ES2838814T3 - FAM19A5 para uso en el diagnóstico y tratamiento de daños en el SNC - Google Patents

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Abstract

Un método de diagnóstico in vitro de daño del sistema nervioso central o una enfermedad cerebral degenerativa que comprende medir una cantidad de una proteína de la familia con similitud de secuencia 19, miembro A5 (FAM19A5) de una muestra biológica de un sujeto que lo necesita con un anticuerpo que es específico de la proteína FAM19A5, en donde el daño del sistema nervioso central o la enfermedad degenerativa del cerebro están asociados con astrocitos reactivos.

Description

DESCRIPCIÓN
FAM19A5 para uso en el diagnóstico y tratamiento de daños en el SNC
La presente invención se refiere a un uso farmacéutico de FAM19A5 que regula la proliferación y diferenciación de células madre neurales en vertebrados para diagnosticar, prevenir o tratar daños en el sistema nervioso central, enfermedades degenerativas del cerebro o enfermedades del sistema nervioso central.
Una placa neural se convierte en un tubo neural durante el desarrollo temprano, y una cavidad dentro del tubo neural forma un ventrículo a través del proceso de desarrollo. La capa de células más cercana al ventrículo es la zona ventricular. Se forma una capa adicional de células en proliferación por encima de la zona ventricular mediante un proceso de neurogénesis, que se denomina zona subventricular. Las células progenitoras en la zona ventricular y la zona subventricular tienen propiedades de células madre neurales y migran a una placa cortical a través de un sistema de control complejo [Dehay y Kennedy, Nat Rev Neurosci 8: 438-450,2007; Molyneaux et al., Nat Rev Neurosci 8: 427­ 437,2007; Angevine y Sidman, Nature 192: 766-768,1961; Caviness y Takahashi, Brain Dev 17: 159-163,1995].
Las células madre neurales tienen la capacidad de dividirse continuamente, es decir, una capacidad de autorrenovación, y diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos del sistema nervioso central. El proceso de diferenciación en neuronas ocurre principalmente durante el período embrionario, pero el proceso de diferenciación en células gliales ocurre después del nacimiento [Bayer et al., J Comp Neurol 307: 499-516, 1991; Miller y Gauthier, Neuron 54: 357-369,2007].
La diferenciación de células madre neurales en neuronas y células gliales es un fenómeno que se observa continuamente en el proceso de desarrollo del cerebro y del cerebro de un adulto. En el cerebro adulto, la neurogénesis ocurre en dos regiones cerebrales diferentes, la zona subventricular del ventrículo lateral y la circunvolución dentada del hipocampo. En la zona subventricular, las células ependimarias más cercanas al ventrículo y los astrocitos distribuidos a lo largo del mismo sirven como células madre neurales, y los dos tipos de células se convierten en neuroblastos a través de células amplificadoras transitorias [Doetsch, Curr Opin Genet Dev 13: 543-550,2003; Doetsch et al., Cell97: 703-716,1999; Lois y Alvarez-Buylla, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2074-2077,1993; Palmer et al., Mol Cell Neurosci 8: 389-404,1997; Temple, Nature 414: 112-117,2001].
Para mantener las funciones normales del cerebro, es esencial un equilibrio numérico de neuronas y células gliales. En el pasado, los astrocitos, que representaban la mayoría de las células gliales, se consideraban simplemente células protectoras que ayudaban a las neuronas a realizar sus funciones. Por el contrario, ahora se sabe que los astrocitos afectan el entorno alrededor de las neuronas más allá de servir como soporte estructural. Es decir, los astrocitos secretan factores de crecimiento, regulan las funciones de las neuronas y ayudan a mantener la barrera entre los vasos sanguíneos y el cerebro. Asimismo, se sabe que los astrocitos desempeñan un papel más activo al regular directamente la formación de estructuras y la función de sinapsis entre neuronas [Nedergaard et al., Trends Neurosci 26: 523-530,2003; Ullian et al., Science 291: 657-661,2001; Song et al., Nature 417: 39-44,2002; Temple y Davis, Development 120: 999-1008,1994; Seri et al., J Neurosci 21: 7153-7160,2001; Svendsen, Nature 417: 29-32, 2002].
La importancia funcional de los astrocitos se conoce patológicamente a través de una gran cantidad de investigaciones. Cuando el cerebro está dañado, los astrocitos proliferan activamente, se vuelven reactivos y se observa hipertrofia. La proliferación activa de tales células gliales es ventajosa porque promueve la recuperación de los tejidos poco después del daño inicial y evita que el daño se propague. Sin embargo, cuando se repite tal fenómeno, se suprime la regeneración de neuronas y se provoca una respuesta inflamatoria, y se aplica daño, lo que puede dar como resultado una enfermedad cerebral degenerativa [Myer et al., Brain 129: 2761-2772,2006; Chen y Swanson, J Cereb Blood Flow Metab 23: 137-149,2003; Cunningham et al., Brian 128: 1931-1942,2005; Faden, Curr Opin Neurol 15: 707-712,2002; Katayama et al., J Neurosurg 73: 889-900,1990].
La gliosis es un fenómeno que se presenta comúnmente en diversos procesos patológicos del sistema nervioso central y está causado por la hiperproliferación y activación de astrocitos resultante del daño neuronal. Cuando se aplica daño al sistema nervioso central, los astrocitos normales se vuelven hipertróficos, astrocitos reactivos que aumentan la generación de una proteína de filamento intermedio llamada proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Varias células gliales, incluidos los astrocitos reactivos, experimentan hiperproliferación después del daño y se forma una capa de células sólidas llamada cicatriz glial que es producto del proceso de curación. Dicha gliosis se observa en enfermedades cerebrales degenerativas como la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, en el daño cerebroespinal y diversos fenómenos patológicos del sistema nervioso central, tales como accidentes cerebrovasculares y tumores cerebrales [Faideau et al., Hum Mol Genet, 2010; Chen et al., Curr Drug Targets, 2005; Rodríguez et al., Cell Death Differ, 2009; Robel et al., J Neurosci, 2011; Talbott et al., Exp Neurol, 2005; Shimada et al., J Neurosci; 2012; Sofroniew y Vinters, Acta Neuropathol, 2010].
En general, la gliosis tiene diversas influencias según las circunstancias en las que se ha producido inicialmente el daño o el tiempo transcurrido desde que se ha producido una herida. Después del daño, los astrocitos reactivos iniciales secretan factores de crecimiento nervioso que previenen la muerte celular programada, tal como el GDNF, y provocan la reanudación de la absorción de ácido glutámico, protegiendo así las neuronas. Además, los astrocitos reactivos iniciales funcionan positivamente en procesos tales como la recuperación de la barrera hematoencefálica, aislando una región en la que se ha producido el daño y previniendo la infección de tejidos sanos. Sin embargo, cuando transcurre un tiempo predeterminado después del daño, las cicatrices de la glía están formadas por astrocitos reactivos que han hiperproliferado y rodean una región dañada como una red, y se acumula una matriz extracelular inhibidora. Una estructura densa de tales proteínas sirve como barrera que evita que las neuronas se regeneren física y químicamente y reconstruyan conexiones. Además, se secretan sustancias que inducen inflamación y sustancias neurotóxicas tales como las citocinas citotóxicas para inducir la apoptosis de neuronas, inhibir la recuperación funcional y empeorar los síntomas patológicos. En la técnica relacionada, las enfermedades del sistema nervioso central pueden detectarse mediante una prueba histopatológica, tomografía computarizada (TC) o formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). Sin embargo, el diagnóstico con tales métodos puede ser posible solo después de que la enfermedad haya progresado hasta cierto punto. Por lo tanto, es esencial el desarrollo de un marcador de diagnóstico que pueda identificar de manera rápida y precisa el grado de progreso de la enfermedad del sistema nervioso central. Asimismo, un método de tratamiento en el que las neuronas sobreviven en la etapa temprana del daño y se minimiza la generación de cicatrices de la glía y se promueve la regeneración de neuronas en la fase posterior será el mejor método.
La presente invención está dirigida a proporcionar un uso farmacéutico de FAM19A5 para diagnosticar, prevenir o tratar el daño del sistema nervioso central, enfermedades cerebrales degenerativas o enfermedades del sistema nervioso central identificando un papel de FAM19A5 en la regulación de la gliogénesis.
Para resolver los objetos descritos anteriormente, la presente invención proporciona una composición para regular la proliferación o diferenciación de células madre que contienen FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) o un inhibidor del mismo como regulador de proliferación o diferenciación.
La presente invención proporciona un método de diagnóstico in vitro de un daño del sistema nervioso central o una enfermedad cerebral degenerativa que comprende medir una cantidad de una proteína de la familia con similitud de secuencia 19, miembro A5 (FAM19A5) de una muestra biológica de un sujeto que lo necesita con un anticuerpo que es específico para la proteína FAM19A5, en donde el daño del sistema nervioso central o la enfermedad degenerativa del cerebro están asociados con astrocitos reactivos.
La presente invención proporciona adicionalmente una composición que comprende un anticuerpo que es específico para una proteína FAM19A5 para su uso en un método para retrasar la astrocitosis reactiva que se produce después de un daño, suprimir una generación de astrocitos o inhibir una proliferación excesiva de astrocitos reactivos en una región dañada en un sujeto que lo necesita, en donde el sujeto sufre un daño en el sistema nervioso central o una enfermedad cerebral degenerativa asociados con astrocitos reactivos y una composición que comprende un anticuerpo que es específico para una proteína FAM19A5 para su uso en un método para disminuir un número de células progenitoras de oligodendrocitos que expresan el antígeno neuronal-glial 2 (NG2) o promueven una regeneración de neuronas en una región dañada en un sujeto que lo necesite, en donde el sujeto sufre una lesión cerebral traumática.
La presente invención también proporciona una composición para diagnosticar daño del sistema nervioso central, enfermedades degenerativas del cerebro o enfermedades del sistema nervioso central, que contiene un agente para medir un nivel de proteína de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
La presente invención también proporciona una composición para tratar una lesión cerebral traumática temprana, que contiene FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
La presente descripción también describe un uso de FAM19A5 para preparar una composición farmacéutica para tratar una lesión cerebral traumática temprana. La invención expuesta también describe un método para tratar una lesión cerebral traumática temprana en animales, que incluye la administración de una composición para tratar una lesión cerebral traumática temprana, que contiene una dosis farmacéuticamente eficaz de FAM19A5 a un sujeto.
La presente invención también proporciona una composición para prevenir o tratar enfermedades cerebrales degenerativas o enfermedades del sistema nervioso central, que contiene un inhibidor de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
La presente descripción también expone un uso del inhibidor de FAM19A5 para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar enfermedades degenerativas del cerebro o enfermedades del sistema nervioso central.
La presente descripción también expone un método para tratar enfermedades cerebrales degenerativas o enfermedades del sistema nervioso central en animales, incluida la administración de una composición para prevenir o tratar enfermedades cerebrales degenerativas o enfermedades del sistema nervioso central, que contiene una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de FAM19A5 a un sujeto.
La presente descripción también expone un método de escrutinio de medicamentos preventivos o terapéuticos para enfermedades cerebrales o enfermedades del sistema nervioso central, que incluye:
poner en contacto los genes de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) con un material candidato in vitro, y
determinar si el material candidato promueve o inhibe la expresión de los genes.
La presente descripción también expone un método de escrutinio de un medicamento preventivo o terapéutico para enfermedades cerebrales o enfermedades del sistema nervioso central, que incluye:
poner en contacto las proteínas FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) con un material candidato in vitro, y
determinar si el material candidato promueve o inhibe una función o actividad de la proteína.
La presente invención ha encontrado que FAM19A5, que es una proteína secretada por las células madre neurales y regula la proliferación o diferenciación de las células madre neurales, se expresa en exceso en caso de daño cerebroespinal, promueve la generación de astrocitos y la recuperación de tejidos dañados tempranos, y cuando FAM19A5 se neutraliza con anticuerpos específicos para FAM19A5 en tejidos dañados, se suprime la generación de astrocitos. Por lo tanto, FAM19A5 se puede utilizar para el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de daños en el sistema nervioso central, enfermedades degenerativas del cerebro o enfermedades del sistema nervioso central. La FIG. 1 muestra las secuencias de aminoácidos (A) de péptidos de FAM19A5 expresados a partir de genes de FAM19A5 de varios vertebrados y un árbol filogenético (B).
La FIG. 2 muestra los patrones de expresión de ARNm (A) de genes de la familia FAM19A en varios tejidos de ratón y patrones de expresión de ARNm (B) de genes de la familia de FAM19A para cada fase del desarrollo a través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR).
La FIG. 3 muestra los resultados obtenidos midiendo la expresión de ARNm de FAM19A5 en la zona ventricular y la médula espinal de ratas para cada fase de desarrollo utilizando hibridación in situ.
La FIG. 4 muestra los resultados obtenidos al determinar la especificidad de unión del anticuerpo específico de FAM19A5 y las proteínas His-FAM19A5 utilizando transferencia Western (A) e inmunocitoquímica (B).
La FIG. 5 muestra los resultados obtenidos midiendo la expresión de péptidos FAM19A5 en la zona ventricular de ratón para cada fase de desarrollo utilizando inmunohistoquímica.
La FIG. 6 muestra los resultados obtenidos midiendo (A) la expresión de péptidos FAM19A5 en células madre neurales y células progenitoras en la zona subventricular de ratón adulto, y (B) el grado de expresión de péptidos de FAM19A5 en condiciones diferenciadas utilizando inmunohistoquímica.
La FIG. 7 muestra los resultados obtenidos midiendo la expresión de péptidos de FAM19A5 en neuroesferas que se desarrollan en células madre neurales de ratón, utilizando inmunocitoquímica.
La FIG. 8 muestra los resultados obtenidos midiendo la expresión de FAM19A5 en neuroesferas. (A) muestra los resultados obtenidos mediante inmunocitoquímica, (B) muestra los resultados obtenidos mediante RT-PCR, y (C) muestra los resultados obtenidos mediante una micromatriz.
La FIG. 9 muestra los resultados obtenidos midiendo el efecto del potencial de diferenciación de las células madre neurales provocado por FAM19A5 y un anticuerpo específico del mismo utilizando inmunocitoquímica (A) y transferencia Western (B).
La FIG. 10 muestra los resultados obtenidos midiendo el efecto del potencial de proliferación de células madre neurales causado por FAM19A5 y un anticuerpo específico.
La FIG. 11 muestra los resultados obtenidos midiendo los cambios en las proteínas FAM19A5 en el modelo de lesión cerebral traumática en ratón utilizando inmunohistoquímica (I) y transferencia Western (II) (A), y en sangre utilizando radioinmunoensayo (B).
La FIG. 12 muestra los resultados obtenidos midiendo los cambios en las proteínas FAM19A5 a lo largo del tiempo después de una lesión cerebral traumática.
La FIG. 13 muestra los resultados obtenidos midiendo los cambios en las proteínas FAM19A5 en un modelo de esclerosis lateral amiotrófica utilizando inmunohistoquímica (A), transferencia Western (B) y radioinmunoensayo (C). La FIG. 14 muestra la señal de fluorescencia en los tejidos cerebrales cuando se tratan con anticuerpos específicos de FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática.
La FIG. 15 muestra cambios en los marcadores celulares a lo largo del tiempo cuando se trata con anticuerpos específicos de FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática.
La FIG. 16 muestra cambios en las neuronas cuando se tratan con anticuerpos específicos de FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática.
La FIG. 17 muestra los resultados obtenidos determinando las posiciones de los astrocitos reactivos que expresan proteínas FAM19A5 en el modelo de lesión cerebral traumática en ratón tratado con anticuerpos específicos de FAM19A5.
La FIG. 18 muestra los resultados obtenidos midiendo los cambios en las células progenitoras de oligodendrocitos NG2 (A) y las células oligodendrocíticas (B) cuando se tratan con anticuerpos específicos de FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática.
A continuación, se describirá en detalle una configuración de la presente invención. La presente invención está definida por las reivindicaciones.
FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) es un miembro de los genes de la familia FAM19A compuestos por cinco genes altamente homólogos que codifican pequeñas proteínas secretoras. Estas proteínas contienen restos de cisteína conservados en posiciones fijas y están relacionadas con MIP-1 alfa, que es un miembro de la familia de genes de quimiocinas CC. Se sabe que estas proteínas se expresan predominantemente principalmente en el cerebro y la médula espinal, se generan y secretan en procesos de neurogénesis y por células madre neurales adultas, y sirven como factor regulador de la diferenciación para promover la generación de astrocitos.
Los autores de la presente invención encontraron la presencia de FAM19A5 en el organismo mediante un enfoque bioinformático y utilizando hibridación in situ e inmunohistoquímica, identificaron un papel de FAM19A5 en un proceso de generación de células diferenciadas de células madre neurales utilizando inmunocitoquímica, y determinaron un uso terapéutico con respecto a varias enfermedades relacionadas con neuronas y gliogénesis en vertebrados, y completaron la presente invención.
Por tanto, la presente invención proporciona una composición para regular la proliferación o diferenciación de células madre, que contiene FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) como regulador de proliferación o diferenciación.
Según un ejemplo detallado de la presente invención, FAM19A5 se expresa predominantemente en el cerebro de los vertebrados, y particularmente, se distribuye fuertemente en la zona ventricular y la región de la médula espinal, se expresa en excesoen la zona ventricular y la zona subventricular de incluso fetos en el embarazo antes del nacimiento, pero se expresa débilmente en la placa cortical en la que se colocan las neuronas diferenciadas. Por lo tanto, la presente invención ha demostrado por primera vez que los genes FAM19A5 se expresan fuertemente en dos regiones del sistema nervioso central que se sabe que tienen una población de células madre neurales, importantes en la formación de un sistema nervioso central completo e involucradas en la generación de neuronas y células gliales que constituyen el sistema nervioso central.
Basándose en estos resultados, se ha observado la expresión de FAM19A5 en neuroesferas desarrolladas a partir de células madre neurales. Como resultado, se puede demostrar que FAM19A5 se distribuye mucho más en las neuroesferas que otros tipos de genes de la familia FAM19A. Esto sugiere que FAM19A5 puede ser un péptido importante en las funciones de las células madre neurales adultas y embrionarias y en el proceso de diferenciación en diferentes tipos de células generadas a partir de ellas.
A través de estos resultados, se ha determinado que FAM19A5 se genera y secreta a partir de células madre neurales, que influye en la generación de células (es decir, neuronas o astrocitos) y su diferenciación. Como resultado, se puede ver que FAM19A5 promueve la generación de astrocitos.
Por tanto, FAM19A5 puede regular el número de neuronas o astrocitos diferenciados de las células madre neurales mediante un cambio cuantitativo en su número. Es decir, dado que el número de astrocitos diferenciados aumenta a través de un aumento cuantitativo de FAM19A5 y el número de neuronas diferenciadas aumenta a través de una reducción cuantitativa de FAM19A5, se puede ver que FAM19A5 es un factor regulador de diferenciación.
Además, según otro ejemplo detallado de la presente invención, se ha determinado que la proliferación de células madre neurales disminuye mediante un aumento cuantitativo de FAM19A5 y la proliferación de células madre neurales aumenta mediante una reducción cuantitativa de FAM19A5. Por tanto, se puede ver que FAM19A5 es un factor regulador de la proliferación de células madre.
Por lo tanto, se pueden utilizar FAM19A5 o un inhibidor del mismo como regulador de la proliferación o diferenciación de células madre.
FAM19A5 de la presente invención es una proteína secretora secretada por células madre neurales, incluye secuencias de genes que codifican un péptido señal típico de un extremo amino como señal que puede secretarse extracelularmente, y tiene secuencias de aminoácidos de FAM19A5 maduro, más adelante (consúltese la FIG 1).
Una composición para regular la proliferación o diferenciación de células madre de la presente invención puede incluir FAM19A5 natural o recombinante, proteínas FAM19A5 que tienen una actividad fisiológica sustancial, células madre neurales transgénicas que expresan en exceso FAM19A5 natural o recombinante, o un inhibidor de FAM19A5. La proteína que tiene una actividad fisiológica sustancialmente equivalente incluye FAM19A5 natural/recombinante, un equivalente funcional de la misma y un derivado funcional.
El término "equivalente funcional" se refiere a una variante de secuencia de aminoácidos en la que algunos o todos los aminoácidos de la proteína natural están sustituidos o algunos aminoácidos se eliminan o añaden, y que tiene una actividad fisiológica sustancialmente equivalente a la de FAM19A5 natural.
El término "derivado funcional" se refiere a una proteína que se ha modificado para aumentar o disminuir las propiedades físicas y químicas de la proteína FAM19A5 y tiene una actividad fisiológica sustancialmente equivalente a la de FAM19A5 natural.
La proteína FAM19A5 de la presente invención se origina principalmente en mamíferos, tales como seres humanos, ratones, ratas y similares; pinzones cebra, pollos, peces cebra, Xenopus, espinosos y similares, y se refiere a una proteína que tiene una secuencia conocida, por ejemplo, derivada de ser humano con Núm. de acceso GenBank NM_134096, NM_001191991.
De acuerdo con un ejemplo detallado, la FAM19A5 utilizada en la presente invención puede prepararse mediante un método de ingeniería genética que es conocido por los expertos en la técnica a partir del Núm. de acceso GenBank NM_134096, NM_001191991 y similares.
Cuando se prepara una proteína mediante un método recombinante de genes para obtener FAM19A5 natural, si en su lugar se utilizan células de mamífero de E. coli o células de insecto, se considera más similar al tipo natural en términos del grado de actividad o solubilidad de la proteína.
La proteína FAM19A5 recombinante se puede aislar utilizando un método de cromatografía en columna típico. El grado de purificación de la proteína se puede determinar mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).
Las células madre neurales transgénicas que expresan en exceso. FAM19A5 natural o recombinante pueden prepararse introduciendo un vector que expresa FAM19A5 natural o recombinante en células madre neurales mediante un método conocido.
El inhibidor de FAM19A5 puede ser uno cualquiera de un oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc, miARN o un vector que incluya el mismo, o anticuerpos.
La composición para regular la proliferación o diferenciación de células madre de la presente invención puede añadirse como factor regulador de la proliferación o diferenciación cuando se cultivan células madre neurales in vitro. Por ejemplo, en un cultivo que induce la proliferación o la diferenciación de células madre neurales, se añade FAM19A5 natural o recombinante o un inhibidor del mismo de manera que un aumento o disminución de la proliferación de células madre se pueda regular mediante un cambio cuantitativo del mismo o se pueda regular el número de neuronas o astrocitos.
Además, cuando se co-cultivan células madre neurales y células madre neurales transgénicas que expresan en exceso FAM19A5 natural o recombinante para inducir la diferenciación, el número de astrocitos puede aumentar debido a aumentos en las cantidades de proteínas FAM19A5 secretadas por células madre neurales transgénicas y regulares.
La composición para regular la proliferación o diferenciación de células madre de la presente invención puede incluir además un factor inductor de diferenciación conocido que induce la diferenciación de células madre neurales además de FAM19A5. Por ejemplo, se puede utilizar un factor neurotrófico ciliar (CNTF), proteínas morfogenéticas óseas (BMP), un factor de crecimiento transformante (TGFa), o neurregulina-1 (Nrgl)-factor de crecimiento glial-2 (GGF2).
La presente invención también proporciona una composición para diagnosticar daño del sistema nervioso central, enfermedades degenerativas del cerebro o enfermedades del sistema nervioso central, que contiene un agente para medir la concentración de proteína de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
Cuando el cerebro está dañado, los astrocitos maduros proliferan activamente, cambian a astrocitos reactivos, se vuelven hipertróficos, inducen una rápida recuperación de los tejidos y evitan que el daño se propague.
De acuerdo con un ejemplo detallado de la presente invención, la expresión de FAM19A5 aumenta significativamente en una región dañada, las células gliales radiales en la región dañada expresan nestina, que sirve como marcador y expresan simultáneamente FAM19A5, y aumentan numéricamente de manera significativa en comparación con un grupo de control no dañado. Además, los neuroblastos que migran a una región de lesión cerebral desde la zona subventricular a través del cuerpo coloso expresan poco o nada de FAM19A5. Además de la región dañada, el número de células que expresan proteínas FAM19A5 aumenta en una región periférica de la zona subventricular en la que se posiciona una población de células madre neurales, y estas expresan simultáneamente GFAP que sirve como marcador de astrocitos.
Además, FAM19A5 puede filtrarse a la sangre mientras se daña la barrera hematoencefálica después de una lesión cerebral. La presencia de FAM19A5 se puede determinar mediante un análisis de sangre. La cantidad de tal expresión tiende a aumentar continuamente con el tiempo después de una lesión cerebral.
Según otro ejemplo detallado de la presente invención, se mide un cambio cuantitativo en la concentración de proteína FAM19A5 en la esclerosis lateral amiotrófica, que es un modelo de enfermedad por daño de la médula espinal. Como resultado, se determinó que la cantidad de expresión aumentó en comparación con un modelo normal.
Por lo tanto, FAM19A5 se puede utilizar como biomarcador para diagnosticar daños en el sistema nervioso central.
Asimismo, según otro ejemplo detallado de la presente invención, cuando se usan anticuerpos específicos de FAM19A5 para tratar astrocitos reactivos generados debido a una lesión cerebral traumática, se inhibe la proliferación excesiva de esos astrocitos, las neuronas sobreviven y, por lo tanto, se espera la promoción de la regeneración de neuronas de la región dañada a largo plazo. Por consiguiente, FAM19A5 puede usarse para diagnosticar objetiva y cuantitativamente un estado progresivo de la enfermedad causado por daño del sistema nervioso central.
Por lo tanto, FAM19A5 se puede utilizar como un biomarcador para diagnosticar enfermedades cerebrales degenerativas debidas a daños en el sistema nervioso central o enfermedad del sistema nervioso central.
El término "daño del sistema nervioso central" en esta memoria descriptiva incluye todos los tipos de daño del sistema nervioso central que provocan la destrucción o degeneración de las células cerebroespinales. Se pueden ejemplificar la lesión cerebral traumática, la esclerosis lateral amiotrófica y similares, pero el daño no se limita a las mismas.
El término "enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central" se refiere a una enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central causadas por la gliosis resultante del daño del sistema nervioso central. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, accidente cerebrovascular o tumor cerebral, pero la enfermedad no se limita a ningún tipo específico de enfermedad.
El término "diagnóstico" se refiere a la determinación de un estado patológico. A la vista del objeto de la presente invención, el diagnóstico se refiere al hecho de que se determina la expresión de FAM19A5, un marcador de diagnóstico de daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central, para identificar la aparición, el progreso y el alivio de daño del sistema nervioso central, enfermedad degenerativa del cerebro y enfermedad del sistema nervioso central.
El término "marcador de diagnóstico" se refiere a un material capaz de diagnosticar por separado células de daño del sistema nervioso central, enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central a partir de células normales, e incluye biomoléculas orgánicas tales como polipéptidos o ácidos nucleicos (por ejemplo , ARNm), lípidos, glicolípidos, glicoproteínas y azúcares (monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y similares) que aumentan o disminuyen en las células de daño del sistema nervioso central, enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central, en comparación con las células normales. El marcador de diagnóstico proporcionado en la presente invención para el daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central puede ser una proteína que se expresa a partir de genes de FAM19A5 cuya expresión aumenta en células de daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa, o enfermedad del sistema nervioso central, en comparación con las células normales.
La composición para diagnosticar daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central de la presente invención incluye un agente para medir la cantidad de proteína expresada. Como tal agente, se pueden incluir oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria al ARNm de FAM19A5, por ejemplo, un cebador o una sonda de ácido nucleico que se une específicamente al ARNm de FAM19A5, y anticuerpos específicos para proteínas FAM19A5.
El cebador se refiere a un oligonucleótido de hebra sencilla que puede servir como punto de partida de la síntesis de ADN dirigida por molde en condiciones adecuadas (es decir, cuatro tipos de nucleósidos trifosfato y enzimas de polimerización diferentes) a una temperatura adecuada y una solución tampón adecuada. La longitud apropiada del cebador se puede cambiar por diversos factores, por ejemplo, la temperatura y el uso del cebador. Además, no es necesario que la secuencia del cebador tenga una secuencia completamente complementaria a la secuencia del molde. Es suficiente que la secuencia tenga suficiente complementariedad en un intervalo en el que las secuencias se pueden hibridar y se puede realizar la función del cebador. Por tanto, no es necesario que el cebador de la presente descripción tenga una secuencia completamente complementaria a la secuencia de nucleótidos de los genes que sirven como molde. Es suficiente que la secuencia tenga suficiente complementariedad en un intervalo en el que las secuencias se hibridan y se puede realizar la función del cebador. Asimismo, el cebador de la presente descripción se puede usar preferiblemente en reacciones de amplificación de genes. La reacción de amplificación se refiere a una reacción de amplificación de moléculas de ácido nucleico. Tales reacciones de amplificación de genes son bien conocidas en la técnica relacionada y pueden incluir, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción (TMA), y amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA).
La sonda de ácido nucleico, que se refiere a un monómero natural o modificado o un oligómero de enlace lineal que incluye un desoxirribonucleótido y un ribonucleótido, es capaz de hibridar específicamente con una secuencia de nucleótidos diana y se produce de forma natural o se sintetiza artificialmente. La sonda, según la presente descripción, puede ser de una sola cadena y, preferiblemente, ser un oligodesoxirribonucleótido. La sonda de la presente descripción puede incluir dNMP naturales (es decir, dAMP, dGMP, dCMP y dTMP) y análogos o derivados de nucleótidos. Asimismo, la sonda de la presente descripción puede incluir un ribonucleótido. Por ejemplo, puede incluir nucleótidos con la cadena principal modificada, tal como, ácido péptidonucleico (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), ADN con fosforotioato, ADN con fosforoditioato, ADN con fosforamidato, ADN ligado a amida, ADN ligado a MMI, 2'-O-metil ARN, ADN alfa y ADN con metilfosfonato, un nucleótido con azúcar modificado, por ejemplo, 2'-O-metil ARN, 2'-fluoro ARN, 2'-amino ARN, 2'-O-alquil ADN, 2'-O-alil ADN, 2'-O-alquinil ADN, ADN con hexosa, piranosil ARN y ADN con anhidrohexitol, nucleótidos que tienen una variación de nucleótidos, por ejemplo, pirimidina sustituida en C-5 (un sustituyente incluye fluoro-, bromo-, cloro-, yodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, etil-, propinil-, alquinil-, tiazolilo-, imidazolil- y piridil-), 7-desazapurina que tiene un sustituyente C-7 (un sustituyente incluye fluoro-, bromo-, cloro-, yodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, alquinil-, alquenil-, tiazolil-, imidazolil- y piridil-), inosina y diaminopurina.
Como anticuerpos específicos para FAM19A5, se pueden utilizar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados.
Los ejemplos de fragmentos del anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab') 2 y Fv; un diacuerpo; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995)); moléculas de anticuerpos monocatenarios; anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y similares.
Cuando los anticuerpos son descompuestos por la papaína, se generan dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, el fragmento "Fab" que tiene un único sitio de unión a antígeno y el fragmento "Fc" restante. Cuando se produce el tratamiento con pepsina, se genera un fragmento F (ab ') 2 que tiene dos sitios de unión al antígeno y todavía es capaz de entrecruzarse con el antígeno. Fv es un pequeño fragmento de anticuerpo producido que incluye una región completa de reconocimiento y unión de antígenos. Esta región está compuesta por un dímero de una cadena pesada y una región variable de cadena ligera, y está fuertemente acoplada por enlaces no covalentes.
Los expertos en la técnica conocen un método para preparar anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se pueden preparar inyectando un agente inmunizante en mamíferos una o más veces y, según sea necesario, se puede inyectar simultáneamente un inmunoadyuvante. Normalmente, el agente inmunizante y/o el inmunoadyuvante se inyectan subcutáneamente o intraperitonealmente en mamíferos varias veces. El agente inmunizante puede ser una proteína de la presente invención o una proteína de fusión de la misma. Cuando una proteína que se sabe que tiene inmunogenicidad y el agente inmunizante se inyectan juntos en mamíferos para ser inmunizados, puede ser eficaz.
Los anticuerpos monoclonales presentados en la presente invención pueden prepararse mediante un método de hibridoma descrito en el documento (Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)), o preparado mediante un método de ADN recombinante (por ejemplo, consúltese la Patente de Estados Unidos Núm. 4.816.576). Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de una biblioteca de anticuerpos de fagos utilizando una técnica descrita en el documento (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)).
Los anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen específicamente anticuerpos "quimera" en los que una parte de una cadena pesada y/o una cadena ligera tiene una secuencia idéntica u homóloga correspondiente a anticuerpos derivados de especies específicas o anticuerpos que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos específica. , pero el resto de las cadenas tiene anticuerpos derivados de diferentes especies, o anticuerpos que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos diferente, o es idéntica u homóloga a los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad deseada (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
Los tipos "humanizados" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, los Murinos) incluyen una inmunoglobulina quimera que tiene una secuencia mínima derivada de una inmunoglobulina no humana, una cadena de inmunoglobulina o fragmentos de las mismas (por ejemplo, Fv, Fab, Fab ', F (ab ') 2 u otras secuencias de anticuerpos de unión a antígeno). En la mayoría de los casos, los anticuerpos humanizados incluyen una inmunoglobulina humana (anticuerpos del receptor) en la que un resto de una región determinante de complementariedad (CDR) de un receptor se sustituye con un residuo de CDR de especies no humanas (anticuerpos donantes), como ratas, ratones o conejos, que tienen una especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, un resto del marco Fv de la inmunoglobulina humana se sustituye por un residuo no humano correspondiente. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden incluir anticuerpos receptores o un resto que no se encuentra en la secuencia de marco o CDR introducida. En general, los anticuerpos humanizados incluyen sustancialmente al menos uno, y generalmente dos o más dominios variables. Aquí, todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a regiones de la inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR corresponden a regiones de secuencias de inmunoglobulina humana. Además, los anticuerpos humanizados incluyen al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc) y, en general, una parte de una región de inmunoglobulina humana (Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
La composición para diagnosticar el daño del sistema nervioso central, una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central de la presente invención puede incluirse en forma de kit.
El kit puede incluir el cebador, la sonda o los anticuerpos que se pueden usar para medir el nivel de expresión de los genes FAM19A5 o la cantidad de proteínas. Las definiciones de los mismos son las mismas que las de la descripción anterior.
Cuando el kit se aplica a un proceso de amplificación por PCR, los reactivos necesarios para la amplificación por PCR, por ejemplo, se pueden incluir opcionalmente una solución tampón, ADN polimerasa (por ejemplo, ADN polimerasa termoestable obtenida de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermofilus (Tth), Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermococcus literalis o Pyrococcus furiosus (Pfu)), un cofactor de ADN polimerasa y dNTP. Cuando el kit se aplica a un inmunoensayo, puede incluir opcionalmente anticuerpos secundarios y un sustrato marcado. Adicionalmente, el kit de acuerdo con la presente descripción se puede fabricar en múltiples envases o compartimentos separados que incluyen los componentes reactivos anteriores.
Asimismo, la composición para diagnosticar el daño del sistema nervioso central, una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central de la presente invención se puede incluir en forma de micromatriz.
En la micromatriz de la presente descripción, el cebador, la sonda o los anticuerpos que se pueden usar para medir el nivel de expresión de la proteína FAM19A5 o el gen que codifica la proteína se utilizan como elementos de matriz hibridables y se fijan sobre un sustrato. Un sustrato preferido puede incluir, por ejemplo, una película, un filtro, un chip, un portaobjetos, una oblea, una fibra, una cuenta magnética o una cuenta no magnética, un gel, un tubo, una placa, un polímero, una micropartícula o un capilar, como un soporte apropiadamente robusto o no robusto. Los elementos de la matriz hibridable están dispuestos y fijados sobre el sustrato. Tal fijación puede realizarse mediante un método de unión química o un método covalente que implica UV. Por ejemplo, el elemento de matriz hibridable se puede acoplar a una superficie de vidrio que se modifica para incluir un compuesto epoxi o un grupo aldehído, o se acopla a una superficie de revestimiento de polilisina por UV. Además, el elemento de la matriz hibridable se puede acoplar al sustrato a través de un conector (por ejemplo: un oligómero de etilenglicol y diamina).
Mientras tanto, cuando una muestra aplicada a la micromatriz de la presente descripción es un ácido nucleico, la muestra se puede marcar e hibridar con un elemento de matriz en la micromatriz. Las condiciones de hibridación pueden ser variables y la detección y el análisis de un grado de hibridación se pueden realizar de diversas formas según el material de marcaje.
Asimismo, la presente invención proporciona un método para diagnosticar daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central utilizando un método para medir el nivel de expresión del gen o proteína FAM19A5, y más específicamente, el método incluye (a) medir el nivel de expresión de genes FAM19A5 o la cantidad de proteína expresada de una muestra biológica de un paciente sospechoso de tener daño del sistema nervioso central, enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central; y (b) medir el nivel de expresión de genes o la cantidad de proteína expresada de una muestra de grupo de control normal y comparar el resultado con el resultado de la medición de (a).
Un método para medir un nivel de expresión de genes o una cantidad de proteína en la descripción anterior puede usar una técnica conocida, que incluye un proceso conocido de separación de ARNm o proteínas de una muestra biológica.
La muestra biológica se refiere a una muestra recogida de un organismo que tiene un nivel de expresión de genes o proteínas diferente en comparación con la aparición o un grado de progreso del daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central de un grupo de control normal. Los ejemplos de la muestra pueden incluir tejido, células, sangre, suero, plasma, saliva y orina, pero la muestra no se limita a ellos.
Cuando se mide el nivel de expresión de los genes, preferiblemente se mide el nivel de ARNm. Como método para medir el nivel de ARNm, se puede utilizar RT-PCR, r T-PCR en tiempo real, un ensayo de protección de ARNasa, una transferencia Northern, un chip de ADN y similares, pero el método no se limita a ellos.
Cuando se mide el nivel de proteína, se pueden usar anticuerpos. En este caso, la proteína FAM19A5 en una muestra biológica y los anticuerpos específicos de la misma forman un producto conjugado, es decir, un complejo antígenoanticuerpo. La cantidad de complejo antígeno-anticuerpo generado puede medirse cuantitativamente por el tamaño de la señal producida por un marcador de detección. Dicho marcador de detección puede seleccionarse de un grupo que consiste en una enzima, un material fluorescente, un ligando, un material emisor de luz, una micropartícula, una molécula redox o un isótopo radiactivo, pero el marcador no se limita a ello. Un método de análisis para medir un nivel de proteína incluye una transferencia Western, ELISA, análisis de radioinmunoensayo, radioinmunodifusión, un método de inmunodifusión de Ouchterlony, inmunoelectroforesis en cohete, inmunotinción de tejidos, un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de fijación del complemento, FACS, un chip de proteína y similares, pero el método no se limita a ello.
Por lo tanto, utilizando los métodos de detección, la presente invención puede determinar la cantidad de proteína expresada en un grupo de control y la cantidad de proteína expresada en un paciente sospechoso de tener daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central. A continuación, los resultados se pueden comparar entre sí para diagnosticar la aparición, el grado de progreso y similares de daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central.
Además, en el método de diagnóstico de daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central según la presente invención, cuando la cantidad de proteínas expresadas según la presente invención aumenta en comparación con la muestra del grupo de control normal, puede determinarse que hay daño en el sistema nervioso central, enfermedad degenerativa del cerebro o enfermedad del sistema nervioso central.
La presente invención también se refiere a una composición para el tratamiento de una lesión cerebral traumática temprana que contiene FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
La presente invención también proporciona el uso de FAM19A5 para preparar una composición farmacéutica para el tratamiento de una lesión cerebral traumática temprana.
Los astrocitos reactivos iniciales generados después de un daño debido a una lesión cerebral traumática secretan un factor de crecimiento nervioso que previene la muerte celular programada, tal como el GDNF, y reanuda la absorción de ácido glutámico para proteger las neuronas. Además, los astrocitos funcionan de manera beneficiosa al recuperar la función de la barrera hematoencefálica, aislar una región en la que se ha producido el daño y prevenir la infección de tejidos sanos.
Dado que FAM19A5 generada a partir de células madre neurales está involucrada en la generación de astrocitos en lugar de neuronas, FAM19A5 puede promover la generación de astrocitos en una región de lesión cerebral para tratar la lesión cerebral temprana e inhibir la progresión de la enfermedad de lesión cerebral.
Por lo tanto, FAM19A5 se puede usar como agente para tratar una lesión cerebral traumática temprana.
Una composición para tratar una lesión cerebral traumática temprana de la presente invención puede incluir al menos una proteína FAM19A5 natural o recombinante, proteínas FAM19A5 que tienen una actividad fisiológica sustancialmente equivalente a la misma, células madre neurales transgénicas que expresan en exceso proteínas FAM19A5 o astrocitos diferenciados de las células madre neurales. Las definiciones de los mismos son las mismas que las de la descripción anterior. Las proteínas FAM19A5 naturales o recombinantes o proteínas FAM19A5 que tienen una actividad fisiológica sustancialmente equivalente a las mismas promueven la generación de astrocitos en una región de lesión cerebral para tratar una lesión cerebral traumática temprana.
Además, las células madre neurales transgénicas que expresan en exceso la proteína FAM19A5 se inyectan directamente en el tejido cerebral y las proteínas FAM19A5 se secretan en una región de lesión cerebral para promover la generación de astrocitos o promover la diferenciación de las células madre neurales transgénicas a astrocitos para tratar una lesión cerebral traumática temprana. En este caso, para promover la diferenciación de las células madre neurales transgénicas, se puede coadministrar un factor inductor de la diferenciación. Los tipos de factores inductores de diferenciación son los mismos que los de la descripción anterior.
Cuando los astrocitos diferenciados de las células madre neurales se inyectan directamente en el tejido cerebral y hay una gran cantidad de astrocitos presentes en una región de lesión cerebral, se puede tratar una lesión cerebral traumática temprana.
Asimismo, la presente descripción describe un método para tratar la lesión cerebral traumática temprana de un animal que incluye la administración de una composición para tratar la lesión cerebral traumática temprana que contiene una dosis farmacéuticamente eficaz de FAM19A5 a un sujeto.
A continuación se describirán una composición farmacéutica y un método de administración usados en el método de tratamiento de la lesión cerebral temprana, no se proporcionarán descripciones redundantes para evitar una complejidad excesiva de la presente memoria descriptiva.
Un sujeto al que se puede administrar la composición para el tratamiento de una lesión cerebral traumática temprana incluye todos los animales, tales como perros, gatos y ratas.
La presente invención también se refiere a una composición para prevenir o tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central que contiene un inhibidor de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5).
La presente descripción también describe un uso del inhibidor de FAM19A5 para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central.
Dado que FAM19A5 promueve la generación de astrocitos, que son un tipo de células gliales, cuando se inhibe la expresión de ARNm o proteína de FAM19A5 en una enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central, en la que se expresa una gran cantidad de células gliales, el número de astrocitos reactivos disminuye debido a la inhibición de FAM19A5, y se promueve la proliferación de células progenitoras que expresan NG2 (antígeno neuronal-glial 2), se mielinizan los axones de las neuronas cercanas a una región de lesión cerebral y, por lo tanto, se puede usar un inhibidor de FAM19A5 para tratar la enfermedad degenerativa del cerebro o la enfermedad del sistema nervioso central.
Por lo tanto, la composición para prevenir o tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central de la presente descripción puede incluir un agente para disminuir la expresión de ARNm de los genes FAM19A5 o la expresión de una proteína de los mismos, o una función o una actividad.
El inhibidor de la proteína FAM19A5 puede ser un péptido o un compuesto que está acoplado a las proteínas FAM19A5 y regula una señal de una ruta de diferenciación neural. Tal inhibidor se puede seleccionar mediante el siguiente método de escrutinio ilustrado, tal como un análisis de estructura de proteínas, y puede diseñarse utilizando un método conocido en la técnica relacionada.
Asimismo, el inhibidor de proteínas puede usar anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados para proteínas FAM19A5, y las definiciones de los anticuerpos son las mismas que las de la descripción anterior.
Cuando la transducción de señales de una vía de diferenciación neural de receptores en las células se regula utilizando los anticuerpos, se puede prevenir o tratar la enfermedad degenerativa del cerebro o la enfermedad del sistema nervioso central.
Un inhibidor de la función o actividad de la proteína FAM19A5 de la presente invención puede ser suministrado mediante liposomas, virus, una pistola genética, un polímero, ultrasonido o descarga eléctrica, pero el método de suministro no se limita a los mismos.
Los genes FAM19A5 pueden ser ADN que codifica el gen o ARNm transcrito a partir del mismo. Por lo tanto, el inhibidor de los genes puede ser un inhibidor que esté acoplado al propio gen para evitar la transcripción o acoplado al ARNm transcrito del gen para evitar la traducción del ARNm.
Por tanto, el inhibidor del gen FAM19A5 incluye todos los inhibidores que suprimen la expresión de los genes FAM19A5. Por ejemplo, tal inhibidor puede ser un péptido, ácido nucleico, un compuesto y similares acoplados al gen. El inhibidor puede seleccionarse mediante el siguiente método de escrutinio ilustrado, tal como el escrutinio basado en células, y puede diseñarse utilizando un método conocido en la técnica relacionada.
En un ejemplo detallado, el inhibidor puede ser un oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc, miARN o un vector que incluya los mismos genes FAM19A5. Tales oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhc, miARN y un vector que los incluya se pueden preparar utilizando un método conocido en la técnica relacionada.
El término "ARNip" en la presente memoria descriptiva se refiere a moléculas de ARN de doble hebra que inducen la interferencia del ARN mediante el corte del ARNm de un gen diana, y requiere una hebra de ARN de una secuencia efectora que tenga la misma secuencia que el ARNm del gen diana y una hebra de ARN de una secuencia antisentido que tiene una secuencia complementaria a la misma.
El ARNip puede incluir el ARNip mismo sintetizado in vitro o una forma que se expresa insertando una secuencia que codifica ARNip en un vector de expresión.
En la presente descripción, el término "vector" se refiere a una construcción genética que incluye ADN externo insertado en un genoma que codifica un polipéptido.
El vector relacionado con la presente descripción es un vector en el que se inserta una secuencia de ácido nucleico que inhibe el gen en un genoma. Los ejemplos de un vector pueden incluir un vector de ADN, un vector de plásmido, un vector de cósmido, un vector de bacteriófago, un vector de levadura o un vector de virus.
Asimismo, la hebra antisentido tiene una secuencia complementaria al gen FAM19A5 o todas o algunas secuencias de ARNm transcritas a partir de fragmentos del mismo y se acopla al ARNm para inhibir la expresión del gen FAM19A5 o fragmentos del mismo.
Asimismo, se puede preparar ARNi en horquilla corta (ARNihc) dirigiéndose a un área común de secuencia de ARNihc de humanos o ratas utilizando un método general.
Asimismo, se describe que la composición para prevenir o tratar la enfermedad degenerativa del cerebro o la enfermedad del sistema nervioso central de la presente descripción incluye adicionalmente células madre neurales embrionarias o células madre neurales adultas además del inhibidor FAM19A5. Dado que el inhibidor de FAM19A5 regula la proliferación y diferenciación de las células madre neurales, si se usan juntas, promueven la generación de neuronas que ayudan a la recuperación de los tejidos, por lo que el tratamiento de la enfermedad degenerativa del cerebro o la enfermedad del sistema nervioso central puede mejorarse aún más.
La presente descripción también describe un método para tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central de un animal, que incluye administrar una composición para prevenir o tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central que contiene una dosis farmacéuticamente eficaz del inhibidor de FAM19A5 a un sujeto.
Dado que la composición farmacéutica y el método de administración usados en el tratamiento de la enfermedad cerebral degenerativa o la enfermedad del sistema nervioso central ya se han descrito anteriormente, no se proporcionará una descripción redundante para evitar una complejidad excesiva de la presente memoria descriptiva.
Mientras tanto, un sujeto al que se puede administrar la composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central puede incluir todos los animales, por ejemplo, animales no humanos tales como perros, gatos y ratas.
Asimismo, una composición de medicamento de la presente invención puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable.
El portador farmacéuticamente aceptable incluye un portador y un vehículo que se usan comúnmente en el campo de la medicina, y específicamente, incluye una resina de intercambio iónico, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, una proteína de suero (por ejemplo, albúmina de suero humano), un material tampón (por ejemplo, varios fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio y una mezcla de glicérido parcial de ácido graso vegetal saturado), agua, sales o electrolitos (por ejemplo, sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio y sales de zinc), sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, un sustrato celulósico, un polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliarilato, cera, polietilenglicol, lanolina y similares, pero el portador no se limita a ellos.
Asimismo, la composición de la presente invención puede incluir adicionalmente un lubricante, un agente humectante, un agente emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares, además de los componentes anteriores.
Como aspecto, la composición de acuerdo con la presente invención puede prepararse como una solución acuosa para administración parenteral. Preferiblemente, se puede utilizar la solución de Hank, la solución de Ringer o una solución tampón, tal como una solución salina tamponada físicamente. Una suspensión para inyección acuosa puede incluir un sustrato que puede aumentar la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano.
La composición de la presente invención puede administrarse sistémica o localmente y puede formularse en una formulación apropiada utilizando una técnica conocida de administración. Por ejemplo, cuando la composición se administra por vía oral, la composición se puede mezclar con un diluyente inerte o un portador comestible, sellar en una cápsula de gelatina dura o blanda, o comprimir en comprimido y a continuación administrar. En la administración oral, el compuesto activo puede mezclarse con un excipiente y usarse en forma de comprimido de ingesta, comprimido bucal, pastilla, cápsula, elixir, suspensión, jarabe, oblea y similares.
Se pueden preparar diversas formulaciones para inyección, administración parenteral y similares mediante un mecanismo conocido en la técnica relacionada o un mecanismo comúnmente utilizado. Dado que FAM19A5 es muy soluble en una solución salina o tampón, FAM19A5 se almacena en un estado liofilizado, y después se puede formular una dosis eficaz de FAM19A5 en una solución salina o tampón para su administración en una forma apropiada para inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, administración percutánea y similares inmediatamente antes de la administración.
Una dosis eficaz del ingrediente activo de la composición de medicamento de la presente invención se refiere a una cantidad necesaria para prevenir, inhibir o aliviar la enfermedad.
Por lo tanto, la dosis eficaz puede regularse de acuerdo con varios factores tales como el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad, el ingrediente activo contenido en la composición y los tipos y contenidos de otros componentes, tipos de formulación, edad, peso, estado general de salud del paciente, y sexo, dieta, tiempo de administración, vía de administración, tasa de secreción de la composición, período de tratamiento y medicamento utilizado por el paciente al mismo tiempo. Por ejemplo, cuando la administración se realiza una o varias veces al día en adultos y el inhibidor de la presente invención se administra una o varias veces al día, se pueden administrar de 0,1 ng/kg a 10 g/kg de un compuesto, de 0,1 ng/kg a 10 g/kg de /de polipéptidos, proteínas o anticuerpos, y de 0,01 ng/kg a 10 g/kg de un oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNihc o miARN, pero la dosis no se limita a los mismos.
La presente descripción también describe un método de escrutinio de una medicamento preventivo o terapéutico para una enfermedad cerebral o una enfermedad del sistema nervioso central, que incluye poner en contacto genes de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) con un material candidato in vitro, y determinar si el material candidato promueve o inhibe la expresión de los genes.
La presente descripción también describe un método de escrutinio de un medicamento preventivo o terapéutico para enfermedad cerebral o enfermedad del sistema nervioso central, que incluye poner en contacto proteínas de FAM19A5 (familia con similitud de secuencia 19, miembro A5) con un material candidato in vitro, y determinar si el material candidato promueve o inhibe una función o actividad de la proteína.
Según el método de escrutinio de la presente descripción, en primer lugar, un material candidato a analizar entra en contacto con células de enfermedad cerebral o enfermedad del sistema nervioso central, que incluyen el gen o la proteína.
Según un método de selección convencional, el material candidato puede incluir un material que promueva o inhiba la transcripción en ARNm y la traducción a proteínas en secuencias del gen de FAM19A5, un material propuesto por tener una posible aplicación médica que promueva o inhiba una función o actividad de las proteínas FAM19A5, o ácidos nucleicos, proteínas, péptidos, otros extractos, productos naturales, compuestos y similares individuales seleccionados aleatoriamente.
A continuación, la cantidad de expresión génica, la cantidad de proteína o la actividad de la proteína puede medirse en células tratadas con material candidato. En el resultado de la medición, cuando se mide un aumento o una disminución en la cantidad de expresión génica, la cantidad de proteína o la actividad de la proteína, el material candidato puede determinarse como un material capaz de tratar o prevenir una enfermedad cerebral o enfermedad del sistema nervioso central.
En la descripción anterior, la medición de la cantidad de expresión génica, la cantidad de proteína o la actividad de la proteína se puede realizar mediante varios métodos conocidos en la técnica relacionada, por ejemplo, RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real, una transferencia Western, una transferencia Northern, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), análisis de radioinmunoensayo (RIA), radioinmunodifusión, ensayo de inmunoprecipitación y similares, pero el método no se limita a los mismos.
Un material candidato que exhibe una actividad que promueve la expresión génica o que promueve una función de proteínas y, a la inversa, un material candidato que exhibe una actividad que inhibe la expresión génica o que inhibe una función de proteínas se obtiene mediante el método de escrutinio de la presente descripción. El primer material puede ser un material candidato de un agente terapéutico para una lesión cerebral traumática temprana. El último material puede ser un material candidato de un agente terapéutico para una enfermedad cerebral degenerativa o una enfermedad del sistema nervioso central.
Tal material candidato a agente terapéutico para enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central puede servir como un compuesto principal en el proceso de desarrollo posterior de un agente terapéutico para enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central. Cuando el compuesto principal transforma y optimiza una estructura del mismo de manera que las funciones de los genes de FAM19A5 o las proteínas expresadas a partir de los mismos se pueden promover o inhibir, se puede desarrollar un nuevo agente terapéutico para la enfermedad degenerativa del cerebro o la enfermedad del sistema nervioso central.
Los contenidos relacionados con la tecnología de la ingeniería genética en la presente invención pueden entenderse claramente a partir de los contenidos divulgados en un libro de Sambrook (Sambrook et al. Molecular Clonan, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)) y Frederick (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in molecular biology volumen 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc. (1994)).
<Ejemplo 1> Búsqueda de un nuevo péptido secretor FAM19A5 utilizando bioinformática
La tarea de escrutinio de los genes de FAM19A5 se realizó mediante un modelo de enfoque bioinformático. Los autores de la presente invención descargaron marcos de lectura abiertos (ORF) de aproximadamente 50.000 especies de genes del genoma humano de Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) y UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot). Con el fin de identificar si entre ellos se encontraban genes que tenían posibles péptidos fisiológicos activos, se escrutaron genes (secretoma) de aproximadamente 2.000 especies que se pueden secretar a partir de células utilizando un programa Signal P3.0. Basándose en la información de UniprotKB, se analizaron los ORF escrutados. El resultado mostró que los ORF de aproximadamente 600 especies se determinaron como genes (peptidomas) que codifican péptidos. Entre ellas, 560 especies eran genes cuyas funciones ya se conocían, pero las 40 especies restantes eran genes cuyas funciones aún no se habían descubierto y codificaban nuevos péptidos.
Entre ellos, se encontraron genes de FAM19A5 en varios vertebrados, incluidos seres humanos. FAM19A5 incluye una secuencia génica que codifica un péptido señal típico de un extremo amino como señal que puede secretarse extracelularmente y, posteriormente, incluye una secuencia de aminoácidos de FAM19A5 madura. En particular, las secuencias de aminoácidos de las proteínas FAM19A5 estaban muy bien conservadas entre las especies (Figura 1A). Un método de análisis genómico comparativo descrito anteriormente se reconoce como un modelo experimental confiable capaz de verificar si un nuevo gen recién descubierto tiene una función sustancial [Robbins, J Comput Biol 3: 465­ 478,1996]. Mientras tanto, de acuerdo con los resultados de los documentos de la técnica convencional, si bien hay un artículo en el que se identificaron genes de quimiocinas CC que se expresan en gran medida en el tejido cerebral afectado por la enfermedad de Alzheimer y se analizó un mecanismo identificado en el que MIP-1a como gen de la familia de quimiocinas CC, hace que proliferen las células gliales y se agrave la enfermedad cerebral degenerativa, un árbol filogenético (Figura 1B) puede mostrar que los genes de la familia FAM19A forman una rama claramente diferente de los genes de la familia de quimiocinas CC [MengQi Dia et al., American Journal of Pathology, 1998].
<Ejemplo 2> Verificación de la expresión de genes de FAM19A5 en varios tejidos mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
Se adquirieron ratones macho negros de seis semanas (C57BL/6, ratón) de Daehan Bio Link Co., Ltd. (http://www.dhbiolink.com). Los ratones adquiridos se criaron en jaulas para ratones en las que se les dieron alimento y agua adecuados, se mantuvo una temperatura de 20 a 24°C y se mantuvo una humedad de 40 a 70%. Además, estos ratones de tipo salvaje se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad 12/12 (luz encendida a las 8:00 am y apagada a las 8:00 pm). Todos los experimentos se diseñaron para utilizar la menor cantidad de ratones, se realizó un método de anestesia de acuerdo con la ética de los experimentos con animales para minimizar el dolor de los ratones utilizados en el experimento, y esto fue aprobado por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Corea (KUIACUC- 08).
Se extrajeron todos los ARN de cada tejido correspondiente de ratones, y después se preparó ADN complementario (ADNc) utilizando transcriptasa inversa y un hexámero aleatorio. A continuación, se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un cebador correspondiente y se observó una distribución de ARNm de los tejidos de ratón. La información sobre los cebadores utilizados en la p Cr se enumera en la Tabla 1.
Como se muestra en la FIG. 2, todo los tipos de genes de la familia FAM19A excepto el gen FAM19A3 se expresaron específicamente en el cerebro. Asimismo, se observó la expresión de genes de la familia FAM19A incluso en la etapa temprana del desarrollo.
[Tabla 1]
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<Ejemplo 3> Verificación de la expresión de los genes de FAM19A5 para cada etapa de desarrollo por hibridación in situ
Para determinar los patrones de expresión de los genes de la familia FAM19A en la corteza cerebral durante el proceso de desarrollo, se utilizó la hibridación in situ para comparar cantidades de ARNm. Las ratas Wistar se trataron de la misma manera que en el método anterior. Las ratas, desde el día embrionario 14 (E14) antes del nacimiento, hasta los 21 días después del nacimiento (día postnatal, P21) fueron sacrificadas (decapitación) para obtener el cerebro del cráneo. Dado que las ratas, antes del nacimiento, tienen un tamaño corporal más grande que los ratones, que es un tipo diferente de rata experimental, las ratas fueron más fáciles de manejar en el experimento y se usaron para comparar la expresión del gen FAM19A5 para cada etapa de desarrollo.
El cerebro extraído se movió y se congeló en una solución de isopentano fría sobre hielo seco. Los tejidos cerebrales congelados se cortaron (seccionaron) a 12 pm, se unieron (descongelaron) a un portaobjetos de vidrio recubierto con TESPA (Sigma-Aldrich Co., Llc., St. Louis, MO, EE.UU.), Y se fijaron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía paraformaldehído al 4%. Después, se realizó una reacción de acetilación utilizando una solución de trietanolamina 0,1 M/NaCl al 0,9% (pH 8,0) que contenía anhídrido acético al 0,25%. A continuación, se utilizaron etanol y una solución de cloroformo para realizar el proceso de deshidratación y desengrasado, y se realizó el secado al aire. Mientras tanto, los tejidos seccionados se hibridaron a 55°C utilizando una sonda marcada con 35S, y se lavaron con una solución 2 x SSC a temperatura normal. El portaobjetos se trató con enzima degradante de ARN (ARNasa), y después el portaobjetos se lavó secuencialmente con soluciones 2 x SSC, 1 x SSC, 0,5 x SSC, 0,1 x SSC que contenían ditiotreitol 1 mM a temperatura normal durante 10 minutos cada una. Finalmente, las secciones de tejido se deshidrataron, se secaron al aire y a continuación se expuso el portaobjetos de vidrio que contenía las secciones de tejido cerebral a una película de rayos X (Biomax MR, Eastman Kodak Co., Rochester, NY, EE.UU.).
Mientras tanto, todos los ARN se extrajeron de la corteza cerebral de ratas adultas para generar una sonda, se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y un cebador hexámero aleatorio, y después se realizó la clonación del vector T (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.). La información sobre los cebadores utilizados en la PCR se enumeró en la Tabla 2. El vector T clonado se utilizó como molde, se realizó un sistema de transcripción in vitro (Promega Corp., Madison, WI, EE.UU.) [35S] UTP (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, EE.UU.) y las ribosondas antisentido de un radiomarcador generado se purificaron y utilizaron en la presente reacción hibridada.
[Tabla 2]
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Se escrutó un plano de disección del cerebro de la rata mediante un plano frontal general y un plano sagital desde rostral en el que se encuentra el bulbo olfatorio hasta caudal en el que se encuentra el cerebelo.
Como se muestra en la FIG. 3, en la expresión de ARNm de los genes de la familia FAM19A, solo el ARNm de FAM19A5 estaba fuertemente distribuido en la zona ventricular y la médula espinal. Los días embrionarios 14 (E14) y 16 (E16) antes del nacimiento, FAM19A5 se expresó fuertemente solo en la zona ventricular. FAM19A5 todavía se expresaba en gran medida el día embrionario 18 (E18) en la zona ventricular y la zona subventricular y se expresaba mucho más débilmente en la placa cortical en la que se incluían neuronas diferenciadas.
Los genes de FAM19A5 se expresaron fuertemente en dos regiones del sistema nervioso central que se sabe que tienen una población distribuida de células madre neurales. Esto significa que las proteínas FAM19A5 son importantes en la formación de un sistema nervioso central completo y demuestra por primera vez que las proteínas FAM19A5 pueden participar en la generación de neuronas y células gliales que constituyen el sistema nervioso central.
<Ejemplo 4> Preparación de anticuerpo específico de FAM19A5
Para preparar anticuerpos capaces de reconocer específicamente proteínas FAM19A5, se inoculó FAM19A5 sintético corto en un conejo para obtener anticuerpos policlonales. Los anticuerpos reconocieron específicamente sólo FAM19A5 entre los genes de la familia FAM19A que están expresados en exceso en células HEK293T (FIG 4A). Asimismo, cuando se trató con N-glicosidasa F, desapareció la banda de 20 kDa, una proteína madura de FAM19A5, que se determinó como una forma N-glicosilada (FIG 4B). Asimismo, cada anticuerpo reconoció específicamente las células HEK293T que expresaban FAM19A5 (etiquetadas con His), lo que se observó utilizando inmunocitoquímica (FIG 4C).
<Ejemplo 5> Medición de la expresión de la proteína FAM19A5 durante el proceso de desarrollo mediante inmunohistoquímica
Para determinar si los patrones de expresión de la proteína FAM19A5 después de la traducción aparecen de forma similar, se utilizó inmunohistoquímica. Los ratones se trataron de la misma manera que en el método anterior. Los ratones los días embrionarios 12 (E12) a 18 (E18) antes del nacimiento se sacrificaron para obtener el cerebro del cráneo. El cerebro extraído se fijó (post-fijación) en solución salina tamponada con fosfato que contenía paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 48 horas y se trató con solución salina tamponada con fosfato que contenía sacarosa al 30% durante 24 horas. A continuación, el cerebro se colocó en un molde para tejidos cerebrales y se congeló en hielo seco con un compuesto OCT que contenía un 30% de una solución de azúcar y se mantuvo a -80°C antes de usar el cerebro.
Para determinar las regiones y la intensidad de la expresión de la proteína FAM19A5 en el cerebro del ratón mediante inmunohistoquímica, se utilizó anti-FAM19A5 que es un anticuerpo policlonal preparado en el Ejemplo 4 como un anticuerpo que puede reaccionar con la proteína FAM19A5. El tejido cerebral congelado del ratón se cortó en rodajas a 40 pm utilizando un micrótomo criostato. Las secciones de tejido cerebral se lavaron con una solución de PBS durante 30 minutos y se bloquearon durante una hora utilizando una solución de PBS-T (una solución en la que TritonX-100 al 10% está contenido en solución salina tamponada con fosfato) que contiene cloruro de suero al 10%. En la imagen de fluorescencia final que se muestra, para evitar reacciones antígeno-anticuerpo casi inespecíficas y distinguir con mayor precisión una región de expresión específica de FAM19A5, se estableció una razón de anticuerpo para FAM19A5:solución de bloqueo en 1:500. Los anticuerpos contra FAM19A5 y los antígenos se hicieron reaccionar a 4°C durante la noche o a temperatura normal (25°C) durante aproximadamente 3 horas. Después de que se completara una reacción primaria de anticuerpo-antígeno, las secciones de tejido cerebral se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos cada vez. Después, como anticuerpo secundario, se diluyó anti-IgG de conejo acoplado con FITC (Invitrogen, EE.UU.) en una proporción de 1:500 y se utilizó. Después de que se completara una reacción secundaria de anticuerpo-antígeno, las secciones de tejido cerebral se lavaron tres veces con una solución salina tamponada con fosfato durante 10 minutos cada vez y después el tejido se montó uniformemente en el portaobjetos de vidrio (montaje). Los tejidos se secaron a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos, se aplicó una solución de cristal/montaje (Biomeda Corp., EE.UU.) sobre los tejidos y se utilizó un cubreobjetos para cubrir y preparar una muestra. Se obtuvo una imagen de fluorescencia de la muestra preparada utilizando una microscopía confocal (microscopía confocal Zeiss LSM 510).
Dado que las células madre neurales o las células progenitoras neurales tienen una proteína de filamento intermedio llamada nestina, la nestina se utilizó como marcador [Lendahl et al., Cell 60: 585-595, 1990]. En la etapa inicial del desarrollo, se observó que la nestina ya se había expresado en la placa neural antes de que se formara un tubo neural [Woodbury et al., J Neurosci Res 61: 364-370,2000]. Dado que los neuroblastos tienen una proteína doblecortina asociada a microtúbulos (DCX), se utilizó DCX como marcador. La nestina y la DCX utilizaron anti-IgG de cabra y ratón acoplada a CY3 (Invitrogen, EE.UU.) diluido en una proporción de 1:500 como anticuerpo secundario.
Como se muestra en la FIG. 5, curiosamente, como en el resultado del experimento utilizando hibridación in situ, las proteínas FAM19A5 se expresaron fuertemente en la zona ventricular, incluso a nivel de proteína. El día embrionario 12 (E12), que es un período en el que las células progenitoras que se están dividiendo están principalmente distribuidas en la zona ventricular, los péptidos FAM19A5 se expresaron principalmente en toda la zona ventricular y todavía se expresaron altamente los días embrionarios 14 (E14) y 18 (E18). La cantidad de expresión en la placa cortical fue mucho menor que en el resultado al utilizar hibridación in situ. En las células progenitoras que contienen nestina, las proteínas FAM19A5 se muestran en forma punteada. En los neuroblastos que contienen d Cx , se mostró una expresión débil de los mismos. En algunos genes, debido a un proceso de preparación después de la transcripción o pos-traducción, los niveles de expresión de proteínas y de expresión de ARNm pueden diferir [Wellington et al., Lab Invest 82: 273-283,2002], pero se mostró el mismo patrón de expresión en el presente experimento.
Los resultados del Ejemplo 5, además de los resultados del Ejemplo 3, propusieron la identificación, una posición de expresión, un nivel de expresión o una intensidad de expresión de las proteínas FAM19A5 en tejidos cerebrales durante un proceso de desarrollo. Se consideró que FAM19A5 se expresaba en células madre neurales que constituyen el sistema nervioso central y que participa en la generación de neuronas y células gliales.
<Ejemplo 6> Medición de la expresión de la proteína FAM19A5 en células madre neurales adultas mediante inmunohistoquímica
Al igual que en los ratones antes del nacimiento, la región y la intensidad de la expresión de la proteína FAM19A5 se determinaron en el cerebro de ratones adultos mediante inmunohistoquímica.
Por lo tanto, a ratones macho de 4 semanas de edad tratados con el método anterior se les inyectaron por vía intraperitoneal 0,5 cc/100 g de uretano como anestesia, se cortó el tórax y se insertó una aguja de Ringer en el ventrículo cardíaco izquierdo para drenar la sangre con solución salina al 0,9% (200 mL) y el ventrículo cardíaco se perfundió con solución salina al 0,9% (200 mL) que contenía paraformaldehído al 4% y se fijó. El cerebro de los ratones fijados se extrajo, se fijó utilizando solución salina tamponada con fosfato que contenía paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 48 horas, y se trató con solución salina tamponada con fosfato que contenía 30% de azúcar durante aproximadamente 24 horas. A continuación, el cerebro se colocó en un molde para tejido cerebral, se congeló en hielo seco con un compuesto OCT que contenía un 30% de una solución de azúcar y se mantuvo a -80°C antes de usar el cerebro. Al igual que en los ratones antes del nacimiento, para determinar la región y la intensidad de la expresión de la proteína FAM19A5 mediante inmunohistoquímica en el cerebro del ratón adulto, se utilizaron anticuerpos para FAM19A5. Asimismo, dado que las células madre neurales adultas (células ependimarias y astrocitos) tienen una proteína filamentosa intermedia denominada proteína ácida fibrilar glial (GFAP, Invitrogen, EE.UU.), se utilizó GFAP como marcador.
Como se muestra en la FIG. 6A, similar al resultado del experimento de la fase de desarrollo, el grado de expresión de FAM19A5 fue alto en la zona subventricular (SVZ) que se sabe que tiene una población distribuida de células madre neurales adultas.
Por tanto, se puede concluir que la expresión de FAM19A5 es mayor en las células madre neurales que en los neuroblastos.
Después se determinó si la cantidad de proteína de FAM19A5 disminuye a través de condiciones diferenciadas. Para ello, se realizó un experimento centrado en el tracto SVZ-RMS-OB.
Los neuroblastos en la SVZ migraron al bulbo olfatorio (OB) a través de una corriente migratoria rostral (RMS) y finalmente se diferenciaron en interneuronas maduras. Dado que FAM19A5 se expresó más en SVZ-RMS que en OB, se consideró que la cantidad de proteína disminuye a través de un proceso de diferenciación (FIG 6B).
<Ejemplo 7> Medición de la expresión de FAM19A5 en neuroesferas que se desarrollan a partir de células madre neurales adultas
La tecnología para la proliferación continua de células madre neurales mejora y, por lo tanto, se puede producir una masa celular que se desarrolla a partir de células madre neurales denominadas neuroesferas. Tal tecnología se puede utilizar para varios experimentos y se está utilizando como un modelo de experimento útil que puede realizar un seguimiento inverso de las propiedades de las células madre neurales [Reynolds y Weiss, Science 255: 17071710,1992; Reynolds y Weiss, Dev Biol 275: 1-13,1996].
Para obtener células madre neurales adultas, se extrajeron cerebros de ratones machos de 3 a 8 semanas de edad. Para separar la zona subventricular conocida por tener una población de células madre neurales adultas, se utilizaron matrices cerebrales. Los tejidos se disociaron en células individuales utilizando proteasa tal como dispasa (Invitrogen, EE.UU.) y papaína (Worthington Biochemical Corp., EE.UU.). Se añadió un factor de crecimiento, tal como un factor de crecimiento epidérmico (EGF, Invitrogen) y un factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, Invitrogen) a una solución de cultivo, y las células proliferaron selectivamente para formar neuroesferas. Además de las células madre neurales adultas, se separó una corteza cerebral de un cerebro de ratón el día embrionario 12 (E12) antes del nacimiento, las células madre neurales embrionarias se cultivaron selectivamente utilizando el mismo método para obtener neuroesferas.
Las neuroesferas compuestas por células madre neurales adultas y las neuroesferas compuestas por células madre neurales embrionarias se fijaron en una placa de cultivo utilizando laminina (Invitrogen, EE.UU.) que actúa como proteína de adhesión celular y a continuación se realizó inmunocitoquímica para determinar si se expresan las proteínas FAM19A5. El resultado se fijó en solución salina tamponada con fosfato que contenía paraformaldehído al 4% durante 15 minutos y se permeabilizó con una solución de p BS-T (una solución en la que se encuentra TritonX-100 al 0,5% en una solución salina tamponada con fosfato) durante 5 minutos. Después de realizar el bloqueo durante 30 minutos, se realizó una reacción antígeno-anticuerpo y se utilizó un método de tinción con dapi para observar los núcleos.
Las proteínas FAM19A5 se expresaron en la mayoría de las neuroesferas. Dado que las proteínas son proteínas secretoras, las proteínas se tiñeron en forma punteada en el citoplasma (FIG 7).
Además, con el fin de conocer las propiedades de las células que expresan proteínas FAM19A5, se tiñeron simultáneamente las neuroesferas con varios marcadores de células madre neurales.
Como resultado, las células que expresan proteínas FAM19A5 expresaron simultáneamente nestina (FIG 8A). Esto indica que las neuroesferas obtenidas de células madre neurales se utilizan como un buen modelo de experimento para estudiar FAM19A5.
Asimismo, para verificar si la expresión génica FAM19A5 en las neuroesferas es más fuerte que la expresión génica de otros tipos de la misma familia, todos los ARN se extrajeron de neuroesferas desarrolladas a partir de células madre neurales adultas. Después, se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y un hexámero aleatorio. La PCR se realizó utilizando un cebador correspondiente y se observó una distribución de ARNm de FAM19A5 en neuroesferas. La información sobre los cebadores utilizados en la PCR se enumeró en la Tabla 1.
Como se muestra en la FIG. 8B, el ARNm de FAM19A5 entre los genes de la familia FAM19A se distribuyó de manera más significativa que los otros tipos.
Además de la RT-PCR, se utilizó una micromatriz para comparar los grados de expresión de los genes de la familia FAM19A. La producción de ADNc y ARNc marcado y una reacción hibridada con un GeneChip Affymetrix MOE430 v2.0 (conjuntos de sondas de 46k) se realizaron de acuerdo con un protocolo básico disponible de Affymetrix, Inc. (www.affymetrix.com). Se utilizó una marca fluorescente en la síntesis de ADNc para facilitar el análisis y se utilizó el soporte lógico ChipInspector (Genomatix Software GmbH) para el análisis estadístico de la cantidad de expresión.
Como se muestra en la FIG. 8C, similar a los resultados en RT-PCR, la cantidad de expresión de los genes FAM19 A5 fue significativamente más alta que la de otros tipos de genes. Además, un nivel normalizado es de 4 a 14. Considerando el hecho de que una distribución de genes de nivel 10 o más es muy rara, el resultado indica que FAM19A5 es un gen que muestra una fuerte expresión en neuroesferas.
Los resultados del Ejemplo 6 y del Ejemplo 7 sugieren fuertemente que FAM19A5 puede servir como un material importante en funciones de células madre neurales adultas y células madre neurales embrionarias o en un proceso de diferenciación en otros tipos de células generadas a partir de ellas.
<Ejemplo 8> Cambio numérico en los astrocitos generados según el análisis de marcadores específicos de neuronas y células gliales después de la acción de neutralización del anticuerpo contra FAM19A5
Para determinar si las proteínas FAM19A5 generadas y secretadas a partir de células madre neurales influyen en la generación de células diferenciadas de las mismas, se utilizó un anticuerpo específico para FAM19A5.
Para realizar una prueba de diferenciación, las neuroesferas se disociaron en células individuales utilizando Accutase (Innovative Cell Technologies Inc., EE.UU.). Se colocaron 50.000 células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se mantuvieron en una solución de cultivo que contenía un factor de crecimiento durante un día, para la estabilización. Al día siguiente, la solución se cambió a una solución de cultivo de diferenciación que contenía un factor que promueve la diferenciación. Se indujo la diferenciación durante 6 días y se añadieron simultáneamente anticuerpos contra FAM19A5 (500 ng/mL) como tratamiento todos los días. Se realizaron transferencia Western e inmunocitoquímica utilizando marcadores que marcaban tres tipos de células del sistema nervioso, incluidas neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
Como se muestra en la FIG. 9, curiosamente, en un grupo experimental que utiliza un anticuerpo correspondiente que induce una acción de neutralización de las proteínas FAM19A5, el número de neuronas marcadas con Tuj1 aumentó aproximadamente dos veces más que un grupo de control tratado con Rb IgG normal, y el número de astrocitos marcados con GFAP disminuyó en consecuencia.
Como resultado, se puede considerar que las proteínas FAM19A5 pueden servir como una molécula funcional en un proceso de diferenciación de células madre a otros tipos de células y, en particular, pueden participar en la promoción de la generación de astrocitos.
<Ejemplo 9> Influencia del péptido FAM19A5 y del anticuerpo específico sobre la proliferación de células madre neurales
Para determinar si las proteínas FAM19A5 generadas y secretadas a partir de células madre neurales influyen en la proliferación, se utilizaron péptidos y anticuerpos específicos de FAM19A5. Para realizar un experimento de proliferación, las neuroesferas se disociaron en células individuales. Se colocaron 50.000 células en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se trató una solución de cultivo que contenía un factor de crecimiento con péptidos o anticuerpos. Se indujo la proliferación durante 6 días utilizando el factor de crecimiento y péptidos FAM19A5 y se trataron simultáneamente anticuerpos específicos a 500 ng/ml todos los días. El último día, las neuroesferas formadas se disociaron en células individuales y se midió el número de células.
Como se muestra en la FIG. 10, se observó que la proliferación de células madre neurales disminuyó significativamente debido a los péptidos FAM19A5 en comparación con el grupo de control, y cuando se añadió el anticuerpo específico como tratamiento, la proliferación aumentó.
<Ejemplo 10> Cambio cuantitativo en las proteínas FAM19A5 en el modelo de ratones con lesión cerebral traumática (TBI)
Para determinar si hay un cambio en las cantidades de proteínas FAM19A5 después de una lesión cerebral, se utilizó un modelo de lesión cerebral traumática. Se fijó la cabeza de un ratón de 8 semanas y después se colocó una barra de hierro, suficientemente enfriada con nitrógeno líquido, en el lado derecho del cráneo durante un minuto. Se suturó la piel del ratón mediante una operación y se trató al ratón de la misma manera que a los ratones normales durante 7 días [Moon et al., Neuro report 22: 304-308].
Siete días después, se realizó anestesia intraperitoneal en el ratón, se cortó eltórax, se insertó una aguja de Ringer en un ventrículo cardíaco izquierdo para drenar sangre con 0,9% de solución salina normal (200 mL), y a continuación se perfundió el ventrículo cardíaco con 0,9%de solución salina (200 mL) que contiene paraformaldehído al 4% y se fijó. El cerebro del ratón fijado se extrajo, se fijó en solución salina tamponada con fosfato que contenía paraformaldehído al 4% durante 24 horas a 48 horas y se trató con solución salina tamponada con fosfato que contenía 30% de azúcar durante aproximadamente 24 horas. Después, el cerebro se colocó en un molde para tejido cerebral, se congeló en hielo seco con un compuesto OCT que contenía un 30% de una solución de azúcar y se mantuvo a -80°C antes de usar el cerebro. El tejido cerebral congelado del ratón se cortó en rodajas a 40 pm utilizando un micrótomo criostato y después se realizó inmunohistoquímica.
Cuando se aplica daño externo, los astrocitos maduros se convierten en células gliales radiales mediante un proceso de diferenciación inverso. Estos tipos de células expresan un marcador de células progenitoras denominado nestina y generan células gliales en una posición de las mismas.
Como se muestra en la FIG. 11A, se observó un aumento significativo en el número de células que expresan proteínas FAM19A5 en una región dañada (penumbra). Las células gliales radiales en la región dañada expresan nestina que sirve como marcador y expresan simultáneamente FAM19A5, y la cantidad de proteínas aumentó significativamente en comparación con un grupo de control que no tenía daño.
Además, aunque es una proporción muy baja, los neuroblastos que migraron a la región de la lesión cerebral desde la zona subventricular a través del cuerpo coloso (CC) no expresaron péptidos FAM19A5. Además de la región dañada, en una región periférica de la zona subventricular en la que se posiciona una población de células madre neurales, aumentó el número de células que expresaban proteínas FAM19A5, y estas expresaron simultáneamente GFAP que actúa como marcador de astrocitos. Como resultado, se consideró que los péptidos FAM19A5 generados a partir de células madre neurales tienen más probabilidades de estar involucrados en la generación de astrocitos que en la generación de neuronas.
Mientras tanto, es probable que un factor secretor de FAM19A5 se filtre a la sangre mientras que la barrera hematoencefálica se daña después de una lesión cerebral. En este caso, al determinar la expresión o el grado de expresión, se puede desarrollar un marcador de diagnóstico capaz de determinar la aparición, el progreso y el alivio de la enfermedad de lesión cerebral o enfermedad cerebral. Para conocer su posibilidad, se obtuvo sangre de ratones normales y de ratones 7 días después de la lesión cerebral, que se consideró que tenían la mayor expresión de FAM19A5, y se coaguló. Después, se separó solo el suero y se realizó un radioinmunoensayo.
La cantidad de proteínas en suero se midió utilizando una curva patrón. Como resultado, sorprendentemente, se detectaron 7 veces o más proteínas FAM19A5 en el suero de los ratones 7 días después de la lesión cerebral en comparación con los ratones normales (FIG 11B).
<Ejemplo 11> Cambio cuantitativo en las proteínas FAM19A5 a lo largo del tiempo después de una lesión cerebral traumática (TBI)
Se observó un cambio cuantitativo en las proteínas FAM19A5 a lo largo del tiempo después de una lesión cerebral traumática solo en los astrocitos reactivos que expresan GFAP.
Como se muestra en la FIG. 12, se determinó que la expresión de FAM19A5 era relativamente baja en los astrocitos marcados con GFAP 3 días después del daño, la expresión comenzó a aumentar después de 5 días y aumentó continuamente durante 7 días.
<Ejemplo 12> Medición del aumento cuantitativo de las proteínas FAM19A5 mostradas en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)
En ratones mSOD1 G93A Tg modelo animal de ELA, se realizó inmunotinción en tejidos en un período en el que se expresaron los síntomas de ELA. Como se muestra en la FIG. 13A, los resultados mostraron que la expresión de FAM19A5 aumentó a un nivel muy alto en la médula espinal del ratón mSOD1 G93A en comparación con el ratón de la misma edad. Este aumento en la expresión se observó fuertemente en el cuerno ventral en el que se distribuyen las neuronas motoras particularmente degeneradas y muertas debido a la ELA. En este período, en la médula espinal del ratón mSOD1 G93A, se observó proliferación de células gliales. Este proceso de modificación patológica también se detectó mediante la doble tinción GFAP. Las imágenes ampliadas en la parte inferior son imágenes de gran aumento del cuerno ventral del ratón mSOD1 G93A. Puede verse que la mayoría de las células gliales marcadas con GFAP muestran un alto nivel de expresión de FAM19A5. Mientras tanto, las células (indicadas por una flecha) distribuidas en el centro de la imagen se consideran neuronas motoras degenerativas, ya que tenían un núcleo circular y no estaban teñidas con GFAP. Incluso en este caso, se observó una fuerte expresión de FAM19A5. Los núcleos se contramarcaron con fluorescencia azul mediante tinción Hoechst.
Además, se observó un cambio en la expresión mediante inmunotransferencia. El resultado mostró que la expresión de FAM19A5 aumentó a un nivel muy alto en la médula espinal de los ratones modelo de ELA (TG) en comparación con los ratones de tipo salvaje (WT) (FIG 13B).
Se realizó un radioinmunoensayo de la misma manera que en el Ejemplo 10. El resultado mostró que la cantidad de proteínas FAM19A5 en el suero de los ratones modelo de ELA se detectó a un nivel 3 veces mayor que el de los ratones normales o más (FIG 13C).
Por lo tanto, la FAM19A5 detectada en un modelo de lesión cerebral que incluye modelos de enfermedad de lesión cerebral traumática y daño de la médula espinal, incluida la esclerosis lateral amiotrófica, puede desarrollarse como un material de marcaje de daño del sistema nervioso central.
<Ejemplo 13> Efecto retardado de la astrocitosis reactiva por el tratamiento con anticuerpo contra FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática (TBI)
Para determinar una función de las proteínas FAM19A5 cuya expresión aumentó después de inducir la lesión cerebral, se inyectaron anticuerpos FAM19A5 en la vena de la cola del ratón un día después de inducir el daño. Se consideró que, cuando se aplica una lesión cerebral traumática, la barrera hematoencefálica cercana a la región dañada puede dañarse y pueden introducirse anticuerpos en los tejidos cerebrales circundantes.
Solo cuando se inyectaron anticuerpos de FAM19A5, se observó una señal de fluorescencia debida a anticuerpos secundarios (FIG 14).
Los anticuerpos se inyectaron un día después del daño. Después de que hubieran transcurrido 3, 5 y 7 días desde el día que provocó el daño, se observaron cambios utilizando varios marcadores celulares.
Como se muestra en la FIG. 15, en un modelo de ratón en el que se inyectaron anticuerpos contra FAM19A5 después de transcurridos 3 días, se inhibió la generación de astrocitos reactivos que expresan GFAP en las proximidades de tejidos dañados, en comparación con un grupo de control en el que se inyectó IgG de conejo normal. Tal fenómeno se mostró de manera más significativa después de que hubieran transcurrido 5 días y se mantuvo débilmente incluso después de que hubieran transcurrido 7 días. Por lo tanto, se considera que la inhibición de FAM19A5 secretado utilizando anticuerpos influye en las células circundantes y, en particular, retrasa la astrocitosis reactiva que se produce después del daño.
Mientras tanto, los astrocitos reactivos generados después del daño secretan un factor de crecimiento nervioso que previene la muerte celular programada tal como GDNF y al mismo tiempo reanuda la absorción de ácido glutámico, actuando así positivamente para reducir el ambiente tóxico alrededor de las neuronas. Por lo tanto, para determinar si un retraso en la astrocitosis reactiva de acuerdo con los anticuerpos FAM19A5 influye negativamente en una función para proteger las neuronas, se realizó la tinción TUNEL.
Como se muestra en la FIG. 16, se determinó que las células que expresan el marcador de neuronas, NeuN, no se tiñeron simultáneamente con TUNEL, y una pérdida de astrocitos reactivos no mata las neuronas.
De acuerdo con el Ejemplo 10, los astrocitos reactivos generados a partir de la región dañada después de una lesión cerebral traumática expresaron fuertemente proteínas FAM19A5. En base al resultado, en un modelo de ratón tratado con anticuerpos contra FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática, se determinaron las posiciones de los astrocitos reactivos en los que se expresan las proteínas FAM19A5.
Como era de esperar, se observó que los astrocitos que expresan proteínas FAM19A5 se posicionaron relativamente por separado de la región dañada en el modelo de daño en el que se inyectan los anticuerpos contra FAM19A5, en comparación con un grupo de control (FIG 17).
<Ejemplo 14> Disminución numérica de las células progenitoras de oligodendrocitos NG2 según el tratamiento con anticuerpo contra FAM19A5 después de una lesión cerebral traumática (TBI)
Utilizando el mismo método experimental descrito anteriormente, con el fin de determinar si los anticuerpos contra FAM19A5 influyen en la generación de otros tipos de células gliales, se realizó la tinción con varios tipos de marcadores de células gliales.
Cuando habían transcurrido 5 días después de la lesión cerebral, el número de células progenitoras de oligodendrocitos que expresaban el antígeno neuronal glial 2 (NG2) disminuyó en la región dañada (FIG 18A).
Mientras tanto, dado que se sabe que las células NG2 divididas en tejidos cerebrales dañados se convierten en oligodendrocitos que forman una vaina de mielina madura, se observaron oligodendrocitos maduros marcados con una proteína básica de mielina (MBP) y el número de los mismos también disminuyó (FIG 18B).
Por tanto, la reactivación de FAM19A5 que se produce después de una lesión cerebral promueve la proliferación de células progenitoras NG2 y se considera que está implicada en la mielinización de los axones de las neuronas circundantes.
La FAM19A5 de la presente invención o un inhibidor de la misma se pueden utilizar como reguladores de la proliferación o diferenciación de células madre, y un kit de diagnóstico, un chip o un agente terapéutico para daño del sistema nervioso central, enfermedad cerebral degenerativa o enfermedad del sistema nervioso central.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un método de diagnóstico in vitro de daño del sistema nervioso central o una enfermedad cerebral degenerativa que comprende medir una cantidad de una proteína de la familia con similitud de secuencia 19, miembro A5 (FAM19A5) de una muestra biológica de un sujeto que lo necesita con un anticuerpo que es específico de la proteína FAM19A5, en donde el daño del sistema nervioso central o la enfermedad degenerativa del cerebro están asociados con astrocitos reactivos.
2. Una composición que comprende un anticuerpo que es específico de una proteína FAM19A5 para su uso en un método para retrasar la astrocitosis reactiva que se produce después de un daño, suprimir una generación de astrocitos o inhibir una proliferación excesiva de astrocitos reactivos en una región dañada en un sujeto que lo necesita En donde el sujeto sufre un daño en el sistema nervioso central o una enfermedad cerebral degenerativa asociados con astrocitos reactivos.
3. Una composición que comprende un anticuerpo que es específico de una proteína FAM19A5 para su uso en un método para disminuir un número de células progenitoras de oligodendrocitos que expresan el antígeno neuronal glial 2 (NG2) o que promueven la regeneración de neuronas en una región dañada en un sujeto que lo necesita, en donde el sujeto sufre una lesión cerebral traumática.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se recoge del sujeto antes de la medición.
5. El método de la reivindicación 1 o 4, en donde la cantidad de proteína FAM19A5 se compara con una cantidad correspondiente medida de una muestra del grupo de control normal y en donde un aumento en la cantidad de la proteína FAM19A5, en comparación con la muestra del grupo de control normal, indica una presencia de daño del sistema nervioso central o enfermedad degenerativa del cerebro.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1,4 y 5, en donde la muestra biológica comprende un tejido, células, sangre, suero, plasma, saliva u orina.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 6, en donde la medición se realiza mediante una transferencia Western, ELISA, análisis de radioinmunoensayo, radioinmunodifusión, un método de inmunodifusión de Ouchterlony, inmunoelectroforesis en cohete, inmunotinción de tejidos, un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de fijación del complemento, FACS, o un chip de proteína.
8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde el anticuerpo aumenta la proliferación de células madre neurales, disminuye un número de astrocitos reactivos o mieliniza un axón de una neurona cerca de la región dañada después de una lesión cerebral.
9. La composición para su uso según la reivindicación 3, en donde la lesión cerebral traumática está asociada con células progenitoras de oligodendrocitos que expresan una molécula de antígeno neuronal glial 2 (NG2).
10. La composición para su uso según la reivindicación 2, en donde el daño del sistema nervioso central comprende una lesión cerebral traumática.
11. La composición para su uso según la reivindicación 2, en donde la enfermedad cerebral degenerativa comprende esclerosis lateral amiotrófica.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 4 a 7 o la composición para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 8 y 9 a 11, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 12 o la composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 8 y 9 a 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 a 7 y 12 o la composición de una cualquiera para el uso según las reivindicaciones 2, 3, 8 y 9 a 12, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.
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