KR20220141966A - 육종의 진단 및 치료를 위한 tjp1의 용도 - Google Patents

육종의 진단 및 치료를 위한 tjp1의 용도 Download PDF

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강현귀
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이은영
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Abstract

본 발명자들은 TJP1의 발현이 정상 조직 대비 육종 환자 조직에서 특이적으로 증가되어 있으며, TJP1의 발현이 높을수록 예후가 좋지 않은 것을 확인하였다. 또한, TJP1 발현이 억제된 암세포는 세포간 응집이 저해되어 안정적으로 성장하지 못해 종양 발달이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 TJP1 발현 억제 세포주는 정상 암세포에 비해 항암제에 대한 민감성이 증가하여 항암제에 의한 세포사멸 효과가 더욱 커지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 TJP1은 육종 진단 및 예후 예측 용도로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 육종의 예방 및 치료 용도와 더불어 항암제 효과를 증진시키기 위한 용도로 활용될 수 있다.

Description

육종의 진단 및 치료를 위한 TJP1의 용도 {Use of TJP1 for the prognosis and treatment of sarcoma}
본 발명은 육종의 진단 및 치료를 위한 TJP1의 용도 등에 관한 것이다.
육종(sarcoma)은 뼈, 연골, 근육, 지방, 신경, 혈관 등의 비상피성 결합조직에서 발생한 종양으로, 크게 뼈에서 발생하는 악성 골종양(osteosarcoma) 및 피부, 지방, 신경, 혈관, 근육 등 연부조직에서 발생하는 연부조직 육종(soft tissue sarcoma)으로 구분된다. 연부조직 육종은 성인암의 약 1%를 차지하는 희귀한 악성 종양으로, 기원 세포에 따라 약 70개의 아형으로 나뉠 수 있다. 최근 분자 프로파일링 등을 통해 미분화 다형세포 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma, UPS), 점액섬유종(myxofibrosarcoma, MFS), 및 평활근육종(leiomyosarcoma, LMS)과 같은 여러 핵형 육종(karyotype sarcoma)에 대한 이해도가 높아졌으나, 효과적인 육종 진단 및 치료 방법은 여전히 발굴되지 않고 있다.
평활근육종은 평활근 기원(예를 들어, 자궁, 복막, 혈관 등)의 악성 종양으로서 연부조직 육종의 10-20%를 차지한다. 평활근육종의 약 20-30%는 국소적으로 재발하고, 재발된 평활근육종의 40-50%는 전이되는 것으로 알려져 있다(SEER Cancer Statistics Review, 1975-2014, National Cancer Institute). 특히, 원격 전이(distant metastases)가 일어난 평활근육종 환자의 평균 생존 기간은 약 12개월로, 예후가 매우 좋지 않다(J Biol Chem 273:29745-29753). 따라서, 이를 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 시급하다.
평활근육종의 주요 치료 방법으로는 수술에 의한 절제, 방사선 치료요법, 및 이포스파미드(ifosfamide), 독소루비신(doxorubicin), 젬시타빈(gemcitabine) 등 약물을 이용한 화학요법 등이 있다. 특히 수술이나 방사선 치료가 불가능한 환자나 암이 전이된 환자는 주로 화학요법을 적용하지만, 항암 화학요법의 가장 큰 장애가 되는 요소는 암세포의 항암제 내성이다. 새로운 화학요법 약물이 계속해서 개발되고 있으며, 투여하는 방법도 다양해지고 있으나, 아직까지 암세포의 내성을 방지하면서 효과적으로 평활근육종을 치료할 수 있는 치료법은 알려져 있지 않다.
세포-세포 연접(cell-cell adhesion)은 미세환경(microenvironment) 내에서 세포간 상호작용을 위한 하나의 경로로서, 특히 부착연접(adherens junction), 간극연접(gap junction), 밀착연접(tight junction)이 잘 알려져 있다. 암세포 사이의 연접을 통한 세포 응집(aggregation)은 암세포를 안정화하여 종양 성장을 촉진하고 화학요법에 대한 내성 발달에 기여할 수 있다. 따라서, 세포간 응집을 저해하면 종양 성장을 효과적으로 억제할 수 있을 것으로 기대되나, 이와 같은 항암 요법에 대한 적극적인 연구는 미비한 실정이다.
대한민국 등록특허 제10-1191958호
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, TJP1(Tight junction protein 1)의 발현이 육종에서 특이적으로 증가되어 있으며, TJP1 억제제 자체가 육종 치료 효과가 있음은 물론 육종 세포주의 항암제에 대한 민감도를 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 TJP1의 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는 육종 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TJP1 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 육종 진단 또는 예후 예측 방법에 필요한 정보를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 육종 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암제 병용투여용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 TJP1(Tight junction protein 1) 단백질 및/또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머(aptamer)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 포함하는, 육종 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 육종 진단 또는 예후 예측 방법; 또는 이에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다: (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TJP1 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (S2) 단계 (S1)에서 측정된 TJP1 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 육종으로 판정하거나 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 양태에서, 상기 예후는 재발, 전체 생존(overall survival), 및 무질병 생존(disease-free survival)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 방법이 육종 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 정상 샘플이고, 상기 방법이 육종의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 육종 샘플일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 육종 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 육종 예방 또는 치료를 위한 TJP1 억제제의 용도를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 육종 치료용 약제 제조를 위한 TJP1 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 TJP1 억제제는 TJP1 특이적 CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein), shRNA(short-hairpin RNA), miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 TJP1의 C-말단 특이적 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 CRISPR-Cas는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함하는 guide RNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 TJP1 억제제는 TJP1의 발현을 억제시킴으로써 암세포간 응집을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 육종은 연부조직 육종(soft tissue sarcoma)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 연부조직 육종은 미분화 육종(undifferentiated sarcoma), 미분화 다형성 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma), 융기피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 섬유육종(fibrosarcoma), 연부조직 유잉육종(soft tissue Ewing's sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 점액섬유육종(myxofibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 활막육종(synovial sarcoma), 다형세포 육종(pleomorphic sarcoma), 방추세포 육종(spindle cell sarcoma), 자궁육종(gynaecological sarcoma), 복막후부 육종(retroperitoneal sarcoma), 위장관기질종양(gastrointestinal stromal tumor), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 악성 말초 신경초 종양(malignant peripheral nerve sheath tumor), 폐포성 연부조직 육종(alveolar soft part sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 투명세포 육종(clear cell sarcoma), 데스모이드형 섬유종증(desmoid/aggressive fibromatosis), 및 혈관육종(angiosarcoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 TJP1은 정상 조직에 비해 육종 조직에서 발현이 특이적으로 증가되어 있을 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 TJP1의 돌연변이를 수반하는 육종 환자의 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 TJP1의 돌연변이는 TJP1의 발현 증가 또는 활성 증가일 수 있다.
또한, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 항암제 병용투여용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 항암제와 함께 병용투여하는 단계를 포함하는, 육종 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 항암제 병용투여용 약물 제조를 위한 TJP1의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 항암제는 화학항암제, 표적항암제, 및 면역항암제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기 병용투여용 약학적 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: (a) 상기 화학항암제는 독소루비신(doxorubicin) 및 알벤다졸(albendazole)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임; (b) 상기 표적항암제는 제피티닙(gefitinib), Bay-11-7085, 및 sb225002로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임; 또는 (c) 상기 면역항암제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 및 CTLA4 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 ROS 포획제(reactive oxygen species(ROS) scavenger)를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 상기 ROS 포획제는 n-아세틸시스테인(N-acetyl-cysteine, NAC)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 면역관문억제제의 효능 증진을 위한 TJP1 억제제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 면역관문억제제 병용투여용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 TJP1의 발현이 정상 조직 대비 육종 환자 조직에서 특이적으로 증가되어 있으며, 특히 TJP1의 발현이 높을수록 예후가 좋지 않은 것을 확인하였다. 또한, TJP1 발현이 억제된 암세포는 세포간 응집이 저해되어 안정적으로 성장하지 못해 종양 발달이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 TJP1 발현 억제 세포주는 정상 암세포에 비해 항암제에 대한 민감성이 증가하여 항암제에 의한 세포사멸 효과가 더욱 커지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 TJP1은 육종 진단 및 예후 예측 용도로 활용될 수 있을 뿐만 아니라, 육종의 예방 및 치료 용도와 더불어 항암제 효과를 증진시키기 위한 용도로 활용될 수 있다.
도 1은 TJP1 발현에 따른 암 환자의 예후를 나타낸다(좌측, TJP1 발현에 따른 전체 생존기간; 우측, TJP1 발현에 따른 무질병 생존기간).
도 2는 정상조직과 암조직의 상대적인 TJP1 mRNA 발현 수준을 나타낸다.
도 3은 TJP1 발현과 관련된 변이의 분포도를 나타낸 것으로, TJP1의 발현 변이가 주로 평활근육종에서 나타남을 보여준다.
도 4는 평활근육종 조직 및 미분화 육종 조직에서의 TJP1 발현 수준을 나타낸다(MFS, 점액섬유육종; LMS, 평활근육종; US, 미분화 육종).
도 5a는 인접 정상 조직과 평활근육종 종양 조직에서의 상대적인 TJP1 발현 수준을 나타낸다.
도 5b는 종양 상태(원발성, 재발성, 전이성)에 따른 상대적인 TJP1 발현 수준을 나타낸다(primary, 원발성; recurred, 재발성; metastatic, 전이성).
도 6은 인접 정상 조직 대비 평활근육종 종양 조직의 TJP1 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 상피세포주 및 간엽세포주에서의 TJP1 발현을 면역블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 평활근육종 세포주에서의 TJP1 발현을 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 평활근육종 세포주에서의 TJP1 발현을 real-time PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 상피세포주인 MCF7 세포(상단) 및 평활근육종 세포주인 SK-LMS-1 세포(하단)에서 면역형광 염색법으로 F-actin, TJP1, 및 핵을 염색한 결과를 나타낸다(붉은색, F-actin; 녹색, TJP1; 파란색, 핵).
도 11은 렌티바이러스 또는 CRISPR/CAS9 시스템을 이용하여 TJP1 발현 억제 세포주를 제조한 후, RT-PCR 및 면역블롯팅으로 TJP1 발현을 확인한 결과를 나타낸다(Parental, 아무것도 처리하지 않은 SK-LMS-1 세포; Sh-Control, 대조군 shRNA를 처리한 SK-LMS-1 세포; Sh-TJP1, TJP1 특이적 shRNA를 처리한 SK-LMS-1 세포; Mock, 대조군 CRISPR/Cas9을 처리한 SK-LMS-1 세포; TJP1KO, TJP1 특이적 CRIPPR를 처리한 SK-LMS-1 세포, 이하 동일).
도 12는 파이브로넥틴(fibronectin)으로 코팅된 플레이트에서 TJP1 발현 억제 세포주를 배양한 후 24시간마다 세포 수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 연한천(soft agar) 플레이트에서 TJP1 발현 억제 세포주가 비부착 성장(anchorage-independent growth)하도록 배양한 후, 세포로부터 형성된 콜로니를 염색하고(좌측) 정량분석한 결과(우측)를 나타낸다.
도 14는 코팅되지 않은 플레이트에서 TJP1을 배양한 후, 세포-세포 응집체를 관찰하고(좌측) 정량분석한 결과(우측)를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서 TJP1 발현 억제 세포주로 in vivo 모델을 제작한 과정을 나타낸다.
도 16은 세포 또는 플라시보를 마우스에 근육 내 주사한 후, 뒷다리 너비를 측정한 결과를 나타낸다.
도 17은 [18F-FDG] PET/CT 이미징으로 마우스에서의 종양 성장을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 18은 마우스 모델의 우측 뒷다리의 주사 부위로부터 조직을 추출하여 H&E 염색으로 염색한 결과를 나타낸다.
도 19는 Sh-Control 세포를 이식한 마우스 모델의 종양 조직의 H&E 염색 결과를 나타낸다(노란색 화살표: 유사분열기 세포).
도 20은 SK-LMS-1 세포 또는 Sh-Control 세포를 이식한 마우스 모델의 종양 조직에서 Ki67 및 F4/80를 검출하기 위한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다.
도 21은 TJP1 발현 억제시 발현이 증가(붉은색), 감소(파란색), 또는 변화가 없는(검은색) 유전자들을 나타낸다.
도 22는 TJP1 발현 억제시 발현이 변화한 유전자들과 관련된 신호전달 경로들을 나타낸다.
도 23은 TJP1 발현 억제에 따른 유전자들의 발현 변화를 면역블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 24는 암세포의 신호전달과 관련 있는 84가지 유전자를 SK-LMS-1 세포에서의 TJP1 발현 억제에 따른 mRNA 발현 변화 정도를 기준으로 세 그룹으로 분류한 것이다.
도 25는 TJP1 발현이 억제된 SK-LMS-1 세포에서 유전자별 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 26은 TJP1 발현이 억제된 SK-LMS-1 세포에서 유전자별 발현 변화를 면역블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 27은 도 26에서 발현 변화 중간 그룹(intermediate) 및 발현 변화 높음 그룹(high)에 해당하는 유전자들의 평활근육종에서의 발현 변이 빈도(alteration frequency)를 TCGA로 분석한 결과를 나타낸다.
도 28은 TJP1 발현 억제에 따라 발현 변화를 보인 15개 유전자간의 네트워크를 String-DB 소프트웨어로 분석한 결과를 나타낸다.
도 29는 TJP1 발현 억제 여부에 따른 항암제 반응성 정도를 세포 생존능 분석으로 확인한 결과를 나타낸다: 도 29a, TJP1 발현 수준에 따른 화학항암제(독소루비신, 알벤다졸)의 항암 효과; 도 29b, TJP1 발현 수준에 따른 표적항암제(제피티닙, Bay-11-7085, sb225002)의 항암 효과; 도 29c, TJP1 발현 수준에 따른 ROS 포획제(NAC) 및/또는 알벤다졸의 항암 효과.
도 30은 평활근육종에서 발현이 상위 10% 이내인 1,816개 유전자에 대해 유전자-유전자 상관관계(연관성) 분석을 수행하여 2개 클러스터를 확인한 결과를 나타낸다(붉은색은 높은 연관성을, 파란색은 낮은 연관성을 나타냄)
도 31은 도 30에서 확인한 2개 클러스터에 해당하는 유전자들을 발현 수준과 함께 나열한 것이다(클러스터 1: 152개 유전자, 클러스터 2: 126개 유전자)(행: 유전자, 열: LMS 환자 ID).
도 32는 상기 2개 클러스터의 유전자들을 관련 신호전달 경로를 기준으로 분류한 결과를 나타낸다(검은색 막대: 클러스터 1에 해당하는 유전자들과 관련된 신호전달 경로, 회색 막대: 클러스터 2에 해당하는 유전자들과 관련된 신호전달 경로).
도 33은 평활근육종 전사체(transcriptome)를 SIC 분류에 따라 분석한 결과를 나타낸다.
도 34는 TJP1과 상관관계가 있는 것으로 확인된 유전자들을 도 33에 표시된 것과 동일한 조직 순서로, 발현 수준에 따라 클러스터링한 결과를 나타낸다.
도 35는 면역관문 단백질(PD-1, PDL-1, 및 CTLA4)의 전사체 데이터를 도 33 및 도 34와 동일한 조직 순서로 나타낸 것이다.
도 36은 TJP1 및 CTLA4 (상단); 및 CTLA4 및 CSF1 사이 (하단)의 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficients)를 산포도(scatter plot)로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 연부조직 육종, 특히 평활근육종에서 TJP1의 발현이 특이적으로 증가되어 있으며 TJP1의 발현이 높은 환자일수록 예후가 좋지 않음을 관찰하여, TJP1이 육종을 진단할 수 있는 신규한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 육종 세포에서 TJP1 발현이 억제되면 세포간 응집이 저해되고, 동물에 주입시 종양 조직을 형성하지 못하는 것을 관찰하여, TJP1이 육종의 치료 타겟이 될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는, 공공 데이터베이스 TCGA를 이용해 육종 및 평활근육종에서의 TJP1 발현 양상을 관찰한 결과, 정상 조직에 비해 다양한 아형의 연부조직 육종 조직에서 TJP1 발현이 더 높고, TJP1의 발현이 높을수록 연부조직 육종의 예후가 좋지 않은 것을 확인하였다. 특히 평활근육종 조직에서 인접 정상 조직에 비해 TJP1의 발현이 높은 것으로 나타났으며, 재발성 종양 조직에서는 TJP1 발현이 더욱 증가된 것을 관찰한 바, TJP1의 발현 증가가 연부조직 육종 및 평활근육종과 연관이 있으며, 예후와도 관련이 있음을 확인하였다(실시예 1).
본 발명의 다른 실시예에서는, 다양한 세포주에서 TJP1 발현 수준을 비교한 결과, 기타 세포주에 비해 연부조직 육종 세포주에서 TJP1 발현이 높고, 특히 평활근육종 세포주에서 TJP1 발현 수준이 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CRISPR-Cas9 시스템 및 shRNA를 이용해 TJP1 발현 억제 세포주를 제작하고, 이의 성장을 관찰하였다. 그 결과, TJP1 발현이 억제되면 특히 비부착 성장(anchorage-independent growth)이 저해되어 콜로니 형성이 감소하고, 세포-세포 응집체의 형성도 감소함을 관찰한 바, TJP1이 비부착 성장 및 세포 응집을 통해 종양세포 및 조직을 안정화함을 확인하였다(실시예 3).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, TJP1 발현 억제 세포주 또는 TJP1 정상 발현 세포주를 마우스에 주입한 결과 후자의 경우만 마우스에서 종양 조직이 형성된 바, TJP1이 종양 조직 성장에 필수적임을 in vivo에서도 확인하였다(실시예 4).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, TJP1 발현 억제 세포주 및 대조군 세포의 RNA 분석을 통해 TJP1의 발현 억제에 따라 발현이 변화한 암-관련 유전자를 선별하여, TJP1이 NF-κB 및 JAK/STAT을 포함한 여러 암 관련 신호전달 경로를 매개하는 것을 확인하였다(실시예 5).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, TJP1 발현 억제 세포주의 RNA를 추가로 분석하여 TJP1 발현 억제에 따라 세포주기 조절 유전자, 세포자멸사 관련 유전자, 오토파지 관련 유전자, 세포-세포 응집 관련 유전자 등의 발현이 변화한 것을 확인하였으며, 또한 TJP1의 영향을 받는 유전자들이 정상 조직 대비 평활근육종 조직에서 유의미한 발현 변화를 가짐을 확인하였는 바, TJP1이 암세포 생존 및 증식에 관여한다는 것을 다시 검증하였다(실시예 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, TJP1 발현 억제 세포주 및 TJP1 정상 발현 세포주에 화학항암제(독소루비신, 알벤다졸), 표적항암제(제피티닙, Bay-117085, sb225002)을 처리한 후 세포 생존능을 관찰한 결과, TJP1 발현이 억제된 세포주에서 항암제에 대한 반응성이 증가하여 세포자멸사가 더 많이 일어난 것을 확인하였으며, 항암보조제인 NAC을 단독으로 처리하거나 알벤다졸과 함께 처리하는 경우에도 TJP1 발현이 억제된 세포주에서 세포사멸이 더욱 활발히 일어난 것을 관찰한 바, TJP1 발현 억제가 항암제에 대한 암세포의 민감도를 증진시키는 것을 확인하였다(실시예 7).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, TCGA를 이용해 평활근육종 조직의 전사체 데이터를 분석한 결과, 면역기능이 높은 육종 조직에서는 TJP1 발현이 낮다는 것과, TJP1 발현과 면역관문 단백질 PD-1, PDL-1, 및 CTLA4의 RNA 발현 사이에 관련성이 있음을 관찰한 바, TJP1 억제제를 면역관문억제제의 효능 증진을 위한 보조제(즉, 면역관문억제제의 조절제)로 활용할 수 있음을 확인하였다(실시예 8).
종합하여, 본 발명자들은 TJP1의 육종 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커이자 육종 치료를 위한 치료 타겟으로서의 유용성을 확인하였으며, 나아가 기존 항암제의 효과를 증가시킬 수 있는 항암제 병용투여용 약물 및 면역관문억제 조절제로서의 잠재성까지 확인하였다. 이에 본 발명은 TJP1 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 진단용 조성물, 육종 치료용 약학적 조성물, 및 항암제 병용투여용 약학적 조성물 등을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 TJP1(Tight junction protein 1) 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, “TJP1(Tight junction protein 1)”은 밀착연접(tight junction)에 관여하는 단백질로, 클라우딘(claudins), 연접 부착 분자(junctional adhesion molecules), 및 오클루딘(occludin)과 같은 막관통 단백질들을 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결함으로써 세포-세포간 응집을 매개하는 것으로 알려져 있다. 상기 TJP1의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 예를 들어 인간 TJP1은 단백질 데이터베이스 UniProt에서 Q07157로 검색할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “육종(sarcoma)”은 간엽(mesenchymal) 기원의 비상피성 세포로부터 유래되는 악성종양을 의미하며 뼈, 지방, 근육, 신경, 인대, 혈관, 림프관 등 간엽세포(mesenchymal cell)로 이루어진 결합조직에서 발생한다. 육종은 종양이 발생하는 조직 또는 세포 유형에 따라 다양한 종류로 분류될 수 있는데, 크게는 근육 또는 혈관과 같은 연부조직(soft tissue)에서 발생하는 연부조직 육종; 및 뼈에서 발생하는 골육종(bone sarcoma)로 구별된다. 하위분류는 약 70여개로 나뉘는데, 대표적인 예로는 미분화 육종(undifferentiated sarcoma), 미분화 다형성 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma), 악성 골종양(osteosarcoma), 융기피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 섬유육종(fibrosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 유잉육종(Ewing's sarcoma), 연부조직 유잉육종(soft tissue Ewing's sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 점액섬유육종(myxofibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 활막육종(synovial sarcoma), 다형세포 육종(pleomorphic sarcoma), 방추세포 육종(spindle cell sarcoma), 자궁육종(gynaecological sarcoma), 복막후부 육종(retroperitoneal sarcoma), 골거대세포종(giant cell tumour of the bone), 위장관기질종양(gastrointestinal stromal tumor), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 악성 말초 신경초 종양(malignant peripheral nerve sheath tumor), 폐포성 연부조직 육종(alveolar soft part sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 투명세포 육종(clear cell sarcoma), 척색종(chordoma), 데스모이드형 섬유종증(desmoid/aggressive fibromatosis), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 혈관육종(angiosarcoma) 등이 있다.
본 발명에 있어서 “육종”은 바람직하게는 “연부조직 육종(soft tissue sarcoma, STS)”일 수 있으며, 가장 바람직하게는 평활근에서 발생하는 악성 종양인 “평활근육종(leiomyosarcoma, LMS)”일 수 있다. 평활근육종은 복부에서 흔하게 발생하나, 자궁 등 신체 다양한 부위에서 발생할 수 있다. 연부조직 육종의 병기(grade)는 F
Figure pat00001
d
Figure pat00002
ration Nationale des Centres de Lutte Contre Le Cancer (FNCLCC) 기준에 따라 1 내지 4기의 4단계로 분류할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “단백질”은 “폴리펩타이드(polypeptide)” 또는 “펩타이드(peptide)”와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)” 또는 “핵산”은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. “mRNA”는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “발현(expression)”은 세포에서 단백질 또는 핵산(예컨대, mRNA)이 생성되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 육종은 인간을 포함한 포유류에서 발병하는 것일 수 있다. 상기 포유류는, 예를 들어, 사람, 개, 고양이, 마우스, 토끼, 말, 양, 햄스터, 고슴도치, 페럿(ferret), 또는 기니 피그(guinea pig)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 TJP1은 정상 조직에 비해 육종 조직에서 발현이 특이적으로 증가하는 것일 수 있다.
본 발명의 조성물이 TJP1의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 TJP1의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “프라이머”는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 TJP1 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 TJP1 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 정방향 프라이머로서 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 서열번호 4로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 6으로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 서열 상동성은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 포함한다. 염기서열, 즉 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 프라이머 세트는 역방향 프라이머로서 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 서열번호 5로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 프라이머; 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 프라이머를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “프로브”란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, TJP1 단백질을 코딩하는 유전자는 그 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
특히 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트 고체지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 모든 기능적 등가물을 포함한다. 또한, 전술한 “프라이머” 또는 “프로브”에 관한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
상기 “기능적 등가물”이라는 용어는 예를 들어, 기준(reference) 서열로부터 하나 또는 그 이상의 치환, 결실 또는 부가, 기준(reference) 서열과 실험(subject) 서열 사이의 다양한 기능적 비유사성을 낳지 않는 실제 효과(net effect) 등 변화된 돌연변이 서열의 뉴클레오티드와 핵산서열 모두를 의미한다. 그런 서열은 나열된 서열과 65%의 서열 동일성을 갖는다. 본 발명에 따른 실질적 등가물인, 예를 들어 돌연변이, 아미노산 서열은 나열된 아미노산 서열과 바람직하게는 최소한 80%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 90%의 서열 동일성을 갖는다. 실질적 등가물인 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어, 유전자 암호의 중복(redundancy) 또는 축퇴(degeneracy)를 고려할 때, 더 낮은 백분율의 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열은 최소한 약 65%의 동일성, 보다 바람직하게는 최소한 약 75%의 동일성, 가장 바람직하게는 약 95%의 동일성을 가져야 한다. 본 발명의 목적을 위해서는, 실질적으로 등가적인 생물학적 활성과 실질적으로 등가적인 합성 특징을 가지는 서열들은 실질적 등가물로 취급된다. 등가물을 결정하기 위해, 성숙 서열(예를 들어, 위(spurious) 종결코돈(stop codon)을 제조하는 돌연변이를 통한)의 절단(truncation)은 무시되어야 한다.
한편, 본 발명의 조성물이 TJP1 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 것인 경우에 TJP1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 결합하는 특이적인 항체 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 본 발명 단백질에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머(aptamer)”는 시료 내의 검출하고자 하는 분석물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는 것으로, 특이적으로 시료 내의 표적 단백질의 존재를 확인할 수 있다. 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 앱타머 칩의 관능기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 NH2로 변형을 시킴으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
TJP1 단백질의 아미노산 서열은 공지되어 있으므로 본 발명의 항체 또는 앱타머는 TJP1 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야 등에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 이 때 항원으로 사용되는 TJP1 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며, 공지된 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 따라 제조할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하는 경우 TJP1 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 TJP1 단백질이 발현되도록 숙주세포를 배양한 후 형질전환체로부터 TJP1 단백질을 회수함으로써 수득할 수 있다.
다클론 항체는 TJP1 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519, 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 TJP1 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 본 발명의 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체(본 발명에서는 피검체로부터 수득한 생물학적 시료)에서 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 진단용 조성물을 포함하는 육종 진단용 키트를 제공할 수 있다.
상기 본 발명의 키트에는 표적 단백질을 마커로 인식하는 항체 또는 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머 세트, 프로브뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자, 즉 TJP1 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트를 포함한다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
다른 구체적인 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 TJP1 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머 외에 면역학적 분석에 사용되는, 당업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학 염색법, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결면역흡착검사법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다.
상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 본 발명의 키트에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 육종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다: (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TJP1 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (S2) 단계 (S1)에서 측정된 TJP1 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 육종으로 판정하거나 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 단계.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 방법이 육종 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 정상 샘플이고; 상기 방법이 육종의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 육종 샘플일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “예후”는 병의 발생, 진행, 회복, 재발, 및 약물 내성 등에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 육종의 발생, 전이, 치료 후 재발, 육종으로 인한 사망, 육종으로부터의 전체 생존(overall survival), 또는 무질병생존(disease-free survival)을 의미할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, “예후가 좋지 않다”는 것은, 육종 발생 위험, 전이 위험, 치료 후 재발 위험, 또는 육종으로 인한 사망이 높다는 것을 의미하거나, 육종으로부터의 전체 생존 기간 또는 무질병생존 기간이 짧은 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “측정”은 목적하는 물질(본 발명에서의 마커 mRNA 또는 단백질)의 존재(발현) 여부를 측정 및 확인하는 것, 또는 목적하는 물질의 존재 수준(발현 수준)의 변화를 측정 및 확인하는 것을 모두 포함하는 의미이다. 즉, 상기 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것은 발현 여부를 측정하는 것(즉, 발현 유무를 측정하는 것); 또는 상기 mRNA 또는 단백질의 질적, 양적 변화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 상기 측정은 정성적인 방법(분석)과 정량적인 방법을 모두 포함하여 제한 없이 수행될 수 있다. mRNA 수준 또는 단백질 수준의 측정에 있어서 정성적 방법과 정량적 방법의 종류는 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서에서 기술한 실험법들이 이에 포함된다. 각 방법 별로 구체적 단백질 수준 비교 방식은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서 상기 목적 mRNA 또는 단백질 검출은 TJP1 mRNA 또는 단백질의 존재 여부의 검출, 또는 상기 mRNA 또는 단백질 발현량의 증가(상향 조절) 또는 감소(하향 조절)를 확인하는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 육종, 특히 평활근육종을 진단하거나 악성도를 평가하고자 하는 피검체에서 채취된 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 생검 등으로 얻어진 조직, 세포, 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물, 소변, 뇌척수액, 골수 등 생체 시료뿐만 아니라 미세침흡인 검체 또한 포함한다. 바람직하게는 생물학적 조직 시료 또는 세포 시료, 예를 들어 병변 조직에서 유래한 세포, 조직, 기관, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에서 측정될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 상기 시료는 단백질 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 환자로부터 수득한 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 유전자 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법에 특별한 제한은 없으나, 예를 들어 PCR(RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR 등), RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅(northern blotting), 사우던 블롯팅(southern blotting), In situ 교잡법 및 마이크로어레이 칩(microarray chip)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 단백질 발현 수준 측정 역시 당업계에 공지된 단백질 발현 측정 방법에 의한 것이라면 측정 방법이 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블롯팅(면역 블롯팅), ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법(Ouchterlony immunodiffusion), 로케트 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis), 면역염색법, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 질량분석법(Mass spectrometry), FACS 및 단백질칩으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, TJP1 발현 수준이 대조군에 비해 증가되어 있다는 것은, 피검체의 TJP1 발현 수준이 대조군의 그것에 비교하여 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상, 예를 들어, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 또는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상 높은 것, 및/또는 0.5배, 1.1배, 1.2배, 1.4배, 1.6배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배 또는 그 이상 높은 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 육종 예방 또는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, “TJP1 억제제”란 TJP1 유전자의 발현을 억제하거나 TJP1 단백질의 기능을 저해할 수 있는 물질이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 TJP1 유전자의 mRNA 발현 또는 단백질 발현을 억제하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 TJP1 유전자의 발현을 억제하는 제제는 TJP1에 특이적인 miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), shRNA(short-hairpin RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein), 및 TJP1의 C-말단 특이적 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, "miRNA, siRNA 및 shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개하기 위하여 주로 목적 유전자로부터 전사된 mRNA에 결합하여, 상기 mRNA의 해독을 저해하는 핵산 분자를 의미한다. 상기 miRNA, siRNA 및 shRNA는 표적 유전자의 발현을 해독수준에서 억제할 수 있기 때문에, 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법에 사용될 수 있다.
특히 shRNA는 보다 안정적인 유전자 녹다운을 유도할 수 있는 플라스미드 기반 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 방법이다. 세포에 shRNA 발현용 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 박테리아 벡터를 도입시킴으로써 shRNA를 발현시킬 수 있으며, Dicer에 의해 가공된 shRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합해 상보적인 염기서열을 가진 타겟 mRNA를 분해함으로써 타겟 유전자의 발현을 억제한다.
따라서, 본 발명에 있어서 TJP1 억제제인 shRNA는 TJP1의 공지된 mRNA 서열 중 일부 또는 전부에 대해 상보적인 서열을 가짐으로써 이를 표적으로 하여 분해할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 본 발명자들은 TJP1을 표적으로 하는 shRNA의 예로 Santacruz biotechnology사의 TJP1 shRNA 렌티바이러스 입자(sc-29829-V)를 구매하여 사용했으나, 이는 TJP1 특이적 shRNA의 대표적인 예시일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어, “CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein)”는 특정 염기서열을 인지하여 해당 부위의 DNA를 절단함으로써 발현을 억제할 수 있는 제한효소 시스템을 지칭하며, 편집하고자 하는 부위의 DNA(타겟 DNA)에 상보적으로 결합하는 RNA인 “guide RNA”; 및 guide RNA가 타겟 DNA에 결합하면 뉴클레아제(nuclease) 활성을 통해 해당 타겟 DNA를 분해하는 단백질인 “Cas”를 포함한다. 구체적으로는, 상기 guide RNA는 Cas 단백질에 결합해 복합체를 형성할 수 있게 하는 스캐폴드 서열 및 타겟 DNA에 결합하는 crRNA(CRISPR RNA) 서열을 포함한다. 본 발명에 있어서, guide RNA는 특히 Cas 단백질을 표적 DNA로 유도하는 crRNA를 의미할 수 있다.
상기 Cas 단백질은 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 갖는다면, 어떠한 Cas 단백질도 제한 없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 발명의 CRISPR/Cas9의 guide RNA는 Cas 단백질을 TJP1 유전자로 유도하여 이를 절단할 수 있게 하는 것이라면 제한없이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 guide RNA는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 염기서열로 코딩될 수 있으나, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 코딩될 수 있다.
본 발명에 있어서 “TJP1의 C-말단 특이적 펩타이드”는 TJP1의 C-말단에 특이적으로 결합하여 TJP1과 다른 단백질 사이의 결합을 방해하여, TJP1의 암세포 생존 촉진 기능을 방해하는 펩타이드를 의미한다. 따라서, 상기 TJP1의 C-말단 특이적 펩타이드는 TJP1의 C-말단(약 800개 아미노산)에 결합할 수 있는 펩타이드라면 제한없이 포함될 수 있으며, 상술한 바와 같이 TJP1의 서열은 공지되어 있으므로 통상의 기술자는 이를 바탕으로 적절한 C-말단 특이적 펩타이드를 제조할 수 있다. 바람직하게는, 상기 C-말단 특이적 펩타이드는 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있고, 더욱 바람직하게는 10 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적인 양태로서, 본 발명의 TJP1 억제제는 TJP1 발현을 억제시켜 암세포간 접합(junction)을 저해할 수 있으며, 특히 암세포간 응집(aggregation)을 저해할 수 있다. 즉, 본 발명의 TJP1 억제제는 TJP1의 발현을 억제해 암세포간 응집을 저해함으로써 결과적으로 암세포 응집체를 불안정화시켜 종양 성장을 저해할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 내의 TJP1 억제제의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 다른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 1 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 항암제 병용투여용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “병용투여”는, 치료 요법의 개별 성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2 이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용 치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응 정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용 치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능보다 치료학적으로 우수하면서 상승효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.
본 발명의 병용투여용 약학적 조성물은 항암제와 동시에, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 항암제와 순차적으로 투여되는 경우에도 투여 순서에 제한되는 것은 아니나, 암의 종류 및 항암제의 종류, 환자의 상태 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “항암제”란, 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 물질을 총칭하는 의미로 사용되었다. 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하거나 항암활성(抗癌活性)을 나타내는 약제이다. 현재 암 치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 알킬화제(alkylating agents), 대사길항제(代謝拮抗劑: antimetabolites), 항생물질(抗生物質: antibiotics), 유사분열억제제(有絲分裂抑制劑: vinca alkaloid), 호르몬제 및 기타의 6개 범주로 분류하고 있으나, 본 발명에 따른 항암제는 상기 범주에 포함되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 항암제는 화학항암제, 표적항암제, 및 면역항암제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 병용투여용 약학적 조성물은 화학항암제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에서 “화학항암제”는 “세포독성항암제” 또는 “화학약물항암제” 등의 용어로도 불리는 1세대 항암제를 의미한다. 상기 화학항암제의 비제한적인 예로 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 페메트렉시드(Pemetrexed), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 카보플라틴(Carboplatin), 플루오로우라실(5-FU), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 독소루비신(Doxorubicin), 및 최근 항암 효과가 있는 것으로 보고된 알벤다졸(albendazole) 등을 들 수 있다.
본 발명의 병용투여용 약학적 조성물은 표적항암제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에서 “표적항암제”는 암 세포나 암 조직에서 특이적으로 변화되는 단백질이나 유전자를 표적으로 하여, 암의 성장 및 발생에 관여하는 분자 활동을 방해함으로써 항암 효과를 나타내는 제제를 의미한다. 상기 표적항암제의 예로는 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI), 혈관신생억제제(angiogenesis inhibitor), 신호계 저해제, 및 사이토카인 수용체 억제제를 들 수 있다.
상기 신호계 저해제는 바람직하게는 NF-κB억제제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Bay-11-7085일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 사이토카인 수용체 억제제는 바람직하게는 CXCR2 억제제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 sb225002일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 티로신 키나아제 억제제의 비제한적인 예시로는 브리가티닙(Brigatinib), 다사티닙(Dasatinib), 다코미티닙(Dacomitinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(Neratinib), 아파티닙(Afatinib), 반데타닙(Vandetanib), 아이코티닙(Icotinib), 바리티닙(Varitinib), 테세바티닙(Tesevatinib), 카네르티닙(Canertinib), 나쿠오티닙(Naquotinib), 엘로티닙(Erlotinib), 펠리티닙(Pelitinib), 포지오티닙(Poziotinib), 로실레티닙(Rociletinib), 나자르티닙(Nazartinib), 오시머티닙(Osimertinib), 알리티닙(Allitinib), 피로티닙(Pyrotinib), 티르포스틴(Tyrphostin), 세리티닙(Ceritinib), 엔트렉티닙(Entrectinib), 트라메티닙(Trametinib), 알렉티닙(Alectinib), 로라티닙(orlatinib) 다브라페닙(Dabrafenib), 라로텍티닙(Larotectinib), 크리조티닙(Crizotinib), 레이저티닙(Lasertinib), 올무티닙(Olmutinib), 제피티닙(Gefitinib), 및 PDGFR-alpha 저해제(예컨대, 올라라투맙(olaratumab)) 등을 들 수 있다.
본 발명의 병용투여용 약학적 조성물은 면역항암제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에서 “면역항암제”란 인체의 면역시스템에 대한 암세포의 회피를 방지하거나 면역세포의 기능을 강화하여 암세포를 더욱 효과적으로 공격하게 유도하는 약물을 말한다. 상기 면역항암제의 예로는 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역세포치료제(immune cell therapy), 치료용 항체(therapeutic antibody), 및 항암백신(anticancer vaccine)을 들 수 있다.
“면역관문억제제”는 T 세포의 활성화를 억제하는 면역체크포인트 단백질(immune checkpoint protein)의 기능을 억제함으로써 T 세포에 의한 암세포 공격을 활성화시키는 약물이다. 대표적인 면역체크포인트 단백질은 PD-1(Programmed cell death protein-1), PD-L1(Programmed death-ligand-1), 및 CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule 4)이므로, 본 발명에 있어서 면역관문억제제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 또는 CTLA4 저해제일 수 있고, 다만 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 상기 면역관문억제제는 PD-1-항체, PD-L1-항체, 또는 CTLA4-항체일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 PD-1 저해제의 비제한적인 예로는 펨브로리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 및 세미플리맙(Cemiplimab) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 PD-L1 저해제의 비제한적인 예로는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 및 더발루맙(Durvalumab) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 CTLA4 저해제의 비제한적인 예로는 아테졸리주맙(Atezolimumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 및 트레멜리무맙(Tremelimumab) 등을 들 수 있다.
면역세포치료제는 환자 체내의 T 세포를 추출하여 강화 및 변형시킨 후 체내에 재주입하여 암세포에 대한 면역세포의 공격력을 강화시키는 약제를 말하며, 이의 비제한적인 예시로는 NK 세포치료제, T 세포치료제, 및 CAR-T 세포치료제 등이 있다.
치료용 항체는 암세포를 표적으로 하는 항체를 이용한 것으로서, 대표적인 예로 항체-약물접합체(antibody-drug conjugate, ADC)가 있다. ADC가 항체를 통해 암세포에 결합하면, 약물이 유리되어 암세포를 파괴한다.
항암백신은 암세포 특이적 항원 또는 체내 면역반응을 향상시킬 수 있는 기타 단백질/펩타이드 분자를 암환자에게 투여하여 면역체계를 활성화함으로써 암세포에 대한 체내 면역기능의 공격을 강화시키는 물질이다.
본 발명의 병용투여용 약학적 조성물은 ROS 포획제(reactive oxygen species(ROS) scavenger)를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 “ROS 포획제”는 활성산소종(reactive oxygen species) 및 기타 반응성 자유 라디칼(free radicals)을 제거할 수 있는 물질을 의미한다. ROS 포획제와 같은 활성산소 저해제는 암세포의 성장을 저해하여 항암 효과를 나타낸다는 것이 보고되어 있으며, 특히 활성산소가 암의 항암제에 대한 내성 발달에 기여하는 것으로 알려져 있어, ROS 포획제는 활성산소를 제거함으로써 항암 효과를 증가시키기 위한 항암보조제로 널리 사용되고 있다. 본 발명에 있어서 상기 ROS 포획제는 n-아세틸시스테인(N-acetyl-cysteine, NAC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에 따른 병용투여용 약학적 조성물은 암세포의 항암제에 대한 민감도를 증가시킴으로써 항암제의 항암 효과를 증진시키고 부작용은 감소시킬 수 있다. 여기서, “항암 효과를 증진”시킨다는 것은, 결과적으로 항암제의 기능을 강화할 수 있는 모든 효과를 이르는 것으로서, 종양의 성장 억제, 종양의 전이 억제, 종양의 재발 억제 등과 같은 항암제의 항암 효과를 증진시키는 것은 물론, 항암제에 대한 암세포의 저항 내지 내성 형성을 억제함으로써 결과적으로 항암 효과를 증진시키는 것까지 모두 포함하는 개념이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. cBioPortal 및 Gene Expression Profiling Interactive Analysis를 이용한 예후 및 발현 상관관계 분석
TJP1 및 관련 유전자들의 발현 수준의 비교 분석을 위해 Cancer Discov 2:401-404를 참고하여 cBioportal을, 그리고 Nucleic Acids Res 45:W98-W102를 참고하여 Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)를 사용해 TCGA 유전체 데이터 마이닝(data mining)을 수행했다. 히트맵(heatmaps) 작성은 Heatmapper(www.heatmapper.ca) 웹툴을 이용했다. Idep.92 (Bioinformatics.sdstate.edu/idep92) 및 Morpheus (Software.broadinstitute.org/ 159/Morpheus/)를 이용해 유전자와 히트맵간 상관관계를 확인했다. g:Profiler (biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)는 신호전달 경로 분석을 위해 사용했으며, 산포도(scatter plot)는 Graph Pad 소프트웨어 5.0 버전(GraphPad Inc.)을 이용해 작성했다.
실험예 2. 조직 시료의 준비
국립암센터 바이오뱅크(National Cancer Center Biobank)로부터 12명의 성인 환자의 냉동된 LMS 조직을 확보했다. 표 1은 상기 환자들 및 종양 조직의 임상병리학적 특징을 정리한 것이다. 냉동된 조직은 슬라이스로 만든 후 hematoxylin 및 eosin으로 염색했다. 암세포 밀집도가 충분함을 확인하기 위해, 육종 전문 병리학자가 염색된 슬라이드를 확인했다. 또한, BMC Med Genet 19:216를 참고해 미세해부(Microdissection)를 수행하여 hematoxylin 및 eosin으로 염색된 종양세포 및 인접 비-종양 세포의 냉동된 절편을 확보했다.
총 샘플 개수 (개체 수) 14 (12)
나이(평균±S.D.(범위)) 54±12(39-71)
성별
여성 6 (50.0%)
남성 6 (50.0%)
병기(FNCLCC)
I 1 (7.1%)
II 5 (35.7%)
III 8 (57.1%)
수술 부위
어깨 1 (7.1%)
견갑골 2 (14.3%)
허리 1 (7.1%)
허벅지 8 (57.1%)
하퇴(lower leg) 2 (14.3%)
샘플 입수 당시 병기
원발(primary) 6 (42.9%)
국소 재발(local recurrence) 3 (21.4%)
원격 재발(distant recurrence) 5 (35.7%)
실험예 3. 세포배양
인간 연부조직 육종 세포주 및 상피세포주는 American Type Culture Collection으로부터 확보했다. 세포는 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v)를 함유한 항진균-항생제를 함유한 세포-특이적 배지에서 배양하였다.
실험예 4. LMS 세포주의 TJP1 발현 침묵(silencing) 및 유전체 편집(genetic editing)
본 실험예에서는 하기 두 가지 방법에 의해 육종 세포주에서 TJP1 발현을 억제하였다. 본 명세서에 있어서, “TJP1 발현 억제 세포주”란 shRNA 또는 CRISPR/Cas9를 이용해 TJP1 발현이 억제된 세포주 모두를 지칭한다.
4-1. short-hairpin(sh)RNA를 이용한 LMS 세포주의 TJP1 발현 침묵
SK-LMS-1 세포에서 TJP1 발현을 억제하기 위해 Santacruz Biotechnology사의 TJP1 shRNA 렌티바이러스 입자(sc-29829-V)를 구매해 사용하였다. 렌티바이러스(lentivirus)를 이용해 세포에서 TJP1-타겟팅 shRNA를 안정적으로 발현시키기 위해, 세포를 24시간 동안 배양한 후 5μg/mL 폴리브렌(polybrene)에서 30분 동안 배양하고, Mol Carcinog 53(Suppl 1):E161-E168를 참고하여 바이러스로 감염시켰다. 임상적 차이를 배제하기 위해, 바이러스로 감염하여 생성한 안정적 세포주(stable cell line) 각각의 클론으로 풀링하였다(pooled). 확립된 세포주를 배양하고 역광 현미경을 이용해 이미지를 캡쳐했다.
4-2. CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated protein-9 nuclease) 시스템을 이용한 LMS 세포주의 유전체 편집
TJP1 녹아웃(knockout, KO) 세포를 제조하기 위해 Nat Protoc 8: 2281-2308를 참고하여 pSpCas9(BB)-2A-녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP; px458) 벡터를 이용해 CRISPR/CAS9 시스템을 수행하였다. 먼저, TJP1에 특이적인 세 가지 guide RNA: sgTJP1-1(서열번호 1), sgTJP1-2(서열번호 2), 및 sgTJP1-3(서열번호 3)을 ChopChop(http://chopchop.cbu.uib.no)을 이용하여 디자인하고, pSpCas9(BB)-2A-GFP 벡터에 삽입하였다. 이어서, 세포(1 × 105개)를 24시간 동안 배양한 후 TJP1을 표적으로하는, 클로닝된 CRISPR/CAS9 시스템, 또는 CRISPR/CAS9 벡터(Mock)로 형질주입(transfection)시켰다. 48시간이 지난 후, GFP 리포터 단백질을 발현하는 세포를 FACSORP(BD Biosciences)로 분류한 후, 96-웰 플레이트(96-well plates) 상에 씨딩(seeding)하였고, 각 세포들이 눈으로 확인 가능한 콜로니(colony)를 형성할 때까지 배양하였다. 수득한 콜로니에 대해 면역블롯팅(immunoblotting)을 수행하여 TJP1 발현을 확인하였다.
실험예 5. 세포 증폭(cell proliferation) 분석
총 1000개의 세포를 12-웰 플레이트에 씨딩한 후 가습된 5% CO2 배양기에서 37℃에서 8일 동안 배양하였다. 24시간마다 세포에 트립신(trypsin)을 처리하여 세포계수기를 사용해 세포 수를 계측했다.
세포 생존능은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) 분석법으로 확인하였다. 5000개의 세포를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 항암제 또는 저해제를 48, 72, 또는 96시간 동안 처리하였다. 세포를 거두기 전에, MTT(0.5mg/mL)를 세포에 2 내지 4시간 동안 처리하였다. 포마잔(formazan) 결정을 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 용해시키고, VersaMax Microplate Reader(Molecular Devices)로 550/620nm에서 흡광도를 측정했다.
실험예 6. 비부착 증식(anchorage-independent growth) 확인
세포(5 × 103개)를 한천(agar)과 혼합한 후(최종 농도 0.3%), 바닥층에는 0.6% 한천을, 상부층에는 0.3% 한천을 포함하는 한천 플레이트 상에 도말하였다. 염색 전후의 콜로니를 역광 현미경(Olympus, CKX53)을 이용해 촬영한 후, Image J 소프트웨어로 계측하였다. 콜로니 염색은 0.1% crystal violet 용액을 이용했다.
실험예 7. 세포-세포 응집(cell-cell aggregation) 분석법
세포(1 × 105개)를 코팅하지 않은 35-mm 디쉬에 씨딩하여 24시간 동안 배양한 후, 역광 현미경으로 촬영하였다. 세포-세포 응집체를 계측하였으며, 그 면적은 ISCapture 4.1.3 버전 소프트웨어(Tucsen Photonics)로 측정하였다.
실험예 8. 면역블롯팅(immunoblotting)
단백질 샘플을 5분동안 95℃에서 가열한 후 8-15% 아크릴아미드 젤(acrylamide gels)에서 SDS-PAGE를 수행하고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane)에 트랜스퍼하였다. 면역블롯팅은 J Cell Mol Med 23: 4043-4053를 참고하여 수행했다. TJP1 항체는 Thermo Fisher Scientific으로부터 구매했다(ZO-1 polyclonal antibody; Cat. #617300).
실험예 9. 역전사(Reverse transcription, RT)-PCR 및 정량적 RT-PCR
RNeasy Mini Kit(Qiagen)을 이용해 총 RNA(total RNA)를 분리하였다. 분리한 총 RNA(5μg)은 oligo-dT 또는 무작위 프라이머(primer), 및 SuperScript™III 역전사 효소(Invitrogen)를 처리하여 제조사의 설명에 따라 역전사시켰다. 이어서 유전자-특이적인 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 사용한 RT-PCR 프라이머 서열은 표 2에 나타냈다. 증폭된 PCR 생성물은 1.5%(w/v) 아가로즈 젤에 전기영동하였다. PCR 생성물의 밴드는 브로민화 에티듐(ethidium bromide) 처리후 GelDoc 프로그램(Bio-Rad Laboratories)으로 촬영하였다.
실시간 PCR(real-time PCR) 정량법을 수행하기 위해, LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics Corp.)을 사용하여 다음과 같이 반응을 수행하였다: 95℃에서 10분 진행 후, 95℃에서 15초 및 58-62℃에서 30초로 45 사이클. 상대적인 폴드 발현(fold expression) 값은 2ΔΔCt 방법으로 계산하였다. 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) mRNA를 대조군으로 사용했다.
유전자 서열(5'-3') Genebank 등록번호(염색체) 서열번호
TJP1 - F(1) GGAGAGGTGTTCCGTGTTGT NM_003257 4
TJP1 - R(1) GAGCGGACAAATCCTCTCTG NM_003257 5
TJP1 - F(2) AGCCATTCCCGAAGGAGTTG NM_003257 6
TJP1 - R(2) ATCACAGTGTGGTAAGCGCA NM_003257 7
GAPDH - F GGGTGTGAACCATGAGAAGT NM_001289745 8
GAPDH - R GACTGTGGTCATGAGTCCT NM_001289745 9
실험예 10. RT 2 어레이(array)를 이용한 유전자 발현 변화 검출
TJP1 발현에 의해 영향을 받는 신호 전달 경로를 프로파일링하기위해, RT2 Profiler PCR Array Human Signal Transduction Pathway Finder TM kit (Qiagen; 84개 유전자)를 제조사의 설명에 따라 사용하였다. 성장 중인 세포를 거둬 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. cDNA 에 대해 PCR 어레이를 수행한 후 Roche LightCycler 480 (Roche Diagnostics Corp.)를 이용하여 분석했다. 발현에 변화가 있는 유전자에 대해 Qiagen 소프트웨어(Data Analysis Center: http://geneglobe.qiagen.com/kr/shop/genes-and-pathways/dataanalysis-center-overview-page/)를 이용하여 신호경로를 분석(pathway analysis)을 수행했다.
실험예 11. 면역형광 염색법(immunofluorescence staining)
유리 슬라이드 상에서 24시간 동안 배양한 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 후, 상온에서 10분 동안 인산염완충식염수 중의 0.25% Triton X-100으로 투과(permeabilization)시켰다. 0.2% 소혈청알부민 용액으로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 세포를 항-TJP1 항체 또는 버퍼(음성 대조군)로 4℃에서 밤새 염색했다. 이어서, 실온에서 1시간 동안 2차 항체(anti-rabbit-dylight488) 및 로다민 팔로이딘(rhodamine phalloidin)으로 표지하였다. 최종 단계에서, 핵 염색을 위해 세포에 DAPI를 5 내지 10분 동안 처리하였고, 마운팅(mounting) 용액으로 마운팅하였다. 공초점 현미경(confocal microscope)(Zeiss)으로 세포를 관찰했다.
실험예 12. in vivo 연구
본 연구는 국립암센터 연구소(National Cancer Center Research Institute, NCCRI)의 동물관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 진행됐다. SK-LMS-1 세포를 2 내지 3일 동안 70 내지 80% 컨플루언시(confluency)가 되도록 배양한 후 트립신 처리하여 수확했다. 세포는 9주령의 마우스(Rag2-/- γc-/- 면역결핍 마우스, The Jackson Laboratory)의 오른쪽 뒷다리에 주입했다(5×106 cells/100μl/마우스). 14주 동안 매주 11마리 마우스의 무게를 재고 모니터링하였다. 9주 및 12주 후에 동물 모델로부터 종양을 관찰하기 위해 18F-fluorodeoxyglucose(FDG)를 이용해 양전자 방출 단층 촬영술(positron emission tomography/computed tomography, PET/CT)를 수행했다. 스캐닝을 위해 마우스는 6시간 동안 금식시키고 2% 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취시켰다. 이미지는 정규화하여 표준화된 흡수값(uptake values)를 확인했다. 마우스의 좌/우 뒷다리 너비는 13주가 지난 시점에 캘리퍼를 사용해 측정했다.
실험예 13. 조직 추출 및 염색
마우스는 ILAR 가이드라인에 따라 희생시켰다. 조직(종양조직 및 인접 정상 조직)은 10% 중화 포르말린(neutral buffered formalin)으로 고정하고 파라핀 조직 블록(paraffin-embedded tissue block)으로 준비했다. 준비된 조직 블록으로 면역조직화학 염색법(immunohistochemistry) 및 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색법을 수행했다. 면역조직화학 염색법의 경우 조직을 Ki67 또는 F4/80에 대한 항체로 염색하고, 헤마톡실린 및 3,3′-다이아미노벤지딘(3,3′-diaminobenzidine)으로 염색했다. 염색된 조직은 Aperio AT Turbo whole-slide scanner(Leica Biosystems)를 이용해 20배로 촬영했다. 일차 항체를 결합시키지 않은 슬라이드의 이미지는 음성 대조군으로 사용했다.
실험예 14. 통계분석
모든 데이터는 대조군에 대해 백분율로 나타냈으며, 평균 ± S.E.로 나타냈다. 그룹간 통계분석은 t-검증(Student's t tests)으로 수행했다. p<0.05 를 유의미한 것으로 분류했다.
[실시예]
실시예 1. 연부조직 육종 및 평활근육종에서의 TJP1의 발현 양상 확인
1-1. 연부조직 육종에서의 TJP1의 발현 양상 확인
연부조직 육종과 같은 비-상피, 간엽(non-epithelial, mesenchymal) 종양에서는 TJP1의 역할에 대해 알려진 바가 없으므로, TJP1 발현이 환자 생존율과 관련이 있는지 확인하기 위해 실험예 1에 따라 GEPIA를 이용한 TCGA 데이터 분석을 수행했다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 TJP1 mRNA 발현 수준이 낮은 그룹이 TJP1 mRNA 발현 수준이 높은 그룹에 비해 전체 생존기간(overall survival) 및 무질병 생존기간(disease-free survival)이 모두 더 긴 것으로 나타났다. 이는 TJP1이 종양 진행 및 악성도(malignancy)에 기여하며, 암환자의 좋지 않은 예후(poor prognosis)와 연관 있음을 보여준다.
이어서, 종양 조직과 정상 조직의 TJP1 발현 정도를 비교하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 대부분의 종양 조직(결장암(COAD), 유방암(BRCA), 폐암(LUAD), 편평세포암(LUSC))에서는 TJP1의 발현이 상피세포에 비해 낮았다. 그러나 흥미롭게도, 연부조직 육종 조직의 경우 정상 조직에 비해 TJP1 발현이 더 높은 것으로 나타났다. 또한, 총 265개의 샘플 중 22개(8.3%)에서 TJP1 유전자의 카피 수(copy number) 변화, 또는 TJP1 mRNA 발현 증가 혹은 감소 등과 같은, TJP1 발현 관련 변이가 존재하는 것으로 나타났다. 특히, 평활근육종(leiomyosarcoma), 역분화 지방육종(dedifferentiated Liposarcoma), 미분화 다형세포 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 방추세포 육종(spindle cell sarcoma), 악성 말초 신경초 종양(malignant peripheral nerve sheath tumor), 공격성 섬유종증(desmoid/aggressive fibromatosis), 및 점액섬유육종(myxofibrosarcoma)과 같은 연부조직 육종에서 TJP1 발현 증가를 초래한 변이가 일어난 것으로 확인 됐으며, 상기 변이 중 65%가 평활근육종에서 나타나는 것으로 관찰됐다(도 3). 이와 같은 결과는 TJP1의 발현 증가가 연부조직육종, 특히 평활근육종의 발달에 중요하다는 것을 암시한다.
1-2. 평활근육종에서의 TJP1의 발현 양상 확인
TJP1의 평활근육종에서의 역할을 확인하기 위해, 평활근육종 조직 및 인접 정상 조직(adjacent normal tissues)에서 TJP1의 발현 수준을 비교했다. European Nucleotide Archive(ENA; primary number PRJEB24352)에 등록되어 있는 RNA 시퀀싱 데이터(sequencing data)를 활용하여, 7개 평활근육종(LMS) 조직; 3개 점액섬유육종(MFS) 조직; 및 4개 미분화 다형세포 육종 조직, 1개 미분화 원형세포육종(round cell sarcoma), 및 1개 미분화 방추세포육종 조직을 포함한 6가지의 미분화 육종(undifferentiated sarcoma, US) 조직에서 TJP1 발현 수준을 비교하였다(도 4). 6가지 미분화 육종 조직 데이터는 왼쪽부터 순서대로, 첫 번째가 미분화 원형세포 육종(Undifferentiated round cell sarcoma) 환자 조직, 2 내지 5번째가 미분화 다형성 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma) 환자 조직, 6번째가 미분화 방추세포 육종(undifferentiated spindle cell sarcoma) 환자 조직의 발현 데이터이다.
그 결과, LMS의 경우 TJP1 발현은 인접 정상 조직에 비해 종양 조직에서 현저하게 높은 것으로 나타났다(도 5a). 또한, TJP1 발현은 원발성 종양(primary tissue)이나 전이 종양(metastatic tissue)에 비해 재발성 종양(recurrent tissue)에서 높은 것으로 나타났다(도 5b). 마찬가지로, 국립암센터 바이오뱅크(National Cancer Center Biobank)로부터 얻은 LMS 조직에서 RT-PCR로 TJP1 발현을 확인한 결과에서도, TJP1의 발현이 인접 정상 조직에 비해 종양 조직에서 증가된 것으로 나타났다(도 6). 이와 같은 결과들은 모두 평활근육종의 진행에 TJP1이 중요하다는 것을 보여준다.
실시예 2. 평활근육종 세포주에서의 TJP1 발현 양상 확인
본 발명자들은 TJP1이 종양 미세환경(tumor microenvironment)에서 종양세포를 안정화함으로써 육종을 발달시킨다고 추측했다. 이를 확인하기 위해, 다양한 세포주에서 TJP1 단백질 발현을 비교하였다. 먼저, 상피세포(HCT116, MCF7, 및 Beas-2b 세포) 및 간엽세포(연부조직 육종 세포주인 SK-LMS-1, SK-UT-1, 및 골육종 세포주인 GCT 세포주)에서 TJP1 발현을 확인한 결과, 상피세포에 비해 육종세포에서 TJP1의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 7). 또한, 세 가지 평활근육종 세포주(SK-LMS-1, SK-UT-1, 및 SK-UT-1B 세포)에서 TJP1의 mRNA 발현 수준을 확인했을 때, 모든 세포에서 TJP1 발현이 높은 것을 확인하였다(도 8 및 도 9). 이와 같은 결과는 연부조직 육종 세포, 특히 평활근육종 세포에서 TJP1의 발현이 증가되어 있음을 보여준다.
이어서, TJP1의 위치를 확인하기 위해 세포를 배양한 후 고정하여 F-actin(붉은색), TJP1(녹색), 및 핵(파란색)을 형광염색하였다. 상피세포에서 TJP1은 세포-세포 접촉(cell-cell contact)이 일어나는 지점의 원형질막 근처에 위치하는 것으로 나타나며, 소위 “키싱 포인트(kissing points)”라고 하는 지점에서 F-actin과 합쳐진 것처럼 보인다(Eur J Cell Biol 81:253-263). 이와 마찬가지로, 상피 기원의 암세포주인 MCF에서도 TJP1은 원형질막의 “키싱 포인트” 지점에 위치하는 것을 관찰한 바, F-actin과 공동국소화(colocalization)되어 있음을 알 수 있었다(도 10 상단). 반면 SK-LMS-1 세포에서는 TJP1이 세포 전반에 분포되어 있으며, F-actin과 공동국소화된 것은 거의 없는 것으로 나타났다(도 10 하단). 이와 같은 결과는 TJP1이 간엽세포에서는 상이한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.
실시예 3. TJP1이 평활근육종 세포주의 비부착 증식 및 세포 응집에 미치는 영향 확인
3-1. TJP1 발현 억제 세포주의 제작
TJP1이 종양 발달에 기여하는지 확인하기 위해, 실험예 4의 두 가지 방법을 통해 SK-LMS-1 세포주에서 TJP1 발현을 억제했다. 먼저, 실험예 4-1에 따라 세포를 TJP1-타겟팅(targeting) shRNA를 암호화하는 렌티바이러스 입자(lentiviral particles)로 감염시켜 TJP1 발현이 억제된 세포주를 확보했다(Sh-TJP1). 다른 방법으로, 실험예 4-2에 따라 CRISPR/CAS9 시스템을 사용해 TJP1 KO 세포주를 제작했다. 구체적으로, 세 가지 gRNA(서열번호 1 내지 3)와 함께 CRISPR/CAS9으로 세포를 형질주입시키고 이틀 동안 배양한 후, GFP를 마커로 이용해 FACS(fluorescence-activated cell sorting)로 CRISPR/Cas9 벡터를 발현하는 세포를 선별했다. 이어서, CRISPR/Cas9 발현 세포로부터 형성된 단일 콜로니를 수득해 TJP1 KO 세포주를 확보했다(TJP1KO). 상기 두 가지 방법으로 제작한 TJP1 발현 억제 세포주에서 RT-PCR 및 면역블롯팅으로 TJP1의 발현을 확인한 결과, 두 종류 세포주 모두 TJP1의 발현이 감소한 것을 확인하였다(도 11).
3-2. TJP1이 비부착 성장에 미치는 영향 확인
세포 부착이 잘 일어나는 파이브로넥틴(fibronectin)-코팅 플레이트에 두 가지 TJP1 발현 억제 세포주를 씨딩(seeding)한 후 8일간 배양하면서 24시간마다 세포 수를 측정한 결과, TJP1의 단백질 발현 억제는 부착-의존성 세포 성장에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(도 12). 반면 세포를 연한천(soft agar) 플레이트에서 배양한 경우에는, TJP1 발현 억제 세포주가 대조군에 비해 콜로니를 상대적으로 적게 형성하며, 형성된 콜로니의 크기도 더 작은 것으로 나타났다(도 13). 이와 같은 결과는 TJP1이 비부착 성장에 중요하다는 것을 보여준다.
3-3. TJP1이 세포 응집에 미치는 영향 확인
이어서, 세포가 성장하는 동안 TJP1이 3-차원의 세포 덩어리(cell mass)의 안정화를 위해 세포-세포 접촉을 조절함으로써 비부착 성장에 영향을 미치는 것인지 확인하였다. 이를 위해, poly-L-lysine 등의 보조 물질로 코팅되지 않은 플레이트에 세포를 씨딩하였다. 데이터는 나타내지 않았으나, 아무것도 처리하지 않은 SK-LMS-1 세포(즉, TJP1 발현이 높음)는 다수의 세포-세포 응집체를 형성했다. 반면, TJP1 발현 억제 세포주는 세포-세포 응집체를 덜 형성하였으며, 형성된 응집체의 크기 또한 대조군 세포(Sh-Control 및 Mock)가 형성한 콜로니에 비해 작은 것으로 나타났다(도 14). 이와 같은 결과는 TJP1이 종양세포의 세포응집체 형성에 중요하며, 종양이 형성될 때 TJP1이 세포-세포 상호작용 및 세포 응집을 유도함으로써 종양세포 및 조직을 안정화한다는 것을 보여준다.
실시예 4. TJP1이 in vivo 에서 평활근육종 종양 성장에 미치는 영향 확인
TJP1의 종양 성장 촉진 효과를 in vivo에서도 확인하였다. 9주령의 면역결핍 마우스에 SK-LMS-1 세포주, TJP1 발현을 억제하거나(Sh-TJP1) 억제하지 않은(Sh-Control) SK-LMS-1 세포주를 동소이식(orthotopically transplanted)하였고, 플라시보로 동일한 부피의 PBS를 투여하였다(도 15). 근육주사 후 희생시키기 전까지 14주 동안 마우스의 뒷다리 너비를 측정하였으며, 결과는 도 16에 나타냈다. 주사하고 9주가 경과한 시점에는 마우스의 뒷다리에서 유의미한 종양 성장이 관찰되지 않았다. 따라서, fluorine-18-fluorodeoxyglucose 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영(18F-FDG PET/CT)을 사용해 종양 조직이 있는지 확인하였다(도 17). 신장을 포함한 다양한 기관에서 18F-FDG의 높은 흡수가 관찰되었으나, SK-LMS-1 Sh-Control 그룹의 한 마리 마우스의 뒷다리에서 매우 약하지만 뚜렷한 신호가 검출되었다. 급격한 종양 성장이 있을 수 있으므로, 3주 동안 추가적인 PET/CT 스캔을 진행했으며, 그 결과, TJP1을 높게 발현하는 SK-LMS-1 및 Sh-Control 마우스에서 종양 성장이 일어난 것을 관찰했다. 반면, TJP1 발현이 억제된 Sh-TJP1 마우스나 암세포를 주사하지 않은 플라시보 마우스에서는 종양 성장이 없었다(표 3 참조).
분류 뒷다리에 종양이 있는 마우스 수(총 마리수)
플라시보 0(1)
SK-LMS-1 2(2)
SK-LMS-1 Sh-Control 4(4)
SK-LMS-1 Sh-TJP1 0(4)
두 번째 PET/CT 스캔 후, 수일 내에 마우스를 희생시켜 SK-LMS-1 및 Sh-Control cell 마우스로부터는 종양 조직을 추출하고, Sh-TJP1 세포 또는 플라시보를 이식했던 마우스로부터는 세포가 이식됐던 자리인 뒷다리 조직을 추출하여 고정시켰다(도 18).
SK-LMS-1 및 Sh-Control 마우스의 종양 조직을 H&E 염색법으로 관찰한 결과 육종 조직에서 다수의 유사분열기 세포가 관찰되었으며 종양세포는 다형성(pleomorphic)인 것을 관찰한 바, 높은 병기의 종양 발달이 진행되었음을 보여주었다(도 19). Ki67 면역조직화학 염색법에 의해서도 종양조직에 다수의 분열 세포가 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 20). TJP1을 높게 발현하는 SK-LMS-1 세포와 Sh-Control 세포를 오른쪽 뒷다리에 근육내 주사한 후 3달이 지났을 때 종양 성장이 확연하게 나타났다. 반면, TJP1 발현이 억제된 Sh-TJP1 세포는 종양 성장이 관찰되지 않은 바, 이와 같은 결과는 TJP1이 in vivo에서 육종, 특히 평활근육종에서 종양 성장에 기여하는 세포-세포 상호작용 및 커뮤니케이션에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.
종양 미세환경 내에서 종양 발달을 위한 커뮤니케이션이 일어나는지 확인하기 위해 마우스 대식세포-한정 단백질인 F4/80에 대해 면역조직화학 염색법을 수행한 결과, Ki67 양성 세포가 많은 영역 일부에서 호중구 및 대식세포와 같은 염증성 세포도 함께 존재하는 것으로 확인됐으나, 특별한 상관관계 없이 Ki67 또는 F4/80 중 하나만 발현하는 영역도 있는 것으로 확인됐다(도 20). 또한, 본 실시예에서 제작된 in vivo 모델 중 높은 병기의 LMS 조직은 Ki67 발현이 매우 높았으며, 공격적이고 다형성인 것으로 확인됐다. 종합적으로, TJP1 발현이 억제된 세포를 이식한 in vivo 모델은 LMS를 발달시키지 않은 반면, TJP1을 발현하는 세포를 이식한 모델은 매우 공격적인 분열세포; 대식세포와 어울려 있는 분열세포; 공격적으로 침윤한 대식세포와 어울려 있는, 비교적 덜 분열하는 세포 등 다양한 유형의 암세포로 이루어진 종양 조직이 발달하였다.
실시예 5. TJP1이 관여하는 신호전달 경로의 확인
평활근육종 세포주에서 TJP1과 관련된 신호전달 경로를 확인하기 위해, Sh-Control 세포 및 Sh-TJP1 세포 각각으로부터 RNA를 분리한 후 RT2 Array 키트로 정량적 RT-PCR을 수행하여 10가지 암-관련 신호경로와 관련된 80가지 유전자를 프로파일링 하였다. 그 결과, 39개 유전자가 TJP1의 발현 억제에 따라 발현이 유의미하게 변화한 것으로 나타났다(도 21). 이를 생물정보학 툴인 g:pro-filter로 분석한 결과, NF-κB, TNF, 세포자멸사(apoptosis), 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, JAK-신호 전달체, 및 STAT 신호전달 경로를 포함한 여러 신호전달 경로가 TJP1과 관련된 신호전달 경로로 확인되었다(도 22). 각 신호전달 경로에 특이적인 유전자들의 발현을 면역블롯팅으로 확인한 결과, 사이토카인, 인터루킨-8(CXCL8), NFKBIA, 및 RELA(p65)와 같은 유전자들의 발현에 변화가 있는 것이 확인된 바, NF-κB 및 TNF 신호경로가 TJP1과 관련된 주요 신호전달 경로로 선별되었다(도 23). 특히 TJP1 억제에 따라 NF-κB 신호경로가 상향조절(upregulated)된 바, 이는 TJP1이 세포 생존에 중요하다는 것을 보여준다. 또한, EGFR(epidermal growth factor receptor) 티로신 인산화효소(tyrosine kinase) 저해제 저항성과 관련된 신호전달 경로가 EGFR, PDGFRα, 및 STAT3 유전자의 발현 변화를 근거로 선별되었다. 이와 함께, p65 및 ERK의 인산화 정도가 TJP1의 억제에 따라 변화한 것이 관찰되었다. 특히, TJP1 발현 억제 세포주에서 EGFR 단백질 수준이 감소함에 따라 이의 하위(downstream) 표적인 ERK의 인산화가 감소한 것으로 나타난 바, 이는 TJP1이 EGFR 신호전달 경로에 중요하다는 것을 보여준다.
즉, 상기 결과들은 TJP1이 NF-κB 및 JAK/STAT을 포함한 여러 암 관련 신호전달 경로를 매개하여 종양세포의 증식 등에 기여한다는 것을 시사한다. 또한, 대식세포와 같은 다른 종류의 세포들이 종양 미세환경에서 종양세포를 돕는 것으로 추측된다.
실시예 6. TJP1이 세포 사멸/생존 및 종양 미세환경과 관련된 유전자 발현에 미치는 영향 확인
보다 구체적으로 종양 발달과 TJP1의 관련성을 살펴보기 위해, SK-LMS-1 세포에서 TJP1 발현 억제가 영향을 미치는 유전자들을 분석했다. 먼저, 암세포의 신호전달과 관련 있는 84가지 유전자를 SK-LMS-1 세포에서의 TJP1 발현 억제에 따른 mRNA 발현 변화 양상(정도)을 기준으로 세 그룹(No/Low, 발현 변화가 없거나 낮음; Intermediate, 발현 변화 중간 정도; High, 발현 변화 높음)으로 나누고(도 24), RT-PCR(도 25) 및 면역블롯팅(도 26)로 유전자 발현을 분석했다. 세포주기 진행과 관련된 유전자인 G1/S-specific cyclin-D1(CCND1, 단백질 중의 Cyclin D1) 및 CCND2는 변화 없음(no change) 및 중간(intermediate) 그룹의 두 그룹에 분류되었다. CCND1 mRNA는 TJP1 녹다운(knockdown)의 영향을 받지 않았지만 단백질은 발현이 감소한 바, 이는 TJP1이 mRNA를 안정화함으로써 세포주기를 조절한다는 것을 시사한다. 또한 세포자멸사와 관련된 유전자(BCL2L1, BCL2, BCL2A1, BIRC3, BBC3, TNFSF10) 및 오토파지(autophagy)와 관련된 유전자(SQSTM1)가 확인된 바, 이는 TJP1이 세포 생존 및 증식에 중요하다는 것을 뒷받침한다. 세포-세포 응집 관련 유전자로 알려진 ICAM1 역시 TJP1 발현에 영향을 받는 것으로 확인되었으며, LRG1, GATA3 (JAK-신호전달 경로와 관련 있으며, STAT 신호전달 경로의 활성자임) 및 CSF1(NF-κB 신호전달 경로)도 TJP1 억제에 반응하여 유의미한 발현 변화를 보인 유전자인 것으로 나타났다. 상기 결과들은 TJP1이 종양 미세환경 내의 면역 반응에 관여한다는 것을 시사한다.
이어서, TJP1의 영향을 받는 유전자들이 평활근육종 조직에서도 특이적인 발현 변화를 보이는지 TCGA 데이터베이스를 이용해 분석했다(도 27). 그 결과, TJP1 발현에 영향을 받는 유전자들은 평활근육종 조직에서 최대 15%까지 변이 빈도(alteration frequency)를 보이는 것으로 확인되었으며, 돌연변이나 카피 수의 변화보다는 발현양의 변화가 더 많은 것으로 나타났다. 이 중, 임상적으로 높은 발현을 보이면서 Sh-TJP1으로 TJP1 발현 억제에 따라 함께 발현 변화를 보인 15개의 유전자를 선별하였으며, 이들 유전자간의 네트워크를 확인하기 위해 String-DB 소프트웨어를 사용했다. 그 결과, 두 개의 클러스터가 나타났다(도 28). 한 클러스터는 세포 증식 및 생존과 관련 있는 EGFR, CDK4, 및 BCL2를 포함하고 있으며, 다른 클러스터는 대사 및 산화환원(redox) 조절과 관련 있는 유전자인 NQO1, GCLC, 및 GSR의 세 개 유전자로만 구성되어 있었다. 상기 두 개 클러스터는 CCND1(Cyclin D1) 및 NQO1을 통해 연결되어 있었다. 두 클러스터 모두 TJP1 발현이 감소된 SK-LMS-1 세포에서 발현이 감소된 바, 이는 TJP1이 세포 증식 및 생존에 중요한 역할을 한다는 것을 증명한다. CSF1(colony-stimulating factor 1)은 네트워크에 포함된 유전자는 아니지만, LMS 종양 세포 및 종양 미세환경, 특히 선천 면역 사이의 커뮤니케이션을 확인하기 위해 후속 연구를 위한 유전자로 선별하였다.
실시예 7. TJP1 및 항암제에 대한 반응성의 상관관계의 확인
항암제는 암세포 성장을 저해하여 암 치료에 기여하지만, 항암제의 장기 사용시 암세포의 항암제에 대한 내성을 발달시켜 항암 효과가 떨어질 수 있으며, 암세포의 내성을 극복하기 위해 항암제를 과용하는 경우 인체에 부작용을 유발할 수 있다. 따라서, 암세포의 항암제에 대한 민감도를 높임으로써 적정량의 항암제로도 항암 효과를 높일 수 있는 전략이 필요하다. 이에, TJP1을 억제하는 것이 육종 치료 전략에 도움이 되는지 확인하기 위해, TJP1을 정상적으로 발현하거나 이의 발현이 억제된 육종 세포주에서 각종 항암제를 처리한 후에 세포 생존능을 비교하였다.
첫 번째로, 화학항암제의 TJP1 발현 수준에 따른 항암 효과를 관찰하였다. 대표적인 화학항암제인 독소루비신과 TJP1 발현의 상관관계를 확인하기 위해, 네 가지 SK-LMS-1 세포주(Sh-Control, Sh-TJP1, Mock, TJP1KO)를 24-웰 플레이트에서 24시간 동안 배양한 후 독소루비신 또는 비히클(vehicle)을 72시간 동안 처리하였다. 그 결과, 대조군 세포(Sh-Control 및 Mock 세포)에 비해 TJP1 발현 억제 세포주(Sh-TJP1 및 TJP1KO)에 독소루비신을 처리했을 때 세포사멸이 상대적으로 많이 일어난 것으로 나타났다(도 29a 상단). 또한, 최근 항암 효과가 있는 것으로 보고된 알벤다졸로 동일한 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 29a 하단에 나타낸 바와 같이, 알벤다졸 역시 TJP1를 정상적으로 발현하는 대조군 세포에 비해 TJP1 발현이 억제된 세포주에 처리하였을 때 세포사멸을 더욱 활발하게 일으키는 것을 확인하였다.
다음으로, TJP1 발현 수준에 따라 표적항암제의 항암 효과도 달라지는지 확인하였다. 먼저 티로신 키나아제 억제제의 대표예인 제피티닙을 대조군 세포 또는 TJP1 발현 억제 세포에 96시간 동안 처리한 결과, 대조군 세포에 비해 TJP1 발현이 억제된 세포주에서 제피티닙에 의한 세포사멸이 증가한 것을 확인하였다(도 29b 상단). 또한, 신호계 저해제인 Bay-11-7085(NF-κB 신호전달 경로 저해제)를 다양한 농도(1, 2, 또는 5μm)로 처리한 경우에도 모든 농도에서 대조군에 비해 Sh-TJP1 및 TJP1KO 의 세포사멸이 증가한 것으로 나타났다(도 29b 중단). 이와 같은 결과는 TJP1의 억제가 NF-κB 신호경로를 통해 암세포의 세포자멸사에 대한 민감도를 증가시킨다는 것을 시사한다. 이어서, CXCR2 억제제인 sb225002를 0 내지 10μM의 다양한 농도로 육종 세포에 처리한 결과, 대조군 세포에 비해 TJP1 발현이 억제된 세포에서 sb225002에 의한 세포사멸이 현저하게 증가한 것이 확인되었다(도 29b 하단).
마지막으로, 활성산소 저해제가 암세포의 항암제에 대한 내성 발달을 억제하여 항암보조제로 활용된다는 것을 고려하여, ROS 포획제에 의한 암세포 성장 억제도 TJP1의 발현 수준에 따라 달라지는지 추가로 확인하였다. 대표적인 ROS 포획제인 n-아세틸시스테인(NAC)을 대조군 세포 또는 TJP1 발현 억제 세포에 0.1μL의 농도로 단독 처리하였으며, 그 결과, 도 29c에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 shRNA로 TJP1 발현을 억제한 세포에서 세포사멸이 크게 일어난 것을 확인할 수 있었다. 특히, NAC과 함께 알벤다졸 1μM를 함께 처리한 경우, shRNA를 이용한 TJP1 발현 억제 세포주는 물론 CRSIPR/Cas9을 이용한 TJP1 발현 억제 세포주에서 세포사멸이 대조군에 비해 확연하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 TJP1의 발현 억제가 항암제의 암세포 사멸 효과를 증진시킬 뿐만 아니라 ROS 포획제와 같은 항암보조제의 효과도 증진시킨다는 것을 보여준다.
종합적으로, 상기 실험결과들은 육종 세포의 TJP1 발현 억제가 화학항암제 및 표적항암제를 포함한 다양한 항암제 및 ROS 포획제와 같은 항암보조제에 의한 암세포의 세포사멸 민감도를 크게 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 8. TCGA LMS 전사체에서의 TJP1 발현 양상 확인
상술한 실시예의 결과들은 TJP1이 평활근육종에서 발현이 증가되어 세포 증식 및 생존의 촉진, 그리고 종양 미세환경 조절을 통해 종양 발달에 기여하는 것을 시사하는 바, 이를 검증하고자 TCGA로부터 106가지 LMS 종양조직의 전사체 데이터(transcriptomic data)를 확보하여 분석했다. 전체적으로, 18,166개 유전자의 발현 수준을 확인하였으며, 이 중 발현이 상위 10% 이내인 1,816개 유전자에 대해 MORPHEUS 웹 툴을 이용해 유전자-유전자 상관관계(gene-gene correlation) 분석을 진행했다. 피어슨 상관 분석(Pearson's correlation analysis)을 이용해 유사성 매트릭스 분석(similarity matrix analysis)를 수행한 결과, 양의 선형 상관관계(positive linear correlation)에 있는 두 가지 클러스터가 확인됐다(도 30). 도 31에 나타낸 바와 같이, 상기 두 클러스터에 속하는 유전자들(클러스터 1: 152개 유전자, 클러스터 2: 126개 유전자)의 발현 정도를 나열했다(행: 유전자; 열: LMS 환자 ID). 또한, 상기 유전자들을 관련 신호전달 경로를 기준으로 분류한 결과 클러스터 1의 유전자들은 세포주기 조절, 면역 시스템, 및 사이토카인-관련 경로와 관련이 있으며(도 32, 검은색 막대), 클러스터 2는 부착연접(adherens junctions), 세포 커뮤니케이션, 및 세포주기 관련 경로와 관련이 있는 것으로 나타났다(도 32, 회색 막대). TJP1 역시 LMS에서 발현이 상위 10% 이내인 유전자에 포함되어 있으며, 클러스터 2로 분류되었다.
TJP1이 종양 미세환경과 관련이 있는지 여부를 확인하고, 면역체크포인트 저해제(immune checkpoing inhibitor; 면역관문억제제), 특히, PD-1(Programmed cell death protein-1) 저해제, PD-L1(Programmed death-ligand-1) 저해제, 또는 CTLA4(cytotoxic T lymphocyte-associated molecule 4) 저해제, 더욱 구체적으로는 PD-1-항체, PD-L1-항체, 또는 CTLA4-항체와 같은 단일클론 항체를 이용한 면역 치료 전략에 활용할 수 있는지 추가로 확인했다. 복합 핵형 육종(complex karyotype sarcomas)의 하위부류 중에서, 높은 밀도의 B 세포 및 3차 림프절 구조(tertiary lymphoid structures)가 나타나는 종양은, 육종 면역 부류(sarcoma immune class, SIC) E로서 면역치료가 가능하다. 따라서, 본 발명자들은 TCGA로부터 확보한 LMS 데이터가 유사한 분류를 나타내는지 확인하기 위해, 120가지 면역-시스템 관련 유전자로 이루어진 TCGA LMS 전사체를 히트맵에서 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)하여 분석하였다(도 33). 클러스터링 후, 클러스터를 형성하지 않는 유전자는 배제하여, 81개의 유전자를 반복 분석하였다. 히트맵을 기반으로, SIC E와 유사한 발현 프로파일(예를 들어, B 세포 계통 및 면역세포 관련 유전자의 강한 발현)을 보이는 조직을 관찰하였다. TJP1과 함께, TJP1과 상관관계가 있는 것으로 확인됐던 유전자들, ICAM1, CSF1, EGFR, 및 BIRC3을 도 33에 표시된 것과 동일한 조직 순서로, 발현 수준에 따라 클러스터링 하였다(도 34). 또한, TJP1과 면역관문억제제 사이의 관계를 살펴보기 위해, 면역관문 단백질(PD-1, PD-L1, 및 CTLA4)의 전사체 데이터를 도 33 및 도 34와 동일한 조직 순서로 히트맵에 나타냈으며, 그 결과 TJP1 발현이 PD-1, PD-L1, 및 CTLA4와 음의 상관관계에 있음을 확인하였다(도 35). 특히, CTLA4와 TJP1의 역상관관계(inversely correlated)가 두드러진 것으로 나타났다(도 36). 즉, SIC 분류에 따른 높은 면역 기능을 갖는 일부 LMS 조직은 TJP1의 발현은 낮은 반면 CTLA4 발현은 높은 것으로 나타났다. TJP1 발현이 낮은 LMS 조직들이 특히 높은 면역 기능을 갖는다는 분석 결과는, TJP1 발현 억제가 체내 면역세포의 기능 강화에 기여할 수 있음을 암시한다. 즉, TJP1 억제제를 면역관문억제제와 병용 투여하는 경우, TJP1의 발현을 억제함으로써 면역관문억제제의 효과(체내 면역 기능 강화)를 증대시킬 수 있음을 보여준다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> National Cancer Center <120> Use of TJP1 for the prognosis and treatment of sarcoma <130> MP20-244 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1-specific CRISPR-Cas9_guide RNA1 <400> 1 caccgagtaa gagtgctgct tatcg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1-specific CRISPR-Cas9_guide RNA2 <400> 2 caccgggagt gagaagattt ggccg 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1-specific CRISPR-Cas9_guide RNA3 <400> 3 caccgaggag aggtgttccg tgttg 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1_FW primer_1 <400> 4 ggagaggtgt tccgtgttgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1_RV primer_1 <400> 5 gagcggacaa atcctctctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1_FW primer_2 <400> 6 agccattccc gaaggagttg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TJP1_RV primer_2 <400> 7 atcacagtgt ggtaagcgca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-FW primer <400> 8 gggtgtgaac catgagaagt 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-RV primer <400> 9 gactgtggtc atgagtcct 19

Claims (22)

  1. TJP1(Tight junction protein 1) 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 육종은 연부조직 육종(soft tissue sarcoma)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 연부조직 육종은 미분화 육종(undifferentiated sarcoma), 미분화 다형성 육종(undifferentiated pleomorphic sarcoma), 융기피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 섬유육종(fibrosarcoma), 연부조직 유잉육종(soft tissue Ewing's sarcoma), 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 점액섬유육종(myxofibrosarcoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 활막육종(synovial sarcoma), 다형세포 육종(pleomorphic sarcoma), 방추세포 육종(spindle cell sarcoma), 자궁육종(gynaecological sarcoma), 복막후부 육종(retroperitoneal sarcoma), 위장관기질종양(gastrointestinal stromal tumor), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 악성 말초 신경초 종양(malignant peripheral nerve sheath tumor), 폐포성 연부조직 육종(alveolar soft part sarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 투명세포 육종(clear cell sarcoma), 데스모이드형 섬유종증(desmoid/aggressive fibromatosis), 및 혈관육종(angiosarcoma)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 TJP1은 정상 조직에 비해 육종 조직에서 발현이 특이적으로 증가되어 있는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 진단용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 육종 진단용 키트.
  9. 하기 단계를 포함하는, 육종 진단 또는 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    (S1) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 TJP1 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (S2) 단계 (S1)에서 측정된 TJP1 발현 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 육종으로 판정하거나 예후가 좋지 않은 것으로 판정하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 예후는 재발, 전체 생존(overall survival), 및 무질병 생존(disease-free survival)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 소변, 타액, 조직, 세포, 기관, 골수, 미세침흡인 검체, 중심부바늘생검(core needle biopsy) 검체 및 진공흡입생검 검체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 방법이 육종 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 정상 샘플이고,
    상기 방법이 육종의 예후 예측에 필요한 정보를 제공하기 위한 것인 경우, 상기 대조군은 육종 샘플인 것인, 방법.
  13. TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 육종 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 TJP1 억제제는 TJP1 특이적 CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein), shRNA(short-hairpin RNA), miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 TJP1의 C-말단 특이적 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 CRISPR-Cas는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 염기서열을 포함하는 guide RNA를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 TJP1 억제제는 TJP1의 발현을 억제시킴으로써 암세포간 응집을 저해하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  17. TJP1 억제제를 유효성분으로 포함하는, 항암제 병용투여용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항암제는 화학항암제, 표적항암제, 및 면역항암제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 병용투여용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    하기 특징 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는, 병용투여용 약학적 조성물:
    (a) 상기 화학항암제는 독소루비신(Doxorubicin) 및 알벤다졸(Albendazole)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임;
    (b) 상기 표적항암제는 제피티닙(gefitinib), Bay-11-7085, 및 sb225002로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임; 또는
    (c) 상기 면역항암제는 PD-1 저해제, PD-L1 저해제, 및 CTLA4 저해제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 ROS 포획제(reactive oxygen species(ROS) scavenger)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 병용투여용 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 ROS 포획제는 n-아세틸시스테인(N-acetyl-cysteine, NAC)인 것을 특징으로 하는, 병용투여용 약학적 조성물.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암제 병용투여용 약학적 조성물.
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