JP6590284B2 - 疼痛抑制物質のスクリーニング方法および疼痛の予防または治療用医薬組成物 - Google Patents

疼痛抑制物質のスクリーニング方法および疼痛の予防または治療用医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、疼痛抑制物質のスクリーニング方法に関するものである。また、本発明は、疼痛の予防または治療用医薬組成物に関するものである。
疼痛は罹患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｆ Ｌｉｆｅ）を低下させる難治性疾患である。慢性疼痛の患者数は全世界で２０００万人を超えると報告されており、疼痛治療薬の市場規模は日米欧で約２兆円に上るといわれている。また脳卒中、がん、糖尿病、ウイルス感染症といった疼痛発症の原因となり得る基礎疾患の患者数が増加していることから、疼痛治療法の確立は非常に重要な医療課題である。特に非ステロイド性抗炎症薬やオピオイド鎮痛薬による治療効果が低い神経障害性疼痛に対する医療ニーズは非常に高い。しかしながら、神経障害性疼痛の発症原因は多岐にわたり、その分子作用機序も非常に複雑であることから、未だに根本的な治療薬は開発されていない（非特許文献１）。神経障害性疼痛の発症・維持に関与する分子メカニズムを明らかにすることは画期的な治療薬の開発につながり、２１世紀における医療の最大課題の一つを解決へ導くと考えられる。
脊髄の後角は神経障害性疼痛の主要な原因箇所の一つであると考えられている（非特許文献２）。末梢からの感覚入力は脊髄後角内で増幅・抑制・統合など様々な修飾を受けてから脳へと伝達される。しかし末梢神経が傷害されると、異常な軸索側枝形成、シナプス伝達の亢進など脊髄後角の神経回路網が変化して疼痛の惹起に繋がってしまうことが過去に報告されている（非特許文献３）。このことから、脊髄後角内の神経回路を制御する新規分子メカニズムを明らかにすることは、画期的な疼痛治療薬の開発に必要な新しいターゲット分子の創出に繋がることが期待される。
ＦＬＲＴ３（fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-3）はフィブロネクチンロイシンリッチリピート膜貫通型タンパク質ファミリーの１つであり、ＦＮ（フィブロネクチン）IIIドメインとロイシンリッチリピートを有している。ＦＬＲＴ３は腎臓、骨格筋、脳、肺を含む様々な組織で発現している（非特許文献４）。ＦＬＲＴ３は神経突起形成（非特許文献５）、細胞接着（非特許文献６）、軸索誘導（非特許文献７）など、発生初期における細胞、組織の形態形成に重要な役割をもつことが報告されている。また、脊髄後角へと投射する後根神経節ニューロンの軸索末端で末梢神経損傷後にＦＬＲＴ３のタンパク質発現が上昇することが報告されている（非特許文献８）。さらに、ＦＬＲＴ３はＵｎｃ５Ｂ受容体と結合することが報告されている（非特許文献７および９）。しかしながら、ＦＬＲＴ３の成体脊髄での働きについてｉｎ ｖｉｖｏで示した研究報告はこれまでに無く、神経障害性疼痛の発症に関与しているかどうかについても全く解明されていない。
Dworkin, R. H. et al. Pharmacologic management of neuropathic pain: evidence-based recommendations. Pain 132, 237-51 (2007). Woolf, C. J. Neuronal Plasticity: Increasing the Gain in Pain. Science 288, 1765-1768 (2000). Markman, J. D. & Dworkin, R. H. Ion channel targets and treatment efficacy in neuropathic pain. The journal of pain 7, S38-47 (2006). Lacy, S. E., Bo, C. G., Buzney, E. A., Kunkel, L. M. & Al, L. E. T. Identification of FLRT1, FLRT2, and FLRT3: A Novel Family of Transmembrane Leucine-Rich Repeat Proteins. 426, 417-426 (1999). Tsuji, L. et al. FLRT3, a cell surface molecule containing LRR repeats and a FNIII domain, promotes neurite outgrowth. Biochemical and Biophysical Research Communications 313, 1086-1091 (2004). Chen, X., Koh, E., Yoder, M. & Gumbiner, B. M. A protocadherin-cadherin-FLRT3 complex controls cell adhesion and morphogenesis. PloS one 4, e8411 (2009). Yamagishi, S. et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. 1-14 (2011). doi:10.1038/emboj.2011.189 Robinson, M. et al. FLRT3 is expressed in sensory neurons after peripheral nerve injury and regulates neurite outgrowth. Molecular and cellular neurosciences 27, 202-14 (2004). Seiradake E. et al. FLRT structure: balancing repulsion and cell adhesion in cortical and vascular development. Neuron, 84(2), 370-385 (2014).
本発明は、末梢神経障害に起因する疼痛に関与する分子を見出し、疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、新規な有効成分を含有する疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供することを課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］疼痛抑制物質のスクリーニング方法であって、ＦＬＲＴ３を用いることを特徴とする方法。
［２］疼痛抑制物質が、末梢神経障害に起因する疼痛を抑制する物質である前記［１］に記載の方法。
［３］ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［５］ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することを特徴とする前記［１］または［２］に記載の方法。
［６］被験物質とＦＬＲＴ３を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＦＬＲＴ３の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＦＬＲＴ３の発現量と比較し、ＦＬＲＴ３の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［３］に記載の方法。
［７］後根神経節組織において被験物質と後根神経節細胞を接触させる工程と、後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量を測定する工程と、該ＦＬＲＴ３量を被験物質と接触させない場合の後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量と比較し、ＦＬＲＴ３量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする前記［４］に記載の方法。
［８］被験物質とＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする前記［５］に記載の方法。
［９］ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
［１０］疼痛が、末梢神経障害に起因する疼痛である前記［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質が、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する核酸である前記［９］または［１０］に記載の医薬組成物。
［１２］ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質が、ＦＬＲＴ３と特異的に結合する抗体またはペプチドである前記［９］または［１０］に記載の医薬組成物。
［１３］後根神経節細胞、後根線維または後根神経節ニューロン軸索末端で作用することを特徴とする前記［９］〜［１２］のいずれかに記載の医薬組成物。
本発明のスクリーニング方法によれば、疼痛の予防または治療薬として有用な疼痛抑制物質を取得することができる。また、本発明の医薬組成物は、疼痛の予防または治療に有用である。
神経障害性疼痛モデルラットから採取した後根神経節細胞におけるＦＬＲＴ３遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法で解析した結果を示す図である。 神経障害性疼痛モデルラットから採取した脊髄におけるＦＬＲＴ３遺伝子発現量を定量ＰＣＲ法で解析した結果を示す図である。 神経障害性疼痛モデルラットから採取した後根神経節細胞におけるＦＬＲＴ３タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法で解析した結果を示す図である。 神経障害性疼痛モデルラットから採取した脊髄におけるＦＬＲＴ３タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法で解析した結果を示す図である。 ＦＬＲＴ３タンパク質を脊髄髄腔内に投与したラットを用いてｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。 神経障害性疼痛モデルラットの脊髄髄腔内に抗ＦＬＲＴ３抗体を投与し、経時的にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って、損傷側後肢の逃避閾値の変化を調べた結果を示す図である。
〔スクリーニング方法〕
本発明は疼痛抑制物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、ＦＬＲＴ３を用いるものであればよい。本発明のスクリーニング方法で用いるＦＬＲＴ３はタンパク質でもよく、遺伝子でもよい。また、ＦＬＲＴ３がタンパク質の場合、全長タンパク質でもよく、機能断片でもよい。
本発明のスクリーニング方法に用いるＦＬＲＴ３は、どのような生物由来のＦＬＲＴ３でもよく、特に限定されないが、哺乳動物のＦＬＲＴ３が好ましい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが好ましく、より好ましくはヒトである。各種動物のＦＬＲＴ３をコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表１に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。
被験物質としては、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等を好ましく用いることができる。ただし、これらに限定されない。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
本発明のスクリーニング方法により、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、またはＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質を選択することが好ましい。本発明者らは、坐骨神経部分絞扼モデルラットの損傷側の後根神経節細胞でＦＬＲＴ３遺伝子およびタンパク質の発現が有意に上昇し、ＦＬＲＴ３タンパク質が後根線維（軸索）を経て脊髄に輸送されて疼痛が増強されることを見出した（実施例参照）。したがって、後根神経節細胞においてＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、および後根神経節細胞から脊髄へのＦＬＲＴ３タンパク質の輸送を阻害する物質は、末梢神経障害に起因する疼痛を抑制することができると考えられる。
また、本発明のスクリーニング方法により、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を選択することが好ましい。ＦＬＲＴ３はＵｎｃ５Ｂ受容体と結合することが報告されている（非特許文献７および９）ので、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質は、ＦＬＲＴ３の下流へのシグナル伝達を阻害することができ、末梢神経障害に起因する疼痛を抑制することができると考えられる。
本発明のスクリーニング方法により、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質を選択する場合、例えば、被験物質とＦＬＲＴ３を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＦＬＲＴ３の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＦＬＲＴ３の発現量と比較し、ＦＬＲＴ３の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。ＦＬＲＴ３を発現する細胞は、生体内の細胞でもよく、培養細胞でもよい。培養細胞は、初代培養細胞でもよく、細胞株でもよい。初代培養細胞として、例えば、後根神経節細胞、吻側視床核細胞、海馬歯状回顆粒細胞、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）などが挙げられ、細胞株として、例えば、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。また、ＦＬＲＴ３をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換したＦＬＲＴ３発現形質転換細胞を用いることができる。
被験物質と細胞を接触させる方法は、被験物質と細胞が接触できる方法であればどのような方法でもよく、特に限定されない。例えば、培養細胞を用いる場合には、培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。例えば、生体において被験物質と細胞とを接触させる場合には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与、標的臓器や標的組織への局所投与などが挙げられる。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
ＦＬＲＴ３の発現量の測定は、ＦＬＲＴ３のタンパク質量を測定してもよく、ＦＬＲＴ３のｍＲＮＡ量を測定してもよい。タンパク質量を測定する場合は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ｍＲＮＡ量を測定する場合は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。
被験物質を接触させない対照群におけるＦＬＲＴ３のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して、被験物質を接触させた場合にＦＬＲＴ３のタンパク質量またはｍＲＮＡ量が減少していれば、当該被験物質を目的物質として選択することができる。被験物質がＦＬＲＴ３のタンパク質量またはｍＲＮＡ量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して５０％以下に減少させる被験物質が好ましく、２５％以下に減少させる被験物質がより好ましい。
本発明のスクリーニング方法により、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質を選択する場合、例えば、後根神経節組織において被験物質と後根神経節細胞を接触させる工程と、後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量を測定する工程と、該ＦＬＲＴ３量を被験物質と接触させない場合の後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量と比較し、ＦＬＲＴ３量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むスクリーニング方法を用いることができる。本スクリーニング方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよく、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施してもよい。
ｉｎ ｖｉｖｏで実施する場合、神経障害性疼痛モデル動物（例えば、坐骨神経部分絞扼モデル（実施例参照）等）を用いることが好ましい。後根神経節組織において被験物質と後根神経節細胞を接触させる方法としては、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与等の全身投与、標的組織への局所投与などを用いることができる。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。その後、後根線維または脊髄を採取し、公知の方法で組織からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いてＦＬＲＴ３を定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施する場合、ラット等の実験動物から後根神経節組織を採取し、市販の神経細胞用コンパートメントチャンバー（例えば、Tyler Research Corporation製）で培養し、後根神経節細胞と後根線維（軸索）を分けて薬剤処理できる実験系を構築する（参考文献；Melli G1, Keswani SC, Fischer A, Chen W, Hoke A. Spatially distinct and functionally independent mechanisms of axonal degeneration in a model of HIV-associated sensory neuropathy. Brain. 2006 May;129(Pt 5):1330-8. Epub 2006 Mar 14.、Pazyra-Murphy MF1, Segal RA. Preparation and maintenance of dorsal root ganglia neurons in compartmented cultures. J Vis Exp. 2008 Oct 17;(20). pii: 951. doi: 10.3791/951.）。細胞側の培地または両方の培地に被験物質を添加し、被験物質と後根神経節細胞を接触させる。その後、後根線維（軸索）を回収し、公知の方法で組織からタンパク質を抽出し、上記公知のタンパク質量測定方法を用いてＦＬＲＴ３を定量することができる。後根神経節組織の培養に用いる培地としては、例えばハムＦ−１２に２％のＢ−２７サプリメント（商品名、Life Technologies）を添加した培地などが挙げられる。後根神経節組織は公知の培養方法（例えば、Kim SU, Tomonaga M, Ghetti B. Neurofibrillary degeneration in cultured adult mouse neurons induced by maytansine. Acta Neuropathol. 1980;52(2):161-4.、Yong VW1, Horie H, Kim SU. Comparison of six different substrata on the plating efficiency, differentiation and survival of human dorsal root ganglion neurons in culture. Dev Neurosci. 1988;10(4):222-30.）またはそれを改変した方法を用いて培養することができる。
被験物質を接触させない対照群における後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量と比較して、被験物質を接触させた場合に後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量が減少していれば、当該被験物質を目的物質として選択することができる。被験物質が後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、対照群のＦＬＲＴ３量と比較して５０％以下に減少させる被験物質が好ましく、２５％以下に減少させる被験物質がより好ましい。
本発明のスクリーニング方法により、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質をスクリーニングする場合、例えば、被験物質とＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むスクリーニング方法を用いることができる。用いるＦＬＲＴ３およびＵｎｃ５Ｂは、天然タンパク質および組み換えタンパク質のいずれでもよい。天然タンパク質を用いる場合、ＦＬＲＴ３および／またはＵｎｃ５Ｂを発現している細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて天然タンパク質を取得することができる。組み換えタンパク質を用いる場合、ＦＬＲＴ３発現ベクターまたはＵｎｃ５Ｂ発現ベクターが導入された細胞の培養上清または細胞抽出物から公知の方法を用いて組み換えタンパク質を取得することができる。ＦＬＲＴ３の組み換えタンパク質は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から得られる遺伝情報（表１参照）および公知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、製造することができる。また、各種動物のＵｎｃ５Ｂをコードする遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列の情報は、例えば表２に示すアクセッション番号で公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができ、これらの遺伝情報および公知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、Ｕｎｃ５Ｂの組み換えタンパク質を製造することができる。
被験物質とＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとを接触させる方法は特に限定されない。例えば、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとを含む反応系を準備し、ここに被験物質を添加する方法が挙げられる。接触時間、接触温度は特に限定されず、適宜選択すればよい。また、被験物質を接触させない対照群を設けることが好ましい。
ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する方法は特に限定されず、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルを確認できる公知の方法を適宜選択して使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、蛍光偏光法などを好適に用いることができる。ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、ＦＬＲＴ３およびＵｎｃ５Ｂのいずれか一方を固相化し、そこに他方および被験物質を添加して反応させ、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂの結合レベルを適当な一次抗体および二次抗体を用いて検出すればよい。
ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する方法は特に限定されない。例えば、被験物質を接触させない対照群におけるＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルと比較して、被験物質を接触させた場合にＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルが低下していれば、当該被験物質を目的物質として選択することができる。被験物質がＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合レベルを低下させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない場合の両者の結合レベルと比較して、結合レベルを５０％以下に低下させる被験物質が好ましく、２５％以下に低下させる被験物質がより好ましい。
〔疼痛の予防または治療用医薬組成物〕
本発明は、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分として含有する疼痛の予防または治療用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、上記本発明のスクリーニング方法を用いて選択される物質を有効成分とすることが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、末梢神経障害に起因する疼痛の予防または治療に好適に用いることができる。
本発明の医薬組成物は、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質を有効成分とし、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、経口投与のための製剤としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。非経口投与のための製剤としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤、関節内注射剤などの剤形を包含する。このような注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記有効成分を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製される。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０等）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記有効成分を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的にまたは非経口的に投与することができる。
本発明の医薬組成物の有効成分は、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する核酸であることが好ましい。ＦＬＲＴ３の発現を阻害する核酸としては、ＦＬＲＴ３遺伝子のｓｉＲＮＡ（short interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（short hairpin RNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。投与対象動物のＦＬＲＴ３遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から容易に取得することができる。ｓｉＲＮＡは、約２０塩基（例えば、約２１〜２３塩基）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡであり、このようなｓｉＲＮＡを細胞に発現させることにより、そのｓｉＲＮＡの標的となる遺伝子（本発明においてはＦＬＲＴ３遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｈＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、３'末端に突出部を有する短いヘアピン構造からからなる約２０塩基対以上の分子のことをいう。そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様に標的となる遺伝子（本発明においてはＦＬＲＴ３遺伝子）の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡは、ＦＬＲＴ３の発現を抑制できるものであればどのような形態であってもよい。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、標的遺伝子の塩基配列に基づいて、公知の方法により設計することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成することができる。また、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡをインビトロで合成することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＬＲＴ３遺伝子のＤＮＡ配列中の連続する５から１００の塩基配列に対して相補的な、またはハイブリダイズするヌクレオチドであればよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよい。また、機能に支障がない限り修飾されたものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは常法によって合成することができ、例えば、市販のＤＮＡ合成装置によって容易に合成することができる。
本発明の医薬組成物の有効成分が、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する核酸である場合、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクターの形態で投与する場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などを利用することができる。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡをウイルスベクターを用いて生体に投与する場合は、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターを利用することができる。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡを導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。
Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（Robinson, M. et al. FLRT3 is expressed in sensory neurons after peripheral nerve injury and regulates neurite outgrowth. Molecular and cellular neurosciences 27, 202-14 (2004)）は、配列番号３に示される塩基配列（TGGGCTGATCATGGTCAGCAG）からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ラットＦＬＲＴ３の発現を抑制したことを報告している。したがって、当該ラットアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的配列に相当するヒトＦＬＲＴ３遺伝子の塩基配列（配列番号１）の第４２位〜第６２位（CTGCTGACCATGATCAGCGCA：配列番号２）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の医薬組成物の有効成分として有用であると考えられる。
本発明の医薬組成物の有効成分は、ＦＬＲＴ３と特異的に結合する抗体またはペプチドであることが好ましい。抗体またはペプチドがＦＬＲＴ３と結合することにより、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害することができる。また、抗体またはペプチドがＦＬＲＴ３と結合することにより、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害することができる。ＦＬＲＴ３と特異的に結合する抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、完全な抗体分子でもよく、抗原に特異的に結合し得る抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等）でもよい。抗体はヒト型キメラ抗体またはヒト化抗体が好ましい。抗体およびペプチドは、いずれも公知の方法により製造することができる。本発明の医薬組成物の有効成分がペプチドまたは抗体である場合、薬学的に許容される担体とともに製剤化された注射剤または輸液として、非経口投与経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮膚内、腹腔内、皮下または局所に投与することが好ましい。
本発明の医薬組成物には、有効成分を０．００１〜５０質量％、好ましくは０．０１〜１０質量％、更に好ましくは０．１〜１質量％含有することができる。
本発明の医薬組成物の投与量は、目的、疾患の種類、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別、既往歴、有効成分の種類などを考慮して、適宜設定される。約６５〜７０ｋｇの体重を有する平均的なヒトを対象とした場合、１日当たり０．０２ｍｇ〜４０００ｍｇ程度が好ましく、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ程度がより好ましい。１日当たりの総投与量は、単一投与量であっても分割投与量であってもよい。
本発明の医薬組成物は、有効成分が後根神経節細胞、後根線維または後根神経節ニューロン軸索末端で作用することが好ましく、有効成分が後根神経節細胞または後根線維で作用することがより好ましい。本発明の医薬組成物の有効成分がＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質またはＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質である場合、本発明の医薬組成物は有効成分が中枢神経に到達することを要せず、例えば後根神経節におけるＦＬＲＴ３の発現を阻害することや、後根神経節から脊髄への輸送を後根線維において阻害することで疼痛を予防または治療することができる点で非常に有利である。本発明の医薬組成物の有効成分がＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質である場合、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂは、脊髄後角の後根神経節ニューロン軸索末端で結合すると考えられるので、有効成分が後根神経節ニューロン軸索末端で作用することが好ましい。
本発明には、以下の各発明が含まれる。
（Ａ）ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質の有効量を投与する工程を包含することを特徴とする疼痛の予防または治療方法。
（Ｂ）疼痛の予防または治療に使用するための、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質。
（Ｃ）疼痛の予防または治療用医薬組成物を製造するための、ＦＬＲＴ３の発現を阻害する物質、ＦＬＲＴ３の脊髄への輸送を阻害する物質またはＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する物質の使用。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：痛覚応答に対するＦＬＲＴ３の関与〕
１−１ 実験方法
（１）神経障害性疼痛モデルの作成
神経障害性疼痛モデルとして、坐骨神経部分絞扼モデル（Seltzer. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain 43, 205-218 (1990)）を用いた。イソフルランと酸素の混合ガスによる吸気麻酔下で、Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系統８週齢雄ラットの左後肢大腿部とその付け根付近を剃毛し、アルコールで消毒した。大腿骨と腰骨の関節部分の皮膚と筋肉を切開し、大腿骨に沿って走る坐骨神経を露出させた。４−０号ナイロン縫合糸で坐骨神経の１／２〜１／３を結紮し、筋肉および皮膚を縫合した。対側である右後肢の坐骨神経は皮膚と筋肉の切開だけ行って、偽手術側とした。
（２）痛み関連行動の計測
機械性刺激に対する応答を計測するために、ｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行った。金網の上にプラスチックケースを置き、疼痛モデルラットをケースに入れて落ち着くまで５〜１０分間慣らした。フィラメント（Semmes-Weinstein Von Frey Anesthesiometer、室町機械）を後肢足裏中央に３〜５秒間押し当てて逃避反応を起こす刺激閾値（ｇ）についてアップダウン法を用いて測定した。
（３）脊髄髄腔内へのＦＬＲＴ３タンパク質投与実験
Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ系統８週齢雄ラットの第４腰椎と第５腰椎の隙間から脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管し、チューブ先端が腰髄膨大部近辺に来るように配置させた（Milligan, E. D., Hinde, J. L., Mehmert, K. K., Maier, S. F. & Watkins, L. R. A method for increasing the viability of the external portion of lumbar catheters placed in the spinal subarachnoid space of rats. Journal of neuroscience methods 90, 81-6 (1999)）。挿管してから１週間後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、挿管による運動異常または感覚異常が無いことが確認できた個体を以後の実験に使用した。ＦＬＲＴ３精製タンパク質（R&D）を生理食塩水で４０ｎｇ／μＬの濃度になるように溶解し、この溶液を１０μＬだけ髄腔内に挿管したチューブの後端から投与した。対照群の動物には生理食塩水を１０μＬ投与した。投与後１２，２４，４８時間目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた。
（４）ウエスタンブロッティング
神経障害性疼痛モデルラットの脊髄と後根神経節細胞それぞれをサンプルとして用いた。ソムノペンチルをラットに過剰量投与して麻酔し、リン酸バッファーを１００ｍＬ潅流して脱血後、腰部の椎骨を切開し、後根神経節の左右の第４から第６腰髄の後根神経節を取り出した。氷上でプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含む溶解バッファー（50 mM Tris-Hcl, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4）に溶解し、４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、上清を以後の実験に使用した。細胞溶解液をサンプルバッファー中で５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質を分離し、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で調製した５％脱脂粉乳を用いてメンブレンをブロッキングし、ＰＢＳ−Ｔで希釈した抗ＦＬＲＴ３抗体（Abcam）とともに４℃で一晩インキュベーションした。メンブレンをＰＢＳ−Ｔで洗浄後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology）でインキュベーションした。検出には、ＥＣＬ化学発光システム（GE Healthcare）を使用した。ＦＬＲＴ３の発現量はβ−アクチンの発現量によって補正した。
（５）定量ＰＣＲ
神経障害性疼痛モデルラットの脊髄と後根神経節細胞それぞれをサンプルとして用いた。ソムノペンチルをラットに過剰量投与して麻酔し、リン酸バッファーを１００ｍＬ潅流して脱血後、腰部の椎骨を切開し、後根神経節の左右の第４から第６腰髄の後根神経節を取り出した。試薬（TRIZOL, Life Technologies）を用いてＲＮＡを抽出後、逆転写酵素（High-capacity Reverse Transcription Kit, Life Technologies）によりｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ（Life Technologies）を用いてラットＦＬＲＴ３遺伝子の発現量を定量した。ＦＬＲＴ３遺伝子発現量はハウスキーピング遺伝子であるラットＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量によって補正した。
１−２ 実験結果
（１）神経障害性疼痛モデルにおけるＦＬＲＴ３遺伝子発現量
定量ＰＣＲ法を用いて神経障害性疼痛病態下でのＦＬＲＴ３遺伝子発現を解析した。神経障害性疼痛モデル作製０，４，７，１４日後のラットから脊髄組織（腰膨大部）と後根神経節細胞それぞれを損傷側と対側とに分けて回収した。組織から抽出したＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写後、ＦＬＲＴ３遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子（リファレンス）の発現について定量ＰＣＲ法を用いて解析した。
後根神経節細胞の定量ＰＣＲの結果を図１に、脊髄組織（腰膨大部）の定量ＰＣＲの結果を図２に、それぞれ示した。図１から明らかなように、損傷側の後根神経節細胞においてＦＬＲＴ３遺伝子の有意な発現上昇が観察された（**p<0.01 vs 0日後）。一方、図２から明らかなように、損傷側の脊髄ではＦＬＲＴ３遺伝子の有意な発現上昇が観察されなかった。この結果から、神経障害性疼痛病態下では、脊髄ではなく、後根神経節細胞でＦＬＲＴ３遺伝子の発現量が増加することが明らかになった。
（２）神経障害性疼痛モデルにおけるＦＬＲＴ３タンパク質発現量
次に、神経障害性疼痛病態下においてＦＬＲＴ３がタンパク質レベルでどのように発現変化するのかを明らかにするために、ウエスタンブロッティング法を用いて解析した。神経障害性疼痛モデル作製０，７日後のラットから脊髄組織（腰膨大部）と後根神経節細胞それぞれを損傷側と対側とに分けて回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ＦＬＲＴ３とβ−アクチンの発現量について調べた。
後根神経節細胞の損傷後７日目のウエスタンブロッティングの結果を図３に、脊髄組織（腰膨大部）の損傷後７日目のウエスタンブロッティングの結果を図４に、それぞれ示した。図３から明らかなように、損傷後７日目の後根神経節細胞では損傷側でＦＬＲＴ３タンパク質の発現上昇が観察された。また、図４から明らかなように、損傷後７日目の脊髄においても損傷側でＦＬＲＴ３タンパク質の発現上昇が観察された。
上記の定量ＰＣＲの結果と合わせると、脊髄のＦＬＲＴ３遺伝子発現量は神経損傷によって増加しないので、損傷後の脊髄におけるＦＬＲＴ３タンパク質の発現上昇は、脊髄以外の箇所、特に後根神経節細胞で発現したＦＬＲＴ３が軸索輸送によって脊髄まで運ばれている可能性が示唆された。
（３）ＦＬＲＴ３タンパク質の脊髄内投与による痛覚応答の増強
ＦＬＲＴ３タンパク質の脊髄での働きを明らかにするために、ＦＬＲＴ３タンパク質を脊髄髄腔内に投与して痛覚応答の変化について調べた。投与後１２，２４，４８時間目にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行い、逃避閾値の変化について調べた結果を図５に示した。図５から明らかなように、ＦＬＲＴ３タンパク質を投与した動物は投与後徐々に逃避閾値が低下し始めた。逃避閾値の低下率について対照群と比較したところ、投与後１２，２４，４８時間目で有意に逃避閾値が低下していることが示された（Tukey-Kramer検定、**p<0.01、*p<0.05）。
以上の結果から、ＦＬＲＴ３は成体脊髄内において動物の痛覚応答を増強させ、疼痛を引き起こす働きがあることが示唆された。
〔実施例２：抗ＦＬＲＴ３抗体による痛覚応答の抑制〕
抗ＦＬＲＴ３抗体によって神経障害性疼痛における鎮痛効果が得られるかどうか明らかにするために、疼痛を発症したモデルラットに抗ＦＬＲＴ３抗体（R&D社、AF2795）を脊髄髄空内に投与して痛み関連行動を調べた。まず、８週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄ラットの脊髄髄腔内にポリエチレンチューブを挿管した。挿管してから１週間後にラットの左後肢の坐骨神経を部分絞扼して神経障害性疼痛モデルを作製した。疼痛モデル作製７日後にｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを用いて逃避閾値の低下（＝機械性アロディニア）が起こっていることを確認した。抗ＦＬＲＴ３抗体を生理食塩水で溶解した液（1μg/μL）を作製し、脊髄髄腔内に挿管したポリエチレンチューブの後端から30μL投与した。対照群の動物にはヤギコントロールＩｇＧ液（1μg/μL）を等量だけ投与した。投与後はチューブの後端を閉じ、皮膚を縫合した。抗体液を投与して１２時間、２４時間、４８時間後のそれぞれでｖｏｎ Ｆｒｅｙ ｆｉｌａｍｅｎｔテストを行って損傷側後肢の逃避閾値の変化について調べた。
結果を図６に示した。抗ＦＬＲＴ３抗体液投与群の逃避閾値は、対照群と比較して上昇していることが示された。特に投与２４時間後において、対照群に対して有意差が認められた（Tukey-Kramer検定、*Ｐ<0.05）。この結果から、抗ＦＬＲＴ３抗体の脊髄髄腔内投与には神経障害性疼痛に対する鎮痛効果があることが明らかになった。
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (5)

  1. ＦＬＲＴ３の発現を阻害するＦＬＲＴ３遺伝子のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
  2. ＦＬＲＴ３と特異的に結合する抗体を有効成分として含有することを特徴とする疼痛の予防または治療用医薬組成物。
  3. 被験物質とＦＬＲＴ３を発現する細胞を接触させる工程と、前記細胞のＦＬＲＴ３の発現量を測定する工程と、該発現量を被験物質と接触させない前記細胞におけるＦＬＲＴ３の発現量と比較し、ＦＬＲＴ３の発現量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする疼痛抑制物質のスクリーニング方法。
  4. 後根神経節組織において被験物質と後根神経節細胞を接触させる工程と、後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量を測定する工程と、該ＦＬＲＴ３量を被験物質と接触させない場合の後根線維または脊髄のＦＬＲＴ３量と比較し、ＦＬＲＴ３量を低下させる被験物質を選択する工程とを含むことを特徴とする疼痛抑制物質のスクリーニング方法。
  5. 被験物質とＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂを接触させる工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を確認する工程と、ＦＬＲＴ３とＵｎｃ５Ｂとの結合を阻害する被験物質を選択する工程を含むことを特徴とする疼痛抑制物質のスクリーニング方法。
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