KR102539159B1 - 서열 유사성을 가진 항-패밀리 19, 멤버 a5 항체 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하고 FAM19A5 활성을 조절하며, 예를 들어 이러한 항체를 이용하여 반응성 신경아교증의 개시 및/또는 반응성 성상세포의 과도한 증식을 저해, 억제, 감소 또는 역전시킨다. 본 발명은 또한 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함으로써 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애 또는 신경병증성 통증과 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

서열 유사성을 가진 항-패밀리 19, 멤버 A5 항체 및 그것의 사용 방법{ANTI-FAMILY WITH SEQUENCE SIMILARITY 19, MEMBER A5 ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2016년 11월 7일자 제출된 미국 임시출원 제62/418,674호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열목록의 참고 자료
출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 파일(파일명: 3763.003PC01_ST25.txt; 크기: 133,676바이트; 생성일: 2017년 11월 6일)로 전자적으로 제출된 서열목록의 내용 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 서열 유사성을 가진 패밀리 19, 멤버 A5(FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 포함하는 조성물 및 대상의 중추신경계 손상과 같은 장애나 질환을 예방하거나 치료하기 위한 상기 항체의 사용 방법을 제공한다.
FAM19A5는 단백질 TAFA 서브패밀리의 일원이며, 5개의 고도로 상동성인 작은 단백질로 이루어진다(Tang T. Y. et al., Genomics 83(4):727-34 (2004)). 이러한 단백질은 고정된 위치에 보존된 시스테인 잔기를 함유하고, CC-케모카인 패밀리의 일원인 대식세포 염증 단백질 1-알파(MIP-1-알파)와 관련이 있다. TAFA 단백질은 뇌와 척수의 특정 영역에서 우선적으로 발현된다. 이러한 단백질은 신경발생 과정에서 성인의 신경줄기세포에 의해 생성 및 분비되는 것으로 밝혀졌다.
FAM19A5는 척추동물의 뇌에서 우선적으로 발현되는데, 중추신경계의 발생, 분화, 형성에서 중요하다고 여겨지며, 중추신경계 손상 및/또는 질환의 예방이나 치료에 사용될 수 있다(미국특허공개 No. 2015/0118230).
FAM19A5의 억제는 중추신경계의 치료에 있어서 중요한 역할을 할 수 있으며, FAM19A5에 특이적으로 결합하고 FAM19A5 활성을 조절할 수 있는 항체를 개발하는 것이 필요하다.
인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분(항-FAM19A5 항체), 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물, 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터 또는 벡터를 포함하는 세포가 개시된다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 인간 FAM19A5 에피토프에 대한 경쟁에서 (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (3) SEQ ID NO: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (4) SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 기준 항체와 상호 경쟁한다. 한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 기준 항체로서 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합한다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99 내지 107(즉, EGCDLLINR), 예를 들어, 아미노산 잔기 102, 103, 105 및 107(즉, DL-I-R), 아미노산 잔기 99, 100, 102, 103, 105 및 107(즉, EG-DL-I-R), 아미노산 잔기 99, 100 및 107(즉, EG------R)에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서, SEQ ID NO: 2인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합한다. 한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 EP6, EP7 및/또는 EP8로 확인된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, EP6은 아미노산 KTKQWCDML(SEQ ID NO: 139)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되고, EP7은 아미노산 GCDLLINR (SEQ ID NO: 140)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성되며, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 141)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 또는 구성된다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, (i) 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 85, 또는 SEQ ID NO: 91을 포함하고; (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 89를 포함하고; (iii) 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84, 또는 SEQ ID NO: 90을 포함하고; (iv) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 92를 포함하고; (v) 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 87, 또는 SEQ ID NO: 93을 포함하고; 및/또는 (vi) 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 88, 또는 SEQ ID NO: 94를 포함한다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (3) SEQ ID NO: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (4) SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 5 및 103-113에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 및/또는 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 6 및 114-124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체이다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 SEQ ID NOs: 27 및 145 내지 155를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NOs: 28 및 156 내지 166을 포함하는 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 아래의 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 결합한다;
(b) ELISA에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 FAM19A5에 결합한다;
(c) 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연, 및/또는 예방한다;
(d) 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제한다;
(e) 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 감소시킨다;
(f) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현을 증가시킨다;
(g) 뉴런의 생존을 촉진한다;
(h) 뉴런에서 GAP43의 발현을 증가시킨다; 및
(i) 축삭돌기의 재성장을 촉진한다.
한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NOs: 2 및 139 내지 141과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되는 FAM19A5 에피토프를 제공하며, 상기 에피토프는 각각 표 4 및 5에 제시된 것과 같은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 기준 항체에 특이적으로 결합될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 개시된 항-FAM19A5 항체 또는 에피토프를 암호화하는 핵산을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 개시된 항-FAM19A5 항체 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 질환 또는 상태의 치료요법에서 사용하기 위한 항-FAM19A5 항체를 제공한다.
구체예
구체예 1. 서열 유사성을 가진 인간 패밀리 19, 멤버 A5(FAM19A5)에 특이적으로 결합하고 아래의 특성 중 하나 이상을 나타내는 분리된 단클로성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분:
(a) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 결합한다;
(b) ELISA에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 FAM19A5에 결합한다;
(c) 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연, 및/또는 예방한다;
(d) 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제한다;
(e) 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 감소시킨다;
(f) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현을 증가시킨다;
(g) 뉴런의 생존을 촉진한다;
(h) 뉴런에서 GAP43의 발현을 증가시킨다; 및
(i) 축삭돌기의 재성장을 촉진한다.
구체예 2. 인간 FAM19A5 에피토프에 대한 결합에서 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 기준 항체와 상호 경쟁하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 3. 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하며, 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 4. SEQ ID NO: 2인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하는, 구체예 2 또는 3의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 5. 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 SEQ ID NO: 2인, FAM19A5에만 결합하는, 구체예 2 내지 4 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 6. 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합하는, 구체예 2 내지 4 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 7. 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합하는, 구체예 2 내지 4 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 8. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 9. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 중쇄 CDR3이 SEQ ID NO: 9를 포함하는, 구체예 8의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 10. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 중쇄 CDR1가 SEQ ID NO: 7을 포함하는, 구체예 8 또는 9의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 11. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 중쇄 CDR2가 SEQ ID NO: 8을 포함하는, 구체예 8 내지 10 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 12. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 경쇄 CDR1이 SEQ ID NO: 10을 포함하는, 구체예 8 내지 11 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 13. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 경쇄 CDR2가 SEQ ID NO: 11을 포함하는, 구체예 8 내지 12 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 14. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 경쇄 CDR3이 SEQ ID NO: 12를 포함하는, 구체예 8 내지 13 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 15. SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 16. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 17. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 18. 항체가 단일 도메인 항체인, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체.
구체예 19. 항체가 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 이들의 변이체로 구성되는 군으로부터 선택되는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 20. 항체가 IgG2 항체, IgG4 항체 또는 이들의 조합인, 구체예 19의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 21. 항체가 IgG2/IgG4 이소타입 항체를 포함하는, 구체예 19의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 22. Fc 기능이 없는 불변 영역을 더 포함하는, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 23. 키메라 항체, 인간 항체 또는 인간화 항체인, 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 24. 단클론성 항체가 SEQ ID NO: 27을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 28을 포함하는 경쇄를 포함하는, 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 단클론성 항체.
구체예 25. 그것의 항원 결합 부분이 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv(scFv)인, 구체예 1 내지 23 중 어느 하나의 그것의 항원 결합 부분.
구체예 26. 제2 결합 부분을 가진 분자에 결합된 전술한 구체예 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 포함하는 이중특이적 분자.
구체예 27. SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나 또는 구성되며, SEQ ID NO: 5의 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 6의 경쇄 가변 영역을 포함하는 기준 항체에 특이적으로 결합될 수 있는, 서열 유사성을 가진 인간 패밀리 19, 멤버 A5(FAM19A5) 에피토프.
구체예 28. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 27의 에피토프를 암호화하는 핵산.
구체예 29. 구체예 28의 핵산을 포함하는 벡터.
구체예 30. 유전자 치료요법에서 사용하기 위한, 구체예 29의 벡터.
구체예 31. 구체예 29의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
구체예 32. 제제에 결합된, 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분 또는 구체예 26의 이중특이적 분자를 포함하는 면역콘쥬게이트.
구체예 33. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트 및 담체를 포함하는 조성물.
구체예 34. 구체예 1 내지 25 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자, 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
*구체예 35. 비-인간 동물을 구체예 27의 에피토프로 면역화하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 생성하는 단계를 포함하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 제조하는 방법.
구체예 36. 적합한 조건하에 구체예 31의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 분리하는 단계를 포함하는, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 생성하는 방법.
구체예 37. 신경아교증의 개시가 지연되도록, 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연 및/또는 예방하는 방법.
구체예 38. 반응성 성상세포의 과도한 증식이 억제되도록, 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제하는 방법.
구체예 39. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸이 감소되는, 대상의 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 감소시키는 방법.
구체예 40. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 뉴런의 생존이 촉진되는, 대상의 뉴런의 생존을 촉진하는 방법.
구체예 41. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 축삭돌기의 재성장이 촉진되는, 대상의 축삭돌기의 재성장을 촉진하는 방법.
구체예 42. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 중추신경계 손상을 치료하는 방법.
구체예 43. 중추신경계 손상은 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중 및 뇌종양을 포함하는, 구체예 42의 방법.
구체예 44. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 뇌척수 또는 신경 장애를 치료하는 방법.
구체예 45. 퇴행성 뇌 장애는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)를 포함하는, 구체예 44의 방법.
구체예 46. 구체예 1 내지 25의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 신경병증성 통증을 치료하는 방법.
구체예 47. 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 정맥내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하 또는 심실내 경로로 투여되는, 구체예 35 내지 46 중 어느 하나의 방법.
구체예 48. 대상이 인간인, 구체예 35 내지 47 중 어느 하나의 방법.
구체예 49. 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애 또는 신경병증성 통증의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 구체예 1 내지 25 중 어느 하나에 따른 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분, 구체예 26의 이중특이적 분자 또는 구체예 32의 면역콘쥬게이트의 용도.
구체예 50. 질환 또는 상태의 치료요법에서 사용하기 위한 구체예 1 내지 49 중 어느 하나의 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 51. 질환 또는 상태는 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애, 또는 신경병증성 통증인, 구체예 50의 사용을 위한, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분.
구체예 52. 대상의 생물학적 샘플을 구체예 1 내지 49 중 어느 하나의 단클론성 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상을 진단하는 방법.
서열 유사성을 가진 인간 패밀리 19, 멤버 5(FAM19A5)에 특이적으로 결합하며 본 명세서에 개시된 특성 중 하나 이상을 나타내는 분리된 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 개시된다.
한 구체예에서, 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 인간 FAM19A5 에피토프에 대한 결합에서 중쇄 및 경쇄를 포함하는 기준 항체와 상호 경쟁하며, (i) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83 또는 SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84 또는 SEQ ID NO: 90의 아미노산 서열을 포함하고, (iii) 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, (i) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 86 또는 SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 87 또는 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함하고, (iii) 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 88 또는 SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 기준 항체는 (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (3) SEQ ID NO: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (4) SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 2인, 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 단클론성 항체, 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 2인, 오직 하나의 FAM19A5 에피토프에만 결합한다. 일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합한다.
일부 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP6, EP7, 및/또는 EP8로 확인된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, EP6은 아미노산 KTKQWCDML(SEQ ID NO: 139)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성되고, EP7은 아미노산 GCDLLINR(SEQ ID NO: 140)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성되며, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 141)을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성된다. 특정 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP6, EP7 및/또는 EP8에만 결합한다. 다른 구체예에서, 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합한다.
개시된 내용의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 문구가 정의된다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에서 제시된다.
I. 정의
본 개시내용의 전체에서, 용어 "한" 또는 "어떤" 실체는 그 실체의 하나 이상임을 말한다; 예를 들어, "한 항체"는 하나 이상의 항체를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한"(또는 "어떤"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"는 상호 교환하여 사용될 수 있다.
또한, "및/또는"은 나머지 것과 함께 또는 나머지 것은 없이 두 명시된 특징 또는 성분의 각각의 구체적인 개시로서 이해되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A(단독)", 및 "B(단독)"를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"은 "A, B 및 C", "A, B 또는 C", "A 또는 C", "A 또는 B", "B 또는 C", "A 및 C", "A 및 B", "B 및 C", "A(단독)", "B(단독)" 및 "C(단독)"의 양태의 각각을 포함하는 것으로 의도된다.
양태들이 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에는 "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 측면에서 설명된 다른 유사한 양태들도 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는다면, 개시된 모든 기술 및 과학 용어는 관련된 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press가 본 개시내용에서 사용된 대부분의 용어에 대한 일반사전적 의미를 당업자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 Systeme International de Unite(SI)에서 승인된 형태로 표시된다. 수치 범위는 해당 범위를 한정하는 숫자들의 양끝 값들을 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 아미노산 서열은 좌측에서 우측으로 아미노에서 카복시 방향으로 제시된다. 제공된 표제들은 본 발명의 다양한 양태의 제한이 아니며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 대한 참조로서 이용될 수 있다. 따라서, 아래 정의된 용어들은 명세서 전반에서 더 충분히 정의된다.
용어 "약"은 대략적, 대충, 근처 또는 부근을 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되었을 때, 제시된 수치 범위의 위와 아래의 한계를 연장함으로써 해당 범위를 변형한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들어 위나 아래로(더 높거나 또는 더 낮은) 10 퍼센트의 변량만큼 명시된 값의 위와 아래로 수치 범위를 변형할 수 있다.
용어 "서열 유사성을 가진 패밀리 19, 멤버 A5" 또는 "FAM19A5"는 5개의 고도로 상동성인 단백질들의 TAFA 패밀리(FAM19 패밀리라고도 함)에 속하는 단백질을 말하며, 뇌와 척수에서 주도적으로 발현된다. FAM19A5는 또한 TAFA5 또는 케모카인-유사 단백질 TAFA-5라고도 알려져 있다.
인간에서, FAM19A5를 암호화하는 유전자는 염색체 22에 위치된다. 다음과 같은 다수의 인간 FAM19A5(UniProt: Q7Z5A7) 이소폼이 있으며, 이들은 대안적 스플라이싱에 의해 생성될 수 있다: 132개 아미노산으로 구성된 이소폼 1(UniProt: Q7Z5A7-1), 125개 아미노산으로 구성된 이소폼 2(UniProt: Q7Z5A7-2) 및 53개 아미노산으로 구성된 이소폼 3(UniProt: Q7Z5A7-3). 인간 FAM19A5 단백질은 막 결합된 형태와 가용성(분비된) 형태로 존재한다. 이소폼 1은 하나의 경막 영역을 가진 막이다. 이소폼 2는 분비된 단백질(가용성)로서 Tang T. Y. et al., Genomics 83(4):727-34 (2004)에 보고되었으며, 아미노산 위치 1-25에 신호 펩타이드를 함유한다. 이소폼 1은 막 단백질인 것으로 여겨진다. 아래에 이 세 공지된 인간 FAM19A5 이소폼의 아미노산 서열이 제시된다.
(I) 이소폼 1(UniProt: Q7Z5A7-1, 경막 단백질): 이 이소폼이 공식 서열로서 선택되었다.
MAPSPRTGSR QDATALPSMS STFWAFMILA SLLIAYCSQL AAGTCEIVTL DRDSSQPRRT IARQTARCAC RKGQIAGTTR ARPACVDARI IKTKQWCDML PCLEGEGCDL LINRSGWTCT QPGGRiKTTT VS (SEQ ID NO: 1)
(II) 이소폼 2(UniProt: Q7Z5A7-2, 가용성 단백질):
MQLLKALWAL AGAALCCFLV LVIHAQFLKE GQLAAGTCEI VTLDRDSSQP RRTIARQTAR CACRKGQIAG TTRARPACVD ARIIKTKQWC DMLPCLEGEG CDLLINRSGW TCTQPGGRIK TTTVS (SEQ ID NO: 4)
(III) 이소폼 3(UniProt: Q7Z5A7-3):
MYHHREWPAR IIKTKQWCDM LPCLEGEGCD LLINRSGWTC TQPGGRIKTT TVS (SEQ ID NO: 26)
용어 "FAM19A5"는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 FAM19A5의 임의의 변이체 또는 이소폼을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 항체는 동일한 종에서의 상이한 이소폼(예를 들어, 인간 FAM19A5의 상이한 이소폼)과 교차 반응할 수 있거나, 또는 인간 이외의 다른 종으로부터의 FAM19A5(예를 들어, 마우스 FAM19A5)과 교차 반응할 수 있다. 또는, 항체는 인간 FAM19A5에 특이적일 수 있고 다른 종과의 교차 반응성은 나타낼 수 없다. FAM19A5 또는 그것의 임의의 변이체 및 이소폼은 이들을 자연적으로 발현하는 세포 또는 조직으로부터 분리될 수 있거나 또는 재조합 생성될 수 있다. 인간 FAM19A5를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 GenBank 수탁 번호 BC039396 및 다음의 서열을 가진다.
[표 1A]
인간 FAM19A5의 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure 112021151826965-pat00001
용어 "항체" 및 "항체들"은 당업계의 용어이며 상호 교환하여 본 명세서에 사용될 수 있고, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 가진 분자를 말한다. 본 명세서에 사용된 이 용어는 전체 항체 및 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원-결합 부분") 또는 그것의 단쇄를 포함한다. 한 구체예에서, "항체"는 이황화물 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질 또는 그것의 항원 결합 부분을 말한다. 다른 구체예에서, "항체"는 단일 가변 도메인, 예를 들어 VHH 도메인을 포함하는 단쇄 항체를 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약기됨)과 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 자연적으로 발생한 항체에서, 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 자연적으로 발생한 항체에서, 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL로 약기됨)과 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 이루어진다.
VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명명된, 초가변성의 영역으로 더 세분될 수 있으며, 이것은 프레임워크 영역(FR)이라고 명명된 더 보존된 영역들에 산재된다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 이루어지며, 이들은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분(Clq)을 포함하는, 면역글로불린과 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개할 수 있다.
용어 "Kabat 넘버링" 및 유사한 용어들은 당업계에서 인정되며, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 말한다. 특정 양태에서, 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라서 결정될 수 있다(예를 들어, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 및 Kabat EA et al,(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조). Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 31 내지 35(이것은 선택적으로 35번 뒤에 1 또는 2개의 추가의 아미노산을 포함할 수 있다(Kabat 넘버링 시스템에서 35A 및 35B라고 한다))(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65(CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102(CDR3)에 존재한다. Kabat 넘버링 시스템을 사용하여, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34(CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56(CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97(CDR3)에 존재한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 개시된 항체의 CDR은 Kabat 넘버링 방식에 따라서 결정되었다. 문구 "Kabat에 제시된 아미노산 위치 넘버링", "Kabat 위치" 및 이들의 변이형들은 Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))에서 항체 집단의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 넘버링 시스템을 말한다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FW 또는 CDR의 단축, 또는 그것에의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 뒤에 단일 아미노산 삽입체(Kabat에 따라서 잔기 52a)를 포함할 수 있고, 중쇄 FW 잔기 82 뒤에 삽입된 잔기(예를 들어, Kabat에 따라서 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 표 1b 참조.
[표 1B]
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잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다. Chothia는 구조적 루프의 위치를 제안한다(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kabat 넘버링 관례를 사용하여 넘버링되었을 때 Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 가변적이다(이것은 Kabat 넘버링 방식이 삽입부를 H35A와 H35B에 위치시키기 때문이다. 35A와 35B 둘 다 존재하지 않는다면 루프는 32에서 끝난다. 35A만 존재한다면 루프는 33에서 끝난다. 35A와 35B가 모두 존재한다면 루프는 34에서 끝난다). AbM 초가변 영역은 Kabat CDR과 Chothia 구조적 루프 사이의 상쇄를 표시하며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
IMGT(ImMunoGeneTics)도 CDR을 포함하는 면역글로불린 가변 영역을 위한 넘버링 시스템을 제공한다. 예를 들어, Lefranc, M.P. et al, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77(2003)를 참조하며, 이것은 참고로 본 명세서에 포함된다. IMGT 넘버링 시스템은 5,000개를 넘는 서열의 정렬, 구조 데이터 및 초가변 루프의 특성화에 기초했으며, 모든 종에서 가변 영역과 CDR 영역의 용이한 비교를 가능하게 한다. IMGT 넘버링 방식에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 있고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다.
본 명세서에 개시된 모든 중쇄 불변 영역 아미노산 위치에 대한 넘버링은 최초로 서열화된 인간 IgG1인 흑색종 단백질 EU의 아미노산 서열을 설명하고 있는, Edelman et al, 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(l):78-85에 최초로 개시된 EU 인덱스를 따른다. Edelman 등의 EU 인덱스는 Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.(United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)에도 제시된다. 따라서, 문구 "Kabat에 제시된 EU 인덱스" 또는 "Kabat의 EU 인덱스" 및 "Kabat에 제시된 EU 인덱스에 따른 ... 위치" 및 이들의 변이형들은 Kabat 1991에 제시된 것과 같은 Edelman 등의 인간 IgG1 EU 항체에 기초한 잔기 넘버링 시스템을 말한다.
가변 도메인(중쇄 및 경쇄 둘 다) 및 경쇄 불변 영역 아미노산 서열에 사용된 넘버링 시스템은 Kabat 1991에 제시된 것이다.
항체는 면역글로불린 분자의 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 유형(예를 들어, Igd, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 서브클래스(예를 들어, 인간에서 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3)를 가질 수 있다. 면역글로불린, 예를 들어 IgG1은 몇몇 알로타입으로 존재하며, 이들은 최대 몇 개의 아미노산이 서로 상이하다. 본 명세서에 개시된 항체는 통상 알려진 이소타입, 유형, 서브클래스 또는 알로타입 중 어느 것으로부터 유래할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스 또는 이들의 임의의 하이브리드에 속한다. 특정 구체예에서, 항체는 IgG2, IgG4 또는 IgG2/IgG4 서브클래스에 속한다.
항체는, 예로서, 자연 발생 및 비-자연 발생 항체; 단클론성 및 다클론성 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비-인간 항체; 완전 합성 항체; 단쇄 항체; 단일특이적 항체; 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함); 2개의 중쇄 분자와 2개의 경쇄 분자를 포함하는 테트라머 항체; 항체 경쇄 모노머; 항체 중쇄 모노머; 항체 경쇄 다이머, 항체 중쇄 다이머, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍; 인트라바디; 헤테로콘쥬게이트 항체; 1가 항체; 단쇄 항체; 낙타화 항체; 아피바디; 항-이디오타입(항-Id) 항체(예를 들어, 항- 항-Id 항체 포함) 및 충분히 항원 결합을 할 수 있는 단일 모노머 가변 항체 도메인(예를 들어, VH 도메인 또는 VL 도메인)으로 구성된 결합 분자를 포함하는 단일-도메인 항체(sdAbs)를 포함한다(Harmen M. M. and Haard H. J. Appl Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22 (2007)).
본 명세서에서 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체(예를 들어, 인간 FAM19A5)의 하나 이상의 단편을 말한다. 이러한 "단편"은, 예를 들어 약 8 내지 약 1500개 아미노산 길이, 적합하게는 약 8 내지 약 745개 아미노산 길이, 약 8 내지 약 300개, 약 8 내지 약 200개 아미노산 또는 약 10 내지 약 50개 또는 100개 아미노산 길이이다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행되는 것으로 밝혀졌다. 항체, 예를 들어 본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함된 결합 단편의 예들은 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 이황화물 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 하나의 팔의 VL 및 VH 도메인, 및 이황화물-연결된 Fv(sdFv)로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(Ward et al, (1989) Nature 341: 544-546) 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 이어질 수 있는 둘 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편, VL 및 VH 중 2개 도메인은 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 재조합 방법을 사용하여, VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자(단쇄 Fv(scFv))를 형성한 단일 단백질 사슬을 이루도록 할 수 있는 합성 링커에 의해 이어질 수 있다(Bird et al, (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이러한 단쇄 항체도 역시 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되도록 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 종래의 기술을 사용하여 얻어지며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술, 또는 무손상 면역글로불린의 효소 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호 교환하여 사용된다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부분, 일반적으로 경쇄 또는 중쇄의 일부분, 전형적으로 성숙한 중쇄에서 약 아미노-말단 110 내지 120개 아미노산 및 성숙한 경쇄에서 약 90 내지 115개 아미노산을 말하며, 이들은 항체들마다 서열이 광범위하게 상이하며 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성을 특화한다 서열의 가변성은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 영역에 집중되며, 가변 도메인에서 더 고도로 보존된 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불린다.
경쇄 및 중쇄의 CDR은 항체와 항원의 상호작용 및 특이성을 주로 담당한다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 인간 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 영장류(예를 들어, 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 구체예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR과 영장류(예를 들어, 비-인간 영장류) 프레임워크 영역(FR)을 포함한다.
본 명세서에 제시된 용어 "중쇄"는 항체와 함께 사용되는 경우 임의이 상이한 타입, 예를 들어 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 및 뮤(μ)를 말할 수 있고, 이들은 각각 IgG의 서브클래스, 예를 들어 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 유형을 발생시킨다.
본 명세서에 제시된 용어 "경쇄"는 항체와 함께 사용되는 경우 임의의 상이한 타입, 예를 들어 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 또는 람다(λ)를 말할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 잘 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 경쇄 가변 영역을 말한다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 상호 교환하여 사용되며 항체의 중쇄 가변 영역을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호 교환이 가능하다. 불변 영역은 항체 부분, 예를 들어 항체와 항원의 결합에는 직접 수반되지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낼 수 있는 경쇄 및/또는 중쇄의 카복시 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 더 보존된 아미노산 서열을 가진다.
"Fc 영역"(단편 결정화가능한 영역), "Fc 도메인" 또는 "Fc"는 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 상에 위치된 Fc 수용체 또는 고전적 보체 시스템의 제1 성분(Clq)과의 결합을 포함하는, 면역글로불린과 숙주 조직 또는 인자의 결합을 매개하는 항체의 중쇄의 C-말단 영역을 말한다. 따라서, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인(예를 들어, CH1 또는 CL)을 제외한 항체의 불변 영역을 포함한다. IgG, IgA 및 IgD 항체 이소타입에서, Fc 영역은 항체의 두 중쇄의 제2(CH2) 및 제3(CH3) 불변 도메인으로부터 유래된, 두 동일한 단백질 단편을 포함한다; IgM 및 IgE Fc 영역은 각 폴리펩타이드 사슬에서 3개의 중쇄 불변 도메인(CH 도메인 2-4)을 포함한다. IgG의 경우, Fc 영역은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3 그리고 Cγ1과 Cγ2 사이의 힌지를 포함한다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 가변적일 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 C226 또는 P230에 있는 아미노산 잔기(또는 이들 두 아미노산 사이의 아미노산)에서부터 중쇄의 카복시-말단까지 늘어나는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 Kabat에 제시된 EU 인덱스를 따른다. 인간 IgG Fc 영역의 CH2 도메인은 대략 아미노산 231에서 대략 아미노산 340까지 연장되고, CH3 도메인은 Fc 영역에서 Cm 도메인의 C-말단 측에 위치되는데, 즉 IgG의 대략 아미노산 341에서부터 대략 아미노산 447까지 연장된다. 본 명세서에 제시된 Fc 영역은 임의의 알로타입 변이체를 포함하는 자생 서열 Fc 또는 변이체 Fc(예를 들어, 비-자연 발생 Fc)일 수 있다. 또한, Fc는 "Fc 융합 단백질"(예를 들어, 항체 또는 면역접합체)라고도 하는 "Fc 영역을 포함하는 결합 단백질"과 같은 Fc-포함 단백질 폴리펩타이드일 수 있다.
"자생 서열 Fc 영역" 또는 "자생 서열 Fc"는 자연에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 자생 서열 인간 Fc 영역은 자생 서열 인간 IgG1 Fc 영역; 자생 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 자생 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 자생 서열 인간 IgG4 Fc 영역뿐만 아니라 이들의 자연적으로 발생한 변이체를 포함한다. 자생 서열 Fc는 Fes의 다양한 알로타입을 포함한다(예를 들어, Jefferis et al, (2009) mAbs 1:1; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520 (온라인 공개 2014-10-20)).
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 면역글로불린의 Fc 영역에 결합하는 수용체이다. IgG 항체에 결합하는 FcR은 이들 수용체의 대립형질 변이체 및 다른 방식으로 스플라이싱된 형태를 포함하는 FcγR 패밀리의 수용체를 포함한다. FcγR 패밀리는 3개의 활성화 수용체(마우스에서 FcγRI, FcγRIII 및 FcγRIV; 인간에서 FcγRIA, FcγRIIA 및 FcγRIIIA) 및 하나의 억제성(FcγRIIB) 수용체로 구성된다. 인간 IgG1은 대부분의 인간 Fc 수용체에 결합하고 가장 강력한 Fc 이펙터 기능을 도출한다. 인간 IgG4는 결합한 활성화 Fc 수용체의 종류와 관련하여 뮤린 IgG2a와 동등하다고 간주된다. 반면, 인간 IgG4는 최소한의 Fc 이펙터 기능을 도출한다(Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20)).
불변 영역은 하나 이상의 이펙터 기능을 제거하기 위해, 예를 들어 재조합 기술에 의해 조작될 수 있다. "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용, 또는 그로부터의 결과인 생화학적 사건을 말한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Clq 결합, 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, FcγR-매개 이펙터 기능, 예컨대 ADCC 및 항체 의존적 세포-매개 포식작용(ADCP) 및 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향조절을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 수 있는 Fc 영역을 필요로 한다. 따라서, 용어 "Fc 기능이 없는 불변 영역"은 Fc 영역에 의해 매개된 하나 이상의 이펙터 기능이 감소되거나 아예 없는 불변 영역을 포함한다.
항체의 이펙터 기능은 상이한 접근법에 의해 감소되거나 또는 회피될 수 있다. 항체의 이펙터 기능은 Fc 영역을 결여한 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAb와 같은)을 사용하여 감소되거나 또는 회피될 수 있다. 또는, Fc 영역에서 특정 잔기에 결합된 당을 제거하여 소위 말하는 비글리코실화된(aglycosylated) 항체가 생성될 수 있으며, 이로써 Fc 영역의 다른 가치있는 속성(예를 들어, 연장된 반감기 및 헤테로다이머화)은 유지한 채로 항체의 이펙터 기능을 감소시킬 수 있다. 비글리코실화된 항체는, 예를 들어 당이 부착된 잔기의 결실 또는 변경, 효소적 당 제거, 글리코실화 억제제의 존재하에 배양된 세포에서 항체의 생성, 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포(예를 들어, 박테리아 숙주 세포)에서 항체의 발현에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 미국특허공개 No. 20120100140 참조). 다른 접근법은 감소된 이펙터 기능을 가진 IgG 서브클래스로부터 Fc 영역을 이용하는 것이며, 예를 들어 IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3보다 더 낮은 수준의 Fc 이펙터 기능의 갖는 것을 특징으로 한다. Fc 부분의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 가까이 있는 잔기가 항체의 이펙터 기능을 담당하며, 그것은 선천적 면역계의 이펙터 세포 상의 Clq(보체) 및 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 상당히 중첩된 결합 부위를 함유한다(Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20)). 따라서, Fc 이펙터 기능이 감소되거나 없는 항체는, 예를 들어 IgG4 이소타입의 IgG 항체로부터의 CH2 도메인과 IgG1 이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 IgG2로부터의 힌지 영역과 IgG4로부터의 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역(예를 들어, Lau C. et al, J. Immunol. 191 :4769-4777 (2013) 참조), 또는 변경된 Fc 이펙터 기능, 예를 들어 감소되거나 없는 Fc 기능을 가져오는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 생성함으로써 제조될 수 있다. 돌연변이를 가진 이러한 Fc 영역은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에서 인용된 미국출원 및 PCT 출원 및 An et al, mAbs 1:6, 572- 579 (2009) 참조; 이들의 개시내용은 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된다).
"힌지", "힌지 도메인", "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역"은 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결하는 중쇄 불변 영역의 도메인을 말하며, 힌지의 상부, 중앙 및 하부 부분을 포함한다(Roux et al, J. Immunol. 1998 161: 4083). 힌지는 항체의 결합 영역과 이펙터 영역 사이에 다양한 수준의 가요성을 제공하며, 또한 두 중쇄 불변 영역 사이에 분자간 이황화물 결합을 위한 부위를 제공한다. 본 명세서에 제시된 힌지는 모든 IgG 이소타입에 대해 Glu216에서 시작해서 Gly237에서 끝난다(Roux et al, 1998 J Immunol 161: 4083). 야생형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 힌지의 서열은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20) 참조).
용어 "CH1 도메인"은 중쇄 불변 도메인의 힌지와 가변 도메인을 연결하는 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 명세서에 제시된 CH1 도메인은 A118에서 시작해서 V215에서 끝난다. 용어 "CH1 도메인"은 야생형 CH1 도메인뿐만 아니라 자연적으로 존재하는 그것의 변이체들을 포함한다(예를 들어, 알로타입). IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 CH1 도메인 서열(야생형 및 알로타입을 포함)은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al, (1991) 상동 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20) 참조). 예시적인 CH1 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변형하는 도메인을 가진 CH1 도메인을 포함한다(예를 들어 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에서 인용된 미국특허 및 특허공개 및 PCT 공개 참조).
용어 "CH2 도메인"은 중쇄 불변 도메인의 CH3 도메인과 힌지를 연결하는 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 명세서에 제시된 CH2 도메인은 P238에서 시작해서 K340에서 끝난다. 용어 "CH2 도메인"은 야생형 CH2 도메인뿐만 아니라 자연적으로 존재하는 그것의 변이체들을 포함한다(예를 들어, 알로타입). IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 CH2 도메인 서열(야생형 및 알로타입을 포함)은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al, (1991) 상동 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20) 참조). 예시적인 CH2 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기 및/또는 감소된 Fc 이펙터 기능을 변형하는 도메인을 가진 CH2 도메인을 포함한다(예를 들어 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에서 인용된 미국특허 및 특허공개 및 PCT 공개 참조).
용어 "CH3 도메인"은 중쇄 불변 도메인의 CH2 도메인을 향해서 C-말단인 중쇄 불변 영역을 말한다. 본 명세서에 제시된 CH3 도메인은 G341에서 시작해서 K447에서 끝난다. 용어 "CH3 도메인"은 야생형 CH3 도메인뿐만 아니라 자연적으로 존재하는 그것의 변이체들을 포함한다(예를 들어, 알로타입). IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 CH3 도메인 서열(야생형 및 알로타입을 포함)은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al, (1991) 상동 및 Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20) 참조). 예시적인 CH3 도메인은 항체의 생물학적 활성, 예를 들어 반감기를 변형하는 도메인을 가진 CH3 도메인을 포함한다(예를 들어, 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에 인용된 미국특허 및 특허공개 및 PCT 공개 참조).
본 명세서에 제시된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 유형(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 및 IgE 항체)을 말한다.
"알로타입"은 특정한 이소타입 그룹 내에서 자연적으로 발생하는, 몇 개의 아미노산에 차이가 있는 변이체들을 말한다(예를 들어, Jefferis et al, (2009) mAbs 1: 1). 본 명세서에 개시된 항체는 임의의 알로타입을 가질 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 알로타입은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Kabat EA et al, (1991) 상동; Vidarsson G. et al., Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20); 및 Lefranc MP, mAbs 1:4, 1-7 (2009) 참조).
문구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호 교환하여 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에 제시된 "분리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 말한다(예를 들어, FAM19A5에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 FAM19A5 이외의 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나, FAM19A5의 에피토프에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 상이한 종으로부터의 다른 FAM19A5 단백질에 대해 교차 반응성을 가진다.
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그것의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총합 강도를 말한다. 달리 나타내지 않는다면, 본 명세서에 개시된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체와 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 말한다. 분자 X의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)에 의해 표시될 수 있다. 친화성은, 제한은 아니지만 평형 해리 상수(KD) 및 평형 결합 상수(KA)를 포함하는, 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표현될 수 있다. KD는 koff/kon로부터 계산되며 몰 농도(M)로서 표현되고, KA는 kon/koff로부터 계산된다. kon은 항체와 항원의 결합 속도 상수이며, koff는 항체와 항원의 해리이다. kon 및 koff는 면역분석(예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)), BIACORE® 또는 역학적 배제 분석(KinExA)과 같은 당업계에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 용어 "특이적으로 결합한다", "특이적으로 인식한다", "특이적 결합", "선택적 결합" 및 "선택적으로 결합한다"는 항체와 관련하여 유사한 용어들이며, 항원(예를 들어, 에피토프 또는 면역 복합체)에 결합하는 분자(예를 들어, 항체)를 말하고, 이러한 결합은 당업자에 의해 이해되는 대로이다. 예를 들어, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는, 예를 들어 면역분석, BIACORE®, KinExA 3000 기기(Sapidyne Instruments, Boise, ID), 또는 당업계에 공지된 다른 분석에 의해 결정되었을 때 일반적으로 더 낮은 친화성으로, 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 해당 분자가 다른 항원에 결합할 때의 KA보다 적어도 2 logs, 2.5 logs, 3 logs, 4 logs 또는 그 이상의 KA로 항원에 결합한다.
항체는 전형적으로 10-5 내지 10-11 M 이하의 해리 상수(KD)에 의해 반영된, 높은 친화성으로 동족 항원에 특이적으로 결합한다. 약 10-4 M을 초과하는 임의의 KD는 일반적으로 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다. 본 명세서에 제시된 항원에 "특이적으로 결합하는" 항체는 높은 친화성으로 항원 및 실질적으로 동일한 항원에 결합하지만 관련 없는 항원에는 높은 친화성으로 결합하지 않는 항체를 말하며, 높은 친화성이란, 예를 들어 정해진 항원을 사용하여 면역분석(예를 들어, ELISA) 또는 BIACORE 2000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술에 의해 결정되었을 때 10-7 M 이하, 바람직하게 10-8 M 이하, 더욱더 바람직하게 10-9 M 이하 및 가장 바람직하게 10-8 M 내지 10-10 M 이하의 KD를 갖는 것을 의미한다.
본 명세서에 개시된 용어 "항원"은 임의의 천연 또는 합성 면역원성 물질, 예컨대 단백질, 펩타이드 또는 합텐을 말한다. 항원은 FAM19A5 또는 그것의 단편일 수 있다.
본 명세서에 개시된 "에피토프"는 당업계의 용어이며 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소 영역을 말한다. 예를 들어, 에피토프는 폴리펩타이드의 인접 아미노산들일 수 있거나(선형 또는 인접 에피토프) 또는 에피토프는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들의 둘 이상의 비-인접 영역으로부터 함께 합쳐질 수 있다(입체구조적, 비-선형, 불연속, 또는 비-인접 에피토프). 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 항상은 아니지만 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로의 처리시 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20개 아미노산을 독특한 공간적 입체구조로 포함한다. 주어진 항체에 의해 에피토프가 결합되는 방식을 결정하기 위한 방법(즉, 에피토프 맵핑)은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 면역블롯팅 및 면역침전 분석을 포함하며, 본 명세서에서는 중첩 또는 인접 펩타이드(예를 들어, FMAM19A5로부터)가 주어진 항체(예를 들어, 항-FAM19A5 항체)와의 반응성에 대해 시험된다. 에피토프의 공간적 입체구조를 결정하는 방법은 당업계의 기술 및 본 명세서에 제시된 것들, 예를 들어 x-선 결정학, 2-차원 핵자기공명 및 FIDX-MS를 포함한다(예를 들어, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996) 참조).
특정 구체예에서, 항체가 결합하는 에피토프는, 예를 들어 NMR 분광학, x-선 회절 결정학 연구, ELISA 분석, 질량분석법과 결합된 수소/중수소 교환(예를 들어, 액체 크로마토그래피 전기분무 질량분석법), 어레이-기반 올리고펩타이드 스캐닝 분석 및/또는 돌연변이유발 맵핑(예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 맵핑)에 의해 결정될 수 있다. x-선 결정학의 경우, 당업계에 공지된 방법 중 어느 것을 사용하여 결정화가 달성될 수 있다(예를 들어, Giege R et al, (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen E (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303 참조). 항체:항원 결정은 잘 알려진 x-선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, X-PLOR(Yale University, 1992, Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포; 예를 들어, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al; U.S. 2004/0014194 참조), 및 BUSTER(Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276 A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al, (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323)와 같은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 확인할 수 있다. 돌연변이유발 맵핑 연구는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 기술을 포함하는 돌연변이유발 기술에 대한 내용은, 예를 들어 Champe M et al, (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085를 참조한다.
용어 "에피토프 맵핑"은 항체-항원 인식을 위한 분자 결정기를 확인하는 과정을 말한다.
둘 이상의 항체와 관련하여 용어 "동일한 에피토프에 결합한다"는 주어진 방법에 의해 결정되었을 때 항체들이 아미노산 잔기의 동일한 세그먼트에 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 본 명세서에 제시된 항체와 "FAM19A5 상의 동일한 에피토프"에 결합하는지의 여부를 결정하는 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 해당 에피토프의 원자분해능을 제공하는 항원:항체 복합체 결정에 대한 x-선 분석 및 수소/중수소 교환 질량분석법(HDX-MS)을 포함한다. 다른 방법은 항원 단편이나 항원의 돌연변이된 변이형에 대한 항체의 결합을 모니터하며, 이 경우 항원 서열 내에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실이 에피토프 성분의 징표로서 주로 고려된다. 또한, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합방식 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 조합방식 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리로부터 특정한 짧은 펩타이드를 친화성 분리할 수 있는 관심 항체의 능력에 의존한다. 동일한 VH 및 VL 또는 동일한 CDR1, 2 및 3 서열을 가진 항체는 동일한 에피토프에 결합할 것으로 예상된다.
"표적과의 결합에 대해 다른 항체와 경쟁하는" 항체는 나머지 항체와 표적의 결합을 억제하는(부분적으로 또는 완전히) 항체를 말한다. 두 항체가 표적과의 결합에 대해 서로 경쟁하는지의 여부, 즉 하나의 항체가 나머지 항체와 표적의 결합을 억제하는지의 여부 및 그 정도는 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 다른 항체와 표적의 결합에 대해 경쟁하며, 다른 항체와 표적의 결합을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 억제한다. 억제 또는 경쟁의 수준은 항체가 "차단 항체"(즉, 먼저 표적과 함께 인큐베이션되는 냉장 항체)인지에 따라 상이할 수 있다. 경쟁 분석은, 예를 들어 Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harb Protoc; 2006; doi: 10.1101/pdb. prot4277 또는 Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA 1999 "Using Antibodies"의 제11장에 개시된 대로 수행될 수 있다. 경쟁 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프(예를 들어, 입체 장해에 의해 증명된 대로)에 결합한다.
다른 경쟁 결합 분석은 고체상 직접 또는 간접 방사성면역분석(RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(Stahli et al, Methods in Enzymology 9:242(1983) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA(Kirkland et al, J. Immunol. 137:3614(1986) 참조); 고체상 직접 표지 분석, 고체상 직접 표지 샌드위치 분석(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988) 참조); I-125 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA(Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988) 참조); 고체상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (Cheung et al, Virology 176:546 (1990) 참조); 및 직접 표지 RIA(Moldenhauer et al, Scand. J. Immunol. 32:77 (1990) 참조)를 포함한다.
"이중특이적" 또는 "이중기능성" 항체는 두 상이한 중쇄/경쇄 쌍과 두 상이한 결합 부위를 가진 인공 하이브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합을 포함하는 여러 방법에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992) 참조).
본 명세서에 제시된 "단클론성 항체"는 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체 또는 모든 항체가 특정한 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체들의 조합을 말한다. 따라서, 용어 "인간 단클론성 항체"는 단일 결합 특이성을 나타내며, 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역 및 선택적인 불변 영역을 가진 항체 또는 항체 조성물을 말한다. 한 구체예에서, 인간 단클론성 항체는 불멸화된 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스젠 및 경쇄 트랜스젠을 포함하는 게놈을 가진 트랜스제닉 비-사람 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생성된다.
본 명세서에 제시된 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함하며, 예컨대 (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물(예를 들어, 마우스) 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합방식 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열과 다른 DNA 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체가 있다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역을 포함하며, 이들은 점라인 유전자에 의해 암호화된 특정한 인간 점라인 면역글로불린 서열을 이용하지만, 예를 들어 항체 성숙화 동안 일어나는, 후속 재배열 및 돌연변이를 포함한다. 당업계에 공지된 대로(예를 들어, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9): 1117-1125 참조), 가변 영역은 항원 결합 도메인을 함유하고, 외래 항원에 특이적인 항체를 형성하도록 재배열한 다양한 유전자에 의해 암호화된다. 재배열에 더하여, 가변 영역은 외래 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시키기 위해 다수의 단일 아미노산 변화에 의해 더 변형될 수 있다(체세포 돌연변이 또는 초돌연변이). 불변 영역은 항원에 대한 추가의 반응에서 변화할 것이다(즉, 이소타입 스위치). 따라서, 항원에 반응하여 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 폴리펩타이드를 암호화하는 재배열되고 체세포 돌연변이된 핵산 분자는 모 핵산 분자와 서열 동일성을 가질 수는 없지만, 대신 실질적으로 동일하거나 유사할 것이다(즉, 적어도 80% 동일성을 가진다).
"인간" 항체(HuMAb)는 프레임워크와 CDR 영역이 둘 다 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 가진 항체를 말한다. 또한, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 불변 영역도 역시 인간 점라인 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 명세서에 개시된 항체는 인간 점라인 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 본 명세서에 개시된 "인간 항체"는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 점라인으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위에 그래프팅된 항체를 포함하지는 않는다. 용어 "인간" 항체 및 "완전 인간" 항체는 동의어로서 사용된다.
"인간화" 항체는 비-인간 항체의 CDR 도메인 바깥에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 상응하는 아미노산으로 치환된 항체를 말한다. 항체의 인간화 형태의 한 구체예에서, CDR 도메인의 바깥에 있는 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부가 인간 면역글로불린으로부터의 아미노산으로 치환되었고, 하나 이상의 CDR 영역 내의 아미노산의 일부, 대부분 또는 전부는 그대로 유지된다. 아미노산의 작은 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 항체가 특정 항원에 결합하는 능력을 없애지 않는 한 허용될 수 있다. "인간화" 항체는 모 항체와 유사한 항원 특이성을 보유한다.
"키메라 항체"는 가변 영역이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역이 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역이 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역이 인간 항체로부터 유래된 항체를 말한다.
본 명세서에 개시된 용어 "교차 반응한다"는 본 명세서에 제시된 항체가 상이한 종으로부터의 FAM19A5에 결합하는 능력을 말한다. 예를 들어, 인간 FAM19A5에 결합하는 항체는 또한 FAM19A5의 다른 종(예를 들어, 마우스 FAM19A5)에도 결합할 수 있다. 교차 반응성은 결합 분석(예를 들어, SPR, ELISA)에서 정제된 항원과의 특이적 반응성을 검출함으로써, 또는 FAM19A5를 생리적으로 발현하는 세포에 대한 결합 또는 다른 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정될 수 있다. 교차 반응성을 결정하는 방법은 본 명세서에 제시된 표준 결합 분석, 예를 들어 BIACORE® 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 BIACORE® 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 또는 유세포계수 기술을 포함한다.
본 명세서에 개시된 용어 "자연적으로 발생한"은 물체에 적용되었을 때 물체가 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연 공급원으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스를 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 자연적으로 발생한 것이다.
"폴리펩타이드"는 적어도 2개의 구성적으로 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 사슬을 말하며, 사슬의 길이에는 상한이 있다. 단백질에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 제한은 아니지만, 글리코실화, 인산화 또는 이황화물 결합 형성과 같은 변형을 함유할 수 있다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일-다각 또는 이중-가닥일 수 있고, cDNA일 수 있다.
본 명세서에 개시된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 가지 종류는 "플라스미드"이며, 추가의 DNA 세그먼트가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 표준 DNA 루프를 말한다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터이며, 추가의 DNA 세그먼트가 바이러스 게놈에 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)도 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들의 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로서 본 명세서에 제시된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용성을 가진 발현 벡터는 주로 플라스미드의 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 플라스미드는 벡터의 가장 흔히 사용되는 형태이다. 그러나, 동등한 기능을 가진 바이러스 벡터와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 또한 포함된다(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스).
본 명세서에 개시된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 세포에 자연적으로 존재하지 않는 핵산을 포함하는 세포를 말하며, 재조합 발현 벡터가 도입된 세포일 수 있다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 말한다는 것이 이해되어야 한다. 돌연변이나 환경 영향으로 인해 후속 세대에서는 특정한 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 명세서에 개시된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 여전히 포함된다.
본 명세서에 개시된 용어 "연결된"은 둘 이상의 분자의 회합을 말한다. 이 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 연결은 또한 유전적(즉, 재조합 융합)일 수 있다. 이러한 연결은 화학적 콘쥬게이션 및 재조합 단백질 생성과 같은 광범위한 당업계에 인정된 기술을 사용하여 달성될 수 있다.
본 명세서에 개시된 "투여하는"은 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 송달 시스템 중 어느 것을 사용하여, 대상에 치료제 또는 치료제를 포함하는 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 말한다. 본 명세서에 제시된 항체를 위한 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 주사나 주입에 의한 경로를 포함한다. 본 명세서에 개시된 "비경구 투여"는 장 및 국소 투여 이외의 다른 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 것을 의미하며, 제한은 아니지만 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 림프내, 병소내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 기관경유, 피하, 피부밑, 관절내, 낭하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입, 뿐만 아니라 생체내 전기천공을 포함한다. 또는, 본 명세서에 제시된 항체는 비-비경구 경로, 예컨대 국소, 상피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비내, 경구, 질, 직장, 설하 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들어 1회, 여러 번, 및/또는 1회 이상의 연장된 기간에 걸쳐서 수행될 수 있다.
본 명세서 개시된 용어 "치료한다", "치료하는" 및 "치료"는 질환과 관련된 증상, 합병증, 상태 또는 생화학적 지표의 진행, 발생, 심각도 또는 재발의 역전, 경감, 완화, 저해 또는 지연이나 예방의 목적하에 대상에 대해 수행된, 또는 대상에 활성제를 투여하는 임의의 종류의 개입이나 과정을 밀한다. 치료는 질환을 가진 대상 또는 질환을 갖지 않은 대상(예를 들어, 예방을 위해)에 대해 수행될 수 있다.
본 명세서 개시된 용어 "대상"은 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "신경아교증의 개시" 또는 "반응성 신경아교증의 개시"는 신경아교증의 시작 또는 개시를 포함한다. 신경아교증은, 예를 들어 외상, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로부터의 상해나 손상에 반응하여 중추신경계(CNS, 예를 들어 뇌 및/또는 척수)에서 신경교 세포의 비특이적 반응성 변화이며, 성상세포, 소신경교세포 및 희돌기교세포를 포함하는 몇몇 상이한 타입의 신경교 세포의 증식이나 비대를 포함한다. 신경아교증의 개시는 흉터 형성을 초래할 수 있고, 외상이나 상해를 입은 CNS의 부분에서 축삭돌기 재생을 저해한다. 신경아교증 개시의 유해한 효과는 신경에 대한 비가역적이거나 영구적인 손상 및/또는 주변 뉴런의 회복 방지를 포함한다. 따라서, 용어 "신경아교증의 개시를 지연한다" 및 "반응성 신경아교증의 개시를 지연한다"는 신경아교증의 시작이나 개시 및 CNS에 대한 그것의 관련된 유해한 효과를 저해, 지연, 억제 또는 방지하는 것을 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "반응성 성상세포의 과도한 증식"은, 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 근처 뉴런의 파괴로 인해 성상세포의 수가 비정상적으로 증가하는 것을 포함한다. 반응성 성상세포의 과도한 증식은 외상이나 상해를 입은 CNS의 부분에서 축삭돌기 재생을 저해하는 흉터 형성, 염증의 악화, 신경독성 수준의 반응성 산소 종의 생성 및 방출, 잠재적 흥분독성 글루타메이트의 방출, 발작 발생에 대한 잠재적 기여, 혈관-뇌 장벽 기능의 손상, 외상 및 뇌졸중 동안 세포독성 부종, 만성 통증에 기여할 수 있는 성상세포의 만성적 사이토카인 활성화에 대한 가능성 및 CNS 상해 후 이차적 변성을 포함하는 CNS에서의 유해한 효과를 초래할 수 있다(Sofroniew, Michael V.(2009) Trends in Neurosciences, 32(12):638-47; McGraw, J. et al. (2001) Journal of Neuroscience Research 63(2): 109-15; and Sofroniew, M. V. (2005) The Neuroscientist 11(5): 400-7 참조). 따라서, 용어 "반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제한다"는 반응성 성상세포의 과도한 또는 비정상적인 증식 및 CNS에 대한 그것의 관련된 유해한 효과의 저해, 지연, 억제, 제한 또는 예방하는 것을 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸"은 단백질 코어와 콘드로이틴 설페이트로 이루어진 프로테오글리칸을 포함한다. CSPG라고도 알려진 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸은 발생중인 CNS와 성체 CNS를 통틀어서 광범위하게 발현된 세포외 바탕질 분자이다. CSGP는 신경 발생 및 신경교 흉터 형성에서 핵심적 역할을 하며, CNS의 상해 후 축삭돌기 재생을 저해한다. 공지된 CSPG는 아그레칸(CSPG1), 베르시칸(CSPG2), 뉴로칸(CSPG3), CSPG4(또는 뉴런-신경교 항원 2(NG2)), CSPG5, SMC3(CSPG6, 염색체 구조 유지 3), 브레비칸(CSPG7), CD44(CSPG8, 분화 클러스터 44) 및 포스파칸뉴로칸(CSPG3)을 포함한다(Rhodes, K. E. and Fawcett, J. W. (2004) Journal of Anatom. 204(l):33-48 참조). 따라서, 용어 "콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 감소시킨다"는 하나 이상의 CSGP의 수준을 저하, 저해, 감소시키거나, 또는 하나 이상의 CSGP의 활성을 감소시키거나 비활성 시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 이 용어는 뉴로칸, NG2, 또는 이 둘 다의 수준을 저하, 저해, 감소시키는 것을 포함하거나, 또는 뉴로칸, NG2, 또는 이둘 다의 활성을 감소시키거나 비활성 시키는 것을 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "뉴런"은 전기 신호 및 화학 신호를 통해서 정보를 가공하고 전송하는 전기적으로 여기가능한 세포를 포함한다. 뉴런은 CNS의 뇌 및 척수, 및 말초신경계(PNS)의 신경교의 주요 성분이며, 서로 연결되어 신경망을 형성할 수 있다. 전형적인 뉴런은 신경세포체(소마), 수상돌기 및 축삭돌기로 이루어진다. 뉴런의 소마(신경세포체)는 핵을 함유한다. 뉴런의 수상돌기는 많은 분지를 가진 세포 연장부며, 대부분의 뉴런 입력이 발생한다. 축삭돌기는 소마로부터 연장된 더 미세한 케이블형 보호부이며, 소마로부터 떨어진 곳의 신경 신호를 운반하고 특정한 종류의 정보를 소마로 다시 운반한다. 용어 "뉴런의 재성장을 촉진한다"는 바람직하게는 상해 또는 손상 후, 뉴런의 성장을 자극, 촉진, 증가 또는 활성화하는 것을 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "c-fos"는 전암유전자 c-fos를 포함하며, 신경전달물질의 자극에 의해 빠르게 유도되고, 마우스 및 인간을 포함하는 많은 종에 존재한다. c-fos 유전자 및 단백질은 공지 및 특성화되어 있다(Curran, T, The c-fos proto-oncogene, pp 307-327(The Oncogene Handbook, Reddy EP et al., (eds.) Elsevier)(1988) 참조). c-fos의 발현은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 노던 블롯, 정량 PCR 또는 면역조직화학에 의해 결정될 수 있다. 용어 "c-fos의 발현을 증가시킨다"는 c-fos mRNA, c-fos 단백질 또는 c-fos 단백질 활성의 수준의 증가를 포함한다.
본 명세서 개시된 용어 "pERK"는 인산화된 세포외 신호-조절 키나아제를 포함한다. 세포외 신호-조절 키나아제 또는 ERK1 및 ERK2을 포함하는 ERK는 미토겐-활성화 단백질 키나아제(MAPK) 패밀리의 구성원이다. ERK는 상류 키나아제에 의한 인산화를 통해 활성화됨으로써 pERK를 형성하며, 이어서 하류 표적을 활성화한다. ERK는 학습, 및 기억 및 통증 과민증의 기초가 되는 신경 및 시냅스성 가소성에 수반된다(Ji R.R. et al, Nat Neurosci (1999) 2: 1114-1119 참조). ERK 유전자, 단백질, 인산화 및 활성화는 공지 및 특성화되어 있고, ERK 및 pERK의 발현은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 노던 블롯, 정량 PCR 또는 면역조직화학)에 의해 결정될 수 있다(Gao Y. J. and Ji R. R., Open Pain J. (2009) 2: 11-17 참조). 용어 "pERK의 발현을 증가시킨다"는 ERK mRNA, ERK 단백질 또는 pERK 활성의 수준의 증가를 포함한다.
"성장 관련 단백질 43"이라고도 알려진 본 명세서에 개시된 용어 "GAP43"은 신경돌기 형성, 재생 및 가소성을 촉진하는 신경 조직-특이적 단백질이다(Benowitz L. I. and Routtenberg A.(1997) Trends in Neurosciences 20 (2):84-91; Aarts L. H. et al,(1998) Advances in Experimental Medicine and Biology 446:85-106 참조). 인간 GAP43은 GAP43 유전자에 의해 암호화된다. 인간GAP43 폴리펩타이드 서열(UniProt: KB - P17677)과 이 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 서열은 당업계에 공지되어 있다(Kosik K. S. et al, (1988) Neuron 1(2): 127-32; Ng S. C. et al, (1988) Neuron 1(2): 133-9 참조). GAP43의 발현은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 노던 블롯, 정량 PCR 또는 면역조직화학)에 의해 결정될 수 있다. 용어 "뉴런에서 GAP43을 증가시킨다"는 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 수준의 증진 또는 증가, 또는 GAP43 단백질의 활성의 증가를 포함한다.
본 명세서에 개시된 용어 "치료적 유효량"은 대상의 질환 또는 장애를 "치료"하거나 또는 질환 또는 장애(예를 들어, 중추신경계 손상)의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키는데 효과적인, 단독 또는 다른 치료제와 조합된, 약물의 양을 말한다. "치료적 유효량"은 질환 또는 장애(예를 들어, 외상성 뇌 상해와 같은 중추신경계 손상 또는 본 명세서에 개시된 다른 질환)를 갖고 있거나 가질 위험이 있는 대상에 일부 개선이나 이익을 제공하는 약물 또는 치료제의 양을 포함한다. 따라서, "치료적 유효"량은 질환 또는 장애의 위험, 잠재성, 가능성 또는 발생을 감소시키거나 또는 일부 경감, 완화를 제공하고 및/또는 적어도 하나의 표시자(예를 들어, 바능성 신경아교증의 개시)를 감소시키고 및/또는 질환 또는 장애의 적어도 하나의 임상 증상을 감소시키는 양이다.
II. 항-FAM19A5 항체
특정한 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 하는 항체, 예를 들어 단클론성 항체가 개시된다. 예를 들어, 항체는 가용성 FAM19A5 및 막 결합된 FAM19A5를 포함하는, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 가용성 및/또는 막 결합된 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 것에 더하여, 본 명세서에 제시된 항체는 다음의 기능적 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 결합한다;
(b) ELISA에 의해 측정되었을 때 10 nM 이하의 KD로 막 결합된 인간 FAM19A5에 결합한다;
(c) 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연 및/또는 예방한다;
(d) 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제한다;
(e) 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 감소시킨다;
(f) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현을 증가시킨다;
(g) 뉴런의 생존을 촉진한다;
(h) 뉴런에서 GAP43의 발현을 증가시킨다; 및
(i) 축삭돌기의 재성장을 촉진한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 높은 친화성으로, 예를 들어 10-7 M 이하, 10-8 M 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M(0.1 nM) 이하, 10-11 M 이하 또는 10-12 M 이하, 예를 들어, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M 또는 10-9 M 내지 10-7 M, 예를 들어, 10-12 M, 5 X 10-12 M, 10-11 M, 5 X 10-11 M, 10-10 M, 5 X 10-10 M, 10-9 M, 5 X 10-9 M, 10-8 M, 5 X 10-8 M, 10-7 M 또는 5 X 10-7 M의 KD로 가용성 인간 FAM19A5 또는 막-결합된 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 다양한 종의 인간 FAM19A5를 향한 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯, 및 RIA를 포함한다. 적합한 분석은 실시예에 상세히 설명된다. 항체의 결합 동력학(예를 들어, 결합 친화성)도 ELISA, BIACORE® 분석 또는 KinExA와 같은 당업계에 공지된 표준 분석에 의해 평가될 수 있다. FAM19A5의 기능적 특성(예를 들어, 리간드 결합)에 대한 항체의 효과를 평가하는 분석은 아래 및 실시예에 더 상세히 설명된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 ELISA에 의해 결정되었을 때, 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 10 nM 이하, 예를 들어, 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM 또는 5 내지 10 nM의 KD로 가용성 FAM19A5에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 ELISA에 의해 결정되었을 때, 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, or 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM 또는 90 nM의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 ELISA에 의해 결정되었을 때, 10-7 M 이하, 10-8 M(10 nM) 이하, 10-9 M(1 nM) 이하, 10-10 M 이하, 10-12 M 내지 10-7 M, 10-11 M 내지 10-7 M, 10-10 M 내지 10-7 M, 10-9 M 내지 10-7 M 또는 10-8 M 내지 10-7 M의 KD로 막-결합된 인간 FAM19A5에 결합한다. 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 ELISA에 의해 결정되었을 때 10 nM 이하, 예를 들어, 0.1 내지 10 nM, 0.1 내지 5 nM, 0.1 내지 1 nM, 0.5 내지 10 nM, 0.5 내지 5 nM, 0.5 내지 1 nM, 1 내지 10 nM, 1 내지 5 nM 또는 5 내지 10 nM의 KD로 막-결합된 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 ELISA에 의해 결정되었을 때, 약 1 pM, 2 pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 20 pM, 30 pM, 40 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 200 pM, 300 pM, 400 pM, 500 pM, 600 pM, 700 pM, 800 pM 또는 900 pM, 또는 약 1 nM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, or 9 nM, 또는 약 10 nM, 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM 또는 90 nM의 KD로 막-결합된 인간 FAM19A5에 결합한다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 신경아교증의 개시를 지연하거나 저해할 수 있으며, 예를 들어 외상, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 상해 또는 손상에 반응하여 중추신경계(CNS, 예를 들어 뇌 및/또는 척수)에서 신경교 세포의 비특이적 반응성 변화의 개시나 시작을 저지, 지연 또는 억제할 수 있다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 반응성 성상세포의 과도한 또는 비정상적 증식 및 CNS에 대한 그것의 관련된 유해한 효과를 저지, 저해, 지연, 억제, 제한 또는 방지할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로 인한 뉴런의 파괴로 인한 성상세포의 수의 비정상적 증가를 저해 또는 방지할 수 있고, CNS에서 흉터 형성을 저해 또는 방지할 수 있고, 신경독성 수준의 반응성 산소 종의 방출 또는 잠재적 흥분독성 글루타메이트의 방출을 저해 또는 감소시킬 수 있고, 발작, 통증 및/또는 CNS 상해 후 2차 퇴행을 감소 또는 저해할 수 있다. 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 바람직하게는 CNS 상해 또는 손상 후, 뉴런 및/또는 축삭돌기의 재성장을 촉진, 자극, 증가 또는 활성화할 수 있다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 단백질 코어 및 콘드로이틴 설페이트(CSGPs), 예컨대 아그레칸(CSPG1), 베르시칸(CSPG2), 뉴로칸 (CSPG3), CSPG4(또는 뉴런-신경교 항원 2(NG2)), CSPG5, SMC3(CSPG6, 염색체 구조 유지 3), 브레비칸(CSPG7), CD44(CSPG8, 분화 클러스터 44) 및 포스파칸뉴로칸 (CSPG3)으로 이루어진 프로테오글리칸을 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현을 저해할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 뉴로칸 및/또는 NG2의 수준, 또는 뉴로칸 및/또는 NG2의 활성을 저해, 저하 또는 감소시킨다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK의 발현을 증가시킬 수 있으며, 예를 들어 c-fos 및 pERK의 mRNA, 단백질 및/또는 단백질 활성을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 GAP43 mPNA, GAP43 단백질의 발현 수준을 증가 또는 증진시키거나, 또는 GAP43 단백질 활성을 증가 또는 증진시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 인간 FAM19A5 에피토프와의 결합에서 본 명세서에 개시된 CDR 또는 가변 영역을 포함하는 항-FAM19A5 항체와 상호 경쟁한다(또는 결합을 저해한다). 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 기준 항체의 결합을 저해하며, (1) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하며; (2) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 29, 30, 31을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 32, 33, 34를 포함하며; (3) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 35, 36, 37을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 38, 39, 40을 포함하며; (4) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 41, 42, 43을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 44, 45, 46을 포함하며; (5) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 47, 48, 49를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 50, 51, 52를 포함하며; (6) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 53, 54, 55를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 56, 57, 58을 포함하며; (7) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 59, 60, 61을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 62, 63, 64를을 포함하며; (8) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 65, 66, 67을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 68, 69, 70을 포함하며; (9) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 71, 72, 73을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 74, 75, 76을 포함하며; (10) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 77, 78, 79를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 80, 81, 82를 포함하며; (11) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 83, 84, 85를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 86, 87, 88을 포함하며; 또는 (12) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 89, 90, 91을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 92, 93, 94를 포함한다.
일부 구체예에서, 기준 항체는 (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (3) SEQ ID NO: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (4) SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 인간 FAM19A5에 대한 이러한 기준 항체의 결합을 저해한다. 경쟁하는 항체들은 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 인접 에피토프(예를 들어, 입체 장해에 의해 증명된 대로)에 결합한다. 2개의 항체가 표적에 대한 결합에 대해 서로 경쟁하는지의 여부는 RIA 및 EIA와 같은 당업계에 공지된 경쟁 실험을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 본 명세서에 개시된 기준 항체와 동일한 FAM19A5 에피토프에 결합하며, (1) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하며; (2) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 29, 30, 31을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 32, 33, 34를 포함하며; (3) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 35, 36, 37을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 38, 39, 40을 포함하며; (4) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 41, 42, 43을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 44, 45, 46을 포함하며; (5) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 47, 48, 49를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 50, 51, 52를 포함하며; (6) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 53, 54, 55를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 56, 57, 58을 포함하며; (7) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 59, 60, 61을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 62, 63, 64를 포함하며; (8) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 65, 66, 67을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 68, 69, 70을 포함하며; (9) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 71, 72, 73을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 74, 75, 76을 포함하며; (10) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 77, 78, 79를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 80, 81, 82를 포함하며; (11) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 83, 84, 85를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 86, 87, 88을 포함하며; 또는 (12) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 89, 90, 91을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 92, 93, 94를 포함한다.
일부 구체예에서, 기준 항체는 (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (3) SEQ ID NO: 104를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (4) SEQ ID NO: 105를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는 (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
2개의 항체가 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위한 기술은, 예를 들어 에피토프 맵핑 방법, 예컨대 에피토프의 원자 분해능을 제공하는 항원-항체 복합체의 결정의 x-선 분석 수소/중수소 교환 질량분광법(HDX-MS), 항원 단편 또는 항원의 돌연변이된 변이형에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 방법, 항원 서열 내에서 아미노산 잔기의 변형으로 인한 결합의 상실이 에피토프 성분의 표지로서 주로 간주되는 경우, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법을 포함한다.
본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은, 예를 들어 인간 FAM19A5의 단편에 항체의 결합에 의해 결정되었을 때, 성숙한 인간 FAM19A5의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 CDMLPCLEGEGCDLLINRSG(SEQ ID NO: 2, 에피토프 F5, 실시예 10, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 90 내지 109)의 아미노산 서열을 가진 적어도 하나의 에피토프에 결합하거나, 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99 내지 107(즉, EGCDLLINR)에 결합한다. 특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99, 100, 102, 103, 105, 및 107(즉, EG-DL-I-R)에 결합한다. 다른 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 102, 103, 105, 및 107(즉, DL-I-R)에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 4의 99, 100, 및 107(즉, EG------R)에 결합한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프는 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 2인, 인간 FAM19A5 에피토프에만, 또는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 2의 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가진 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 그것의 자생 입체구조에서(즉, 비-변성) SEQ ID NO: 2 또는 그것의 단편에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 글리코실화된 및 비글리코실화된 인간 FAM19A5에 모두 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프에 더 결합한다. 따라서, 특정한 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NO: 2의 에피토프 및 추가의 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프는
QFLKEGQLAAGTCEIVTLDR(SEQ ID NO: 13, 에피토프 F1),
TLDRDSSQPRRTiARQTARC(SEQ ID NO: 14, 에피토프 F2),
TARCACRKGQIAGTTRARPA(SEQ ID NO: 15, 에피토프 F3),
ARPACVDARIIKTKQWCDML(SEQ ID NO: 16, 에피토프 F4), 또는
NRSGWTCTQPGGRIKTTTVS(SEQ ID NO: 17, 에피토프 F6), 또는 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열 내에 위치된 단편은 SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17 중 어느 것의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가진 단편을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열 내에 위치된 단편, 예를 들어 SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 아미노산을 가진 단편, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 그것의 자생 입체구조(즉, 비-변성)에서 하나 이상의 추가의 에피토프 중 어느 것과 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 하나 이상의 추가의 FAM19A5 에피토프의 글리코실화된 것 및 비글리코실화된 것과 결합한다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP6, EP7, 또는 EP8로서 확인된 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, EP6은 아미노산 KTKQWCDML(SEQ ID NO: 139)를 포함하고, EP7은 아미노산 GCDLLINR(SEQ ID NO: 140)을 포함하고, EP8은 아미노산 TCTQPGGR(SEQ ID NO: 141)을 포함한다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 에피토프는 EP6, EP7 또는 EP8과 적어도 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP6, EP7 또는 EP8에만 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP6, EP7 및 EP8에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP7 및 EP8에 결합한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 EP7에 결합한다.
특정 구체예에서, 예를 들어 면역분석(예를 들어, ELISA), 표면 플라즈몬 공명 또는 역학적 배제 분석에 의해 측정되었을 때 FAM19A 패밀리의 다른 분자에 대한 것보다 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 더 높은 친화성으로 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 제공된다. 특정 구체예에서, 예를 들어 면역분석에 의해 측정되었을 때 FAM19A 패밀리의 다른 분자와 교차 반응성을 갖지 않는 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 결합하는 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 제공된다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 자생 항체가 아니거나 또는 자연적으로 발생한 항체가 아니다. 예를 들어, 항-FAM19A5 항체는 번역 후 변형이 더 많거나, 더 적거나 또는 상이한 타입인 것과 같은, 자연적으로 발생한 항체와는 상이한 번역 후 변형을 가진다.
III. 예시적인 항-FAM19A5 항체
본 명세서에 제시된 특정한 항체는 항체 1-65, P2-C12, 13B4, 13F7, 15A9, P1-A03, P1-A08, P1-F02, P2-A01, P2-A03, P2-F07 또는 P2-F1의 CDR 및/또는 가변 영역 서열을 가진 항체, 예를 들어 단클론성 항체, 뿐만 아니라 이들의 가변 영역 또는 CDR 서열에 적어도 80% 동일성(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 동일성)을 가진 항체이다. 본 발명의 항-FAM19A5 항체의 VH 및 VL 아미노산 서열은 각각 표 2 및 3에 제시된다.
[표 2]
가변 중쇄 CDR 아미노산 서열
Figure 112021151826965-pat00003
[표 3]
가변 경쇄 CDR 아미노산 서열
Figure 112021151826965-pat00004
[표 4]
가변 중쇄 아미노산 서열
Figure 112021151826965-pat00005
[표 5]
가변 경쇄 아미노산 서열
Figure 112021151826965-pat00006
따라서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 개시되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 5 또는 103-113의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NOs: 5 또는 103-113으로 구성되는 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 개시되며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 6 또는 114-124의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NOs: 6 또는 114-124로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
특정 구체예에서, 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 SEQ ID NOs: 5 또는 103-113으로 구성되는 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역의 CDR 및 SEQ ID NOs: 6 또는 114-124로 구성되는 군으로부터 선택된 경쇄 가변 영역의 CDR을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분이 개시되며,
(i) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 포함하며;
(ii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 114의 아미노산 서열을 포함하며;
(iii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 104의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 115의 아미노산 서열을 포함하며;
(iv) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 116의 아미노산 서열을 포함하며;
(v) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 106의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 117의 아미노산 서열을 포함하며;
(vi) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 107의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 118의 아미노산 서열을 포함하며;
(vii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 108의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 119의 아미노산 서열을 포함하며;
(viii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 120의 아미노산 서열을 포함하며;
(ix) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 110의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 121의 아미노산 서열을 포함하며;
(x) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 111의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 122의 아미노산 서열을 포함하며;
(xi) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 112의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 123의 아미노산 서열을 포함하며; 및
(xii) 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 113의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 124의 아미노산 서열을 포함한다.
중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 개시되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 5 또는 103-113에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 개시되며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 6 또는 114-124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분이 개시되며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 5 또는 103-113에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NOs: 6 또는 114-124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명은 분리된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 제공하며, 이것은
(a) SEQ ID NOs: 5 및 6을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(b) SEQ ID NOs: 103 및 114을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(c) SEQ ID NOs: 104 및 115을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(d) SEQ ID NOs: 105 및 116을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(e) SEQ ID NOs: 106 및 117을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(f) SEQ ID NOs: 107 및 118을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(g) SEQ ID NOs: 108 및 119을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(h) SEQ ID NOs: 109 및 120을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(i) SEQ ID NOs: 110 및 121을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(j) SEQ ID NOs: 111 및 122을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열;
(k) SEQ ID NOs: 112 및 123을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열; 또는
(l) SEQ ID NOs: 113 및 124을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열
을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 (i) 1-65의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 1-65의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (ii) P2-C12의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P2-C12의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (iii) 13B4의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 13B4의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (iv) 13F7의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 13F7의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (v) 15A9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 15A9의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (vi) P1-A03의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P1-A03의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (vii) P1-A08의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P1-A08의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (viii) P1-F02의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P1-F02의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (ix) P2-A01의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P2-A01의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (x) P2-A03의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P2-A03의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; (xi) P2-F07의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P2-F07의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합; 또는 (xii) P2-F11의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 조합, 및/또는 P2-F11의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 명세서에 개시된 상이한 항-FAM19A5 항체에 대한 VH CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은 표 2에 제시된다. 본 명세서에 개시된 상이한 항-FAM19A5 항체에 대한 VL CDR1, CDR2, 및 CDR3의 아미노산 서열은 표 3에 제시된다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 29의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 30의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 31의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 32의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 33의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 34의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 35의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 36의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 38의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 41의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 42의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 43의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 44의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 45의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 46의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 49의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 50의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 51의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 52의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 53의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 54의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 55의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 56의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 59의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 60의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 62의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 63의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 64의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 67의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 68의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 69의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 71의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 72의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 73의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 74의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 75의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 76의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 77의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 78의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 79의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 80의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 81의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 82의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 83의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 84의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 85의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 86의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 87의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 88의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VH CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1; 및/또는
(b) SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(c) SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 VL CDR 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 포함한다.
일부 구체예에서, 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은:
(a) SEQ ID NO: 89의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1;
(b) SEQ ID NO: 90의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2;
(c) SEQ ID NO: 91의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3;
(d) SEQ ID NO: 92의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1;
(e) SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2; 및/또는
(f) SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3
을 포함한다.
특정 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 상기 CDR들 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개를 포함한다.
본 명세서에 제시된 VH 도메인 또는 그것의 하나 이상의 CDR은 중쇄, 예를 들어 전장 중쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 제시된 VL 도메인 또는 그것의 하나 이상의 CDR은 경쇄, 예를 들어 전장 경쇄를 형성하기 위해 불변 도메인에 연결될 수 있다. 전장 중쇄와 전장 경쇄는 조합되어 전장 항체를 형성할 수 있다.
따라서, 특정 구체예에서, 항체 경쇄 및 중쇄, 예를 들어 분리된 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체가 본 명세서에 제시된다. 경쇄와 관련하여, 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄는 카파 경쇄이다. 다른 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄는 람다 경쇄이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다. 특정 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 임의의 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 경쇄의 불변 영역은 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 VL 또는 VL CDR 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하며, 경쇄의 불변 영역은 인간 람다 경쇄 부련 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적 예들은 당업계에 공지되어있다(예를 들어, 미국특허 No. 5,693,780 및 Kabat EA et al, (1991)(상동)을 참조).
중쇄와 관련하여, 일부 구체예에서 본 명세서에 제시된 항체의 중쇄는 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄일 수 있다. 다른 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체의 중쇄는 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε), 감마(γ) 또는 뮤(μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 중쇄의 불변 영역은 인간 감마(γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 VH 또는 VH CDR 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하며, 중쇄의 불변 영역은 본 명세서에 제시되거나 당업계에 공지된 인간 중쇄의 아미노산을 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비제한적 예들은 당업계에 공지되어있다(예를 들어, 미국특허 No. 5,693,780 및 Kabat EA et al, (1991)(상동)을 참조).
일부 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 VH 또는 VH CDR 및 VL 및 VL CDR을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자, 또는 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 구체예에서, FAM19A5 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 제시된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며, 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 및 IgA2)의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4), 및 알로타입(예를 들어, G1m, G2m, G3m 및 nG4m) 및 그것의 변이체를 포함하는, 자연적으로 발생한 인간 IgG의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다(예를 들어, Vidarsson G. et al. Front Immunol. 5:520(온라인 공개 2014-10-20), 및 Jefferis R. 및 Lefranc MP, mAbs 1:4, 1-7(2009) 참조). 일부 구체예에서, 불변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 또는 그것의 변이체의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 Fc 이펙터 기능, 예를 들어 보체-의존적 세포독성(CDC) 및/또는 항체-의존적 세포 포식작용(ADCP)를 갖지 않는다. 이펙터 기능은 Fc 영역에 의해 매개되며, Fc 영역의 CH2 도메인에서 힌지 영역에 가장 가까이 있는 잔기가 항체의 이펙터 기능을 담당하고, 선천적 면역계의 이펙터 세포 상에서 Clq(보체)와 IgG-Fc 수용체(FcγR)에 대해 상당히 중첩된 결합 부위를 함유한다. 또한, IgG2 및 IgG4 항체는 IgG1 및 IgG3 항체보다 더 낮은 수준의 Fc 이펙터 기능을 가진다. 항체의 이펙터 기능은 당업계에 공지된 상이한 접근법에 의해 감소되거나 회피될 수 있으며, (1) Fc 영역을 결여한 항체 단편의 사용(예를 들어, Fab, F(ab')2, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAB); (2) 당이 부착된 잔기의 결실 또는 변경, 효소적으로 당의 제거, 글리코실화 억제제의 존재하에 배양된 세포에서 항체의 생성, 또는 단백질을 글리코실화할 수 없는 세포에서 항체의 발현에 의해 생성될 수 있는, 비글리코실화된 항체의 생성(예를 들어, 박테리아 숙주 세포, 미국특허공개 No. 20120100140 참조); (3) 감소된 이펙터 기능을 가진 IgG 서브클래스로부터 Fc 영역의 이용(예를 들어, IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 Fc 영역 또는 IgG2 또는 IgG4 항체로부터의 CH2 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 미국특허공개 No. 20120100140 및 Lau C. et al, J. Immunol. 191: 4769-4777 (2013) 참조); 및 (4) 감소된 Fc 기능을 가져오거나 Fc 기능을 없애는 돌연변이를 가진 Fc 영역의 생성(예를 들어, 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에 인용된 미국출원 및 PCT 출원 및 An et al, mAbs 1:6, 572-579 (2009) 참조);을 포함한다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 단쇄 Fv(scFv), 또는 모노머 VH 또는 VL 도메인으로 구성된 sdAb이다. 이러한 항체 단편은 당업계에 잘 공지되어 있으며 본 명세서에 개시되어 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖거나 Fc 이펙터 기능을 갖지 않는 Fc 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, 불변 영역은 인간 IgG2 또는 IgG4의 Fc 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 IgG2/IgG4 이소타입을 가진다. 일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체는 IgG4 이소타입의 IgG 항체로부터의 CH2 도메인 및 IgG1 이소타입의 IgG 항체로부터의 CH3 도메인을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 IgG2로부터의 힌지 영역 및 IgG4로부터의 CH2 영역을 포함하는 키메라 Fc 영역, 또는 감소된 Fc 기능을 가져오거나 Fc 기능을 없애는 돌연변이를 가진 Fc 영역을 포함한다. 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖거나 Fc 이펙터 기능을 갖지 않는 Fc 영역은 당업계에 공지된 것들을 포함한다(예를 들어, Lau C. et al, J. Immunol. 191: 4769-4777 (2013); An et al, mAbs 1: 6, 572-579 (2009); 및 미국특허공개 No. 20120100140 및 이 문헌에 인용된 미국특허 및 특허공개 및 PCT 공개 참조). 또한, 감소된 Fc 이펙터 기능을 갖거나 Fc 이펙터 기능을 갖지 않는 Fc 영역은 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다.
IV. 핵산 분자
본 명세서에 개시된 다른 양태는 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분 중 임의의 하나를 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자에 관한 것이다. 핵산은 전체 세포에, 세포 세포용해물에, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 다른 세포 성분이나 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 핵산(예를 들어, 다른 염색체 DNA, 예컨대 분리된 DNA에 연결된 염색체 DNA) 또는 단백질로부터 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 제한 효소, 아가로오스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 공지된 다른 기술을 포함하는 표준 기술에 의해 정제되었을 때 "분리되거나" 또는 "실질적으로 순수하게 된다"(예를 들어, F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York 참조). 본 명세서에 제시된 핵산은, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 인트론 서열을 함유할 수 있거나 또는 함유할 수 없다. 특정 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.
본 명세서에 제시된 핵산은 표준 분자생물학 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 아래 더 상세히 설명된 대로 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스제닉 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 제조된 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻어질 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(예를 들어, 파지 디스플레이 기술을 사용한)로부터 얻어진 항체의 경우, 항체를 암호화하는 핵산은 라이브러리로부터 회수될 수 있다.
본 명세서에 제시된 특정한 핵산 분자는 본 발명의 항-FAM19A5 항체의 VH 및 VL 서열을 암호화하는 것들이다. VH 및 VL 서열을 암호화하는 예시적인 DNA 서열은 각각 표 6 및 7에 제시된다.
[표 6]
가변 중쇄 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure 112021151826965-pat00007
[표 7]
가변 경쇄 폴리뉴클레오타이드 서열
Figure 112021151826965-pat00008
본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체를 제조하는 방법은 신호 펩타이드, 예를 들어 SEQ ID NO: 18 및 19를 각각 가진 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 셀라인에서 중쇄 및 경쇄를 발현하는 것을 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 숙주 세포는 본 발명에 포함된다.
VH 및 VL 세그먼트를 암호화하는 DNA 단편이 얻어지면, 이들 DNA 단편은 표준 재조합 DNA 기술에 의해, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 전환하도록 더 조작될 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 암호화하는 다른 DNA 단편에 작동 가능하게 연결된다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 두 DNA 단편에 의해 암호화된 아미노산 서열이 프레임 내에 유지되도록 두 DNA 단편이 이어지는 것을 의미한다.
VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역(힌지, CH1, CH2 및/또는 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자와 작동 가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 dnA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역, 예를 들어 IgG2 및/또는 IgG4 불변 영역일 수 있다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA는 VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동 가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(뿐만 아니라 Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있으며(예를 들어, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 얻어질 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편이 가요성 링커를 암호화하는, 예를 들어 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동 가능하게 연결되며, 이로써 VH 및 VL 서열은 VL 영역과 VH 영역이 가요성 링커에 의해 이어진 인접 단쇄 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 참조).
일부 구체예에서, 본 발명은 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 다른 구체예에서, 벡터는 유전자 치료요법에 사용될 수 있다.
본 발명을 위한 적합한 벡터는 발현 벡터, 바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함한다. 한 구체예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 명세서에 제시된 발현 벡터는 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 임의의 핵산 구성물을 말하거나, 또는 RNA 바이러스 벡터의 경우, 적절한 숙주 세포에 도입되었을 때, 복제 및 번역에 필요한 요소를 말한다. 발현 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항체 또는 그것의 항원 결합 부분에 대한 코딩 서열은 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 두 핵산 서열은 이들이 각 성분 핵산 서열이 그것의 기능성을 유지하도록 허용하는 방식으로 공유 연결되었을 때 작동 가능하게 연결된다. 코딩 서열과 유전자 발현 제어 서열은 이들이 유전자 발현 제어 서열의 영향이나 제어하에 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 수행할 수 있는 방식으로 공유 연결되었을 때 작동 가능하게 연결되었다고 한다. 두 DNA 서열은 5' 유전자 발현 서열에 프로모터의 도입이 코딩 서열의 전사를 가져오고 두 DNA 서열 간 결합의 성질이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 가져오지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, 또는 (3) 단백질로 번역되는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면 작동 가능하게 연결되었다고 한다. 따라서, 유전자 발현 서열은 이 유전자 발현 서열이 해당 코딩 핵산 서열의 전사를 행할 수 있었다면 코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이며, 이로써 전사체는 원하는 항체 또는 그것의 항원 결합 부분으로 번역된다.
바이러스 벡터는 제한은 아니지만, 다음의 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함한다: 레트로바이러스, 예컨대 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스, Harvey 뮤린 육종 바이러스, 뮤린 유방 종양 바이러스, 및 Rous 육종 바이러스; 렌티바이러스; 아데노바이러스; 아데노-관련 바이러스; SV40-타입 바이러스; 폴리오마 바이러스; 엡스타인-바르 바이러스; 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 우두 바이러스; 폴리오 바이러스; 및 RNA 바이러스, 예컨데 레트로바이러스. 당업자는 당업계에 잘 공지된 다른 벡터들도 쉽게 이용할 수 있다. 특정한 바이러스 벡터는 비-필수 유전자가 관심 유전자로 치환된 비-세포병증 진핵생물 바이러스에 기초한다. 비-세포병증 바이러스는 레트로바이러스를 포함하며, 이것의 라이프 사이클은 게놈 바이러스 RNA의 DNA로의 역전사를 수반하며, 후속해서 숙주 세포 DNA에 프로바이러스 통합이 이루어진다. 레트로바이러스는 인간 유전자 치료요법 시험을 위해 승인되었다. 가장 유용한 것은 복제-결함(즉, 원하는 단백질의 합성을 지시할 수 있지만 감염성 입자는 제조할 수 없는)을 가진 레트로바이러스이다. 이러한 유전적으로 변경된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내 유전자의 고 효율 형질도입에서 일반적인 유용성을 가진다. 복제-결함 레트로바이러스를 생성하는 표준 프로토콜(플라스미드에 외인성 유전자 물질의 통합 단계, 플라스미드로 패키징 셀라인의 트랜스펙션 단계, 패키징 셀라인에 의한 재조합 레트로바이러스의 생성 단계, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자의 수집 단계 및 바이러스 입자로 표적 세포의 감염 단계를 포함하는)은 Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York(1990); Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)에 제시된다.
한 구체예에서, 바이러스는 아데노-관련 바이러스, 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 아데노-관련 바이러스는 복제-결함이 되도록 유전조작될 수 있으며, 광범위한 세포 타입 및 종을 감염시킬 수 있다. 아데노-관련 바이러스는 열 및 지질 용매 안정성; 조혈 세포를 포함하는 다양한 계통의 세포에서 높은 형질도입 빈도; 및 초감염 억제를 결여함에 의한 다수의 연속 형질도입의 허용과 같은 이점을 가진다. 실험 결과에 의하면, 아데노-관련 바이러스는 부위-특이적 방식으로 인간 세포 DNA에 통합될 수 있고, 이로써 레트로바이러스 감염의 특징인 삽입 돌연변이유발의 확률 및 삽입된 유전자 발현의 가변성을 최소화한다. 또한, 야생형 아데노-관련 바이러스 감염이 선택압의 부재하에 100 계대를 초과하는 동안 조직 배양물에서 추적되었고, 이것은 아데노-관련 바이러스 게놈 통합이 비교적 안정적인 사건임을 암시한다. 또한, 아데노-관련 바이러스는 염색체외 방식으로 기능할 수 있다.
다른 구체예에서, 벡터는 렌티바이러스로부터 유도된다. 특정 구체예에서, 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다.
렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 전형적으로 레트로바이러스에서 발견된 3개의 유전자, 즉 gag, pol 및 env를 가지며, 이들은 2개의 긴 말단 반복부(LTR) 서열이 측면에 위치된다. gag 유전자는 내부 구조(바탕질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 암호화하고, pol 유전자는 RNA-지정 DNA 중합효소(역전사효소), 프로테아제 및 인테그라아제를 암호화하고, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 암호화한다. 5' 및 3' LTR들은 비리온 RNA들의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 작용을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필수적인 모든 cis-작용 서열을 함유한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx를 포함하는 추가의 유전자를 가진다.
5' LTR에 인접해서 게놈의 역 전사(tRNA 프라이머 결합 부위)와 입자에 바이러스 RNA의 효과적인 캡시드화(Psi 부위)에 필요한 서열이 있다. 캡시드화(또는 감염성 비리온에 레트로바이러스 RNA의 패키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈에 없는 경우, cis 결핍은 게놈 DNA의 캡시드화를 방지한다.
그러나, 돌연변이는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있게 유지된다. 본 발명은 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스를 생성하는 방법을 제공하며, 이 방법은 적합한 숙주 세포를 패키징 기능을 지닌 둘 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env, 뿐만 아니라 rev 및 tat로 트랜스펙션하는 것을 포함한다. 아래 개시된 대로, 기능적 tat 유전자를 결여한 벡터가 특정한 용도에 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 제1 벡터는 바이러스 gag 및 바이러스 pol을 암호화하는 핵산을 제공할 수 있고, 다른 벡터는 패키징 세포를 생성할 수 있는 바이러스 env를 암호화하는 핵산을 제공할 수 있다. 전달자 벡터로서 확인된, 이종성 유전자를 제공하는 벡터를 해당 패키징 세포에 도입하는 것은 관심 외래 유전자를 지닌 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산자 세포를 제공한다.
벡터 및 외래 유전자의 상기 제시된 구성형태에 따라서, 제2 벡터는 바이러스 외피(env) 유전자를 암호화하는 핵산을 제공할 수 있다. env 유전자는 레트로바이러스를 포함하는 임의의 적합한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, env 단백질은 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 양쪽성 외피 단백질이다.
레트로바이러스-유래 env 유전자의 비 제한적인 예는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), Harvey 뮤린 육종 바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 뮤린 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 Rous 육종 바이러스(RSV)를 포함한다. 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G(VSV G), 간염 바이러스 및 인플루엔자와 같은 다른 env 유전자 또한 사용될 수 있다.
바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 벡터는 본 명세서에 제시된 조절 서열과 작동 가능하게 회합된다.
특정 구체예에서, 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하는 벡터의 능력을 손상시키지 않고 HIV 병독성 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실된 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
일부 구체예에서, 벡터는 3' LTR의 U3 영역의 결실을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. U3 영역의 결실은 완전한 결실 또는 부분적 결실일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 FVIII 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 (a) gag, pol, 또는 gag와 pol 유전자를 포함하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 이종성 env 유전자를 포함하는 제2 뉴클레오타이드 서열로 세포에 트랜스펙션될 수 있다; 여기서 렌티바이러스 벡터는 기능적 tat 유전자를 결여한다. 다른 구체예에서, 세포는 rev 유전자를 포함하는 제4 뉴클레오타이드 서열로 더 트랜스펙션된다. 특정 구체예에서, 렌티바이러스 벡터는 vif, vpr, vpu, vpx 및 nef, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 기능적 유전자를 결여한다.
특정 구체예에서, 렌티바이러스는 gag 단백질, Rev-반응 요소, 중심 폴리퓨린 트랙(cPPT), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
렌티바이러스 벡터의 예들은 W09931251, W09712622, W09817815, W09817816, 및 W09818934에 개시되며, 이들은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당업계에 광범위하게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조). 지난 수 년 동안 플라스미드 벡터는 숙주 게놈 내에서 복제되어 통합될 수 있는 능력을 갖지 않았기 때문에 생체내에서 세포에 유전자를 송달하는데 특히 유익한 것으로 판명되었다. 그러나, 숙주 세포와 양립가능한 프로모터를 가진 플라스미드는 플라스미드 내에서 작동 가능하게 암호화된 유전자로부터 펩타이드를 발현할 수 있다. 상업적 공급자로부터 이용가능한 일부 공통 사용되는 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, 다양한 pcDNA 플라스미드, pRC/CMV, 다양한 pCMV 플라스미드, pSV40 및 pBlueScript를 포함한다. 구체적인 플라스미드의 추가의 예들은 pcDNA3.1, 카탈로그 넘버 V79020; pcDNA3.1/hygro, 카탈로그 넘버 V87020; pcDNA4/myc-His, 카탈로그 넘버 V86320; 및 pBudCE4.1, 카탈로그 넘버 V53220을 포함하며, 모두 Invitrogen(Carlsbad, CA.)으로부터 구입할 수 있다. 다른 플라스미드들도 당업자에게 잘 공지되어 있다. 추가로, 플라스미드는 DNA의 특정한 단편을 제거하고 및/또는 추가하기 위해 표준 분자생물학 기술을 사용하여 주문 디자인될 수 있다.
V. 항체 생성
FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 단편은 항체의 합성을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 화학 합성이나 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은, 달리 나타내지 않는다면, 분자생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 변형, 핵산 혼성화 및 당업계의 관련 분야에서의 종래의 기술을 이용한다. 이들 기술은 본 명세서에 인용된 참고문헌들에 기재되어있으며, 이들 문헌에는 상세히 설명되어 있다(예를 들어, Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al, (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al, (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(1987 및 연간 갱신); Current Protocols in Immu-nology, John Wiley & Sons(1987 및 연간 갱신) Gait(ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein(ed.) (1991) Oligonucleo-tides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al, (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조).
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체는, 예를 들어 DNA 서열의 합성, 유전자 유전조작을 통한 생성을 수반하는 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체(예를 들어, 재조합 항체)이다. 특정 구체예에서, 이러한 항체는 생체내에서 동물 또는 포유류(예를 들어, 인간)의 항체 점라인 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열(예를 들어, DNA 서열 또는 아미노산 서열)을 포함한다.
특정 양태에서, 본 명세서에 제시된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 제조하는 방법이 개시된다. 특정 양태에서, 본 명세서에 제시된 세포 또는 숙주 세포(예를 들어, 본 명세서에 제시된 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 발현하는(예를 들어, 재조합 발현하는) 것을 포함하는 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그것의 항원-결합 단편의 제조 방법이 개시된다. 특정 구체예에서, 세포는 분리된 세포이다. 특정 구체예에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드가 세포에 도입되었다. 특정 구체예에서, 이 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 얻어진 항체 또는 항원-결합 단편을 정제하는 단계를 더 포함한다.
다클론성 항체를 생성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Chapter 11, Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al, eds., John Wiley and Sons, New York 참조).
단클론성 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 광범위한 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 단클론성 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981)에 교시된 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 본 명세서에 제시된 "단클론성 항체"는 하이브리도마 기술을 통해서 생성된 항체에 제한되지 않는다. 예를 들어, 단클론성 항체는 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 단편, 예를 들어 이러한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 외인성 발현하는 숙주 세포로부터 재조합 생성될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 "단클론성 항체"는 단일 세포(예를 들어, 재조합 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생성된 항체이며, 예를 들어 ELISA 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 개시된 실시예에 제시된 다른 항원-결합 또는 경쟁 결합 분석에 의해 결정되었을 때, FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 단클론성 항체는 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정 구체예에서, 단클론성 항체는 1가 항체 또는 다가(예를 들어, 2가) 항체이다. 특정 구체예에서, 단클론성 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)이다. 본 명세서에 제시된 단클론성 항체는, 예를 들어 Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256: 495에 기재된 대로 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 본 명세서에 제시된 것과 같은 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 클론 셀라인의 제조 및 이렇게 발현된 단클론성 항체의 제조를 위한 다른 방법들도 당업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, Chapter 11, Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al, 상동 참조).
하이브리도마 기술을 사용하여 특정한 항체를 생성하고 스크리닝하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 양, 염소, 토끼, 래트, 햄스터 또는 짧은꼬리 원숭이가 면역화에 사용된 단백질(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 도출하도록 면역화된다. 또는, 림프구가 시험관내 면역화될 수 있다. 다음에, 림프구는 적합한 융합제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 흑색종 세포와 융합되고, 이로써 하이브리도마 세포가 형성된다(Goding JW (Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986) 참조). 추가로, RIMMS(반복 면역화 다중 부위) 기술이 동물을 면역화하는데 사용될 수 있다(Kilpatrick KE et al, (1997) Hybridoma 16:381-9, 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다).
일부 구체예에서, 마우스(또는 다른 동물, 예컨대 닭, 래트, 원숭이, 당나귀, 돼지, 양, 햄스터 또는 개)가 항원(예를 들어, FAM19A5, 예컨대 인간 FAM19A5)으로 면역화될 수 있으며, 면역 반응이 검출되면, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되며, 마우스 비장이 수거되고 비장세포가 분리된다. 다음에, 잘 공지된 기술에 의해 비장세포가 임의의 적합한 흑색종 세포, 예를 들어 American Type Culture Collection(ATCC®)(Manassas, VA)로부터 이용가능한 셀라인 SP20으로부터의 세포에 융합되고, 이로써 하이브리도마가 형성된다. 하이브리도마는 제한된 희석에 의해 선택되고 클로닝된다. 특정 구체예에서, 면역화된 마우스의 림프절이 수거되고 NSO 흑색종 세포와 융합된다.
이렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게 미융합, 부모 흑색종 세포의 성장이나 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지에 파종되고 성장된다. 예를 들어, 부모 흑색종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라아제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여한다면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린, 및 티미딘(HAT 배지)를 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결함 세포의 성장을 방지한다.
특정 구체예는 선택된 항체-생성 세포를 효과적으로 융합하고, 그것에 의한 안정적인 높은 수준의 항체 생성을 지원하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 흑색종 세포를 이용한다. 이들 흑색종 셀라인 중에는 뮤린 흑색종 셀라인, 예컨대 NSO 셀라인 또는 Salk Institute Cell Distribution Center(San Diego, CA, USA)로부터 이용가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들 및 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA)로부터 이용가능한 SP-2 또는 X63-Ag8.653 세포가 있다. 인간 흑색종 및 마우스-인간 이종흑색종 셀라인이 또한 인간 단클론성 항체를 생성하기 위해 제시되었다(Kozbor D (1984) J Immunol 133: 3001-5; Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) 참조).
하이브리도마 세포가 성장한 배양 배지는 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 대해 지정된 단클론성 항체의 생성에 대해 평가된다. 하이브리도마 세포에 의해 생성된 단클론성 항체의 결합 특이성은 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예컨대 방사성면역분석(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 결정된다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding JW(Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 상동). 이 목적을 위한 적합한 배양 배지는, 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI 1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수(ascites) 종양으로서 생체내 성장될 수 있다.
서브클론에 의해 선택된 단클론성 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로오스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수 유체 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체는 특정한 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)를 인식하는 항체 단편을 포함하며, 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편의 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편의 생성)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질 가수분해 절단에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 항체 분자의 두 동일한 팔 중 하나에 상응하고, 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전한 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화물 결합에 의해 연결된 항체 분자의 2개의 항원-결합 팔을 함유한다.
또한, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인이 그것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지닌 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 특히, VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열이 동물 cDNA 라이브러리(예를 들어, 병든 조직의 인간 또는 비-인간, 예컨대 뮤린 또는 닭 cDNA 라이브러리)로부터 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합되고 파지미드 벡터에 클로닝된다. 벡터는 이콜리에 전기천공되고, 이콜리는 헬퍼 파지로 감염된다. 이들 방법에 사용된 파지는 전형적으로 fd 및 M1 3을 포함하는 사상 파지이고, VH 및 VL 도메인은 일반적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합 융합된다. 특정 유전자에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지가 선택될 수 있고, 항원, 예를 들어 표지된 항원 또는 고체 표면이나 비드에 연결되거나 포착된 항원을 사용하여 확인될 수 있다. 본 명세서에 제시된 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예들은 Brinkman U et al, (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al, (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al, (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al, (1997) Gene 187:9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT 출원 No. PCT/GB91/001134; 국제공개 Nos. WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO 97/13844; 및 미국특허 Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743 및 5,969,108에 개시된 것들을 포함한다.
상기 참고문헌에 기재된 대로, 파지 선택 후, 파지로부터 항체 코딩 영역이 분리될 수 있고, 인간 항체를 포함하는 전체 항체, 또는 임의의 다른 원하는 항원 결합 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 아래 기재된 대로 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 임의의 원하는 숙주에서 발현될 수 있다. 또한, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편을 재조합 생성하는 기술이 PCT 공개 No. WO 92/22324; Mullinax RL et al, (1992) BioTechniques 12(6): 864-9; Sawai H et al, (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34; 및 Better M et al, (1988) Science 240: 1041-1043에 개시된 것들과 같이 당업계에 공지되어 있다.
한 양태에서, 전체 항체를 생성하기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오타이드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하기 위한 플랭킹(flanking) 서열을 포함하는 PCR 프라이머가 주형, 예를 들어 scFv 클론으로부터 VH 또는 VL 서열을 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인이 VH 불변 영역을 발현하는 벡터에 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 VL 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터에 클로닝될 수 있다. 또한, VH 및 VL 도메인은 필수 불변 영역을 발현하는 하나의 벡터에 클로닝될 수 있다. 다음에, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 중쇄 전환 벡터와 경쇄 전환 벡터가 셀라인에 공-트랜스펙션됨으로써 전장 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정적인 또는 일시적인 셀라인을 생성할 수 있다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 면역글로불린 분자로부터 유래된 분자이다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간 항체의 불변 영역에 융합된 비-인간 동물(예를 들어, 마우스, 래트 또는 닭) 단클론성 항체의 가변 영역을 함유할 수 있다. 키메라 항체를 생성하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) Bio-Techniques 4: 214-221; Gillies SD et al, (1989) J Immunol Methods 125: 191-202; 및 미국특허 Nos. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397, 및 6,331,415 참조).
인간화 항체는 정해진 항원에 결합할 수 있고, 실질적으로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 프레임워크 영역 및 실질적으로 비-인간 면역글로불린(예를 들어, 뮤린 또는 닭 면역글로불린)의 아미노산 서열을 가진 CDR을 포함한다. 특정 구체예에서, 인간화 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 인간화 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소타입을 포함하는 면역글로불린의 임의의 유형으로부터 선택될 수 있다. 인간화 항체는 당업계에 공지된 여러 가지 기술을 사용하여 생성될 수 있으며, 공지된 기술의 비 제한적인 예는 CDR-그래프팅(유럽특허 No. EP 239400; 국제공개 No. WO 91/09967; 및 미국특허 Nos. 5,225,539, 5,530,101, 및 5,585,089), 베니어링 또는 리서페이싱(유럽특허 Nos. EP 592106 및 EP 519596; Padlan EA (1991) Mol Immunol 28(4/5): 489-498; Studnicka GM et al, (1994) Prot Engineering 7(6): 805-814; 및 Roguska MA et al, (1994) PNAS 91: 969-973), 사슬 셔플링(미국특허 No. 5,565,332), 그리고 미국특허 No. 6,407,213, 미국특허 No. 5,766,886, 국제공개 No. WO 93/17105; Tan P et al, (2002) J Immunol 169: 1119-25; Caldas C et al, (2000) Protein Eng. 13(5): 353-60; Morea V et al, (2000) Methods 20(3): 267-79; Baca M et al, (1997) J Biol Chem 272(16): 10678-84; Roguska MA et al, (1996) Protein Eng 9(10): 895 904; Couto JR et al, (1995) Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s; Couto JR et al, (1995) Cancer Res 55(8): 1717-22; Sandhu JS (1994) Gene 150(2): 409-10 및 Pedersen JT et al, (1994) J Mol Biol 235(3): 959-73에 기재된 기술을 포함한다. 또한, 미국출원공개 No. US 2005/0042664 A1(2005-2-24)를 참조하며, 이것은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
다중특이적(예를 들어, 이중특이적) 항체를 제조하는 방법이 공개되어있다(예를 들어, 미국특허 Nos. 7,951,917; 7,183,076; 8,227,577; 5,837,242; 5,989,830; 5,869,620; 6,132,992 및 8,586,713 참조).
단일 도메인 항체, 예를 들어 경쇄를 결여한 항체가 당업계에 잘 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다(Riechmann L & Muyldermans S (1999) J Immunol 231: 25-38; Nuttall SD et al, (2000) Curr Pharm Biotechnol 1(3): 253-263; Muyl-dermans S, (2001) J Biotechnol 74(4): 277-302; 미국특허 No. 6,005,079; 및 국제공개 Nos. WO 94/04678, WO 94/25591 및 WO 01/44301 참조).
또한, FAM19A5 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 잘 공지된 기술을 사용하여 항원을 "의태하는" 항-이디오타입 항체를 생성하는데 이용될 수 있다(예를 들어, Greenspan NS & Bona CA (1989) 77(5): 437-444; 및 Nissinoff A (1991) 7 Immunol 147(8): 2429-2438 참조).
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체로서 FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)의 동일한 에피토프에 결합하는, 본 명세서에 제시된 항체는 인간 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다. 특정 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 대한 결합으로부터 본 명세서에 제시된 항체(예를 들어, 1-65)를 경쟁적으로 차단하는(예를 들어, 용량-의존적 방식으로), 본 명세서에 제시된 항체는 인간 항체 또는 그것의 항원-결합 단편이다.
인간 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스가 사용될 수 있다. 특히, 인간 중쇄와 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체가 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해 마우스 배아 줄기세포에 도입될 수 있다. 또는, 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역이 인간 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기세포에 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 동시에 또는 별도로 비기능적으로 될 수 있다. 특히, JH 영역의 동형접합성 결실은 내인성 항체 생성을 방지한다. 변형된 배아 줄기세포가 확장되고 배반포에 마이크로인젝션됨으로써 키메라 마우스가 생성된다. 다음에, 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 동형접합성 자손을 생성하도록 사육된다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원으로, 예를 들어 항원(예를 들어, FAM19A5)의 전부 또는 일부로 정상 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 지정된 단클론성 항체는 종래의 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된, 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진다. 트랜스제닉 마우스에 의해 숨겨진 인간 면역글로불린 트랜스젠은 B 세포 분화 동안 재배열되고, 이어서 유형 전환 및 체세포 돌연변이를 거친다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여, 치료적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생성하는 것이 가능하다. 인간 항체를 생성하기 위한 이 기술의 개략적인 내용에 대해서는, Lonberg N & Huszar D (1995) Int Rev Immunol 13 : 65-93을 참조한다. 인간 항체 및 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 이 기술 및 이러한 항체를 생성하는 프로토콜에 대한 상세한 내용은 예를 들어 국제공개 Nos. WO 98/24893, WO 96/34096 및 WO 96/33735; 및 미국특허 Nos. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318 및 5,939,598을 참조한다. 인간 항체를 생성할 수 있는 마우스의 예들은 XENOMOUSE™(Abgenix, Inc.; 미국특허 Nos. 6,075,181 및 6,150,184), HUAB-MOUSE™(Mederex, Inc./Gen Pharm; 미국특허 Nos. 5,545,806 및 5,569,825), TRANS CHROMO MOUSE™(Kirin) 및 KM MOUSE™(Medarex/ Kirin)를 포함한다.
FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 상기 기재된 파지 디스플레이 방법을 포함하는 당업계에 공지된 여러 가지 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 미국특허 No. 4,444,887, 4,716,111 및 5,885,793; 및 국제공개 No. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조한다.
일부 구체예에서, 인간 항체는 마우스-인간 하이브리도마를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 엡스타인-바르 바이러스(EBV)로 형질전환된 인간 말초혈 림프구는 인간 단클론성 항체를 분비하는 마우스-인간 하이브리도마를 생성하기 위해 마우스 흑색종 세포와 융합될 수 있고, 이들 마우스-인간 하이브리도마는 표적 항원(예를 들어, 인간 FAM19A5와 같은 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 인간 단클론성 항체를 분비하는 것을 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Shinmoto H et al, (2004) Cytotechnology 46: 19-23; Naganawa Y et al, (2005) Human Antibodies 14: 27-31 참조).
VI. 항체 유전조작 방법
상기 기재된 대로, 본 명세서에 제시된 VH 및 VL 서열을 가진 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 VH 및/또는 VL 서열, 또는 거기 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체의 구조적 특징은 인간 FAM19A5에 대한 결합과 같은, 본 명세서에 제시된 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 항-FAM19A5 항체를 생성하는데 사용된다. 예를 들어, 유전조작 방법을 위한 출발 재료는 본 명세서에 제시된 VH 및/또는 VL 서열, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역이다. 유전조작된 항체를 생성하기 위해, 본 명세서에 제시된 VH 및/또는 VL 서열 중 하나 이상, 또는 그것의 하나 이상의 CDR 영역을 가진 항체를 실제로 제조하는 것(즉, 단백질로서 발현하는 것)은 필요하지 않다. 오히려 서열(들)에 함유된 정보가 모 서열(들)로부터 유래된 "2세대" 서열(들)을 생성하기 위한 출발 재료로 사용되며, 다음에 "2세대" 서열(들)이 단백질로서 제조되고 발현된다.
따라서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원 결합 부분을 제조하는 방법이 본 명세서에 제시되며, 이 방법은
(a) (i) 표 2에 제시된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 표 4에 제시된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 서열; 및 (ii) 표 3에 제시된 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열 또는 표 5에 제시된 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 서열을 제공하는 단계;
(b) 중쇄 가변 영역 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 또는 항원 결합 부분 서열을 생성하는 단계; 및
(c) 변경된 항체 또는 항원 결합 부분 서열을 단백질로서 발현하는 단계
를 포함한다.
표준 분자생물학 기술이 변경된 항체 또는 항원 결합 부분 서열을 제조 및 발현하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 변경된 항체 또는 항원 결합 부분 서열(들)에 의해 암호화된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체의 기능적 특성 중 하나, 일부 또는 전부를 보유하는 것이며, 기능적 특성은 다음을 포함한다:
(1) 예를 들어 Biacore에 의해 측정되었을 때, 10nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 10nM)의 Kd로 가용성 인간 FAM19A5에 결합;
(2) 예를 들어 ELISA에 의해 측정되었을 때, 1nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 1nM)의 Kd로 막 결합 인간 FAM19A5에 결합;
(3) 예를 들어 ELISA에 의해 측정되었을 때, 1nM 이하(예를 들어, 0.01nM 내지 1nM)의 EC50으로 막 결합 인간 FAM19A5에 결합;
*(4) 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연 및/또는 예방;
(5) 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제;
(6) 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원 2(NG2)를 포함하는 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현의 감소;
(7) 뉴런의 핵에서 c-fos 및 pERK 발현의 증가;
(8) 뉴런의 생존 촉진;
(9) 뉴런에서 GAP43의 발현 증가;
(10) 축삭돌기의 재성장 촉진; 및
(11) 인간 FAM19A5에 대한 결합에서 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체와 한 방향으로 또는 양 방향으로 경쟁.
변경된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분은 상기 (1) 내지 (11)에 제시된 기능적 특성 중 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 다섯 이상, 여섯 이상, 일곱 이상, 여덟 이상, 아홉 이상, 열 이상, 열하나 또는 전부를 나타낼 수 있다. 변경된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분의 기능적 특성은 실시예에 제시된 것들과 같은(예를 들어, ELISA, FACS) 당업계에서 이용가능하고 및/또는 본 명세서에 제시된 표준 분석을 사용하여 평가될 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체를 유전조작하는 방법의 특정 구체예에서, 돌연변이가 항-FAM19A5 항체코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 그 결과 변형된 항-FAM19A5 항체는 결합 활성 및/또는 본 명세서에 제시된 다른 기능적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Short에 의해 PCT 공개 WO 02/092780은 포화 돌연변이유발, 합성 라이게이션 조립체, 또는 이들의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 개시한다). 또는, Lazar 등에 의한 PCT 공개 WO 03/074679는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위한 컴퓨터 스크리닝 방법을 사용하는 방법을 개시한다.
VII. 세포 및 벡터
특정 양태에서, FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 제시된 항체(또는 그것의 항원-결합 부분)을 발현하는(예를 들어, 재조합 방식으로) 세포(예를 들어, 숙주 세포) 및 관련된 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터가 개시된다. 숙주 세포, 예를 들어 포유류 세포에서의 재조합 발현을 위해 항-FAM19A5 항체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 개시된다. 또한, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 인간 또는 인간화 항체)를 재조합 발현하기 위한 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 개시된다. 특정 양태에서, 숙주 세포로부터 이러한 항체를 발현시키는 것을 포함하는, 본 명세서에 제시된 항체를 생성하는 방법이 개시된다.
FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 제시된 항체(예를 들어, 본 명세서에 제시된 전장 항체, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 단쇄 항체)의 재조합 발현은 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 수반한다. 본 명세서에 제시된 항체 분자, 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 또는 그것의 단편(예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 얻어지면, 항체 분자의 생성을 위한 벡터가 당업계에 잘 공지된 기술을 사용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄)을 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 단백질을 제조하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 당업계에 잘 공지된 방법이 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 제시된 항체 분자, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 또는 그것의 단편, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터가 개시된다. 이러한 벡터는, 예를 들어 항체 분자의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있으며(예를 들어, 국제공개 Nos. WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국특허 No. 5, 122,464 참조), 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄와 경쇄 둘 다의 발현을 위해 이러한 벡터에 항체의 가변 도메인이 클로닝될 수 있다.
발현 벡터는 종래의 기술에 의해 세포(예를 들어, 숙주 세포)에 전달될 수 있으며, 다음에 얻어진 세포가 종래의 기술에 의해 배양되어 본 명세서에 제시된 항체(예를 들어, 본 발명의 항-FAM19A5 항체의 VH 및/또는 VL, 또는 VH 및/또는 VL CDR 중하나 이상을 포함하는 항체) 또는 그것의 단편을 생성할 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서 이러한 서열들의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 단편, 또는 그것의 중쇄 또는 경쇄, 또는 그것의 단편, 또는 본 명세서에 제시된 단쇄 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 숙주 세포가 본 명세서에 개시된다. 특정 구체예에서, 이중-사슬 항체의 발현을 위해, 중쇄와 경쇄 둘 다를 개별적으로 암호화하는 벡터가 아래 상세히 기재된 대로 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공-발현될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 제시된 항체, 또는 그것의 단편의 중쇄와 경쇄를 둘 다 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 함유한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 두 상이한 벡터를 함유하며, 제1 벡터는 본 명세서에 제시된 항체, 또는 그것의 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 제2 벡터는 본 명세서에 제시된 항체, 또는 그것의 단편의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 구체예에서, 제1 숙주 세포는 본 명세서에 제시된 항체, 또는 그것의 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 세포에 의해 발현된 중쇄/중쇄 가변 영역은 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 회합하여 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 형성한다. 특정 구체예에서, 이러한 제1 숙주 세포와 이러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 집단이 개시된다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체의 경쇄/경쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 벡터, 및 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체의 중쇄/중쇄 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 집단이 개시된다.
여러 가지 숙주-발현 벡터 시스템이 본 명세서에 제시된 항체 분자를 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 이어서 정제될 수 있는 비히클을 포함할 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 형질전환되거나 트랜스펙션되었을 때 본 명세서에 제시된 항체 분자를 인시튜 발현할 수 있는 세포를 포함한다. 이러한 숙주-발현 시스템은 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 박테리아(예를 들어, 이콜리 및 바실루스 섭틸리스)와 같은 미생물; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 또는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii)와 같은 녹색 조류); 또는 포유류 세포의 게놈(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)으로부터 또는 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구성물을 숨기고 있는 포유류 세포 시스템(예를 들어, COS(예컨대, COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NSO, PER.C6, VERO, CRL7030, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, Rl .1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 단편을 발현시키기 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS SYSTEM™(Lonza)로부터의 CHO 세포이다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체를 발현시키기 위한 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 셀라인이다. 특정 구체예에서, 포유류 발현 벡터는 POPTIVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 특정 구체예에서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해, 이콜리 또는 진핵생물 세포(예를 들어, 포유류 세포)와 같은 박테리아 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해 사용된다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유류 세포는 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 같이 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이 된다(Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-5; 및 Cockett MI et al, (1990) Biotechnology 8(7): 662-7 참조). 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체는 CHO 세포 또는 NSO 세포에 의해 생성된다. 특정 구체예에서, FAM19A5(예를 들어, 인간 FAM19A5)에 면역특이적으로 결합하는 본 명세서에 제시된 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 발현은 구성성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터가 발현될 항체 분자에 따라 유익하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학 조성물의 생성을 위해 다량의 항체가 생성되어야 할 때, 쉽게 정제되는 높은 수준의 융합 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터의 비 제한적인 예는 항체 코딩 서열이 lac Z 코딩 영역을 가진 프레임 내에서 벡터에 개별적으로 라이게이션됨으로써, 융합 단백질이 생성될 수 있는 이콜리 발현 벡터 UR278(Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794); pIN 벡터(Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G & Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509) 등을 포함한다. 또한, pGEX 벡터가 글루타티온 5-트랜스페라아제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 바탕질 글루타티온 아가로오스 비드에의 흡착 및 결합 이후 자유 글루타티온의 존재하에 용출에 의해 세포용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인되며, 이로써 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 부분으로부터 방출될 수 있다.
곤충 시스템에서, 예를 들어 오토그래파 캘리포니아 핵 다면체형성 바이러스(AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 이 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열이 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 두어질 수 있다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 항체 코딩 서열이 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 3원 리더 서열에 라이게이션될 수 있다. 다음에, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에 삽입은 생육성이며 감염된 숙주에서 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 가져올 것이다(예를 들어, Logan J & Shenk T (1984) PNAS 81(12): 3655-9 참조). 특정한 개시 신호가 삽입된 항체 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해 또한 필요하다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 또한, 개시 코돈은 전체 삽입체의 번역을 보장하기 위해 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 같은 위상에 있어야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 다양한 기원을 가질 수 있다. 발현 효능은 적절한 전사 인핸서 요소, 전사 터미네이터 등을 포함함으로써 증진될 수 있다(예를 들어, Bitter G et al, (1987) Methods Enzymol. 153 : 516-544 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 원하는 특정한 방식으로 유전자 생성물을 변형하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 처리 및 변형에 대한 특이적인 메커니즘을 가진다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변형 및 처리를 보장할 수 있는 적절한 셀라인 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사체, 글리코실화 및 인산화의 적절한 처리를 위한 세포 기전을 지닌 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포의 비 제한적인 예는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, NSO(임의의 면역글로불린 사슬을 내인성 생성하지 않는 뮤린 흑색종 셀라인), CRL7030, COS(예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, Rl.l, B-W, L-M, BSC 1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포에서 생성된다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 감소된 푸코오스 함량을 가지거나 푸코오스 함량을 갖지 않는다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 푸코실화 능력에 결함이 있거나 푸코실화 능력을 결여한 세포에서 발현될 수 있다. 특정 예에서, 1,6-푸코실트랜스페라아제의 두 대립형질이 녹아웃된 셀라인이 감소된 푸코오스 함량을 가진 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 감소된 푸코오스 함량을 가진 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 생성하기 위해 사용될 수 있는 이러한 시스템의 일례는 POTELLIGENT® 시스템(Lonza)이다.
재조합 단백질의 장기적 고 수율을 얻기 위해, 안정한 발현 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 안정적으로 발현하는 셀라인이 유전조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 세포는 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 형성하기 위해 회합하는 경쇄/경쇄 가변 도메인과 중쇄/중쇄 가변 도메인을 안정적으로 발현한다.
특정 양태에서, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것이 아니라 숙주 세포가 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택성 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA/폴리뉴클레오타이드의 도입 후, 유전조작된 세포는 부화된 배지에서 1-2일 동안 성장될 수 있고, 다음에 선택성 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드의 선택성 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고 세포가 염색체에 플라스미드를 안정적으로 통합 및 성장하여 초점(foci)을 형성하도록 하며, 이것은 차례로 셀라인에 클로닝되고 확장될 수 있다. 이 방법은 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항체 결합 부분을 발현하는 셀라인을 유전조작하는데 유익하게 사용될 수 있다. 이러한 유전조작된 셀라인은 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
다수의 선택 시스템이 사용될 수 있으며, 비 제한적인 예로서 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제(Wigler M et al, (1977) Cell 11(1): 223-32), 하이포잔틴구아닌 포스포리보실트랜스페라아제(Szybalska EH & Szybalski W(1962) PNAS 48(12): 2026-2034) 및 아데닌 포스포리보실트랜스페라아제(Lowy I et al, (1980) Cell 22(3): 817-23) 유전자가 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 이용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 다음의 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: dhfr(메토트랙세이트에 대한 내성을 부여함)(Wigler M et al, (1980) PNAS 77(6): 3567-70; O'Hare K et al, (1981) PNAS 78: 1527-31); gpt(미코페놀산에 대한 내성을 부여함)(Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4):2072-6); neo(아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여함)(Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596; Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932; 및 Morgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Feigner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-5); 및 hygro(하이그로마이신에 대한 내성을 부여함)(Santerre RF et al, (1984) Gene 30(1-3): 147-56). 재조합 DNA 기술의 분야에 공지된 방법이 원하는 재조합 클론을 선택하기 위해 관례적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어 Ausubel FM et al, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY(1993); Kriegler M, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); Chapters 12, 13, Dracopoli NC et al, (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colbere-Garapin F et al, (1981) J Mol Biol 150: 1-14에 기재되며, 이들은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다(Bebbington CR & Hentschel CCG, DNA 클로닝에서 포유류 세포에서 클로닝된 유전자의 발현을 위한 유전자 증폭에 기초한 벡터의 사용, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987) 참조). 항체를 발현하는 벡터 시스템의 마커가 증폭 가능한 경우, 숙주 세포의 배양물에 존재하는 억제제 수준의 증가는 마커 유전자의 카피수를 증가시킬 것이다. 증폭된 영역이 항체 유전자와 관련되므로, 항체의 생성 또한 증가할 것이다(Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66 참조).
숙주 세포는 본 명세서에 제시된 둘 이상의 발현 벡터, 즉 중쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 벡터로 공-트랜스펙션될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택성 마커를 함유할 수 있다. 숙주 세포는 둘 이상의 발현 벡터의 상이한 양으로 공-트랜스펙션될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 제1 발현 벡터 및 제2 발현 벡터로 다음의 비율: 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:12, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 또는 1:50 중 임의의 하나로 트랜스펙션될 수 있다.
또는, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드를 모두 암호화하고 발현할 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 경쇄는 독성이 없는 중쇄의 과량을 피하기 위해 중쇄 앞에 위치되어야 한다(Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; 및 Kohler G (1980) PNAS 77: 2197-2199). 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 모노시스트론 또는 멀티시스트론일 수 있다. 멀티시스트론 핵산 구성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상, 또는 2-5, 5-10 또는 10-20 범위의 유전자/뉴클레오타이드 서열을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 바이시스트론 핵산 구성물은 프로모터, 제1 유전자(예를 들어, 본 명세서에 제시된 항체의 중쇄) 및 제2 유전자(예를 들어, 본 명세서에 제시된 항체의 경쇄)의 순서로 포함할 수 있다. 이러한 발현 벡터에서, 두 유전자의 전사는 프로모터에 의해 유도될 수 있고, 제1 유전자로부터 mRNA의 번역은 캡-의존성 스캐닝 메커니즘에 의해 이루어질 수 있으며, 제2 유전자로부터 mRNA의 번역은 캡-독립적 메커니즘, 예를 들어 IRES에 의해 이루어질 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체 분자가 재조합 발현에 의해 생성되면, 면역글로불린 분자의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특정 항원에 대한 친화성, 및 크기분류 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질의 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제시된 항체는 본 명세서에 개시된 이종성 폴리펩타이드 서열에 융합될 수 있거나 또는 정제를 촉진하기 위한 당업계에 공지된 다른 방식이 적용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 분리되거나 정제된다. 일반적으로, 분리된 항체는 분리된 항체 이외의 다른 항원 특이성을 가진 다른 항체가 실질적으로 없는 것이다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체의 제조물은 세포 물질 및/또는 화학 전구체가 실질적으로 없다. 문구 "세포 물질이 실질적으로 없는"은 항체가 분리되거나 제조합 생성된 세포의 세포 성분으로부터 항체가 분리된 항체의 제조물을 포함한다. 따라서, 세포 물질이 실질적으로 없는 항체는 이종성 단백질(또는 오염 단백질) 및/또는 항체의 변이체, 예를 들어 항체의 상이한 번역 후 변형된 형태 또는 항체(또는 항체 결합 부분)의 다른 상이한 버전을 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1%(건조 중량 기준) 미만으로 가진 항체의 제조물을 포함한다. 항체가 재조합 생성되었을 때, 일반적으로 배양 배지를 실질적으로 갖지 않으며, 즉 배양 배지가 단백질 제조물의 부피의 약 20%>, 10%>, 2%, 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만이다. 항체가 화학 합성에 의해 생성되었을 때, 일반적으로 화학 전구체나 다른 화학물질을 실질적으로 갖지 않으며, 즉 단백질의 합성에 수반되는 화학 전구체나 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 항체의 이러한 제조물은 관심 항체 이외의 다른 화학 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 또는 5%(건조 중량 기준) 미만으로 가진다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체는 분리되거나 정제된다.
VIII. 분석
본 명세서에 제시된 항체는, 예를 들어 표준 ELISA에 의해 FAM19A5에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 마이크로타이터 플레이트가 PBS 중에 1-2 μg/ml로 정제된 FAM19A5로 코팅되고, 이어서 PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 차단된다. 항체 희석물(예를 들어, FAM19A5-면역화된 마우스로부터의 혈장의 희석물)이 각 웰에 첨가되고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션된다. PBS/Tween으로 플레이트가 세척되고, 이어서 37℃에서 1시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)에 콘쥬게이트된 2차 시약(예를 들어, 인간 항체에 대해, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 다클론성 시약)과 함께 인큐베이션된다. 세척 후 플레이트가 ABTS 기질(Moss Inc, product: ABTS-1000)로 전개되고 OD 415-495에서 분광광도계에 의해 분석된다. 다음에, 면역화된 마우스로부터의 혈청이 인간 FAM19A5를 발현하는 셀라인에 대한 결합에 대해 유세포계수법에 의해 더 스크리닝되며, 이때 FAM19A5를 발현하지 않는 대조군 셀라인은 결합되지 않는다. FAM19A5 발현 CHO 세포와 항-FAM19A5 항체를 1:20 희석으로 함께 인큐베이션함으로써 항-FAM19A5 항체의 결합이 평가된다. 세포는 세척되고 PE-표지된 항-인간 IgG Ab로 결합이 검출된다. 유세포계수 분석이 FACScan 유세포계수기를 사용하여 수행된다(Becton Dickinson, San Jose, CA). 바람직하게, 가장 높은 역가를 발생시킨 마우스가 융합에 사용될 것이다.
상기 기재된 ELISA 분석은 FAM19A5 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 항체 및 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 다음에, FAM19A5에 대해, 바람직하게 높은 친화성으로 결합하는 항체를 생성하는 하이브리도마가 서브클로닝되고 더 특성화된다. 다음에, 부모 세포의 반응성을 보유한 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론이 세포 은행을 만들고 항체를 정제하기 위해 선택될 수 있다(ELISA에 의해).
항-FAM19A5 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마가 단클론성 항체 정제를 위한 2-리터 스피너-플라스크에서 성장될 수 있다. 상청액은 단백질 A-세파로오스 친화성 크로마토그래피(Pharmacia, Piscataway, NJ)에 앞서 여과 및 농축될 수 있다. 순도를 보장하기 위해 용출된 IgG는 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 검사될 수 있다. 버퍼 용액이 PBS로 교환될 수 있으며, 농도는 1.43 흡광계수를 사용하여 OD 280에 의해 결정될 수 있다. 단클론성 항체는 알리쿼트로 나눠지고 -80℃에 보관된다.
선택된 항-FAM19A5 단클론성 항체가 독특한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해, 각 항체는 상업적으로 이용가능한 시약(Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 바이오틴화될 수 있다. 바이오틴화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 미표지 단클론성 항체와 바이오틴화된 단클론성 항체를 사용한 경쟁 연구는 상기 기재된 대로 FAM19A5-코팅된 ELISA 플레이트를 사용하여 수행될 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 특정 이소타입의 항체에 특이적인 시약을 사용하여 이소타입 ELISA가 수행될 수 있다. 예를 들어, 인간 단클론성 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 마이크로타이터 플레이트의 웰이 4℃에서 하룻밤 항-인간 면역글로불린 1 μg/mL로 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단 후, 1 내지 2시간 동안 주변 온도에서 플레이트가 시험 단클론성 항체 또는 정제된 이소타입 대조군 1 μg/mL 이하와 반응된다. 다음에, 웰은 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타아제-콘쥬게이트된 프로브와 반응될 수 있다. 플레이트는 상기 기재된 대로 전개되고 분석된다.
FAM19A5를 발현하는 살아 있는 세포에 대한 단클론성 항체의 결합을 시험하기 위해, 실시예에 기재된 대로 유세포계수법이 사용될 수 있다. 막-결합된 FAM19A5를 발현하는 셀라인(표준 성장 조건하에 성장)이 0.1% BSA를 함유하는 PBS 중의 다양한 농도의 단클론성 항체와 1시간 동안 4℃에서 혼합된다. 세척 후 세포는 1차 항체 염색과 동일한 조건하에 플루오레세인-표지된 항-IgG 항체와 반응된다. 샘플은 단일 세포 상에서 문을 열고 닫는 라이트 앤 사이드 스캐터 특성을 사용하는 FACScan 기기에 의해 분석될 수 있으며, 표지된 항체의 결합이 측정된다. 유세포계수 분석에 더하여 또는 대신에 형광 현미경을 사용하는 다른 분석도 사용될 수 있다. 세포는 상기 기재된 대로 정확히 염색되고 형광 현미경에 의해 검사될 수 있다. 이 방법은 개별 세포의 시각화를 허용하지만, 항원의 밀도에 따라서는 저하된 감도를 가질 수 있다.
항-FAM19A5 항체는 웨스턴 블롯팅에 의해 FAM19A5 항원과의 반응성에 대해 더 시험될 수 있다. FAM19A5를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물이 제조될 수 있고 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동이 행해질 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스 막으로 전달되고 20% 마우스 혈청으로 차단되고 시험될 단클론성 항체로 탐침될 것이다. IgG 결합은 항-IgG 알칼리성 포스파타아제를 사용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 전개될 수 있다.
다양한 항-FAM19A5 항체의 결합 친화성, 교차 반응성 및 결합 동력학을 분석하기 위한 방법은 당업계에 공지된 표준 분석, 예를 들어 BIACORE™ 2000 SPR 기기(Biacore AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 BIACORE™ 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 인간 FAM19A5의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 항체는 인간 FAM19A5의 막-결합된 형태에 특이적으로 결합한다. 항체는 FAM19A5의 특정 에피토프(예를 들어, SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 2 내의 단편)에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 구체예에서, 항체는 바람직하게는 높은 친화성으로 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하고, 단백질의 FAM19 서브패밀리의 다른 멤버와는 교차 반응하지 않는다.
IX. 이중특이적 분자
본 명세서에 제시된 항체는 이중특이적 분자를 형성하기 위해 사용될 수 있다. 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 다른 기능적 분자, 예를 들어 다른 펩타이드 또는 단백질(예를 들어, 다른 항체 또는 수용체의 리간드)로 유도체화되거나 결합될 수 있으며, 이로써 적어도 둘 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자가 생성된다. IL-6, CNTF, LIF, EGF 및 TGFa와 같은 사이토카인은 단백질 신호 전달자 또는 전사 3의 활성인자(STAT3)를 활성화함으로써 신경아교증 및/또는 반응성 신경아교증의 개시의 촉발자로서 연루되며(Balasingam et al, J. Neurosci. 14(2):846-56 (1994); Winter et al, Proc. Natl. Acad. Set U. S. A. 20; 92(13):5865-9 (1995) 참조), 이어서 CNS 상해 후 많은 양태의 반응성 성상세포증을 조절한다(Herrmann J. E. et al, J. Neurosci. 28(28): 7231-7243(2008) 참조). 예를 들어, STAT3의 부재나 감소는 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP)의 약화된 상향조절, 성상세포 비대의 실패, 및 염증의 증가된 전파, 증가된 병소 용적 및 CNS 상해 후 부분적으로 약화된 운동 회복을 초래한다(Herrmann J. E. et al, J. Neurosci. 28(28): 7231-7243 (2008) 참조). 따라서, 항-FAM19A5 항체는 조합 치료를 위해 신경아교증의 개시 및/또는 반응성 성상세포증의 과도한 증식을 억제하는데 수반되는 임의의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 scFv에, 예를 들어 IL-6, CNTF, LIF, EGF 또는 TGFa에 대한 항체에 결합될 수 있다.
또한, 항-FAM19A5 항체는 대상의 중추신경계 손상(예를 들어, 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중 또는 뇌종양), 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애(예를 들어, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS), 퇴행성 뇌척수 및 신경 장애, 또는 신경병증성 통증을 포함하는 질환 또는 장애(아래 제XII장에 기재된 질환 또는 장애 참조)를 치료하는 항체 또는 scFv에 결합될 수 있다. 예를 들어, 항-FAM19A5 항체는 다발성 경화증을 치료하는 항체 또는 scFv, 예를 들어 나탈리주맙(TYSABRI®), 알렘투주맙(LEMTRADA®)에 결합될 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체는 실제로 3개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하기 위해 2개 이상의 다른 기능적 분자로 유도체화되거나 결합될 수 있다; 이러한 다중특이적 분자도 "이중특이적 분자"에 포함된다. 본 명세서에 제시된 이중특이적 분자를 생성하기 위해, 본 명세서에 제시된 항체는 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 다른 항체, 그것의 항체 결합 부분, 펩타이드 또는 결합 의태체에 기능적으로 연결될 수 있으며(예를 들어, 화학 커플링, 유전자 융합, 비공유 회합 또는 다른 방식에 의해), 이로써 이중특이적 분자가 얻어진다. 한 구체예에서, 이중특이적 분자는 FAM19A5와 VEGF에 결합한다. 다른 구체예, 이중특이적 분자는 FAM19A5와 EGF에 결합한다.
따라서, FAM19A5에 대한 적어도 하나의 제1 결합 특이성 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이적 분자가 본 명세서에 개시된다. 이중특이적 분자가 다중특이성인 구체예에서, 분자는 제3 결합 특이성을 더 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서에 제시된 이중특이적 분자는 결합 특이성으로서, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 또는 단쇄 Fv(scFv)를 포함하는 적어도 하나의 항체 또는 그것의 항체 결합 부분을 포함한다. 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 다이머, 또는 그것의 임의의 최소 단편, 예컨대 Ladner et al, 미국특허 No. 4,946,778에 기재된 Fv 또는 단쇄 구성물을 수 있으며, 이것의 내용은 참고로 본 명세서에 포함된다.
인간 단클론성 항체가 바람직하지만, 본 명세서에 제시된 이중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화 단클론성 항체이다.
본 명세서에 제시된 이중특이적 분자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 구성 결합 특이성을 콘쥬게이트함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이성은 개별적으로 생성된 다음 서로 콘쥬게이트될 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩타이드일 때, 여러 커플링제 또는 가교제가 공유 콘쥬게이션에 사용될 수 있다. 가교제의 예들은 단백질 A, 카보다이아미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-다이티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌다이말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP) 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다(예를 들어, Karpovsky et al, (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al, (1985) Proc. Natl. Acad. Set USA 82: 8648 참조). 다른 방법은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al, (1985) Science 229: 81-83), 및 Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)에 기재된 것들을 포함한다. 바람직한 콘쥬게이션 제제는 SATA 및 설포-SMCC이며, 이들 모두 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)로부터 구입 가능하다.
결합 특이성이 항체일 때, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설프하이드릴 결합을 통해서 콘쥬게이트될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 홀수 개의 설프하이드릴 잔기, 바람직하게 1개의 잔기를 함유하도록 콘쥬게이션 전에 변형된다.
또는, 두 결합 특이성이 동일한 벡터에서 암호화되고 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 분자가 a mAb x mAb, mAb x Fab, mAb x (scFv)2, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 이중특이적 항체는 각 중쇄의 C-말단에 scFv를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제시된 이중특이적 분자는 단쇄 항체와 결합 결정기를 포함하는 단쇄 분자, 또는 2개의 결합 결정기를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국특허 No. 5,260,203; 미국특허 No. 5,455,030; 미국특허 No. 4,881,175; 미국특허 No. 5, 132,405; 미국특허 No. 5,091,513; 미국특허 No. 5,476,786; 미국특허 No. 5,013,653; 미국특허 No. 5,258,498; 및 미국특허 No. 5,482,858에 기재되어 있다.
이중특이적 분자의 특이적 표적에 대한 결합은 당업계에 공지된 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성면역분석(RIA), FACS 분석, 바이오어쎄이(예를 들어, 성장 억제), 또는 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 확인될 수 있다. 이들 분석은 각각 일반적으로 관심 복합체에 특이적인 표지된 시약(예를 들어, 항체)을 이용함으로써 특정한 관심 단백질-항체 복합체를 검출한다.
X. 진단
한 구체예에서, 항-FAM19A5 항체에 부착되는 부분은 결합 부분, 표지화 부분 및 생물학적 활성 부분으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 제시된 항체는 샘플 시험 및 생체내 영상화를 포함하는 진단 목적으로 위해 사용될 수 있으며, 이 목적을 위해 항체(또는 그것의 결합 부분)는 적절한 검출가능한 제제에 콘쥬게이트됨으로써 면역콘쥬게이트를 형성할 수 있다. 진단 목적을 위해, 적절한 제제는 방사성동위원소를 포함하는 검출가능한 표지이고, 전체 신체 영상화를 위한 적절한 제제는 방사성동위원소, 효소, 형광 표지 및 샘플 시험을 위한 다른 적합한 항체 택이다.
검출가능한 표지는 시험관내 진단 분야에서 현재 사용되는 다양한 종류 중 어느 것일 수 있으며, 콜로이드상 금과 같은 금속 졸을 포함하는 미립자 표지, 예를 들어 N2S2, N3S 또는 N4 타입의 펩타이드 킬레이트화제와 함께 제시되는 I125 또는 Tc99와 같은 동위원소, 형광 마커, 발광 마커, 인광 마커 등을 포함하는 발색단, 뿐만 아니라 주어진 기질을 검출가능한 마커로 전환하는 효소 표지, 및 중합효소 연쇄반응과 같은 증폭 후 드러나는 폴리뉴클레오타이드 택을 포함한다. 적합한 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제 등을 포함한다. 예를 들어, 표지는 1,2-다이옥세탄 기질의 전환 후 화학발광의 존재 또는 형성을 측정함으로써 검출되는, 효소 알칼리성 포스파타아제, 예컨대 아다만틸 메톡시 포스포릴옥시페닐 다이옥세탄(AMPPD), 다이소듐 3-(4-(메톡시스피로{1,2-다이옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트라이시클로{3.3.1.1 3,7}데칸}-4-일)페닐포스페이트(CSPD) 뿐만 아니라 CDP 및 CDP-star® 또는 당업자에게 잘 공지된 다른 발광 기질, 예를 들어 테르븀(III) 및 유로퓸(III)과 같은 적합한 란탄족 원소의 킬레이트일 수 있다. 검출 수단은 선택된 표지에 의해 결정된다. 표지 또는 그것의 반응 생성물의 출현은 표지가 미립자이고 적절한 수준으로 축적되는 경우에는 육안을 사용하여, 또는 분광광도계, 발광측정계, 형광측정계 등과 같은 기기를 사용하여 확인할 수 있으며, 모두 표준 실시과정에 따른다.
또한, 본 명세서에 제시된 항체는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)와 같은 면역콘쥬게이트를 형성하기 위해 치료제에 콘쥬게이트될 수 있다. 적합한 치료제는 신경아교증 및/또는 반응성 성상세포증의 개시를 조정하고 및/또는 퇴행성 뇌 장애, 중추신경계 손상, 또는 신경병증성 통증을 치료하는 제제를 포함한다. 퇴행성 뇌 장애를 치료하기 위한 치료제는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)를 치료하는 약물을 포함한다. 치료제는 이러한 퇴행성 뇌 장애를 치료하기 위해 통상 사용되는 약물, 예를 들어 제XII장에 개시된 약물을 포함한다.
면역콘쥬게이트는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게, 콘쥬게이션 방법은 실질적으로(또는 거의) 비-면역원성인 결합, 예를 들어 펩타이드-(즉, 아미드-), 설파이드-, 다이설파이드-, 하이드라존- 및 에테르 결합을 가져온다. 이들 결합은 거의 비-면역원성이며 혈청 내에서 적합한 안정성을 나타낸다(예를 들어, Senter, P. D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886 참조).
모이어티 및 항체의 생화학적 성질에 따라, 상이한 콘쥬게이션 전략이 이용될 수 있다. 모이어티가 자연적으로 발생하거나 또는 50 내지 500개 아미노산의 재조합체인 경우, 단백질 콘쥬게이트 합성의 표준 과정은 문헌에 기재되어있으며, 당업자는 이를 쉽게 재현할 수 있다(예를 들어, Hackenberger, C. P. R., and Schwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47 (2008) 10030-10074 참조). 한 구체예에서, 항체 또는 모이어티 내의 시스테인 잔기와 말레인이미도 모이어티의 반응이 사용된다. 이것은, 항체의 Fab 또는 Fab'-단편이 사용되는 경우 특히 적합한 커플링 화학이다. 또는, 한 구체예에서, 항체 또는 모이어티의 C-말단 단부와의 커플링이 수행된다. 단백질, 예를 들어 Fab-단편의 C-말단 변형은, 예를 들어 문헌(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)에 기재된 대로 수행될 수 있다.
일반적으로, 부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 다른 작용기의 반응성에 직교하는 반응성을 가진 아미노산으로 천연 아미노산을 변형하는 것에 기초한다. 예를 들어, 희귀한 서열 내용 내의 특정한 시스테인은 알데하이드로 효소적으로 전환될 수 있다(Frese, M. A., 및 Dierks, T., ChemBioChem. 10 (2009) 425-427 참조). 또한, 주어진 서열 내용에서 천연 아미노산과 특정 효소의 특이적 효소 반응성을 이용함으로써 원하는 아미노산 변형을 얻는 것이 가능하다(예를 들어, Taki, M. et al, Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126; Gautier, A. et al, Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; 및 Protease-catalyzed formation of C-N bonds is used by Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry (2004) 389-403 참조).
부위 특이적 반응 및 공유 커플링은 적절한 변형 시약과 말단 아미노산의 선택적 반응에 의해 또한 달성될 수 있다. N-말단 시스테인과 벤조니트릴의 반응성이 부위-특이적 공유 커플링을 달성하기 위해 사용될 수 있다(Ren, H. et al, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48 (2009) 9658-9662 참조). 자생적 화학 라이게이션도 C-말단 시스테인 잔기에 의존할 수 있다(Taylor, E. Vogel; Imperiali, B, Nucleic Acids and Molecular Biology (2009), 22 (Protein Engineering), 65-96 참조).
EP 1 074 563은 양으로 하전된 아미노산의 스트레치에 위치된 시스테인과 음으로 하전된 아미노산의 스트레치 내의 시스테인의 빠른 반응에 기초한 콘쥬게이션 방법을 개시한다.
모이어티는 또한 합성 펩타이드 또는 펩타이드 의태체일 수 있다. 폴리펩타이드가 화학적으로 합성되는 경우, 직교하는 화학 반응성을 가진 아미노산이 이러한 합성 동안 통합될 수 있다(예를 들어, de Graaf, A.J. et al, Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295 참조). 상당히 다양한 직교 작용기들이 관련되어 있고 합성 펩타이드에 도입될 수 있기 때문에, 링커에 이러한 펩타이드의 콘쥬게이션은 표준 화학이다.
단일-표지된 폴리펩타이드를 얻기 위해, 1:1 화학량론의 콘쥬게이트가 다른 콘쥬게이션 부산물로부터 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다. 이 과정은 염료 표지된 결합 쌍 구성원과 하전된 링커를 사용함으로써 촉진될 수 있다. 전하 및 분자량의 차이가 분리에 사용될 수 있기 때문에, 표지되고 고도로 음으로 하전된 결합 쌍 구성원을 사용함으로써 단일-콘쥬게이트된 폴리펩타이드가 비-표지된 폴리펩타이드 및 둘 이상의 링커를 지닌 폴리펩타이드로부터 쉽게 분리된다. 형광 염료는 표지된 1가 바인더와 같은 미결합 성분으로부터 복합체를 정제하는데 유용할 수 있다.
XI. 약학 조성물
생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA) 중에 원하는 정도의 순도를 가진 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제는 이용된 투약량 및 농도가 수혜자에게 비독성이며, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산과 같은 버퍼; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄클로라이드; 헥사메토늄클로라이드; 벤잘코늄클로라이드, 벤제토늄클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 카운터 이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN®, PLURONICS® 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
특정 구체예에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 예방제 또는 치료제를 제약학적으로 허용되는 담체 중에 포함한다. 특정 구체예에서, 약학 조성물은 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분의 유효량, 및 선택적으로 하나 이상의 추가의 예방제 또는 치료제를 제약학적으로 허용되는 담체 중에 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 약학 조성물에 포함된 유일한 활성 성분이다. 본 명세서에 제시된 약학 조성물은 FAM19A5 활성을 증진, 유도 또는 활성화하고 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애 또는 신경병증성 통증과 같은 상태를 치료하는데 유용할 수 있다.
비경구 제제에 사용된 제약학적으로 허용되는 담체는 수성 비히클, 비수성 비히클, 항균제, 등장제, 버퍼, 항산화제, 국소마취제, 현탁 및 분산제, 유화제, 봉쇄 또는 킬레이트화제 및 다른 제약학적으로 허용되는 물질을 포함한다. 수성 비경구 비히클의 예들은 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로오스 주사액, 멸균수 주사액, 덱스트로오스 및 락테이트 링거 주사액을 포함한다. 비수성 비경구 비히클은 식물 기원의 고정유, 면실유, 옥수수유, 참깨유 및 땅콩유를 포함한다. 정균 또는 정진균 농도로 항균제가 다중-용량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있으며, 이들은 페놀 또는 크레졸, 수은 함유 물질, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-하이드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤잘코늄클로라이드 및 벤제토늄클로라이드를 포함한다. 등장제는 염화나트륨 및 덱스트로오스를 포함한다. 버퍼는 포스페이트 및 시트레이트를 포함한다. 항산화제는 소듐 바이설페이트를 포함한다. 국소마취제는 프로카인 염산염을 포함한다. 현탁 및 분산제는 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 유화제는 폴리소르베이트 80(TWEEN® 80)을 포함한다. 금속 이온의 봉쇄 또는 킬레이트화제는 EDTA를 포함한다. 제약학적 담체는 또한 수 혼화성 비히클을 위해 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜을 포함하고, pH 조정을 위해 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
약학 조성물은 대상에게 투여하는 임의의 경로에 맞게 제제화될 수 있다. 투여 경로의 구체적인 예들은 비내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하 또는 심실내 경로를 포함한다. 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 특징으로 하는 비경구 투여가 또한 고려된다. 주사제는 종래의 형태로, 액체 용액이나 현탁액으로, 주사 전 용액 또는 현탁액이 되는데 적합한 고체 형태로 또는 에멀젼으로 제조될 수 있다. 주사제, 용액 및 에멀젼은 또한 하나 이상의 부형제를 함유한다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤 또는 에탄올이다. 또한, 투여되는 약학 조성물은 습윤제, 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해성 증진제, 및 다른 제제, 예컨대 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 및 사이클로덱스트린과 같은 비-독성 보조 물질을 소량 함유할 수 있다.
항체의 비경구 투여용 제제는 사용 직전 바로 주사가능한 멸균 용액, 멸균 건조 가용성 제품, 예컨대 사용 직전 바로 용매와 조합될 수 있는 동결건조 분말, 예를 들어 피하주사용 정제, 사용 직전 바로 주사가능한 멸균 현탁액, 사용 직전 바로 비히클과 조합될 수 있는 멸균 건조 불용성 제품 및 멸균 에멀젼을 포함한다. 용액은 수성이거나 비수성일 수 있다.
정맥내 투여되는 경우, 적합한 담체는 생리 식염수 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 증점제 및 가용화제를 함유하는 용액, 예컨대 글루코오스, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜 및 이들의 혼합물을 포함한다.
항체를 포함하는 국소 혼합물은 국소 및 전신 투여용으로 기술된 대로 제조된다. 얻어진 혼합물은 용액, 현탁액, 에멀젼 등일 수 있고, 크림, 젤, 연고, 에멀젼, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크, 페이스트, 폼, 에어로졸, 관류제, 스프레이, 좌약, 붕대, 피부 패치 또는 국소 투여에 적합한 임의의 다른 제제로 제제화될 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은, 예를 들어 흡입에 의한 국소 적용을 위한 에어로졸로서 제제화될 수 있다(예를 들어, 염증성 질환, 특히 천식의 치료에 유용한 스테로이드의 송달을 위한 에어로졸을 설명하는 미국특허 Nos. 4,044,126, 4,414,209 및 4,364,923 참조). 기도에 투여하기 위한 이들 제제는 에어로졸 또는 네불라이저용 용액의 형태, 또는 흡입제용 마이크로핀 분말일 수 있으며, 단독으로 또는 락토오스와 같은 비활성 담체와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 경우, 제제의 입자는, 한 구체예에서 50 마이크로 미만, 한 구체예에서 10 마이크론 미만의 직경을 가진다.
본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 국부 또는 국소 적용을 위해, 예를 들어 피부 및 점막에, 예컨대 눈에 국소 적용을 위해, 젤, 크림 및 로션의 형태로, 및 눈에 적용하거나 또는 수조내 또는 척수내 적용을 위해 제제화될 수 있다. 국소 투여는 경피 송달 및 눈 또는 점막 투여용으로, 또는 흡입 치료요법용으로 고려된다. 항체 단독 또는 다른 제약학적으로 허용되는 부형제와 조합된 점비액이 또한 투여될 수 있다.
이온영동 및 전기영동 장치를 포함하는 경피 패치가 당업계에 공지되어 있으며, 이는 항체를 투여하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 패치는 미국특허 No. 6,267,983, 6,261,595, 6,256,533, 6,167,301, 6,024,975, 6,010715, 5,985,317, 5,983, 134, 5,948,433, 및 5,860,957에 개시된다.
특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분을 포함하는 약학 조성물은 동결건조된 분말이며, 용액, 에멀젼 및 다른 혼합물로서 투여하기 위해 복원될 수 있다. 또한, 약학 조성물은 고체 또는 젤로서 복원되고 제제화될 수 있다. 동결건조된 분말은 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 또는 그것의 제약학적으로 허용되는 유도체를 적합한 용매에 용해함으로써 제조된다. 일부 구체예에서, 동결건조된 분말은 멸균 분말이다. 용매는 분말 또는 분말로부터 제조된 복원된 용액의 안정성 또는 다른 약학적 성분을 개선하는 부형제를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 부형제의 비 제한적인 예는 덱스트로오스, 소르비톨, 프럭토오스, 옥수수 시럽, 자일리톨, 글리세린, 글루코오스, 수크로오스 또는 다른 적합한 제제를 포함한다. 또한, 용매는, 중성 pH 버퍼, 예컨대 시트레이트, 소듐 또는 포타슘 포스페이트 또는 당업계에 공지된 다른 버퍼를 함유할 수 있다. 용매를 후속 멸균 여과한 후 당업계에 공지된 표준 조건하에 동결건조하여 원하는 제제를 얻을 수 있다. 한 구체예에서, 얻어진 용액은 동결건조용 바이알에 분배될 것이다. 각 바이알은 화합물의 단일 투약량 또는 다수 투약량을 함유할 것이다. 동결건조된 분말은 적절한 조건하에, 예컨데 약 4℃ 내지 실온에서 보관될 수 있다.
주사용수로 동결건조된 분말을 복원시켜 비경구 투여용 제제를 얻을 수 있다. 복원을 위해, 동결건조된 분말은 멸균수 또는 다른 적합한 담체에 첨가된다. 정확한 양은 선택된 화합물에 따른다. 이러한 양은 경험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 면역콘쥬게이트 및 본 명세서에 제시된 다른 조성물은 또한 치료될 특정 조직, 수용체 또는 대상의 신체의 다른 영역에 표적화되도록 제제화될 수 있다. 많은 표적화 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 표적화 방법은 즉석 조성물에 사용하기 위해 고려된다. 표적화 방법의 비제한적 예는 미국특허 Nos. 6,316,652, 6,274,552, 6,271,359, 6,253,872, 6,139,865, 6,131,570, 6,120,751, 6,071,495, 6,060,082, 6,048,736, 6,039,975, 6,004,534, 5,985,307, 5,972,366, 5,900,252, 5,840,674, 5,759,542, 및 5,709,874를 참조한다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항체 또는 그것의 항원-결합 부분은 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 또는 신경병증성 통증을 치료하도록 표적화된다.
생체내 투여하기 위해 사용될 수 있는 조성물은 멸균될 수 있다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
XII. 키트
본 명세서에 제시된 하나 이상의 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자, 또는 그것의 면역콘쥬게이트를 포함하는 키트가 개시된다. 특정 구체예에서, 본 명세서에 제시된 하나 이상의 항체 또는 그것의 항원-결합 부분과 같은, 본 명세서에 제시된 약학 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 채워진 하나 이상의 용기, 및 선택적인 사용설명서를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트가 개시된다. 일부 구체예에서, 키트는 본 명세서에 제시된 약학 조성물 및 본 명세서에 제시된 임의의 예방제 또는 치료제를 함유한다.
XIII. 치료적 사용 및 방법
한 양태에서, 대상의 CNS의 상해 또는 손상을 완화하기 위한 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 대상의 신경아교증의 시작 또는 개시 및 CNS에 대한 그것의 관련된 유해한 효과를 저해, 지연, 억제, 제한 또는 예방하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상의 반응성 성상세포의 과도한 또는 비정상적 증식 및 CNS에 대한 그것의 관련된 유해한 효과를 저해, 지연, 억제, 제한 또는 예방하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, 대상의 뉴로칸, NG2 또는 이 둘 다의 수준을 저하, 저해, 감소시키거나, 또는 뉴로칸, NG2 또는 이 둘 다의 활성을 감소시키거나 비활성으로 만드는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상에서 상해 또는 손상 후 뉴런의 성장을 자극, 촉진, 증가 또는 활성화하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상에서, 바람직하게는 뉴런의 핵에서 c-fos mRNA, c-fos 단백질, 또는 c-fos 단백질 활성의 수준을 증가시키고 ERK mRNA, ERK 단백질 또는 pERK 활성을 증가시키는 방법이 개시되며, 이 방법은 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 필요한 대상에서, 바람직하게는 뉴런에서 GAP43 mRNA, GAP43 단백질의 수준을 증진 또는 증가시키거나, 또는 GAP43 단백질의 활성을 증가시키는 방법이 개시되며, 이 방법은 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상의 뉴런의 생존을 증진 또는 촉진하고 및/또는 축삭돌기의 재성장을 촉진하는 방법이 개시되며, 이 방법은 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상은 인간, 예를 들어 CNS 손상, 외상, 상해, 뇌척수 손상, 뇌종양, 감염, 허혈, 뇌졸중, 자가면역반응 및/또는 신경퇴행성 질환으로부터 뉴런의 상해 또는 손상을 가진 인간이다.
일부 구체예에서, 대상의 중추신경계 손상, 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애, 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애 또는 신경병증성 통증을 포함하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 중추신경계 손상은 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 퇴행성 뇌 장애는 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 또는 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 대상의 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양 또는 이들의 조합을 치료하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 대상의 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, ALS를 치료하는 방법이 개시되며, 이 방법은 대상에게 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트, 또는 그것의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트의 치료적 유효량이 투여된다. 대상(예를 들어, 인간)을 치료할 때, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트의 치료적 유효량은 나이, 성별, 질환의 심각도와 같은 요인들에 따르며, 당업자(예를 들어, 의사)에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트는 하루 0.01μg 내지 1000mg의 용량으로 투여된다. 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트는 질환 또는 장애의 증상 및 심각도에 따라 하루 1회, 2회, 또는 그 이상의 횟수로 투여될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 부분, 이중특이적 분자 또는 면역콘쥬게이트 또는 그것의 조성물은 정맥내, 경구, 비경구, 척추강내, 뇌실내, 폐, 피하 또는 심실내 경로로 투여된다.
일부 구체예에서, 항-FAM19A5 항체 또는 그것의 항원-결합 분자, 또는 그것의 조성물은 중추신경계 손상(예를 들어, 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중 또는 뇌종양), 뇌척수계 손상, 퇴행성 뇌 장애(예를 들어, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 골수종, ALS), 퇴행성 뇌척수 또는 신경 장애, 또는 신경병증성 통증을 치료하기 위한 하나 이상의 추가의 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 헌팅턴병을 치료하기 위한 비제한적 예시적 제제는 테트라베나진(XENAZINE®), 항정신병 약물, 예컨대 할로페리돌(HALDOL®), 클로르프로마진, 리스페리돈(rRIDPERDAL®) 및 퀴티아핀(SEROQUEL®)을 포함한다.
파킨슨병을 치료하기 위한 비제한적 예시적 제제는 레보도파(카비도파와 함께 또는 카비도파 없이)(LODOSYN®), 도파민 작용제, 예컨대 프라미펙솔(MIRAPEX®), 로피니롤(REQUIP®), 및 로티고틴(NEUPRO®), 및 아포몰핀(APOKYN®), 셀레길린(ELDEPRYL®, ZELAPAR®), 라사길린(AZILECT®), 엔타카폰(COMTAN®), 벤즈트로핀(COGENTIN®), 트리헥시페니딜, 및 아만타딘을 포함한다.
알츠하이머병을 치료하기 위한 비제한적 예시적 제제는 도네페질(ARICEPT®), 갈란타민(RAZADYNE®), 및 리바스티그민(EXELON®)을 포함한다.
다발성 골수종을 치료하기 위한 비제한적 예시적 제제는 글라티라메르 아세테이트(COPAXONE®), 디메틸푸마레이트(TECFIDERA®), 핑골리모드(GILENYA®), 테리피우노미드(AUBAGIO®), 나탈리주맙(TYSABRI®), 알렘투주맙(LEMTRADA®), 및 미톡산트론(NOVANTRONE®)을 포함한다.
ALS를 치료하기 위한 비제한적 예시적 제제는 릴루졸(RILUTEK®)을 포함한다.
하나 이상의 추가의 치료 약물의 용량 및 투여는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 각각의 약물의 제품 라벨에 기재된다.
본 발명은 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 상기 항체는 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하고 FAM19A5 활성을 조절하며, 예를 들어 이러한 항체를 이용하여 반응성 신경아교증의 개시 및/또는 반응성 성상세포의 과도한 증식을 저해, 억제, 감소 또는 역전시킨다. 본 발명은 또한 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 항체를 투여함으로써 중추신경계 손상, 퇴행성 뇌 장애 또는 신경병증성 통증과 같은 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
도 1a, 1b 및 1c는 FAM19A5 단백질에 대한 개별 scFv 클론의 결합 분석을 도시한다. 흡광도는 405nM에서 측정되었다. 클론 넘버는 X 축에 표시된다. 도 1a, 1b 및 1c는 각각 제1 닭, 제2 닭 및 제3 닭으로부터 유래된 3차, 4차 또는 5차 바이오-패닝(bio-panning)으로부터의 96개 클론의 분석을 도시한다.
도 2는 포유류 발현 백터로의 항-FAM19A5 항체(scFv)의 서브클로닝을 위한 도식적 다이어그램을 도시한다.
도 3은 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)의 SDS-PAGE 결과를 도시한다. 좌측 패널은 환원 SDS-PAGE를 나타내고, 우측 패널은 비-환원 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 4는 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)가 인간 FAM19A5에 특이적으로 결합하는 것을 도시한다.
도 5a는 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)가 FAM19A5 단백질에는 특이적이지만 FAM19A 서브패밀리의 다른 단백질에는 결합하지 않는 것을 도시한다.
도 5b는 FAM19A5 발현에 대한 면역세포화학(ICC, 좌측 패널) 및 면역조직화학(IHC, 우측 3개 도면) 분석을 도시한다. ICC 결과는 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)가 His-택과 콘쥬게이트된 FAM19A5 단백질에 결합한다는 것을 나타낸다. IHC 결과는 FAM19A5 단백질이 정상 마우스(좌측)의 부뇌실 구역의 GFAP 단백질-발현 세포에서 발현된다는 것을 나타내며, 5일 동안 외상성 뇌 상해를 가진 마우스의 손상된 반영(TBI5D, 중앙)에서, 그리고 7일 동안 허혈성 뇌 상해를 가진 래트의 손상된 반영(IBI7D, 우측)에서 발현된다.
도 6은 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)(하부 패널)가 외상성 뇌 상해(TBI) 마우스 모델에서 신경아교증의 개시를 억제, 감소, 지연, 및/또는 역전시킨다는 것을 도시한다. 정상 인간 대조군 면역글로불린(HCI)이 대조군으로 사용되었다(상부 패널). 항-FAM19A5 항체 또는 대조군 항체는 0.1μg, 0.3μg, 1μg, 3μg, 5μg 또는 10μg의 농도 중 하나로 마우스에 투여되었다.
도 7은 외상성 뇌 상해 마우스 모델에서 키메라 항-FAM19A5-IgG2/4 단클론성 항체(1-65)(우측 패널)의 신경보호 효과를 도시한다. 정상 인간 대조군 면역글로불린(HCI)이 대조군으로 사용되었다(좌측 패널). 동물은 항체 5μg을 섭취하였다. 상부 패널은 손상된 영역의 반영 내에서 GFAP(신경교 섬유질 산성 단백질) 발현을 나타낸다. 하부 패널은 TBI 마우스에서 손상된 영역의 확대된 구역 내에서 GFAP와 NeuN(뉴런 핵)의 공-발현을 나타낸다. 점선은 외상성 뇌 상해에 노출 후 병소 경계를 표시한다.
도 8은 인간화 항-FAM19A5-IgG2/4 항체(1-65)(원, C 그룹), 토끼 항-FAM19A5 다클론성 항체(사각, B 그룹), 또는 비히클 대조군(다이아몬드, A 그룹)으로 치료된 척수 상해를 가진 동물의 기능 회복 결과를 도시한다. 항-FAM19A5 항체에 의한 동물의 치료는 BBB 운동능 분석(좌측)과 경사면 시험(우측)에서 모두 운동 활성을 개선한다. 각 도면 아래의 표는 TBI 유도 후 상이한 날짜("dpi")에서 측정된 특정 점수를 나타낸다.
도 9는 상이한 종(즉, 인간, 마우스, 래트 및 닭)의 FAM19A5 아미노산 서열의 정렬을 도시한다. 에피토프 맵핑 분석에 사용된 단편 F1-F6이 표시된다. 신호 펩타이드는 밑줄로 표시된다.
도 10은 에피토프 F1-F6(BSA에 콘쥬게이트)의 아미노산 서열과 인간 FAM19A5 폴리펩타이드 상에서 아미노산의 위치를 도시한다. 위에 도시된 아미노산 서열은 야생형 FAM19A5 이소폼 2(신호 펩타이드가 없음)이다. 아래에 도시된 아미노산 서열은 동일한 서열이지만 펩타이드 합성 동안 비특이적 활성을 감소시키기 위해 시스테인 잔기가 세린으로 돌연변이되었다. 상이한 에피토프 단편들의 크기는 괄호 안에 표시된다.
도 11은 에피토프 단편 F1 내지 F6에 대한 단클론성 항체 클론 1-65의 결합에 대한 웨스턴 블롯 결과를 도시한다(각각 레인 3-8). FAM19A5-CK(레인 1), PSA-CK(레인 2), 펩타이드 NDV-BSA(레인 9) 및 BSA(레인 10)가 대조군으로 사용되었다. 사용된 항원의 각각의 크기는 블롯의 우측에 표시된다. 웰당 사용된 항원의 양은 300ng이다. 웨스턴 블롯에 사용된 1차 항체는 1-65-scFv-토끼-Fc-SSS(2 μg/ml)이고, 사용된 2차 항체는 항-토끼 IgG(Fc 특이적)-HRP(1:4000)이다.
도 12a 및 12b는 에피토프 단편 F1 내지 F6에 대한 몇몇 항-FAM19A5 항체의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 도 12a는 항-FAM19A5 항체 1-65, 2-13, 및 3-2에 대한 결과를 도시한다. 3-2 항체에 대해, 2개의 다음과 같이 상이한 이소타입이 도시된다: 인간 IgG1("h3-2") 및 마우스 IgG1("m3-2"). 도 12b는 P2-C12 항체에 대한 결과를 도시한다. 각각의 항체에 대해, 1st, 2nd, 3rd, 4th, 5th 및 6th 막대(좌측에서 시작해서)는 각각 에피토프 단편 F1, F2, F3, F4, F5 및 F6에 대한 결합을 나타낸다. 맨 우측 막대(검은색)는 양성 대조군(즉, His-택 FAM19A5 단백질)을 나타낸다. 정확한 O.D. 값은 각 막대의 상부에 표시된다.
도 13a 및 13b는 8개의 상이한 FAM19A5 단편 5 돌연변이 펩타이드(F5-1 내지 F5-8)에 대한 항-FAM19A5 항체 1-65(도 13a) 및 P2-C12(도 13b)의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 정확한 O.D. 값은 각 막대의 상부에 표시된다.
도 14는 FAM19A 패밀리(즉, FAM19A1-5)의 상이한 멤버들의 아미노산 서열 정렬을 도시한다. 멤버들 중 가장 큰 아미노산 다양성을 가진 영역이 박스로 표시되며 EP1 내지 EP8로 나타낸다.
도 15a 내지 15c는 FAM19A5 돌연변이 M1 내지 M8에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 도 15a는 항-FAM19A5 항체 1-65, 1-28, 2-13 및 3-2에 대한 결과를 도시한다. 도 15b는 항-FAM19A5 항체 13B4, 13F7 및 15A9에 대한 결과를 도시한다. 도 15c는 항-FAM19A5 항체 P1-A08, P1-F02, P1-G09, P2-A01, P2-A03, P2-C12, P2-F07 및 P2-F11에 대한 결과를 도시한다. 도 15a 내지 15C에서, 각각의 항체에 대한 8개의 막대는 돌연변이 M1 내지 M8에 상응한다(좌측에서 우측으로).
도 16a는 상이한 항-FAM19A5 항체들 간 상호 경쟁을 평가하기 위해 사용된 2 부위 샌드위치 ELISA 분석의 도식적 다이어그램을 도시한다. 도 16b는 6개의 상이한 항-FAM19A5 항체: 1-65, P2-A03, P2-F11, 13B4, 2-13 및 3-2에 대한 상호 경쟁 분석의 결과를 도시한다. 용어 "S/N"은 신호 대 노이즈 비율을 말하며, 이것은 다음과 같이 측정된다: [10 ng/mL 항원의 O.D.] / [0 ng/mL 항원의 O.D.]. 회색 상자는 상호 경쟁을 나타낸다(즉, 2 미만의 S/N 비율).
도 17a 내지 17d는 FAM19A5에 대한 항체 1-65(도 17a), 13B4(도 17b), 13F7 (도 17c), 및 15A9(도 17d)의 결합에 대한 OCTET 시험 결과를 도시한다. 각각의 항체에 대해 Kd 값이 또한 표시된다. 도 17a 내지 17D에서, 각각의 라인은 시험에 사용된 항-FAM19A5 항체의 상이한 농도(즉, 300nM, 100nM, 33nM, 11nM, 3.3 nM,또는 1.1nM)에 상응한다.
도 18a 및 18b는 FAM19A5에 대한 몇몇 항-FAM19A5 항체의 결합에 대한 ELISA 결과를 도시한다. 다음의 항체들에 대한 결과가 도시된다: 1-65, 13B4, 13F7, 1-28, 2-13, 3-2, P1-A03, P1-A08, P1-D03, P1-F02, P1-G09, P2-A01, P2-A03, P2-C12, P2-F07 및 P2-F11(좌측에서 우측으로). 도 18a는 항-FAM19A5 항체의 다양한 농도에 대한 막대그래프로서 결과를 도시한다. 도 18b는 상이한 항-FAM19A5 항체에 대한 Kd(nM)를 나타낸다.
도 19a 내지 19e는 상이한 FAM19A5 항체(100μg/마우스)로 치료된 동물로부터 뇌 조직의 손상된 영역의 대표적인 면역조직화학 이미지를 제공한다. 도 19a는 두 상이한 농도 100μg(상부 열) 및 10μg(하부 열)에서 항체 13B4에 대한 대표적인 이미지를 도시한다. 도 19b는 항체 13F7에 대한 6개의 상이한 대표적인 이미지를 도시한다. 도 19c는 항체 15A9에 대한 3개의 상이한 대표적인 이미지를 도시한다. 도 19d는 항체 P2-A03(상부 열) 및 P2-F11(하부 열)에 대한 각각 3개의 대표적인 이미지를 도시한다. 도 19e는 항체 P1-A03에 대한 3개의 대표적인 이미지를 도시한다. 각각의 이미지에서, 뇌 조직 부분은, 뇌 상해 후 반응성 성상세포에서 유도되는 것으로 알려진, GFAP(신경교 섬유질 산성 단백질, 녹색) 및 네스틴(붉은색)으로 염색되었다. 점선은 외상성 뇌 상해에 노출 후 병소 경계를 표시한다.
실시예
다음의 실시예들은 예시를 위한 것이며, 제한을 위한 것은 아니다.
실시예 1: 인간 FAM19A5 단백질의 발현 및 정제
재조합 인간 FAM19A5 단백질을 아래 기재된 대로 제조 및 정제하고, 정제된 단백질을 결합 친화성 분석 기초 항체 스크리닝 분석에 사용했다. 먼저, FAM19A5 유전자를 발현하는 LPS-hT 플라스미드를 박테리아에 형질전환하고 단백질 과발현을 유도했다. 생성된 FAM19A5 단백질은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제했다. 이미다졸의 농도를 점차 높이면서 Ni-칼럼으로부터 His-택이 붙은 FAM19A5 단백질을 제거했다. 용액 중 단백질 발현은 Coomassie Brilliant Blue R-250 염료를 사용하여 측정했다. FAM19A5 이미다졸 함유 용액만을 취해서 PBS를 사용하여 FAM19A5 단백질을 농축했다. 농축이 완료되었을 때 FAM19A5 단백질의 순도 및 농도를 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 측정했다. 이어서 농축된 단백질을 사용하여 FAM19A5-특이적 항체를 스크리닝했다.
실시예 2: 항체 라이브러리 FAM19A5의 생성
1. 면역화
유-중-수 에멀젼 에쥬번트(RIBI + MPL + TDM + CWS 애쥬번트, Sigma, St. Louis, Mo, USA)를 함유하는 TDW 및 CWS의 세포벽 성분을 유화한 다음 닭 3마리 또는 토끼 4마리에 피하 주사했다. 닭 및 토끼를 각각 총 3번 및 4번 대략 2-3주 간격으로 면역화했다. 면역화된 동물로부터 얻어진 항체의 역가를 FAM19A5 단백질을 과발현한 HEK293T 세포의 세포용해물을 사용하여 면역 블롯팅을 통해 측정했다.
2. 면역화된 닭 및 토끼로부터 단쇄 가변 단편(scFv) 라이브러리의 생성
TRI 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 상기 개시된 면역화된 닭의 비장, 골수 및 활액낭(synovial sac)으로부터 RNA를 추출했다. Oligo-dT 프라이머 및 SUPERSCRIPT™ III 제1 가닥 합성 시스템(Invitrogen)을 사용하여 제1 가닥 cDNA를 합성했다. 동물의 면역계로부터 얻어진 cDNA에 대해, 확장형 고 충실도(Expand High Fidelity) PCR 시스템(Roche Molecular Systems, IN, USA)을 사용하여 단쇄 가변 영역 라이브러리를 생성했다. 각 반응에서, 1μL cDNA, 각 프라이머 60 pmol, 10μL 10x 반응 버퍼 용액, 8μL 2.5mM dNTP(Promega, Madison, WI, USA) 및 0.5μL Taq DNA 중합효소를 물과 혼합했다. 최종 부피는 100μL였다. PCR 반응은 다음의 조건을 사용하여 수행되었다: (i) 94℃에서 15초, (ii) 56℃에서 30초 및 (iii) 72℃에서 90초, 이후 72℃에서 10분간 최종 익스텐션의 30 사이클. 약 350 bp의 길이를 가진 단편을 포함하는 PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔에 로딩하고 전기영동한 후, QIAGEN Gel II 추출 키트(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 뉴클레오타이드 단편을 정제했다. 정제된 PCR 생성물을 OD 260nm에서 판독함으로써 정량했다(1 단위 OD = 50μg/ml).
2차 PCR로부터의 2개의 VH 및 VL 1차 생성물을 오버랩 익스텐션 PCR(Overlap extension PCR)에 의해 무작위로 연결했다. 각 PCR 반응은 100ng의 정제된 VL 및 VH 생성물, 각 프라이머 60 pmol, 10μL 10x 반응 버퍼, 8μL 2.5mM dNTP, 0.5μL Taq DNA 중합효소 및 최종 부피 100μL가 되도록 물과 혼합했고, 다음의 조건하에 PCR을 수행했다: (i) 94℃에서 15초, (ii) 56℃에서 30초 및 (iii) 72℃에서 2분, 이후 72℃에서 10분간 최종 익스텐션의 25 사이클. 약 700 bp의 길이를 가진 단쇄 가변 영역 단편을 포함하는 PCR 생성물을 1.5% 아가로오스 겔에 로딩하고 전기영동한 후, QIAGEN Gel II 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 뉴클레오타이드 단편을 정제했다. 정제된 PCR 생성물을 OD 260nm에서 판독함으로써 정량했다(1 단위 OD = 50μg/ml).
3. 라이브러리, 라이게이션 및 형질전환
PCR 생성물의 scFv 단편과 벡터 pComb3X-SS(The Scripps Research Institute CA, USA)를 Sfi I 제한 효소로 분해했다. 정제된 중첩 PCT 생성물 10μg을 360 단위의 Sif I(16 단위당 μg DNA, Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA, USA), 20μL 10x 반응 버퍼 및 최종 부피 200μL가 되도록 물과 혼합했다. pComb3X-SS 벡터 20μg을 120 단위의 Sfi I(6 단위당 μg DNA), 20μL 1Ox 반응 버퍼 용액 및 최종 부피 200μL가 되도록 물과 혼합했다. 혼합물을 8시간 동안 50℃에서 분해시켰다. 이후, scFv 단편(약 700 bp)과 벡터(약 3400 bp)를 포함하는 분해된 생성물을 1% 아가로오스 겔에 로딩하고 Gel Extraction Kit II QIAGEN(QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제했다.
Sfi I-제한된 pComb3X 벡터 1400ng 및 분해된 scFv 단편 700ng을 5x 리가아제 버퍼, 10μL T4 DNA 리가아제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 최종 부피 200μL가 되도록 물과 혼합했다. 혼합물을 16시간 동안 16℃에서 인큐베이션하여 라이게이션을 수행했다.
에탄올로 침전 후, DNA 펠릿을 물 15μL에 용해시켰다. 라이브러리를 생성하기 위해, 바이브레이터 유전자(유전자 퍼서: Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 전기천공을 통해 라이게이션 샘플을 이콜리 균주 ER2738(New England Biolabs Inc, Hitchin, Hertfordshine, SG4 OTY, England, UK)에 형질전환했다. 세포를 5ml SuperBroth(SB) 배지에서 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 250rpm에서 교반하면서 인큐베이션했다. 다음에, 100 mg/mL 카나마이신 3μL를 SB 배지 100mL에 첨가했다. 라이브러리 크기를 결정하기 위해, 배양 샘플 0.1μL, 1μL 및 10μL를 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 Luria Broth(LB) 아가 플레이트 위에 펼쳐발랐다. 1시간 동안 교반 후, 100 mg/mL 카나마이신 4.5μL를 LB 배양물에 첨가하고 1시간 더 교반했다. 다음에, VCM13 헬퍼 파지 수용액 2mL(> 1011 cfu/ml)를 100 mg/mL 카나마이신 92.5μL를 함유하는 예열된 LB(183mL)와 함께 LB 배지에 첨가했다. 이 혼합물을 37℃에서 250rpm에서 2시간 더 교반했다. 다음에, 카나마이신 280μL(50 mg/mL)를 배양물에 첨가하고 37℃에서 하룻밤 교반했다. 다음날, 박테리아 펠릿을 고속 원심분리기를 사용하여 3,000g, 4℃에서 원심분리했다. 이후, 박테리아 펠릿을 사용하여 파지미드 DNA를 추출했고, 상청액을 멸균 원심분리 병으로 옮겼다. 다음에, 상청액에 폴리에틸렌 글리콜-8000(PEG-8000, Sigma) 8g과 염화나트륨(NaCl, Merck) 6g을 첨가하고 얼음에서 30분간 유지시켰다. 이후, 상청액을 15,000g, 4℃에서 15분 원심분리했다. 다음에, 상청액을 버리고 파지 펠릿(1% BSA를 함유하는 Tris - 재현)을 완충 식염수(TBS)에 현탁시켰다.
실시예 3: 고정된 항원에 대한 라이브러리 패닝(바이오-패닝)
자기 비드(Dynabeads M-270 에폭시, Invitrogen)를 사용하여 바이오-패닝을 수행했다. 실온에서 20시간 동안 비드와 단백질을 함께 회전시키면서 교반하여 대략 1 x 107 비드를 재조합 FAM19A5 단백질 5μg로 코팅했다. 코팅이 완료되면 비드를 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 4번 세척하고 실온에서 3% BSA를 함유하는 PBS에서 1시간 차단시켰다. 다음에, 코팅된 비드를 상기 기재된 파지 디스플레이된 scFv와 함께 실온에서 2시간 동안 배양했다. 항원 코팅된 비드에 결합되지 않은 파지를 제거하기 위해 비드를 0.05% Tween 20/PBS로 세척했다. 다음에, 결합된 파지는 0.1M 글리신/염산(0.1M 글리신-HCl, pH 2.2) 50μL로 용출하고 염화수소를 가진 2M Tris(tris-HCl, pH 9.1) 3μL로 중화시켰다. 이 파지-함유 상청액을 사용하여 이콜리 ER2738 세포를 감염시켰고, VCSM13 헬퍼 파지를 사용하여 하룻밤 증폭시켜 구제했다. 또한, 50 μg/mL 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 파지-감염된 배양물을 블롯팅함으로써 파지-감염된 배양물로부터 파지 역가에 의한 투입(인풋) 및 생성(아웃풋)을 결정했다. 다음날, PEG-8000 및 NaCl을 사용하여 파지를 침전시키고, 이어서 바이오-패닝에 사용했다. 바이오-패닝은 상기 과정을 반복함으로써 최대 총 5회 수행되었다. 각 증폭마다 파지를 스크리닝하고 FAM19A5 단백질에 대한 높은 친화성에 대해 선택했다.
실시예 4: 파지 ELISA에 의한 클론의 선택
바이오-패닝으로부터 선택된 클론을 분석하기 위해, 파지 디스플레이된 scFv로부터 개별 클론을 무작위로 선택하고, ELISA를 사용하여 클론이 FAM19A5 재조합 단백질에 결합하는지 확인했다. FAM19A5 재조합 단백질을 0.1M NaHC03 버퍼에 희석하고, 100 ng/웰 단백질을 사용하여 16시간 동안 4℃에서 96-웰 마이크로타이터 플레이트를 코팅했다. 다음날, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 3% BSA/PBS로 차단했다. 다음에, 파지 상청액을 6% BSA/PBS와 혼합하고 37℃에서 2시간 배양했다. 다음에, 상청액을 함유하는 플레이트를 0.05% Tween-20/PBS로 세척했다. HRP-콘쥬게이트된 M13 항체(a-M13-HRP, Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA)를 1/5000으로 희석했다. 희석된 항체 50μL를 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 및 세척 후, 색 전개를 위해 플레이트에 0.05M 시트레이트 버퍼 용액, 1 μg/mL 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)(ABTS, Amresco, Solon, OH, USA) 및 0.1% H202를 첨가했다. 각 웰의 흡광도를 405nm에서 측정했다.
도 1a 내지 1c에 도시된 대로, FAM19A5 재조합 단백질에 결합하고 높은 흡광도를 나타내는 면역화된 닭으로부터 생성된 24개의 클론을 분석했다. 이들 24개 클론으로부터 독특한 서열을 가진 13개의 scFv 클론을 얻었다. 면역화된 토끼로부터 생성된 클론의 경우(데이터 미도시), 174개의 클론이 처음에 확인되었고, 이 중 164개의 클론이 서열화되었다. 이들 클론으로부터 최종적으로 22개의 독특한 scFv 서열을 얻었다.
실시예 5: 항-FAM19A5-IGG2/4 항체의 생성
1. 포유류 발현 벡터에 항-FAM19A5 scFv의 서브클로닝
FAM19A5 scFv 유전자 서열에서 인간 Cκ 유전자를 경쇄 가변 도메인에 연결하고, CH2, CH2 및 CH3 유전자의 인간 면역글로불린 이소타입 IgG2/4를 중쇄 가변 영역에 연결했다. 제한 부위(Genscript, USA)를 첨가함으로써 각 경쇄와 각 중쇄를 가진 항체를 합성했다. 합성된 유전자를 클로닝을 촉진하도록 변형된 제한 부위를 가진 포유류 세포 발현 벡터에 삽입했다. 먼저, 경쇄 유전자를 Hind III 및 Xba I(New England Biolabs, UK) 제한 효소를 사용하여 벡터에 삽입한 다음, Nhel 및 BamHI(New England Biolabs, UK) 제한 효소를 사용하여 중쇄 유전자를 벡터에 첨가했다(도 2).
2. 항-FAM19A5 항체의 정제
항-FAM19A5-IgG2/4 항체를 발현하고 정제하기 위해, 포유류 세포 트랜스펙션 및 과발현 주입 시스템을 사용했다. 포유류 발현 벡터 2 μg/mL와 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, Warrington, PA, USA) 4μg을 세포 배양물 부피의 1/10에 해당하는 150mM 염화나트륨(NaCl, Merck)에서 혼합했다. 혼합물을 실온에서 15분 방치했다. 혼합물을 HEK293F 세포(2 x 106 세포/ml, Invitrogen)에 첨가하고, 이어서 7% CO2 및 37℃에서 100 U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 FREESTYLE™ 293 발현 배양 배지에서 6일 동안 135rpm의 교반 조건하에 인큐베이션했다. 세포 배양 상청액으로부터 발현된 항-FAM19A5 IgG2/4 항체를 정제하기 위해, 단백질 A 비드(RepliGen, Waltham, MA, USA) 친화성 겔 크로마토그래피를 사용했다. 단백질 A 크로마토그래피 정제된 항체에 4-12% Bis-Tris 구배 겔 전기영동을 수행했다. 단백질의 크기 및 수율을 Coomassie Brilliant Blue 염색에 의해 확인했다(도 3).
실시예 6: 항-FAM19A5-IGG2/4 항체 특이성의 검증
단백질의 FAM19A 패밀리를 암호화하는 유전자로 안정적으로 트랜스펙션된 HEK293T 세포를 50mM Tris-HCl(pH 6.8), 2% SDS, 10% 글리세롤, 100mM 메르캅토에탄올 및 브로모페놀 블루를 함유하는 버퍼에서 세포용해시켰다. 전-세포 추출물을 SDS-폴리아크릴아미드(PAGE) 겔에서 분해시키고, Bio-Rad Trans-Blot 전기영동 장치(Hercules, CA, USA)의 니트로셀룰로오스 블롯팅 막으로 전달했다. 블롯을 0.3% Tween 20 및 5% 탈지유를 함유하는 Tris-완충 식염수에서 차단하고, 실온에서 3시간 동안 항-FAM19A5 항체와 함께 인큐베이션했다. 다음에, 이들을 TBS/0.3% Tween 20으로 3번 세척했다. 이어서 양고추냉이 퍼옥시다아제(Jackson ImmunoReserch Laboratories, West Grove, PA, USA)에 결합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하여 항체 결합을 검출했다. 블롯을 3번 세척하고, GE healthcare ECL 시약(Buckingham-shire, UK)의 적용 후 0.5분 또는 10분간 x-선 필름에 노출시켜 면역반응성 밴드를 시각화했다. 그 결과, 항-FAM19A5 항체 1-65가 Flag-택과 콘쥬게이트된 FAM19A5 단백질에는 특이적으로 결합하지만 다른 FAM19A 서브패밀리 단백질에는 결합하지 않는다는 것을 확인했다(도 5a). 면역세포화학 분석의 경우, FAM19A-패밀리 단백질을 발현하는 HEK293 세포를 4% PFA로 고정했다. 다음에, 세포를 실온에서 30분간 PBS에서 3% BSA 및 0.1% Triton X-100로 차단했다. 1차 항체(항-FAM19A5 항체 1-65)를 4℃에서 하룻밤 적용했다. PBS로 몇 번 세척 후, 적절한 2차 항체를 30분간 적용했다. 이어서 세포를 세척하고 형광 현미경이나 공초점 현미경에 장착해서 관찰했다(LSM700; Zeiss, Goettingen, Germany). 핵을 Hoechst 33342로 염색했다. HEK293T에서 발현된 His-택 FAM19A5의 면역세포화학 분석은 항-FAM19A5 항체 1-65가 His-택과 콘쥬게이트된 FAM19A5 단백질에 특이적으로 결합한다는 것을 나타냈다(도 5b, 좌측 패널).
실시예 7: FAM19A5 에피토프 단편 F1-F6을 사용한 에피토프 맵핑 분석
인간 FAM19A5 단백질의 중첩 펩타이드 단편(F1-F6, 도 9 참조)을 합성하고 BSA에 콘쥬게이트했다. 웨스턴 블롯 분석 또는 ELISA 분석에 의해 BSA-콘쥬게이트된 펩타이드 단편 F1-F6에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체의 결합을 확인했다. 웨스턴 블롯 분석의 경우, 표준 과정에 의해 BSA-콘쥬게이트된 FAM19A5 단편 F1-F6을 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리하고 니트로셀룰로오스 막으로 전달했다. 항-FAM19A5 항체(예를 들어, 1-65, 2 μg/ml, 1-65-scFv-토끼 Fc-SSS)와 함께 막을 인큐베이션하고, 양고추냉이 퍼옥시다아제와 콘쥬게이트된 적절한 2차 항체(항-토끼 IgG(Fc 특이적)-HRP, 1:4000 희석)로 항원-항체 복합체를 검출했다. ELISA 분석은 다음의 프로토콜을 사용했다. FAM19A5 단편 F1-F6(50mM 카보네이트 버퍼(Biosesang)에서 1 μg/mL로 희석 또는 고 농도 분석을 위해 20 μg/mL로 희석)을 사용하여 4℃에서 하룻밤 96-웰 면역 플레이트(Thermo Scientific)(100 μL/웰)의 웰을 코팅한 다음 1x PBS로 2번 세척했다. 다음에, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 차단 버퍼(100 μL/웰)로 차단했다. 1시간 인큐베이션하는 동안, 관련된 항-FAM19A5 항체를 희석 버퍼에 1 μg/mL(또는 고 농도 분석을 위해서는 20 μg/mL)로 희석했다. 플레이트를 세척한 후(1x PBS를 사용하여 2x), 희석된 항-FAM19A5 항체를 적절한 웰에 첨가하고, 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 이어서 플레이트를 세척 버퍼를 사용하여 총 5번 세척했다. 다음에, ODP 기질(9mL 멸균 탈이온수와 1mL 10x 안정한 Peroxide Stable 버퍼(Theromo)에 1개의 ODP 정제(O-페닐렌디아민 중염산염, Thermo)를 용해하여 제조)을 각 웰에 첨가하고, 10분간 색 변화 반응이 일어나도록 두었다. 웰에 2N H2S04(Daejung) 100μL를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device)를 사용하여 492nm에서 각 웰의 흡광도를 검출했다.
도 11 및 12A에 도시된 대로, 웨스턴 블롯과 ELISA 분석에 의해 측정된 바, 항-FAM19A5 항체 1-65는 단편 F5에 강하게 결합했다. 항-FAM19A5 항체 P2-C12 또한 에피토프 단편 F5에는 강하게 결합했지만, 다른 단편(F1-F4 및 F6)에는 유의하게 결합하지 않았다(도 12b 참조). 한편, 항-FAM19A5 항체 3-2는 단편 F5에 결합하지 않았다. 대신, 3-2 항체는 에피토프 단편 F2에 강하게 결합했고, 다른 단편에는 최소한으로 결합했다(도 12a 참조). 이 결과는 항-FAM19A5 1-28 항체에 대해서도 동일했다(데이터 미도시). 그러나, 다른 항체와 달리, 항-FAM19A5 항체 2- 13은 어느 에피토프 단편에도 결합하지 않는 것으로 확인됐다(도 12a 참조).
다음에, 1-65 및 P2-C12 항체가 결합하는 에피토프 단편 F5 내의 특정한 아미노산 잔기를 확인하기 위해, F5 단편의 상이한 아미노산 잔기들을 표 9(아래)에 나타낸 대로 알라닌으로 치환했다. 돌연변이된 잔기는 볼드체 및 밑줄로 표시했다. 항-FAM19A5 항체의 결합 친화성은 상기 기재된 대로 ELISA 분석을 사용하여 측정했다.
[표 9]
Figure 112021151826965-pat00009
동반 밑줄: 시스테인이 펩타이드 합성 과정에서 반응성이기 때문에 반응성을 감소시키기 위해 세린으로 치환되었다. 세린의 구조가 시스테인에 가장 가깝기 때문에 세린으로 치환되었다. 이러한 치환은 동반 밑줄로 표시했다.
도 13a에 도시된 대로, 1-65 항체는 유사한 친화성으로 돌연변이 펩타이드 #1, 5, 6, 및 7에 결합할 수 있었다. 그러나, 단편 F5의 아미노산 잔기 D13, L14, I16 및 R18이 알라닌으로 돌연변이되었을 때(상기 표 9에서 SEQ ID NO: 125에 기초하여 넘버링), 1-65 항체는 이 펩타이드 단편에 더 이상 결합할 수 없었으며, 이것은 이들 아미노산 잔기가 1-65 항체의 중요한 결합 부위였음을 시사한다. 반면, P2-C12 항체는 돌연변이 펩타이드 #2, 3, 4, 5, 및 7에는 높은 결합성을 나타냈지만 돌연변이 펩타이드 #1, 6, 및 8에는 결합하지 않았다(도 13b 참조). 표 9(상기)에 나타낸 대로, 돌연변이 펩타이드 #1, 6, 및 8은 아미노산 잔기 G11, E10 및 R18에 알라닌 치환을 포함하며(SEQ ID NO: 125에 기초하여 넘버링), 이것은 이들 아미노산 잔기가 P2-C12 항체에서 중요한 결합 부위임을 시사한다.
실시예 8: FAM19A5 돌연변이 M1-M8을 사용한 에피토프 맵핑 분석
본 명세서에 개시된 항-FAM19A5 항체의 결합 에피토프를 더 특성화하기 위해, 상이한 FAM19 패밀리 멤버(즉, FAM19A1-5)에 대한 아미노산 서열을 도 14에 도시된 대로 정렬했다. 이 정렬에 기초하여 FAM19A5 단백질의 아미노산 서열이 FAM19A5 패밀리의 다른 멤버(즉, FAM19A1-4)와 가장 유의하게 차이가 있었던 8개 영역이 확인되었다(M1-M8). 이들 영역의 아미노산 서열을 FAM19A1-4 단백질에 대한 상응하는 영역의 컨센서스 서열로 치환했다(표 10 참조 - 돌연변이된 아미노산 잔기는 볼드체 및 밑줄로 표시했다).
돌연변이 FAM19A5-발현 파지를 다음과 같이 제조했다. 파지 배양 배지를 제조하기 위해, 2M 글루코오스(D-(+)-글루코오스, Sigma) 55.6mL, 1M MgCl2(Magnesium chloride, Junsei) 5mL, 34 mg/mL 클로람페니콜(Sigma) 1mL를 2x YT 배지에 첨가했다. 모노-파지 ELISA를 통해서 얻어진 콜로니를 선택하고 제조된 배지(2x YT-GMC) 5mL에 넣어 쉐이킹 인큐베이터(VS-8480, Vision)에서 37℃에서 16시간 동안 배양했다. 각 배양물 100μL를 개별적으로 10 mL 2x YT-GMC로 옮기고, 인큐베이터에서 37℃에서 O.D. 600nm에서의 검출값이 0.5에 도달할 때까지 배양했다. 검출값이 O.D. 600nm에서 0.5에 도달하면, 샘플로서 각 배양물 5mL를 취하여 감염시켰다. 샘플 제조 후, M1 헬퍼 파지 50μL를 각 샘플에 첨가한 후, 30분 동안 쉐이킹 없이 그리고 다음 30분 동안 쉐이킹하면서 37℃에서 인큐베이션했다. 개별 배양물을 Micro 원심분리기(Microl2, Hanil)를 사용하여 3,850rpm에서 15분간 원심분리했다. 원심분리된 배양물의 상청액을 제거하여 따로 보관하고, 1M IPTG(AG Scientific) 1mL, 1M MgC12 5mL, 70 μg/μL 카나마이신(Biopure) 1mL 및 클로람페니콜 1mL를 함유하는 2x YT 배지 5mL로 대체했다. 얻어진 펠릿을 새로 첨가된 배지에 완전히 분산시킨 후 교반하면서 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션했다.
[표 10]
Figure 112021151826965-pat00010
도 15a 및 실시예 7에 기재된 데이터를 참조하면, 항-FAM19A5 항체 1-65는 FAM19A5 돌연변이 M6, M7 및 M8과의 결합에 실패했다. M6 및 M7 돌연변이는 FAM19A5의 에피토프 단편 F5 내의 영역에 상응하는 부위에 아미노산 돌연변이를 포함한다(상기 표 10 참조).
추가의 항-FAM19A5 항체에 대한 에피토프 분석은 도 15b 및 15C에 제공된다. 항-FAM19A5 항체 13B4, 13F7 및 15A9는 모두 FAM19A5 돌연변이 M8과의 결합에 실패했으며, 돌연변이 M7에 대해서는 감소된 결합을 가졌다. 또한, 13B4 항체는 FAM19A5 돌연변이 M6과의 결합에 실패했다(도 15b 참조). 유사하게, 항체 P1-A08, P1-F02, P2-A01, P2-A03, P2-F07 및 P2-F11은 모두 FAM19A5 돌연변이 M8과의 결합에 실패했으며, 대부분의 항체는 또한 돌연변이 M7에 대해 감소된 결합을 갖거나 결합하지 않았다. P2-C12 항체는 이들 항체와 다르게 FAM19A5 돌연변이 M8에 강하게 결합했다. 대신, P2-C12 항체는 FAM19A5 돌연변이 M6과의 결합에 실패했는데, 이 결과는 에피토프 단편 F5가 P2-C12 항체의 중요한 FAM19A5 결합 부위를 포함한다는 것을 증명한 앞선 데이터와 일치한다.
실시예 9: 상호 경쟁 분석
*다음에, 아래 기재된 대로 2-부위 샌드위치 ELISA를 사용하여 유사한 결합 에피토르를 가진 상이한 항-FAM19A5 항체들이 서로 상호 경쟁하는지의 여부를 평가했다(도 16a 참조).
먼저, 인큐베이션된 항-FAM19A5 항체를 10 μg/mL의 농도로 1x PBS에 희석했다. 희석된 항-FAM19A5 항체(1x PBS 중에 10 μg/m, "캡처 항체")를 사용하여 대략 1시간 동안 37℃에서 96-웰 플레이트(100 μL/웰)를 코팅했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척 버퍼(0.01% Tween-20/PBS; 0.01% PBST라고도 함)로 총 5번 세척하고, 차단 용액(5% BSA/PBS; 5% PBSA라고도 함, 250 μL/웰)으로 37℃에서 1시간 동안 차단한 다음 다시 세척했다. 다음에, 100 μg/mL FAM19A5 항원(5% BSA, 0.01% Tween-20를 함유하는 PBS에 희석; 5% PBSAT라고도 함; "희석 버퍼")을 각 웰에 첨가하고, 96-웰 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 0.01% PBST를 사용하여 총 5번 세척했다. 마지막 세척 후, 인큐베이션된 바이오틴화 항-FAM19A5 항체("검출 항체", 5% PBSAT에 1 μg/mL로 희석)를 관련된 웰(100 μL 부피)에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1시간 더 인큐베이션했다. 이후, 플레이트를 0.01% PBST로 다시 세척했다(총 5번 세척). 다음에, 10μL의 희석된(5% PBSAT에 1/2000) 스트렙타비딘-HRP(1 mg/mL, Sigma, USA)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 30분간 인큐베이션했다. 다음에, 플레이트를 세척하고 TMB 기질 100μL로 처리했다(다음에, 3,3플레이트를 세척하고 100μL로 처리했다, Thermo Fisher Scientific). 실온에서 30분 더 인큐베이션 후, TMB 기질을 첨가하여 색 변화 반응을 유도했다. 반응을 황산(2N H2S04) 50 μL을 사용하여 중단시키고, 96-웰 마이크로플레이트 리더(Molecular Device)를 사용하여 620nm 기준 파장으로 450nm에서의 색 변화 정도를 검출했다.
*도 16b에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체 1-65, P2-A03, P2-F11 및 13B4는 모두 서로 상호 경쟁했다. 이 결과는 앞선 에피토프 분석과 일치하며, 이들 항체가 유사한 에피토프(즉, EP6, EP7, 및/또는 EP8)에서 FAM19A5에 결합한다는 것을 나타냈다(도 15a-15C 참조).
실시예 10: 결합 친화성 분석
FAM19A5에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체의 결합 친화성에 차이가 있는지의 여부를 결정하기 위해, OCTET® 시험과 ELISA 분석을 사용했다. OCTET® 시험에는 다음의 프로토콜을 사용했다. Octet QK3에서 Ni-NTA 바이오센서를 UPLC 등급 물로 수화시켰다. FAM19A5 단백질의 His-택을 Ni-NTA 바이오센서 상에 고정했다(2nM의 수준으로). 인큐베이션된 항-FAM19A5 항체를 300nM, 100nM, 33nM, 11nM, 3.3nM, 1.1nM 및 0nM의 농도로 희석했다. 바이오센서 상에 고정된 FAM19A5에 대한 상이한 항-FAM19A5 항체의 결합 동력학을 측정했다. 이 데이터를 Data Analysis Software(버전 9.0) 프로그램을 사용하여 분석했다.
도 17a-17D에 도시된 대로, 항-FAM19A5 항체 1-65 및 13F7는 유사한 결합 친화성을 가졌고(각각 Kd = 0.23nM 및 0.25nM), 항체 13B4(Kd = 3.6nM) 및 15A9(Kd = 5.95nM)와 비교하여 더 강하게 FAM19A5에 결합했다. ELISA에 의해 측정된 상이한 항-FAM19A5 항체의 결합 친화성이 도 18a 및 18B에 제시되었다.
실시예 11: 뇌 상해 동물 모델에서의 FAM19A5 항체의 사용
본 명세서에 제시된 항-FAM19A5 항체의 생체내 기능을 평가하기 위해, 외상성 뇌 상해(TBI) 마우스 모델을 사용했다. C57BL/6 성체 수컷 마우스(8-9주령)를 소듐 펜토바르비탈(50 mg/kg)로 마취시켰다. 1분 동안 두개관 위에 예냉된 철 막대를 두어 극저온 TBI를 유도했다. 다음에, 마우스의 피부를 봉합하고 정상 마우스와 동일한 방식으로 수용해 두었다(Moon et al, Neuro Report 22: 304-308 (2011) 참조). TBI 유도 후 대략 1일에, 포스페이트-완충 식염수(PBS)에 희석된 상이한 항-FAM19A5 항체를 다양한 농도(0.1, 0.3, 1, 3, 5, 10 또는 100μg/마우스)로 동물에 정맥내 투여했다. 정상 인간 대조군 면역글로불린(HCI)을 대조군으로 사용했다.
다음에, TBI 유도 후 제5일(TBI5D)에 PBS 중의 4% 파라포름알데하이드(PFA)를 관류시켜 동물을 죽이고 뇌 조직을 수거했다. 수거된 뇌 조직을 24시간 동안 4% PFA 용액에 더 고정시켰다. 다음에, 뇌 조직을 30% 수크로오스에서 동결보호하고 크라이오스탯에서 연속으로 절편화하고(40μm), 사용할 때까지 -20℃에서 50% 글리세롤/50% PBS에 보관했다.
신경아교증과 관련된 반응성 성상세포를 염색하기 위해(네스틴 양성 및 GFAP 발현), 뇌 조직 절편을 PBS 중의 3% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.1% Triton X-100으로 30분간 차단했다. 다음에, 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 절편과 함께 인큐베이션했다. 이 연구에 사용된 1차 항체는 마우스 항-네스틴(Millipore, Billerica, MA, USA) 및 토끼 항-GFAP(Dako, Carpinteria, CA, USA)였다. PBS로 몇 번 세척 후, 적절한 2차 항체를 30분간 적용했다. Hoechst 33342(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 핵을 표지했다. 이어서 절편을 세척하고 형광 또는 공초점 현미경(Leica, Wetzlar, Germany)에 장착해서 관찰했다.
효과를 정량하기 위해, 각 이미지에서 GFAP-음성 영역의 ROI(관심 영역)를 먼저 특정하고, 이어서 상응하는 ROI의 영역(μm2, A)을 LAS AF 라이트 소프트웨어(Leica Microsystem CMS GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 계산했다. 또한, 반영과 접하고 있는 상해 중심의 경계선의 외측 길이(μm, B)를 동일한 소프트웨어로 측정했다. A/B의 결과는 병소 중심으로부터 평균 거리(A/B, μm)를 나타낸다.
도 6에 도시된 대로, 대조군 HCI 항체와 다르게 항-FAM19A5 항체 1-65는 외상성 뇌 상해 후 반영 영역에서 반응성 신경아교증의 개시를 현저히 감소, 역전 및/또는 예방했으며, 이것은 병소 경계(점선으로 표시) 근처에서 GFAP-양성 염색이 적은 것에 의해 증명된다. 유사한 결과가 항-FAM19A5 항체 13B4, 13F7, 15A9, P2-A03, P2-F11 및 P1-A03에서도 관찰되었다(도 19a-19E 참조). 그리고 도 7에 도시된 대로, 상해 중심 및 반영에서의 GFAP 및 NeuN의 면역염색은 항-FAM19A5 항체가 또한 손상된 영역을 둘러싼 반영 영역에서 뉴런의 생존을 촉진할 수 있음을 나타냈다.
실시예 12: 척수 상해의 치료를 위한 항-FAM19A5의 효능
항-FAM19A5 항체가 손상된 동물의 기능적 운동 활성을 개선할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 척수 상해(SCI) 동물 모델을 이용했다. 성체 수컷 Sprague Dawley 래트(DaeHan BioLink Co., Ltd, Korea)를 클로랄 하이드레이트(500 mg/kg)로 마취하고 8번 또는 10번 흉추를 노출시켰다. 인간 척수 상태를 시뮬레이션하기 위해, 상해 강도를 수치값으로 계산하도록 디자인된 NYU 임팩터(Routes, Sciteck Korea Inc.)를 이용했다. 10g 추를 25mm 높이에서 가슴쪽 9번 척수에 떨어뜨리고, 경막 손상 없이 라미넥토미를 통해서 노출시켰다. NYU 임팩터로부터 계산된 데이터는 상해가 오차 범위 내에서 균일하게 전달되었음을 확인했으며 상처를 봉합했다. 상처 부위에 포비돈 요오드를 도포 후, 케이지당 2마리 래트를 수용하고, 방광을 7주 동안 하루 3번 마사지하여 배뇨를 촉진시켰다. 다음에, 각 동물은 다음의 항체 중 하나를 정맥내 경로로 투여받았다: (i) 항-FAM19A5 항체 1-65(60μg), (ii) 항-FAM19A5 다클론성 Ab(60μg) 또는 (iii) PBS 중의 정상 래트 IgG(60μg). SCI 동물의 운동 기능을 BBB 운동능 점수를 사용하여 평가했다. BBB 점수는 뒷다리 움직임이 없는 경우의 0점에서부터 정상 움직임에 대한 21점까지의 범위이다. 동물은 개방 공간에서 자유롭게 배회하도록 두었고 2명의 블라인드 관찰자에 의해 관찰되었다. SCI 후 제1일에 BBB 점수가 1점을 초과하는 동물은 연구에서 제외했다. 40일 동안 점수를 모니터했다. 데이터는 두 뒷다리 점수의 평균±SEM으로 정량되었고 편집되고 그래프로 정리되었다. 도 8(좌측 패널)은 FAM19A5 항체 1-65의 단일 투여(C, 원)가 비히클 치료된 래트(A, 다이아몬드)와 비교하여 상해 후 21일(dpi)부터 운동 활성을 유의하게 개선한다는 것을 나타낸다. 또한, 항-FAM19A5 다클론성 Ab(B, 사각)를 이용한 치료도 비히클 치료된 래트(A, 다이아몬드)와 비교하여 35 dpi부터 운동 활성을 개선했다. 또한, 경사면 시험을 6주까지 매주 수행했다(도 8 우측 패널). 경사면 시험에서 래트는 조정가능한 경사면에 위치되었다. 각 동물이 적어도 5초 동안 안정적인 자세를 유지했던 경사면의 최대 각도가 동물 그룹에 대해 블라인드된 2명의 관찰자에 의해 평가되었고 평균 각도가 기록되었다. 경사면 시험도 역시 대조군 그룹(A, 다이아몬드)과 비교하여 FAM19A5 항체 1-65(C, 원) 또는 항-FAM19A5 다클론성 Ab(B, 사각)로 치료된 동물의 기능 활성을 개선했음을 나타냈다.
발명의 개요 및 요약서 부문을 제외한 상세한 설명 부문은 청구범위를 해석하기 위해 사용되도록 의도된다. 발명의 개요 및 요약서 부문은 발명자(들)에 의해 고찰된 것과 같은 본 개시내용의 예시적인 구체예를 전부는 아닌 하나 이상을 제시할 수 있고, 따라서 본 개시내용 및 첨부된 청구범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다.
본 개시내용은 명시된 기능들의 실시 및 이들의 관계를 예시하는 기능적 빌딩 블록의 도움하에 상기 기재되었다. 이들 기능적 빌딩 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본 명세서에서 임의로 한정되었다. 다른 경계는 명시된 기능들 및 이들의 관계가 적절히 수행되는 한에서 한정될 수 있다.
특정 구체예의 전술한 설명은 본 개시내용의 일반적인 성질을 충분히 드러낼 것이며, 나머지 것들은 당업계 내의 지식을 적용함으로써 본 개시내용의 일반적 개념으로부터 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 이러한 특정 구체예를 쉽게 변형하고 및/또는 다양한 적용에 맞게 조정할 수 있다. 따라서, 이러한 조정 및 변형은 본 명세서에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 개시된 구체예의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서에 제시된 구절 또는 용어는 제한이 아니라 설명의 취지라는 것이 이해되어야 하며, 이로써 본 명세서의 용어 및 구절은 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석되어야 한다.
본 개시내용의 범위는 상기 기재된 예시적인 구체예 중 어느 것에 의해 제한되어서는 안 되며, 이후의 청구범위 및 그들의 등가물에 따라서만 한정되어야 한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특히, 특허출원, 인터넷 사이트 및 수탁 번호/데이터베이스 서열(폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 포함하는)은 각 개별 간행물, 특허, 특허출원, 인터넷 사이트 또는 기탁 번호/데이터베이스 서열이 본 명세서에 참고로 포함된다는 구체적이며 개별적으로 지적된 것만큼의 정도로 모든 취지를 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEURACLE SCIENCE CO., LTD. <120> ANTI-FAMILY WITH SEQUENCE SIMILARITY 19, MEMBER A5 ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF <130> 3763.003PC01 <150> 62/418,674 <151> 2016-11-07 <160> 166 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ser Pro Arg Thr Gly Ser Arg Gln Asp Ala Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Met Ser Ser Thr Phe Trp Ala Phe Met Ile Leu Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Ala Tyr Cys Ser Gln Leu Ala Ala Gly Thr Cys Glu Ile Val 35 40 45 Thr Leu Asp Arg Asp Ser Ser Gln Pro Arg Arg Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 Thr Ala Arg Cys Ala Cys Arg Lys Gly Gln Ile Ala Gly Thr Thr Arg 65 70 75 80 Ala Arg Pro Ala Cys Val Asp Ala Arg Ile Ile Lys Thr Lys Gln Trp 85 90 95 Cys Asp Met Leu Pro Cys Leu Glu Gly Glu Gly Cys Asp Leu Leu Ile 100 105 110 Asn Arg Ser Gly Trp Thr Cys Thr Gln Pro Gly Gly Arg Ile Lys Thr 115 120 125 Thr Thr Val Ser 130 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope F5 <400> 2 Cys Asp Met 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Lys Asp 130 135 140 Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160 Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln 180 185 190 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 155 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-F11 HC <400> 155 Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Ala Asn Asn Tyr Asn Pro His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys 65 70 75 80 Met Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg 85 90 95 Asp Asn Tyr Gly Met Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 130 135 140 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu 145 150 155 160 Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 180 185 190 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val 195 200 205 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 156 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-C12 LC <400> 156 Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Ser Thr Asn 85 90 95 Val Trp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 157 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13B4 LC <400> 157 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Val Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Thr Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Lys Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Leu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala Val 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 158 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 13F7 LC <400> 158 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Val Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Arg Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 159 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15A9 LC <400> 159 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Ser 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Ala Ser Ile Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 160 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-A03 LC <400> 160 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 161 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-A08 LC <400> 161 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Asn 85 90 95 Tyr Gln Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Arg Ser 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 162 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1-F02 LC <400> 162 Glu Leu Asp Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 163 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-A01 LC <400> 163 Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Arg Ile Arg Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Thr Tyr Ser Ser 85 90 95 Thr Gly Thr His Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 164 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-A03 LC <400> 164 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Gly Gly Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Pro Ala Tyr Asp Pro Ala 85 90 95 Ala Tyr Val Gly Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Leu 100 105 110 Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 165 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-F07 LC <400> 165 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Leu Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Thr Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Gly Gly Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gly Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 166 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2-F11 LC <400> 166 Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Asn Asn 20 25 30 Lys Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Val 65 70 75 80 Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Ser Cys 85 90 95 Ser Ser Ala Asp Cys Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile 100 105 110 Leu Arg Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (13)

  1. SEQ ID NO: 2(CDMLPCLEGEGCDLLINRSG, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 90 내지 109), SEQ ID NO: 139(KTKQWCDML) 또는 SEQ ID NO: 141(TCTQPGGR)의 FAM19A5 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 단클론성 항체 또는 그것의 항원 결합 부분(항-FAM19A5 항체)으로서, 상기 항-FAM19A5 항체는 상기 서열에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하며, 하기의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 기준 항체와 FAM19A5 에피토프와의 결합에서 상호 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체:
    (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (3) SEQ ID NO: 104을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (4) SEQ ID NO: 105을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99 내지 107(즉, EGCDLLINR), SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 102, 103, 105 및 107(즉, DL-I-R), SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99, 100, 102, 103, 105 및 107(즉, EG-DL-I-R) 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99, 100 및 107(즉, EG------R)에 상응하는 하나 이상의 아미노산에서 적어도 하나의 FAM19A5 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며,
    (i) 중쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 85 또는 SEQ ID NO: 91을 포함하고;
    (ii) 중쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83 또는 SEQ ID NO: 89를 포함하고;
    (iii) 중쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 84 또는 SEQ ID NO: 90을 포함하고;
    (iv) 경쇄 CDR1은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 86 또는 SEQ ID NO: 92를 포함하고;
    (v) 경쇄 CDR2는 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 87 또는 SEQ ID NO: 93을 포함하고; 및
    (vi) 경쇄 CDR3은 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 88 또는 SEQ ID NO: 94
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는
    (1) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함;
    (2) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 29, 30, 31을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 32, 33, 34를 포함;
    (3) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 35, 36, 37을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 38, 39, 40을 포함;
    (4) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 41, 42, 43을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 44, 45, 46을 포함;
    (5) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 47, 48, 49를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 50, 51, 52를 포함;
    (6) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 53, 54, 55를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 56, 57, 58을 포함;
    (7) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 59, 60, 61을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 62, 63, 64를을 포함;
    (8) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 65, 66, 67을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 68, 69, 70을 포함;
    (9) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 71, 72, 73을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 74, 75, 76을 포함;
    (10) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 77, 78, 79를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 80, 81, 82를 포함;
    (11) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 83, 84, 85를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 86, 87, 88을 포함; 또는
    (12) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 89, 90, 91을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 92, 93, 94
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는
    (1) SEQ ID NO: 5를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 6을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (2) SEQ ID NO: 103을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 114를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (3) SEQ ID NO: 104을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 115를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (4) SEQ ID NO: 105을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 116을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (5) SEQ ID NO: 106을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 117을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (6) SEQ ID NO: 107을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 118을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (7) SEQ ID NO: 108을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 119를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (8) SEQ ID NO: 109를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 120을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (9) SEQ ID NO: 110을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 121을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (10) SEQ ID NO: 111을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 122를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL);
    (11) SEQ ID NO: 112를 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 123을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL); 또는
    (12) SEQ ID NO: 113을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 SEQ ID NO: 124를 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 항-FAM19A5 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 5 및 103 내지 113에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO: 6 및 114 내지 124에 제시된 아미노산 서열과 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체.
  7. 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 항-FAM19A5 항체:
    　(a) 효소결합면역흡착분석(ELISA)에 의해 측정되었을 때 10nM 이하의 KD로 가용성 인간 FAM19A5에 결합;
    　(b) ELISA에 의해 측정되었을 때, 10nM 이하의 KD로 막결합된 인간 FAM19A5에 결합;
    　(c) 반응성 신경아교증의 개시를 감소, 역전, 지연 또는 예방;
    　(d) 반응성 성상세포의 과도한 증식을 억제;
    　(e) 뉴로칸 및 뉴런-신경교 항원2(NG2)를 포함한 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸의 발현 감소;
    　(f) 뉴런의 핵으로 c-fos 및 pERK의 발현 증가;
    　(g) 뉴런의 생존 촉진;
    　(h) 뉴런에서 GAP43의 발현을 증가; 및
    　(i) 축삭돌기의 재생장을 촉진.
  8. 제 1 항의 항-FAM19A5 항체를 암호화하는 핵산.
  9. 제 1 항의 항-FAM19A5 항체, 상기 항-FAM19A5 항체가 제2 결합 부분을 가진 분자에 결합된 이중특이적 분자 또는 상기 항-FAM19A5 항체 또는 상기 이중특이적 분자를 포함하는 면역콘쥬게이트 및 담체를 포함하는 외상성 뇌 상해, 뇌척수 손상, 뇌졸중, 뇌종양 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 중추신경계 손상; 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 퇴행성 뇌 장애; 또는 신경병증성 통증;의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  10. 질환 또는 상태의 치료요법에서 사용하기 위한 제 1 항의 항-FAM19A5 항체.
  11. 대상의 생리학적 샘플과 접촉시킴으로써 상기 대상을 진단하는 방법으로 사용하기 위한 제 1 항의 항-FAM19A5 항체.
  12. FAM19A5에 특이적으로 결합하는, 분리된 항체 또는 그것의 항원 결합 부분(항-FAM19A5 항체)으로서, 상기 항-FAM19A5 항체는 하기의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-FAM19A5 항체:
    (1) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함;
    (2) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 29, 30, 31을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 32, 33, 34를 포함;
    (3) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 35, 36, 37을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 38, 39, 40을 포함;
    (4) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 41, 42, 43을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 44, 45, 46을 포함;
    (5) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 47, 48, 49를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 50, 51, 52를 포함;
    (6) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 53, 54, 55를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 56, 57, 58을 포함;
    (7) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 59, 60, 61을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 62, 63, 64를을 포함;
    (8) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 65, 66, 67을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 68, 69, 70을 포함;
    (9) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 71, 72, 73을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 74, 75, 76을 포함;
    (10) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 77, 78, 79를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 80, 81, 82를 포함;
    (11) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 83, 84, 85를 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 86, 87, 88을 포함; 또는
    (12) 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 89, 90, 91을 포함하고, 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3은 각각 SEQ ID NOs: 92, 93, 94;를 포함함.
  13. 제 12 항의 항-FAM19A5 항체를 암호화하는 핵산.
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