KR20180040343A

KR20180040343A - MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20180040343A
Application number: KR1020160132099A
Authority: KR
Inventors: 최윤라; 신영기; 오두이
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2016-10-12
Filing date: 2016-10-12
Publication date: 2018-04-20
Also published as: KR101888104B9; KR101888104B1

Abstract

본 발명은 MET　엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하는 siRNA, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA는 MET 엑손 14 스키핑에 대한 특이성이 높으며 이에 결합하여 MET 엑손 14 스키핑을 갖는 개체의 MET 발현을 억제하는 우수한 효과가 있고, 암 세포의 증식억제 작용을 나타내므로 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물{MET exon 14 skipping specific siRNA and pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer containing the same}

본 발명은 MET　엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하는 siRNA, 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유전자치료제(Gene therapy)는 질환을 치료하기 위해 직접적으로 기능 유전자 및 DNA 단편, RNA 간섭(RNA interfering, RNAi), 앱타머, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 세포로 삽입하는 의약품을 지칭한다. RNA 간섭 기술 중 하나인 siRNA(small interfering RNA)는 21-25nt 크기의 작은 RNA 조각으로, 일반적으로 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex)와 복합체를 형성하여 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 타겟 mRNA를 절단시킨 후 단백질 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. 기존에 약이 존재하지 않았던 질병에 대해 유전자 염기 서열에 특이적인 siRNA를 제조함으로써 병인성 단백질 생성을 원천적으로 억제하여 생체 내에 존재하는 생화학적 기작을 통한 안전하고 효과적인 siRNA 신약 제조가 가능하다.

2017년까지, RNAi 기술에 대한 세계시장은 연간 40억 달러의 가치가 있을 것으로 추정되고, 현재 RNAi 치료제와 관련된 20개 이상의 임상시험 단계는 모두 임상 1, 2 상의 초기 단계에 있으며 전임상 중에서도 여러 가지의 siRNA 치료제가 개발 중인 실정이다. 현재 제약 산업은 특허만료와 R&D 생산성 위기라는 두 가지 과제에 직면하였는데, 특허만료는 최근 대두되고 있는 대형 제약사들의 R&D 생산성 하락 문제와 함께 제약 산업의 중장기적 성장 저해 요소이다. 미국에서 전임상을 포함한 파이프라인에서 임상이 성공할 확률이 대략 0.25%에 불과한 상황이고 임상승인 기준마저 엄격해지고 절차의 투명성, 정보공개 확대 등의 규제로 임상 성공률은 향후 더욱 낮아질 것으로 예상된다. 임상 단계별로 살펴보면 비용과 생산성에 가장 큰 영향을 미치는 2상과 3상의 임상 실패율이 가장 가파르게 올라가고 있는 추세이다.

GIA 자료에 따르면 항암치료제 시장에서 새롭고 효과적인 치료방법에 대한 요구가 커지면서 유전자치료제 시장은 2017년 7억 9천만달러 규모에 이를 것으로 전망된다. 유전자치료제 시장의 가장 큰 성장요인은 항암제이며, 보다 효과적이고 부작용이 적은 약물에 대한 요구가 커지면서 유전자치료제가 전통적인 방사선치료와 화합물 치료를 일부 대체할 것으로 기대되고, 실제로 임상 진행 중인 유전자치료제 중 40%가 항암제로 개발중이다. 차세대 유전자치료제로 개발되고 있는 분야는 안티센스 약물(antisense drugs)로, 안티센스 RNAi(siRNA) 의약품은 2020년까지 12조원 규모의 시장을 형성할 것으로 예상된다.

한편, 엑손 스키핑(exon skipping)은 유전자 코드가 잘못된 부분을 뛰어넘는 RNA 스플라이싱(splicing)의 한 형태로, 유전적 변형에 의해 절단된 단백질이 생산되도록 하며, 엑손 스키핑에 의해 융합 단백질이 생성된다.

MET 엑손 14 스키핑(MET exon 14 skipping)은 폐선암에서 약 3% 발생하는 것으로 보고되었다. MET 엑손 14는 유비퀴틴화에 관여하는 c-Cbl 결합 부위를 포함하므로 MET 엑손 14 스키핑이 일어나면 MET 분해가 억제된다. MET 엑손 14 스키핑을 갖는 환자들은 MET 수용체의 발현이 증가되어 있고 MET 신호전달이 증가되어있어, 크리조티닙(Crizotinib)을 통해 MET 신호전달을 억제할 수 있다. 그러나 현재까지 MET 엑손 14 스키핑 환자들의 크리조티닙 저항성에 대한 대안은 없는 실정이다.

이와 관련하여, 현재까지 융합 유전자를 표적하는 난치암 치료를 위한 siRNA 치료제 개발은 전임상 및 임상단계에서 경쟁 물질이 없으며, 바이오 시밀러 또는 제네릭 약물 또한 개발되거나 시판되고 있지 않다. 특히, siRNA를 기반으로 하는 새로운 치료제의 시장이 더욱 확대되고 있으나, 난치암에서 융합 유전자를 표적으로 하는 약물 개발은 전무한 상태이다.

난치암 특이적 융합 유전자를 표적으로 하는 siRNA 치료제의 경우, 유전자 기반 치료제의 특성상 상대적으로 짧은 개발 기간과 적은 비용으로 다양한 질병을 대상으로 치료제 개발이 가능하여 개발 기술의 과학적 의미와 함께 산업적 활용 가치가 매우 크며 이에 선진국을 중심으로 경쟁적으로 연구 투자가 이루어지고 있다. 따라서, 개인 맞춤의학구축 및 난치암 환자의 생존율 증가를 위한 융합 유전자 특이적 siRNA 치료제 개발에 대한 요구가 증가하고 있다.

이에 본 발명자들은 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 작용하는 siRNA에 대한 연구를 수행한 결과, MET 엑손 14 스키핑에 특이적인 siRNA를 설계하고 상기 siRNA가 암의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, siRNA(small interfering RNA)를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA 및 핵산 전달체를 포함하는, siRNA 복합체를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, siRNA(small interfering RNA)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA 및 핵산 전달체를 포함하는, siRNA 복합체를 제공한다.

본 발명의 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA는 MET 엑손 14 스키핑에 대한 특이성이 높으며 이에 결합하여 MET 엑손 14 스키핑을 갖는 개체의 MET 발현을 억제하는 우수한 효과가 있고, 암 세포의 증식억제 작용을 나타내므로 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 MET 엑손 14 스키핑의 브레이크 포인트를 확인하기 위해서 H596 세포주 및 Hs746T 세포주에 대해 Sanger 시퀀싱을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 설계한 14종의 siRNA를 H596 세포주에 형질감염시킨 후 MET 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 선별된 3종의 siRNA를 H596 세포주 및 Hs746T 세포주에 형질감염시킨 후 MET mRNA 발현의 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 선별된 3종의 siRNA(siRNA #1, siRNA #10, siRNA #14) 및 siRNA #8을 H596 세포주 및 Hs746T 세포주에 형질감염시킨 후 MET 단백질 발현의 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 선별된 3종(siRNA #1, siRNA #10, siRNA #14)의 siRNA를 293FT 세포주 및 MKN-45 세포주에 형질감염시킨 후 야생형 MET mRNA 발현의 변화를 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 선별된 3종(siRNA #1, siRNA #10, siRNA #14)의 siRNA를 293FT 세포주 및 MKN-45 세포주에 형질감염시킨 후 야생형 MET mRNA 발현의 변화를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 siRNA를 Hs746T 세포주에 형질감염시킨 후 암세포증식억제효과 및 MET 발현의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 siRNA를 H596 세포주에 형질감염 및 크리조티닙 처리 후 암세포증식억제효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 siRNA 스크리닝 방법을 도식화한 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, siRNA(small interfering RNA)를 제공한다.

상기 용어 “안티센스 서열”은 센스 가닥의 핵산 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 RNA의 총칭이며, 본 발명에서 서열번호 1로 표시되는 서열의 안티센스 서열은 AAACTGATCTTTAATTTGC이다.

상기 siRNA는 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 센스 서열에 상보적인 안티센스(antisense) 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있는 센스 서열과 안티센스 서열은 듀플렉스(duplex) 형태일 수 있다.

상기 siRNA는 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하여 MET 엑손 14 스키핑을 갖는 개체에서 MET 발현을 억제함으로써 암세포의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명에서, 용어 “엑손”은 예비-프로세싱된 (또는 전구체) RNA의 모든 부분이 스플라이싱에 의해 제거된 후의, 단백질을 코딩하는 핵산의 한정된 구획, 또는 RNA 분자의 성숙한 형태에서 나타나는 핵산 서열을 지칭한다. 성숙한 RNA 분자는 전령 RNA (mRNA) 또는 rRNA 또는 tRNA와 같은 비-코딩 RNA의 기능성 형태일 수 있다.

본 발명에서, 용어 "엑손 스키핑(exon skipping)"은 일반적으로 전체 엑손 또는 그의 부분이 주어진 예비-프로세싱된 RNA로부터 제거됨으로써, 단백질로 번역되는 성숙한 mRNA와 같은 성숙한 RNA에 존재하는 것으로부터 배제되는 프로세스를 지칭한다. 따라서, 스키핑된 엑손에 의해 코딩되는 단백질의 부분은 단백질의 발현된 형태에 존재하지 않으며, 전형적으로 여전히 기능성이지만 변경된 형태의 단백질을 생성한다. 본 발명에서 스키핑되는 엑손은 바람직하게는 MET(mesenchymal-epithelial transition factor) 유전자의 엑손 14이다.

본 발명에서, 용어 "siRNA(small interfering RNA)"는 이중가닥 RNA가 다이서(Dicer) 효소에 의해 절단되어 생성되는 18~23 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 당해 단백질, mRNA의 발현을 억제하는 데 사용할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 야생형 MET에는 결합하지 않는 반면 MET 엑손 14 스키핑에 결합하므로 MET 엑손 14 스키핑에 대한 특이성이 높다. 따라서 siRNA의 표적인 MET 엑손 14 스키핑 브레이크 포인트에 특이적으로 결합하여 RNA 간섭 효율성이 증가되므로, MET　엑손 14 스키핑을 갖는 개체의 MET mRNA 또는 단백질의 발현 억제 효율이 우수한 특징이 있다.

본 발명의 siRNA는 리보핵산 서열 자체, 또는 이를 발현하는 재조합 벡터 (발현 벡터) 형태를 모두 포함하는 개념이다. 또한, 상기 발현 벡터는 플라즈미드 또는 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 암세포 용해성 바이러스(oncolytic adenovirus) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 바이러스 벡터일 수 있다.

상기 siRNA의 처리에 의한 MET 발현 억제 효과는 정량 PCR(qPCR), RT-PCR, bDNA (branched DNA) assay, 웨스턴 블롯, ELISA 등의 방법으로 mRNA 또는 단백질 수준의 변화를 측정하여 확인할 수 있다.

본 발명에서, siRNA는 변형되지 않고 자연에 존재하는 리보핵산 단위구조를 가지고 있는 것이거나, 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 이러한 siRNA의 화학적 변형은 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비 특이적 면역반응 감소를 위한 것이다.

상기 화학적 변형을 통해, RNAi 능력에는 영향을 미치지 않고, 뉴클레아제(nuclease)에 대한 저항성 증진, 세포내 흡수(uptake) 증가, 세포 표적화 향상, 안정성 증가, 인터페론 활성 감소, 면역 반응 및 센스(sense) 효과와 같은 타겟 이외의(off-target) 효과 감소 등을 포함하는 siRNA의 다양한 특성을 변형되지 않은 siRNA 보다 향상시킬 수 있다.

이러한 siRNA의 화학적 변형 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 원하는 방식대로 상기 siRNA를 합성하고 변형시킬 수 있다. 예컨대 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH기가 -CH₃(메틸), -OCH₃(methoxy), -NH₂, -F(불소), -O-2-메톡시에틸 -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸 포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하고, siRNA의 5‘또는 3’-말단에 콜레스테롤, 비오틴, 세포 투과성 펩타이드(cell penetrating peptide)와 같은 리간드(ligand)를 붙이는 것도 가능하다.

상기 화학적 변형 중 siRNA 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 가닥의 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 치환하는 방법을 통해 뉴클레아제(nuclease)의 핵산 분해에 대한 저항성을 높일 수 있다. 예컨대, siRNA 센스(sense)와 안티센스(antisense) 양쪽 가닥의 3’-말단 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합으로 변경할 수 있다.

상기 화학적 변형 중 siRNA 센스(sense) 또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 3’말단, 또는 양 말단에 ENA(Ethylene bridge nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid)를 도입하는 방법이 있을 통해 RNAi 능력에 영향을 미치지 않고 siRNA 안정성을 증가시키고 면역 반응 및 비특이적 억제 효과를 줄일 수 있다.

상기 화학적 변형 외에도 다양한 화학적 변형을 가할 수 있으며, 이러한 화학적 변형은 어느 한 가지 형태의 변형만 이루어질 수도 있고, 여러 가지 화학적 변형이 함께 이루어질 수도 있다.

다만 상기 변형에 있어서, siRNA 이중 가닥구조를 안정화시키는 동시에 유전자 발현 저해활성을 감소시키지 않도록, 바람직하게는 최소한의 변형이 이루어지도록 하는 것이 좋다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 siRNA는 암세포의 증식을 억제하므로, 암 예방 또는 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 암은 MET 엑손 14 스키핑을 나타내는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 siRNA는 MET 엑손 14 스키핑을 나타내는 개체에서 MET의 발현을 억제할 수 있다.

상기 암은 크리조티닙(Crizotinib) 저항성 및 MET 엑손 14 스키핑 특이적 암일 수 있다. 일반적으로 MET 신호전달이 증가되어 있는 암 환자를 치료하기 위해 크리조티닙을 사용할 수 있고, MET 엑손 14 스키핑을 나타내는 개체 또한 크리조티닙에 효과가 있으나 MET 엑손 14 스키핑 이외의 크리조티닙의 저항성을 가지는 유전자를 동시에 가지고 있는 개체는 기존의 치료제로는 치료가 불가하다. 그리고 야생형 HGF-MET 시그널링은 근아세포이동을 위한 배발생, 간 및 태반 형성, 조직복구, 다양한 기관손상의 보호 효과등에 관여한다. 대부분의 MET 억제제들은 야생형 MET를 타겟하기 때문에 원치 않는 오프타겟 독성을 가지고 있다. MET 엑손 14 스키핑과 크리조티닙 저항성 유전자를 동시에 가진 환자들의 크리조티닙 저항성에 대한 치료법이 없고 MET 엑손 14 스키핑 특이적 치료법이 없으므로, 본 발명의 siRNA를 사용하면 MET 엑손 14 스키핑 환자에서 MET를 특이적으로 억제할 수 있어 크리조티닙 저항성 및 MET 엑손 14 스키핑 특이적 암을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 암은 MET 엑손 14 스키핑 양성 암을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 폐암, 위암, 신경아세포종, 골섬유성 이형성증(OFD)일 수 있다.

본 발명의 조성물은 핵산 전달체를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열과 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA 및 핵산 전달체를 포함하는, siRNA 복합체를 제공한다.

본 발명에서, 용어 “핵산 전달체(nucleic acid delivery system)”는 체내로의 전달효율을 높이기 위한 것으로, 체내에서의 안정성이 우수할 뿐 아니라 약물로서의 제조 공정이 간단하다는 장점이 있다.

상기 핵산 전달체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등을 포함할 수 있다. 바이러스성 벡터는 전달 효율이 높고 지속 시간이 긴 이점이 있고, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 백시니아바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector), 암세포 용해성 바이러스 벡터 등이 포함된다. 비바이러스 벡터(nonviral vector)는 플라즈미드를 포함할 수 있다. 그 외에도 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼, 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles) 등의 다양한 제형이 사용될 수 있다. 핵산 전달을 위한 양이온성 고분자에는 키토산, 아텔로콜라겐(atelocollagen), 양이온성 폴리펩타이드(cationic polypeptide) 등과 같은 천연고분자와 poly(L-lysin), 선형 또는 분지형 PEI(polyethylene imine), 사이클로덱스트린계열 다가양이온(cyclodextrin-based polycation), 덴드리머(dendrimer) 등과 같은 합성고분자가 포함될 수 있다.

siRNA가 상기와 같은 핵산 전달체와의 복합체 형태로 조성물에 포함되는 경우, siRNA를 효율적으로 타겟 세포로 전달을 촉진하여, 비교적 낮은 농도의 투여량으로도 타겟 세포로 전달되어 높은 타겟 유전자 발현 조절 기능을 나타낼 수 있다. 또한 타겟 이외의 타 장기 및 세포로의 비 특이적인 siRNA의 전달을 방지할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 조성물의 투여 대상 환자는 포유 동물, 바람직하게는 인간, 원숭이, 설치류 (마우스, 래트)일 수 있으며, 특히 MET 엑손 14 스키핑 발현과 관련되는 질병이나 증상을 가지거나, MET 엑손 14 스키핑을 가지며 MET의 발현 억제를 필요로 하는 모두 포유 동물, 예컨대, 인간일 수 있다.

MET 엑손 14 스키핑 개체에서 MET 발현 억제에 유효한 효과를 얻으면서 면역 반응 등의 바람직하지 않은 부반응을 최소화하기 위하여, 조성물 내의 siRNA의 농도, 또는 사용 또는 처리 농도는, 0.001 내지 1000nM, 바람직하게는 0.01 내지 100nM, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 10nM로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 서열번호 1로 표시되는 siRNA는 화학적으로 변형된 형태 또한 포함할 수 있으며, 추가적으로 본 발명의 siRNA 이외의 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하는 siRNA가 본 발명의 조성물에 추가적으로 포함될 수 있다. 상기와 같이 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 siRNA 이외에 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하는 siRNA를 모두 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 이용할 경우, 병용 요법(combination therapy)과 같이 상승적인 효과를 거둘 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 siRNA는 암의 치료를 위해 in vivo 또는 ex vivo 상에서 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명의 siRNA를 세포 내에 도입하게 되면 표적인 MET 엑손 14 스키핑 환자에서 MET의 발현을 억제하여 암의 생성에 관여하는 MET 엑손 14 스키핑의 발현이 억제되어 암세포의 분화가 억제되어 암세포가 사멸하고, 궁극적으로는 암의 치료가 가능하게 된다.

이와 같이, 본 발명의 siRNA와 함께 화학요법을 병용하여 화학요법제에 대한 민감도를 높임으로써 치료효과를 극대화하고 부작용을 감소시킬 수 있을 뿐 아니라, 각종 성장인자 (예컨대 VEGF, EGF, PDGF 등), 성장 인자 수용체 및 하위 신호전달 단백질, 바이러스성 종양유발인자, 항암제 내성 유전자의 발현을 저해하는 siRNA와 병용하여 암의 여러 경로를 동시에 차단함으로 항암효과를 극대화 할 수 있다.

본 발명이 제공하는 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 결합하는 siRNA는 MET 엑손 14 스키핑 개체에서 MET의 mRNA 발현을 저해시킬 뿐만 아니라, 해당 단백질의 발현을 현저하게 저해시킨다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MET 엑손 14 스키핑의 브레이크 포인트(breakpoint) 확인 및 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA의 설계

1.1 세포주의 선별 및 MET 엑손 14 스키핑의 브레이크 포인트 확인

먼저 MET 엑손 14 스키핑을 가진 세포주를 선별하였는데, H596 세포는 폐 선편평세포 암종 세포주로, MET 엑손 14 스키핑과 PIK3CA 돌연변이를 가진다. 한편, Hs746T 세포는 위암 세포주로, MET 엑손 14 스키핑과 MET 증폭을 모두 갖는 세포주이다. 선별한 상기 두 세포주에 대해 Sanger 시퀀싱을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, H596 세포주 및 Hs746T 세포주의 브레이크 포인트를 확인하였다.

1.2 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA의 설계 및 스크리닝

상기 실시예 1.1에서 확인한 MET 엑손 14 스키핑 브레이크 포인트에 특이적으로 작용하는 siRNA를 디자인하기 위해서, 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 14종의 siRNA를 제작하고 스크리닝을 수행하였다.

상기 표 1의 siRNA 중 MET 엑손 14 스키핑에 특이적인 siRNA를 스크리닝하기 위해서 설계된 14종의 siRNA의 in vitro 기능을 분석하였다. 구체적으로, 리포펙타민(lipofectamine)을 이용해서 각각의 siRNA를 H596 세포주에 형질감염시킨 후, MET 발현이 억제되는지 여부를 확인하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 3종의 siRNA로 형질감염시킨 H596 세포에서 MET 발현이 98% 이상 감소된 것을 확인하였고, 상기 3종의 siRNA(siRNA #1, siRNA #10, siRNA #14)를 선택하여 추가적인 스크리닝을 수행하였다.

선택된 3종의 siRNA 및 비교 실험군인 siRNA #8을 H596 세포주와 Hs746T 세포주에 각각 형질감염시킨 후, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 MET의 발현을 측정한 결과를 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 선택된 3종의 siRNA가 MET mRNA 발현 수준을 억제시키고 도 4에 나타낸 바와 같이, 선택된 3종의 siRNA가 MET 단백질의 발현 수준을 억제시키는 것을 확인하였다.

추가적으로, 선택된 3종의 siRNA가 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 작용하는지 여부를 확인하기 위해서, 야생형 MET를 발현하는 세포주인 인간 배아 신장 세포주 293FT, 위선암 세포주 MKN-45에 상기 3종의 siRNA를 형질감염시키고, qRT-PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 야생형 MET의 발현을 측정하였다. 측정 결과를 도 5 및 도 6에 각각 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 선택된 3종의 siRNA 중 야생형 MET mRNA 발현 수준을 억제시키는 siRNA는 2종이고, 야생형 MET mRNA 발현 수준을 억제시키지 않는 siRNA는 1종임을 확인하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 선택된 3종의 siRNA 중 야생형 MET 단백질 발현 수준을 억제시키는 siRNA는 2종이고, 야생형 MET 단백질 발현 수준을 억제시키지 않는 siRNA는 1종임을 확인하였다.

따라서, 상기 선택된 3종의 siRNA 중 야생형 MET에 작용하지 않고 MET 엑손 14 스키핑에 특이적인 siRNA 1종(siRNA #10)을 선별하고, 하기의 실험에 사용하였다.

실시예 2: MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA의 세포증식억제 효과 확인

상기 실시예 1에서 선별한 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA가 세포증식억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해 하기와 같이 수행하였다.

위암 세포주인 Hs746T 세포주에 상기 실시예 1에서 선별한 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA를 형질감염시킨 후 6일차에 세포증식 변화를 확인하였다. 대조군으로는 인간, 마우스, 랫트의 공지된 유전자들에 대한 상동성이 낮은 서열로 제작된 siRNA를 사용하였으며, 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, MET 엑손 14 스키핑을 갖는 세포주인 Hs746T 세포주에 본 발명의 siRNA를 형질감염시킨 결과 암세포증식이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였고 MET의 발현이 감소함을 확인하였다.

실시예 3: 크리조티닙 저항성 세포주에서 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA의 세포증식억제 효과 확인

상기 실시예 1 및 2 에서 선별한 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA가 크리조티닙 저항성 세포의 세포증식억제 효과를 나타내는지 확인하기 위해 하기와 같이 수행하였다.

MET 엑손 14 스키핑과 PIK3CA 돌연변이를 가진 크리조티닙 저항성 세포주인 H596 세포주에 상기 실시예 1 및 2 에서 선별한 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA를 형질감염하고 크리조티닙을 처리한 후 4일차에 세포증식 변화를 확인하고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, H596 세포주에서 본 발명의 siRNA를 형질감염시키고 크리조티니닙을 처리한 결과 암세포증식이 더욱더 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 MET 엑손 14 스키핑 특이적 siRNA는 암세포에 존재하는 MET 엑손 14 스키핑에 특이적으로 작용하여 암세포 증식을 억제시키는 효과뿐만 아니라 크리조티닙 저항성 세포주에서도 세포증식억제 효과가 있으므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> MET exon 14 skipping specific siRNA and pharmaceutical composition for preventing or treating of cancer containing the same <130> 1_39 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MET exon 14 skipping specific siRNA <400> 1 gcaaattaaa gatcagttt 19

Claims

서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, siRNA(small interfering RNA).
제1항에 있어서, 상기 siRNA는 MET(mesenchymal-epithelial transition factor) 엑손 14 스키핑(MET exon 14 skipping)에 특이적으로 결합하는 것인, siRNA.
제1항에 있어서, 상기 siRNA가 화학적으로 변형된 것인, siRNA.
제3항에 있어서, 상기 화학적 변형은 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´탄소 위치에서 -OH기가 -CH₃, -OCH₃, -NH₂, -F, -O-2-메톡시에틸 -O-프로필, -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형; PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형;으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, siRNA.
서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열 및 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 MET 엑손 14 스키핑 양성 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 크리조티닙(Crizotinib) 저항성 및 MET 엑손 14 스키핑 특이적 암인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경아세포종, 및 골섬유성 이형성증(Osteofibrous dysplasia; OFD)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 핵산 전달체를 더 포함하는, 조성물.
서열번호 1로 표시되는 센스(sense) 서열과 이의 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 siRNA 및 핵산 전달체를 포함하는, siRNA 복합체.
제10항에 있어서, 상기 핵산 전달체는 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 리포좀, 양이온성 고분자, 미셀(micelle), 에멀젼 및 지질 나노입자(solid lipid nanoparticles)로 구성된 군에서 선택되는 것인, siRNA 복합체.