ出さ れた特異的結合性ファージでＴＧＩ細胞を感染させ、そしてＴＹ−ｔｅｔプレー ト上にプレイティングした。３０〜３７℃において一夜インキユベーションした 後、プレートを、ｐＡｂＤｌ、３に対して特異的であるｚｔｐ標識したオリゴヌ クレオチドＶＨＩＦＯＲ（ｌｌａｒｄら、前掲）にハイブリダイゼーシヨンさせ ることによって、分析したｅｃ）−夜のプレートからの単一のコロニーを増殖さ せ、ファージを精製し、そしてリゾチーム結合について試験した。ｄ）濃縮はオ リゴヌクレオチドのブロービングのデータから計算した。 表２　、　混合ｐＡｂ　１ｔｆｆｌカラ（７）ｐＡｂ（０１，３）　（７）ｆＡ ｖＭｌ、１０”のファージを表１におけるようにリゾチームのカラムに適用した 。 ２、　細胞をプレイティングし、そして表１におけるようにオリゴヌクレオチド でプロービングしたが、ただしオリゴヌクレオチドはＤｌ、３ＣＤＲ３Ａであっ た。 表　３：ファージ−酵素の酵素活性 表−」− （Ｃｈａｉｄａｒｏｇｌｕら　（この研究から１９８８からのデータ）　のデー タ） 助ｏＡｒ吐四　助ａ山佳四　助曝」α鉢　助ａ山佳競に、（μＭ　）　１２．７ 　１６２０　７３　１０７０相対に、　１　１２７　１　１４．６ 相対ｋｃｍＬ１　０．３９７　１　０．３６０相対ｋｃ、、／に、　１　０．０ ０３２　１　０．０２４可溶性のおよびファージに結合したアルカリ性ホスファ ターゼの反応速度論的パラメーター、可溶性酵素およびファージ酵素についての ｋｃｍおよびに、の相対値は、野生型酵素（ｐＡｂＡｒｇ１６６）およびファー ジ野生型酵素（ｆｄｐｈｏＡｒｇ１６６）についての値と比較することによって 誘導した。 に一１ フ　−ジ　・の 表　８　ファージ　のアフィニティークロマトグラフィー表−」− ミューチーター株での増殖の後のファージ上での表示により選択された５ｃＦｖ Ｂ１８における変異ヌクレオチド変異　アミノ酸変異　番　号（塩基の位置） ３０８　Ａｌａ−＋Ｖａｌ（ＶＨＦＲ３）　３７０３　Ｔｙｒ−＋Ａｓｐ（ＶＬ 　ＣＤＲ３）　１７０６　５ｅｒ−”Ｇｌｙ（ＶＬ　ＣＤＲ３）　１７２４　Ｇ ｌｙ−＋５ｅｒ（ＶＬ　ＦＲ４）　２１７２５　Ｇｌｙ−＊Ａｓｐ（ＶＬ　ＦＲ ４）　３７３４　Ｔｈｒ−”１ｉｅ（ＶＬ　ＦＲ４）　１８８目８８８ 亡乙む８ちご お宅葺目 ａ８８４ 荘耘日を 藁謔藁藁冨 Ｅｔ魁を 葺Ｅ　毘車■車　阻白葺壓紺泪纏ミ ９耘　計藷計粥　耘荘Ｅ日葺ｉ看壮葺 如！：　８じ８８８む　藁罎冨藁冒　しむわじ七ＩＪ　＋、！ｌ　（ｄ：　（ｇ 　（ｇ　○（Ｊ　（Ｊ　ＩＪ　ＣＪ　＜　ｍｅ　＜　ｇｅ　＜膀慕　引を引ｔ　 Ｅ滅目滅民目然腔旨 耘馨　１ｉｊｕｕ民コ民　３ミミミミ！Ｌｉ４Ｌｆ４Ｌｌ　（Ｊ　（Ｊ　Ｃｊ　 Ｃｊ　ＣＪ　ｕ　＜　（＜　＜　＜　＜　＜＜　＜　＜　ｇｅ　（＜　＜　ＣＪ 　ｕ　ＱＣＪ　ＣＪ　Ｑ（Ｊ（ｊ　Ｉ＋ＩＩＪロＱロＣロロ−ロロロリに」１ １　切断可能な試薬でビオチン化した０Ｘ−ＢＳＡを使用するアフィニティー精 製によるｐＡｂＤｌ、３からのｐＡｂＮＱｌｌの濃縮およびストレプトアビジン 磁気ビーズへの結合 インプット比１　アウトプット比２　濃　縮（ｐＡｂＤｌ、３：ｐＡｂＮＱｌｌ ）　（ｐＡｂ　ＮＱＩＩ：全ファージ）２２３５：１　６１／１９７　６９０ ２２３５０　：　１　５／２０２　５４４１、抗原（ＯＸ−ＢＳＡ）で前取てコ ーティングした５μｌのストレプトアビジン−磁気ビーズと０．５１中の１．９ 　ＸＩＯ”ファージと１時間混ｔＵ　抗原性細胞の選択の結果 細胞の数　全細胞に対する％ 金牌細胞　４　Ｘ　１０’　− ｔ１４　選択された細胞集団からのＦｖＮＩＰ結合ＥＬＩＳＡの結果陽　性　濃 縮の程度１ 全肺臓からのＲＮＡ　２９／２８２　＞９６抗原結合細胞からのＤＮＡ　１７／ ２８２　＞５６表面ｒｇ選択 表面１ｇ陰性分画からのＲ１１Ａ　８／９４　−全肺臓からのＲＮＡ　４／９４ 　− ０　全ＤＮＡに対する濃縮の程度 ＢｓｔＥｌ［による切断 Ｋｌｅｎｏｗによるフィルイン 再連結 ！ 試験管内変異誘発（ｔｌＪゴｌ） 試験管内変異誘発（オリコ゛２） マ ＦＤＴｐＳ／Ｘｈ ｂｓ αＷ倶−でス　隔π記逼ｍαπＡ’ｒ％ＣＣτにυズスα℃ＧコつＧＡＴ’ｎク ゴπ円スσ■℃Ｃ仄℃αＸスαＸ仄　、７０　ＥＩＯ９０１００１１０１２０ Ｐ８を工 ＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＣＡＧＡＧＣでｒフＲスゴα亡ＡＱ 閣■℃λｃｃＳＬＴＧＹＧＶＮＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷ？＝閣円】ＡＣαズＸ 万λＴスア仄ｎスＡＡｖＨＤ１．３ ＬＧＭＩＷＧＤＧＮＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＬσ■℃ＧＮｄ℃Ｎ口−ワズｍ’ｒｗ 〜ｗ’ｒｙ　ｍＤＤＴＡＲＹＹＣＡＲＥＲＤＹＲＬＤＹＷＧＧＡＴＧＡＣＡＷ（ ：”Ｉｆλ　ＴｒＡ　Ｃ’に；ＧＧＧＣＬｉｎｋｅｒ　Ｐ＠ｐセ１ｄａ Ｑ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｖ　Ｔ　Ｖ　Ｓ　Ｓ　−＃ｇｇａｇｇｍｔＣａｇｇｃｇｇａｇ ｇｔｇｇＣｔＣｔ’ｊｇｃ４１！″　４４０　４５０　４６０　４７０　４８０ ｂａｔＥエエ Ｓａｃ工 ＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＡＷ−ＹＱすλσ■ｎニスＣａζ℃Ｍス　 Ｔ闇−’ＣＡｉコいＪＴＫ円Ｔ覧スコｍズ刀スＴＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＹ ＴＴＴＬＡＤｍｍＴワ■７（スＡＣＡＮＣＣＴＩスＧＣＡＧＡＴＶＸＤＬ＋３ Ｇ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　ＲＦ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｓ　Ｇ　Ｔ　Ｑ　Ｙ　Ｓ　Ｌ　Ｋ　Ｉ 　ＩＪαＴσ■℃ＣＡ　Ｗ）０シＡＣ入ｃｉｒｍｚ’ｒｃｍｃＳＬＱＰＥＤＦＧ ＳＹＹＣＱＨＦＷＳＴＰＲｆｍ（ＪＶ ＥＣＯＲ工 ファージ上澄液の体積（ｍ＋） コーティング濃度（円／面） 切断部位 抗原 ＭＫＹＬＬＰＴＡＡ ｍＴ次ｒＡ ＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡＱＶＱＬＱＥＳ７０　８０　９０　１００　ｎｏ　 １２０ＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＩＪＯＬ４０　肥０　１６０ 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ローロ団ロ＝閣ロ囲口闇■ 八８ リゾチームのコーティング濃度（ｕｇ／ｍｌ）リゾチームのコーティング濃度 遺伝子■のＮ未満 希釈倍数 ｍＲＮＡ　ｍｌ？ＮＡ ｐｅｌＢ　ＶＨＯ１３Ｈｕｎｔ−ＩＩ　ｍｙｃ　ｐｅｌＢ　ＶＫＤｔ３　ＨｕＣ Ｋリンカ−領域の配列 ３　ヒト　ＣＨＩおよびヒンジ□ ＫＰ５ＮＴＫＶＤ　にＫＶＥＰＫＳＳＴＫＴＨＴｐｅｌＢ　＋７−ダー□ ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬ ｒｒ＋ｒ２ＮＡ　ｍＲＮＡ ＨｕＶＨＢＡ（Ｋ２Ｍｉｘ　ＨｕＶＬＢＡＣＫ２Ｍｉｘ濃度 濃度 要約書 特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員が、このようなｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性 の集団をコードするＤＮＡを組み換え宿主細胞の中で発現することによって同定 され、ここでｓｂρ構成員またはそのポリペプチド成分をコードするＤＮＡを含 有する分泌される複製可能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の表面におい て、ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分がｒｇｄｐのキャプシド成分との 融合体として発現されるのでｓｂｐ構成員は機能的形態で表示される０表示され たｓｂｐは相補的ｓｂｐ構成員との親和性により選択することができ、そしてＤ ＮＡは選択されたｓｂｐ構成員の発現のために選択されたｒｇｄｐから回収する ことができる。こうして抗体のｓｂｐ構成員を得ることができ、その異なる鎖が 発現され、一方はキャプシド成分に融合され、そして他方は融合相手のペプチド との会合のために遊離の形態である。ファージミドを発現ベクターとして前記キ ャプシド融合体とともに使用して、ファージミドＤＮＡのパッケージングを促進 することができる。 この方法を使用して、このようなマルチマーのｓｂｐ構成員のそれぞれの鎖をコ ードするＤＮＡのライブラリーを組み合わせ、これにより従来の方法により容易 に得ることができるものより、非常により大きい遺伝学的多様性をｓｂｐ構成員 において得ることができる。 国際調査報告

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．特異的結合対（ｓｂｐ）のマルチマー構成員の製造方法であって、組み換え 宿主生物において、分泌される複製可能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ） の成分に融合した該ｓｂｐの構成員またはその型のｓｂｐ構成員の遺伝学的に多 様性の集団の第１ポリペプチド鎖を発現し、これにより前記ｒｇｄｐは前記ポリ ペプチドをパッケージの表面に表示し、そして組み換え宿主生物において、前記 マルチマーの第２ポリペプチド鎖を発現し、そしてこれらのポリペプチド鎖を一 緒にさせて前記マルチマーを前記ｒｇｄｐの一部分として形成させることを含ん でなり、該ポリペプチド鎖の少なくとも１つはそのための前記成分を使用してパ ッケージングされることができる核酸から発現され、これにより前記ｒｇｄｐの 各々の遺伝的物質は前記ポリペプチド鎖をコードする、ことを特徴とする方法。
2. ２．前記鎖が同一宿主生物において発現される、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記マルチマーの第１鎖および第２鎖がそれらのそれぞれの核酸を含有する 単一ベクターから別々の鎖として発現される、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つがファージベクターから発現される、 請求項１，２または３に記載の方法。
5. ５．前記ポリペプチド鎖の少なくとも１つがファージミドから発現され、前記方 法はヘルパーファージ、または相補的ファージ遺伝子を発現するプラスミドを使 用して前記ファージミドのゲノムのパッゲージングを促進することを包含し、そ してｒｇｄｐの前記成分はそのためのキャプシドタンパク質である、請求項１〜 ４のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．前記キャプシドタンパク質がヘルパーファージ中に存在しないか、欠陥を有 するか、または条件的に欠陥を有する、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記第１ポリペプチド鎖を発現することができるベクターを前記第２ポリペ プチド鎖を遊離の形態で発現する宿主生物に導入するか、あるいは前記第２ポリ ペプチドを遊離の形態で発現することができるベクターを前記第１ポリペプチド 鎖を発現する宿主生物に導入することを含んでなる、請求項１〜６のいずれか１ 項に記載の方法。
8. ８．前記各ポリペプチド鎖が前記成分の触合産生物を使用してｒｇｄｐとしてパ ッゲージングされることができる核酸から発現され、これにより前記両ポリペプ チド鎖をコードする核酸はそれぞれのｒｇｄｐの中にバッケージングされる、請 求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．前記第１および第２ポリペプチド鎖の少なくとも１つをコードする核酸が、 前記鎖または前記鎖の変異型の集団をコードする核酸を包含する核酸ライブラリ ーから得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．第１および第２ポリペプチド鎖の両者はそれぞれの前記核酸ライブラリー から得られる、請求項９に記載の方法。
11. １１．特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員またはその型のｓｂｐ構成員の遺伝的に 多様性の集団をコードする核酸を包含する核酸ライブラリーから特異的結合対（ ｓｂｐ）の構成員を製造する方法であって、前記方法は、組み換え宿主細胞にお いて、分泌される複製可能な遺伝的表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分に融合さ れているか、あるいは前記ｒｇｄｐの成分との融合体として発現される前記ｓｂ ｐ構成員のポリペプチド成分との会合のための遊離の形態で前記核酸のライブラ リーによりコードされたポリペプチドを発現することを含んでなり、こうしてｒ ｇｄｐは前記ｓｂｐ構成員を機能的形態でパッケージの表面に表示し、前記ライ ブラリー核酸は前記ｒｇｄｐの成分を使用してパッヶージングされることができ る形態で宿主細胞内に含有され、これによりｓｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの 遺伝的物質は前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードする核酸を 含有する、前記方法。
12. １２．特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員の製造方法であって、組み換え宿主細胞 において、該ｓｂｐ構成員またはその型のｓｂｐ構成員の遺伝学的に多様性の集 団をコードする核酸を発現することを含んでなり、ここで前記または各ｓｂｐ構 成員またはそのポリペプチド成分は、前記ｓｂｐ構成員をパッケージの表面に表 示する分泌される複製可能な遺伝的表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との触合 体として発現され、前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードする 核酸は前記ｒｇｄｐ成分を使用してパッゲージングされることができる形態で宿 主細胞内に含有され、これにより前記ｓｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの遺伝的 物質は前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードし、前記宿主生物 は遺伝学的多様性を前記ｓｂｐ構成員の中に導入して前記混合された集団を産生 するミューチーターの菌株である、ことを特徴とする方法。
13. １３．特異的結合対（ｓｂｐ）の構成員の製造方法であって、組み換え宿主細胞 において、該ｓｂｐ構成員またはその型のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集団 をコードする核酸を発現することを含んでなり、ここで前記または各ｓｂｐ構成 員またはそのポリペプチド成分は、前記ｓｂｐ構成員をパッケージの表面に表示 する分泌される複製可能な遺伝的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合 体として発現され、前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードする 核酸は前記ｒｇｄｐ成分を使用してパッケージングされることができる形態で宿 主細胞内に含有され、これによりｓｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの遺伝的物質 は前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードし、前記融合体はバク テリオファージのキャプシドタンパク質と共に形成されたものであり、そしてｒ ｇｄｐは野生型で発現される前記キャプシドタンパク質の不存在下に、前記融合 体とともに形成される、ことを特徴とする方法。
14. １４．特異的結合対（ｓｂｐ）構成員を製造する方法であって、組み換え宿主細 胞において、該ｓｂｐ構成員またはその型のｓｂｐ構成員の遺伝的に多様性の集 団をコードする核酸を発現することを含んでなり、ここで前記または各ｓｂｐ構 成員またはそのポリペプチド成分は、前記ｓｂｐ構成員をパッケージの表面に表 示する分泌される複製可能な遺伝学的表示のパッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との 融合体として発現され、前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコード する核酸は前記ｒｇｄｐ成分を使用してパッケージングされることができる形態 で宿主細胞内に含有され、これによりｓｂｐ構成員を表示するｒｇｄｐの遺伝的 物質は前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードし、前記ｓｂｐ構 成員またはそのポリペプチド成分はキャプシド融合体としてファージミドから発 現され、そしてヘルパーファージ、または相補的ファージ遺伝子を発現するプラ スミドを前記キヤプシド融合体と一緒に使用してファージミドの核酸をパッケー ジングする、ことを特徴とする方法。
15. １５．前記キャプシドタンパク質がヘルパーファージの中に存在しないか、欠陥 を有するか、あるいは条件的に欠陥を有する、請求項１４に記載の方法。
16. １６．宿主細胞がｓｂｐ構成員の核酸の中に遺伝的多様性を導入するミユーデー ター菌株である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. １７．前記ライブラリーまたは遺伝学的に多様性の集団が、（ｉ）相補的ｓｂｐ 構成員で免疫化された動物の組み換えられた免疫グロブリンの遺伝子のレパート リー、（ｉｉ）相補的ｓｂｐ構成員で免疫化されていない動物の組み換えられた 免疫グロブリンの遺伝子のレパートリー、（ｉｉｉ）人工的に組み換えられた免 疫グロブリンの１または２以上の遺伝子のレパートリー、 （ｉｖ）免疫グロブリンの相同体の１または２以上のレパートリー、または （ｖ）（ｉ），（ｉｉ）．（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の任意の混合物、から得ら れる、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. １８．前記ｓｂｐ構成員が免疫グロブリンのドメインであるか、あるいはそれと 相同性であるドメインを含んでなる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方 法。
19. １９．前記ｒｇｄｐがバクテリオファージであり、宿主が細菌であり、そしてｒ ｇｄｐの前記成分がバクテリオファージのためのキャプシドタンパク質である、 請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. ２０．前記ファージがフィラメント状ファージである、請求項１９に記載の方法 。
21. ２１．前記ファージがクラスＩのファージｆｄ，Ｍ１，ｆ１，Ｉｆ１，ｌｋｃ， ＺＪ／Ｚ，Ｆｆ並びにクラスＩＩのファージＸｆ，ＰｆＩおよびＰｆ３である、 請求項２０に記載の方法。
22. ２２．前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド鎖がファージｆｄの遺伝子ＩＩ Ｉキャプシドタンパク質または他のフィラメント状ファージ中のその対応物との 融合体として発現される、請求項２０または２１に記載の方法。
23. ２３．前記ｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド鎖が分泌リーダーペプチドの下 流の成熟キャプシドタンパク質のＮ末端領域に押入される、請求項２２に記載の 方法。
24. ２４．前記宿主が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項１９〜２３のいずれか １項に記載の方法。
25. ２５．前記ｓｂｐ構成員のポリペプチドをコードする核酸が、抑制可能な翻訳停 止コドンを通してウイルスのキャプシドタンパク質に対して下流に連鎖されてい る、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
26. ２６．前記発現により形成されたｒｇｄｐが、個々のｓｂｐ構成員もしくは該ｓ ｂｐ構成員の混合された集団またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸であっ てこれら各々のｒｇｄｐｓにおいて該ｓｂｐ構成員又はそのポリペプチド鎖と会 合しているものを提供するように、選択またはスクリーンされる、請求項１〜２ ５のいずれか１項に記載の方法。
27. ２７．前記ｒｇｄｐが前記ｓｂｐ構成員に対して相補的な構成員との親和性によ り選択される、請求項２６に記載の方法。
28. ２８．前記第２構成員に結合したｒｇｄｐを溶出液で洗浄することによって回収 することを含んでなる、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．前記溶出液が相補的ｓｂｐ構成員への結合について前記ｒｇｄｐと競争す る分子を含有する、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記ｒｇｄｐを、前記相補的ｓｂｐ構成員への結合について前記パッケー ジと競争する分子の存在下に、前記相補的ｓｂｐ構成員に適用する、請求項２７ 〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. ３１．選択またはスクリーンされたｒｇｄｐに由来する核酸を使用して、組み換 え宿主生物中で前記ｓｂｐ構成員もしくはその断片または誘導体を発現する、請 求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. ３２．１または２以上のｒｇｄｐからの核酸を取りそして使用することにより、 更なる前記方法においてコード核酸を得、個々のｓｂｐ構成員もしくはｓｂｐ構 成員の混合集団、またはそのコードする核酸を得る、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．発現最終産生物を修飾してその誘導体を産生する、請求項３１または３２ に記載の方法。
34. ３４．発現最終産生物またはその誘導体を使用して、治療または予防用薬物また は診断用製品を調製する、請求項３１，３２または３３に記載の方法。
35. ３５．特異的結合対（ｓｂｐ）のある型の構成員の遺伝的に多様性の集団をコー ドする断片を含んでなる核酸断片のライブラリーを収容し、各ｓｂｐ構成員また はそのポリペプチド成分は分泌される複製可能な遺伝学的表示のパッケージ（ｒ ｇｄｐ）の成分との融合体として発現され、こうして前記ｓｂｐ構成員は前記ｒ ｇｄｐの表面上に機能的形態で表示され、そして前記ｒｇｄｐの遺伝学的物質は 会合したｓｂｐ構成員またはそのポリペプチド成分をコードする、ことを特徴と する組み換え宿主細胞。
36. ３６．ｓｂｐ構成員の前記型が免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの相同体で あり、その第１ポリペプチド鎖がｒｇｄｐの成分との前記融合体として発現され 、そしてその第２ポリペプチド鎖が遊離の形態で発現され、そしてｒｇｄｐの中 の融合した第１ポリペプチド鎖と会合している、請求項３５に記載の組み換え宿 主細胞。
37. ３７．ヘルパーファージであって、そのゲノムはそのキャプシドタンパク質の１ つをコードする核酸を欠如するか、あるいはそのコードする核酸は条件的に欠陥 があるか、あるいは欠陥のある形態または条件的に欠陥のある形態の前記キャプ シドタンパク質をコードする、ヘルパーファージ。
38. ３８．細菌宿主細胞であって、そのキャプシドタンパク質を欠如するフィラメン ト状ファージのゲノムを含有し、そして前記欠如を補足するキャプシドタンパク 質を発現することができ、こうして感染タンパク質粒子をそれから得ることがで きろ、細菌宿主細胞。
39. ３９．前記補足するキャプシドタンパク質が前記宿主の中でその中に含有される 他のベクターから発現される、請求項３８に記載の細菌宿主細胞。
40. ４０．前記欠陥のあるキャプシドタンパク質がファージｆｄの遺伝子ＩＩＩまた は他のフィラメント状ファージの中のその対応物である、請求項３８または３９ に記載の細菌宿主細胞。
41. ４１．組み換え大腸菌ＴＧ１　Ｍ１３Ｋ０７　ｇＩＩＩ　Ｎｏ．３（ＮＣＴＣ１ ２４７８）。
42. ４２．特異的結合対またはその結合ドメインの構成員を機能的形態でその表面上 に表示する型の複製可能な遺伝的表示パッケージを有するファージ。
43. ４３．上記１〜３４項のいずれかに記載の方法の実施において使用される、 （ｉ）一本鎖のバクテリオファージのための複製起点、前記ｓｂｐ構成員をコー ドする核酸の挿入のための制限部位またはファージのキャプシドタンパク質の成 熟コード配列の５′末端領域においてそのポリペプチド成分を有し、そしてキャ プシドタンパク質およびｓｂｐポリペプチドの融合体を細菌宿主のペリプラスミ ック空間に向ける分泌リーダー配列を前記部位の上流にもつ、少なくとも１つの ベクター、および （ｉｉ）前記方法を実施するために要求される補助的成分、を含んでなるキット 。