ES2929942T3 - Vacunas contra el virus de la gripe y sus usos - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de hemaglutinina (HA) de influenza quiméricos, composiciones que los comprenden, vacunas que los comprenden y métodos para su uso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Vacunas contra el virus de la gripe y sus usos
1. Introducción
En el presente documento se describen en general polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe y composiciones que los comprenden, vacunas que los comprenden y métodos para su uso.
2. Antecedentes
Los virus de la gripe son virus de ARN con envuelta que pertenecen a la familia de los Orthomyxoviridae (Palese y Shaw (2007) Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication, 5a ed. Fields' Virology, compilado por B.N. Campos, D. M. Knipe y P.M. Howley. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Filadelfia, EE.UU., p 1647-1689). El hospedador natural de los virus de la gripe A son principalmente las aves, pero los virus de la gripe A (incluidos los de origen aviar) también pueden infectar y causar enfermedades en los seres humanos y otros hospedadores animales (murciélagos, perros, cerdos, caballos, mamíferos marinos y mustélidos). Por ejemplo, el virus de la gripe A aviar H5N1 que circula en Asia se ha encontrado en cerdos en China e Indonesia y también ha ampliado su rango de hospedadores para incluir gatos, leopardos y tigres, que generalmente no se consideraban propensos a la gripe A (CIDRAP - Avian Influenza: Agricultural and Wildlife Considerations). La aparición de infecciones con el virus de la gripe en animales, potencialmente podría dar lugar a cepas de virus de la gripe pandémicas en los seres humanos.
Los virus de la gripe A y B son los principales agentes patógenos para los seres humanos y causan una enfermedad respiratoria que varía en gravedad desde una infección subclínica hasta una neumonía vírica primaria que puede provocar la muerte. Los efectos clínicos de una infección varían según la virulencia de la cepa de virus gripal y la exposición, los antecedentes, la edad y el estado inmunitario del hospedador. La morbilidad y mortalidad acumulada causada por una gripe estacional es sustancial debido a la tasa de ataques relativamente alta. En una temporada normal, la gripe puede causar entre 3 y 5 millones de casos de enfermedad grave y hasta 500.000 muertes en todo el mundo (Organización Mundial de la Salud (2003) Influenza: Overview; marzo de 2003). En los Estados Unidos, los virus de la gripe infectan de forma estimada a un 10-15% de la población (Glezen y Couch RB (1978) Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76. N Engl J Med 298: 587-592; Fox et al. (1982) Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern of infection in invaded households and relation of age and prior antibody to occurrence of infection and related illness. Am J Epidemiol 116: 228-242) y están asociados con aproximadamente 30.000 muertes cada año (Thompson WW et al. (2003) Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syncytial Virus in the United States. JAMA 289: 179-186; Belshe (2007) Translational research on vaccines: influenza as an example. Clin Pharmacol Ther 82: 745-749).
Además de las epidemias anuales, los virus de la gripe son la causa de pandemias poco frecuentes. Por ejemplo, los virus de la gripe A pueden causar pandemias como las que ocurrieron en 1918, 1957, 1968 y 2009. Debido a la falta de inmunidad previamente establecida contra el principal antígeno vírico, la hemaglutinina (HA), la gripe pandémica puede afectar a más del 50% de la población en un solo año y a menudo causa una enfermedad más grave que la gripe epidémica. Un claro ejemplo es la pandemia de 1918, en la que se estima que murieron entre 50 y 100 millones de personas (Johnson y Mueller (2002) Updating the Accounts: Global Mortality of the 1918-1920 "Spanish" Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76: 105-115). Desde la aparición del virus de la gripe aviar H5N1 altamente patógeno a finales de la década de 1990 (Claas et al. (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351: 472-7), existe una preocupación de que pueda ser el próximo virus pandémico. Además, las cepas H7 y H9 son candidatas para nuevas pandemias ya que esas cepas infectan en ocasiones a los seres humanos.
Hai et al. (Journal of Virology, 86(10), 2012, p. 5774-5781) se refieren a polipéptidos de hemaglutinina quiméricos que comprenden un dominio del tallo procedente de un virus de la gripe y un dominio de la cabeza globular procedente de otro virus de la gripe. Describen un polipéptido de HA quimérico del virus de la gripe que comprende el dominio del tallo de la HA procedente de PR8 (HI, grupo 1) y el dominio de la cabeza globular de la HA procedente de A/Viet Nam/1203/04.
Chen et al. (Journal of Virology, 84(1), 2010, p. 44-51) se refieren a reordenamientos del virus de la gripe A/California/7/09 (H1N1) (CA09) generados usando genética inversa que expresan HA y NA del virus CA09 y seis segmentos de genes de proteínas internas del virus de la gripe A/Ann Arbor/6/60 (virus H2N2). También proporcionan datos sobre la eficacia del crecimiento de diferentes cepas que son portadoras de sustituciones de un solo aminoácido en el seg­ mento de la HA.
Una forma efectiva de protegerse contra una infección con el virus de la gripe es a través de la vacunación; sin em­ bargo, los enfoques de vacunación actuales se basan en lograr una buena coincidencia entre las cepas circulantes y las cepas aisladas incluidas en la vacuna. Esa coincidencia es a menudo difícil de lograr debido a una combinación de factores. En primer lugar, los virus de la gripe están en constante cambio: cada 3 a 5 años, la cepa predominante del virus de la gripe A es reemplazada por una variante que ha experimentado la suficiente deriva antigénica para evitar las respuestas de los anticuerpos existentes. Por lo tanto, las cepas aisladas que se incluirán en las preparacio­ nes de vacunas deben seleccionarse cada año en función de esfuerzos intensivos de vigilancia de los centros colaboradores de la Organización Mundial de la Salud (OMS). En segundo lugar, para permitir un tiempo suficiente para la preparación y la distribución de las vacunas, las cepas deben seleccionarse aproximadamente seis meses antes del inicio de la temporada de la gripe. A menudo, las predicciones del comité de selección de cepas para vacunas son inexactas, lo que da como resultado una disminución sustancial de la eficacia de la vacunación.
La posibilidad de que un nuevo subtipo del virus de la gripe A se introduzca en la población humana también presenta un desafío importante para las estrategias de vacunación actuales. Dado que es imposible predecir qué subtipo y qué cepa del virus de la gripe causará la próxima pandemia, los enfoques actuales específicos de una cepa no se pueden emplear para preparar una vacuna contra la gripe pandémica.
3. Compendio
La presente invención proporciona un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende el dominio del tallo de la HA del virus de la gripe A/California/4/2009 (H1N1) y el dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5).
En una realización, el dominio del tallo de la HA conserva los residuos de cisteína Ap y Aq, en donde Ap es una Cys que corresponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3, y en donde Aq es una Cys que corresponde a la posición del aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3.
En una realización, (a) el dominio del tallo de la HA comprende (i) un segmento del tallo N-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos de HA1N-term hasta Ap ; (ii) un seg­ mento del tallo C-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos de Aq hasta HA1o-term; y (iii) un dominio del tallo de HA2; y (b) el dominio de la cabeza globular de HA comprende los residuos de aminoácidos entre Ap y Aq de un dominio HA1; en donde HA1N-term es el aminoácido N-terminal de una proteína HA0 madura que carece de un péptido señal; en donde HA1o-term es el aminoácido C-terminal de un dominio HA1; y en donde Ap es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3.
En una realización, (a) el dominio del tallo de HA comprende (i) un segmento del tallo N-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos de HA1N-term hasta Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-10, Ap, Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7, Ap+8, Ap+9 o Ap+10; (ii) un segmento del tallo C-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10, Aq, Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9 o Aq+10 hasta HA1C-term;
y (iii) un dominio del tallo de HA2; y (b) el dominio de la cabeza globular de HA comprende los residuos de aminoácidos entre (i) Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-10, Ap, Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, y (ii) Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10, Aq, Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, un dominio HA1; en donde HA1N-term es el aminoácido N-terminal de una proteína HA0 madura que carece de un péptido señal; en donde HA1C-term es el aminoácido C-terminal de un dominio HA1; en donde Ap es la Cys que corres­ ponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y en donde el polipéptido HA es capaz de formar una estructura tridimensional similar a una hemaglutinina del virus de la gripe de tipo silvestre.
En una realización, el polipéptido es soluble o está unido a una membrana.
En una realización, (a) el polipéptido comprende un dominio de trimerización; o (b) el polipéptido no comprende un dominio transmembranal o un endodominio de una HA del virus de la gripe.
En una realización, el polipéptido comprende además (i) un sitio de escisión de trombina y un dominio de trimerización de T4; y/o (ii) un marcador HIS.
En una realización, el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención se expresa y se aísla a partir de una célula.
En una realización, la célula es una célula de mamífero.
En el presente documento se proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimé­ rico del virus de la gripe de la invención.
También se proporciona en el presente documento una célula que expresa el ácido nucleico de la invención.
En una realización, la célula es una célula Crucell Per.C6, célula Vero, célula CHO, célula VERY, célula BHK, célula HeLa, célula COS, célula MDCK, célula 293, célula 3T3, célula WI38, célula NS0, célula 45.6 TG1.7, célula 9B5 clon
AF-2, célula 9B5 clon AF-2, célula J558L, célula MOPC 315, células MPC-11, célula NCI-H929, célula NP, célula NSO/1, célula P3 NS1 Ag4, célula P3/NS1/1-Ag4-1, célula P3U1, célula P3X63Ag8, célula P3X63Ag8.653, célula P3X63Ag8U.1, célula RPMI 8226, célula Sp20-Ag14, célula U266B1, célula X63AG8.653, célula Y3.Ag.1.2.3, célula YO, célula Sf9, célula Sf21, célula Ao/Tn 38, célula High Five, célula Trichoplusia ni, célula Spodoptera frugiperda o célula Bombyx mori.
La presente invención también proporciona un virus que comprende: (a) un genoma diseñado genéticamente para expresar el ácido nucleico de la invención; o (b) el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención.
En una realización, el virus es: (i) un virus de la gripe; o (ii) un virus de la estomatitis vesicular (VSV), un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un adenovirus o un baculovirus.
En una realización, el virus es un virus de la gripe A.
En una realización, el virus de la invención está: (i) vivo atenuado; o (ii) inactivado o fraccionado.
La presente invención también proporciona una partícula similar a un virus que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención.
También se proporciona una línea celular o un huevo embrionado que comprende el virus de la invención.
La presente invención también proporciona una composición inmunogénica que comprende un polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención, un virus de la invención o una partícula similar a un virus de la invención.
En una realización, la composición inmunogénica comprende además un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe, un segundo virus que comprende un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe o un segundo virus que comprende un genoma diseñado genéticamente para expresar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe o una segunda partícula similar a un virus que comprende un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe, en donde el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe y un segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe, en donde el segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe es heterólogo frente al segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe.
En una realización, A) el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe que es de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la hA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/An-hui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En una realización, B) el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8), A/Perth/16/2009 (H3N2) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Netherlands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (H7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/mallard/Alberta/24/2001 (h7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En una realización, C) el segundo virus comprende un genoma diseñado genéticamente para expresar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que com­ prende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indone­ sia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En una realización, D) el segundo virus comprende un genoma diseñado genéticamente para expresar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que com­ prende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA A/Netherlands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (H7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/mallard/Alberta/24/2001 (H7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En una realización, E) el segundo virus comprende un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un se­ gundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Tur­ key/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En una realización, F) el segundo virus comprende un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un se­ gundo dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Netherlands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (H7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/mallard/Alberta/24/2001 (H7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En una realización, la composición inmunogénica de la invención, con respecto a A) o B), comprende además un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Brisbane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención, con respecto a C) o D), comprende además un tercer virus que comprende un genoma diseñado genéticamente para expresar un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Brisbane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención, con respecto a E) o D), comprende además un tercer virus que comprende un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Bris­ bane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención comprende además un adyuvante.
En una realización, el adyuvante es una sal de aluminio, monofosforil lípido A 3 De-O-acilado, MF59, AS03, AS04, polisorbato 80, un compuesto de imidazopiridina, un compuesto de imidazoquinoxalina, Matrix-M, MVA, ISCOMATRIX, AddaVax, poliI:C, horquilla de ARN transcrita in vitro procedente de ARN de interferencia defectuoso de la cepa Cantell del virus Sendai, una saponina, adyuvante de Freund, una emulsión de aceite en agua, CpG, un adyuvante físico o una molécula estimulante del receptor de tipo Toll.
En una realización, la composición inmunogénica de la invención es para uso en un método para inmunizar a un sujeto contra el virus de la gripe, prevenir una enfermedad con el virus de la gripe en un sujeto o tratar una infección o enfermedad con el virus de la gripe en un sujeto.
En una realización, la composición inmunogénica es para administrar al sujeto por vía intramuscular o intranasal.
En una realización, la composición inmunogénica es para uso según la invención, en donde el método es para inmu­ nizar al sujeto contra el virus de la gripe y en donde el método comprende: (a) administrar al sujeto una primera dosis de la composición inmunogénica; (b) administrar al sujeto una segunda dosis de la composición inmunogénica 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la primera dosis.
En una realización, el método para inmunizar al sujeto contra el virus de la gripe comprende (c) administrar al sujeto una tercera dosis de la composición inmunogénica 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la segunda dosis, en donde el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe presente en la primera dosis es diferente del dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe presente en la segunda y/o la tercera dosis.
En una realización, la composición inmunogénica es para uso según la invención, en donde el sujeto es un ser humano.
En una realización, el sujeto humano es un lactante humano, un sujeto humano de 1 a 5 años de edad o un sujeto humano anciano, en donde el lactante humano es un recién nacido humano de hasta 1 año de edad.
La presente invención también proporciona un método para producir el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención o el virus de la invención, en donde (I) el método para producir el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) cultivar la célula de la invención; y (b) aislar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe; o (II) el método para producir el virus comprende (a) multiplicar el virus de la invención en un huevo embrionado o una célula; y (b) aislar el virus desde el huevo embrionado o la célula.
En el sentido de esta solicitud, un método para inducir una respuesta inmunitaria, un método para prevenir o un método para tratar una enfermedad debida al virus de la gripe se refiere a una composición inmunogénica para uso en un método para inmunizar a un sujeto contra el virus de la gripe, prevenir una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto o tratar una infección o enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto, respectivamente.
En el presente documento se describen polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe que indu­ cen una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra el dominio del tallo de la HA conservada de los virus de la gripe. Los polipéptidos quiméricos de HA del virus de la gripe descritos en este documento comprenden un dominio del tallo de la HA estable (p. ej., formado correctamente) y un dominio de la cabeza globular de la HA que es heterólogo con respecto al dominio del tallo (es decir, los dominios de la cabeza y el tallo se obtienen a partir de diferentes cepas y/o subtipos del virus de la gripe).
La invención proporciona además una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, es decir, el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) y el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) y, opcionalmente, otros polipéptidos quiméricos de la HA del virus de la gripe especificados a continuación. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H1 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H5 (algunas veces denominado en el presente documento "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/Califor­ nia/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)). El dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H1 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 proporcionado en el presente documento puede proceder de un subtipo H1 contra el que la mayoría de la población no ha sido tratada. El dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H1 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 proporcionado en este documento, puede proceder de una próxima cepa de la vacuna H1N1, por ejemplo, la cepa de la vacuna H1N1 en uso en el año 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031,2032, 2032, 2033, 2034 o 2035.
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 no comprende el dominio del tallo de la HA A/Puerto Rico/8/34 ("PR8") y no comprende el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H5 (algunas veces denominado en el presente documento "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3"). En una realización especí­ fica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victo­ ria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización espe­ cífica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar-headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachu­ setts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/In­ diana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) y el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realiza­ ción específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
El dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 puede proceder de un subtipo H3 contra el que la mayoría de la población no ha sido tratada. Por ejemplo, el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 puede proceder de una próxima cepa de vacuna H3N2, por ejemplo, la cepa de la vacuna H3N2 en uso en el año 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021, 2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031, 2032, 2032, 2033, 2034 o 2035.
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 no comprende el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) y no comprende el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H7 (algunas veces denominado en el presente documento "poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3").
En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (h3n2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victo­ ria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Victoria/361/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (h7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a un A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (h3n2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de he­ maglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indiana/10/2011 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Nether­ lands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de he­ maglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/2009 (H3N2)) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
El dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H3 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 puede proceder de un subtipo H3 contra el que la mayoría de la población no ha sido tratada. Por ejemplo, el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H3 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, puede proceder de una próxima cepa de vacuna H3N2, por ejemplo, la cepa de la vacuna H3N2 en uso en el año 2013, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2019, 2020, 2021,2022, 2023, 2024, 2025, 2026, 2027, 2028, 2029, 2030, 2031,2032, 2032, 2033, 2034 o 2035, por ejem­ plo.
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 no comprende el dominio de la cabeza globular de A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otro ejemplo específico, un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 no comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H5 (a veces denominado en el presente documento un "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B").
En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una hA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Vietnam/1203/2004 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Indonesia/5/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Bris­ bane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Anhui/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/turkey/Turkey/1/2005 (H5)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5)).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H7 (a veces denominado en el presente documento un "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B").
En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Ma­ laysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de he­ maglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Netherlands/219/03 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Canada/504/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/Ca­ nada/444/04 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Alberta/24/2001 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/rhea/NC/39482/93 (H7)). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7) (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7)).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de una cepa del virus de la gripe B diferente (a veces denominada en el presente docu­ mento un "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B").
En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/Lee/1940). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Malaysia/2506/2004) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/Lee/1940). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/seal/Nether­ lands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/Lee/1940). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Wisconsin/1/2010) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una Ha de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/Lee/1940). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a B/Brisbane/60/2008) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina procedente de un virus de la gripe del subtipo H4 (algunas veces denominado en el presente documento "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3"). En una realización especí­ fica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/09 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/09). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/09 (o el dominio del tallo de una HA de un virus de la gripe similar a A/Perth/16/09) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/duck/Czech/56 (o el dominio de la cabeza globular de una HA de un virus de la gripe similar a A/duck/Czech/56).
En realizaciones específicas, los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este do­ cumento son solubles, por ejemplo, son solubles en composiciones, por ejemplo, las composiciones descritas en este documento. Los métodos ejemplares para generar polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe so­ lubles se describen en la Sección 6.6.1.2, más adelante.
Al diseñar los polipéptidos de HA quiméricos del virus de la gripe anteriores, se debe tener cuidado en conservar la estabilidad de la proteína resultante. En este sentido, en ciertas realizaciones, se recomienda que para los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe que comprenden dominios procedentes del tallo del virus de la gripe A, los residuos de cisteína identificados como Ap y Aq en la Fig. 1 se conserven, ya que contribuyen a la estabilidad del tallo de la HA como se describe con más detalle, en la Sección 5.1 más adelante. Por ejemplo, para obtener la mejor estabilidad, se prefiere "intercambiar" el dominio globular de HA como un todo (entre los residuos de cisteína Ap y Aq, tal y como se muestra en la Fig. 1) ya que la conformación resultante sería la más cercana a la estructura natural. De manera similar, los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe que comprenden los dominios del tallo del virus de la gripe B, pueden utilizar cisteínas presentes en los dominios de la cabeza globular del virus de la gripe A, a partir de los cuales se obtiene el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe (véase, por ejemplo, la Figura 36).
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (p. ej., formulaciones de vacunas) que comprenden el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprenden uno, dos o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente docu­ mento. En ciertas realizaciones, las composiciones inmunogénicas (p. ej., formulaciones de vacunas) proporcionadas en el presente documento pueden comprender además polipéptido(s) de hemaglutinina quimérico(s) del virus de la gripe descritos en el presente documento, virus de la gripe (p. ej., virus vivos o muertos) que comprenden polipéptido(s) de hemaglutinina quimérico(s) del virus de la gripe descritos en el presente documento o un genoma diseñado gené­ ticamente para codificar polipéptido(s) de hemaglutinina quimérico(s) del virus de la gripe descritos en este documento; o vectores o células que comprenden uno o más polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe des­ critos en este documento o un genoma diseñado genéticamente para codificar polipéptido(s) de hemaglutinina quimé­ rico^) del virus de la gripe descritos en este documento. Las composiciones inmunogénicas de la invención compren­ den el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención. En ciertos ejemplos, las composiciones inmunogénicas comprenden además un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B descrito en este documento, o un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cHB/B descrito en este documento. En ciertas realizaciones, las compo­ siciones inmunogénicas comprenden una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en el presente documento; o una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en el presente documento. En deter­ minadas realizaciones, las composiciones inmunogénicas comprenden una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en el presente documento y uno entre un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B, cH7/B o cB/B descrito en este documento; o una combinación de un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en este documento y uno entre un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B, cH7/B o cB/B descrito en este documento.
En el presente documento se proporcionan formulaciones de vacunas que comprenden el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna monovalente que comprende los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe de la invención. En otra realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna bivalente que comprende dos de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe (es decir, dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe distintos, en donde uno de los polipéptidos HA es el polipéptido HA de la invención). En otra realización específica, se proporciona en este documento una vacuna triva­ lente que comprende tres de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe (es decir, tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe distintos, en donde uno de los polipéptidos HA es el polipéptido HA de la invención).
Las formulaciones de vacunas proporcionadas en el presente documento comprenden los polipéptidos de hemagluti­ nina quiméricos del virus de la gripe de la invención en cualquier forma. Por ejemplo, las formulaciones de vacunas proporcionadas en el presente documento pueden comprender vacunas de subunidades que comprenden el polipép­ tido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento (por ejemplo, composiciones que comprenden polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, por ejemplo, polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe solubles); virus de la gripe vivos de la invención (p. ej., virus de la gripe atenuados vivos) que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hema­ glutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; virus de la gripe vivos de la invención (p. ej., virus de la gripe atenuados vivos) que comprenden un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; virus de la gripe muertos de la invención que comprenden el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; virus de la gripe muertos de la invención que comprenden un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento; virus/partículas similares a virus ("VLPs") de la invención que contienen el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; vacunas con virus fraccionado de la invención, en donde dicho virus expresa el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento; vector de expresión vírica de la invención (por ejemplo, vectores de expresión vírica que no son de la gripe) que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina qui­ méricos del virus de la gripe descritos en este documento; y vectores de expresión bacteriana que expresan el poli­ péptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento.
Las formulaciones de vacunas descritas en el presente documento pueden generar anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el dominio del tallo de la HA de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe. Esas vacunas "universales" se pueden utilizar para inducir y/o potenciar respuestas inmunitarias de protección cruzada entre los subtipos del virus de la gripe.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas de la invención para uso en un método para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección con el virus de la gripe, que comprende administrar al sujeto la composición de la invención. En ciertas realizaciones un sujeto se sensibiliza con una primera composición que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprende uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente docu­ mento o una formulación de vacuna que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, y posteriormente se refuerza con la misma composición o una diferente (por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe diferente; una composición que comprende el mismo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe pero en un contexto diferente (por ejemplo, la primera composición comprende una vacuna con una subunidad que comprende el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención y la composición diferente comprende un vector vírico que comprende el mismo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe diferente en un contexto diferente) que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que comprende además uno o más de los polipép­ tidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento o una formulación de vacuna que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención. El sujeto puede ser reforzado una o más veces con la composición de la invención que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprende uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento o una formulación de vacuna que comprende el polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, cuando el sujeto recibe un refuerzo más de una vez, el primer refuerzo y el segundo refuerzo son con diferentes composiciones que comprenden el polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención y que además comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento o una formulación de vacuna que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y cada refuerzo comprende una composición diferente a la composición que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento o una formulación de vacuna que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención usado para sensibilizar al sujeto.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona la composición inmunogénica de la invención para uso en un método para inmunizar a un sujeto (p. ej., un sujeto humano) contra el virus de la gripe que comprende administrar al sujeto una primera dosis de una cantidad eficaz del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención y administrar al sujeto una segunda dosis de una cantidad eficaz del polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención, de 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la primera dosis, en donde (i) el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe del vector, la composición inmunogénica o la formu­ lación de vacuna en la primera y la segunda dosis son iguales o diferentes (p. ej., la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la primera dosis es diferente de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la segunda dosis); y/o (ii) el tipo de composición inmunogénica o vector o formulación de vacuna administrado en ambas dosis es igual o diferente. En ciertas realizaciones, el método comprende además administrar al sujeto una tercera dosis de una can­ tidad eficaz del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la inven­ ción, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención, de 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la segunda dosis, en donde (i) el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe del vector, la composición inmunogénica o la formulación de vacuna es igual o diferente al polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en la primera y/o la segunda dosis; y (ii) el tipo de composición inmunogénica o vector o formulación de vacuna administrado en ambas dosis es igual o diferente. En ciertas realizaciones, dos, tres o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, se administran como parte de la primera, segunda y/o tercera dosis, en donde cada polipéptido HA quimérico en una dosis es diferente de los otros. En algunas realizaciones, la primera, la segunda y/o la tercera dosis del vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la inven­ ción comprende dos, tres o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es la HA quimérica del virus de la gripe de la invención, en donde cada polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención, la formulación de vacuna de la invención administrado en una dosis, es diferente (por ejemplo, la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la primera dosis es diferente de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la segunda dosis, etc.).
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento la composición inmunogénica de la invención para uso en un método para inmunizar a un sujeto humano de 1 a 5 años contra el virus de la gripe que comprende administrar al sujeto una primera dosis de una cantidad eficaz del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención y administrar al sujeto una segunda dosis de una cantidad eficaz del polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de la vacuna, de 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la primera dosis, en donde (i) el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe del vector, la composición inmunogénica o la formulación de la vacuna en la primera y las segunda dosis son los mismos o diferentes (p. ej., la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la primera dosis es diferente de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la segunda dosis); y/o (ii) el tipo de composición inmunogénica o vector o formulación de vacuna administrado en ambas dosis es igual o diferente. En ciertas realiza­ ciones, el método comprende además administrar al sujeto una tercera dosis de una cantidad eficaz del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna del invención, de 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la segunda dosis, en donde (i) el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe del vector de la invención, la composi­ ción inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención, de la primera y la segunda dosis son iguales o diferentes (por ejemplo, la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la primera dosis es diferente de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) qui­ mérico del virus de la gripe administrado en la segunda dosis); y/o (ii) el tipo de composición inmunogénica o vector o formulación de vacuna administrado en ambas dosis es igual o diferente. En ciertas realizaciones, dos, tres o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, se administran como parte de la primera, segunda y/o tercera dosis, en donde cada polipéptido HA quimérico en una dosis es diferente de los otros. En algunas realizaciones, la primera, la segunda y/o la tercera dosis del vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención comprende dos, tres o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA del virus de la gripe de la invención, en donde cada polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe en el vector de la invención, la composición inmunogénica de la invención o la formulación de vacuna de la invención administrado en una dosis es diferente (por ejemplo, la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la primera dosis es diferente de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe administrado en la segunda dosis, etc.).
En otro aspecto, en este documento se proporcionan kits que comprenden el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención descritos en este documento o una formulación de vacuna de la invención. Los kits proporcionados en el presente documento pueden comprender además uno o más componentes adicionales, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe proporcionados en el kit.
Los Ejemplos de trabajo (por ejemplo, los Ejemplos de la Sección 6) demuestran, entre otras cosas, la preparación de estructuras artificiales que codifican polipéptidos HA quiméricos del virus de la gripe quiméricos que comprenden un dominio del tallo de HA y que muestran un dominio de la cabeza globular de HA heterólogo, y la producción de poli­ péptidos HA quiméricos estables a partir de esas estructuras artificiales que reaccionan de forma cruzada con anti­ cuerpos contra el dominio del tallo y el dominio de la cabeza. Los Ejemplos de trabajo también ilustran el uso de esas estructuras artificiales en la generación de una respuesta inmunitaria protectora en sujetos frente a múltiples cepas y subtipos diferentes del virus de la gripe, es decir, los Ejemplos demuestran que los polipéptidos HA quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento se pueden utilizar como una vacuna universal contra la gripe.
3.1 Terminología
Los términos "aproximadamente" o "aproximado", cuando se usan haciendo referencia a la posición de un aminoácido, se refieren a la posición particular de un aminoácido en una secuencia o cualquier aminoácido que se encuentre dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un residuo de esa posición de aminoácido, ya sea en dirección N-terminal o dirección C-terminal.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "cerca de" o "aproximadamente" cuando se usa junto con un número, se refiere a cualquier número dentro del 1, 5 o 10% del número de referencia. En ciertas realizaciones, el término "aproximadamente" incluye el número exacto mencionado.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "fragmento" en el contexto de una secuencia de ácido nucleico, se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende una porción de nucleótidos consecutivos procedentes de una secuencia parental. En una realización específica, el término se refiere a una secuencia de nucleótidos de 5 a 15, 5 a 25, 10 a 30, 15 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia parental. En otra realización, el término se refiere a una secuencia de nucleótidos de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 o 475 nucleótidos consecutivos de una secuencia parental.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "fragmento" en el contexto de una secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que comprende una porción de residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental. En una realización específica, el término se refiere a una secuencia de aminoácidos de 2 a 30, 5 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 o más residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental. En otra realización, el término se refiere a una secuencia de aminoácidos de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175 o 200 residuos de aminoácidos consecutivos de una secuencia parental.
Tal y como se usa en este documento, los términos "enfermedad" y "trastorno" se usan indistintamente para referirse a una afección en un sujeto. En realizaciones específicas, un término "enfermedad" se refiere al estado patológico resultante de la presencia del virus en una célula o un sujeto o debido a la invasión de una célula o sujeto con el virus. En determinadas realizaciones, la afección es una enfermedad en un sujeto, cuya gravedad disminuye al inducir una respuesta inmunitaria en el sujeto mediante la administración de una composición inmunogénica.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de una terapia a un sujeto, se refiere a la cantidad de una terapia que tiene efectos profilácticos y/o terapéuticos. En ciertas realizaciones, una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de una terapia a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) reducir o mejorar la gravedad de una infección, enfermedad o síntoma asociado con el virus de la gripe; (ii) reducir la duración de una infección, enfermedad o síntoma asociado con el virus de la gripe; (iii) prevenir la progresión de una infección, enfermedad o síntoma asociado con el virus de la gripe; (iv) causar la regresión de una infección con el virus de la gripe, enfermedad o síntoma asociado con el mismo; (v) prevenir el desarrollo o la aparición de una infección, enfer­ medad o síntoma asociado con el virus de la gripe; (vi) prevenir la recurrencia de una infección, enfermedad o síntoma asociado con el virus de la gripe; (vii) reducir o prevenir la multiplicación de un virus de la gripe de una célula a otra célula, de un tejido a otro tejido o de un órgano a otro órgano; (ix) prevenir o reducir la propagación de un virus de la gripe de un sujeto a otro sujeto; (x) reducir la insuficiencia orgánica asociada con una infección con el virus de la gripe; (xi) reducir la hospitalización de un sujeto; (xii) reducir la duración de la hospitalización; (xiii) aumentar la supervivencia de un sujeto con una infección con el virus de la gripe o una enfermedad asociada con el mismo; (xiv) eliminar una infección con el virus de la gripe o una enfermedad asociada con el mismo; (xv) inhibir o reducir la replicación del virus de la gripe; (xvi) inhibir o reducir la entrada de un virus de la gripe en la(s) célula(s) hospedadora(s); (xviii) inhibir o reducir la replicación del genoma del virus de la gripe; (xix) inhibir o reducir la síntesis de proteínas del virus de la gripe; (xx) inhibir o reducir el ensamblaje de las partículas del virus de la gripe; (xxi) inhibir o reducir la liberación de partículas del virus de la gripe desde una célula hospedadora; (xxii) reducir el título de virus de la gripe; y/o (xxiii) aumentar o mejorar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
En determinadas realizaciones, la cantidad eficaz no da como resultado una protección completa frente a una enfer­ medad con el virus de la gripe, pero da como resultado un título más bajo o un número reducido de virus de la gripe en comparación con un sujeto no tratado. En ciertas realizaciones, la cantidad eficaz da como resultado una reducción de 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 125 veces reducción de 150 veces, 175 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 750 veces o 1.000 veces o más en el título del virus de la gripe en relación con un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz da como resultado una reducción en el título de virus de la gripe en relación con un sujeto no tratado de aproximadamente 1 magnitud logarítmica o más, aproximadamente 2 magnitudes logarítmicas o más, aproxima­ damente 3 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 4 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 5 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 6 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 7 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 8 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 9 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 10 magnitudes logarítmicas o más, 1 a 3 magnitudes logarítmicas, 1 a 5 magnitudes loga­ rítmicas, 1 a 8 magnitudes logarítmicas, 1 a 9 magnitudes logarítmicas, 2 a 10 magnitudes logarítmicas, 2 a 5 magni­ tudes logarítmicas, 2 a 7 magnitudes logarítmicas, 2 magnitudes logarítmicas a 8 magnitudes logarítmicas, 2 a 9 magnitudes logarítmicas, 2 a 10 magnitudes logarítmicas, 3 a 5 magnitudes logarítmicas, 3 a 7 magnitudes logarítmi­ cas, 3 a 8 magnitudes logarítmicas, 3 a 9 magnitudes logarítmicas, 4 a 6 magnitudes logarítmicas, 4 a 8 magnitudes logarítmicas, 4 a 9 magnitudes logarítmicas, 5 a 6 magnitudes logarítmicas, 5 a 7 magnitudes logarítmicas, 5 a 8 magnitudes logarítmicas, 5 a 9 magnitudes logarítmicas, 6 a 7 magnitudes logarítmicas, 6 a 8 magnitudes logarítmicas, 6 a 9 magnitudes logarítmicas, 7 a 8 magnitudes logarítmicas, 7 a 9 magnitudes logarítmicas o 8 a 9 magnitudes logarítmicas. Los beneficios de una reducción en el título, el número o la carga total de virus de la gripe incluyen, entre otros, síntomas menos graves de la infección, menos síntomas de la infección y una reducción en la duración de la enfermedad asociada con la infección.
"Hemaglutinina" y "HA" se refieren a cualquier hemaglutinina conocida por los expertos en la técnica. En ciertas reali­ zaciones, la hemaglutinina es hemaglutinina del virus de la gripe, tal como una hemaglutinina del virus de la gripe A, una hemaglutinina del virus de la gripe B o una hemaglutinina del virus de la gripe C. Una hemaglutinina típica com­ prende dominios conocidos por los expertos en la técnica que incluyen un péptido señal (opcional en este documento), un dominio del tallo, un dominio de la cabeza globular, un dominio luminal (opcional en este documento), un dominio transmembranal (opcional en este documento) y un dominio citoplasmático (opcional en este documento). En deter­ minadas realizaciones, una hemaglutinina consiste en una única cadena polipeptídica, como HA0. En determinadas realizaciones, una hemaglutinina consiste en más de una cadena polipeptídica en asociación cuaternaria, p. ej., HA1 y HA2. Los expertos en la técnica reconocerán que una HA0 inmadura podría escindirse para liberar un péptido señal (aproximadamente 20 aminoácidos) produciendo una hemaglutinina HA0 madura. Una hemaglutinina HA0 podría es­ cindirse en otro sitio para producir el polipéptido HA1 (aproximadamente 320 aminoácidos, incluido el dominio de la cabeza globular y una parte del dominio del tallo) y el polipéptido HA2 (aproximadamente 220 aminoácidos, incluido el resto del dominio del tallo, un dominio luminal, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático). En deter­ minadas realizaciones, una hemaglutinina comprende un péptido señal, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático. En ciertas realizaciones, una hemaglutinina carece de péptido señal, es decir, la hemaglutinina es una hemaglutinina madura. En determinadas realizaciones, una hemaglutinina carece de un dominio transmembranal o un dominio citoplasmático o ambos. Tal y como se usa en el presente documento, los términos "hemaglutinina" y "HA" incluyen polipéptidos de hemaglutinina que se modifican mediante un procesamiento postraduccional, como la esci­ sión del péptido señal, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación (por ejemplo, glicosilación ligada a N), escisión de proteasas y modificación de lípidos (p. ej., S-palmitoilación).
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe", "polipéptido HA quimérico del virus de la gripe", "polipéptido de hemaglutinina quimérico" y "polipéptido de hemaglutinina del influenzavirus quimérico" se refieren a una hemaglutinina del virus de la gripe que comprende un dominio del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe y un dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina del virus de la gripe, en donde el dominio de la cabeza de la hemaglutinina del virus de la gripe es heterólogo frente al dominio del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe (es decir, el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe es de una cepa o subtipo de virus de la gripe diferente al del dominio del tallo del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe).
“Segmento del tallo N-terminal de HA1” se refiere a un segmento del polipéptido que corresponde a la porción aminoterminal del dominio del tallo de un polipéptido HA1 de hemaglutinina del virus de la gripe. En ciertas realizaciones, un segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en residuos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos HA1N-term hasta Ap de un dominio HA1. HA1N-term es el aminoácido N-terminal de HA1 como reconocen los expertos en la técnica. Ap es el residuo de cisteína en el segmento del tallo N-terminal de HA1 que forma o es capaz de formar un enlace disulfuro con un residuo de cisteína en un segmento del tallo C-terminal de HA1. El residuo Ap se identifica en los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos de tallo N-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en residuos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos 1-52 de HA1 de una hemaglutinina H3. Se debe tener en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, a partir de la cual se ha eliminado el péptido señal. Los expertos en la técnica podrán reconocer fácilmente los residuos de aminoácidos que corresponden al segmento del tallo N-terminal de HA1 de otros polipéptidos HA del virus de la gripe, por ejemplo, los residuos de aminoácidos que corresponden al segmento del tallo N-terminal HA1 de HA1, de los de una hemaglutinina H1 (véase, por ejemplo, la Figura 1).
"Segmento del tallo C-terminal de HA1" se refiere a un segmento de polipéptido que corresponde a la porción carboxiterminal del dominio del tallo de un polipéptido de la hemaglutinina HA1 del virus de la gripe. En ciertas realizaciones, un segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en residuos de aminoácidos que corresponden aproximadamente a los aminoácidos Aq hasta HA1c-term de un dominio HA1. HA1c-term es el aminoácido C-terminal del dominio HA1 como reconocen los expertos en la técnica. El residuo Aq se identifica en polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe A en la FIG. 1. En el presente documento se describen ejemplos de segmentos del tallo C-terminal de HA1. En ciertas realizaciones, un segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en residuos de aminoácidos que corresponden apro­ ximadamente a los aminoácidos 277-329 de HA1 de una hemaglutinina H3. Se debe tener en cuenta que, en este sistema de numeración, 1 se refiere al aminoácido N-terminal de la proteína HA0 madura, de la que se ha eliminado el péptido señal. Los expertos en la técnica podrán reconocer fácilmente los residuos de aminoácidos que correspon­ den al segmento del tallo C-terminal de HA1 de otros polipéptidos HA del virus de la gripe, por ejemplo, los residuos de aminoácidos que corresponden al segmento del tallo C-terminal HA1 de HA1, de los de una hemaglutinina H1 (véase, por ejemplo, la Figura 1).
"HA2" se refiere a un dominio polipeptídico que corresponde al dominio HA2 de un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, HA2 consiste en un dominio del tallo, un dominio luminal, un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático (véase, por ejemplo, Scheiffle et al., 2007, EMBO J. 16(18):5501-5508,). En determinadas realizaciones, HA2 consiste en un dominio del tallo, un dominio luminal y un dominio transmembranal. En ciertas realizaciones, HA2 consiste en un dominio del tallo y un dominio luminal; en esas realizaciones, HA2 podría ser soluble. En ciertas realizaciones, HA2 consiste en un dominio del tallo; en esas realizaciones, HA2 podría ser soluble.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" en el contexto de un polipéptido, ácido nucleico o virus se refiere a un polipéptido, ácido nucleico o virus, respectivamente, que normalmente no se encuentra en la naturaleza o que normalmente no está asociado en la naturaleza con un polipéptido, ácido nucleico o virus de interés. Por ejemplo, un "polipéptido heterólogo" puede referirse a un polipéptido obtenido a partir de un virus diferente, por ejemplo, una cepa o un subtipo de virus de la gripe diferente o un virus no relacionado o una especie diferente. En realizaciones específicas, cuando se usa en el contexto de un dominio de la cabeza globular de una hemaglutinina quimérica del virus de la gripe descrito en el presente documento, el término heterólogo se refiere a un dominio de la cabeza globular de una HA del virus de la gripe que está asociado con un dominio del tallo de una HA del virus de la gripe con el que normalmente no estaría asociado (por ejemplo, los dominios de la cabeza y el tallo de la HA no se encontrarían juntos en la naturaleza).
Tal y como se usa en este documento, la expresión "en combinación", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia (p. ej., más de un agente profiláctico y/o agente terapéutico). El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden con el que se administran las terapias a un sujeto. Por ejemplo, una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) puede administrarse antes (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), de forma concomitante o posterior (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después) a la administración de una segunda terapia a un sujeto.
Tal y como se usa en este documento, el término "infección" significa la invasión, multiplicación y/o presencia de un virus en una célula o un sujeto. En una realización, una infección es una infección "activa", es decir, una en la que el virus se replica en una célula o un sujeto. Tal infección se caracteriza por la propagación del virus a otras células, tejidos y/u órganos, desde las células, tejidos y/u órganos infectados inicialmente por el virus. Una infección también puede ser una infección latente, es decir, una en la que el virus no se replica.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "enfermedad por el virus de la gripe" se refiere al estado patológico resultante de la presencia de un virus de la gripe (p. ej., virus de la gripe A o B) en una célula o sujeto, o la invasión de una célula o sujeto con un virus de la gripe. En realizaciones específicas, la expresión se refiere a una enfermedad respiratoria provocada por un virus de la gripe.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "sistema carente de IFN" o "sustrato carente de IFN" se refieren a sistemas, p. ej., células, líneas celulares y animales, tales como cerdos, ratones, pollos, pavos, conejos, ratas, etc., que no producen IFN o producen niveles bajos de IFN (es decir, una reducción en la expresión de IFN del 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% o más cuando se compara con sistemas compe­ tentes para IFN en las mismas condiciones), no responden o responden de manera menos eficiente al IFN y/o son deficientes en la actividad de uno o más genes antivirales inducidos por IFN.
Tal y como se usa en el presente documento, el término "similar", cuando se usa en el contexto de un "virus similar al virus de la gripe", se refiere a un virus de la gripe que representa una cepa aislada diferente del virus de la gripe al que se hace referencia, en donde la secuencia de aminoácidos de dicha cepa aislada diferente o de la secuencia de aminoácidos de la HA de dicha cepa aislada diferente, es idéntica o casi idéntica a la secuencia de aminoácidos del virus de la gripe al que se hace referencia o la secuencia de aminoácidos de la HA del virus de la gripe al que se hace referencia; y/o la respuesta inmune frente a dicha cepa aislada diferente confiere una protección total frente al virus de la gripe al que se hace referencia, y viceversa. En ciertas realizaciones, una cepa aislada del virus de la gripe que tiene una secuencia de aminoácidos que es casi idéntica a la secuencia de aminoácidos de un virus de la gripe al que modificación postraduccional de las proteínas víricas y liberación desde la célula hospedadora mediante lisis o gema­ ción y adquisición de una envuelta de fosfolípidos que contiene glicoproteínas víricas incrustadas. En algunas realiza­ ciones, los términos y expresiones "replicación", "replicación vírica" y "replicación de un virus" se refieren a la replicación del genoma vírico. En otras realizaciones, los términos y expresiones "replicación", "replicación vírica " y "replicación de un virus" se refieren a la síntesis de proteínas víricas.
Tal y como se usa en el presente documento, las expresiones "polipéptido del dominio del tallo", "dominio del tallo de HA", "polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe" y "dominio del tallo de HA" se refieren a un polipéptido que comprende o consiste en una o más cadenas polipeptídicas que forman un dominio del tallo de una hemaglutinina del virus de la gripe. Un polipéptido del dominio del tallo puede ser una sola cadena polipeptídica, dos cadenas polipeptídicas o más cadenas polipeptídicas. Por lo general, un polipéptido del dominio del tallo es una sola cadena polipeptídica (es decir, correspondiente al dominio del tallo de un polipéptido de la hemaglutinina HA0) o dos cadenas polipeptídicas (es decir, correspondiente al dominio del tallo de un polipéptido de la hemaglutinina HA1 en asociación con un polipéptido de la hemaglutinina HA2). En realizaciones específicas, un polipéptido del dominio del tallo se obtiene a partir de una hemaglutinina del virus de la gripe A H1 o H3 o una hemaglutinina del virus de la gripe B.
Tal y como se usa en este documento, las expresiones "polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe", "dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe", "dominio de la cabeza globular de la HA" y "dominio de la cabeza HA" se refieren al dominio de la cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe. Por ejemplo, para el virus de la gripe A, generalmente se entiende que el dominio de la cabeza globular está presente entre dos residuos clave de cisteína en la porción HA1 de la molécula de HA. Esos residuos de cisteína se identifican como "Ap" y "Aq" en la Fig. 1 para varios virus de la gripe A.
Tal y como se usa en este documento, los términos "sujeto" o "paciente" se usan indistintamente para referirse a un animal (p. ej., aves, reptiles y mamíferos). En una realización específica, un sujeto es un pájaro. En otra realización, un sujeto es un mamífero que incluye un no primate (p. ej., un camello, un burro, una cebra, una vaca, un cerdo, un caballo, una cabra, una oveja, un gato, un perro, una rata y un ratón) y un primate (p. ej., un mono, un chimpancé y un ser humano). En ciertas realizaciones, un sujeto es un animal no humano. En algunas realizaciones, un sujeto es un animal de granja o una mascota. En otra realización, un sujeto es un ser humano. En otra realización, un sujeto es un lactante humano. En otra realización, un sujeto es un niño humano. En otra realización, un sujeto es un adulto humano. En otra realización, un sujeto es un ser humano de edad avanzada. En otra realización, un sujeto es un lactante humano prematuro.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "lactante humano prematuro" se refiere a un lactante humano nacido con menos de 37 semanas de edad gestacional.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "lactante humano" se refiere a un ser humano desde recién nacido hasta 1 año de edad.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "niño humano" se refiere a un ser humano que tiene entre 1 año y 18 años.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "adulto humano" se refiere a un ser humano que tiene 18 años o más.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "ser humano de edad avanzada" se refiere a un ser humano de 65 años o más.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "cepa del virus de la gripe estacional" se refiere a una cepa del virus de la gripe a la que una población de sujetos está expuesta de forma estacional. En realizaciones específicas, la expresión cepa del virus de la gripe estacional se refiere a una cepa del virus de la gripe A. En realizaciones espe­ cíficas, la expresión cepa del virus de la gripe estacional se refiere a una cepa del virus de la gripe que pertenece al subtipo H1 o H3, es decir, los dos subtipos que actualmente persisten en la población de sujetos humanos. En otras realizaciones, la expresión cepa del virus de la gripe estacional se refiere a una cepa del virus de la gripe B.
Tal y como se usa en este documento, los términos "terapias" y "terapia" pueden referirse a cualquier protocolo, mé­ todo, compuesto, composición, formulación y/o agente que puede usarse en la prevención o tratamiento de una infec­ ción vírica o una enfermedad o síntoma asociado con la misma. En ciertas realizaciones, los términos "terapias" y "terapia" se refieren a terapia biológica, terapia de apoyo y/u otras terapias útiles en el tratamiento o prevención de una infección vírica o una enfermedad o síntoma asociado con ella, conocidas por un experto en la técnica. En algunas realizaciones, el término "terapia" se refiere a (i) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, (ii) un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o (iii) un vector o composición que comprende un ácido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. En algunas realizaciones, el término "terapia" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe.
Tal y como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento" y "tratando" se refieren en el contexto de la administración de una(s) terapia(s) a un sujeto para tratar una enfermedad o infección con el virus de la gripe para obtener un efecto beneficioso o terapéutico de una terapia o una combinación de terapias. En realizaciones específicas, esos términos se refieren a uno, dos, tres, cuatro, cinco o más de los siguientes efectos que son el resul­ tado de la administración de una terapia o una combinación de terapias: (i) la reducción o mejora de la gravedad de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad o un síntoma asociado con la misma; (ii) la reducción de la duración de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad o un síntoma asociado con la misma; (iii) la regresión de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad o un síntoma asociado con la misma; (iv) la reducción del título de un virus de la gripe; (v) la reducción de la insuficiencia orgánica asociada con una infección con el virus de la gripe o una enfermedad asociada con la misma; (vi) la reducción de la hospitalización de un sujeto; (vii) la reducción del tiempo de hospitalización; (viii) el aumento de la supervivencia de un sujeto; (ix) la eliminación de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad o síntoma asociado con la misma; (x) la inhibición de la progresión de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad o un síntoma asociado con la misma; (xi) la prevención de la propagación de un virus de la gripe desde una célula, tejido, órgano o sujeto a otra célula, tejido, órgano o sujeto; (xii) la inhibición o reducción de la entrada de un virus de la gripe en una célula hospedadora; (xiii) la inhibición o reducción de la replicación de un genoma del virus de la gripe; (xiv) la inhibición o reducción de la síntesis de proteínas del virus de la gripe; (xv) la inhibición o reducción de la liberación de partículas del virus de la gripe desde una(s) célula(s) hospedadora(s); y/o (xvi) la potenciación o mejora del efecto terapéutico de otra terapia.
Tal y como se usa en el presente documento, en algunas realizaciones, la expresión "de tipo silvestre" en el contexto de un virus, se refiere a los tipos de virus que prevalecen, que circulan de forma natural y que producen brotes típicos de enfermedad. En otras realizaciones, la expresión "de tipo silvestre" en el contexto de un virus se refiere a un virus parental.
4. Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 presenta un alineamiento de secuencias mediante CLUSTALW, de secuencias representativas de 17 subtipos de hemaglutinina del virus de la gripe A (SEQ ID NOS: 1-16 y 35 respectivamente). El residuo designado Ap es el residuo de cisteína en el segmento del tallo N-terminal de HA1 que forma o es capaz de formar un enlace disulfuro con el residuo designado como Aq, un residuo de cisteína en un segmento del tallo C-terminal de HA1. El residuo designado Bq representa el aminoácido N-terminal aproximado de los segmentos de tallo cortos C-terminales de HA1 descritos en este documento. El residuo designado Cq representa el aminoácido N-terminal aproximado de los segmentos de tallo largos C-terminales de HA1 descritos en este documento. El residuo de­ signado Cp representa el aminoácido C-terminal aproximado de los segmentos de tallo largos N-terminales de HA1 descritos en este documento.
La Fig. 2 proporciona un esquema de HAs quiméricas con un dominio del tallo H1 conservado y diferentes domi­ nios de la cabeza globular de distintos subtipos de HAs.
La Fig. 3 proporciona una nueva vacuna contra la gripe y una plataforma de herramientas de diagnóstico para inducir y analizar anticuerpos y sueros reactivos. A) Expresión de HAs quiméricas. Las HAs quiméricas que consisten en el dominio del tallo de HA A/PR/8/34 y el dominio de la cabeza globular de A/California/4/09 (HA quimérica), así como HAs de tipo silvestre (PR8-HA y CAL09-HA) y un control de GFP, se expresaban en células 293T. La transferencia Western superior se sometió a ensayo con un anticuerpo específico de PR8 (PY102), mientras que la transferencia del lado inferior se sometió a ensayo con un anticuerpo específico de Cal09 (39C2). B) Dibujo esquemático de estructuras artificiales de HAs expresadas en A. La HA quimérica está compuesta por el dominio del tallo de HA A/PR/8/34 y el dominio de la cabeza globular de 2009 A/California/04/09.
La Fig. 4 proporciona un esquema de las HAs quiméricas. A) Estructura básica de una HA quimérica. La cabeza globular se puede intercambiar convenientemente en el enlace disulfuro Cys 52-Cys 277. B) Régimen de sensi­ bilización-refuerzo con administración secuencial de HAs quiméricas que consisten en un dominio del tallo com­ pletamente conservado y un dominio de la cabeza globular variable.
La Fig. 5 describe la generación de una HA quimérica con el tallo de una HA H1 y la cabeza globular de una HA H3. Una HA quimérica que consiste en el dominio del tallo de HA A/PR/8/34 y el dominio de la cabeza globular de HK/68 (H3 quimérica), así como HAs de tipo silvestre (PR8-HA y HK68 hA) se expresaban en células 293T. La transferencia Western superior se sometió a ensayo con un anticuerpo específico de PR8, mientras que la de la parte inferior se sometió a ensayo con un anticuerpo específico de H3.
La Fig. 6 representa una comparación de secuencias de las secuencias de la proteína de hemaglutinina de A/Hong Kong/1/1968 (H3), A/Perth/16/2009 (H3), A/PR/8/34 (H1), A/Cal/4/09 (H1), A/Viet Nam/1203/04 (H5) y A/mallard/Alberta/24/01 (H7). Se especifican los residuos de aminoácidos Cys52 y Cys277 (basándose en la numeración H3). El sombreado negro indica los aminoácidos conservados. La línea ondulada negra representa la región de la cabeza globular de las HAs. Se indican los puntos de partida de HA1 y HA2. Se presentan las secuencias de aminoácidos desde el extremo N-terminal hasta Cys52 de la HA de cada una de A/Hong Kong/1/1968 (H3), A/Perth/16/2009 (H3), A/PR/8/34 (H1), A/Cal/4/09 (H1), A/Viet Nam/1203/04 (H5) y A/ma­ llard/Alberta/24/01 (H7) y se corresponden con SEQ ID NOs. 23-28, respectivamente. Se presentan las s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e C y s 277 d e la H A d e c a d a u n a d e A /H o n g K o n g /1 /1968 (H 3 ) , A /P e r th / 16 /2009 ( H 3 ) , A /P R /8 /34 ( H 1 ) , A /C a l/ 4 /09 (H 1 ) , A /V ie t N a m /1203 /04 (H 5 ) y A /m a l la r d /A lb e r t a / 24 /01 (H 7 ) h a s ta e l e x t r e m o C - te r m in a l y s e c o r r e s p o n d e n c o n S E Q ID N O s . 29 - 34 , r e s p e c t iv a m e n te .
L a F ig . 7 r e p r e s e n ta u n e s q u e m a d e h e m a g lu t in in a s q u im é r ic a s . (A ) D ia g r a m a d e la e s t r u c tu r a a r t i f ic ia l d e la H A q u im é r ic a P R 8 - c H 1. L a H A q u im é r ic a s e c o n s t r u y ó in t e r c a m b ia n d o e l d o m in io d e la c a b e z a g lo b u la r u b ic a d o e n t r e C y s 52 y C y s 277 d e H A A /P R /8 /34 (H 1 ) c o n e l d e H A A /C a l i f o r n ia / 4 / 09 ( H 1 ) . L a H A q u im é r ic a r e s u l ta n te t ie n e la r e g ió n d e l ta l lo d e H A A /P R /8 /34 (H 1 ) c o n u n d o m in io d e la c a b e z a g lo b u la r d e H A A /C a l i f o r n ia / 4 / 09 (H 1 ) d e s ig n a d o P R 8 - c H 1. (B ) E s q u e m a d e la s e s t r u c tu r a s p le g a d a s d e la s d i f e r e n te s H A s d e t ip o s i lv e s t r e y q u im é r i ­ c a s , c o m o la H A d e P R 8 d e t ip o s i lv e s t r e , la H A d e P R 8 -c H 1 q u im é r ic a , la H A d e P R 8 - c H 5 q u im é r ic a , la H A d e P e r th d e t ip o s i lv e s t r e y la H A d e P e r th - c H 7 q u im é r ic a ( d e iz q u ie r d a a d e r e c h a ) . L a s e s t r u c tu r a s d e la s H A s d e lo n g i tu d c o m p le ta s e d e s c a r g a r o n d e la b a s e d e d a to s P r o te in D a ta b a s e ( P D B ) : P R 8 H A ( P D B ID 1 R U 7 ) y P e r th H A ( r e p r e s e n ta d a p o r H K 68 H A , P D B ID 1 M Q N ) . L a s im á g e n e s f in a le s s e g e n e r a r o n c o n P y M o l
L a F ig . 8 r e p r e s e n ta la e x p r e s ió n s u p e r f ic ia l y e l a n á l is is f u n c io n a l d e e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s q u im é r ic a s d e H A . (A ) S e e v a lu ó la e x p r e s ió n s u p e r f ic ia l d e e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s q u im é r ic a s d e H A e n c é lu la s t r a n s fe c ta d a s t r a n ­ s i to r ia m e n te . A la s 24 h d e la t r a n s fe c c ió n , la s c é lu la s 293 T s e t r ip s in iz a r o n y la e x p r e s ió n d e la s u p e r f ic ie c e lu la r d e la s p r o te ín a s H A q u im é r ic a s s e a n a l iz ó m e d ia n te c i t o m e t r ía d e f lu jo . E n lo s p a n e le s s u p e r io r e s , la s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s d e fo r m a s im u la d a ( r e g ió n s o m b r e a d a d e la iz q u ie r d a ) s e c o m p a r a n c o n c é lu la s t r a n s fe c ta d a s c o n H A d e P R 8 ( d e r e c h a ) o c é lu la s t r a n s fe c ta d a s c o n P R 8 -c H 1 ( d e r e c h a ) o P R 8 - c H 5 ( d e r e c h a ) . E n lo s p a n e le s in fe r io r e s , la s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s d e f o r m a s im u la d a ( r e g ió n s o m b r e a d a a la iz q u ie r d a ) s e c o m p a r a n c o n la s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s c o n la s e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s P e r th y P e r th - c H 7 ( d e r e c h a ) . (B ) S e u s a r o n p s e u d o p a r t í c u la s q u e c o d i f ic a b a n lu c i fe r a s a q u e e x p r e s a n H A s q u im é r ic a s p a r a in f e c t a r c é lu la s M D C K . L a s u n id a d e s r e la t iv a s d e lu z ( U R L ) g e n e r a d a s e n e l e n s a y o c o n lu c i fe r a s a in d ic a n q u e la s p s e u d o p a r t í c u la s q u e e x p r e s a n H A s q u im é r ic a s p o d ía n e n t r a r e n la s c é lu la s .
L a F ig . 9 d e s c r ib e la g e n e r a c ió n d e v i r u s r e c o m b in a n te s q u e s o n p o r t a d o r e s d e h e m a g lu t in in a s q u im é r ic a s . (A ) A n á l is is d e t r a n s fe r e n c ia W e s te r n d e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s . S e p r e p a r a r o n e x t r a c to s d e c é lu la s M D C K in f e c ­ ta d a s d e fo r m a s im u la d a o in f e c ta d a s c o n lo s v i r u s in d ic a d o s (16 h p i) c o n u n a M O I d e 2 y s e s o m e t ie r o n a e n s a y o c o n a n t ic u e r p o s : a n t i - A /P R 8 /H A ( H 1 ) ( P Y 102 ) , a n t i - A / C a l /09 /H A ( H 1 ) ( 29 C 1 ), a n t i- A /V N /H A ( H 5 ) ( M 08 ) , a n t i- H 3 /H A ( 12 D 1 ) , a n t i- H 7 ( N R - 3125 ) , a n t i- A /N P ( H T 103 ) y a n t i- G A P D H c o m o c o n t r o l d e c a r g a in te r n a . ( b ) A n á l is is d e in -m u n o f lu o r e s c e n c ia d e la s c é lu la s M D C K in f e c ta d a s c o n v i r u s r e c o m b in a n te s u s a n d o a n t ic u e r p o s : a n t i- A /N P ( H T 103 ) , a n t i - A / H A H1 ( 6 F 12 ) , a n t i - A / P R 8 / H A ( P Y 102 ) , a n t i - A / C a l /09 /H A ( 29 C 1 ) , a n t i - A / V N /H A ( M 08 ) , a n t i-H 3 /H A ( 12 D 1 ) y a n t i- v i r u s A /H 7 ( N R - 3152 ) .
L a F ig . 10 d e s c r ib e la c in é t ic a d e c r e c im ie n t o y lo s fe n o t ip o s d e p la c a s d e v i r u s r e c o m b in a n te s . (A ) S e in fe c ta r o n h u e v o s d e p o l lo e m b r io n a d o s d e 10 d ía s d e e d a d c o n v i r u s d e t ip o s i lv e s t r e o r e c o m b in a n te , c o n 100 u fp p o r h u e v o y s e c o n t r o ló e l c r e c im ie n t o v i r a l d u r a n te 72 h o r a s d e s p u é s d e la in fe c c ió n . (B ) E l f e n o t ip o d e p la c a d e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s s e e v a lu ó m e d ia n te e n s a y o e n p la c a . L a s c é lu la s M D C K s e in f e c ta r o n c o n u n v i r u s d e t ip o s i lv e s t r e o r e c o m b in a n te y , 48 h o r a s d e s p u é s d e la in fe c c ió n , s e in m u n o t iñ e r o n p a r a v is u a l iz a r e l f e n o t ip o d e la p la c a u s a n d o e l a n t ic u e r p o c o n t r a A /N P ( H T 103 ) .
L a F ig . 11 r e p r e s e n ta u n a n á l is is d e la in m u n o f lu o r e s c e n c ia d e c é lu la s t r a n s fe c ta d a s c o n h e m a g lu t in in a H 6 q u i ­ m é r ic a . S e t r a n s fe c ta r o n c é lu la s 293 T c o n 1 g g d e p lá s m id o p C A G G S q u e e x p r e s a b a h e m a g lu t in in a H 6 q u im é ­ r ic a . S e a ñ a d ie r o n s u e r o s d e a n im a le s q u e r e c ib ie r o n A D N (F ig . 11 A ) , in fe c c ió n c o n C a l /09 (F ig . 11 B ) , A D N e in fe c c ió n c o n C a l /09 (F ig . 11 C ) o v a c u n a f r a c c io n a d a d e C a l /09 (F ig . 11 D ) , a la s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s y s e v i ­ s u a l iz a r o n m e d ia n te m ic r o s c o p ía d e f lu o r e s c e n c ia d e s p u é s d e la in c u b a c ió n c o n u n a Ig G a n t i- r a tó n c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r 594. C o m o c o n t r o le s , s e a ñ a d ió a la s c é lu la s t r a n s fe c ta d a s e l a n t ic u e r p o C 179 d e l t a l lo H1 c o n r e a c c ió n c r u z a d a (F ig . 11 E ) o e l a n t ic u e r p o P Y 102 (F ig . 11 F ) d ir ig id o c o n t r a la c a b e z a g lo b u la r d e P R 8 y s e v is u a l iz a r o n m e d ia n te m ic r o s c o p ía d e f lu o r e s c e n c ia s e g u id a d e in c u b a c ió n c o n Ig G a n t i- r a tó n c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r 594.
L a F ig . 12 d e m u e s t r a q u e la s e n s ib i l iz a c ió n c o n A D N y e l r e fu e r z o c o n v i r u s q u im é r ic o c o n f ie r e n p r o te c c ió n a lo s a n im a le s e x p u e s to s a u n a p r o v o c a c ió n le ta l c o n e l v i r u s d e la g r ip e . L o s a n im a le s s e t r a ta r o n c o n A D N s o lo , v i r u s H 9 q u im é r ic o s o lo , s e n s ib i l iz a c ió n c o n A D N y r e fu e r z o c o n v i r u s H 9 q u im é r ic o o c o n v i r u s P R 8 in a c t iv a d o . L u e g o , lo s r a to n e s fu e r o n e x p u e s to s a 5 x 104 u fp d e v i r u s P R 8 , in s t i la d o p o r v í a in t r a n a s a l, y s e c o n t r o ló e l p e s o d e lo s a n im a le s d u r a n te 14 d ía s .
L a F ig . 13 d e m u e s t r a la r e a c t iv id a d d e lo s a n t ic u e r p o s e s p e c í f ic o s d e l t a l lo f r e n te a la p r o te ín a c H 6 s e g ú n lo d e t e r m in a d o m e d ia n te E L IS A .
L a F ig . 14 m u e s t r a u n a r e p r e s e n ta c ió n e s q u e m á t ic a d e p r o te ín a s q u im é r ic a s H A ( c H A ) (A ) y e x p r e s ió n d e c H A e n c é lu la s M D C K (B ) . P r o te ín a s q u im é r ic a s H A ( c H A ) y v i r u s q u im é r ic o r e c o m b in a n te . (A ) R e p r e s e n ta c ió n e s ­ q u e m á t ic a d e c H A s . E l d o m in io d e la c a b e z a g lo b u la r s e d e f in e c o m o la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s in te r c a la d a e n t r e lo s r e s id u o s C 52 y C 277 ( n u m e r a c ió n H 3 ) . U t i l iz a n d o e s e e n la c e d is u l fu r o c o m o d e m a r c a c ió n e n t r e la c a b e z a y e l ta l lo , s e in t r o d u je r o n c a b e z a s d e H A s e x t r a ñ a s s o b r e ta l lo s h e te r ó lo g o s . E l d o m in io d e l t a l lo s e d e f in e c o m o la s p o r c io n e s r e s ta n te s d e la s s u b u n id a d e s H A 1 y H A 2. C T , c o la c i t o p la s m á t ic a ; S P , p é p t id o s e ñ a l ; T M , dominio transmembranal. Las estructuras de longitud completas de HAs se descargaron desde la base de datos Protein Database (PDB): HA PR8 (H1) (PDB ID 1RU7) y HA A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 [representada por A/swine/Hong Kong/9/98 (H9; PDB ID 1JSD)]. Las imágenes finales se generaron con PyMol (Delano Scientific). Debido a que no se ha publicado la estructura de una HA H6, la imagen del plegamiento de la cabeza de HA PR8 se usa para la estructura artificial cH6/1. (B) Inmunofluorescencia para confirmar la expresión de cHA. Las células MDCK se infectaron con el virus WT PR8 o cH9/1 N3 o se infectaron de forma simulada. Se usaron anticuerpos específicos para la cabeza y el tallo del virus PR8, así como un anticuerpo con reactividad hacia H9 para confirmar la expresión de cHA. (Barra de aumento: 40x).
La Fig. 15 muestra que los pacientes adultos infectados con el virus pandémico H1N1 tienen títulos altos de anticuerpos neutralizantes que son reactivos con el tallo de HA. Reactividad de sueros de adultos infectados con pH1N1 (n = 9), niños no infectados con pH1N1 (n = 5) y adultos no infectados con el virus pH1N1 (n = 11) con la proteína cH6/1 (A), la proteína cH9/1; (B), la LAH de la proteína HA2 (se usó anticuerpo anti-LAH como control positivo; (C), proteína H5 de HA (se usó suero policlonal de ratón producido contra H5 de HA como control positivo y un anticuerpo pan-H3, 12D1, se usó como control negativo; (D) (13) o proteína H3 de HA (se usó 12D1 como control positivo y suero policlonal de ratón producido contra H5 de HA se usó como control negativo; (E). Todos fueron evaluados mediante ELISA; los puntos de datos representan títulos promedio con SE o reactividad de muestras agrupadas.
La Fig. 16 muestra que los pacientes adultos infectados con el virus pandémico H1N1 tienen títulos altos de anticuerpos neutralizantes que son específicos del tallo de HA (A y B). Sueros procedentes de adultos infectados con pH1N1 (n = 14) y adultos no infectados con pH1N1 (n= 5) se combinaron por separado y se purificó la IgG total de ambos grupos. La capacidad de neutralización de los anticuerpos del tallo se evaluó mediante un ensayo de reducción de placa utilizando el virus cH9/1 N3. Los puntos de datos representan la media y el SE de dos experimentos. Las placas se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-H9 G1-26. (B) muestra la reducción de placa de las cuatro diluciones de sueros que se muestran en la parte superior. (C) Un ensayo de neutralización de partículas de pseudotipos mide la actividad de los anticuerpos neutralizantes de las preparaciones de IgG purifi­ cadas de humanos (sueros de adultos infectados con pH1N1 y adultos no infectados con pH1N1). Las concen­ traciones de IgG total eran 50, 10 y 2 pg/mL. Como control positivo se utilizó el anticuerpo monoclonal específico del tallo 6F12.
La Fig. 17 muestra la expresión y la función de la proteína cH6/1 y cH9/1. A) Gel de Coomasie con 2 pg de proteína cH6/1 y cH9/1. M, proteínas marcadoras. (B) Análisis de transferencia Western de proteínas cHA expre­ sadas en baculovirus. Carril 1, proteína cH6/1; carril 2, proteína cH9/1; carril 3, HA de WT PR8; carril 4, hA de WT H3. Se sometieron a ensayo transferencias con anticuerpos que se sabía que reaccionaban con el tallo del virus PR8 (anti-HA2 policlonal de conejo) o los virus H3 (mAb 12D1 de ratón) y la cabeza globular de H6 (anti-H6 policlonal de cabra) o los virus H9 (mAb G1-26 de ratón) para confirmar la identidad de las cHAs expresadas en baculovirus. El mAb 12D1 reacciona tanto con HA0 como con HA2 (la preparación de proteína H3 se escinde, lo que da como resultado dos bandas distintas). (C) Ensayo en placa del virus reordenado cH9/1 N3. El fenotipo en placa del virus cH9/1 N3 reordenado es similar a las placas producidas por el virus WT PR8. Las placas se inmunotiñeron con PY102 y anticuerpo anti-H9 G1-26.
La Fig. 18 muestra que los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el tallo de HA del virus de la gripe se unen a las cHAs y las neutralizan. (A) Se usó el anticuerpo del tallo C179 para someter a ensayo la reactividad frente a la proteína expresada por baculovirus cH6/1 mediante ELISA. C179 reaccionaba con cH9/1 de forma depen­ diente de la dosis. (B) Se usó el anticuerpo del tallo C179 para someter a ensayo la reactividad frente a la proteína expresada por baculovirus cH9/1 mediante ELISA. C179 reaccionaba con cH9/1 de forma dependiente de la dosis (C y D). El anticuerpo 6F12 neutraliza la replicación del virus cH9/1 N3. Se usó 6F12 para evaluar la capa­ cidad de los anticuerpos monoclonales específicos del tallo para neutralizar el virus cH9/1 N3 mediante un ensayo de reducción de placa. D muestra la reducción de placa del virus cH9/1 N3 utilizando cinco diluciones de mAb 6F12 (100, 20, 4, 0,8 y 0,16 pg/mL). Las placas se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-H9 G1-26.
La Fig. 19 representa esquemas de hemaglutininas quiméricas. La Fig. 19A muestra un diagrama de virus de tipo silvestre y cH1/1. La HA quimérica se construyó intercambiando el dominio de la cabeza globular ubicado entre Cys52 y Cys277 de HA PR8 (H1) con el de HA A/California/4/09 (H1). La HA quimérica resultante tiene la región del tallo de HA A/PR/8/34 (H1) con un dominio de la cabeza globular de HA A/California/4/09 (H1) y se denomina cH1/1. La Fig. 19B muestra esquemas teóricos de las estructuras plegadas de las diferentes HAs quiméricas y de tipo silvestre. De izquierda a derecha: HA de PR8 de tipo silvestre, HA de cH1/1 quimérica, HA de cH5/1 quimérica, HA de Perth de tipo silvestre, HA de cH7/3 quimérica y HA de cH5/3 quimérica.
La Fig. 20 muestra una tabla que compara la identidad de los aminoácidos entre las HAs H1, H3, H5 y H7 utilizadas en este estudio. El porcentaje de identidad de aminoácidos se calculó usando ClustalW (excluyendo el péptido señal). El porcentaje de identidad de aminoácidos se compara para una HA de longitud completa, así como para los dominios de la cabeza globular y el tallo. Las barras grises indican un 100% de identidad.
La Fig. 21 muestra la expresión en la superficie de estructuras artificiales quiméricas de HAs. La expresión en la superficie de estructuras artificiales de HAs quiméricas se evaluó en células transfectadas o infectadas de forma transitoria. A las 48 h de la transfección, las células 293T se tripsinizaron y se analizó la expresión en la superficie celular de las proteínas HAs quiméricas mediante citometría de flujo. En los paneles superiores, las células transfectadas de forma simulada (gris) se comparan con células transfectadas con HA de PR8 (línea negra) o células transfectadas con cH1/1 (línea negra) o cH5/1 (línea negra). En los paneles centrales, las células transfectadas de forma simulada (gris) se comparan con las células transfectadas con las estructuras artificiales Perth/09, cH7/3 (línea negra) y cH5/3 (línea negra). En los paneles inferiores, las células MDCK se infectaron con virus recombi­ nantes que expresaban Perth/09, cH7/3 y cH5/3. A las 12 h de la infección se analizó la expresión en la superficie celular de las diferentes HAs mediante citometría de flujo.
La Fig. 22 demuestra la capacidad de las HAs quiméricas para entrar en las células MDCK. Se usaron pseudopartículas que codificaban luciferasa que expresaban HAs quiméricas para transducir las células MDCK. Las unidades relativas de luz (URL) generadas en el ensayo de luciferasa indican que las pseudopartículas que expresaban HAs quiméricas pueden entrar en las células.
La Fig. 23 muestra un análisis con transferencia Western de células infectadas con los virus recombinantes que expresan cHA. Se prepararon extractos de células MDCK con infección simulada o con los virus indicados con una MOI de 2 y se sometieron a ensayo con anticuerpos con 16 hpi: anti-A/PR8/HA (H1) (PY102), anti-A/Cal/09/HA (H1) (29E3), anti-A/VN/HA (H5) (mAb #8), anti-H3/HA (12D1), anti-H7 (NR-3152), anti-A/NP (HT103) y anti-GAPDH como control de carga.
La Fig. 24 representa un análisis con inmunofluorescencia de células MDCK infectadas con virus recombinantes usando los anticuerpos: anti-A/NP (HT103), anti-A/H1 HA (6F12), anti-A/PR8/HA (PY102), anti-A/Cal/09/HA (29E3), anti-A/VN/HA (mAb #8), anti-H3/HA (12D1) y anti-virus A/H7 (NR-3152).
La Fig. 25 representa las cinéticas de crecimiento y los fenotipos de placa de virus recombinantes y de tipo silvestre. (A) Se infectaron huevos de pollo embrionados de 10 días de edad con 100 ufp por huevo de virus de tipo silvestre o recombinante y se controló el crecimiento vírico durante 72 horas después de la infección. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación estándar de las réplicas experimentales. (B) Los feno­ tipos de placa de los virus recombinantes se evaluaron mediante ensayo en placa. Las células MDCK se infec­ taron con un virus de tipo silvestre o recombinante. Las células se fijaron 48 horas después de la infección y se inmunotiñeron para visualizar los fenotipos de placa usando el anticuerpo contra A/NP (HT103).
La Fig. 26 representa que el anticuerpo monoclonal específico del tallo neutraliza virus que expresan cHA y partículas pseudotípicas. La capacidad de un mAb (KB2) para neutralizar virus que expresan cHA o partículas pseudotípicas se evaluó mediante un ensayo de reducción de placa o un ensayo de inhibición de partículas pseudotípicas. Las células MDCK se infectaron o se transdujeron con virus que expresaban cHA o partículas pseudotípicas en presencia de la cantidad indicada (ug/mL) del mAb o sin anticuerpo. Se usó la formación de placas o la actividad de luciferasa como lectura para determinar el grado de inhibición con el mAb (A). El mAb neutraliza la replicación del virus cH1/1 (cuadrados negros) y cH5/1 (triángulos negros) de manera dependiente de la dosis, con una inhibición del 100% con concentraciones superiores a 100 ug/mL. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación estándar de las réplicas experimentales. (B) El mAb también inhibe la entrada de partículas pseudotípicas cH1/1 (cuadrados negros) de manera dependiente de la dosis, con una in­ hibición completa por encima de 4 ug/mL. Los puntos de datos representan el promedio y la desviación estándar de las réplicas experimentales. Los ensayos de inhibición de pseudotipo se procesaron de forma independiente.
La Fig. 27 demuestra que la vacunación secuencial con estructuras artificiales de cHA provoca anticuerpos es­ pecíficos del tallo de HA y proporciona protección contra una exposición letal. Los ratones fueron sensibilizados con 20 pg de proteína cH9/1, administrados con adyuvante por vía intranasal e intraperitoneal. Tres semanas más tarde, los ratones tuvieron un refuerzo con 20 pg de proteína cH6/1, administrados con adyuvante por vía intranasal e intraperitoneal. Como controles, los ratones fueron sensibilizados y reforzados de manera similar usando BSA o se les administró el virus FM1 inactivado por vía intramuscular. Se tomó una muestra de sangre de los animales y tres semanas después de la última vacunación se expusieron a 5 DL50 del virus A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1). (A) Las placas de ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reac­ tividad del tallo provocada mediante la vacunación (BSA BSA es la línea inferior del gráfico). (B) Los ratones se pesaron diariamente durante 14 días para evaluar la protección frente al estímulo. (C) Curva de Kaplan Meier que representa la tasa de supervivencia después del estímulo. Los ratones vacunados con cH9/1 cH6/1 tenían una tasa de supervivencia estadísticamente mayor que en comparación con los controles BSA (p = 0,0003)
La Fig. 28 demuestra que la vacunación con cH6/1 provoca inmunidad específica del tallo que media en la pro­ tección contra la exposición al virus cH9/1 N1. A los animales se les inoculó el virus YAM-HA para simular una infección previa o una vacunación contra el virus de la gripe. Tres semanas más tarde, los animales fueron vacunados con cH6/1 o BSA con adyuvante, por vía intranasal e intraperitoneal. A los animales de control se les inoculó B/Yamagata/16/1988 de tipo silvestre y fueron vacunados de manera similar con BSA o se les administró el virus cH9/1 N1 inactivado por vía intramuscular. Se tomó una muestra de sangre de los animales y se estimu­ laron con 250 DL50 de virus cH9/1 N1 tres semanas después de la vacunación. (A) Los animales se pesaron durante 8 días para evaluar la protección contra el estímulo. Los días 3-5, los animales YAM-HA cH6/1 mos­ traron una pérdida de peso estadísticamente menor que en comparación con la cohorte YAM-HA BSA (p < 0,05). (B) Curva de Kaplan Meier que representa la supervivencia. Se observaron tasas de supervivencia esta­ dísticamente diferentes en el grupo YAM-HA cH6/1 en comparación con la cohorte YAM-HA BSA (p = 0,038), así como en los animales sin tratamiento previo y WT YAM BSA (p < 0,0001). La tasa de supervivencia de la cohorte YAM-HA BSA no era estadísticamente diferente de la de la cohorte WT-YAM BsA (p = 0,058). (C) Las placas de ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reactividad del tallo provocada por la vacunación. (D) Se representan los resultados de un ensayo de reducción de placa utilizando el virus cH5/1. (E) Los animales se vacunaron, se les extrajo sangre y se recogió la IgG total para el ensayo de inhibición de la entrada de pseudopartículas basado en H5. El porcentaje de inhibición se evaluó como una disminución de la expresión de luciferasa en comparación con los controles.
La Fig. 29 demuestra que la vacunación con cH6/1 protege a los ratones una exposición letal al virus de la gripe H5. A los animales se les inoculó el virus YAM-HA para simular una infección previa o una vacunación contra el virus de la gripe. Tres semanas más tarde, los animales fueron vacunados con cH6/1 o BSA con adyuvante, por vía intranasal e intraperitoneal. A los animales de control se les inoculó B/Yamagata/16/1988 de tipo silvestre y se vacunaron de manera similar con BSA o se les administró el virus cH5/1 N1 inactivado por vía intramuscular. Se tomó una muestra de sangre de los animales y se estimularon con 10 DL50 del virus reordenado 2:6 H5 en el contexto de PR8 (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). (A) Curva de Kaplan Meier que representa la supervivencia. Las diferencias en las tasas de supervivencia se acercaron a la significación esta­ dística al comparar el grupo YAM-HA+cH6/1 con la cohorte YAM-HA+BSA (p = 0,06). (B) La duración de la supervivencia promedio era mayor en los animales inoculados con YAM-HA y vacunados con cH6/1 que en los animales vacunados con BSA (p = 0,037), así como en los controles sin tratamiento previo y WT YAM/BSA (p < 0,001). (C) Las placas de ELISA se recubrieron con virus cH5/1 N1 para evaluar el grado de reactividad del tallo provocada por la vacunación. Se representaron gráficamente diluciones 1:50 de suero frente al % de pérdida máxima de peso. Se determinó que un valor era un valor atípico y se omitió del análisis. Para la regresión lineal, R2 = 0,56 y p =,02.
La Fig. 30 demuestra que la vacunación con cHA provoca inmunidad específica del tallo que media en la protec­ ción contra la exposición al virus H1N1. (A-F) Los animales se sensibilizaron con ADN que codificaba cH9/1 y luego se vacunaron con cH6/1 y se reforzaron con proteína soluble cH5/1 (n=10) o BSA (n=5), mientras que los ratones de control positivo recibieron el virus inactivado por vía intramuscular (n=5). (A) Los animales fueron vacunados y expuestos al virus FM1; los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como un cambio en el porcentaje del peso inicial. (B) Gráfico que representa la supervivencia de los ratones expuestos en (A). (C) Los animales fueron vacunados y expuestos al virus pH1 N1; los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como un cambio en el porcentaje del peso inicial. (D) Gráfico que representa la supervivencia de ratones expuestos en (C). (E) Los animales fueron vacunados y expuestos al virus PR8; los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como un cambio en el porcentaje del peso inicial. (F) Gráfico que representa la supervivencia de los ratones expuestos en (E). (G) Reactividad frente a HA H1 del suero de animales vacunados como se ha descrito arriba en A-F y abajo en H-I y expuestos a 5 DL50 de A/FM/1/1947 (A, B), 10 DL50 de A/Netherland/602/2009 (C, D) o 5 DL50 de A/PR/8/1934 (E, F, H, I). (H) Los animales se vacunaron como se ha descrito anteriormente en A-F (cuadrado, n = 4) o no se habían tratado previamente (triángulo, n = 3), mientras que los ratones del control positivo recibieron el virus PR8 inactivado por vía intramuscular (marca X, n = 5). Los linfocitos T CD8 se agotaron antes de la exposición al virus PR8. Los ratones se pesaron diariamente y la pérdida de peso a lo largo del tiempo se muestra como un cambio en el porcentaje del peso inicial. (I) Gráfico que representa la supervivencia de ratones expuestos en (H). (J) Los animales se vacunaron como se ha descrito para A-F. La IgG total se purificó para uso en el ensayo de inhibición de la entrada de pseudopartículas basado en H2. El porcen­ taje de inhibición se evaluó como una disminución de la expresión de luciferasa en comparación con los controles. El fragmento Fab CR6261 se utilizó como control positivo.
Fig.31. Esquema de HA de tipo silvestre y estructuras artificiales de expresión. (A) Hemaglutinina del virus de la gripe de longitud completa no escindida. El péptido señal es el componente más a la izquierda, el ectodominio de HA es el componente medio y el dominio transmembranal y el endodominio son el componente más a la derecha. (B) Estructura artificial de expresión con dominio de trimerización. El dominio transmembranal y el en­ dodominio se intercambiaron con un sitio de escisión de trombina (tercer componente desde la izquierda), un dominio de trimerización T4 (cuarto componente desde la izquierda) y un marcador de hexahistidina (marcador 6xhis, quinto componente desde la izquierda) en la posición V503 (numeración H3). (C) Estructura artificial de expresión sin dominio de trimerización. El dominio transmembranal y el endodominio se intercambiaron con un marcador de hexahistidina (marcador 6xhis, componente más a la derecha) en la posición del aminoácido 509 (HI, H2 y H5) o 508 (H3) respectivamente (numeración H3).
Fig. 32. La introducción de un dominio de trimerización influye en la estabilidad y la formación de oligómeros en HAs recombinantes. (A) Análisis de HAs recombinantes con y sin dominio de trimerización mediante SDS-PAGE reductora y desnaturalizante. Las HAs recombinantes que se expresan con el dominio de trimerización (+) mues­ tran una mayor estabilidad que las HAs expresadas sin (-). HA no escindida (HA0) y productos de escisión (HA1/producto de degradación; HA2) se indican con flechas. (B) Análisis SDS-PAGE reductora y desnaturali­ zante de HAs reticuladas. En la transferencia se indican diferentes especies de HAs. Los multímeros de alto peso molecular están indicados por H, los trímeros por T, los dímeros por D y los monómeros por M. (C) Panel izquierdo (casillas 1-4): análisis de transferencia Western de HAs del grupo 1 reducidas, desnaturalizadas y reticuladas procedentes de B, sometidas a ensayo con un anticuerpo anti-marcador de hexahistidina. Panel derecho (cuadro más a la derecha): control de reticulación (IgG) con BS3 analizado en una SDS-PAGE. Las diferentes especies (anticuerpo completo, cadena pesada, cadena ligera) se indican mediante flechas. Los pesos moleculares de las bandas del marcador se indican a la izquierda de cada panel.
Fig. 33. Unión de anticuerpos reactivos con el tallo a HAs recombinantes PR8 (H1) y Cal09 (H1). (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tallo C179, CR6261 y 6F12 y anticuerpo reactivo con la cabeza PY102 y antisuero de PR8 con HA de PR8 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimerización o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización. (B) Unión de anti­ cuerpos reactivos con el tallo C179, CR6261 y 6F12 y anticuerpo reactivo con la cabeza 7B2 y antisuero Cal09 con Cal09 de HA soluble recombinante sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimeriza­ ción o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización.
Fig. 34. Unión de anticuerpos reactivos con el tallo a HAs recombinantes JAP57 (H2) y VN04 (H5). (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tallo C179 y CR6261 y anticuerpo reactivo con la cabeza 8F8 y antisuero H2 con HA de JAP57 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimerización o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización. (B) Unión de anticuerpos reactivos con el tallo C179 y CR6261 y anticuerpo mAb#8 reactivo con la cabeza y antisuero de H5 con HA de VN04 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimerización o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización.
Fig. 35. Unión de anticuerpos reactivos con el tallo a HAs del grupo 2. (A) Unión de anticuerpos reactivos con el tallo 12D1 y CR8020 y anticuerpo reactivo con la cabeza XY102 y antisuero H3 con HA de HK68 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimerización o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización. (B) Unión de anticuerpos reactivos con el tallo 12D1 y CR8020 y antisuero de H3 con HA de Wisc05 recombinante soluble sin (sin dominio de trim. T4, líneas con triángulos) dominio de trimerización o con (con dominio de trim. T4, líneas con cuadrados) dominio de trimerización.
La Fig. 36 representa un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe ejemplar (SEQ ID NO: 21) que comprende el dominio del tallo de un virus de la gripe B (B/Florida/4/2006) y el dominio de la cabeza globular de un virus de la gripe A del subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004).
La Fig. 37 demuestra que una estrategia de vacunación basada en el tallo de HA brinda una amplia protección contra la exposición a virus H3N2 divergentes. (A) Representación esquemática de la estrategia de vacunación (se muestra la forma monomérica de cada antígeno). (B a E) Los animales se vacunaron con ADN plasmídico que codificaba HA de cH4/3 y posteriormente se reforzaron con cH5/3 soluble recombinante, seguida de proteí­ nas cH7/3 (triángulos grises, apuntando hacia abajo; n = 9 o 10 animales). Los animales de control positivo recibieron la vacuna inactivada que contenía la cepa de provocación correspondiente (círculos grises; n = 5 animales). Los animales que solo recibieron una sensibilización (triángulos grises, apuntando hacia arriba; n = 5 animales) recibieron la sensibilización con ADN seguida de dos refuerzos con proteínas irrelevantes. Se usaron animales sin tratamiento previo (cuadrados negros; n = 5 animales) como controles adicionales para la exposi­ ción. (B) Curvas de pérdida de peso tras la exposición al virus Phil82 (H3N2). (C) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier tras la exposición a Phil82. (D) Morbilidad observada tras la exposición al virus X-31 (H3N2). (E) Curvas de supervivencia después de la exposición a X-31 (H3N2). La supervivencia de los grupos vacunados (cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3) frente a los grupos de control (cH4/3DNA-BSA-BSA) es altamente significativa para ambos experimentos de exposición (P = 0,0008 y 0,0001, respectivamente). (F y G) Experimentos de titulación pulmonar para someter a ensayo adicionalmente la amplitud de la protección de la vacuna contra virus que no son letales en el modelo de ratón. Los animales vacunados (BcH7/3-cH5/3-cH4/3) y los animales de control (Bwt-BSA-BSA) se infectaron con 5 x 104 ufp de la variante H3N2 (F) o 1 x 105 ufp de H3N2 humano A/Wyoming/03/03 (G). El día 3 después de la infección, los pulmones de los animales de ambos grupos se extirparon y se homogeneizaron, y se midió la dosis infecciosa del cultivo tisular al 50% (TCID50).
La Fig. 38 muestra que la vacunación con estructuras artificiales de cHA puede reforzar los títulos preexistentes de anticuerpos reactivos con el tallo a niveles protectores. (A a G) Para imitar la inmunidad preexistente al dominio del tallo presente en la población humana, los animales se infectaron subletalmente con un virus de la gripe B recombinante que expresaba HA de cH7/3. Posteriormente, se reforzaron con cH5/3 soluble recombinante (o HA H3 de longitud completa para animales expuestos a cH5/3N1) y luego con proteína cH4/3 (triángulos gris oscuro, apuntando hacia abajo; n = 10 animales). Los animales de control positivo recibieron la vacuna inactivada que contenía la cepa de provocación correspondiente (círculos gris oscuro; n = 5 animales). Los animales únicamente sensibilizados (triángulos gris oscuro, apuntando hacia arriba; n = 5 animales) recibieron la sensibilización con virus de la gripe B recombinante y luego dos refuerzos con proteínas irrelevantes. Los grupos de control adicio­ nales se infectaron con el virus de la gripe B de tipo silvestre y luego recibieron dos refuerzos con proteínas irrelevantes (triángulos gris claro, apuntando hacia abajo; n = 5) o no tenían tratamiento previo (cuadrados ne­ gros; n = 5). (B a D) Curvas de pérdida de peso después de la exposición al virus. (B) Se usó un virus cH5/3N1 patógeno para ratones que expresa el dominio del tallo de una HA de una cepa aislada H3N2 humana reciente vector (triángulos gris claro, apuntando hacia abajo, Bwt-BSA-BSA, n = 5 animales), animales sin tratamiento previo (cuadrados negros, n = 5 animales) y animales de control positivo (recibieron la vacuna del virus Phil82 inactivado, n = 5 animales). Se muestra la curva de supervivencia de Kaplan-Meier (P < 0,026 para los grupos BcH7/3-cH5/3-cH4/3 frente a Bwt-BSA-BSA).
La Fig. 42 muestra la filogenia de miembros seleccionados del grupo 2 de hemaglutininas del virus de la gripe que representan la amplitud de la respuesta provocada por la vacuna. Las secuencias de proteínas se descar­ garon de GenBank y se realizaron alineaciones múltiples utilizando el algoritmo ClustalW en la versión Mega 5.1. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando el programa informático FigTree y el método de unión de vecinos. La barra de escala representa un cambio de aminoácidos del 5%. La protección cruzada/reactividad cruzada sometida a ensayo positivamente de los ratones vacunados con cHA con las cepas respectivas, se indica entre paréntesis después de los nombres de las cepas (inmunofluorescencia [IF], provocación, ELISA y título pulmonar). No se sometieron a ensayo los nombres de cepas sin indicación.
La Fig. 43 revela que la vacunación con cHA del tallo H3 protege a los ratones de la provocación con el virus H7N9. (A) Representación esquemática del régimen de vacunación. Las estructuras se basan en la estructura de la base de datos de proteínas # 1RU7. Los ratones en (B-G) recibieron una sensibilización con ADN que codificaba la proteína cH4/3 (cabeza H4 en combinación con un tallo H3) y luego se reforzaron con cH5/3 (cabeza H5 sobre un tallo H3) y proteína H3 de longitud completa. Los animales fueron expuestos cuatro semanas des­ pués de la última inmunización con el virus H7N9. Las curvas de pérdida de peso se muestran en (B-D), las curvas de supervivencia se muestran en (E-G). La línea discontinua en (C y D) indica la mayor pérdida de peso promedio (día 7) del grupo 'PIC i.n.+i.m.' que se muestra en (B). Los ratones que se muestran en (B) y E (PIC i.n.+i.m.) se reforzaron secuencialmente con proteína cH4/3 y cH5/3 por vía intranasal e intramuscular en pre­ sencia de poli I:C (PIC) como adyuvante. Los animales en (C) y (F) recibieron las mismas proteínas que el re­ fuerzo pero recibieron las inmunizaciones solo por vía intramuscular (PIC i.m.). Los ratones en (D) y (G) fueron inmunizados por vía intramuscular solo con un adyuvante de aceite en agua (OIW i.m.). Los animales de los grupos de control recibieron BSA con el adyuvante respectivo y a través de las rutas respectivas. Los animales de control positivo (el mismo grupo se comparó con las tres condiciones experimentales) fueron vacunados por vía intramuscular con un virus de provocación adecuado inactivado.
La Fig. 44 describe una preparación y las características del adyuvante de aceite en agua (OIW). (A) Esquema de la preparación de adyuvante OIW. La emulsión OIW se prepara a una escala de 20-40 mL. Span-85 se di­ suelve en escualeno, el polisorbato 80 se disuelve en agua desionizada y luego se mezcla con tampón citratoácido cítrico. Las fracciones de fase oleosa y acuosa se combinan y se mezclan en una emulsión basta mediante agitación vorticial que luego se pasa a través de un Microfluidizer LV1 (Microfluidics, Westwood, MA) a 827,37 bar (12000 psi). El eluyente se recoge y se vuelven a realizar pases con un total de 5 pases a través del microfluidizador para producir una emulsión estable y homogénea. El pase final se filtra a través de un filtro de 0,22 pm y se introduce en viales de vidrio estériles. (B) El tamaño de partícula del adyuvante OIW preparado mediante microfluidización se determinó mediante dispersión de luz dinámica en un Malvern Nano 3ZS. Los tamaños que se muestran son la media Z-promedio de 2 lotes preparados de forma independiente. Esas preparaciones se consideran monomodales ya que la polidispersidad después del pase final a través del microfluidizador y la fil­ tración estéril oscilaba entre 8 y 11%.
La Fig. 45 ilustra que la vacunación con cHAs basadas en el tallo H3 induce títulos elevados de anticuerpos contra la hemaglutinina H7 en ratones. (A) Títulos de punto final de IgG de ratones vacunados con cHA contra la HA H7 (A/Shanghai/1/13). El valor p de una cola se calculó utilizando una prueba t no apareada. (B) Distribución de isotipos de inmunoglobulina dirigida a la HA H7 en sueros de ratones vacunados por diferentes vías y con diferentes adyuvantes. El análisis se realizó con una dilución 1:200.
5. Descripción detallada
En el presente documento se describen polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe que indu­ cen una respuesta inmunitaria de protección cruzada contra el dominio del tallo de HA conservado de los virus de la gripe. Los polipéptidos HA quiméricos del virus de la gripe comprenden un dominio del tallo de HA estable y un dominio de la cabeza globular de HA que es heterólogo frente al dominio del tallo (es decir, los dominios de cabeza y del tallo se obtienen a partir de diferentes cepas y/o subtipos del virus de la gripe).
En este documento se describen composiciones que comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento (p. ej., composiciones que comprenden polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe solubles descritos en este documento, virus que comprenden genomas diseñados genéticamente para codificar los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento, vectores de expresión que comprenden los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento, vectores de expresión que comprenden genomas diseñados genéticamente para codificar los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento, ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento, etc.).
También se describen en este documento formulaciones de vacunas que comprenden uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna monovalente que comprende los polipéptidos de hemaglutinina qui­ méricos del virus de la gripe de la invención. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna bivalente que comprende dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención (es decir, dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe distintos). En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna trivalente que comprende tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención (es decir, tres polipéptidos de hemaglutinina qui­ méricos del virus de la gripe distintos). Las formulaciones de vacunas proporcionadas en el presente documento com­ prenden, por ejemplo, la vacuna de subunidades de la invención que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento (por ejemplo, composiciones que comprenden polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, por ejemplo, polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe solubles); virus de la gripe vivos de la invención (p. ej., virus de la gripe vivos atenuados) que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; virus de la gripe vivos de la invención (p. ej., virus de la gripe vivos atenuados) que com­ prenden un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento; virus de la gripe muertos de la invención que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; virus de la gripe muertos de la invención que comprenden un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este docu­ mento; virus/partículas similares a virus ("VLPs") de la invención que contienen el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; vacuna de virus fraccionado de la invención en la que dicho virus expresa el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento; vectores de expresión vírica de la invención (p. ej., vectores de expresión de virus que no son de la gripe) que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento; y vectores de expresión bacterianos de la invención que expresan el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento.
Las formulaciones de vacunas descritas en el presente documento pueden generar anticuerpos altamente potentes y ampliamente neutralizantes contra el dominio del tallo de HA de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe. Esas vacunas "universales" se pueden utilizar para inducir y/o potenciar respuestas inmunitarias con pro­ tección cruzada entre los subtipos del virus de la gripe.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas de la invención para usar de acuerdo con la invención en métodos para inmunizar a un sujeto contra una enfermedad o infección con el virus de la gripe que comprende administrar al sujeto la composición de la invención que comprende el polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento o una formulación de vacuna descrita en este documento.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento o una formulación de vacuna descrita en el presente documento. Los kits propor­ cionados en el presente documento pueden comprender además uno o más componentes adicionales, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe proporcionados en el kit.
5.1 Polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe
En el presente documento se describen polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe que comprenden o consisten en un polipéptido del dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe y un polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe, en donde dicho polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe es heterólogo frente a dicho polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe (por ejemplo, el polipéptido del dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe y el polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe se obtienen a partir de diferentes subtipos de hemaglutinina del virus de la gripe). Los dominios del tallo y de la cabeza globular de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe pueden basarse en los dominios del tallo y la cabeza globular de la hemaglutinina del virus de la gripe A (por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, 15, H16, H17 y H18) y/o los dominios de la cabeza globular y el tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe B.
Una hemaglutinina del virus de la gripe de longitud completa comprende normalmente un dominio HA1 y un dominio HA2. El dominio del tallo está formado por dos segmentos del dominio HA1 y la mayor parte o la totalidad del dominio HA2. Los dos segmentos del dominio HA1 están separados, en secuencia primaria, por el dominio de la cabeza glo­ bular (véanse, por ejemplo, los residuos de aminoácidos entre los residuos designados Ap y Aq en la Figura 1). En determinadas realizaciones, los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe conservan esa estruc­ tura. Es decir, los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden una estructura de tallo estable compuesta por un dominio HA1 y un dominio HA2, y un dominio de la cabeza globular que separa los dos segmentos del dominio HA1 (en secuencia primaria), en donde dicho dominio de la cabeza globular es heterólogo frente al dominio del tallo formado por los otros segmentos del dominio HA1 y el dominio HA2.
La invención proporciona además una composición inmunogénica que comprende el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, es decir, el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) y el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5) y, opcionalmente, otros polipéptidos quiméricos de HAs del virus de la gripe especificados a continuación. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H1 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H5 (algunas veces denominado en el presente documento "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de un virus de la gripe similar a A/California/4/2009). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/Califor­ nia/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/Califor­ nia/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/Califor­ nia/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio del tallo de la HA A/California/4/2009 (H1N1) (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/California/4/2009) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H5 (algunas veces denominado en el presente documento "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio globular dominio de la cabeza de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/In­ diana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 proporcionado en el presente documento no comprende el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otro ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 no comprende el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H7 (algunas veces denominado en el presente documento "poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victo­ ria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Victoria/361/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Ca­ nada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachu­ setts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra reali­ zación específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Indiana/10/2011 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3N2) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 no comprende el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otro ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 no comprende el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/2009 (H3).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglu­ tinina de un virus de la gripe del subtipo H5 (a veces denominado en el presente documento un "polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Flo­ rida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Indonesia/5/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Anhui/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Bris­ bane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/turkey/Turkey/1/2005 (H5). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglu­ tinina de un virus de la gripe del subtipo H7 (a veces denominado en el presente documento un "polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipép­ tido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wiscon­ sin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Netherlands/219/03 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/504/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/Canada/444/04 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Bris­ bane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/rhea/NC/39482/93 (H7). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B es el dominio de la cabeza globular de la HA A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe B y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglu­ tinina de una cepa de virus de la gripe B diferente (a veces denominado en el presente documento un "polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Malaysia/2506/2004 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 la HA (o un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006. En otra realización específica, el dominio del tallo de un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de he­ maglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Florida/4/2006 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 la HA (o un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Wisconsin/1/2010 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/Lee/1940. En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio del tallo de la HA B/Brisbane/60/2008 y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B es el dominio de la cabeza globular de la HA B/seal/Netherlands/1/99 (o un virus de la gripe similar a B/seal/Netherlands/1/99).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe adicional comprende (i) el dominio del tallo de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H3 y (ii) el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un virus de la gripe del subtipo H4 (algunas veces denominado en el presente documento "poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3"). En una realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/09 (o el dominio del tallo de un virus de la gripe similar a la HA A/Perth/16/09). En otra realización específica, el dominio del tallo de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio del tallo de la HA A/Perth/16/09 (o el dominio del tallo de una HA del virus de la gripe similar a A/Perth/16/09) y el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 es el dominio de la cabeza globular de A/duck/Czech/56 (o el dominio de la cabeza globular de una HA del virus de la gripe similar a A/duck/Czech/56).
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención es monomérico. En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención es multimérico. En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención es trimérico.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención com­ prende un péptido señal. Normalmente, el péptido señal se escinde durante o después de la expresión y traducción del polipéptido para producir un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe maduro. En determinadas realizaciones, también se proporciona en el presente documento el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe maduro de la invención que carece de un péptido señal. En realizaciones en las que el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención comprende un péptido señal, el péptido señal puede estar basado en cualquier péptido señal del virus de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en los péptidos señal del virus de la gripe A. En ciertas realizaciones, los péptidos señal se basan en el péptido señal de una hemaglutinina del virus de la gripe A, seleccionada a partir del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 y H18 (Véase, p. ej., Tong et al., 2013. PLoS Path. 9(10): e1003657. Doi:10.1371/journal.ppat.1003657 para ejemplos de una hemaglutinina H18 del virus de la gripe A). En determinadas realizaciones, el péptido señal podría ser cualquier péptido señal que sea con­ siderado útil por un experto en la técnica.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención com­ prende un dominio luminal. En realizaciones en las que el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención comprende un dominio luminal, el dominio luminal podría basarse en cualquier dominio luminal de virus de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios luminales se basan en los dominios luminales del virus de la gripe A. En ciertas realizaciones, los dominios luminales se basan en el dominio luminal de una hemaglutinina del virus de la gripe A, seleccionada a partir del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 y H18. En ciertas realizaciones, el dominio luminal puede ser cualquier dominio luminal que sea considerado útil por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios luminales son de la misma hemaglutinina que el dominio del tallo. En ciertas realizaciones, los dominios luminales son de la misma cepa o subtipo de virus de la gripe que la subunidad HA2 del dominio del tallo.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención com­ prende un dominio transmembranal. En realizaciones en las que el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe proporcionado en el presente documento comprende un dominio transmembranal, el dominio transmem­ branal podría basarse en cualquier dominio transmembranal de virus de la gripe conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios transmembranales se basan en los dominios transmembranales de virus de la gripe A. En ciertas realizaciones, los dominios transmembranales se basan en un dominio transmembranal de una hemaglutinina del virus de la gripe A, seleccionada a partir del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 y H18. En determinadas realizaciones, el dominio transmem­ branal podría ser cualquier dominio transmembranal que sea considerado útil por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios transmembranales son de la misma hemaglutinina que el dominio del tallo. En ciertas realizaciones, los dominios transmembranales son de la misma cepa o subtipo de virus de la gripe que la subunidad HA2 del dominio del tallo.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención comprende un dominio citoplasmático. En realizaciones en las que el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención comprende un dominio citoplasmático, el dominio citoplasmático podría basarse en cual­ quier dominio citoplasmático de virus de la gripe conocido por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios citoplasmáticos se basan en los dominios citoplasmáticos del virus de la gripe A. En ciertas realizaciones, los dominios citoplasmáticos se basan en un dominio citoplasmático de una hemaglutinina del virus de la gripe A, seleccionada a partir del grupo que consiste en H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17 y H18. En ciertas realizaciones, el dominio citoplasmático podría ser cualquier dominio citoplasmático que sea considerado útil por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, los dominios citoplasmáticos son de la misma hemaglutinina que el dominio del tallo. En ciertas realizaciones, los dominios citoplasmáticos son de la misma cepa o subtipo de virus de la gripe que la subunidad HA2 del dominio del tallo.
En determinadas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención com­ prende además uno o más dominios polipeptídicos. Los dominios polipeptídicos útiles incluyen dominios que facilitan la purificación, el plegamiento y la escisión de porciones de un polipéptido. Por ejemplo, un marcador HIS (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO: 17), un epítopo FLAG u otro marcador de purificación puede facilitar la purificación de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe proporcionado en este documento. En algunas realizacio­ nes, el marcador HIS tiene la secuencia, (His)n, en donde n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mayor. Un dominio foldon o de trimerización, procedente de la fibritina del bacteriófago T4 puede facilitar la trimerización de los polipéptidos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el dominio de trimerización comprende una repetición heptada de trimerización de GCN4pII de tipo silvestre o una repetición heptada de trimerización de GCN4pII modificada que permite la formación de espirales enrolladas triméricas o tetrámeras. Véase, por ejemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. El dominio foldon puede tener cualquier secuencia de foldon conocida por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Papanikolopoulou et al., 2004, J. Biol. Chem.
279(10):8991-8998). Los ejemplos incluyen GSGYIPeApRdGQaYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 18). Un dominio foldon puede ser útil para facilitar la trimerización de polipéptidos solubles proporcionados en el presente documento. Los sitios de escisión se pueden usar para facilitar la escisión de una porción de un polipéptido, por ejemplo, la escisión de un marcador de purificación o un dominio foldon o ambos. Los sitios de escisión útiles incluyen un sitio de escisión de trombina, por ejemplo uno con la secuencia LVPRGSP (SEQ ID NO: 19). En determinadas realizaciones, el sitio de escisión es un sitio de escisión reconocido por la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser) (SEQ ID NO: 20)).
En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención es un polipéptido soluble.
En ciertas realizaciones, los polipéptidos del dominio del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe de los polipéptidos de hemaglutinina de virus de la gripe quiméricos de la invención conservan los residuos de cisteína identificados en los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe como Ap y Aq en la Fig. 1, es decir, los residuos de cisteína identificados en los polipéptidos de hemaglutinina del virus de la gripe como Ap y Aq en la Fig. 1 se conservan en los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, en la secuencia primaria del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención: (i) el segmento N-terminal de un polipéptido del dominio del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe termina en el residuo de cisteína identificado como Ap en la Fig. 1, (ii) el segmento C-terminal de un polipéptido del dominio del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe comienza en el residuo de cisteína identificado como Aq en la Fig. 1; y (iii) el polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe (que es heterólogo frente al polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe) está entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe.
En ciertas realizaciones, el segmento del tallo N-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención, no termina exactamente en Ap (p. ej., Cys52 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), pero en un residuo próximo en la secuencia y estructuralmente a Ap . Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento del tallo N-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención, termina en Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-s, Ap-g, Ap-10. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo N-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención termina en el intervalo de Ap-1 a Ap-3, Ap-3 a Ap-5, Ap-5 a Ap-s, Ap-s a Ap-10. Por ejemplo, un segmento del tallo N-terminal de HA1 que termina en Ap-10 terminaría en la Leu 42 de una hemaglutinina H3. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo N-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención, termina en Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7, Ap+8, Ap+9, Ap+10. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo N-terminal de HA1 del polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe de la invención termina en el intervalo de Ap+1 a Ap+5, Ap+5 a Ap+10. El extremo de un segmento del tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el extremo del segmento del tallo C-terminal de HA1 y el polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe, de modo que el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar a la hemaglutinina del virus de la gripe de tipo silvestre. En esas realizaciones, el polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención (que es heterólogo frente al polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe.
En ciertas realizaciones, el segmento del tallo C-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención no comienza exactamente en Aq (p. ej., la Cys277 de una subunidad HA1 de una hemaglutinina H3), pero en un residuo próximo en la secuencia y estructuralmente a Aq . Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el segmento del tallo C-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención, comienza en aproximadamente Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo C-terminal de HA1 de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe de la invención, comienza en el intervalo de Aq-1 a Aq-5, Aq-5 a Aq-10. Por ejemplo, un segmento del tallo C-terminal de HA1 que termina en Aq-10 comenzaría en la isoleucina 267 de una hemaglutinina H3. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo C-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe descrito de la invención, comienza en Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9, Aq+10. En ciertas realizaciones, el segmento del tallo C-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención comienza en el intervalo de Aq+1 a Aq+3, Aq+3 a Aq+5, Aq+5 a Aq+8, Aq+8 a Aq+10. El extremo de un segmento del tallo N-terminal de HA1 debe seleccionarse junto con el inicio del segmento del tallo C-terminal de HA1 y el polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe, de modo que el polipéptido de la hemaglutinina de virus de la gripe quimérico resultante sea capaz de formar una estructura tridimensional similar a la hemaglutinina del virus de la gripe de tipo silvestre. En esas reali­ zaciones, el polipéptido del dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe (que es heterólogo frente al polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe) está ubicado, en secuencia primaria, entre los segmentos N-terminal y C-terminal del polipéptido del dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe.
En un ejemplo, un segmento del tallo N-terminal de HA1 de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, puede terminar en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos de hemagluti­ nina 45-48 (usando la numeración H3) y un segmento del tallo C-terminal de HA1 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe puede comenzar en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos de hemaglutinina 282-287 (usando la numeración H3); y el dominio de la cabeza heterólogo puede comenzar en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 46-49 y terminar en una cualquiera de las posiciones de aminoácidos 284-289 (usando la numeración H3).
Cuando el dominio del tallo de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el pre­ sente documento se obtiene a partir de un virus de la gripe B, el segmento del tallo N-terminal de HA1 puede terminar, por ejemplo, en los aminoácidos 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 de la hA (en secuencia de aminoácidos primaria), y el segmento del tallo C-terminal de HA1 puede comenzar, por ejemplo, en el aminoácido 280, 281,282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299 o 300 de la HA (en secuencia de aminoácidos primaria). El dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe se insertaría así entre el segmento del tallo N-terminal de HA1 y el segmento del tallo C-terminal de HA1 del dominio del tallo del virus de la gripe B. Por ejemplo, en la HA del virus de la gripe B/Hong Kong/8/73 (PDB:2RFT: GenBank:M10298.1), el segmento del tallo N-terminal de HA1 comenzaría con los aminoácidos DRICT (SEQ ID NO:22), siendo "D" la posición 1, y terminaría en la posición del aminoácido 42 (en secuencia primaria); y el segmento del tallo C-terminal de HA1 comenzaría en la posición del aminoácido 288 (en secuencia primaria) y conti­ nuaría hasta el final del extremo C-terminal de HA.
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede conjugarse con proteínas heterólogas, por ejemplo, un complejo principal de histocompatibilidad (MHC) con o sin proteínas de choque térmico (por ejemplo, Hsp10, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90 o Hsp100). Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede conjugarse con moléculas inmunomoduladoras, tales como proteínas que dirigirían el polipép­ tido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe hacia células inmunitarias tales como linfocitos B (por ejem­ plo, C3d) o linfocitos T. Además, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede conjugarse con proteínas que estimulan el sistema inmunitario innato, como interferón de tipo 1, interferón alfa, beta o gamma, factores estimulantes de colonias como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interleucina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF)-p, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (Cd40L) y CD40 inducible con fármacos (iCD40).
Los expertos en la técnica entenderán que los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe propor­ cionados en el presente documento se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica conocida y considerada adecuada por los expertos en la técnica, incluidas las técnicas descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, se aísla el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención.
5.2 Ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe
En el presente documento se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención (por ejemplo, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe proporcionados en la Sección 5.1). Debido a la degeneración del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención se incluye en este documento. En determinados ejemplos, los ácidos nucleicos correspondientes o capaces de hibridarse con ácidos nucleicos del virus de la gripe de origen natural que codifican un segmento del tallo N-terminal de HA1, un segmento del tallo C-terminal de HA1, un dominio HA2, un dominio luminal, un dominio transmembranal y/o un dominio citoplasmático, se utilizan para producir un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento.
También se describen en este documento ácidos nucleicos capaces de hibridarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento (por ejemplo, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en la Sección 5.1). En el presente docu­ mento se describen ácidos nucleicos capaces de hibridarse con un fragmento de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento. También se describen en este documento ácidos nucleicos capaces de hibridarse con el ácido nucleico de longitud completa que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. Los paráme­ tros generales para las condiciones de la hibridación de ácidos nucleicos se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, New York (1994)). La hibridación se puede realizar en condiciones muy rigurosas, condiciones medio rigurosas o condiciones poco riguro­ sas. Los expertos en la técnica comprenderán que las condiciones del rigor bajo, medio y alto dependen de múltiples factores, todos los cuales interaccionan y también dependen de los ácidos nucleicos en cuestión. Por ejemplo, las condiciones muy rigurosas pueden incluir temperaturas dentro de un margen de 5°C de la temperatura de fusión de los ácidos nucleicos, una concentración de sal baja (p. ej., menos de 250 mM) y una concentración elevada de codisolvente (p. ej., 1-20% de codisolvente, por ejemplo, DMSO). Las condiciones poca rigurosas, por otra parte, pueden incluir temperaturas superiores a 10°C por debajo de la temperatura de fusión del ácido o ácidos nucleicos, una con­ centración de sal alta (p. ej., superior a 1000 mM) y la ausencia de codisolventes.
En algunas realizaciones, se aísla el ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se separa de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. En otras palabras, el ácido nucleico aislado puede comprender ácidos nucleicos heterólogos que no están asociados con él en la naturaleza. En otras realizaciones, un ácido nucleico "aislado", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente exento de otro material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión "sustancialmente exento de material celular" incluye preparaciones de ácido nucleico en las que el ácido nucleico se separa de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aísla o se produce de forma recombinante. Por lo tanto, el ácido nucleico que está sustancialmente exento de material celular incluye preparaciones de ácido nucleico que tienen menos de aproximadamente 30%, 20%, 10% o 5% (en peso seco) de otros ácidos nucleicos. La expresión "sustancialmente exento de medio de cultivo" incluye preparaciones de ácido nucleico en las que el medio de cultivo representa menos del 50%, 20%, 10% o 5% del volu­ men de la preparación. La expresión "sustancialmente exento de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones en las que el ácido nucleico se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis del ácido nucleico. En realizaciones específicas, esas preparaciones de ácido nucleico de la invención tienen menos del 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (en peso seco) de precursores químicos o com­ puestos distintos del ácido nucleico de interés.
En el presente documento también se describen ácidos nucleicos que codifican los componentes individuales de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican el dominio de la cabeza globular, el segmento del tallo N-terminal de HA1, el segmento del tallo C-terminal de HA1 y/o el dominio HA2 de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, se proporcionan en este documento. Los ácidos nucleicos que codifican componentes de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento pueden ensamblarse utilizando técnicas de biología molecular estándar conocidas por los expertos en la técnica para producir un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento.
5.3 Expresión de polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe
En el presente documento se proporcionan vectores, incluidos vectores de expresión, que contienen el ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe proporcionado en la Sección 5.1). En una realiza­ ción específica, el vector es un vector de expresión que es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. Los ejem­ plos no limitantes de vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y vectores víricos, tales como retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y baculovirus con fallos en la replicación. Los vectores de expresión también pueden incluir, sin limitación, animales transgénicos y células/organismos que no son de mamífero, por ejem­ plo, células/organismos de mamíferos que han sido diseñados genéticamente para realizar la glicosilación ligada a N de mamíferos.
En este documento se describen vectores de expresión que codifican componentes de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. Esos vectores pueden usarse para expresar los componentes en una o más células hospedadoras y los componentes pueden aislarse y conjugarse junto con un enlazador usando técnicas conocidas por un experto en la técnica.
Un vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. En una realización específica, el vector de expresión de la invención incluye además una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedadoras que se van a usar para la expresión, que se ligan funcionalmente al ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión, "ligado funcionalmente" significa que un ácido nucleico de interés está ligado a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión del ácido nucleico (p. ej., en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). Las secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros ele­ mentos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen una expresión constitutiva de un ácido nucleico en muchos tipos de células hospedadoras, aquellas que dirigen la expresión del ácido nucleico solo en ciertas células hospedadoras (p. ej., secuencias reguladoras específicas de un tejido) y aquellas que dirigen la expresión del ácido nucleico ácido nucleico tras la estimulación con un agente particular (p. ej., secuencias reguladoras inducibles). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. La expresión "célula hospedadora" se entiende que incluye una célula objeto particular, transformada o transfectada con un ácido nucleico y la progenie o la progenie potencial de esa célula. La progenie de esa célula puede no ser idéntica a la célula parental transformada o transfectada con el ácido nucleico, debido a mutaciones o influencias ambientales que pueden ocurrir en generaciones sucesivas o la integración del ácido nucleico en el genoma de la célula hospedadora.
Los vectores de expresión se pueden diseñar para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento, usando células procarióticas (p. ej., E. coli) o células eucariotas (p. ej., células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus, véase, por ejemplo, Treanor et al., 2007, JAMA, 297(14):1577-1582), células de levadura, células vegetales, algas o células de mamífero). Ejemplos de células hospedadoras de levadura incluyen, entre otros, S. pombe, S. cerevisiae y P. pastoris y ejemplos a continuación. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero de la invención incluyen, sin limitarse a, células Crucell Per.C6, células Vero, células CHO, células VERY, células BHK, células HeLa, células CoS, células MDCK, células 293, células 3T3 o células WI38. En ciertas realizaciones, las células hospedadoras de la invención son células de mieloma, p. ej., células NS0, células 45.6 TG1.7, células AF-2 clon 9B5, células AF-2 clon 9B5, células J558L, células MOPC 315, células MPC-11, células NCI-H929, células NP, células NS0/1, células P3 NS1 Ag4, células P3/NS1/1-Ag4-1, células P3U1, células P3X63Ag8, células P3X63Ag8.653, células P3X63Ag8U.1, células RPMI 8226, células Sp20-Ag14, cé­ lulas U266B1, células X63AG8.653, células Y3.Ag.L2.3 y células YO. Ejemplos no limitativos de células de insecto incluyen Sf9, Sf21, Ao/Tn 38, High Five, Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda y Bombyx mori. En una realización particular, se utiliza un sistema de cultivo de células de mamífero (por ejemplo, células de ovario de hámster chino o de riñón de cría de hámster) para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. En otra realización, se usa un sistema de cultivo de células vegetales para la expresión de un polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. Véanse, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. n° 7.504.560; 6.770.799; 6.551.820; 6.136.320; 6.034.298; 5.914.935; 5.612.487; y 5.484.719, y los documentos de publicación de solicitud de patente de EE.UU. n22009/0208477, 2009/0082548, 2009/0053762, 2008/0038232, 2007/0275014 y 2006/0204487 para células vegetales y métodos para la producción de proteínas utilizando sistemas de cultivo de células vegetales. En ejemplos específicos, los sistemas de cultivo de células vegetales no se usan para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento.
Las plantas (por ejemplo, plantas del género Nicotiana ) pueden diseñarse genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1). En realizaciones específicas, las plantas se modifican para expresar el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención a través de un procedimiento de agroinfiltración, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención que codifican un gen de interés, por ejemplo, un gen que codifica el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, se introducen en una cepa de Agrobacterium. Posteriormente, la cepa se cultiva en un cultivo líquido y las bacterias resultantes se lavan y suspenden en una solución tampón. A continuación, las plantas se exponen (p. ej., mediante inyección o inmersión) al Agrobacterium que comprende los ácidos nucleicos que codifi­ can un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus la gripe, de modo que el Agrobacterium transforma el gen de interés en una parte de las células vegetales. El polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe es expresado transitoriamente por la planta y puede aislarse usando métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento. (Para ejemplos específicos véase Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23):2930-2934; y D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940). En una realización específica, la planta es una planta de tabaco (por ejemplo, Nicotiana tabacum) . En otra realización específica, la planta está emparentada con la planta del tabaco (por ejemplo, Nicotiana benthamiana) . En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención se expresan en una especie de soja. En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención se expresan en una especie de maíz. En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención se ex­ presan en una especie de arroz.
En otras realizaciones, las algas (por ejemplo, Chlamydomonas reinhardtii) pueden diseñarse para expresar el poli­ péptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, por ejemplo, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe proporcionado en la Sección 5.1 (véase, por ejemplo, Rasala et al., 2010, Plant Biotechnology Journal (publicado en línea el 7 de marzo de 2010)).
5.4 Vectores del virus de la gripe
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan virus de la gripe que contienen el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención (por ejemplo, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe proporcionado en la Sección 5.1). En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención se incorpora a los viriones del virus de la gripe de la invención. Los virus de la gripe de la invención se pueden conjugar con restos que dirigen los virus a tipos de células particulares, como las células inmunitarias. En algunas realizaciones, a los viriones del virus de la gripe de la invención se les ha incorporado o expresan un polipéptido heterólogo además del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que tenga actividad inmunopotenciadora o que dirija el virus de la gripe a un tipo de célula particular, como un anticuerpo que se une a un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se une a un receptor específico en una célula específica.
Los virus de la gripe que contienen el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención se pueden producir suministrando en trans el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe durante la producción de viriones, utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como genética inversa y rescate de plásmidos sin agentes auxiliares. Alternativamente, la replicación de un virus de la gripe parental que com­ prende un genoma diseñado genéticamente para expresar el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención en células susceptibles a una infección con el virus, en donde la función de la hemaglutinina se proporciona en trans, producirá una descendencia de virus de la gripe que contienen el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención.
En el presente documento se describen virus de la gripe que comprenden un genoma diseñado genéticamente para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1). En una realización específica, el genoma de un virus de la gripe parental se modifica para codificar el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, que se expresa a través de la progenie del virus de la gripe. En otra realización específica, el genoma de un virus de la gripe parental se modifica para codificar el polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, que se expresa y se incorpora en los viriones de la progenie del virus de la gripe. Por lo tanto, la progenie del virus de la gripe resultante de la replicación del virus de la gripe parental de la invención, contiene el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. Los viriones del virus de la gripe parental de la invención pueden tener además, incorporado en ellos, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que contiene un dominio del tallo o de la cabeza del mismo tipo, subtipo o cepa del virus de la gripe, o uno diferente. Alternativamente, los viriones del virus de la gripe parental pueden tener incorporado un resto que es capaz de reemplazar funcionalmente una o más de las actividades del polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe (p. ej., la unión al receptor y/o las actividades fusogénicas de la hemaglutinina del virus de la gripe). En ciertas realizaciones, una o más de las actividades del polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención es proporcionada por una proteína de fusión que comprende (i) un ectodominio de un polipéptido heterólogo frente al virus de la gripe, fusionado con (ii) un dominio transmembranal o con un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe. En una realización específica, los viriones del virus de la gripe parental de la invención pueden tener incorporada una proteína de fusión que comprende (i) un ectodominio de un polipéptido que se une al receptor/fusogénico de un agente infeccioso distinto del virus de la gripe, fusionado con (ii) un dominio transmembranal o con un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático de una hemaglutinina del virus de la gripe. Para obtener una descripción de las proteínas de fusión que proporcionan una o más actividades de un polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe y los métodos para la producción de virus de la gripe diseñados genéticamente para expresar tales proteínas de fusión, véanse, por ejemplo, el documento de publicación de solicitud de patente internacional n° WO 2007/064802, publicada el 7 de junio, 2007 y el documento de publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2012/0122185.
En ciertas realizaciones, los virus de la gripe diseñados genéticamente para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y para expresar además uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quimé­ ricos del virus de la gripe descritos en el presente documento, comprenden una neuraminidasa (NA) o un fragmento de la misma, que procede de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la gripe) que de la que se obtiene el dominio de la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, los virus de la gripe de la invención diseñados para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y para expresar además uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento, comprenden una neuraminidasa (NA) o un fragmento de la misma, que procede de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la gripe) que de la que se obtiene el dominio de la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención, en donde el dominio de la cabeza globular es heterólogo frente al dominio del tallo de las subunidades HA1 y/o HA2 del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, los virus de la gripe de la invención diseñados para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y para expresar además uno o más de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento, comprenden una neuraminidasa (NA) o un fragmento de la misma, que procede de la misma fuente (p. ej., cepa o subtipo del virus de la gripe) que de la que se obtiene el dominio del tallo de la HA del polipéptido quimérico de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención.
En algunas realizaciones, los viriones del virus de la gripe parental tienen incorporado dentro de ellos el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además tienen incorporado dentro ellos un polipéptido heterólogo.
En determinadas realizaciones, el genoma de un virus de la gripe parental se modifica para codificar un polipéptido heterólogo y el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, que se expresan en la progenie del virus de la gripe. En realizaciones específicas, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención o el polipéptido de HA quimérico del virus de la gripe de la invención y el polipéptido heterólogo se incorporan en los viriones de la descendencia del virus de la gripe.
El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que dirige el virus de la gripe hacia un tipo de célula particular, como un anticuerpo que reconoce un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se une a un receptor específico en un tipo de célula específico. En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido reemplaza la función de reconocimiento de células diana del virus. En una realización específica, el polipéptido heterólogo dirige el virus de la gripe hacia los mismos tipos de células que los que el virus de la gripe infecta en la naturaleza. En otras realizaciones específicas, el polipéptido heterólogo dirige la progenie del virus de la gripe hacia células inmunitarias, como los linfocitos B, los linfocitos T, los macrófagos o las células dendríticas. En algunas realizaciones, el polipéptido heterólogo reconoce y se une a marcadores específicos de una célula entre las células presentadoras de antígeno, tales como las células dendríticas (p. ej., como CD44). En una realización, el polipéptido heterólogo es DC-SIGN que dirige el virus hacia las células dendríticas. En otra realización, el polipéptido heterólogo es un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo monocatenario) que dirige el virus hacia una célula inmunitaria, que puede fusionarse con un dominio transmembranal de otro polipéptido de modo que se incorpora en el virión del virus de la gripe. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo de CD20, un anticuerpo de CD34 o un anticuerpo contra DEC-205. Las técnicas para diseñar virus para expresar polipéptidos con funciones de direccionamiento son conocidas en la técnica. Véanse, p. ej., Yang et al., 2006, PNAS 103: 11479-11484 y los documentos de publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 20080019998, publicado el 24 de enero, 2008 y el n° 20070020238, publicado el 25 de enero, 2007.
En otra realización, el polipéptido heterólogo es una proteína de fijación de virus. Ejemplos no limitativos de virus cuyas proteína(s) de fijación pueden usarse en este aspecto, son virus seleccionados a partir del grupo de: virus de la fiebre de Lassa, virus de la hepatitis B, virus de la rabia, virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), un retrovirus como el del virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus vaccinia, herpesvirus, poliovirus, alfavirus como el virus del bosque de Semliki, el virus del río Ross y el virus Aura (que comprenden glicoproteínas de superficie tales como E1, e2 y E3), virus de la enfermedad de Borna, virus de Hantaan, foamyvirus y virus SARS-CoV.
En una realización, se puede usar una glicoproteína de superficie de flavivirus, tal como la proteína E del virus del dengue (DV). En algunas realizaciones, se usa una glicoproteína del virus Sindbis de la familia de los alfavirus (K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol.66, 4992 (1992)). En ciertas realizaciones, el polipéptido heterólogo se obtiene a partir de una proteína HN o F de NDV; gp160 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (o su producto, tal como gp41 o gp120); un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg); una glicoproteína de herpesvirus (p. ej., gD, gE); o VP1 del poliovirus.
En otra realización, el polipéptido heterólogo se obtiene a partir de cualquier sistema de direccionamiento no vírico conocido en la técnica. En ciertas realizaciones, se usa una proteína de un agente patógeno no vírico, tal como una bacteria intracelular o un protozoo. En algunas realizaciones, el polipéptido bacteriano es proporcionado, por ejemplo, por Chlamydia, Rikettsia, Coxelia, Listeria, Brucella o Legionella. En algunas realizaciones, el polipéptido protozoario es proporcionado, p. ej., por especies de plasmodio, L e is h m a n ia s p p ., T o x o p la s m a g o n d i i o T ry p a n o s o m a c ru z i. Otros ejemplos de sistemas de direccionamiento se describen en Waehler et al., 2007, "Engineering targeted viral vectors for gene therapy," Nature Reviews Genetics 8: 573-587.
En determinadas realizaciones, el polipéptido heterólogo expresado por un virus de la gripe tiene actividad inmunopotenciadora (inmunoestimulante). Los ejemplos no limitativos de polipéptidos inmunopotenciadores incluyen, sin limi­ tarse a, moléculas de estimulación, citocinas, quimiocinas, anticuerpos y otros agentes tales como ligandos de Flt-3. Los ejemplos específicos de polipéptidos con actividad inmunopotenciadora incluyen: interferón de tipo 1, interferón alfa, beta o gamma, factores estimulantes de colonias como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macró­ fagos (GM-CSF), interleucina (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, factor de necrosis tumoral (TNF)-p, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) y CD40 inducible por fármacos (iCD40) (véase, p. ej., Hanks, B. A., et al. 2005. Nat Med 11:130-137)
Dado que el genoma de los virus de la gripe A y B consiste en ocho (8) segmentos de cadena sencilla con sentido negativo (los virus de la gripe C consisten en siete (7) segmentos de cadena sencilla con sentido negativo), el genoma de un virus de la gripe parental se puede diseñar para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y para expresar adicionalmente un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en el presente documento (y cualquier otro polipéptido, tal como un polipéptido heterólogo) utilizando un segmento recombinante y técnicas conocidas por los expertos en la materia, tal como genética inversa y rescate de plásmidos sin agentes auxiliares. En una realización, el segmento recombinante comprende el ácido nucleico de la invención que codifica los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, así como las señales de incorporación 3' y 5' que se requieren para una replicación, transcripción y empaquetamiento adecuados de los ARNv. (Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng, et al., 1996, Virology 217:242-251). En una realización específica, el segmento recombinante utiliza las secuencias no codificantes y/o no traducidas 3' y 5' de segmentos del virus de la gripe que proceden de un tipo, subtipo o cepa diferente o el mismo que el virus de la gripe parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante comprende la región 3' no codificante del polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención, las regiones no traducidas de un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención y la región 5' no codificante de un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención. En realizaciones específicas, el segmento recombinante comprende las secuencias 3' y 5' no codificantes y/o no traducidas del segmento HA de un virus de la gripe que es del mismo tipo, subtipo o cepa que el tipo, subtipo o cepa del virus de la gripe que el segmento N-terminal del tallo de HA1, el segmento del tallo C-terminal de HA1, el dominio de la cabeza globular y/o HA2 de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención puede reemplazar el segmento HA de un virus de la gripe parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) qui­ mérico del virus de la gripe de la invención puede reemplazar el gen NS1 del virus de la gripe parental. En algunas realizaciones, el segmento recombinante que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención puede reemplazar el gen NA del virus de la gripe parental. Las cepas ejemplares de virus de la gripe que se pueden usar para expresar los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe des­ critos en el presente documento, incluyen Ann Arbor/1/50, A/Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, A/South Dakota/6/2007, A/Uruguay/716/2007, A/California/07/2009, A/Perth/16/2009, A/Brisbane/59/2007, A/Brisbane/10/2007, A/Leningrad/134/47/57, B/Brisbane/60/2008, B/Yamagata/1/88, A/Panama/2007/99, A/Wyoming/3/03 y A/WSN/33.
En algunas realizaciones, un segmento de un gen de la hemaglutinina del virus de la gripe codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. En realizaciones específicas, el seg­ mento de un gen de la hemaglutinina del virus de la gripe y al menos otro segmento de un gen del virus de la gripe, comprenden señales de empaquetamiento que permiten que el segmento del gen de la hemaglutinina del virus de la gripe y al menos otro segmento de gen se segreguen juntos durante la replicación de un virus de la gripe recombinante (véase, Gao & Palese 2009, PNAS 106:15891-15896; documentos de Publicación de Solicitud Internacional n° WO11/014645; y de Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2012/0244183).
En algunas realizaciones, el genoma de un virus de la gripe parental puede diseñarse para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y para expresar opcionalmente un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, usando un segmento recombinante que es bicistrónico. Las técnicas bicistrónicas permiten la modificación genética de secuencias codificantes de múltiples proteínas en un solo ARNm, mediante el uso de secuencias del sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). Las secuencias IRES dirigen el reclutamiento interno de los ribosomas a la molécula de ARN y permiten la traducción aguas abajo de manera independiente de la caperuza. Brevemente, una región codificante de una proteína se inserta en el marco de lectura abierto (ORF) de una segunda proteína. La inserción está flanqueada por un IRES y cualquier secuencia señal no traducida necesaria para una expresión y/o función adecuadas. La inserción no debe interrumpir el ORF, la poliadenilación o los promotores transcripcionales de la segunda proteína (véase, p. ej., García-Sastre et al., 1994, J. Virol.
68:6254-6261 y García-Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246,). Véanse además, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. n° 6.887.699. 6.001.634. 5.854.037 y 5.820.871. Cualquier IRES conocido en la técnica o descrito en el presente documento puede usarse de acuerdo con la invención (p. ej., el IRES del gen BiP, nucleótidos 372 a 592 del registro de la base de datos GenBank HUMGRP78; o el IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), nucleótidos 1430-2115 del registro de la base de datos GenBank CQ867238). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, un virus de la gripe parental se modifica para que contenga un segmento de ARN bicistrónico que expresa el polipép­ tido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención y otro polipéptido, tal como un gen expresado por el virus de la gripe parental. En algunas realizaciones, el gen del virus de la gripe parental es el gen HA. En algunas realizaciones, el gen del virus de la gripe parental es el gen NA. En algunas realizaciones, el gen del virus de la gripe parental es el gen NS1.
Pueden usarse técnicas conocidas por un experto en la técnica para producir un virus de la gripe que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y un virus de la gripe que comprende un genoma modificado para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de genética inversa para generar un virus de la gripe de ese tipo. Brevemente, las técnicas de genética inversa implican generalmente la preparación de ARN víricos recombinantes sintéticos que contienen las regiones no codificantes del ARN vírico de cadena negativa que son esenciales para el reconocimiento por las polimerasas víricas y para empaquetar las señales necesarias para generar un virión maduro. Los ARNs recombinantes se sintetizan a partir de una plantilla de ADN recombinante y se reconstituyen in v itro con un complejo de polimerasa vírica purificada para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNPs) que pueden usarse para transfectar células. Se logra una transfección más eficiente si las proteínas de la polimerasa vírica están presentes durante la transcripción de los ARNs sintéticos in v itro o in v ivo . Las RNPs recombinantes sintéticas se pueden rescatar dentro de partículas de virus infec­ ciosos. Las técnicas anteriores se describen en los documentos de patente de EE.UU. n° 5.166.057 concedida el 24 de noviembre, 1992; en la patente de EE.UU. n° 5.854.037 concedida el 29 de diciembre, 1998; en la publicación de patente europea EP 0702085A1, publicada el 20 de febrero, 1996; en la Solicitud de Patente de EE.UU. n° de serie 09/152.845; en Publicaciones Internacionales de Patentes PCT WO 97/12032 publicadas el 3 de abril, 1997; WO 96/34625 publicada el 7 de noviembre, 1996; en la publicación de patente europea EP A780475; WO 99/02657 publi­ cada el 21 de enero, 1999; WO 98/53078 publicada el 26 de noviembre, 1998; Wo 98/02530 publicada el 22 de enero, 1998; WO 99/15672 publicada el 1 de abril, 1999; WO 98/13501 publicada el 2 de abril, 1998; WO 97/06270 publicada el 20 de febrero, 1997; y EPO 780475A1 publicada el 25 de junio, 1997.
Alternativamente, la tecnología de plásmidos sin agente auxiliar puede usarse para producir un virus de la gripe que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y un virus de la gripe que comprende un genoma diseñado para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. Brevemente, los ADNc de longitud completa de segmentos víricos se amplifican mediante PCR con cebadores que incluyen sitios de restricción únicos, que permiten la inserción del producto de la PCR en el vector plasmídico (Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123; Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873). El vector plasmídico está diseñado para que se exprese un transcrito exacto negativo (sentido de ARNv). Por ejemplo, el vector plasmídico puede diseñarse para posicionar el producto de la PCR entre un promotor de la ARN polimerasa I humana truncado y una secuencia de una ribozima del virus de la hepatitis delta, de manera que se produzca un transcrito exacto negativo (sentido de ARNv) a partir del promotor de la polimerasa I. Los vectores de plásmidos distintos que comprenden cada segmento vírico así como los vectores de expresión que comprenden las proteínas víricas necesarias, pueden transfectarse en células que conducen a la producción de partículas víricas recombinantes. En otro ejemplo, pueden usarse vectores plasmídicos a partir de los cuales se expresan tanto el ARN genómico vírico como el ARNm que codifica las proteínas víricas necesarias. Para obtener una descripción detallada de la tecnología de plásmidos sin agentes auxiliares, véanse, por ejemplo, los documentos de Publicación internacional n° WO 01/04333; patentes de EE.UU. n° 6.951.754, 7.384.774, 6.649.372 y 7.312.064; Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682; Quinlivan et al., 2005, J. Virol. 79:8431 -8439; Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113; Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350; Enami y Enami, 2000, J. Virol. 74(12):5556-5561; y Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70(6):4188-4192.
Los virus de la gripe pueden multiplicarse sobre cualquier sustrato que permita que el virus crezca hasta títulos que permitan su uso de acuerdo con los métodos descritos en este documento. En una realización, el sustrato permite que los virus de la invención crezcan hasta títulos comparables a los determinados para los virus de tipo silvestre corres­ pondientes. En determinadas realizaciones, el sustrato es uno que es biológicamente relevante para el virus de la gripe o para el virus a partir del cual se obtiene la función de HA. En una realización específica, un virus de la gripe atenuado de la invención en virtud de, p. ej., una mutación en el gen NS1, puede multiplicarse sobre un sustrato que carece de IFN. Por ejemplo, un sustrato que carece en IFN adecuado puede ser uno que tenga una capacidad defec­ tuosa para producir o responder al interferón o uno en el que un sustrato que carece de IFN pueda usarse para el crecimiento de cualquier cantidad de virus que pueda requerir un entorno de crecimiento carente de interferón. Véanse, por ejemplo, los documentos de patentes de EE.UU. n° 6.573.079, concedida el 3 de junio, 2003, 6.852.522, concedida el 8 de febrero, 2005 y 7.494.808, concedida el 24 de febrero, 2009. En una realización específica, el virus de la invención se multiplica en huevos embrionados (p. ej., huevos de gallina). En una realización específica, el virus de la invención se multiplica en huevos embrionados de 8 días, 9 días, 8-10 días, 10 días, 11 días, 10-12 días o 12 días (p. ej., huevos de gallina). En determinadas realizaciones, el virus de la invención se multiplica en células MDCK, células Vero, células 293T u otras líneas celulares conocidas en la técnica. En ciertas realizaciones, el virus de la invención se multiplica en células obtenidas a partir de huevos embrionados.
Los virus de la gripe proporcionados en el presente documento pueden aislarse y purificarse mediante cualquier mé­ todo conocido por los expertos en la técnica. En una realización, el virus de la invención se extrae a partir de un cultivo celular y se separa de los componentes celulares, típicamente mediante procedimientos de clarificación bien conoci­ dos, por ejemplo, como centrifugación en gradiente y cromatografía en columna, y puede purificarse adicionalmente según se desee usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, ensayos en placa.
En ciertas realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen a partir o se derivan de un virus de la gripe A. En ciertas realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen o se derivan a partir de dos o más subtipos o cepas del virus de la gripe A.
En algunas realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen o se derivan de un virus de la gripe B. En ciertas realizaciones, los virus de la gripe o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen o se derivan de dos o más subtipos o cepas del virus de la gripe B. En otras realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento se obtienen o se derivan de una combinación de subtipos o cepas del virus de la gripe A y B.
En algunas realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento se obtienen o se derivan de un virus de la gripe C. En ciertas realizaciones, el virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen o se derivan de dos o más subtipos o cepas del virus de la gripe C. En otras realizaciones, los virus de la gripe de la invención o los polipéptidos, genes o segmentos del genoma del virus de la gripe para uso tal y como se describe en el presente documento, se obtienen o se derivan de una combinación de subtipos o cepas del virus de la gripe C y el virus de la gripe A y/o el virus de la gripe B.
En determinadas realizaciones, los virus de la gripe proporcionados en el presente documento tienen un fenotipo atenuado. En realizaciones específicas, el virus de la gripe atenuado de la invención se basa en el virus de la gripe A.
En otras realizaciones, el virus de la gripe atenuado de la invención se basa en el virus de la gripe B. En aún otras realizaciones, el virus de la gripe atenuado de la invención se basa en el virus de la gripe C. En otras realizaciones, el virus de la gripe atenuado de la invención puede comprender genes o segmentos de genoma procedentes de una o más cepas o subtipos de virus de la gripe A, gripe B y/o gripe C. En algunas realizaciones, el virus principal atenuado comprende genes procedentes de un virus de la gripe A y de un virus de la gripe B.
En realizaciones específicas, se desea una atenuación del virus de la gripe de la invención, de modo que el virus permanezca, al menos parcialmente, infeccioso y pueda replicarse in vivo, pero solo generar títulos bajos dando como resultado niveles subclínicos de infección que no son patogénicos. Esos virus atenuados son especialmente adecua­ dos para realizaciones en las que el virus de la invención o una composición inmunogénica del mismo, se administra a un sujeto para inducir una respuesta inmunitaria. La atenuación del virus de la gripe se puede lograr de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica, tal como, p. ej., seleccionando mutantes víricos generados por mutagénesis química, mutación del genoma por ingeniería genética, seleccionando virus reordenados que contienen segmentos con función atenuada o seleccionando mutantes de virus condicionales (p. ej., virus adaptados al frío). Alternativa­ mente, los virus de la gripe atenuados que se producen de forma natural pueden usarse como cadenas principales del virus de la gripe para los vectores del virus de la gripe.
En una realización, un virus de la gripe puede atenuarse, al menos en parte, en virtud de la sustitución del gen HA del virus de la gripe parental con el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En algunas realizaciones, un virus de la gripe puede atenuarse, al menos en parte, modificando el virus de la gripe para que exprese adicionalmente un gen NS1 mutado que afecta a la capacidad del virus para antagonizar la respuesta del interferón celular (IFN). Los ejemplos de los tipos de mutaciones que se pueden introducir en el gen NS1 del virus de la gripe incluyen deleciones, sustituciones, inserciones y combinaciones de las mismas. Se pueden introducir una o más mutaciones en cualquier parte del gen NS1 (p. ej., el extremo N-terminal, el C-terminal o algún punto intermedio) y/o el elemento regulador del gen NS1. En una realización, un virus de la gripe atenuado comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además comprende un genoma que tiene una mutación en un gen NS1 del virus de la gripe, lo que da como resultado una deleción que consiste en 5, preferiblemente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 o 175 residuos de aminoácidos desde el extremo C-terminal de NS1, o una deleción de los residuos de aminoácidos 5-170, 25-170, 50-170, 100-170, 100-160 o 105-160 desde el extremo C-terminal. En otra realización, un virus de la gripe atenuado comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además comprende un genoma que tiene una mutación en un gen NS1 del virus de la gripe, de manera que codifica una proteína NS1 con los residuos de aminoácidos 1-130, residuos de aminoácidos 1-126, residuos de aminoácidos 1­ 120, residuos de aminoácidos 1-115, residuos de aminoácidos 1-110, residuos de aminoácidos 1-100, residuos de aminoácidos 1 -99, residuos de aminoácidos 1 -95, residuos de aminoácidos 1 -85, residuos de aminoácidos 1 -83, resi­ duos de aminoácidos 1 -80, residuos de aminoácidos 1 -75, residuos de aminoácidos 1 -73, residuos de aminoácidos 1 -70, residuos de aminoácidos 1-65 o residuos de aminoácidos 1-60, en donde el aminoácido N-terminal es el número 1. Para ejemplos de mutaciones de NS1 y virus de la gripe que comprenden un NS1 mutado, véanse, p. ej., los documentos de patente de EE.UU. n° 6.468.544 y 6.669.943; y Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138.
En otra realización, un virus de la gripe de la invención puede atenuarse, al menos en parte, mutando un gen NA o M del virus, tal y como se describe en la bibliografía.
5.5 Vectores de virus que no son de la gripe
En el presente documento se describen virus que no son de la gripe que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1). En una realización específica, el polipéptido de hemagluti­ nina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención se incorpora en los viriones del virus que no es de la gripe. En una realización específica, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención está contenido en/expresado por un virus aislado o purificado (p. ej., purificado en placa). Los virus que no son de la gripe pueden conjugarse con restos que dirigen los virus a tipos de células particulares, como las células inmunitarias. En algunas realizaciones, los viriones del virus que no es de la gripe han incorporado dentro de ellos o expresan un polipéptido heterólogo además del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención.
El polipéptido heterólogo puede ser un polipéptido que tiene actividad inmunopotenciadora o que dirige el virus que no es de la gripe a un tipo de célula particular, como un anticuerpo que reconoce un antígeno en un tipo de célula específico o un ligando que se une a un receptor específico en un tipo de célula específico. Véase la Sección 5.4 anterior para ejemplos de esos polipéptidos heterólogos.
Los virus que no son de la gripe que contienen/expresan un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe se pueden producir usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los virus que no son de la gripe que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, se pueden producir suministrando en trans el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe durante la producción de viriones, usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Alternativamente, la replicación de un virus parental que no es de la gripe que comprende un genoma diseñado para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en células susceptibles a la infección con el virus, en donde la función de la hemaglutinina se proporciona en trans, producirá una progenie de virus que contendrán el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe.
Cualquier tipo, subtipo o cepa de virus, incluyendo, pero no limitados a, cepas, variantes o mutantes de origen natural, virus mutagenizados, reordenados y/o virus modificados genéticamente, puede usarse como un vector de virus que no son de la gripe. En una realización específica, el virus parental que no es de la gripe no es un virus que está en la naturaleza. En otra realización específica, el virus parental que no es de la gripe es un virus modificado genéticamente. En ciertas realizaciones, se prefiere un virus con envuelta para la expresión del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención unido a una membrana.
En una realización ejemplar, el vector del virus que no es de la gripe es un virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). En otra realización, el vector de virus que no es de la gripe es un virus vaccinia. En otra realización, el vector de virus que no es de la gripe es un baculovirus (tal como, por ejemplo, BacMam [Invitrogen]). En otras realizaciones ejempla­ res, no limitativas, el vector del virus que no es de la gripe es adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus de la hepatitis B, retrovirus (tales como, p. ej., un gammaretrovirus como el genoma del virus de células madre de ratón (MSCV) o el virus de la leucemia murina (MLV), p. ej., virus de la leucemia murina de Moloney, oncoretrovirus o lentivirus), un alfavirus (p. ej., virus de la encefalitis equina venezolana), un rabdovirus (como el virus de la estomatitis vesicular (VSV) o los papilomavirus), poxvirus (como, por ejemplo, el virus vaccinia, un vector MVA-T7 o virus de la viruela aviar), metapneumovirus, virus del sarampión, herpesvirus (como el virus del herpes simple) o foamyvirus. Véase, por ejemplo, Lawrie y Tumin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (vectores retrovirales); Bett et al., 1993, J. Virol. 67, 5911 (vectores adenovirales); Zhou et al., 1994, J. Exp. Med. 179, 1867 (vectores de virus adenoasociados); Dubensky et al., 1996, J. Virol. 70, 508-519 (vectores víricos de la familia de la viruela que incluyen el virus vaccinia y los virus de la viruela aviar y vectores víricos del género de virus alfa, tales como los derivados de Sindbis y Semliki Forest Viruses); documento de patente de EE.UU. n° 5.643.576 (virus de la encefalitis equina vene­ zolana); WO 96/34625 (VSV); Ohe et al., 1995, Human Gene Therapy 6, 325-333; Woo et al., documento WO 94/12629; Xiao y Brandsma, 1996, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (virus del papiloma); y Bukreyev y Collins, 2008, Curr Opin Mol Ther. 10:46-55 (NDV).
En una realización específica, el vector del virus que no es de la gripe es NDV. Cualquier tipo, subtipo o cepa de NDV puede servir como la estructura principal que está diseñada para expresar el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, incluidos, sin limitación, cepas, variantes o mutantes de origen natural, virus mutagenizados, reordenados y/o virus modificados genéticamente. En una realización específica, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es una cepa de origen natural. En ciertas realizaciones, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es una cepa lítica. En otras realizaciones, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es una cepa lentogénica. En algunas realizaciones, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es una cepa mesogénica. En otras realizaciones, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es una cepa velogénica. Los ejemplos específicos de cepas de NDV incluyen, sin limitación, la cepa 73-T, la cepa Ulster, la cepa MTH-68, la cepa Italien, la cepa Hickman, la cepa PV701, la cepa Hitchner B1, la cepa La Sota, la cepa YG97, la cepa MET95 y la cepa F48E9. En una realización específica, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es la cepa Hitchner B1. En otra realización específica, el NDV que sirve como estructura principal para la ingeniería genética es la cepa La Sota.
En un ejemplo, el NDV utilizado como estructura principal para un vector del virus que no es de la gripe, se modifica para expresar una proteína F modificada en la que el sitio de escisión de la proteína F se reemplaza por uno que contiene uno o dos residuos de arginina adicionales, lo que permite activar el sitio de escisión del mutante para ser activado por proteasas expresadas ubicuamente de la familia de las furinas. Los ejemplos específicos de NDV que expresan esa proteína F modificada incluyen, sin limitación, rNDV/F2aa y rNDV/F3aa. Para obtener una descripción de las mutaciones introducidas en una proteína F del NDV para producir una proteína F modificada con un sitio de escisión mutado, véase, por ejemplo, Park et al. (2006) "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and Newcastle disease." PNAS USA 103: 8203-2808.
En una realización, el vector del virus que no es de la gripe es un poxvirus. Un vector de poxvirus puede basarse en cualquier miembro de los poxviridae, en particular, un virus vaccinia o un virus de la viruela aviar (p. ej., tales como viruela del canario, viruela aviar, etc.) que proporciona secuencias adecuadas para vectores de vacunas. En una realización específica, el vector poxviral es un vector del virus vaccinia. Los virus vaccinia adecuados incluyen, pero no se limitan a, la cepa Copenhagen (VC-2) (Goebel, et al., Virol 179: 247-266, 1990; Johnson et al., Virol. 196: 381­ 401, 1993), cepa Copenhague modificada (NYvAC) (documento de patente de EE.UU. n° 6.265.189), la cepa WYETH y la cepa Ankara modificada (MVA) (Antoine et al., Virol. 244: 365-396, 1998). Otros poxvirus adecuados incluyen cepas de viruela aviar como los vectores ALVAC y TROVAC que brindan propiedades deseables y están muy atenua­ das (véanse, por ejemplo, documento de patente de EE.UU. n° 6.265.189; Tartaglia et al., en AIDS Research Reviews, Koff et al., compiladores, vol. 3, Marcel Dekker, Nueva York, 1993; y Tartaglia et al., 1990, Reviews in Immunology 10: 13-30, 1990).
Los métodos para modificar genéticamente virus que no son de la gripe para expresar polipéptidos de la gripe, son bien conocidos en la técnica, al igual que los métodos para atenuar, multiplicar y aislar y purificar esos virus. Para tales técnicas con respecto a los vectores NDV, véanse, por ejemplo, los documentos de Publicación Internacional n° WO 01/04333; patentes de EE.UU. n27.442.379, 6.146.642, 6.649.372, 6.544.785 y 7.384.774; Swayne et al. (2003). Avian Dis. 47:1047-1050; y Swayne et al. (2001). J. Virol. 11868-11873. Para tales técnicas con respecto a los poxvirus, véanse, por ejemplo, Piccini, et al., Methods of Enzymology 153: 545-563, 1987; documentos de Publicación Internacional n° wO 96/11279; patente de EE.UU. n° 4.769.330; patente de EE.UU. n° 4.722.848; patente de EE.UU. n° 4.769.330; patente de EE.uU. n° 4.603.112; patente de EE.UU. n° 5.110.587; patente de EE.UU. n° 5.174.993; EP 83 286; EP 206920; Mayr et al., Infection 3: 6-14, 1975; y Sutter y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851, 1992. En determinadas realizaciones, el virus que no es de la gripe está atenuado.
Las consideraciones ejemplares para la selección de un vector de virus que no es de la gripe, particularmente para uso en composiciones para la administración a un sujeto, son seguridad, baja toxicidad, estabilidad, especificidad de tipo celular e inmunogenicidad, particularmente, antigenicidad del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento expresado por el vector de virus que no es de gripe.
5.6 Virosomas y partículas similares a virus
Los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención y los descritos en el presente documento (por ejemplo, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en la Sección 5.1) se pueden incorporar en vectores de partículas similares a virus (VLPs), por ejemplo, VLPs purificadas/aisladas. Las VLPs generalmente comprenden polipéptido(s) vírico(s) derivado(s) típicamente de una(s) proteína(s) estructural(es) de un virus. En algunas realizaciones, las VLPs de la invención no son capaces de replicarse. En determinadas realizaciones, las VLPs de la invención pueden carecer del genoma completo de un virus o comprender una parte del genoma de un virus. En algunas realizaciones, las VLPs de la invención no son capaces de infectar una célula. En algunas realizaciones, las VLPs de la invención expresan en su superficie uno o más restos que se dirigen a virus (p. ej., glicoproteína de la superficie del virus) o no (p. ej., anticuerpo o proteína), que son conocidos por un experto en la técnica o están descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las VLPs de la invención comprenden el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención y una proteína estructural vírica, tal como gag del VIH. En una realización específica, las VLPs de la invención comprenden el polipéptido de hemaglu­ tinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido gag del VIH.
Se han descrito métodos para producir y caracterizar VLPs producidas de forma recombinante basándose en varios virus, incluido el virus de la gripe (Bright et al. (2007) Vaccine. 25:3871), virus del papiloma humano de tipo 1 (Hagnesee et al. (1991) J. Virol. 67:315), virus del papiloma humano de tipo 16 (Kirnbauer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992)89:12180), VIH-1 (Haffer et al., (1990) J. Virol. 64:2653) y virus de la hepatitis A (Winokur (1991) 65:5029). Los métodos para expresar VLPs que contienen proteínas NDV los proporciona Pantua et al. (2006) J. Virol. 80:11062-11073, y en Estados Unidos el documento de publicación de solicitud de Patente n° 20090068221, publicada el 12 de marzo de 2009. En una realización específica, las VLPs de la invención que además comprenden polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento se generan utilizando baculovirus. En otras realizaciones, las VLPs de la invención que comprenden además el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento se generan usando células 293T.
En realizaciones específicas, las VLPs, por ejemplo, las VLPs que comprenden el polipéptido quimérico de hemaglu­ tinina (HA) del virus de la gripe de la invención, se expresan en células (por ejemplo, células 293T). En ciertas reali­ zaciones, las VLPs de la invención se expresan en células que expresan glicoproteínas de la superficie que compren­ den ácido siálico. De acuerdo con tales realizaciones, las células se cultivan en presencia de neuraminidasa (por ejemplo, neuraminidasa vírica o bacteriana). En ciertas realizaciones, las VLPs, por ejemplo, las VLPs que compren­ den el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, se expresan en células que no expresan glicoproteínas de superficie que comprenden ácido siálico.
En un ejemplo específico, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento puede incorporarse en un virosoma. Un virosoma que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) qui­ mérico del virus de la gripe descrito en este documento, se puede producir usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede producir un virosoma al romper un virus purificado, extraer el genoma y volver a ensamblar las partículas con las proteínas víricas (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento) y los lípidos para formar partículas lipídicas que contienen proteínas víricas.
5.7 Vectores bacterianos
Las bacterias pueden diseñarse genéticamente para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1). Las bacterias adecuadas para la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento incluyen, pero no se limitan a, Listeria, Salmonella, Shigella sp., Mycobacterium tuberculosis, E. coli, Neisseria meningitides, Brucella abortus, Brucella melitensis, Borrelia burgdorferi, Lactobacillus, Campylobacter, Lactococcus, Bifidobacterium y Francisella tularensis. Las bacterias diseñadas para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento pueden atenuarse. Las técnicas para la producción de bacterias diseñadas para expresar un polipéptido heterólogo se conocen en la técnica y se pueden aplicar a la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. Véase, por ejemplo, el documento de Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 20080248066, publicada el 9 de octubre, 2008, y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 20070207171, publicada el 6 de septiembre, 2007. Los vectores bacterianos utilizados en el presente documento poseen la capacidad de realizar una glicosilación ligada a N, por ejemplo, tales bacterias poseen de forma natural la maquinaria para una N-glicosilación (por ejemplo, Campylobacter) o han sido modificadas genéticamente para poseer la maquinaria para una N-glicosilación.
5.8 Generación de anticuerpos contra polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe
El polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención (p. ej., los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe proporcionados en la Sección 5.1), los ácidos nucleicos de la invención que codifican esos polipéptidos o los vectores de la invención que comprenden esos ácidos nucleicos o polipéptidos, se pueden emplear para producir anticuerpos neutralizantes contra el virus de la gripe, por ejemplo, contra la región del tallo de un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención. En una realización específica, los polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, los ácidos nucleicos de la invención que codifican esos polipéptidos o los vectores de la invención que comprenden esos ácidos nucleicos o polipéptidos, pueden administrarse a un sujeto no humano (p. ej., ratón, conejo, rata, conejillo de indias, etc.) para inducir una respuesta inmunitaria que incluye la producción de anticuerpos que pueden aislarse utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.).
Los anticuerpos humanos dirigidos contra los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención pueden generarse utilizando sujetos no humanos (por ejemplo, ratones transgénicos) que son capaces de producir anticuerpos humanos. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos humanos utilizando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulinas humanas. Por ejemplo, los complejos génicos de la inmunoglobulina de la cadena ligera y pesada humana pueden introducirse aleatoriamente o mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón además de los genes de la cadena pesada y ligera humana. Los genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera de ratón pueden volverse no funcionales por separado o simultánea­ mente, con la introducción de loci de inmunoglobulina humana mediante recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embriona­ rias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. A continuación, los ratones quiméricos se cruzan para producir una descendencia homocigótica que expresa anticuerpos humanos. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reorganizan durante la dife­ renciación de los linfocitos B y, posteriormente, experimentan un cambio de clase y una mutación somática. Por lo tanto, usando esa técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para obtener una descripción general de esa tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar, Int. Rev. Inmunol. 13:65-93 (1995). Para una descripción detallada de esa tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véanse, p. ej., los documentos de publicaciones PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente Europea n20598877; paten­ tes de EE.UU. n25.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Empresas como Abgenix, Inc. (Freemont, California), Genpharm (San José, California) y Medarex, Inc. (Princeton, N.J.) pueden participar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado. Además, a los sujetos no humanos se les puede trasplantar leucocitos, esplenocitos o médula ósea de sangre perifé­ rica humana (por ejemplo, Trioma Techniques XTL) para que se generen anticuerpos humanos que se unen a un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento.
Alternativamente, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe pueden usarse para selec­ cionar anticuerpos a partir de bancos de anticuerpos. Por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe aislado puede inmovilizarse sobre un soporte sólido (por ejemplo, un gel de sílice, una resina, una película de plástico derivatizada, una perla de vidrio, algodón, una perla de plástico, una perla de poliestireno, una perla de gel de alúmina o un polisacárido, una perla magnética), y se examina si se une a anticuerpos. Como alterna­ tiva, los anticuerpos pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido y se examina si se unen al polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe aislado. Cualquier ensayo de selección, tal como un ensayo de clasificación, ELISA, resonancia de plasmones superficiales u otro ensayo de selección de anticuerpos conocido en la técnica, puede usarse para seleccionar anticuerpos que se unen al polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. El banco de anticuerpos examinado puede ser un banco de anticuerpos comercialmente disponible, un banco generado in vitro o un banco obtenido identificando y clonando o aislando anticuerpos de un individuo infectado con el virus de la gripe. El banco de anticuerpos puede generarse a partir de un superviviente de un brote de virus de la gripe. Los bancos de anticuerpos se pueden generar de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. El banco de anticuerpos puede generarse clonando los anticuerpos y usándolos en bancos de presentación en fagos o un banco de presentación en fagémidos.
Los anticuerpos identificados en los métodos descritos en el presente documento pueden analizarse para determinar la actividad neutralizante y la falta de autorreactividad utilizando ensayos biológicos conocidos en la técnica o descritos en el presente documento. Un anticuerpo aislado a partir de un animal no humano o un banco de anticuerpos, puede neutralizar un polipéptido de la hemaglutinina de más de un subtipo de virus de la gripe. Un anticuerpo obtenido o 5.9 Estimulación de células con polipéptidos de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe.
En este documento se describen métodos para estimular células ex vivo con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimé­ rico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1). Tales células, por ejemplo, células dendríticas, pueden usarse in vitro para generar anticuerpos contra el polipéptido de la hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o ellas mismas se pueden administrar a un sujeto, p. ej., una técnica de transferencia adoptiva conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento de Publicación de solicitud de Patente de Estados Unidos n° 20080019998, publicada el 24 de enero de 2008, para una descripción de las técnicas de transferencia adoptiva. En ciertos ejemplos, cuando las células que han sido estimuladas ex vivo con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento se administran a un sujeto, las células no son células de mamífero (por ejemplo, células CB-1).
En un ejemplo no limitante, un vector, p. ej., un vector del virus de la gripe, diseñado para expresar un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento, puede usarse para generar células dendríticas (CDs) que expresan el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y muestran propiedades inmunoestimuladoras dirigidas contra un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe. Esas CDs se pueden usar para expandir linfocitos T de memoria y son potentes estimuladores de los linfocitos T, incluidos los clones de linfocitos T citotóxicos específicos del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. Véase Strobel et al., 2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218.
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede administrarse a una célula diana de cual­ quier manera que permita que el polipéptido entre en contacto con la célula diana, p. ej., una CD, y entregar el poli­ péptido a la célula diana. En ciertos ejemplos, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento se administra a un sujeto, tal y como se describe en este documento. En algunos de tales ejemplos, las células en contacto con el polipéptido pueden aislarse y multiplicarse.
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede administrarse a una célula diana in vitro. Pueden usarse técnicas conocidas por los expertos en la técnica para administrar el polipéptido a las células diana. Por ejemplo, las células diana pueden ponerse en contacto con el polipéptido en una placa, tubo u otro recipiente para el cultivo de tejidos. El polipéptido se puede suspender en los medios y añadir a los pocillos de una placa, tubo u otro recipiente de cultivo. El medio que contiene el polipéptido se puede añadir antes de sembrar las células o después de que se hayan sembrado las células. Las células diana se incuban preferiblemente con el polipéptido durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir que el polipéptido entre en contacto con las células. Por ejemplo, las células se pueden incubar con el polipéptido durante aproximadamente 1 hora o más, aproximadamente 5 horas o más, aproximadamente 10 horas o más, aproximadamente 12 horas o más, aproximadamente 16 horas o más, aproxima­ damente 24 horas o más, aproximadamente 48 horas o más, de aproximadamente 1 hora a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 24 horas o de aproximadamente 24 horas a aproxima­ damente 48 horas. En cierto ejemplo, en donde el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe está en un virus, la puesta en contacto de las células diana comprende infectar las células con el virus.
Las células diana pueden ser de cualquier especie, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, ratones, ratas, conejos y cobayas. En algún ejemplo, las células diana son CDs obtenidas a partir de un sujeto sano o un sujeto que necesita tratamiento. En cierto ejemplo, las células diana son CDs obtenidas a partir de un sujeto en el que se desea estimular una respuesta inmunitaria frente al polipéptido. Los métodos para obtener células a partir de un sujeto son bien cono­ cidos en la técnica.
5.10 Composiciones
Los ácidos nucleicos de la invención, vectores de la invención, polipéptidos de la invención, bacterias, anticuerpos y/o células de la invención (a veces denominados en el presente documento "compuestos activos") pueden incorporarse a las composiciones. En una realización específica, las composiciones de la invención son composiciones farmacéu­ ticas, tales como una composición inmunogénica que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención (p. ej., formulaciones de vacunas). Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente do­ cumento pueden estar en cualquier forma que permita que la composición se administre a un sujeto. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para una administración veterinaria y/o humana. Las composiciones pueden usarse en métodos para prevenir o tratar una enfermedad debida al virus de la gripe.
En una realización, la composición farmacéutica * comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), mezclado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención comprende el ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, codifica además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), en una mezcla por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención comprende un vector de expresión de la invención que comprende el ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, codifica además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), en una mezcla por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención comprende el virus de la gripe o el virus que no es de la gripe de la invención que contiene el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, contiene además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente docu­ mento (p. ej., el polipéptido de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), en una mezcla por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica de la in­ vención comprende el virus de la gripe o el virus que no es de la gripe de la invención que tiene un genoma diseñado para expresar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, expresa además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., un poli­ péptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), mezclado por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención comprende la partícula similar a un virus de la invención o virosoma que contiene el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, que contiene además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (p. ej., el polipéptido de la hemaglutinina (HA) descrito en la Sección 5.1), en una mezcla por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farma­ céutica de la invención comprende una bacteria que expresa o está modificada genéticamente para expresar el poli­ péptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, expresa además un polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), en una mezcla por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica de la invención comprende células estimuladas con el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente codifica además un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en la Sección 5.1), mezclado por adición con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una o más terapias ade­ más de una terapia que utiliza el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o indicado en la Farmacopea de EE.UU. u otras farmacopeas gene­ ralmente reconocidas para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra la composición farmacéutica. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como vehículos líquidos, particu­ larmente para soluciones inyectables. Los excipientes adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gela­ tina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. La formulación debe adaptarse al modo de administración.
En una realización específica, las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan para que sean adecuadas para la vía de administración prevista para un sujeto. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la invención se puede formular para que sea adecuada para una administración parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorrectal, intraperitoneal y rectal. En una realización específica, la composición farmacéutica de la invención puede formu­ larse para una administración intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica o pulmonar. En una realización específica, la composición farmacéutica de la in­ vención se formula para una administración intranasal. En otra realización específica, la composición farmacéutica de la invención se formula para administración intramuscular.
En ciertas realizaciones, pueden usarse polímeros biodegradables, tales como etilenvinilacetato, polianhídridos, polietilenglicol (PEGilación), polímeros de polimetilmetacrilato, polilactidas, poli(lactida-co-glicólidos), poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico) como vehículos. En algunas realizaciones, los compuestos activos se preparan con vehículos que aumentan la protección del compuesto contra una eliminación rápida del organismo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. También se pueden usar liposomas o micelas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 4.522.811. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención compren­ den uno o más adyuvantes.
En realizaciones específicas, las composiciones inmunogénicas de la invención son formulaciones monovalentes, por ejemplo, formulaciones monovalentes que comprenden el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención. También se describen en este documento composiciones inmunogénicas monovalentes que comprenden un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B descrito en este documento, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cHB/B descrito en este documento o un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 descrito en este documento.
En otros ejemplos específicos, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulacio­ nes multivalentes, por ejemplo, formulaciones bivalentes y trivalentes. En un ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un vector que expresa el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, una formulación multivalente comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además comprende uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos de virus de la gripe diferentes descritos en el presente documento, expresados usando un solo vector. En ciertas realizaciones, una formulación multivalente comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y comprende además diferentes polipéptidos de hemaglutinina quiméricos de virus de la gripe, en donde cada polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe comprende el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina de virus de la gripe y diferentes dominios del tallo de hemaglutinina de virus de la gripe. Los diferentes dominios del tallo de hemaglutinina de virus de la gripe pueden proceder de diferentes cepas, subtipos o grupos de virus de la gripe. Por ejemplo, una formulación bivalente puede comprender dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos de virus de la gripe, en donde los dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos de virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina de virus de la gripe y diferentes dominios del tallo de hemaglutinina de virus de la gripe de dos virus de la gripe diferentes. En otro ejemplo, una formulación trivalente puede comprender tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos de virus de la gripe en donde los tres polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos de virus de la gripe comprenden los mismos dominios de la cabeza globular de hemaglutinina de virus de la gripe y diferentes dominios del tallo de hemaglutinina de virus de la gripe procedentes de tres virus de la gripe diferentes. En realizaciones específicas, una formulación de vacuna bivalente proporcionada en este documento comprende una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento; o una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en el presente documento. En realizaciones específicas, una formulación de vacuna trivalente proporcionada en este documento comprende (i) una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento y o bien un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1, uno cH7/b o uno cB/B descrito en este documento; o (ii) una combinación de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en el presente documento y o bien un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1, uno cH7/b o uno cB/B descrito en este documento. En ciertas realizaciones, un polipéptido HA bivalente o el quimérico de la inven­ ción del virus de la gripe comprende además una formulación de vacuna trivalente que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y comprende además un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 descrito en el presente documento.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente un agente con­ servante, por ejemplo, timerosal derivado de mercurio. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden de 0,001% a 0,01% de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden un agente conservante. En una realización específica, el timerosal se usa durante la preparación de una composición farmacéutica de la invención y el timerosal se elimina mediante etapas de purificación posteriores a la producción de la composición farmacéutica, es decir, la composición farmacéutica contiene cantidades traza de timerosal (<0,3 pg de mercurio por dosis después de la purificación; esas composiciones farmacéuticas se consideran productos exentos de timerosal).
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden además proteína de huevo (p. ej., ovoalbúmina u otras proteínas de huevo). La cantidad de proteína de huevo en las composiciones far­ macéuticas de la invención puede oscilar entre aproximadamente 0,0005 y aproximadamente 1,2 pg de proteína de huevo por 1 ml de composición farmacéutica. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden proteína de huevo.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente uno o más agentes antimicrobianos (p. ej., antibióticos) que incluyen, entre otros, gentamicina, neomicina, polimixina (p. ej., polimixina B) y kanamicina, estreptomicina. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden ningún antibiótico.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente uno o más componentes usados para inactivar un virus, por ejemplo, formalina o formaldehído o un detergente tal como desoxicolato de sodio, octoxinol 9 (Triton X-100) y octoxinol 10. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden ningún componente utilizado para inactivar un virus.
En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente gela­ tina. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden gelatina.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente uno o más tampones, por ejemplo, tampón fosfato y tampón glutamato fosfato de sacarosa. En otras realizaciones, las composi­ ciones farmacéuticas de la invención no comprenden tampones.
En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden adicionalmente una o más sales, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, glutamato monosódico y sales de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de aluminio y potasio) o una mezcla de tales sales de aluminio). En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención no comprenden sales.
En realizaciones específicas, las composiciones farmacéuticas de la invención son vacunas contra el virus de la gripe con bajo contenido en aditivos, es decir, la composición farmacéutica de la invención no comprende uno o más aditivos que se encuentran comúnmente en las vacunas contra el virus de la gripe. Se han descrito vacunas antigripales con pocos aditivos (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/IB2008/002238 publicado como Publicación Internacional n° WO 09/001217).
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en este documento se pueden incluir en un envase, paquete o dispensador junto con las instrucciones para la administración.
Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento se pueden almacenar antes del uso, por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se pueden almacenar congeladas (por ejemplo, a aproximadamente -20°C o a aproximadamente -70°C); almacenar en condiciones de refrigeración (por ejemplo, a aproximadamente 4°C); o almacenar a temperatura ambiente (véase el documento de Solicitud Internacional n° PCT/IB2007/001149 publicada como Publicación Internacional n° WO 07/110776, para los métodos de almacenamiento de composiciones que com­ prenden vacunas antigripales sin refrigeración).
En ciertas realizaciones, cuando el compuesto activo en la composición farmacéutica de la invención es una célula diseñada para expresar el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, las células en la composición farmacéutica no son células de mamífero (por ejemplo, células CB-1).
5.10.1 Vacunas de subunidades
En una realización específica, en el presente documento se proporcionan vacunas de subunidades que comprenden el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En algunas realizaciones, una subunidad comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y comprende además un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en el presente documento y una o más glicoproteínas de superficie (p. ej., neuraminidasa del virus de la gripe), otros restos para direccionamiento o adyuvantes. En realizaciones específicas, una vacuna de subunidades comprende el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En otras realizaciones, una vacuna de subunidades comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además comprende dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el presente documento. En ejemplos específicos, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe utilizados en una vacuna de subunidades, no están unidos a la membrana, es decir, son solubles.
Las vacunas de subunidades proporcionadas en el presente documento comprenden una cantidad eficaz del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, las vacunas de subunidades proporcionadas en este documento comprenden aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 pg del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento. En ciertas realizaciones, las vacunas de subunidades proporcionadas en este documento comprenden aproximadamente de 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140 o 140-150 pg del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente uno o más polipéptidos quiméricos de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descritos en este documento.
En una realización específica, una vacuna de subunidades monovalente proporcionada en el presente documento comprende entre 7,5 pg y 90 pg del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En otra realización específica, una vacuna de subunidades bivalente proporcionada en el presente documento com­ prende entre 7,5 pg y 90 pg de un primer polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) de la gripe, es decir, el polipép­ tido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y entre 7,5 pg y 90 pg de un segundo polipéptido de hemagluti­ nina (HA) quimérico del virus de la gripe. En otra realización específica, una vacuna de subunidades trivalente propor­ cionada en el presente documento comprende entre 7,5 pg y 90 pg de una primera hemaglutinina quimérica del virus de la gripe, es decir, el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, es decir, el polipéptido (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, entre 7,5 pg y 90 pg de un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, y entre 7,5 pg y 90 pg de un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe.
En ciertas realizaciones, se proporcionan en el presente documento vacunas de subunidades que comprenden de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 60 pg del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y, opcionalmente, uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en el pre­ sente documento, aproximadamente del 0,001% al 0,01% de timerosal, de aproximadamente 0,1 pg a aproximada­ mente 1,0 pg de proteína de huevo de gallina, de aproximadamente 1,0 pg a aproximadamente 5,0 pg de polimixina, de aproximadamente 1,0 pg a aproximadamente 5,0 pg de neomicina, de aproximadamente 0,1 pg a aproximada­ mente 0,5 pg de betapropiolactona y de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 0,05% de p/v de etoxilato de nonilfenol por cada dosis.
En una realización específica, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento comprende o consiste en una dosis de 0,5 ml que comprende 45 pg del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, < 1,0 pg de mercurio (procedente de timerosal), < 1,0 pg de proteína de huevo de gallina (es decir, ovoalbúmina), < 3,75 pg de polimixina y < 2,5 pg de neomicina. En algunas realizaciones, una vacuna de subuni­ dades proporcionada en el presente documento comprende adicionalmente o consiste en no más de 0,5 pg de be­ tapropiolactona y no más del 0,015% de p/v de etoxilato de nonilfenol por dosis. En algunas realizaciones, la vacuna de subunidades en dosis de 0,5 ml de la invención, se envasa en una jeringa precargada.
En una realización específica, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento consiste en un vial multidosis de 5,0 ml (0,5 ml por dosis) que comprende 45 pg del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, 25,0 pg de mercurio (procedente de timerosal), < 1,0 pg de proteína de huevo de gallina (es decir, ovoalbúmina), < 3,75 pg de polimixina y < 2,5 pg de neomicina. En algunas realizaciones, una vacuna de subunidades proporcionada en el presente documento comprende adicionalmente o consiste en no más de 0,5 pg de betapropiolactona y no más del 0,015% de p/v de etoxilato de nonilfenol por dosis.
En una realización específica, la vacuna de subunidades de la invención se prepara utilizando el virus de la gripe que se ha multiplicado en huevos de pollo embrionados (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención) se aíslan a partir de un virus que se ha multiplicado en huevos de gallina embrionados). En otro ejemplo, la vacuna de subunidades se prepara usando un virus de la gripe que no se ha multiplicado en huevos de pollo embrionados (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento) se aíslan a partir de virus que no se han multiplicado en huevos de gallina embrionados). En otra realiza­ ción específica, la vacuna de subunidades de la invención se prepara utilizando el virus de la gripe que se ha multipli­ cado en células de mamíferos, por ejemplo, células humanas inmortalizadas (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/EP2006/067566 publicada como Publicación Internacional n° WO 07/045674), células de riñón canino, tales como células MDCK (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional n° Wo 08/032219), células Vero, células PerC.6 o cé­ lulas de pato tales como células EB66 (es decir, los componentes de la vacuna de subunidades (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención) se aíslan a partir de virus que se han multiplicado en células de mamífero). En otra realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe en las vacunas de subunidades proporcionadas en el presente documento, se preparan usando un vector de expresión, p. ej., un vector vírico, un vector vegetal o un vector bacteriano (es decir, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe en la vacuna de subunidades se obtiene/aísla a partir de un vector de expre­ sión).
En el presente documento se describe una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna de subunidades monovalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (por ejemplo, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 proporcionado en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subuni­ dades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en la Sección 5.1). También se describe una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico es una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/1 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe B/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico es una vacuna de subunidades monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH4/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 descrito en la Sección 5.1).
En el presente documento se proporcionan vacunas de subunidades bivalentes que comprenden el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona una vacuna de subunidades bivalente que comprende dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, en donde los dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los dos polipéptidos de hemaglu­ tinina quiméricos del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe diferente procedente de dos virus de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe son de dos cepas, subtipos o grupos de gripe diferentes. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otro ejemplo específico, es una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, es una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, es una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subunidades bivalente que com­ prende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
También se describe en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico descrito en el presente documento, es una vacuna de subunidades bivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En otro ejemplo específico en el presente documento se describe una vacuna de subunidades bivalente que com­ prende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B y un polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe cB/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades bivalente que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico cH4/3 descrito en el presente documento.
En el presente documento se describen vacunas de subunidades trivalentes que comprenden virus que contienen y/o comprenden un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento. En ciertos ejemplos en el presente documento, se proporciona una vacuna de subunidades trivalente que comprende tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, en donde los tres poli­ péptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los tres polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe diferente, procedente de tres virus de la gripe diferentes. En ciertos ejemplos, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe proceden de tres cepas, subtipos o grupos de virus de la gripe diferentes. En una realización específica, se proporciona en este documento una vacuna de subunidades trivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se proporciona en este documento una vacuna de subunidades trivalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en este documento una vacuna de subunidades trivalente que comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de subunidades trivalente que ejemplo, células humanas inmortalizadas (véanse, por ejemplo, los documentos de Solicitud Internacional n° PCT/EP2006/067566 publicada como Publicación Internacional n° WO 07/045674), células de riñón canino, tales como células MDCK (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional n° WO 08/032219), células Vero, células PerC.6 o células de pato tales como células EB66 antes de su uso en la composición inmunogénica de la invención.
Puede preferirse una composición inmunogénica que comprende un virus vivo para administrar a un sujeto porque la multiplicación del virus en el sujeto puede conducir a un estímulo prolongado de un tipo y magnitud similar al que ocurre en las infecciones naturales y, por lo tanto, conferir una inmunidad sustancial y duradera.
En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo monovalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (por ejemplo, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 proporcionado en la Sección 5.1). En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, en este documento se describe una vacuna de virus vivo que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, en este documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un virus que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, en este documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un virus que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/1 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, en este documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un virus que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe B/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, en el presente documento se describe una vacuna de virus vivo monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica una hemaglutinina quimérica del virus de la gripe cH4/3.
En el presente documento se proporcionan vacunas de virus vivos bivalentes que comprenden virus de la invención que contienen y/o comprenden un genoma que codifica el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, en donde los dos polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina del virus de la gripe procedente de un virus de la gripe y cada uno de los dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprende un dominio diferente del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe procedente de dos virus de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, los dominios del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe proceden de dos cepas, subtipos o grupos de gripe diferentes. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que com­ prende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la inven­ ción y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de la hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de la hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En otro ejemplo específico, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
También se proporcionan en el presente documento vacunas de virus vivos trivalentes que comprenden virus que contienen y/o comprenden un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporciona una vacuna de virus vivo trivalente que comprende tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención, en donde los tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina del virus de la gripe procedente de un virus de la gripe y cada uno de los tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprende un dominio diferente del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe procedente de tres virus de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, los dominios del tallo de la hemaglutinina del virus de la gripe proceden de tres cepas, subti­ pos o grupos de virus de la gripe diferentes. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que com­ prende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En ciertas realizaciones, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus vivo trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma en el que el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
En una realización específica, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe que forma parte de una vacuna de virus vivo se encuentra y/o se expresa en la superficie del virus vivo (p. ej., la superficie del virus de la gripe vivo).
En un ejemplo específico, una vacuna de virus vivo proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otro ejemplo específico, una vacuna de virus vivo proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un ge­ noma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
En un ejemplo específico, una vacuna de virus vivo proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otro ejemplo específico, una vacuna de virus vivo proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
5.10.3 Vacunas de virus inactivados
En el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas (por ejemplo, vacunas) que comprenden un virus inactivado que contiene el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En realizaciones específicas, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe está unido a una membrana. En realizaciones particulares, el virus inactivado de la invención es un virus de la gripe, tal como se ha descrito en la Sección 5.4, anterior. En otras realizaciones, el virus inactivado de la invención es un virus que no es de la gripe, tal como se ha descrito en la Sección 5.5, anterior. En algunas realizaciones, la composición inmunogénica de la invención comprende dos, tres, cuatro o más virus inactivados que contienen el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que además contienen dos, tres, cuatro o más polipéptidos hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe diferentes, descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, las composi­ ciones inmunogénicas de virus inactivados de la invención comprenden uno o más adyuvantes.
Pueden usarse técnicas conocidas por un experto en la técnica para inactivar virus que contienen un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. Los métodos comunes usan formalina, calor o detergente para la inactivación. Véase, p. ej., el documento de patente de EE.UU. n° 6.635.246. Otros métodos incluyen los descritos en los documentos de patente de EE.UU. n° 5.891.705; 5.106.619 y 4.693.981.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) que comprenden un virus de la gripe inactivado de manera que cada dosis de la composición inmunogé­ nica comprende de aproximadamente 7,5 gg a aproximadamente 90 gg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 gg del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de cloruro de sodio, de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 gg de fosfato de sodio monobásico, de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 gg de fosfato dibásico de sodio, de aproxima­ damente 5 a aproximadamente 30 gg de fosfato de potasio monobásico, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 gg de cloruro de potasio y de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 gg de cloruro de calcio. En algunas de las realizaciones de la invención, las composiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) se envasan como dosis únicas de 0,25 ml o dosis únicas de 0,5 ml de la invención. En otras realizaciones, las composiciones inmuno­ génicas de la invención (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis.
En ciertas realizaciones, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) que comprenden un virus de la gripe inactivado de manera que cada dosis de la composición inmunogé­ nica comprende de aproximadamente 7,5 gg a aproximadamente 90 gg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 60 gg, del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, de aproximadamente 0,001% a 0,01% de timerosal, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 5,0 mg de cloruro de sodio, de aproxima­ damente 20 a aproximadamente 100 gg de fosfato de sodio monobásico, de aproximadamente 100 a aproximada­ mente 500 gg de fosfato dibásico de sodio, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 gg de fosfato de potasio monobásico, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 pg de cloruro de potasio y de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 pg de cloruro de calcio por dosis. En algunas realizaciones, las composiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) se envasan en dosis únicas de 0,25 ml o de 0,5 ml. En otras realizaciones, las com­ posiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) proporcionadas en el presente do­ cumento se envasan en dosis únicas de 0,25 ml y comprenden 22,5 pg del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, 2,05 mg de cloruro de sodio, 40 pg de fosfato de sodio monobásico, 150 pg de fosfato de sodio dibásico, 10 pg de fosfato de potasio monobásico, 10 pg de cloruro de potasio y 0,75 pg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas (p. ej., vacunas) proporcionadas en el presente do­ cumento se envasan en dosis únicas de 0,5 ml y comprenden 45 pg del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, 4,1 mg de cloruro de sodio, 80 pg de fosfato de sodio monobásico, 300 pg de fosfato de sodio dibásico, 20 pg de monobásico fosfato de potasio, 20 pg de cloruro de potasio y 1,5 pg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, las composiciones inmunogénicas de la invención (p. ej., vacunas) se envasan como formulaciones multidosis que comprenden o consisten en 5,0 ml de vacuna (0,5 ml por dosis) y comprenden 24,5 pg de mercurio (de timerosal), 45 pg del polipéptido quimérico hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, 4,1 mg de cloruro de sodio, 80 pg de fosfato de sodio monobásico, 300 pg de fosfato de sodio dibásico, 20 pg de fosfato de potasio monobásico, 20 pg de cloruro de potasio y 1,5 pg de cloruro de calcio por dosis.
En una realización específica, el virus inactivado de la invención que contiene el polipéptido quimérico de hemagluti­ nina (HA) del virus de la gripe de la invención se multiplica en huevos embrionados de pollo antes de su inactivación y posterior uso en la composición inmunogénica de la invención. En otro ejemplo específico, el virus inactivado que contiene un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, no se mul­ tiplica en huevos de pollo embrionados antes de su inactivación y posterior uso en una composición inmunogénica descrita en este documento. En otra realización específica, el virus inactivado que contiene el polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, se multiplica en células de mamífero, por ejemplo, células humanas inmortalizadas (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/EP2006/067566 publi­ cada como Publicación Internacional n° WO 07/045674), células de riñón canino, tales como células MDCK (véase, por ejemplo, el documento de Solicitud Internacional n° PCT/IB2007/003536 publicada como Publicación Internacional n° WO 08/032219), células Vero, células PerC.6 o células de pato tales como células EB66 antes de su inactivación y posterior uso en la composición inmunogénica de la invención.
En el presente documento se describe una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (por ejemplo, el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 proporcionado en Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado mono­ valente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/1 descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B descrito en la Sección 5.1). En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado monovalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 descrito en la Sección 5.1).
En este documento se describen vacunas de virus inactivados bivalentes que comprenden virus que contienen y/o comprenden un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento. En ciertos ejemplos, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, en donde los dos polipéptidos de he­ maglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe de dos virus de la gripe diferentes. En ciertas realizaciones, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe proceden de dos cepas, subtipos o grupos de virus de la gripe diferentes. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otra realización específica, se pro­ porciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o com­ prende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En otra realización específica, se proporciona en este documento una vacuna de virus inactivado bivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimé­ rico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
En el presente documento se proporcionan vacunas de virus inactivados trivalentes que comprenden virus de la in­ vención que contienen y/o comprenden un genoma que codifica el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En ciertos ejemplos, se describe en este documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, en donde los tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los tres polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe procedente de tres virus de la gripe diferentes. En ciertos ejemplos, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe proceden de tres cepas, subtipos o grupos de virus de la gripe diferentes. En una realización específica, en el presente docu­ mento se proporciona una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende un virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemagluti­ nina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización espe­ cífica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende el virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende el virus de la invención que con­ tiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus inactivado trivalente que comprende un virus de la invención que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
En una realización específica, un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe que forma parte de una vacuna de virus inactivado se encuentra y/o se expresa en la superficie del virus inactivado (p. ej., la superficie de un virus de la gripe inactivado).
En un ejemplo específico, una vacuna de virus inactivado proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otro ejemplo específico, una vacuna de virus inactivado proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
En un ejemplo específico, una vacuna de virus inactivado proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otro ejemplo específico, una vacuna de virus inactivado proporcionada en este documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
5.10.4 Vacunas de virus fraccionado
En una realización, la composición inmunogénica de la invención que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención es una vacuna de virus fraccionado. En algunas realizaciones, la vacuna de virus fraccionado contiene el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y además con­ tiene dos, tres, cuatro o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe diferentes descritos en el presente documento. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe está/estaba unido a la membrana. En ciertas realizaciones, las vacunas de virus fraccionado comprenden uno o más adyuvantes.
bivalente que comprende dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, en donde los dos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los dos polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos del virus de la gripe comprende un dominio diferente del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe procedente de dos virus de la gripe diferentes. En ciertos ejemplos, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe proceden de dos cepas, subtipos o grupos de gripe diferentes. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado bi­ valente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o com­ prende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus frac­ cionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un ge­ noma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 y un virus que contiene y/o comprende un ge­ noma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otro ejemplo específico, se describe en este documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En el presente documento se describe una vacuna de virus fraccionado bivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna bivalente de virus fraccionado que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y codifica además un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
En realizaciones específicas, en el presente documento se proporcionan vacunas de virus fraccionado trivalentes que comprenden los virus que contienen y/o comprenden un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertos ejemplos, se describe en este documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, en donde los tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprenden el mismo dominio de la cabeza globular de hemaglutinina del virus de la gripe de un virus de la gripe y cada uno de los tres polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe comprende un dominio diferente del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe procedente de tres virus de la gripe diferentes. En ciertos ejemplos, los dominios del tallo de hemaglutinina del virus de la gripe proceden de tres cepas, subtipos o grupos de virus de la gripe diferentes. En una realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglu­ tinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3, y un virus que contiene y/o com­ prende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B.
En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B. En otro ejemplo específico, se describe en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 del virus de la gripe, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención, un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3, y un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cB/B. En otra realización específica, se proporciona en el presente documento una vacuna de virus fraccionado trivalente que comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3.
En un ejemplo específico, una vacuna de virus fraccionado proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/Vietnam/1203/2004 (H5). En otro ejemplo espe­ cífico, una vacuna de virus fraccionado proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
En un ejemplo específico, una vacuna de virus fraccionado proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio de la cabeza globular de A/mallard/Alberta/24/2001 (H7). En otro ejemplo específico, una vacuna de virus fraccionado proporcionada en el presente documento no comprende un virus que contiene y/o comprende un genoma que codifica un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 que comprende el dominio del tallo de A/Perth/16/2009 (H3).
5.10.5 Adyuvantes
En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden, o se administran en combinación con, un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición descrita en el presente docu­ mento puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición proporcionada en el presente documento, aumenta, mejora y/o refuerza la respuesta inmunitaria frente al polipéptido quimérico hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, pero cuando el compuesto se administra solo, no genera una respuesta inmune frente al polipéptido. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmune frente al polipéptido de la invención y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvan­ tes pueden potenciar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen, por ejemplo, el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de linfocitos B y/o T y la estimulación de macrófagos.
En ciertas realizaciones, un adyuvante aumenta la respuesta intrínseca frente al polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención sin causar cambios conformacionales en el polipéptido que afecten a la forma cualitativa de la respuesta. Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, sin limitación, sales de aluminio (alumbre) (como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A 3 De-O-acilado (MPL) (véase el documento GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase el documento de Solicitud Interna­ cional n° PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional n° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase el documento de Solicitud Internacional n° PCT/US2007/064858, publicado como Publicación Internacional n° WO2007/109813), Matrix-M (iscanova), MVA (the Jenner Institute, Oxford), ISCOMATRIX (CSL Beh­ ring), AddaVax (Invivogen), poliI:C (Invivogen), horquilla de ARN transcrita in vitro a partir del ARN de interferencia defectuoso del virus Sendai, cepa Cantell y saponinas como QS21 (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (compiladores Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); véase el documento de patente de EE.Uu. n° 5,057,540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con inmunoestimulantes, como el monofosforil lípido A (véase, Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998). Esos adyuvantes se pueden usar con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, como MPL o 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos o monoméricos, como poli(ácido glutámico) o polilisina, u otros agentes inmunopotenciadores descritos en la Sección 5.4, anterior. En otra realización, el adyuvante es un adyuvante físico, como microagujas y parches de microagujas. En otra reali­ zación, el adyuvante es una molécula estimulante del receptor de tipo Toll (TLR) tal como flagelina (Mc Sorley et al., 2002. J. Immunol. 169:3914-3919). Debe entenderse que diferentes formulaciones de polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento pueden comprender diferentes adyuvantes o pueden comprender el mismo adyuvante.
5.11 Usos profilácticos y terapéuticos
En el presente documento se describen métodos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto utilizando un compuesto activo (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que con­ tiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o una composición (p. ej., formulación de vacuna) descrita en el presente documento. En una realización específica, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o una composición inmunogénica del mismo (por ejemplo, una formulación de vacuna del mismo). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un ácido nucleico de la invención que codifica el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y que codifica opcionalmente un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un vector vírico que contiene o expresa el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente que contiene o expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización adicional, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de células estimu­ ladas con el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o una composición farmacéutica del mismo. En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención usado en el método es un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe purificado de la invención obtenido a partir de una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de insecto.
En una realización específica, un método para inducir una respuesta inmunitaria frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades proporcionada en este documento (véase la Sección 5.10.1). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, com­ prende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus vivo proporcionada en este documento (véase la Sección 5.10.2). En realizaciones particulares, la vacuna de virus vivo comprende un virus atenuado. En otra realiza­ ción, un método para inducir una respuesta inmunitaria frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus inactivado propor­ cionada en este documento (véase la Sección 5.10.3). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende admi­ nistrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de virus fraccionado proporcionada en este documento (véase la Sec­ ción 5.10.4). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de partículas similares a virus proporcionada en este documento (véase la Sección 5.6). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmune frente al polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe de la invención com­ prende administrar a un sujeto que lo necesita un virosoma descrito en este documento (véase la Sección 5.6). En otra realización, un método para inducir una respuesta inmunitaria frente al polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe de la invención, comprende administrar a un sujeto que lo necesita una bacteria que expresa o está modi­ ficada para expresar el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe proporcionado en el presente documento o una composición del mismo (véase la Sección 5.7). En ciertas realizaciones, el polipéptido de hemaglu­ tinina (HA) quimérico del virus de la gripe proporcionado en este documento, utilizado en el método es un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe purificado proporcionado en el presente documento, obtenido a partir de una célula de mamífero, una célula vegetal o una célula de insecto.
La respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o una composición (p. ej., formulación de vacuna) descrita en el presente documento, puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por cualquier subtipo o cepa del virus de la gripe. En algunos ejemplos, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (p. ej., formulación de vacuna) descrita en el presente documento, es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por una o más cepas dentro del mismo subtipo de virus de la gripe. En algunos ejemplos, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) descrita en el presente docu­ mento, es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por múltiples cepas del mismo subtipo de virus de la gripe.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición de la invención (p. ej., formulación de vacuna), es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por los (i) subtipos H1N1 y H1N2; (ii) subtipos H1N1 y H3N1; (iii) subtipos H1N2 y H3N2; y/o (iv) cualquiera de las combinaciones de (i)-(iii) y el virus de la gripe B.
La respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de va­ cuna) descrita en el presente documento puede ser eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por un subtipo de virus de la gripe que pertenece a un grupo de HA (por ejemplo, el Grupo 1, que comprende H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 y H18) y no pertenece al otro grupo de HA (por ejemplo, el Grupo 2, que comprende H3, H4, H7, H10, H14 y H15). Por ejemplo, la respuesta inmune inducida puede ser efectiva para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por un virus de la gripe que pertenece al grupo de HA que consiste en H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 y/o H2. Alternativamente, la respuesta inmune inducida puede ser efectiva para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por un virus de la gripe que pertenece al grupo de HA que consiste en H3, H4, H14, H10, H15 y/o H7. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (p. ej., formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por uno, dos, tres, cuatro o cinco subtipos de virus de la gripe. En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince subtipos de virus de la gripe. En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por una, dos o más cepas de un virus de la gripe que pertenece al grupo H1 de HA y/o una, dos o más cepas de un virus de la gripe que pertenece al grupo H2 de HA. En otra realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por una, dos o más cepas de un virus de la gripe que pertenecen al grupo H1 de HA; una, dos o más cepas de un virus de la gripe que pertenecen al grupo H3 de HA; y/o una, dos o más cepas del virus de la gripe B.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con es polipéptido) o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención, es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por ambos subtipos H1N1 y H2N2. En otras realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención, no es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por ambos subtipos H1N1 y H2N2. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por los subtipos H1N1, H2N2 y H3N2. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (p. ej., una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por los subtipos H3N2. En otros ejemplos, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) descrita en el presente documento, no es eficaz para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe causada por los subtipos H3N2.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe causada por un subtipo de virus de la gripe que pertenece a un grupo de HA y no al otro grupo de HA. Por ejemplo, la respuesta inmune inducida puede ser efectiva para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la gripe causada por un virus de la gripe que pertenece al grupo de HA que consiste en H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 y/o H2. Alternativamente, la respuesta inmune inducida puede ser efectiva para prevenir y/o tratar una enfermedad del virus de la gripe causada por un virus de la gripe que pertenece al grupo de HA que consiste en H3, H4, H14, H10, H15 y/o H7. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (p. ej., una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe causada por cualquiera de uno, dos, tres, cuatro o cinco subtipos del virus de la gripe. En determinadas realiza­ ciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe causada por cualquiera de seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o quince subtipos del virus de la gripe. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (p. ej., una for­ mulación de vacuna) de la invención es eficaz para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe causada por una o más cepas dentro del mismo subtipo de virus de la gripe.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención, es eficaz para reducir los síntomas resultantes de una enfermedad/infección con el virus de la gripe. Los síntomas de una enfermedad/infección con el virus de la gripe incluyen, pero no se limitan a, dolores corporales (especialmente en las articulaciones y la garganta), fiebre, náuseas, dolores de cabeza, ojos irritados, fatiga, dolor de garganta, ojos o piel enrojecidos y dolor abdominal.
En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención, es eficaz para reducir la hospitalización de un sujeto que padece una enfermedad por el virus de la gripe/infección. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un compuesto activo o una composición (por ejemplo, una formulación de vacuna) de la invención es eficaz para reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que padece una enfermedad/infección con el virus de la gripe.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una infección con el virus de la gripe en un sujeto, utilizando un compuesto activo (por ejemplo, el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o una composición (p. ej., formulación de vacuna) de la invención. En una realización, un método para prevenir o tratar una infección con el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector que contiene o expresa ese polipéptido o una composición de uno cualquiera de los anteriores. En una realización específica, un método para prevenir o tratar una infección con el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades, una vacuna de virus vivo, una vacuna de virus inactivado, una vacuna de virus fraccionado o una vacuna de partículas similares a virus de la invención.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto que utiliza el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido o una composición (p. ej., formulación de vacuna) proporcionada en el presente do­ cumento. En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz del ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención o una composición inmunogénica del mismo. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un vector vírico que contiene o expresa el polipéptido quimérico de hemagluti­ nina (HA) del virus de la gripe de la invención o una composición inmunogénica del mismo. En otro ejemplo adicional, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o una composición farmacéutica del mismo.
En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de subunidades de la invención. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una vacuna de virus vivo de la invención. En realizaciones particulares, la vacuna de virus vivo comprende un virus atenuado. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una vacuna de virus inactivado de la invención. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una vacuna de virus fraccionado de la invención. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe comprende administrar a un sujeto que lo necesita una vacuna de partículas similares a virus de la invención. En otro ejemplo, un método para prevenir o tratar una enferme­ dad por el virus de la gripe en un sujeto, comprende administrar a un sujeto que lo necesita un virosoma descrito en el presente documento. En otra realización, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesita una bacteria que expresa o está modificada para expresar el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención o una composición del mismo.
En una realización específica, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar una vacuna multivalente (p. ej., una vacuna bivalente o trivalente) a un sujeto, en donde la vacuna multivalente comprende dos o más polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención. En ciertas realizaciones, una segunda vacuna multivalente (p. ej., una vacuna bivalente o trivalente) se administra al sujeto como refuerzo, en donde la segunda vacuna multivalente comprende dos o más polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, y en donde la segunda vacuna multivalente es diferente de la primera vacuna multivalente. En una realización específica, los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe de la segunda vacuna multivalente difieren de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe de la primera vacuna multivalente, con respecto a los dominios de la cabeza globular de la hemaglutinina de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe. En ciertas realizaciones, los dominios del tallo de la hemaglutinina de los polipéptidos de hemaglutinina quimé­ ricos del virus de la gripe de la segunda vacuna multivalente son los mismos que los dominios del tallo de la hemaglu­ tinina de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe de la primera vacuna multivalente.
En el presente documento se describen métodos para prevenir y/o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto mediante la administración de anticuerpos neutralizantes descritos en el presente documento (véase la Sec­ ción 5.9). En un ejemplo específico, un método para prevenir o tratar una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de un anticuerpo neutralizante descrito en el presente documento o una composición farmacéutica del mismo. En ejemplos particulares, el anticuerpo neutra­ lizante es un anticuerpo monoclonal. En ciertos ejemplos, el anticuerpo neutralizante no es CR8114, CR8020 (Ekiert et al., 2011. Science. 333(6044): 843-850), FI6 (Corti et al., 2011. Science. 333(6044) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669), los mAbs 3A2, 10C4 o 5A7 del tallo del virus de la gripe B (Yasugi et al., 2013. PLoS Pathog. 9(2): e1003150), CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (FERM BP-4517), AI3C (Fe RM BP-4516) o cualquier otro anticuerpo descrito en Ekiert DC et al. (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicado en Science Express el 26 de febrero de 2009); Kashyap et al. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Sui et al. (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273; los documentos de patente de EE.UU. n° 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070 y 6.720.409; Solicitud Internacional n° PCT/US2007/068983 publicada como Publicación Internacional n° WO 2007/134237; Solici­ tud Internacional n° PCT/US2008/075998 publicada como Publicación Internacional n° WO 2009/036157; Solicitud Internacional n° PCT/EP2007/059356 publicada como Publicación Internacional n° WO 2008/028946; y Solicitud In­ ternacional n° PCT/US2008/085876 publicada como Publicación Internacional n° WO 2009/079259. En otras realiza­ ciones, el anticuerpo neutralizante no es un anticuerpo descrito en Wang et al. (2010) "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9.
En ciertas realizaciones, los métodos para prevenir o tratar una enfermedad o infección con el virus de la gripe en un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un animal no humano) proporcionados en el presente documento, dan como resultado una reducción de la replicación del virus de la gripe en el sujeto, medida por ensayos in vivo e in vitro conocidos por los expertos en la técnica y descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la replicación del virus de la gripe se reduce en aproximadamente 1 magnitud logarítmica o más, aproximadamente 2 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 3 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 4 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 5 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 6 magnitudes logarítmicas o más, apro­ ximadamente 7 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 8 magnitudes logarítmicas o más, aproximada­ mente 9 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 10 magnitudes logarítmicas o más, de 1 a 3 magnitudes logarítmicas, de 1 a 5 magnitudes logarítmicas, de 1 a 8 magnitudes logarítmicas, de 1 a 9 magnitudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 2 a 5 magnitudes logarítmicas, de 2 a 7 magnitudes logarítmicas, de 2 magni­ tudes logarítmicas a 8 magnitudes logarítmicas, de 2 a 9 magnitudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 3 a 5 magnitudes logarítmicas, de 3 a 7 magnitudes logarítmicas, de 3 a 8 magnitudes logarítmicas, de 3 a 9 magnitudes logarítmicas, de 4 a 6 magnitudes logarítmicas, de 4 a 8 magnitudes logarítmicas, de 4 a 9 magnitudes logarítmicas, de 5 a 6 magnitudes logarítmicas, de 5 a 7 magnitudes logarítmicas, de 5 a 8 magnitudes logarítmicas, de 5 a 9 magnitudes logarítmicas, de 6 a 7 magnitudes logarítmicas, de 6 a 8 magnitudes logarítmicas, de 6 a 9 magnitudes logarítmicas, de 7 a 8 magnitudes logarítmicas, de 7 a 9 magnitudes logarítmicas o de 8 a 9 magnitudes En algunas realizaciones, una terapia de combinación comprende una inmunización activa con el polipéptido HA qui­ mérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente con un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe descrito en el presente documento o uno o más vectores de expresión proporcionados en el presente documento y una inmunización pasiva con uno o más anticuerpos neutralizantes generados y/o identificados usando el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. En algunos ejemplos, una terapia de combinación comprende una inmunización con uno o más vectores de expresión descritos en este documento y la administración de células (p. ej., por transferencia adoptiva) estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento.
En algunas realizaciones, una terapia de combinación comprende la administración de dos o más vectores de expre­ sión diferentes descritos en este documento.
En algunos ejemplos, una terapia de combinación comprende una inmunización activa con un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) que induce una respuesta inmune frente a uno, dos, tres o más subtipos de HA en un grupo de HA (p. ej., el Grupo 1) en combinación con un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de hema­ glutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, un ácido nucleico que codifica ese polipép­ tido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) que induce una respuesta inmune frente a uno, dos, tres o más subtipos de HA en el otro grupo de HA (p. ej., el Grupo 2).
En algunas realizaciones, una terapia de combinación comprende una inmunización activa con dos o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, uno de los cuales es el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención.
5.11.2 Poblaciones de pacientes
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, puede administrarse a un sujeto sin tratamiento previo, es decir, un sujeto que no tiene una enfermedad causada por una infección con el virus de la gripe o que no ha estado ni está actualmente infectado con el virus de la gripe. En una realización, un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento se administra a un sujeto sin tratamiento previo que corre el riesgo de contraer una infección con el virus de la gripe. En una realización, un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente docu­ mento se administra a un sujeto que no tiene una enfermedad causada por el virus de la gripe específico o que no ha estado y no está infectado con el virus de la gripe específico frente al cual el polipéptido de hemaglutinina (HA) qui­ mérico del virus de la gripe de la invención induce una respuesta inmune. Un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento también se puede administrar a un sujeto que está y/o ha estado infectado con el virus de la gripe o de otro tipo, un subtipo o cepa del virus de la gripe frente a la que el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención induce una respuesta inmune.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, se administra a un paciente al que se ha diagnosticado una infección con el virus de la gripe. En algunas realizaciones, un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento se administra a un paciente infectado con un virus de la gripe antes de que los síntomas se manifiesten o los síntomas se vuelvan graves (p. ej., antes de que el paciente requiera una hospitalización). En algunas realizacio­ nes, un compuesto activo o una composición proporcionados en el presente documento se administran a un paciente que está infectado o al que se ha diagnosticado una infección con un tipo de virus de la gripe diferente al del virus de la gripe a partir del cual se ha obtenido el dominio de la cabeza del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérica del virus de la gripe de la invención del compuesto activo o composición.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, se administra a un paciente que puede estar o está infectado con un virus de la gripe que pertenece al mismo grupo de HA que el del dominio de la cabeza del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención. En determinadas realizaciones, un compuesto activo o una compo­ sición que se proporciona en el presente documento se administra a un paciente que puede estar o está infectado con un virus de la gripe del mismo subtipo que el del dominio de la cabeza del polipéptido hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención.
En algunas realizaciones, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un ave. En ciertas realizaciones, el animal es un perro. En ciertas realizaciones, el animal es un gato. En ciertas realizaciones, el animal es un caballo. En ciertas realizaciones, el animal es una vaca. En ciertas realizaciones, el animal es un mamífero, p. ej., caballo, cerdo, ratón o primate, preferiblemente un ser humano.
En ciertas realizaciones, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector fp. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es un adulto humano. En determinadas reali­ zaciones, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es un adulto humano de más de 50 años. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se va a admi­ nistrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es un sujeto humano de edad avanzada.
En ciertas realizaciones, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector fp. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es un niño humano. En determinadas realiza­ ciones, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento es un lactante humano. En determinadas realizaciones, un sujeto al que se administra un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, no es un lactante de menos de 6 meses de edad. En una realización específica, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es un ser humano de 2 años o más joven. En otra realización específica, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es un ser humano de 5 años o más joven. En otra realización específica, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es un ser humano de 1 a 5 años.
En realizaciones específicas, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo (es decir, el polipéptido quimé­ rico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector fp. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimu­ ladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es cualquier lactante o niño de más de 6 meses de edad y cualquier adulto de más de 50 años de edad. En otras realizaciones, el sujeto es una persona que está embarazada. En otra realización, el sujeto es una persona que puede estar o estará embarazada durante la temporada de la gripe (p. ej., generalmente, de noviembre a abril en el hemisferio norte). En realizaciones específicas, un sujeto al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, es una mujer que ha dado a luz, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas antes.
En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector fp. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es cualquier individuo con riesgo incrementado de infección con el virus de la gripe o una enfermedad resultante de la infección con el virus de la gripe (p. ej., una persona inmunocomprometida o inmunodeficiente). En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a admi­ nistrar un compuesto activo o una composición proporcionados en el presente documento, es cualquier individuo que está en estrecho contacto con un individuo con un riesgo incrementado de infección con el virus de la gripe o una enfermedad resultante de la infección con el virus de la gripe (p. ej., personas inmunocomprometidas o inmunosuprimidas).
En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector fp. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es un individuo afectado por cualquier afección que aumenta la susceptibilidad frente a una infección con el virus de la gripe o complicaciones o enfermedades resul­ tantes de una infección con el virus de la gripe. En otras realizaciones, un compuesto activo o una composición pro­ porcionada en el presente documento se administra a un sujeto, en el que una infección con el virus de la gripe tiene potencial para aumentar las complicaciones de otra afección que afecta al individuo o que tiene riesgo de padecer. En realizaciones particulares, tales afecciones que aumentan la susceptibilidad frente a complicaciones con el virus de la gripe o en las cuales el virus de la gripe aumenta las complicaciones asociadas con la afección, son, p. ej., afecciones que afectan los pulmones, como fibrosis quística, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfisema, asma o infecciones bacterianas (p. ej., infecciones causadas por Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila y Chlamydia trachomatus); enfermedad cardiovascular (por ejemplo, enfermedad cardíaca congénita, insuficiencia cardíaca congestiva y enfermedad de las arterias coronarias); trastornos endocrinos (p. ej., dia­ betes), afecciones neurológicas y del desarrollo de las neuronas (p. ej., trastornos del cerebro, la médula espinal, los nervios periféricos y los músculos (como parálisis cerebral, epilepsia (trastornos convulsivos), accidente cerebrovascular, discapacidad intelectual (p. ej., retraso mental), distrofia muscular y lesión de la médula espinal)).
En algunas realizaciones, al sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, es un individuo que reside en un hogar colectivo, tal como una residencia de ancianos. En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento trabaja o pasa una cantidad significativa de tiempo en un hogar colectivo, p. ej., una residencia de ancianos. En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente do­ cumento, es un trabajador en el campo de la salud (p. ej., un médico o una enfermera). En algunas realizaciones, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente do­ cumento, es fumador. En una realización específica, el sujeto humano al que se va a administrar un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento, está inmunocomprometido o inmunodeprimido.
Además, los sujetos con mayor riesgo de desarrollar complicaciones debido a una gripe a los que se puede administrar un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, incluyen: cualquier individuo que pueda transmitir los virus de la gripe a aquellos con alto riesgo de complicaciones, tales como, p. ej., miembros de hogares con personas de alto riesgo, incluidos hogares que inclui­ rán lactantes menores de 6 meses, personas que están en contacto con lactantes menores de 6 meses o personas que están en contacto con personas que viven en residencias de ancianos u otros centros de cuidado a largo plazo; personas con trastornos a largo plazo de los pulmones, el corazón o la circulación; personas con enfermedades metabólicas (p. ej., diabetes); personas con trastornos renales; personas con trastornos de la sangre (incluyendo anemia o enfermedad de células falciformes); personas con sistemas inmunitarios debilitados (incluida la inmunosupresión causada por medicamentos, enfermedades malignas como cáncer, trasplante de órganos o infección por VIH); niños que reciben una terapia con aspirina a largo plazo (y, por lo tanto, tienen una mayor probabilidad de desarrollar el síndrome de Reye si se infectan con el virus de la gripe).
En otras realizaciones, los sujetos para la administración de un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente, incluyen personas sanas de seis meses de edad o mayo­ res, que: planean viajar a países extranjeros y áreas en donde pueden estar surgiendo brotes de gripe, p. ej., como los trópicos y el hemisferio sur de abril a septiembre; viajar como parte de grandes grupos turísticos organizados que pueden incluir personas de áreas de la tierra en donde circulan los virus de la gripe; asistir a la escuela o la universidad y residir en dormitorios o residir en instalaciones institucionales; o desean reducir su riesgo de enfermar con la gripe.
En algunas realizaciones, un sujeto para el cual la administración de un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimé­ rico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimu­ ladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento, está contraindicada, incluye a cualquier persona para la que esté contraindicada una vacunación contra la gripe, como: lactantes menores de seis meses de edad; e individuos que han tenido una reacción anafiláctica (reacciones alérgicas que provocan dificultad para respirar, que a menudo va seguida de choque) frente a los huevos, productos derivados del huevo u otros com­ ponentes utilizados en la producción de la formulación inmunogénica. En ciertas realizaciones, cuando la administra­ ción de un compuesto activo o una composición proporcionada en el presente documento está contraindicada debido a uno o más componentes utilizados en la producción de la formulación inmunogénica (p. ej., debido a la presencia de huevo o productos derivados del huevo), el compuesto activo o composición puede ser producido de una manera que no incluya el componente que hace que la administración de un compuesto activo o composición esté contraindi­ cada (por ejemplo, el compuesto activo o composición puede ser producido sin el uso de huevos o productos derivados del huevo).
En algunas realizaciones, puede ser aconsejable no administrar una vacuna de virus vivo de la invención a una o más de las siguientes poblaciones de pacientes: personas de edad avanzada; lactantes menores de 6 meses; personas embarazadas; lactantes menores de 1 año; niños menores de 2 años; niños menores de 3 años; niños menores de 4 años; niños menores de 5 años; adultos menores de 20 años; adultos menores de 25 años; adultos menores de 30 años; adultos menores de 35 años; adultos menores de 40 años; adultos menores de 45 años; adultos menores de 50 años; seres humanos de edad avanzada mayores de 70 años; seres humanos mayores de 75 años; seres humanos mayores de 80 años; seres humanos mayores de 85 años; seres humanos mayores de 90 años; seres humanos de edad avanzada mayores de 95 años; niños y adolescentes (de 2 a 17 años de edad) que reciben aspirina o medica­ mentos que contienen aspirina, debido a las complicaciones asociadas con la aspirina y las infecciones por el virus de la gripe de tipo silvestre en ese grupo de edad; personas con antecedentes de asma u otras enfermedades reactivas de las vías respiratorias; personas con afecciones médicas subyacentes crónicas que pueden predisponerlas a infec­ ciones graves con el virus de la gripe; personas con antecedentes de síndrome de Guillain-Barré; personas con en­ fermedad grave aguda con fiebre; o personas que están moderada o gravemente enfermas. Para esos individuos, puede preferirse la administración de vacunas de virus inactivados, vacunas de virus fraccionado, vacunas de subuni­ dades, virosomas, partículas similares a virus o vectores no virales. En ciertas realizaciones, los sujetos a los que se administra preferentemente una vacuna de virus vivo, pueden incluir niños y adolescentes sanos, de 2 a 17 años de edad, y adultos sanos de 18 a 49 años de edad.
En ciertas realizaciones, una formulación inmunogénica de la invención que comprende un vector de virus vivo no se administra simultáneamente con otras vacunas de virus vivo.
5.12 Modos de administración
5.12.1 Rutas de administración
Un compuesto activo (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición proporcionada en el presente documento puede administrarse a un sujeto por una variedad de rutas. Estas incluyen, pero no se limitan a, la vía intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, conjuntival y subcutánea. En algunas realizaciones, la composición de la invención se formula para una administración tópica, por ejemplo, para aplicación sobre la piel. En realizaciones específicas, la vía de administración es nasal, p. ej., como parte de un aerosol nasal. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula para administración intramuscular. En algunas realizaciones, la composición de la invención se formula para administración subcutánea. En ciertos ejemplos, una composición no se formula para administración mediante inyección. En realizaciones espe­ cíficas para vacunas de virus vivos, la vacuna se formula para su administración por una vía distinta a la inyección.
En los casos en que el antígeno es un vector vírico, un vector de partículas similar a un virus o un vector bacteriano, por ejemplo, puede ser preferible introducir una composición inmunogénica a través de la ruta natural de infección del virus o la bacteria con la estructura principal a partir de la cual se ha obtenido el vector. Alternativamente, puede ser preferible introducir un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe a través de la ruta natural de infección del virus de la gripe a partir del cual se ha obtenido el polipéptido. La capacidad de un antígeno, en particular un vector vírico, para inducir una respuesta inmunitaria fuerte, secretora y celular puede utilizarse ventajosamente. Por ejemplo, una infección del tracto respiratorio con un vector vírico puede inducir una fuerte respuesta inmune se­ cretora, por ejemplo en el sistema urogenital, con protección concomitante contra el virus de la gripe. Además, en una realización preferida, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas en los pulmones por cualquier vía adecuada. También puede emplearse la administración pulmonar, p. ej., mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante para uso como espray.
En una realización específica, la vacuna de subunidades de la invención se administra por vía intramuscular. En otra realización, la vacuna viva contra el virus de la gripe se administra por vía intranasal. En otra realización, la vacuna del virus de la gripe inactivado de la invención o la vacuna del virus de la gripe fraccionado de la invención se administra por vía intramuscular. En otra realización, la partícula similar a un virus de la invención o una composición de la misma se administra por vía intramuscular.
En algunos ejemplos, las células estimuladas con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento in vitro puede introducirse (o reintroducirse) en un sujeto, usando técnicas conocidas por un experto en la técnica. En algunos ejemplos, las células pueden introducirse en la dermis, debajo de la dermis o en el torrente sanguíneo periférico. En algunos ejemplos, las células introducidas en un sujeto son preferentemente cé­ lulas obtenidas a partir de ese sujeto, para evitar una respuesta inmunitaria adversa. En otros ejemplos, también se pueden usar células que se obtienen a partir de un hospedador donante que tiene antecedentes inmunitarios similares. También se pueden usar otras células, incluidas las diseñadas para evitar una respuesta inmunogénica adversa.
5.12.2 Dosificación y frecuencia de la administración
La cantidad de un compuesto activo (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o de una composición que será eficaz en el tratamiento y/o prevención de una infección con el virus de la gripe o una enfermedad por el virus de la gripe, dependerá de la naturaleza de la enfermedad, y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales.
La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración, y de la grave­ dad de la infección o enfermedad que provoca, y deberá decidirse según el juicio del facultativo y de las circunstancias de cada sujeto. Por ejemplo, las dosis efectivas también pueden variar según el medio de administración, el lugar de destino, el estado fisiológico del paciente (incluida la edad, el peso corporal, la salud), si el paciente es humano o animal, otros medicamentos administrados y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Normalmente, el paciente es un ser humano, pero también se pueden tratar mamíferos no humanos, incluidos los mamíferos transgénicos. Las dosificaciones de un tratamiento se ajustan de manera óptima para optimizar la seguridad y la eficacia.
En ciertas realizaciones, un ensayo in vitro se emplea para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de curvas de respuesta a la dosis, obtenidas a partir de sistemas de ensayo en modelos animales o in vitro.
En ciertas realizaciones, un compuesto activo o una composición de la invención (p. ej., una composición que com­ prende un compuesto activo) se administra a un sujeto como una dosis única seguida de una segunda dosis, 3 a 6 semanas más tarde. En determinadas realizaciones, un compuesto activo o una composición de la invención se ad­ ministra a un sujeto como una dosis única seguida de una segunda dosis, 3 a 6 semanas después, seguida de la administración de una tercera dosis, 3 a 6 semanas después. En determinadas realizaciones, la segunda y/o la tercera administración pueden utilizar un compuesto activo o una composición diferente. En realizaciones específicas, el do­ minio de la cabeza globular de cada polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en los compues­ tos activos o composiciones administrados, es diferente entre sí, por ejemplo, en la primera y la segunda o la primera, segunda y tercera administraciones en cada una se usa un diferente compuesto activo o composición, en donde al menos el dominio de la cabeza globular del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe en cada compuesto activo o composición administrado, es diferente. De acuerdo con estas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo se pueden administrar al sujeto, por ejemplo, a intervalos de 3 a 6 meses, de 6 a 9 meses o de 6 a 12 meses, después de la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar una com­ posición o un compuesto activo diferente. Por ejemplo, la primera administración (sensibilización) comprende una hemaglutinina de longitud completa o un fragmento de la misma (o un ácido nucleico que la codifica) y la segunda administración (refuerzo) comprende la administración de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento (o un ácido nucleico que lo codifica, una VLP que lo comprende o un virus o bacteria que lo expresa). En algunas realizaciones, la administración del mismo compuesto activo o composición de la invención puede repetirse y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses. En determinadas realizaciones, el compuesto activo o la composición de la invención se administra a un sujeto como una dosis única una vez al año.
En realizaciones específicas para la administración a niños, dos dosis de un compuesto activo (p. ej., el polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe de la invención, un ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición de la invención, administradas al menos con un mes de diferencia, se administran a un niño. En realizaciones específicas para la administración a adultos, se administra una sola dosis. En otra realización, se administra a un adulto dos dosis de un compuesto activo o composición de la invención, admi­ nistradas con al menos un mes de diferencia. En otra realización, a un niño pequeño (de seis meses a nueve años) se le puede administrar un compuesto activo o una composición de la invención por primera vez en dos dosis, admi­ nistradas con un mes de diferencia. En una realización particular, un niño que ha recibido solo una dosis en su primer año de vacunación, debe recibir dos dosis el año siguiente. En algunas realizaciones, se prefieren dos dosis adminis­ tradas con 4 semanas de diferencia para niños de 2 a 8 años de edad a los que se les administra por primera vez una vacuna contra la gripe, por ejemplo, una formulación inmunogénica descrita en este documento. En ciertas realizacio­ nes, para niños de 6 a 35 meses de edad, puede preferirse media dosis (0,25 ml), a diferencia de 0,5 ml, que puede preferirse para sujetos mayores de tres años.
Para la administración a lactantes humanos, a un lactante se administran dos dosis de un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe o una composición del mismo y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLPs o virosomas, en donde el dominio de la cabeza de la hemaglutinina del virus de la gripe del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe usado en la primera dosis, es de una cepa o subtipo diferente al dominio de la cabeza de hemaglutinina del virus de la gripe del polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe usado en la segunda dosis. La primera y la segunda administración pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
Para la administración a lactantes humanos, a un lactante se administran tres dosis de un polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe o una composición del mismo y/o uno o más de los ácidos nucleicos, vectores, VLPs o virosomas, en donde los dominios de la cabeza de la hemaglutinina del virus de la gripe de los polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe usados en la primera, segunda y tercera dosis proceden de dife­ rentes cepas o subtipos de virus de la gripe. Las administraciones primera, segunda y tercera pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.
En realizaciones particulares, un compuesto activo (p. ej., el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención, el ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, el vector de la invención (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido, células estimuladas con ese polipéptido) o la composición de la invención, se administra a un sujeto en otoño o invierno, es decir, antes o durante la temporada de gripe en cada hemisferio. En una realización, a los niños se les administra su primera dosis al principio de la temporada, p. ej., finales de septiembre o principios de octubre en el hemisferio norte, de modo que la segunda dosis pueda administrarse antes del pico de la temporada de gripe.
Para una inmunización pasiva con un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo generado y/o identificado usando un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento), la dosificación varía desde aproxi­ madamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más generalmente de 0,01 a 5 mg/kg de peso corporal del paciente. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg o, en otras palabras, 70 mg o 700 mg o dentro del intervalo de 70-700 mg, respectivamente, para un paciente de 70 kg. Un régimen de tratamiento ejemplar implica la administración una vez cada dos semanas o una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses durante un período de un año o durante varios años o durante varios intervalos de años. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especifici­ dades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo generalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles en sangre de anticuerpos contra el polipéptido hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en el paciente.
5.13 Ensayos biológicos
5.13.1 Ensayos para someter a ensayo la actividad de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe
Los ensayos para analizar la expresión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en un vector, se pueden realizar utilizando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, un ensayo para la incorpo­ ración en un vector vírico comprende el cultivo del virus, la purificación de las partículas víricas mediante centrifugación a través de un cojín de sacarosa y el posterior análisis de la expresión del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe mediante un inmunoensayo, como la transferencia Western, usando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos para determinar si un polipéptido de hemaglutinina es quimérico son conocidos por los exper­ tos en la técnica y se describen en el presente documento.
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito, se puede someter a ensayo para deter­ minar si el plegamiento y la funcionalidad son correctos analizando su capacidad para unirse específicamente a un anticuerpo neutralizante dirigido a un polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe, tal como la región del tallo del polipéptido, usando cualquier ensayo para la interacción anticuerpo-antígeno conocido en la técnica. Los anticuerpos neutralizantes para uso en esos ensayos incluyen, por ejemplo, los anticuerpos neutralizantes descritos en Ekiert et al., 2009, Science Express, 26 de febrero de 2009; Kashyap et al., 2008, Proc Natl Acad Sci USA 105: 5986-5991; Sui et al. 2009, Nature Structural and Molecular Biology, 16:265-273; Wang et al., 2010, PLOS Pathogens 6(2):1 -9; los documentos de patente de EE.UU. n° 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070 y 6.720.409; Solicitud Internacional n° PCT/US2007/068983 publicada como Publicación Internacional n° WO 2007/134237; Solicitud Internacional n° PCT/US2008/075998 publicada como Publicación Internacional n° WO 2009/036157; Solicitud Internacional n° PCT/EP2007/059356 publicada como Publicación Internacional n° WO 2008/028946; y Solicitud Internacional n° PCT/US2008/085876 publicada como Publicación Internacional n° WO 2009/079259. Esos anticuerpos incluyen CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (FERM BP-4517), AI3C (FERM BP-4516), CR8114, CR8020 (Ekiert et al., 2011. Science. 333(6044): 843-850), FI6 (Corti et al., 2011. Science. 333(6044) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669), los mAbs 3A2, 10C4 o 5A7 del tallo del virus de la gripe B (Yasugi et al., 2013. PLoS Pathog. 9(2): e1003150), entre otros.
Además, se puede someter a ensayo un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe para analizar el plegamiento adecuado mediante una determinación de la estructura o conformación del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe usando cualquier método conocido en la técnica, tal como, p. ej., RMN, métodos cristalográficos de rayos X o métodos de predicción de estructuras secundarias, por ejemplo, dicroísmo cir­ cular.
5.13.2 Ensayos para evaluar la actividad de los anticuerpos generados utilizando polipéptidos de hemaglutinina qui­ méricos del virus de la gripe
Los anticuerpos descritos en el presente documento se pueden caracterizar en una variedad de formas conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, ELISA, visualización con resonancia de plasmón superficial (BIAcore), trans­ ferencia Western, inmunofluorescencia, inmunotinción y/o ensayos de microneutralización). Por ejemplo, se puede someter a ensayo la capacidad de los anticuerpos para unirse específicamente a un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, o a un vector que comprende dicho polipéptido. Ese ensayo se puede realizar en solución (por ejemplo, Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412 421), sobre perlas (Lam, 1991, Nature 354:82 84), sobre chips (Fodor, 1993, Nature 364:555 556), sobre bacterias (documento de patente de e E.UU. n° 5.223.409), sobre esporas (documentos de patente de EE.uU. n° 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), sobre plásmidos (Cull et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:1865 1869) o sobre fagos (Scott y Smith, 1990, Science 249:386390; Cwirla et al., 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87:63786382; y Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301 310).
La unión específica de un anticuerpo al polipéptido quimérico de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe y la reactivi­ dad cruzada con otros antígenos pueden evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Los inmunoensayos que se pueden usar para analizar la unión específica y la reactividad cruzada incluyen, entre otros, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que utilizan técnicas tales como transferencias Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo "sándwich", ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, por nombrar solo algunos. Esos ensayos son rutinarios y bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel et al., compiladores, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York).
La afinidad de la unión de un anticuerpo hacia un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y la tasa de interacción anticuerpo-antígeno pueden determinarse mediante ensayos de unión competitiva. Un ejemplo de un ensayo de unión competitiva es un radioinmunoensayo que comprende la incubación de un antígeno marcado (por ejemplo, 3H o 125I) con el anticuerpo de interés en presencia de cantidades crecientes de antígeno sin marcar y la detección del anticuerpo unido al antígeno marcado. La afinidad del anticuerpo hacia un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y las tasas de unión pueden determinarse a partir de los datos mediante un análisis con el diagrama de Scatchard. La competencia con un segundo anticuerpo también se puede determinar usando radioinmunoensayos. En ese caso, se incuba un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe con el anticuerpo de la prueba conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H o 125I), en presencia de cantidades crecientes de un segundo anticuerpo sin marcar.
La afinidad de la unión del anticuerpo y las constantes de la tasa pueden medirse utilizando el sistema KinExA 3000 (Sapidyne Instruments, Boise, ID). En algún ejemplo, un análisis con resonancia de plasmones superficiales (p. ej., BIAcore cinético) se usa para determinar las tasas de asociación y disociación de los anticuerpos con un polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe. El análisis cinético BIAcore comprende analizar la asociación y la disociación de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe desde chips, con anticuerpos inmovilizados contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe sobre su superficie. Un estudio cinético típico de BIAcore implica la inyección de 250 pL de un reactivo de anticuerpo (mAb, Fab) con una concentración variable, en tampón HBS que contiene Tween-20 al 0,005% sobre la superficie de un chip sensor, en donde se ha inmovilizado el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe. El caudal se mantiene constante a 75 pl/min. Los datos de la disociación se recopilan durante 15 minutos o más, según sea necesario. Después de cada ciclo de inyección/disociación, el anticuerpo unido se retira de la superficie del polipéptido de hemaglutinina del virus de la gripe usando pulsos breves de 1 min de ácido diluido, típicamente HCl 10-100 mM, aunque se emplean otros agentes regenerantes según lo requieran las circunstancias. Más específicamente, para la medición de las tasas de asociación, kon, y disociación, koff, el polipéptido se inmoviliza directamente sobre la superficie del chip sensor mediante el uso de química de acoplamiento de amina convencional, a saber, el método EDC/NHS (EDC = N-dietilaminopropil)-carbodiimida). Brevemente, se prepara una solución 5-100 nM del polipéptido en NaOAc 10 mM, pH 4 o pH 5 y se hace pasar sobre la superficie activada con EDC/NHS hasta que se inmovilizan aproximadamente 30-50 RUs de polipéptido. Después de esto, los ésteres activos sin reaccionar se "taponan" con una inyección de Et-NH21 M. Se prepara una superficie en blanco, que no contiene polipéptido, en condiciones de inmovilización idénticas con fines de referencia. Una vez que se ha preparado una superficie adecuada, se prepara una serie de diluciones adecuadas de cada uno de los reactivos de anticuerpos en HBS/Tween-20, y se hacen pasar sobre las superficies del polipéptido y de la célula de referencia, que están conectadas en serie. El intervalo de concentraciones de anticuerpo que se prepara varía, dependiendo de cuál sea la constante de unión en equilibrio, Kd, estimada que vaya a ser. Como se ha descrito anteriormente, el anticuerpo unido se retira después de cada ciclo de inyección/disociación usando un agente regene­ rante apropiado.
La actividad neutralizante de un anticuerpo se puede determinar utilizando cualquier ensayo conocido por los expertos en la técnica. Los anticuerpos descritos en este documento pueden analizarse por su capacidad para inhibir la unión de un virus de la gripe o cualquier otra composición que comprenda un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe (p. ej., una VLP, un liposoma o un extracto de detergente), a su receptor en la célula hospedadora (es decir, ácido siálico) usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las células que expre­ san receptores del virus de la gripe se pueden poner en contacto con una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe en presencia o ausencia del anticuerpo y la capacidad del anti­ cuerpo para inhibir la unión del antígeno se puede medir, por ejemplo, mediante un análisis con citometría de flujo o un ensayo de centelleo. La composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o el anticuerpo, se puede marcar con un compuesto detectable, tal como un marcador radiactivo (por ejemplo, 32P, 35S 125I) o un marcador fluorescente (p. ej., isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina) para permitir la detección de una interacción entre la composición que com­ prende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y un receptor celular. Alternativamente, la capacidad de los anticuerpos para inhibir la unión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe a su receptor puede determinarse en ensayos exentos de células. Por ejemplo, una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe se puede poner en contacto con un anticuerpo y se puede determinar la capacidad del anticuerpo para inhibir la composición que comprende el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe para que no se una a un receptor celular. El anticuerpo se puede inmovi­ lizar sobre un soporte sólido y la composición que comprende un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe se marca con un compuesto detectable. Alternativamente, una composición que comprende un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, se inmoviliza sobre un soporte sólido y el anticuerpo se marca con un compuesto detectable. En cierto ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la unión de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento a un receptor celular, se determina evaluando el porcentaje de inhibición de la unión del anticuerpo en relación con un control (p. ej., un anticuerpo conocido por inhibir la unión del polipéptido hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe al receptor celular).
Por ejemplo, un anticuerpo adecuado para uso en los métodos descritos en el presente documento, no inhibe la unión del receptor del virus de la gripe, pero todavía se encuentra que es neutralizante en un ensayo descrito en el presente documento. En algunos ejemplos, un anticuerpo adecuado para uso de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento, reduce o inhibe la fusión de la membrana entre virus-hospedador en un ensayo conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
En un ejemplo, la fusión de la membrana entre virus-hospedador se analiza en un ensayo in vitro utilizando un virus de la gripe que contiene un agente informador y una célula hospedadora capaz de infectarse con el virus. Un anticuerpo inhibe la fusión si la actividad del agente informador se inhibe o se reduce en comparación con un control negativo (p. ej., la actividad del agente informador en presencia de un anticuerpo de control o en ausencia de anticuerpo).
En un ejemplo, la fusión de la membrana entre virus-hospedador se detecta utilizando un sistema de modelo de fusión celular. En un ensayo de fusión celular ejemplar, las células (p. ej., células HeLa) se transfectan con un plásmido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe y se ponen en contacto y se exponen a un tampón que permite la función de fusión del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe (p. ej., tampón a pH 5,0) en presencia de un anticuerpo. Un anticuerpo es neutralizante si reduce o inhibe la formación de sincitios en comparación con un control negativo (p. ej., formación de sincitios en presencia de un anticuerpo de control o en ausencia de anticuerpo).
En otros ejemplos, la fusión de la membrana entre virus y hospedador se analiza utilizando un ensayo in vitro basado en liposomas. En un ensayo ejemplar, el receptor de la célula hospedadora se reconstituye en liposomas que contie­ nen la mitad de un agente informador. Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe se recons­ tituye en otro conjunto de liposomas que contienen la otra mitad de un agente informador. Cuando las dos poblaciones de liposomas se mezclan, la fusión se detecta mediante la reconstitución del agente informador, por ejemplo, una reacción enzimática que se puede detectar colorimétricamente. El anticuerpo inhibe la fusión si la actividad del agente informador se reduce o se inhibe en comparación con la actividad del agente informador en un ensayo realizado en ausencia de anticuerpo o en presencia de un anticuerpo de control. En ejemplos, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la fusión se determina evaluando el porcentaje de fusión en presencia del anticuerpo en relación con el porcen­ taje de fusión en presencia de un control.
5.13.3 Ensayos para someter a ensayo la actividad de células estimuladas
Las células estimuladas de acuerdo con los métodos descritos en este documento, pueden analizarse, por ejemplo, para estudiar la integración, la transcripción y/o la expresión del polinucleótido o de gen(es) de interés, el número de copias del gen integrado y la ubicación de la integración. Ese análisis se puede realizar en cualquier momento y se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Una estimulación exitosa de la célula diana con un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe puede determinarse detectando la producción de anticuerpos neutralizantes contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, usando métodos conocidos en la técnica o descritos en este documento.
Los sujetos a los que se administran las células estimuladas, p. ej., CDs, se pueden analizar para localizar las células, la expresión de un polipéptido entregado por un vector o un gen que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, la estimulación de una respuesta inmune (p. ej., la producción de anticuerpos neutrali­ zantes contra el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe), y/o realizar un seguimiento para detectar síntomas asociados con una infección con el virus de la gripe o una enfermedad asociada con el mismo mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento.
Pueden usarse ensayos con un agente informador para determinar la especificidad del direccionamiento del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención. Por ejemplo, se puede obtener una población mixta de células de médula ósea de un sujeto y cultivarlas in vitro. El polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe de la invención puede administrarse a la población mixta de células de la médula ósea, y la expresión de un gen informador asociado con el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, se puede someter a ensayo en las células cultivadas. En algunos ejemplos, al menos aproximadamente el 50%, más preferible­ mente al menos aproximadamente el 60%, 70%, 80% o 90%, aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 95% de las células estimuladas en la población de células mixtas, son células dendríticas.
5.13.4 Ensayos de la actividad antivírica
Los anticuerpos descritos en este documento o sus composiciones pueden evaluarse in vitro para analizar la actividad antivírica. Los anticuerpos o composiciones de los mismos se pueden someter a ensayo in vitro para estudiar su efecto sobre el crecimiento de un virus de la gripe. El crecimiento del virus de la gripe puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en el presente documento (p. ej., en un cultivo celular). En un ejemplo específico, las células se infectan con una MOI de 0,0005 y 0,001,0,001 y 0,01,0,01 y 0,1,0,1 y 1 o 1 y 10 o una MOI de 0,0005, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,5, 1,5 o 10 y se incuban con medio complementado exento de suero. Los títulos virales se determinan en el material sobrenadante mediante placas de hemaglutinina o cualquier otro ensayo viral descrito en este documento. Las células en las que se pueden evaluar los títulos virales incluyen, entre otras, células EFK-2, células Vero, células MDCK, células endoteliales primarias de la vena umbilical humana (HUVEC), línea celular epitelial humana H292 y células HeLa. Los ensayos in vitro incluyen aquellos que miden una replicación alterada del virus (según lo determinado, por ejemplo, por la formación de placas) o la producción de proteínas víricas (según lo determinado, por ejemplo, por un análisis de transferencia Western) o ARN vírico (según lo determinado, por ejemplo, por RT-PCR o análisis de transferencia Northern) en células cultivadas in vitro usando métodos que son bien conocidos en la técnica o se describen en este documento.
En un ejemplo no limitante, una monocapa de la línea celular de mamífero diana se infecta con diferentes cantidades (p. ej., multiplicidad de 3 unidades formadoras de placa (ufp) o 5 ufp) de virus (p. ej., virus de la gripe) y posteriormente se cultivan en presencia o ausencia de varias diluciones de anticuerpos (p. ej., 0,1 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml o 10 pg/ml). Los cultivos infectados se recogen 48 horas o 72 horas después de la infección y se valoran mediante ensayos en placa convencionales conocidos en la técnica sobre la línea celular diana adecuada (p. ej., células Vero).
En un ejemplo no limitante de un ensayo de hemaglutinación, las células se ponen en contacto con un anticuerpo y se infectan simultánea o posteriormente con el virus (p. ej., con una MOI de 1) y el virus se incuba en condiciones que permitan la replicación del virus (p. ej., 20-24 horas). Los anticuerpos están preferentemente presentes durante todo el transcurso de la infección. A continuación, se determina la replicación vírica y la liberación de partículas víricas mediante ensayos de hemaglutinación, utilizando glóbulos rojos de pollo al 0,5%. Véase, p. ej., Kashyap et al., PNAS USA 105: 5986-5991. Un compuesto se considera que es un inhibidor de la replicación vírica si reduce la replicación vírica en al menos 2 pocillos de HA, lo que equivale aproximadamente a una reducción del 75% en el título viral. En un ejemplo específico, un inhibidor reduce el título viral en ese ensayo en un 50% o más, en un 55% o más, en un 60% o más, en un 65% o más, en un 70% o más, en un 75% o más, en un 80% o más, en 85% o más, en 90% o más o en 95% o más. En otro ejemplo específico, un inhibidor produce una reducción de aproximadamente 1 magnitud logarítmica o más, aproximadamente 2 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 3 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 4 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 5 magnitudes logarítmicas o más, apro­ ximadamente 6 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 7 magnitudes logarítmicas o más, aproximada­ mente 8 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 9 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 10 magnitudes logarítmicas o más, de 1 a 3 magnitudes logarítmicas, de 1 a 5 magnitudes logarítmicas, de 1 a 8 magni­ tudes logarítmicas, de 1 a 9 magnitudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 2 a 5 magnitudes logarít­ micas, de 2 a 7 magnitudes logarítmicas, de 2 magnitudes logarítmicas a 8 magnitudes logarítmicas, de 2 a 9 magni­ tudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 3 a 5 magnitudes logarítmicas, de 3 a 7 magnitudes logarít­ micas, de 3 a 8 magnitudes logarítmicas, de 3 a 9 magnitudes logarítmicas, de 4 a 6 magnitudes logarítmicas, de 4 a 8 magnitudes logarítmicas, de 4 a 9 magnitudes logarítmicas, de 5 a 6 magnitudes logarítmicas, de 5 a 7 magnitudes logarítmicas, de 5 a 8 magnitudes logarítmicas, de 5 a 9 magnitudes logarítmicas, de 6 a 7 magnitudes logarítmicas, de 6 a 8 magnitudes logarítmicas, de 6 a 9 magnitudes logarítmicas, de 7 a 8 magnitudes logarítmicas, de 7 a 9 magnitudes logarítmicas o de 8 a 9 magnitudes logarítmicas en el título del virus de la gripe en el sujeto. La reducción logarítmica en el título del virus de la gripe puede compararse con un control negativo, con otro tratamiento o con el título del paciente antes de la administración del anticuerpo.
5.13.5 Ensayos de citotoxicidad
Se pueden utilizar muchos ensayos bien conocidos en la técnica para evaluar la viabilidad de las células (infectadas o no infectadas) o de líneas celulares después de la exposición a un compuesto activo o a una composición del mismo y, por lo tanto, para determinar la citotoxicidad del compuesto o la composición. Por ejemplo, la proliferación celular se puede analizar midiendo la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) (Véase, por ejemplo, Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79), incorporación de timidina (3H) (Véase, por ejemplo, Chen, J., 1996, Oncogen 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. Biol. Chem. 270:1836773), mediante un recuento celular directo o mediante la detección de cambios en la transcripción, traducción o actividad de genes conocidos como protooncogenes (p. ej., fos, myc) o marcadores del ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, D1, D2, D3, E, etc.). Los niveles de esa proteína y del ARNm y la actividad pueden determinarse mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína se puede cuantificar mediante métodos de inmunodiagnóstico conocidos como ELISA, transferencia Western o inmunoprecipitación utilizando anticuerpos, incluidos los disponibles comercialmente. El ARNm se puede cuantificar usando métodos que son bien conocidos y rutinarios en la técnica, por ejemplo, usando análisis Northern, protección de ARNasa o reacción en cadena de la polimerasa junto con transcripción inversa. La viabilidad celular se puede evaluar usando tinción con azul de tripano u otros marcadores de la viabilidad o muerte celular conocidos en la técnica. En un ejemplo específico, el nivel de ATP celular se mide para determinar la viabilidad celular.
La viabilidad celular se puede medir en periodos de tres y siete días, utilizando un patrón de ensayo en la técnica, como el kit de ensayo CellTiter-Glo (Promega) que mide los niveles de ATP intracelular. Una reducción del ATP celular es indicativa de un efecto citotóxico. Alternativamente, la viabilidad celular se puede medir en el ensayo de captación de rojo neutro. La observación visual de cambios morfológicos puede incluir agrandamiento, granularidad, células con bordes irregulares, apariencia pelicular, redondeo, desprendimiento de la superficie del pocillo u otros cambios. A esos cambios se les otorga la designación T (100% tóxico), PVH (parcialmente tóxico-muy pesado-80%), PH (parcialmente tóxico-pesado-60%), P (parcialmente tóxico-40%), Ps (parcialmente tóxico-leve-20%) o 0 (ninguna toxicidad-0%), con­ forme al grado de citotoxicidad observado. Una concentración inhibidora de las células (citotóxica) del 50% (CI50) se determina mediante un análisis de regresión de esos datos.
En una realización específica, las células utilizadas en el ensayo de citotoxicidad son células animales, incluidas células primarias y líneas celulares. En algunas realizaciones, las células son células humanas. En ciertas realizacio­ nes, la citotoxicidad se evalúa en una o más de las siguientes líneas celulares: U937, una línea celular de monocitos humanos; células mononucleares primarias de sangre periférica (PBMC); Huh7, una línea celular de hepatoblastoma humano; 293T, una línea celular de riñón embrionario humano; y THP-1, células monocíticas. En ciertas realizaciones, la citotoxicidad se evalúa en una o más de las siguientes líneas celulares: MDCK, MEF, Huh 7.5, Detroit o células epiteliales traqueobronquiales humanas (HTBE).
Los compuestos activos (p. ej., polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención) o composiciones de los mismos pueden analizarse para analizar la toxicidad in vivo en modelos animales. Por ejemplo, los modelos animales, descritos en este documento y/u otros conocidos en la técnica, usados para someter a ensayo las actividades de los compuestos activos, también pueden usarse para determinar la toxicidad in vivo de esos com­ puestos. Por ejemplo, a los animales se les administra un intervalo de concentraciones de compuestos activos. Pos­ teriormente, los animales se controlan a lo largo del tiempo en cuanto a letalidad, pérdida de peso o falta de aumento de peso y/o niveles de marcadores séricos que pueden ser indicativos de un daño tisular (p. ej., nivel de fosfocinasa de creatina como indicador de daño tisular general, nivel de transaminasa de ácido oxálico o transaminasa de ácido pirúvico como indicadores de posible daño hepático). Esos ensayos in vivo también pueden adaptarse para someter a ensayo la toxicidad de varios modos y/o regímenes de administración, además de las dosificaciones.
La toxicidad y/o la eficacia de un compuesto activo (p. ej., polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención) puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población). La relación entre las dosis para los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefiere un compuesto activo que muestre índices terapéuticos altos. Si bien se puede usar un compuesto activo que muestre efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija esos agentes al sitio del tejido afec­ tado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivos celulares y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación de un compuesto activo para uso en humanos. La dosificación de tales agentes se en­ cuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de ese intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto activo utilizado en un método descrito en el presente docu­ mento, la dosis efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del compuesto del ensayo que alcanza la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) de­ terminada en un cultivo celular. Esa información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. En este documento se proporciona una información adicional sobre la determinación de la dosificación.
Además, se puede usar cualquier ensayo conocido por los expertos en la técnica para evaluar la utilidad profiláctica y/o terapéutica de los compuestos activos y las composiciones de la invención o descritas en el presente documento, por ejemplo, midiendo la infección vírica o una afección o síntomas asociados con la misma.
5.13.6 Actividad antiviral in vivo
Los compuestos activos (p. ej., polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención) y sus composiciones se pueden someter a ensayo in vivo para estudiar la actividad terapéutica o profiláctica deseada antes del uso en seres humanos. Por ejemplo, se pueden usar ensayos in vivo para determinar si es preferible admi­ nistrar un compuesto activo o una composición del mismo y/u otra terapia. Por ejemplo, para evaluar el uso de un compuesto activo o una composición del mismo para prevenir una enfermedad con el virus de la gripe, la composición se puede administrar antes de que el animal se infecte con el virus de la gripe. Como alternativa o además, se puede administrar al animal un compuesto activo o una composición del mismo al mismo tiempo que el animal está infectado con el virus de la gripe. Para evaluar el uso de un compuesto activo o una composición del mismo para tratar una infección con el virus de la gripe o una enfermedad asociada con el mismo, el compuesto o la composición pueden administrarse después que el animal se haya infectado con el virus de la gripe. En una realización específica, un compuesto activo o una composición del mismo se administra al animal más de una vez.
Los compuestos activos (p. ej., polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención) y las composiciones de los mismos se pueden someter a ensayo para estudiar la actividad antiviral en sistemas de modelos animales que incluyen, pero sin limitación, ratas, ratones, pollos, vacas, monos, cerdos, hurones, cabras, ovejas, perros, conejos, cobayas, etc. En una realización específica, los compuestos activos y sus composiciones se someten a ensayo en un sistema de modelo de ratón. Esos sistemas de modelo son ampliamente utilizados y bien conocidos por los expertos en la materia. En una realización específica, los compuestos activos y las composiciones de los mismos se someten a ensayo en un sistema de modelo de ratón. En esta sección se proporcionan ejemplos no limitativos de modelos animales para el virus de la gripe.
En general, los animales se infectan con el virus de la gripe y, al mismo tiempo o posteriormente, se tratan con un compuesto activo o una composición del mismo o un placebo. Alternativamente, los animales se tratan con un com­ puesto activo o una composición del mismo o un placebo y posteriormente se infectan con el virus de la gripe. Muestras obtenidas de esos animales (p. ej., suero, orina, esputo, semen, saliva, plasma o muestra de tejido) se pueden analizar para estudiar la replicación vírica a través de métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., aquellos que miden títulos víricos alterados (según lo determinado, p. ej., por la formación de placas), la producción de proteínas víricas (según lo determinado, p. ej., por transferencia Western, ELISA o análisis de citometría de flujo) o la producción de ácidos nucleicos víricos (según lo determinado, p. ej., mediante RT-PCR o análisis de transferencia Northern). Para la cuantificación de virus en muestras de tejido, las muestras de tejido se homogeneizan en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y las diluciones de homogeneizados clarificados se adsorben durante 1 hora a 37°C sobre monocapas de células (p. ej., células Vero, CEF o MDCK). En otros ensayos, las evaluaciones histopatológicas se realizan des­ pués de la infección, preferiblemente evaluaciones de un órgano u órganos que se sabe que son atacados por el virus en la infección. La inmunohistoquímica del virus se puede realizar utilizando un anticuerpo monoclonal específico del virus.
El efecto de un compuesto activo (por ejemplo, polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe de la invención) o una composición del mismo sobre la virulencia de un virus, también se puede determinar usando ensayos in vivo en los que se determina el título del virus en un sujeto infectado al que se ha administrado un com­ puesto activo o una composición del mismo, la duración de la supervivencia de un sujeto infectado al que se ha administrado un compuesto activo o una composición del mismo, la respuesta inmunitaria en un sujeto infectado al que se ha administrado un compuesto activo o una composición del mismo, la cantidad, la duración y/o la gravedad de los síntomas en un sujeto infectado al que se le ha administrado un compuesto activo o una composición del mismo y/o el período de tiempo antes de la aparición de uno o más síntomas en un sujeto infectado al que se le ha adminis­ trado un compuesto activo o una composición del mismo. Pueden usarse técnicas conocidas por un experto en la técnica para medir tales efectos. En ciertas realizaciones, un compuesto activo o una composición del mismo da como resultado una reducción en una cantidad de 0,5 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 6 veces, 8 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 125 veces, 150 veces, 175 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 750 veces o 1.000 veces o más del título del virus de la gripe en relación con un sujeto no tratado. En algunas realizaciones, un compuesto activo o una composición del mismo da como resultado una reducción en el título del virus de la gripe en relación con un sujeto no tratado de aproximadamente 1 magnitud logarítmica o más, aproximadamente 2 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 3 magnitudes logarítmicas o más, aproxima­ damente 4 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 5 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 6 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 7 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 8 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 9 magnitudes logarítmicas o más, aproximadamente 10 magnitudes logarítmi­ cas o más, de 1 a 3 magnitudes logarítmicas, de 1 a 5 magnitudes logarítmicas, de 1 a 8 magnitudes logarítmicas, de 1 a 9 magnitudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 2 a 5 magnitudes logarítmicas, de 2 a 7 magni­ tudes logarítmicas, de 2 magnitudes logarítmicas a 8 magnitudes logarítmicas, de 2 a 9 magnitudes logarítmicas, de 2 a 10 magnitudes logarítmicas, de 3 a 5 magnitudes logarítmicas, de 3 a 7 magnitudes logarítmicas, de 3 a 8 magni­ tudes logarítmicas, de 3 a 9 magnitudes logarítmicas, de 4 a 6 magnitudes logarítmicas, de 4 a 8 magnitudes logarít­ micas, de 4 a 9 magnitudes logarítmicas, de 5 a 6 magnitudes logarítmicas, de 5 a 7 magnitudes logarítmicas, de 5 a 8 magnitudes logarítmicas, de 5 a 9 magnitudes logarítmicas, de 6 a 7 magnitudes logarítmicas, de 6 a 8 magnitudes logarítmicas, de 6 a 9 magnitudes logarítmicas, de 7 a 8 magnitudes logarítmicas, de 7 a 9 magnitudes logarítmicas o de 8 a 9 magnitudes logarítmicas.
Se han descrito modelos animales del virus de la gripe, tales como hurones, ratones, cobayas, monos ardilla, macacos y pollos, desarrollados para someter a ensayo agentes antivirales contra el virus de la gripe. Véase, por ejemplo, Sidwell et al., Antiviral Res., 2000, 48:1-16; Lowen AC et al. PNAS., 2006, 103: 9988-92; y McCauley et al., Antiviral Res., 1995, 27:179-186 y Rimmelzwann et al., Avian Diseases, 2003, 47:931-933. Para modelos de gripe en ratones, ejemplos no limitantes de parámetros que se pueden usar para someter a ensayo la actividad antiviral de los com­ puestos activos administrados a los ratones infectados con gripe, incluyen muerte asociada a neumonía, aumento de la glicoproteína ácida a1 en suero, peso del animal, virus pulmonar sometido a ensayo con hemaglutinina, virus pul­ monar analizado mediante ensayos en placa y cambio histopatológico en el pulmón. Se lleva a cabo un análisis esta­ dístico para calcular la significación (p. ej., un valor de P de 0,05 o menor).
En otros ensayos, las evaluaciones histopatológicas se realizan después de la infección de un sujeto de un modelo animal. Los cornetes nasales y la tráquea pueden examinarse en busca de cambios epiteliales e inflamación subepi­ telial. Los pulmones pueden examinarse en busca de cambios epiteliales bronquiolares e inflamación peribronquiolar en los bronquiolos grandes, medianos y pequeños o terminales. Los alvéolos también se evalúan en busca de cambios inflamatorios. Los bronquiolos medianos se clasifican en una escala de 0 a 3+ de la siguiente manera: 0 (normal: revestido con células epiteliales cilíndricas medianas a altas con bordes apicales ciliados y núcleos seudoestratificados basales; inflamación mínima); 1+ (capa epitelial cilíndrica e incluso en el contorno con proliferación ligeramente au­ mentada; cilios todavía visibles en muchas células); 2+ (cambios prominentes en la capa epitelial que van desde atenuación hasta proliferación marcada; células desorganizadas y contorno de la capa irregular en el borde luminal); 3+ (capa epitelial marcadamente alterada y desorganizada con células necróticas visibles en la luz; algunos bronquiolos atenuados y otros en marcada proliferación reactiva).
La tráquea se califica sobre una escala de 0 a 2,5+ de la siguiente manera: 0 (normal: revestida por células epiteliales cilíndricas medianas a altas con borde apical ciliado, núcleos basales y seudoestratificados. Citoplasma evidente entre seguimiento del inicio de los síntomas de la infección con el virus de la gripe; de la capacidad del virus de la gripe para infectar al sujeto y/o una reducción/ausencia de uno o más síntomas asociados con una infección con el virus de la gripe). Pueden usarse técnicas conocidas por médicos familiarizados con enfermedades infecciosas para determinar si un compuesto activo o una composición del mismo reduce uno o más síntomas asociados con la enfermedad del virus de la gripe.
5.14 Evaluación de los anticuerpos en un sujeto
Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento, puede usarse para evaluar la respuesta de los anticuerpos de un sujeto (p. ej., un sujeto sin tratamiento previo o un sujeto inmunizado/vacunado) o de una población de sujetos frente a un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento). Por ejemplo, se puede usar un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe para evaluar la presencia de anticuerpos específicos del tallo en el sujeto o la población de sujetos.
En un ejemplo específico, la respuesta de los anticuerpos de un sujeto o de una población de sujetos que han sido inmunizados/vacunados con un polipéptido de la hemaglutinina del virus de la gripe (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento), se evalúa para identificar los tipos de anticuerpos específicos del tallo en el sujeto o la población de sujetos. Esa evaluación puede permitir la identificación de marcadores/criterios de valoración importantes alternativos para determinar la respuesta clínica frente a la admi­ nistración de uno o varios polipéptidos del polipéptido HA del virus de la gripe (p. ej., un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento o un virus que expresa un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento) descritos en este documento. En ese enfoque, una muestra biológica, p. ej., sangre, del sujeto o de una población de sujetos se puede aislar y analizar directamente para detectar la presencia de anticuerpos o puede procesarse (p. ej., para obtener sueros) y posteriormente analizar la presencia de anticuerpos. Esa prueba de los anticuerpos puede utilizar ensayos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA.
El perfil de anticuerpos de un sujeto que no ha sido tratado previamente (es decir, un sujeto que no ha sido inmunizado/vacunado con un(os) polipéptido(s) del polipéptido HA del virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento) o un virus que expresa un(os) polipéptido(s) del polipéptido HA del virus de la gripe (por ejemplo, un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe descrito en este documento) o una población de sujetos sin tratamiento previo, puede evaluarse para determinar si dicho sujeto o población de sujetos posee anticuerpos específicos de la cabeza globular y/o del tallo, contra varias cepas o subtipos del virus de la gripe. Tal evaluación puede permitir la generación de un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe o virus que expresan polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe, que son adecuados para la administración a dicho sujeto o población de sujetos. Esa evaluación puede determinar una estrategia de inmunización para el paciente.
En el presente documento se describe un método para evaluar/detectar la presencia de anticuerpos en un sujeto que son específicos de un dominio del tallo de una cepa o un subtipo particular de virus de la gripe, que comprende poner en contacto in vitro una muestra biológica (p. ej., sangre, suero) de dicho sujeto con un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento, en donde dicho polipéptido de hemaglutinina qui­ mérico del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de la cepa o el subtipo de interés. En otro ejemplo especí­ fico, se describe en este documento un método para evaluar/detectar la presencia de anticuerpos en un sujeto, que son específicos de un dominio del tallo de una cepa o un subtipo particular del virus de la gripe que comprende poner en contacto in vitro una muestra biológica (p. ej., sangre, suero) de dicho sujeto con un virus que expresa/contiene un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe descrito en el presente documento, en donde dicho poli­ péptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe comprende un dominio del tallo de la cepa o subtipo de interés.
5.15 Kits
En el presente documento se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas/inmunogénicas descritas en el presente docu­ mento, tal como uno o más compuestos activos proporcionados en el presente documento. Asociado opcionalmente con dicho(s) recipiente(s) puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, notificación que refleja la aprobación por parte de la agencia de la fabricación, uso o venta para administración humana.
Los kits incluidos en este documento se pueden usar de acuerdo con los métodos descritos en este documento. En una realización, un kit comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención. En una realización, un kit comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y comprende además un compuesto activo descrito en este documento, preferiblemente uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento, en uno o más recipientes. En ciertas realizaciones, un kit comprende una vacuna proporcionada en el presente documento, por ejemplo, una vacuna de virus fraccionado, una vacuna de subunidades, una vacuna de virus de la gripe inactivado o una vacuna de virus de la gripe vivo, en donde dicha vacuna comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe de la invención y opcionalmente comprende además uno o más polipéptidos de hemaglutinina (HA) quiméricos del virus de la gripe descritos en este documento. En una reali­ zación específica, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención e instrucciones para usar el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención para evaluar los anticuerpos presentes en un sujeto. En otra realización específica, en el presente documento se proporcionan kits que comprenden el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe de la invención para usar en métodos de ensayo para analizar la presencia de anticuerpos específicos del dominio del tallo de la HA en una muestra.
En una realización específica, un kit proporcionado en el presente documento comprende el polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (o el ácido nucleico de la invención que codifica ese poli­ péptido, un vector de la invención (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido). En un ejemplo específico, un kit descrito en este documento comprende un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido), un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido), un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/B descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese poli­ péptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido), un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/B descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido), un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cHB/B descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) o un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH4/3 descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (por ejemplo, un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido.
En otra realización específica, un kit proporcionado en el presente documento comprende una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (o el ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, el vector de la invención (por ejemplo, un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células de la invención estimuladas con ese polipéptido) y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido); o una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (o el ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, el vector de la invención (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) y un polipéptido de hema­ glutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimu­ ladas con ese polipéptido).
En otra realización específica, un kit proporcionado en el presente documento comprende una combinación de un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (o el ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, el vector de la invención (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/3 descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) y un polipép­ tido quimérico de hemaglutinina del virus de la gripe cH5/B, cH7/B o cB/B descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido).
En otra realización específica, un kit proporcionado en el presente documento comprende una combinación del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH5/1 de la invención (o el ácido nucleico de la invención que codifica ese polipéptido, el vector de la invención (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) y un polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH7/3 descrito en el presente documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido) y un polipép­ tido quimérico de hemaglutinina del virus de la gripe cH5/B, cH7/B o cB/B descrito en este documento (o un ácido nucleico que codifica ese polipéptido, un vector (p. ej., un vector vírico o una bacteria) que contiene o expresa ese polipéptido o células estimuladas con ese polipéptido).
6. Ejemplos
6.1 Ejemplo 1: Polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe
Este ejemplo describe polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe y métodos para inducir niveles elevados de anticuerpos del tallo de HA con neutralización cruzada en un sujeto, que comprende la administración de dichos polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe. Como se describe en este ejemplo, se generó hemaglutinina quimérica del virus de la gripe que se expresaba con éxito en el virus de la gripe y en células diseñadas para expresar la hemaglutinina quimérica del virus de la gripe. La hemaglutinina quimérica del virus de la gripe se recuperó con éxito en su conformación adecuada, como lo demuestra el reconocimiento de los anticuerpos de los dominios del tallo y la cabeza de la hemaglutinina quimérica del virus de la gripe.
La Figura 2 representa las hemaglutininas (HA) quiméricas del virus de la gripe, que comprenden el dominio del tallo/tallo de un subtipo HI del virus de la gripe y los dominios heterólogos de la cabeza globular de otros subtipos del virus de la gripe (H2, H3 y H5). Siguiendo el esquema de la estrategia de la Figura 2, se generó un virus de la gripe que comprendía una HA quimérica compuesta por un dominio del tallo obtenido a partir de un virus de la gripe H1N1 (PR8-H1N1) y el dominio de la cabeza globular de la HA H1 pandémica de 2009 (Cal/09). Los dominios de la cabeza globular de las HAs de los dos virus son muy distintos (~70% de identidad de aminoácidos), mientras que los dominios del tallo están muy conservados pero siguen siendo divergentes (~89% de identidad de aminoácidos). Como se de­ muestra en la Figura 3, las HAs quiméricas se expresaban con el mismo dominio del tallo pero con cabezas de HA muy diferentes dentro del mismo subtipo.
Además, se expresó una HA quimérica que consistía en el dominio del tallo de la HA A/PR/8/34 y el dominio de la cabeza globular de HK/68 (H3 quimérica), así como HAs de tipo silvestre (PR8-HA y HA HK68) en células 293T. La Fig. 5 demuestra que también es posible expresar HAs quiméricas estables con el mismo dominio del tallo (obtenido a partir del subtipo HA H1) y con una cabeza globular de un subtipo diferente (H3).
Por lo tanto, se diseñaron inmunógenos de HA que comparten completamente el dominio del tallo de HA pero que son muy divergentes en sus cabezas globulares. Las inmunizaciones repetidas con esas estructuras artificiales deberían dar como resultado niveles elevados de anticuerpos con neutralización cruzada contra el dominio del tallo común de la HA. Por lo tanto, una estrategia de vacuna mejorada utiliza HAs quiméricas con un dominio del tallo/tallo constante y una cabeza globular cambiante para inducir anticuerpos anti-dominio del tallo con neutralización cruzada fuerte. Se puede usar un dominio del tallo constante de, por ejemplo, HA H1 de A/PR/8/34 junto con cabezas globulares de diferentes HAs del grupo 1 (HI, H2, H5, H9) para preparar un panel de virus recombinantes inactivados, virus atenua­ dos recombinantes o HAs recombinantes (Figura 4). Un panel similar para HAs del grupo 2 basado en el dominio del tallo de, por ejemplo, HA H3 de un virus X31, en combinación con cabezas globulares de H3, H4 y H7, puede propor­ cionar la base para una vacuna universal de HAs del grupo 2. Los virus recombinantes se pueden rescatar sobre una estructura principal de vacuna contra virus de la gripe, tal como PR/8 o virus de la gripe adaptados al frío, cultivados mediante técnicas estándar y usar como vacunas inactivadas o atenuadas. Las HAs recombinantes se pueden expre­ sar en células de insecto que pueden realizar una glicosilación similar a la de los mamíferos (MIMIC Sf9) o mediante una transfección transitoria, por ejemplo, de células 293 T o Vero, y luego se pueden purificar mediante cromatografía de Ni-quelato con la ayuda de un marcador His C-terminal. Otras estrategias pueden incluir el uso de vacunas de ADN que expresan las HAs quiméricas u otros vectores, tales como vectores de adenovirus, que expresan las HAs quimé­ ricas.
6.2 Ejemplo 2: Virus que expresan polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe
Este ejemplo describe varias hemaglutininas quiméricas de virus de la gripe funcionales que incluyen una variedad de combinaciones de cabeza globular y tallo procedentes de diferentes subtipos de hemaglutininas, así como virus de la gripe recombinantes que expresan esas hemaglutininas quiméricas, que tenían propiedades de crecimiento similares a las de los virus de la gripe de tipo silvestre.
6.2.1 Materiales y métodos
6.2.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y se conser­ varon en medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM) o en MEM (Gibco, Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone; Thermo Scientific) y penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen).
Todos los virus recombinantes A/PR/8/34 se cultivaron en huevos de pollo embrionados de 10 días de edad a 37°C durante 2 días.
6.2.1.2 Construcción de plásmidos
Los plásmidos que codificaban las diferentes hemaglutininas quiméricas se construyeron mediante una estrategia similar adaptada, a partir de la construcción de plásmidos mediante genética inversa para generar virus recombinantes como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Brevemente, los diferentes segmentos de HA quimérica se amplificaron mediante PCR con cebadores que contenían sitios SapI, se digirieron con SapI y se clonaron en los sitios SapI del vector pDZ que contenía el promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa I de ratón (véase, p. ej., Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439), mediante ligación multisegmentaria.
6.2.1.3 Análisis mediante citometría de flujo
Para evaluar los niveles de proteínas de hemaglutinina en la superficie celular, se transfectaron células 293T con 1 qg del plásmido apropiado, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. A las 24 h de la transfección, las células se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2% antes de teñirlas con el anticuerpo monoclonal (mAb) 6F12 contra las HAs H1 con una dilución 1/1000 o con el mAb 12D1 contra las HAs H3 (véase Wang et al., 2010, pLoS Pathog 6:e1000796) con una dilución de 1/400. Las células teñidas se con­ taron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytomics FC 500 y los resultados se analizaron usando el programa informático FlowJo.
6.2.1.4 Generación de pseudopartículas y ensayo de entrada
El procedimiento para la producción de pseudopartículas se adaptó a partir de estudios previos (véase, por ejemplo, Evans et al., 2007, Nature 446:801 -805; y Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009). Brevemente, las células 293-T se cotransfectaron con cuatro plásmidos que codificaban (i) un provirus que contenía el agente informador deseado (V1-GLuc), (ii) Gag-Pol del VIH, (iii) la proteína de hemaglutinina quimérica diferente y (iv) neuraminidasa (NA) PR8 del virus de la gripe A. Los materiales sobrenadantes se recogieron 72 h después de la transfección y, posteriormente, se filtraron (tamaño de poro de 0,45 qm). Todas las transducciones y ensayos de infección con pseudopartículas se realizaron en presencia de 1 qg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (véase, Sui et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009).
El ensayo de entrada se realizó mediante la infección de células MDCK con pseudopartículas con diferentes hemaglutininas quiméricas que contenían el agente informador G-Luc. Veinticuatro horas después de la infección, las células se lavaron tres veces con medio de nuevo aporte para eliminar la proteína G-Luc que estaba presente en el inóculo de las pseudopartículas. Cuarenta y ocho horas después de la infección, se realizaron ensayos con luciferasa (véase Evans et al., 2007, Nature 446:801-805).
6.2.1.5 Rescate de los virus de la gripe A quiméricos recombinantes
El rescate de los virus de la gripe A a partir del ADN del plásmido se realizó como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Para generar el virus PR8 recombinante de tipo silvestre (rWT), se cotransfectaron células 293T con 1 qg de cada uno de los 8 plásmidos de rescate pDZ PR8, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los virus que expresaban diferentes HAs quiméricas se generaron de la misma forma pero sustituyendo el plásmido de HA por el quimérico correspondiente para recuperar los virus quiméricos correspondientes. A las 6 h de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 qg/ml de tripsina tratada con TPCK (L-1 -tosilamida-2-feniletilclorometilcetona). A las 24 horas de la transfección, se inoculó el material sobrenadante que con­ tenía virus en huevos de pollo embrionados de 8 días. Se recogió el líquido alantoideo después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó la presencia de virus mediante hemaglutinación de los glóbulos rojos de pollo y mediante formación de placas en células MDCK.
6.2.1.6 Ensayo de las cinéticas de crecimiento de virus
Para analizar las características de la replicación de los virus recombinantes, se inocularon huevos de pollo embrionados de 10 días de edad con 100 ufp de cada virus respectivo. Se recogió el líquido alantoideo y posteriormente se analizó el crecimiento viral a las 0, 9, 24, 48 y 72 h de la infección (hpi). Los títulos de virus presentes en el líquido alantoideo se determinaron mediante ensayo de placas en células MDCK.
6.2.1.7 Inmunotinción de placas
Las placas se visualizaron mediante inmunotinción con el mAb (HT103) contra la proteína NP del virus de la gripe A.
6.2.1.8 Transferencia Western y análisis con inmunofluorescencia indirecta
Se infectó un pocillo de una placa de 12 pocillos de células MDCK confluentes (multiplicidad de infección [MOI] de 2) con los virus de la gripe recombinantes indicados o se infectó de forma simulada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 hora a 37°C. A las 12 h de la infección (hpi), las células se lisaron en tampón de carga de proteína IX como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los lisados celulares reducidos se analizaron mediante análisis de transferencia Western usando mAbs contra A/NP (HT 103), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (29C1), A/VN/HA (M08) (20), A/H3/HA (12D1). La detección de Perth-cH7 utilizaba un suero policlonal de cabra, NR-3152, contra el virus A/FPV/Dutch/27 (H7), que se había obtenido a partir de BEI Resources. El anticuerpo de control de carga del mAb anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) procedía de Abcam. Todas las proteínas de interés se visualizaron utilizando un sistema mejorado de detección de proteínas por quimioluminiscencia (PerkinElmer Life Sciences, Boston, MA).
Para el análisis de inmunofluorescencia, se infectaron monocapas confluentes de células MDCK sobre cubreobjetos de 15 mm con virus recombinantes con una MOI de 2. A las 15 hpi, las células se fijaron y se permeabilizaron con metanol-acetona (relación 1:1) a -20°C durante 20 min. Después de bloquearlas con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con el anticuerpo dirigido contra A/NP (HT103), A/H1/HA (6F12), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (29C1), A/VN/HA (M08) (20), A/H3/HA (12D1) y virus A/H7 (NR-3152) como se ha mencionado anteriormente. Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con inmunoglobulina G anti-ratón conjugada con Alexa Fluor 594 (IgG; Invitrogen, Carlsbad, CA) o inmunoglobulina G anti-cabra conjugada con Alexa Fluor 594 (IgG, Invitrogen, Carlsbad, CA). Des­ pués de los últimos tres lavados, las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.2.2 Resultados
6.2.2.1 Generación de hemaglutininas quiméricas
Para obtener información sobre la conservación de los residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro Cys52-Cys277, se generó un alineamiento de las secuencias de HA del virus gripe A de los subtipos H1, H3, H5 y H7 (véase la Fig. 6). Las secuencias de las subunidades HA1 están menos conservadas que las de las subunidades HA2, prin­ cipalmente debido a la presencia de sitios antigénicos inmunodominantes en el dominio de la cabeza globular. Las cadenas de HA2 más conservadas comprenden las regiones del tallo que anclan las moléculas de HA a la envuelta viral. El alineamiento demuestra que Cys52 y Cys277 y los aminoácidos hacia ambos extremos se conservan en los subtipos seleccionados. De ahora en adelante, las secuencias de hemaglutinina N-terminal para Cys52 y C-terminal para Cys277 se definen como el dominio del tallo (Fig. 6). La secuencia intermedia se considera en este ejemplo el dominio de la cabeza.
Primero se generó una estructura artificial de hemaglutinina quimérica (PR8-cH1) que contenía el dominio de la cabeza globular pandémica de HA H1 Cal/09 con la región del tallo procedente de la HA PR8 (H1) (Fig. 7A). También se generó una HA quimérica (PR8-cH5) que contenía la cabeza globular de la HA VN1203 (H5) con el tallo de la HA PR8 (H1) (Fig. 7B). Dado que los 16 subtipos de HAs del virus de la gripe se agrupan en dos grupos filogenéticos (grupos 1 y 2) (véase, por ejemplo, Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273) y las HAs H1 y H5 pertenecen al grupo 1, se aplicó una estrategia similar para generar una HA quimérica portadora del dominio de la cabeza A/Alberta/24/01 (H7) con la región del tallo de HA A/Perth/16/2009 (H3) (Perth-cH7) (Fig. 7B). Tanto H7 como H3 son miembros del grupo filogenético del grupo 2 (véase, por ejemplo, Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273).
A continuación, se sometió a ensayo si las diferentes estructuras artificiales quiméricas de HAs se expresaban y se transportaban a la superficie celular. Un análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de células 293T transfectadas transitoriamente, se realizó después de una tinción de la superficie con anticuerpos espe­ cíficos del dominio del tallo PR8 y H3, respectivamente (Fig. 8A). Como se muestra en la Figura 8A, se detectó la expresión de las tres estructuras artificiales quiméricas. Esa detección indica que no se interrumpe el transporte de las HAs quiméricas a través del complejo de Golgi hasta la superficie celular.
A continuación, se examinaron las características de la entrada de las diferentes HAs quiméricas a través de una infección de las células MDCK con partículas pseudotipadas de HAs retrovirales que contenían la HA quimérica, NA de PR8 del virus de la gripe A de tipo silvestre y luciferasa basada en VIH. La eficiencia de la entrada mediada por las proteínas HA quiméricas se detectó mediante una lectura de la luciferasa. Se observaron niveles comparables de administración de luciferasa mediada por partículas pseudotipadas para las HAs quiméricas PR8-cH5 y Perth-cH7 y las correspondientes proteínas de tipo silvestre (Fig. 8B). La HA PR8-cH1 mostraba un nivel de luciferasa más bajo en comparación con las otras estructuras artificiales de HA.
6.2.3 Generación de virus de la gripe recombinantes portadores de hemaglutininas quiméricas
De cara a los resultados anteriores, se determinó si una HA quimérica es funcional en el contexto de una partícula de virus entera y, en última instancia, si permitiría el rescate de un virus de la gripe A recombinante que solo expresaba una HA quimérica. Usando protocolos previamente publicados (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590), se generaron con éxito virus que contenían todas las diferentes HAs quiméricas. Los virus resultantes se purificaron en placa, se amplificaron en huevos embrionarios de 10 días de edad y los segmentos quiméricos se analizaron mediante RT-PCR y se secuenciaron. En todos los casos, se encontró que el virus tenía el segmento de HA quimérica esperado y ningún otro segmento de HA.
La identidad de los virus quiméricos se demostró además mediante transferencia Western e inmunofluorescencia indirecta de las células infectadas (Fig. 9A y 9B). Las células MDCK se infectaron con virus rWT A/PR8, A/Perth de tipo silvestre, PR8-cH1, PR8-cH5 y Perth-cH7 (Fig. 9A y 9B). Las proteínas HAs quiméricas PR8-cH1 y PR8-cH5 se detectaron en las muestras correspondientes usando anticuerpos contra HA Cal/09 (29C1) o HA VN/04 (M08) (véase Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753), respectivamente (Fig. 9A). Usando 12D1, un mAb del tallo pan H3 (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796), se observaron niveles de expresión comparables entre Perth cH7-HA y Perth HA de tipo silvestre. Solo se detectó una banda positiva para la muestra de la infección Perth-cH7 cuando se usaban anticuerpos anti-H7 (NR-3152).
Para el estudio de inmunofluorescencia, las condiciones de la infección eran similares a las del análisis Western. Las células infectadas se tiñeron con los anticuerpos correspondientes como se indica en la Figura 9B. Todas las células infectadas mostraban la expresión esperada de las HAs así como de la proteína A/NP (Fig. 9B).
6.2.4 C a r a c te r í s t ic a s d e la r e p l ic a c ió n d e v i r u s r e c o m b in a n te s
L a s p r o p ie d a d e s d e l c r e c im ie n to d e lo s v i r u s s e e v a lu a r o n e n h u e v o s d e p o l lo e m b r io n a d o s d e 10 d ía s a 37 ° C (F ig .
8 A ) . E l v i r u s r W T P R 8 s e in c lu y ó p a r a c o m p a r a r la c in é t ic a d e c r e c im ie n t o d e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s q u e e x p r e s a b a n H A s q u im é r ic a s . C o n r e s p e c to a l v i r u s P R 8 - c H 5 , s e o b s e r v ó u n p a t r ó n d e r e p l ic a c ió n s im i la r a l d e l v i r u s P R 8. E n c u a n to a l v i r u s P e r th - c H 7 , h a b ía u n a r e d u c c ió n d e 2 v e c e s e n e l t í t u lo v i r a l e n c o m p a r a c ió n c o n e l v i r u s r W T P R 8 a la s 9 h p i. S in e m b a r g o , a lc a n z a b a u n t í t u lo p ic o s im i la r a l d e l v i r u s d e t ip o s i lv e s t r e ( l x 10 9 u fp /m l) a la s 48 h p i. E l v i r u s P R 8 -c H 1 e s ta b a a te n u a d o e n c o m p a r a c ió n c o n e l v i r u s r W T P R 8 , c o m o s e m u e s t r a p o r la r e d u c c ió n d e lo s t í t u lo s e n to d o s lo s p u n to s d e t ie m p o . N o o b s ta n te , in c lu s o e s e v i r u s q u im é r ic o a lc a n z a b a u n t í t u lo m á x im o c o r r e s p o n d ie n t e d e a p r o x im a d a m e n te 108 u fp /m l. E l f e n o t ip o d e la p la c a d e c a d a u n o d e lo s v i r u s q u im é r ic o s t a m b ié n s e e v a lu ó e n c é lu la s M D C K . T o d o s lo s v i r u s fo r m a b a n p la c a s d e u n t a m a ñ o c o m p a r a b le , c o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 8 B . E s to s r e s u l ta d o s c o n f ir m a n q u e la s e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s q u im é r ic a s d e H A s e p l ie g a n c o r r e c t a m e n te in v ivo y s o n b io ló g ic a m e n te fu n c io n a le s .
6.2.5 C o n c lu s ió n
S e d e s a r r o l ló u n a e s t r a te g ia n o v e d o s a p a r a g e n e r a r v i r u s d e la g r ip e c o n p r o te ín a s H A q u im é r ic a s q u e e r a n p o r t a d o r a s d e d i f e r e n te s d o m in io s d e la c a b e z a g lo b u la r d e H A , a p r o v e c h a n d o e l e n la c e d is u l fu r o c o n s e r v a d o C y s 52 - C y s 277 q u e d e l im i t a e l l ím i te e n t r e lo s d o m in io s d e la c a b e z a y e l ta l lo . A s í , m e d ia n te la s u s t i tu c ió n d e l d o m in io d e la c a b e z a p a r e n ta l c o n e l d o m in io d e la c a b e z a d e o t r a H A , s e g e n e r ó u n p a n e l d e H A s q u im é r ic a s c o n e l m is m o ta l lo p e r o d i f e r e n te s c a b e z a s g lo b u la r e s . E l d is e ñ o s e s o m e t ió a e n s a y o e n v a r io s s u b t ip o s , in c lu id o e l d o m in io d e l ta l lo P R 8 c o n c a b e z a s g lo b u la r e s C a l /09 y V N H 5. A d e m á s , s e c o lo c ó u n a c a b e z a g lo b u la r H 7 e n u n d o m in io d e l t a l lo H 3. E s a s e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s in c lu y e n a m b o s g r u p o s f i lo g e n é t ic o s d e la p r o te ín a H A d e l v i r u s d e la g r ip e . C a d a e s t r u c tu r a a r t i f ic ia l s e e x p r e s a b a e n la s u p e r f ic ie c e lu la r y c o n s e r v a b a la a c t iv id a d d e fu s ió n c o m o s e m u e s t r a e n la F ig u r a 7. L a g e n e r a c ió n d e v i r u s r e c o m b in a n te s q u e p o r t a b a n la s H A s q u im é r ic a s v a l id ó a d ic io n a lm e n te q u e la s H A s s e p l ie g a n c o r r e c t a m e n te y c o n s e r v a n la s fu n c io n e s b io ló g ic a s .
6.3 E je m p lo 3 : A p l ic a c io n e s p a r a d ia g n ó s t ic o d e lo s p o l ip é p t id o s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic o s d e l v i r u s d e la g r ip e y v a c u n a c ió n d e r a to n e s c o n p o l ip é p t id o s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic o s d e l v i r u s d e la g r ip e
E s te e je m p lo d e m u e s t r a q u e lo s p o l ip é p t id o s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic o s d e l v i r u s d e la g r ip e s e p u e d e n u t i l iz a r c o n f in e s d e d ia g n ó s t ic o y q u e lo s v i r u s q u e e x p r e s a n p o l ip é p t id o s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic o s d e l v i r u s d e la g r ip e s e p u e d e n u t i l iz a r e n v a c u n a s .
6.3.1 M a te r ia le s y m é to d o s
6.3.1.1 C é lu la s y p lá s m id o s
L a s c é lu la s 293 T y M D C K s e o b tu v ie r o n d e la A T C C y s e c o n s e r v a r o n e n m e d io d e E a g le m o d i f ic a d o c o n D u lb e c c o ( D M E M ) y m e d io e s e n c ia l m ín im o ( a m b o s d e G ib c o ) , r e s p e c t iv a m e n te , c a d a u n o c o m p le m e n t a d o c o n s u e r o d e te r n e r a fe ta l a l 10 % ( H y C lo n e ) y 100 u n id a d e s /m l d e p e n ic i l in a - 100 p g /m l d e e s t r e p to m ic in a ( P e n /S t r e p , G ib c o ) . T N M - F H ( S ig m a - A ld r ic h ) c o m p le m e n t a d o c o n s u e r o d e te r n e r a fe ta l a l 10 % y m e d io s d e c u l t iv o d e in s e c to H y c lo n e S F X ( T h e r -m o S c ie n t i f ic ) s e u t i l iz a r o n p a r a e l c u l t iv o d e la s c é lu la s S f9 y B T I - T N 5 B 1 - 4 ( H ig h F iv e ) .
E s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s q u im é r ic a s d e h e m a g lu t in in a c o n e l ta l lo d e A /P u e r to R ic o /8 /1934 ( P R 8 ) q u e c o n te n ía n e l d o ­ m in io d e la c a b e z a g lo b u la r d e l v i r u s A /M a l la r d /S w e d e n /81 /02 ( " c H 6 " ) o v i r u s A /G u in e a f o w l /H o n g K o n g /W F 10 /99 ( " c H 9 " ) s e g e n e r a r o n u s a n d o té c n ic a s s im i la r e s . P a r a la e s t r u c tu r a a r t i f ic ia l q u im é r ic a H 6 , d i f e r e n te s c o m p o n e n te s fu e r o n a m p l i f ic a d o s p o r P C R y c lo n a d o s e n e l p lá s m id o p D Z , u t i l iz a n d o u n a e s t r a te g ia d e c lo n a c ió n d e s c r i t a a n t e r io r ­ m e n te ( v é a s e , p o r e je m p lo , F o d o r e t a l. , 1999 , J V ir o l 73 :9679 - 82 ; y H a i e t a l. , 2008 , J o u r n a l o f V i r o lo g y 82 :10580 - 90 ) . B r e v e m e n te , d i f e r e n te s c o m p o n e n t e s d e la h e m a g lu t in in a q u im é r ic a ( c H A ) s e a m p l i f ic a r o n m e d ia n te P C R c o n c e b a ­ d o r e s q u e c o n te n ía n s i t io s d e S a p I, s e d ig i r ie r o n c o n S a p I y s e c lo n a r o n e n lo s s i t io s d e S a p I d e l p lá s m id o p D Z . P a ra la g e n e r a c ió n d e l p lá s m id o d e t r a n s fe r e n c ia d e b a c u lo v ir u s , s e a m p l i f ic ó c H 6 p o r P C R , s e c o r tó c o n B a m H I y N o t I , y s e c lo n ó e n m a r c o e n u n v e c to r d e t r a n s fe r e n c ia d e b a c u lo v ir u s p B a c P A K 8 m o d i f ic a d o ( G e n te c h ) q u e a lb e r g a b a u n fo ld o n d e fa g o T 4 C - te r m in a l y u n m a r c a d o r 6 - h is ( v é a s e M e ie r e t a l. , 2004 , J M o l B io l 344 :1051 - 69 ) . L a s s e c u e n c ia s d e to d o s lo s p lá s m id o s s e c o n f ir m a r o n m e d ia n te u n a s e c u e n c ia c ió n d e S a n g e r .
6.3.1.2 R e s c a te d e l v i r u s c H 9 r e c o m b in a n te
P a r a r e s c a ta r e l v i r u s d e la v a c u n a r e c o m b in a n te , s e u t i l iz a r o n o c h o p lá s m id o s d e g e n é t ic a in v e r s a q u e c o d i f ic a b a n e l A R N v y e l A R N m d e lo s s ie te s e g m e n to s v i r a le s d e t ip o s i lv e s t r e d e P R 8 y e l c H 9 , c o m o s e h a d e s c r i t o a n te r io r m e n te ( F o d o r e t a l. , 1999 , J V ir o l 73 :9679 - 82 ; y P le s c h k a e t a l. , 1996 , J V ir o l 70 :4188 - 92 ) . B r e v e m e n te , s e t r a n s fe c ta r o n c é lu la s 293 T c o n 1 p g d e c a d a u n o d e lo s o c h o p lá s m id o s u t i l iz a n d o L ip o fe c ta m in e 2000 ( In v i t r o g e n ) . A la s 12 h o r a s d e la t r a n s fe c c ió n , e l m e d io s e r e e m p la z ó c o n D M E M q u e c o n t e n í a a lb ú m in a d e s u e r o b o v in o a l 0 ,3 % , H E P E S 10 m M y 1 ,5 p g /m l d e t r ip s in a t r a t a d a c o n T P C K ( 1 - 1 - t o s i la m id a - 2 - f e n i le t i lc lo r o m e t i lc e to n a ) . D o s d ía s d e s p u é s d e la t r a n s fe c ­ c ió n , s e in o c u ló e l m a te r ia l s o b r e n a d a n te q u e c o n t e n í a v i r u s e n h u e v o s d e p o l lo e m b r io n a d o s d e 10 d ía s d e e d a d . E l l íq u id o a la n to id e o s e r e c o g ió d e s p u é s d e 2 d ía s d e in c u b a c ió n a 37 ° C y s e a n a l iz ó p a r a d e t e c ta r la p r e s e n c ia d e v i r u s m e d ia n te h e m a g lu t in a c ió n d e lo s g ló b u lo s r o jo s d e p o l lo . E l v i r u s c H 9 r e s c a ta d o s e m u lt ip l ic ó d e s p u é s e n h u e v o s d e 10 d ía s d e e d a d d e s p u é s d e u n a in c u b a c ió n d u r a n te 48 h o r a s a 37 ° C . L a s e x is t e n c ia s d e v i r u s s e t i t u la r o n m e d ia n te un ensayo en placa como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53). La secuencia del cH9 se confirmó mediante secuenciación de productos de PCR con transcripción in­ versa.
6.3.1.3 Generación de baculovirus recombinantes, expresión y purificación de proteínas
Para generar baculovirus recombinantes (rBV) portadores de cH6, se cotransfectaron plásmidos y ADN Baculogold (BDBioschiences) en células Sf9 con Cellfectin II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El baculovirus recombinante se amplificó en células Sf9 cultivadas en medio TNM-FH (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA) y los títulos se determinaron mediante ensayo en placa como se ha descrito previamente (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53).
Las células High Five (véase, Krammer et al., 2010, Mol Biotechnol 45:226-34) cultivadas en medios de células de insecto HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) se infectaron con rBV que expresaba cH6 con una multiplicidad de infección (MOI) de 10 y una densidad celular de 1 x 106 células/ml en matraces para agitación de 500 ml. Las células se recogieron 96 horas después de la infección y se separaron del material sobrenadante mediante centrifugación a baja velocidad durante 10 minutos a 2000 x g a temperatura ambiente. Para la purificación de la proteína cH6, se recogió el material sobrenadante y se incubó con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas a 4°C. La suspensión se cargó en columnas y se lavó tres veces con tampón de lavado (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8). La proteína eluyó en etapas de 0,5 ml con tampón de elución (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8), se analizó el contenido en proteína con reactivo de Bradford y se agruparon las fraccio­ nes que contenían proteína. La pureza y la identidad de la proteína se sometieron a ensayo mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. La concentración de proteína se determinó con el reactivo de Bradford.
6.3.1.4 Experimentos con ratones
Para todos los procedimientos, los ratones se anestesiaron con inyecciones intraperitoneales de 0,1 ml de mezclas de ketamina/xilazina (1,5 mg de ketamina y 0,3 mg de xilazina).
Dosis letales del 50% (DL50) de los ratones se determinaron en ratones BALB/c (Charles River Laboratories) infectando grupos de cuatro ratones con diluciones en serie de 10 veces del virus de la gripe. Se controlaron los pesos corporales durante un período de dos semanas. Se consideró que los ratones que perdían más del 25% de su peso corporal, habían alcanzado el punto final experimental y se sacrificaron. Los valores de DL50 fueron calculados por el método de Reed y Meunch (véase Reed y Meunch. 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497).
Para los experimentos destinados a evaluar los anticuerpos del tallo producidos después de la infección con el virus A/California/04/09 (Cal/09), ratones hembra BALB/c de 8 a 10 semanas de edad se sensibilizaron primero con una administración intramuscular de 80 pg de un plásmido de expresión que codificaba HA de longitud completa proce­ dente del virus PR8, junto con la aplicación de una estimulación eléctrica como se ha descrito anteriormente (sistema de administración TriGrid, Ichor Medical Systems) (véase, por ejemplo, Luxemburgo et al., 2007, Expert Opinion on Biological Therapy 7:1647-64). Tres semanas más tarde, los ratones fueron reforzados con una dosis subletal de 104 ufp de Cal/09 en un volumen de 50 pl, por vía intranasal. Los animales de control recibieron ADN solo o virus Cal/09 solo o una inyección intramuscular de la vacuna 2009-2010 (vacuna fraccionada Cal/09). T res semanas después del refuerzo o el punto de tiempo equivalente para los animales de control, se extrajo sangre de los ratones y se recogió el suero para someter a ensayo la reactividad frente a cH6 mediante inmunofluorescencia como se describe a conti­ nuación.
Para los experimentos que sometían a ensayo la eficacia del virus cH9 como estructura artificial de vacuna, se admi­ nistró ADN de longitud completa de PR8 como se ha descrito anteriormente. T res semanas después de la sensibiliza­ ción, los ratones fueron inoculados con 103 ufp de virus cH9 instilado por vía intranasal. Los animales de control recibieron ADN solo o virus Cal/09 solo o virus PR8 inactivado purificado por vía intramuscular. Tres semanas después del refuerzo o el punto de tiempo equivalente para los animales de control, los ratones fueron expuestos con una inoculación intranasal con DL50 a 5 x 104 del virus PR8. Los ratones se pesaron durante 14 días después de la expo­ sición. Los animales que perdían más del 27,5% de su peso corporal inicial fueron sacrificados y clasificados como muertos.
6.3.1.5 Inmunofluorescencia para confirmar la expresión de la hemaglutinina quimérica
Se transfectaron monocapas confluentes de células 293T con 1 pg de plásmido pDZ cH6. A las 48 horas de la transfección, las células se fijaron y se bloquearon con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%. A continuación, las células se incubaron con sueros combinados de los animales de cada uno de los cuatro grupos experimentales descritos anteriormente (ADN de PR8 solo, Cal/09 solo, ADN de PR8 e infección con Cal/09 o vacuna fraccionada Cal/09 solo). Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 hora con IgG anti-ratón conjugada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen). Las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.3.1.6 ELISA
Se recubrieron placas de ELISA de noventa y seis pocilios (Nunc, MaxiSorp) con 50 ml de cH6 expresado en baculovirus y se incubaron durante una noche a 4°C. Las placas se bloquearon con leche al 3%/PBS y luego se lavaron con PBS/Tween al 0,1% (PBST). El suero de los ratones vacunados se diluyó en serie en PBS y se añadió a la placa, seguido de una incubación de 1 hora a 37°C. A continuación, las placas se lavaron con PBST y se incubaron con una dilución 1:2500 de IgG anti-ratón ligada a peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare). Después de un lavado adi­ cional con PBST, se añadió sustrato SigmafastOPD (Sigma). La reacción se detuvo con H2SO43 M y las mediciones de densidad óptica se realizaron a 490 nm.
6.3.2 Resultados
6.3.2.1 Los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe se pueden usar en aplicaciones para diag­ nóstico
Se generó una estructura artificial de hemaglutinina quimérica que comprendía el dominio de la cabeza globular de la hemaglutinina de un subtipo de virus de la gripe H6 y el dominio del tallo/tallo de la hemaglutinina del virus PR8 para servir como herramienta analítica para evaluar la producción de anticuerpos por parte de los ratones inmunizados contra el dominio del tallo H6. Debido a que los ratones inmunizados solo fueron expuestos a la cabeza globular de los virus H1, los anticuerpos que se generaron en los animales de experimentación solo eran reactivos frente a la hemaglutinina H6 quimérica (cH6) si se dirigían hacia su tallo H1.
Como se muestra en las Figuras 11A y 11D, el tratamiento con ADN solo o con vacuna fraccionada pandémica no provocaba ningún anticuerpo reactivo en los ratones vacunados. Por el contrario, la infección con Cal/09 solo generaba anticuerpos reactivos frente al tallo (Figura 11B), aunque no en la medida provocada mediante una electroporación de ADN e infección (Figura 11C). Se usó un anticuerpo del tallo H1 con reacción cruzada, C179, como control para la transfección (Figura 11E). Como se esperaba, PY102, un anticuerpo dirigido contra la cabeza globular de PR8, no reaccionaba con la HA de cH6 transfectada (Figura 11F).
Como se muestra en la Figura 13, la utilidad del polipéptido de hemaglutinina quimérico del virus de la gripe cH6 como herramienta para detectar la unión de un anticuerpo del tallo, se confirmó mediante ELISA.
6.3.2.2 Los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe se pueden usar en vacunas
Como se muestra en la Figura 12, los animales que fueron vacunados con el virus PR8 inactivado estaban protegidos frente a una exposición letal, mientras que los animales que recibieron ADN solo sucumbieron completamente a la infección el día 5 después de la exposición. Los animales que recibieron solo el virus cH9 tampoco estaban protegidos contra la infección, con una tasa de supervivencia de solo el 25%. Por el contrario, los animales que primero fueron sensibilizados con ADN y luego reforzados con el virus cH9, estaban protegidos frente a la exposición, con una tasa de supervivencia que era estadísticamente la misma que la de los animales vacunados con la preparación de virus inactivado.
6.4 Ejemplo 4: Anticuerpos del tallo de hemaglutinina producidos mediante infección con el virus de la gripe H1N1 pandémica de 2009
Este ejemplo describe polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe que se usaron para estudiar anticuerpos específicos del dominio del tallo. Usando esos polipéptidos, se determinó que una infección con el virus pandémico H1N1 de 2009 provocaba un aumento en el título de anticuerpos neutralizantes de virus dirigidos contra el tallo de hemaglutinina. Además de los polipéptidos de hemaglutinina quiméricos del virus de la gripe, también se describen ensayos que pueden usarse para medir los anticuerpos neutralizantes del virus de la gripe que no se de­ tectan en el ensayo tradicional de inhibición de la hemaglutinación.
6.4.1 Materiales y métodos
6.4.1.1 Células y plásmidos
Las células 293T y MDCK se obtuvieron en la ATCC y se mantuvieron en medio de Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) y medio esencial mínimo (ambos de Gibco), respectivamente, cada uno complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina - 100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). Se utilizaron medios TNM-FH (Gemini Bioproducts) complementados con suero de ternera fetal al 10% y medios de cultivo de insecto Hyclone SFX (ThermoScientific) para el cultivo de células Sf9 y BTI-TN5B1-4 (High Five).
Estructuras artificiales de hemaglutinina quimérica (cHA) con el tallo de A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) que contenían el dominio de la cabeza globular de los virus A/Mallard/Sweden/81/02 (cH6/1) o A/Guinea fowl/Hong Kong/WF 10/99 (cH9/1), se generaron utilizando métodos descritos anteriormente (Hai et al., 2008, J Virol 82, 10580; Fodor et al., 1999, J Virol 73, 9679). En resumen, diferentes componentes de la hemaglutinina quimérica (cHA) se amplificaron mediante PCR con cebadores que contenían sitios para Sap I, se digirieron con Sap I y se clonaron en los sitios de Sap I del plásmido pDZ (Quinlivan et al., 2005, J Virol 79, 8431). Para la generación de los plásmidos de transferencia de baculovirus, se amplificaron cH6/1 y cH9/1 mediante PCR, se cortaron con BamHI y NotI y se clonaron en marco en un vector de transferencia de baculovirus pFastBac (Invitrogen) modificado, que albergaba un foldon de fago T4 C t e r m in a l y u n m a r c a d o r 6 - h is ( M e ie r e t a l. , 2004 , J M o l B io l 344 , 1051 ) . L a s s e c u e n c ia s d e to d o s lo s p lá s m id o s s e c o n f ir m a r o n m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n d e S a n g e r .
6.4.1.2 G e n e r a c ió n d e b a c u lo v ir u s r e c o m b in a n te s , e x p r e s ió n y p u r i f ic a c ió n d e p r o te ín a s
P a r a g e n e r a r la p r o te ín a c H 6 /1 y c H 9 /1 r e c o m b in a n te , lo s v e c to r e s d e t r a n s fe r e n c ia d e b a c u lo v ir u s s e t r a n s fo r m a r o n e n la c e p a d e E. c o li D H 10 B a c ( In v i t r o g e n ) s e g ú n la s in s t r u c c io n e s d e l f a b r ic a n te . S e r e c o g ie r o n c o lo n ia s d e D H 10 B a c q u e m o s t r a b a n e l f e n o t ip o c o r r e c to , s e c u lt iv a r o n y s e p r e p a r a r o n b á c m id o s u s a n d o u n k i t P la s m id M id i ( Q ia g e n ) .
Figure imgf000098_0001
L a s c é lu la s H ig h F iv e c u l t iv a d a s e n m e d io s d e c é lu la s d e in s e c to H y C lo n e S F X ( T h e r m o F is h e r S c ie n t i f ic ) s e in fe c ta r o n c o n b a c u lo v ir u s r e c o m b in a n te s q u e e x p r e s a b a n c H 6 /1 o c H 9 /1 c o n u n a m u lt ip l ic id a d d e in fe c c ió n (M O I) d e 10 y u n a d e n s id a d c e lu la r d e 1 x 106 c é lu la s /m l, e n m a t r a c e s d e a g i ta c ió n d e 500 m l ( K r a m m e r e t a l. , 2010 , M o l B io t e c h n o l 45 , 226 ) . L a s c é lu la s s e r e c o g ie r o n 96 h o r a s d e s p u é s d e la in fe c c ió n y s e s e p a r a r o n d e l m a te r ia l s o b r e n a d a n te m e d ia n te c e n t r i f u g a c ió n a b a ja v e lo c id a d d u r a n te 10 m in u to s a 2000 g y t e m p e r a t u r a a m b ie n te . P a r a la p u r i f ic a c ió n d e la s p r o ­ t e ín a s d e c H A , s e r e c o g ió e l m a te r ia l s o b r e n a d a n te y s e in c u b ó c o n r e s in a N i- N T A ( Q ia g e n ) d u r a n te 2 h o r a s a 4 ° C . L a s u s p e n s ió n s e c a r g ó e n c o lu m n a s y s e la v ó 3 v e c e s c o n ta m p ó n d e la v a d o ( N a C l 50 m M , 300 m M , im id a z o l 20 m M , p H 8 ) . L a p r o te ín a e lu y ó e n e ta p a s d e 0 ,5 m l c o n ta m p ó n d e e lu c ió n (N a 2 H C O 3 50 m M , N a C l 300 m M , im id a z o l 250 m M , p H 8 ) , s e a n a l iz ó e l c o n te n id o e n p r o te ín a c o n r e a c t iv o d e B r a d fo r d y s e a g r u p a r o n la s f r a c c io n e s q u e c o n te n ía n p r o te ín a . L a s f r a c c io n e s a g r u p a d a s s e in t e r c a m b ia r o n c o n ta m p ó n e n P B S y s e c o n c e n t r a r o n u s a n d o u n a u n id a d d e f i l t r o c e n t r í f u g o A m ic o n U lt r a ( M i l l ip o r e ) c o n u n l ím i te d e p e s o m o le c u la r d e 10 k D e n u n r o to r d e c u b e t a o s c i la n te . L a p u r e z a y la id e n t id a d d e la s p r o te ín a s s e a n a l iz a r o n m e d ia n te S D S - P A G E , t in c ió n d e C o o m a s s ie y t r a n s fe r e n c ia W e s ­ te r n . S e u s a r o n lo s s ig u ie n te s a n t ic u e r p o s p a r a c o n f i r m a r la e x p r e s ió n d e c H A : a n t is u e r o d e c a b r a a n t i- H 6 ( B E I, # N R -663 ) , G 1 - 26 ( a n t i- H 9 , r a tó n ; B E I# N R - 9485 ) , 3951 ( c o n e jo , a n t i- H A 2 d e P R 8 ) ( G r a v e s e t a l. , 1983 , V i r o lo g ía 126 , 106 ) , P Y 102 ( a n t i- c a b e z a d e P R 8 , r a tó n ) y 12 D 1 ( a n t i- t a l lo d e H 3 , r a tó n ) ( W a n g e t a l. , 2010 , P L o S P a th o g 6 , e 1000796 ) . L a s c o n c e n t r a c io n e s f in a le s d e p r o te ín a s e d e t e r m in a r o n c o n e l r e a c t iv o d e B r a d fo r d .
6.4.1.3 R e s c a te d e v i r u s r e c o m b in a n te s q u e e x p r e s a n c H A
P a r a r e s c a ta r e l v i r u s r e c o m b in a n te q u e e x p r e s a c H 9 / 1 , s e u s a r o n lo s p lá s m id o s d e g e n é t ic a in v e r s a q u e c o d i f ic a b a n e l A R N v y e l A R N m d e lo s s e is s e g m e n to s v i r a le s d e t ip o s i lv e s t r e d e P R 8 , a s í c o m o lo s p lá s m id o s q u e c o d i f ic a b a n la N A N 3 d e l v i r u s A /m a l la r d /A lb e r t a / 24 /01 y c H 9 / 1 , c o m o s e h a d e s c r i t o p r e v ia m e n te (H a i e t a l. , 2008 , J V ir o l 82 , 10580 ; F o d o r e t a l. , 1999 , J V ir o l 73 , 9679 , 27 ) . B r e v e m e n te , s e t r a n s fe c ta r o n c é lu la s 293 T c o n 1 p g d e c a d a u n o d e lo s o c h o p lá s m id o s u t i l iz a n d o L ip o fe c ta m in e 2000 ( In v i t r o g e n ) s e g ú n la s in s t r u c c io n e s d e l f a b r ic a n te . A la s 12 h o r a s d e la t r a n s -fe c c ió n , e l m e d io s e r e e m p la z ó c o n D M E M q u e c o n t e n í a a lb ú m in a d e s u e r o b o v in o a l 0 ,3 % , H E P E S 10 m M y 1 ,5 p g d e t r ip s in a /m L t r a t a d a c o n T P C K ( 1 - to s i la m id a - 2 - fe n i le t i lc lo r o m e t i lc e t o n a ) ( S ig m a T 1426 ) . D o s d ía s d e s p u é s d e la t r a n s fe c c ió n , s e in o c u ló m a te r ia l s o b r e n a d a n te q u e c o n t e n í a v i r u s e n h u e v o s d e p o l lo e m b r io n a d o s d e 10 d ía s d e e d a d . E l l íq u id o a la n to id e o s e r e c o g ió d e s p u é s d e 2 d ía s d e in c u b a c ió n a 37 ° C y s e a n a l iz ó p a r a d e t e c ta r la p r e s e n c ia d e v i r u s m e d ia n te h e m a g lu t in a c ió n d e g ló b u lo s r o jo s d e p o l lo . E l v i r u s c H 9 /1 r e s c a ta d o s e m u lt ip l ic ó d e s p u é s e n h u e ­ v o s d e 10 d ía s d e s p u é s d e u n a in c u b a c ió n d e 48 h o r a s a 37 ° C . L a s r e s e r v a s d e v i r u s s e v a lo r a r o n m e d ia n te u n e n s a y o e n p la c a c o m o s e h a d e s c r i t o p r e v ia m e n te , e n c é lu la s M D C K e n p r e s e n c ia d e t r ip s in a T P C K ( S te e l e t a l. , 2009 , J V ir o l 83 , 1742 ) . L a s e c u e n c ia d e l A R N d e c H 9 /1 s e c o n f ir m ó m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n d e p r o d u c to s d e la P C R c o n t r a n s ­ c r ip c ió n in v e r s a .
6.4.1.4 I n m u n o f lu o r e s c e n c ia p a r a c o n f i r m a r la e x p r e s ió n d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic a
S e in f e c ta r o n m o n o c a p a s c o n f lu e n te s d e c é lu la s M D C K c o n e l v i r u s c H 9 /1 N 3 c o n u n a M O I d e 2. A la s 48 h o r a s d e la in fe c c ió n , la s c é lu la s s e f i ja r o n y b lo q u e a r o n c o n a lb ú m in a s é r ic a b o v in a a l 1 % e n P B S q u e c o n t e n í a T w e e n 20 a l 0 ,1 % . A c o n t in u a c ió n , la s c é lu la s s e in c u b a r o n c o n m A b s d e r a tó n : a n t ic u e r p o a n t i- N P H T 103 , P Y 102 , a n t i- H 9 (B E I N R # 9485 ) o u n a n t ic u e r p o e s p e c í f ic o d e l ta l lo p a n -H 1 ( 6 F 12 ) . D e s p u é s d e t r e s la v a d o s c o n P B S q u e c o n t e n í a T w e e n 20 a l 0 ,1 % , la s c é lu la s s e in c u b a r o n d u r a n te 1 h o r a c o n Ig G a n t i- r a tó n c o n ju g a d a c o n A le x a F lu o r 488 ( In v i t r o g e n ) . L a s c é lu la s in f e c ta d a s s e a n a l iz a r o n m e d ia n te m ic r o s c o p ía d e f lu o r e s c e n c ia c o n u n m ic r o s c o p io O ly m p u s IX 70.
6.4.1.5 M u e s t r a s d e s u e r o h u m a n o
L a s m u e s t r a s d e s u e r o s h u m a n o s s e r e c o g ie r o n y s e u t i l iz a r o n d e a c u e r d o c o n p r o to c o lo s in s t i t u c io n a le s . S e r e c o g ie ­ ro n s u e r o s d e t r e s c o h o r t e s d e p a c ie n te s : a d u l to s n o in f e c ta d o s c o n p H 1 N 1 , n iñ o s n o in f e c ta d o s c o n p H 1 N1 y a d u l to s in f e c ta d o s c o n e l v i r u s p H 1 N 1. S e r e c o g ie r o n s u e r o s d e p a c ie n te s in f e c ta d o s c o n p H 1 N1 e n la s 3 p r im e r a s s e m a n a s d e in f e c c ió n s in t o m á t ic a . P a r a lo s e x p e r im e n t o s q u e u t i l iz a b a n s u e r o c o m b in a d o , s e m e z c ló u n v o lu m e n ig u a l d e c a d a m u e s t r a p a r a g e n e r a r u n c o n ju n to . L a c o n f ir m a c ió n d e la in f e c c ió n f u e r e a l iz a d a p o r W r a m m e r t e t a l. m e d ia n te R T -P C R y p o r e n s a y o s s e r o ló g ic o s ( W r a m m e r t e t a l. , 2011 , J E x p M e d 208 , 181 -193 ) .
6.4.1.6 E n s a y o s d e in h ib ic ió n d e h e m a g lu t in in a
Los sueros recogidos se inactivaron primero mediante tratamiento con tripsina y peryodato térmico o mediante trata­ miento con RDE para eliminar los inhibidores no específicos de la hemaglutinación (Coleman, Dowdle, 1969, Bull World Health Organ 41, 415 (1969). Se realizaron ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HI) para someter a ensayo la reactividad con los virus cH9/1 N3 y A/duck/France/MB42/76 (HA H6) (Desselberger et al., 1978, Proc Natl Acad Sci U S A 75, 3341 (julio, 1978)) como se ha descrito anteriormente (Lowen et al., 2009, J Virol 83, 2803). Una muestra se considera negativa si no se observa actividad de HI con una dilución 1:10 del suero.
6.4.1.7 ELISAs
Placas de ELISA de noventa y seis pocillos (Qiagen HisSorb o Nunc Immulon 2) se recubrieron con 50 ul de cH6/1, cH9/1 expresado en baculovirus o hemaglutinina de longitud completa (HA H5, BEI NR#660; HA H3, BEI NR#15171) proteínas o hélice alfa larga (LAH) de la secuencia de H1 (PR8) (Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979) diluidos en PBS y se incubaron durante una noche a 4°C. Las placas se bloquearon con leche al 0,5%/suero de cabra al 2%/PBS y luego se lavaron 3X con PBS/Tween al 0,1% (PBST). Anticuerpos monoclonales, sueros de sujetos humanos y sueros de ratones utilizados como controles se diluyeron en serie en PBS o tampón de bloqueo y luego se agregaron a la placa, seguido de una hora de incubación a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron 3X con PBST y se incubaron con una dilución 1:5000 de IgG [Fc] anti-humana de cabra acoplada a fosfatasa alcalina (AP) (Meridian Life Science) o anti-AP de ratón (Invitrogen) durante una hora adicional. Después de lavar 3X con PBST, se añadió sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma). La reacción se detuvo con NaOH después de 10 minutos y se tomaron mediciones de la densidad óptica a 405 nm.
6.4.1.8 Ensayo de reducción de placa
Los sueros de pacientes adultos infectados y sin tratamiento previo (no infectados con el virus pH1N1) se agruparon primero y se cargaron en una columna de flujo por gravedad con proteína G y sefarosa (GE Healthcare) para la purificación de las proteínas de IgG. La columna se lavó con PBS. Los anticuerpos policlonales eluyeron con un tam­ pón de glicina 0,1 M (pH 2,7). Se añadió inmediatamente un tampón Tris-HCl 2 M (pH 10) en una proporción 1:10 para restaurar el pH. El eluato se intercambió con tampón en PBS y se concentró usando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore) con un corte de 50 kD de peso molecular en un rotor de cubeta oscilante. Las concentra­ ciones de proteína se midieron en un espectrofotómetro NanoDrop 2000 usando el método A280. La eliminación de los inhibidores séricos no específicos se confirmó mediante pruebas de HI, utilizando múltiples cepas de virus que demostraron una ausencia de actividad HI en las preparaciones de IgG purificadas (datos no mostrados). La capacidad de neutralización de los anticuerpos reactivos con el tallo se evaluó como se ha descrito anteriormente (Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796). Primero se diluyó el virus hasta una concentración que produciría 100 unidades formadoras de placa por pocillo. A continuación, se coincubaron diferentes concentraciones de IgG de los sueros agrupados con el virus a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron placas de seis pocillos sembradas con células MDCK con PBS y luego se infectaron con 200 ul de mezclas de virus-IgG. Después de una incubación de cuarenta y cinco minutos a 37°C, se aspiraron el virus y la IgG desde las células y se añadió a cada pocillo una capa de agar que contenía la concentración adecuada de anticuerpo y tripsina TPCK. Las placas se incubaron durante 2 días a 37°C. Las placas se visualizaron mediante inmunotinción (Bouvier et al., 2008, J Virol 82, 10052) utilizando el anticuerpo anti-H9, G1-26.
6.4.1.9 Ensayo de neutralización de partículas de pseudotipo
El procedimiento para la producción de pseudopartículas se adaptó a partir de estudios previos (Evans et al., 2007, Nature 446:801). Brevemente, las células 293-T se cotransfectaron con cuatro plásmidos que codificaban (i) un provi­ rus que contenía el agente informador deseado (V1-GLuc), (ii) Gag-Pol del VIH, (iii) la proteína de hemaglutinina cH9/1 quimérica y (iv) neuraminidasa (NA) del virus de la gripe B/Yamagata/16/88 (Tscherne et al., 2010, J Virol Methods 163, 336). El plásmido V1-GLuc codifica una proteína luciferasa que es secretada por las células y puede detectarse en el material sobrenadante celular. Los materiales sobrenadantes se recogieron 48 h después de la transfección y posteriormente se filtraron (tamaño de poro de 0,45 gm) para purificar las preparaciones de partículas de cH9/1. A continuación, las partículas se incubaron (en la cantidad determinada para proporcionar actividad luciferasa dentro del intervalo lineal después de la infección) con diferentes concentraciones (50 gg/ml, 10 gg/ml y 2 gg/ml) de IgGs huma­ nas purificadas y se añadieron a células MDCK. Las infecciones prosiguieron durante 6 horas antes de que se lavaran las células y se pusiera material sobrenadante de nuevo aporte sobre las células. Todas las infecciones con partículas de pseudotipo se realizaron en presencia de 1 gg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (Tscherne et al., 2010, J Virol Methods 163, 336). Se realizaron ensayos con luciferasa cuarenta y ocho horas después de la infección.
6.4.2 Resultados
6.4.2.1 Desarrollo de reactivos basados en hemaglutinina quimérica
Se generaron estructuras artificiales de hemaglutinina quimérica (cHA) para servir como herramientas analíticas para evaluar la presencia de anticuerpos del tallo en sueros humanos. Aprovechando un enlace disulfuro que existe entre C52 y C277, y que define el límite entre el tallo y la cabeza de HA, se diseñaron plásmidos de expresión que codifica­ ban el dominio de la cabeza globular de una hemaglutinina H6 o H9 sobre el dominio del tallo de la HA del virus PR8 (Fig. 14A). Se planteó la hipótesis de que las muestras de suero humano que contenían anticuerpos del tallo probablemente serían negativas para la actividad de inhibición de la hemaglutinación (HI) contra los virus H6 o H9 (debido a una falta de exposición previa a esos subtipos de virus), pero serían reactivas con las estructuras artificiales cH6/1 o cH9/1 debido a una exposición previa al tallo de la hemaglutinina H1. Estas herramientas, proteínas cHA expresadas de forma recombinante y virus que expresan cHA, podrían usarse para evaluar cantidades relativas de anticuerpos del tallo en muestras de suero humano y para medir cualquier actividad neutralizante mediada por esos anticuerpos específicos del tallo.
Con el fin de generar proteína cH6/1 y cH9/1 para ensayos analíticos, se generaron plásmidos que codifican las HAs quiméricas y se expresaron como proteínas solubles en un sistema de expresión de baculovirus. La tinción con Coomassie de 2 pg de proteína total, sugiere un alto grado de pureza en esas preparaciones (Fig. 17A). Se cree que la migración ligeramente retrasada de cH9/1 es el resultado de un mayor número de sitios de glicosilación ocupados en la cabeza de cH9/1. Las proteínas cHA se caracterizaron adicionalmente mediante análisis de transferencia Wes­ tern usando anticuerpos reactivos con varias partes de la HA. Como se muestra en la Fig. 17B, solo cH6/1, cH9/1 y HA de longitud completa de PR8 reaccionaban con un antisuero policlonal de conejo específico para el tallo de PR8. Los anticuerpos monoclonales contra los dominios de la cabeza de H6, H9 y PR8 confirmaron que las estructuras artificiales quiméricas expresaban cabezas extrañas sobre un tallo de PR8. La proteína H3 se usó como control nega­ tivo y solo se detectó cuando se usaba el anticuerpo pan-H3, 12D1 (Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796).
También se rescataron virus recombinantes que expresaban las moléculas quiméricas con el fin de detectar anticuer­ pos del tallo neutralizantes. Debido a que todos los virus de la gripe humana durante el último siglo han codificado una NA del subtipo N1 o N2, se razonó que el rescate del virus cH9/1 N3 reordenado permitiría la evaluación de la capaci­ dad de neutralización de los anticuerpos específicos del tallo, sin medir ninguna actividad del anticuerpo de neuraminidasa (N1 o N2). El virus cH9/1 N3 (que expresa el tallo H1 con la cabeza globular H9 de HA con una neuraminidasa de subtipo N3) se rescató utilizando genética inversa y se cultivó hasta títulos altos en huevos de gallina embrionados. El fenotipo del ensayo en placa de este virus era similar al del virus de tipo silvestre PR8 (Fig. 17C). Para confirmar la presencia de la cabeza H9 después del pase con el virus, las células se infectaron con el virus cH9/1 N3. A continua­ ción, las células infectadas se sometieron a ensayo con el mAb G1-26 de ratón, un anticuerpo específico para las proteínas de hemaglutinina del subtipo H9. Se usó un anticuerpo específico del tallo pan-H1, 6F12, para detectar células infectadas con el virus PR8 de tipo silvestre y cH9/1 N3 (Fig. 14B).
6.4.2.2 Los anticuerpos específicos del tallo se unen y neutralizan cHA
Para confirmar que las proteínas cH6/1 y cH9/1 podían usarse como herramientas para detectar anticuerpos del tallo, primero se validó el uso de esas cHAs con un anticuerpo que se sabía que reaccionaba con el tallo de HA. De hecho, el mAb C179 de ratón, un anticuerpo reactivo con el tallo de HA H1 (Okuno et al., 1993, J Virol 67, 2552), unido a la proteína cH6/1 y cH9/1 se expresaba en baculovirus, mediante ELISA de una manera dependiente de la dosis (Figs.
18A y B).
A continuación, se comprobó si la replicación del virus cH9/1N3 podía inhibirse con el anticuerpo monoclonal 6F12, que tiene actividad neutralizante frente a los virus de la gripe H1 (datos no mostrados). El anticuerpo 6F12 era capaz de unirse y neutralizar el virus cH9/1 N3 en un ensayo de reducción de placas (Figs. 18 C y D), de manera dependiente de la dosis, observándose una inhibición del cien por cien con concentraciones superiores a 4 pg/ml. Estos resultados validaron la hipótesis de que las proteínas quiméricas y el virus cH9/1N3 recombinante podían usarse para detectar anticuerpos del tallo con actividad neutralizante.
6.4.2.3 Los pacientes infectados con pH1 N1 tienen títulos altos de anticuerpos que se unen y neutralizan cHA
Antes del uso de las proteínas solubles cH6/1 y cH9/1 para cuantificar los anticuerpos reactivos con el tallo en muestras de sangre de pacientes, se analizó la actividad HI de los sueros frente a virus que expresaban esos dos subtipos de HA. Utilizando los virus A/duck/France/MB42/76 (H6) y cH9/1 N3, se confirmó que todas las muestras de suero pediá­ tricas y adultas recogidas eran HI negativas (no se muestran los resultados).
A continuación, se analizó mediante ELISA la reactividad de los sueros con las proteínas cH6/1 y cH9/1. Los sueros recogidos de sujetos adultos y pediátricos no infectados con virus pH1 N1, mostraban poca reactividad con cualquiera de las proteínas. Sin embargo, los sueros recogidos de pacientes infectados con el virus de la gripe pH1 N1, mostraban una mayor unión a ambas estructuras artificiales de cHA, con una diferencia de más de 30 veces en la reactividad de IgG (comparando diluciones que arrojaban lecturas de densidad óptica equivalentes) al comparar grupos de suero de pH1 N1 infectados con los de adultos y niños no infectados (Figs. 15 A y B). Por lo tanto, se razonó, teniendo en cuenta los datos negativos de HI, que la reactividad con las proteínas cHA se produce en el dominio del tallo.
Usando muestras agrupadas de sueros humanos, también se sometió a ensayo la unión de IgG a una porción del tallo de HA, la hélice alfa larga (LAH). Se había demostrado previamente que esas IgGs mediaban en la inmunidad protec­ tora en ratones (Wang et al., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979). Los sueros de pacientes infectados con pH1N1 contenían anticuerpos reactivos con LAH H1, mientras que los pacientes no expuestos al virus pandémico tenían un mínimo de anticuerpos séricos específicos de LAH (Fig. 15C).
El subtipo de hemaglutinina H5 está dentro del mismo grupo filogenético que el de HA H1 y comparte una estructura del tallo muy similar (Ekiert et al., 2009, Science 324, 246). Curiosamente, los pacientes expuestos a pH1N1 tenían especificidades reforzadas de anticuerpos séricos, reactivas con la proteína H5 (Fig. 15D), mientras que no tenían ninguna actividad HI sérica contra el virus del subtipo H5 homólogo (datos no mostrados). Este resultado sugirió que la exposición al virus pH1 N1 podía haber conferido un grado de inmunidad anti-H5 mediada por anticuerpos específi­ cos del tallo.
Es importante destacar que los pacientes infectados con pH1 N1 no tenían anticuerpos séricos reforzados específicos de una proteína de hemaglutinina H3 (H3 está en un grupo filogenético distinto de las HAs H1 y H5) (Fig. 15E). Este resultado demuestra que el título mejorado de anticuerpos específicos del tallo en sueros de pacientes infectados con pH1N1, no es una función de la estimulación inmunitaria general; más bien, las especificidades del anticuerpo del tallo H1 se vieron reforzadas selectivamente por la infección con la cepa del virus pandémico.
A continuación, se evaluó si esos anticuerpos reactivos del tallo encontrados en esas muestras humanas tenían ca­ pacidad neutralizante. Se combinaron muestras de suero de adultos infectados y no infectados y se purificó la IgG total para eliminar los inhibidores no específicos (p. ej., moléculas que contienen ácido siálico y lectinas) que se unirían a la cabeza de hemaglutinina. Usando esas preparaciones de IgG pura, se logró la formación de placas con inhibición completa con concentraciones de anticuerpo superiores a 55,5 pg/mL de IgG sérica total (Figs. 16 A y B). De acuerdo con los datos de ELISA, se observaba una diferencia de aproximadamente 30 veces en la capacidad de neutralización al comparar los sueros de infectados con pH1N1 con los de adultos no infectados. Utilizando el mAb 6F12 como patrón, se pudo realizar una comparación entre las actividades neutralizantes mediadas por 6F12 y la preparación de IgG humana policlonal. Al comparar las concentraciones de 6F12 e IgG humana que producían una neutralización del 100% del virus cHA, se estimó que el 7% del total de IgG humana de los pacientes infectados con pH1N1 durante los últimos 30 días, comprendía anticuerpos del tallo neutralizantes.
Finalmente, se evaluó la capacidad de neutralización de los anticuerpos reactivos con el tallo, utilizando un ensayo de infección de partículas de pseudotipo que tiene una lectura de la actividad de luciferasa que se genera tras la entrada del virus en las células hospedadoras. Las partículas pseudotipadas que expresaban la proteína cH9/1 se incubaron con IgG humana purificada y se midió la actividad neutralizante mediante la inhibición de la entrada de partículas, lo que daba lugar a una ausencia de actividad enzimática de luciferasa en los materiales sobrenadantes celulares (véase, métodos). De acuerdo con el ensayo de reducción de placas, el ensayo de partículas pseudotipadas también mostraba una neutralización del 100% de las partículas con concentraciones de IgG totales superiores a 10 pg/ml (Fig. 16C).
6.4.3 Conclusión
Se desarrollaron nuevas herramientas analíticas, en forma de proteínas quiméricas de hemaglutinina y virus que ex­ presaban esas proteínas quiméricas, que permitieron la detección selectiva de anticuerpos específicos del tallo en preparaciones que también incluyen anticuerpos que se unen a la cabeza globular de las proteínas de hemaglutinina. Esas estructuras artificiales novedosas de hemaglutinina tienen un tallo del subtipo H1 constante, con dominios de la cabeza globular procedentes de distintos subtipos de hemaglutinina (por ejemplo: tallo de H1 con cabeza de H6). Esto se logró aprovechando un enlace disulfuro que existe entre las cisteínas 52 y 277 en la proteína hemaglutinina (19) para intercambiar la secuencia intermedia con la de un subtipo diferente de HA.
Usando esas estructuras artificiales de hemaglutinina quimérica (cHA), se demostró que una pequeña cohorte de seres humanos con una infección confirmada con el virus pH1 N1, generaba un título elevado de anticuerpos neutrali­ zantes específicos del tallo, en comparación con los controles adultos y pediátricos no infectados con los virus pH1 N1. Estos hallazgos respaldan la hipótesis de que los anticuerpos reactivos con el tallo de hemaglutinina, generados como respuesta a una infección con pH1N1, probablemente contribuían a la extinción de los virus H1N1 estacionales que circulaban antes de la pandemia de la gripe del 2009.
6.5 Ejemplo 5: Virus de la gripe que expresan hemaglutininas quiméricas: dominios de la cabeza globular y el tallo obtenidos a partir de diferentes subtipos y grupos filogénicos
Este ejemplo describe varias hemaglutininas de virus de la gripe quiméricos funcionales que incluyen una variedad de combinaciones de cabeza globular y tallo procedentes de diferentes subtipos de hemaglutinina y diferentes grupos filogénicos, así como virus de la gripe recombinantes que expresan esas hemaglutininas quiméricas, que tenían pro­ piedades de crecimiento similares a las de los virus de la gripe de tipo silvestre. Esos virus recombinantes quiméricos poseen propiedades de crecimiento similares a las de los virus de la gripe de tipo silvestre y pueden usarse como reactivos para medir anticuerpos específicos de dominios en ensayos virológicos e inmunológicos.
6.5.1 Materiales y métodos
6.5.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se conservaron en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) o en MEM (Gibco, Invitrogen) complementado con suero de ternera fetal al 10% (HyClone; Thermo Scientific) y penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). Los virus de tipo silvestre A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) y A/Perth/16/2009 (Perth/09) (amablemente proporcionados por Alexander Klimov, CDC) y los virus recombinantes se cultivaron en huevos de gallina embrionados (Charles River) exentos de agentes patógenos espe­ cíficos de 10 días de edad, a 37°C durante 2 días.
6.5.1.2 Construcción de los plásmidos
Los plásmidos que codificaban las diferentes hemaglutininas quiméricas se construyeron utilizando una estrategia similar a la descrita anteriormente (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Brevemente, los diferentes segmentos de HA quimérica se amplificaron mediante PCR con cebadores que contenían sitios para SapI, se digirieron con SapI y se clonaron en los sitios de SapI del vector de expresión pDZ de ambos sentidos, en el que la transcripción del ARNv está controlada por el promotor de la ARN polimerasa I humana y el terminador de la ARN polimerasa I de ratón, y la transcripción de ARNm/ARNc está contro­ lada por el promotor de la polimerasa II de beta actina de pollo (véase, por ejemplo, Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439), mediante ligación multisegmentaria. Agradecemos amablemente a Daniel Pérez (Universidad de Maryland) por el plásmido HA H7 (Genbank ID: DQ017504). Los plásmidos que codificaban los genes A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) se usaron como se ha descrito previamente (Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590).
6.5.1.3 Número de registro de la secuencia de nucleótidos
Todos los genes cHA construidos utilizados en este estudio se han depositado en la base de datos Influenza Research con el número de registro IRD-RG-684014, IRD-RG-684022, IRD-RG-684030 e IRD-RG-684038. Las cH1/1, cH5/1, cH7/3 y cH5/3 quiméricas se indican como A/Puerto Rico/8-RGcH1-1/34, A/Puerto Rico/8-RGcH5-1/34, A/Perth/16-RGcH7-3/09 y A/Perth/16-RGcH5-3/09, respectivamente.
6.5.1.4 Análisis por citometría de flujo
Para evaluar los niveles de expresión de la proteína hemaglutinina en la superficie celular, se transfectaron células 293T con 1 pg del plásmido apropiado, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante o se infectaron células MDCK con virus recombinantes que expresaban cHA. A las 48 h de la transfección, las células 293T se tripsinizaron y se resuspendieron en PBS que contenía FBS al 2% antes de teñirlas con el anticuerpo monoclonal (mAb) 6F12 (5 pg/ml), un mAb generado en nuestro laboratorio que es ampliamente reactivo con el domi­ nio del tallo del grupo 1 de HAs (datos no mostrados) o con el mAb 12D1 (5 pg/mL) contra las HAs H3 (véase Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). A las 12 h de la infección, las células MDCK se resuspendieron mediante tripsinización y se tiñeron con el mAb 12D1. Las células teñidas se analizaron en un citómetro de flujo Beckman Coulter Cytomics FC 500 y los resultados se analizaron usando el programa informático FlowJo.
6.5.1.5 Generación de pseudopartículas y ensayo de entrada
El procedimiento para la producción de pseudopartículas fue adaptado a partir de estudios previos (véase, por ejemplo, Evans et al., 2007, Nature 446:801-805 y Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43). Brevemente, cotransfectamos células 293T con cuatro plásmidos que codificaban (i) un pro-virus que contenía el agente informador deseado (luciferasa de V1-Gaussia) (Evans et al., 2007, Nature 446:801-805), (ii) Gag-Pol VIH (Evans et al., 2007, Nature 446:801 -805), (iii) proteína de hemaglutinina quimérica y (iv) neuraminidasa (NA) del virus B/Yamagata/16/88. Los materiales sobrenadantes se recogieron 72 h después de la transfección y posteriormente se filtraron (tamaño de poro de 0,45 pm). La presencia de partículas similares a virus (VLPs) del pseudotipo se evaluó mediante un ensayo de hemaglutinación. Se ajustaron diferentes preparaciones de VLPs para las 4 mismas unidades de hemaglutinación antes de la inoculación de las células MDCK. Todos los siguientes ensayos que empleaban pseudopartículas se rea­ lizaron en presencia de 1 pg/mL de polibreno (Sigma) para aumentar la eficiencia de la transducción (véase, por ejemplo, Evans et al., 2007, Nature 446:801-805 y Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43).
El ensayo de entrada se realizó transduciendo células MDCK con pseudopartículas que expresaban diferentes hemaglutininas quiméricas y contenían el agente informador de luciferasa de Gaussia. Veinticuatro horas después de la transducción, las células se lavaron tres veces con medio de nuevo aporte para eliminar cualquier residuo de proteína de luciferasa de Gaussia presente en el inóculo. Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se realizaron ensayos con luciferasa (Evans et al., 2007, Nature 446:801-805).
6.5.1.6 Rescate de virus de la gripe A quiméricos recombinantes
El rescate de los virus de la gripe A a partir del ADN del plásmido se realizó como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Para generar el virus PR8 recombinante de tipo silvestre (rWT), se cotransfectaron células 293T con 1 pg de 8 plásmidos de rescate pDZ PR8, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El plásmido de HA de tipo silvestre se sustituyó por un plásmido que codificaba la HA quimérica deseada para generar virus recombinantes que expresaban cHA. A las 6 h de la transfección, el medio se reemplazó con DMEM que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3%, HEPES 10 mM y 1,5 pg/ml de tripsina tratada con TPCK (L-1-tosilamida-2-feniletilclorometilcetona) (Sigma). Después de 24 horas de la transfección, se inocularon huevos de pollo embrionados de 8 días con material sobrenadante que contenía virus. Se recogió el líquido alantoideo después de 2 días de incubación a 37°C y se analizó la presencia de virus mediante hemaglutinación de los glóbulos rojos de pollo. Las reservas de virus se valoraron mediante un ensayo de placa en células MDCK como se ha descrito anteriormente (Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590).
6.5.1.7 Ensayo de las cinéticas de crecimiento de los virus
Para analizar las características de la replicación de los virus recombinantes, se inocularon huevos de pollo embrionados de 10 días de edad con 100 unidades formadoras de placa (ufp) de virus recombinantes de tipo silvestre o que expresaban cHA. Se recogió líquido alantoideo y posteriormente se analizó el crecimiento vírico 0, 9, 24, 48 y 72 h después de la infección (hpi). Los títulos de virus presentes en el líquido alantoideo se determinaron mediante ensayo de placa en células MDCK como se ha indicado anteriormente.
6.5.1.8 Inmunotinción de las placas
Las placas se visualizaron mediante inmunotinción con mAb HT103 contra la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe A, utilizando un protocolo que se ha descrito previamente (Bouvier et al., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; y Steel et al, 2009, J Virol 83:1742-53).
6.5.1.9 Transferencia Western y análisis mediante inmunofluorescencia indirecta
Las células MDCK confluentes se infectaron (multiplicidad de infección [MOI] de 2) con los virus de la gripe recombi­ nantes indicados o se infectaron de forma simulada con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 1 h a 37°C. A las 12 hpi, las células se lisaron en tampón de carga 1X SDS como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los lisados celulares reducidos se analizaron mediante análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos monoclonales (mAbs) contra la nucleoproteína del virus de la gripe A (NP) (HT 103), el dominio de la cabeza de PR8 HA (PY102), el dominio de la cabeza de HA Cal/09 (29E3), dominio de la cabeza de HA VN/04 (mAb #8) y 12D1, un anticuerpo pan-H3 reactivo contra el tallo de HA. Para detectar los dominios de la cabeza H7, se utilizó suero policlonal de cabra NR-3152 (obtenido contra el virus A/FPV/Dutch/27 (H7), BEI Resources). Se usó un anticuerpo anti-gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (Abcam) para el control de la carga. Las proteínas se visualizaron usando un sistema mejorado de detección de proteínas mediante quimioluminiscencia (PerkinElmer Life Sciences).
Para el análisis de la inmunofluorescencia, se infectaron monocapas confluentes de células MDCK sobre cubreobjetos de 15 mm con virus recombinantes, con una MOI de 2. A las 15 hpi, las células se fijaron y se permeabilizaron con metanol-acetona (relación 1:1) a -20°C durante 20 minutos. Después de ser bloqueadas con albúmina de suero bovino al 1% en PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con los anticuerpos descritos anteriormente, así como con el mAb 6F12. Después de tres lavados con PBS que contenía Tween 20 al 0,1%, las células se incubaron durante 1 h con IgG anti-ratón conjugada con Alexa Fluor 594 (Invitrogen) o IgG anti-cabra con­ jugada con Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Después de los últimos tres lavados, las células infectadas se analizaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio Olympus IX70.
6.5.1.10 Ensayo de reducción de placa
El ensayo de reducción de placa se realizó como se ha descrito anteriormente (véase, Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). Se incubaron aproximadamente de 60 a 80 ufp de virus recombinantes que expresaban cHAs formadas con dominios de la cabeza globular Cal/09 o VN/04 sobre un tallo PR8 con o sin diferentes concentraciones (100, 20, 4, 0,8, 0,16 y 0,032 ug/ml) de mAb KB2, un anticuerpo anti-HA del tallo ampliamente neutralizante generado en nuestro laboratorio (datos no mostrados), durante 60 minutos en un volumen total de 240 uL a temperatura ambiente. Una capa confluente de células MDCK en placas de 6 pocillos se lavó dos veces con PBS y luego se incubó con la mezcla de anticuerpo y virus durante 40 minutos a 37°C. Una capa de agar con tripsina TPCK complementada con anticuerpo en las concentraciones descritas anteriormente o sin anticuerpo, se añadió después a cada pocillo una vez que se había aspirado el inóculo. Las placas se incubaron durante 2 días a 37°C. A continuación, las placas se visualizaron mediante inmunotinción (Bouvier et al., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; y Steel et al, 2009, J Virol 83:1742-53) con anticuerpo anti-NP del virus de la gripe A, HT 103.
6.5.1.11 Ensayo de neutralización de partículas de pseudotipo
El procedimiento para la producción de partículas de pseudotipo era el mismo que se describió anteriormente, utili­ zando la estructura artificial cHA que se compone de una cabeza VN/04 (H5) o Cal/09 (H1) y un tallo PR8 (H1) con NA del virus de la gripe B/Yamagata/16/88. A continuación, las partículas se incubaron con diferentes concentraciones de mAb KB2 con diluciones de 5 veces desde 100 hasta 0,032 pg/ml. Luego, esas mezclas se agregaron a las células MDCK. Las transducciones prosiguieron durante 6 horas antes de que se lavaran las células y se colocara medio de nuevo aporte sobre las células. Todas las transducciones con partículas de pseudotipo se realizaron en presencia de 1 pg/mL de polibreno (Sigma, St. Louis, MO) (Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163: 336-43). Cuarenta y ocho horas después de la transducción, se realizaron ensayos con luciferasa para evaluar el grado en que el mAb KB2 bloqueaba la entrada.
6.5.2 Resultados:
6.5.2.1 Generación de hemaglutininas quiméricas
Para ver si los residuos de cisteína que forman el enlace disulfuro Cys52-Cys277 se habían conservado, en este estudio se utilizó un alineamiento de las secuencias de HA del virus de la gripe A de los subtipos H1, H3, H5 y H7. Debido a que esos residuos de cisteína están altamente conservados en los subtipos de HA, tanto para el grupo 1 como para el grupo 2, el enlace disulfuro Cys52-Cys277 se usó como un punto de delimitación entre los dominios de la cabeza y el tallo. Al definir la secuencia entre Cys52 y Cys277 como región de la cabeza, y el resto de la molécula como tallo, se racionalizó que se podían preparar estructuras artificiales que codificaban nuevas combinaciones de cabeza y tallo a partir de una variedad de subtipos de HAs (Figs. 19 A y B).
El grado de identidad de los aminoácidos que existe entre las regiones del tallo de los subtipos de hemaglutinina nos animó aún más a pensar que el intercambio de los dominios de la cabeza podría ser posible. Se observaron porcen­ tajes más altos de identidad de aminoácidos en los dominios del tallo en todos los subtipos, en comparación con los dominios de la cabeza (Fig. 20).
Los 16 subtipos de virus de la gripe HA se clasifican en dos grupos filogenéticos (Palese y Shaw, 2006, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, Fields virology, 5a ed., 1647-1690). Debido a que se observaron porcentajes más altos de identidad de aminoácidos dentro de las regiones del tallo de un grupo particular (Fig. 20) y porque se había generado con éxito un virus cHA que contenía dominios de la cabeza y el tallo procedentes de virus del grupo 1 (Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-8), se intentó generar cHAs de intragrupos. Para el grupo 1, se generaron dos estructuras artificiales quiméricas de hemaglutinina que codifican el dominio de la cabeza globular pandémica H1 Ca1/09 HA o VN/04 con la región del tallo de la HA PR8 (H1) (cH1/1 y cH5/1, respectivamente) (Fig. 19B). Se aplicó una estrategia similar para generar una HA quimérica que expresaba dominios de la cabeza y el tallo procedentes de diferentes cepas de virus de la gripe del grupo 2: la cabeza de Alb/01 (H7, grupo 2) y la región del tallo de HA Perth/09 (H3, grupo 2) (cH7/3) (Figura 19B). Finalmente, se evaluó si los dominios de la cabeza y el tallo podían intercambiarse para crear una HA quimérica entre los grupos que contuviera el dominio de la cabeza de HA VN/05 (H5, grupo 1) sobre un tallo HA Perth/09 (H3, grupo 2) (cH5/3) (Figura 19B).
Después de la construcción de esos plásmidos, se realizaron experimentos para determinar si las diferentes estructu­ ras artificiales de HAs quiméricas se podían expresar y transportar a la superficie celular como las HAs de tipo silvestre. Un análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) de las células 293T transfectadas transito­ riamente, se realizó después de la tinción de la superficie con anticuerpos específicos del dominio del tallo H1 y H3, respectivamente. Usando ese método, se detectó expresión en la superficie celular de las cuatro estructuras artificiales quiméricas (Fig. 21). Sin embargo, en comparación con la HA PR8 de tipo silvestre, se detectó menos expresión de la proteína de superficie para la estructura artificial cH1/1, lo que podía atribuirse al carácter inherente asociado con el dominio de la cabeza de HA Cal/09 o a una menor eficiencia de la transfección para esa estructura artificial de ADN quimérico. Además, cabe señalar que había diferencias en el patrón de expresión de la superficie celular para las estructuras artificiales cH7/3 y cH5/3. Ese patrón de expresión de "doble pico" se observó solo en condiciones de transfección y era reproducible. No se detectó tras una infección con virus recombinantes que expresaban cH7/3 o cH5/3 (Fig. 21). Por lo tanto, esos datos indican que las cHAs pueden transportarse a través del complejo de Golgi hasta la superficie celular.
A continuación, se examinaron las características de entrada de las diferentes cHAs a través de una transducción de células MDCK, utilizando partículas de pseudotipo retroviral que contenían una estructura artificial de agente informa­ dor de luciferasa y expresaban la cHA y la NA del virus B/Yamagata/16/88 de tipo silvestre sobre la superficie de la partícula. La eficiencia de la entrada mediada por las proteínas cHAs fue detectada mediante una lectura de la luciferasa. Se observaron niveles comparables de expresión de luciferasa mediada por partículas de pseudotipo para las HAs quiméricas cH5/1, cH7/3 y cH5/3 y las correspondientes proteínas de tipo silvestre (Fig. 22). Las partículas que codificaban HA cH1/1 expresaban niveles más bajos de luciferasa que en comparación con las otras estructuras arti­ ficiales de HAs, lo que podía deberse a la menor expresión de cH1/1 en la línea celular productora y, por lo tanto, a menos trímeros de Ha por partícula o a las propiedades de entrada menos eficientes de HA cH1/1. También es posible que al normalizar las partículas de pseudotipo a 4 unidades de hemaglutinina, la cantidad real de partículas de pseudotipo varíe debido a las diferencias en la unión a los glóbulos rojos.
6.5.2.2 Generación de virus de la gripe recombinantes portadores de hemaglutininas quiméricas
Debido a que se había determinado que nuestras estructuras artificiales de cHAs se expresaban y se transportaban eficientemente a la superficie celular, se realizó un estudio para evaluar si se podía rescatar un virus de la gripe recombinante que codificaba una cHA. Los virus que contenían las diferentes cHAs se generaron con éxito utilizando protocolos publicados anteriormente (véase, por ejemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; y Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Los virus resultantes se purificaron en placa, se amplificaron en huevos embrionados de 10 días y los segmentos quiméricos se analizaron mediante RT-PCR y se secuenciaron. En todos los casos, se encontró que el virus tenía el segmento de HA quimérica esperado y ningún otro segmento de HA (datos no mostrados).
La presencia de cHAs en los virus rescatados se confirmó además mediante transferencia Western (Figura 23) e inmunofluorescencia indirecta de las células infectadas (Figura 24). Las células MDCK se infectaron con los virus rWT PR8, Perth/09 de tipo silvestre, cH1/1, cH5/1, cH7/3 y cH5/3. Las proteínas de HAs quiméricas cH1/1 y cH5/1 se detectaron en las muestras correspondientes usando anticuerpos reactivos contra los dominios de la cabeza de HA Cal/09 (H1) (29E3) (Medina et al., 2010, Nature Communications 1:28) o HA VN/04 (H5) (mAb #8) (Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-53), respectivamente (Figura 23). Se observaron niveles de expresión comparables entre cH7/3, cH5/3 y HA Perth de tipo silvestre usando 12D1, un mAb anti-tallo pan-H3 (véase, Wang et al., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). La HA Perth de tipo silvestre mostraba una migración más lenta en el gel, lo que probablemente se debía a u n m a y o r n ú m e r o d e s i t io s d e g l ic o s i la c ió n e n e l d o m in io d e la c a b e z a g lo b u la r . S e c o n f i r m ó q u e e l d o m in io d e la c a b e z a d e H A c o r r e c to s e e x p r e s a b a e n c im a d e u n ta l lo H 3 m e d ia n te e l u s o d e a n t ic u e r p o s p o l ic lo n a le s a n t i- H 7 (N R -3152 ) o m o n o c lo n a le s a n t i- H 5 ( m A b # 8 ) , e n m u e s t r a s d e in fe c c ió n c o n c H 7 /3 o c H 5 /3 , r e s p e c t iv a m e n te . S e d e te c ta r o n b a n d a s p o s i t iv a s e n a m b o s c a s o s .
P a r a e l e s tu d io d e in m u n o f lu o r e s c e n c ia , la s c o n d ic io n e s d e la in f e c c ió n e r a n s im i la r e s a la s u t i l iz a d a s p a r a e l a n á l is is d e t r a n s fe r e n c ia W e s te r n . L a s c é lu la s in f e c ta d a s s e t iñ e r o n c o n lo s a n t ic u e r p o s c o r r e s p o n d ie n t e s c o m o s e in d ic a e n la F ig . 23. T o d a s la s c é lu la s in f e c ta d a s m o s t r a b a n la e x p r e s ió n e s p e r a d a d e la s H A s q u im é r ic a s y d e t ip o s i lv e s t r e , a s í c o m o d e N P d e l v i r u s d e la g r ip e A (F ig . 24 ) .
6.5.2.3 C a r a c te r í s t ic a s d e la r e p l ic a c ió n d e v i r u s r e c o m b in a n te s
L a s p r o p ie d a d e s d e l c r e c im ie n t o d e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s y d e t ip o s i lv e s t r e s e e v a lu a r o n e n h u e v o s d e p o l lo e m -b r io n a d o s d e 10 d ía s d e e d a d a 37 ° C (F ig . 25 A ) . E l v i r u s r W T P R 8 s e in c lu y ó p a r a c o m p a r a r la c in é t ic a d e c r e c im ie n to d e lo s v i r u s r e c o m b in a n te s q u e e x p r e s a b a n H A s q u im é r ic a s . L o s v i r u s c H 5 /1 y c H 5 /3 m o s t r a b a n u n a c in é t ic a d e r e p l i ­ c a c ió n c o m p a r a b le a la d e l v i r u s r W T P R 8. E l v i r u s c H 7 /3 c r e c ía h a s ta t í t u lo s p ic o s im i la r e s a lo s d e r W T P R 8 a la s 48 h p i ( 1 x 109 u fp /m L ) , a u n q u e h a b ía u n a r e d u c c ió n d e 2 m a g n i tu d e s lo g a r í tm ic a s e n e l t í t u lo v i r a l e n c o m p a r a c ió n c o n e l v i r u s r W T P R 8 a la s 9 h p i. E l v i r u s c H 1 /1 e s ta b a a te n u a d o e n c o m p a r a c ió n c o n e l v i r u s r W T P R 8 , c o m o lo m u e s t r a n lo s t í t u lo s v i r a le s r e d u c id o s e n to d o s lo s p u n to s d e t ie m p o . N o o b s ta n te , e l v i r u s c H 1 /1 a lc a n z ó u n t í t u lo m á x im o r e s ­ p e ta b le d e a p r o x im a d a m e n t e 108 u fp /m L . E l v i r u s d e t ip o s i lv e s t r e P e r th /09 c r e c e h a s ta t í t u lo s m á x im o s c o m p a r a b le s e n h u e v o s e m b r io n a d o s ( d a to s n o m o s t r a d o s ) .
E l f e n o t ip o d e p la c a d e c a d a u n o d e lo s v i r u s q u im é r ic o s ta m b ié n s e e v a lu ó e n c é lu la s M D C K . T o d o s lo s v i r u s fo r m a r o n p la c a s d e u n t a m a ñ o c o m p a r a b le c o m o s e m u e s t r a e n la F ig . 25 B . E s o s d a to s ju n to s c o n f ir m a n q u e la s e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s q u im é r ic a s d e H A s e p l ie g a n c o r r e c t a m e n te y s o n b io ló g ic a m e n te fu n c io n a le s .
6.5.2.4 L o s a n t ic u e r p o s e s p e c í f ic o s d e l t a l lo p u e d e n n e u t r a l iz a r v i r u s y p s e u d o p a r t í c u la s q u e e x p r e s a n c H A
F in a lm e n te , s e s o m e t ie r o n a e n s a y o a n t ic u e r p o s e s p e c í f ic o s d e l ta l lo p a r a d e t e r m in a r la c a p a c id a d p a r a n e u t r a l iz a r n u e s t r o s v i r u s r e c o m b in a n te s r e c ié n g e n e r a d o s q u e e x p r e s a b a n c H A . L o s e n s a y o s d e r e d u c c ió n d e p la c a s e r e a l iz a r o n e n p r e s e n c ia d e l m A b K B 2 , u n a n t ic u e r p o e s p e c í f ic o d e l ta l lo d e H A c o n a m p l ia r e a c t iv id a d c o n e l g r u p o 1, o s in a n t ic u e r p o . S e d e m o s t r ó q u e e l m A b K B 2 n e u t r a l iz a to d o s lo s v i r u s q u e e x p r e s a n c H A c o n u n a e f ic a c ia s im i la r y d e fo r m a d e p e n d ie n te d e la d o s is . C o n 100 u g /m L , m A b K B 2 e r a c a p a z d e n e u t r a l iz a r c o m p le ta m e n t e lo s v i r u s c H 1 /1 y c H 5 /1 c o n u n a e f ic a c ia d e l 100 % , c o n c ie r t a a c t iv id a d n e u t r a l iz a n te a c o n c e n t r a c io n e s ta n b a ja s c o m o 4 u g /m L (F ig .
26 A ) .
P a r a c o n f i r m a r e s o s r e s u l ta d o s , s e r e a l iz ó u n e n s a y o d e in h ib ic ió n d e p a r t íc u la s d e p s e u d o t ip o c o n m A b K B 2. S e a ñ a d ie r o n p a r t í c u la s d e p s e u d o t ip o q u e e x p r e s a b a n c H 1 /1 o c H 5 /1 y N A d e l v i r u s d e la g r ip e B a c é lu la s M D C K e n p r e s e n c ia d e l m A b K B 2 o s in a n t ic u e r p o . C u a r e n ta y o c h o h o r a s d e s p u é s d e la t r a n s d u c c ió n , s e r e c o g ió e l m a te r ia l s o b r e n a d a n te y s e a n a l iz ó la a c t iv id a d d e la lu c i fe r a s a . C o m o e r a d e e s p e r a r , e l m A b K B 2 b lo q u e a b a la e n t r a d a d e p a r t í c u la s d e p s e u d o t ip o c H 1 /1 y c H 5 /1 d e m a n e r a d e p e n d ie n te d e la d o s is c o n c o n c e n t r a c io n e s s u p e r io r e s a 4 u g /m L . S i b ie n u n a c o n c e n t r a c ió n m á s b a ja d e m A b K B 2 e r a s u f ic ie n te p a r a in h ib i r la e n t r a d a d e p a r t íc u la s d e p s e u d o t ip o e n c o m p a r a c ió n c o n la s c o n c e n t r a c io n e s u t i l iz a d a s e n e l e n s a y o d e r e d u c c ió n d e p la c a , e s te e r a u n r e s u l ta d o e s p e r a d o d e b id o a la s u p u e s ta m e n o r in c o r p o r a c ió n d e t r í m e r o s d e H A s o b r e la s u p e r f ic ie d e la s p a r t í c u la s d e p s e u d o t ip o (C o r t i e t a l. , 2010 , T h e J o u r n a l o f C l in ic a l I n v e s t ig a t io n 120 :1663 - 73 ) . E s te f e n ó m e n o d e d i f e r e n te s p o te n c ia s n e u t r a l iz a n te s d e lo s m A b s e n e n s a y o s q u e im p l ic a n u n v i r u s c o m p le to f r e n te a p a r t íc u la s d e p s e u d o t ip o , s e h a a p r e c ia d o e n o t r o s e s tu d io s ( C o r t i e t a l. , 2010 , T h e J o u r n a l o f C l in ic a l In v e s t ig a t io n 120 :1663 - 7321 ; S u i e t a l. , 2009 , N a tu r e S t r u c tu r a l & M o le c u la r B io lo g y 16 :265 - 73 ) .
6.5.3 C o n c lu s ió n
S e d e s a r r o l ló u n a e s t r a te g ia n o v e d o s a p a r a g e n e r a r v i r u s d e la g r ip e c o n p r o te ín a s d e H A s q u im é r ic a s q u e s o n p o r t a ­ d o r e s d e d i f e r e n te s d o m in io s d e la c a b e z a g lo b u la r d e H A , a p r o v e c h a n d o e l e n la c e d is u l fu r o c o n s e r v a d o C y s 52 -C y s 277 q u e d e f in e e l l ím i te e n t r e lo s d o m in io s d e la c a b e z a y e l t a l lo . A s í , m e d ia n te la s u s t i t u c ió n d e l d o m in io d e la c a b e z a p a r e n ta l c o n e l d o m in io d e la c a b e z a d e o t r a H A , s e g e n e r ó u n p a n e l d e H A s q u im é r ic a s c o n e l m is m o ta l lo p e r o d i f e r e n te s c a b e z a s g lo b u la r e s . E l d is e ñ o s e s o m e t ió a e n s a y o e n v a r io s s u b t ip o s , in c lu id o e l d o m in io d e l ta l lo P R 8 c o n la s c a b e z a s g lo b u la r e s C a l /09 y V N H 5. A d e m á s , s e c o lo c ó u n a c a b e z a g lo b u la r H 7 e n u n d o m in io d e l ta l lo H 3. E s a s e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s in c lu y e n a m b o s g r u p o s f i lo g e n é t ic o s d e la p r o te ín a H A d e l v i r u s d e la g r ip e . C a d a e s t r u c tu r a a r t i f ic ia l s e e x p r e s a b a s o b r e la s u p e r f ic ie c e lu la r y c o n s e r v a b a la a c t iv id a d d e fu s ió n . L a g e n e r a c ió n d e v i r u s r e c o m b in a n te s q u e s o n p o r t a d o r e s d e H A s q u im é r ic a s v a l id ó a d ic io n a lm e n te q u e la s H A s s e p l ie g a n c o r r e c t a m e n te y c o n s e r v a n la s fu n c io n e s b io ló g ic a s .
6.6 E je m p lo 6 : E s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic a c o m o v a c u n a u n iv e r s a l c o n t r a la g r ip e
E s te e je m p lo d e m u e s t r a la e f ic a c ia p r o te c to r a d e u n a r e s p u e s ta in m u n it a r ia e s p e c í f ic a d e l ta l lo q u e p u e d e p r o v o c a r s e m e d ia n te u n a v a c u n a c ió n c o n e s t r u c tu r a s a r t i f ic ia le s d e h e m a g lu t in in a q u im é r ic a ( c H A ) , p r o te ín a s q u e c o n t ie n e n c o m ­ b in a c io n e s ú n ic a s d e la c a b e z a y e l t a l lo d e h e m a g lu t in in a .
6.6.1 Materiales y métodos
6.6.1.1 Células y virus
Las células 293T y MDCK se obtuvieron en la ATCC y se conservaron en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM) y medio esencial mínimo (ambos de Gibco). Cada uno se complementó con suero bovino fetal al 10% (HyClone) y 100 unidades/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco).
Se realizaron pases con los virus de la gripe A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) y A/Netherlands/602/2009 en pulmones de ratón y luego se cultivaron en huevos de pollo embrionados de 10 días de edad durante 48 horas. El virus reorde­ nado de baja patogenicidad A/Vietnam/1203/04 (VN04):PR82:6 con el sitio de escisión polibásico eliminado (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753) y el virus B/Yamagata/16/1988, se cultivaron en huevos embrio­ nados de 10 días de edad durante 48 horas a 37°C o 72 horas a 33°C, respectivamente.
Los virus de la gripe recombinantes se produjeron mediante un sistema de genética inversa como se ha descrito más arriba y como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431 -8439). El virus cH9/1 N1, un virus que expresa el dominio de la cabeza globular de la HA de un virus H9 sobre un tallo H1 (del virus PR8), y los virus N1 cH5/1 (cabeza H5 (VN04), tallo H1) se rescataron de manera similar como se ha descrito ante­ riormente (véase, por ejemplo, Pica et al., 2012, PNAS uSa 109:2573-2578). Para generar el virus YAM-HA, el dominio extracelular de la HA B/Yamagata/16/1988 (WT YAM) se sustituyó por el dominio correspondiente de la HA del virus A/Puerto Rico/8/1934 (véase, por ejemplo, Hai et al., 2011, Journal of Virology 85:6832-6843). Los plásmidos genéticos inversos que codificaban los otros 7 segmentos virales de WT YAM se construyeron en un estudio previo (véase, por ejemplo, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Después del rescate, los virus recombinantes que expresaban cHA se multiplicaron en huevos de pollo embrionados de 10 días de edad durante 48 horas a 37°C. El virus YAM-HA se cultivó en huevos de pollo embrionados de 8 días de edad durante 72 horas a 33°C.
Los virus recombinantes y de tipo silvestre se valoraron en células MDCK (ATCC) en presencia de tripsina TPCK como se ha descrito anteriormente. El virus cH5/1 N1 se purificó parcialmente sobre un colchón de sacarosa al 30% para uso en ensayos de ELISA. Los virus cH9/1 N1, cH5/1 N1 y FM1 se purificaron mediante centrifugación en gradiente y se inactivaron con formaldehído diluido (1:4000) en PBS para utilizarlos como vacunas de control positivo.
6.6.1.2 Generación de estructuras artificiales de proteína cH6/1 y cH9/1
Las proteínas cH6/1 y cH9/1 solubles se generaron usando un sistema de expresión de baculovirus como se ha des­ crito más arriba y como se ha descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Brevemente, los vectores de la baculotransferencia se generaron primero, siguiendo una transfección de bácmidos dentro de células Sf9. Luego se usaron baculovirus recombinantes para infectar células High Five con una MOI de 10. Los materiales sobrenadantes se recogieron 96 h después de la infección y luego se incubaron con resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 h a 4°C para purificar las proteínas cHAs recombinantes marcadas con His. La suspensión se cargó en columnas y, después de los lavados, eluyó en tampón de elución a pH 8 (Na2HCO350 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM). Las fracciones agrupadas que contenían proteína se intercambiaron con tampón en PBS y se concentraron usando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) con un límite de masa molecular de 10 kDa en un rotor de cubeta oscilante. La pureza y la identidad de las proteínas se analizaron mediante SDS/PAGE, tinción de Coomassie y transferencia Western. Las concentraciones finales de proteína se determinaron con el reactivo de Bradford.
6.6.1.3 Animales
A los animales se les permitió acceso a comida y agua a voluntad y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad (Jackson Laboratories) fueron anestesiados para todos los procedimientos intranasales con inyección intraperitoneal (IP) de 0,1 ml de ketamina/xilazina (0,15 mg de ketamina y 0,03 mg de xilazina).
6.6.1.4 Experimentos de vacunación y exposición
Se vacunaron ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad sin tratamiento previo, con proteína cH9/1, por vía intranasal (10 ug) en presencia del adyuvante R848 (Invitrogen) y por vía intraperitoneal (10 ug) con Addavax, un adyuvante similar a MF59 (Invitrogen). Los animales se reforzaron con proteína cH6/1 o BSA (BioRad) tres semanas después de la sensibilización. También se administraron vacunas de refuerzo por vía intranasal (10 ug) e intraperito­ neal (10 ug), aunque con poli I:C como adyuvante (Invitrogen). Se administró virus FM1 inactivado (1 ug) por vía intramuscular con un volumen de 50 ul como control positivo. Tres semanas después del refuerzo, se extrajo sangre de los animales y se recogieron los sueros, y los animales se expusieron a 5 DL50 de virus FM1. Se controlaron los pesos durante 14 días después de la exposición.
En otros experimentos, los animales fueron sensibilizados con cH9/1 que codificaba ADN de plásmido (80 ug, sistema de administración TriGrid; Ichor Medical Systems) y luego se reforzaron tres semanas más tarde con proteína cH6/1 o cH9/1 (control) administrada con poliI :C por vía intranasal. (10 ug) e intramuscular (10 ug). El refuerzo se repitió tres semanas más tarde con la proteína cH5/1 o cH9/1 (control). Los animales de control también recibieron electroporación de ADN con ADN codificante de cH9/1, pero se reforzaron dos veces con BSA (de manera similar al grupo de trata­ miento). Los animales de control positivo recibieron virus FM1 o PR8 inactivados (1 gg) o 1 gg de vacuna fraccionada monovalente de pH1N1 por vía intramuscular (BEI). Después, los animales se expusieron 3-5 semanas después del refuerzo con 5 DL50 de PR8 o FM1 o 10 DL50 de virus pH1N1. Los animales utilizados para el agotamiento de los linfocitos T CD8+, se trataron 48 y 24 horas antes de la exposición con 300 gg de un anticuerpo anti-linfocitos T CD8+ (véase, por ejemplo, ML Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707) (procedentes de la línea de hibridoma 2.43, adquirida en la ATCC) y se expusieron a 5 DL50 del virus PR8. Se controlaron los pesos durante 14 días después de la exposición. Se utilizó un límite del 20% para todos los virus.
Para otros experimentos, a los ratones se les inoculó el virus YAM-HA o WT YAM y luego se vacunaron con BSA o proteína cH6/1 en presencia de poli I:C por vía intramuscular e intraperitoneal tres semanas después. Los animales sin tratamiento previo sirvieron como control adicional. A todos los animales se les extrajo sangre y fueron expuestos 3-5 semanas después de la vacunación a 250 DL50 de virus cH9/1 N1 o 10 DL50 de virus H5 reordenado 2:6 con el sitio de escisión polibásico eliminado en el contexto de PR8 (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). El virus cH9/1 N1 inactivado con formaldehído (1 ug) y el virus cH5/1 N1 se administraron por vía intramuscular con un volumen de 50 ul como control positivo para una exposición viral apropiada. Los animales fueron sacrificados si perdían más del 30% de su peso corporal inicial después de la exposición, de acuerdo con las pautas institucionales. Se utilizó un límite del 20% para la infección con los virus menos patógenos cH9/1 N1 y A/Netherlands/602/2009. Para las exposiciones a esos dos virus, se usaron dosis más estrictas para apreciar la muerte o pérdidas de peso sustan­ ciales de todos los controles (250 o 10 DL50).
6.6.1.5 Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas
Las placas Immulon 4HBX (Thermo Scientific) se recubrieron durante una noche con virus cH5/1 N1 parcialmente purificado diluido hasta 5 ug/mL en PBS. Las placas se bloquearon durante 1 hora con Tween 20-PBS al 0,1% (TPBS) que contenía leche en polvo descremada al 3% y luego se incubaron con sueros de ratón diluidos en serie en TPBS que contenía leche en polvo al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con IgG anti-ratón unida a fosfatasa alcalino (AP) (específica de la cadena y, Invitrogen). A continuación, las placas se lavaron tres veces con TPBS, se revelaron con sustrato de pnitrofenilfosfato (PNPP) (Zymed), la reacción se detuvo con NaOH 0,5 M y se leyeron las placas con una densidad óptica de 405 nm. Para todos los experimentos se utilizó un lector de placas Synergy 4 (BioTek).
Los títulos de anticuerpos específicos del tallo se detectaron mediante ELISA como se ha descrito anteriormente. Se usaron antígenos PR8 para recubrir las placas ELISA con el fin de cuantificar la reactividad específica del tallo. Para detectar la capacidad de neutralización de los anticuerpos específicos del tallo en ratones vacunados, se agruparon los sueros y se purificó la IgG sérica total.
Se usaron pseudopartículas que expresaban HA H5 en un ensayo de entrada de pseudopartículas como se ha descrito previamente (véase, por ejemplo, Hai et al., 2012, J. Virol.86:5774-5781 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Al entrar, las pseudopartículas expresan un agente informador de luciferasa. La inhibición de esa entrada mediante IgG se cuantificó como el porcentaje de expresión en comparación con los controles no tratados con IgG. Debido a que los animales no habían estado expuestos a los dominios de la cabeza globular H5, esos ensayos determinaron el grado en que los anticuerpos específicos del tallo producidos por la vacunación, neutralizaban el virus. El anticuerpo monoclonal CR6261 y la IgG purificada de ratones infectados con virus de la gripe B de tipo silvestre se usaron como controles.
6.6.1.6 Ensayo de neutralización por reducción de placa (PRNA)
Primero se preincubaron diluciones de mAbs con 60 a 80 unidades formadoras de placas (ufp) de virus (virus de la gripe A cH9N1) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador. A continuación, la mezcla de virus e IgG purificada se utilizó para infectar una monocapa de células MDCK por duplicado en un formato de 12 pocillos y se incubó a 37°C durante 1 hora con balanceo intermitente cada 10 minutos. La capa de agar se complementó con las correspondientes diluciones de IgG. Dos días después de la infección (dpi), la monocapa se fijó con PFA al 4%/PBS 1X durante 30 minutos. Las células se bloquearon con leche desnatada al 5%/PBS 1X durante 30 minutos a tempera­ tura ambiente y se incubaron en consecuencia con un anticuerpo monoclonal específico de H9 (5 gg/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se usó un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP como secundario con una dilución de 1:1000. Las placas se visualizaron usando sustrato de peroxidasa TrueBlue (KPL Inc.) y la reacción se detuvo con agua corriente. Se contaron las placas para cada anticuerpo y se calculó el porcentaje de inhibición sobre el grupo sin mAb.
6.6.1.7 Pruebas estadísticas
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando una prueba T de Student de una cola (Prism4, GraphPad). Para la Fig. 29C, todos los valores se representan como promedios con el error estándar de la media. Las diferencias en la supervivencia se calcularon con el análisis de supervivencia de Kaplan Meier con la prueba de significancia de rango logarítmico.
Para los análisis con valores de P, los valores de P iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos. Se utilizó la corrección de Welch si se determinaba que las varianzas eran estadísticamente diferentes. Los valores de P iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente significativos. Al comparar la reactividad del suero del tallo con la pérdida máxima de peso en la Figura 29C, se detectó un valor como atípico (puntuación Z modificada > 3,5 desviaciones estándar por encima de la media) según los métodos de Iglewicz y Hoaglin (véase, Iglewicz, B. a. H., D. 1993. Volumen 16: How to detect and handle outliers. En E. Mykytka (compilador), The ASQC Basic References in Quality Control: Statistical Techniques. Sociedad Americana de Control de Calidad), y se omitió de los análisis.
6.6.2 Resultados
6.6.2.1 La vacunación secuencial con estructuras artificiales de cHAs produce anticuerpos específicos del tallo de HA y brinda protección contra una exposición letal al virus de la gripe
Se planteó la hipótesis de que las estructuras artificiales que expresan dominios de la cabeza globular de virus con diferentes antigenicidades podían estimular respuestas policlonales hacia el dominio del tallo de la HA. Para someter a ensayo esto, los ratones se vacunaron primero con proteína soluble cH9/1 con adyuvante, procediendo el tallo de la HA del virus A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) y la cabeza de una cepa aislada H9. Tres semanas después de la sensibili­ zación, se reforzó a los ratones con una segunda cHA soluble, cH6/1 (cabeza del virus H6, tallo del virus PR8), con la intención de estimular las respuestas humorales hacia el dominio del tallo de la molécula. (Los ratones vacunados con el virus FM1 inactivado sirvieron como control positivo). Tres semanas después del refuerzo, se extrajo sangre de los ratones para evaluar la reactividad del suero con el dominio del tallo H1 y luego se expusieron al virus A/Fort Mounmoth/1/1947 (FM1) adaptado a ratones. Como se muestra en la Figura 27A, los ratones vacunados produjeron res­ puestas de anticuerpos séricos hacia el dominio del tallo de HA. Después de la exposición a FM1, los animales per­ dieron una cantidad considerable de peso (Figura 27B), aunque se recuperaron después del día 7 con una tasa de supervivencia global del 90% (Figura 27C). Aunque los ratones solo habían estado expuestos a los dominios de la cabeza globular de los virus H9 y H6, se verificó que todos los ratones eran negativos para HI frente al virus FM1 y, por lo tanto, se confirmó que la protección provocada por la vacunación era el resultado de una respuesta inmunitaria específica del dominio del tallo. Por lo tanto, la vacunación con cHAs basadas en PR8 proporciona inmunidad especí­ fica del tallo que protege frente a una exposición al virus FM1.
6.6.2.2 La vacunación con proteína cH6/1 provoca inmunidad específica del tallo que media en la protección contra una exposición al virus cH9/1 N1
Aunque se generaron respuestas de anticuerpos hacia el tallo mediante la administración de dos estructuras artificiales de cHAs solubles diferentes, se observó un grado sustancial de morbilidad después de la exposición a FM1. Debido a que los ratones inmunológicamente no tenían un contacto previo con el virus de la gripe, era posible que se requirieran múltiples exposiciones al virus de la gripe seguidas de la introducción de una cabeza antigénicamente distinta para inducir títulos altos de anticuerpos séricos contra el tallo de HA. Una estimulación mejorada de los títulos de anticuer­ pos séricos con especificidad hacia el tallo de hemaglutinina también puede requerir una infección y puede explicar por qué no se observó una protección fuerte después de la preparación y el refuerzo con proteínas cHAs solas.
Con el fin de estimular respuestas inmunes hacia la hemaglutinina vírica, pero no generar una inmunidad protectora frente a otras proteínas víricas, se construyó un virus recombinante B/Yamagata/16/1988 que expresaba el ectodomi-nio de la HA del virus PR8 (yAm-HA) (véase, p. ej., Hai et al., 2011, Journal of Virology 85:6832-6843). Los ratones fueron inoculados con YAM-HA para imitar exposiciones previas al virus de la gripe y luego se vacunaron 3 semanas más tarde con BSA o proteína cH6/1. Como control adicional, los ratones se infectaron con el virus B/Yamagata/16/1988 (WT YAM) de tipo silvestre y se vacunaron con BSA. A continuación, se utilizó como virus de exposición un virus de la gripe A que expresaba cH9/1 (cabeza H9, tallo H1) para demostrar definitivamente el carácter protector de una respuesta inmunitaria dirigida únicamente hacia el tallo de la HA. Nuevamente, debido a que los animales habían estado expuestos a los dominios de la cabeza globular de los virus H1 y H6, la protección observada después de la exposición a un virus que expresaba HA cH9/1, probablemente era el resultado de la inmunidad hacia el dominio del tallo H1.
Como se muestra en la Figura 28A, los animales que recibieron la vacuna de proteína cH6/1 después de una exposi­ ción a YAM-HA, estaban completamente protegidos frente a una exposición a 250 DL50 con un virus que expresaba cH9/1 en el contexto de PR8. Los animales vacunados con la proteína soluble cH6/1 perdieron estadísticamente me­ nos peso los días 3, 4 y 5, en comparación con los animales vacunados con BSA. Esa protección frente a la pérdida de peso daba como resultado una mayor supervivencia en el grupo vacunado con cH6/1, en comparación con la cohorte vacunada con BSA (p = 0,038; Figura 28B). Los animales sin tratamiento previo y los inoculados con WT YAM no estaban protegidos contra la infección, lo que demuestra que cualquier protección observada en los otros grupos de vacunación no era el resultado de la replicación vírica, sino una respuesta específica frente al dominio del tallo H1. Debido a que los animales estuvieron expuestos a los dominios de la cabeza globular de los virus H1 y H6, y eran negativos para una HI con el virus con exposición a cH9/1, se cree que la protección que se ve en este caso es el resultado de una inmunidad frente al dominio del tallo H1.
Cabe señalar que se han aislado anticuerpos monoclonales con especificidades hacia el tallo de HA de personas infectadas o vacunadas contra los virus H1N1 estacionales (véase, por ejemplo, Corti et al., 2010, The Journal of clinical investigation 120:1663-1673; Corti et al., 2011, Science 333:850-856; Ekiert et al., 2011, Science 333: 843­ 850; Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273; Throsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942), y los títulos del tallo se han apreciado en individuos no infectados con el virus pH1 N1, aunque con niveles más bajos (véase, por ejemplo, Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Como tal, no sorprende que los animales a los que se había inoculado YAM-HA fueran capaces de generar cierto grado de título del tallo. Sin embargo, la vacunación con la estructura artificial cH6/1 aumentaba 4 veces los títulos séricos del tallo (diluciones recíprocas que produjeron valores de DO equivalentes) (Fig. 28C, y animales protegidos de una pérdida de peso sustancial y muerte (Fig. 28A y 28B). La vacu­ nación con la estructura artificial cH6/1 provocaba la producción de IgG específica del tallo que neutralizaba el virus con una eficacia del 100% (YAM-HA BSA) (Figura 28D), mientras que el suero de los animales sensibilizados mos­ traba niveles de neutralización apenas por encima del fondo (YAM-HA BSA). De hecho, los animales a los que se había inoculado YAM-HA y luego vacunado con BSA, tenían tasas de supervivencia estadísticamente similares a aquellos que fueron inoculados con el virus WT YAM y vacunados con BSA (p = 0,058). En contraste, el uso de la proteína cH6/1 como vacuna producía una supervivencia del 100% a partir de la exposición, una tasa que era muy significativa en comparación con la de los animales a los que se había inoculado WT YAM (p < 0,0001). La supervi­ vencia también mejoró en comparación con la de los ratones a los que se había inoculado YAM-HA y vacunado con BSA (p = 0,038). Esas diferencias no se reflejaban en el ensayo de entrada de pseudopartículas, ya que las IgGs de los ratones YAM-HA BSA y YAM-HA cH6/1 inhibían la entrada de pseudopartículas que codificaban una HA H5 con una eficiencia similar (Fig. 28E). Es importante señalar que este último ensayo solo detecta la capacidad de los anticuerpos para bloquear la entrada de pseudopartículas. Por lo tanto, los efectos de los anticuerpos del tallo aguas abajo de la entrada y/o su interacción con células (inmunes) infectadas, no se detectarían en este ensayo. Esto podría explicar por qué no se observaron diferencias en la neutralización entre los dos grupos y no reflejaban los hallazgos in vivo. No obstante, los anticuerpos producidos con estos protocolos de infección eran específicos del tallo y eran ampliamente neutralizantes. Debido a que el virus de la exposición solo codifica el dominio del tallo de un virus H1, se puede concluir que la protección observada era el resultado de la respuesta inmunitaria del hospedador frente al dominio del tallo de HA que se había estimulado mediante la vacunación con cH6/1.
6.6.2.3 La vacunación con la proteína cH6/1 protege a los ratones de una exposición letal al virus de la gripe H5
A continuación se comprobó si la vacunación con la proteína cH6/1 podía proteger a los ratones de la exposición a un virus H5. Los ratones fueron inoculados y vacunados como se ha descrito anteriormente, y expuestos a 10 DL50 de un virus reordenado 2:6 que expresaba la HA y la NA del virus A/Vietnam/1203/2004 en el contexto de PR8 (véase, por ejemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). Como era de esperar, los animales sin tratamiento previo y los inoculados con el virus WT YAM no estaban protegidos frente a la exposición y sucumbieron a la infección el día 8. Los animales a los que se había inoculado el virus YAM-HA y vacunado con BSA estaban marginalmente protegidos de la exposición, con una tasa de supervivencia del 40%. Se observó una mayor protección cuando los animales fueron vacunados con la proteína cH6/1, con una supervivencia del 90%. La diferencia en las tasas de supervivencia entre los dos grupos de vacunas se acercaba a la significación estadística (p = 0,06), aunque los ratones vacunados con la proteína cH6/1 sobrevivían durante un tiempo estadísticamente mayor (p = 0,037) (Figura 29A y 29B). Al com­ parar la reactividad con el tallo de HA con el % de pérdida de peso máxima durante el período de seguimiento después de la exposición a H5, se detectó una correlación inversa, en la que los animales con títulos séricos de tallo más altos tendían a perder menos peso después de la exposición (Figura 429C), lo que respalda la idea de que cH6/1 puede reforzar la inmunidad basada en el tallo de HA.
Usando virus para la exposición con dominios de la cabeza globular de HA frente a los que los ratones vacunados eran inmunológicamente como sin tratamiento previo y negativos para HI, los resultados indican que la protección contra la exposición después de la vacunación se basaba únicamente en una respuesta inmune frente al tallo de HA. Para excluir la posibilidad de que los anticuerpos con reacción cruzada con el sitio de unión del receptor puedan desempeñar un papel en la protección que se observa en este caso, todos los ratones se analizaron con respecto a HI y se encontró que eran negativos para HI con sus respectivos virus de exposición.
6.6.2.4 La vacunación con cHA provoca inmunidad específica del tallo que media en la protección contra las exposi­ ciones al virus H1N1
Se han detectado anticuerpos específicos del tallo en sueros humanos (véanse, por ejemplo, las Figs. 15A y 15B; M. Thorsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942, DC Ekiert et al., 2009, Science 324:246-251, DC Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850, J. Wrammert et al., 2011, J. Exp. Med. 208:181 -193 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Debido a que es posible que una exposición previa a la HA del virus de la gripe sea fundamental para la producción vigorosa de una respuesta inmunitaria específica del tallo, se determinó si se podía recapitular la inmunidad preexistente frente al virus de la gripe en ratones. Se planteó la hipótesis de que eso protegería más eficazmente contra la morbilidad después de la exposición al virus. Para lograr esto, los ratones fueron sensibilizados con un vector de expresión de ADN (véase, por ejemplo, J. Steel et al, 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10) que codificaba cH9/1, luego se reforzaron con proteína cH6/1 soluble, seguida de proteína (cabeza H5, tallo H1) y finalmente se expusieron a un panel de virus H1N1 (Figs. 30A-30F). Después de la infección con los virus FM1 (Figs. 30A y 30B), A/Netherlands/602/2009 (pH1 N1) (Figs.
30C y 30D) y PR8 (Figs. 30E y 30F), todos los animales vacunados con cHA estaban protegidos de la exposición y mostraban solo cantidades mínimas de pérdida de peso, si las había. Por el contrario, los animales de control negativo que recibieron BSA después de la sensibilización con ADN de cH9/1, perdieron cantidades considerables de peso y, con la excepción de un animal, sucumbieron a la infección el día 9 (Figs. 30A-30F). La supervivencia de los animales vacunados con cHA en cada uno de los experimentos de exposición era significativamente diferente de la de los controles (Figs. 30B, 30D y 30F). Para confirmar que la protección provocada era el resultado de una inmunidad humoral específica del tallo, se confirmó que todos los ratones eran negativos para HI para cada virus de la exposición, aunque los sueros eran capaces de unirse a HA H1 mediante ELISA (Fig. 30G), lo que confirma la producción de anticuerpos específicos del tallo a través de nuestro protocolo de vacunación. Debido a que es posible que los linfocitos T CD8 dirigidos hacia los epítopos dentro del tallo de HA puedan desempeñar un papel en la protección que se observa en este caso (véase, por ejemplo, M. Tamura et al., J. Virol. 72:9404-9406), los ratones se vacunaron y se agotaron los linfocitos T CD8 mediante la administración del anticuerpo monoclonal 2.43 antes de la exposición a PR8 (ML Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707-718). El agotamiento no afectaba a la pérdida de peso ni a los resul­ tados de supervivencia, lo que implicaba una respuesta humoral en la protección provocada por la vacunación (Figs.
30H y 301). Por lo tanto, una respuesta inmunitaria humoral adaptativa hacia el tallo de HA, y no hacia la cabeza, brindaba protección contra los tres virus H1N1 diferentes.
Para validar adicionalmente que el protocolo de vacunación basado en cHA inducía anticuerpos específicos del tallo con capacidad neutralizante contra otros subtipos, se sometió a ensayo la capacidad de IgG purificada a partir de ratones vacunados para bloquear la entrada de pseudopartículas que albergaban una HA H2. Debido a que las pseudopartículas expresan un gen informador de luciferasa después de la entrada, la actividad neutralizante se midió por la ausencia de actividad enzimática de la luciferasa en los materiales sobrenadantes celulares (R. Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781 y N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). De acuerdo con la protección observada después de la exposición, la IgG purificada a partir de ratones vacunados inhibía la entrada de pseudopartículas de manera dependiente de la dosis y con una eficacia similar a la de CR6261, un anticuerpo monoclonal con especificidad hacia el tallo de HA que se usaba como control positivo (Figura 30J). El protocolo de vacunación, por lo tanto, producía anticuerpos contra el tallo con amplias especificidades, capaces de neutralizar otras HAs del grupo 1, tal como H2.
6.6.3 Conclusión
Este ejemplo demuestra el efecto protector de una respuesta inmunitaria específica del tallo que puede provocarse mediante una vacunación con HAs quiméricas. Se demostró que una respuesta inmune dirigida hacia el tallo de HA era suficiente para la protección contra una exposición viral, y que este protocolo de vacunación proporcionaba pro­ tección heterosubtípica. Se podía desarrollar una estrategia similar en humanos para brindar protección contra una amplia gama de virus de la gripe, eliminando la necesidad de una vacunación anual y mejorando la preparación para una pandemia.
6.7 Ejemplo 7: Un dominio de trimerización carboxi-terminal estabiliza los epítopos conformacionales sobre el dominio del tallo de sustratos de hemaglutinina recombinantes solubles
Este ejemplo demuestra que un dominio de trimerización carboxi-terminal es importante para la integridad estructural de los epítopos del tallo en la hemaglutinina del virus de la gripe soluble recombinante.
6.7.1 Materiales y métodos
6.7.1.1 Células
Se cultivaron células de insecto Sf9 (ATCC # CRL-1711) en medio TMN-FH (Gemini BioProducts) complementado con FBS al 10% (Atlanta Biologicals), Pluronic F68 al 0,1% (Sigma) y una mezcla de antibiótico penicilina-estreptomi­ cina (Gibco). Se cultivaron células BTI-TN-5B1 -4 (High Five - subclón del Instituto de Biotecnología de Viena) en medio exento de suero HyClone SFX (Fisher Scientific) complementado con una mezcla de antibióticos penicilina-estrepto­ micina (Gibco).
6.7.1.2 Clonación y generación de baculovirus recombinantes
Secuencias que codificaban HAs de las cepas H1 A/Puerto Rico/8/34 (PR8), A/California/04/09 (Cal09), cepa H2 A/Japón/305/57 (JAP57), cepas H3 A/Hong Kong/1/68 (HK68), A/Wisconsin/67/05 (Wisc05) y cepa H5 A/Viet Nam/1203/04 (VN04 - con sitio de escisión polibásico eliminado; véase Steel et al., 2009, J Virol 83: 1742-1753), se amplificaron a partir de plásmidos pCAGGS mediante la reacción en cadena de la polimerasa y se clonaron en un vector pFastBac modificado (Invitrogen) utilizando las endonucleasas de restricción (NEB) BamHI o StuI y NotI. Se clonaron dos con­ juntos de estructuras artificiales, HA sin y con dominio de trimerización: las estructuras artificiales de HA sin dominio de trimerización se diseñaron de modo que el dominio transmembranal C-terminal y el endodominio de la HA se reemplazaron con un marcador de hexahistidina (la secuencia de HA termina en 1509 para H1, V509 para H2 y H5 y G508 para H3; numeración H3); el otro conjunto de estructuras artificiales, HA con dominio de trimerización, también carece de endodominios y dominio transmembranal C-terminal (la secuencia HA termina en V503 - numeración H3) pero incluye un sitio de escisión de trombina y un dominio de trimerización de foldon T4 (véase, por ejemplo, Meier et al., 2004, J Mol Biol 344: 1051-1069) además del marcador de hexahistidina C-terminal (Figura 31). Los clones de pFastBac recombinantes generados se transformaron en bacterias DH10Bac (Invitrogen) de acuerdo con las instruc­ ciones del fabricante y los bácmidos recombinantes se prepararon con un kit PureLink Plasmid Filter Midiprep (Invitro­ gen). Los bácmidos recombinantes se transformaron en células Sf9 utilizando Cellfectin II (Invitrogen) para el rescate de baculovirus recombinantes. Todas las secuencias fueron confirmadas mediante secuenciación de Sanger.
trimerización aparecía solo como una banda HA0 (Figura 32A). HA PR8 y HK68 parecían ser muy estables (presentes como HA0) incluso en ausencia de un dominio de trimerización.
Las HAs se reticularon con y sin el dominio de trimerización T4 usando BS3, un reticulador químico hidrofílico de 11 Angstrom que se había usado recientemente para mostrar la trimerización de las HAs (véase, por ejemplo, Weldon et al., 2010, PLoS One 5). Después de la reticulación, las muestras se diluyeron en un colorante de carga desnaturali­ zante y reductor y se determinaron en un gel SDS-PAGE desnaturalizante y reductor. Las HAs del grupo 1 sin dominio de trimerización formaban oligómeros de alto peso molecular que apenas se desplazaban en el gel en ejecución y se retenían en su mayoría en el gel de apilamiento (Figura 32B y 32C). El fenotipo más fuerte se detectó para VN04 y JAP57; otras HAs del grupo 1 también formaban trímeros adicionales (aproximadamente 230 kDa), dímeros (130 a 150 kDa) y monómeros (60 kDa) (Figura 32B y 32C). Las HAs del grupo 1 con dominio de trimerización formaban en su mayoría trímeros que se desplazaban hasta aproximadamente 230 kD en el gel SDS-PAGE y formaban una banda definida en el gel en ejecución. Sin embargo, también formaban dímeros (aproximadamente 130 a 150 kDa, más fuertes para Cal09) y monómeros (60 kDa). Las HAs del grupo 2 se comportaban de manera diferente: HA HK68 formaba predominantemente trímeros y hasta cierto punto dímeros, independientemente de la presencia de un domi­ nio de trimerización. HA Wisc05 mostraba principalmente dimerización en ausencia de un dominio de trimerización, mientras que una HA con el dominio T4 estaba mayormente trimerizada.
6.7.2.2 Un dominio de trimerización C-terminal mejora fuertemente la unión de anticuerpos reactivos con el tallo a sustratos de HA
Se evaluó la reactividad de un panel de anticuerpos neutralizantes muy reactivos frente a las estructuras artificiales de HA, para determinar la unión diferencial de esos anticuerpos a sustratos de HA con y sin dominio de trimerización. Se emplearon anticuerpos específicos del tallo mAb C179, mAb 6F12 de ratón, mAb CR6261 humano (todos especí­ ficos del grupo 1); y se usaron mAb 12D1 de ratón y mAb CR8020 humano (ambos específicos del grupo 2) en el experimento. También se usaron en el experimento otros cuatro anticuerpos reactivos con el tallo, KB2, BD3, GG3 e IB11, que se habían aislado recientemente y se caracterizaban por tener reactividad tanto con HAs H1 como con H5. Como control, se usaron anticuerpos específicos de una cepa que se sabía que se unen al dominio de la cabeza globular de HA. Como controles adicionales, se utilizaron sueros de ratones infectados subletalmente con cepas del virus de la gripe (PR8, Cal09, H3, VN04) o vacunados con VLPs (JAP57). Los anticuerpos C179, CR6261 y 6F12 mostraban un fuerte fenotipo de unión a las dos HAs H1 que se sometieron a ensayo (Cal09 y PR8). Cabe señalar que se unían exclusivamente a HAs que tenían un dominio de trimerización (Figura 33A y 33B); no se observó unión a HAs sin un dominio de trimerización. Se observaron características de unión similares con los otros cuatro anticuer­ pos de H1-H5 ampliamente neutralizantes reactivos con el tallo. Por el contrario, los anticuerpos específicos de la cabeza, como 7B2 (Cal09) y PY102 (PR8), reaccionaban con la HA independientemente de la expresión de un dominio de trimerización y esos hallazgos se confirmaron utilizando sueros de animales infectados con Cal09 o PR8 (Figura 33A y 33B).
Este efecto no es específico del subtipo H1: al someter a ensayo la unión de las HAs C179 y CR6261 a JAP57 (H2) y VN04 (H5) con y sin un dominio de trimerización, se observó un fenotipo similar, en donde esos anticuerpos solo reaccionaban con formas trimerizadas de la proteína (Figura 34A y 34B). Se observó el mismo resultado cuando se evaluaba la reactividad de los cuatro anticuerpos de H1-H5. Los anticuerpos específicos de la cabeza 8F8 (JAP57) y mAb#8 (VN04) o los sueros anti-H2 o anti-H5 policlonales, reconocían ambas formas de HA igualmente bien.
Para los anticuerpos que se unen a HAs del grupo 2 surgió un patrón diferente. Para someter a ensayo los efectos de un dominio de trimerización sobre la reactividad de los anticuerpos del tallo con HAs del grupo 2, se usaron anticuerpos ampliamente reactivos CR8020 y 12D1. CR8020 se une a un epítopo conformacional en las HAs del grupo 2, mientras que se cree que 12D1 se une a un epítopo lineal dentro de la hélice alfa larga (LAH) de la subunidad HA2. La unión de CR8020 a las HAs HK68 y Wisc05 con dominios de trimerización, mejoraba mucho con respecto a la unión a las HAs sin dominio de trimerización (Figura 35A y 35B). Sin embargo, la falta del dominio de trimerización no eliminaba por completo la unión como se observa con las HAs del grupo 1. 12D1 no distinguía entre HAs con o sin dominio de trimerización (Figura 35).
6.7.3 Conclusión
El dominio de trimerización de T4 permite una trimerización exitosa de las moléculas de HAs solubles y aumenta en gran medida la estabilidad de esas moléculas después de la expresión de baculovirus.
6.8 Ejemplo 8: Virus de la gripe que expresa una HA quimérica que comprende el dominio del tallo de un virus de la gripe H1 y el dominio de la cabeza globular de un virus de la gripe H5 (CH5/1)
Este ejemplo demuestra que la ingeniería genética y el rescate de un virus de la gripe que expresa una HA quimérica que comprende el dominio del tallo de un virus de la gripe H1 y el dominio de la cabeza globular de un virus de la gripe H5 (es decir, un virus de la gripe que comprende un genoma diseñado para expresar un polipéptido de hemaglutinina quimérico cH5/1 del virus de la gripe).
Se construyó un plásmido para el rescate del virus de la gripe que expresaba un polipéptido de hemaglutinina quimé­ rico del virus de la gripe cH5/1 mediante la sustitución de codones del dominio de la cabeza globular (53 a 276, ha descrito en otra parte (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728-4737; Krammer et al., 2012. PLoS One. 7:e43603. doi:10.1371/joumal.pone.0043603) y se multiplicaron en células Sf9. Para la expresión, las células High Five se infec­ taron con baculovirus recombinantes con una multiplicidad de infección de aproximadamente 10, se transfirieron a matraces Fernbach y se incubaron a 28°C, con agitación. Los materiales sobrenadantes del cultivo se recogieron 96 h después de la infección mediante centrifugación a baja velocidad (5500 de fuerza centrífuga relativa [RCF], 10 min, 4°C) y luego se incubaron con resina de ácido ni-nitriltriacético (NTA) (Qiagen) durante 3 h a temperatura ambiente (TA), con agitación a 75 rpm en un agitador rotatorio. A continuación, la mezcla de resina y material sobrenadante se hizo pasar por columnas de polipropileno de 10 ml (Qiagen), se lavó cuatro veces con tampón de lavado (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, pH 8) y eluyó con tampón de elución (Na2HCO3 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8). Las fracciones eluidas se concentraron y el tampón se intercambió por solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,4) usando unidades de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore; corte de masa molecular de 30 kDa). La pureza, la identidad y la integridad de las proteínas purificadas se evaluaron mediante SDS-PAGE y transferencia Western o ELISA, y la concentración de las proteínas se midió utilizando el reactivo de Bradford (Bio-Rad). Las HAs solubles A/Perth/16/09 H3, A/Shanghai/1/13 H7 y A/PR/8/34 H1 para los ELISAs se expresaban de manera similar pero como una proteína de fusión con un motivo de trimerización GCN4pII y un Strep-Tag II C-terminal a través de la resina StrepTactin (GE Healthcare) para evitar la señal de fondo cuando se usaba en ELISAs para evaluar los anticuerpos reactivos con el tallo inducidos por las estructuras artificiales de la vacuna (Krammer et al., 2013. J. Virol. 87:6542-6550).
Animales, vacunación y exposición. Todos los experimentos con animales se realizaron con ratones hembra BALB/c de 6 a 8 semanas de edad (Jackson Laboratories) y en pleno cumplimiento de las pautas de la Escuela de Medicina Icahn Sinai en el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Mount Sinai. Los animales tenían libre acceso a comida y agua y se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Los animales fueron anestesiados en todos los procedimientos por vía intranasal mediante la administración de 0,1 ml de una mezcla de ketamina-xilazina (0,15 mg/kg y 0,03 mg/kg) por vía intraperitoneal.
Para el experimento inicial, se vacunaron ratones BALB/c sin tratamiento previo de 6 a 8 semanas de edad en el músculo de la pantorrilla izquierda con ADN que codificaba una HA cH4/3 (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728-4737; Krammer et al., 2013. J. Virol. 87:6542-6550; Steel et al., 2010. mBio 1(1):e00018-10. doi:10.1128/mBio.00018-10), mediante electroporación in vivo utilizando un sistema de administración TriGrid (Ichor Medical Systems). Tres sema­ nas más tarde, los animales recibieron un refuerzo por vía intramuscular (i.m.) e intranasal (i.n.) con 5 gg de proteína adyuvada con 5 gg de poli(PC) (Invivogen) en cada sitio (n = 9 o 10 animales por grupo). Los animales únicamente sensibilizados (n = 5 por grupo) recibieron la misma cantidad de una proteína irrelevante (albúmina de suero bovino [BSA]), con la misma cantidad de adyuvante, tanto i.m. como i.n. Se administró un segundo refuerzo 3 semanas más tarde de la misma manera pero con proteína cH7/3. Para el subconjunto de ratones que se exponían a H7N1, la proteína cH7/3 se reemplazó por la proteína Perth09 H3 de longitud completa. Los animales únicamente sensibilizados recibieron nuevamente la vacuna BSA correspondiente. Los animales de control positivo (n = 5 por grupo) fueron vacunados con 1 gg de virus de exposición, compatible inactivado i.m., 3 semanas antes de la exposición. Se inclu­ yeron ratones sin tratamiento previo (n = 5 por grupo) como grupos de control negativo adicionales. Cuatro semanas después del último refuerzo, los animales fueron anestesiados e infectados con 5 dosis letales al 50% (DL50) de los virus Phil82, X-31 o RheaH7. El peso se controló diariamente durante un período de 14 días, y los animales que perdieron el 25% o más de su peso corporal inicial se clasificaron como muertos y se sacrificaron humanitariamente. Las muestras de suero se recogieron antes de la sensibilización y antes de la exposición mediante extracción de sangre submandibular.
Para el segundo grupo de experimentos, se infectaron ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad por vía intranasal con una dosis subletal (106 ufp) de un vector del virus de la gripe B recombinante (basado en B/Yamagata/16/88) que expresaba la proteína HA cH7/3. Los animales de control recibieron la misma dosis de virus de la gripe B de tipo silvestre (wt) (Bwt). A continuación, los ratones del grupo vacunado se reforzaron con proteína cH5/3 (5 gg i.n. más 5 gg i.m., cada cantidad con 5 gg de adyuvante poli(PC), con la excepción de un subconjunto de animales que tuvieron una exposición al virus cH5/3N1; esos animales recibieron HA H3 Perth09 recombinante de longitud completa de la misma manera, en lugar de la proteína cH5/3 (n = 10 por grupo). Los animales únicamente sensibilizados y de control de vector (n = 5 por grupo) recibieron en su lugar un refuerzo con proteína irrelevante (BSA; misma cantidad, adyuvante y vías de administración que para los grupos vacunados). Finalmente, los animales recibieron un segundo refuerzo 3 semanas más tarde con proteína cH4/3 como se ha descrito para el primer refuerzo. De nuevo, los animales única­ mente sensibilizados y de control de vector recibieron proteína irrelevante, de la misma manera. Se incluyeron ratones sin tratamiento previo (n = 5 por grupo) como grupos de control negativo adicionales. Los animales de control positivo (n = 5 por grupo) se vacunaron con 1 gg de virus de exposición compatible inactivado, i.m., 3 semanas antes de la exposición al virus. Cuatro semanas después del último refuerzo, los animales fueron anestesiados y se expusieron a 10 DL50 de Phil82 o X-31 o a 100 DL50 del virus cH5/3N1. La pérdida de peso se controló diariamente durante un período de 14 días, y los animales que perdieron el 25% o más de su peso corporal inicial se clasificaron como muertos y se les practicó una eutanasia humanitaria. Las muestras de suero se recogieron antes de la sensibilización y antes de la exposición mediante extracción de sangre submandibular. Para los experimentos de valoración pulmonar, los ratones se vacunaron como se ha descrito anteriormente (grupos cHA y Bwt-BSA-BSA, n = 3 ratones por grupo) y luego se infectaron con 5 X 104 ufp de H3N2v o 1 X 105 ufp del virus H3N8, WyoH3 o H10N7. Los pulmones se recogieron el día 3 después de la infección y se homogeneizaron, y la dosis infecciosa del cultivo tisular al 50% (TCID50) se midió como se ha descrito antes (Miller et al., 2013. J. Infect. Dis. 207:98 - 105).
Para los experimentos de transferencia pasiva, se recogieron sueros del último conjunto de experimentos del grupo con vacuna (vectorizados contra la gripe B), el grupo de control positivo, el grupo de control del vector y los animales sin tratamiento previo. Luego, los sueros de cada grupo se transfirieron mediante inyección intraperitoneal a ratones sin tratamiento previo (de 6 a 8 semanas de edad, n = 5 por grupo, 300 ql de suero por ratón) y los ratones fueron expuestos a 5 DL50 del virus Phil82, 2 h después de la transferencia. El peso se controló diariamente durante un período de 14 días, y los animales que perdieron el 30% o más de su peso corporal inicial se clasificaron como muertos y se sacrificaron.
ELISA. Las placas de ELISA (Immunolon 4 HBX) se recubrieron durante la noche a 4°C con virus purificado (4 qg/ml) o proteína purificada (2 qg/ml) diluida en tampón de recubrimiento de carbonato/bicarbonato (pH 9,4). Las placas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con PBS que contenía Tween 20 al 0,1% (TPBS) y leche en polvo descremada al 3%. El suero de ratón se diluyó previamente 1:100, se diluyó en serie en etapas de 1:2 en TPBS que contenía leche en polvo descremada al 1% y se incubó en las placas durante 1 hora a TA. Después de un lavado a fondo con TPBS (3X 100 ql/pocillo), las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con una IgG conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) anti-IgG de ratón (Santa Cruz) diluida en TPBS que contenía leche en polvo descremada al 1%. Después de tres etapas más de lavado con TPBS, las placas se revelaron usando el sustrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (SigmaFast OPD; Sigma). Las reacciones se detuvieron usando HCl 3 M y las placas se leyeron con una densidad óptica de 490 nm.
La detección de IgA en lavados nasales se realizó con un ensayo similar, excepto que se utilizó un anticuerpo IgA anti­ ratón ligado a fosfatasa alcalina (AP) (Southern Biotech) diluido 1:500 y etapas de incubación a 37°C durante 3 h. La distribución de los isotipos en suero se determinó mediante ELISA utilizando un kit de isotipificación (Invitrogen), que contenía una colección de anticuerpos secundarios específicos para cada subtipo y un anticuerpo terciario conjugado con AP que permitía la detección de la unión.
Ensayo de neutralización de partículas pseudotipadas. El protocolo de producción de partículas pseudotipadas fue adaptado a partir de estudios previos (Hai et al., 2012. J. Virol. 86:5774 -5781; Evans et al., 2007. Nature, 446:801-805; Pica et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:2573-2578). Brevemente, las células 293-T se cotransfectaron con cuatro plásmidos que codificaban un provirus que contenía un gen indicador de luciferasa, el Gag-Pol del VIH, la proteína HA Vic11 y la neuraminidasa del virus de la gripe B B/Yamagata/16/88. Los materiales sobrenadantes del cultivo se recogieron 48 h después de la transfección y se filtraron a través de una unidad de filtro con un tamaño de poro de 0,45 g para eliminar los restos celulares. Las partículas pseudotipadas purificadas se incubaron con diferentes concentraciones de suero de ratón inactivado antes de agregarlas a las células MDCK. El procedimiento de transducción se llevó a cabo durante 6 h, luego se lavaron las células y se colocó medio de nuevo aporte sobre las células. Los procedimientos de transducción se realizaron en presencia de 1 qg/ml de Polybrene (Sigma, St. Louis, MO). La actividad de la luciferasa se leyó 48 horas después de la transducción. El anticuerpo monoclonal reactivo con el tallo 12D1 (Wang et al., 2010. PLoS Pathog.6:e1000796.doi:10.1371/journal.ppat.1000796) se utilizó como control positivo con una concentración inicial de 123 qg/ml.
Tinción de inmunofluorescencia. Las células MDCK se transfectaron con plásmidos que expresaban HA A/Anhui/1/13 (H7N9), A/Shanghai/1/13 (H7N9), A/chicken/Jalisco/12283/12 (H7N3), A/mallard/Gurjev/263/82 (H14N5) y A/wedge tailed shearwater/Western Australia/2576/79 (H15N9). Las células se transfectaron con el plásmido respectivo. Dieci­ séis horas después de la transfección, las células se fijaron con paraformaldehído al 0,5% y se tiñeron con una dilución 1:200 de sueros recogidos de animales vacunados (cH4/3DNA-cH5/3-H3) o que no tenían tratamiento previo. Anti­ cuerpos reactivos con el tallo FI6 (Corti et al., 2011. Ciencia, 333:850 - 856) y FBE9 (ambos utilizados con una con­ centración de 10 qg/ml) sirvieron como controles positivos, mientras que el suero recogido de los animales sin trata­ miento previo se utilizó como control negativo. Se usaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa 488 para visualizar la reactividad frente a las proteínas. Las imágenes se tomaron en un microscopio confocal LSM 510 Meta (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Alemania) con un aumento de X10.
Pruebas estadísticas, modelo de hemaglutinina y análisis filogenético. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism4 (GraphPad). Todos los valores se representan como promedios con desviaciones estándar de las medias. Las diferencias en la supervivencia se calcularon utilizando el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier con la prueba de significancia de rango logarítmico. Los valores de P iguales o inferiores a 0,05 se consideran estadísticamente signifi­ cativos. Para generar modelos de hemaglutininas de tipo silvestre y quiméricas, se construyeron modelos de estruc­ turas procedentes del Protein Data Bank (PDB) utilizando el programa informático PyMol (Delano Scientific). Para el modelo de la estructura artificial cH4/3, se utilizó la HA A/Hong Kong/1/68 (HK68) (identificador PBD [ID] 1MQN) y el dominio de la cabeza H4 se indicó con un color diferente (no hay una estructura H4 disponible). Para HA cH5/3 se construyó un modelo con el tallo de HA HK68 (PBD ID 1 mQn) y la cabeza globular de un virus H5 (PBD ID 2FK0); el modelo de cH7/3 se construyó con el dominio del tallo HK68 y un dominio de la cabeza de un virus H7 aviar (PDB ID 4DJ6). Para los virus de exposición quiméricos se construyó un modelo utilizando la estructura del tallo de HK68 (PBD ID 1MQN) y la cabeza de H5 HA (PBD ID 4DJ6). El análisis filogenético se realizó utilizando ClustalW (EMBL-EBI). Las secuencias de proteínas se descargaron del GenBank y se realizaron alineaciones múltiples utilizando el algoritmo ClustalW en versión Mega 5.1. Los árboles filogenéticos se construyeron utilizando el programa informático FigTree y el método de unión de vecinos.
6.9.2 Resultados
Las estructuras artificiales quiméricas de HA brindan una amplia protección contra una exposición a virus H3N2 diver­ gentes. Para inducir una amplia protección frente a los virus de la gripe que expresaban HA del grupo 2 en el modelo de ratón, se potenciaron específicamente los anticuerpos frente al dominio del tallo de HA conservado. Con este fin, se construyó una colección de moléculas de cHAs que expresaban dominios del tallo H3 combinados con varios dominios de la cabeza (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737; Hai et al., 2012. J. Virol. 86:5774 -5781). Los ratones se sensibilizaron por vía intramuscular (i.m.) con ADN de un plásmido que codificaba una HA cH4/3 (que expresaba un dominio de la cabeza globular H4 y un dominio del tallo H3) (Fig. 37A). Tres semanas más tarde, los ratones recibieron un refuerzo con proteína cH5/3 soluble (dominio del tallo H3 combinado con un dominio de la cabeza globular H5) vía i.m. e intranasal (i.n.). Se utilizaron ambas rutas para asegurar la inducción de una inmunidad sistémica y de las mucosas, ya que ambas respuestas son importantes para una protección eficaz contra la infección con el virus de la gripe. Un segundo refuerzo con proteína cH7/3 (cabeza globular H7 sobre un tallo H3) siguió 3 semanas más tarde (Fig. 37A). Se planteó la hipótesis de que al exponer repetidamente a los animales frente a antígenos que expresaban un dominio del tallo común, sin restricciones (soluble, no unido a la membrana), se podía mejorar la inmunogenicidad de esa región, ya que las estrategias de vacunación utilizadas actualmente inducen solo una res­ puesta subdominante (Wrammert et al., 2008. Nature 453:667-671; Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737).
Los animales de control recibieron solo la sensibilización con ADN (control de solo sensibilización) o un virus de ex­ posición inactivado compatible (control positivo) o no tenían un tratamiento previo. Para someter a ensayo la capacidad de esa vacuna para proteger contra la morbilidad y la mortalidad asociadas con la gripe, se infectaron ratones con dos virus H3N2 diferentes. Cabe señalar que todos los animales vacunados con cHA eran negativos para HI frente a las respectivas cepas de exposición. Tras la infección con el virus A/Philippines/2/82 (Phil82), los animales vacunados perdían cantidades mínimas de peso en comparación con el control positivo sin pérdida de peso, no desarrollaban síntomas clínicos y estaban completamente protegidos contra la mortalidad (Fig. 37B y C). Sin embargo, los animales sin tratamiento previo perdían peso rápidamente y sucumbían a la infección el día 9 (control sin tratamiento previo). Los controles de únicamente sensibilizados también mostraban una rápida pérdida de peso, y solo el 20% de ellos sobrevivían a la exposición vírica. Se observó un resultado similar tras la exposición a X-31, un virus que expresa las glicoproteínas del virus Hong Kong 1968 H3N2 (Fig. 37D y E).
Los datos anteriores demuestran que una infección subletal con los virus de la gripe es una forma de inducir anticuer­ pos reactivos con el tallo en ratones y seres humanos (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737; Pica et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:2573-2578; Krammer et al., 2012. J. Virol. 86:10302-10307). Dado que la mayoría de los seres humanos están expuestos a los virus de la gripe varias veces a través de su vida, por lo general tienen niveles básicos de anticuerpos reactivos con el tallo. Para imitar esa inmunidad preexistente en el modelo de ratón, se rescató un virus de la gripe B que expresaba una HA cH7/3, en lugar de la HA del virus de la gripe B de tipo silvestre. Se usó una dosis subletal de ese virus para sensibilizar a los ratones, que luego se vacunaron a intervalos de 3 semanas con cH5/3 seguido de proteína cH4/3, tanto i.m. como i.n. (Figura 38A). Cuando se expusieron a Phil82 o X-31, los animales no mostraron signos clínicos de enfermedad y una pérdida de peso mínima comparable a la de los animales del control positivo que recibieron cepas de exposición compatibles inactivadas (Fig. 38C, D, F y G). Los animales de control infectados de manera subletal con el virus de la gripe B de tipo silvestre y vacunados de manera similar con una proteína irrelevante (BSA), así como los ratones sin tratamiento previo y los controles únicamente sensibilizados, perdieron peso rápidamente y sucumbieron a ambas infecciones. A continuación, se sometió a ensayo la capacidad de una inmunidad dirigida hacia el tallo para proteger contra cepas aisladas de H3N2 más recientes. Dado que los virus H3N2 contemporáneos no son patógenos en el modelo de ratón, un virus cH5/3N1 que expresaba el dominio del tallo H3 de la cepa de una vacuna reciente A/Perth/16/09 (Perth09) y una NA de A/PR/8/34 (H1N1), fue utilizado para este fin (Hai et al., 2012. J. Virol. 86:5774 -5781). Para evaluar la protección conferida por los anticuerpos reactivos con el tallo (y para excluir los anticuerpos reactivos con la cabeza H5-H5), se modificó el régimen de vacu­ nación para este subconjunto de ratones y se administró H3 de longitud completa en lugar de la proteína cH5/3 (Fig. 38A). Al exponer a una dosis alta (100 DL50 de ratón [mDLsü]) del virus cH5/3N1, se observaba una protección fuerte frente a la pérdida de peso, así como una protección completa frente a la mortalidad de los animales vacunados. Esto demostraba la eficacia del enfoque de la vacuna basada en tallos de HA contra cepas aisladas contemporáneas de H3N2 (Fig. 38B y E). Para someter a ensayo cepas H3 divergentes adicionales que no inducen mortalidad en el modelo de ratón, se realizaron experimentos de titulación pulmonar. Los animales vacunados como se ha descrito anterior­ mente, se infectaron con la variante del virus H3N2 (H3N2v) (CDC. Julio 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep.
61:561), una cepa aislada aviar H3N8 (H3N8) y la cepa humana H3N2 A/Wyoming/03/03 (WyoH3). El día 3 después de la infección, los títulos pulmonares de los animales vacunados eran bajos (cerca del límite de detección), mientras que se detectaron títulos altos de virus en los pulmones recogidos en los animales de control (Bwt-BSA-BSA) (Fig. 37F y G y datos no mostrados). En conjunto, estos datos muestran claramente que la estrategia de vacunación basada en el tallo puede proporcionar una protección sólida contra virus heterólogos y heterosubtípicos en el modelo de gripe en ratones.
La vacunación con estructuras artificiales quiméricas de HA induce una amplia respuesta humoral sistémica y en las mucosas, dirigida al tallo. Se emplearon ELlSAs para caracterizar la respuesta de anticuerpos dirigidos al tallo, indu­ cida por este régimen de vacunación. Dado que los animales fueron expuestos solo a HA recombinante o expresada en el vector, pero a ninguna otra proteína del virus de la gripe A, se pudo usar el virus purificado como sustrato para medir las respuestas anti-tallo. Los sueros de ambos regímenes de vacunación (virus de la gripe B vectorizados o sensibilizados con ADN) se analizaron para determinar su reactividad frente a las cepas de exposición Phil82 y X-31, así como a la actual cepa A/Victoria/361/11 (Vic11) de la vacuna H3N2, una cepa H3N8 y proteína HA de Perth09. Mientras que los sueros recogidos de animales que no habían sido expuestos previamente o que fueron expuestos solo una sensibilización con ADN, mostraban un bajo nivel de unión de fondo, había una reactividad elevada contra las cinco cepas víricas en los sueros recogidos de los ratones vacunados (Fig. 39A a E). De manera similar, se detec­ taron títulos altos de anticuerpos dirigidos al tallo en los sueros de animales sensibilizados con el virus de la gripe B que expresaba cHA (Fig. 39F a H). El control del vector (virus de la gripe B de tipo silvestre) y los animales sin trata­ miento previo, nuevamente solo mostraban reactividad de fondo, mientras que el grupo de únicamente sensibilizados (virus de la gripe B que expresaba HA c7/3) tenía un fenotipo de unión intermedia. Se pensó que los títulos intermedios en el último grupo eran el resultado de la replicación del virus (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737; Krammer et al., 2012. J. Virol. 86:10302-10307). La distribución de los isotipos reveló que el perfil de la respuesta de los anti­ cuerpos inducida por la vacuna está equilibrado, siendo la mayoría de las IgGs de la subclase IgG1, IgG2a o IgG2b (véase la Fig. 41C).
Además de los títulos de IgG en suero, se evaluaron los niveles de IgA secretora sobre las superficies mucosas de los ratones vacunados. Esto reveló una alta reactividad frente a HA Perth09 H3 en lavados nasales recogidos del grupo de ratones que recibieron la vacuna, mientras que los lavados nasales de los animales de control no reaccionaban frente al sustrato (véase la Fig. 41B). Aunque los anticuerpos IgA anti-tallo de la mucosa y su capacidad para bloquear la infección vírica aún no se han caracterizado formalmente, se supone que contribuyen a la protección observada.
Recientemente se han descrito en las publicaciones anticuerpos anti-cabeza globular ampliamente reactivos (Ekiert et al., 2012. Nature 489:526 -532; Lee et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:17040-17045; Krause et al., 2012. J. Virol. 86:6334 - 6340). Aunque son raros en la naturaleza, esos anticuerpos tienden a reconocer regiones conser­ vadas del sitio de unión al receptor y reconocen dominios de la cabeza globular divergentes sin tener una relación filogenética estrecha. La unión a los dominios de la cabeza de las HAs del grupo 1 y del grupo 2 (p. ej., la unión H1-H3) ha sido descrita con esos anticuerpos. Para evaluar si la vacunación basada en cHA induce tales anticuerpos, se realizó un ELISA adicional con HA H1 de longitud completa como sustrato (véase la Fig.41A). Los sueros de animales vacunados con cHA no reaccionaban con ese sustrato, lo que sugiere que la vacunación con cHA no induce niveles detectables de anticuerpos anti-cabeza que sean ampliamente reactivos.
Los anticuerpos ampliamente reactivos inducidos neutralizan potentemente virus, tanto in vitro como in vivo. Para seguir sometiendo a ensayo la naturaleza de la neutralización cruzada in vitro de los anticuerpos del tallo inducidos por el régimen de vacunación, se realizó un ensayo de inhibición de la entrada con partículas pseudotipadas HA Vic11. El suero de los animales vacunados inhibía la entrada celular de las pseudopartículas de una manera dependiente de la dosis (véase la Fig. 41D). Por el contrario, el suero de los animales de control infectados con el vector del virus de la gripe B y ratones sin tratamiento previo, no mostraba actividad inhibitoria en ese ensayo.
Se realizó un experimento de transferencia pasiva para demostrar que la protección inducida por la vacuna observada in vivo se debía, al menos en parte, a los anticuerpos neutralizantes en el suero. Se transfirieron sueros de animales vacunados, de control positivo, infectados con el vector del virus de la gripe B o sin tratamiento previo a ratones sin tratamiento previo, que luego se expusieron al virus Phil82. Los ratones que recibían sueros de los grupos vacunados o de control positivo estaban completamente protegidos frente a una mortalidad, mientras que ninguno de los animales que recibieron sueros de cualquiera de los grupos de control negativo sobrevivía (véase la Fig. 41E). Estos resultados indican que la respuesta humoral dirigida al tallo es suficiente para proteger a los ratones de una exposición letal.
La vacunación con estructuras artificiales quiméricas de HA induce inmunidad heterosubtípica basada en el tallo. En las publicaciones se han descrito anticuerpos que neutralizan de forma cruzada los virus de la gripe con HAs diver­ gentes del grupo 2 (Wang et al., 2010. PLoS Pathog. 6:e1000796. doi:10.1371/journal.ppat.1000796; Ekiert et al., 2011. Science 333:843-850). Para someter a ensayo la protección contra un virus H7N1 heterosubtípico y excluir cualquier participación de anticuerpos dirigidos a la cabeza en la protección observada, se utilizó el régimen de vacu­ nación ADN-proteína-proteína descrito anteriormente, aunque la proteína HA cH7/3 se reemplazó con HA H3 de lon­ gitud completa (Figura 40A). Tanto los animales vacunados como los de control positivo expuestos a la cepa aviar H7N1 A/rhea/North Carolina/39482/93 (RheaH7) experimentaron una pérdida de peso inicial similar, de aproximada­ mente el 15% (Fig. 40B). Esto probablemente se deba a la gran cantidad de ufp/dosis letales de ratón necesarias para esa exposición vírica experimental. Sin embargo, los ratones de ambos grupos recuperaron el peso rápidamente y el grupo de la vacuna mostraba una tasa de supervivencia del 90%. Sin embargo, los animales sin tratamiento previo y los que solo recibieron una sensibilización, experimentaron una pérdida de peso grave y mostraban una supervivencia baja o nula (20%), respectivamente. Los resultados del último experimento demuestran la verdadera naturaleza hete­ rosubtípica de la inmunidad proporcionada por una respuesta dirigida al tallo de HA (Fig. 40C). Para evaluar más a fondo el nivel de anticuerpos ampliamente neutralizantes presentes en los sueros, se realizaron ELISAs con virus expuesto H7N1 purificado, así como con proteína H7 recombinante de la nueva cepa del virus chino H7N9 (Gao et al., 2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897). La detección de títulos elevados de anticuerpos en sueros recogidos de estos animales contra las HAs H7, subraya la naturaleza de reactividad cruzada de la respuesta inducida por el dominio del tallo H3 (Fig. 40D y E, Fig. 41). Además, se realizó un experimento de exposición con un virus H10N7, con títulos pulmonares como lectura del ensayo. Los títulos pulmonares del día 3 para los animales vacunados estaban en el intervalo de 103 TCID5ü/ml, mientras que los animales vacunados de forma simulada mostraban un título de 10 a 100 veces mayor (Fig. 40F). La unión eficiente de los sueros de animales vacunados con cHA a las células que expresaban HA H7 de linaje euroasiático y norteamericano, así como HA H14 y H15, demuestra aún más la naturaleza de reacción cruzada de esta respuesta inmunitaria (Fig. 40G y 42).
6.9.3 Discusión
Aunque los anticuerpos anti-tallo se pueden encontrar en seres humanos que han estado expuestos a los virus de la gripe mediante vacunación o infección (Margine et al., 2013. J. Virol. 87:4728 - 4737; Sui et al., 2011. Clin. Infect. Dis.
52:1003-1009; Corti et al., 2010. J. Clin. Invest. 120:1663-1673), parecen ser raros en la naturaleza, y es probable que los niveles in vivo de esos anticuerpos sean demasiado bajos para brindar protección. En consecuencia, las vacunas capaces de aumentar los niveles de esos anticuerpos reactivos con el tallo, ampliamente neutralizantes podrían dar lugar a una protección universal frente a las cepas de virus de la gripe humana en circulación, así como frente a posibles virus aviares pandémicos como la emergente cepa china H7N9 (Gao et al., 2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897). Según la conservación del dominio del tallo de la HA, es probable que una vacuna universal de este tipo deba incluir tres componentes: un grupo 1, un grupo 2 y un antígeno basado en el tallo del virus de la gripe B.
Los animales vacunados secuencialmente con estructuras artificiales de HAs quiméricas que expresaban un dominio del tallo H3 y cabezas globulares divergentes, desarrollaron altos títulos de anticuerpos con reacción cruzada contra el dominio del tallo. Esos anticuerpos no solo protegían contra un panel de cepas H3N2 y virus H3N8, sino que también brindaban una protección sólida contra una exposición heterosubtípica a cepas aisladas aviares H7N1 y H10N7, lo que demuestra una amplitud que incluye ambos clados de virus que expresan HA del grupo 2. Esa amplitud es impor­ tante de cara a las crecientes preocupaciones sobre el potencial pandémico de los virus variantes H3N2 (H3N2v) y los virus H3N8 aislados a partir de focas comunes de Nueva Inglaterra y otras cepas zoonóticas de H3 (Baz et al., 2013. J. Virol. 87:6901-6910; CDC. Julio 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61:561; Anthony et al., 2012. mBio 3(4):e00166 -12. doi: 10.1128/mBio.00166-12), así como virus que expresan H4, H7 y H10 que infectan a los seres humanos ocasionalmente (Runstadler et al., 2013. Infect. Genet. Evol. 17:162-187; Kayali et al., 2011. PLoS One 6:e26818. doi:10.1371/journal.pone.0026818; Arzey et al., 2012. Emerg. Infect. Dis. 18:814 - 816 CDC. 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61:726 -727; Fouchier et al., 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:1356 -1361; Tweed et al., 2004. Emerg. Infect. Dis. 10:2196 - 2199). Es importante destacar que esa estrategia de vacunación también inducía títulos elevados de anticuerpos reactivos frente a la HA H7 del virus chino emergente H7N9 (Gao et al., 2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897).
Los seres humanos están expuestos a los virus de la gripe varias veces a través de su vida y, por lo tanto, es probable que tengan linfocitos B de memoria preexistentes con especificidades en el dominio del tallo. En un intento de imitar esta situación en el modelo de ratón y de aumentar de manera eficiente los títulos preexistentes de anticuerpos reac­ tivos con el tallo, los ratones fueron expuestos previamente al dominio del tallo H3 al ser infectados subletalmente con un virus de la gripe B recombinante que expresaba el dominio del tallo H3, en combinación con un dominio de la cabeza globular irrelevante. Tras la vacunación posterior con estructuras artificiales de cHA que contenían el mismo dominio del tallo pero diferentes cabezas, los niveles de anticuerpos reactivos con el tallo aumentaron de manera eficiente y protegieron a los ratones de una exposición a un panel de cepas del virus de la gripe H3N2 que abarcaba desde 1968 hasta 2009. El suero de ratones vacunados mostraba buena reactividad frente a una amplia gama de sustratos de virus H3N2, así como a un virus H7N1 y un sustrato de proteína HA H7N9. Los animales vacunados también mostraban títulos pulmonares reducidos después de la infección con H3N2v, H3N8 y H10N7. Además, el suero mostraba actividad neutralizante y podía proteger a los ratones en un experimento de exposición con transfe­ rencia pasiva. Estos hallazgos arrojan una luz sobre el mecanismo de neutralización provocado por esta estrategia de vacunación y sugieren que un mecanismo mediado por anticuerpos, probablemente basado en la neutralización de virus, está mediando en la protección. No se puede descartar en este punto una contribución de los linfocitos T CD8+ y CD4+ a la protección, aunque la transferencia de suero por sí sola era suficiente para proteger de una exposición. Una patogenicidad mejorada inducida por anticuerpos anti-gripe de reacción cruzada no neutralizantes se ha pro­ puesto como una posible razón de la alta patogenicidad del nuevo virus chino H7N9 en las personas ancianas (Skowronski et al., 2013. Euro Surveill. 18:pii=20465. http://www.eurosurveillance.org/View Article.aspx? Articleld=20465). No se observó una patogenicidad mejorada en animales vacunados con cHA que tenían títulos altos de anticuerpos con neutralización cruzada. De hecho, los animales estaban protegidos de la morbilidad y la mortalidad y el virus se eliminaba más rápidamente.
Los presentes experimentos se diseñaron para mostrar que la protección contra los virus que expresan HAs del grupo 2 puede estar mediada por anticuerpos reactivos solo con el tallo. Como se describe en este documento, una estrategia de vacuna humana podría basarse en virus inactivados o atenuados que expresan estructuras de cHA en combinación con una neuraminidasa funcional y todas las proteínas internas del virus de la gripe. El reemplazo del dominio de la cabeza globular de HA H3, frente al que los humanos tienen respuestas de memoria, por un dominio de la cabeza irrelevante "exótico" al que los humanos no conocen, además de impulsar los anticuerpos reactivos con el tallo (Krammer et al., 2013. J. Virol. 87:6542-6550; Miller et al., 2013. J. Infect. Dis. 207:98 -105; Pica et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:2573-2578; Li et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:9047-9052; Wrammert et al., 2011. J. Exp. Med. 208:181-193; Thomson et al., 2012. Front. Immunol. 3:87), debería potenciar los niveles de anticuerpos dirigidos contra la NA. Además, la presencia de proteínas internas con fuertes epítopos de linfocitos T aseguraría que también la rama celular de la respuesta inmune se active y probablemente contribuya a la protección. Esa vacuna incluiría un componente del grupo 1, grupo 2 y del tallo B, para garantizar una amplia protección contra todas las cepas de virus de la gripe humana en circulación, así como contra posibles subtipos pandémicos. Dado que la mayoría de los seres humanos, con la excepción de los niños muy pequeños, tienen una inmunidad preexistente frente a los virus de la gripe, incluidos niveles bajos de anticuerpos contra el dominio del tallo de la HA, es posible que la vacunación con una vacuna quimérica trivalente contra la HA pueda aumentar suficientemente esos títulos hasta niveles de pro­ tección.
6.10 Ejemplo 10: Estructuras artificiales de hemaglutinina quimérica del virus de la gripe basadas en el tallo H3 prote­ gen a los ratones de una exposición a H7N9
Este ejemplo demuestra que los sujetos pueden protegerse frente al nuevo virus H7N9 utilizando estructuras artificiales quiméricas de HA que no poseen un dominio de la cabeza H7. Este ejemplo también demuestra que un adyuvante a base de aceite en agua similar a los autorizados para los seres humanos, estaba bien representado con las vacunas candidatas de HA quimérica.
Para estudiar la importancia de las respuestas de las mucosas a la protección, se aplicó una configuración experimen­ tal que inducía tanto una inmunidad sistémica como de la mucosa, y se comparó con una que solo inducía una inmu­ nidad sistémica. Además, se compararon dos adyuvantes, poli I:C (PIC), que ya se ha utilizado con éxito en combina­ ción con cHA en animales, y un adyuvante genérico de aceite en agua (OIW) (Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (compilador), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer). Este último es similar a los adyuvantes que han sido autorizados para su uso en seres humanos (Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p.211-228. In O'Hagan dT (compilador), Vaccine Adjuvants, vol.42. Springer).
Los animales (cuadrados, N = 10 por grupo, ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad) se sensibilizaron con un plásmido de ADN que expresaba una proteína cH4/3 (cabeza H4 obtenida a partir de A/duck/Czech/56 encima de un dominio del tallo H3 obtenido a partir de A/Perth/16/09) (Margine et al., 2013. J Virol 87:10435-10446) mediante electroporación intramuscular con un dispositivo de electroporación TriGrid (Ichor Medical Systems) (Fig. 43A). Cabe señalar que la vacunación con ADN no es esencial para la inducción de una protección amplia mediante los regímenes de vacunación con cHA. La vacunación solo con proteínas (sin ADN) arrojaba resultados comparables a la vacunación con sensibilización con ADN en estudios anteriores (Goff et al., 2013. PLoS One 8:e79194). Tres semanas después de la sensibilización, los animales recibieron una proteína cH5/3 recombinante (cabeza H5 obtenida a partir de A/Vietnam/1203/04 encima de un tallo H3 obtenido a partir de A/Perth/16/09) (Margine et al., 2013. J Virol 87:10435-10446). Los animales de un grupo recibieron 5 pg de proteína cH5/3 por vía intranasal (i.n.) y 5 pg por vía intramuscular (i.m.) con 5 pg de adyuvante PIC (de peso molecular elevado, Invivogen) ('PIC i.n.+i.m.'). Un segundo grupo solo recibió la dosis i.m. con PIC (5 pg de HA en total) ('PIC i.m.'), mientras que un tercer grupo recibió 5 ug de proteína cH5/3 con un adyuvante genérico basado en OIW ('OIW i.m.') (Fig.43A). Todos los ratones fueron reforzados por segunda vez tres semanas más tarde con proteína H3 de longitud completa usando las mismas vías de vacunación, adyuvantes y cantidades de inmunógeno, respectivamente (Fig. 43A). Todas las proteínas recombinantes utilizadas para la vacu­ nación se expresaban en el sistema de expresión de baculovirus con un dominio de trimerización de foldon T4 C-terminal y un marcador de hexahistidina para facilitar la purificación (Krammer et al., 2012. PLoS One 7:e43603). El adyuvante OIW (citrato 20 mM, polisorbato 80 al 0,5%, pH 6,5, span-85 al 0,5% (trioleato de sorbitán), escualeno al 4,3%) se preparó como se ha descrito anteriormente (Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p.
211 -228. In O'Hagan DT (compilador), Vaccine Adjuvants, vol.42. Springer) (Figura 44). Los controles positivos (círcu­ los, n=5) recibieron una vacunación i.m. de preparación de virus completo A/Shanghai/1/13 H7N9 inactivado con formalina (SH1, reagrupado 6:2 con HA y NA obtenidas a partir de A/Shanghai/1/13 y los genes internos de A/Puerto Rico/8/34). Los controles negativos (triángulos, n=4-5) recibieron una vacunación de ADN simulada seguida de dos refuerzos con albúmina de suero bovino (BSA) administrados en las mismas cantidades y vías con los regímenes de vacunación con cHA respectivos, con los que se compararon. Cuatro semanas después de la última inmunización, se extrajo sangre de los animales y luego se expusieron a 10 dosis letales 50 murinas (mDL50) del virus SH1. La pérdida de peso se controló durante un período de 14 días y los ratones que perdieron más del 20 por ciento de su peso corporal inicial fueron sacrificados. Los animales en el grupo PIC i.n.+i.m. perdían un promedio del 10% de su peso corporal inicial (Fig.43B) en comparación con el 15% en el grupo PIC i.m. (Fig.43C), lo que sugiere que la inmunidad de la mucosa en el sitio de la infección tiene un papel importante en la protección. Además, los ratones en el grupo OIW i.m. perdían solo el 12% de su peso corporal inicial como promedio (Fig. 43D), lo que también se refleja en la supervivencia observada. Todos los animales vacunados PIC i.m.+i.n. sobrevivieron a la exposición (Fig. 43E), en comparación con solo el 70% de los animales PIC i.m. (Fig.43F). Sin embargo, la supervivencia en el grupo OIW i.m. era del 100% (Fig.43F), lo que indica un mejor efecto protector con el adyuvante OIW. Para evaluar cuantitativamente los títulos de anticuerpos de HA H7 producidos por los tres regímenes de vacunación diferentes, se realizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISAs) usando una HA H7 de SH1 recombinante como sustrato. Dado que los animales vacunados con cHA no se expusieron a un dominio de la cabeza H7, se planteó la hipótesis de que cualquier reactividad observada frente a H7 se habría obtenido predominantemente por anticuerpos anti-tallo con reactividad cruzada. Para excluir la unión al marcador de hexahistidina o al dominio de trimerización, se utilizó una HA H7 de SH1 recombinante expresada con un dominio de trimerización de cremallera de leucina GCN pII y un marcador strep II (Krammer et al., 2013. J Virol 87:6542-6550; Weldon et al., 2010. PLoS One 5). Los títulos de punto final más altos se detectaron en suero recogido de los animales vacunados PIC i.n.+i.m., seguido por los animales OIW i.m. (Fig.45A). Los ratones que recibieron la vacuna PIC i.m. tenían títulos más bajos estadísticamente significativos (p = 0,03) que los animales OIW i.m. Esta diferencia en los títulos de punto final se correlaciona con las diferencias en la pérdida de peso y la supervivencia. La distribución de los isotipos de anticuerpos puede verse fuertemente influenciada por los adyuvantes y puede tener un gran impacto sobre la eficacia protectora de los anticuerpos. Sin embargo, no había diferencias significativas en el perfil de isotipos cuando se compararon los tres regímenes de vacunación (Fig. 45B). Esto sugiere que, en el caso de solo una vacunación i.m., el título de anticuerpos era el principal asociado con la protección. Los sueros de los grupos de vacuna y de control también se analizaron en un ensayo de microneutralización, pero los resultados de los grupos de vacuna con cHA eran negativos, probablemente debido al límite de detección (1:20) de este ensayo (datos no mostrados). Se plantea la hipótesis de que los anticuerpos IgA de la mucosa inducidos por la vacunación i.n. tenían una contribución sustancial a la protección, ya que los animales inmunizados por ambas vías presentaban menor morbilidad que los animales vacunados únicamente por vía intramuscular. Dife­ rencias en la pérdida de peso entre el grupo PIC i.n.+i.m. y PIC i.m. eran estadísticamente significativas el día 7 (p=0,0383) y el día 8 (0,0136) (prueba t no pareada). Sin embargo, cabe señalar que esos animales también recibieron el doble de antígeno que los animales con solo i.m.
En conclusión, este ejemplo demuestra que los ratones pueden protegerse contra el nuevo virus H7N9 usando un régimen de inmunización basado en el tallo con estructuras artificiales de cHA que no poseen un dominio de la cabeza H7. Además, un adyuvante a base de aceite en agua similar a los autorizados para uso en humanos (Ott et al., 2000. The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective, p. 211-228. In O'Hagan DT (compilador), Vaccine Adjuvants, vol. 42. Springer; O'Hagan et al., 2013. Expert Rev Vaccines 12:13-30) se presentaba bien con las vacunas candidatas cHA, lo que sugiere que esa combinación también podría considerarse para pruebas en humanos. Una vacuna basada en el tallo de HA que proporciona protección universal contra el virus de la gripe podría reemplazar las vacunas estacio­ nales específicas de una cepa y mejorar adicionalmente la capacidad de preparación contra posibles cepas del virus de la gripe pandémico como H7N9.

Claims (24)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende el dominio del tallo de la HA del virus de la gripe A/California/4/2009 (H1N1) y el dominio de la cabeza globular de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5).
2. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según la reivindicación 1, en donde el dominio del tallo de la HA conserva los residuos de cisteína Ap y Aq, en donde Ap es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3, y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido
277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3.
3. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según la reivindicación 1 o 2, en donde
(a) el dominio del tallo de HA comprende (i) un segmento del tallo N-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos HA1N-term hasta Ap ; (ii) un segmento del tallo C-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos Aq hasta HA1 C-term; y (iii) un dominio del tallo de HA2; y
(b) el dominio de la cabeza globular de HA comprende los residuos de aminoácidos entre Ap y Aq de un dominio HA1;
en donde HA1N-term es el aminoácido N-terminal de una proteína HA0 madura que carece de un péptido señal;
en donde HA1C-term es el aminoácido C-terminal de un dominio HA1; y en donde Ap es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3.
4. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según la reivindicación 1, en donde
(a) el dominio del tallo de HA comprende (i) un segmento del tallo N-terminal de HA1, en donde el segmento del tallo N-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos HA1N-term hasta Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4, Ap-5, Ap-6,
Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-10, Ap, Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7, Ap+8, Ap+9 o Ap+10; terminal de HA1, en donde el segmento del tallo C-terminal de HA1 consiste en los residuos de aminoácidos Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10, Aq , Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9 o Aq+10 hasta
HA1 C-term; y (iii) un dominio del tallo de HA2; y
(b) el dominio de la cabeza globular de HA comprende los residuos de aminoácidos entre (i) Ap-1, Ap-2, Ap-3, Ap-4,
Ap-5, Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-10, Ap, Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7, Ap+8, Ap+9 o Ap+10, y (ii) Aq-1, Aq-2, Aq-3, Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8, Aq-9, Aq-10, Aq, Aq+1, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+8, Aq+9 o Aq+10 de un dominio HA1 ;
en donde HA1 N-term es el aminoácido N-terminal de una proteína HA0 madura que carece de un péptido señal;
en donde HA1C-term es el aminoácido C-terminal de un dominio HA1; en donde Ap es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 52 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y en donde Aq es la Cys que corresponde a la posición del aminoácido 277 de un dominio HA1 utilizando la numeración H3; y
en donde el polipéptido HA es capaz de formar una estructura tridimensional similar a una hemaglutinina del virus de la gripe de tipo silvestre.
5. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido es soluble o está unido a la membrana.
6. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según la reivindicación 5, en donde
(a) el polipéptido comprende un dominio de trimerización; o
(b) el polipéptido no comprende un dominio transmembranal o un endodominio de una HA del virus de la gripe, y en donde, opcionalmente, el polipéptido comprende además (i) un sitio de escisión de trombina y un dominio de trimerización de T4; y/o
(ii) un marcador HIS.
7. El polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se expresa y se aísla a partir de una célula, en donde, opcionalmente, la célula es una célula de mamífero.
8. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe según una cual­ quiera de las reivindicaciones 1 a 6.
9. Una célula que expresa el ácido nucleico según la reivindicación 8, en donde, opcionalmente, la célula es una célula Crucell Per.C6, célula Vero, célula CHO, célula VERY, célula BHK, célula HeLa, célula COS, célula MDCK, célula 293, célula 3T3, célula WI38, célula NS0, célula 45.6 TG1.7, célula 9B5 clon AF-2, célula 9B5 clon AF-2, célula J558L, célula MOPC 315, célula MPC-11, célula NCI-H929, célula NP, célula NS0/1, célula P3 NS1 Ag4, célula P3/NS1/1-Ag4-1, célula P3U1, célula P3X63Ag8, célula P3X63Ag8.653, célula P3X63Ag8U.1, célula RPMI 8226, célula Sp20-Ag14, célula U266B1, célula X63AG8.653, célula Y3.Ag.1.2.3, célula YO, célula Sf9, célula Sf21, célula Ao/Tn 38, célula High Five, célula T richoplusia ni, célula Spodoptera frugiperda o célula Bombyx mori.
10. Un virus que comprende:
(a) un genoma modificado genéticamente para expresar el ácido nucleico según la reivindicación 8; o
(b) el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. El virus según la reivindicación 10, en donde el virus es:
(i) un virus de la gripe, opcionalmente un virus de la gripe A; o
(ii) virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), adenovirus o baculovirus.
12. El virus según la reivindicación 10 u 11, que está:
(i) vivo atenuado; o
(ii) inactivado o fraccionado.
13. Una partícula similar a un virus que comprende el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cual­ quiera de las reivindicaciones 1 a 6.
14. Una línea celular o un huevo embrionado que comprende el virus según la reivindicación 10.
15. Una composición inmunogénica que comprende un polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cual­ quiera de las reivindicaciones 1 a 6, un virus según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 o una partícula similar a un virus según la reivindicación 13.
16. La composición inmunogénica según la reivindicación 15, que comprende además un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe, un segundo virus que comprende un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe o un segundo virus que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe o una segunda partícula similar a un virus que comprende un segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe, en donde el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe y un segundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe, en donde el segundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe es heterólogo frente al segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe.
17. La composición inmunogénica según la reivindicación 16, en donde:
A, el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe que es de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la hA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5);
B, el segundo polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8), A/Perth/16/2009 (H3N2) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la ca­ beza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Netherlands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (H7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/mallard/Alberta/24/2001 (H7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7);
C, el segundo virus que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un segundo ácido nu­ cleico que codifica un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indo­ nesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5);
D, el segundo virus que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un segundo ácido nu­ cleico que codifica un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un segundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA A/Netherlands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (H7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/mallard/Alberta/24/2001 (H7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7);
E, el segundo virus que comprende un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un se­ gundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5) o A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5); o
F, el segundo virus que comprende un segundo polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe que comprende (a) un segundo dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/harbor seal/Massachusetts/1/2011 (H3N8) o A/Indiana/10/2011 (H3N2); y (b) un se­ gundo dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Nether-lands/219/03 (H7), A/Canada/504/04 (H7), A/Canada/444/04 (h7), A/chicken/Jalisco/CPA1/2012 (H7), A/ma­ llard/Alberta/24/2001 (H7), A/rhea/NC/39482/93 (H7) o A/mallard/Netherlands/12/2000 (H7).
18. La composición inmunogénica según la reivindicación 17,
(a) en donde, con respecto a la reivindicación 17A o 17B, comprende además un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA de la gripe virus B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Brisbane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99;
(b) en donde, con respecto a la reivindicación 17C o 17D, comprende además un tercer virus que comprende un genoma modificado genéticamente para expresar un tercer ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Brisbane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99; o
(c) en donde, con respecto a la reivindicación 17E o 17F, comprende además un tercer virus que comprende un tercer polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe, en donde el tercer polipéptido HA qui­ mérico del virus de la gripe comprende (a) un tercer dominio del tallo de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe B/Malaysia/2506/2004, B/Florida/4/2006, B/Wisconsin/1/2010; o B/Brisbane/60/2008; y (b) un tercer dominio de la cabeza globular de HA del virus de la gripe de la HA del virus de la gripe A/Vietnam/1203/2004 (H5), A/Indonesia/5/2005 (H5), A/Anhui/1/2005 (H5), A/bar headed goose/Quinghai/1A/2005 (H5), A/turkey/Turkey/1/2005 (H5), A/whooperswan/Mongolia/244/2005 (H5), B/Lee/1940 o B/Seal/Netherlands/1/99.
19. La composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que comprende además un adyuvante, en donde, opcionalmente, el adyuvante es una sal de aluminio, monofosforil lípido A 3 De-O-acilado, MF59, AS03, AS04, polisorbato 80, un compuesto de imidazopiridina, un compuesto de imidazoquinoxalina, Matrix-M, MVA, ISCOMATRIX, AddaVax, poliI:C, horquilla de ARN transcrita in vitro procedente de un ARN de interferencia defectuoso de la cepa Cantell del virus Sendai, una saponina, adyuvante de Freund, una emulsión de aceite en agua, CpG, un adyuvante físico o una molécula estimuladora del receptor de tipo Toll.
20. La composición inmunogénica según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, para uso en un método para inmunizar a un sujeto contra el virus de la gripe, prevenir una enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto o tratar una infección o enfermedad por el virus de la gripe en un sujeto, y en donde, opcionalmente, la composición inmuno­ génica es para administración intramuscular o intranasal al sujeto.
21. La composición inmunogénica para uso según la reivindicación 20, en donde el método es para inmunizar al sujeto contra el virus de la gripe y en donde el método comprende:
(a) administrar al sujeto una primera dosis de la composición inmunogénica;
(b) administrar al sujeto una segunda dosis de la composición inmunogénica 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la primera dosis; y, opcionalmente,
(c) administrar al sujeto una tercera dosis de la composición inmunogénica 30 días a 6 meses después de que el sujeto haya recibido la segunda dosis,
en donde el dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe presente en la primera dosis es diferente al dominio de la cabeza globular del polipéptido de hemaglutinina (HA) quimérico del virus de la gripe presente en la segunda y/o la tercera dosis.
22. La composición inmunogénica para uso según la reivindicación 20 o 21, en la que el sujeto es un ser humano.
23. La composición inmunogénica para uso según la reivindicación 22, en donde el sujeto humano es un lactante humano, un sujeto humano de 1 -5 años de edad o un sujeto humano de edad avanzada, en donde el lactante humano es un ser humano desde recién nacido hasta 1 año de edad.
24. Un método para producir el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe según una cualquiera de las reivindica­ ciones 1 a 6, o el virus según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde
(I) el método para producir el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe comprende (a) cultivar la célula según la reivindicación 9; y (b) aislar el polipéptido HA quimérico del virus de la gripe; o
(II) el método para producir el virus comprende (a) multiplicar el virus según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 (i) en un huevo embrionado o una célula; y (b) aislar el virus desde el huevo embrionado o la célula.
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