JPH05501348A

JPH05501348A - あらかじめ選択された特異性を有するレセプターを単離する方法

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Publication number: JPH05501348A
Application number: JP50827490A
Authority: JP
Inventors: ヒュース　ウィリアム　ディー
Original assignee: スクリップス　クリニック　アンド　リサーチ　ファウンデーション
Priority date: 1989-05-16
Filing date: 1990-05-16
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2017-09-03
Also published as: JP3321159B2; EP0472638A4; PT94066A; AU5673390A; EP0472638A1; PT94066B; AU651065B2; WO1990014424A1; CA2016841A1; CA2016841C; EP0472638B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】あらかじめ選択された特異性を有するレセプターを単離する方法起−述侠歪公団本発明はあらかじめ選択された活性を有するポリマーを製造する方法に関する。豊−量リガントとレセプターの間の結合現象は生物学上の系において多くの非常に重要な役割を果たす、このような現象の例としては、酸素分子がデオキシヘモグロビンに結合してオキシヘモグロビンを形成すること、及び蛋白質とトリプシン等のプロテアーゼの間に起こるような、基質のそれに作用する酵素への結合がある。生物学上の結合現象のさらに他の例としては、抗原の抗体への結合、及び補体成分Ｃ３のいわゆるＣＲ１レセプターへの結合がある。多くの薬物及び他の治療用薬剤も結合現象に依存するものと考えられている０例えば、モルヒネ等のアヘン剤は脳の中の特異的レセプターに結合することが報告されている。アヘン作用薬及び拮抗薬はモルヒネ等の薬物とその結合部位を競合することが報告されている。モルヒネ及びその誘導体のような合成薬品等のリガンド類並びに、エルドルフィン及びホルモン等の生物学上の系に天然に存在するリガンド類は生物学上の系に天然に存在するレセプターに結合するもので、共にここで扱うことになろう、このような結合は数多くの生物学上の現象を導くことができ、それらには特にそれぞれ、蛋白質がトリプシン若しくはパパイン等の酵素によって構成成分であるポリペプチドに加水分解されるか、若しくは脂肪がグリセリンと３個のカルボン酸に開裂されるような、アミド結合及びエステル結合の加水分解が含まれる。さらに、このような結合は、炭素−炭素結合及び炭素−窒素結合の形成と同様に、蛋白質及び脂肪の形成におけるアミド結合及びエステル結合の形成を導くことができる。を推動物におけるレセプター産生系の例として免疫系がある。哺乳動物の免疫系は、おそら＜１．０Ｘ１０’以上のレセプター特異性を抗体という形で生ぜしめることができるほどに、最も融通性の高い生物学上の系のひとつである。実際に、現在の生物学的及び医学的研究の多くはこのレパートリ−を開くことをめざしている。この１０年間、広大な免疫学的レパートリ−の産生物を活用するための能力は劇的に増大してきている。ケーラー及びミルシティン（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によるハイブリドーマ法の開発はモノクローナル抗体、すなわち単一の特異性を持つ抗体分子組成物を、免疫反応の間に誘導される抗体のレパートリ−から生産することを可能にしている。残念ながら、モノクローナル抗体を産生させるための現行の方法では、特定の抗原により誘導される抗体反応の全体を効率よく把えることはできない、動物−個体中には、例えばジニトロフェノールのような小さく比較的堅い抗原に対する独特の抗体を産生ずることができる異なるＢ細胞クローンが最低５−１０，０００個ある。さらに、多様な抗体を産生ずる間の、身体の突然変異過程により、本質的に無限の数の独特の抗体分子が産生されるであろう、多様な抗体に対するこの広大な可能性とは対照的に、現在のハイブリドーマ法からは、−融合あたりわずか数百の異なるモノクローナル抗体しか通常得られない。ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体の製造における他の困難には、ハイブリドーマ培養組織の遺伝的不安定性及び低い生産能力が含まれる。当技術分野がこれらの後者の２問題を克服しようとの試みに用いてきた方法の１つが、興味をひく特定のハイブリドーマからの免疫グロブリン産生遺伝子を原核生物の表現系の中にクローニングすることであった０例えば、ロビンソンら（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、）＋　Ｐ　ＣＴ公開第Ｗ○８９１０　Ｏ９９号；ウィンターら（１４ｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、欧州特許公開第０２３９４００号；リーディング（Ｒｅａｄ　ｉｎｇ）　＋　米国特許第４，７１４，６８１号；及びカビリイら（Ｃａｂｉｌｌｙ　ｅｔ　ａｌ、Ｌ欧州特許公開第０１２５０２３号を参照のこと。を椎動物の免疫学的レパートリ−には最近、触媒活性を有する免疫グロブリンをコーディングする遺伝子が含まれることが見出されている。トラモンターノら（Ｔｒａｓｏｎｔａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓｃｉ、）、　２３４巻、第１５６６−１５７０頁、１９８６年；ボラックら（Ｐｏｌｌａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、）＋　サイエンス（Ｓｃｉ、）、２３４巻、第１５７０−１５７３頁、１９８６年：ジヤツジら（Ｊａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、）。サイエンス（Ｓｅｔ、）、２４１巻、第１１８８−１１９１頁、１９８８年；及びジヤツジら（Ｊａｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、）、サイエンス（Ｓｃｉ、）、２４４＠、第４３７−４４０頁、１９８９年。化学反応を触媒することができる、すなわち酵素のように作用する抗体分子の存在、あるいはそれを生産するレパートリ −を誘導する能力は、はぼ２０年も前にＷ、Ｐ、ジェンクス（１４，ｐ、　Ｊｅｎｃｋｓ）によって化学及び酵素学における触媒、マクグロウヒル社、ニューヨーク、１９６９年、中に既に仮定されていた。当技術分野が早くに免疫学的レパートリ−から触媒的な抗体を単離できず、またそれらを実際に発見した後ですら現在までに多くを単離できずにいる理由の１つは請求める活性についてのレパートリ−の大部分がスクリーニング不能であることによると考えられる。もう１つの理由は、ハイブリドーマ法のような現在利用できるスクリーニング法が、本質的に触媒作用に対抗して、その効力を消す過程に参加するように設計された高親和性抗体を生産することに偏向していることによると考えられる。発ａｙｙ、（１粒本発明は、それぞれ第−及び第二遺伝子からの第−及び第二ポリペプチドの発現を調節する５′末端プロモーターを含む線状二本鎖ＤＮＡ発現ベクターを製造する方法において、当該第−及び第二ポリペプチドがあらかじめ決められた特異性を有するヘテロ二量体レセプターを形成することができる方法を提供する。該ベクターは当該第一ポリペプチドをコードしている遺伝子を含む第一遺伝子の多様な第一集団を単離することによって製造され、当該第一集団はエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位を規定する線状二本鎖ＤＮＡ分子によって構成されており、当該制限部位は当該遺伝子に対しては５′末端に配置され、当該遺伝子の発現を調節するプロモーターに対しては３′末端に配置される。当該第二ポリペプチドをコードする遺伝子を含む第二の遺伝子から成る第二の多様な集団がその後単離され、当該第二集団は当該制限部位を規定する線状二本鎖ＤＮＡ分子によって構成されており、当該制限部位は当該第二遺伝子に対して３′末端に配置され、当該第二遺伝子は当該第二遺伝子の発現を調節するプロモーターに対して３′末端に配置されている。二本鎖ＤＮＡ分子はその後当該集団中に存在する間に当該エンドヌクレアーゼによって開裂され、粘着末端及び当該第一遺伝子の１個あるいは当該第二遺伝子の１個のいずれかを有する制限断片を産生ずる。こうして製造された制限断片はそれぞれの当該粘着末端により互いにランダムに結合し、同一のＤＮＡＮ玉鎖上に並び単一のプロモーターの調節下にある当該第一遺伝子を１個と当該第二遺伝子を１個有する二本鎖線状ＤＮＡ発現ベクターからなる多様な集団を産生ずる。あらかじめ決められた特異性を有する当該異種二成分性（ｈｅｔｅｒｏｃｊｉｍｅｒｉｃ）レセプターを発現することができるベクターがその後、二本鎖ＤＮＡ発現ベクターの多様な集団から単離される。盈皿旦亘！呈悦皿本開示の一部を成す図面において二Ｘ上　主要な構造上の特徴を示す免疫グロブリン分子の概略図を示す。重鎮（Ｈ鎖）上の丸で囲まれた範囲は可変領域（ＶＨ）を表わし、その領域の生物学上活性な（リガンド結合）部分を含むポリペプチド及びそのポリペプチドをコードする遺伝子が本発明の方法によって製造される。ＩＬＬΔ　ヒトＩｇＧ（ＩｇＧ１サブクラス）のＨ鎖の概略図。番号付けは左方のＮ末端から右方のＣ末端方向になされている。それぞれが約６０アミノ酸残基に及ぶ傾向ジスルフィド結合（Ｓ−８）を含有する４個のドメインの存在に注目されたい。記号ＣＨＯは炭化水素を表わす。重（Ｈ）鎖のＶ領域（ＶＨ）は３個の超可変性ＣＤＲ（表示せず）を有することにおいてＶＬに類似している。！旦　ヒトに鎖の概略図（パネルｌ）。番号付けは左方のＮ末端から右方のＣ末端方向へなされている。ＶＬ及びＣＬ　ドメインにおいてほぼ同数のアミノ酸残基に及ぶ傾向ジスルフィド結合（Ｓ＝Ｓ）に注目されたい。パネル２はＶＬ　ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を示す。ＣＤＲより外の部分は骨格部分（Ｆ　Ｒ）である。ｌＪ３　ホスホリルコリンに対して特異性を有する１９のマウスモノクローナル抗体のＶＨ領領域アミノ酸配列。アミノ酸配列の各部分は連続番号の数ページにわたって示しである。ＨＰという記号は該蛋白質がハイブリドーマの産物であることを示す。残りのものは骨髄腫蛋白である（ギアハートら（Ｇｅａｒｈｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、　）、ネイチャ＝（Ｎａｔｕｒｅ）、２９１巻、第２９頁、１９８９年）。１４ＦＩＴｃで免疫したマウスの肺臓から得られたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅より得られた結果を例示する。レーンＲ１７−Ｒ２４は独特の５′プライマー（２−９、表１）及び３′プライマー（１２、表１）との増幅反応に対応し、Ｒ１６はイノシンを含有する５′プライマー（１０、表１）及び３′プライマー（１２、表１）とのＰＣＲ反応を表わす。Ｚ及びＲ９は増幅対照である：対照Ｚはプラスミド（ＰＬＲ２）からのＶＨの増幅を含み、Ｒ９はプライマー１１及び１３（表１）を用いた肺臓ｍ　ＲＮ　Ａの不変領域からの増幅を表わす。ｌ　ヌクレオチド配列をラムダＺＡＰ中のＰＣＲ増幅化ｖＨ領域のｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、連続番号の数ページにわたって示す。Ｎ末端の１１０塩基をここでは記載しており、下線のヌクレオチドはＣＤＲＩ　（相補性決定領域）を表わす。配列Ｌ０３、Ｌ３５、Ｌ４７及びＬ４８はあらかじめ定義されたいずれのサブグループにも分類できなかった。９６　ラムダＺａｐＩＩＶＨ（パネルＡ）及びラムダＺａｐＶＬ　（パネルＢ）発現ベクターを産生ずるためにラムダＺＡＰ中に挿入された合成りＮＡ挿入基の配列（各パネルを連続番号の数ページにわたって示した）。このベクターがＶＨ及びＶＬココ−ィングＤＮＡホモログ（相同体）を発現するためにめられる種々の特徴にはシャインーダルガルノリポゾーム結合部位、ムーバら（Ｍｏｕｖａ　ａｔ　ａｌ、）によってジャーナルオブバイオロジカルケミストリイ（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｗ、）、２５５−ｌ、第２７頁、１９８０年、に述べられているような発現蛋白質を周辺原形質に振り向けるためのリーダー配列、並びにＶ、及び■、ホモログを発現ベクターに機能的に結合させるのに使用される種々の制限酵素部位が含まれる。 ■８発現ベクター配列は重鎮の可変性領域（Ｖ　Ｍ骨格）に典型的に見られるアミノ酸をコードする短い核酸配列も含む、このｖ９骨格はすぐ上流にあり、ＸｈｏＩ及び５ｐｅＩ中に機能的に結合されているｖ、ＤＮＡホモログとして正確に読まれる一ＶＬＤＮＡホモログはＮｃｏｌ及び５ｐｅＩ制限酵素部位で■、配列（パネルＢ）中に機能的に結合されており、それゆえにｖ８骨格領域はｖＬＤＮＡホモログが機能的に■１ベクター中に結合される場合には抹消される。［細菌性発現ベクターラムダＺａｐＵＶイ　（Ｖ、−発現ベクター）の主な特徴を示す０図６による合成りＮＡ配列をラムダＺａｐｎからのＴ、ポリメラーゼプロモーターとともに上部に示す。ラムダＺａｐＨ中の挿入配位（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す−ＶＭＤＮＡホモログＸｈｏＩ及び５ｐｅｒ制限酵素部位中に挿入される。　ＶＭ　ＤＮＡはＸｈｏｌ及び５ｐｅ１部位中に挿入され、転写を通じての読取りにより、クローニング部位の丁度３′に位置するデカペプチドエピトーブ（ｔａｇ：標識）を産生ずる。計　細菌性発現ベクターラムダＺａｐＨＶＬ　（ＶＬ発現ベクター）の主な特徴を示す０図６に示した合成配列をラムダＺａｐ■からのＴ、ポリメラーゼプロモーターとともに上部に示す、ラムダＺａｐ■中の挿入配位を示す。ＶＬＤＮＡホモログは、ショートら（Ｓｈｏｒｔ　ｅｔ　ａｌ、）＋ヌクレイ７クアシツヅリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓているインビボの除去プロトコールによって製造されるファージミド中に挿入される。ｉＶ、ＤＮＡホモログは該ファージミドのＮｃｏｌ及び５ｐｅｌクロ一ニング部位中に挿入される。ｌ　修飾された細菌性発現ベクターラムダＺａｐＩＩＶＬｎ、このベクターは下記の合成りＮＡ配列：を、制限酵素５ａｃＩ及びＸｈｏＩで消化されたラムダＺａｐＩＩ中に挿入することによって構成される。この配列はシャインーダルガルノ配列（リポゾーム結合部位）、発現蛋白質を周辺原形質に振り向けるためのリーダー配列、及びｖ、ＤＮＡホモログをこのベクターにより供給される５ａｃＩ及びＸｂａＩｉ１１限酵素部位中に機能的に結合させるのに過当な核酸配列を含む。皿工立　ラムダｖＬ■発現ベクターを産生ずるためにラムダＺａｐＵ中に挿入される合成りＮＡ断片の配列０種々の特徴及び制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。型土上　■工及び■、を別々に及び両者を合わせて発現するためのベクターを示す。これらのベクターの種々の必須成分を示す。軽鎖ベクター若しくは■５発現ベクターを■８発発現ベクターみ合わせて、発現のために同一のプロモーターに機能的に結合した■。及び■、の両方を含む組み合わせベクターを製造することができる。この図は連続番号の数ページにわたって示しである。ｌｕ　ｖ、及びｖ、ＤＮＡホモログを含むイー・コリ　（Ｅ。ｃｏｌｉ）から免疫沈降したラベル化蛋白質を示す。レーン１は、ｖＨ若しくは ■ＬＤＮＡホモログを含まないイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から免疫沈降したバックグラウンド蛋白質を示す。レーン２は、Ｖ□ＤＮＡホモログのみを含むイー・コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ）から免疫沈降した■、蛋白質を含む。レーン３及び４は、■工及びＶＬＤＮＡホモログの両方を含むイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）から免疫沈降した■８蛋白及びＶＬ蛋白の共移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を示す。レーン５では、ｖＨ及び■ＬＤＮＡホモログから発現されたｖＨ蛋白及び■１蛋白の存在が２種の識別可能な蛍白種によって証明されている。レーン６はマウス腹水中に存在する抗イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）抗体により免疫沈降したバンクグラウンド蛋白を含む。１　カルボキサミド基ｆ（式２）を加水分解するための抗体を誘導する遷移状態アナログ（式１）、グルタリルスペイサ−及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド− リンカ−付加物を含む式１の化合物はハプテン（式１）を蛋白キャリアーＫＬＨ及びＢＳＡに共役させるのに使用される形態であるが、式３の化合物は阻害側である。ホスホンアミデートの機能性は、アミド結合の加水分解における遷移状態の立体電子特性を模倣していることにある。皿上土　ＮＰＮで免疫されたマウスの肺臓ｍ　ＲＮ　ＡからのＦｄ及びカフバー領域のＰＣＲ増幅を例示する。増幅は実施例１７で述べるように、軽鎖配列（表２）若しくは重鎖配列（表１）の増幅に特異的なプライマーを持つｍ　ＲＮ　Ａの逆転写によって得られたＲＮＡ　ｃＤＮＡハイブリッドを用いて行なった。レーンＦｌ−Ｆ８は８種の５′プライマーのそれぞれ（プライマー２−９、表１）のうちの１個と単一の３′プライマー（プライマー１５、表２）による重鎖増幅反応の産物を表わしている。５′プライマー（それぞれ、プライマー３−６及び１２、表２）と適当な３′プライマー（プライマー１３、表２）による軽鎖（ｋ）増幅をレーンＦ９−Ｆ１３に示す。全レーンに見られる７　００　ｂｐｓのバンドは、Ｆｄ及びに領域の増幅がうまくいっていることを示している。１ｇ１５−　抗原結合に対するファージライブラリーのスクリーニングを実施例１７Ｃにより描いている。Ｆａｂ（フィルターＡ、Ｂ）、重鎮（フィルターＥ、Ｆ）及び軽鎖（フィルターＧＳＨ）発現ライブラリーの２個ずつのプラーク隆起（ｌｉｆｔ）のスクリーニングを１プレートあたり約３０，０００プラークの濃度でＮＰＮと共役させた＋２８　Ｉ−ラベル化ＢＳＡに対して行なった。フィルターＣ及びＤは、本文中で考察されているように一次フイルターＡ（矢印）からのコア化陽性物の２個ずつの二次スクリーニングを例示している。スクリーニングは標準プラク隆起法を使用した。ファージ感染せたＸＬＩ青色細胞を１５０ｍｍプレート上に、３７℃で４時間インキュベートし、１０ｍＭイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）に浸したニトロセルロースフィルターをかぶせることにより蛋白発現を誘導し、該プレートを２５℃で８時間インキュベートした。フィルターを２個ずつ、同様の条件を用いた二次インキュベーションの間に得た。フィルターをその後ＰＢＳ中１％ＢＳＡ溶液中に１時間ブロックした後、１％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓ中でＮＰＮに共役させた１２５Ｉ−ラベル化ＢＳＡ溶液（２Ｘ１０’ｃｐｍｍｊ７−’；ＢＳＡ濃度０．１Ｍ、Ｂ５Ａｌ分子あたり約１５ＮＰＮ）と２５°で１時間、揺らしながらインキュベートした。バックグラウンドは放射化　ＢＳＡのストック溶液を１００，０００ｇで１５分間前遠心にかけ、挿入物のないファージを感染させた細菌を含むプレートからのプラグ隆起物と該溶液を前インキュベートすることにより減じた。ラベル化の後、フィルターをＰＢＳｌｏ、０５％ツイーン２０で繰り返し洗浄し、その後オートラジオブライフィーで−晩展開させた。区土工　拮抗阻害により示されるような抗原結合の特異性を実施例１７ｃによって例示する。陽性プラークからのフィルター隆起を存在する阻害剤ＮＰＮの濃度を上げなから１２’　１−ＢＳＡ　−ＮＰＮに被曝させた。この実験では図１５のようにＮＰＮ結合と相関した幾つかのファージを直接、細菌ローンの上にスポットした（１スポツトあたり約１００粒子）。プレートにその後Ｉ　ＰＴＧに浸したフィルターをかぶせ、２５°で１９時間インキュベートした。該フィルターをその後ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中でブロックした後、ラベル化溶液中にＮＰＮを量を変えて含むことを除いては図１５で先に述べたのと同様に１２５Ｉ−ＢＳＡ−ＮＰＮ中でインキュベートした。他の条件及び手順は図１５におけるものと同様であった。中程度の親和性を持つファージについての結果を図中に２個ずつ示す。同様の結果が、有効な阻害剤濃度の範囲に幾つかの違いがある４種の他のファージについても得られた。区エユ　抗原結合蛋白の特性表示を実施例１７Ｄにより例示する。ＮＰＮ結合クローンの濃縮部分精製細菌上清をゲル濾過によって分離し、各分画から部分標本をＢＳＡ−ＮＰＮでコーティングしたミクロタイタープレートにのせた。アルカリホスファターゼと共役させた抗デカペプチド（−−−）若しくは抗カッパー鎖（−）抗体のいずれかを添加した後、発色させた。矢印は既知のＦａｂ断片の溶出位置を示す。結果から抗原の結合は重鎮及び軽鎖の両方を含む５０ｋＤ蛋白の特性であることが示されている。２個のＮＰＮ陽性クローン（図１５）から個々のプラークを採取し、重鎮及び軽鎖挿入物を含むプラスミドを摘出した。Ｌ−培地による培養物５００ｍ１ｌに、摘出した該プラスミドを含む飽和培養菌３ｍｌを接種し、３７°で４時間インキュベートした。蛋白合成をＩＰＴＧの最終濃度が１　ｍＭになるように加えて開始し、該培養物を２５°で１０時間インキュベートした。細胞上清２００ｍ１を２ｍｌに濃縮し、ＴＳＫ−Ｇ４０００カラムにのせた。溶出分画から５０μｌの部分標本をＥＬＩＳＡによりアッセイした。ＥＬｌ、ＳＡ分析用に、微少滴定プレートを１ｔｔｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＮＰＮでコーティングし、５０μｌのサンプルに５０μｌのＰＢＳ−ツイーン２０（０，０５％）−ＢＳＡ　（０，１％）を加えて混合し、該プレートを２５°で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−トウィーン２Ｏ−ＢＳＡで洗浄した後、アルカリホスファターゼと共役させた適当な濃度のウサギ抗デカペプチド抗体（２０）及びヤギ抗マウスカッパ軽鎖（サザンバイオテク社）抗体を５０μｌ加え、２５° で２時間インキュベートした。さらに洗浄した後、５０１ｔｌのｐ−ニトロフェニルリン酸（５０ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む０．１ＭトリスｐＨ９，５中１ｍｇ／ｍ１）を加え、プレートを１５−３０分間インキュベートした後、４０５ｎｍのＯＤを読んだ。複素環式塩基から成る、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの単量体ユニット。該塩基はグリコシド炭素（該五炭糖の１′炭素）により糖部分に結合しており、塩基と糖の組み合わせはヌクレオシドである。該ヌクレオシドが該五炭糖の３′ 若しくは５′位に結合するリン酸基を含む場合に、これをヌクレオチドと呼ぶ。塩基対（ｂ）：　二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）、若しくはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の共同。ＲＮＡ中では、チミンがウラシル（Ｕ）に置き換わる。１叔：　ヌクレオチドのポリマーで、一本鎖若しくは二本鎖である。這倣王：　そのヌクレオチド配列がＲＮＡ若しくはポリペプチドをコーディングしている核酸。遺伝子はＲＮＡ若しくはＤＮＡのいずれかでありうる。ｍ玉：　ＤＮＡ若しくはＲＮＡが二本鎖配置を採る場合に通常、対になるヌクレオチド。ヌクレオチド配置：　ＤＮＡ若しくはＲＮＡの一本鎖分子中のヌクレオチド配列において、別の一本領上の配列に対して十分相補的であり、結果として生じる水素結合によってそれと特異的にハイブリダイズするもの。されている（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）　：　ヌクレオチド配列は、仮にそれがあらかじめ選択された配列の正確な相補物に非ランダムにハイブリダイズするならば、あらかじめ選択された（照合）配列について保存されている。ハイブリダイゼーション：　実質的に相補的なヌクレオチド配列（核＃鎖）が対になり、相補的塩基対の間に水素結合ができることにより、二本鎖若しくはヘテロ二本鎖を形成すること、これは特異的、すなわち非ランダムの、２個の相補的ポリヌクレオチド間の相互作用であり、拮抗阻害されうる。ヌクレオチドアナログ：　構造的にＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ若しくはＵとは異なるが、核酸分子中で通常のヌクレオチドに置き換えるに十分類似しているプリン若しくはピリミジンヌクレオチド。ＤＮＡホモログ：はあらかじめ選択され保存されているヌクレオチド配列及びあらかじめ選択されたりガントに結合することができるレセプターをコードする配列を有する核酸。抜止：　種々の文法上の形態による抗体という用語は、ここでは免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗体結合部位あるいはパラトープを含む分子を言うのに用いられる。抗体分子の例としては、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子並びに、当技術分野においてＦａｂ、　Ｆａｂ’　、Ｆ（ａｂ　’　）ｚ及びＦ　（ｖ）として周知の部分を含む免疫グロブリン分子の一部分がある。抗体結合部位：　抗体結合部位は抗原に特異的に結合する（免疫反応する）重鎮及び軽鎖の可変領域及び超可変領域を含む抗体分子の構造部分である。種々の形態における免疫反応という用語は抗原決定因子含有分子及び、全抗体分子あるいはその一部等の抗体結合部位を含む分子の間の特異的結合を意味する。モノクローナル抗体：　種々の文法上の形態におけるモノクローナル抗体という成句は、特定の抗原と免疫反応することができる唯一種の抗体結合部位を含む抗体分子の集合を言う。従ってモノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応を示すいずれの抗原に対しても共通の結合親和性しか示さない。モノクローナル抗体はそれゆえに、複数の抗体結合部位を有し、おのおのが異なる抗原に対して免疫特異的である抗体分子、例えば二重特異性モノクローナル抗体等を含んでもよい。旦一方法本発明は保存されている遺伝子のレパートリ−からあらかじめ選択された活性、好ましくは触媒活性を有するレセプターをコードする遺伝子を単離する方法に関する。該レセプターはポリペプチドＲ１転移ＲＮＡ　（ｔＲＮＡ）等のＲＮＡ分子、酵素活性を示すＲＮＡなどでもよい。好ましくは該レセプターは、例えば酵素、抗体分子あるいはその免疫学上活性な部分、細胞レセプター又は細胞付着蛋白等のりガントであって保存されている遺伝子群、すなわち長さが最低約１０ヌクレオチドの保存されているヌクレオチド配＋１を含む遺伝子群のうちの一員によりコードされるリガンドに結合可能なポリペプチドでもよい。保存されている遺伝子群の例としては、免疫グロブリン、クラス１あるいは■の主要組織適合性複合抗原、リンパ球レセプター、インテグリン等をコードしているものがある。遺伝子はいくつかの方法を用いて、保存されている遺伝子のレパートリ−に属するものであることを同定することができる。例えば、単離した遺伝子をサザン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ）、ジャーナルオブモリキュラバイオロジイＵ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）　、９８巻、第５０３頁、１９７５年に記述されている方法を使用して、低厳密条件下でハイブリダイゼーションプローブとして用い、ゲノムＤＮＡ中に存在する保存されている遺伝子のレパートリ−の他のメンバーを検出することができる。ハイブリダイゼーシヨンプローブとして用いた遺伝子が複数の制限エンドヌクレアーゼ断片にハイブリダイズする場合、その遺伝子は保存されている遺伝子のレパートリ−のメンバーである。免炎ｌ旦工悲ヱ免疫グロブリン、若しくは抗体分子は、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ。ＩｇＭ及びＩｇＥ等の数種の分子を含む大きな分子族である。抗体分子は各領土に可変（Ｖ）領域及び不変（Ｃ）８ｉ域の両方が存在する重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖を含む、免疫グロブリンの幾つかの異なる領域は免疫グロブリンのレパートリ−を単離するのに有用な保存されている配列を含む、保存されている配列の例を表す広範囲のアミノ酸及び核酸配列データがカバットら（Ｋａｂａｔ　ｅｔａｌ、）によって“免疫学的重要性を持つ蛋白の配列”、米国保健協会、ベテスダ、メリーランド州、１９８７年、に免疫グロブリン分子として集められている。Ｈ鎖のＣ領域は特定の免疫グロブリン型を定義する。それゆえに、Ｈ鎖のＣ領域からのここで定義されたような保存されている配列の選択から、選択されたＣ領域の免疫グロブリン型のメンバーを有する免疫グロブリン遺伝子のレパートリ− が作成されることになる。Ｈ若しくはＬ鎖のＶ領域は、保存されている配列範囲を含み、おのおのが比較的低い変異度を持つ４個の骨格（ＦＲ）領域を含む。ｖＨ鎖のＦＲＩ及びＦＲ４（Ｊ領域）骨格領域からの保存されている配列の使用は好ましい態様であり、実施例中で述べる。骨格領域は通常、数種若しくは全ての免疫グロブリン型に渡って保存されており、よって、それに含まれる保存されている配列は幾つかの免疫グロブリン型を持つレパートリ−の作成に特に適している。主　織適合　複合体主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、クラスＩ、クラス■若しくはクラスＩＩＩＭＨＣ分子と呼ばれる分子クラスを含む広範囲の蛋白族をコードする大きな遺伝座である。ポールら（Ｐａｕｌ　ｅｔ　ａｌ、）、ファンダメンタルイミュノロジイ（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、レイパン出版、ニューヨーク、第３０３−３７８頁、１９８４年。クラスＩ　ＭＨＣ分子は、該抗原が重鎮及び非ＭＨＣコード化軽鎖を含む保存されている族であることを意味する、移植抗原の多様な形を持つグループである。該重鎮はＮ、ＣＩ、Ｃ２、膜及び細胞質領域と呼ばれる幾つかの領域を含む。本発明において有用な保存されている配列は主にＮ、ＣＩ及びＣ２領域に見出され、上記のカバトら（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、　）により“不変残基“の連続的配列として同定されている。クラスＩＩＭＨＣ分子は、免疫反応性に関与しアルファ及びベータ鎖を含む、多様な形を持つ抗原の保存されている一族を含む。アルファ及びベータ鎖をコードする遺伝子はそれぞれ、ＭＨＣクラス■アルファ若しくはベータ鎖レパートリ−を製造するのに適した保存されている配列を含む幾つかの領域を含む。保存されているヌクレオチド配列の例としては、全てアルファ領土の、Ａ１領域のアミノ酸残基２６−３０、Ａ　２　ｗＩ域のアミノ酸残基１６１−１７０及びＩＩ　８１域のアミノ酸残基１９５−２０６をコードするものがある。保存されている配列は、ベータ鎖の８１、Ｂ２及び膜領域にも、それぞれアミノ酸残基４１−４５．１５０−１６２及び２００−２０９をコードするヌクレオチド配列に存在している８レノ連球−ｋｊビヘダニ及で一旬Ｕ脚−表ｊ１植Ｊ東リンパ球はその細胞表面Ｅに、Ｔ細胞レセプター、Ｔｈｙ−を抗原並びに、モノクローナル抗体０ＫＴ４　（ｌｅｕ　３）　、０ＫＵＴ５／８　（ｌｅｕ　２）　、０ＫＵＴ３．０ＫＵＴＩ　（ｌｅｕ　１）　、０ＫＴＩＩ（１ｅｕ５）　、０ＫＴ６及び０ＫＴ９によって規定される抗原を含む多数のＴ細胞表面抗原を含む幾つかの蛋白族を含む、ボール（Ｐａｕｌ）、上記、第４５８−４７９頁。Ｔ細胞レセプターはＴ細胞の表面上に見られる抗原結合分子族を言うのに用いられる用語である。Ｔ細胞レセプター族はその多様性において免疫グロブリンと同様の多形的結合特異性を示す。完成したＴ細胞レセプターはそれぞれに可変（Ｖ）及び不変（Ｃ）領域を持つアルファ及びベータ鎖を含む、Ｔ細胞レセプターが遺伝学上の構成及び作用において有する免疫グロブリンとの類似性は、Ｔ細胞レセプターが保存されている配列を持つ領域を含むことを示している。レイら（Ｌａｉ　ｅｔ　ａｌ、）　、　ネイチャー（Ｎａ　ｔｕｒａ）　＋３３１巻、第５４３−５４６頁、１９８８年。保存されている配列の例として、アルファ鎖のアミノ酸残基８４−９０、ベータ鎖のアミノ酸残基１０７−１１５、並びにガンマ鎖のアミノ酸残基９１−９５及び１１１−１１６をコードしているものがある。カバトら（Ｋａｂａｔ　ｅｔ　ａｌ、　）、上記、第２７９頁。インテグリン及び・　物細胞付着に関与する付着性蛋白は、インテグリンと呼ばれる同族の蛋白からなる大きな一族に属する。インテグリンはベータ及びアルファサブユニットを含むヘテロニ量体である。インテグリン族のメンバーには、細胞表面糖蛋白血小板レセプターＧｐ　ＩＩｂ−ＩＩＩａ、ビトロネクチン、レセプター（ＶｎＲ）フィブロネクチンレセプター（ＦｎＲ）、並びにリンパ球付着レセプターＬＦＡ−１，Ｍａｃ−１、Ｍｏ−１及び６０．３が含まれる。ルーシャーティら（Ｒｏｕｓｈａｈｔｉ　１！ｔ　ａｌ、　）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２３８巻、第４９１−４９７頁、１９８７年。核酸及び蛋白配列データは、保存されている配列領域が、これらの種族のメンバー中に、特にＧｐ　ＩＩｂ−ＩＩ［ａ　ＶｎＲ及びＦｎＲのベータ鎖の間、並びにＶｎＲｌＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、Ｆｎｒ及びＧｐ　ＩＩｂ−ｎＩａのアルファサブユニットの間に存在することを証明している。スズキら（Ｓｕｚｕｋｉｅｔａｌ、）、プロシーディンゲス　オブ　ザ　ナショナル　ア力デミイ　オブ　サイエンス　オブ　ザ　ユナイテッド　スティンオブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　８３巻、第８６１４−８６１８頁、１９８６年；ジンスバーグら（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　）＋ジャーナルオブバイオロジカルケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ）。２６２巻、第５４　ｓ　７−５４４ｏ頁、１９８７年。以下の考察は、免疫グロブリン遺伝子レパートリ−から保存されているレセプター−コーディング遺伝子を単離するのに用いられる本発明の詳細な説明するものである。この考察は限定的なものと考えるべきではなく、むしろ機能上同族のレセプターをコードするいずれの種類の保存されている遺伝子類からも遺伝子を単離するために使用できる原理の適用を説明するものと考えるべきである。一般に、本方法は以下の要素を合わせたものである：１、　免疫レパートリ−の実質的部分を含む核酸の単離。２、　免疫グロブリンソイ及びｖＬｊｌ域遺伝子を含むポリヌクレオチド切片のクローニングのためのポリヌクレオチドブライマーの製造。３、該レパートリ−からの異なるＶ８及びＶＬ遺伝子の複数を含む遺伝子ライブラリーの製造。４、　原核生物及び真核生物宿主を含む適当な宿主中において、別々の若しくは同一の細胞中で、同−若しくは異なる発現ベクターにおけるｖＭ及び■、ポリペプチドの発現。５、　発現されたポリペプチドのあらかじめ選択された活性に対するスクリーニング、及び該スクリーニング処理により同定されたＶイ及び■、ココ−ィング遺伝子の組み合わせの分離。本発明による製造される抗体は、それが拮抗阻害されうろことから明らかなように、抗原、酵素基質等のあらかじめ選択された、若しくはあらかじめ決められたリガンドに対して特異的な結合部位を有する形態をとる。ある１ｌｂｉ様においては、本発明の抗体はあらかじめ選択された抗原に特異的に結合して、該抗原と該結合部位の間に該免疫反応産物が単離されるのに十分な強度の結合を有する免疫反応産物（複合体）を形成する抗原結合部位を形成する。該抗体は一般に１０’Ｍ−’より大きく、より通常には１０６より大きく、好ましくは１０”Ｍ−’より大きい親和力若しくはアビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）を持つ。別のＢ様においては、本発明の抗体は基質に結合して、該基質からの産物形成を触媒する。触媒様抗体のリガンド結合部位の位相はおそらく、その基質に対する親和力（結合定数若しくはｐにａ）よりもそのあらかじめ選択された活性に対しては重要であるが、対象である触媒様抗体はあらかじめ選択された基質について一般に１０’　Ｍ−’より大きく、より通常には１０’Ｍ−’若しくは１０６Ｍ　−１よりも大きく、好ましくは１０’Ｍ−’よりも大きい結合定数を持つ。好ましくは、本発明により製造される抗体はへテロニ量体であり、それゆえに２個の異なるポリペプチド鎖を通常含み、それらはどちらの単独のポリペプチド、すなわちモノマーの親和力若しくは結合定数とも異なる、好ましくはより高い結合親和力若しくは結合定数をあらかじめ選択された抗体に対して有する形態を合わせて取る。異なるポリペプチド鎖の一方若しくは両方は免疫グロブリンの軽鎖及び重鎮の可変領域に由来する０通常、軽（ＶＬ）及び重（ＶＮ）可変領域を含むポリペプチドは合わせて、あらかじめ選択された抗体の結合に使用される。本発明により製造される■８若しくは■、は、ホモ型若しくはヘテロ型のいずれかで、好ましくはへテロニ量体である多量体形態と同様に、単量体でも活性を示すことができる０本発明により製造される■イ及びｖＬリガンド結合ポリペプチドはへテロニ量体（抗体分子）にうまく組み合わせてどちらかの活性を調節するか、若しくは該へテロニ量体に独特の活性を作り出してもよい。個々のりガント結合ポリペプチドをｖ、ｌ及び■１と呼び、ヘテロ二量体を抗体分子と呼ぶことにする。もっとも、■工結合ポリペプチドが、■、に加えて、重鎮の不変領域の実質上全て若しくは一部を含んでもよいことは理解すべきである。ｖＬ結合ポリペプチドは、ｖＬに加えて、軽鎖の不変領域の実質上全て、若しくは一部を含んでもよい。重鎮の不変領域の一部を含む■イ結合ポリペプチド及び軽鎖の不変領域の実質上全てを含むＶＬ結合ポリペプチドを含むヘテロ二量体はＦａｂ断片と呼ばれる。Ｆａｂ中に含まれる付加的不変領域配列はＦｖと比較するとｖＨ及びＶＬの相互作用を安定化できるようなので、Ｆａｂの製造は状況によっては有利となりえる。このような安定化はＦａｂに抗原に対するより高い親和力を持たせることができるであろう。さらに、Ｆａｂは当技術分野においてはより一般的に使用されており、そのためにＦａｂを特異的に認識するのに有効な市販の抗体がより多くある。個々のｖ、Ｉ及びｖＬポリペプチドは通常６０以上のアミノ酸残基、一般には約９５以上のアミノ酸残基、より一般的には約１００以上のアミノ酸残基を有する一方で、通常１２５より少ないアミノ酸残基、より一般的には約１２０より少ないアミノ酸残基を有するであろう、好ましくは、■、ｌは長さが約１１０ないし約１２５アミノ酸残基で、一方■、は長さが約９５ないし約１１５アミノ酸残基であろう。アミノ酸残基配列は、関係する特定の遺伝子型によって幅広く変化するであろう、一般に、約６０ないし７５のアミノ酸残基によって隔てられ、ジスルフィド結合によって結合されている最低２個のシスティンがあるであろう。本発明によって製造されるポリペプチドは通常、免疫グロブリンの重鎮及び／又は軽鎖の可変領域の遺伝子型の実質的なコピーになるであろうが、場合によってポリペプチドが請求める活性を有利に改善するためにアミノ酸残基配列にランダムな変異を含んでもよい。場合によっては、■イ及び■、ポリペプチドの交叉共有結合を作ることが望ましく、これはカルボキシル末端にシスティン残基を供給することにより果たすことができる。該ポリペプチドは通常、免疫グロブリンの不変領域なしに製造されるであろうが、Ｊ領域の小部分はＤＮＡ合成プライマーをうまく選択した結果として含んでもよい。Ｄｒｉｌｌ域は通常、■４の転写に関与するであろう。他の場合によっては、ｖＬ及びＶイを連結するためのペプチドリンカ−を供給して、■や及びｖＬを含む単鎖抗原結合蛋白を形成することが望ましい。この単鎖抗原結合蛋白は一本の蛋白鎖として合成されるであろう。このような単鎖抗原結合蛋白はバードら（Ｂｉｒｄ　ｅｔ　ａｌ、）＋サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、　２４２巻、第４２３−４２６頁、１９８８年に記述されている。適当なペプチドリンカ−領域の設計はロバート・ランドナー（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｌａｎｄｎｅｒ）による米国特許第４，７０４，６９２号に記述されている。このようなペプチドリンカ−は発現ベクター中に含まれる核酸配列の一部として設計してもよかろう、該ペプチドリンカ−をコードする核酸配列は、ｖＨ及びｖＬＤＮＡホモログ、並びにｖＭ及びＶＬＤＮＡホモログを発現ベクターに機能的に結合するのに使用される制限エンドヌクレアーゼ部位の間にあるらしい。このようなペプチドリンカ−は、種々の遺伝子ライブラリーを製造するのに用いられるポリヌクレオチドブライマーの一部である核酸配列によってコードされることもあろう、該ペプチドリンカ−をコードする核酸配列は該プライマーのうちの１個に接続した核酸から作ることができ、あるいは該ペプチドリンカ−をコードする核酸配列は該遺伝子ライブラリーを作成するのに用いられる幾つかのポリヌクレオチドブライマーに接続した核酸配列に由来してもよい。典型的には、Ｖ、及びＶＬポリペプチドのＣ末端領域はＮ末端よりも配列の多様性が大きいと思われ、当計画に基づき、通常現われるＶ、及び■、鎖を変化させられるような修正をさらに行なうことができる１合成ポリヌクレオチドを超可変領域中の１個以上のアミノ酸を変化させるのに使用してもよい。１、レパートリ−の免疫掌上の遺伝子レパートリ−の実質部分を含む核＃組成物を製造するには、■ ８及び／又はＶ、ポリペプチドをコードする遺伝子源が必要となる。好ましくは該遺伝子源は抗体産生細胞、すなわちＢリンパ球（Ｂｍｍフン好ましくはを椎動物の循環若しくは膵臓中に見られるような転位Ｂ細胞の不均買集合であろう。（転位Ｂ細胞は免疫グロブリン遺伝子転置、すなわち転位が起きていることが、隣接した位置に免疫グロブリン遺伝子Ｖ、Ｄ及びＪ領域の転写を持つｍＲＮＡが細胞中に存在することによって明らかにされている。）場合により、多様な段階の年齢、健康及び免疫反応のいずれがらあるを椎動物の細胞を核酸Ｓ（原料細胞）として用いる等によって、あらかじめ選択された活性についてレパートリ−を片寄らせることが望ましい。例えば、転位Ｂ細胞を採集する前に健康な動物に繰り返して免疫化を行なうことにより、高い親和力のりガント結合ポリペプチドを産生ずる遺伝材料を豊富に持つレパートリ−が得られる。逆に、免疫系が過去の近い時点で攻撃されたことのないｇｌｌｉｔな動物からの転位Ｂ細胞を採集すると、高親和力の■ｏ及び／又は■、ポリペプチドの産生に片寄らないレパートリ−を産生ずることになる。核酸を得ようとする細胞集団の遺伝的不均質性が大きくなるほど、本発明の方法によるスクリーニングに利用できるであろう免疫レパートリ−の多様性が増すことに注目すべきである。従って、特に免疫学上有意な年齢差を持つ種々の個体からの細胞及び種々の系統、類若しくは種の個体からの細胞をうまく合わせてレパートリ−の不均質性を増加させることができる。よって、好ましい−ＩｌＫ！様において、原料細胞は、それに対する活性がめられている抗原リガンド（抗原）、すなわちあらかじめ選択された抗原によって免疫、若しくは部分的に免疫されているを椎動物、好ましくは哺乳動物から得られる。免疫は通常の方法により行なってよい、動物における抗体力価は請求められるレパートリ−の増加量若しくは偏向量に対応する段階である請求められる免疫段階を決定するために追跡することができる０部分的に免疫される動物は通常− 回のみの免疫を受け、反応が検出された後早期にそれらから細胞を採集する。完全に免疫された動物は最大力価を示し、それは抗原を宿主哺乳動物に１回以上繰り返して、通常２ないし３週間の間隔で、注射して得られる。一般に、最後の注射の３ないし５日後に膵臓を除去し、その約９０％が転位Ｂ細胞である膵臓細胞の遺伝レパートリ−を標準的方法を用いて単離する。分子生物学における最新プロトコール、アウスベルら（Ａｕｉｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）、＆Ｉ、ジ四ンワイレイアンドサンズ社、ニューヨーク、参照のこと、■、及び■Ｌポリペプチドをコーディングする遺伝子は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭを産生ずる細胞、最も好ましくはＩｇＭ及びＩｇｃを産生ずる細胞に由来してもよい。免疫グロブリン可変領域遺伝子を多様な集合としてそれからクローニングすることができるゲノム遺伝子の断片を製造する方法は当技術分野において周知である０例えば、ヘルマンら（Ｈｅｒｒｗａｎｎｅｔ　ａｔ−）＋メソフ′ゾインエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）＋１５２巻、第１８０−１８３頁、１９８７年；フリシャラフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）、メソッヅ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　）、　］　５２巻、第１８３−１９０頁、１９８７年：フリシャラフ（Ｆｒｉｓｃｈａｕｆ）、メソッヅ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、　１５２巻、第１９０−１９９頁、１９８７年；及びディレーラら（ＤｉＬｅｌｌａ’ｅｔ　ａｌ、　）、メソッヅ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）、　１５２巻、第１９９−２１２頁、１９８７年、を参照のこと。（ここに引用した参考文献の教示はここに参照文として組み入れる。請求める遺伝子レパートリ−は、可変領域を発現する遺伝子を含むゲノム材料若しくは可変領域の転写に相当するメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）のいずれかから単離することができる。非転位Ｂリンパ球以外からのゲノムＤＮＡを用いる難しさは、該可変領域をコードする配列がイントロンによって隔てられている場合に、それを並列させることにある。適当なエクソンを含むＤＮＡ断片を単離し、イントロンを削除し、その後エクソンを適当な順序及び適当な位置にスプライシングしなければならない。大部分においてこれは困難と思われるので、結果として可変領域全体について配列が連続的になる（イントロンがない）ように、Ｃ１，Ｄ及びＪ免疫グロブリン遺伝子領域が隣接するように転位される転位Ｂ細胞を使用する代わりの技術を方法として選択するであろう。ｍＲＮＡを利用する場合、細胞はＲＮａｓｅ阻害条件下で溶解させるであろう。 −態様において、最初の段階は全細胞ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースカラムへのハイブリダイゼーションによって単離することである。重鎮及び／又は軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在をその後適当な遺伝子のＤＮＡ一本領とのハイブリダイゼーションによりアッセイすることができる。都合のよいことに、■８及び■、の不変部分をコードする配列をポリヌクレオチドプローブとして使用してもよく、該配列は入手可能な材料から得ることができる０例えば、アーリイ及びフッド（Ｅａｒｌｙ　ａｎｄ　Ｈｏｏｄ）、遺伝子工学、セットロウ及びホレンダー（Ｓｅｔｌｏｗ　ａｎｄ　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ）　Ｍｉ、第３巻、ブレナム出版社、ニューヨーク、１９８１年、第１５７−１８８頁；及びカバトら（Ｋａｂａｔｅｔ　ａｌ、Ｌ免疫学的重要性を持つ配列、米国保健協会、ベテスタ、メリーランド州、１９８７年を参照のこと。好ましい態様においては、全細胞ｍ　ＲＮ　Ａを含む調製物において最初にｖＨ及び／又はｖＬココ−ィングｍＲＮＡの存在を増加させる。この増加は、典型的には全−ＲＮＡ調製物若しくはその部分精製ｍＲＮＡ製品を、本発明のポリヌクレオチド合成プライマーを用いてプライマー伸張反応にかけることにより成される。２、ポリヌクレオチドプローブ−〇　゛プライマーに関してここで用いる６ボリヌクレオチド“という用語、プローブ、及びプライマー伸張により合成されるべき核酸断片若しくは切片は、２個以上、好ましくは３個より多いデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドを含む分子と定義される。その正確なサイズは多くの要因に依存するであろうし、その多くの要因もまた最終的な使用条件に依存する。ここで用いる“プライマー°という用語は、核酸の制限断片から精製されたものであるか合成されたものであるかにかかわらず、ａｒ＃Ｉ￥に相補的なプライマー伸張産物の合成が誘導される条件下、すなわち、ヌクレオチド並びにＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等の重合剤が存在し、適当な温度及びｐＨにある時に、合成開始点として作用することができるポリヌクレオチドを意味する。プライマーは最大効率を得るには好ましくは一本鎖であるが、あるいは二本鎖でもよい、二本鎖の場合、プライマーを伸張産物の製造に使用する前に最初にプライマーの鎖を分離する処理を施す。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチドである。該プライマーは重合剤の存在下で伸張産物の合成を開始させるに十分の長さでなければならない。該プライマーの正確な長さは、温度及びプライマー源を含む多くの要因に依存するであろう。例えば、標的となる配列の複雑さによって、ポリヌクレオチドプライマーは通常１５ないし２５、若しくはそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドでもよい、短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低温であることがめられる。ここで用いるプライマーは合成若しくは増幅しようとする各特異配列の種々の鎖に対して“実質的に”相補的であるように選択される。このことは、該プライマーがそのおのおのの鋳型鎖と非ランダムハイブリダイズするのに十分なだけ相補的でなければならないことを意味する。それゆえに、該プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映してはならない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片は、該プライマー配列の残りが該鎖に対して実質的に相補的であるプライマーの５′末端に結合することができる。このような非相補的断片は通常、エンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。あるいは、該プライマー配列が、合成若しくは増幅されるべき鎖の配列に対して、それに非ランダムにハイブリダイズし、それによってポリヌクレオチド合成条件下で伸張産物を形成するのに十分な相補性を持つ場合に、非相補的塩基若しくはより長い配列を該プライマー中に散在させてもよい。該ポリヌクレオチドブライマーは、例えばホスホトリエステル法若しくはホスホジエステル法等のいずれの適当な方法を用いて製造してもよい。ナラングら（Ｎａｒａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　）、メソッヅインエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、６８巻、第９０頁、１９７９年；米国特許第４．３５６．２７０号、及びブラウンら（Ｂｒｏｗｎ　ｅｔ　ａｌ、　）。メソッヅインエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、６８巻、第１０９頁、１９７９年、を参照のこと。プライマーのヌクレオチド配列の選択は、該核酸のめるレセプターをコードする領域からの距離、使用するいずれかの第２のプライマーに関係する核酸上のそのハイブリダイゼーション部位、それがハイブリダイズすべきレパートリ−中の遺伝子の数等の要因に依存する。例えば、プライマー伸張によってＶｌ、ｌコーディングＤＮＡホモログを産生ずるために、プライマーのヌクレオチド配列は、機能的（結合可能な）ポリペプチドが得られるように該ｖＨココ−ィング領域に実質的に隣接する部位で複数の免疫グロブリン重鎮遺伝子にハイブリダイズするように選択される。複数の異なるＶ□ココ−ィング核酸鎖にハイブリダイズするには、該プライマーは種々の鎖間に保存されているヌクレオチド配列の実質的な相補物でなければならない。そのような部位には、不変領域、可変領域骨格領域のいずれか、好ましくは第三骨格領域、リーダー領域、プロモーター領域、Ｊ領域等のヌクレオチド配列が含まれる。本発明のプライマーはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列若しくはその相補物を含んでもよい。例えば、クリーブら（Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ、　）、ヌクレイックアシッヅリサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、　１２巻、第７０５７−７０頁、１９８４年；スチューブイアら（Ｓｔｕｃｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）、１８９巻、第１１３−１３０頁、１９８６年：及び分子クローニング；実験マニュアル、第２版、マニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　）編、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、１９８９年、を参照のこと。ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを使用する場合、該プライマーは増幅すべきポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズし、該ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーラゼプロモーターの第２のポリヌクレオチド鎖はイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼｒ若しくはイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■のクレノー断片等の誘導剤を用いて完成される。その後ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを加えることにより相補的ＲＮＡポリヌクレオチドが製造される。ＲＮＡポリヌクレオチドの原料ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドとＤＮＡポリヌクレオチドの産生の間を交替することにより増幅される。ｖつコーディング及び■、ココ−ィングＤＮＡホモログをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅により製造しようとする場合、増幅すべき核酸のコーディング鎖のそれぞれに対して２個のプライマーを使用しなければならない、第一プライマーはナンセンス（マイナス若しくは相補）鎖の一部となり、該レパートリ−中のＶＮ　（プラス）鎖の間に存在されているヌクレオチド配列にハイブリダイズする５ＶＩＩコーデイングＤＮＡホモログを製造するには、それゆえに第一プライマーを免疫グロブリン遺伝子のＪｓＩ域、ＣＨＩＳＩ域、ヒンジＷｉＭＡ、ｃＨ２領！、若Ｌ＜はＣＨ３１［域等の中の保存されている領域にハイブリダイズする（すなわち、相補的である）ように選択するｓＶＬコーディングＤＮＡホモログを製造するには、第一プライマーを免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＪ領域若しくは不変領域等の中の保存されている領域にハイブリダズする（すなわち、相補的である）ように選択する。第ニプライマーはコーディング（プラス）鎖の一部となり、マイナス鎖の間に保存されているヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ＶにコーディングＤＮＡホモログを製造するには、第ニプライマーは、それゆえにリーダー若しくは第１骨格領域をコードするその範囲内にあるようなＶＨココ −ィング免疫グロブリン遺伝子の５′末端の保存されているヌクレオチド配列にハイブリダイズするように選択する。Ｖｏ及びＶ、コーディングＤＮＡホモログの両方を増幅する場合、第ニプライマーの保存されている５′ヌクレオチド配列は、ローら（Ｌｏｈ　ｅｔ　ａｌ、　）、サイエンス（Ｓｃｉ、　）、２４３巻、第２１７−２２０頁、１９８９年に述べられているように末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて外から加えた配列に対して相補的であってもよい。第−及び第ニプライマーの一方若しくは両方がエンドヌクレアーゼ認識部位を規定するヌクレオチド配列を含んでもよい。該部位は増幅される免疫グロブリン遺伝子に対して非対応でもよく、通常該プライマーの５′末端若しくはその近辺に見られる。３、遺伝　ライブラリーの製造単離されたレパートリ−中に含まれるＶＨ及び／又はｖＬ遺伝子のクローニング、すなわち実質的な複製のために使用するストラテジーは、当技術分野において周知であるように、該レパートリ−を形成する核酸の型、複雑度及び純度に依存するであろう。他の因子には該遺伝子が増幅されかつ／又は突然変異をうけることになるかどうかが含まれる。あるストラテジーにおいて、目的はｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡのセンス（ｓｅｎｓｅ）鎖等のポリヌクレオチドコーディング鎖を含むレパートリ−からＶＨ及び／又はＶＬココ−ィング遺伝子をクローニングすることにある。該レパートリ−が二本鎖ゲノムＤＮＡの形態をとる場合、一般的にはそれをまず、通常は溶解により、一本領に変性させる。該レパートリ−を、あらかじめ選択されたヌクレオチド配列を持つ第一ポリヌクレオチド合成プライマーで該レパートリーを処理（接触）することにより最初の一次伸張反応にかける。該第−プライマーは該レパートリ−中に保存されているヌクレオチド配列、好ましくは長さが最低約１０ヌクレオチド、より好ましくは長さが最低約２０ヌクレオチドのものにハイブリダイズすることにより、第一プライマー伸張反応を開始することができる。第一プライマーは核酸のコーディング鎖若しくはセンス鎖にハイブリダイズするため本明細書で“センスプライマー”と時折呼ぶことがある。第ニプライマーは核酸の非コーディング鎖若しくは非センス鎖、すなわちコーディング鎖に相補的な鎖に対合するため、“非センスプライマー゛と時折呼ぶことがある。第一プライマー伸張は、好ましくはあらかじめ決められた量の、第一プライマーを、好ましくはあらかじめ決められた量の、該レパートリ−の核酸と混ぜて第一プライマー伸張反応混合物を作ることにより行なわれる。該混合物をポリヌクレオチド合成条件下に、一般にはあらかじめ決められた、第一プライマー伸張反応産物の形成に十分であり、それゆえに複数の異なる■やコーディングＤＮＡホモログ相補物を産生ずるだけの期間中維持する。該相補物をその後、あらかじめ選択されたヌクレオチド配列を持つ第二ポリヌクレオチド合成プライマーでそれらを処理することにより第ニプライマー伸張反応にかける。該第ニプライマーは、例えば第一プライマー伸張反応により産生されたもののような複数の異なるＶ、コーディング遺伝子相補物の間に保存されているヌクレオチド配列、好ましくは長さが最低約１０ヌクレオチドのもの、より好ましくは長さが最低約２０ヌクレオチドのものにハイブリダイズすることにより、第２の反応を開始することができる。これは、好ましくはあらかじめ決められた量の、第ニプライマーを、好ましくはあらかじめ決められた量の、相補核酸と混ぜて第ニプライマー伸張反応混合物を作ることにより成される。該混合物をポリヌクレオチド合成条件下に、一般にはあらかじめ決められた、第ニプライマー伸張反応産物の形成に十分であり、それゆえに複数の異なるＶ。及び／又は■、ココ−ィングＤＮＡホモログを含む遺伝子ライブラリーを産生ずるだけの期間中維持する。各増幅において、複数の第一プライマー及び／又は複数の第ニプライマーを使用してもよく、あるいは第−及び第ニプライマーの固有のペアを使用してもよい。いずれの場合でも、同じ若しくは異なる組み合わせの第−及び第ニプライマーを用いた増幅の増幅産物を合わせて遺伝子ライブラリーの多様性を増すことができる。別のストラテジーにおいては、目的は、ゲノムｄｓＤＮＡの非センス鎖、若しくは■ＲＮＡを逆転写酵素反応にかけることにより産生されたポリヌクレオチド等の該レパートリ−のポリヌクレオチド相補物を供給することにより、該レパートリ−からｖ、Ｉ及び／又はｖＬココ−ィング遺伝子をクローニングすることにある。このような相補物を製造する方法は当技術分野において周知である。該相補物を、上述の第ニプライマー伸張反応と同様のプライマー伸張反応、すなわち複数の異なる■９コーディング遺伝子相補物の間に保存されているヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド合成プライマーを用いるプライマー伸張反応にかける。該プライマー伸張反応は何らかの適当な方法を用いて行なわれる。一般的には、それは好ましくはｐＨが７−９、最も好ましくは約８の水性溶液バッファー中で行なわれる。好ましくは、過剰モル量（ゲノム核酸に対して；通常約１０’ｌプライマー：鋳型）のプライマーを鋳型鎖を含むバッファー中に混合する。該工程の効率を改善にするには大過剰モルが好ましい。デオキシリボヌクレオチド３リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰも適当な量を該プライマー伸張（ポリヌクレオチド合成）反応混合物に加え、できた溶液を約９０℃−１００℃に約１ないし１０分間、好ましくは１ないし４分間加熱した。この加熱期間の後、ブライマーハイブリダイゼーションに好ましい室温まで冷却させる。この冷却された混合液にプライマー伸張反応を誘導若しくは触媒するのに適当な試薬を加え、当技術分野において周知の条件下で反応を行なわせる。＠合成反応は室温から、それ以上では誘導剤がもはや有効に作用しなくなる温度までの間で行なうことができる。従って、例えばＤＮＡポリメラーゼを誘導剤として使用する場合、温度は通常約４０℃以下である。誘導剤は、プライマー伸張産物の合成をなし遂げるように作用するであろう、酵素を含むいずれの化合物若しくは系でもよい。この目的に対して適当な酵素には、例えばイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ■、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及びヌクレオチドが適正な様式に結合して各核酸鎖に相補的なプライマー伸張産物を形成するのを促進するであろう熱安定性酵素を含む他の酵素がある。一般に、該合成は各プライマーの３′末端で開始され、合成が終了するまで鋳型鎖に沿って５′方向へ進み、種々の長さの分子を産生ずることになる。もっとも、５′末端で合成を開始して、上記と同じ方法を用いて上の方向へ進める誘導剤があってもよい。ｔｆｍ導剤は、ＲＮＡプライマー伸張産物の合成を遂行するように作用するであろう、酵素を含む化合物若しくは系でもよい、好ましい態様においては、該誘導剤はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ若しくはＳ　Ｐ　６　ＲＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼでもよい。これらのＲＮＡポリメラーゼは本発明のプライマー中に含まれるプロモーターから合成を開始する。これらのポリメラーゼは相補的ＲＮＡポリヌクレオチドを産生ずる。チャンバーリンら（Ｃｈａｓｂｅｒｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、）＋酵素、Ｐ、ボイヤーＣＰ、　Ｂｏｙｅｒ）１ｍ、第８７−１０８頁、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８２年に述べられているように、ＲＮＡポリメラーゼの高いターンオーバー速度が原料ポリヌクレオチドを増幅する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの別の利点は、ジツイスら（Ｊｏｙｃｅ　ｅｔ　ａｌ、）、ヌクレイフクアシッヅリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ）、　１７巻、第７１１−７２２頁、１９８９年によって先に述べられているように、ｃＤＮＡの一部を１個以上の突然変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置換し、部分的に誤ハイプリダイゼーシッンのある鋳型を直接に転写することにより、ポリヌクレオチド合成中に突然変異を導入することができることにある。誘導剤がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーラゼでありそれゆえにリボヌクレオチド３リン酸を組み込んでいる場合、十分量のＡＴＰ　。ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰがプライマー伸張反応混合物に混合され、できた溶液が上述のように処理される。新しく合成された鎖及びその相補的核酸鎖は該製法の次の段階で使用することができる二本鎖分子を形成する。上で考察した第−及び／又は第ニプライマー伸張反応は、免疫学的検出及び／又はレセプターの単離に有用なあらかじめ選択されたエピトープをレセプター中に組み込むのにうまく使用することができる。これは、該レセプターのアミノ酸残基配列中にあらかじめ決めたアミノ酸残基配列を組み込むために、第−及び／又は第二ポリヌクレオチド合成プライマー若しくは発現ベクターを利用することによってなし遂げられる。レパートリ−中の複数の異なる■。及び／又はｖＬココ−ィング遺伝子に対するｖ８及び／又はｖＬココ−ィングＤＮＡホモログを製造した後、該ホモログを典型的に増幅する。Ｖや及び／又は■、ココ−ィングＤＮＡホモログは自律的復製（ａｕｔｏｎｏ履ｏｕｓｌｙｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）ベクター中に組み込む等の古典的技法によって増幅してもよいが、ＤＮＡホモログをベクター中に挿入する前にそれらをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）にかけることによって、ＤＮＡホモログを最初に増幅することが好ましい、実際に、好ましい方法においては、遺伝子ライブラリーを製造するために使用される第−及び／又は第ニプライマー伸張反応は、ポリメラーゼ鎖反応における第−及び第ニプライマー伸張反応である。ＰＣＲは通常、上述の第−及び第ニプライマー伸張反応を循環させること、すなわち、１混合物中で同時に行なわせることにより実行され、各サイクルはポリヌクレオチド合成とそれに続ぐできた二本鎖ポリヌクレオチドの変性を含む、ＤＮＡホモログの増幅における方法と系はいずれもマリスら（Ｍｕｌｌｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）による米国特許第４，６８３．１９５号及び第４，６８３，２０２号に述べられている。好ましい態様においては、一対のみの第−及び第ニプライマーを増幅反応１回につき使用する。それぞれ複数の異なるプライマー対を使用した複数回の異なる増幅から得られた増幅反応産物をその後金わせる。もっとも、本発明は共増幅（２対のプライマーを使用）及び複合増幅（最大約８．９若しくは１０プライマ一対を使用）にょるＤＮＡホモログ製造にも関する。ＰＣＲ増幅により製造されたＶｌ、Ｉ及びＶＬココ−ィングＤＮＡホモログは通常２本鎖形態をとり、それぞれの末端に連続若しくは隣接してエンドヌクレアーゼ制限部位を規定するヌクレオチド配列を持つ、末端若しくはその近辺に制限部位を存するｖ７及びｖＬココ−ィングＤＮＡホモログを１個以上の適当なエンドヌクレアーゼで切断することにより、あらかじめ決められた特異性の粘着末端を持つホモログが製造される。好ましい態様においては、ＰＣＲ法は該ライブラリーの■イ及び／又は■Ｌココ−ィングＤＮＡホモログを増幅するだけでなく、該ライブラリー中に突然変異を誘発し、それによってより大きな不均質性を持つライブラリーを提供する。第一に、ＰＣＲ法はそれ自身、当技術分野において周知の種々の要因によって本質的に突然変異誘発性であることに注意すべきである。第二に、上に参照した米国特許第４．６８３．１９５号に述べられている突然変異誘発性変異に加えて、他の突然変異誘発性ＰＣＲ変異も使用できる０例えばＰＣＲ反応混合物、すなわち第−及び第ニプライマー伸張反応混合物を合わせたものは、該伸張産物中に組み込まれるべき種々の量の１個以上のヌクレオチドを伴なって作られてもよい、このような条件下で、該ＰＣＲ反応は特定の塩基の欠乏の結果として伸張産物中にヌクレオチド代用物を製造しながら進行する。同様に、初期ＰＣＲ反応混合物中に、Ｘ回のサイクルを有効に行なえる量のほぼ等モル量のヌクレオチド類を組み込み、その後に該混合物を、例えば２Ｘ回等のＸより過剰のサイクル数を循環させてもよい、あるいは、該反応混合物中に、増幅されるレパートリ−の核酸中に通常見られない、イノシン等のヌクレオチド誘導体を組み込むことによってＰＣＲ反応期間中に突然変異を誘発してもよい、しかる後のインビボ増幅期間中に、ヌクレオチド誘導体が代用ヌクレオチドと置き換えられ、それによりポイント突然変異が誘発されるである上述の方法によって製造されたライブラリー中に含まれるＶ。及び／又はＶ、コーディングＤＮＡホモログは、増幅及び／又は発現用ベクターに機能的に結合させることができる。ここで使用する“ベクター”という用語は、種々の遺伝環境間で、それが機能的に結合している他の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。好ましいベクターの１つの型はエピソーム、すなわち染色体外複製ができる核酸分子である。好ましいベクターはそれらが結合している核酸の自律的複製及び／又は発現が可能なものである。それらが機能的に結合している遺伝子の発現を指示することができるベクターをここでは“発現ベクター”と呼ぶ。ｖＨ及び／又はＶＬココ−ィングＤＮＡホモログが機能的に結合するベクターの選択は、当技術分野において周知のように請求められる機能的性質、例えば複製若しくは蛋白発現、及び形質転換を受ける宿主細胞に直接依存し、これらは組み換えＤＮＡ分子構築の技術分野において固有の制限である。好ましい態様において、使用されるベクターには原生生物レプリコン、すなわちそれにより形質転換される原生生物宿主細胞、例えば細菌性宿主細胞中の染色体外の組み換えＤＮＡ分子の自律的複製及び維持を指示することができるＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当技術分野において周知である。さらに、原生生物レプリコンを含む態様は、それにより形質転換された細菌性宿主に、薬物耐性等の選択的長所がその発現によって与えられるような遺伝子も含む。一般的な細菌性薬物耐性遺伝子はアンピシリン若しくはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。原生生物レプリコンを含むそれらのベクターは、それにより形質転換されたイー・コ’Ｊ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）等の細菌性宿主細胞中にＶＨ及び／又はＶ、コーディングホモログの発現（転写及び翻訳）を指示することができる原生生物プロモーターを含んでもよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させて転写を起こさせるＤＮＡ配列によって形成される発現調節要素である。細菌性宿主に適合性のあるプロモーター配列は通常、本発明のＤＮＡ切片の挿入に都合のよい制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。このようなベクタープラスミドの代表例としては、バイオラッドラボラトリーズ社（リッチモンド、カリフォルニア州）から入手できるｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、及びファルマシア社（ビス力タウエイ、ニューシャーシー州）から入手できるｐＰＬ及びｐＫＫ２２３がある。真核生物細胞に適合性のある発現ベクター、好ましくはを椎動物細胞に適合性のある発現ベクターも使用することができる。真核生物細胞発現ベクターは当技術分野において周知であり、いくつかの発売元から入手できる。一般に、そのようなベクターはめるＤＮＡホモログの挿入に都合のよい制限部位を含んで供給される。このようなベクターの代表例には、ｐＳｖＬ及びｐＫＳＶ＝ＩＯ（ファルマシア社）　、ｐＢＰＶ−１／ＰＭＬ２ｄ　（インターナショナルバイオテクノロジイ社）及びｐＴＤＴｌ　（ＡＴＣＣ。第３１２５５号）がある。好ましい態様において、使用される真核生物細胞発現ベクターには、真核細胞において有用な選択マーカー、好ましくは薬物耐性選択マーカーが含まれる。好ましい薬物耐性マーカーはその発現がネオマイシン耐性をもたらす遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーセ（ｎｅｏ）遺伝子である。サザンら（Ｓｏｕｔｈｅｒｎｅｔａｌ、）、ジャーナルオブモリキュラーアンドアプライドジエネティクス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）、１巻、第３２７−３４１頁、１９８２年。ＶＷ及び／又はＶＬココ−ィングＤＮＡホモログの遺伝子を発現させるためのレトロウィルス発現ベクターの使用も企図されている。ここで用いる“レトロウィルス発現ベクター”という用語はレトロウィルスゲノムの長い末端反復（ＬＴＲ）領域に由来するプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。好ましい態様においては、該発現ベクターは通常、好ましくは真核生物細胞中では複製不能のレトロウィルス発現ベクターである。レトロウィルスベクターの構造及びその使用に関してはリーダら（Ｓｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、　）、モリキュラーアンドセルラーバイオロジイ（Ｍｏ１．　Ｃｅ１．　Ｂｉｏｌ、　）、　４巻、第１７３０−１７３７頁、１９８４年に述べられている。ＤＮＡを相補的粘着末端によりベクターに機能的に結合させるために種々の方法が開発されている。例えば、相補的粘着末端を、先に考察したように適当に設計されたポリヌクレオチド合成プライマーを使用することにより、プライマー伸張反応期間中にＶＨ及び／又はＶＬココ−ディングＤＮＡホモログ中工作することができる。該ベクター、及び必要ならばＤＮＡホモログは、制限エンドヌクレアーゼに開裂されて、ＤＮＡホモログの末端に相補的な末端を作り出す。該ベクター及びＤＮＡホモログの相補的粘性末端がその後機能的に結合（連結）されて、二本鎖ＤＮＡ分子単位を作成する。好ましい態様においては、多様なライブラリーの■エコーディング及びｖＬココ −ィングＤＮＡホモログを個々のベクターからの多シストロン性発現のためにインビトロでランダムに組み合わせる。すなわち、二本鎖ＤＮＡ発現ベクターの多様な集合が作り出され、そこでは単一プロモーターの調節下で各ベクターが１個のｖ８コーディングＤＮＡホモログ及び１個のｖＬココ−ィングＤＮＡホモログを発現し、該集合の多様性は種々の■８及び■。コーディングＤＮＡホモログの組み合わせの結果として起こる。インビトロでのランダムな組み合わせは、それぞれにおける両者に共通の制限部位の位置により互いに識別される２個の発現ベクターを用いて成し遂げることができる。好ましくは、該ベクターはここで述べられるラムダＺａｐ誘導ベクター等の線状二本鎖ＤＮＡである。第一ベクターにおいて、制限部位はプロモーターとポリリンカーの間、すなわちポリリンカーに対して３′末端（発現方向に対して下流）ではなく５′末端（発現方向に対して上流）に位置する。第二ベクターにおいては、ポリリンカーがプロモーターと制限部位の間に位置し、すなわち、制限部位がポリリンカーに対して３′末端に位置し、ポリリンカーはプロモーターに対して３′末端に位置する。好ましい態様において、各ベクターはりボゾーム結合及びリーダーをコードするヌクレオチド配列を規定し、該配列はプロモーター及びポリリンカーの間に位置するが、共有制限部位がプロモーター及びポリリンカーの間にある場合はそれよりも下流（３′末端）に位置する。同時に、停止コドンを、ポリリンカーよりも下流であるが、共を制限部位がポリリンカーよりも下流にある場合にはいずれの共有制限部位よりも上流に含むベクターも好ましい、第−及び／又は第二ベクターはペプチド標識をコーディングするヌクレオチド配列を規定してもよい、該標識配列は通常ポリリンカーよりも下流であるが停止コドンが存在する場合はいずれの停止コドンよりも上流に位置する。好ましい態様においては該ベクター類は、そのベクターの一部、すなわち特定のラムダアームの存在がそれにより、若しくはそれに対して選択できるような、選択可能なマーカーを含む。通常の選択可能なマーカーは当業者に周知である。このようなマーカーの例としては、抗生剤耐性遺伝子、遺伝的選択可能マーカー、アンバーサプレッサー等の突然変異サプレッサーなどがある。選択可能なマーカーは通常、プロモーターの上流かつ／又は第２制限部位の下流に位置する。好ましい！Ｓ様においては、■、コーディングＤＮＡホモログを含む第一ベクター上のプロモーターの上方に１個の選択可能マーカーが位置する。第２の選択可能マーカーは、ＶＬココ−ィングＤＮＡホモログを含むベクター上の第２制限部位の下流に位置する。 ■、コーディングベクター及びｖＬココ−ィングベクターが第１制限部位によってランダムに結合されている際に、その結果できた■。及びｖＬの両方並びに両方の選択可能マーカーを含むベクターが選択できさえすれば、この第２の選択可能マーカーは第１のものと同−若しくは異なっていてもよい。通常、該ポリリンカーは１個以上、好ましくは最低２個の、それぞれがベクターに固有であって好ましくは他のベクターと共有されない、すなわちそれが第一ベクター上にあるならば、第二ベクター上にはそれがないような、制限部位を規定するヌクレオチド配列である。該ポリリンカー制限部位は■４若しくは■Ｌココ −ィングＤＮＡホモログを、該ベクター中の存在するいずれのリーダー、標識若しくは停止コドン配列とも同じ読取りフレーム内に連結させるように位置付けられる。ランダムな組み合わせはＶＨココ−ィングＤＮＡホモログを第一ベクター中の、通常ポリリンカー中の制限部位（類）にＶＨココ−ィングＤＮＡホモログを連結することによって成される。同様に、ｖＬココ−ィングＤＮＡホモログは第二ベクター中に連結され、それにより２個の異なる発現ベクター集団を作る。ＤＮＡホモログのどちらのタイプ、すなわちＶＨ若しくはｖＬがどちらのベクターに連結されるかは重要ではないが、例えばＶＨココ−ィングＤＮＡホモログの全てが第−若しくは第二ベクターのいずれかに連結され、■、ココ−ィングＤＮＡホモログの全てが該第−若しくは第二ベクターのうちのもう一方のほうに連結されることが好ましい。両集団のメンバーはその後エンドヌクレアーゼによって共有制限部位で開裂されるが、これは通常同じ酵素によって両方の集団を切断することによる。できた産物は２つの異なる制限断片の集合となるが、一方のメンバーは他方のメンバーの粘着末端に相補的な粘着末端を有する。２集合の制限断片は互いにランダムに連結され、すなわちランダムな異集団間連結が行なわれて、同じ読取りフレーム内に位置し、第二ベクターのプロモーターの調節下にあるＶ。コーディング及びＶＬココ−ィングＤＮＡホモログをそれぞれに持つ異なる集団のベクターが産生される。もちろん、その後の組み換えは、２集団からのメンバーの連結の際に通常修正される共有制限部位における開裂及びそれに続く再連結を通じてもたらすことができる。できた構造物をその後適当な宿主中に導入して、別々若しくは組み合わせてのいずれかの形で、ＶＨ及び／又はｖＬココ−ィングＤＮＡホモログの増幅及び／又は発現を行なわせる。同−若しくは異なるベクター上のいずれかで同じ生物中で共発現させた場合、機能的に活性なＦｖが産生される。Ｖ）ｌ及びｖＬポリペプチドを異なる生物中に発現させた場合、それぞれのポリペプチドを単離した後、適当な培地中で合わせてＦｖを形成させる。■、及び／又は■Ｌココ−ィングＤＮＡホモログを含む構造物がその中に導入されている細胞性宿主のことをここでは“形質転換されている″若しくは“形質転換体”と呼ぶ。宿主細胞は原生生物若しくは真核生物のいずれでもよい、細菌細胞は好ましい原生生物宿主細胞であり、通常例えばベセスダリサーチラボラトリーズ、ベセスダ、メリーランド州から入手できるイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｄ　Ｈ５株等のイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）株である。好ましい真核生物宿主細胞には酵母及び哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サル若しくはヒト細胞系からのもの等のを椎動物細胞が含まれる。本発明の組み換えＤＮＡ分子による適当な細胞宿主の形質転換は、使用するベクターの型に通常依存する方法により成し遂げられる。原生生物宿主細胞の形質転換に関しては、例えばコーエンら（Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、）＋　ブロシーディングスオブナシヲナルアヵデミイオプサイエンスＵＳＡ　（Ｐｒｏ、　Ｍａｔ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）＋　６９巻、第２１１０頁、１９７２年及びマニアチスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、）。分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバ−研、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク州（１９８２）を参照のこと。ｒＤＮＡを含むレトロウィルスベクターによるを椎動物細胞の形質転換に関しては、例えばリーダら（Ｓｏｒｇｅ　ａｔ　ａｌ、）。モリキュラーアンドセルラーバイオロジイ（門ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、）。４巻、第１７３０−１７３７頁、１９８４年；グラハムら（Ｇｒａｈａ＋ｍａｔ　ａｌ、）＋パイラロジイ（Ｖｉｒｏｌ、）、５２１’、第４５６頁、１９７３年；及びウィグラーら（１４ｉｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）＋プロシーディングスオブナシッナルアカデミイオプサイエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、　７６　％、第１３７３−１３７６頁、１９７９年を参照うまく形質転換された細胞、すなわちベクターに機能的に結合されたＶＨ及び／又は■１コーディングＤＮＡホモログを含む細胞は、レセプターのりガントへの結合、若しくはレセプターを、好ましくはその活性部位を、コーディングするポリヌクレオチドの存在を検出するためにいずれの適当な周知の技法によって同定してもよい。好ましいスクリーニングアッセイは、レセプターによるリガンド結合が直接的若しくは間接的のいずれかで検出可能な信号を出すようなものである。このような信号としては、例えば複合体の産生、触媒反応産物の形成、エネルギー発生若しくは摂取等がある。例えば、被験ｒＤＮＡによる形質転換をうけた集団からの細胞をクローニングしてモノクローナルコロニーを産生させてもよい。それらのコロニーがらの細胞を収集し、溶解して、そのＤＮＡ含量を、サザン（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ）　＋　ジャーナルオブモリキュラーバイオロジイ（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、）、　９８巻、第５０３頁、１９７５年、若しくはベレフトら（Ｂｅｒｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ−）＋バイオチクノロシイ（Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ、）、３Ｓ１第２０８頁、１９８５年に述べられているような方法を用いて、ｒＤＮＡの存在について検査してもよい。 ■、及び／又はｖＬココ−ィングＤＮＡホモログの存在に対する直接的アッセイに加えて、形質転換がうまくいっていることは周知の免疫学的方法によって、特に産生される■イ及び／又はＶＬポリペプチドがあらかじめ選択されたエピトープを含む場合に、確認することができる。例えば、形質転換されていることが推測される細胞サンプルをあらかじめ選択されたエピトープの存在について該エピトープに対する抗体を用いてアッセイする。６、ＶＰ及び／又はＶ　ｔコーディング遺伝子ライブラリ一本発明は、ここで述べたプライマー伸張反応若しくはプライマー伸張反応の組み合わせによって好ましくは製造され、最低約１０３、好ましくは最低約１０４及びより好ましくは最低約１０５の異なるＶＵ及び／又はＶＬココ−ィングＤＮＡホモログを含む遺伝子ライブラリーに関する。該ホモログは好ましくは単離された形態、すなわち、例えばプライマー伸張反応剤及び／又は基質、ゲノムＤＮＡ切片等の材料を実質的に含まないものである。好ましい態様においては、該ライブラリー中に存在するホモログの実質的部分は、ベクターに機能的に結合しており、好ましくは発現のために発現ベクターに機能的に結合している。好ましくは、該ホモログは水、バッファー塩を含む水等の、インビトロ操作に適した培地中に存在する。該培地はホモログの生物学的活性の維持に影響を及ぼしてはならない。さらに、該ホモログはそれらと適合する宿主細胞を妥当な頻度で形質転換させるのに十分な濃度で存在すべきである。該ホモログがそれらによって形質転換された適合性のある宿主細胞中に存在することがさらに好ましい。Ｄ一旦里さＬヱ二本発明はまた、とりわけ本発明の方法を実施する際に有用な種々の発現ベクターに関する。それぞれの該発現ベクターはラムダＺａｐの新規誘導体である。ｌ−之ムｌ二亜且ラムダＺａｐＩＩは、ベクターラムダＺａｐのラムダＳ遺伝子を、実施例６に述べるように、ラムダｇｔｌＯベクターからのラムダＳ遺伝子で置き換えることにより製造される。２、ラムダＺａＩＩＶ□ ラムダＺａρ■Ｖ、は図６Ａに図解されている合成りＮＡ配列を上記のラムダＺａｐｎヘクター中に挿入することにより製造される。挿入されたヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡの蛋白中への翻訳を適正に模倣させるリボゾーム結合部位（シャイン−ダルガル／配列）及び翻訳された蛋白を周辺原形質へ効率よく導くリーダー配列をうまく供給する。ラムダＺａｐｎＶイの製造は実施例９により詳しく述べてあり、その特徴は図６Ａ及び７に図解されている。３・ｉム１１■↓呈ＬラムダＺａｐＩＩＶＬは実施例１２に述べるように、図６Ｂに図解されている合成りＮＡ配列をラムダＺａｐＩＩ中に挿入することにより製造される。ラムダＺａｐＩ［Ｖ、の重要な特徴は図８に図解されラムダＺａｐＵｖＬ■は実施例１１に述べられるように、ＩＭＩＯに図解されている合成りＮＡ配列をラムダＺａｐｌｒ中に挿入することにより製造される。上記のベクター類はイー・コリ（［＋、　ｃｏｌｉ）宿主に適合しており、すなわち発現のためにそれらが機能的に結合している遺伝子によってコーディングされている蛋白をそれらは発現して周辺原形質中に分泌することができる。実施■ 以下の実施例は本発明の範囲を制限するものではなく、これを説明するためのものである。１、ボ盲ヌクレオチドの′ 免疫グロブリンたんばく質ＣＤＲＩＩをコードするヌクレオチド配列は非常に変化に冨む、しかし、ｖＮ　ドメインに隣接して非常に保存性の高い領域がいくつかある。すなわち実質的に保存性の高い配列、つまり同じプライマー配列にハイブリダイズする配列がある。それゆえ、これらの保存的配列にハイブリダイズし、かつベクターに合成したＤＮＡフラグメントを機能的に結合させるのに適した制限部位を生成したＤＮＡホモログに組込むポリヌクレオチド合成（増巾）プライマーを構築した。特に、このＤＮＡホモログはラムダＺＡＰｎベクター（ストラタジーンクローニングシステム、サンディエゴ、ＣＡ）のＸｈｏＩ及びＥｃｏＲ１部位に挿入する。ＶＨドメインを増巾するためＪ□領領域ｍＲＮＡに相補的となるように３′プライマー（第１表のプライマー１２）を設計した。全ての場合５′プライマー（第１表、プライマー１〜１０）は保存的Ｎ−末端領域の第１鎖ｃＤＮＡ　（アンチセンス鎖）に相補的となるように選択した。最初の増巾は５個の部位で縮退する３２個のプライマー混合物（第１表、プライマーｌ）を用いて行った。ハイブリドーマｍＲＮＡは混合プライマーで増巾し得るが膵臓からｍＲＮＡを増巾する最初の試みはいろいろな結果を与えた。それゆえ、混合５′ プライマーを用いた何度かの増巾を比較した。最初の増巾は混合プライマープールの各メンバーに対応する多重ユニークプライマーを構築するもので、そのうちの８個を第１表に示した。第１表の各プライマー２〜９は５個の縮退部位の３ケ所に２つの可能なヌクレオチドを組込むことにより構築した。第２の増巾はタカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。（Ｕ、Ｓ、Ａ、）８２　：１９３１−１９３５　（１９８５）およびオーツカ（Ｏｈｔｓｕｋａ）等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０　：　２６０５− ２６０８（１９８５）の報告に基づき、種々の部位の４つにイノシンを含むプライマー（第１表、プライマー１０）を構築するものである。このプライマーは縮退しておらず、かつ同時にマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）等、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１３　：８９２７　（１９８５）で議論されているように非保存的部位のミスマツチのネガティブな効果を最少にするという利点がある。しかし、イノシンヌクレオチドの存在がクローン化したｖ１４領域に望ましくない配列を組込んでしまうかどうかは分らない。それゆえ、制限部位の切断後増巾したフラグメントに残る１つの部位にイノシンは含まれなかった。結果としてイノシンはクローン化した挿入物には存在しなかった。さらに、ユニークな３′プライマーを含むＶ□増巾プライマーはガンマ１重鎖ｍＲＮＡの第１定常部ドメインの一部に相補的となるように設計した（第１表、プライマー１５および１６）。これらのプライマーはＶＨおよび重鎮の第１定常部ドメイン由来のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡホモログを生成する。それゆえ、これらのＤＮＡホモログを使用してＦｖよりむしろＦａｂフラグメントを生成し得る。膵臓またはハイブリドーマｍＲＮＡからの増巾のコントロールとして、定常部１ｇＧ。重鎮遺伝子内の非常に保存性の高い領域にハイブリダイズする一組のプライマーを構築した。５′プライマー（第１表、プライマー１１）はＣ，２領域内のｃＤＮＡに相補的であり、一方３′プライマー（第１表、プライマー１３）は０．３領域内のｍＲＮＡに相補的である。これらのプライマーとそれらのテンプレート間にはミスマツチはないと考えられている。ｖＬＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は非常に変化に富んでいる。しかしＪＬ、ＶＬフレームワーク領域およびｖＬリーダー／プロモーターを含むＶＬ　ＣＤＲドメインに隣接する保存性の高い領域かい（つかある。それゆえ、この保存的配列にハイブリダイズし、かつＮｏＣｌおよび５ｐｅｌで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−ベクターに増巾したフラグメントをクローニングするのを可能にする制限部位を組込む増巾プライマーを構築した。Ｖ、ＣＤＲドメインを増巾するため、ＪＬｅＮ域内のｍＲＮＡに相補的となるよう３′プライマー（第１表、プライマー１４）を設計した。５′プライマー（第１表、プライマー１５）は保存的Ｎ−末端領域内の第１鎖ｃＤＮＡ　（アンチャンスｔＩｉ）と相補的となるよう選択した。 ■ＬＣＤＲドメインの増巾用の第２組の増巾プライマー、５′プライマー（第２表、プライマー１〜８）は保存的Ｎ−末端領域内の第１１［ｃＤＮＡに相補的となるように設計した。また、これらのプライマーはＶＬＤＮＡホモログをＶ、Ｕ発現ベクターにクローン化するのに使用する５ａｃｌ制限工ンドヌクレアーゼ部位を導入した。３’Ｖｔ増巾プライマー（第２表、プライマー９）はＪＬ領域内のｓ＋ＲＮＡに相補的であり、かつｖＬ■−発現ベクターにｖＬＤＮＡホモログを挿入するのに必要なＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するよう設計した（第３図）。別の３′ｖＬ増巾プライマーは各カッパーまたはラムダ■ＲＮ＾の定常部にハイブリダイズするよう設計した（第２表、プライマー１０および１１）、これらのプライマーは各力ンパまたはラムダ鎖の定常部アミノ酸をコードするポリペプチド配列を含むＤＮＡホモログを生成させる。これらのプライマーはＦ、よりむしろＦａｂフラグメントの生成を可能する。Ｆａｂを構築するためのカッパ軽鎖配列の増巾に使用するプライマーを少な（とも第２表に示す、これらのプライマーを用いた増巾は各々５′プライマー（プライマー３〜６および１２）１つおよび３′プライマー（プライマー１３）１つを含む５回の反応で行った。残りの３′プライマー（プライマー９）を用いてＦ、フラグメントを構築した。５′プライマーには５ａｃｌ制限部位が含まれ、また３′プライマーにはＸｂａｌ制限部位が含まれる。Ｆａｂ構築用の重鎖Ｆｄフラグメント増巾に使用するプライマーを少なくとも第１表に示す。増巾は各々５′プライマー（プライマー２〜９）１つおよび３′プライマー（プライマー１５）１つを含む８回の反応で行った。単一反応の増巾で使用した残りの５′プライマーは縮退プライマー（プライマー１）または４個の縮退部位にイノシンを組込むプライマー（第１表、プライマー１０、および第２表、プライマー１７および１８）である。残りの３′プライマー（第２表、プライマー１４）を使用してＦ、フラグメントを構築した。多くの５′プライマーはＸｈｏ１部位を含み、また３′プライマーは５ｐｅｌ制限部位を含んでいる。またラムダおよびカッパー両アイソタイプのヒト軽鎖可変領域を増巾するよう設計したｖＬ増巾プライマーを第２表に示す、ここで使用する第１〜４表に示した全てのプライマーおよび合成ポリヌクレオチドはアラバマ、ハンツビルのリサーチ・ジェネティクス社から購入するか、もしくはアブライドバイオシステムズ社ＤＮＡ合成機で合成した。譬　くト伽ｌ！Ｉｌｖ２、ＦＩＴＣＰＡたんばく　の　なＶ。コーディングレパートレセプター結合のりガントとしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を選んだ。さらに抗ＦＩＴＣレセプターをコードする遺伝子に対する免疫学的遺伝子レパートリ −１すなわちＶＨ−およびＶＬ−コード遺伝子レパートリ−を免疫により増加させることを決定した。これは“抗体ラボラトリ−マニュアル”、バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびロー（Ｌｏｗｅ）編、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、（１９８８）で述べられている方法を用いＦＩＴＣをキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）に結合させることで行った。簡単に云うと、ｌＯミリグラム（ｍｇ）のキーホールリンペットヘモシアニンと０．５ｍｇＦ　Ｉ　ＴＣＣＯＯＬ　Ｍ炭酸ナトリウムルミ（９，６を含むバッファ１ｍｌに添加し、４℃で１８〜２４時間攪拌した。未結合のＦＩＴＣをセファデックスＧ−２５を用いたゲル濾過で除去した。マウスへの注射用のＫＬＨ−Ｆ　Ｉ　ＴＣ結合体は１００μｇの結合体を２５０μｌのリン酸緩衝液に加えて調製した。等容量の完全フロインドアジュバントを加え、この溶液を５分間かけてエマルジョンとした。１２９Ｇ＋ｘ＋マウスにこのエマルジエン３００μｌを注射した。これは、２１ゲージ針を用いた数ケ所の皮下注射で行った。ＫＬＨ−ＦＩＴＣによる二次免疫は２週間後に行った。この注射液は以下のように調製した。５０μｇのＫＬＨ −ＦＩＴＣを２５０μｌのＰＢＳで希釈し、この溶液に等容量のミョウバンを混合した。２３ゲージ針を用いこの溶液５００μｌをマウスに腹腔的注射した。１力月後、５０μｇ　ＫＬＨ−ＦＩＴＣ結合体の２００μＩＰＢｓ希釈物による最後の注射を行った。これは３０ゲージ針を用いた尾側部への静脈注射で行った。最後の注射の５日後マウスを殺し、その肺臓から全細胞性ＲＮＡを単離した。ホスホネートエステルに免疫特異的な抗体を生産するハイブリドーマＰＣＰ８Ｄ１１をペニシリンおよびストレプトマイシンを補った１０パーセントのウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ギブコラボラトリーズ、グランドアイランド、ニューヨーク）で培養した。約５Ｘ１０”個のハイブリドーマを収穫し、リン酸緩衝液で２回洗浄した。これらの単離したハイブリドーマ細胞から全細胞性ＲＮＡを調製した。３、ｖトコード゛　云　レパートリ−の量チョムクヂンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　）等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｂｅｓ。土立主：１５６−１５９　（１９８７）に報告されているＲＮＡ調製法およびストラタジーンクローニングシステム（ラジッラ、ＣＡ）社のＲＮＡ単離キットを用い、実施例２で述べたようにＫＬＨ−Ｆ　ＩＴＣで免疫化した単一マウスの肺臓から全細胞性ＲＮＡを調製した。８１単に云うと、免疫化マウスから肺臓を採取したら直ちにその組織をガラスホモジナイザーを用い、４．０　Ｍグアニンイソチオシアネート、０．２５Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７，０および０．１　Ｍ　２−メルカプトエタノールを含む変性溶液１０ｍ１中でホモジナイズした。　２　Ｍ、　ｐＨ４，０の酢酸ナトリウムｌ　ｍ　ｌをこのホモジナイズした膵臓に混合する。ついで予め水で飽和したフェノール１　ｍ　ｌをホモジナイズした肺臓を含む変性溶液に混合した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：　１’／ｖ）混合液２ｍＡをこのホモジネートに加えた。このホモジネートを１０秒間激しく撹拌し、１５分間氷上に放置した。ついで、このホモジネートを肉厚の５０ｍｌポリプロピレン遠心チューブ（フィッシャーサイエンティフィックカンパニー、ピッツバーグ、ＰＡ）に移し、４℃、２０分間１０．ＯＯＯｘｇで遠心した。　ＲＮＡを含む上水層を新しい５０ｍ１ポリプロピレン遠心管に移し、等容量のイソプロピルアルコールを混合した。この溶液を一２０℃で少なくとも１時間冷却しＲＮＡを沈殿させた。沈殿ＲＮＡを含む液を４℃、２０分間、１０，０００Ｘｇで遠心した。ベレット化した全細胞性ＲＮＡのベレットを回収し、上述の変性溶液３ｍｌにｔ容かした。このン容液に３　ｍ　’１のイソプロピルアルコールを加え、激しく混合してから、−２０℃に少なくとも１時間維持しＲＮＡを沈殿させた。この沈殿化ＲＮＡを含む溶液を４℃、１０分間１０、ＯＯＯＸｇで遠心した。ベレット化したＲＮＡを７５％エタノールを含む溶液で１度洗浄し、減圧下で１５分間乾燥してからジメチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理した水（ＤＥＰＣ−ＨｚＯ）に懸濁した。長いポリＡトラクトを含む配列に冨むメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を“モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュアル、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等線、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１ＮＹ、（１９８２）に述べられている方法をもちいて全細胞性ＲＮＡから調製した。簡単に云うと上述のように調製した単一の免疫化マウス肺臓から単離した全ＲＮＡの半分を１ｍｌのＤＢＰＣ−Ｈ，Ｏに溶解し６５℃に５分間保った。このＲＮＡ溶液に１００ｗＭ）リス−ＨＣｆｆ１．１Ｍ塩化ナトリウム、２．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）ｐＨ７，５および０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む２×高塩ローデイングバツフア１　ｍ　ｌを加え、この混合液を室温まで冷却した。ついでこの混合液を予め０．１Ｍ水酸化ナトリウムおよび５ｍＭＥＤＴＡを含む溶液でオリゴｄＴを洗浄し、ＤＥＰＣ−ＨｌＯで平衡化することにより調製したオリゴｄＴ（コラポラティプリサーチ社、２型または３型）カラムにかけた。溶出物を滅菌したポリプロピレンチューブに回収し６５℃で５分間加熱した後再び同じカラムにかけた。ついでこのオリゴｄＴカラムを５０＋ｗＭトリス−ＨＣＪ　、　ｐＨ１，５，５８０閘Ｍ塩化ナトリウム、１難ＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含む高塩ローディングバｌファ２ｍｌで洗浄した。ついで１０ｍＭトリス−ＩＣ１ｐＨ７，５，１＋ｇＭＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳを含むバッファ１ｍｌをもちいてこのカラムがらメツセンジャーＲＮＡを溶出した。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、ついで１００％クロロホルムで抽出し、メツセンジャーＲＮＡを精製した。このメツセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿でｉｌｌｍＬ、Ｄ　Ｅ　ｐ　ｃ　−＊ｚｏ　ｃ溶ｇｔ、り。上述の方法で単離したメンセンジャーＲＮＡには多くの異なるｖＨコードポリヌクレオチド、すなわち約１０４種以上のＶ、コード遺伝子が含まれる。４、−の■９コードポリヌクレオチドの發全細胞性ＲＮＡを実施例２で調製したモノクローナルハイブリドーマ細胞から抽出すること以外は実施例３に従って単一のＶ。をコードするポリヌクレオチドを単離した。このように単離したポリヌクレオチドは単一のＶＮをコードする。５、　Ｄ　Ｎ　Ａホモログの− ＰＣＲ増巾用の調製物を作るため上記実施例に従って調製したｍＲＮＡをプライマー伸長反応によるｃＤＮＡ合成用のテンプレートとして使用した。典型的な５０μ！転写反応においては、まず５〜１０μ５ｌｌｌｌｉｉまたはハイブリドーマ５ＲＮＡ水溶液に、６５℃、５分間かけて５００ｎｇ　（５０，０ｐｓｏｌ）の３　’　ＶＮプライマー（第１表、プライマー１２）をハイブリダイズ（アニールさせた。つづいて、この混合物を１．５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ。ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４０ｍＭ）リス−〇ＣＡ　ｐＨ８，０，８ｓＭＭｇＣ１ｇ、５０ｍＭ　ＮａＣＪおよび２ｍＭスペルミジンとなるように調整した。モロニー・ムライン白血病ウィルス逆転写酵素（ストラタジーンクローニングシステム社）２６ユニツトを加え、この溶液を３７℃に１時間保った。ＰＣＲ増巾は逆転写反応産物（約５μｇのｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）　、３００部ｇ３’　ＶＨプライマー（第１表、プライマー１２）、各３００部ｇ５　’　ＶＨプライマー（第１表、プライマー２〜Ｉ　Ｏ）　、２００ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、５０ｍＭＫＣｊ７．１０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，１５ｍＭ　ＭｇＣ１２，０，１％ゼラチンおよび２ユニツトＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む１００μ１反応液で行った。この反応混合液にミネラルオイルを重層し、４０サイクルで増巾した。各サイクルは９２℃、１分の変性、５２℃、２分のアニーリングおよび７２℃、１．５分のプライマー伸長によるポリヌクレオチド合成で構成される。増巾したｖＨコードＤＮＡホモログを含む試料を、フェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿した後１０ｒｎＭ）リス−ＨＣｌ！（ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥＤＴＡ溶液中−７０℃で保存した。ユニークな５′プライマー（第１表２〜９）を用い、第３図、レーンＲ１７〜Ｒ−２４に示したように有効なＶ□コードＤＮＡホモログ合成および肺臓ｍＲＮＡからの増巾を行った。増巾したｃＤＮＡ（ＶＨコードＤＮＡホモログ）は期待されるサイズ（３６０ｂｐ）の主要バンドとして出現した。各反応物中の増巾されたＶＨ−コードポリヌクレオチドフラグメントの濃度は同じで、このことはこれら全てのプライマーが増巾の開始に関してほぼ同じ効率で働いたことを示している。これらのプライマーを用いた増巾の収率および特性には再現性があった。またイノシンを含むプライマーによって、他の増巾ｃＤＮＡと同じ濃度で期待されるサイズの肺臓ｍＲＮＡ由来のＶＨコードＤＮＡを再現性よく増巾された（第４図レーンＲ１６参照）。この結果はイノシンが存在しても十分効率よ＜ＤＮＡホモログの合成と増巾が進行することを示している。多種類の■。コードＤＮＡホモログを生成する上でこれらのプライマーがいかに有用であるかを明瞭に示している。定常部プライマー（第１表、プライマー１１および１３）から得た増巾産物は、おそらくテンプレートとプライマーとの高いホモロジーのために増巾がより効率的に起ったことを強く示している（第４図、レーンＲ９）。これらの結果に基づき、各々別の５′プライマーで行った８回の増巾産物からｖＨコード遺伝子ライブラリーを構築した。各プライマー伸長反応からの産物の一部を混合し、これを用いてｖｌ（コードＤＮＡホモログ含有ベクターライブラリーを作製した。先に述べたように精製したｍＲＮＡからＶＬ　ＤＮＡホモログを調製した。ＰＣＲ増巾用の調製物を作るため、上記実施例に従って調製したｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成用のテンプレートとして用いた。典型的な５０μ！転写反応では、まず５〜ＩＯμｇ牌臓またはハイブリドーマｍＲＮＡ水溶液に６５℃、５分間かけて３００部ｇ　（５０，０ｐｍｏｌ）の３’ＶＬプライマー（第１表、プライマー１４）をアニールさせた。つづいて、この混合物を１．５　ｍＭ　ｄＡＴＰ。ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、４０ｍＭトリス−ＨＣｆ　ｐＨ８，ｏ。８　ｍＭ　ＭｇＣｊ’　！　、５０　ｍＭ　ＮａＣｊ’、および２ｍＭスペルミジンとなるように調整した。モロニー・ムライン白血病ウィルス逆転写酵素（ストラタジーンクローニングシステムズ社）２６ユニツトを添加し、この溶液を３７℃に１時間保った。ＰＣＲ増巾は約５μｇの上記のように調製したｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、３００部ｇ３’Ｖ、プライマー（第１表、プライ７−１４）　、３００部ｇ５′ｖ、プライマー（第１表、プライ７−１５）　、２００ｍＭｄＮＴＰ混合物、５０ｍＭＫＣｊ７．１０ｍＭトリス−ＨＣ４７ｐＨ８，３，１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．１％ゼラチンおよび２ユニツトＴａｑポリメラーゼを含む１００μ１反応液で行った。この溶液にミネラルオイルを重層し、４０サイクルの増巾を行った。各サイクルは９２℃、１分間の変性、５２℃、２分間のアニーリングおよび７２°Ｃ１１，５分間の伸長で構成される。増巾したサンプルをフェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿後１０ｍＭトリス−１（ＣＪ　ｐＨ７，５および１ｍＭＥＤＴＡ中−７０° Ｃで保存した。６、ＤＮＡホモログのベクターへの挿入■Ｈ配列に富むライブラリーをクローニングするため、ＰＣＲ産物（１５０ｍＭ　ＮａＣＡ、　８ｍＭトリス−ＨＣｊ７　（ｐＨ７，５）　、６ｍＭＭｇＳＯ４，１ｍＭＤＴＴ、２００ｍｇ／ｍＡウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）３０ｕｌ中２．５　ｍｇ）を３７℃で制限酵素ＸｈｏＩ　（１２５ユニツト）およびＥｃｏＲＩ　（１０Ｕ）で消化し、１％アガロースゲルで精製した。増巾反応産物の混合物を必要とするクローニング実験においては、増巾後で、かつ制限消化前に等容量（５０μ！、１〜ＩＯμｇ濃度）の反応液を合せた。消化したＰＣＲ増巾牌臓肺臓ＮＡのゲル電気泳動後、約３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを含むゲル領域を切り出し、透析膜に電気溶出した後エタノール沈殿させてｌｏｎｇ／μｉとなるよう１０ｍＭ）リス−ＨＣｊ７ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡに溶解した。ついでこの等モル量の挿入物を５℃、１晩かけて、予めＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断したラムダＺＡＰＴＭｎベクター（ストラタジーンクローニングシステムズ社、ラジョラ、ＣＡ）１ｇｇにライゲーションした。このライゲーション混合物の１部（ｌμｌ）をギカパックゴールドパッキングエクストラクト（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ）を用い室温２時間かけてパッケージし、この物質をＸＬＩ−ブルー宿主細胞上にブレーティングした。このライブラリーは弁組換えバックグランド３０％以下で２Ｘ１０７ＶＨホモログからなると測定された。先に用いたベクター、ラムダＺａｐＩＩは、ＳＡＭ１００変異を有するが６個のユニークな制限部位、融合たんばく質発現、ファージミド（ブルースクリプト５Ｋ−）の型で迅速に挿入物を切り出す能力を含む元のラムダＺａｐの全ての特性を有し、ＸＬＩ−ブルーを含む多くのＮｏｎ−３ｕｐＦ株上で生育できるラムダＺａｐ　（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）の誘導体である。ショート（Ｓｈｏｒｔ　）等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　７５８３−７６００．１９８８で報告されている方法を用い制限酵素ＮｃｏＩでラムダＺａｐを消化することにより生成する４２５４塩基対（ｂｐ）ＤＮＡフラグメント中に含まれるラムダＳ遺伝子を置換することによりラムダＺａｐＩ［を構築した。この４２５４ｂｐＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｃｏＩで消化したラムダｇｔｌ　Ｏ（ＡＴＣＣ＃４０，１７９）から単離したラムダＳ遺伝子を含む４２５４ｂｐＤＮＡフラグメントで置換した。このラムダｇｔｌＯから単離した４　２５４ｂｐＤＮＡフラグメントをＴ　４　ＤＮＡリガーゼおよびカレントプロトコールインモレキュラーバイオロジー、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等線、ジョンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク、１９８７に説明されている標準的方法を用い元のラムダＺａｐベクターにライゲーションした。ＶＬ配列に富むライブラリーをクローニングするために、２μｇのＰＣＲ増巾産物（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，８ｍＭ）リス−Ｈ１（ｐＨ７，５）　６　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ，，１ｍＭ　ＤＴＴ、　２００ｍｇ／ｍｊ７ＢＳＡ３０μｉ中２．５ｍｇ、　３７℃）を制限酵素ＮｃｏＩ　（３０ユニフト）および５ｐｅＩ（４５ユニツト）で消化した。消化したＰＣＩＩ増中産物中産物キュラークローニング、ラボラトリ−マニュアル、？＝７チス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等！、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、（１９８２）に説明されている標準的エレクトロポレーション法を用い、１％アガロースゲルから精製した。簡単にいうと、消化したＰＣＲ増中量中産物ルエレクトロポレーション後、適当なサイズの■１コードＤＮＡフラグメントを含むゲルの一部を切り出し、透析膜への電気溶出、エタノール沈殿の後、１０ｍＭトリス−ＨＣ１ｐＨ７，５，１ｓＭＥＤＴＡを含む溶液１＋＋Ｊ当りＬｏｎｇとなるように溶解した。多種のＶＬコードＤＮＡホモログを有する等モル量のＤＮＡを予めＮｃｏＴおよび５ｐｅＴで切断したｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−ファージミドベクターにライゲーションした。ライゲーション反応物の一部をエピクイアンコリＸＬＩ −ブルーコンピテント細胞（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジ５う、ＣＡ）にトランスホームした。このトランスホーマントライブラリーはｖＬホモログμｇ当り１．２Ｘ１０３コロニ一形成単位を含むと測定された。弁組換え体のバックグランドは３％以下であった。ラムタＺａｐＩＩファージクローンを分析するため、このクローンを業者の指示に従かい（ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ）ラムダＺａｐからプラスミドに切り出した。簡単にいうと、ファージプラークを寒天プレートを採取し、５０ｍＭトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，５）　、１００　ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋および０．０１％ゼラチンを含むバッファ５００μ ｌおよびクロロホルム２０μｉを入れた滅菌マイクロフユージチューブに移した。切断するためファージストック２００μ！、ＸＬＩ−ブルー細胞（Ａｚｉ。＝１．０Ｏ）２００μ２およびＲ４０８へルバーファージ（Ｉ　Ｘ　１０”　ｐｆｕ／ｍｆ）　１μｌを３７℃で１５分間インキュベートした。切断したプラスミドをＸＬＩ−ブルー細胞に感染させ、アンピシリンを含むＬＢプレートにブレーティングした。ホルメス（Ｈｏｌｓｅｓ）等、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１１４　：　１９４　（１９８１）に報告されている方法に従がい、ファージミド含量細胞から二本鎖ＤＮＡを調製した。最初にＰｖｕＩ［またはＢｇｌｌによる制限消化によりＤＮＡ挿入したクローンをスクリーニングし、ついでｖ、Ｉ挿入物を含むクローンをサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、７４：５４６３　５４６７（１９７７）の−触法およびストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡのＡＭＶ逆転写酵素３ＳＳ −ｄＡＴＰシーケンシングキットを用いたその方法の修正法に従い、逆転写酵素を用いてシーケンシングした。８、クローンヒしたｖ６レパートリーのＸｈｏｌおよびＥｃｏＲＩで消化し、ラムダＺａｐにクローニングした項中産物で９．ＯＸ　１０’　ｐｆｕのｃＤＮＡライブラリーを生成した。このライブラリーが多種類のｖＨコードＤＮＡホモログを含むことを確かめるため、ライブラリーからランダムに選んだ１８個のクローンのＮ末端の１２０塩基を切り出しシーケンシングした（第５図）。このクローンがＶ。遺伝子由来のものかどうかを決めるため、クローン化した配列を既知のＶ、配列およびｖＬ配列と比較した。このクローンは、カボット（Ｋａｂｏｔ）等第４Ｗ、米国デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサイエンス（１９８７）、“免疫学的に重要なたんばく質の配列”の配列と比較したとき既知重鎮配列と８０〜９０％のホモロジーを示したが、軽鎖配列とのホモロジーはなかった。このことはこのライブラリーは軽鎖配列などの他の配列よりも所望するＶイ配列に富んでいることを示している。シーケンスしたクローンを所定のサブグループに分類して集団の多様性を検定した（第５図）。マウスＶＨ配列は、“免疫学的に重要なたんばく質の配列”、カボフ）　（Ｋａｂｏｔ）等、第４編、米国、デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサイエンス（１９８７）；ディルドロップ（Ｄｉｌｄｒｏｐ）、　Ｉ讃ｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ。５．８４　（１９Ｂ４）；およびブロダー（Ｂｒｏｄｅｕｒ）等、Ｅｕｒ、　Ｊ。ｌ５ｎｕｎｏ１．、　１４　；　９２２　（１９８４）に報告されている枠組みアミノ酸配列に基づく１１個のサブグループ（Ｉ　（Ａ、　Ｂ）　、］ｌ（Ａ、Ｂ、’ｃ＞　、ｍ　（Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄ）　、Ｖ　（Ａ、Ｂ））　に分類される。シーケンスしたクローンの分類で、ｃＤＮＡライブラリーが少なくとも７種のサブグループのｖ９配列を含んでいるが示された。さらに、シーケンスしたクローン間のホモロジーの比較で全ての部位で等しい２つの配列はないことが示され、このことはこの集団が配列分析で特徴付けることができる程度の多様性をもつことを示している。このクローンのうちの６個（Ｌ３６−５０、第５図）はサブクラスＩＩ［Ｂに属しており、非常に似たヌクレオチド配列を存していた。このことは刺激した肺臓中の１つまたはいくつかの関連する可変性遺伝子から誘導されるｍＲＮＡが圧倒的に多いことを反映しているが、このデータは増巾過程におけるバイアスの可能性を除外するものではない。９、Ｖ　ベタ　−のベクターシステムを選択する主たる基準は直接スクリーニングし得る最も多いＦａｂフラグメントを生成する必要性である。３つの理由から発現ベクターとしてバクテリオファージラムダを選んだ。第１に、ファージＤＮＡのインビトロでのパフキングは宿主細胞にＤＮＡを再導入する最も有効な方法である。第２に、単一ファージプラークレベルでたんばく質発現が検出可能である。最後に、一般的にファージライブラリーのスクリーニングは非特異的結合に伴う困難がない。代替物としてのプラスミドクローニングベクターは同定後のクローンの解析にのみ有効である。この利点はラムダＺａｐを使用することにより切り出せる重鎮、軽鎖またはＦａｂ発現挿入物を含むプラスミドを使用する本システムでは消失する。大腸菌宿主細胞において７ＭコードＤＮＡホモログの多様性を示すため、適当なリーディングフレームに７ＭコードＤＮＡホモログを置き、シャイン（Ｓｈｉｎｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ＋　２５４　：　３４．１９７５によって報告されているリボゾーム結合部位、発現たんばく賞を細胞周辺腔に送るリーダー配列、既知エピトープをコードするポリヌクレオチド配列（エピトープタッグ）およびｖＨコードＤＮＡホモログおよびエピトープタッグをコードするポリヌクレオチドの間のスペーサーたんばく質をコードするポリヌクレオチドを提供するベクターを構築した。上述のポリヌクレオチドおよび特性の全てを含む合成りＮＡ配列は、互いにハイブリダイズし第６図に示した二本鎖合成りＮＡ配列を形成する２０〜４０塩基の一本領ポリヌクレオチドセグメントを設計することにより構築した。各−末鎖ポリヌクレオチド（ＮＩ　Ｎ＋□）を第３表を示す。各ポリヌクレオチド１μｊ（０，１μｇ／μｍ）および２０ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０謹ＭトリスーＨＣｊ、ｐＨ７，６，１０ｍＭ　ＭｇＣｊｌｇ　、５ｓＭ　ＤＴＴ、　１０　ｍＭ２ＭＥ。５００μｇ１ｍｌＢｓＡを含む溶液に添加することによりポリスクレオチド２．３．９−４′、１１、ｔ　ｏ−ｓ　’、６．７および８を５′リン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持することにより反応を停止した。２つの末端ポリヌクレオチド、Ｎ１およびＮ１２．２０ｎｇを２０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，２，０■ＭＭｇＣ１８および５０．ＯｍＭＮａＣ１を含む１０分の１容量の溶液とともに上述のキナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０℃に５分間加熱した後、５００ｍｌのビーカーの水中、１．５時間かけて室温、約２５℃に冷却した。この時間内に１０個全てのポリヌクレオチドがアニールし、第６Ａ図に示した二本鎖合成りＮＡ挿入物が形成される。この反応物４０μｌを５０ｍＭ）リス−ＭＣＩ、　ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣｊ！、、１　＋ｍＭ　ＤＴＴ、１　ｍＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に加えることにより各ポリヌクレオチドを互いに共有結合させ、合成りＮＡ挿入物を安定化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃に１０分間維持してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。この反応液５２μｌ、１０ｍＭＡＴＰを含む溶液４μｌおよび５ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することにより末端ポリヌクレオチドを５′リン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持した後、６５℃で１０分間加熱してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完成した合成りＮＡ挿入物を予め制限酵素Ｎｏｔ　ＩおよびＸｈｏｌで消化したラムダＺａｐｎベクターに直接ライゲーションした。このライゲーション混合物をストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡから市販されているギガパック■ゴールドバッキングエクストラクトを用い業者の指示に従ってパフキングした。パフキングしたライゲージタン混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタジーンクローニングシステムズ、サンディエゴ、ＣＡ）にブレーティングした。各ラムダＺａｐＵプラークを採取し、その挿入物を業者、ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡによって提供されるインビボ切り出し法に従って切り出した。このインビボ切り出し法はクローン化した挿入物をラムダＺａｐＵベクターからプラスミドベクターに移して操作やシーケンシングを容易にする。上述のクローニングステップの正確性はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、７４：５４６３−５４６７　（１９７７）に報告されているサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のダイデオキシ法およびストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡのＡＭＶ逆転写酵素３ＳＳ−ＡＴＰシーケンスキフトを用いて挿入物をシーケンシングで確認した。このＶ、１発現ベクターの配列を第６Ａ図および第７図に示す。玉１表Ｎ５）　５１　ＴＣＧＡＣＴＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧ入入ＴＴＣＴＣＧＡＧ　コー　。Ｎｉ１）　５雷　ＧＡＣＧＴＴＣＣＧにＡＣＴＡＣＧＧＴＴＣＴＴＡＡＴ、コ− ，ＧＡＡ’ＩＴＣに　３自Ｎ１０−５）　５１　ＣＧにＡＡＣＧＴＣＧＴＡＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧ入入入ＴＣＴＣＧＡＧ　３’１０、　Ｖ、　ベクターの大腸菌宿主細胞で多様な■、コードポリヌクレオチドを発現させるため、適正なリーディングフレームに■、コードポリヌクレオチドを置き、シャイン（Ｓｈｉｎｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ、２５４　：　３４、（１９７５）に報告されているリボゾーム結合部位、発現たんばく質を細胞周辺校に送るリーダー配列、およびＶＬポポリクレオチドおよびエピトープタフグをコードするポリヌクレオチドの間のスペーサーたんばく譬をコードするポリヌクレオチドを提供するベクターを横築した。上述の全のポリヌクレオチドおよび特性を含む合成りＮＡ配列は、互いにハイブリダイズし、かつ第６Ｂ図に示した二本鎖合成りＮＡ配列を形成する２０〜４０塩基の一本領ポリヌクレオチドセグメントを設計することにより構築した。各−重鎖ポリヌクレオチド（Ｎ、−Ｎ、”）を第３表に示す。各ポリヌクレオチド１μｌおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２０ユニットを７０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，６，１０５Ｍ１′ＩｇＣ１，、５ｍＭ　ＤＴＴ％　Ｉ　Ｑ　＋ｗＭ２ＭＥ、５　０　０　μｇ／ｍ１ＢＳＡを含む溶液に添加することによりポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ６、Ｎ７およびＮ８を５ ′リン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃で１０分間加熱することにより、反応を停止した。２つの末端ポリヌクレオチド、Ｎ１およびＮ５、各２０ｎｇを、２０．０ＢＭトリスーＨＣｌ、ＰＨ７、４，２，０ｍＭ　ＭｇＣｌ１　ｔおよび５０．　ＯｍＭ　ＮａＣＪを含む１０分の１培容の溶液とともに上述のリン酸化溶液に加えた。この溶液を７０℃で５分間加熱し、５００層！ビーカー中、１．５時間かけて室温、約２５℃に冷却した。この際に全てのポリヌクレオチドがアニールし、二本鎖合成りＮＡ挿入物が形成する。上述溶液４０μｌを５０ｍＭ）リス−ＨＣβ、ｐＨ７，５，７ｍＭ　Ｍｇｃｚ、　、１ｅｒＭ　ＤＴＴＳｌ　ｍＭ　ＡＴＰ、および１０ユニツトＴ　４　ＤＮＡリガーゼを含む溶液５０μｌに加えることにより各ポリヌクレオチドを互いに共有結合することで合成りＮＡ挿入物を安定化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃で１０分間加熱することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させる。この溶液５２μｌと、１０ａ＋ＭＡＴＰおよび５ユニツトＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む４μｅの溶液を混合することにより末端ポリヌクレオチドをリン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃で１０分間加熱することによりこのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。この完成した合成りＮＡ挿入物を予め制限酵素Ｎｏｔ　ＴおよびＸｈｏｌで消化したラムダＺａｐＨヘクターに直接ライゲーションした。このライゲーション混合物をストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡから市販されているギカバック■ゴールドバッキングエクストラクトを用いてバッキングした。このバンキングしたライゲーション混合物をＸＬＩ−ブルー細胞（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ）にブレーティングした０個々のラムダＺａｐＨプラークを採取し、その挿入物を製造業者、ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡによって提供され、かつシｖ　−）　（Ｓｈｏｒｔ）等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　７５８３−７６００．１９８８に報告されているインビボ切り出し操作に従って切り出した。このインビボ切り出し操作によりクローン化挿入物をラムダＺａｐＨベクターからファージミドベクターに移し操作やシーケンシングが容易となり、かつｖＬ発現ベクターのファージミドバージョンができる。上述のクローニングステップの正確性はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のダイデオキシ法（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　：　５４６３　５４６７、（１９７７）　”）およびストラタジーンクローニングシステムズ、ラジッラ、ＣＡ市販のＡＭＶ逆転写酵素３ＳＳ−ｄＡＴＰシーケンシングキ７）の説明書を用いてこの挿入物をシーケンシングすることにより確認した、生成した■５発発現ベクター配列を第６図および第８図に示す。 ■Ｌライブラリーの構築に用いた■５発現ベクターは■１発現ベクターのＤＮＡの測定を可能となるように作ったファージミドである。先に詳細に説明したようにこのファージミドはラムダＺａｐＶＬ発現ヘクターからインビボ切り出し操作を用いて作った（第８図）、このベクターのファージミドバージョンはユニークな制限部位を含むことからこれを用いてＶＬＤＮＡホモログを発現ベクターに機能的に結合させることができる。１１、ＶＩＩ　ベクターの大１ｌｌｉ＆＠宿主細胞中で多様なりＬコードＤＮＡホモログを発現するため、ＶＬコードＤＮＡホモログを適正なリーディングフレームに置き、シャイン（Ｓｈｉｎｅ）等、Ｎａｔｕｒｅ、２５４　：　３４．１９７５に報告されているリボゾーム結合部位、レイ（Ｌｅｉ）等、Ｊ、　Ｂａｃ、１６９：４３７９　（１９８Ｔ）およびペター（Ｂｅｔｔｅｒ）等、５ｃｉｅｎｃｅ＋　２４０　：１０４１　（１９８８）に報告されている大腸菌中でＦａｂフラグメントをうまく分泌させるのに用いられたＰｅ１Ｂ遺伝子リーダー配列およびクローニング用の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリヌクレオチドを提供するベクターを構築した。上述の全てのポリヌクレオチドおよび特性を含む合成りＮＡ配列を互いにハイブリダイズし、かつ第１０図に示した二本鎖合成りＮＡ配列を形成する２０〜６０塩基の一重鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することにより構築した。二本鎖合成りＮＡ配列内の各−末鎖ポリヌクレオチド（０１−０８）の配列を第４表に示す。各ポリヌクレオチド０２．０３．０４．０５．０６および０７．１μｆｆ１（０，１μｇ／μｉ）と２０ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，６）　、１０　ｍＭ塩化マグネシウム（ＭｇＣｆ２）　、５　ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０＋ｎＭ２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）　、５００μｇ／ｍ１のウシ血清アルブミンを含む溶液に添加することによりこれらのポリヌクレオチドの５′側をリン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持し、ついで６５℃で１０分間加熱することで反応を停止した。２つの末端ポリヌクレオチド、０１および０８を各２０ｎｇ、２０．０　ｍＭ　トリス−Ｈ（ｌｐＨ７，４，２，０ｍＭ　ＭｇＣｎ　２および１５．０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣ１）を含む１０分の１容の溶液とともに上述のリン酸化反応溶液に添加した。この溶液を７０°Ｃで５分間加熱した後、５００ｍＡのビーカー中の水で室温、約２５℃まで１．５時間かけて冷却した。この際に８個すべてのポリヌクレオチドがアニールし第９図に示した二本鎖合成りＮＡ挿入物が生成する。この反応液４０μｌを５０ｍＭ）リス−ＨＣＪ。ｐＨ７，５，７ｍＭ　ＭｇＣｊＬ　、Ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ、　１　ｍＭ　ＡＴＰおよび１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に加えることにより各ポリヌクレオチドを互いに共有結合させて合成りＮＡ挿入物を安定化させた。この溶液を３７℃に３０分間維持した後、６５℃で１０分間加熱してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。上述の溶液５２μＩ！、１０　ｍＭ　ＡＴＰおよび５ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液４μｌを混合することにより末端ポリヌクレオチドを５′リン酸化した。この溶液を３７℃に３０分間維持した後、６５℃で１０分間加熱することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。この完全した合成りＮＡ挿入物を、予め制限酵素Ｎｏｔ　ＩおよびＸｈｏＩで消化したラムダＺａｐＩＩベクターに直接ライゲーションした。このライゲーション混合物をストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ市販のギガパック■ゴールドバッキングエクストラクトを業者の指示に従って用いてバッキングした。このバッキングしたライゲーション混合物をＸＬＩ・ブルー細胞（ストラタジーンクローニングシステムズ、サンディエゴ、ＣＡ）上にブレーティングした。各ラムダＺａｐＩＩプラークを採取し、挿入物をストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡによって提供されているインビボ切り出し操作法に従って切り出した。このインビボ切り出し操作でクローン化した挿入物がラムダＺａｐＩＩベクターからプラスミドベクターに移り、取り扱いやシーケンシングが容易になった。上述のクローニングステップの正確性はストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ市販のＡＭＶ逆転写酵素”５−ｄＡＴＰシーケンシングキットを説明書に従がい用いてこの挿入物をシーケンシングすることにより確認した。生成したＶＬ■−発現ベクターの配列を第９図および第１１図に示す。０３　）　５　’　ＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣ３１、’　０４）　５’　ＧＡＧＣＴＣＧＴＣＡＧ’ＩＴＣＴＡＧＡご川ＧＣＧＧＣＣＧ　３１０７）　５’　ＴＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＧＧ　３１０８）　５’　ＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＣ３’１２、　ＶＨ＋ＶＬライブラリーの構築ＶＨ配列に富む発現ライブラリーを調製するため、ＶＨ配列に富むＤＮＡホモログを３′プライマーとしてプライマー１２Ａ（第１表）を用いること以外は同じ５′プライマーを用い実施例６に従って調製した。ついでこれらのホモログを制限酵素ＸｈｏＩおよび５ｐｅＩで消イζし、“モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュアル ”、マニアチス（Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ　）編、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ、（１９８２）に説明されている標準的電気溶出技術を用い、１％アガロースゲルで精製した。ついでこれらの調製したＤＮＡホモログを予めＸｈｏＩおよび５ｐｅＩで消化したＶＨ発現ベクターに直接挿入した。このＶ、ＤＮＡホモログを含むライゲーション混合物をギガパックゴールド■バッキングエクストラクト（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ）を説明書に従って用いバッキングした。これらをＸＬ−１ブルー細胞にブレーティングして発現ライブラリーとした。ＶＬ配列に富むライブラリーを調製するため、実施例６に従ってＶＬ配列に富むＰＣＲ増巾産物を調製した。これらのＶＬＤＮＡホモログを制限酵素ＮｃｏＩおよび５ｐｅＩで消化した。消化したＤＮＡホモログを“モレキュラークローニングラボラトリ−マニュアル１、マニアチス（Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ　）等線、コールトスプリングツ１−バー、ＮＹ（１９８２）に述べられている標準的電気溶出技術を用い１％アガロースゲルで精製した。この調製したＶＬ　ＤＮＡホモログを予め制限酵素ＮｃｏＩおよび５ｐｅＩで消化したＶｔ、発現ベクターに直接挿入した。ＶＬＤＮＡホモログを含むライゲーション混合物を業者の説明書に従がいＸＬ−１ブルーコンピテント細胞にトランスホームした（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ）。１３、　Ｖ、コードＤＮＡホモログの７０発　ベクターへの挿入ＶＬ配列に富むライブラリーをクローニングするために、ＰＣＲ増巾産物（１５０ｍＭ　ＮａＣＣ８ｍＭトリス−ＨＣｉ７　（ｐＨ７，５）。６　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｓ、１　ｍＭ　ＤＴＴ、２００ｕｇ／ｍ１ＢｓＡ溶液３０μ β中２．５μｇ）を３７℃で制限酵素５ａｃＩ　（１２５１ニツト）およびＸｂａｌ（１２５ユニツト）を用いて消化し、１％アガロースゲルで精製した。増巾反応産物の混合物を必要とするクロー二゛／グ実験では等容量（５０με中１〜１０μｇの濃度）の各反応混合物を増巾後で制限処理前に合せた。消化したＰＣＲ増巾ｌ１ＩＩ臓ｍＲＮＡのゲル電気泳動後、約３５０塩基対のＤＮＡフラグメントを含むゲル断片を切り出し遇折膜に電気溶出した後にエタノール沈殿し、５０ｎｇ／μｌの濃度となるように１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）および１ｍＭＥＤＴＡを含むＴＥ溶液に溶解した。クローニングに用いるＶＬ■発現Ｄ　Ｎ　Ａベクターは、このＤＮＡ１００μｇを各２５０ユニツトの制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｌおよびＸｂａ［（いずれもベーリンガーマンハイム製、インディアナポリス、ＩＮ）および業者が推薦するバッファを含む溶液に加えることにより調製した。この溶液を３７℃に１．５時間維持した。ついでこの溶液を６５℃で１５分間加熱し、制限エンドヌクレアーゼを失活させた。この溶液を３０℃に冷やし、２５ユニツトの２５受性（ＨＫ）ホスファターゼ（エビセンター、マジソン、Ｗ＋）および（：ａＣＩ！　ｚを業者の説明書に従って混合した。この溶液を３０℃に１時間維持した。この溶液をフェノールおよびクロロホルムの混合液で抽出し、ついでエタノール沈殿を行ってＤＮＡを精製した。これで先の実施例で調製したＶＬＤＮＡホモログにライゲーションするＶｔｎ発現ベクターが得られた。 ■Ｌ配列に冨むＤＮＡホモログを第２表に示した５′軽鎖プライマーおよび３′ 軽鎖プライマーを用いること以外は実施例５に従って調製した。この３′軽鎖プライマーと各５′軽鎖プライマーを用いて個々の増巾反応を行った。各Ｖ、ホモログを含む反応物を合わせ、実施例６に従って制限エンドヌクレアーゼ５ａｃｌおよびＸｂａｌで消化した。“モレキュラークローニングラボラトリ−マニュアル３マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等線、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９８２）に説明されている標準的電気溶出技術を用いて■、ホモログを１％アガロースゲルで精製した。ついでこれらの■ＬＤＮＡホモログは、５℃で１晩かけて３モルのＶＬＤＮＡホモログ挿入物を各モル数の■、■発現発現ダクターイゲーションすることにより先に調製したｖＬ■発現ベクターのＳａｃ　Ｉ　− Ｘｂａ　Ｉ切断物に直接挿入した。このＤＮＡをギガパンク■ゴールド（ストラタジーンクローニングシステムズ、ラジララ、ＣＡ）でパフキングして３．０Ｘ１０’プラ一ク形成単位が得られ、その５０％が組換え体であった。実施例１３で調製した■、■、■ライブラリーを増巾し、この増巾ファージストックから“モレキュラークローニング、ラボラトリ−マニュアル“マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等線、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ（１９８２）に述べられている方法を用いて５００μ ｇのＶＬＩＩ発現ライブラリーファージＤＮＡを調製した。この■、■、■ライブラリーファージＤＮＡ５０μｇをＭＬｕｒ用バフファ２００μｉ中制限酵素ＭＬｕ＋（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）１００ユニツトを含む溶液中、３７℃で１．５時間処理した。ついでこの溶液をフェノールおよびクロロホルム混合液で抽出した。ＤＮＡをエタノール沈殿し、１００μｌの水に溶解した。この溶液を業者によって指定されている成分を含む最終容積２００ μｌ中１００ユニツトの制限酵素ＥｃｏＲＩ（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）と混合した。この溶液を３７℃に１．５時間維持してからフェノールとクロロホルムの混合液で抽出し、ＤＮＡをエタノール沈殿した後ＴＥに溶解した。実施例１２で調製した■８発現ライブラリーを増巾し、先に詳細に説明した方法を用い５００μｇの■。発現ライブラリーファージＤＮＡを調製した。業者指定の２００ｔｔｌバツフア中１００ユニツトの制限酵素Ｈ４ｎｄＩ［ｌ　（ヘーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）を含む溶液中５０μｇのＶ、発現ライブラリーファージＤＮＡを３７℃で１．５時間処理した。ついでこの溶液を０．１　Ｍ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）で飽和したフェノールおよびクロロホルム混合液で抽出した。ＤＮＡをエタノール沈殿した後１００μｌの水に溶解した。この溶液を業者指定の成分を含む最終容積２００μｌのバッファ中１００ユニットの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（ベーリンガーマンハイム、インディアナポリス、ＩＮ）と混合した。この溶液を３７℃に１．５時間維持し、その後フェノールおよびフェノール混合液で抽出した。ＤＮＡをエタノール沈殿し、ＴＨに溶解した。これらの制限処理した■９及びＶＬ■発現ライブラリーをライゲーションした。このライゲーション反応物にはストラタジーンクローニングシステムズ（ラジツラ、カリホルニア）市販のライゲーションキットに含まれる試薬を用いた１０μ １反応液中１μｇのＶ、Ｉおよび１．ｃ＋ｇのＶＬ■ファージライブラリーＤＮＡが含まれている。４℃、１６時間のライゲージラン反応の後、１μＰのライゲーションしたファージＤＮＡをキガパフクゴールド■バッキングエクストラクトでバンキングし、業者の指示に従って調製したＸＬＩ−ブルー細胞にブレーティングした。得られた３×１０６個のクローンの一部を用いて組合せの効率を測定した。生成した■８およびｖＬ発現ベクターを第１１図に示す。ＶＨおよびＶＬ両方を含むクローンをショート（Ｓｈｏｒｔ）等、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、　１６　：　７５８３−７６００　（１９８８）に述べられているインビトロ切り出し法を用いてファージからｐＢｌｕｅｓｒｉｐｔに切り出した。切り出し用に選んだクローンはデカペプチドタグ−を発現し、かつ２ｍＭＩＰＴＧの存在下でＸ−ｇａｌを切断せず白色のままであった。これらの特性を有するクローンはライブラリーの３０％を占めていた。切り出し用に選んだクローンの５０％は制限分析でＶ□とＶ、が含んでいることが分った。このＶ、、ライブラリーの３０％のクローンがデカペプチドタグを発現しかつ、 ■、■、■ブラリーのクローンの５０％がｖＬ配列を含んでいることから組合せたライブラリーのせいぜい１５％がＶＨとＶＬクローンの両方を含んでいると考えられる。実際の数がライブラリーの１５％であったことから組合せのプロセスは非常に効率の良いものであることが示された。１５、　ＶＨ抗原結合たんばく　に対するＤＮＡホモログの　離ＶＨ抗原結合たんばく質をコードするＤＮＡホモログを含む各クローンを分離するため、実施例１１で調製したＶＨ発現ライブラリーのタイターを測定した。このライブラリーのタイター測定は当分野でよく知られている方法で行った。簡単にいうと、ライブラリーの連続的希釈物を１００　ｍＭ　ＮａＣｊ！、　５０　ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨｌ、５および１０　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋を含むバッファーを用いて調製した。各希釈物１０μｌを対数増殖期の大腸菌細胞懸濁液２００μｌに添加し、３７℃に１５分間維持してファージを大腸菌に吸着させた。５　ｇ／ｌ　ＮａＣ１，２ｇ／ｌ　Ｍｇ５Ｏ＜、５ｇ／ＩＩイーストエクストラクト、１０ｇ／ＡＮＺアミン（カゼイン加水分解物）および０．７％融解５０Ｃアガロースとなるようトップアガー３ｒｎｌを調製した。ファージ、大腸菌およびトップアガーを混ぜ、予め温めておいたバクテリアアガープレート（５ｇ／ｌＮａＣ１，２ｇ／Ｉｇｓ０１．５　ｇ／ｉイーストエクストラクト、１０　ｇ／ＩＮＺアミン（カセイン加水分解物）および１５ｇ／ｌディフコアガー）の表面に均等に拡げた。このプレートを３７℃に１２〜２４時間維持し、この間にバクテリアの下地にラムダプラークが出現する。このラムダプラークを計数して元のライブラリーのｍ１当りのプラーク形成単位数を測定した。タイター測定した発現ライブラリーをブレーティングし、このライブラリーのレプリカフィルターを作製した。このレプリカフィルターを用いて目的の抗原結合たんばく質を発現するライブラリー中の個々のクローンを単離することができる。簡単にいうと、１５０ミリリットルプレート当り２００００個のプラークを生ずるタイター測定したライブラリー溶液を６００μｌの対数増殖期大腸菌に添加し、３７℃に１５分間維持してファージを大腸菌に吸着させた。さらに、７．５ｍｌのトップアガーを大腸菌と吸着したファージを含む溶液に混ぜ、この溶液全体を予め温めておいた大腸菌アガープレートの表面に均等に拡げた。この過程を全プラーク数が少なくともライブラリーサイズと等しくなるように十分な数のプレートについて繰り返す。これらのプレートを３７℃に５時間維持する。これらのプレートに予め１０ｍＭイソプロピル−ベーターＤ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む溶液で処理したニトロセルロースフィルターを乗せ、３７℃ で４時間インキュベートする。プレートに対するニトロセルロースフィルターの方向は親油性インクに浸した針をフィルターを通して大腸菌アガープレートまでつきとおし数カ所に穴をあけることで印を付ケた。ピンセットでニトロセルロースフィルターを取り、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　、１５０　ｍＭ　ＮａＣｊ！および０．０５％ポリオキシエチレンソリパンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ　−２０）を含むＴＢＳＴ溶液で１回洗浄した。ｌｏｗＭ　ｒＰＴＧ溶液に浸した別のニトロセルロースフィルターをこの大腸菌プレートに乗せ複製フィルターを作製した。さらにこのフィルターをＴＢＳＴ溶液で１５分間洗浄した。ついでこのフィルターを２０ｍＭ）リス−ＨＣ２，ｐＨ７，５、ｌ　５０　ａＭ　Ｎａｃｌおよび１％ＢＳＡを含むブロッキング液に浸し、室温で１時間振とうした。このニトロセルロースフィルターを１〜５００倍に希釈した一次抗体を含む新鮮なブロッキング液に移し、室温で少なくとも１時間緩やかに振とうした。−次抗体を含む溶液中でのフィルターの振とう後、このフィルターをＴＢＳＴ液中５分間の洗浄を３〜５回繰り返し、残存する未結合の一次抗体を除去した。ついで、このフィルターを新鮮なブロッキング液および５００分の１からｔｏｏｏ分の１に希釈したアルカリホスファターゼ結合二次抗体を含む溶液に移し、室温で少なくとも１時間緩やかに振とうした。少なくとも５分間のＴＢＳＴ液による洗浄を３〜５回行ないフィルターから残存する未結合の二次抗体を除いた。さらにこのフィルターを２０ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，５および１５０　ｓＭ　ＮａＣ１を含む溶液で１度洗浄した。フィルターを濾紙ではさんでこの溶液および湿気を除去した。このフィルターを１００ｍＭ）リス−ＨＣ１（ｐＨ９，５）　、　１　０　０　ｍＭ　ＮａＣ１、５ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｔ　、０．３Ｂ／ｍｌ　＝　トロフ゛ル−テトラソ゛リウム（Ｎ　Ｂ　Ｔ）および０．１５Ｂ／ｍｊ！　５−フ゛ロモー４−クロロー３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液中に室温で少なくとも１時間浸して発色させた。フィルターに残する発色液は２０ｍＭ）リス−１ｃｊ＋　ｐＨ７，５および１５０　ｗＭ　ＮａＣ１を含む溶液ですすいで除いた。強い紫色の発色はポジティブな結果を示している。このフィルターを用いて所望するたんばく質を産するファージのプラークを特定する。このファージプラークを単離し、さらに分析するため増殖した。い（つかの異なる組合せの一次抗体および二次抗体を用いた。最初の組合せでは、ＶＨ抗原結合たんばく質が適正なリーディングフレームで発現し、ＶＨ抗原結合たんばく質に共有結合で結合するデカペプチドエピトープを含むように翻訳される場合にのみ発現するデカペプチドに免疫特異的な一次抗体を使用した。このデカペプチドエピトープおよびこのエピトープに免疫特異的な抗体は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）等、Ｃｅ１１２８　：４７７　（１９８２）およびナイマン（Ｎｉｍａｎ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８０　：　４９４９（１９８３）に報告されている。確認されたデカペプチドの配列を第１１図、に示す。このデカペプチドに免疫特異的である等価な機能を示すモノクローナル抗体は、グリーン（Ｇｒｅｅｎ　）等およびナイマン（Ｎｉｍａｎ）等の方法を用いて調製することができる。この−次抗体とともに使用した二次抗体はヤギの抗マウスＩｇＧである（フィッシャーサイエンティフィック社）。この抗体はマウスＩｇＧの定常部に免疫特異的であるが、重鎮の可変部のいずれの部分も認識しなかった。上述の方法でこの特定の一次および二次抗体を用いることでクローンの２５％〜３０％がデカペプチドを発現し、従って、それらのクローンはＶＨ抗原結合たんばく質も発現していることが分った。別の組合せでは一次抗体として抗デカペプチドマウスモノクローナル抗体、および二次抗体としてストラタジーンクローニングシステムズ、ラジョラ、ＣＡ市販のアフィニティ精製ヤギ抗マウスＩｇを用いた。二次抗体も重鎮のＶＨと免疫反応するためこの組合せでは誤ったポジティブクローンが多数出現した。それゆえこの抗体はいずれかのＶＨたんぼ（質を発現する全てのクローンと反応し、したがってこの組合せの一次抗体および二次抗体では適正なリーディングフレームの７Ｍポリヌクレオチドを有し、デカペプチドを発現するクローンを特異的に検出できなかった。 −次抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）と結合した場合に一次抗体と二次抗体のいくつかの組合せを使用したが、この場合は、その抗体が所定の抗原（ＦＩＴＣ）と結合し、かつ発現ライブラリー中のクローンによって生産されるＶＭ抗原結合たんばく質によって結合されるのはその抗原であることから、この抗原の免疫特異性は重要ではなかった。結合した後の一次抗体はＦＩＴＣ結合マウスモノクローナル抗体ｐ２　５７６４（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９５０５）と呼ばれる。この−次抗体とともに用いた二次抗体はアルカリホスファターゼと結合したヤギ抗マウス１ｇ＆（フィッシャーサイエンティフィック、ピフツバーク、ＰＡ）。“抗体ラボラトリ−マニュアル”、バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびロー（Ｌｏｎｅ）ｋｌＡ、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ　（１９８８）に示しである方法を用いた。もしＶ、発現ライブラリー中の特定のクローンが一次抗体に共有結合したＦＩＴＣを結合するｖＭ結合たんばく質を発現するなら二次抗体が特異的に結合し、またアルカリホスファターゼを発色させると明瞭な紫色を呈する。このタイプの抗体を用いる第２の組合せではＦＩＴＣを結合したウサギ抗ヒトＩｇＧ　（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）を−次抗体に使用する。この−次抗体とともに使用した二次抗体は“抗体ラボラトリ−マニュアル”バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌｉｎｅ）編、コールドスプリングハーバ−２ＮＹ（１９８Ｂ）に示されている方法を用いてアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ウサギＩｇＧである。もし、ｖＭ発現ライブラリー中の特定のクローンが一次抗体に結合したＦＩＴＣと結合する■、結合たんばく賞を発現するなら、二次抗体は特異的に結合し、またアルカリホスファターゼを発色させると明瞭な紫色を呈する。別の一次抗体としてはＦＩＴＣおよびＩＺＪの両方に結合したマウスモノクローナル抗体ｐ　２　５７６４　（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９５０５）を用いた。この抗体は発現するいずれのＶＨ抗原結合たんばく質とも結合する。この抗体は＋２５（でも標識されているので、アルカリホスファターゼに結合する二次抗体を使用する代りにフィルターのオートラジオグラムをとる。このようにオートラジオグラムを直接とることで目的の■８抗原結合たんばく賞を発現するライブラリー中のクローンの単離が可能となる。１６、五凰猪査ヱユＳま羞するｖ８およびｖＬに関するＤＮＡホモ三久見車屋抗原結合Ｆｖを形成するＶ、およびｖＬをコードするＤＮＡホモログを含む個々のクローンを単離するために、Ｖ、ｌおよびＶＬ発現ライブラリーを実施例１５に従ってタイターを測定した。このライブラリーを実施例１５に示した方法を用い■８を発現するデカペプチドタッグの存在に関してスクリーニングした。ついでデカペプチドタッグを発現するクローンからＤＮＡを調製した。このＤＮＡを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、これらのクローンが■１ＤＮＡホモログを含むかどうかを測定した。ＰｖｕＩ［制限エンドヌクレアーゼフラグメントのより小さい移動度はそのクローンが■８および７１両ＤＮＡホモログを含んでいることを示している。Ｖ工および■Ｌ両ＤＮＡホモログを含むクローンを分析してこれらのクローンが ■イおよびＶＬＤＮＡホモログ由来の集合的Ｆ、たんばく質分子を生産しているかどうかを決定した。■Ｈおよび■１両方を含むクローン中で生産されるＦｖたんばく賞フラグメントをクローン中で発現される放射能標識したたんば（質の免疫沈殿で観察した。１００μｇ／μｌアンピシリンを含むＬＢ培地（５ｇ／ｆイーストエクストラクト、１０ｇ／ｌトリプトンおよび１０　ｇ／　Ｉ　ＮａＣＡ ’　ｐＨ７，０）　５０＋＋＋４＋にＶＯおよび■、を含むプラスミドを有する大腸菌をイノキュレートした。５５０ｎｍの光学密度が０．５になるまでこの培養物を３７℃で振とうし、ついで３０００ｇで１０分間遠心した後、メチオニンまたはシスティンを除くアミノ酸を補ったＭ９培地（６ｇ／　ｌ　ＮａｚＨＰＯ＋　、３　ｇ／　ｌ　ＫＨｚＰＯ＋、　０．５　ｇ／　ｌ　ＮａＣｊ２．１ｇ／１ＮＨ４ｃｌ、２ｇ／ｌグルコース、２　ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ＋および０．　ｌ　ｍＭ　ＣａＣ１２）　５０ｍｆ！に懸濁した。この溶液を３７℃に５分間維持した後、ＩＳＯ，−とじて０．５ｍＣ１の３５８にューイングランドニュークリア；ボストン、ＭＡ）を添加し、この溶液をさらに２時間３７℃に維持した。この溶液を３０００Ｘｇで遠心し、その上清を除去した。この細菌ペレットを凍結および融解した後４０ｍＭｈリスｐＨ８，０，１００ｍＭスクロースおよび１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液に懸濁した。この溶液を１１００００Ｘで１０分間遠心した後上清を採取した。この上清に抗デカペプチドモノクローナル抗体１０μｌを混合し、氷水中に３０〜９０分間維持した。セファロースビーズに結合したプロティンＧ（ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）４０μｌをこの溶液に混合し、氷水中に３０分間放置して免疫沈殿を形成させた。この溶液を１１００００Ｘで１０分間遠心し、生成したペレットを１００ｍＭトリス−ＨＣｊ７　（ｐＨ７，５）溶液１ｍＩ！に懸濁した後、再び１１００００Ｘで１０分間遠心した。この操作を２回繰り返す。生じた免疫沈殿ペレットを説明書に従かいファストゲルホモジニアス２０ゲル（ファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）にかけた。乾燥後、このゲルでＸ線フィルムを感光させた。このオートラジオグラムを第１２図に示す。沈殿する抗体によって認識される■ 、−デカペプチドタッグに結合していることから免疫沈殿するＶＬの存在により集合化したＦｖ分子の存在を知ることができる。１７、ファージにおける免疫グロブリンレパートリ−の　な　ムせライブラリーのＶイ、ＶＬ、ＦＶおよびＦａｂ配列の発現に適したベクターを第７図および第９図に示した。先に議論したように、このベクターは合成オリゴヌクレオチドを多重クローニング部位に挿入することによりラムダＺａｐを修正して構築した。またこのベクターはクローニングおよび発現配列に隣接するＮｏｔｌおよびＥｃｏＲ１部位に関して非対称となるように設計した。以下に述べるようにバクテリオファージのような線状ベクターにおける制限部位の位置の非対称性は軽鎖発現ライブラリーを重鎮発現ライブラリーと組合せて組合せＦａｂ発現ライブラリーを構築するシステムには基本的性質である。ラムダＺａｐＨＶｔ　１１　（第９図）は、ライブラリー構築の最初のステップで軽鎖フラグメント用のクローニングベクターとして働くよう設計され、ラムダＺａρＩ［ＶＮ（第７図）は重鎮フラグメント用のクローニングベクターとして働くよう設計されている。これらのベクターは各末端に組込んである特異的制限部位にＰＣＲ増中座中産物率よ（クローン化するように作製されている。＾、フラグメントのＰＣＲ増巾産物の両端に制限部位を組込むオリゴヌクレオチドによる肺細胞から単離したｍＲＮＡのＰＣＲ増巾を用いてＦｄおよびカッパ鎖配列を含む重鎮配列をクローン化および発現させることができる。これらの増巾に用いるオリゴヌクレオチドを第１表および第２表に示す。これらのプライマーは実施例５で■イ配列の増巾に用いたものに類似している。重鎮増巾用の５′プライマーは先にＶ、ｌの増巾に用いたものと同じであり、また、軽鎖増巾用のプライマーは同様の原則（サストリー（Ｓａｓｔｒｙ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８　Ｇ　：　５７２８　（１９８９）およびオーランド（Ｏｒｌａｎｄ）等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８　Ｇ、　３８３３（１９８９）を用いて選択した。重鎮（ＩｇＧ１）および軽鎖（Ｋ）ｔＸのユニークな３′プライマーは重軽鎖ジスルフィド結合形成に関するシスティンを含めるように選択した。この段階ではマウス抗体のほんの一部しか構成していないのでラムダ軽鎖を増巾するプライマーは構築されていない、さらに、Ｊ（結合）領域に当るｍＲＮＡに相補的な３′プライマーとプロセシングを受けたたんばく質の保存的Ｎ末端領域中の第１鎖ｃＤＮＡに相補的な１組のユニークな５′プライマーを用いてＦｖフラグメントを構築した。制限エンドヌクレアーゼ認識配列をプライマーに組込んで発現用の所定のリーディングフレームでラムダファージベクターに増巾したフラグメントをクローニングすることを可能にしている。Ｂ、ライプーリーの組合せライブラリーの構築は２段階で行った。第１段階では重鎮および軽鎖ライブラリーを別々に各々ラムダＺａｐＵＶＨおよびラムダＺａｐｎＶｔに構築した。第２段階で、これらのライブラリーを各ベクターに存在する非対称ＥｃｏＲ１部位で結合した。これで潜在的に重鎖と軽鎖の両方を発現するクローンのライブラリーができる。実際の組合せはランダムであり、必ずしも親動物中のＢ細胞集団中にある組合せを反映していない、ラムダＺａｐ■Ｖ。発現ベクターを用いて、予めキーホールリンペソトヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）を結合した第１式（第１３図）に従うｐ−ニトロフェニルホスホアミデー１−　（ＮＰＮ）抗原１で免疫化したｌ　２９　Ｇｉｘ＋マウスの肺臓から単離したｍＲＮＡのＰＣＲ増中により得られるＤＮＡから重鎮配列ライブラリーを作製した。ＮＰＮ−ＫＬＨ結合体はジメチルホルムアミド中第１式（第１３図）に従うＮＰＮ２．５ｍｇを含む溶液２５０μｌと０．０１Ｍリン酸ナトリウムバッフｙ　（ｐＨ７，２）中２ｍｇのＫ　Ｌ　Ｈを含む溶液７５０！１１を混合することにより調製した。ＫＬＨ溶液をスターラーチップで攪拌しながら、これにＮＰＮ溶液をゆっ（りと添加してい（ことによりこれらの溶液を混合した。その後、この混合物を同様に攪拌しながら４℃で１時間維持し、結合を促進させた。結合したＮＰＮ−ＫＬＨをセファデックスＧ２５を用いたゲル濾過で未結合のＮＰＮおよびＫＬＨから単離した。このＮＰＮ−ＫＬＨ結合体を実施例２で述べたマウスの免疫化に用いた。上述の免疫化で生じた肺臓ｍＲＮＡを単離し、これを用いてラムダＺａｐＩＩＬ＋発現ベクターでＶＨ遺伝子配列−次ライブラリーを構築した。この−次ライブラリーには１．３Ｘ１０’ｐｆｕが含まれており、デカペプチドタッグの発現に関するスクリーニングによりＦｄ配列を発現するクローンの割合を測定した。このペプチドの配列はＦｄ　（またはＶ、）フラグメントのベクターへのクローニング後の発現にとって読み枠の適正なもののみである。このライブラリー中の少なくとも８０％のクローンはデカペプチドタッグの免疫的検出に基づくＦｄフラグメントを発現する。軽鎖ライブラリーを重鎮と同様の方法で構築し、２．５ＸＩＯ’個のメンバーが含まれていることが示された。抗カッパ鎖抗体を用いたプラークスクリーニングは、このライブラリーの６０％が軽鎖挿入物を含んでいることを示した。この比較的少ない挿入物の割合はおそら＜５ａｃＩおよびＸｂａＩの切断後のベクターの不完全な脱リン酸化によるものである。一度これらのライブラリーが出来れば、これらを用いてＥｃｏＲ１部位での交叉により組合せライブラリーを構築できる。交叉を行うにはまずＤＮＡを各ライブラリーから精製する。ついで軽鎖ライブラリーを制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩで切断し、生成する５′末端を脱リン酸化し、その生成物をＥｃｏＲＩで消化した。この過程でベクターの左アームがいくつかに分断されるが、軽鎖配列を含む右アームは元のままである。平行して、重鎮ライブラリーのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、脱リン酸化後ＥｃｏＲＩで切断した。これにより重鎮配列を含む左アームを元のまま残し右アームを破壊した。このように調製したＤＮＡを合わせライゲーションした。その後軽鎖含有クローンの右アームと重鎮含有クローンの左アームの組合せで生じるクローンのみが生育するファージを再構成する。ライゲーションおよびバッキング後２．５Ｘ１０’クローンが得られた。これはＮＰＮに対するアフィニティーを有するクローンであると同定される組合せＦａｂ発現ライブラリーである。軽鎖および重鎖フラグメントを共発現するファージの頻度を測定するため軽鎖、重鎮および組合せライブラリーの複製物を軽鎖および重鎮発現に関して述べた方法を用いてスクリーニングした。約５００個の組換えファージを用いた実験で、その約６０％が軽鎖および重鎮たんばく質を共発現した。Ｃ−仄厘旦殖金３つのライブラリー、軽鎖、重鎖およびＦａｂをスクリーニングして、それらがＮＰＮを結合する抗体フラグメントを発現するかどうかを調べた。典型的には３００００個のファージをブレーティングし、ニトロセルロースの複製物を１２５ ■ラベルしたＢＳＡに結合したＮＰＮへの結合に関してスクリーニングした（第１５図）。軽鎖ライブラリーからの５ｏｏｏｏ個の組換え体ファージおよび重鎮ライブラリーからの同数の組換え体ファージの複製物はいずれもその抗原を結合しなかった。これに対し、Ｆａｂ発現ライブラリー由来の同数のクローンのスクリーニングではＮＰＮを結合するファージが多数同定された（第１５図）。このことは軽鎖と組合せた多くの重鎮が抗原に結合する条件下では、同重鎖または軽鎖のみではその抗原に結合しないことを示している。それゆえ、ＮＰＮの場合、各々特定の軽鎖および重鎮と組合わされた場合のみ抗原と結合する重鎮および軽鎖が多数存在すると考えられる。組合せライブラリー中の多数のクローンをスクリーニングし、かつ抗原結合クローンの頻度をより定量的に見積るため、１００万個のファージプラークをスクリーニングし、その約１００個のクローンが抗原と結合することが同定された。ＮＰＮと結合すると考えられる６個のクローンに関し、そのポジティブプラークとその周囲の約２０個のプラークを含むプレートの領域を採取し、再ブレーティングした後、複製物でスクリーニングを行った（第１５図）。期待されるように、ファージの約２０分の１が抗原と特異的に結合子る。ネガティブと考えられるブレーティングファージの採取領域は再ブレーティングでもポジティブな結果を示さなかった。抗原−抗体相互作用の特異性を測定するため、第１６図に示すように抗原結合を遊離の非標識抗原と競合させた。この競争実験で各クローンはその抗原アフィニティーに基づいて区別し得ることが示された。結合の完全な阻害に必要な遊離ハプテンの濃度はｌＯ〜１００ＸｌＯ’Ｍの範囲にあり、このことは発現したＦａｂフラグメントはナノモルレンジの結合定数を有していることを示している。Ｄ、クローンの　と実施例１８Ｃで述べたようにＮＰＮを結合し得るたんばく質産物の特性を調べるため、重鎮および軽鎖遺伝子を含むプラスミドをＭ１３Ｉｌｐ８へルバーファージを用い適当なバクテリオファージ採取物から切り出した。切り出したプラスミドのマツピングで重鎖および軽鎖配列の組込みと一致する制限パターンが示された。１つのクローンのたんばく質産物をＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロットで分析しＮＰＮ結合たんばく質の存在を確認した。ＩＰＴＧ誘導後誘導菌上清を濃縮しゲル濾過した。分子量４０〜６０ＫＤレンジの百分を採集し、濃縮後さらにゲル濾過した。第１７図に示したように、溶出フラクションのＥＬ　Ｉ　ＳＡ分析は、ＮＰＮ結合が免疫学的検出で重鎮および軽鎖両方を含んでいることが示された約５０ＫＤの分子量を有するたんばく賞に関連していることが示された。非還元条件下での濃縮細菌上清調製物のウェスタンプロット（データ示さず）を抗デカペプチド抗体で検出した。これで分子量５０ＫＤのたんばく質バンドが検出された。これらの結果は、重鎮および軽鎖が共有結合したＦａｂフラグメントの機能であるＮＰＮ結合と一致している。本実施例ではＦｄ配列のＰＣＲ増中に限定した数のプライマーを用いたことで比較的に制限されたライブラリーが構築された。このライブラリーにはカッパ／ガンマ配列を発現するクローンのみが含まれると期待される。しかし、さらにプライマーを添加してどのクラスまたはサブクラスの抗体も増巾し得ることから本方法を本質的に制限するものではない、この制限にもかがねらず我々は多数の抗原結合クローンを単離できた。本研究から生じる中心的問題はこれまで述べてきたように調製したファージライブラリーがサイズ、多様性および取板い易さの点でどのようにインビボ抗体レパートリ−と比較できるかという事である。哺乳類抗体レパートリ−の大きさは評価し難くいが、１０”〜１０”種の抗原特異性があると云われている。以下に述べる条件で現行の方法を修正することによりこのサイズあるいはそれ以上のファージライブラリーを容易に構築できる。事実、一度最初の組合せライブラリーを構築すれば、重鎮および軽鎖をシャツフルして非常に大きいサイズのライブラリーを得ることができる。原則として、本来のく免疫化していない）インビボレパートリ−および対応するファージライブラリーの多様性はいずれも重鎮と軽鎖のランダムな組合せによるものである点で同じであることが期待される。しかし、インビボレパートリ−とファージライブラリーによって発現される多様性は種々の因子で制限されているであろう、たとえば、耐性等の生理的変化はインビボレパートリ−由来の特定の抗原特異性の発現を制限するであろうが、ファージライブラリーにおいてはこれらの特異性は出現するであろう。一方、クローニング過程のバイアスはファージライブラリーの多様性を制限するであろう。たとえば、刺激されたＢ細胞によって発現される配列の−ＲＮＡの出現は、発現レベルが高いことから非刺激細胞由来のものよりも多いことが期待される。種々の組織（たとえば、末梢血液、骨髄またはリンパ節）および種々のＰＣＲプライマー（たとえば種々のクラスの抗体を増巾することが期待されるもの）で種々の多様性を有するライブラリーができる。インビボレパートリ−とファージライブラリーの別の差異は前者から単離された抗体は重鎮および軽鎖の組合せ後の体細胞変異によるアフィニティーの成熟による恩恵を授かるが後者では成熟した重鎮および軽鎖がランダムに結合していることである。特定のインビボレパートリ−に由来する十分大きいライブラリーが与えられれば、本来の成熟した重鎮および軽鎖が組合せられるであろう。しかし、この新しい方法の潜在的利点の１つは単一の非常に多様性に富む“包括的“ファージライブラリーの生成により免疫化を省けることであるので体細胞変異やクローン選択の欠除を補償するため配列を至適化する方法は有用である。第１に、ＣＩ）Ｈについて飽和突然変異誘発を行ない、生じたＦａｂを機能の増加について検定した。第２に、抗原を結合するクローンの重鎮または軽鎖を組合せライブラリーの構築に用いたものと同様の操作で全軽鎖または重鎮ライブラリーと組合せる。第３に、２つの上記操作を免疫グロブリンのアフィニティーまたは触媒特性が至適化するまで繰り返す。後者の２つの操作はＢ細胞クローン選択では許るされない。このことはここで述べている方法が実際に至適配列を同定しつる能力を増加していることを示していることに注目すべきである。アクセスするのはインビボレパートリ−とファージライブラリーを比較することが興味深い第３の領域である。実際にはファージライブラリーの方が非常にアクセスしやすい。スクリーニング法ではプレート当り少なくとも５ｏｏｏｏ個のクローンを調べることができ、その結果１日に１０’種の抗体を容易に試験できる。この因子だけでもハイブリドーマ法を本方法に置き換えるに十分である。最も強力なスクリーニング法は従属栄養細菌株の複製に必要な放出基や触媒作用の不活性化を引き起こす毒性置換体などの選択可能マーカーを抗原に組込むことにより行ない得る選択を利用する。またインビボ抗体レパートリ−は結合アフィニティーに基つく選択である免疫化を介してアクセスし得るという事実に関する利点がある。ファージライブラリーに同様の制限はない。たとえば、触媒活性を有する抗体を同定する唯一の一般的方法は遷移状態アナログに対する抗体のアフィニティーに基づく予備選択によるものである。原則として触媒を直接検定し得るインビトロライブラリーにそのような制限は適用されない。機能に関して多量の抗体を直接検定し得る能力により、そのメカニズムがよく分っていないか、または遷移状態アナログの合成が困難な反応中の触媒の選択が可能となる。触媒活性検定は合成アナログにそぐわない反応メカニズムに関するスクリーニング操作のバイアスを直接除外する。それゆえ所定の化学的転換に対する多くの反応経路を同時に検索することが可能である。ここで公開している方法は本来の抗体とは多くの重要な点に関して明らかに異なるＦａｂフラグメントの生成について述べられている。１価Ｆａｂ抗原バインダーを有することにおいて明らかにアフィニティーのロスがあるが、これは適当なバインダーを選択により補償される。診断やバイオセンサーなど多数の応用を目的として】価Ｆａｂフラグメントを得ることは好ましい。Ｆｃエフェクター機能を必要とする応用のため、哺乳類細胞中重鎖遺伝子を拡張しグリコジル化した抗体を発現するため方法がすでにある。ここで示された考え方は抗体の同定および評価における困難に立ち向っている。従来に比べ少な（とも３桁も多い一特異的クローンを構築およびスクリーニングすることが可能である。本方法、の応用は基本的研究および応用科学に及ぶ。先に示した事項は本発明の説明を目的としたものでこれを制限するものではない。本発明の精神や範囲を逸脱することなしに本発明を変化および修正することが可能である。浄書（内容に変更なし）浄Ｖ（内容に変更なし）＃Ｌ：３９ＴＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＴＴ＃ＬＯ：３＃Ｌ３２ＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣサブクラス　エエ　（Ｂ）＃Ｌ：３７／ＬＯ６浄書（内容に変更なし）ＬＯ２Ｌ３４＃Ｌ５０浄書（内容に変更なし）Ｊ”ＬＯ８その他／Ｌ：Ｉ５／Ｌ４８浄書（内ｉ；二変更４し）シャインーダルガルノ　ＭΣＴＣＧＴＴＴＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＴＧＧＡＴＭＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＧＴＣ浄書（内容に変更な− ＦＩＧ、　６Ｂ−１とＥＴ　リーダー配列ＦＩＧ、　６Ｂ−２特表平５−５０１３４８　（３１）ＦＩＧ、　１２浄書（内容に変更なし）・　・　０・　・　６．７×１０°１２・　・　６．７×１０°１０・　・　６．７　×１０”９６．７×１０°８６．７　×１０’ ６．７×１０°６６．７×１０°５吸収　ｆ４０５　ｎｍｌ吸収　［４０５ｎｍｌ平成　年　月　日

Claims

【特許請求の範囲】

１．それぞれ第一及び第二遺伝子からの第１及び第二ポリペプチドの発現を調節する５′末端プロモーターを含む線状二本鎖ＤＮＡ発現ベクターを製造する方法において、当該第一及び第二ポリペプチドがあらかじめ決められた特異性を有するヘテロ二重体レセプターを形成することができる方法であり、（ａ）当該第一ポリペプチドをコードしている遺伝子を含む第一遺伝子の多様な第一集団の単離（但し、当該第一集団はエンドヌクレアーゼによって認識される制限部位を規定する線状二本鎖ＤＮＡ分子によって構成されており、当該制限部位は当該遺伝子に対しては５′末端に配置され、当該遺伝子の発現を調節するプロモーターに対しては３′末端に配置されている。）；（ｂ）当該第二ポリペプチドをコードする遺伝子を含む第二の遺伝子の多様な第二集団の単離（但し、当該第二集団は当該制限部位を規定する線状二本鎖ＤＮＡ分子によって構成されており、当該制限部位は当該第二の遺伝子に対して３′末端に配置され、当該第二の遺伝子は当該第二の遺伝子の発現を調節するプロモーターに対して３′末端に配置されている。）；（ｃ）粘着末端及び当該第一遺伝子の１個あるいは当該第二遺伝子の１個のいずれかを有する制限断片を産生するための、当該二本鎖ＤＮＡ分子の当該集団中に存在する間の当該エンドヌクレアーゼによる開裂；及び（ｄ）同一のＤＮＡ鎖上に縦に並び単一のプロモーターの調節下にある当該第一遺伝子を１個と当該第二遺伝子を１個有する二本鎖線状ＤＮＡ発現ベクターの多様な集団を産生するための、当該制限断片のそれぞれの当該粘着末端による互いのランダムな結合；（ｅ）二本鎖ＤＮＡ発現ベクターの当該多様な集団からの、あらかじめ決められた特異性を有する当該異種二成分性レセプターを発現することができるベクターの単離；を含む方法。
２．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第一遺伝子が第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離湾、（ａ）第一ポリペプチドコーディング遺伝子のレパートリーの鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされた第一ポリペプチドコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該第一ポリペプチドコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーは第一ポリペプチドコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なる第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なる第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログが産生される）；及び（ｃ）複数の異なる当該第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログのそれぞれの、プロモーター調節下における発現のための発現ベクターへの機能的結合；を含む方法。
３．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第二遺伝子が第二ポリペフチドコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）第二ポリペプチドコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされた第二ポリペプチドコーディング鎖を含む二本領核酸を含む）；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該第二ポリペプチドコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーは第二ポリペプチドコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なる第二ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なる第二ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログが産生される）；及び（ｃ）複数の異なる当該第二ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログのそれぞれの、プロモーター調節下における発現のための発現ベクターへの機能的結合；を含む方法。
４．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第一ポリペプチドがＶＨであり、当該第一遺伝子がＶＨコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＨコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＨコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；及び、（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該ＶＨコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＨコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
５．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第二ポリペプチドがＶＬであり、当該第二遺伝子がＶＬコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＬコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＬコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；及び（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ当該ＶＬコーディング鎖の間に保存されている配列にハイプリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＬコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＬコーディングＤＮＡ水モログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なる第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
６．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第一ポリペプチドがＶＬであり、当該第一の遺伝子がＶＬコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＬコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＬコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；及び（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該ＶＬコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＬコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＬコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なる第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
７．請求の範囲第１項記載の方法において、当該第二ポリペプチドがＶＨであり、当該第二の遺伝子がＶＨコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＨコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＨコーディング鎖を含む二木鎖核酸を含む）；及び、（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該ＶＨコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第２プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＨコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
８．請求の範囲第４項記載の方法において、当該第二ポリペプチドがＶＬであり、当該第二の遺伝子がＶＬコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＬコード化遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＬコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；及び（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該ＶＬコーディング鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＬコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＬコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なる第一ポリペプチドコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
９．請求の範囲第６項記載の方法において、当該第二ポリペプチドがＶＨであり、当該第二の遺伝子がＶＨコーディングＤＮＡホモログであり、当該単離が、（ａ）ＶＨコーディング遺伝子のレパートリーにある鎖の分離（但し、当該レパートリーはそれぞれが、相補的鎖にアニールされたＶＨコーディング鎖を含む二本鎖核酸を含む）；及び、（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件下での、第一及び第二ポリヌクレオチド合成プライマーによる当該分離鎖の処理（但し、当該第一プライマーはそれぞれ、当該ＶＨコーディング鎖の間に保存されている配列にハイプリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第二プライマーはそれぞれ、当該相補的鎖の間に保存されている配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を有し、当該第一及び第二プライマーはＶＨコーディング遺伝子の当該レパートリーからの複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログの増幅を開始させることができ、当該処理により複数の異なるＶＨコーディングＤＮＡホモログが産生される）；を含む方法。
１０．水性溶媒中にエンドヌクレアーゼとともに混合された第一及び第二線状二本鎖ＤＮＡベクターを含むクローニング系において、当該ベクターがそれぞれ、プロモーター、当該エンドヌクレアーゼによって開裂される制限部位及びポリリンカーを規定し、当該制限部位が当該第一ベクター上では当該プロモーター及び当該ポリリンカーの間に位置し、当該ポリリンカーが当該第二ベクター上では当該プロモーター及び当該制限部位の間に位置し、当該制限部位が開裂して当該ベクターのそれぞれから互いに相補的な末端を有する第一及び第二ポリリンカー含有性制限断片をそれぞれ産生することができるクローニング系。