JP2022550670A - 炎症性疾患のためのｄｄｘ１７及びｎｌｒｃ４標的化 - Google Patents

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Abstract

ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害若しくは病状を処置及び／又は防止するための方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む。また、細胞においてＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するための方法、ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害するための方法、対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害するための方法、及びここに開示されている方法に使用するための組成物も提供される。【選択図】 なし

Description

関連出願の相互参照
本発明は、2019年8月23日に出願された米国仮特許出願第62/891,124号の優先権を主張し、本明細書にはその全体が参照により組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号DP1GM114862及びR01EY029799の下での米国政府の支援によってなされた。そのため米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、一般的には、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施態様では、方法は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る組成物をその必要がある対象に投与することを含み、投与することは、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性を減縮するために有効な経路及び量によってである。
ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）は多様な刺激に対する自然免疫応答において重大な役割を演ずる。いくつかのＮＬＲは抗細菌免疫に寄与する。例えば、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤ含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソームは細胞質内の細菌フラジェリン及びＴ３ＳＳコンポーネントによって活性化され、それによってプロカスパーゼ－１をその活性な形態へと切断して、パイロトーシス及び下流の炎症カスケードの引き金となる。ＮＬＲＣ４はこれらの細菌産物を直接的には認識しない。代わりに、それはＮＬＲファミリーアポトーシス阻害剤蛋白質（ＮＡＩＰ）ファミリーの蛋白質を利用してフラジェリン及びＴ３ＳＳを感知する。ＮＡＩＰは細菌リガンドの直接的な受容体としての用をなし、それによって、下流の炎症カスケードにとってのアダプターとしてのＮＬＲＣ４インフラマソームを可能化する。マウスでは、ＮＡＩＰ１～６は特異的な細菌リガンドに応答したＮＬＲＣ４活性化を媒介することができる。しかしながら、ヒトはマウスで見られるＮＡＩＰ遺伝子の重複を欠く。代わりに、単一のヒトＮＡＩＰが複数の細菌リガンドの認識を可能化する。無菌性の組織ダメージもまた虚血性脳卒中及び多発性硬化症のモデルにおいてＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化することが公知であるが、どの内在性の刺激がこれらの設定において細菌感染の不在下でＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化するのかは不明である。これらの多様な無菌性の活性化因子についてのＮＬＲＣ４インフラマソームの感知スペクトルは未知であり、今日まで、公知のＮＬＲＣ４インフラマソーム阻害剤はない。
短鎖散在核エレメント（ＳＩＮＥ）は哺乳類ゲノムのおよそ１０％を構成する非コードレトロトランスポゾンである。ＡｌｕＲＮＡはヒトにおける最も成功したレトロトランスポゾンＳＩＮＥエレメントであり、Ｂ１、Ｂ２、ＩＤ、及びＢ４はマウスＳＩＮＥである。ＳＩＮＥのゲノム挿入及び／又は転写過剰はインフラマソーム活性化を引き起こし得、嚢胞性線維症、血友病Ａ、網膜色素変性症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病、及び高コレステロール血症を包含する複数の疾患に関連する。しかしながら、ＳＩＮＥ－ＲＮＡを認識するための上流のセンサーは依然として未知である。
この概要は本発明のいくつかの実施態様を列挙し、多くのケースでは本発明のこれらの実施態様の変形及び順列を列挙する。この概要は単に多数のかつ様々な実施態様の例示である。所与の実施態様の１つ以上の代表的特徴の言及は同様に例示的である。かかる実施態様は、典型的には、言及されている特徴（単数又は複数）あり又はなしで存在し得る。同様に、この概要に列挙されるか否かにかかわらず、それらの特徴は本発明の他の実施態様に適用され得る。過剰な繰り返しを避けるために、この概要はかかる特徴の全ての可能な組み合わせを列挙又は示唆しない。
いくつかの実施態様では、本発明は、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害若しくは病状を処置及び／又は防止するための方法であって、該方法は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれからなる、又はそれから成る組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、本質的にそれからなる、又はそれから成り、該投与段階は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性を減縮することに有効な経路及び量によって行われ、それにより、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止する、方法である。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患、任意に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である。
いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状は、移植片対宿主病、慢性疼痛、増殖性硝子体網膜症、緑内障、関節リウマチ、多発性硬化症、双極性障害、大うつ病性障害、腎線維症、腎炎、肺線維症、ハンチントン病、骨粗鬆症、慢性リンパ性白血病、不安障害、肺結核、閉経後の女性及び骨折患者における骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症性及び神経障害性疼痛、常染色体優性多発性嚢胞腎、脊髄損傷、アルツハイマー病、神経障害性疼痛、高血圧、静脈瘤、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、痛風、自己免疫性肝炎、グラフト血管損傷、動脈硬化、血栓症、メタボリックシンドローム、唾液腺炎症、外傷性脳損傷、虚血性心疾患、虚血性脳卒中、パーキンソン病、メラノーマ、神経芽腫、前立腺、乳、皮膚、及び甲状腺癌、早期管状腺胃癌、神経内分泌癌、ムコイド結腸癌、結腸癌；高異型度尿路上皮癌、淡明型腎細胞癌、未分化卵巣癌、乳頭嚢胞内乳癌、グラム陰性敗血症、感染性緑膿菌、ビブリオコレラ、レジオネラｓｐｐ．、フランシセラｓｐｐ．、リーシュマニアｓｐｐ．、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びクラミジアｓｐｐ．、クライオピリノパチー；角膜炎、尋常性ざ瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、インスリン抵抗性、肥満、溶血性尿毒症症候群、ポリオーマウイルス感染、免疫複合体型腎疾患、急性尿細管障害、ループス腎炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、マックル・ウェルズ症候群及び小児多臓器系炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節自己炎症性疾患、腎虚血灌流障害、糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、全身性血管炎、ＩｇＡ腎症、マラリア、寄生蠕虫、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、枯草熱、慢性閉塞性肺疾患、薬剤性肺炎症、接触皮膚炎、らい病、バークホルデリア・セノセパシア感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、乾癬、強皮症、反応性関節炎、嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群、炎症性関節疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、心臓手術（周術期／術後炎症）、急性及び慢性臓器移植拒絶、急性及び慢性骨髄移植拒絶、並びに腫瘍血管新生からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、その必要がある対象にＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤を投与することを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の（the）少なくとも１つの追加の阻害剤は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ＣＧＡＳ）、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、インターフェロン遺伝子刺激因子－１（ＳＴＩＮＧ１）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。
いくつかの実施態様では、本発明は、細胞においてＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するための方法であって、ＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させる段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成り、それによって、ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化が細胞において阻害される、方法である。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、細胞は、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤をその必要がある対象に投与することを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ＣＧＡＳ）、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、インターフェロン遺伝子刺激因子－１（ＳＴＩＮＧ１）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。
本発明は、いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害するための方法にもまた関する。いくつかの実施態様では、方法は、ＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させることを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、それによって、細胞からのＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が阻害される。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、細胞は、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化及び／又はＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状に関連する。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患、任意に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である。
いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状は、移植片対宿主病、慢性疼痛、増殖性硝子体網膜症、緑内障、関節リウマチ、多発性硬化症、双極性障害、大うつ病性障害、腎線維症、腎炎、肺線維症、ハンチントン病、骨粗鬆症、慢性リンパ性白血病、不安障害、肺結核、閉経後の女性及び骨折患者における骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症性及び神経障害性疼痛、常染色体優性多発性嚢胞腎、脊髄損傷、アルツハイマー病、神経障害性疼痛、高血圧、静脈瘤、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、痛風、自己免疫性肝炎、グラフト血管損傷、動脈硬化、血栓症、メタボリックシンドローム、唾液腺炎症、外傷性脳損傷、虚血性心疾患、虚血性脳卒中、パーキンソン病、メラノーマ、神経芽腫、前立腺、乳、皮膚、及び甲状腺癌、早期管状腺胃癌、神経内分泌癌、ムコイド結腸癌、結腸癌；高異型度尿路上皮癌、淡明型腎細胞癌、未分化卵巣癌、乳頭嚢胞内乳癌、グラム陰性敗血症、感染性緑膿菌、ビブリオコレラ、レジオネラｓｐｐ．、フランシセラｓｐｐ．、リーシュマニアｓｐｐ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びクラミジアｓｐｐ．、クライオピリノパチー；角膜炎、尋常性ざ瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、インスリン抵抗性、肥満、溶血性尿毒症症候群、ポリオーマウイルス感染、免疫複合体型腎疾患、急性尿細管障害、ループス腎炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、マックル・ウェルズ症候群及び小児多臓器系炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節自己炎症性疾患、腎虚血灌流障害、糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、全身性血管炎、ＩｇＡ腎症、マラリア、寄生蠕虫、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、枯草熱、慢性閉塞性肺疾患、薬剤性肺炎症、接触皮膚炎、らい病、バークホルデリア・セノセパシア感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、乾癬、強皮症、反応性関節炎、嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群、炎症性関節疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、心臓手術（周術期／術後炎症）、急性及び慢性臓器移植拒絶、急性及び慢性骨髄移植拒絶、並びに腫瘍血管新生からなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤をその必要がある対象に投与することを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、少なくとも１つの追加の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗体、又はその抗原結合断片からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害するための方法に関する。いくつかの実施態様では、方法は、対象の細胞においてＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させることを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、それによって、細胞からのＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が阻害される。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、細胞は、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在するＲＰＥ細胞である。
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、ＲＰＥを分解から保護するように設計された少なくとも１つの追加の処置を対象に施すことを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、少なくとも１つの追加の処置は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、カスパーゼ－４、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。
本発明は、いくつかの実施態様では、また、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状を処置及び／又は防止することに使用するための組成物に関する。いくつかの実施態様では、この組成物はヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
本発明は、いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害することに使用するための組成物にもまた関し、組成物は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
本発明は、いくつかの実施態様では、対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害することに使用するための組成物にもまた関し、組成物は、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
本発明の組成物のいくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、組成物は眼部送達のために製剤される。
いくつかの実施態様では、組成物は、更に、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、カスパーゼ－４、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。
従って、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止するための組成物及び方法を提供することが、本発明の目的である。
この及び他の目的は全体的に又は部分的に本発明によって達成される。更に、本発明の目的が上で申し立てられたが、本発明の他の目的及び利点は次の記載、図、及び実施例の研究の後に当業者には明らかになるであろう。加えて、本発明の種々の態様及び実施態様が下に更に詳細に記載される。
マウスマクロファージ（ＢＭＤＭ）におけるＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化（部位Ｓ５３３）。マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）がＳＩＮＥ－ＲＮＡ（それぞれ１００ｐｍｏｌのＡｌｕ（配列番号８６）、Ｂ１（配列番号８７）、及びＢ２（配列番号８８））、及びポリＩ：Ｃ（１０μｇ／ｍｌ）によって処置された。リン酸化Ｎｌｒｃ４（ｐ－Ｎｌｒｃ４）及びトータルＮｌｒｃ４（ｔ－Ｎｌｒｃ４）がウエスタンブロットによって検出された。アクチンはローディング対照として提供されている。ｐ－ＮＬＲＣ４バンドは黒色矢印によって指示された。 蛋白質キナーゼＣデルタによるＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化（部位Ｓ５３３）。ＬＲＲＫ２キナーゼ阻害剤ｇｓｋ２５７８２１５ａ（ＧＳＫ；５－（２－フルオロ－４－ピリジニル）－２－（フェニルメトキシ）－Ｎ－３－ピリジニル－ベンズアミド；ＣＡＳ番号１２８５５１５－２１－０；シグマアルドリッチ、セントルイス、ミズーリ、米国）又はＰＫＣデルタ阻害剤ロットレリン（ＣＡＳ番号８２－０８－６；シグマアルドリッチ）によって２μＭ又は５μＭで前処置され、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクション又はトランスフェクション試薬単独（モック）によって処置されたＢＭＤＭ細胞。ＮＬＲＣ４リン酸化（Ｐ－ＮＬＲＣ４）及び上清カスパーゼ－１活性化がＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出された。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクションがＮＬＲＣ４リン酸化及びカスパーゼ－１前駆体（プロ）の切断を誘導するということを示した。これはカスパーゼ－１の活性形態（蛋白質サイズは～２０ｋＤａであり、ｐ２０と標識されている）を細胞培地（上清）に放出する。ＰＫＣデルタ阻害剤のロットレリンはＡｌｕＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化及びカスパーゼ－１活性化をブロックした。ｐ－ＮＬＲＣ４及びカスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示された。 ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＡＳＣオリゴマー化はＮＬＲＣ４に依存する（ＢＭＤＭ）。図３Ａ．Ａｌｕ（配列番号８６）もしくはＢ２（配列番号８８）ＲＮＡ又はトランスフェクション試薬のみ（モック）によってトランスフェクションされた後のＢＭＤＭにおける内在性のＡＳＣスペック及びＮＬＲＣ４斑点の免疫蛍光画像。結果はＳＩＮＥ－ＲＮＡ（Ａｌｕ及びＢ２、それぞれ配列番号８６及び８８）がＡＳＣスペックの形成を誘導するということを示した。これはインフラマソーム活性化のホールマークである（矢印で指示されている）。その上、ＮＬＲＣ４蛋白質は斑点としてアセンブリし、ＡＳＣスペックと共存した。図３Ｂ．ＡＳＣオリゴマー化が架橋及びウエスタンブロットによって野生型及びＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭにおいて評価された。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化がＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれるということを示した。オリゴマーＡＳＣ蛋白質のバンドは黒色矢印によって指示された。 ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４蛋白質オリゴマー化。マウスＢＭＤＭがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６；１００ｐｍｏｌ）によって指示されている時点において処置された。ＮＬＲＣ４オリゴマーがトリス－グリシンネイティブＰＡＧＥによって検出された。ローディング対照はアクチンによって示されている。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクションがＮＬＲＣ４オリゴマーの形成を誘導するということを示した。これはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームのアセンブリ及び活性化を指示する。オリゴマーＮＬＲＣ４蛋白質のバンドは黒色矢印によって指示された。 ＮＬＲＣ４欠損はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソームをブロックする（ＢＭＤＭ）。図５Ａ．野生型及びＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）、Ｂ２ＲＮＡ（配列番号８８）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、又はモックによってトランスフェクションされた。ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、及びアクチンの発現が細胞ライセートのイムノブロットによって検出された。カスパーゼ－１前駆体（ｐ４５）の切断及びカスパーゼ－１の活性形態（ｐ２０）の放出は上清のイムノブロットによって測定された。結果は、ＳＩＮＥ－ＲＮＡ（Ａｌｕ及びＢ２。それぞれ配列番号８６及び８８）によって誘導されるカスパーゼ－１切断がＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれるということを示した。カスパーゼ－１（ｐ２０）のバンドは黒色矢印によって指示された、図５Ｂ．野生型及びＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭがＡｌｕ（配列番号８６）、Ｂ２ＲＮＡ（配列番号８８）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、又はモックによってトランスフェクションされた。ＩＬ－１β放出がＥＬＩＳＡによって測定された。結果は、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＩＬ－１β放出がＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭにおいてブロックされたということを示している。データは平均±ＳＥＭとして示されている。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 ＣＬＩＰ－質量分析はＤｄｘ５／Ｄｄｘ１７が可能性としてＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）に結合するということを同定した。図６Ａ．個々の同定されたＡｌｕＲＮＡ結合蛋白質についてのＣＬＩＰ－ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの散布図。対応する－ｌｏｇ１０（Ｐ値）に対してプロットされたバックグラウンド（ビオチン）と比較したベイト特異的な蛋白質濃縮（ビオチン化ＡｌｕＲＮＡ；配列番号８６）の（メジアンｌｏｇ２（～倍の変化））について、定量分析がフィッシャーの正確確率検定によって行われた。横の点線はｌｏｇ２（～倍の変化）カットオフを表し、縦線はそのＰ値カットオフを表す。図６Ｂ．ビオチン－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）サンプルに濃縮されたトータルスペクトル数の定量。ＤＤＸ５及びＤＤＸ１７の濃縮されたピークは黒色矢印によって指示された。 蛍光染色はヒトＲＰＥ細胞におけるＤｄｘ１７及びＢｔｎ－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の共局在を示す。ヒトＲＰＥ細胞がビオチン標識ＡｌｕＲＮＡ（ｂｔｎ－Ａｌｕ；配列番号８６）によって処置された。内在性のＤｄｘ１７及びｂｔｎ－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の二重染色はＤｄｘ１７及びＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の間の共（co－co）共局在を示す。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクションがＤＤＸ１７蛋白質の核から細胞質への移行を誘導し、ＤＤＸ１７がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）と共局在するということを示した。ＤＤＸ１７及びＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）二重陽性シグナルは白色矢印によって指示された。 ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）及びＤｄｘ１７相互作用についてのＣＬＩＰ（架橋免疫沈降）。ヒトＨＥＫ２９３細胞がｂｔｎ－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によってトランスフェクションされ、紫外光によって架橋され、ビオチン－ストレプトアビジンによってプルダウンされた。Ｄｄｘ１７の結合がウエスタンブロットによって決定された。図８Ａ．ビオチン又はｍｙｃタグによって媒介される免疫沈降にのためのＣＬＩＰ（架橋免疫沈降）の概略図。図８Ｂ．ビオチン－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）のストレプトアビジンプルダウン（ＩＰ）の結果は、ＤＤＸ１７が細胞内で物理的にＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）に結合するということを示している。ＷＣＬは全細胞ライセートである。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によるプルダウンされたＤＤＸ１７蛋白質のバンドは黒色矢印によって指示された。図８Ｃ．ＨＥＫ２９３細胞がｍｙｃタグ付きＤＤＸ１７及びビオチン－ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によってトランスフェクションされた。細胞が架橋され、ライセートは抗ｍｙｃビーズによる免疫沈降のためであった。トータルＲＮＡが抽出され、そして（and were）ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がノーザンブロットによって検出された。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）が細胞内でＤＤＸ１７と相互作用するということを示した。ｍｙｃ－ＤＤＸ１７蛋白質によるプルダウンされたＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）のバンドは黒色矢印によって指示された。 ＢＭＤＭ細胞におけるＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４のＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導される共局在。野生型ＢＭＤＭ細胞がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置された。内在性のＤｄｘ１７及びＮＬＲＣ４蛋白質の局在が蛍光染色によって検出された。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置がＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の共局在を誘導するということを示した。これは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４アセンブリ及びＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を誘導したということを暗示している。ＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４二重陽性シグナルは白色矢印によって指示された。 共免疫沈降はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置後のＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の相互作用を同定した。ＨＥＫ２９３細胞がＦｌａｇタグ付きＮＬＲＣ４プラスミド及びＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によってトランスフェクションされた。Ｆｌａｇ免疫沈降が種々のライセートによって行われた。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置がＮＬＲＣ４及びＤＤＸ１７の間の相互作用を誘導するということを示した。免疫沈降されたＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４蛋白質は黒色矢印によって指示された。
そのマイクロプロセッサ機能に非依存的なＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソームに関わるＤｄｘ１７。ＤＤＸ１７はＤＤＸ５及びＤｒｏｓｈａとのマイクロプロセッサ複合体のコンポーネントである。ＤＤＸ１７のマイクロプロセッサ機能がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソームのために要求されるかどうかを試験するために、我々はＴＨＰ細胞におけるカスパーゼ－１活性化をＤＤＸ５又はＤｒｏｓｈａノックダウン（ＤＤＸ５のｓｉＲＮＡ：ＧＧＡＡＡＵＵＡＣＡＧＵＵＡＧＡＧＧＵ；配列番号８９）；ＤｒｏｓｈａのｓｉＲＮＡ：ＧＡＣＡＡＧＵＵＧＡＵＡＧＧＡＵＡＵＡ；配列番号９０）によって測定した。図１１Ａ．ＴＨＰ１細胞におけるＤｄｘ５ではなくｓｉＲＮＡによって媒介されるＤｄｘ１７ノックダウンは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１活性化をブロックした。図１１Ｂ．ｓｉＲＮＡによって媒介されるＤｒｏｓｈａノックダウンは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１活性化に影響しなかった。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示された。 ＤＤＸ１７ノックダウンはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化及びＩＬ－１β放出をブロックする。図１２Ａ．ＴＨＰ１細胞におけるＤｄｘ５（ＤＤＸ５のｓｉＲＮＡ：ＧＧＡＡＡＵＵＡＣＡＧＵＵＡＧＡＧＧＵ；配列番号８９）ではなくｓｉＲＮＡによって媒介されるＤＤＸ１７ノックダウン（ＤＤＸ１７のｓｉＲＮＡ：ＣＣＡＡＵＣＵＧＡＵＧＵＡＵＣＡＧＧＡ；配列番号９１）は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化をブロックした。ＡＳＣオリゴマーのバンドは黒色矢印によって指示された。図１２Ｂ．ＴＨＰ１細胞におけるＤｄｘ５ではなくｓｉＲＮＡによって媒介されるＤＤＸ１７ノックダウンは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＩＬ－１β放出をブロックした。 Ｄｄｘ１７欠損はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソームをＢＭＤＭにおいてブロックする。Ｄｄｘ１７－／－ｉＢＭＤＭ細胞はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１活性化（図１３Ａ）及びＩＬ－１β放出（図１３Ｂ）をブロックした。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示された。 Ｄｄｘ１７ノックダウンはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＩＦＮＩ応答及び炎症プライミングに影響しない。野生型ＢＭＤＭ細胞がＤＤＸ１７上のｓｉＲＮＡ標的（ＣＣＡＡＵＣＵＧＡＵＧＵＡＵＣＡＧＧＡ；配列番号９１）によってトランスフェクションされ、それから、２４時間後に、ＢＭＤＭ細胞がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６；１００ｐｍｏｌ）によって処置された。トータルＲＮＡがｑＰＣＲアッセイのために抽出された。結果は、Ｄｄｘ１７ノックダウンが、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＩ型インターフェロン応答（ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮＢ；図１４Ａ）又は炎症プライミング（ＩＬ－１β（ＩＬ１ｂ）、カスパーゼ－１（ＣＡＳＰ１）；図１４Ｂ）に影響しないということを示した。 ＤＤＸ１７ノックダウンは古典的なＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３インフラマソームに影響しない。ＴＨＰ１細胞がＤＤＸ１７上のｓｉＲＮＡ標的（ｓｉＲＮＡ配列：ＣＣＡＡＵＣＵＧＡＵＧＵＡＵＣＡＧＧＡ；配列番号９１）によってトランスフェクションされ、それから、２４時間後に、フラジェリン（３μｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（１２５ｎｇ／ｍｌ）プラスＡＴＰ（５０ｍＭ／３０分）、ＤＯＴＡＰプラスＬＰＳがＴＨＰ１細胞に追加された。上清がカスパーゼ－１検出のために収集された。結果は、配列番号９１によるＤＤＸ１７ノックダウンが古典的なＮＬＲＣ４インフラマソーム及びＮＬＲＰ３インフラマソームに影響しないということを示した。ローディング対照はアクチンによって示されている。カスパーゼ－１前駆体はｐ４５、カスパーゼ－１の活性形態はｐ２０と言われる。インフラマソームアセンブリのアダプター蛋白質のＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様蛋白質（ＡＳＣ）がＡＳＣと標識されている。カスパーゼ－１ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示された。 ＤＤＸ１７に結合するＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）はＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３の二重リクルートを誘導する。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置された野生型及びＤｄｘ１７－／－ｉＢＭＤＭ細胞が１２時間後に収集された。細胞ライセートがＮＬＲＰ３抗体によって免疫沈降され、指示されている抗体によってイムノブロットされた。ＮＬＲＰ３－ＩＰによる免疫沈降されたＮＬＲＣ４蛋白質のバンドは黒色矢印によって指示された。 ＮＬＲＣ４欠損はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＰ３－ＡＳＣ相互作用をブロックする（ＢＭＤＭ）。図１７Ａ．ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＰ３－ＡＳＣ相互作用はＮｌｒｃ４－／－ＢＭＤＭではなくなった。ＡＳＣ－ＩＰによる免疫沈降されたＮＬＲＰ３蛋白質のバンドは黒色矢印によって指示された。図１７Ｂ．ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化はＮｌｒｐ３－／－ＢＭＤＭではブロックされた。ＡＳＣオリゴマーのバンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＬＲＰ３欠損はＳＩＮＥ－ＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをＢＭＤＭにおいてブロックする。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１活性化（図１８Ａ）及びＩＬｌ－β放出（図１８Ｂ）はＮｌｒｐ３－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれた。＊＊＊ｐ＜０．００１。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＡＩＰはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームに不可欠ではない（ＢＭＤＭ）。図１９Ａ．フラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化及びＩＬ－１β放出はＮａｉｐ－／－ＢＭＤＭ（Ｎａｉｐ１～６Δ／Δと言われる（referred as））において損なわれた。図１９Ｂ．ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１切断及びＩＬ－１β放出はＮａｉｐ－／－ＢＭＤＭでは影響されなかった。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３はＤｉｃｅｒ１ノックダウンによって誘導されるインフラマソーム活性化に要求される。図２０Ａ．Ｄｉｃｅｒ１ノックダウン（Ｄｉｃｅｒ１のｓｉＲＮＡ：ＧＣＡＧＵＵＧＵＣＣＵＡＡＡＣＡＧＡＵ；配列番号９２）はｐ－ＮＬＲＣ４の増大及びカスパーゼ－１活性化を引き起こす。これらはＤｄｘ１７－／－ｉＢＭＤＭではブロックされた。図２０Ｂ．Ｄｉｃｅｒ１ノックダウンによって誘導されるカスパーゼ－１切断はＮｌｒｃ４－／－及びＮｌｒｐ３－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれた。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。
ドライＡＭＤのＲＰＥ組織におけるＤｄｘ１７－Ｎｌｒｃ４シグナル伝達の発現レベル。図２１Ａ．ドライＡＭＤ患者からのＲＰＥ組織のライセートによるＤｄｘ１７、Ｎｌｒｃ４、ＰＫＣＤのイムノブロットは、ドライＡＭＤサンプルにおける有意に上方制御されたＤｄｘ１７蛋白質を示した。図２１Ｂ：図２１Ａのイムノブロットのスキャンからの注記されている蛋白質の相対レベルの棒グラフ。ＤＤＸ１７バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＤＤＸ１７はドライＡＭＤのヒトドナー眼のＲＰＥにおいてＮＬＲＣ４と相互作用する。インサイチュのＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の間の相互作用を捕捉するために、我々はドライＡＭＤ又は健康な対照のドナー眼のヒト組織切片によって近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）を行った。結果は、ＤＤＸ１７がドライＡＭＤのドナー眼のＲＰＥにおいてＮＬＲＣ４と相互作用したということを示している。これは、ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４複合体のアセンブリがヒトドライＡＭＤにおいて生起するということを指示した。ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４複合体の陽性シグナルは黒色矢印によって指示されている。 ＮＬＲＣ４高活性型蛋白質の外因的発現はＲＰＥ変性を誘導する。ＲＰＥにおけるＮＬＲＣ４活性化の帰結を試験するために、ヒトＮＬＲＣ４蛋白質の野生型（ｐＮＬＲＣ４ＷＴ）及び高活性型変異体（ｐＮＬＲＣ４Ｔ３３７Ｓ）をコードする５００ｎｇのプラスミドがインビボのマウスＲＰＥ細胞に形質導入された。我々の結果はＮＬＲＣ４活性化がＲＰＥ変性を引き起こすということを示した。図２３Ａ．眼底画像は高活性型ＮＬＲＣ４蛋白質によって誘導されるＲＰＥ変性を示した。ＲＰＥ変性を原因とする高密度エリアは白色矢印によって指示されている。図２３Ｂ．蛍光画像はＮＬＲＣ４Ｔ３３７Ｓ発現細胞における遮断されたＺＯ－１染色を示した。ＺＯ－１無秩序化のＲＰＥエリアは白色矢印によって指示されている。 ヒトＲＰＥ細胞におけるＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４活性化。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がヒトＲＰＥにおけるＮＬＲＣ４活性化を誘導するかどうかを試験するために、我々はヒトＲＰＥをＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によってトランスフェクションした。図２４Ａ．ＮＬＲＣ４の免疫蛍光染色は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がｈＲＰＥ細胞におけるサイトゾルＮＬＲＣ４斑点を誘導したということを示している。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４集合体が白色矢印によって指示されている。図２４Ｂ．ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４（ｐ－ＮＬＲＣ４）リン酸化及びオリゴマー化。ローディング対照はアクチンによって示されている。ＮＬＲＣ４オリゴマーはトリス－グリシンネイティブＰＡＧＥによって検出された。データはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がヒトＲＰＥにおけるＮＬＲＣ４活性化を誘導するということを実証した。ＮＬＲＣ４オリゴマーのバンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＬＲＣ４ノックダウンはＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化及びＲＰＥ変性をブロックする。ヒトＲＰＥ細胞がＮＬＲＣ４（ＮＬＲＣ４のスマートプールｓｉＲＮＡ：ＣＡＡＣＵＧＧＧＣＵＣＣＵＣＵＧＵＡＡ；配列番号９３）及びＮＡＩＰ（ＮＡＩＰのスマートプールｓｉＲＮＡ：ＧＵＡＡＡＧＡＧＣＵＡＵＡＵＧＧＡＵＡ；配列番号９４）上のｓｉＲＮＡ標的によって処置され、２４時間後に、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって処置された。図２５Ａ．イムノブロットは、ＮＡＩＰではなくＮＬＲＣ４ノックダウンが、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化を縮減したということを示している。ＡＳＣオリゴマーのバンドは黒色矢印によって指示された。図２５Ｂ．眼底画像及びＺＯ－１蛍光画像は、ＮＬＲＣ４ノックダウンが、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性をブロックしたということを示している。眼底画像のＲＰＥ変性及びＲＰＥシートのＺＯ－１無秩序化を原因とする高密度エリアは白色矢印によって指示されている。 ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４シグナル伝達に干渉すること（interfering）は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性をブロックする。Ｃ５７／Ｂ６マウスの野生（wilde）型がＤｄｘ１７上のｓｉＲＮＡ標的（Ｄｄｘ１７のｓｉＲＮＡ：ＧＧＣＵＡＧＡＵＧＵＧＧＡＡＧＡＵＧＵ；配列番号９５）を硝子体注射され、２日後に、Ｎｌｒｃ４－／－、Ｎａｉｐｌ－６－／－マウス、及びＤｄｘ１７ノックダウンマウスがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）を網膜下注射された。眼底画像及びＺＯ－１蛍光画像は、ＮａｉｐではなくＤｄｘ１７及びＮｌｒｃ４に干渉することが、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性をブロックするということを示した。眼底画像のＲＰＥ変性及びＲＰＥシートのＺＯ－１無秩序化を原因とする高密度エリアは白色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩはフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをＢＭＤＭにおいてブロックする。野生型ＢＭＤＭ細胞が例示的なＮＲＴＩ（Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）によって１００μＭで１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。上清及び細胞ライセートがカスパーゼ－１検出のために収集された。結果は、ＮＲＴＩ処置がフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化を縮減するということを示した。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩ（３ＴＣ）はフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームを用量依存的な様式でブロックする。野生型ＢＭＤＭ細胞が指示されているドーズのＮＲＴＩ（３ＴＣ）によって１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。上清がカスパーゼ－１検出のために収集された。結果は、ＮＲＴＩがフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化を用量依存的な様式で阻害するということを示した。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩ（３ＴＣ）はフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４オリゴマー化を用量依存的な様式でブロックする。野生型ＢＭＤＭ細胞が指示されているドーズのＮＲＴＩ（３ＴＣ）によって１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。細胞ペレットがネイティブＰａｇｅ電気泳動によるＮＬＲＣ４オリゴマー検出のために収集された。結果は、ＮＲＴＩ３ＴＣがフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４オリゴマー化を阻害するということを示した。ＮＬＲＣ４オリゴマーのバンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩ（３ＴＣ）はフラジェリンによって誘導されるインターロイキン１ベータ産生をブロックする。野生型ＢＭＤＭ細胞が指示されているドーズのＮＲＴＩ（３ＴＣ）によって１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。上清が収集され、分泌ＩＬ－１βについてアッセイされた。結果は、フラジェリンがＩＬ－１β前駆体（蛋白質サイズは３０ｋＤである；ｐ３０）の切断及び細胞培地（上清）中へのＩＬ－１βの活性形態（蛋白質サイズは１７ｋＤである：ｐ１７）の放出を誘導するということを示した。ＮＲＴＩはフラジェリンによって誘導されるＩＬ－１β放出を阻害した。切断されたＩＬ－１βのバンドは黒色矢印によって指示されている。
修飾ＮＲＴＩ（Ｋ８、Ｋ９）はＢＭＤＭにおけるフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをブロックする。野生型ＢＭＤＭ細胞が通常のＮＲＴＩ（Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）、修飾ＮＲＴＩの３－メチル－３ＴＣ（Ｋ９）もしくは２－エチル－ＡＺＴ（Ｋ８）、又はＮＬＲＰ３阻害剤（ＭＣＣ９５０、ＣＹ－０９）によって１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。上清が分泌カスパーゼ－１検出のために収集された。結果は、修飾ＮＲＴＩがフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するということを示した。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩはフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをＮＬＲＰ３依存的な様式でブロックする。ＮＬＲＰ３ノックアウトＢＭＤＭ細胞が通常のＮＲＴＩ（Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）又はＮＬＲＰ３阻害剤（ＭＭＣ９５０、ＣＹ－０９）によって１時間に渡って前処置され、それから、フラジェリントランスフェクション（３μｇ／ｍｌ）によって刺激された。上清がカスパーゼ－１検出のために収集された。結果は、修飾ＮＲＴＩがフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化をＮＬＲＰ３ノックアウトＢＭＤＭでは阻害しないということを示した。カスパーゼ－１（ｐ２０）バンドは黒色矢印によって指示されている。 ＮＲＴＩは再構成系において直接的にＮＬＲＰ３／ＮＬＲＣ４複合体に結合する。ＨＥＫ２９３細胞がＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３によってトランスフェクションされた。ビオチン標識ＮＲＴＩ（Ｄ４Ｔ、ＡＺＴ）がＨＥＫ細胞に４時間後に追加され、細胞ペレットがビオチンストレプトアビジンプルダウンのために収集された。ＮＲＴＩ及びＮＬＲＣ４／ＮＬＲＰ３の間の結合がイムノブロットによって検出された。結果は、ビオチン標識ＮＲＴＩが直接的にＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３蛋白質に結合し得るということを示した。ビオチン化ＮＲＴＩによってプルダウンされたＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３のバンドは黒色矢印によって指示されている。 ＰＫＣδ及びＮＬＲＣ４リン酸化（Ｓ５３３）はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソーム活性化に要求される。図３５Ａ及び３５Ｂ．野生型、Ｐｒｋｃｄ－／＋、及びＰｒｋｃｄ－／－ＢＭＤＭがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって１２時間に渡ってトランスフェクションされた。カスパーゼ－１、ＩＬ－１β切断、及びＩＬ－１β放出を測定するために、上清が収集された。細胞ライセートがｐ－ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＣ４、ＰＫＣδ、及びアクチンブロッティングのために収集された。結果は、カスパーゼ－１、ＩＬ－１β切断、及びＩＬ－１β放出がＰｒｋｃｄ－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれるということを示した。図３５Ｃ．野生型及びＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡＢＭＤＭがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって１２時間に渡ってトランスフェクションされた。ＥＬＩＳＡによってＩＬ－１β放出を測定するために、上清が収集された。結果は、ＩＬ－１β放出がＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡＢＭＤＭにおいて損なわれるということを示した。ｐ－ＮＬＲＣ４及びカスパーゼ－１（ｐ２０）のバンドが黒色矢印によって指示されている。 ＰＫＣδによって媒介されるＮＬＲＣ４リン酸化はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性に要求される。野生型、Ｐｒｋｃｄ－／－、及びＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡマウスがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）を網膜下注射された。眼底画像（図３６Ａ）及びＺＯ－１（図３６Ｂ）フラットマウント蛍光画像は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性がＰｒｋｃｄ－／－及びＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３Ａマウスではブロックされるということを示した。眼底画像のＲＰＥ変性及びＲＰＥシートのＺＯ－１無秩序化を原因とする高密度エリアは白色矢印によって指示されている。 ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）はヒト細胞におけるＤＤＸ１７移行を誘導する。ヒト単球（ＴＨＰ－１）がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００ブランドトランスフェクション試薬（リポ；サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いてトランスフェクションされた。細胞ライセートが収集され、細胞分画に付された。ＤＤＸ１７及びヒストンＨ３のイムノブロットが用いられて、ＤＤＸ１７の細胞内分布を評価した。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置が核から細胞質へのＤＤＸ１７移行を誘導し、ＤＤＸ１７がサイトゾルＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）と共局在したということを示している。細胞核及び細胞質のＤＤＸ１７のバンドは黒色矢印によって指示された。 ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）はＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリを誘導する。ヒトＲＰＥ細胞がビオチン化ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によってＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００ブランドトランスフェクション試薬（リポ；サーモフィッシャーサイエンティフィック）によってトランスフェクションされた。ＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリが近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によって評価された。結果は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクションがヒトＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリを誘導するということを示した。ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３複合体のシグナルは白色矢印によって指示されている。 ＤＤＸ１７の発現はドライＡＭＤのヒトドナー眼のＲＰＥにおいて増大している。インサイチュのヒト眼におけるＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４発現を測定するために、我々は免疫組織化学によってドライＡＭＤのヒトドナー眼又は健康な対照におけるＤＤＸ１７蛋白質（図３９Ａ）及びＮＬＲＣ４蛋白質（図３９Ｂ）のレベルを検出した。結果は、ＤＤＸ１７の発現がドライＡＭＤのヒトドナー眼のＲＰＥにおいて増大しているということを指示した。ＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４シグナルは黒色矢印によって指示されている。
配列表の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２１２０９．４に対応する。
配列番号２は配列番号１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０６７０３２．３に対応する。
配列番号３～６は、配列番号１のヌクレオチド配列及び他のヒトＮＬＲＣ４遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号７はマウスＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（Ｎｌｒｃ４）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０３３３６７．３に対応する。
配列番号８は配列番号７によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１０２８５３９．１に対応する。
配列番号９～２０は、配列番号７のヌクレオチド配列及び他のマウスＮｌｒｃ４遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号２１はヒトＤＥＡＤボックスヘリカーゼ１７（ＤＤＸ１７）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６３８６．５に対応する。
配列番号２２は配列番号２１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００６３７７．２に対応する。
配列番号２３～２７は、配列番号２１のヌクレオチド配列及び他のヒトＤＤＸ１７遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号２８はマウスＤＥＡＤボックスヘリカーゼ１７（Ｄｄｘ１７）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１０４０１８７．１に対応する。
配列番号２９は配列番号２８によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１０３５２７７．１に対応する。
配列番号３０～３４は、配列番号２８のヌクレオチド配列及び他のマウスＤｄｘ１７遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号３５はヒトＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４８９５．５に対応する。
配列番号３６は配列番号３５によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００４８８６．３に対応する。
配列番号３７はマウスＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（Ｎｌｒｐ３）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１３５９６３８．１に対応する。
配列番号３８は配列番号３７によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１３４６５６７．１に対応する。
配列番号３９はヒトカスパーゼ－１（ＣＡＳＰ１）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３３２９２．４に対応する。
配列番号４０は配列番号３９によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿１５０６３４．１に対応する。
配列番号４１はマウスカスパーゼ－１（Ｃａｓｐ１）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００９８０７．２に対応する。
配列番号４２は配列番号４１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０３３９３７．２に対応する。
配列番号４３はヒトカスパーゼ－４（ＣＡＳＰ４）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１２２５．４に対応する。
配列番号４４は配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１２１６．１に対応する。
配列番号４５は、配列番号４３のヌクレオチド配列及び他のヒトＣＡＳＰ４遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号４６～５１は、配列番号４３のヌクレオチド配列及び他のヒトＣＡＳＰ４遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５２はマウスカスパーゼ－４（Ｃａｓｐ４）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００７６０９．３に対応する。
配列番号５３は配列番号５２によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０３１６３５．２に対応する。
配列番号５４はヒトサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ＣＧＡＳ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１３８４４１．３に対応する。
配列番号５５は配列番号５４によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿６１２４５０．２に対応する。
配列番号５６及び５７は、配列番号５４のヌクレオチド配列及び他のヒトＣＧＡＳ遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５８は、配列番号５４のヌクレオチド配列及び他のヒトＣＧＡＳ遺伝子産物を標的化する例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号５９はマウスサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（Ｃｇａｓ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１７３３８６．５に対応する。
配列番号６０は配列番号５９によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿７７５５６２．２に対応する。
配列番号６１はヒトインターフェロン応答ｃＧＡＭＰ相互作用因子刺激因子１（ＳＴＩＮＧ１）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１９８２８２．４に対応する。
配列番号６２は配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿９３８０２３．１に対応する。
配列番号６３は、配列番号６１のヌクレオチド配列及び他のヒトＳＴＩＮＧ１遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６４はマウスインターフェロン応答ｃＧＡＭＰ相互作用因子刺激因子１（Ｓｔｉｎｇ１）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２８２６１．１に対応する。
配列番号６５は配列番号６４によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０８２５３７．１に対応する。
配列番号６６はヒトペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５７２９．４に対応する。
配列番号６７は配列番号６６によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００５７２０．１に対応する。
配列番号６８は、配列番号６６のヌクレオチド配列及び他のヒトＰＰＩＦ遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号６９はマウスペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（Ｐｐｉｆ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿１３４０８４．１に対応する。
配列番号７０は配列番号６９によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿５９８８４５．１に対応する。
配列番号７１はヒトガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２４７３６．７に対応する。
配列番号７２は配列番号７１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０７９０１２．３に対応する。
配列番号７３は、配列番号７１のヌクレオチド配列及び他のヒトＧＳＤＭＤ遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号７４はマウスガスダーミンＤ（Ｇｓｄｍｄ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２６９６０．４に対応する。
配列番号７５は配列番号７４によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０８１２３６．１に対応する。
配列番号７６はヒトインターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００２１７６．４に対応する。
配列番号７７は配列番号７６によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００２１６７．１に対応する。
配列番号７８は、配列番号７６のヌクレオチド配列及び他のヒトＩＦＮ－β遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号７９はマウスインターフェロン－ベータ（Ｉｆｎ－β）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１０５１０．１に対応する。
配列番号８０は配列番号７９によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０３４６４０．１に対応する。
配列番号８１はヒトインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００１３８４４９８．１に対応する。
配列番号８２は配列番号８１によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿００１３７１４２７．１に対応する。
配列番号８３は、配列番号８１のヌクレオチド配列及び他のヒトＩＦＮＡＲ遺伝子産物を標的化する例示的なｓｈＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号８４はマウスインターフェロン－α／β受容体（Ｉｆｎａｒ）遺伝子産物の例示的なヌクレオチド配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１０５０８．２に対応する。
配列番号８５は配列番号８４によってコードされるアミノ酸配列であり、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースのアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０３４６３８．２に対応する。
配列番号８６は例示的なＡｌｕＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号８７は例示的なＢ１ＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号８８は例示的なＢ２ＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号８９は、ＤＤＸ５遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９０は、Ｄｒｏｓｈａ遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９１は、ＤＤＸ１７遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９２は、Ｄｉｃｅｒ１遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９３は、ＮＬＲＣ４遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９４は、ＮＡＩＰ遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
配列番号９５は、Ｄｄｘ１７遺伝子産物に標的化された例示的なｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
詳細な記載
Ｉ．定義
本発明を記載及び請求することには、次の術語が下で提出される定義に従って用いられるであろう。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書においては冠詞の文法的対象の１つ又は１つよりも多くを（すなわち少なくとも１つを）言うために用いられる。例として、「要素」は１つの要素又は１つよりも多くの要素を意味する。
本明細書において用いられる用語「約」は、およそ、～の領域、大体、又は前後を意味する。用語「約」が数的な範囲と共に用いられるときには、それは、提出される数値よりも上及び下に境界を拡大することによってその範囲を修飾する。例えば、いくつかの実施態様では、用語「約」は本明細書においては、申し立てられた値よりも１０％のばらつきだけ上及び下に数値を修飾するために用いられる。よって、約５０％は４５％～５５％の範囲内を意味する。エンドポイントによって本明細書に記載される数的な範囲は、その範囲内に含められる全ての数及び画分を包含する（例えば、１から５は１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５を包含する）。全ての数及びそれらの画分は用語「約」によって修飾されると考えられるということもまた理解されるであろう。
本明細書において用いられる言い回し「生体サンプル」は、対象から（例えば、生検、血液、血清など）又は対象からの細胞もしくは組織から（例えば、それから単離されたＲＮＡ及び／又はＤＮＡ及び／又は蛋白質もしくはポリペプチド）単離されたサンプルを言う。生体サンプルは、いずれかの生物からのいずれかの生体組織又は液又は細胞、並びにインビトロで培養された細胞、例えば細胞株及び組織培養細胞であり得る。頻繁に、サンプルは、対象（すなわち、診断手続き及び／又は処置を経過する対象）に由来するサンプルである「臨床サンプル」であろう。典型的な臨床サンプルは、脳脊髄液、血清、血漿、血液、唾液、皮膚、筋肉、嗅覚組織、涙液、滑液、爪組織、毛髪、大便、尿、組織又は細胞型、及びそれらの組み合わせ、組織又は針生検サンプル、及びそれらからの細胞を包含するが、これらに限定されない。生体サンプルは、組織の切片、例えば組織学目的で取られた凍結切片又はホルマリン固定切片をもまた包含し得る。
「包含する」、「含有する」、又は「特徴とする」と類義である本明細書において用いられる用語「含む」は、包含的又は開放的であり、追加の記載されていない要素及び／又は方法ステップを排除しない。「含む」はクレーム用語に用いられる専門用語であり、これは、名指しされている要素が存在するが、他の要素が追加され得、依然として本発明の範囲内の組成物又は方法を形成し得るということを意味する。限定ではなく例として、特定の活性な薬剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は他のコンポーネントをもまた含有し得る。他の活性な薬剤、他の担体及び賦形剤、並びにいずれかの限定なしに医薬組成物中への包含に適当であり得るいずれかの他の分子を包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる言い回し「からなる」は、特に請求項に記載されないいずれかの要素、ステップ、又は成分を排除する。言い回し「からなる」がプリアンブルの直後よりもむしろクレームボディのクローズに現れるときには、それはそのクローズで提出されている要素のみを限定する；他の要素は全体的な請求項から排除されない。限定ではなく例として、活性な薬剤及び薬学的に許容される担体からなる医薬組成物は、その特定の活性な薬剤及び薬学的に許容される担体以外の他のコンポーネントを含有しない。しかるべき検出レベルよりも下であるいずれかの分子は不在であると見なされるということは理解される。
本明細書において用いられる言い回し「から本質的になる」は、規定されている材料又はステップ、プラス請求される主題の基本的なかつ新規の特質（単数又は複数）に実質的に影響しないものに請求項の範囲を限定する。限定ではなく例として、活性な薬剤及び薬学的に許容される担体から本質的になる医薬組成物は、活性な薬剤及び薬学的に許容される担体を含有するが、いずれかの追加の要素をもまた包含し得る。これは存在し得るが、これはインビトロ又はインビボの組成物の生物学的機能に実質的に影響しない。
用語「含む」、「から本質的になる」、及び「からなる」について、これらの３つの用語の１つが本明細書において用いられるところでは、本開示及び請求の主題は他の２つの用語のどちらかの使用を包摂する。例えば、「含む」は「から本質的になる」及び「からなる」両方よりも幅広い移行の用語であり、それゆえに、用語「含む」は「から本質的になる」及び「からなる」両方を暗黙的に包摂する。同様に、移行句「から本質的になる」は「からなる」よりも幅広く、それゆえに、言い回し「から本質的になる」は「からなる」を暗黙的に包摂する。
本明細書において用いられる用語「対象」はいずれかの無脊椎動物又は脊椎動物種のメンバーを言う。従って、用語「対象」は動物界のいずれかのメンバーを包摂することを意図され、脊索動物門（すなわち、硬骨魚（硬骨魚類）、両生（両生類）、爬虫（爬虫類）、鳥（鳥類）、及び哺乳（哺乳動物）綱のメンバー）、並びにそれらに包摂される全ての目及び科を包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、対象はヒトである。
本明細書において開示される全ての遺伝子、遺伝子名、遺伝子産物、及び他の産物は、本明細書において開示される組成物及び方法が適用可能であるいずれかの種からのオーソログ又は他の類似の産物に対応することを意図されるということが注記される。それゆえに、用語はヒト及びマウスからの遺伝子及び遺伝子産物を包含するが、これらに限定されない。特定の種からの遺伝子又は遺伝子産物が開示されるときに、それが現れる文脈が明瞭に指示しない限り、本開示は例示的であることのみを意図され、限定として解釈されるべきではないということは理解される。それゆえに、例えば、本明細書において具体的に言及され、かつ種々の例示的な遺伝子産物のアクセッションＮｏ．がＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースに開示されているいずれかの遺伝子は、他の哺乳動物を包含するがこれらに限定されない他の動物及びヒトからの相同な及びバリアントの遺伝子及び遺伝子産物を包摂することを意図される。限定ではなく例として、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースは、中でもヒトＮＬＲＣ４遺伝子産物のヌクレオチド配列に対応するアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２１２０９．４及びマウスＮｌｒｃ４遺伝子産物のヌクレオチド配列に対応するＮＭ＿００１０３３３６７．３、並びに中でもヒトＤＤＸ１７遺伝子産物のヌクレオチド配列に対応するアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６３８６．５及びマウスＤｄｘ１７遺伝子産物のヌクレオチド配列に対応するＮＭ＿００１０４０１８７．１を包含する。用語「Ｎｌｒｃ４」は他の動物からのＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４遺伝子及び遺伝子産物並びにそれらのバリアントを言い、用語「Ｄｄｘ１７」は他の動物からのＤＥＡＤボックスヘリカーゼ１７（Ｄｄｘ１７）遺伝子及び遺伝子産物並びにそれらのバリアントを言うということが理解される。
本発明の方法は温血脊椎動物にとって特に有用である。それゆえに、本発明は哺乳動物及び鳥類に関係する。より具体的には、哺乳動物、例えばヒト及び他の霊長類、並びにヒトにとって絶滅危惧であることを原因として重要な（例えばシベリアトラ）、経済的に重要な（ヒトによる消費のために農場で育てられる動物）、及び／又は社会的に重要な（ペットとして又は動物園で飼われている動物）哺乳動物、例えばヒト以外の肉食動物（例えばネコ及びイヌ）、ブタ（育成豚、成豚、及びイノシシ）、反芻動物（例えば畜牛、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、野牛、及びラクダ）、齧歯類（例えばマウス、ラット、及びウサギ）、有袋動物、及びウマからの幹細胞の単離、操作、及び使用が企図される。絶滅危惧である動物園で飼われている種類の鳥類、並びにそれらがヒトにとって経済的にもまた重要であるキジカモ類、より具体的には飼育キジカモ類、例えば家禽、例えばシチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、及び同類を包含する鳥類への本発明の方法及び組成物の使用もまた提供される。それゆえに、養豚（育成豚及び成豚）、反芻動物、ウマ、家禽、及び同類を包含するがこれらに限定されない家畜からの幹細胞の単離、操作、及び使用もまた企図される。
本明細書において用いられる言い回し「実質的に」は、実体の集合体のコンポーネントのいくつかの実施態様では５０％以下、いくつかの実施態様では４０％以下、いくつかの実施態様では３０％以下、いくつかの実施態様では２５％以下、いくつかの実施態様では２０％以下、いくつかの実施態様では１５％以下、いくつかの実施態様では１０％以下、いくつかの実施態様では９％以下、いくつかの実施態様では８％以下、いくつかの実施態様では７％以下、いくつかの実施態様では６％以下、いくつかの実施態様では５％以下、いくつかの実施態様では４％以下、いくつかの実施態様では３％以下、いくつかの実施態様では２％以下、いくつかの実施態様では１％以下、及びいくつかの実施態様では０％以下が所与の特質を有さない条件を言う。
本発明の文脈において用いられる用語「追加の治療活性化合物」又は「追加の治療薬剤」は、処置されようとする特定の傷害、疾患、又は障害への追加の治療使用のための化合物の使用又は投与を言う。例えば、かかる化合物は、無関係の疾患もしくは障害、又は処置されようとする傷害、疾患、もしくは障害の一次処置に対して応答性ではない疾患もしくは障害を処置するために用いられているものを包含し得る。追加の治療活性な薬剤によって処置されようとする疾患及び障害は、例えば高血圧及び糖尿病を包含する。追加の化合物は、疼痛及び炎症を包含するがこれらに限定されない傷害、疾患、又は障害に関連する症状を処置するためにもまた用いられ得る。
本明細書において用いられる用語「成体」はいずれかの非胎児の又は非未成年の対象を言うことを意味される。
本明細書において用いられる「アゴニスト」は、ヒトなどの哺乳動物に投与されるときに、対象における目当ての標的化合物又は分子のレベル又は存在に帰せられ得る生物活性を増強又は拡大する組成物である。
疾患、病状、もしくは障害の症状の重篤度、又はかかる症状が対象によって経験される頻度、あるいは両方が縮減される場合には、疾患あるいは障害は「緩和」される。
本明細書において用いられるアミノ酸は、表１に指示されている通り、その完全な名称、それに対応する３文字コード、又はそれに対応する１文字コードによって表される：
Figure 2022550670000002
本明細書において用いられる表現「アミノ酸」は、天然及び合成アミノ酸両方並びにＤ及びＬアミノ酸両方を包含することを意図される。「標準アミノ酸」は、天然に生起するペプチドに普通に見出される２０個の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸残基」は、それが合成的に調製されるか又は天然のソースに由来するかどうかにかかわらず、標準アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸を意味する。本明細書において用いられる「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸をもまた包摂し、塩、アミノ酸誘導体（例えばアミド）、及び置換を包含するが、これらに限定されない。本発明のペプチド上において、特にカルボキシ又はアミノ末端に含有されるアミノ酸はメチル化、アミド化、アセチル化、又は他の化学基による置換によって修飾され得、これらは、それらの活性に悪影響することなしにペプチドの循環半減期を変化させ得る。加えて、ジスルフィド連結部が本発明のペプチド上に存在し得るか又は不在であり得る。
用語「アミノ酸」は「アミノ酸残基」と交換可能に用いられ、遊離のアミノ酸又はペプチドのアミノ酸残基を言い得る。それが遊離のアミノ酸又はペプチドの残基を言うかどうかは、用語が用いられる文脈から明らかであろう。
アミノ酸は側鎖Ｒに基づいて７つの群に分類され得る：（１）脂肪族側鎖、（２）ヒドロキシル（ＯＨ）基を含有する側鎖、（３）硫黄原子を含有する側鎖、（４）酸性又はアミド基を含有する側鎖、（５）塩基性基を含有する側鎖、（６）芳香族環を含有する側鎖、及び（７）側鎖がアミノ基に融合しているイミノ酸のプロリンである。
本明細書において開示されるペプチド化合物を記載するために用いられる命名法は従来の慣行を踏襲し、アミノ基は各アミノ酸残基の左に、カルボキシ基は右に提示される。別様に規定されない限り、本発明の選択された具体的な実施態様を表す処方において、アミノ及びカルボキシ末端基は、具体的に示されてはいないが、それらが生理的ｐＨ値において採るであろう形態であると理解されるであろう。
本明細書において用いられる用語「塩基性」又は「正荷電」アミノ酸は、Ｒ基がｐＨ７．０において正味の正電荷を有し、標準アミノ酸リジン、アルギニン、及びヒスチジンを包含するが、これらに限定されないアミノ酸を言う。
化学的な化合物の本明細書において用いられる「アナログ」は、例として、構造が別のものに似ているが必ずしも異性体ではない化合物である（例えば、５－フルオロウラシルはチミンのアナログである）。
「アンタゴニスト」は、ヒトなどの哺乳動物に投与されるときに、対象における目当ての化合物又は分子のレベル又は存在に帰せられ得る生物活性を阻害する組成物である。
本明細書において用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又はアンチセンス核酸は、それの少なくとも部分が、正常細胞又は異常細胞に存在する核酸に対して相補的である核酸ポリマーを意味する。「アンチセンス」は、特に、蛋白質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コード鎖の核酸配列、又は非コード鎖に対して実質的に相同である配列を言う。本明細書において定義されるアンチセンス配列は、蛋白質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に対して相補的である。アンチセンス配列がＤＮＡ分子のコード鎖のコード部分だけに対して相補的であるということは必要ではない。アンチセンス配列は、蛋白質をコードするＤＮＡ分子のコード鎖上に規定される制御配列に対して相補的であり得る。この制御配列はコード配列の発現をコントロールする。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエートオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドの他の修飾を包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる用語「自家」は、天然にかつ正常では体のある種の型の組織に又は特定の構造に生起する何かを言う。移植では、それは、ドナー及びレシピエントエリアが同じ個体にある移植片を、又はドナーが先に献血し、それから通常は手術の間に再度受け取る血液を言う。
本明細書において用いられる用語「生体適合性」は実質的な有害な応答をホストに誘発しない材料を言う。
本明細書において用いられる用語「生分解性の」は、生体によって分解されることができることを意味する。生分解性の材料が生体によって単位へと分解され得、これらが生体系から取り除かれ得るか及び／又は生体系に化学的に組み込まれ得るかどちらかであるという点で、生分解性の材料は非生分解性の材料とは異なる。
本明細書において用いられる用語「生体サンプル」は、生きている生物から得られるサンプルを言い、皮膚、毛髪、組織、血液、血漿、細胞、汗、及び尿を包含する。
本明細書において用いられる用語「生体吸収性」はインビボで吸収される材料の能力を言う。「完全な」吸収は、有意な細胞外断片が残らないということを意味する。吸収プロセスには、体液、酵素、又は細胞の作用による元のインプラント材料の消去が関わる。例えば、吸収された炭酸カルシウムは、骨塩としてもしくは体内で別様に再利用されることによって再定着し得るか、又は排泄され得る。用語が本明細書において用いられる「強く生体吸収性」は、インプラントされた材料のトータルの質量の少なくとも８０％が１年以内に吸収されるということを意味する。
言い回し「細胞培養培地（cell culture medium）」、「培養培地（culture medium）」（各ケースにおいて複数は「培地（media）」）、及び「培地製剤」は、細胞を培養するための栄養溶液を言い、交換可能に用いられ得る。
「馴化培地」は、細胞又は組織の第１の集団を培地によって培養することと、それから培地を収穫することとによって調製されるものである。それから、馴化培地は（細胞によって培地中に分泌されるいずれかのものと併せて）、例えば対象の疾患もしくは障害を処置するために又は細胞の第２の集団の成長もしくは分化を支持するために、いずれかの所望のやり方で用いられ得る。
本明細書において用いられる用語「保存的アミノ酸置換」は、本明細書においては次の表２に要約されている５つの群の１つの中でのアミノ酸交換として定義される。
Figure 2022550670000003
「対照」細胞、組織、サンプル、又は対象は、試験細胞、組織、サンプル、又は対象と同じ型の細胞、組織、サンプル、又は対象である。対照は、例えば、試験細胞、組織、サンプル、又は対象が検査される正確に又はほぼ同じ時間に検査され得る。対照は、例えば、試験細胞、組織、サンプル、又は対象が検査される時間から離れた時間において検査され得、対照の検査の結果が記録され得、その結果、記録された結果が試験細胞、組織、サンプル、又は対象の検査によって得られる結果と比較され得る。試験が行われようとする疾患又は障害を有することが疑われる対象から試験サンプルが得られるところでは、対照は試験群又は試験対象以外の別のソース又は類似のソースからもまた得られ得る。
「試験」細胞、組織、サンプル、又は対象は、検査又は処置されようとするものである。
「病的指標」細胞、組織、又はサンプルは、存在するときには、細胞、組織、又はサンプルが所在する（又は組織が得られた）動物が疾患又は障害に冒されているという指標であるものである。例として、動物の肺組織における１つ以上の乳部細胞の存在は、動物が転移性の乳癌に冒されているという指標である。
細胞の１つ以上が疾患又は障害に冒されていない動物の組織に存在する場合には、組織は細胞を「正常に含む」。
本明細書において用いられる「化合物」は、本発明の薬物又は薬物としての使用のための候補、上の組み合わせ及び混合物、並びにポリペプチド及び抗体と普通に見なされるいずれかの型の物質又は薬剤を言う。
本明細書において用いられる「サイトカイン」は細胞間シグナル伝達分子を言い、これらの最も周知のものは哺乳類の体細胞の制御に関わる。それらの効果が成長促進性及び成長阻害性両方のサイトカインのいくつものファミリーがキャラクタリゼーションされており、例えばインターロイキン、インターフェロン、及びトランスフォーミング増殖因子を包含する。いくつもの他のサイトカインが当業者に公知である。これらのサイトカインのソース、特質、標的、及びエフェクター活性は記載されている。
本明細書において用いられる「ケモカイン」は、Ｔ細胞などの白血球の走化性に関わる細胞間シグナル伝達分子を言う。
用語「送達基剤」は、インビボで細胞を送達するために用いられ得るか又は動物に投与される細胞を含む組成物に追加され得るいずれかの種類のデバイス又は材料を言う。これは、インプラント可能なデバイス、細胞の集合体、マトリックス材料、ゲルなどを包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる化合物の「誘導体」は、アルキル、アシル、又はアミノ基によるＨの置き換えのような１つ以上のステップによって類似の構造の別の化合物から産生され得る化学的な化合物を言う。
単語「検出する」及びその文法的バリアントの使用は、定量なしの種の測定を言うことを意味され、単語「決定する」又は「測定する」の使用は、それらの文法的バリアントと共に、定量ありの種の測定を言うことを意味される。用語「検出する」及び「同定する」は本明細書において交換可能に用いられる。
本明細書において用いられる「検出可能なマーカー」又は「レポーター分子」は、マーカーなしの類似の化合物の存在下においてマーカーを含む化合物の特異的検出を可能にする原子又は分子である。検出可能なマーカー又はレポーター分子は、例えば、放射性同位体、抗原性決定基、酵素、ハイブリダイゼーションに利用可能な核酸、クロモフォア、フルオロフォア、化学発光分子、電気化学的に検出可能な分子、及び変改された蛍光偏光又は変改された光散乱を可能にする分子を包含する。
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持し得ず、疾患が良くならない場合には動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態である。
対照的に、動物の「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康状態が障害の不在下よりも良好ではない健康状態である。無処置のまま放置された障害は動物の健康状態のさらなる減少を必ずしも引き起こさない。
本明細書において用いられる「有効量」は、選択された効果を生ずるために十分な量を意味する。「治療上有効量」は、疾患又は障害を処置又は防止することに用いられようとする薬剤の有効量を意味する。
本明細書において用いられる用語「エピトープ」は、抗体を誘発しそれと反応し得る抗原分子上の小さい化学基として定義される。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。ほとんどの抗原は多くのエピトープを有する。すなわち、それらは多価である。一般的には、エピトープはサイズが大体５つのアミノ酸又は糖である。当業者は、一般的には、分子の具体的な線状の配列よりもむしろ総体的な３次元構造が抗原特異性の主な基準であるということを理解する。
「断片」又は「セグメント」は、少なくとも１つのアミノ酸を含むアミノ酸配列のある部分、又は少なくとも１つのヌクレオチドを含む核酸配列のある部分である。用語「断片」及び「セグメント」は本明細書においては交換可能に用いられる。
蛋白質又はペプチドに適用される本明細書において用いられる用語「断片」は、通例では、長さが少なくとも約３～１５アミノ酸、少なくとも約１５～２５アミノ酸、長さが少なくとも約２５～５０アミノ酸、長さが少なくとも約５０～７５アミノ酸、長さが少なくとも約７５～１００アミノ酸、及び長さが１００アミノ酸超であり得る。
核酸に適用される本明細書において用いられる用語「断片」は、通例では、長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、典型的には少なくとも約５０ヌクレオチド、より典型的には約５０から約１００ヌクレオチド、いくつかの実施態様では少なくとも約１００から約２００ヌクレオチド、いくつかの実施態様では少なくとも約２００ヌクレオチドから約３００ヌクレオチド、尚いくつかの実施態様では少なくとも約３００から約３５０、いくつかの実施態様では少なくとも約３５０ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド、尚いくつかの実施態様では少なくとも約５００から約６００、いくつかの実施態様では少なくとも約６００ヌクレオチドから約６２０ヌクレオチド、尚いくつかの実施態様では少なくとも約６２０から約６５０であり得、最大ではいくつかの実施態様では、核酸断片は長さが約６５０ヌクレオチド超であろう。
本明細書において用いられる「機能的な」分子は、それが特徴とする特性又は活性を見せる形態の分子である。
本明細書において用いられる「機能的な生体分子」は、それが特徴とする特性を見せる形態の生体分子である。例えば、機能的な酵素は、酵素が特徴とする特徴的な触媒活性を見せるものである。
本明細書において用いられる用語「増殖因子」は、細胞又は組織の増殖を促進する生物活性分子を意味する。本発明に有用な増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子－アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子－ベータ（ＴＧＦ－β）、ＡＡ、ＡＢ、及びＢＢアイソフォームを包含する血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＦＧＦ酸性アイソフォーム１及び２、ＦＧＦ塩基性形態２、並びにＦＧＦ４、８、９、及び１０を包含する線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓ、及びベータＮＧＦ、並びにニューロトロフィンを包含する神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子、軟骨由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＥＧ－ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ関連蛋白質、Ｂｖ８、ＶＥＧＦ－Ｅ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）Ｉ及びＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、骨格増殖因子、骨基質由来増殖因子、及び骨由来増殖因子、並びにそれらの混合物を包含するが、これらに限定されない。いくつかの増殖因子は細胞又は組織の分化をもまた促進し得る。例えば、ＴＧＦは細胞又は組織の成長及び／又は分化を促進し得る。
本明細書において用いられる「相同な」は、２つのポリマー分子間の、例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間の、又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列類似性を言う。２つの分子の両方におけるあるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占められているときには、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれのある位置がアデニンによって占められている場合には、それらはその位置において相同である。２つの配列間の相同性は、マッチするか又は相同な位置の数の直接的な関数である。例えば、２つの化合物配列上の位置の半分（例えば、長さが１０サブユニットのポリマー上の５つの位置）が相同である場合には、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９がマッチしているか又は相同である場合には、２つの配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列５'－ＡＴＴＧＣＣ－３'及び５'－ＴＡＴＧＧＣ－３'は５０％の相同性を共有する。
本明細書において用いられる「相同性」は「同一性」と類義的に用いられる。
２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。例えば、２つの配列を比較するために有用な数学的アルゴリズムは、カーリン（Karlin）＆アルチュル（Altschul），１９９０年のアルゴリズムであり、カーリン（Karlin）＆アルチュル（Altschul），１９９３年の通り改変される。このアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれ（アルチュル（Altschul）ら，１９９０年ａ；アルチュル（Altschul）ら，１９９０年ｂを見よ）、例えば国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ワールドワイドウェブサイトにおいてアクセスされ得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と指定される）によって次のパラメータを用いて行われ得る：本明細書に記載される核酸に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ギャップペナルティー＝５；ギャップ延長ペナルティー＝２；ミスマッチペナルティー＝３；マッチリワード＝１；期待値１０．０；及びワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴ蛋白質検索はＸＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩウェブサイトでは「ｂｌａｓｔｎ」と指定される）又はＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムによって次のパラメータを用いて行われ得る：本明細書に記載される蛋白質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るためには、ギャップ付きＢＬＡＳＴがアルチュル（Altschul）ら，１９９７年に記載の通り利用され得る。代替的には、分子間の遠い関係性（アルチュル（Altschul）ら，１９９７年）及び共通のパターンを共有する分子間の関係性を検出する反復的検索を行うために、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ又はＰＨＩ－Ｂｌａｓｔが用いられ得る。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔ、及びＰＨＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用するときには、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが用いられ得る。
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許すことあり又はなしに、上に記載されているものに類似の技術を用いて決定され得る。パーセント同一性を算出する際には、典型的には厳密なマッチがカウントされる。
本明細書において用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸の対形成を参照して用いられる。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強さ（すなわち、核酸間の結び付きの強さ）は、核酸間の相補性の度合い、関わる条件の厳しさ、形成されるハイブリッドの長さ、及び核酸上のＧ：Ｃ比などの因子によってインパクトを及ぼされる。
用語「成分」は、化学的又は生物学的起源かどうかにかかわらず、細胞の増殖、生残、又は分化を維持又は促進するための細胞培養培地に用いられ得るいずれかの化合物を言う。用語「コンポーネント」、「栄養素」、「サプリメント」、及び「成分」は交換可能に用いられ得、全てかかる化合物を言うことを意味される。細胞培養培地に用いられる典型的な限定しない成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、蛋白質、及び同類を包含する。エクシビボの細胞の培養を促進又は維持する他の成分は、特定の必要に従って当業者によって選択され得る。
本明細書において用いられる用語「阻害する」は、用語「阻害する」が用いられる文脈に基づいて、記載される機能、レベル、活性、速度などを縮減又は妨害する化合物、薬剤、又は方法の能力を言う。いくつかの実施態様では、阻害は少なくとも１０％、いくつかの実施態様では少なくとも２５％、いくつかの実施態様では少なくとも５０％であり、いくつかの実施態様では、機能は少なくとも７５％阻害される。用語「阻害する」は「縮減する」及び「ブロックする」と交換可能に用いられる。
本明細書において用いられる用語「阻害剤」は、その適用が分化及び活性を包含するがこれらに限定されない目当てのプロセス又は機能の阻害をもたらすいずれかの化合物又は薬剤を言う。目当ての活性又は機能の縮減がある場合には、阻害が推察され得る。
本明細書において用いられる言い回し「阻害性核酸」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）又は遺伝子サイレンシングを媒介することができるいずれかの核酸分子を言う。例えば、バス（Bass），２００１年；エルバシール（Elbashir）ら，２００１；並びにＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ９９／０７４０９；ＷＯ９９／３２６１９；ＷＯ００／０１８４６；ＷＯ００／４４８９５；ＷＯ００／４４９１４；ＷＯ０１／３６６４６；及びＷＯ０１／２９０５８を見よ。例示的な阻害性核酸は、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡを包含する。いくつかの実施態様では、阻害性核酸は、相補的なセンス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子を含み、アンチセンス領域は標的核酸分子のある領域に対して相補的な配列を含む。例えば、いくつかの実施態様では、阻害性核酸は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＤＤＸ１７、カスパーゼ－１、カスパーゼ－４、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ１、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物のある領域に対して相補的なアンチセンス領域を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害性核酸は、自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、アンチセンス領域は標的核酸分子のある領域に対して相補的な配列を含む。いくつかの実施態様では、阻害性核酸は、１つ以上のループ構造と自己相補的なセンス及びアンチセンス領域を含むステムとを有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、アンチセンス領域は標的核酸分子のある領域に対して相補的な配列を含み、ポリヌクレオチドはインビボ又はインビトロどちらかでプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介することができる活性な阻害性核酸を生成し得る。いくつかの実施態様では、阻害性核酸はｓｉＲＮＡであり、これは、いくつかの実施態様では、配列番号３～６（ｈＮＬＲＣ４ｓｉＲＮＡ）、９～２０（ｍＮｌｒｃ４ｓｉＲＮＡ）、２３～２７（ｈＤＤＸ１７ｓｉＲＮＡ）、３０～３４（ｍＤｄｘ１７ｓｉＲＮＡ）、４６～５１（ｈＣＡＳ－４ｓｉＲＮＡ）、及び５８（ｈＣＧＡＳｓｉＲＮＡ）のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害性核酸はｓｈＲＮＡであり、これは、いくつかの実施態様では、配列番号４５（ｈＣＡＳ－４ｓｈＲＮＡ）、５６（ｈＣＧＡＳｓｈＲＮＡ）、５７（ｈＣＧＡＳｓｈＲＮＡ）、６３（ｈＳＴＩＮＧ１ｓｈＲＮＡ）、６８（ｈＰＰＩＦｓｈＲＮＡ）、７３（ｈＧＳＤＭＤｓｈＲＮＡ）、７８（ｈＩＦＮ－βｓｈＲＮＡ）、及び８３（ｈＩＦＮＡＲｓｈＲＮＡ）のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
本明細書において用いられる阻害性核酸分子は、ＲＮＡのみを含有する分子に限定される必要はなく、更に化学修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドを包摂する。
本明細書において用いられる「注射又は適用する」は、多数の経路及びアプローチによる本発明の化合物又は組成物の投与を包含し、外用、経口、バッカル、静脈内、腫瘍内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経真皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、外用、舌下、膣、眼、経肺、又は直腸経路を包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、組成物は眼部送達のために製剤される。
本明細書において用いられる「傷害」は一般的にダメージ、危害、又は傷付けを言う。通常は、外力によって体に課されたダメージに適用される。
本明細書において用いられる「説明材料」は、本明細書に記載される種々の疾患又は障害の緩和を成就するためのキット中の本発明の組成物の有用性を伝達するために用いられ得る刊行物、録音、ダイアグラム、又はいずれかの他の表現媒体を包含する。任意に又は代替的に、説明材料は哺乳動物の細胞又は組織の疾患又は障害を緩和する１つ以上の方法を記載し得る。本発明のキットの説明材料は、例えば、本発明の同定された化合物を含有する容器に添付され得るか、又は同定された化合物を含有する容器と一緒に出荷され得る。代替的には、説明材料は、説明材料及び化合物がレシピエントによって協力的に用いられるという意図で、容器とは別個に出荷され得る。
用語「単離する」及び「セレクションする」は本明細書において交換可能に用いられる。
用語「単離する」、「単離される」、「単離すること」、及びそれらの文法的変形は、細胞を参照して用いられるときには、それが起源の培養又は組織において共に生起する他の細胞型又は他の細胞材料から少なくとも部分的に単離された目当ての単細胞又は目当ての細胞の集団を言う。それが目当ての細胞以外の細胞又は他の細胞材料をいくつかの実施態様では少なくとも６０％、いくつかの実施態様では少なくとも７５％、いくつかの実施態様では少なくとも９０％、ある種のケースでは、いくつかの実施態様では少なくとも９９％不含であるときに、サンプルは「実質的に純粋」である。純度は、例えば例において提示されるものだがこれらに限定されないいずれかの適当な方法によって測定され得る。
「単離された核酸」は、天然に生起する状態ではそれをフランキングする配列から分離された核酸セグメント又は断片、例えば正常では断片に隣接する配列、例えばそれが天然に生起するゲノム上の断片に隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を言う。用語は、天然では核酸に付随する他のコンポーネント、例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ、又は天然では細胞内においてそれに付随する蛋白質から実質的に精製された核酸にもまた適用される。よって、用語は、例えば、ベクター上に、自律複製プラスミドもしくはウイルス上に、又は原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ上に組み込まれているか、あるいは他の配列から独立した別個の分子として（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素消化によって産生されるｃＤＮＡ又はゲノムもしくはｃＤＮＡ断片として）存在する組み換えＤＮＡを包含する。それは、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡをもまた包含する。
別様に規定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンでありかつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。蛋白質をコードするヌクレオチド配列及びＲＮＡはイントロンを包含し得る。
本明細書において用いられる「リガンド」は、標的化合物に特異的に結合する化合物である。混成の化合物のサンプル中の化合物の存在を決定する結合反応において、リガンドが機能するときには、リガンド（例えば抗体）は、化合物「に特異的に結合する」又は「と特異的に免疫反応性である」。それゆえに、指定されるアッセイ（例えば、イムノアッセイ）条件下では、リガンドは特定の化合物に選好的に結合し、サンプル中に存在する他の化合物には有意な程度に結合しない。例えば、イムノアッセイ条件下において、抗体はそれに対して抗体が育てられたエピトープを持つ抗原に特異的に結合する。特定の抗原と特異的に免疫反応性の抗体をセレクションするために、種々のイムノアッセイフォーマットが用いられ得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、抗原と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体をセレクションするために慣例的に用いられる。特異的免疫反応性を決定するために用いられ得るイムノアッセイフォーマット及び条件の記載については、ハーロー（Harlow）＆レーン（Lane），１９８８年を見よ。
「受容体」はリガンドに特異的に又は選択的に結合する化合物である。
本明細書において用いられる用語「連結部」は２つの基の間の接続を言う。接続は共有結合的又は非共有結合的どちらかであり得、イオン結合、水素結合、及び疎水性／親水性相互作用を包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる用語「リンカー」は、２つの他の分子を共有結合的に又は非共有結合的に、例えばイオンもしくは水素結合又はファンデルワールス相互作用によって繋ぐ分子又はそれに由来する二価基を言う。
本明細書において用いられる用語「発現のレベルを測定すること」又は「発現のレベルを決定すること」は、アッセイの結果を目当ての遺伝子又は蛋白質の発現のレベルと相関させるために用いられ得るいずれかの尺度又はアッセイを言う。かかるアッセイは、ｍＲＮＡのレベル、蛋白質レベルなどを測定することを包含し、例えばノーザン及びウエスタンブロット分析、結合アッセイ、イムノブロットなどのアッセイによって行われ得る。発現のレベルは発現の速度を包含し得、存在するｍＲＮＡ又は蛋白質の実際の量に換算して測定され得る。かかるアッセイは、情報を保存及びプロセシングするための、並びにレベル、シグナルなどを定量することを助けるための、並びにレベルを比較することへの使用のために情報をデジタイズするためのプロセス又は系とカップリングされる。
本明細書において用いられる用語「調節する」は、活性、機能、又はプロセスのレベルを変化させることを言う。用語「調節する」は、活性、機能、又はプロセスを阻害及び刺激すること両方を包摂する。用語「調節する」は本明細書においては用語「制御する」と交換可能に用いられる。
用語「核酸」は典型的には大きいポリヌクレオチドを言う。「核酸」によってはいずれかの核酸が意味され、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドから構成されるかどうかにかかわらず、ホスホジエステル連結部又は修飾連結部、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、橋かけホスホロアミダート、橋かけメチレンホスホネート、橋かけホスホロアミダート、橋かけホスホロアミダート、橋かけメチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、橋かけホスホロチオエート、もしくはスルホン連結部、及びかかる連結部の組み合わせから構成されるかどうかにかかわらない。用語核酸は、具体的には、５つの生体に生起する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸をもまた包含する。
本明細書において用いられる用語「核酸」は、ＲＮＡ並びに一本及び二本鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡを包摂する。更にその上、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、及び類似の用語は、核酸アナログ、すなわちホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログをもまた包含する。例えば、当分野で公知であり、ホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合をバックボーンに有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内と見なされる。「核酸」によってはいずれかの核酸が意味され、デオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドから構成されるかどうかにかかわらず、ホスホジエステル連結部又は修飾連結部、例えばホスホトリエステル、ホスホロアミダート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダート、カルバメート、チオエーテル、橋かけホスホロアミダート、橋かけメチレンホスホネート、橋かけホスホロアミダート、橋かけホスホロアミダート、橋かけメチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、橋かけホスホロチオエート、又はスルホン連結部、及びかかる連結部の組み合わせから構成されるかどうかにかかわらない。用語核酸は、具体的には、５つの生体に生起する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）以外の塩基から構成される核酸をもまた包含する。ポリヌクレオチド配列を記載するためには、従来の表記法が本明細書において用いられる。一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の端は５'端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は５'方向と言われる。新生ＲＮＡ転写物へのヌクレオチドの５'から３'の追加の方向は転写方向と言われる。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は「コード鎖」と言われる。ＤＮＡ上の参照点の５'に所在するＤＮＡ鎖上の配列は「上流配列」と言われる。ＤＮＡ上の参照点の３'であるＤＮＡ鎖上の配列は「下流配列」と言われる。
本明細書において用いられる用語「核酸コンストラクト」は、ゲノム的な又は合成的な方法によって得られるかどうかにかかわらず、所望の特定の遺伝子又は遺伝子断片をコードするＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包摂する。
別様に規定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンでありかつ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を包含する。蛋白質をコードするヌクレオチド配列及びＲＮＡはイントロンを包含し得る。
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、一般的には約５０ヌクレオチドを超えない短いポリヌクレオチドを言う。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表されるときには、これは「Ｕ」が「Ｔ」を置き換えるＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）をもまた包含するということは理解されるであろう。
２つのポリヌクレオチドを「作動可能に連結された」と記載することによって、一本鎖又は二本鎖核酸部分が、２つのポリヌクレオチドの少なくとも１つがそれが特徴とする生理学的効果を他方に対して行使することができるような様式で核酸部分の中に配置された２つのポリヌクレオチドを含むということが意味される。例として、遺伝子のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターはコード領域の転写を促進することができる。
医薬組成物の本明細書において用いられる「非経口投与」は、対象の組織の物理的裂孔を特徴とする投与及び組織の裂孔部からの医薬組成物の投与のいずれかの経路を包含する。それゆえに、非経口投与は、組成物の注射、切開部からの組成物の適用、組織穿通非手術的創傷からの組成物の適用、及び同類による医薬組成物の投与を包含するが、これらに限定されない。具体的には、非経口投与は、皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注射、腫瘍内、及び腎臓透析輸液技術を包含することを企図されるが、これらに限定されない。
用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの活性成分を含む組成物を意味するものとし、それによって、組成物は、哺乳動物（例えば、限定なしにヒト）における規定された効能アウトカムの検討を受け入れる。当業者は、業者の必要に基づいて活性成分が所望の効能アウトカムを有するかどうかを決定するための適当な技術を理解及び了解するであろう。
本明細書において用いられる用語「薬学的に許容される担体」は、適当な化合物又は誘導体が組み合わせられ得、かつ組み合わせ後に適当な化合物を対象に投与するために用いられ得る化学組成物を意味する。
本明細書において用いられる用語「生理学的に許容される」エステル又は塩は、組成物が投与されるべき対象にとって有害性ではない、医薬組成物のいずれかの他の成分と適合性である活性成分のエステル又は塩形態を意味する。
「複数」は少なくとも２つを意味する。
「ポリヌクレオチド」は核酸の一本鎖又はパラレル及びアンチパラレル鎖を意味する。それゆえに、ポリヌクレオチドは一本鎖又は二本鎖核酸どちらかであり得る。
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基、関係する天然に生起する構造バリアント、及びそれらの合成の天然に生起しないアナログ、関係する天然に生起する構造バリアント、並びにそれらの合成の天然に生起しないアナログから構成されるポリマーを言う。
「合成ペプチド又はポリペプチド」は天然に生起しないペプチド又はポリペプチドを意味する。合成ペプチド又はポリペプチドは例えば自動ポリペプチド合成機を用いて合成され得る。種々の固相ペプチド合成方法が当業者に公知である。
本明細書において用いられる用語「防止する」は、何かが起こることを止めること、又は可能なもしくは蓋然的な何かが起こることに対して事前措置を取ることを意味する。医学の文脈では、「防止」は、一般的には、疾患又は病状を獲得する確率を減少させるために取られる行為を言う。
「プライマー」は、指定されるポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイゼーションすること及び相補的なポリヌクレオチドの合成の開始点を提供することができるポリヌクレオチドを言う。かかる合成は、ポリヌクレオチドプライマーが、合成が誘導される条件下に、すなわちヌクレオチド、相補的なポリヌクレオチド鋳型、及びＤＮＡポリメラーゼなどのポリマー化のための薬剤の存在下に置かれるときに生起する。プライマーは典型的には一本鎖であるが、二本鎖であり得る。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、広い種々の合成の及び天然に生起するプライマーが多くの適用に有用である。プライマーは、合成開始部位としての用をなすためのそれがハイブリダイゼーションするように設計されている鋳型に対して相補的であるが、鋳型の厳密な配列を反映する必要はない。かかるケースでは、鋳型に対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件の厳しさに依存する。プライマーは例えばクロモゲン性、放射性、又は蛍光部分によって標識され、検出可能な部分として用いられ得る。
「予防」処置は、疾患又は傷害に関連する病理を発生するリスクを減少させる目的で、疾患もしくは傷害の徴候を見せないか又は疾患もしくは傷害の早期の徴候のみを見せる対象に投与される処置である。
本明細書において用いられる用語「プロモーター／制御配列」は、プロモーター／制御配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に要求される核酸配列を意味する。いくつかの場合には、この配列はコアプロモーター配列であり得、他の場合には、この配列はエンハンサー配列及び遺伝子産物の発現に要求される他の制御エレメントをもまた包含し得る。プロモーター／制御配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
「恒常的」プロモーターは、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を細胞において一定した様式で駆動するプロモーターである。例として、細胞ハウスキーピング遺伝子の発現を駆動するプロモーターは恒常的プロモーターであると見なされる。
「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されたときに、プロモーターに対応する誘導因子が実質的に細胞内に存在するときのみに、遺伝子産物が生細胞によって産生されることを引き起こすヌクレオチド配列である。
「組織特異的」プロモーターは、遺伝子産物をコード又は規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されたときに、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、遺伝子産物が生細胞によって産生されることを引き起こすヌクレオチド配列である。
末端アミノ基について本明細書において用いられる「保護基」はペプチドの末端アミノ基を言い、この末端アミノ基がペプチド合成に従来使用される種々のアミノ末端保護基のいずれかとカップリングされる。かかる保護基は、例えばアセチル保護基、例えばホルミル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、及びメトキシスクシニル；芳香族ウレタン保護基、例えばベンジルオキシカルボニル；並びに脂肪族ウレタン保護基、例えばｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル又はアダマンチルオキシカルボニルを包含する。好適な保護基についてはグロス（Gross）＆ミーンホーファー（Mienhofer），１９８１年を見よ。
末端カルボキシ基について本明細書において用いられる「保護基」はペプチドの末端カルボキシル基を言い、この末端カルボキシル基が種々のカルボキシル末端保護基のいずれかとカップリングされる。かかる保護基は、例えばｔｅｒｔ－ブチル、ベンジル、又はエステルもしくはエーテル結合によって末端カルボキシル基に連結される他の許容される基を包含する。
用語「蛋白質」は典型的には大きいポリペプチドを言う。ポリペプチド配列を描写するためには、従来の表記法が本明細書においては用いられる。ポリペプチド配列の左手の端はアミノ末端である。ポリペプチド配列の右手の端はカルボキシル末端である。
本明細書において用いられる用語「蛋白質制御経路」は、蛋白質を制御する上流制御経路及び蛋白質が制御する下流事象両方を言う。かかる制御は、目当ての蛋白質の転写、翻訳、レベル、活性、翻訳後修飾、及び機能、並びに蛋白質が制御する下流事象を包含するが、これらに限定されない。
用語「蛋白質経路」及び「蛋白質制御経路」は本明細書においては交換可能に用いられる。
本明細書において用いられる用語「精製された」及び同類の用語は、正常ではネイティブな環境において分子又は化合物と結び付けられた他のコンポーネントに対して相対的な分子又は化合物の濃縮に関する。用語「精製された」は、特定の分子の完全な純度がプロセスの間に達成されたということを必ずしも指示しない。本明細書において用いられる「高度に精製された」化合物は、９０％超純粋である化合物を言う。
「組み換えポリヌクレオチド」は、天然では一緒に繋がれていない配列を有するポリヌクレオチドを言う。増幅又はアセンブリされた組み換えポリヌクレオチドが好適なベクター上に包含され得、ベクターは好適なホスト細胞を形質転換するために用いられ得る。
組み換えポリヌクレオチドは、非コード機能（例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）も供し得る。
組み換えポリヌクレオチドを含むホスト細胞は「組み換えホスト細胞」と言われる。遺伝子が組み換えポリヌクレオチドを含む組み換えホスト細胞によって発現される遺伝子は、「組み換えポリペプチド」を生ずる。
「組み換えポリペプチド」は、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるものである。
用語「制御する」は、目当ての機能又は活性を刺激又は阻害することどちらかを言う。
本明細書において用いられる用語「制御エレメント」は「制御配列」と交換可能に用いられ、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現対照エレメント、又はかかるエレメントのいずれかの組み合わせを言う。
「可逆的にインプラント可能な」デバイスは、（例えば、外科的に、又は動物の天然の開口部への挿入によって）動物の体に挿入され、その後に動物の健康への多大な危害なしに取り除かれ得るものである。
本明細書において用いられる「サンプル」は、いくつかの実施態様では、対象からの生体サンプルを言い、正常組織サンプル、疾患組織サンプル、生検、血液、唾液、大便、精液、涙、及び尿を包含するが、これらに限定されない。サンプルは、目当ての細胞、組織、又は液を含有する対象から得られる材料のいずれかの他のソースでもまたあり得る。サンプルは細胞又は組織培養からもまた得られ得る。
「有意な検出可能なレベル」は、提示されるデータから可視であり、法医学的証拠の分析の間には議論／説明されることを必要とするであろうコンタミネートの量である。
用語「シグナル配列」によって、ポリペプチドが細胞内で取る進路を指令するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が意味される。すなわち、それは、細胞からのポリペプチドの最終的な分泌を包含するがこれに限定されない細胞内のポリペプチドの細胞性のプロセシングを指令する。シグナル配列は、ポリペプチドの合成を小胞体へと標的化する専らではないが典型的にポリペプチドのアミノ末端に見出されるアミノ酸の配列である。いくつかの場合には、シグナルペプチドはポリペプチドから蛋白質加水分解的に取り除かれ、それゆえに成熟蛋白質には不在である。
「短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」によって、とりわけ、センス及びアンチセンス鎖両方から構成される単離されたｄｓＲＮＡ分子が意味される。いくつかの実施態様では、それは長さが１０ヌクレオチド超である。ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子からのセンス及び相補的なアンチセンス配列両方、例えばヘアピンを有する単一の転写物をもまた言う。ｓｉＲＮＡは、更に、天然に生起するＲＮＡとは１つ以上のヌクレオチドの追加、欠失、置換、及び／又は変改が異なる変改されたＲＮＡ、並びにｄｓＲＮＡのいずれかの形態（より大きいｄｓＲＮＡの蛋白質加水分解的に切断される産物、部分精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換え産生ＲＮＡ）を包含する。
用語「固体支持体」、「表面」、及び「基材」は交換可能に用いられ、いずれかのサイズの構造単位を言い、前記の構造単位又は基材は分子構造の固定化又は前記構造の修飾にとって好適な表面を有し、前記基材は金属、金属箔、ガラス、溶融シリカ、合成ポリマー、及び膜などだがこれらに限定されない材料から作られる。
本明細書において用いられる用語「特異的に結合する」によって、特定の分子を認識及び結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識又は結合しない分子が意味される。又は、それは、細胞の制御プロセスの一部のような２つ以上の分子間の結合を意味し、ここでは、前記分子はサンプル中の他の分子を実質的に認識又は結合しない。
本明細書において用いられる用語「標準」は比較のために用いられる何かを言う。例えば、それは、試験化合物を投与するときに投与され、結果を比較するために用いられる公知の標準的な薬剤又は化合物であり得る。又は、それは、パラメータ又は機能に対する薬剤又は化合物の効果を測定するときに対照値を得るために測定される標準的なパラメータ又は機能であり得る。「標準」は「内部標準」をもまた言い得る。例えば、既知の量でサンプルに追加され、かつ目当てのマーカーが測定される前にサンプルがプロセシングされるか又は精製もしくは抽出手続きに付されるときに精製又は回収率などの事を決定することに有用である薬剤又は化合物である。常にではないが多くの場合に、内部標準は例えば放射性同位体によって標識された目当ての精製されたマーカーに限定され、それがサンプル中の内在性の物質から見分けられることを許す。
本明細書において用いられる用語「刺激する」は、それが対照値に対して相対的に高いようにして、活性又は機能レベルを誘導又は増大させることを意味する。刺激は直接的な又は間接的なメカニズムによってであり得る。いくつかの実施態様では、活性又は機能は対照値と比較して少なくとも１０％、いくつかの実施態様では少なくとも２５％、いくつかの実施態様では少なくとも５０％刺激される。本明細書において用いられる用語「刺激因子」は、その適用が目当てのプロセス又は機能の刺激をもたらすいずれかの組成物、化合物、又は薬剤を言う。
診断又は処置の「対象」はヒトを包含する動物である。それはペット及び家畜をもまた包含する。
本明細書において用いられる「その必要がある対象」は、本発明の方法又は組成物によって益されるであろう患者、動物、哺乳動物、又はヒトである。
本明細書において用いられる「実質的に相同なアミノ酸配列」は、少なくとも約９５％の相同性、いくつかの実施態様では少なくとも約９６％の相同性、更にいくつかの実施態様では少なくとも約９７％の相同性、いくつかの実施態様では少なくとも約９８％の相同性、最大ではいくつかの実施態様では少なくとも約９９％以上の相同性を参照配列のアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列を包含する。アミノ酸配列の類似性又は同一性は、ＢＬＡＳＴ（基本的局所アラインメント検索ツール）２．０．１４アルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮプログラムを用いることによって計算され得る。これらのプログラムに用いられるデフォルトの設定は、本発明の目的で実質的に類似のアミノ酸配列を同定することに好適である。
「実質的に相同な核酸配列」は、対応する配列が、参照核酸配列によってコードされるペプチドと実質的に同じ構造及び機能を有するペプチドをコードする、参照核酸配列に対応する核酸配列を意味する。例えば、ここでは、ペプチド機能に有意に影響しないアミノ酸の変化のみが生起する。いくつかの実施態様では、実質的に同一の核酸配列は、参照核酸配列によってコードされるペプチドをコードする。実質的に類似の核酸配列及び参照核酸配列の間の同一性のパーセンテージは少なくとも約５０％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％、又はより多くである。核酸配列の実質的同一性は、例えば物理的／化学的方法（すなわちハイブリダイゼーション）によって又はコンピュータアルゴリズムによる配列アラインメントによって、２つの配列の配列同一性を比較することによって決定され得る。ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に実質的に類似であるかどうかを決定するための好適な核酸ハイブリダイゼーション条件は：５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウムＳＤＳ、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃で２×標準クエン酸含有生理食塩水（ＳＳＣ）、０．１％ＳＤＳによる洗浄；いくつかの実施態様では、５０℃で７％（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄；いくつかの実施態様では、５０℃で７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄；更にいくつかの実施態様では、５０℃で７％ＳＤＳ、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍのＥＤＴＡ６５℃で０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄である。２つの核酸配列間の実質的類似性を決定するための好適なコンピュータアルゴリズムは、ＧＣＳプログラムパッケージ及びＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡプログラムを包含する（アルチュル（Altschul）ら，１９９０年ａ；アルチュル（Altschul）ら，１９９０年ｂ；アルチュル（Altschul）ら，１９９７年）。これらのプログラムで提供されるデフォルトの設定は、本発明の目的で核酸配列間の実質的類似性を決定することに好適である。
用語「実質的に純粋」は、天然にそれに付随するコンポーネントから分離された化合物、分子、又は同類を記載している。典型的には、サンプル中のトータルの材料の少なくとも１０％、更にいくつかの実施態様では少なくとも２０％、更にいくつかの実施態様では少なくとも５０％、更にいくつかの実施態様では少なくとも６０％、更にいくつかの実施態様では少なくとも７５％、更にいくつかの実施態様では少なくとも９０％、最大ではいくつかの実施態様では少なくとも９９％（体積、湿潤もしくは乾燥重量、又はモルパーセントもしくはモル分率による）が目当ての化合物であるときに、化合物は実質的に純粋である。純度は、いずれかの適当な方法、例えば例において開示されるものによって、又はポリペプチドのケースではカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、もしくはＨＰＬＣ分析によって測定され得る。化合物、例えば蛋白質は、それが天然に結び付いたコンポーネントを本質的に不含であるときに又はそれがその天然の状態においてそれに付随するネイティブなコンタミナントから分離されているときにもまた実質的に精製されている。
「表面活性剤」又は「界面活性剤」は、材料の表面張力を縮減及び材料内への又は中の浸透を可能化する能力を有する物質である。
本明細書において用いられる用語「症状」は、患者によって経験されるかつ疾患の指標である構造、機能、又は感覚のいずれかの病的現象又は正常からの逸脱を言う。対照的に、「徴候」は疾患の客観的証拠である。例えば、鼻血は徴候である。それは患者、医師、看護師、及び他の観察者にとって明白である。
「治療」処置は、それらの徴候を逓減又は消去する目的で、病理の兆候を見せる対象に投与される処置である。
化合物の「治療上有効量」は、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するために十分である化合物の量である。
「組織」は、（１）特定の機能を果たす統合された類似の細胞の群；（２）類似の構造及び機能を有する細胞の集合体からなる生物の一部；又は（３）類似にそれらの構造及び機能を特徴とする細胞の群分け、例えば筋肉もしくは神経組織を意味する。
本明細書において用いられる用語「外用適用」は皮膚などの表面への投与を言う。この用語は皮膚のケースでは「皮膚塗布」と交換可能に用いられる。「外用適用」は「直接適用」である。
「経真皮」送達によって、皮膚又は粘膜組織を通して血流中への薬物の通過による送達が意味される。経真皮は、それへの薬物又は化合物の外用適用による薬物又は化合物の投与のための入口としての皮膚をもまた言う。「経真皮」は「経皮」と交換可能に用いられる。
用語「トランスフェクション」は用語「遺伝子移入」、「形質転換」、及び「形質導入」と交換可能に用いられ、ポリヌクレオチドの細胞内導入を意味する。「トランスフェクション効率」は、トランスフェクションに付された細胞によって取り込まれるトランスジーンの相対量を言う。実際的には、トランスフェクション効率はトランスフェクション手続き後に発現されるレポーター遺伝子産物の量によって見積もられる。
本明細書において用いられる用語「トランスジーン」は、アミノ酸配列をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーター／制御配列をコードする核酸を含む外因的な核酸配列を意味し、この外因的核酸はトランスジェニック哺乳動物によってコードされる。
本明細書において用いられる用語「処置すること」は、特定の傷害、疾患、障害、もしくは病状の予防、又は特定の傷害、疾患、障害、もしくは病状に関連する症状の緩和、及び／又は前記症状を防止もしくは消去することを包含し得る。「予防」処置は、疾患に関連する病理を発生するリスクを減少させる目的で、疾患の徴候を見せないか又は疾患の早期の徴候のみを見せる対象に投与される処置である。「処置すること」は本明細書において「処置」と交換可能に用いられる。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部に送達するために用いられ得る組成物である。多数のベクターが当分野で公知であり、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結び付けられたポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを包含するが、これらに限定されない。それゆえに、用語「ベクター」は自律複製プラスミド又はウイルスを包含する。用語は、例えばポリリジン化合物、リポソーム、及び同類などの、細胞への核酸の移入又は送達を容易化する非プラスミド及び非ウイルス化合物をもまた包含すると解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組み換えウイルスベクター、及び同類を包含するが、これらに限定されない。非ウイルスベクターの例は、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体、及び同類を包含するが、これらに限定されない。
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に作動的に連結された発現対照配列を含む組み換えポリヌクレオチドを含むベクターを言う。発現ベクターは発現のための十分なシス作用エレメントを含む。発現のための他のエレメントはホスト細胞によって又はインビトロ発現系によって供給され得る。発現ベクターは、当分野で公知の全てのもの、例えばコスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含有された）、及びウイルスを包含し、これらが組み換えポリヌクレオチドを組み込む。
本明細書において用いられる術語は特定のバージョン又は実施態様を記載する目的のためのみであり、本発明の範囲を限定することは意図されない。本明細書において言及される全ての刊行物はそれらの全体が参照によって組み込まれる。
ＩＩ．組成物
いくつかの実施態様では、本発明は、本明細書において開示される方法に使用するための組成物に関する。ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状を処置及び／又は防止するための、細胞のＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するための、ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害するための、並びに対象のＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害するための方法を包含するが、これらに限定されない。
従って、いくつかの実施態様では、本発明は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止することに使用するための組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明は、ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害することに使用するための組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明は、対象のＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害することに使用するための組成物を提供する。
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は、１つ以上のヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。数々のＮＲＴＩが公知であり、次を包含するが、これらに限定されない：アバカビル（（１Ｓ，４Ｒ）－４－［２－アミノ－６－（シクロプロピルアミノ）－９Ｈ－プリン－９－イル］シクロペンタ－２－エン－１－イル｝メタノール；ＡＢＣ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．８，１８３，３７０）、アデホビル（｛［２－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）エトキシ］メチル｝ホスホン酸；ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６６３，１５９）、アムドキソビル（［（２Ｒ，４Ｒ）－４－（２，６－ジアミノプリン－９－イル）－１，３－ジオキソラン－２－イル］メタノール；マーフィー（Murphy）ら，２０１０年）、アプリシタビン（４－アミノ－１－［（２Ｒ，４Ｒ）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－オキサチオラン－４－イル］ピリミジン－２（１Ｈ）－オン；ＡＶＸ７５４；ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ２０１４／１８３１４７）、センサブジン（１－［（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチニル－５－（ヒドロキシメチル）－２Ｈ－フラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．７，５８９，０７８；８，１９３，１６５；９，１２６，９７１）、ジダノシン（９－（（２Ｒ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）－３Ｈ－プリン－６（９Ｈ）－オン；ＤＤＩ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．７，５８９，０７８；８，１９３，１６５；９，１２６，９７１）、エルブシタビン（４－アミノ－５－フルオロ－１－［（２Ｓ，５Ｒ）－５－（ヒドロキシメチル）－２，５－ジヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－オン；Ｕ．Ｓ．特許出願公開Ｎｏ．２０１１／０１５０９９７）、エムトリシタビン（２'，３'－ジデオキシ－５－フルオロ－３'－チアシチジン４－アミノ－５－フルオロ－１－［（２Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－オキサチオラン－５－イル］－１，２－ジヒドロピリミジン－２－オン；ＦＴＣ；ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ２０１４／１７６５３２）、エンテカビル（２－アミノ－９－［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－３－（ヒドロキシメチル）－２－メチリデンシクロペンチル]－１Ｈ－プリン－６－オン；ＥＴＶ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，６２７，２２４）、ラミブジン（２'，３'－ジデオキシ－３'－チアシチジン－４－アミノ－１－［（２Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－オキサチオラン－５－イル］－１，２－ジヒドロピリミジン－２－オン；３ＴＣ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．８，４８１，５５４）、ラシビル（４－アミノ－５－フルオロ－１－［（２Ｓ，５Ｒ）－２－（ヒドロキシメチル）－１，３－オキサチオラン－５－イル］－１，２－ジヒドロピリミジン－２－オン；オットー（Otto），２００４年、スタンピジン（メチルＮ－（（４－ブロモフェノキシ）｛［（２Ｓ，５Ｒ）－５－（５－メチル－２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２，５－ジヒドロフラン－２－イル］メトキシ｝ホスホリル）－Ｄ－アラニネート；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，３５０，７３６）、スタブジン（１－［（２Ｒ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）－２，５－ジヒドロフラン－２－イル］－５－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロピリミジン－２，４－ジオン；ｄ４Ｔ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．８，０２６，３５６）、テノホビルジソプロキシル（ビス｛［（イソプロポキシカルボニル）オキシ］メチル｝（｛［（２Ｒ）－１－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２－プロパニル］オキシ｝メチル）ホスホネート；ＴＤＦ；ＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ２００８／００７３８２）、テノホビルアラフェナミド（イソプロピル（２Ｓ）－２－［［［（１Ｒ）－２－（６－アミノプリン－９－イル）－１－メチル－エトキシ］メチル－フェノキシ－ホスホリル］アミノ］プロパノエート；ＧＳ－７３４０；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．９，２９６，７６９）、ザルシタビン（４－アミノ－１－（（２Ｒ，５Ｓ）－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－オン；ｄｄＣ；シェルトン（Shelton）ら，１９９３年）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（３'－デオキシ－３'－アジド－チミジン１－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）－４－アジド－５－（ヒドロキシメチル）オキソラン－２－イル］－５－メチルピリミジン－２，４－ジオン；ＡＺＴ；Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，９０５，０８２；６，２９４，５４０；６，４１７，１９１）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ（カムブジン－９及びＫ－９としてもまた公知）、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせ。Ｕ．Ｓ．特許出願公開Ｎｏ．２０１９／００２２１１５、２０１９／００５５２７３、２０１９／０１７７３２６、２０１９／０１８５５０８をもまた見よ。これらのＵ．Ｓ．特許、Ｕ．Ｓ．特許出願公開、及びＰＣＴ国際特許出願公開のそれぞれは、その全体が参照によって組み込まれる。それゆえに、いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は医薬組成物として調製される。本化合物を含む医薬組成物はその必要がある個体に多数の経路によって投与され、外用、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経真皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、外用、舌下、又は直腸経路を包含するが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の組成物を含む医薬組成物をもまた対象とする。より具体的には、かかる化合物は、当業者に公知の標準的な薬学的に許容される担体、フィラー、可溶化剤、及び安定化剤を用いて医薬組成物として製剤され得る。
本発明は、本明細書において開示される方法を実施するための適当な化合物、そのホモログ、断片、アナログ、又は誘導体の医薬組成物の使用をもまた包摂し、組成物は、少なくとも１つの適当な化合物、そのホモログ、断片、アナログ、又は誘導体及び薬学的に許容される担体を含む。
本発明を実施するために有用な医薬組成物は、１ｎｇ／ｋｇ／日及び１００ｍｇ／ｋｇ／日の間のドーズを送達するように投与され得る。本発明の方法に有用である医薬組成物は、経口固体製剤、眼、坐剤、エアロゾル、外用、又は他の類似の製剤によって全身投与され得る。適当な化合物に加えて、かかる医薬組成物は、薬学的に許容される担体及び薬物投与を増強及び容易化することが公知の他の成分を含有し得る。他の可能な製剤、例えばナノ粒子、リポソーム、リシール赤血球、及び免疫学系の系もまた、本発明の方法に従って適当な化合物を投与するために用いられ得る。
本発明は、活性成分として本明細書において開示される病状、障害、及び疾患の処置に有用な化合物を含む医薬組成物の調製及び使用をもまた包摂する。かかる医薬組成物は対象への投与に好適な形態の活性成分単独からなり得るか、又は医薬組成物は活性成分並びに１つ以上の薬学的に許容される担体、１つ以上の追加の成分、又はこれらの何らかの組み合わせを含み得る。当分野で周知である通り、活性成分は、生理学的に許容されるエステル又は塩の形態で、例えば生理学的に許容されるカチオン又はアニオンとの組み合わせで医薬組成物中に存在し得る。
本明細書において用いられる用語「生理学的に許容される」エステル又は塩は、組成物が投与されるべき対象にとって有害性ではない、医薬組成物のいずれかの他の成分と適合性である活性成分のエステル又は塩形態を意味する。
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知の又は今後開発されるいずれかの方法によって調製され得る。一般的には、かかる調製方法は、活性成分を担体又は１つ以上の他の補助的な成分と結び付け、それから、必要な又は望ましい場合には、産物を所望のシングル又はマルチドーズユニットへと成形又はパッケージングするステップを包含する。
本明細書において提供される医薬組成物の記載は主としてヒトへの医療投与に好適である医薬組成物を対象とするが、かかる組成物は全ての種類の動物への投与に一般的に好適であるということは当業者によって理解されるであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするためのヒトへの投与に好適な医薬組成物の改変は良く理解されており、通例の技能の獣医学薬理学者はかかる改変をせいぜい単に通例の実験作業によって設計し得、行い得る。
本発明の医薬組成物の投与が企図される対象は、ヒト及び他の霊長類、並びに商業的に大事な哺乳動物を包含する哺乳動物、例えば畜牛、育成豚、ウマ、ヒツジ、ネコ、及びイヌを包含するが、これらに限定されない。
本発明の方法に有用である医薬組成物は、経口、直腸、膣、非経口、外用、経肺、鼻腔内、バッカル、眼、髄腔内、又は別の投与経路に好適な製剤として調製、パッケージング、又は販売され得る。いくつかの実施態様では、組成物は眼部送達のために製剤される。他の企図される製剤は、有突起ナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有するリシール赤血球、及び免疫学系製剤を包含する。
本発明の医薬組成物は、バルクで、シングルユニットドーズとして、又は複数のシングルユニットドーズとして調製、パッケージング、又は販売され得る。本明細書において用いられる「ユニットドーズ」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量である。活性成分の量は、一般的には、対象に投与されるであろう活性成分の用量、又はかかる用量の便利な画分、例えばかかる用量の二分の一又は三分の一に等しい。
本発明の医薬組成物中の活性成分（単数又は複数）、薬学的に許容される担体（単数又は複数）、及びいずれかの追加の成分の相対量は、処置される対象のアイデンティティー、サイズ、及び状態に依存して、更に、組成物が投与されるべき経路に依存して変動するであろう。例として、組成物は０．１％及び１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は更に１つ以上の追加の薬学的に活性な薬剤を含み得る。特に企図される追加の薬剤は、制吐薬及びスカベンジャー、例えばシアニド及びシアネートスカベンジャーを包含する。
本発明の医薬組成物の制御放出又は徐放製剤が従来のテクノロジーを用いて作られ得る。経口投与に好適な本発明の医薬組成物の製剤は、個別的な固体投薬単位の形態で調製、パッケージング、又は販売され得、それぞれが所定の量の活性成分を含有する錠剤、ハードもしくはソフトカプセル、カシェ、トローチ、又はロゼンジを包含するが、これらに限定されない。経口投与に好適な他の製剤は、粉末状もしくは顆粒状製剤、水系もしくは油系懸濁液、水系もしくは油系溶液、又はエマルションを包含するが、これらに限定されない。
本明細書において用いられる「油系」液体は、炭素含有液体分子を含み、かつ水よりも極性でない性質を見せるものである。
経口投与に好適である本発明の医薬組成物の液体製剤は、液体形態で、又は使用に先立つ水もしくは別の好適な基剤による水戻しを意図される乾燥産物の形態でどちらかで、調製、パッケージング、及び販売され得る。
液体の懸濁液は、水系又は油系基剤による活性成分の懸濁を達成するための従来の方法を用いて調製され得る。水系基剤は例えば水及び等張生理食塩水を包含する。油系基剤は、例えばアーモンド油、油系エステル、エチルアルコール、野菜油、例えば落花生、オリーブ、胡麻、又はココナッツ油、分画野菜油、及び鉱油、例えば液体パラフィンを包含する。液体の懸濁液は１つ以上の追加の成分を更に含み得、懸濁剤、分散又は濡れ剤、乳化剤、粘滑薬、保存料、緩衝剤、塩、香味剤、着色料、及び甘味料を包含するが、これらに限定されない。油系懸濁液は更に増粘剤を含み得る。公知の懸濁剤は、ソルビトールシロップ、水素添加食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガム、及びセルロース誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを包含するが、これらに限定されない。
公知の分散又は濡れ剤は、天然に生起するホスファチド、例えばレシチン、脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの、又は脂肪酸及び無水ヘキシトールに由来する部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合産物（例えば、それぞれ、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を包含するが、これらに限定されない。
公知の乳化剤はレシチン及びアカシアを包含するが、これらに限定されない。公知の保存料は、パラヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、又はｎ－プロピル、アスコルビン酸、及びソルビン酸を包含するが、これらに限定されない。公知の甘味料は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース、及びサッカリンを包含する。油系懸濁液のための公知の増粘剤は例えば蜜蝋、固形パラフィン、及びセチルアルコールを包含する。
水系又は油系溶媒中の活性成分の液体の溶液は液体の懸濁液と実質的に同じ様式で調製され得る。一次的な違いは、活性成分が溶媒中に懸濁されるよりもむしろ溶解されるということである。本発明の医薬組成物の液体の溶液は、液体の懸濁液について記載されているコンポーネントのそれぞれを含み得る。懸濁剤は必ずしも溶媒中の活性成分の溶解を補助しないであろうということは理解される。水系溶媒は例えば水及び等張生理食塩水を包含する。油系溶媒は、例えばアーモンド油、油系エステル、エチルアルコール、野菜油、例えば落花生、オリーブ、胡麻、又はココナッツ油、分画野菜油、及び鉱油、例えば液体パラフィンを包含する。
本発明の医薬調製物の粉末状及び顆粒状製剤は公知の方法を用いて調製され得る。かかる製剤は対象に直接的に投与され得、例えば、錠剤を形成するために、カプセルを充填するために、又はそれへの水系もしくは油系基剤の追加によって水系もしくは油系懸濁液もしくは溶液を調製するために用いられる。これらの製剤のそれぞれは、更に、分散又は濡れ剤、懸濁剤、及び保存料の１つ以上を含み得る。追加の賦形剤、例えばフィラー及び甘味料、香味剤、又は着色料もまたこれらの製剤に包含され得る。
本発明の医薬組成物は、水中油型エマルション又は油中水型エマルションの形態でもまた調製、パッケージング、又は販売され得る。油相は、野菜油、例えばオリーブ又は落花生油、鉱油、例えば液体パラフィン、又はこれらの組み合わせであり得る。かかる組成物は、１つ以上の乳化剤、例えば天然に生起するガム、例えばアカシアガム又はトラガカントガム、天然に生起するホスファチド、例えば大豆又はレシチンホスファチド、ソルビタンモノオレエートなどの脂肪酸及び無水ヘキシトールの組み合わせに由来するエステル又は部分エステル、並びにエチレンオキシドとのかかる部分エステルの縮合産物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを更に含み得る。これらのエマルションは、例えば甘味料又は香味剤を包含する追加の成分をもまた含有し得る。
本発明の医薬組成物は、直腸投与、膣投与、非経口投与に好適な製剤としてもまた調製、パッケージング、又は販売され得る。
医薬組成物は、無菌注射用水系又は油系懸濁液又は溶液の形態で調製、パッケージング、又は販売され得る。この懸濁液又は溶液は公知技術に従って製剤され得、活性成分に加えて、追加の成分、例えば本明細書に記載される分散剤、濡れ剤、又は懸濁剤を含み得る。かかる無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒、例えば水又は例えば１，３ブタンジオールを用いて調製され得る。
他の許容される希釈剤及び溶媒は、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、及び不揮発性油、例えば合成のモノ又はジグリセリドを包含するが、これらに限定されない。有用である他の非経口投与可能な製剤は、活性成分を微結晶形態で、リポソーム調製物として、又は生分解性のポリマー系のコンポーネントとして含むものを包含する。徐放又はインプラントのための組成物は、薬学的に許容されるポリマー又は疎水性材料、例えばエマルション、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩を含み得る。
経口及び／又は経鼻投与にとって好適な製剤は、例えば約０．１％（ｗ／ｗ）ほども少しから１００％（ｗ／ｗ）ほども多くまでの活性成分を含み得、更に、本明細書に記載される追加の成分の１つ以上を含み得る。
本発明の医薬組成物は、バッカル投与に好適な製剤として調製、パッケージング、又は販売され得る。かかる製剤は、例えば従来の方法を用いて作られる錠剤又はロゼンジの形態であり得、例えば０．１から２０％（ｗ／ｗ）の活性成分であり得、残部は経口的に溶解可能な又は分解可能な組成物と任意に本明細書に記載される追加の成分の１つ以上とを含む。その代わりに、バッカル投与に好適な製剤は、活性成分を含む粉末又はエアロゾル化もしくは噴霧された溶液もしくは懸濁液を含み得る。かかる粉末状の、エアロゾル化された、又はエアロゾル化された製剤は、分散されるときには、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均粒径又は液滴径を有し、本明細書に記載される追加の成分の１つ以上を更に含み得る。
本明細書において用いられる「追加の成分」は次の１つ以上を包含するが、これらに限定されない：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味料；香味剤；着色料；保存料；生理学的に分解可能な組成物、例えばゼラチン；水系基剤及び溶媒；油系基剤及び溶媒；懸濁剤；分散又は濡れ剤；乳化剤、粘滑薬；緩衝剤；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；及び薬学的に許容されるポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬組成物に包含され得る他の「追加の成分」は当分野において公知であり、例えばレミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences），ジェンナーロ（Genaro）（編）（１９８５年）マック出版社，イーストン，ペンシルベニア，米国に記載されている。これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与され得る本発明の化合物の用量は、対象の体重のキログラム当たり１μｇから約１００ｇの量の範囲であるが、投与される正確な用量は、処置されようとする動物の型及び疾患状態の型、動物の年齢、並びに投与経路を包含するがこれらに限定されない多数の因子に依存して変動するであろう。１つの実施態様では、化合物の用量は動物の体重のキログラム当たり約１０μｇから約１０ｇまで変動するであろう。別の実施態様では、用量は対象の体重のキログラム当たり約１０ｍｇから約１ｇまで変動するであろう。
化合物は毎日数回ほども頻繁に対象に投与され得る。又は、それは、より頻繁でなく、例えば１日に1回、１週に1回、２週に1回、１ヶ月に1回、又は更にはより頻繁でなく、例えば数ヶ月に1回又は更には１年に1回、又はより少なく投与され得る。投薬の頻度は当業者には難なく明らかであり、例えば処置されようとする疾患の型及び重篤度、対象の型及び年齢などだがこれらに限定されない多数の因子に依存するであろう。
いくつかの実施態様では、本発明の組成物は追加の治療薬剤を包含する。これらは、いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、カスパーゼ－４、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化する。いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、サイクリックＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲの核酸及び抗体に基づく阻害剤は例えばＰＣＴ国際特許出願公開Ｎｏ．ＷＯ２０１９／０７４８８４に開示され、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ＩＩＩ．使用及び処置の方法
本明細書において開示される通り、インフラマソームを活性化するＳＩＮＥ－ＲＮＡを認識する細胞センサーはＤｄｘ１７として同定された。意外にも、ＳＩＮＥ－ＲＮＡとの結合によって、Ｄｄｘ１７は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３蛋白質、及びＣＡＲＤ含有アポトーシス関連スペック様蛋白質（ＡＳＣ）蛋白質の二重リクルート、次に下流の炎症カスケードを引き起こす。その上、ＳＩＮＥはＮＡＩＰとは独立してＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化した。これは細菌感染の際の古典的ＮＬＲＣ４インフラマソームに要求される。我々のデータは、Ｄｄｘ１７－ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３シグナル伝達がＡＭＤの進行した形態の地図状萎縮の臨床的及び病理学的ホールマークのＲＰＥ変性に寄与するということを示唆する。まとめると、我々の研究は、ＮＡＩＰとは独立のＳＩＮＥによって活性化される無菌性の非古典的ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路の第１の報告への新規の洞察を提供し、ＡＭＤの病理におけるＮＬＲＣ４インフラマソームの意外な役割をもまた記載する。
従って、本発明のいくつかの実施態様では、例えば黄斑変性、アルツハイマー病、ループスなどだがこれらに限定されない複数の疾患に関連付けられているＳＩＮＥ－ＲＮＡが、ＮＬＦＣ４インフラマソームを先には未知の様式で活性化するということが見出された。より具体的には、ＳＩＮＥ－ＲＮＡはＤＤＸ１７によって認識され、これはＮＬＲＣ４と相互作用し、先にはＮＬＲＣ４活性化に要求されると考えられていたＮＡＩＰとは独立のＮＬＲＣ４の活性化を提供する。本明細書に更に記載される通り、ＤＤＸ１７又はＮＬＲＣ４を標的化するｓｉＲＮＡは網膜変性を包含する細胞性炎症及び細胞死をブロックする。ＮＲＴＩ又はアルキル化ＮＲＴＩもまたＮＬＲＣ４活性化をブロックし、それゆえに、ＮＬＲＣ４の第１の低分子阻害剤かつ複数の疾患の薬物候補を表す。
よって、いくつかの実施態様では、本発明は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状を処置及び／又は防止するための方法に関する。本明細書において用いられる言い回し「ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状」は、その少なくとも１つの症状が直接的に又は間接的にどちらかでＮＬＲＣ５生物活性からもたらされ、かつ細胞及び／又は対象におけるその改善が本発明の組成物及び方法による細胞及び／又は対象の処置からもたらされ得るいずれかの疾患、障害、及び／又は病状を言う。ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する例示的な疾患、障害、及び／又は病状は、移植片対宿主病、慢性疼痛、増殖性硝子体網膜症、緑内障、関節リウマチ、多発性硬化症、双極性障害、大うつ病性障害、腎線維症、腎炎、肺線維症、ハンチントン病、骨粗鬆症、慢性リンパ性白血病、不安障害、肺結核、閉経後の女性及び骨折患者における骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス、慢性炎症性及び神経障害性疼痛、常染色体優性多発性嚢胞腎、脊髄損傷、アルツハイマー病、神経障害性疼痛、高血圧、静脈瘤、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、痛風、自己免疫性肝炎、グラフト血管損傷、動脈硬化、血栓症、メタボリックシンドローム、唾液腺炎症、外傷性脳損傷、虚血性心疾患、虚血性脳卒中、パーキンソン病、メラノーマ、神経芽腫、前立腺、乳、皮膚、及び甲状腺癌、早期管状腺胃癌、神経内分泌癌、ムコイド結腸癌、結腸癌；高異型度尿路上皮癌、淡明型腎細胞癌、未分化卵巣癌、乳頭嚢胞内乳癌、グラム陰性敗血症、感染性緑膿菌、ビブリオコレラ、レジオネラｓｐｐ．、フランシセラｓｐｐ．、リーシュマニアｓｐｐ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びクラミジアｓｐｐ．、クライオピリノパチー；角膜炎、尋常性ざ瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、インスリン抵抗性、肥満、溶血性尿毒症症候群、ポリオーマウイルス感染、免疫複合体型腎疾患、急性腎障害、ループス腎炎、家族性寒冷自己炎症性症候群、マックル・ウェルズ症候群及び小児多臓器系炎症性疾患、慢性乳児神経皮膚関節自己炎症性疾患、腎虚血灌流障害、糸球体腎炎、クリオグロブリン血症、全身性血管炎、ＩｇＡ腎症、マラリア、寄生蠕虫、敗血症性ショック、アレルギー性喘息、枯草熱、慢性閉塞性肺疾患、薬剤性肺炎症、接触皮膚炎、らい病、バークホルデリア・セノセパシア感染、呼吸器合胞体ウイルス感染、乾癬、強皮症、反応性関節炎、嚢胞性線維症、梅毒、シェーグレン症候群、炎症性関節疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、心臓手術（周術期／術後炎症）、急性及び慢性臓器移植拒絶、急性及び慢性骨髄移植拒絶、並びに腫瘍血管新生を包含するが、これらに限定されない。ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する特定の疾患、障害、及び／又は病状は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である。
本発明のいくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状を処置及び／又は防止するための方法は、ＮＲＴＩを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る組成物をその必要がある対象に投与することを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。投与することは、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性を減縮するための有効な量及び経路によってであり、それによって、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止する。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の特定の実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状は網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患であり、これはいくつかの実施態様では加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮を包含し得る。
類似に、いくつかの実施態様では、本発明は、細胞のＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するための方法に関する。いくつかの実施態様では、方法は、ＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲＰ３遺伝子産物の複合体をＮＲＴＩを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させることを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。それによって、ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化が細胞において阻害される。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の方法のいくつかの実施態様では、細胞は、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する。
加えて、いくつかの実施態様では、本発明はＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害するための方法に関する。これらは、いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲＰ３遺伝子産物の複合体をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させることを含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。それによって、細胞からのＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が阻害される。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本発明の方法のいくつかの実施態様では、細胞は、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する。
いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化及び／又はＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出は、ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性と関連する疾患、障害、及び／又は病状と関連する。いくつかの実施態様では、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性と関連する疾患、障害、及び／又は病状は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患、任意に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である。
加えて、いくつかの実施態様では、本発明は、対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害するための方法に関する。これらは、いくつかの実施態様では、対象の細胞のＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲＰ３遺伝子産物の複合体をヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させることを含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。それによって、細胞からのＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が阻害される。いくつかの実施態様では、ＮＲＴＩは、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、細胞はＲＰＥ細胞であり、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する（that present）。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、ＲＰＥを分解から保護するように設計された少なくとも１つの追加の処置を対象に施すことを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
それゆえに、かつ当業者によって理解されるであろう通り、いくつかの実施態様では、本発明の組成物及び方法は組み合わせ治療の一部であり、処置されるべき疾患、障害、及び／又は病状に依存して、ＮＲＴＩ処置以外の適当な治療が使用される。限定ではなく例として、いくつかの実施態様では、本発明の方法は、更に、その必要がある対象にＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤を投与することを含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。いくつかの実施態様では、少なくとも１つの追加の阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及び抗体又はその抗原結合断片からなる群から選択される。本発明の組成物及び方法に使用され得るｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡが本明細書において上で開示され、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、ＣＧＡＳ、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化する核酸を包含し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
いくつかの実施態様では、少なくとも１つの追加の処置は、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施態様では、阻害剤は短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－ｌ、ｃＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る。
いくつかの実施態様では、阻害剤は抗体又はその抗原結合断片であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ｃＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する。ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ｃＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲ遺伝子産物に結合する抗体及びそれらの断片は、当分野で公知の方法を用いて容易に産生され得る（例えば、ハーラン（Harlan）＆レーン（Lane），１９８８年を見よ）。代替的に又は加えて、これらの遺伝子産物に結合する抗体及びそれらの抗原結合断片は、Ａｂｃａｍ（ケンブリッジ、英国）、サンタクルーズバイオテクノロジー社（サンタクルーズ、カリフォルニア、米国）、シグマアルドリッチ（セントルイス、ミズーリ、米国）、及び他を包含するがこれらに限定されないソースから商業的に利用可能である。
ここで、本発明の代表的な実施態様が示される付随する例を参照して、本発明が以降でより詳しく記載される。しかしながら、本発明は異なる形態で実施され得、本明細書において提出される実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に詳しく伝えるようにして提供される。
実施例１
ＳＩＮＥ－ＲＮＡはＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を誘導する
先の研究は、サルモネラ暴露に応答したＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化が、その活性化のための２つのステップ、ＮＬＲＣ４のＳｅｒ５３３残基のリン酸化とＮＬＲＣ４のＮＡＩＰによって媒介されるオリゴマー化とを要求するということを示している。イムノブロットは、ヒトＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）並びにマウスＢ１（配列番号８７）及びＢ２（配列番号８８）ＲＮＡがＢＭＤＭにおいてＳ５３３のＮＬＲＣ４リン酸化を誘導するということを明らかにした。注記すべきことに、長鎖ｄｓＲＮＡミメティックポリ（Ｉ：Ｃ）はＮＬＲＣ４リン酸化を誘導しなかった（図１）。その上、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによる処置はインフラマソーム活性化の指標のカスパーゼ－１ｐ２０切断を誘導した（図２）。この研究における爾後の実験には、我々はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）をＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化するための刺激として用いた。今日まで、２つのキナーゼがＮＬＲＣ４をＳ５３３でリン酸化することが報告されている：蛋白質キナーゼＣデルタ（ＰＫＣδ）及びロイシンリッチリピート含有キナーゼ－２（ＬＲＲＫ２）である。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化におけるこれらのキナーゼの役割を探求するために、我々はＢＭＤＭをそれぞれＬＲＲＫ２（ＧＳＫ２５７８２１５Ａ、ＧＳＫ）及びＰＫＣδ（ロットレリン、Ｒｏｔ）の薬理学的阻害剤によって前処置した。ＧＳＫではなくロットレリンは、ＮＬＲＣ４のＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるリン酸化とカスパーゼ－１活性化とをＢＭＤＭにおいて阻害し（図２）、ＬＲＲＫ２ではなくＰＫＣδがこのプロセスに関わるということを示唆した。
活性化したＮＬＲＣ４インフラマソームは、高分子質量マルチ蛋白質複合体へとアセンブリすることによってオリゴマー化を経過する。我々は、ＢＭＤＭのＳＩＮＥ－ＲＮＡ処置に応答したＮＬＲＣ４及びアポトーシススペック（ＡＳＣ）様蛋白質複合体のインサイチュのアセンブリを第１に検討した。免疫蛍光研究は、モック処置された細胞と比較して、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって処置されたＢＭＤＭにおける増大したＮＬＲＣ４及びＡＳＣスペックを示す（図３Ａ）。ＮＬＲＣ４インフラマソームアセンブリを評価するために、ＷＴ及びＮＬＲＣ４ＫＯのＢＭＤＭ細胞をＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置した。スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）によって架橋されたライセートを変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分析してＡＳＣオリゴマーを検出し、細胞ライセートをネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ネイティブ－ＰＡＧＥ）を用いて分析してＮＬＲＣ４オリゴマー化を検出した。イムノブロットは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がＡＳＣオリゴマーの形成をＮＬＲＣ４に依存的に誘導し（図３Ｂ）、典型的な大きいオリゴマーＮＬＲＣ４複合体がＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導される（図４）ということを明らかにした。ＮＬＲＣ４／ＡＳＣオリゴマー化はプロカスパーゼ－１からその活性形態ｐ２０への切断及びＩＬ－１β放出に必須である。有意に、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるカスパーゼ－１の活性化及びＩＬ－１β放出は、ＮＬＲＣ４ＢＭＤＭにおいて損なわれた（図５Ａ及び５Ｂ）。総体的に、これらのデータは、リン酸化、オリゴマー化、及びＥＬＩＳＡアッセイによってモニタリングされる通り、ＳＩＮＥ－ＲＮＡがマウスＢＭＤＭにおけるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を誘導するということを実証し、ＰＫＣδがＮＬＲＣ４リン酸化を担うキナーゼであるということを示唆する。
実施例２
ＤＤＸ１７はＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化に要求される
次に、我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を担うセンサーを同定することを求めた。我々は架橋免疫沈降（ＣＬＩＰ）－質量分析を使用してＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の蛋白質相互作用パートナーを明らかにした。爾後に、ＤＤＸ５及びＤＤＸ１７を可能性としてのＡｌｕＲＮＡ相互作用パートナーとして同定した（図６Ａ及び６Ｂ）。免疫局在研究は、ＷＴマウスＢＭＤＭにおけるビオチン標識ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）及びＤＤＸ１７の重ね合わせを示している（図７）。次に、我々は、ＤＤＸ１７がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）と相互作用するかどうかをＣＬＩＰアッセイを用いて検討した。我々はＭｙｃタグ付きＤＤＸ１７をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、爾後にそれらをビオチン標識ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置し、それらをＵＶ架橋に付した（図８Ａ）。ノーザンブロッティングによって検出される通り、抗ストレプトアビジン（図８Ｂ）又はＭｙｃ抗体（図８Ｃ）による細胞ライセートの免疫沈降はビオチン標識ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）をプルダウンした。ｍｙｃのイムノブロット及びＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）のノーザンブロッティングは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がＤＤＸ１７と相互作用するということを示した（図８Ｃ）。次に、我々はＤＤＸ１７がＮＬＲＣ４と相互作用するという仮説を試験した。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたマウスＢＭＤＭでは、免疫蛍光研究はＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の共局在を明らかにした（図９）。ＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の間の物理的相互作用が、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたＨＥＫ２９３細胞において、ＦＬＡＧ－ＮＬＲＣ４発現系及び免疫沈降を用いて同定された（図１０）。
次に、我々は、ＤＤＸ５又はＤＤＸ１７が、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化のセンサーであるかどうかを検査した。ＤＤＸ５及びＤＤＸ１７の配列の類似性の高い度合いを原因として、我々はＤＤＸ５単独、ＤＤＸ１７単独、又はＤＤＸ５及びＤＤＸ１７両方を標的化する３つのｓｉＲＮＡを設計し、それらの標的効率をＴＨＰ１細胞において確認した（図１１Ａ）。ＤＤＸ５／１７ｓｉＲＮＡ及びＤＤＸ１７ｓｉＲＮＡ両方は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置された細胞におけるカスパーゼ－１切断を縮減したが、ＤＤＸ５ｓｉＲＮＡはそうしなかった（図１１Ａ）。最近の証拠は、ＤＤＸ５及びＤＤＸ１７がコアＲＮＡ特異的エンドリボヌクレアーゼＤｒｏｓｈａと併せてｍｉＲＮＡマイクロプロセシングに関わるということを示唆している。よって、我々はＤｒｏｓｈａもまたＳＩＮＥ－ＲＮＡ－ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４軸に関わるかどうかを試験した。そこで、我々はｓｉＤｒｏｓｈａ又はｓｉＤＤＸ１７又はｓｉ対照をモック又はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたＴＨＰ１細胞においてトランスフェクションし、カスパーゼ－１活性化をイムノブロットによって検査した。ｓｉＤＤＸ１７はカスパーゼ－１のレベルを阻害したが（図１１Ｂ）、ｓｉＤｒｏｓｈａはしなかった。これらの観察は、ＤＤＸ１７によって媒介されるＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームがマイクロプロセッサ機能に非依存的であるということを関連付けている。
それから、我々は、ｓｉＤＤＸ１７がＴＨＰ１細胞におけるＡＳＣオリゴマー化及びＩＬ－１β放出をもまた阻害し得るかどうかを検査した。イムノブロットは、ｓｉ対照及びｓｉＤＤＸ５と比較して、ｓｉＤＤＸ１７のみがＡＳＣオリゴマーの形成を防止するということを明らかにした（図１２Ａ）。ＥＬＩＳＡ読み出しは、ｓｉＤＤｘ５／対照と比較して、ＩＬ－βがｓｉＤＤＸ１７及びｓｉＤＤＸ５／１７では有意に縮減されたということを示している（図１２Ｂ）。全てのこれらのデータは、ＤＤＸ１７がＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化のセンサーであるということを示唆する。ＤＤＸ１７がＮＬＲＣ４のセンサーであるということを更に確認するために、我々は、それぞれＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）又はモック処置されたＴＨＰ１細胞及びＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭにおいて、イムノブロットによるカスパーゼ－１切断及びＥＬＩＳＡによるＩＬ－１β分泌を検討した。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたＷＴ細胞と比較して、カスパーゼ－１はＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭでは有意に縮減された；図１３Ａ）。更にその上、ＩＬ－１βのレベルはＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭ及びｓｉＤＤＸ１７、ｓｉＤＤＸ５／１７トランスフェクションＴＨＰ１細胞では有意に阻害され、ＮＬＲＣ４のセンサーとしてのＤＤＸ１７の根拠を更に提供した（図１３Ｂ）。
我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答及び炎症プライミングをＢＭＤＭにおいて誘導するということを先に報告した。ＤＤＸ１７はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるインフラマソーム活性化に必須であるので、我々はＤＤＸ１７ノックダウンがＩ型ＩＦＮ応答などのインフラマソームカスケードの下流事象に影響し得るかどうかを試験した。カスパーゼ－１、ＣＸＣＬ１０、ＩＦＮβ、ＩＬ－１８、及びＩＬ－１β遺伝子の発現は、カスパーゼ－１を例外としてＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）による処置に応答して上方制御された。ＤＤＸ１７ｓｉＲＮＡはこれらの遺伝子の発現レベルに影響しなかった（図１４Ａ及び１４Ｂ）。
最後に、我々は、ＤＤＸ１７がＮＡＩＰを要求するフラジェリンによる従来のＮＬＲＣ４活性化とＬＰＳ＋ＡＴＰ依存的なＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化とに役割を有するかどうかを検査した。我々はマウスＢＭＤＭをフラジェリン又はＬＰＳ＋ＡＴＰによって処置し、ｓｉＤＤＸ１７によってトランスフェクションし、ＮＬＲＣ４又はＮＬＲＰ３依存的なカスパーゼ－１切断を検査した。イムノブロットは、無変化のカスパーゼ－１レベルによって指示される通り、ＤＤＸ１７ノックダウンが、それぞれフラジェリン及びＬＰＳ＋ＡＴＰによって誘導されるＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３インフラマソームに影響しないということを示している（図１５）。これらのデータは、ＤＤＸ１７が、フラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４及びＬＰＳ＋ＡＴＰのＮＬＰ３インフラマソームには関わっていないという考えを支持する。
実施例３
ＮＡＩＰではなくＮＬＲＰ３がＡｌｕＲＮＡによって誘導されるＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４活性化に要求される
次に、我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＤＤＸ１７が可能性としてＮＬＲＣ４以外のＮＬＲと相互作用し得るかどうかを検討した。免疫沈降タンデム質量分析は、モック処置されたＤＤＸ１７と比較して、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＤＤＸ１７がＮＬＲＰ３ペプチドともまた相互作用するということを同定した（表３及び４を見よ）。そこで、我々は、ＤＤＸ１７とのＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の相互作用がＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３インフラマソーム両方をリクルートし得るかどうかを試験した。我々はＷＴ及びＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭをＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置し、ＮＬＲＰ３を免疫沈降してＮＬＲＣ４発現について検査した。イムノブロットは、ＮＬＲＣ４がＤＤＸ１７ＫＯではなくＷＴのＢＭＤＭのみで発現されるということを明らかにし、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）及びＤＤＸ１７複合体がＮＬＲＰ３及びＮＬＲＣ４インフラマソームをリクルートするということを示唆した（図１６）。次に、我々は、ＮＬＲＣ４活性がＮＬＲＰ３－ＡＳＣ相互作用にとって機能的に大事かどうかを問うた。我々はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたＷＴ及びＮＬＲＣ４ＫＯのＢＭＤＭにおいてＡＳＣを免疫沈降し、ＮＬＲＰ３発現を検査した。イムノブロットは、ＮＬＲＰ３発現がＮＬＲＣ４ＫＯのＢＭＤＭでは完全に阻害されるということを明らかにし、ＮＬＲＰ３－ＡＳＣ相互作用がＮＬＲＣ４の不在下において阻害されるということを示唆した（図１７Ａ）。更にその上、ＡＳＣ単量体及び二量体は、ＮＬＲＰ３又はＡＳＣＫＯのＢＭＤＭではなくＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置されたＷＴのＢＭＤＭでのみ現れた（図１７Ｂ）。次に、我々はＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるインフラマソームにおけるＮＬＲＰ３の機能的な役割を評価した。ＷＴ及びＮＬＲＰ３ＫＯのＢＭＤＭをモック又はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置に付して、ＮＬＲＣ４、カスパーゼ－１、及びＩＬ－１βレベルを検査した。イムノブロットの結果は、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるインフラマソームが、ＮＬＲＣ４発現に影響することなしにＮＬＲＰ３ＫＯのＢＭＤＭにおいてブロックされるということを示している（図１８Ａ）。類似に、ＩＬ－１βレベルはＷＴのＢＭＤＭと比較してＮＬＲＰ３ＫＯでは有意に阻害された（図１８Ｂ）。これらのデータは、ＮＬＲＰ３がＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームに要求されるが、必須ではないということを示唆する。
Figure 2022550670000004
Figure 2022550670000005
蛋白質のＮＡＩＰファミリーは、専用の病原体センサーとして作用することによってＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を促すように機能する。先の研究は、マウスＮＡＩＰがＮＬＲＣ４及び細菌リガンドとの複合体を形成してインフラマソームを活性化するということを示した。例えば、ＮＡＩＰ５及びＮＡＩＰ２はＮＬＲＣ４及びそれぞれサルモネラ種のフラジェリン又はＴ３ＳＳコンポーネントとの複合体を形成する。後の研究は、ＮＡＩＰ５に類似に、ＮＡＩＰ６もまたフラジェリンを認識し得るが、ＮＡＩＰ１はＴ３ＳＳ蛋白質ＰｒｇＩに応答してＮＬＲＣ４を活性化するということを明らかにした。しかしながら、ヒトでは、１コピーのＮＡＩＰのみが存在し、これによってＮＬＲＣ４が活性化される。それゆえに、ＮＡＩＰはマウス及びヒトにおけるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化に必須である。ゆえに、我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４活性化がＮＡＩＰ依存的であるかどうかを決定することを求めた。第１に、我々は、ＮＡＩＰ１～６ＫＯマウス細胞を用いて、ＮＡＩＰを要求するフラジェリンによるＮＬＲＣ４によって媒介されるカスパーゼ－１活性化を検査した。先の研究と整合して、ＮＡＩＰ１～６ＫＯマウスから単離されたＢＭＤＭは、切断されたカスパーゼ－１産物（ｐ２０サブユニット；図１９Ａ）の有意な阻害によって証明される通り、フラジェリンによって刺激されたときにＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化することに失敗した。文献で報告されている知見に類似に、ＥＬＩＳＡによって見積もられるＩＬ－１βレベルもまたＮＡＩＰ１～６ＫＯ細胞では有意に縮減された（図１９Ａ）。
それから、我々は、ＷＴ及びＮＡＩＰ１～６ＫＯマウスから収穫されたＢＭＤＭにおいて、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化の違いがあるかどうかを検査した。イムノブロットはＮＬＲＣ４リン酸化がＮＡＩＰ１～６ＫＯマウスでは阻害されないということを明らかにし、ＮＡＩＰがＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４活性化には関わらずにあり得るということを指示した（図１９Ｂ）。次に、我々はＣ５７ＢＬ／６ＪのＷＴ、ＮＬＲＣ４ＫＯ、及びＮＡＩＰ１～６ＫＯのＢＭＤＭをＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって処置し、カスパーゼ－１活性化をウエスタンブロッティングによってモニタリングした。興味深いことに、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるカスパーゼ－１切断はＮＡＩＰ１～６ＫＯのＢＭＤＭではブロックされず（図１９Ｂ）、ＡｌｕＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化がＮＡＩＰ非依存的であるということを示唆する。ＡｌｕＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４活性化がＮＡＩＰ非依存的であるということを更に確認するために、我々はＷＴ及びＮＡＩＰ１～６ＫＯのＢＭＤＭをＳＩＮＥ－ＲＮＡによって処置し、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－１β分泌を検査した。ＩＬ－１β分泌はＳＩＮＥ－ＲＮＡ処置に応答して阻害されなかった（図１９Ｂ）。まとめると、我々の結果は、ＡｌｕＲＮＡを新規のＮＡＩＰ非依存的な非古典的ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路の引き金として導入する。
我々は、ＤＩＣＥＲ欠損によって媒介されるＡｌｕＲＮＡの蓄積がＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を誘導するということを先に示した。そこで、我々はＤＩＣＥＲノックダウンがＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３シグナル伝達をもまた誘導し得るかどうかを検査した。ＷＴ及びＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭをｓｉＤＩＣＥＲによってトランスフェクションして、ＮＬＲＣ４リン酸化及びカスパーゼ－１を検査した。イムノブロットデータは、ｄｉｃｅｒ欠損がＷＴにおいてはＮＬＲＣ４のリン酸化及びカスパーゼ－１活性化を誘導し、これがＤＤＸ１７ＫＯのＢＭＤＭではブロックされるということを示している（図２０Ａ）。それから、我々は、ＮＬＲＣ４のリン酸化及びカスパーゼ－１活性化をＷＴ、ＮＬＲＣ４ＫＯ、及びＮＬＲＰ３ＫＯのＢＭＤＭにおいてｓｉＤＩＣＥＲ又はｓｉ対照によるトランスフェクション後に決定した。ＮＬＲＣ４のリン酸化はＷＴ又はＮＬＰＲ３ＫＯのＢＭＤＭではなくＮＬＲＣ４ＫＯのみでブロックされる（図２０Ｂ）。更にその上、ｓｉＤＩＣＥＲは、ＷＴのＢＭＤＭにおけるカスパーゼ－１の活性化を誘導した。これはＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３ＫＯのＢＭＤＭではブロックされる（図２０Ｂ）。全てのこれらのデータは、ＤＤＸ１７－ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３シグナル伝達がＤＩＣＥＲノックダウンによって誘導されるインフラマソーム活性化に要求されるという見解を支持する。
実施例４
加齢黄斑変性の治療標的としてのＤＤＸ１７によって媒介される非古典的ＮＬＲＣ４－ＮＬＲＰ３インフラマソーム
次に、我々はＧＡのヒト眼がＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４を発現するかどうかを試験した。イムノブロットは、対照の眼と比較して、ＧＡの眼のＲＰＥ／脈絡膜におけるＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４の豊富さを明らかにした（図２１Ａ及び２１Ｂ）。ＤＤＸ１７はＮＬＲＣ４とインビトロで相互作用したので、我々はこれがＡＭＤの患者にもまた当てはまるかどうかを検討した。ＰＬＡアッセイをヒトＡＭＤ組織に用いて、我々は、健康な対照と比較して、ＮＬＲＣ４がＤＤＸ１７と相互作用するということを発見した（図２２）。まとめると、これらのデータは、ＢＭＤＭ及びＴＨＰ１細胞培養研究における機能的データを映して、ヒトＧＡへのＮＡＩＰ及びＮＬＲＣ４の関わりの証拠を提供する。
我々は、ＤＩＣＥＲ１喪失を原因とするＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）の蓄積がマウス及びヒトにおいてＮＬＲＰ３インフラマソームを活性化し、カスパーゼ－１依存的な様式でＲＰＥ変性を引き起こすということを先に確立した。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）はマウスＢＭＤＭにおいてＮＬＲＣ４を活性化するので、我々は、次に、ＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化がマウスにおけるＲＰＥ変性を誘導し得るかどうかを検査するためのインビボ実験を行なった。我々は、恒常的に活性なＮＬＲＣ４の強制発現がマウスにおいてＲＰＥ変性を誘導し得るかどうかを試験した。ｐＮＬＲＣ４ＷＴ－ＩＲＥＳ－ＧＦＰではなく、恒常的に活性であるｐＮＬＲＣ４Ｔ３３７５－ＩＲＥＳ－ＧＦＰの網膜下注射は、ＷＴマウスにおいてＲＰＥ変性を誘導した（図２３Ａ及び２３Ｂ）。
次に、我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がヒトＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化の引き金ともまたなるかどうかを問うた。我々は免疫蛍光染色実験を行なって、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）がヒトＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４スペック形成を誘導し得るかどうかを検査した。我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置に応答したヒトＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４のスペックに似ている斑点構造に気づいた（図２４Ａ）。更にその上、モックトランスフェクション細胞と比較して、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によってトランスフェクションされたヒトＲＰＥ細胞はＮＬＲＣ４オリゴマーの形成を誘導した（図２４Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって活性化されるＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４シグナル伝達経路の存在を実証している。我々は、更に、カスパーゼ－１切断に関わる決定的ステップのＮＬＲＣ４によって誘導されるＡＳＣオリゴマー化を研究することによって、ＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化の下流事象を検討した。ＮＬＲＣ４ｓｉＲＮＡは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）と併用投与されたときに、インビトロのＡＳＣオリゴマー化（図２５Ａ）及びインビボのＲＰＥ変性（図２５Ｂ）をブロックした。
最後に、我々は、ＮＬＲＣ４インフラマソームに干渉することが、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＲＰＥ変性をブロックするかどうかを検討することを求めた。我々は、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）又はＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）＋ｓｉＤＤＸ１７をＷＴ又はＮＬＲＣ４ＫＯ又はＮＡＩＰ１～６ＫＯマウスにおいて網膜下送達し、先に記載された通り眼底写真及びＺＯ－１染色を用いてＲＰＥ変性について検査した。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）はＲＰＥ変性をＷＴ及びＮＡＩＰ１～６ＫＯマウスにおいてのみ誘導し、ＮＬＲＣ４ＫＯ及びｓｉＤＤＸ１７注射マウスはこの表現型からレスキューされた。ＮＬＲＣ４インフラマソームシグナル伝達に干渉することが、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＲＰＥ変性をブロックするということを示唆している（図２６）。
実施例５
ＮＲＴＩはＮＬＲＣ４インフラマソームによって誘導されるＲＰＥ変性をブロックする
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）はレトロウイルス複製を阻害するＨＩＶ治療薬である。我々は、ＮＲＴＩが、内在性のレトロエレメントＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によるＰ２Ｘ７によって媒介されるＮＬＲＰ３インフラマソーム活性化を阻害するということを先に示した。ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によるＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化はＡＭＤの重篤な形態の地図状萎縮における網膜色素上皮（ＲＰＥ）の死を引き起こす。我々は、ＮＲＴＩ（Ｄ４Ｔ及びＡＺＴ）の腹腔内投与が、マウスにおけるＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性を防止するということを先に報告した。現行では、複数のＮＬＲＰ３インフラマソーム阻害剤、例えばＭＣＣ９５０、ＣＹ０９が利用可能である。しかしながら、ＮＬＲＣ４の阻害剤はない。そこで、ＮＬＲＣ４によって駆動される疾患を研究するためのＮＬＲＣ４インフラマソームの阻害剤を開発する必要が存在する。ここで、我々は、ＮＲＴＩがフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをブロックするということを初めて示す。我々はフラジェリントランスフェクションされたＢＭＤＭをＤＴ４及び３ＴＣによって前処置して、カスパーゼ－１活性化を検査した。イムノブロット研究は、対照と比較して、Ｄ４Ｔ及び３ＴＣがフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化をブロックするということを示している（図２７）。その上、我々は３ＴＣによって処置されたときのカスパーゼ－１活性化の用量依存的阻害を見た（図２８）。一緒になって、全てのこれらのデータはＮＲＴＩがＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化をブロックするということを示唆する。
ＮＬＲＣ４オリゴマー化は、高分子質量のＮＬＲＣ４蛋白質複合体がアセンブリされるインフラマソーム活性化の別のホールマークである。そこで、我々は次に３ＴＣがフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４オリゴマー化をもまたブロックし得るかどうかを検査した。３ＴＣによって前処置されたＢＭＤＭをフラジェリンによってトランスフェクションし、細胞ライセートをネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ネイティブＰＡＧＥ）を用いて分析して、ＮＬＲＣ４オリゴマー化を検出した。イムノブロットは、フラジェリンが対照ではＮＬＲＣ４オリゴマーを誘導し、これが３ＴＣによって用量依存的に阻害されるということを明らかにし、ＮＲＴＩがフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソームをブロックするということを示唆した（図２９）。更にその上、活性化したＮＬＲＣ４インフラマソームはＩＬ－１βサイトカインの産生を誘導する。そこで、我々は、３ＴＣがフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４依存的なＩＬ－１β産生をもまたブロックし得るかどうかを検査した。イムノブロットデータは、ＩＬ－１β産生がフラジェリントランスフェクションＢＭＤＭでは用量依存的な様式で３ＴＣによって阻害されるということを示している（図３０）。次に、我々はＡＺＴ及び３ＴＣを修飾して２－エチルＡＺＴ（Ｋ８）及び３－メチル３ＴＣ（Ｋ９）を生成し、フラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４依存的なカスパーゼ－１活性化をブロックするそれらの能力を試験した。イムノブロットの結果は、対照と比較して、Ｋ８及びＫ９がフラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化をブロックしたということを示している（図３１）。まとめると、全てのこれらのデータは、ＮＲＴＩ及び修飾ＮＲＴＩがＮＬＲＣ４インフラマソームの活性化を阻害するということを示唆する。
最後に、我々はＮＲＴＩがＮＬＲＣ４インフラマソームを阻害するメカニズムを検討することを求め、これがＮＬＲＰ３依存的であるかどうかを問うた。我々はＷＴ及びＮＬＲＰ３ＫＯのＢＭＤＭをフラジェリンによってトランスフェクションして、イムノブロットを用いてカスパーゼ－１活性化を検査した。フラジェリンによって誘導されるカスパーゼ－１活性化はＮＬＲＰ３欠損ＢＭＤＭではブロックされ、ＮＬＲＣ４活性化がＮＬＲＰ３依存的であるということを示唆する（図３２）。ＮＲＴＩの作用機序を更に確認するために、我々は、それらが直接的にＮＬＲＰ３／ＮＬＲＣ４複合体に結合するかどうかを再構成系において検討した。我々は、フラジェリントランスフェクションＢＭＤＭを遊離及びビオチン標識Ｄ４Ｔ及びＡＺＴによって処置し、ビオチンをプルダウンした。イムノブロットは、Ｄ４Ｔ及びＡＺＴがＮＬＲＰ３及びＮＬＲＣ４と相互作用するということを明らかにし、それらの作用機序を更に確認した（図３３）。要約すると、全てのこれらのデータは、ＮＲＴＩが、ＮＬＲＰ３／ＮＬＲＣ４複合体に直接的に結合することによってフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４活性化を阻害するということを示唆する。
実施例６
ＰＫＣδ阻害はＮＬＲＣ４リン酸化及びＡｌｕＲＮＡによって誘導されるカスパーゼ－１活性化をブロックする
野生型ＢＭＤＭを、指示されているドーズのＰＫＣδ阻害剤ロットレリン（シグマアルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ、米国）及びＬＲＲＫ２阻害剤ＧＳＫ２５７８２１５Ａ（シグマアルドリッチ）によって１時間に渡って前処置し、それから、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクション（１００ｐｍｏｌ）によって刺激した。上清及び細胞ライセートをカスパーゼ－１切断及びｐ－ＮＬＲＣ４ブロットのために収集した。結果は、ＰＫＣδ阻害剤がＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＮＬＲＣ４リン酸化及びカスパーゼ－１活性化を阻害するということを指示した。
実施例７
ＰＫＣδ及びＮＬＲＣ４リン酸化（Ｓ５３３）はＡｌｕＲＮＡによって誘導されるインフラマソーム活性化に要求される
野生型、Ｐｒｋｃｄ－／＋、及びＰｒｋｃｄ－／－ＢＭＤＭをＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって１２時間に渡ってトランスフェクションした。カスパーゼ－１、ＩＬ－１β切断、及びＩＬ－１β放出を測定するために、上清を収集した。細胞ライセートをｐ－Ｎｌｒｃ４、Ｎｌｒｃ４、ＰＫＣδ、及びアクチンブロットのために収集した。図３４A及び３４Bに提示されている結果は、カスパーゼ－１、ＩＬ－１β切断、及びＩＬ－１β放出がＰｒｋｃｄ－／－ＢＭＤＭにおいて損なわれるということを示した。
野生型及びＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡＢＭＤＭをＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって１２時間に渡ってトランスフェクションした。ＥＬＩＳＡによってＩＬ－１β放出を測定するために、上清を収集した。図３４Ｃに示されている結果は、ＩＬ－１β放出がＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡＢＭＤＭにおいて損なわれるということを指示した。
実施例８
ＰＫＣδによって媒介されるＮＬＲＣ４リン酸化は、ＡｌｕＲＮＡによって誘導されるＲＰＥ変性に要求される
野生型、Ｐｒｋｃｄ－／－、及びＮｌｒｅ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３ＡマウスにＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）を網膜下注射した。眼底画像及びＺＯ－１蛍光画像が図３５Ａ及び３５Ｂに提示されている。示されている通り、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）によって誘導されるＲＰＥ変性はＰｒｋｃｄ－／－及びＮｌｒｃ４Ｓ５３３Ａ／Ｓ５３３Ａマウスではブロックされた。
実施例９
ＡｌｕＲＮＡはヒト細胞におけるＤＤＸ１７移行を誘導する
ヒト単球（ＴＨＰ－１）をＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって処置した。細胞ライセートを収集し、細胞分画に付した。ＤＤＸ１７及びヒストンＨ３のイムノブロットを用いてＤＤＸ１７の細胞内分布を評価した。図３６に示されている通り、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）処置は核から細胞質へのＤＤＸ１７移行を誘導し、ＤＤＸ１７はサイトゾルＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）と共局在した。
実施例１０
ＡｌｕＲＮＡはＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリを誘導する
ヒトＲＰＥ細胞をビオチン化ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６、１００ｐｍｏｌ）によって処置した。ＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリを近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によって評価した。結果は図３７に提示されている。これは、ＡｌｕＲＮＡ（配列番号８６）トランスフェクションがヒトＲＰＥ細胞におけるＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３複合体のアセンブリを誘導するということを示した。
実施例１１
ＤＤＸ１７の発現はドライＡＭＤのヒトドナー眼のＲＰＥにおいて増大している
ＤＤＸ１７及びＮＬＲＣ４蛋白質の発現を免疫組織化学によってドライＡＭＤのヒトドナー眼において測定した。結果は図３８Ａ及び３８Ｂに提示されている。そこに示されている通り、ＤＤＸ１７の発現はドライＡＭＤのヒトドナー眼のＲＰＥでは増大していた。
実施例の考察
ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有（ＮＬＲＣ）４は上皮及び自然免疫細胞によって発現されるサイトゾル蛋白質である。ＮＬＲＣ４蛋白質はアポトーシススペック様蛋白質及びカスパーゼ－１と共にインフラマソーム複合体をアセンブリして、炎症促進性サイトカインのインターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－１８、及びガスダーミンＤ（Ｇｓｄｍｄ）の成熟を促進し、それによって、パイロトーシスとして公知の細胞死の炎症性の形態を誘導する。ＮＬＲＣ４インフラマソームは、ＮＬＲファミリーアポトーシス阻害性蛋白質（ＮＡＩＰ）として公知の病原体感知蛋白質の助けによって、細菌フラジェリン及びＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）を間接的に感知することによって抗細菌免疫を制御することから最も周知である。ここでは、我々は、非細菌性分子の短鎖散在核エレメント（ＳＩＮＥ）転写物もまたマウス及びヒトマクロファージ並びに網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を誘導し得るということを示している。ＮＡＩＰに依存的であるフラジェリンによって誘導されるＮＬＲＣ４活性化とは対照的に、我々は、全てのＮＡＩＰ遺伝子を欠損したマウスが、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４活性化に対して感受性のままに残るということを示す。不偏的な様式によって、我々は、ＲＮＡヘリカーゼのＤＥＡＤボックスファミリーのメンバーＤＤＸ１７をＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化のセンサーとして同定した。我々は、ＳＩＮＥ－ＲＮＡとの結合によって、Ｄｄｘ１７がＮＬＲＣ４及びＮＬＲＰ３の二重リクルートを誘導し、かつＡＳＣ分子はカスパーゼ－１活性化及びＩＬ－１β放出をもたらすということを機構的に見出した。Ｄｄｘ１７－Ｎｌｒｃ４－ＮＬＲＰ３シグナル伝達の治療操作は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の動物モデルにおいてＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＲＰＥ変性から保護する。最後に、我々は、現行でＨＩＶ治療薬として用いられているヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）が、ＮＬＲＣ４インフラマソームに対する阻害活性を所有するということを示す。まとめると、これらのデータは、可逆的中枢性失明の最も普通の原因のＡＭＤに関連性を有する無菌性のＮＡＩＰ非依存的な非古典的ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路の発見と、ＮＲＴＩがこのＮＬＲＣ４インフラマソーム経路を阻害するように機能するということとをハイライトとしている。
我々のデータは、インビボ及びヒト細胞培養研究両方において、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって活性化される新規のＮＡＩＰ非依存的な非古典的ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路を同定した。更にその上、我々は、ＤＤＸ１７をＳＩＮＥ－ＲＮＡによって媒介されるＮＬＲＣ４インフラマソームの新規のセンサーとして同定した。興味深いことに、我々は、ＮＬＲＣ４インフラマソームコンポーネントがヒトＡＭＤの眼において脱制御しているということを見出した。ＮＬＲＣ４インフラマソーム経路シグナル伝達に干渉することは、ＳＩＮＥ－ＲＮＡによって誘導されるＲＰＥ変性を逆行させた。更にその上、我々は、ＮＲＴＩ及び修飾ＮＲＴＩがＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を有効にブロックするということを示す。これらのデータはＮＬＲＣ４インフラマソームをＡＭＤの発病機序におけるキープレーヤーとして関連付けている。
今日まで、３つのモデルがＮＬＲＣ４インフラマソームの活性化を最も良く説明する。第１に、フラジェリン及びＴ３ＳＳ蛋白質などの細菌産物を包含する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）は、ＮＡＩＰを介してＮＬＲＣ４インフラマソームを活性化する。このメカニズムは腸病原体に対する防御にとって不可欠である。第２に、ＮＬＲＣ４の遺伝性変異は小児における重篤な自己炎症性疾患をもたらす。最後に、いくつかの研究は、脳損傷、加齢性ヌクレオチド代謝、又はリゾホスファチジルコリンを包含する内在性の刺激もまたＮＬＲＣ４依存的なインフラマソーム活性化を誘導し得るということを報告している。
この無菌性のＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化を支配する分子メカニズムは大きくは未知である。ＡＭＤをモデルとして用いて、我々の知見は、内在性のＳＩＮＥ－ＲＮＡ種によって誘導されるＮＡＩＰ非依存的な非古典的ＮＬＲＣ４インフラマソームを初めて明らかにした。Ｄｄｘ１７によるＳＩＮＥ－ＲＮＡ認識によって、ＮＬＲＣ４はＰＫＣδによってリン酸化されて、Ｄｄｘ１７及びＮＬＲＣ４の間の相互作用を促進し、ＮＬＲＣ４のオリゴマー化、ＡＳＣスペック形成、カスパーゼ－１活性化、及びＩＬ－１８放出をもたらす。これらの知見はＡＭＤの病理に関連性を有する。
イムノブロット研究を用いて、我々は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム活性化がＮＬＲＰ３依存的であるということと、ＮＲＴＩがＮＬＲＰ３－ＮＬＲＣ４複合体に直接的に結合してその活性化を阻害し得るということとを発見した。これらの知見は、ＮＬＲＣ４インフラマソームによって駆動される疾患を処置及び／又は防止する並びにＮＬＲＣ４阻害剤として作用するＮＲＴＩ並びに修飾ＮＲＴＩの能力を支持している。
引用文献
全ての特許、特許出願及びそれらの公開、科学雑誌記事、及びデータベースエントリー（例えばＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）バイオ配列データベースエントリー及びその中の利用可能な全てのアノテーション）を包含するが、これらに限定されない下で列挙される全ての参照及び本開示に引用される全ての参照は、それらが本明細書において使用される方法論、技術、及び／又は組成物を補足するか、説明するか、そのバックグラウンドを提供するか、又は教示する程度まで、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
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本発明を具体的な実施態様を参照して開示したが、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなしに、本発明の他の実施態様及び変形が他の当業者によって考案され得るということは明らかである。

Claims (37)

  1. ＮＬＲファミリーＣＡＲＤドメイン含有４（ＮＬＲＣ４）インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害若しくは病状を処置及び／又は防止するための方法であって、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれからなる、又はそれから成る組成物を、その必要がある対象に投与する段階を含む、本質的にそれからなる、又はそれから成り、該投与段階は、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性を減縮することに有効な経路及び量によって行われ、それにより、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状を処置及び／又は防止する、方法。
  2. 前記ＮＲＴＩが、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害又は病状が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患、任意に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 更に、その必要がある対象にＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤を投与する段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の（the）少なくとも１つの追加の阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ＣＧＡＳ）、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、インターフェロン遺伝子刺激因子－１（ＳＴＩＮＧ１）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項４に記載の方法。
  6. 前記阻害剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項５に記載の方法。
  7. 前記阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する、抗体又はその抗原結合断片である、請求項５に記載の方法。
  8. 細胞においてＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化を阻害するための方法であって、ＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させる段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成り、それによって、ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化が細胞において阻害される、方法。
  9. 該ＮＲＴＩが、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. いくつかの実施態様では、前記細胞が、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 更に、その必要がある対象に、インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤を投与する段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１（ＣＡＳ－１）、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ＣＧＡＳ）、カスパーゼ－４（ＣＡＳ－４）、インターフェロン遺伝子刺激因子－１（ＳＴＩＮＧ１）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記阻害剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１１に記載の方法。
  15. ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害するための方法であって、ＮＬＲＣ４遺伝子産物、並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させる段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成り、それによって、細胞からＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが放出されることが阻害される、方法。
  16. 前記ＮＲＴＩが、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記細胞が、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在する、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 前記ＮＬＲＣ４によって誘導されるカスパーゼ－１活性化及び／又はＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状に関連する、請求項８～１７のいずれか一項に記載の方法
  19. 前記ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、又は病状が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の疾患、任意に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）及び／又は地図状萎縮である、請求項１８に記載の方法。
  20. 更に、ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性の少なくとも１つの追加の阻害剤を、その必要がある対象に投与する段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項１８又は１９に記載の方法。
  21. 前記少なくとも１つの追加の阻害剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、抗体、又はその抗原結合断片からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記阻害剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、ＣＡＳ－１、ＣＧＡＳ、ＣＡＳ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項２１に記載の方法。
  23. 対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害するための方法であって、対象の細胞においてＮＬＲＣ４遺伝子産物並びに／又はＮＬＲＣ４遺伝子産物及びＮＬＲファミリーパイリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）遺伝子産物の複合体を、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る有効量の組成物と接触させる段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成り、それによって、細胞からのＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１β放出が阻害される、方法。
  24. 前記ＮＲＴＩが、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記細胞が、対象、任意に哺乳類対象、更に任意にヒト対象に存在するＲＰＥ細胞である、請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. 更に、前記ＲＰＥを分解から保護するように設計された少なくとも１つの追加の処置を対象に施す段階を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の方法
  27. 前記少なくとも１つの追加の処置が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、カスパーゼ－４、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を対象に投与する段階を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記阻害剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これはＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する、抗体又はその抗原結合断片である、請求項２７に記載の方法。
  30. ＮＬＲＣ４インフラマソーム生物活性に関連する疾患、障害、及び／又は病状を処置及び／又は防止することに使用するための組成物であって、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、組成物。
  31. ＮＬＲＣ４によって誘導されるＩＬ－１βが細胞から放出されることを阻害することに使用するための組成物であって、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、組成物。
  32. 対象におけるＡｌｕによって誘導される網膜色素細胞（ＲＰＥ）変性を阻害することに使用するための組成物であって、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、組成物。
  33. 前記ＮＲＴＩが、アバカビル（ＡＢＣ）、アデホビル（ビスＰＯＭ－ＰＭＥＡ）、アムドキソビル、アプリシタビン（ＡＶＸ７５４）、センサブジン、ジダノシン（ＤＤＩ）、エルブシタビン、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ラミブジン（３ＴＣ）、ラシビル、スタンピジン、スタブジン（ｄ４Ｔ）、テノホビルジソプロキシル（ＴＤＦ）、テノホビルアラフェナミド（ＧＳ－７３４０）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＺＤＶ）／アジドチミジン（ＡＺＴ）、それらの誘導体、任意にそれらのアルキル化誘導体、更に任意にトリメトキシ３ＴＣ、それらの薬学的に許容される塩、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３０～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 眼部送達のために製剤される、請求項３０～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記組成物が、更に、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、カスパーゼ－４、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）、ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼＦ（ＰＰＩＦ）、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（ＭＰＴＰ）、ガスダーミンＤ（ＧＳＤＭＤ）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）、及びインターフェロン－α／β受容体（ＩＦＮＡＲ）からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は複合体の生物活性の阻害剤を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記阻害剤が、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり、これは、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の転写産物を標的化し、任意に、転写産物は、配列番号１、７、２１、２８、３５、３７、３９、４１、４３、５２、５４、５９、６１、６４、６６、６９、７１、７４、７６、７９、８１、及び８４のいずれかで提出されるヌクレオチド配列アミノ酸を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、更に任意に、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡは、ヒトＮＬＲＣ４転写産物を標的化する配列番号３～６、マウスＮｌｒｃ４転写産物を標的化する配列番号９～２０、ヒトＤＤＸ１７転写産物を標的化する配列番号２３～２７、マウスＤｄｘ１７転写産物を標的化する配列番号３０～３４、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４５、ヒトＣＡＳ－４転写産物を標的化する配列番号４６～５１、ヒトＣＧＡＳ転写産物を標的化する配列番号５６～５８、ヒトＳＴＩＮＧ１転写産物を標的化する配列番号６３、ヒトＰＰＩＦ転写産物を標的化する配列番号６８、ヒトＧＳＤＭＤ転写産物を標的化する配列番号７３、ヒトＩＦＮ－β転写産物を標的化する配列番号７８、及びヒトＩＦＮＡＲ転写産物を標的化する配列番号８３のいずれかで提出されるヌクレオチド配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれから成る、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記阻害剤が、ＮＬＲＣ４、ＮＬＲＰ３、カスパーゼ－１、ｃＧＡＳ、カスパーゼ－４、ＳＴＩＮＧ、ＰＰＩＦ、ＭＰＴＰ、ＧＳＤＭＤ、ＩＦＮ－β、及びＩＦＮＡＲからなる群から選択される遺伝子の翻訳産物に結合する、抗体又はその抗原結合断片である、請求項３５に記載の組成物。
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