JPH04506600A

JPH04506600A - ヘテロマーレセプタの同時発現

Info

Publication number: JPH04506600A
Application number: JP50908290A
Authority: JP
Inventors: ヒュース　ウィリアム　ディー
Original assignee: ザ　スクリップス　リサーチ　インスチテュート
Priority date: 1989-05-16
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1992-11-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】浄書（内容に変更なし）ヘテロマーレセプタの同時発現発明の背景多くの生物学的に重要な分子は、アミノ酸サブユニットの線形配列からなるタンパクである。タンパクは、特に酵素、抗体または構造タンパクとして機能できる。他のタンパクまたは非タンパク分子と結合して化学反応する機能をもつタンパクはレセプタといわれる。

生細胞内で発現された場合に、タンパクの機能的特徴はそのアミノ酸配列によって定まり、該アミノ酸配列は、順に遺伝子と呼ばれるＤＮＡ配列によりコードされる。多くのタンパクは単一の遺伝子によりコードされる単一の分子であるが、他のタンパクは空間的に結合して活性なタンパクを形成する２種以上の別々のポリペプチドで構成され、該ポリペプチドの各々は別々の遺伝子によりコードされる。このようなタンパクはヘテロマー（ｈｅｔｅｒｏ−１ｌｅｒ）　と呼ばれている。このようなタンパクがレセプタとして機能する場合、これらはヘテロマーレセプタである。

特徴的構造または機能によって規定されるタンパクの特別な群は、その機能の多様性を示し、これは特定のアミノ酸配列における差異を反映している０例えば、色覚において異る源色に対するレセプタは、構造上は関連するがａ能的に異なる種の異ったロドプノン分子である。構造上の差異は各種疾病におし）て重要である。

例えば、大部分の健康な人々のヘモグロビンは、鎌状赤血球貧血症色者のヘモグロビンと、隼−のアミノ酸のみ異なる。実際に、ある群のタンパクははかり知れない可変性を示す、このような可変性は該タンパクの特定の機能の故に重要である。

多くのタンパクは多数の構造並びに機能的ドメインをもつ、いくつかの場合において、２つの異る型のドメインが同時に存在し得る。抗体は、同時に存在する２種の明確に規定された構造的並びに機能的ドメインをもつタンパク群の例である。抗原と結合するこれらドメインの一方は機能的に分れており、かつ他方のエフェクタドメインは機能的に制限されている。抗体は４種の結合したポリペプチドを含むタンパクであり、その２つはいわゆる重鎮であり、残りの２つは軽鎖である。この４種のポリペプチドは結合して、ｒＹＪ字に顕像すると思われる構造を形成し、２本の腕の先端部は抗原と呼ばれる分子を選択的に認識しかつこれと結合することのできる結合サイトである。この際、身体は該抗原を異物質と認識する。該重鎮の結合サイトはＶＨと記され、一方軽鎖の結合サイトはＶＬと記される。該“Ｙ−字型１の各腕はＦａｂフラグメントと呼ばれる。というのは、これ力ｑ亥抗原結合機能ドメインを含むからである。このような結合は、有害な異物、例えばウィルスまたはバクテリアの排除のために重要である。生物が遭遇する恐れのある多大な種類の異る抗原の存在のために、真人な数の抗体が必要とされる。このような多様性、即ち能力範囲は咳ＶＨおよびＶＬ結合領域のタンパクをコードする多数の遺伝子を各個体がもつことにより達成される。免疫系の細胞中では、これら様々なＶＨおよびＶＬコード遺伝子の無秩序な組合せが無秩序に結合して、１０’個もの異る抗体分子の表現を可能とする。

この可能性は、咳■ＨおよびＶＬ積構造ドメインが、これら２つの横５ドメイン間にふり分けられた該結合機能ドメインよりも小さいことから生ずる。機能の大きな多様性が構造ドメインの組合せにより得られる場合、任意の２つの特定の構造ドメインの組合せの特異的機能は予測できない。従って、タンパク工学には、予想し得る機能のタンパクの構造ドメインの組合せが限られた機能の多様性のみを発現でき、一方で様々な機能を生ずる構造ドメインの組合せが通常は予測できないという長年月に及ぶ問題があった。この非予想性は著しく多様性の潜在的機能をもつタンパク分子の構築を妨害してきた。この問題に対する一解決策は、３Ｄタンパク構造およびコンピュータアルゴリズムを利用した合理的なタンパク設計により、タンパク設計の予測可能性を高めようとする試みであった。この方法は一般的には成功していない。この非予測性を扱った全く異る方法は各々が潜在的に所定の機能をもつと思われる極めて多数のタンパクを構築することであろう。この非予測性が、構築し得かつ所定の機能につきアッセイし得る、可能性として正しいポリペプチドの数と一致する場合には、非予測性の問題は克服できる。

これは、予め決められた特性をもつタンパクの設計および遺伝子のクローニングに対して基本的な関連性をもつ。

ここ１５年間に、バクテリアまたは他の細胞中でポリペプチド−コード遺伝子を表現することによる生産法が開発された。遺伝子クローニングと呼ばれるこの方法は、特定のタンパクを大量に生産できるという大きな利点をもたらす。遺伝子はその配列構造および表現されたタンパクの機能を基にしてクローニングされなければならない。しかし、最近まで、クローン化遺伝子をその表現タンパクの機能により同定する場合に、Ｅ、コリ中の遺伝子ライブラリから単一の遺伝子クローンが同定できたにすぎない。かくして、例えば、Ｅ、コリ中で様々な異る型の機能を再現することは不可能であった。更に、大量の単一の抗体種を与えるハイブリドーマ技術さえも、単一の生物によって作られる抗体種ばかりか種内でまたは種間で生成し得る抗体種の多様な能力範囲を再現できないという問題を有する。生体外でのヘテロマーの大きな能力範囲（「ｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ　）を実現しかつスクリーニングする能力は、特定の望まれる機能をもつ特定のへテロマーの選別を可能とするであろう。

従って、各々が別々のＤＮＡ配列によってコードされる複数のポリペプチドを含むヘテロマーの真人な能力を実現し得る方法め開発に対する積年の要求があった。本発明はこの要求を満たし、かつ関連する多くの利点をも与える。

発明の概要本発明は、第１及び第２ＤＮＡ配列の様々な組合せを含む複数の原核細胞を含有する組成物を提供するものであり、該ＤＮＡ配列は夫々第１及び第２ポリペプチドをコードし、該ポリペプチドはヘテロマーレセプタを構成し、また少なくとも一つの該複数の原核細胞は予め選択された分子に対し結合活性を示すヘテロマーを発現する。

本発明は２種以上のＤＮＡ配列を同時に発現するのに有用なベクターの調製用キットをも提供し、該キットは２種のベクターを含み、その第１のベクターは配向を規定するクローニングサイトの規定された側に第１の結合サイトをもち、かつ第２のベクターは第２の結合サイトおよび該第１ベクターの配向とは非対称の配向をもつクローニングサイトをもち、該ベクターの少なくとも一方は、該クローニングサイトに挿入されたＤＮＡ配列によりコードされるヘテロマーレセプタを形成するポリペプチドを発現するためのプロモータを含む。

本発明は、更に結合してヘテロマーレセプタを形成する第１及び第２ポリペプチドをコードする第１及び１Ｅ２ＤＮＡ配列をもつ種々の数のベクターを生成する方法をも提供し、該方法は以下の諸工程を含む。即ち、（ａ）Ｉ＜１のポリペプチドをコードする種々の数の第１のＤＮＡ配列を、ある定められた配向で結合サイトおよびクローニングサイトを有する第１のベクターに機能可能に結合する工程、（ｂ）　第２のポリペプチドをコードする様々な数の第２のＤＮＡ配列と、該第１のベクターの結合サイトと相容性の結合サイト’ ｂよび該第１のベクターとは非対称配向のクローニングサイトをもつ第２のベクターとを機能可能に結合する工程、および（Ｃ）　工程（ａ）のベクター生成物と、工程（ｂ）のベクター生成物とを、結合ベクターを形成し得る条件下で結合させて、該結合ベクター上で機能的に結合した第１及び第２ＤＮＡ配列を有する該ベクターを生成する工程。この結合は、例えば工程（ａ）およびら）で得たベクターを制限エンドヌクレアーゼで開裂し、ＤＮＡリガーゼまたはＦＩｐｌＪコンビナーゼを用いて該開裂された工程（ａ）および（ｂ）のベクターを結合することにより実施することができる。

図面の簡単な説明第１図は軽鎖ベクター（λＬｃ１）、重鎮ベクター（λＨｃ２）およびこれらの結合ベクターを模式的に示す図であり、第２図は、第１図の（Ａ）軽鎖ベクター（λＬｃｌ）および（Ｂ）重鎮ベクター（λＨｃ２）を生成するためのλＺａｐｆｆに挿入された合成オリゴヌクレオチドの核酸配列を示す図であり、第３図は、結合鎖（ＡとＢ）、重鎮（ＥとＦ）および軽鎖（ＧとＨ）ライブラリーに対するライブラリースクリーニングのオートラジオグラフを示す図であり、第４図は競合阻害により結合する抗原の特異性を示す図であり、第５図は該結合ベクターから切除し得るプラスミドを表す模式％式％第６図は結合ベクターライブラリー由来の抗原結合タンパクの特徴付けを示す図であり、第７図は、該結合サイトとしてＦｌｐ認識配列を用いた結合ベクターのベクター系の構成を示す図である。

又里坐狂貢左且ユここで使用する１多種の組み合わせ（ｄｉｖｅｒｓｅ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ）”という用語は、第１のポリペプチドをコードする多、数の可能性を有する核酸が、第２のポリペプチドをコードする多数の可能性を有する核酸と組み合わされることを意味する。従って、多数の可能性を有する組み合わせが説明される。

ここで使用する“異種のレセプター゛という用語は、少なくとも一方が異種のＤＮＡにコードされる、少なくとも２種のポリペプチドからなるポリペプチドを意味する。従って、ヘテロマーは、共通の機能を結び付は且つ示す２種以上のポリペプチドからなる。

レセプターは、リガンドを結合する能力を有するポリペプチドを意味する。従って、レセプターはまた、そのリガンドに結合したとき第２のプロセスに影響を及ぼすことができる蛋白質も含む。

形成可能な異種のレセプターの例としては、抗体、Ｔ−細胞レセプター、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）、ホルモンレセプター及び伝達レセプターが挙げられる。

ここで使用する“結合活性°という用語は、ヘテロマーが分子に対する親和力を示すことを意味する。この親和力はその分子に特異的なものであり得、例えば、これを使用してその分子に対する機能を検出しあるいは影響を及ぼすことができる。

ここで使用する“予め選択された分子”という用語は、結合活性が望まれる特定の分子を意味する。実際的にはいかなる分子も結合することができるので、この分子はすべての可能性のある分子群から選択される。この分子に特異的に結合しその分子の機能を検出し又はそれに影響を及ぼすことができる特異的なヘテロマーを創製することができる。

ここで使用する“結合することができる第１及び第２ポリペプチド”という用語は、相互に化学的又は物理的にひきつけあってヘテロマーを形成する、第１及び第２ヌクレオチド配列がコードするポリペプチドを意味する。

ここで使用する“結合部位”という用語は、開裂し、他のヌクレオチド配列と結合することができるヌクレオチド配列を意味する。このような開裂と結合の結果、望ましいポリペプチドの翻訳を可能とするように適切な配向で両配列を含む核酸ができる。

ここで使用する“非対称”という用語は、分割線のような境界の両側で又は軸の周囲で、形状、サイズ又は配置が同一ではないこと又は対応していないことを意味する。例えば、ＤＮＡ配列の５゛及び３゛末端に関して２種の異なる制限部位の配置が第１のベクターと第２のベクターで反対方間に配置されている場合には、これらの配置は非対称である。

ここで使用する“感染”又は１形質転換”という用語は、核酸が脂質膜により細胞外の流体から完全に分離された生物細胞中に核酸を導入することを意味する。

本発明は組み合わせ遺伝子発現に関するものであり、ここで使用する“インビトロ”という用語は、特定の発現が自然には起こらない系でそのプロセスを実施することを意味し、従って、“インビトロ”という用語は、原核細胞中及び真核細胞中両者での発現を意味することができる。ただし、後者は遺伝子の組み合わせを自然に発現することはない。

本発明は、発現可能で且つ異種のレセプターを形成することができる、第１及び第２のポリペプチドをコードする第１及び第２ＤＮＡ配列の多種の組み合わせを含む複数の原核細胞を含み、該複数の原核細胞の少なくとも１種が、′予め選択された分子に対する結合活性を示すヘテロマーを発現するような組成物を提供する。

原核細胞は好ましくは大腸菌であるが、他の好適な原核細胞も使用することができる。好適な代替細胞は、文献を調べ、どのベクター及び細胞がここに教示された方法に適合したものであるかを決定することにより選択できるであろう。従って、代替細胞は選択された宿主細胞中で第１及び第２ＤＮＡ配列を発現することができる適合ベクターを必要とする。また、真核細胞も使用することができる。

この使用は単に、適合真核細胞中で機能する真核細胞の制御及び発現要素の置換を必要とするだけである。従って、原核及び真核細胞系において適合性とは、ベクター／宿主の組み合わせが、望ましい機能を達成するために必要なすべての信号及び要素を備えていることを意味する。

細胞、ベクター、及びこのベクターを使用する方法を始めとする本発明において、異種のレセプターの機能性部分をコードする第１及び第２ＤＮＡ配列は、例えば、抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター及び伝達レセプターであり得る。従って、第１及び第２ＤＮＡ配列はＦａｂ、　Ｆ’ａｂ等の抗体の可変重鎮及び可変軽鎖の機能性部分をコードすることができる。

実際、多種の組み合わせ又は代替コード配列のレパートリ−から形成されるいかなるヘテロマーも本発明の方法により製造することができる。例えば、特定のホルモン及び伝達レセプターをα及びβサブユニットの組み合わせにより製造することができる。従って、本発明は、後に発見された代替型の、多種の組み合わせヘテロマーに容易に適用可能である。

本発明はまた、結合して予め選択された分子に対する結合活性を示す異種のレセプターを形成することができる、第１及び第２ポリペプチドをコードする異種の第１及び第２ＤＮＡ配列の種々の組み合わせを含む複数の原核細胞を含み、第１の［）ＮＡ配列の多様性が約１００以上の異なる配列であり、第２のＤＮＡ配列の多様性が約１０００以上の異なる配列であるような組成物を提供するものである。

本発明はさらに、２種以上のＤＮＡ配列の共発現に使用するベクターの製造用キットであって、２種のベクター、すなわち、配向を規定するクローニング部位の所定の側に第１の結合部位を有する第１ベクターと、該第１ベクターの配向と非対称な配向のクローニング部位と第２の結合部位とを有する第２ベクターを含み、該ベクターの一方又は双方が、該クローニング部位に挿入されたＤＮＡ配列がコードする異種のレセプターを形成するポリペプチドを発現するためのプロモーターを含んでいることを特徴とするキットを提供するものである。該ベクターはウィルスであり得る。

好適なウィルスは、哺乳動物ウィルス及びバタテリオファージを含み得る。ここに教示された内容はこのようなベクターの使用に適用することができる。また、ベクターはプラスミドであってもよい。

本発明のベクターの第１及び第２結合部位は可能性のある多数の型のものである。ここで使用される特定の部位は、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲｌ及びＮｏｔｌ−Ｎｏｔｌであり、特定のクローニング部位はＸｈｏｌ−３ｐｅｌ、５ａｃｌ−Ｘｂａｌ及び５ａｃｌ−３ｐｅｌからなる群から選択された。さらに、第１及び第２の結合部位は、部位特異的再結合部位、特に、Ｆｏｐ再結合部位であり得る。代替部位は本発明の開示に基づいて実施することができる。

本発明はまた、第２ベクターと結合されたとき予め選択された分子に対する結合活性を示すヘテロマーを発現することができるベクターであって、配向を規定するクローニング部位の所定の側に第１の結合部位を有し、該第１ベクターの配向と非対称な配向のクローニング部位と第２の結合部位とを有する第２ベクターと結合することができ、該ベクターの一方又は双方が、該クロー三ング部位に挿入されたＤＮＡ配列がコードするヘテロマーを形成するポリペプチドを発現するためのプロモーターを含んでいることを特徴とするベクターを提供するものである。

本発明はさらに、結びついてヘテロマーを形成するポリペプチドをコードする二種のＤＮＡ配列を共発現するためのクローニング系を提供するものであり、該クローニング系は、第−ＤＮＡ配列の多様な集合を有する一種類の第一ベクターの組と、第二ＤＮＡ配列の多様な集合を有する一種類の第二ベクターの組とを有し、該第−及び第二ベクターは、該第−及び第二ＤＮＡ配列が機能的に結合されるように互換性のある結合部位を有している。

本発明はまた、可能な第−及び第二ＤＮＡ配列の複数を含む複数の発現ベクターを提供するものであり、それぞれの発現ベクターは、ベクター上に機能的に結合された第−ＤＮＡ配列及び第二ＤＮＡ配列を有しており、各ベクターは実質的に第−及び第二ＤＮＡ配列の異なる組合せを含む。

さらに本発明により、結びついてヘテロメリックなレセプターを形成する第−及び第二ポリペプチドをコードする第−及び第二ＤＮＡ配列を有するベクターの多様な集合を構築する方法が提供され、該方法は、（ａ）決定された配向で結合部位とクローニング部位とを有する第一ベクターに、第一ポリペプチドをコードする第−ＤＮＡ配列の多様な集合を機能的に結合させる工程、（ｂ）　！−ベクターの配向性とは非対称の配向性で第一ベクター上の結合部位と互換性のある結合部位とクローニング部位とを有する第二ベクターに、第二ポリペプチドをコードする第二ＤＮＡ配列の多様な集合を機能的に結合させる工程、（ｃ）工程（ａ）のベクター産物を、工程（ｂ）のベクター産物に両者の結合が起こる条件下で結合して、そのベクターに機能的に結合された該第 −及び第二ＤＮＡ配列を有する結合ベクターとする工程、を含む。上記の結合工程は、例えば工程（ａ）及び（ｂ）のベクターを制限エンドヌクレアーゼで開裂し、開裂した工程（ａ）及び（ｂ）のベクターをＤＮＡリガーゼで結合するか、Ｆｌｐレコンビナーゼで結合することにより行うことができる。

予め選択された分子に特異的なヘテロマーを発現する原核細胞を選択する方法も併せて提供される。その方法は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の多様な集団を有する第一ベクターと、第一ベクターによりコードされるポリペプチドとヘテロメリックなレセプターを形成するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の異なる多様な集団を有する第二ベクターとを、ランダムに結合する工程、ランダムに結合した該配列を充分な数で原核細胞にトランスフェクトする工程、および、該細胞をスクリーニングして予め選択された分子に特異的なヘテロマーを発現する細胞を決定する工程を含む。この方法において、上記の結合工程は、第−及び第二ベクターを制限エンドヌクレアーゼで開裂し、開裂した第−及び第二ベクターをライゲートするか、Ｆｌｐレコンビナーゼを使用することにより行うことができる。従って、所望のヘテロマーの取得を合理的に確保するための該第−及び第二ＤＮＡの集合の可能な組合せに対して、ランダムに結合した配列の数Ｃま充分に匹敵するものであってよい。

最後に、複数のポリペプチドにより構成される機能的なヘテロメリックレセプターを同定する方法が提供され、該方法は、結合してヘテロメリックレセプターを形成するポリペプチドをコード第−及び第二ＤＮＡホモログの多様な集合を形成させる工程を含み、この多様性は、共発現に由来するポリペプチドにより形成されるヘテロマーの少なくとも一つが、所望の機能特性を有するのに少なくとも充分であり、かつ咳へテロメリツクレセプターが予め定められた機能についてスクリーニングすることができるように制限されている。

ここで使用される方法では、インビトロまたはインビボのランダム結合は、両者に共通なエンドヌクレアーゼ認識部位の位置によって互いが区別される二つの発現ベクターを用いて行うことができる。該ベクターは、好ましくは、ここに記述されたような、ラムダＺａｐＴＰＩ由来ベクターのごとき直線状二重鎖ＤＮＡであって、タンパク発現要素に関して対称である。認識部位は、好ましくは、一つのベクターにおいて、少なくとも−の相補的決定部位（ＣＤＲ’ｓ）のコーディング配列に対し５゛末端に配置されてしする。第二ベクターでは、認識部位は少なくとも一つのＣＤＲ’　ｓに対し３゛に配置されている。例えば、認識部位は −のベクターにおし）てリポソーム結合部位とＲＮＡポリメラーゼプロモータ一部位の間Ｇこ位グサイトに対して３゛に位置する。

該認識部位は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位、Ｆｌｐ部位等のレコンビナーゼ認識部位、若しくはその他の等価な部位であってもよい０本発明の好ましい− ！３様では、それぞれのベクターがリポソーム結合部位及びリーダーをコードするヌクレオチド配列を定めており、該配列はプロモーターとポリリンカーの間に位置しているが、下流（その部位がプロモーターとポリリンカーの間にある場合に共存する制限部位より３゛末端側）にある。ポリリンカーより下流にある停止コドンを含むベクターも同様に好ましい、該第−及び／又は第二ベクターは、標ｉ１Ｈ（ｔａｇ）として機能できるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を規定していてもよい、そのような標識の例としては、（１）短いペプチド配列、（２）予め決定された他の抗体又はプロティンＧ等、抗体のＣＨＩドメイン等のレセプターに結合するタンパクをコードする配列、（３）酵素として機能するタンパク（ベーターガラクトシダーゼやアルカリンフォスファターゼ等）、または（４）ファージに対してファージ外殻への結合を惹起させるファージ外殻蛋白を挙げることができる。

該標識配列は、典型的にはポリリンカーより下流にあるが、いかなる停止コドン（存在してもよい）よりも上流にある。ベクターは、好ましい態様においては、ベクターの一部分、すなわち特定のラムダアーム等の存在について、またはその逆について選択できるような選択可能マーカーを含むものである。

典型的な選択可能マーカーは、当業者に周知である。この様なマーカーの例として、抗生物質耐性遺伝子、遺伝的に選択可能なマーカー、アンバー（ａｍｂｅｒ）突然変異の様な抑制的突然変異等を挙げることができる。該選択可能マーカーは、典型的には、該プロモータ若しくはポリリンカーの上流及び／又は下流に位置する。

好ましい態様においては、１個の選択可能マーカーが、ＶＨ−コーディング（可変重鎮コーディング）ＤＮＡ配列を含む第一ベクター上のプロモーターの上流に位置している。第二の選択可能マーカーは、ＶＬ−コーディング（可変軽鎖コーディング）ＤＮＡ配列を含むベクター上の結合部位とは逆側に配置されている。

Ｖｌｌ−コーディングベクターおよびＶＬ−コーディングベクターが結合部位でランダムに結合されており、ＶＨ及びＶＬの両者を含む結合ベクターが優先的に選択される限りにおいては、上記の第二の選択可能マーカーは第一マーカーと同一でも異なってもいてもよい。

該ポリリンカーは、典型的には一以上の、好ましくは少なくとも二の制限部位を規定するヌクレオチド配列である。該ポリリンカー制限部位は、同一のリーディングフレーム内のリーダー配列、標識配列、リンカ−配列、標識配列、又は停止コドン配列において、ＶＨ−若しくはＶＬ−コーディングＤＮＡホモログを該ベクター中にライゲートできるように配向されている。

ランダム結合は、典型的には、制限部位若しくはポリリンカー内の部位において、ＶＨ−コーディングＤＮＡホモログを第一ベクターにライゲートすることによりなされる。同様に、ＶＬ−コーディングＤＮＡホモログは第二ベクター内にライゲートされ、それによってベクターの二種類の多様な集合が製造される。どちらの種類のＤＮＡホモログ、すなわちＶＨまたはＶＬが、どちらのベクターにライゲートされるかは問題ではないが、例えば、ＶＨココ−ィングＤＮＡホモログの全てが、第−若しくは第二ベクターのいずれかにライゲートされることが好ましい。両者の集合の要素は結合部位で結合される。好ましい態様においては、結合部位が制限部位であり、その後に両者の集合の要素が適当な制限エンドヌクレアーゼによって開裂される。その結果得られた生成物は、制限断片の２種類の多様な集合であり、一方の要素が他方の要素の粘着末端に相補的な粘着末端を有している。

以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、本発明を限定するものではない。これらは用いられるかもしれない方法のうちでは典型的なものであり、当業者に既知の他の手法を替わりに用いてもよい。

実施例１ベクターの構成ｖｓ　、ＶＬ　ＳＦｖ　（可変領域のフラグメント）の発現のためのベクター及びＦａｂ配列を第１及び２図に図示した。これらは、ラムダ１ａｐＵ　（米国カリフォルニア州うジョーラストラータジーン）；ショートらによるｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｊ　１６　：　７５８３（１９８８）の変更例によって構成されており、本発明者らは、上記ラムダＺａｐＩ［中の多重クローニング位置に合成オリゴヌクレオチドを挿入した。本実施例に記載の方法は、当業者には公知であり、マニアチスらによるｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」Ｄ−ルドスプリングハーバー、（１９ｇ２）及びオーサベルらによるｒＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョンウイリーアンドサンズ、（１９８７）に詳細に開示されている。これらの文献は本明細書中に参考文献として採り入れられている。このベクターはクローニング及び発現配列の側面に位置するＮｏｔ　Ｉ及びＥｏｃＲＩ制限部位に関して非対称になるように設計されている。

バタテリオファージのような線状ベクター中の制限部位の位置におけるこの非対称により、１のライブラリー発現ＬｉＪｌ（軽鎖）は、１の発現Ｈ１ｆｆ（重鎮）と結合して、結合Ｆａｂ発現ライブラリーを構成する。

第２Ａ図に示されるヌクレオチド配列をラムダＺａｐＴＩの５ａｃｌ及びＸｈｏＩ部位へ挿入することによって、実施例２の記載と同様に、ラムダＬｃ　ｌベクターは、Ｌ鎮タンパクをコードするｍＲＮＡのＰＣＲ増幅された生成物をクローニングするように作成した。

ベクターは、Ｕｎｉ−Ｚａｐ（商標）ｘＲベクターキット　（米国カリフォルニア州うジョーラストラータジーン）由来のラムダアーム１０μｇを５ａｃｌにより消化することによって製造した。！２Ａ図に示す配列は、重複合成オリゴヌクレオチドから構成されており、下記に示す上記Ｓ　ａｃ　Ｉにより消化されたアームにクローンされた。（表１に示される＞ＬＬからＬ５及びＬ７からＬ９（ＬＬ、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ７、Ｌ８及びＬ９）のオリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチド（０，１μｇ／μＡ＞１μｌ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、ガイテルスブルグ、ＭＤ）２０ニー’−ｚトを、７０ｍＭ）リスＯＣＡ　（ｐＨ７，６）　、０．１　ＭＫＣＣ１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭアデノシン三リシリン酸ＴＰ）、１０ｍＭ２ＭＥＳＢＳＡ５００ μｇ　／ｍ（ｌを含む溶液へ添加することによってキナーゼ処理した。この溶液を３０分間、３７℃に保ち、次いでこの溶液を１０分間６５℃に保つことによって反応を停止した。２つの末端オリゴヌクレアーゼＬ６及びＬｌｏを、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−）１ｉ　（ｐｔ１７．４）　、２．０ｍＭ　ＭｇＣＡ　２及び５０、０　ｍＭ　ＮａＣβを含有する溶液のｌ／１０の容量とともに、上記キナーゼ反応溶液へ添加した。この溶液を５分間７０℃に加熱し、次いで、ゆっくりと室温まで冷却させた。この間、全てのオリゴヌクレオチドがアニーリングして、第２Ａ図に示す二本鎮合ｔＬＤＮＡ挿入物を生成した。ｐＨ７，６の６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ’、６．６ｍＭ　ＭｇＣｊ？　２．１　ｍＭＤＴＴ、１　ｍＭＡＴＰ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１０ユニッ）（ＢＲＬ、ガイテルスブルグ、ＭＤ）を含む溶液に、上記反応物４０μｌを添加することによって、アニーリングされたオリゴヌクレオチドは互いに共有結合した。この溶液を３０分間２５℃に保ち、次いで、この溶液を１０分間６５℃に加熱することによってＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを失活させた。得られたオリゴヌクレオチドのリン酸化されていない末端を、上記反応物５２μｌと１０ｍＭＡＴＰ及びＴ４ボリヌクレオチドキナーゼ５ユニットとを含有する溶液４μｌを混合することによって、キナーゼ処理した。この溶液を３０分間３７℃に保ち、次いで１ｏ分間６５℃に加熱することによって、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。リン酸化された合成りＮＡ挿入物を上記の製造されたラムダＺａｐｎベクターアー人中に直接連結させた。

ＩＪＯＣＴＡＧＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＭＧＣＴ表２Ｈｌ　ＧＧＣＣＧＣＡ入ＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＴＣＨ１ｌ　ＡＡＴＡＡＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＴＡＧＧＣＡＡＨ１２ＴＡＧＧＴＡＴＩ’ＴＣＡＴＴＡＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＨ１３ＧＡＡＡＴＡＧＡＡＴ！ＴＧＣ第２Ｂ図に示されるヌクレオチド配列をラムダＺａｐＩＩのＮｏｔ’１及びＸｈｏＩ位置に挿入することによって、実施例２に記載されているように、ラムダＨｃ２ベクターをＨ鎖Ｆｄ配列をコードするＰＣＲ増幅生成物をクローニングするために構成した。Ｌ鎮ベクターと同様に、Ｈ鎖ベクターは、Ｕ旧−Ｚａｐ（商標）ＸＲベクターキット　（米国カリフォルニア州うジョーラストラータジーン）由来のラムダアームをＮｏｔ、Ｉによって消化することにより製造した。これは、ベクター１０μｇを反応緩衝液１．０ＯＡＬｉ’中で３７℃において１時間消化することにより行なわれ、消化後にＤＮＡを上記のように抽出、析出及び乾燥させた。第２Ｂ図に示される挿入された配列は、上記に概説したように表２中に示す重複合成オリゴヌクレオチドＨ１からＨｌ３より構成された。正確に構成されたベクターを、下記に説明するＤＮＡ配列分析により確認した。

上記オリゴヌクレオチドの配列は、Ｆａｂフラグメントの構成、発現および分泌の要素を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドは、非対称のＮｏｔｌ及びＥｃｏＲ１制限部位；ペターらにょるｒｓｃｉｅｎｃｅ」２４０：１０４１　（１０８８）、すでに［ｉ、　ｃｏｌｉにおいて使用されＦａｂフラグメントを分泌することに成功している細菌のｐｅｔ　Ｂ　ｇｅｎｅのリーダーペプチドニスケラ及びブラックサンによるＩ’５ｃｉｅｎｃｅＪ　２４０：１０３８　（１９８８）、（両文献は本明細書中に参考として採り入れられている）、クローンされた配列の発現のための最適距離離れたリポソーム結合部位；ＬまたはＨ鎮ＰＣＲ生成物のクローニング部位；及びラムダＨｃ　２における発現されたＨ鎖タンパクフラグメントのカルボキシ末端のデカペプチド末端を導入する。デカペプチド末端の配列は、融合タンパクの免疫親和精製に使用されるこのペプチドのモノクローナル抗体が入手しやすいため、有用であった。フィールドらによるｒＭｏｌ、ｃｅｌｌＢｉｏｌ、　Ｊ８：２１５９　（１９８８）、この文献は、本明細書中に参考として採り入れられている。ベクターは、本明細書に参考として採り入れられているサンガーらのｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｊ米国、７４：５４６３−５４６７　（１９７７）に記載されている制限消化分析及びＤＮＡ配列及びＡＭＶ逆転写酵素３５Ｓ−ＡＴＰ配列キット（米国カリフォルニア州うジョーラ、ストラータジーン）の使用により特徴づけられる。

実施例２ｍＲＮＡの単離及び抗体フラグメントのＰＣＲ増幅初期Ｆａｂ発現ライブラリーを、ＫＬＨ結合ｐ−ニトロフェニルホスホンアミデート抗原１　（ＮＰＮ）で免疫されたマウスから単離したｍＲＮＡで構築した。バーロー（Ｈａｒｌｏｗ）及びロウ（Ｌｏｗｅ）編、　八ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８Ｂ）に記載されている技術を使用して、ＮＰＮをキーホールリンペントヘモシアニンに結合させた。該文献は、参考として本明細書に含まれる。つまり、１０．０ミリグラム（ｍｇ）のキーホールリンペットヘモシアニンと０６５ｍｇのＮＰＮをグルタリル・スペーサーアーム・Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドリンカ−付属体で結合させた。結合反応は、ヨンダ（Ｊｏｎｄａ　）らによる５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１：　１１８８　（１９８８）に記載されている通りに行った。

該文献は、参考として本明細書に含まれる。未結合ＮＰＮは、セファデックスＧ −２５を使用して工灰濾」クロマトグラフィーで除去した。

咳ＫＬＨ−ＮＰＮ複合体１００μｇを２５０μｌの食塩前リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に添加して、マウス注射用複合体液を調製した。等量の完全フロインドアジュバントを添加し、該全溶液を５分間乳濁した。Ａ　１２９　Ｇｌｘ。マウスに３００μｉの該乳濁液を注射した。２５ゲージ針を使用して、数箇所に皮下注射した。

ＫＬＨ−ＮＰＮでの２回目の免疫は、２週間後に行った。この注射液は、次のようにして調製した：５０μｇのＫＬＨ−ＮＰＮを２５０μｉのＰＢＳで希釈し、等量のミョウバン（ａｌｕｍ）を８９ＫＬＨ−ＮＰＮ溶液に混合した。２３ゲージ針を使用して、５００μｌの該溶液をマウスに腹腔注射した。１力月後に、該マウスに、ＰＢＳで２００ｐｌに希釈した該ＫＬＨ−ＮＰＮ複合体５０．ｕｇを最終注射した。この注射は、３０ゲージ針を使用して、尾の側脚に静脈注射した。この最終注射の５日後に、これらマウスを犠牲にして、それらの肺臓から全細胞ＲＮＡを単離した。

コハクジンキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）及びサクチ（Ｓａｃｃｈｉ）によるＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１６２：　１５６−１５９　（１９８７）の方法で、上記したようにして免疫した一部元マウスの肺臓から全ＲＮＡを単離した。該文献は、参考として本明細書に含まれる。つまり、免疫したマウスからの肺臓の除去のあとすぐに、４．０Ｍグアニンイソチオシアネート、ｐ　Ｈ７，０の０．２５　Ｍクエン酸ソーダ及び０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含有するｌ　Ｑｍ７！の変性溶液中で、ガラスホモジュナイザーを使用して、該組織をホモジュナイズした。１ｍｌのｐ　Ｈ４，０の２Ｍ濃度酢酸ソーダを該ホモジュナイズした肺臓に混合した。更に、１ｍｆの飽和フェノールも、該ホモジュナイズした肺臓を含有する変性溶液に混合した。このホモシュネートに、２ｍｆのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１混合し、氷上に１５分間保持した０次いで、該ホモシュネートを５０ｍｊ！厚肉ポリプロピレン製遠心分離管（フィッシャー科学会社、ピッツバーグ、ＰＡ）に移した。該溶液を４℃で２０分間１０．０００Ｘｇで遠心分離した。上層のＲＮＡ含有水性相を新しい５０ｍ１ポリプロピレン製遠心分離管に移し、等量のイソプロピルアルコールと混合した。

この溶液を少なくとも１時間−２０℃に維持してＲＮＡを析出させた。析出したＲＮＡを含有する溶液を、４℃で２０分間１０，０００ｘｇで遠心分離した。沈澱した全細胞ＲＮＡを集め、上記した変性溶液３ｍｌに溶解した。再懸濁した全細胞ＲＮＡに３ｍｊ！のイソプロピルアルコールを添加し、激しく混合した。この溶液を少な（とも１時間−２０℃に維持してＲＮＡを析出させた。析出したＲＮＡを含有する溶液を、４℃で１０分間１０．ＯＯＯＸｇで遠心分離した。７５％エタノール含有溶液で沈澱したＲＮＡを１回洗浄した。沈澱したＲＮＡを減圧下で１５分間乾燥し、次いで、ジメチルピロカーボネート（ＤＢＰＣ）処理ＨｚＯ（Ｄ　Ｅ　Ｐ　Ｃ−Ｈｉｄ）中に再懸濁した。

最初のｃＤＮＡ９１合成で使用するため、アビブ（Ａνｉν）及びレーダー（Ｌｅｄｅｒ）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　６９：　１４０８−１４１２（１９７２）、によって記載された方法を使用して、上記単離した全ＲＮＡから、ポリＡ″ＲＮＡを調製した。該文献は、参考として本明細書に含まれる。つまり、上記のようにして調製した一部元免疫マウスの１ｔｌｌｆｆから単離した全ＲＮＡの半分を１ｍ／のＤＥＰＣ処理ｄＨ，○中に再懸濁し、５分間６５℃に維持した。該再懸濁ＲＮＡに、１ｍｌの２×高食塩負荷緩衝液（ｐＨ７，５の１００ｍＭトリス−ＨＣｌの１Ｍ塩化ナトリウム、ｐ　Ｈ８，０の２．０　ｒｎ　Ｍジナトリウム・エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）及び０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を添加し、該混合液を室温に冷却した。次いで、該混合液を、０．１Ｍ水酸化ナトリウム及び５ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する溶液でオリゴ−ｄＴを洗浄し次いで該カラムをＤＥＰＣ処理ｄＨ， ○で平衡化することによって調製したオリゴ−ｄＴ（コラボラティブ・リサーチ　タイプ２または３）カラムで処理した。溶出液を無菌ポリプロピレン管に集め、該溶出液を６５℃で５分間加熱したあと、同一のカラムで再び処理した。次いで、該オリゴーｄＴカラムを、ｐ　Ｈ７，５の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ　Ｈ８，０の１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳからなる２ｍｌの高食塩負荷緩衝液で洗浄した。次いで、該オリゴーｄＴカラムを、２ｍｌ１の１×中塩緩衝液（ｍｅｄｉｕｍ　５ａｌｔ　ｂｕｆｆｅｒ）　（ｐ　Ｈ７，５の５０ｍＭ）リス−Ｈｃ１．１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐ　Ｈ８，０の１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％５ＤＳ）で洗浄した。ｍＲＮＡは、ｐ　Ｈ７，５の１０ｍＭトリス−ＨＣｊ！、ｐ　Ｈ８，０の１ｍＭ　ＥＤＴＡ及びｏ、０５％ＳＤＳからなる１ｍ６の緩衝液に溶出した。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、１００％クロロホルムで１回抽出し、エタノールで析出させ、そして、ＤＢＰＣ処理ｄ　Ｈ２０中に懸濁させることによって、該メツセンジャーＲＮＡを精製した。

ＰＣＲ増幅物の製造においては、ｃＤＮＡ合成の鋳型としてｍｌ？ＮＡを使用した。典型的な転写混合物２５０．ｃ＋Ａ中で５−１０．ｌｊｇの水中の肺臓ｍＲＮＡを５００ｎｇ　（０，５ｐｍｏ　１　）の３’　Ｖ＋＋プライマー（プライマー１２、表３）または３’　ｖＬプライマー（プライマー９、表４）と６５℃ で５分間最初にアニーリングさせた。次に、混合物が、０．８ｍＭ　ｄＡＴＰ、　０．８ｍＭ　ｄＡＴＰ　、　０．８ｍＭ　ｄＣＴＰ、　０．８ｍＭ　ｄＧＴＰ、０．８ｍＭ　ｄＴＴＰ、　１００ｍＭ　トリス−ＨＣｌ（ｐ）Ｉ　８．６ン、１０ｍ１ｌ　ＭｇＣｌ１　ｚ　、４０ｍＭ　ＫＣＩ及び２０１２−門Ｅを含むように調整した。マロ二−ネズミ白血病ウィルス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）逆転写酵素、２６ユニツトを加え、溶液を４０’Ｃで１時間インキュベートした。得られた最初のストランドｃＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈降させ、以下に記載する重鎖及び軽鎖配列の増幅のためのポリメラーゼ鎖反応（Ｐｃｔ？）工程に使用ラムダＨｃ２ライブラリーの構築のための重鎖Ｆｄフラグメントの増幅に使用したプライマーは表３に示した。

増幅は５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ、。

と腹匹ｅ　２３９：４８７−４９１　（１９８８）　（この文献は参考文献として本明細書の一部とする）に記載されたようにして、８つの別々の反応物中で行い、各反応物は表３に挙げた５°プライマー（プライマー２〜９）の１種及び３゛プライマー（プライマー１２）の１種を含む。

単一の反応物での増幅に使用した残りの５′プライマーは縮退プライマー（プライマー１）または４つの縮退位１にイノシンが導入されたプライマー　（プライマー１０）である。残りの３゛プライマー（プライマー１１）はＦｖフラグメントを構築するのに使用した。５゛プライマーの下線部にはＸｈｏ　１部位が、同じ（３゛プライマーの下線部にはＳｐｅ　Ｉ制限部位が、発現のためのラムダファージベクターの予め決められた読み取り枠に増幅フラグメントをクローニングするために導入されている。

表３重鎮プライマー３）　５・　−ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧΩ工Ωユ八ΩＴＣＡＧＧ　−へ３１４）　デ　−ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＣ’巧＝込ΩＴＣＴＧＧ　−コ１５）　’５ｌ −ＡＧＧＴＣＣＡＧ−−一一とＴＣＡＧＧ　−３１６）　５’−ＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧ広工以逅ＴＣＴＧＧ−３’７）　５’　−ＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＪＴＣＡＧＧ　−３’８）　５１　−　ＡＧＧＴＣＣＭＣＴＴｑユ２ＴＣＴにＧ　− ３’９）　５−−　ＡＧＧＴＣＣＭＣＴＴ３ＴＣＡＧＧ　−３’ＦａｂのラムダＬｃｌ　ライブラリーの構築のためのマウスカッパ軽鎖配列の増幅に使用したプライマーは表４に示した。これらのプライマーは、ベクターと適合し、マウス軽量ＲＮＡの逆配列中に存在しない制限部位を含むように選択した。増幅は５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ。

（前出）に記載されたようにして５つの別々の反応物中で行い、各反応物は表４に挙げた５′プライマー（プライマー３〜７）の１種及び３′プライマー（プライマー９）の１種を含む。残りの３′プライマー（プライマー８）はＦＶフラグメントを横築するのに使用した。５′プライマー及び３′プライマーの下線部はそれぞれ、発現のためのラムダファージベクターの予め決められた読み取り枠に増幅フラグメントをクローニングするために導入されたＳａｃ　Ｉ制限部位及びＸｂａ　Ｉ部位を示す。

表４軽鎖プライマー４）　５’　−ＣＣＡＧＴＴＣｑ込αスＱスＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ　−３’５）　５’　−ＣＣＡＧＡＴＧＴΩΔ（Ω工ｇＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ　−３”６）　５’　−ＣＣＡＧＡＴＧＴＱ≦匹＝じ＝ＧＴＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ　−３’７）　５’　−ＣＣＡＧＴＴＣＣＱＱｑ工ＱＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡ　−３’８　）　５　’　−ＧＣＡＧＣＡ；ｚλ込Ｇｆｆｌ’ＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＣＣ−３’９）　５’　 −ＧＣＧＣＣＧＥコ臆ｖＴＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＡ　−３” 　゛Ｎ鎖フラグメント及び軽鎖フラグメントのＰＣＲ増幅を、逆転写反応の上記生成物（５μｇのｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）、３０　Ｑｎｓｏｌの３°ｖ１１プライマー（プライマー１２、表１）、及びｊＩＩ増幅用の５’ＶＨプライマー（プライマー２〜９、表１）の一つ、又は３００μｍｏｌノ３°ＶＬ　７” 　５　イア−（７”　ライフ　−９、表２）、及び各軽鎖増幅用の５°ｖＬプライマー（プライマー３〜７、表２）の−っ、２００ｍＭ（７）ｄＮＴＰｓ　、　５０ｍＭ　Ｋ　Ｃ１，１０ｍＭトリス塩酸（ｐ　Ｈ８，３）　、１５１１Ｍ　（ＤＭｇＣｌｔ　、　０．１　Ｘ　セラチア、及び２ユニツトのサーマスアクアチクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼを含有する１００μｌの反応混合物中で行った。反応混合物を鉱油で覆い、４ｏサイクルの増幅を行った。各増幅サイクルにおいて、９２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニーリング、及び７２℃で１．５分間の延長を行った。増幅されたサンプルを、フェノール／ＣＨＣＡ、で２回、ＣＨＣｌ！ｚで１回抽出し、エタノール沈澱し、−７０℃で１０ｍＭのトリス塩酸、１）Ｏ７，５／１ｍＭのＥＤＴＡ中に保存した。

上記の各々等容量（５０，ｃ＋６）のｌａｍｂｄａ　）ｌｃ　２又は！ａｍｂｄａ　Ｖｃｌベクターへのクローニングの調製の際には、ＰＣＲ−増幅生成物を混合し、フェノール／　ＣＨＣ１３抽出により精製し、エタノール沈澱し、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７，５／１ｍＭのＥＤＴＡ中で１μｇ／μｌで再懸濁した。重鎮プライマーＰＣＲ増幅の混合生成物を、３７℃で、にｈｏｌ（１２５ユニツト、ストラフジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジオラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ）及び５ｐａｒ（１０−Ｌニット−ストラフジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　％ラジオラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ）を用い、１５０μＭのＮａ　Ｃｌ　−、８ｔｓＭのトリス塩酸（ｐＨ血清７）Ｌｔブミ７　（２００μｇ／ｍｊりを含有する２、５μｇ／３０μｌの緩衝液中で消化した。軽鎖プライマーによる増幅の混合生成物を、２００ユニツトのＳａｃ　Ｉ及び２００ユニツトのＸｂａ　Ｉを用い、５ＯＯｐｉ中の３３ｍＭのトリス酢酸、ｐ　Ｏ７，８５，６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．５ｍＭのＤＴＴ中で、３７℃で１時間、軽鎖増幅生成物用に消化し、１％アガロースゲルで精製した。

消化したＰＣＲ−増幅肺臓ｍＲＮＡのゲル電気泳動後、７００塩基対（ｂ　ｐ）のＤＮＡフラグメントを含有するゲル領域を切り出し、透析膜中に電気溶離し、エタノール沈澱し、１０ｎ＋Ｍのトリス塩酸、ｐＨ７，５／１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁し、Ｌｏｎｇ／μｌの最終濃度にした。上記の生成物を実施例３に記載のライブラリー構築に用いた。

実施例３ライブラリーの構成結合ライブラリーを、２工程で構成した。第１工程において、分離した重鎮ライブラリー及び軽鎖ライブラリーを、ラムダＨｃ２及びラムダＬｃ　１ベクターにそれぞれ構成した（図１）。第２工程において、この２種のライブラリーを、各ベクターに存在する非対称性のＥｃｏ　Ｒ１部位で結合させた。

ラムダＨｅ　２及びラムダＬｃ　１　ライブラリーを構成するために、実施例２に記載したゲル分離インサート（ｉｎｓｅｒｔ）　３モル当量を、後述するように５℃で、−晩かけて、ベクターアーム１モル当量と結合させ、実施例１に記載したラムダＨｃ　２又はラムダＬｃ　Ｉとした。重鎮インサートを、前もってＸｈｏ　ｒ及びＳｐｅ　Ｉ　と結合させたラムダＨｃ　２アームと結合させ、脱リン酸した。軽鎖インサートを、前もってＳａｃ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉ　と結合させたラムダＬｃ　１アームと結合させ、脱リン酸した。ベクターアームを次の文献に記載された技術を使用して調整した：　Ｍａｎｉａｔｉｓらの論文、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｆｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　（この文献の内容は、本願明細書の内容として引用する。　”）　、　ＮＺＣＹＭ培地（ＮＺアミン１０ｇ／Ｉｔ、イーストエキス５ｇ／Ｉｔ、ＮａＣ１５ｇ／ｌ。

ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　１　ｇ　／　ｊ！　、Ｍｇ５Ｏａ−７Ｈｚ０２ｇ　／　Ｒ１ｐＨ７，５）　１０１ｍ１に、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅの華−コロニーを植え付け、活発に撹拌しながら３７℃で一晩培養した。この培養液１ｍｌを用いて、３７℃に加温したＮＺＣＹ？ｌ培地５００ｍ６を入れた４個の２１フラスコに植え付けた。この４個のフラスコを３７℃で、さらに３〜４時間、撹拌した０次いで、各フラスコに実施例１で調製した、精製した組み換えバタテリオファージベクター１０’°Ｐｆｕを植え付け、ホスト細胞が完全に溶解するまで、３〜５時間、振盪した。各フラスコにクロロホルム１０ｎｊ！を加え、３７℃でさらに１０分間、培養を継続した。培養物を、室温で、３０分間かけ、ＤＮＡ５Ｅ　Ｉ及びＲＮＡ５ｅＡそれぞれ１μｇ／＋＊　ｌ用いて処理した。ＮａＣ１を最終濃度がＩＭとなるように加え、この培養物を氷の上で１時間、冷却した。遠心分離（ＩＬ　Ｏｏｏｘｇ）を１０分間、行って培養残渣を取り除き、最終濃度が１０％（重量／容量）となるよう、上清に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ　８０００）を加えた。氷上に１時間置いた後、懸濁液からバタテリオファージを沈澱させ、遠心分離（１１，０００ｘｇ）を１０分間行い、ベレント化した。ファージを３Ｍ緩衝液（ＮａＣＪ　１５．８ｇ／　Ｉｌ　、Ｍｇ５Ｏａ−７Ｈｚ０２ｇ／　１、ＩＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ＋　１０ｍｆｆ１　／　１　（ｐＨ７，５）、　２％ゼラチン５ｍ１）に再度懸濁し、クロロホルムを抽出して細胞残渣を除いた。固形の塩化セリウム（ＣｓＣＲ）を０．５ｇ／ｍｊ！となるように加え、このファージ懸濁液を、ＣｓＣＩｔの段階的勾配（１，７ｇ／ｎ　ｉｔ、１．５ｇ／ｍ　Ｉｌ、１．４５ｇ／ｍ　１　：溶媒はすべて３Ｍ緩衝液である。）の上に、（ｓｗｉｎｇｔｎｇ　ｂｕｃｋｅｔ　ｒｏｔｏｒを使用した。）。帯状にファージ粒子が集まり、これを４℃、３８．００Ｏｒｐｍで、２４時間かけて遠心分離した。再度、ファージが帯状に集まり、この懸濁液を、１０ＩＩＭ　ＮａＣＪ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩｔ　（ｐＨ８，０）、　１０ｍＭ　ＭｇＣＲｔの溶液中で透析した。ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を２０ｍＭ、７’ｏナーゼを０．５ｍｇ／＋　１　、ＳＯ５を０．５％となるように加え、３７℃で、１時間、恒温に保持し、続いて、フェノール抽出、クロロホルム抽出及び１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ！　（ｐＨ８）、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）で−晩、透析を行った。酢酸ナトリウムを０．３モルになるように加え、２倍の容量のエタノールを使用して、このＤＩＪＡを沈澱させた。ベクター［ＩＮＡを遠心分離により回収し、１０ａ＋Ｍ　丁ｒｔｓ−Ｃ１（ｐＨ７，６）、　ＩｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８）に再懸濁した。

Ｈｃ２ベクターアームを調製するために、精製された■Ｃ２ＤＮＡ２００μｇを、５０ｍＭ　Ｔｒｔｓ−ＣＡ　（ｐＨ８，０）、　１０ｍＭ　ＭｇＣｊ！　ｚ、　５０ｗＭ　ＮａｆＪ！中において、３７℃で、１時間かけ、Ｘｈｏ　Ｉ　６００ユニットを使用して切り出した。切り出したＨｃ　２　ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、次に、２ｋＭ　Ｔｒｉｓ−（／！　（ｐＨ７，４）、　５ｎ＋Ｍ　ＭｇＣｊ！　ｚ、５０ｍＭ　ＫＣｌ中において、３７℃で、１時間がけ、Ｓｐａ　Ｉ　６００　：１−ニットを使用して、再度切り出した。

二回切り出したｆｆｃ　２　ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。回収したベクター１）ＮＡを、３０ｍＭ　Ｔｒｙｓ　Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７，８５）、　３０ｍＭ　ＫＡＣ，５ｍＭ　ＣａＣｊ！　２．０．５ｍＭ　ＤＴＴ、　ＢＡＳ　１００μｇ／＋　１の溶液中で、３０℃、１０分間、次いで、６５℃、１０分間かけ、ＨＫフォスファターゼ０．５ユニット／μｇを使用して、脱リン酸を行った６次いで、フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、１０５Ｍτｒｉｓ−Ｃｊ！　（ｐＨ７，５）、　１ｍＭＨＤＴＡ（ｐＨ８，０）の溶液に再懸濁した。

Ｌｃ　１ベクターブー″ムを上記のように調製した。但し、最初の切り出しを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）＋　１６Ｍ　Ｍｇ１ｌ　ｔ＋　５０ｍＭ　Ｎａ１ｌ中において、Ｘｂａ　Ｉ　６００ユニツトを使用して行い、第２の切り出しを、’６＋ｅ’Ｍ’ＴｒｉｌＣｊ！’（ｐＨ７，４）、　２０＋ａＭ　ＮａＧ　Ｉｔ　、　２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ＋　６ｆｆ１Ｍ　ＫＣＩＥ@。

６＋ｇＭ　２−）ＩＥ、　ＢＳＡ　Ｏ，１ｍｇ／ｗｉＩｌの溶液中で、３７℃で、１時間かけ、Ｓａｃ’ｌ　６００ユニツトを使用して行った。各リゲイシッン（１ｉｇａｔｉｏｎ）混合物（１μｍ）を、ギガバックゴールドパッケイジエクストラクト（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｅｘｔｒａｃｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ。

ＣＡ）を使用して、封入し、この封入した材料を、製造業者によって記載されているように、力価を測定し、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅホスト細胞を覆うようにした。

特に、ライブラリーを１００ｍＭ　ＮａＣ１、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｅ　Ｒ（ｐＨ７，５）、・　ＩＯｌｌＭＭｇＳＯａを含む緩衝液で、連続的に希釈した。

各希釈液１０ｐｉｔを、対数増殖期（ＤＨ，ｃｏｌｉ［体２００μｌに加え、３７℃で１５分間そのままに保ち、ファージを菌体に吸収させた。上部寒天３ｍｌは、ＮａＣ１５ｇ／　ｌ　、門ｇｓＯａ　２ｇ／　１　、イーストエキス５ｇ／ｊ！、ＮＺアミンＬｏｇ／　Ｉｔ　（カゼイン加水分解物）＋　０．７％溶解５０Ｃアガロースからなるものであった。ファージ、前記の菌及び上部寒天を混合し、次いで、前もって加温した細菌用寒天平板（ＮａＣ１，９ｇ／　１　。

ｈｇｓｏ、　２ｇ／　ｊ！　、イーストエキス５ｇ／Ｌ　ＮＺ７ミン１０ｇ／ｉ（カゼイン加水分解物））及びディフコ（Ｄｉｒｃｏ）寒天の表面に均等に延ばした。

この平板を、３７℃で、１２〜２４時間そのままに保った。なお、この時間は、ラムダプラークを計数し、もとのライブラリ−１ｔｍｌ当たりのプラーク形成ユニットの総数を決定するものである。

ラムダＨｃ　２の初期ライブラリーは、１．３　ＸＩＯ”プラーク形成ユニッ）　（ｐｆｕ）を含んでおり、デカペプチドタグの発現をスクリーニングし、Ｆｄ配列を発現するクロー′ンのパーセント数を決定する。このペプチドに関する配列は、Ｆｄ（又はＶＸ）フラグメントの遺伝子を、ベクターに増殖させた後、発現するフレームに過ぎない、デカペプチドタグの免疫学的検出法による分析を行った場合、ライブラリーにおけるクローンの少なくとも８０％が、Ｆｄフラグメントを発現する。　・　□ 免疫学的検出法を、次のように行った□。１５０・鶴平板当たりプラーク数が２０，０００個となるような容量の力価を測定したライブラリーを、対数増殖期のＥ、ｃｏｌを菌体６００μｌに加え、３７℃で１５分間そのままに保ち、ファージを菌体に吸収させた。次に、上部寒天７．５ｎｊ！を、細菌菌体及び吸収されたファージを含む溶液と混合し、全混合物を加温した細菌用寒天平板の表面に均等に広げた。この方法を十分な数の平板について操り返し、少なくともライブラリーのサイズと同じプラークの総数になるよう培養した。

その後、これらのプレートを５時間、３７℃で保持した。そのプレートにその後、１０ｄのイソプロピル−β−り、チオガラクトピ”ラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）を含む溶液で前処理したニトロセルロースフィルターを被せ、４時間、３７℃で保持した。そのニトロセルロースマイルターの該プレートに対する向きは、そのフィルターを通して細菌プレートの中へ幾つかの位置に、防水性インクに浸した針で穴を開けることによってマークした。そのニトロセルロースフィルターをピンセットで除去し、２０ｎ＋Ｈのトリス−塩酸ｐｌ（７，５，１５０ＩＩＩＭのＮａＣ１及び０．０５％のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含むＴＢＳＴ？Ｓ液の中で１回洗浄した。１０ｍＭのｒＰＴＧを含む溶液にまた浸しておいた第２のニトロセルロースフィルターを該細菌プレートに再び適用し、複製フィルターを作った。そのフィルターを更にＴＢＳＴの新しい溶液中で１５分間洗浄した。フィルターをその後、２０ｎＨのトリス−塩酸ｐＨ７，５，１５０ｍＭのＮａ　Ｃ１及び１％ＢＳＡからなるブロッキング溶液の中に置き、室温で１時間撹拌した。そのニトロセルロースフィルターを１〜５０（ｌ希釈の’１４１　抗体ヲ含む新しいブロッキング溶液へ移し、室温で少なくとも１時間の間、穏やかに撹拌した。フィルターを第１抗体を含む溶液中で撹拌した後、そのフィルターをＴＢＳＴ溶液中で５分間３〜５回洗浄し、各時点で残留する未結合の第１抗体のどれをも除去した。そのフィルターを新しいブロッキング溶液と１〜５００から１〜１０００倍希釈のアルカリホスファターゼ結合第２抗体を含む溶液中へ移した。そのフィルターを室温で少なくとも１時間の間、その溶液中で撹拌した。そのフィルターを少なくとも５分間、ＴＢＳＴｉ液中で３〜５回洗浄し、各時点で残留する未結合の第２抗体のど、れをも除去した。

そのフィルターを２０ｍＭのトリス−塩酸ｐＨ７，５及び１５０＋＊ＭのＮａＣｆを含む溶液で１回洗浄した。そのフィルターをこの溶液から除去し、過剰の湿り気をそこから濾紙で吸い取った。そのフィルターを、１００ｄのトリス−塩＃ｐｔ１８．５．１００ｍＭのＮａＣ１，５ｍＭのＭｇＣｊｌｔ　１０．３ｍｇ／ｍＡのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び０．１５ｍｇ／履ｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液中に室温で少なくとも３０分間、置くことによって発色させた。残留する発色溶液を２０＋ａＭのトリス−塩酸ｐＨ７，５及び１５０ＩＩＭのＮａｉ：、ｊ！を含む溶液で、そのフィルターから洗い流した。そのフィルターをその後、２０１！ｌ？Ｉのトリス−塩酸ｐ）１２．９及び１１のＥＤＴＡからなる停止溶液中に置いた。濃紫色の発色は陽性の結果を示す、そのフィルターを、所望する蛋白質を製造したファージプラークを置くために使用する。そのファージプラークは分離されて、その後、続く分析のために培養される。

軽鎖ライブラリーを重鎮ライブラリーと同様の方法で作り、それは２Ｘ１０’のメンバーを含むことを示した。マウスのに鎖に対する抗体でのブラークースクリーニングは、そのライブラリーの６０％が発現された軽鎖の挿入を含むことを示す。挿入のこの比較的低いパーセンテージはたぶん、Ｓａｃ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉでの開裂の後のベクターの不完全な脱リン酸化から生じるのであろう。

組合せライブラリーの構築のために、上記の２つのライブラリーを次のように、Ｅｅｏ　ＲＩ部位でそれらを交叉させることによって使用した。上述のように、先ず各ライブラリーからＤＮＡを精製した。その軽鎖ライブラリーをＭｌｕ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼで　。

開裂させ、得られた５°末端を脱リン酸化し、その生成物をＥｃ。

Ｒ１で分解する。このプロセスはベクターの左腕を幾つかの小片に１　開裂するが、軽鎖配列を含む右腕はそのまま残った０重鎮ライブラリーのＤＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩＩで開裂して、脱リン酸化し、その後Ｅｃｏ　Ｒ１で開裂した；このプロセスは右腕を分解したが、重鎮配列を含む左腕はそのまま残った。このように調製されたＤＮＡをその後、混合して結合した。結合の後、軽鎖の右腕を含有するクローンと重鎮の左腕を含有するクローンの組合せから生じたクローンのみが、生存能力のあるファージを再構成した。結合及びパンケージングの後、２．５Ｘ１０’　クローンが得られた。これは、下記の実施例４に記載されているようにスクリーニングされてＮＰＮに親和性を有するクローンをｆ１１！認する、組合せＦａｂ発現ライブ　、ラリ−である。軽鎖及び重鎖フラグメントをともに発現する（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓ）ファージクローンの頻度を測定するために、軽鎖及び重鎮発現のための組合せライブラリーの複製リフト（ｄｕｐ　ｌ　ｉｃａ　ｔｅ１ｉｆｔｓ）をスクリーニングした。概ね５００ｍみ換えファージの試験において、約６０％が軽鎖及び重鎮蛋白質をともに発現した。

実施例４　抗原結合３つのすべてのライブラリー、すなわち軽鎖、重鎖およびＦａｂ・　はそれらが抗体フラグメント結合ＮＰＮを発現した遺伝子組換えファージを含むかどうかを決定するためにスクリーニングした。

典型的に方法により、３０，０００のファージをニトロセルロースで覆い、その２組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　１ｉｆｔｓ）について、実施例３の方法により、ＩｔＪで標識した牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）に結合したＮＰＮへの結合性をスクリーニングした（図３）。軽鎖ライブラリーからの９０，０００の遺伝子組換えファージおよび重鎮ライブラリーからの同様な数の遺伝子組換えファージの二重のスクリーニングでは、抗原に結合したどんなりローンも同定しなかった。

これとは対照的に、Ｆａｂ発現ライブラリーからの同様の数のスクリーニングによりＮＰＮ　（第５図）に結合した多くのファージプラークを同定した。簡単に述べれば、Ｆａｂ（フィルターＡおよびＢ）、重鎮（フィルターＥおよびＦ）および軽鎖（フィルター〇およびＨ）発現ライブラリーの二重プラークリフトを、 ■プレート当り約３０，０００のプラークの密度において、ＮＰＮと共役した、１２５１で標識されたＢＳＡに対してスクリーニングした。フィルター〇およびＤは１次フィルターＡ（矢印）からのコアードポジティブの二重の２次スクリーニングを説明する。ＢＳＡは上記バーローら（Ｈａｒｌｏｔ＋　ｅｔ　ａｌ、）、に記載されているようにして標識された。これは本明細書に参考文献として組み入れられる。ジ、　ヨーン・ライレイ・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ−目ｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ）から１９８７年に出版された上記の、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ、）＋による“分子生物学における現代のプロトコールズ（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏ−ｃｏｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）および実施例２に記載されているようにして標準のプラークリフト法がスクリーニングに使用された。

簡単に述べれば、ファージで感染された細胞（ＸＬＩ青）は１５０■−のプレート上で、３７℃で４時間にわたり培養され、蛋白質発現は１ミリモルのイソプロピル−１−千オーβ−Ｄ−ガラクトサイド（ＩＰＴＧ）に浸漬されたニトロセルロースフィルターでおおうことによって誘導され、プレートは２５℃で８時間にわたり培養された。二重のフィルターは同じ条件の下での２度目の培養の間に得られた。フィルターはついでＮＰＮ　（２Ｘ　１０’　ｃｐｍ／ｍＡ；ＢＳＡ分子当り約１５のＮＰＮ）に共役したＩＺＪで標識されたＢＳＡ（０，１μＭにおいて）の溶液で、２５℃において１時間にわたって培養（揺動しながら）する前にリン酸塩−緩衝塩（ＰＢＳ）中Ｂ５Ａ１％の溶液中に封鎖された。バックグラウンドは１００，０００ｇにおける１５分間にわたるストックのＩＺＪで標識されたＢＳＡ溶液の予備的遠心分離およびインサートのないファージで感染された細菌を含むプレートからのプラークリフトをもった溶液の予備的培養によって減少した。標識後、フィルターは、１晩中自動放射線写真をとる前にＰＢＳを含む０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０でくり返し洗浄された。

この観察は多くの重鎖が軽鎖と組合わされている条件の下では抗原に結合し、重鎮または軽鎖単独では抗原に結合しないことを示す。それ故に、ＮＰＮの場合には、重鎮および軽鎖がそれぞれ特定の軽鎖および重鎮と組合わされる場合にだけ抗原と結合する多くの重鎮および軽鎖がある。この結果は、大きな組合せのＦａｂ表現ライブラリーをスクリーニングすると云う本発明者らの決定を支持する。

多数のクローンをスクリーニングする本発明者らの能力を評価するため、および組合せのライブラリー中抗原結合クローンの頻度のもっと定量的な見積りを得るために、我々は１００万のファージプラークをスクリーニングし、抗原に結合した約１００のクローンを同定した。６個のクローンに対しては、正のファージプラークを含むプレートの部分およびそれらをかこむ約２０が“ファー”され、再プレートされ、二重のリフトでスクリーニングされたく第３図）。２０のファージの中でほぼ１つの発現生成物が抗原に結合する。最初のスクリーニングで負であると信ぜられたファージは再プレートでもポジティブではなかった。

抗原−抗体相互反応の特異性を決定するために、抗原−結合を遊離の、未標識の抗原との競争にかけた（第３図）。正のプラークからのフィルターリフトは濃度を増加しつつある抑制剤ＮＰＮの存在において＋２５　Ｉ−標識ＢＳＡ−ＮＰＮにさらされた。ＮＰＮ結合と関連する多数のファージは、第３図のように、細菌のローン上に直接に、二重にスポットされた（スポット当り約１００の粒子）。

プレートはついでＩ　ＰＴＧで浸漬されたフィルターでおおわれ、２５℃で１９時間にわたり培養された。フィルターはついで、標識溶液中にＮＰＨのいろいろな量を含有させて先に行ったようにして＋２５Ｉ−標識ＢＳＡ−ＮＰＮで培養する前に、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中で封鎖された。他の条件および方法は第３図に対して記載されたとおりであった。中程度の親和性を有するファージに対する結果は、この図の中に二重に示されている。他の４つのファージに対しては、効力のある抑制剤の濃度の範囲において若干の相異はあるが、同様な結果が得られた。これらの研究は個々のクローンが抗原親和性に基づいて区別できることを示した。結合の完全抑制に対して必要な遊離の／’ｔブテンの濃度が１０〜１０１００ＸＩＯ−の間で変ることは、発現されるＦａｂフラグメントがナノモル範囲の結合常数をもっていたことを示唆する。

蛋白質生成物を特性づけるための準備において、重鎮および軽鎖の遺伝子を含有するプラスミドはラムダＺａｐＵに対するやり方と類似のやり方でヘルパーファージで切りとられた。簡単に述べると、ＭＬ３ｍｐ８かへルバーファージとして使用され、切り取られたファージはＭＣ１０６１のＦ１誘導体中に感染させられた。

切り取られたプラスミドは抗体フラグメント発現に対しては親のベクターが含むのと同じ構成を含む（第１図）。このようなプラスミド構築物は、抗体結合に基いて同定され単離されたラムダファージクローンの蛋白質発現及び制限パターンについてもっと都合よく分析される。このプラスミドはまた配列分析および試験管内突然変異生成のための単一ストランドＤＮＡの調製を促進する復製のｒｔａをも含む。切り取られたプラスミドの遺伝子地図は重鎖および軽鎖配列の導入と一致する制限パターンを示した。クローンの１つの蛋白質生成物はＮＰＮ結合蛋白質の組成を確認するために、酵素のリンクした免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）および免疫プロット法によって分析された。Ｉ　ＰＴＧ誘導のあとで表面に浮いている細菌は濃縮され、ゲル濾過にかけるられる０分子の大きさが４０〜６０ＫＤの範囲にある画分はプールされ、濃縮され、さらにゲル濾過分離にかけられた。溶離された画分のＥＬＩＳＡ分析は（第６図）　、ＮＰＮ結合が分子の大きさが約５０ＫＤの蛍白質と関連づけられることを示し、それは重鎮および軽鎖の両方を含んでいた。

ＥＬＩＳＡによって特性づけるために、ＮＰＮ結合クローンの一部が純化された細菌浮遊物の濃厚物がゲル濾過によって分離され、各両分からの試料がＢＳＡ− ＮＰＮで被覆されたミクロタイタープレートに適用された。デカベプタイド（− −一）に対する抗体か、アルカリホスホターゼと結合したＫｔ）Ｗ（−１左手スケ−ル）に対する抗体を加えたあとで、発色させた。矢印は公知のＦａｂフラグメントの溶離の位置を示す。この結果は抗原結合が、重鎮および軽鎖の両方を含む５０−ＫＤ蛋白質の性質であることを示す、蛋白質を特性づけることを認めるために、ＮＰＮの正のクローン（第３図）をとりあげ、重鎮および軽鎖のインサート（第５図）を含むプラスミドが上に記載したようにして切り取られた。Ｌブロス中の培養液（５００ｍｊりがクローンの飽和培養液の３１ＩＪで接種され、３７℃で４時間にわたり培養された。蛋白質の合成はＩ　ＰＴＧの最終の濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加えることによって誘導され、この培養液は２５ ℃で１０時間にわたり培養された。細胞の２００＋Ｊからの浮遊物が２ｍｌにまで濃縮され、ＴＳＫ−Ｇ４０００カラムに適用された。ミクロタイ溶竺犠分からの５Ｃｘｔｌｔの試料はＢＳＡ（０，１％）が加えられたＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　２０　（０，０５％）の５０μｌと混合され、プレートは２５℃で２時間にわたり培養された。プレート上の物質はついでＰＢＳ　−Ｔｗｅｅｎ　２Ｏ−ＢＳＡで洗浄され、デカベプタイドに対するウサギの抗体、またはアルカリホスファターゼと結合したマウスに軽鎖〔サザーン・バイオチク、オークリッジ、ＴＮ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｋ、　Ｏａｋｒｉｄｇｅ、ＴＮ）　）に対するヤギの抗体の適当な濃縮物の５０μｌが加えられ、２５℃で２時間にわたり培養された。プレートは再び洗浄され、ニトロフェニルホスフェート（０，１）リス中１ｍｇ／ｍ１、ｐＨ９，５，５０ｍＭの？ＩｇＣ１，を含む）の５０μβが加えられ、プレートは１５〜２０分間培養され、吸光度は４０５ｎｍにおいて読まれた。

非還元条件下で濃縮された細菌の浮遊物の調製による免疫プロット法はデカペブタイドに対する抗体によって明らかにされた。

これは５　’Ｏ−Ｋ　Ｄ蛋白質の帯を示した。本発明者らは蛋白質Ｇ上の親和性クロマトグラフィーにつづいて行なうゲル濾過を含む２段階で、抗原結合蛋白質を細菌浮遊物から均質物にまで純粋にすることができることを発見した。蛋白質の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は非還元条件下では約５０ＫＤにおける単−帯を、また還元条件下では約２５ＫＤにおける二重線の帯をあられした。これをまとめると、このような結果は重鎮および軽鎖がジスルフィド結合によって共有結合しているＦａｂフラグメントの機能であるＮＰＮ−結合と一致する。

実施例５ファージ組合せライブラリーに比べての、インビボレパートリ−の特性Ｆｄクシ−ンスのポリメラーゼ鎖反応（Ｐ　ＣＲ）増強のために限られた数のプライマーが用いられたという理由のみから、中庸に制限されたライブラリーを調製した。該ライブラリーは、Ｋ−ガンフルシーセンスを表現するクローンのみを含むと予想される。

しかし、これは、より多くのプライマーの付加が何らかの抗体クラスまたはサブクラスを増強できる故に、該方法の固有の限定ではない。この制限にも拘らず、抗原結合性蛋白質を産生ずる多数のクローンを単離することができた。

中心的課題は、ファージライブラリーがインビボ抗体レパートリ−とサイズ、多様性の特徴及びアクセスの容易性の点でいかに匹敵するかということである。

補乳類抗体レパートリ−のサイズは、判断することが難しいが、１０６〜１０” オーダー異る抗原特異性の数値がしばしば言及される。後記の保存物のいくかを用いて、このサイズの又はより大きなファージライブラリーを、記述の方法の変法により容易に作ることができる。一旦、最初の組合せライブラリーが作られると、Ｈ及びＬ鎖をシャツフルして、異例に大きな数のライブラリーを得ることができる。

原則として、ナイーブな（非免疫化）インビボレパートリ−及び対応するファージライブラリーの多様性特徴は、両者がＨ及びＬ鎖のランダム組合せを含む点で類似であると予想される。しかし、種々の因子が、インビボレパートリ−及びファージライブラリーにより表現される多様性を制限するよう働く。たとえば、寛容のような生理的変性は、インビボレパートリ−からの成る抗原特異性の表現を制限するであろうが、これら特異性はファージライブラリーにおいてはなお現われうる。しかし、クローニング手順におけるバイアスが、ファージライブラリーの多様性に制限を導入しろる。たとえば、刺激されたＢ細胞により表現されるシーケンスのためのｍＲＮＡの表現（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は、表現（ｅｘ−ｐｒｅｓｓｉｏｎ）のより高いレベルの故に、刺激されていない細胞のそれを上回ると予想されることができる。加えて、静止している（ｒｅｓｔｉｎｇ）　レパートリ−は、その免疫グロブリンが比較的特異的でないと示唆されているところの自発的に活性化されたＢ細胞を過度に表現する（ｏｖｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔ）かも知れない。いずれにせよ、細胞のそのような集団を選択的に除く方法が存在する。また、クローニング及び組合せのために用いたものと類似の種々の遺伝子中の制限部位の偶発的存在が、それらを除去されるようになすであろう。ベクター系にアンバー変異を導入するような小さな変化をなすことによって、これら困難のいくつかを回避できる。異るソースの＆［（たとえば末梢血、骨ずい、又は局所リンパ節）及び異るＰＣＲプライマー（たとえば種々の抗体クラスを増強するもの）は、異る多様性特徴のライブラリーを結果しうる。

インビボレパートリ−とファージライブラリーの別の違いは、レパートリ−から単離された抗体がＨ及びＬ鎖の組合せ後の体性変異の結果としてアフィニティ成熟から利益を受けるのに対し、ファージライブラリーは、成熟したＨ及びＬ鎖をランダムに組合せる点にある。特定のインビボレパートリ−から導かれた十分大きなファージライブラリーが与えられると、オリジナルの成熟したＨ及びＬｉｔ（は組換えられるであろう。しかし、この技術の潜在的利点の一つは単一の高度に多様性の“包括的（ｇｅｎｅｒｉｃ）　”ファージライブラリーの発生により免疫化の必要性を取除くことである故に、体性変異及びクローナル選択の不存在を補償するためにシーケンスを最適化する方法を持つことが有用であろう。提供されたベクター系を介して三つの手順が容易に使用できるようにされる。第一に、飽和変異誘発が、相補性決定領域（ＣＤＲ）（２３）上で実施されてよく、得られたＦａｂが、増大された機能についてアッセイされうる。第二に、抗原を結合するクローンのＨ又はＬ鎖が、組合せライブラリーを構築するのに用いられたのと同じ手順で、夫々全り又はＨ鎖うイブラリーと組換えられることができる。

第三に、上記二つの手順の反復サイクルを行って、免疫グロブリンのアフィニティまたは触媒的特性を更に最適化できる。後二者の手順は、Ｂ細胞クローナル選択では許されず、このことは、ここで述べた方法が最適シーケンスを同定する能力を実際に増大させうることを示唆する。

アクセスは、インビボ抗体レパートリ−とファージライブラリーを比べるために興味ある第三の分野である。実際的には、ファージライブラリーは、アクセスがはるかに容易である。用いられるスクリーニング法は、プレート当り少くとも５０，０００のクローンの遺伝子生産物を調べることを可能にし、従って、−日に１０６〜１０７の抗体を容易に検査できるが、最も強力なスクリーニング法は選択に依存する。触媒的抗体系において、このことは、抗原に栄養要求性バクテリア株の複製のために必要な脱離基（ｌｅａｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐｓ）又は触媒的失活を受けやすい毒性置換基を導入することによって達成されつる。別の利点は、インビボ抗体レパートリ−が免疫化を介してのみアクセスされつるという事実に関係し、これは結合アフィニティに基づく選択である。ファージライブラリーは、同様には制限されない。たとえば、触媒的特性で抗体を同定する唯一の一般的方法は、遷移状態同族体への抗体のアフィニティに基づく予備選択によった。

そのような制限は、触媒が原則として直接にアッセイされうるところのインビボライブラリーに当てはまらない。多数の抗体を機能について直接アッセイする能力は、メカニズムがよく知られていない又は遷移状態同族体の合成が困難である反応における触媒の選択を可能にする。

触媒を直接アッセイすることは、特定の合成同族体に限定された反応メカニズムのためのスクリーニング手順のバイアスを除く。

従って、所与の化学的変換のための複数の反応経路の同時的探求が可能である。

多数の重要な点で抗体とは明らかに異るＦａｂフラグメントの発生のための手順を述べた。−価のＦａｂ抗原バインダーを持つこきにおいて、アフィニティの損失が疑いなくある。しかし、これを、適当にタイトなバインダーの選択によって補償できる。診断及びバテオセンサーのような多数の用途に、−価Ｆａｂフラグメントは好ましい。Ｆｃエフェクター機能を必要とする用途のために、哺乳類細胞においてＨ鎖遺伝子を延長し、グリコリル化された全抗体を表現するための技術がすでに存在する。

データは、従来可能であったよりも少くとも３のオーダーで多い、単一特異性のクローンを構築し、スクリーンすることが今回能となったことを示す。またデータは、生きた動物を用いない抗体の産生に関する予想を与える。

実施例６Ｆｌ、組換え実施例２記載のようにＬ鎖蓋白質をコードするｍＲＮＡのＰＣＲ増強された生産物のクローニングのために、ラムダＺａｐｎの５ａｃＩおよびＸｈｏ１部位に表３記載のヌクレオチド配列を挿入することによって、ラムダＬｃ　２ベクターが作られた。該ベクターは、Ｕｎｉ　−Ｚａｐ　（商標）ＸＲベクターキット（ストラタジーン、ラヨラ、カリフォールニア）からのラムダアームの１０μｇを、１００μ！中３０単位の反応５ａｃｌで消化することにより調製された。オーバーラツプする合成オリゴヌクレオチドは、下記のよりゴヌクレオチドＬＬｌ〜Ｌ１５及びＬ１７−Ｌ１９　（Ｌｌｌ、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１７、Ｌ１８及びＬ１９）（表３に示す）が、ｐＨ７，６の７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　Ｈ（Ｊ　、　０．１　Ｍ　ＫＣｆ、１０ａ＋Ｍ　Ｆ’１ｇＣ１ｚ　、５ａ＋ＭＤＴＴ、　１ｍＭアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）　、１０ｍＭ２ＭＥ、ＢＳＡの５００μｇ／ｍｆｆを含む溶液に、各ヌクレオチドク０．１μｇ／μｌ）の２μｌ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、ガイテルブルグ、ＭＤ）の２０単位を加えることによりキナーゼされた。溶液を３７℃に３０分間維持し、そして６５℃に１０分間溶液を保つことにより反応を停止した。二つのエンドオリゴヌクレオチドＬ１６及びＬｌｌｏを、ｐｏ７．４の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、２゜ＯｍＭ　ＭｇＣＩ！、　ｚ及び５０．０ｍＭ　ＮａＣ１を含む溶液１／１０体積と共に上記キナーゼ反応溶液に加えた。この溶液を７０°Ｃに５分間加熱し、室温へとゆつくり放冷した。この期間に、総てのオリゴヌクレオチドがアニールして、図２Ａに示すものと類似の二本鎖合成りＮＡゼインートを形成した。アニールしたオリゴヌクレオチドが、上記反応の４０μｌを、ｐＨ７，６の６５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２．６．６ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ　ｚ　、１ｓ＋ＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ及び１０単位の７４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ、ガイテルブルグ、ＭＤ）を含む溶液に加えることによって、互いに共有結合的に結合された。

この溶液を２５℃に３０分間維持し、次に溶液を６５℃に１０分間加熱することによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。得たオリゴヌクレオチドのホスホリル化されていない末端が、上記反応の５２μｌと、１０ｍＭＡＴＰ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液４μＥを混合することによりキナーゼされた。この溶液を３７℃に３０分間保ち、次に溶液を６５℃に１０分間加熱することによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。ホスホリル化された合成りＮＡゼインートは、上記調製したラムダＺａｐｎベクターアーム中に直接リゲートされた。

１−亙！（１１ＧＧＣＣにＣＡＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＣＡＭ；ＧＡＧＡＣＡＧＴＣ図２Ｂに示すヌクレオチドシーケンスをラムダＺａｐＩＩのＮｏｔ　Ｔ及びＸｈｏｒ部位にインサートすることによって、実施例２記載のようにＨ鎖ＦｄシーケンスをコードするＰＣＲ増強された生産物をクローンするためにラムダＨｃ　２ベクターが構築された。Ｌ鎖と同様に、１００μ！反応バフファー中のＮｏｔ　Ｉ制限酵素３０単位でＵｎｉ−Ｚａｐ（商標）ＸＲベクターキット（ストラタジーン、ラヨラ、カリホールニア）からのラムダアームを消化することによりＨ鎖ベクターを調製した。図２Ｂのものと類似のインサートされたシーケンスが、上述のように表Ｈ１ｌ〜Ｈ１１３に示したオーバーラツプする合成ヌクレオチドから構築された。

上記オリゴヌクレオチドのシーケンスは、Ｆａｂフラグメントの構築、表現及び分泌のための要素を含む。これらオリゴヌクレオチドは、非対称Ｎｏｔ　Ｔ及びＥｃｏＲＩ制限部位；バクテリアのｐｅｌＢ遺伝子のためのリーダーペプチド（これはＦａｂフラグメントを分泌するためにＥ、　ｃｏｌｉにおいて成功裡に従来用いられた。ペターら、サイエンス、２４０：１０４１．１９８８、スケラ及びプルックサン、サイエンス、２４０１０３Ｂ、１９８８゜この両者は引用することにより本明細書に包含される。）、クローンされたシーケンスの表現のための最適距離でのリポソーム結合部位；Ｌ又はＨ鎖ＰＣＲ生産物の一方のためのクローニング部位；及び、ラムダＨｃ　２において、表現されたＨ核蛋白質フラグメントのカルボキシル末端でのデカペプチドタグを導入する。デカペプチドタグのシーケンスは、融合蛋白質の免疫アフイニテイ精製のために用いられた、このペプチドに対するモノクローナル抗体の入手容易性の故に有用であった。フィールドら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８　：２１５９　（１９８８）（これは引用することにより本明細書に包含される）、ベクターは、制限消化分析及びＤＮＡシーケンシング（サンガーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７４　：５４６３−５４６７．１９７７゜これは引用することにより本明細書に包含される）により、及びＡＭＶリバーストランスクリブターゼ３５Ｓ−ＡＴＰシーケンシングキフト（ストラタジーン、ラヨラ、カリホールニア）を用いて特徴付けされた。

ラムダし０２ベクターのＥｃｏＲ１部位にオリゴヌクレオチドＦＯ１及びＦＯ２又はＦＯ３及びＦＯ４をイ、ンサー卜することによって、ラムダＬｃ　２からラムダＬｃＲＦ及びラムダＬｃＬＦを構築した。ベクターは、１００μβの反応バッファー中で３０単位のＥｃｏＲ１制限酵素（ＮＥＢベバリー、マサチューセッツ）により、１０μｇのラムダＬｃ２ＤＮＡを３７℃で１時間開裂することによって、リゲーションのために調製された。溶液を６５°Ｃで３０分間加熱し、次に３０℃に冷却した。ＣａＣｌ２を、５ｍＭの最終１度に加え、５単位の熱失活性（ＨＫ　：　Ｈｅａｔ−Ｋｉｌｌａｂｌｅ）ホスファターゼ（エビセンター、マジソン、ライスコンシン）を加えた。３０℃で６０分間反応を進めた。ＥｃｏＲｌ消化されたラムダＬｃ　２ＤＮＡは、フェノールクロロホルム抽出及びエタノール沈澱により精製された。ラムダＬｃＲＦは、１０μｌの反応体積で、ＥｃｏＲ消化されたラムダＬｃ　２の１μ乙に３モル当量のホスボリル化オリゴヌクレオチドＦＯ３及びＦＯ４を４℃で１夜リゲートすることによって構築された。

リゲーションの一部（１μｍ）がインビトロラムダファージバッキング抽出物でパッケージされ、ＸＬＩ−ブルーバクテリアのローン（ｌａｗｎ）上にプレートされた。

１０μｌ反応体積で、ＥｃｏＲＩ消化されたラムダＬｃ　２の１μｇに３モル当量のホスホリル化オリゴヌクレオチドＦＯＩ及びＦＯ２を４℃で１夜リゲートすることによって、ラムダＬｃＬＦが構築された。リゲーション混合物の一部（１ μｍ）がインビトロラムダファージバッキング抽出物でバッキングされ、ＸＬＩ −ブルーバクテリアのローン上にプレートされた。

望む組換ファージの同定のために、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含む新鮮なＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％ＮａＣ１、ｐＨ７，５）にＸＬＩ−ブルー（ストラタジーン、ラ　ヨラ、カリホールニア）を接種し、３７℃で一夜振とうした。バクテリアを遠心分離でペレット状にし、１０ｍＭＭｇ５０４の１！２体積に再懸濁し、１０００ｐｆｕの組換ファージを１００μｌのＸＬＩ−ブルー懸濁物と混合し、３７℃で２０分間インキュベートした。この混合物を、ＬＢ培地中の溶融され冷却された０、７％トップアガロース７ｍｌ中に素早く分散し、スラリーを温めたＬＢプレート上にプレートした。アガロースを室温で固化させ、次にプレートを３７℃で１０〜１２時間温め、次に４ ℃に１時間冷却した。該プレートのアガロース表面上に直接にＭＳＩマグナナイロン膜（フィッシャーサイエンティフィック、カリホールニア）を１分間置き、次に注意深く持ち上げて離した。

プラックリフト（１ｉｆｔｓ　）を変性溶液（０，５Ｎ　ＮａＯＨ，１，５ＭＮａＣｅ　）中に５分間浸し、中和溶液（１，５Ｍ　Ｎａ（１！　、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４）に５分間移し、２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）中で濯ぎ、そして祇タオル上で風乾した。上記と同じプレートから複製のフィルターが発生された。

総てのフィルターをフィルター紙のシートの間にはさんで重ね、８０℃で一定減圧下で１時間ベーキングした。フィルターをフィルター紙から取去り、洗滌溶液（５ＸＳＳＣ１０，５％ＳＤＳ、１ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ　ｐＨ８，Ｏ）中に４２℃ で１〜２時間浸した；洗滌溶液に漬けたスポンジで各フィルターをおだやかにぬぐうことによって、バクテリア片を除去した。次にフィルターを、予備ハイブリッド化溶液（６ＸＳＳＣ１０，２％Ｆｉｃｏｌｌ　４００．０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウシ血清アルブミン（ベンタックスフラクションＶ）、０．５％　ＳＤＳ、５０　ｗＭリン酸ナトリウム、ｐ）（ｓ、　５　、及び２５０ μｇ　／　ｍ　１の変性しかつ剪断したニシン精子ＤＮＡ）中で予備ハイブリッド化した。６５℃で２〜１４時間後、予備ハイブリッド化溶液をデカントし、新鮮な溶液をオリゴプローブ（後記）と共に加え、フィルターを室温で１４〜２４時間振とうした。フィルターを５ｘＳＳＣ１０，５％ＳＤＳで３７℃で３０分間、３度洗い、次にオートラジオグラフィーに付した。

フィルター及び複製の両者で陽のハイブリッド化を示すブラックを分離し、制限マンピンク渣びシーケンシングにより調べた。オリゴプローブは下記のように開裂された：１０μｇのオリゴを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　７．４．１０　ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｘ　、５　ｍＭ　ＤＴＴ−０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ、０．１　＋ｅＭスペルミジン、１００μｃｉ〔α−”Ｐｌ　ＡＴＰ　（アメルシャム、アーリントンハイツ、イリノイ）、及びｌＯμＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲＬ、ガイテルブルグ、ＭＤ＞と、５０μｌ反応体積で混合した。ラムダＬｃＬＦを同定するためにオリゴヌクレオチドＬＬＦを用い、ラムダＬｃＲＦを同定するためにＬＲＦを用いた。

ラムダＬ　ｃ　Ｆベクターの構築のために、ラムダＬｃＬＦ及びラムダＬｃＲＦが下記のようにＸｂａ１部位でクロスされた。ラムダＬｃＲＦをＭｌｕｌ制限エンドヌクレアーゼで開裂し、得た５′末端を脱ホスホリル化し、そして生産物をＸｂａＩで消化した。このプロセスは、ベクターの左アームをいくつかの片へと開裂し、しかし右アームはそのまま残った。ラムダＬｃＬＦのＤＮＡを旧ｎｄ■ で開裂し、脱ホスホリル化し、次にＸｂａＩで開裂した：このプロセスは右アームを破壊し、しかし左アームはそのまま残った。

このように調製したＤＮＡを次に混合し、リゲートした。リゲートの後に、Ｌ鎖含有クローンの右アームとＨ鎖含有クローンの左アームの組合から得られたクローンのみが、生きたファージを再構築した。リゲーション及びパッケージングの後に、望むベクター、ラムダＬｃＦはシーケンス分析により上記の通り同定された。

ラムダＨｃ　２ベクターのＥＣｏＲｌ部位にオリゴヌクレオチドＦＯＩ及びＦＯ２又はＦＯ３及びＦＯ４をインサートすることによって、ラムダＨｃ　３からラムダＨｃＲＦ及びラムダＨｃＬＦを構築した。ベクターは、１００μｌの反応バッファー中で３０単位のＥｃｏＲＩ制限酵素（ＮＥＢベバリー　マサチューセッツ）で１０μｇのラムダＨｃ２ＤＮＡを３７℃で１時間開裂することによって、リゲーションのために調製された。溶液を６５℃で３０分間加熱し、次に３０℃ に冷却した。５　ｍＭの最終濃度にＣａＣｌ２を加え、５単位の熱失活性（ＨＫ）ホスファターゼ（エビセンター、マジソン、ライスコンシン）を加えた。３０ ℃で６０分間反応を進めた。ＥｃｏＲＩ消化されたラムダＨｃ３ＤＮＡを、フエノ−ルクロロホルム抽出及びエタノール沈澱により精製した。１μｇのＥｃｏＲＩ消化されたラムダＨｃ　２に３モル当量のホスボリル化オリゴヌクレオチドＦＯ３及びＦＯ４を１０μｌの反応体積で４℃で１夜リゲートすることによって、ラムダＨｃＲＦを構築した。リゲーションの一部（１μｌ）をインビトロラムダファージパッケージング抽出物でパッケージし、ＸＬＩ−ブルーバクテリアのローン上にプレートした。

１０μｌの反応体積で、１μｇのＥｃｏＲＩ消化されたラムダＨｃ　２に３モル当量のホスホリル化オリゴヌクレオチドＦＯＩ及びＦＯ２を４℃で１夜リゲートすることによって、ラムダ）ＩｃＬＰを構築した。リゲーション混合物の一部（１μＩｌ）をインビトロラムダファージパッケージング抽出物でパッケージし、ＸＬＩ−ブルーバクテリアのローン上でプレートした。上記のように、ハイブリッド化によりラムダＨｃＬＦを同定するためにオリゴヌクレオチドＨＬＦを用い、ラムダＬｃＲＦを同定するためにＬＲＦを用いた。

ラムダＨｃＦベクターの構築のために、ラムダＨｅＬＦ及びラムダＨｃＲＦベクターがＸｂａ１部位でクロスされた。この二つのベクターからのＤＮＡは初めに精製された。ラムダＨｃＲＦベクターＤＮＡをＭＩｕＩ制限エンドヌクレアーゼで開裂し、得た５′末端を脱ホスホリル化し、そして生産物をＥｃｏＲＩで消化した。

このプロセスは、ベクターの左アームをいくつかの片に開裂したが、右アームはそのまま残った。ラムダＨｃＬＦ　ＤＮＡを）（ｉｎｄ■で開裂し、脱ホスホリル化し、次にＥｃｏＲＩで開裂した：このプロセスは、右アームを破壊したが、左アームはそのまま残った。

このように調製したＤＮＡを次に混合し、リゲートした。リゲートの後に、Ｌ鎖含有クローンの右アームとＨ鎖含有クローンの左アームの組合せから得たクローンのみが、生きたファージを再構築した。リゲーション及びパンケージングの後に、望むＨ鎖ベクターをシーケンス分析により確認した。

実施例３と同様に、但しクローニングのための調製において：　５ａｃＩ及びＸｂａＩの代りに５ａｃｌ及び５ｐｅＩでラムダＬｃＦを開裂して、このベクター中にライブラリーが構築された。５ａｃｒとＸｂａｒでの開裂により調製されたし鎖ＰＣＲインサートは、これらアームと同等であった。

表−７ＦＯＩ　５’　ＡＡＴｒＣＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＡＣＴＴＩ’ＣＴＡＧＡＧ　３’実施例７左アームに二つのアンバー変異を含むＬ鎖ベクターが構築された。ＥＭＢ　Ｌ　３　Ａからの左アームとラムダＬｃＦからの右アームを組合わせて、ラムダＬｃＦＡを構築した。ＤＮＡは、二つの親うムダファージヘクターの夫々から調製された。１０μｇのラムダＥＭＢＬＡをＨｉｎｄｌｎで消化し、脱ホスホリル化し、そしてＫｐｎＩで消化した。１０μｇのラムダＬｃＦをＭｌｕ＋で消化し、次に脱ホスホリル化した。このＤＮＡを次にＫｐｎ［で消化した。

二つの親ベクターの夫々からの消化されたＤＮＡ　１μｇを混合し、リゲートした。インビトロでのパフケージングの後に、ファージはＢ　Ｂ　４　Ｅ、　ｃｏｌｉ中に感染された。総てのファージは、ＥＭＢ　Ｌからの二つのアンバー変異及びラムダＬｃＦからのクローニング部位を有し、これらファージの一つはラムダＬｃＦＡと名付けられた。

実施例６のラムダＨｃＦＡの構築と同じ方法で、ラムダＺａｐにアンバー変異を持つＨ鎖ベクター、ラムダＨｃＦＡが構築された。但し、ラムダＺａｐｌは、Ｎｏｔ　Ｉ及びＥｃｏＲＩで消化され、熱失活性ホスファターゼで脱ホスホリル化され、ファージベクターはＥ、　ｃｏｌｉ　Ｂ　Ｂ　４上で生育された。

実施例６におけるようにこれらベクター中でＨ及びＬ鎖うイブラリーが構築されるとき、プラスミドｐＵｃ１９Ｆで形質変換されたＢＢ４　（、ストラタジーン、ラ　ヨラ、カリホールニア）細胞中にファージライブラリーを共怒染することによって組合せを行うことができた（ゴビナルとジャヤラム、ジーン、５１：３１−４１　（１９８７）記載のように。これは、引用することにより本明細書に包含される）。そして、組合わされたファージは、５ｕｐＦアンバー変異に対して選択されたＭＣＩ　Ｏ６１（ＡＴＣＣ）Ｅ、ｃｏｌｉ上にプレートすることにより選択された。

本発明を好ましい実施態様によって説明したが、本発明の精神から離れることなく種々の改変が可能であることが理解されなければならない。従って、本発明は、下記の請求の範囲によってのみ限定される。

浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　２Ａ　ルＣ１３’　ＴＣＧＡＡＣＴＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＧＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＴＰａｌ　ＢリーダーＬｓｕ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌｅ　Ｇｌｎ　Ｐｒ。

ＣＣＴＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＧＡＴＡＡＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧＮｃｏｌ　５ａｃｌ　Ｘｂａｌ　ＮｏｔｆＧＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＴＣＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＴＣＧＣＣＧＧＣＡＧＣＴ　５’ｃｏｌＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＡＣＣＴＡＡＣＡＡＴＡＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＧＧＴＸｈｏｌ　Ｘｔｎｌ　Ｓｐ＠ＩＡＣＣＧＧＧＴＣＣＡＣＴＴＴＧＡＣＧＡＧＣＴＣＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣｃｏ　Ｒ１浄書（内容に変更なし）・　・　０・　・　６．７×１０°１２・　・　６．７×１０°１０・　・　６．７×１０°９６．７×１０“８６．７　×１０”７６．７×１０”６６．７×１０°５浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　５ＦＩＧ、６浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　７平成　年　月　日

Claims

【特許請求の範囲】

１．発現可能な第１および第２ポリペプチドをコードする様々な組み合せの第１および第２のＤＮＡ配列を含む複数の原核細胞を含有し、該ポリペプチドはヘテロマーレセプタを形成し、かつ該複数の原核細胞の少なくとも一種が予め選ばれた分子に対して結合活性を示すヘテロマーを発現することを特徴とする組成物。
２．該原核細胞がＥ．コリである請求の範囲第１項記載の組成物。
３．該第１および第２ＤＮＡ配列が、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタの機能性部分をコードする請求の範囲第１項記載の組成物。
４．該第１および第２ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第３項記載の組成物。
５．第１および第２ポリペプチドをコードする異る第１および第２ＤＮＡ配列の様々な組合せを含む複数の原核細胞を含み、該第１および第２ポリペプチドが結合して予め定めた分子に対して結合活性を呈するヘテロマーレセプタを形成でき、該第１のＤＮＡ配列の多様性が約１００よりも多くの異る配列に相当し、かつ該第２のＤＮＡ配列の多様性が約１０００よりも多くの異る配列数に相当することを特徴とする組成物。
６．該原核細胞がＥ．コリである請求の範囲第５項記載の組成物。
７．該第１および第２ＤＮＡ配列が、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタの機能性部分をコードする請求の範囲第５項記載の組成物。
８．該第１および第２ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第７項記載の組成物。
９．２種以上のＤＮＡ配列の同時発現に適したベクター調製用キットであって、２種のベクターを含み、その第１のベクターが、配向を規定するクローニングサイトの規定された側に第１の結合サイトをもち、第２のベクターが第２の結合サイトと該第１のベクターとは非対称の配向のクローニングサイトとをもち、該ベクターの一方もしくは両者が、該クローニングサイトに挿入されたＤＮＡ配列によってコードされるヘテロマーレセプタを形成するポリペプチドを発現するためのプロモータを含むことを特徴とする上記キット。
１０．該ベクターがウイルス中にある請求の範囲第９項記載のキット。
１１．該ベクターがプラスミドである請求の範囲第９項記載のキット。
１２．該ＤＮＡ配列が抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれる機能性部分をコードする請求の範囲第９項記載のキット。
１３．該ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第１２項記載のキット。
１４．該第１および第２結合サイトがＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ− ＮｏｔＩからなる群から選ばれる請求の範囲９記載のキット。
１５．該クローニングサイトがＸｈｏＩ−ＳｐｅＩ、ＳａｃＩ−ＸｂａＩおよびＳａｃＩ−ＳｐｅＩからなる群から選ばれる請求の範囲第１４項記載のキット。
１６．第２のベクターと結合した際に予め定められた分子に対して結合活性をもつヘテロマーを発現できるベクターであって、配向を規定するクローニングサイトの定められた側に第１の結合サイトを有し、かつ第１のベクタとは非対称の配向のクローニングサイトと第２の結合サイトをもつ第２のベクターと結合でき、該ベクターの一方または両者が、該クローニングサイト中に挿入されたＤＮＡ配列によりコードされるヘテロマーを形成するポリペプチドを発現するためのプロモータを含むことを特徴とする上記ベクター。
１７．該ＤＮＡ配列が、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタの機能性部分をコードする請求の範囲第１６項記載のベクター。
１８．該ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第１６項記載のベクター。
１９．結合してヘテロマーを形成するポリペプチドをコードする２種のＤＮＡ配列を同時に発現するクローニング系であって、第１のＤＮＡ配列を種々の数で含む均一な第１のベクター群と、第２のＤＮＡ配列を種々の数で含む均一な第２のベクター群とを含み、該第１および第２のベクターが相補的結合サイトを含んでいて、該第１および第２ＤＮＡ配列の機能可能な結合を可能とする上記クローニング系。
２０．該２種のＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードし、該ポリペプチドが結合して、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタを形成する請求の範囲第１９項記載のクローニング系。
２１．該２種のＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第２０項記載のクローニング系。
２２．該結合サイトがＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ−ＮｏｔＩからなる群から選ばれる請求の範囲第１９項記載のクローニング系。
２３．複数の可能な第１および第２ＤＮＡ配列を含む複数の表現ベクターであって、該発現ベクターの各々がその上に第１および第２ＤＮＡ配列を機能可能に結合しており、かつ実質的に該ベクターの各々が異る第１および第２ＤＮＡ配列の組合せを含むことを特徴とする上記複数の表現ベクター。
２４．結合してヘテロマーレセプタを形成する第１および第２のポリペプチドをコードする第１および第２ＤＮＡ配列を含む種々の数のベクターを樹立する方法であって、以下の諸工程（ａ）第１のポリペプチドをコードする種々の数の第１のＤＮＡ配列を、定められた配向で結合サイトおよびクローニングサイトを有する第１のベクターに機能可能に結合する工程、（ｂ）第２のポリペプチドをコードする様々な数の第２のＤＮＡ配列と、該第１のベクターの結合サイトと相容性の結合サイトおよび該第１のベクターとは非対称配向のクローニングサイトをもつ第２のベクターとを機能可能に結合する工程、および（ｃ）該工程（ａ）のベクター生成物と、該工程（ｂ）のベクター生成物とを、結合ベクターを形成し得る条件下で結合させて、その上で機能的に結合した該第１および第２ＤＮＡ配列を有する結合ベクターを形成する工程を含むことを特徴とする上記方法。
２５．該第１および第２ＤＮＡ配列が、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタの機能性部分をコードする請求の範囲第２４項記載の方法。
２６．該第１および第２ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖をコードする請求の範囲第２５項記載の方法。
２７．該結合を、該工程（ａ）および（ｂ）のベクターの制限エンドヌクレアーゼ開裂および該開裂された工程（ａ）および（ｂ）のベクターのＤＮＡリガーゼによる結合により実施する請求の範囲第２４項記載の方法。
２８．該結合をＦｌｐリコンビナーゼで行う請求の範囲第２４項記載の方法。
２９．予め選択された分子に対して特異的なヘテロマーを発現する原核細胞を選別する方法であって、ポリペプチドをコードする種々の数のＤＮＡ配列をもつ第１のベクターと、ポリペプチドをコードし、該第１のベクターのコードする該ポリペプチドと共にヘテロマーレセプタを形放する異った種々の数のＤＮＡ配列をもつ第２のベクターとを無秩序に結合し、十分な数の該無秩序に結合された配列の該原核細胞へのトランスフェクションを行い、該細胞をスクリーニングして、該予め定められた分子に特異的なヘテロマーを発現する細胞を決定することを特徴とする上記方法。
３０．該第１および第２ＤＮＡ配列が、抗体、Ｔ細胞レセプタ、インテグリン、ホルモンレセプタおよび伝達物質レセプタからなる群から選ばれるヘテロマーレセプタの機能性部分をコードする請求の範囲第２９項記載の方法。
３１．該第１および第２ＤＮＡ配列が抗体の可変重鎖および可変軽鎖の機能性部分をコードする請求の範囲第３０項記載の方法。
３２．該第１および第２ベクターを制限エンドヌクレアーゼ開裂し、該開裂された第１および第２ベクターを連結することにより該結合を行う請求の範囲第２９項記載の方法。
３３．該結合をＦｌｐリコンビナーゼで行う請求の範囲第２９項記載の方法。
３４．無秩序に結合された配列の数が、該第１および第２ＤＮＡの可能な組合せの数に十分に等しい請求の範囲第２９項記載の方法。
３５．複数のポリペプチドを含む機能性のヘテロマーレセプタの同定法であって、結合してヘテロマーレセプタを形成するポリペプチドをコードする無秩序の第１および第２のＤＮＡ同族体の組合せを同時に発現させて、種々の数の該第１および第２のＤＮＡ同族体を形成する工程を含み、その多様性が、上記同時表現により得られたポリペプチドにより形成される少なくとも一種のヘテロマーが所定の機能性をもつのに少なくとも十分であり、かつ該ヘテロマーレセプタが予め定められた機能につきスクリーニングし得るように制限されていることを特徴とする上記同定法。