KR20060035596A - 외래유전자도입 식물로부터 유래된 면역보호성 조성물을제조하기 위한 벡터와 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백신 제조에 유용한 면역보호성 입자를 생산하는데 이용되는 병원성 생물체로부터 면역원을 발현하는 유전적으로 형질전환된 식물 세포를 제조하기 위한 벡터와 방법에 관한다. 본 발명에는 뉴캐슬병 바이러스의 HN 단백질을 인코딩하는 식물 최적화된 유전자가 포함된다. 또한, 본 발명은 외래유전자도입 식물에서 항원을 생산하는 방법에 관한다.

외래유전자도입 식물

Description

외래유전자도입 식물로부터 유래된 면역보호성 조성물을 제조하기 위한 벡터와 세포{VECTORS AND CELLS FOR PREPARING IMMUNOPROTECTIVE COMPOSITIONS DERIVED FROM TRANSGENIC PLANTS}

본원은 2003년 5월 5일자로 제출된 U.S. 가출원 No. 60/467,998에 우선권을 주장한다. 상기 출원의 전체 내용은 순전히 참조로 한다.

본 발명은 전반적으로, 식물 분자 생물학 분야에 관하고, 식물-기초한 백신의 재조합 생산에 적용된다.

재조합 DNA 기술은 백신을 비롯한 제약학적 약물과 수의학적 약물의 안정성, 품질, 효능, 비용에서 실질적인 향상을 제공하고 있다. 식물 생산된 점막 백신은 Curtiss와 Cardineau에 의해 발명되었다(참조: US 특허 5,654,184; 5,679,880; 5,686,079). Arntzen, Mason, Lam을 비롯한 여러 저자에 의해 면역보호성 항원을 발현하는 외래유전자도입 식물 및 생산 방법이 보고되었다(참조: US 특허 5,484,717; 5,914,123; 6,034,298; 6,136,320; 6,194,560; 6,395,964).

식물 시스템에서 생산된 백신은 전통적인 생산 시스템에 비하여 여러 이점을 제공한다. 전통적으로 생산된 백신 균주(활동 또는 벡터)는 독력을 복구하거나 생산 공정으로부터 생물학적 오염물질을 운반할 수 있다. 아단위 백신은 단백질 불안 정성 문제로 인하여 생산과 정제가 어렵고, 원핵생물에서 생산되는 경우에 당화되지 않는다.

식물 세포 생산은 성장 배지에서 동물-근원된 성분을 필요로 하지 않기 때문에, 생물 공정으로부터 병원성 오염물질을 전달하는 위험이 본질적으로 제거된다. 식물 세포는 번역후 당화가 가능하고, 식물 세포 성장 배지는 백신의 제조에 통상적으로 이용되는 전통적인 성장 배지에 비하여 가격이 저렴하고 취급과 제조가 용이하다.

특정 병원균에 대한 전신 면역은 특정 병원성 생물체에 의해 제공된 항원에 반응하거나, 또는 특정 병원균에 대항하도록 설계된 백신을 통하여 면역계로부터 활성화에 기인한다. 병원균에 대한 노출은 병원성 생물체에 의해 지속적으로 노출되고 공격받는 점막 표면을 통하여 주로 수행된다.

점막과 경구 면역은 기도, 위장관, 비뇨생식기로의 모든 점막 표면을 감싸는 분비물 및 모든 분비 샘으로부터 분비물에서 sIgA(분비 IgA)의 생산으로부터 기인한다(McGhee, J. R. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 409,(1983)). 이들 sIgA 항체는 점막 표면에서 병원균의 집락형성을 예방하고(Williams, R. C. et al., Science 177, 697(1972); McNabb, P. C. et al., Ann. Rev. Microbiol. 35, 477(1981), 따라서 점막 표면을 통한 집락형성 또는 침입을 예방하는 제 1 방어선으로서 기능한다. sIgA의 생산은 분비 샘이나 조직의 국소 면역화에 의해, 또는 GALT(gut-associated lymphoid tissue 또는 Peyer's patches) 또는 BALT(bronchial associated lymphoid tissue)에 항원의 제시에 의해 자극될 수 있다(Cebra, J. J. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 41, 210(1976); Bienenstock, J. M., Adv. Exp. Med. Biol. 107, 53(1978); Weisz-Carrington, P. Et al., J. Immunol 123, 1705(1979); McCaughan, G. et al., Internal Rev. Physiol 28, 131(1983)). M(membranous microfold) 세포는 GALT와 BALT의 표면을 덮고, 다른 분비 점막 표면과 결합된다. M 세포는 점막 표면에 인접한 움푹 파인 공간(luminal space)으로부터 항원을 추출하고 이들 항원을 항원-제시 세포(수상돌기 세포와 대식세포)에 전달하며, 항원-제시 세포는 항원을 T 림프구(T-의존성 항원의 경우)에 제시하고, T 림프구는 수임된 B 세포에 제시를 위하여 항원을 가공한다. 이후, 자극된 B 세포는 증식하고 이동하며, 궁극적으로 제시된 항원에 대한 IgA를 생산하는 항체-분비 혈장 세포로 전환된다. 항원이 GALT와 BALT 위에 존재하는 M 세포에 흡입되면, 신체에서 모든 분비 조직에 의해 생성되는 항원에 대한 sIgA에 의해 전신성 점막 면역이 유도된다(Cebra et al., supra; Bienenstock et al., supra; Weinz-Carrington et al., supra; McCaughan et al., supra). 이런 이유로, 경구 면역은 전신성 점막 면역 반응을 자극하는데 가장 중요한 경로이며, 구강과 위장관에서 분비 면역 반응의 국소 자극을 유도한다.

점막 면역은 후대에도 전달될 수 있다. 신생아에서 면역은 초유 또는 모유를 통하여 수동적으로 획득된다. 이는 유즙면역(lactogenic immunity)이라 하며, 유년기 동물을 보호하는데 효과적인 방법이다. sIgA는 모유에서 주요 면역글로불린이며, 점막 면역에 의해 가장 효과적으로 유도된다.

장-결합된 림프 조직의 접합림프소절(Peyer's patch) 위에 존재하는 M 세포 는 다양한 항원성 물질과 입자를 흡입할 수 있다(Sneller, M. C. and Strober, W., J. Inf. Dis. 154, 737(1986)). 라텍스와 폴리스티렌 구체, 목탄, 마이크로캡슐 및 다른 가용성 미립자 물질을 흡입하는 능력으로 인하여, 이들 세포는 전달되는 물질의 임의의 특이적인 접착 특성과 상관없이, 다양한 물질을 GALT에 전달할 수 있다.

외래유전자도입 식물-유래된 면역보호성 항원을 생산하는데 유용한 벡터와 세포 및 개선된 항원 생산 방법은 유효한 식물-기초한 백신의 개발과 제조를 증진한다.

본 발명의 요약

본 발명은 목적하는 면역보호성 항원을 인코딩하는 식물 최적화된 서열에 기초한다. 특히, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원을 인코딩하는 식물 최적화된 DNA 서열, 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원을 인코딩하는 DNA 서열에 기초한다. 또한, 본 발명은 식물 세포에서 면역보호성 항원 유전자의 발현을 유도하는 재조합 발현 벡터; 상기 발현 벡터를 포함하는 식물 세포와 외래유전자도입 식물; 상기 발현 벡터의 단백질 산물을 함유하는 백신에 관한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 백신을 이용하여 병원균의 효과를 저해하는 방법에 관한다. 더 나아가, 본 발명은 외래유전자도입 식물에서 항원을 생산하는 방법에 관한다.

본 발명은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하고 뉴캐슬병(newcastle disease) 바이러스의 HN 항원을 인코딩하는 분리된 식물 최적화된 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 1을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제시한다.

한 구체예에서, 벡터는 pCHN, pGHN, pGHN151, pGHN153, pMHN, pUHN에서 선택 된다.

다른 구체예에서, 벡터는 SEQ ID NO:1에 작동가능하게 결합된 식물-기능성 프로모터를 포함한다.

또한, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하고 식물 세포에서 면역보호성 항원을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제시하는데, 상기 벡터는 pCHA이다.

더 나아가, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 면역원성 항원의 발현을 위한 외래유전자도입 식물 세포를 제시한다. 상기 식물 세포는 감자 식물 세포 또는 토마토 식물 세포 및 아래에 기술된 다른 식물 종으로부터 유래된 세포이다.

더 나아가, 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 외래유전자도입 식물을 제시한다.

또한, 본 발명은 재조합 바이러스 항원성 단백질과 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 백신을 제시하는데, 상기 바이러스 항원성 단백질은 본 발명의 벡터에 의해 생산된 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원이고, 상기 백신은 동물에 투여이후 면역 반응을 유도할 수 있다.

한 구체예에서, 상기 백신의 HN 단백질은 SEQ ID NO:2를 포함한다. 상기 백신의 HN 단백질은 식물 세포에서 생산될 수 있다.

또한, 본 발명은 재조합 바이러스 항원성 단백질과 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 백신을 제시하는데, 상기 바이러스 항원성 단백질은 본 발명의 벡터에 의해 생산된 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원이고, 상기 백신은 동물에 투여이후 면역 반응을 유도할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 백신의 HA 단백질은 식물 세포에서 생산될 수 있다.

또한, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 또는 조류 인플루엔자 바이러스로부터 동물을 보호하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 본 발명에 따른 적절한 백신의 효과량을 동물에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 한 구체예에서, 백신은 경구, 비강내, 복강내, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여된다. 상기 방법의 한 구체예에서, 백신의 효과량은 체중 ㎏당 1 ㎍ 내지 50 ㎍이다.

또한, 본 발명은 외래유전자도입 식물에서 항원을 생산하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:

a) 상기 항원을 인코딩하는 벡터를 포함하는 외래유전자도입 식물을 생산하고; b) 상기 식물이 상기 항원을 발현하는 조건하에 식물을 배양하고; 여기서, 상기 식물은 성숙 개시에 앞서 배양된다.

한 구체예에서, 식물은 성숙하는 열매를 포함한다.

다른 구체예에서, 식물은 토마토 식물이다.

다른 구체예에서, 식물의 열매는 성숙 개시에 앞서 수확된다. 상기 방법의 한 구체예에서, 항원은 수확된 열매로부터 분리된다.

다른 구체예에서, 항원은 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원, 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원, LTB, NVCP, 투명대(zone pellucida) 당단백질, HBsAg에서 선택된다.

도 1a와 1b. NDV 균주 “Lasota”의 HN 유전자의 식물 최적화된 코딩 서열(SEQ ID NO: 1)과 단백질 서열(SEQ ID NO: 2)

도 2. 식물 선별가능 마커 PAT(phosphinothricin acetyl transferase), 구조성 CsVMV(cassava vein mosaic virus) 프로모터를 보유하고 MAS3'(mannopine synthase) 요소로 종결되는 pBBV-PHAS-iaaH의 유전자 지도. 아그로박테리움(Agrobacterium)으로부터 LB와 RB(좌측과 우측 T-DNA 경계) 요소는 식물 게놈에 통합되는 DNA의 경계를 이룬다.

도 3. 면역보호성 항원을 발현하기 위한 다양한 식물 발현 벡터의 출발 플라스미드로 이용되는 “주형 벡터”인 pCP!H의 유전자 지도.

도 4. NDV HN 단백질에 대한 pCHN 발현 벡터의 유전자 지도. HN 발현 카세트를 포함하는 상기 벡터는 구조성 CsVMV 프로모터를 보유하고 콩 vspB 3' 요소로 종결된다.

도 5. NDV HN 단백질에 대한 pgHN 발현 벡터의 유전자 지도. HN 발현 카세트를 포함하는 상기 벡터는 TEV 5' UTR이 존재하는 덩이줄기-특이적 GBSS 프로모터를 보유하고, 콩 vspB 3' 요소로 종결된다.

도 6. NDV HN 단백질에 대한 pgHN151 발현 벡터의 유전자 지도. 상기 HN 발현 벡터 또는 카세트는 고유 5' UTR과 인트론이 존재하는 덩이줄기-특이적 GBSS 프로모터를 보유하고, 콩 vspB 3' 요소로 종결된다. 상기 벡터는 식물 선별가능 마커 PAT, CsVMV 프로모터를 보유하고 MAS3' 요소로 종결되는 pBBV-PHAS-iaaH로부터 유래된다. LB와 RB(좌측과 우측 T-DNA 경계) 요소는 식물 게놈에 통합되는 DNA의 경 계를 이룬다.

도 7. NDV HN 단백질에 대한 pgHN153 발현 벡터의 유전자 지도. 상기 HN 발현 벡터는 고유 5' UTR과 인트론이 존재하는 덩이줄기-특이적 GBSS 프로모터를 보유하고, 콩 파세올린 3' 요소로 종결된다. 상기 벡터는 식물 선별가능 마커 PAT, CsVMV 프로모터를 보유하고 MAS3' 요소로 종결되는 pBBV-PHAS-iaaH로부터 유래된다. LB와 RB(좌측과 우측 T-DNA 경계) 요소는 식물 게놈에 통합되는 DNA의 경계를 이룬다.

도 8. NDV HN 단백질에 대한 pMHN 발현 벡터의 유전자 지도. 상기 HN 발현 벡터는 구조성 4OCS△MAS 프로모터(P2 방향)를 보유하고, 콩 vspB 3' 요소로 종결된다. 상기 벡터는 식물 선별가능 마커 PAT, CsVMV 프로모터를 보유하고 MAS3' 요소로 종결되는 pBBV-PHAS-iaaH로부터 유래된다. LB와 RB(좌측과 우측 T-DNA 경계) 요소는 식물 게놈에 통합되는 DNA의 경계를 이룬다.

도 9. AIV A / turkey / Wisconsin / 68(H5N9)의 HA 유전자에 대한 pCHA 발현 벡터의 유전자 지도.

도 10. AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)의 HA 유전자의 DNA(SEQ ID NO: 3)와 단백질(SEQ ID NO: 4) 서열.

도 11. pGLTB 중간 벡터의 유전자 지도.

도 12. pCLT105 중간 벡터의 유전자 지도.

도 13. pGPTV-HAO 또는 pCHA를 이용한 외래유전자도입 NT1 세포에서 HA 발현.

도 14. pCHA-형질전환된 NT1 세포주의 반복 분석.

도 15. pCHA-형질전환된 NT1 세포주에서 AIV HA 발현에 대한 웨스턴 블랏.

도 16. pCHA-형질전환된 감자 식물의 미세덩이줄기에서 HA 발현.

도 17. pCHA-형질전환된 감자 식물의 잎에서 HA 발현.

도 18. 토양-성장된 pCHA-형질전환된 감자 식물의 덩이줄기에서 HA 발현.

도 19. pCHN으로 형질전환된 NT1 세포에서 NDV-HN의 발현.

도 20. pCHN-형질전환된 NT1 세포주에서 세포 중량당 HN의 발현.

도 21. pCHN-형질전환된 NT1 세포주에서 HN 발현의 안정성.

도 22. HN-특이적 항체를 이용한 pCHN-형질전환된 NT1 세포의 웨스턴 블랏.

도 23. HN 항원은 냉동-건조된 pCHN-형질전환된 NT1 세포 추출물에 유지시키고 4℃에 보관한다.

도 24. HN 항원의 수크로오스 구배 분석은 미립자 특성을 입증한다.

도 25. pMHN-과 pCHN-형질전환된 NT1 세포주에서 HN의 발현.

도 26. pCHN-형질전환된 감자에서 HN 발현.

도 27. pCHN-형질전환된 감자 덩이줄기로부터 추출된 HN 항원의 입자 행동.

도 28. pGHN-형질전환된 감자 식물의 미세덩이줄기에서 HN 발현.

도 29. pGHN-과 pGHN151-형질전환된 감자 식물의 덩이줄기에서 HN의 발현.

도 30. 구조체 pCHN으로부터 T-DNA 영역.

도 31. 야생형 TA234 토마토 열매 pH에 대한 성숙의 효과.

도 32. 야생형 TA234 토마토 열매 전체 가용성 단백질에 대한 성숙의 효과.

도 33. T₀ CHN 토마토 세포주의 서던 분석.

도 34. 야생형과 외래유전자도입 토마토 열매로부터 전체 RNA.

도 35. 성숙하는 CHN 토마토 열매에서 HN 농도의 ELISA 분석.

도 36. 야생형과 외래유전자도입 토마토 열매와 잎 및 NT1 세포 추출물로부터 가공되지 않은 단백질 추출물의 웨스턴 분석.

도 37. CHN 토마토의 열매와 잎에서 혈구응집(haemagglutination) 활성.

도 38. 성숙하는 열매 직경에서 변화. “주(Week)”는 수분(pollination)이후 기간을 표시한다. 반점은 3회 측정의 평균을 표시하고, 막대는 평균의 표준 오차를 표시한다.

도 39. 성숙하는 토마토 열매의 열매 중량에서 변화. “주(Week)”는 수분이후 기간을 표시한다. 각 반점은 3회 측정의 평균을 표시하고, 막대는 평균의 표준 오차를 표시한다.

도 40. 냉동 건조이후 성숙하는 토마토 열매로부터 수분 손실. “주(Week)”는 수분이후 기간을 표시한다. 반점은 3회 측정의 평균을 표시하고, 막대는 평균의 표준 오차를 표시한다.

도 41. 새로운 토마토 열매 g당 HN의 농도. “주(Week)”는 수분이후 기간을 표시한다. 막대는 3가지 샘플의 평균을 표시한다. 동일 문자로 표지된 막대는 유의한 차이가 존재하지 않는다(α=0.05). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 표시한다.

도 42. 성숙하는 토마토 열매에서 HN의 양. “주(Week)”는 수분이후 기간을 표시한다. 막대는 중량으로 곱해진 3가지 중복 HN 함량의 평균을 표시한다. 동일 문자로 표지된 막대는 유의한 차이가 존재하지 않는다(α=0.05). 오차 막대는 평균의 표준 오차를 표시한다.

도 43. CHN-18 마스터 시드(master seed)에서 조절된 생물제(pCHN) 삽입체.

도 44. CHN-18 마스터 시드에서 전체 유전자 삽입체의 DNA 서열(SEQ ID NO: 12).

도 45. pCHA 벡터 서열(SEQ ID NO: 24).

도 46. pMHN 벡터 서열(SEQ ID NO: 25).

도 47. pCHN 벡터 서열(SEQ ID NO: 26).

도 48. pUHN의 구성.

서열의 요약

도 1에 도시된 SEQ ID NO: 1과 2는 NDV 균주 “Lasota”의 HN 유전자의 식물 최적화된 코딩 서열과 단백질 서열이다.

도 10에 도시된 SEQ ID NO: 3과 4는 AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)의 HA 유전자의 DNA와 단백질 서열이다.

SEQ ID NO: 5는 pCP!H에서 CsVMV 프로모터를 말단-맞춤하는데 이용되는 PCR 프라이머이다.

SEQ ID NO: 6은 pCP!H에서 CsVMV 프로모터를 말단-맞춤하는데 이용되는 PCR 프라이머이다.

SEQ ID NO: 7은 Nco I 부위를 만드는데 이용되는 돌연변이성 프라이머이다.

SEQ ID NO: 8은 5' 영역에 상보적인 전방 프라이머이다.

SEQ ID NO: 9는 XhoI I 부위를 만드는데 이용되는 돌연변이성 프라이머이다.

SEQ ID NO: 10은 프라이머 HNa를 이용함으로써 만들어진 PCR 표지된 프로브이다.

SEQ ID NO: 11은 프라이머 HNb를 이용함으로써 만들어진 PCR 표지된 프로브이다.

SEQ ID NO: 12는 CHN-18 마스터 시드에서 전체 유전자 삽입체의 DNA 서열이다.

SEQ ID NO: 13은 B형 간염 바이러스 균주 Gly D 표면 항원, 완전 cds를 인코딩하는 DNA 서열이다(GenBank 수탁 AF134148).

SEQ ID NO: 14는 B형 간염 바이러스 균주 Gly D 표면 항원단백질 서열이다(GenBank 수탁 AAD31865).

SEQ ID NO: 15는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 투명대(zone pellucida) 당단백질 3(정자 수용체)(ZP3), mRNA를 인코딩하는 DNA 서열이다(GenBank 수탁 NM_007155).

SEQ ID NO: 16은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 투명대(zone pellucida) 당단백질 3 프리프로단백질(정자 수용체)(ZP3)의 단백질 서열이다(GenBank 수탁 NP_009086).

SEQ ID NO: 17은 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) mRNA, 완전 cds를 인코딩하는 DNA 서열이다(GenBank 수탁 U67783).

SEQ ID NO: 18은 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)의 단백질 서열이다(GenBank 수탁 AAC58999).

SEQ ID NO: 19는 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌-뉴우라미니다아제(HN), mRNA, 완전 cds를 인코딩하는 DNA 서열이다(GenBank 수탁 AY510092).

SEQ ID NO: 20은 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌-뉴우라미니다아제(HN)의 단백질 서열이다(GenBank 수탁 AAS10195).

SEQ ID NO: 21은 적색야계(Gallus gallus) 투명대(zone pellucida) 당단백질 3(정자 수용체)(ZP3), mRNA를 인코딩하는 DNA 서열이다(GenBank 수탁 NM_204389).

SEQ ID NO: 22는 적색야계(Gallus gallus) 투명대(zone pellucida) 당단백질 3(정자 수용체)(ZP3)의 단백질 서열이다(GenBank 수탁 NP_989720).

SEQ ID NO: 23은 오리 B형 간염 바이러스의 DNA 서열이다(GenBank 수탁 X58569).

SEQ ID NO: 24는 벡터 pCHA의 DNA 서열이다.

SEQ ID NO: 25는 벡터 pMHN의 DNA 서열이다.

SEQ ID NO: 26은 벡터 pCHN의 DNA 서열이다.

정의

본 명세서에서, “면역원 또는 면역보호성 항원”은 건강한 동물에서 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도하여 이런 면역원을 보유하는 병원균에 대한 추후 노출로부터 동물을 보호하는 비-자가 물질이다. 병원균은 전형적으로, 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물과 같은 병원체이다. 면역원은 세포 벽 성분과 바이러스 외피 단백질을 비롯한 병원균의 항원성 일부분일 수도 있다.

본 명세서에서, “면역보호성 입자”는 면역원을 발현하는 외래유전자도입 식물 세포로부터 유래되고, 동물에 적절하게 투여되는 경우에 이런 면역원을 보유하는 병원균에 대한 추후 노출로부터 보호를 제공하는 입자 또는 소포이다.

본 명세서에서, “예방접종”은 병원체, 또는 이의 비-독력 형태 또는 일부분의 면역원성 조제물을 숙주에 접종하여 숙주 면역계를 자극하고 상기 병원균의 추후 노출에 대한 후속적인 숙주 반응을 예방 또는 완화시킴으로써 병원균으로부터 보호를 제공하는 수단으로 정의된다.

본 명세서에서, “백신”은 적어도 한가지 면역보호성 항원성 물질을 포함하는 동물을 백신접종하는데 이용되는 조성물이다.

본 명세서에서, “병원성 생물체”는 감염된 동물에서 질환 또는 의학적 이상을 유발하는 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 원생동물이다.

본 명세서에서, “보조약”은 면역원 또는 항원에 대한 면역 반응을 강화, 증가 또는 향상시키는 물질이다. 본 명세서에서, 강화, 증가 또는 향상은 예로써, 보조약이 부재하는 경우에 비하여 보조약의 존재하에 투여된 항원에 반응하여 생산된 항체의 양에서 2-배 이상, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000-배 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 또한, 강화, 증가 또는 향상은 예로써, 보조약이 부재하는 경우에 비하여 보조약의 존재하에 투여된 항원에 반응하여 적어도 5% 이상, 예를 들면, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상의 항체 생산을 의미한다. 보조약은 전형적으로, 체액과 세포 면역 반응을 모두 강화시키지만 보조약을 정의하는 다른 특성이 부재하는 경우에 한쪽 반응을 증가시킨다. 더욱이, 보조약과 이들의 용도는 면역학자에게 널리 공지되어 있으며, 면역원의 용량이 제한되거나 면역원의 면역원성이 불량하거나, 또는 투여 경로가 최적이하인 경우에 면역 반응을 강화시키는데 주로 이용된다. 따라서, “보조 함량”은 일정한 면역원 또는 항원에 대한 면역 반응을 강화시킬 수 있는 보조약의 함량이다. 보조 함량에 상응하는 질량은 변하고, 면역원의 특성, 면역원의 투여량, 숙주 종, 투여 경로, 면역원의 투여 프로토콜을 비롯한 다양한 인자에 좌우된다. 보조 함량은 일정한 환경 조건에서 통상적인 실험으로 용이하게 정량될 수 있다. 이는 당업자의 이해 범위에 속하며, 가변적인 양으로 투여된 면역원과 보조약에 통상적인 용량 반응 결정이 이용된다. 반응은 효소 결합된 면역흡착 검사, 방사성 면역 검사, 혈구응집 검사 등을 이용하여, 면역원에 반응하여 생성된 혈청 항체 역가를 측정함으로써 결정된다.

본 명세서에서, “외래유전자도입 식물 세포”는 외래 유전자를 안정적으로 발현하는 식물 세포를 의미하는데, 여기서 외래 유전자는 식물 세포 크로모좀에 통합되고 바이러스에 독특한 바이러스 벡터 서열을 보유하지 않고, 상기 외래 유전자는 차기 세포 세대에 전달되고 숙주 식물 세포 크로모좀으로부터 발현될 수 있다. 이에 더하여, “외래유전자도입 식물 물질”은 널리 공지된 세포 배양 기술로 수득된 하나 또는 복수의 “외래유전자도입 식물 세포”를 함유하는 “외래유전자도입 세포 현탁액”에 관한다(Street, HE. 1973. Plant tissue and cell culture: botanical monographs. Vol II, University of California, Berkeley).

본 명세서에서, “외래유전자도입 식물”은 세포에서 “이질성” 외래 유전자가 안정적으로 발현되는 식물을 의미하는데, 여기서 외래 유전자는 식물 세포 크로모좀에 통합되고 바이러스에 독특한 바이러스 벡터 서열을 보유하지 않고, 상기 외래 유전자는 차기 식물 세대에 전달되고 숙주 식물 세포 크로모좀으로부터 발현될 수 있다. “외래유전자도입 식물”은 “복수의 외래유전자도입 식물 세포”를 포함한다. “외래유전자도입 식물”은 전체 식물, 뿌리, 줄기, 잎, 잎자루, 씨, 열매, 덩이줄기, 꽃, 꽃가루 등을 비롯한 이의 일부를 의미한다. 이질성 외래 유전자의 예는 놀윅(Norwalk) 바이러스 캡시드 단백질(NVCP), 조류 인플루엔자 혈구응집 항원(AIV-HA), 뉴캐슬병 바이러스 뉴우라미니다아제(NDV-HN), 투명대(zone pellucida) 당단백질 3(ZP3), B형 간염 표면 항원(HBsAg) 등이다.

본 명세서에서 외래유전자도입 식물은 식물 세포 배양액, 식물 세포주, 식물, 또는 형질전환된 식물 세포 또는 원형질체로부터 유래된 이의 후손으로 정의되는데, 여기서 형질전환된 식물의 게놈은 동종의 고유 비-외래유전자도입 식물 세포에 존재하지 않지만 실험실 기술로 도입된 외래 DNA를 보유한다. 당분야에서 “외래유전자도입 식물”과 “형질전환된 식물”은 DNA에 외인성 DNA 분자가 존재하는 식물을 정의하는 동의어로 빈번하게 이용된다.

본 명세서에서, “식용 식물”은 동물에 의해 소비되고 영양적 가치를 보유하며 비-독성인 식물을 의미한다. “식용 식물”은 인간 또는 다른 동물에 의해 섭취되는 식물, 또는 식물로부터 획득된 물질인 “식품”이다. “식품”에는 인간 또는 다른 동물에게 공급되는 식물 물질, 또는 인간 또는 다른 동물에게 공급되는 가공된 식물 물질이 포함된다. 식물로부터 획득된 물질에는 인간 또는 다른 동물에 의해 궁극적으로 섭취되는 식물 성분이 포함된다. “식용 식물”의 예는 토마토, 쌀, 밀, 옥수수, 당근, 감자, 사과, 콩, 알파파, 개자리속(medicago) 식물, 야채, 열매 또는 상기한 임의의 식용 식물 등이다.

일부 경우에, “식용 식물”은 “영양학적 가치를 위하여 섭취”될 수 있는데, 영양학적 가치는 대사가능 에너지원, 보조 또는 필수 비타민이나 보조-인자, 섬유소 함유 식품, 또는 동물에 의한 섭취에 대한 유익한 효과를 제공하는 식물 또는 이의 일부를 의미한다. 따라서, 본 발명의 방법으로 치료되는 동물이 셀룰로오스의 박테리아-보조된 섭취가 가능한 초식동물인 경우에, 이런 음식은 외래유전자도입 초목으로 대표된다. 다른 식용 식물에는 야채와 열매가 포함된다. 유사하게, 예로써 외래유전자도입 상추 식물이 에너지원; 빌딩 블록 분자, 예를 들면, 단백질, 탄수화물 또는 지방; 다른 필수 또는 보조 비타민이나 보조-인자에 실질적으로 기여하지는 않지만, 동물용 사료로서 본원에 기술된 핵산 분자에 대한 외래유전자도입 상추 식물은 이런 상추의 섭취가 동물에게 섬유소를 제공하고 유익하다면, 동물이 상추의 셀룰로오스 내용물을 소화할 수 없다 하더라도 본 명세서에서 식품의 정의에 속한다. 이런 이유로, “식용 식물”은 담배를 제외한다.

본 명세서에서, “면역 반응”은 외래 또는 자가 단백질을 비롯한 물질에 대한 생물체의 면역계에 의해 발생된 반응을 의미한다. 점막, 체액, 세포 “면역 반응”을 비롯한 3가지 유형의 “면역 반응”이 존재한다. “점막 면역 반응”은 기도, 위장관, 비뇨생식기로의 모든 점막 표면을 감싸는 분비물 및 모든 분비 샘으로부터 분비물에서 분비 IgA(sIgA)의 생산으로부터 기인한다(McGhee, J. R. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 409,(1983)). 이들 sIgA 항체는 점막 표면에서 병원균의 집락형성을 예방하고(Williams, R. C. et al., Science 177, 697(1972); McNabb, P. C. et al., Ann. Rev. Microbiol. 35, 477(1981), 따라서 점막 표면을 통한 집락형성 또는 침입을 예방하는 제 1 방어선으로서 기능한다. sIgA의 생산은 분비 샘이나 조직의 국소 면역화에 의해, 또는 장-결합된 림프 조직(GALT 또는 Peyer's patches) 또는 기관지-결합된 림프 조직(BALT)에 항원의 제시에 의해 자극될 수 있다(Cebra, J. J. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 41, 210(1976); Bienenstock, J. M., Adv. Exp. Med. Biol. 107, 53(1978); Weisz-Carrington, P. Et al., J. Immunol 123, 1705(1979); McCaughan, G. et al., Internal Rev. Physiol 28, 131(1983)). M(membranous microfold) 세포는 GALT와 BALT의 표면을 덮고, 다른 분비 점막 표면과 결합된다. M 세포는 점막 표면에 인접한 움푹 파인 공간(luminal space)으로부터 항원을 추출하고 이들 항원을 항원-제시 세포(수상돌기 세포와 대식세포)에 전달하며, 항원-제시 세포는 항원을 T 림프구(T-의존성 항원의 경우)에 제시하고, T 림프구는 수임된 B 세포에 제시를 위하여 항원을 가공한다. 이후, 자극된 B 세포는 증식하고 이동하며, 궁극적으로 제시된 항원에 대한 IgA를 생산하는 항체-분비 혈장 세포로 전환된다. 항원이 GALT와 BALT 위에 존재하는 M 세포에 흡입되면, 신체에서 모든 분비 조직에 의해 생성되는 항원에 대한 sIgA에 의해 전신성 점막 면역이 유도된다(Cebra et al., supra; Bienenstock et al., supra; Weinz-Carrington et al., supra; McCaughan et al., supra). 이런 이유로, 경구 면역은 전신성 점막 면역 반응을 자극하는데 가장 중요한 경로이며, 구강과 위장관에서 분비 면역 반응의 국소 자극을 유도한다.

“면역 반응”은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 결정할 수 있다. 가령, 혈청, 혈액 또는 다른 분비물을 “면역 반응”이 존재할 것으로 의심되고 미생물로부터 획득하고, 효소-결합된 면역-흡착법(ELISA)을 이용하여 상기한 면역글로불린의 존재를 검사한다(U.S. Pat. No. 5,951,988; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology 3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc. 1995). 본 발명에 따라, 본 발명의 단백질은 ELISA로 검출된 목적 단백질로 치료된 동물에서 면역글로불린의 정량적 수치가 통계학적으로 상이하면(가령, 생산된 항체의 양에서 2-배 이상, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000-배 또는 그 이상의 증가 또는 감소), “면역 반응”을 자극한다고 할 수 있다. 또한, 증가 또는 감소는 목적 단백질로 치료되지 않은 동물에서 검출된 면역글로불린 수치로부터 항체 생산에서 적어도 5% 이상, 예를 들면, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상의 증가, 또는 항체 생산에서 적어도 5% 또는 그 이상의 감소를 의미하는데, 여기서 상기 면역글로불린은 목적 단백질에 특이적이다. 측정된 면역글로불린 수준에서 차이를 결정하는데 유효한 당분야에서 공지된 통계학적 검증은 ANOVA, 스튜던트 t-검증 등인데, 여기서 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001, 또는 <0.0001이다.

“면역 반응”은 “면역 반응”동안 생성된 면역글로불린의 일부분에 특이적인 표지된 항체를 이용한 면역조직화학과 같은 다른 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 목적 단백질이 본 발명에 따라 투여된 동물로부터 조직(가령, 난소 조직)은 당분야에 공지된 기술을 이용한 면역조직화학으로 수득되고 처리될 수 있다(Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology 3rd Ed. John Wiley & Sons, Inc. 1995). 면역조직화학으로 수득된 현미경 데이터는 면역조직화학적으로 염색된 조직 샘플을 스캐닝하고 NIH Image(National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 비롯한 당분야에 공지된 컴퓨터 소프트웨어 프로그램을 이용하여 염색 수준을 정량할 수 있다. 본 발명에 따라, 본 발명의 단백질은 목적 단백질로 치료된 동물에서 면역조직화학 염색의 정량적 척도가 목적 단백질로 치료되지 않은 동물에서 검출된 면역조직화학 염색의 척도로부터 통계학적으로 상이하면(상기한 증가 또는 감소로 정의됨) “면역 반응”을 자극한다고 할 수 있는데, 여기서 상기 조직화학적 염색은 상기 단백질에 대한 특이적인 결합을 요한다. 측정된 면역조직화학적 염색 수준에서 차이를 결정하는데 이용되는 당분야에 공지된 통계학적 검증은 ANOVA, 스튜던트 t-검증 등인데, 여기서 P 값은 적어도 <0.1, <0.05, <0.01, <0.005, <0.001, 또는 <0.0001이다.

“점막 면역 반응”은 상기 인용된 기술을 이용하여 “검출”할 수 있다. 가령, 항-IgA 항체를 이용한 ELISA 검사로 점막-특이적 면역글로불린을 검출하고 측정할 수 있다(Dickinson, B.L. & Clements, J.D. Dissociation of Escherichia cold heat-labile enterotoxin adjuvanticity from ADP ribosyltransferase activity. Infect Immun 63, 1617- 1623(1995)).

“체액 면역 반응”은 항원에 대한 반응으로 항체의 생산을 수반한다. 세포 면역 반응은 보조 T-세포(CD4+) 반응과 세포독성 T-세포 림프구(CD8+) 반응을 포함한다. 점막 면역 반응(또는 분비 면역 반응)은 분비(sIgA) 항체의 생산을 수반한다. 면역 반응은 이들 반응 중에서 한가지 또는 이들 반응의 조합을 수반할 수 있다.

본 명세서에서, “동물”은 동물계 계통 내에서 분류된 생물체를 의미한다. 본 명세서에서, “동물”은 포유동물을 또한 의미한다. 본 발명에 유용한 동물은 포유동물, 유대류, 생쥐, 개, 고양이, 소, 인간, 사슴, 말, 양, 가축, 가금, 닭, 칠면조, 타조, 어류, 갑각류(shell fish) 등이다.

본 명세서에서, “외떡잎식물”은 배아가 하나의 떡잎을 보유하는 식물을 의미한다. “외떡잎식물”의 예는 백합; 볏과 식물; 옥수수; 귀리, 밀, 보리를 비롯한 곡물; 난초; 붓꽃속 식물; 양파와 야자 등이다.

본 명세서에서, “쌍떡잎식물”은 배아가 두 개의 보유하는 식물을 의미한다. “쌍떡잎식물”의 예는 담배; 토마토; 알파파를 비롯한 콩과식물; 오크; 단풍나무; 장미; 박하; 호박; 데이지; 호두나무; 선인장; 바이올렛과 미나리아재비 등이다.

본 명세서에서, “벡터”는 결합되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 한가지 유형의 벡터는 “플라스미드”인데, 이는 추가의 핵산 분절이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 핵산 루프를 의미한다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다(가령, 박테리아 복제 기원을 보유하는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(가령, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 직후에 숙주 세포의 게놈에 통합되고, 이후 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 유인할 수 있다. 이런 벡터는 “발현 벡터”라고 한다. 일반적으로, 재조합 핵산 기술에서 유용한 발현 벡터는 주로 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, “플라스미드”와 “벡터”는 서로 동일한 의미로 이용될 수 있는데, 그 이유는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적인 형태이기 때문이다.

본 명세서에서, “프로모터”는 일반적으로, 전사의 개시에 요구되는 RNA 중합효소와 다른 인자에 대한 인식과 결합 부위를 제공함으로써 코딩 영역의 발현을 조절하는 구조 유전자의 코딩 영역의 상류에서 DNA 서열을 의미한다. 프로모터의 선택은 목적 핵산 서열에 좌우된다. “식물-기능성 프로모터”는 식물 세포에서 전사의 개시를 뒷받침할 수 있는 “프로모터”를 의미한다. 본 발명에 유용한 “식물-기능성 프로모터”는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)의 35S 프로모터; 종자 저장 단백질 유전자, 예를 들면, Zma1OKz 또는 Zmag12, 광 유도성 유전자, 예를 들면, '리뷸로스 비스포스페이트 카복실라제(ribulose bisphosphate carboxylase) 소형 아단위(rbcS), 스트레스 유도된 유전자, 예를 들면, 알코올 디하이드로게나아제(Adh1), 또는 모든 세포에서 발현하는 “키핑 유전자(housekeeping gene)”의(가령, Zmact, 옥수수 액틴 유전자); 토마토 ES 프로모터; 유비퀴틴; 만노핀 합성효소(mannopine synthetase, mas); 쌀 액틴 1; 콩 종자 단백질 글리시닌(Gy1); 콩 영양 저장 단백질(asp); 과립-결합된 전분 합성효소(granule-bound starch synthase, gbss) 등이다. 다른 “식물-기능성 프로모터”에는 식용 식물 부분에서 높은 발현을 제공하는 것으로 알려진 유전자에 대한 프로모터, 예를 들면, 감자로부터 파타틴(patatin) 유전자 프로모터가 포함된다.

본 명세서에서, “작동가능하게 결합된”은 기술된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 하는 병렬 관계를 의미한다. 코딩 서열에 “작동가능하게 결합된” 대조 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립하는 조건하에 달성되도록 하는 방식으로 결찰된다. 프로모터 서열은 유전자의 전사를 조절할 수 있을 만큼 유전자의 전사 개시 부위에 충분히 근접하는 경우에 “작동가능하게 결합된다.”

본 명세서에서, “투여”는 “전달된” 물질이 투여된 동물의 점막 표면에 접촉하도록 담보하는 방식으로, 본 발명의 외래유전자도입 식물 물질, 세포, 조성물, 제약학적 제제의 동물로의 전달을 의미한다. 본 발명에 유용한 “전달” 경로는 경구 전달, 비강 전달, 복강내 전달, 근육내, 정맥내 또는 피하 전달, 직장 또는 질내 전달(가령, 좌약, 또는 극소 투여로), 또는 전달된 물질이 점막 표면과 직접 접촉하는 전달 경로(즉, “점막 전달”) 등이다. 본 명세서에서, “제약학적으로 수용가능한”은 활성 성분의 생물학적 활성의 효능을 간섭하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 좌우된다.

본 명세서에서, “점막 표면” 또는 “점막”은 이들 구조의 널리 공지된 의학적 정의, 다시 말하면, 상피, 고유판(lamina propria), 평활근 층(소화관)을 포함하는 구조의 표면 또는 내막을 의미한다. “점막 표면”의 예는 기관지의 내부층, 고실(tympanic cavity)의 점막층, 결장의 내부 점막층, 정관(ductus deferens)의 내부층, 식도의 내부층, 소장의 점막층, 후두의 점막층, 혀의 점막, 뇌하수체 막, 구강의 점막, 인두의 점막, 기관(trachea)의 내부 점막층, 이관(auditory tube)의 내막, 난관(uterine tube)의 점막층, 요관의 내부층, 요도의 내부층, 자궁내막, 질의 점막, 위의 점막층, 방광의 내부층, 정액낭(seminal vesicle)의 점막 등이다.

본 명세서에서, “담체”는 본 발명에 따른 백신의 동물로의 전달을 달성하거나 또는 강화시키기 위한 불활성 비-독성 물질을 의미한다. 담체의 예는 물, 인산염 완충액, 또는 염수 등이고, 보조약을 추가로 함유할 수 있다. 불완전 Freund 보조약, 알루미늄 인산염, 수산화알루미늄, 또는 명반과 같은 보조약은 당분야에 널리 공지된 물질이다.

본 발명은 또한, 한가지이상의 제약학적으로 수용가능한 보조약 담체, 희석제, 부형제와 공동으로 본 발명의 면역보호성 입자를 함유하는 제약학적 조성물과 수의학적 조성물을 제시한다. 이런 제약학적 조성물은 백신으로 지칭되며, 제약학적 백신 분야에 널리 공지된 방식으로 조제된다.

“투여”는 동물의 체내로 물질의 도입으로 정의되고, 구강, 비강, 직장, 질내, 장관외 경로를 포괄한다. 본 발명의 조성물은 피하(SQ) 근육내(IM), 정맥내(IV), 점막, 비강 또는 구강을 비롯한 임의의 투여 경로를 통하여 개별적으로, 또는 다른 치료제와 공동으로 투여될 수 있다. 조성물은 SQ 또는 IM 경로를 통하여 투여된다. 특히 바람직하게는 점막 경로, 가장 바람직하게는 경구 경로이다.

본 명세서에서, “백신의 효과량 또는 효과 용량”은 인간이나 동물에서 병원균에 의해 가해지는 위협에 효과적으로 저항할 수 있을 만큼 충분한 선천성 면역 반응을 자극하는 필요한 양이다. 가령, 한 구체예에서, “백신의 효과량 또는 효과 용량”은 백신의 면역보호성 항원에 결합하는 항체의 양에서 증가를 유도한다. 본 명세서에서, 증가는 백신접종되지 않은 개체에 비하여 백신접종된 개체에 의해 생산된 항체의 양에서 2-배 이상, 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000-배 또는 그 이상의 증가를 의미한다. 증가는 또한, 백신접종되지 않은 개체에 비하여 백신접종된 개체에 의한 적어도 5% 이상, 예를 들면, 5, 6, 10, 20, 30, 40, 50, 60 70, 80, 90, 100% 또는 그 이상의 항체 생산을 의미한다. 이런 인간이나 동물에 대한 투여량은 특정 면역보호성 입자 또는 입자의 조합, 인간이나 동물의 상태, 선택된 투여 경로를 비롯한 유관한 환경에 기초하여 의사 또는 수의사에 의해 결정된다. 본원에 제시된 용량 범위는 본 발명의 범위를 전혀 한정하지 않으며, 숙련자를 위한 총괄적인 보도로서 제공된다. 효과 용량은 세포 배양 검사, 또는 동물 모델, 일반적으로, 생쥐, 토끼, 개 또는 돼지에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델은 원하는 농도 범위와 투여 경로를 달성하는 데에도 이용된다. 이후, 이런 정보를 활용하여 인간에게 적합한 투여 용량과 경로를 결정할 수 있다.

정확한 용량은 치료되는 환자에 맞게 개별 의사에 의해 선택된다. 용량과 투여는 충분한 수준의 활성 부분을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위하여 조정된다. 고려해야 하는 추가적인 인자는 질병 상태의 심각도; 개체의 연령, 체중, 성별; 식이, 투여 시간과 빈도, 약물 조합, 반응 감수성, 내성/치료 반응 등이다. 장기간 작용하는 제약학적 조성물은 특정 제제의 반감기와 청소율에 따라, 매 3-4일 간격, 매주 간격, 또는 격주 간격으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 항원성 조성물의 특정 용량은 조성물이 투여되는 인간이나 동물의 종, 연령, 전반적인 상태 및 조성물의 투여 양식을 비롯한 다양한 인자에 좌우된다. 본 발명에 따른 조성물의 효과량은 통상적인 실험을 이용하여 용이하게 결정할 수 있다. 시험관내와 생체내 모델(가령, 가금)을 이용하여 적량을 확인할 수 있다. 일반적으로, 0.1, 1.0, 1.5, 2.0, 5, 10, 또는 100 ㎎/㎏의 항원이 대형 동물, 예를 들면, 비비, 침팬지 또는 인간에게 투여된다. 원하는 경우에, 보조-자극 분자 또는 보조약 역시 항원성 조성물 이전에, 이후에, 또는 항원성 조성물과 동시에 제공될 수 있다. 적절하게는, 항원의 용량은 1 ng 내지 0.5 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 1 ㎎ 내지 50 ㎎/㎏ 체중의 범위에서 투여된다.

본 발명에 따른 식용 백신의 효능은 백신의 투여가 치료되거나 목적 병원균에 의해 유발되는 질환의 증상을 적어도 5%, 바람직하게는 10-20%, 더욱 바람직하게는 25-100% 예방하거나 완화시킨다는 것을 예증함으로써 결정된다.

본 명세서에서 “조류”는 날개로 변형된 앞다리, 비늘족(scaly leg), 부리를 보유하고, 딱딱한 껍질의 알을 낳는 조강(class Aves)의 임의의 온혈 척추동물 구성원으로 정의된다. 본 발명에서 바람직한 조류 군은 닭, 칠면조, 타조, 오리, 거위, 코니쉬 게임 헨(cornish game hen)이다. 더욱 바람직한 군은 닭과 칠면조이다. 본 발명에서 가장 바람직한 조류는 구이용 영계와 알 낳는 닭을 비롯한 닭이다.

본 발명의 방법과 조성물은 인간과 동물, 바람직하게는 가축, 예를 들면, 조류(가금), 소, 양, 염소, 돼지, 말, 고양이, 개, 라마, 가장 바람직하게는 조류이다. 이들 동물 종의 일부는 복수의 위부 및 식물 물질의 분해에 특이적인 소화 효소를 보유할 수 있는데, 이들 대부분이 다른 유형의 경구 백신을 쉽게 비활성화시킨다. 본 발명을 한정하지 않으면서, 외래유전자도입 식물 세포와 이로부터 유래된 조성물의 섭취는 편도선을 비롯한 구강 점막 부위에서 동물의 면역화를 결과할 수 있다.

본 명세서에서, “열매”는 확장되고 발달하면 종자를 둘러싸는 조직 덩어리를 형성하는 속씨식물 꽃 및 관련 구조(가령, 화관(floral tube)의 꽃턱(receptacle) 또는 일부분)의 씨방을 의미한다. 본 발명에서, 열매 발육에 관련된 특정 조직은 종에 따라 달라지지만, 본 발명에서 열매 발육에 관련된 조직은 항상 후대 종자의 모계로부터 유래된다.

본 명세서에서, “성숙”은 색소에서 변화, 산과 전분의 유리 당(free sugar)으로의 전환, 열매의 연화(softening)를 유도하는 세포벽의 붕괴로 특성화되는 열매 발육 단계를 의미한다.

본 명세서에서, “열매 성숙 상태”는 씨방의 수정이후 발생하는 모계 조직의 세포 분화와 확장을 비롯하여 열매 성숙에 관련된 발육 과정이 발생할 수 있는 조건을 의미한다. 본 명세서에서, 예로써 에틸렌의 생산은 토마토와 같은 급등형 열매(climacteric fruit)에서 성숙을 위한 유전 프로그램을 자극하는 화학적 신호이다.

본 명세서에서, “열매 성숙의 개시에 앞서”는 10% 이하(가령, 9.9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5%)의 열매가 색소에서 변화를 겪는 열매 발육 단계를 의미한다. “열매 성숙의 개시에 앞서”는 또한, 열매의 산과 전분의 10% 이하(가령, 9.9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5%)가 당으로 전환되는 열매 발육 단계를 의미한다. “열매 성숙의 개시에 앞서”는 또한, 열매의 세포벽 물질의 10% 이하(가령, 9.9, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5%)가 분해되는 열매 발육 단계를 의미한다.

본 명세서에서, “배양”은 야외, 또는 통제되거나 통제되지 않은 실험실이나 내부 환경에서 식물의 성장을 수반한다. 본 발명의 한 구체예에서, 항원은 열매 성숙의 개시에 앞서 식물이 항원을 발현하는 조건하에 상기 식물을 앞서 정의된 바와 같이 “배양”함으로써, 식물에서 생산된다.

본 발명은 목적 항원을 인코딩하는 서열, 예를 들면, 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원을 인코딩하는 식물 최적화된 서열에 관한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 식물 최적화된 서열을 포함하는 벡터, 식물 세포, 외래유전자도입 식물, 백신에 관한다. 더 나아가, 본 발명은 바이러스 감염, 예를 들면, 뉴캐슬병 바이러스 또는 조류 인플루엔자 바이러스에 의한 감염으로부터 보호 방법에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 외래유전자도입 식물에서 항원 생산 방법에 관한다.

본 발명에 유용한 면역보호성 항원

본 발명은 이질성 외래 유전자를 발현하는 식물 세포와 외래유전자도입 식물을 제시한다. 본 발명의 이질성 외래 유전자는 Norwalk 바이러스 캡시드 단백질(NVCP)(GenBank 수탁 번호: M87661, GenBank #AF093797, Norwalk 바이러스에 대한 게놈, GenBank 수탁 번호 AAB50466, NV 캡시드 단백질), 조류 인플루엔자 혈구응집 항원(AIV-HA)(GenBank 수탁 번호 U67783과 AAC58999), 뉴캐슬병 바이러스 뉴우라미니다아제(NDV HN)(GenBank 수탁 번호 NM-204389, NP-989720, NP-009086, NM-007155)(GenBank 수탁 번호: AY510092와 AAS10195), 투명대(zone pellucida) 당단백질 3(ZP3), B형 간염 표면 항원(HBsAg)(GenBank 수탁 번호 AF134148, AAD31865, X58569, GenBank #AF090842), 시가독소(shigatoxin) B(StxB)(Genbank #AJ132761), 스타필로코커스(Staphylococcus) 내독소 B(SEB)(GenBank #M11118), 대장균(E. coli) 불안정 독소 B(LT-B)(GenBank#AB011677), 대장균(E. coli) 불안정 독소 A 아단위(LT-A)(GenBank #AB011677) 등을 비롯한 임의의 목적 유전자일 수 있다.

뉴캐슬병 바이러스(NDV)는 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae)의 파라믹소바이러스 속(Paramyxovirus genus)의 구성원이다. 상기 속의 바이러스는 센다이 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스와 같은 파라인플루엔자를 포함하는 외피 네거티브-가닥 RNA 바이러스이다(Kingsbury et al. , 1978, Intervirology, 10: 137-152). 비리온(virion)은 헤마글루티닌 뉴우라미니다아제(HN) 74 kDA 단백질 및 좀더 작은 융합(F) 단백질을 비롯한 2가지 표면 당단백질의 존재로 특성화된다. HN은 시알산 보유 세포 수용체의 인식에 의한 세포 부착 및 자가-응집을 예방하는 후대 바이러스 입자로부터 시알산을 절단하는 뉴우라미니다아제 활성을 비롯한 2가지 중요한 기능에 관여한다. F 단백질은 바이러스-세포와 세포-세포 융합과 용혈을 매개한다(참조: Scheid, A., and Choppin, P.W.(1973) J. Virology. 11, 263- 271; Scheid, A, and Choppin, P.W.(1974) Virology 57, 470-490; Lamb, R.A., and Kolakofsky, D.(1996). Paramyxoviridae: the viruses and their replication, p.577-604. In B.N. Fields, D.M. Knipe, and P.M. Howley(ed.), Fields virology, 3rd ed. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.) 어느 한쪽 단백질에 대하여 제조된 다가 혈청은 바이러스의 감염성을 중화시킬 수 있다(참조: Mertz, D.C., Scheid, A., and Choppin, P.W.(1980) J. Exp. Med. 151, 275-288).

조류 인플루엔자 바이러스는 Suarez et al., Virus Res. 1997, 51: 115; Sockett, Can. Med. Assoc. J., 1998, 158:369에서 기술한다. 조류 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 유전자는 Barun et al., 1998, Nuc. Acids. Res., 16:4181에서 기술한다.

본 발명에 따른 구조체의 제조

본 발명에 따른 발현 카세트는 식물 세포에서 기능하는 전사와 번역 조절 영역에 작동가능하게 결합된 적어도 한가지 면역보호성 항원을 인코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 적절하게는, 본 발명은 식물에서 면역보호성 항원 외래유전자를 발현하는데 유용한 식물 발현 카세트를 제시한다. 이들 카세트는 5'에서 3'로 작동가능하게 결합된 아래의 요소를 포함한다:

A) 식물에서 자연적으로 발현하는 식물 유전자 프로모터 서열;

B) 목적하는 면역보호성 항원을 인코딩하는 핵산 서열;

C) 3'UTR.

본 구체예에서 유용한 프로모터는 식물에서 기능하는 임의의 공지된 프로모터이다. 많은 프로모터가 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이런 프로모터에는 다른 유전자와 자연적으로 결합된 프로모터 및/또는 임의의 박테리아 세포, 바이러스 세포, 진핵 세포 또는 식물 세포로부터 분리된 프로모터가 포함된다. 발현을 위하여 선택된 세포 또는 조직에서 외래 코딩 서열의 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터를 이용하는 것이 바람직하다. 단백질 발현을 위한 프로모터와 세포형 조합의 이용은 분자생물학 분야의 당업자에게 전반적으로 공지되어 있다(참조: Sambrook et al., In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). 이용된 프로모터는 구조성 또는 유도성이고, 재조합 단백질 또는 펩티드의 대규모 생산에서처럼 도입된 DNA 분절의 고도 발현을 유도하는 적절한 조건하에 이용될 수 있다. 프로모터와 관련하여 “구조성”은 프로모터가 자극(가령, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이, 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 전사를 유도할 수 있다는 것을 의미한다. 대조적으로, “유도성” 프로모터는 자극(가령, 열 쇼크, 화학물질 등)의 존재하에, 작동가능하게 결합된 핵산 서열의 전사 수준을 유도할 수 있는 프로모터인데, 여기서 상기 전사 수준은 자극이 없는 경우의 전사 수준과 상이하다. 본 명세서에서, “유도성”은 또한, 광의 존재에서 및/또는 발육 변화에 대응하여, 외인성 또는 내인성 화학물질(가령, 알코올, 호르몬, 또는 성장 인자)의 존재하에 발현을 의미한다. 본 명세서에서, “유도성”은 또한, 화학 유도물질의 존재하에 임의의 조직에서 발현을 의미한다. 본 명세서에서, 본 발명에 따른 “화학적 유도”는 식물이나 식물 기관에 대한 외인성 또는 내인성 물질(거대분자, 예를 들면, 단백질, 또는 핵산 포함)의 물리적 적용(가령, 화학 유도물질을 함유하는 액체 용액의 잎 분무, 액체 용액의 뿌리 도포, 또는 식물이나 식물 기관의 가스 또는 증기에 노출에 의해)을 의미하는데, 상기 물질은 식물이나 식물 기관의 세포에 존재하는 표적 프로모터가 전사 속도를 증가시키도록 유도하는 효과를 보유한다.

본 발명의 구조 유전자를 발현하는데 이용될 수 있는 일부 전형적인 식물 기능성 프로모터는 아래와 같다: CaMV 35S와 19S 프로모터(US 5,352,605, US 5,530,196); 파타틴 프로모터(US 5,436,393); 영향 감자(Solanum tubersum)로부터 유래된 파타틴 유전자의 B33 프로모터 서열, 이는 B33 프로모터에 융합된 서열의 덩이줄기 특이적 발현을 유도한다(US 5,436,393); 토마토 E8 프로모터(WO 94/24298); 토마토 열매 프로모터(US 5,556,653); 식물 유비퀴틴 프로모터 시스템(US 5,614,399, 5,510,474); 아브시스산(abscisic acid)-반응성 유전자 발현의 5' 시스-조절 요소(US 5,824,865); 바드나바이러스(badnavirus), 쌀 턴그로 간상(rice tungro bacilliform) 바이러스(RTBV)로부터 프로모터(US 5,824,857); 담배 Pit-1a 유전자의 코딩 영역에 인접한 5' 측면 영역으로부터 화학 유도성 프로모터 단편(US 5,789,214); 나무딸기 dru1 프로모터(US 5,783,394); 딸기 프로모터와 유전자(WO 98/31812); 나핀(napin) 프로모터, 파세올린 프로모터, DC3 프로모터(US 5,773,697); LEA 프로모터(US 5,723,765); 싱크 기관(sink organ) 특이적 발현을 위한 5' 전사 조절 영역(US 5,723,757); 외래유전자도입 식물에서 이질성 유전자의 발현을 조절하는 프로모터의 cis-요소로서 기능하는 G-박스 관련된 서열 모티프, 특히 Iwt와 PA 모티프(US 5,723,751); P119 프로모터와 이들의 용도(US 5,633,440); 그룹 2(Gp2) 식물 프로모터 서열(US 5,608,144); 옥수수, 피튜니아, 담배의 여러 유전자로부터 유래된 핵산 프로모터 단편(US 5,608,143); 완두 식물(Pisum sativum)에서 엽록체 GS2 글루타민 합성효소에 대한 핵 유전자 및 시토졸 GS3 글루타민 합성효소에 대한 2개의 핵 유전자로부터 분리된 프로모터 서열(US 5,391,725); 피그워트(figwort) 모자이크 바이러스(FMV)로부터 전장 전사체 프로모터(US 5,378,619); 이소시트레이트 리아제 프로모터(US 5,689,040); 소포자(microspore)-특이적 조절 요소(US 5,633,438); 식물 아스파라긴 합성효소 프로모터를 이용하여 외래유전자도입 식물과 식물 세포에서 이질성 유전자의 발현(US 5,595,896); 옥토핀(octopine)-유형 수관찰상종양(crown gall tumor)에서 1450 염기 TR 전사체의 발현을 유도하는 프로모터 영역(US 4,771,002); 리불로즈-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제의 작은 아단위로부터 유전자의 프로모터 서열(US 4,962,028); 애기장대(Arabidopsis) 히스톤 H4 프로모터(US 5,491,288); 종자-특이적 식물 프로모터(US 5,767,363); 정상적으로 녹색 조직 특이적 프로모터인 rbcS-3A 프로모터에 뿌리 발현 능력을 부여할 수 있는 21개 bp 프로모터 요소(US 5,023,179); 식물, 특히 뿌리에서 연관된 DNA 서열의 조직-선호적 전사의 프로모터(US 5,792,925); Brassica sp. 폴리갈락투로나아제 프로모터(US 5,689,053); 종자 외피-특이적 비밀 프로모터 영역(US 5,824,863); 벤조-1,2,3-티아디아졸, 이소니코틴산 화합물, 또는 살리실산 화합물의 도포에 의해 유도되는 담배 Pit-1a 유전자로부터 분리된 화학 유도성 핵산 프로모터 단편(US 5,689,044); 벤조-1,2,3-티아디아졸의 도포에 의해 유도되는 오이 키티나아제(chitinase)/리소자임 유전자로부터 분리된 프로모터 단편(US 5,654,414); 적어도 씨방, 꽃, 미성숙 배, 성숙 배, 종자, 줄기, 잎, 뿌리 조직에서 발현을 유도하는 담배로부터 구조성 프로모터(US 5,824,872); 식물에서 유전자 발현의 변형(US 5,223,419); 외떡잎식물에서 유전자 발현을 위한 재조합 프로모터(US 5,290,924); 펩티드와 단백질을 과다생산하는 TMV를 이용하는 방법(WO 95/21248); 생장점(shoot meristem)-특이적 프로모터와 조절된 서열을 포함하는 핵산(WO 98/05199); 파세올린 프로모터와 구조 유전자(EP-B-0122791); 식물 프로모터[CaMV 35S의 서브 도메인](US 5,097,025); 성숙 열매에서 이질성 유전자, 예를 들면, 5-아데노실메티오닌 하이드롤라아제를 발현하기 위한 토마토 E8-유래된 프로모터의 용도(WO 94/24294); 외래유전자도입 식물에서 유전자 발현을 조절하는 전이활성(transactivation) 단백질을 이용하는 방법(US 5,801,027); 유도성 식물 프로모터와 토마토 Adh2 효소를 인코딩하는 DNA 분자(US 5,821,398); 합성 식물 코어 프로모터와 상류 조절 요소(WO 97/47756); 쌍떡잎 상처 유도성 프로모터를 보유하는 외떡잎식물(US 5,684,239); 식물에서 선택적 유전자 발현(US 5,110,732); CaMV 35S 강화된 만노핀 합성효소 프로모터와 이들을 이용하는 방법(US 5,106,739); 종자 특이적 전사 조절(US 5,420,034); 종자 특이적 프로모터 영역(US 5,623,067); 밀로부터 DNA 프로모터 단편(US 5,139,954); 식물에 이용되는 키메라 조절 영역과 유전자 카세트(WO 95/14098); 유전자 산물의 높은 수준으로 생산(WO 90/13658); 식물과 식물 세포 배양액에서 유전자 산물의 HMG 프로모터 발현 시스템과 포스터 하비스트 생산(US 5,670,349); 식물에서 알파 아밀라아제 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 유전자 발현 시스템(US 5,712,112).

바람직한 프로모터 군은 US 특허 출원 09/202,838에 기술된 카사바 베인 모자이크(cassava vein mosaic) 바이러스 프로모터; US 특허 5,591,605에 기술된 파세올린 프로모터; US 특허 5,641,876에 기술된 쌀 액틴 프로모터; WO 98/56921에 기술된 per5 프로모터; WO 00/12681에 기술된 감마 제인(gamma zein) 프로모터이다.

프로모터 DNA 서열이 코딩 DNA 서열의 전사에 영향을 주도록 이들 두 서열이 위치하는 경우에, 프로모터 DNA 서열은 코딩 DNA 서열에 “작동가능하게 결합”되었다고 한다. 가령, 코딩 DNA 서열이 단백질의 생산을 코딩하는 경우에, 프로모터 DNA 서열이 코딩 DNA 서열로부터 단백질 산물의 발현에 영향을 준다면 프로모터 DNA 서열은 코딩 DNA 서열에 작동가능하게 결합된다.

유전자 카세트의 작제는 당분야에 널리 공지된 방법으로 용이하게 달성된다(Sambrook et al.(1989); Ausubel et al.(1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY). 또한, 본 발명은 면역보호성 항원을 인코딩하는 개시된 서열과 실질적으로 서열 상동성을 보유하고, 발현에 대한 상기한 효과를 발휘할 수 있는 DNA 서열을 제시한다. 본 명세서에서 “실질적인 서열 상동성”은 뉴클레오티드 서열(DNA 또는 RNA의 경우에) 또는 아미노산 서열(단백질 또는 폴리펩티드의 경우에)이 다른 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 실질적인 기능적 또는 구조적 등가를 보인다는 것을 의미한다. 실질적인 서열 상동성을 보유하는 서열 사이의 기능적 또는 구조적 차이는 최소허용보조(de minimis)이다; 다시 말하면, 이들 차이는 본원에 지시된 바와 같이 기능하는 서열의 능력에 영향을 주지 않는다. 본원에 개시된 서열과 실질적인 서열 상동성을 보유하는 서열은 일반적으로, 돌연변이체와 같은 이들 개시된 서열의 변이체이지만 합성 서열일 수도 있다.

대부분의 경우에, 본원에 구체적으로 개시된 서열에 95% 상동성을 보유하는 서열은 등가물로서 기능하고, 많은 경우에 상대적으로 적은 상동성, 예를 들면, 75% 또는 80%가 수용된다. 이들 서열에서 중요하지 않은 부분의 확인은 많은 시간이 소요되긴 하지만 당분야의 통상적인 기술에 속한다. 올리고뉴클레오티드 서열을 변형하는 전형적인 기술은 폴리뉴클레오티드-매개된 특정부위 돌연변이유발이다(참조: Zoller et al.(1984); Higuchi et al.(1988); Ho et al.(1989); Horton et al.(1989); PCR Technolov: Principles and Applications for DNA Amplification,(ed.) Erlich(1989)).

본 발명은 목적하는 면역보호성 항원을 인코딩하는 식물 최적화된 서열을 제시한다. 식물-최적화된 코딩 서열은 토마토와 감자 코돈 사용빈도(codon usage)를 반영하는 하이브리드 코돈 차등으로 설계된다(Ausubel F., et al., eds.(1994) Current Protocols in Molecular Biology, vol. 3, p. A.1C.3 Haq TA, Mason HS, Clements JD, Arntzen CJ(1995)).

본 발명의 식물 최적화된 서열은 U.S. 5,380,831에서 기술한다. 일반적으로, 목적하는 표적 식물에 대한 코돈 사용빈도는 목적하는 표적 유전자, 예를 들면, NDV HN의 코돈 사용빈도를 조정하는데 이용된다.

고유 서열은 표적 식물에서 발현을 간섭하는 서열 모티프, 예를 들면, 폴리-A 부가 부위, Shaw/Kamen 분해 분위, 절단접합 부위, RNA 종결 또는 잠재적 헤어핀 형성과 관련된 부위 등을 스캔한다. A/T 서열의 연속은 빈번하게 회피된다. 한 구체예에서, 가능하면 한 열에서 일련의 AT를 4개 이하로 유지시키는 것이 바람직한데, 그 이유는 대부분의 조절 부위가 A와 T의 연속(가령, AATAAA 공통 폴리-A 또는 ATTTA Shaw/Kamen)을 보유하는 경향이 있기 때문이다. 일반적으로, 기존 문헌에서 밝혀진 식물로부터 확인된 부위에 기초하여 대략 16개의 추정 폴리-A 부가 서열을 스캔하는 것이 유용하다. 특정 구체예에서, 헤어핀 스템 형성을 안정화시킬 수 있는 C/G 연속을 검색하는 것이 유용하다. 외떡잎식물이 쌍떡잎식물보다 3번째 위치 C와 G를 선호하는 경향이 있기 때문에, C/G 연속의 확인 타당성은 발현을 위한 숙주 식물 표적에 좌우된다.

유전자가 쌍떡잎식물과 외떡잎식물에서 발현되는 한 구체예에서, 전체 식물 코돈 사용빈도는 서열 최적화를 위한 기초로서 이용된다.

본 명세서에서 막 고정 서열은 당업자가 이해하는 바와 동일하다. 막 고정 서열에는 막통과 단백질 서열을 포함되는데, 이들은 많은 자연 발생 단백질에서 발견된다. 이런 막 고정 서열은 크기가 다양하긴 하지만, 막 내에서 소수성 환경을 선호하는 친지성 또는 지방족 측쇄를 보유하는 일련의 아미노산으로 항상 구성된다. RNA 번역과 번역이후 가공 동안, 고정 서열은 통합되고 세포막에 끼워지며 단백질을 세포막 성분에 고정시키거나 느슨하게 부착시켜, 단백질의 친수성 부분이 노출되고 세포의 내외에서 수성 환경과 상호작용할 수 있도록 한다.

본 발명의 구조체를 제조하는 과정에서, 다양한 DNA 단편을 조작하여 적절한 방향 및 적절한 해독틀에서 DNA 서열을 제공할 수 있다. 어댑터 또는 링커를 이용하여 DNA 단편을 결합시키거나, 또는 다른 조작을 수행하여 전통적인 제한 부위, 불필요한 DNA의 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공할 수 있다.

다양한 단계를 수행함에 있어서, 클로닝을 이용하여 원하는 숙주 세포로의 후속적인 도입을 위한 프로모터/목적 유전자를 보유하는 벡터를 증폭한다. 다양한 클로닝 벡터가 이용가능한데, 클로닝 벡터는 대장균(E. coli)에서 기능한 복제 시스템 및 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 하는 마커를 보유한다. 전형적인 벡터는 pBR322, pUC 시리즈, pACYC184, Bluescript 시리즈(Stratagene) 등이다. 따라서, 상기 서열은 적절한 제한 부위에서 벡터에 삽입되고, 생성된 플라스미드는 대장균(E. coli) 숙주(가령, 대장균(E. coli) 균주 HB101, JM101, DH5α)를 형질전환시키는데 이용되고, 상기 대장균(E. coli)은 적절한 영양 배지에서 성장되고, 세포는 수거되고 용해되며, 플라스미드는 회수된다. 분석에는 서열 분석, 제한 분석, 전기영동 등이 포함된다. 각 조작이후, 최종 구조체에 이용되는 DNA 서열은 제한되고 다음 서열에 연결되는데, 여기서 각각의 부분 구조체는 동일 또는 상이한 플라스미드에 클론된다.

식물 세포의 형질전환을 위한 벡터는 입수가능하거나 용이하게 제조될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 특정 숙주에서 이질성 DNA 서열의 유지와 발현에 필요한 모든 DNA 조절 서열을 보유해야 한다. 이런 조절 서열은 일반적으로, 리더 서열, 번역 개시 코돈, 번역 종결 코돈을 코딩하는 DNA 서열, 메신저 RNA 처리를 조절하는 3'UTR 신호를 코딩하는 DNA 서열을 보유한다. 임의의 특정 종에서 발현을 최적화시키기 위한 적절한 요소의 선택은 본원의 교시에 따라 당분야의 통상적인 기술이다. 최종적으로, 벡터는 가급적, 벡터를 보유하는 숙주 세포의 확인을 가능하게 하는 표현형을 제공할 수 있는 마커 유전자를 보유해야 한다.

식물 세포에 삽입된 외래 코딩 서열의 활성은 삽입체에 인접한 내인성 식물 DNA의 영향에 좌우된다. 일반적으로, 이질성 유전자의 삽입은 임의의 형질전환 기술에 의해 무작위로 진행된다; 하지만, DNA의 식물 세포로의 부위 특이적인 재조합으로 식물을 산출하는 기술이 현재한다(참조: WO 91/09957). 프로모터의 조절하에 원하는 서열의 발현을 유도하는 임의의 방법 또는 방법의 조합은 수용가능하다.

본 발명은 식물 세포를 형질전환하는 임의의 특정 방법에 한정되지 않는다. DNA를 식물 세포에 도입하는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 외래 DNA를 식물 세포로 전달하는 4가지 기본적인 방법이 보고되었다. 화학적 방법(Graham and van der Eb, Virology, 54(02):536-539, 1973; Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136-153, 1992); 미세주입(Capecchi, Cell, 22(2) :479-488, 1980), 전기천공(Wong and Neumann, Biochim. Biophys. Res. Conmmun. 107(2):584-587, 1982; Fromm, Taylor, Walbot, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(17):5824-5828,1985; U.S. Pat. No. 5,384,253), 유전자 총(Johnston and Tang, Methods Cell. Biol., 43(A):353-365, 1994; Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(24): 11478-11482, 1993)을 비롯한 물리적 방법; 바이러스 방법(Clapp, Clin. Perinatol., 20(1):155-168, 1993; Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, J. Exp. Med. 178(6) :2089-2096, 1993; Eglitis and Anderson, Biotechniques, 6(7):608-614, 1988; Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, Avd. Exp. Med. Biol., 241:19 27, 1988); 수용체-매개된 방법(Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(19):8850-8854, 1991; Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, Hu, Hum. Gen. Ther., 3(2): 147-154, 1992; Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(13):6099 6103, 1992).

전기천공에 의한 DNA의 식물 세포로의 도입은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 식물 세포벽-분해 효소, 예를 들면, 펙틴-분해 효소를 이용하여 수용자 세포가 처리되지 않은 세포에 비하여 전기천공에 의한 형질전환에 더욱 민감하도록 한다. 전기천공에 의한 형질전환을 달성하기 위하여, 세포의 현탁 배양액 또는 배형성 유합조직(embryogenic callus)과 같은 약한 조직, 또는 미성숙 배 또는 다른 체계화된 조직을 직접 이용할 수도 있다. 일반적으로, 펙틴-분해 효소에 표적 식물 물질의 세포벽을 부분적으로 분해시키거나, 또는 통제된 방식으로 기계적인 상처를 입히는 것이 필요하다. 이런 처리된 식물 물질은 전기천공에 의해 외래 DNA를 수용하게 된다.

외래 형질전환 DNA를 식물 세포에 전달하는 다른 방법은 미세투사 충격(microprojectile bombardment)이다. 상기 방법에서, 미세입자는 외래 DNA로 피복되고 추진력에 의해 세포로 전달된다. 이런 미세입자는 전형적으로, 텅스텐, 금, 백금, 유사 금속으로 제조된다. 미세투사 충격의 장점은 원형질체의 분리(Cristou et al., 1988, Plant Physiol., 87:671-674,) 또는 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염의 민감성이 요구되지 않는다는 점이다. 가속화에 의한 DNA를 옥수수 세포로 전달하는 방법의 전형적인 구체예는 Biolistics Particle Delivery System인데, 이는 DNA 또는 세포로 피복된 입자를 스크린을 통하여 현탁 배양된 옥수수 세포로 덮인 필터 표면으로 추진하는데 이용될 수 있다. 스크린은 입자를 분산시켜, 이들 입자가 큰 응집체 형태로 수용자 세포에 전달되지 않도록 한다. 충격을 위하여, 현탁 세포는 가급적 필터 또는 고체 배양 배지에 농축시킨다. 대안으로, 미성숙 배 또는 다른 표적 세포를 고체 배양 배지에 정렬시킨다. 충격된 세포는 미세투사 중단 플레이트 아래에 적절한 거리로 이격된다. 충격 형질전환에서, 충격 배양 조건과 충격 모수를 최적화함으로써 최대치의 안정적인 형질전환체를 산출할 수 있다. 충격을 위한 물리적 모수와 생물학적 모수가 이런 기술에 중요한다. 물리적 인자는 DNA/미세투사 침전물의 조작과 관련된 인자 또는 미세투사물의 비행과 속도에 영향을 주는 인자이다. 생물학적 인자는 충격 이전과 직후에 세포 조작에 관련된 모든 단계, 충격과 연관된 외상을 완화시키는데 도움을 주는 표적 세포의 삼투압 조정, 형질전환 DNA(가령, 선형화된 DNA 또는 완전한 초나선 플라스미드)의 특성 등이다.

아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 전이는 외래 DNA를 식물 세포로 도입하는데 폭넓게 이용되는 시스템인데, 그 이유는 DNA가 전체 식물 조직에 도입되어, 원형질체로부터 완전한 식물을 재생시킬 필요가 없기 때문이다. DNA를 식물 세포로 도입하기 위한 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 식물 통합 벡터의 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다(참조: Fraley et al., 1985, Biotechnology, 3:629; Rogers et al., 1987, Meth. in Enzymol., 153:253-277). 더 나아가, Ti-DNA의 통합은 극소수의 재배치를 유발하는 상대적으로 정확한 공정이다. 전달되는 DNA의 영역은 경계 서열에 의해 정의되고, 개입 DNA는 일반적으로, Spielmann et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 205:34; Jorgensen et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 207:471에 기술된 바와 같이 식물 게놈으로 삽입된다.

현재의 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질전환 벡터는 대장균(E. coli) 및 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 복제할 수 있고, 간편한 조작이 가능하다. 게다가, 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 유전자 전이를 위한 벡터에서 최근의 기술적 진보로 인하여, 벡터에서 유전자와 제한 부위의 정렬이 개선되어 다양한 단백질 또는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 벡터의 작제가 용이해졌다. 삽입된 폴리펩티드 코딩 유전자의 직접적인 발현을 위하여 프로모터와 폴리아데닐화 부위가 측면에 위치하는 간편한 다중-링커 영역이 본 발명에 적합하다. 이에 더하여, 무장된 Ti 유전자와 무력화된 Ti 유전자 모두를 보유하는 아그로박테리움(Agrobacterium)이 형질전환에 이용될 수 있다.

식물 원형질체의 형질전환은 칼슘 인산염 침전, 폴리에틸렌 글리콜 처리, 전전기천공, 이들 처리의 조합에 기초한 방법을 이용하여 달성할 수 있다(참조: Potrykus et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199:183; Marcotte et al., Nature, 335:454, 1988). 서로 다른 식물 종에 이들 시스템의 적용은 원형질체로부터 특정 종을 재생시키는 능력에 좌우된다.

식물 세포가 일단 형질전환되고 선별되고 항원 발현이 조사되면, 일부 경우에 전체 수정 식물을 재생시키는 것이 가능하다. 이는 선택된 식물 종에 상당 부분 좌우된다. 다수의 식물 종을 재생시키는 방법은 기존 문헌에서 보고되었고 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 실시를 위하여, 전반적으로 지루한 재생 단계를 피하면서 신속하게 배양하고 규모를 확대할 수 있는 식물 세포주를 형질전환하는 것이 바람직하다. 이에 더하여, 식물 세포 배양액의 이용은 현장 생산을 피하고 유전자 누출(gene escape)과 식품 오염의 가능성을 현저하게 감소시킨다. 담배 현탁 세포 배양액, 예를 들면, NT-1과 BY-2(An, G., 1985 Plant Physiol. 79, 568-570)가 선호되는데, 그 이유는 이들 세포주가 배양중의 처리에 특히 민감하고 쉽게 형질전환되며 안정적으로 통합되고 냉동보존(cryopreservation)이 용이하기 때문이다.

담배 현탁 세포주, NT-1은 본 발명의 실시에 적합하다. NT-1 세포는 황색종 연초(Nicotiana tabacum L.cv. bright yellow) 2로부터 처음 개발되었다. NT-1 세포주는 폭넓게 이용되고 쉽게 입수할 수 있다; 하지만, 임의의 담배 현탁 세포주가 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 주목할 점은 NT-1 세포주의 기원이 분명하지 않다는 점이다. 게다가, 상기 세포주는 배양 조건에 따라 변하는 것으로 보인다. 아래의 실시예에 사용하기 적합한 NT-1 세포는 수탁 번호 ATCC No. 74840하에 American Type Culture Collection으로부터 입수가능하다(참조: US Pat No 6,140,075).

실험실-규모 교반 플라스크에서부터 수천 리터 생물반응기 용기까지 많은 식물 세포 배양 기술과 시스템이 보고되었고 식물 세포 배양 분야에 널리 공지되어 있다(참조: Fischer, R. et al, 1999 Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 109 112; Doran, P., 2000 Current Opinions in Biotechnology 11, 199-204). 형질전환된 식물 세포를 원하는 부피로 배양한 이후, 이들은 채집하고 부드럽게 세척하며 초음파처리를 위한 적절한 완충액에 위치시킨다. 다양한 완충액이 본 발명에 적합하다. 일반적으로, 완충액은 임의의 세정제를 함유하지 않는 중성 또는 거의 중성 pH 값에서 수성 등장성 완충된 염 용액이다. 바람직한 완충액은 둘베코 인산염 완충액 및 1 mM EDTA를 함유하는 PBS이다.

초음파처리를 위하여, 세척된 세포는 대략 0.01 gm/㎖ 내지 대략 5.0 gm/㎖, 바람직하게는 대략 0.1 gm/㎖ 내지 대략 0.5 gm/㎖(완충액 용적당 세척된 습식 중량 세포) 범위로 완충액에 집어넣는다. 다양한 상업적으로 가용한 초음파처리 장치가 본 발명에 이용될 수 있고, 초음파처리 시간은 대략 5 내지 대략 20초, 바람직하게는 대략 15 내지 대략 20초이다. 생성된 입자는 수 마이크론 내지 수백 마이크론 크기를 보유하고 재조합 면역보호성 고정된 단백질을 노출시키는 막 소포이다.

목적하는 면역보호제 또는 항원은 당분야에 널리 공지되고 아래의 실시예에 기술된 방법에 따라 발현되고 분리된다.

한 구체예에서, 목적하는 항원을 생산하는 방법은 상기 항원을 인코딩하는 벡터를 포함하는 외래유전자도입 식물을 제조하는 단계로 구성된다. 식물은 식물의 성숙 개시에 앞서 상기 식물이 항원을 발현하는 조건하에 배양된다. 본 구체예에서, 식물은 성숙하는 열매를 보유한다(토마토, 바나나, 감귤류, 멜론, 딸기, 파인애플, 핵과, 망고, 호박, 스쿼시 등). 상기 방법에 따라 생산된 항원은 투여에 앞서 식물, 또는 식물의 열매로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 항원은 식물로부터 분리되지 않고 가공되지 않은, 식품-가공된 또는 원료 형태로 투여된다. 이런 방법의 상세는 아래의 실시예에서 기술한다.

본 발명에 유용한 식물

본 발명은 또한, 본 발명의 구조체로 형질전환된 외래유전자도입 식물을 제시한다. 본 발명의 실시에 이용될 수 있는 식물은 쌍떡잎과 외떡잎식물이다. 여기에는 담배, 토마토, 감자, 가지, 페피노(pepino), 참마, 콩, 완두, 사탕무(sugar beet), 상추, 단고추(bell pepper), 셀러리, 당근, 아스파라거스, 양파, 포도나무, 머스크멜론, 딸기, 쌀, 해바라기, 평지씨/캐놀라, 밀, 귀리, 옥수수, 목화, 호두나무, 가문비나무/구과 식물, 포플러와 사과, 딸기, 장과, 예를 들면, 딸기와 나무딸기, 알파파, 바나나 등이 포함된다. 인간에 의해 식품으로 소비되거나 동물 사료의 성분으로서 대부분의 식용 식물은 쌍떡잎식물이기 때문에 쌍떡잎식물이 전형적으로 이용되지만, 외떡잎식물 형질전환 역시 동물 사료에 유용한 특정 곡물의 생산에 이용될 수 있다. 특히, 인간 유아에서 특정 질환을 예방하기 위하여, 토마토, 콩, 당근과 같은 인간에게 투여하기 용이한 주스, 또는 우유 형태로 백신을 생산하는 것이 바람직하다. 이들 식물 백신으로부터 유래된 세포와 종자 역시 본 발명에 유용하다.

이런 시스템으로 형질전환된 대표적인 식물 및 대표적인 참고문헌은 표 A에 기재한다. 가공되면 분리된 단백질을 제공할 수 있는 식용 부분을 보유하는 다른 식물은 동일한 방법 또는 이의 통상적인 변형으로 형질전환시킬 수 있다.

[표 A]

식물 참고문헌

담배 Barton, K. et al.,(1983) Cell 32, 1033

토마토 Fillatti, J. et al.,(1987) Bio/Technology 5, 726-730

감자 Hoekema, A. et al.,(1989) Bio/Technology 7: 273-278

가지 Filipponee, E. et al.,(1989) Plant Cell Rep. 8: 370-373

페피노 Atkinson, R. et al.,(1991) Plant Cell Rep. 10: 208-212

참마 Shafer, W. et al.,(1987) Nature. 327:529-532

콩 Delzer, B., et al.,(1990) Crop Sci. 30: 320-322

완두 Hobbs, S. et al.,(1989) Plant Cell Rep. 8: 274-277

사탕무 Kallerhoff, J. et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9: 224-228

상추 Michelmore, R., et al.,(1987) Plant Cell Rep. 6: 439-442

단고추 Liu, W. et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9: 360-364

셀러리 Liu, C-N. et al.,(1992) Plant Mol. Biol. 1071 - 1087

당근 Liu, C-N. et al,(1992) Plant Mol Biol. 1071- 1087

아스파라거스 Delbriel, B. et al.,(1993) Plant Cell Rep. 12: 129-132;

양파 Dommisse, E. et al.;(1990) Plant Sci. 69:249-257

포도나무 Baribault, T., et al.,(1989) Plant Cell Rep. 8: 137- 140

머스크멜론 Fang, G., et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9: 160-164

딸기 Nehra, N. et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9: 10-13

쌀 Raineri, D. et al.,(1990) Bio/Technology. 8: 33-38

해바라기 Schrammeijer, B. et al.,(1990) Plant Cell Rep. 9:55-60

평지씨/캐놀라 Pua, E. et al.,(1987) Bio/Technology 5. 815

밀 Mooney, P. et al.,(1991) Plant Cell Tiss. Organ Cult. 25:209-218

귀리 Donson, J. et al.,(1988) Virology. 162: 248-250

옥수수 Gould, J. et al.,(1991) Plant Physiol. 95: 426-434

알파파 Chabaud, M. et al.,(1988) Plant Cell Rep. 7: 512-516

목화 Umbeck, P. et al.,(1987) Bio/Technology. 5:263-266

호두나무 McGranahan, G. et al.,(1990) Plant Cell Rep. 8:512-516

가문비나무/ Conifer Ellis, D. et al.,(1989) Plant Cell Rep. 8: 16-20

구과 식물

포플러 Python, F. et al.,(1987) Bio/Technology 5:1323

사과 James, P. et al.,(1989) Plant Cell Rep. 7:658-661

상기한 벡터로 형질전환된 외래유전자도입 식물은 본 발명의 다른 특징이다.

감자 품종 FL 1607(“Frito Lay 1607”)과 Desiree 및 토마토 품종 Tanksley TA234TM2R은 특히 바람직한 품종인데, 이들은 본원에 기술된 방법을 이용하여 2원 벡터로 형질전환되었다. 이들 형질전환된 품종 중에서, Desiree는 유일하게 상업용 품종이다; 다른 품종은 Frito-Lay(Rhinelander, WI)와 Steve Tanksley(Dept. of Plant Breeding, Cornell Univ.)로부터 입수할 수 있다. 감자 품종 FL1607은 신속한 형질전환이 가능하지만 중공(hollow heart)이 발생한다는 점에서 우수한 작물 품종은 아니다.

토마토는 유전자 형질전환이 용이하고, 열매-특이적 성숙 의존한 프로모터가 조절된 발현에 가용하기 때문에 외래 단백질의 발현을 위한 모델 시스템으로서 선호된다(Giovannoni et al., 1989).

본 발명은 본 발명의 적어도 한가지 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 전체 식물, 식물 세포, 식물 기관, 식물 조직, 식물 종자, 원형질체, 유합조직, 세포 배양액, 구조적 및/또는 기능적 단위로 체계화된 임의의 식물 세포군을 포괄한다. 적절하게는, 전체 식물, 식물 세포, 식물 기관, 식물 조직, 식물 종자, 원형질체, 유합조직, 세포 배양액, 임의의 식물 세포군은 전체 가용성 식물 물질 g당 0.001, 0.01, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 또는 1000 ㎍의 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생산한다.

본 발명에 따른 백신의 용법, 용량, 투여

식용 식물 생산된 항원은 백신 제조를 위하여 동물-공급된 성분을 요하지 않는 저렴한 항원 공급원을 제공한다.

본 발명에 따른 백신은 목적 병원균 및 바이러스 감염으로부터 보호에 유효하다.

1. 투여

본 발명은 본 발명에 따른 백신을 포유동물에 투여하여 바이러스 감염을 예방하는 방법을 제시한다.

한 구체예에서, 백신은 비용과 편의의 이점뿐만 아니라 점막 면역 반응을 확실하게 유도하기 위하여 경구(급식으로 또는 경구 위관 영양으로) 투여된다. 간편하게, 경구 투여 단계는 본 발명에 따른 외래유전자도입 식물 또는 식물의 일부분을 소비하는 단계를 수반한다. 본 발명에 따른 식용 백신은 식물의 일부분, 추출액, 주스, 액체, 분말 또는 정제 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 백신은 비강 스프레이 형태로 비강내 경로를 통하여 투여될 수도 있다. 대안으로, 본 발명에 따른 백신은 경구, 복강내, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여될 수도 있다.

본 발명은 생리학적으로 양립하는 담체와 혼합된 식용 백신을 함유하는 조성물을 제시한다. 본 명세서에서, “생리학적으로 양립하는 담체”는 물, 인산염 완충액, 또는 염수와 같은 생리학적으로 수용가능한 희석제를 의미하고, 보조약을 추가로 함유할 수 있다. 불완전 Freund 보조약, 알루미늄 인산염, 수산화알루미늄, 또는 명반과 같은 보조약은 당분야에 널리 공지된 물질이다.

또한, 본 발명은 제약학적 조성물을 제시한다. 활성 성분 이외에, 이들 제약학적 조성물은 제약학적으로 이용될 수 있는 적절한 제약학적으로 수용가능한 담체 제조물을 함유한다.

경구 투여용 제약학적 조성물은 경구 투여에 적합한 용량에서 당분야에 널리 공지된 제약학적으로 수용가능한 담체를 이용하여 조제할 수 있다. 이런 담체는 제약학적 조성물이 환자 섭취를 위한 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 조제될 수 있도록 한다.

경구용 제약학적 조성물은 활성 성분과 고체 부형제를 조합하고, 선택적으로 생성 혼합물을 분쇄하고, 원하는 경우 적절한 보조제를 첨가한 이후 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 제조함으로써 수득할 수 있다. 적절한 부형제는 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 솔비톨을 비롯한 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 유래된 전분; 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 또는 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스; 아라비아 검과 트래거캔스를 비롯한 검; 젤라틴과 콜라겐과 같은 단백질이다. 원하는 경우에, 붕해제 또는 안정제, 예를 들면, 가교-결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 알긴산, 또는 이의 염, 예를 들면, 나트륨 알기네이트를 첨가할 수 있다.

당의정 코어는 농축된 당 용액과 같은 적절한 코팅을 제공하는데, 이들 코팅은 아라비아 검, 활석, 폴리비닐피롤리돈, 카보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화티타늄, 래커 용액, 적절한 유기 용제 또는 용제 혼합물 역시 함유할 수 있다. 산물 확인을 위하여 또는 활성 화합물의 용량을 특성화하기 위하여 물감 또는 색소를 정제 또는 당의정에 첨가할 수 있다.

경구 투여될 수 있는 제약학적 제조물에는 젤라틴 및 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 코팅으로 구성되는 밀봉된 연성 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 구성되는 푸시-핏(push-fit) 캡슐이 포함된다. 푸시-핏 캡슐은 충전제 또는 결합제, 예를 들면, 락토오스 또는 전분, 윤활제, 예를 들면, 활성 또는 스테아르산마그네슘, 선택적으로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연성 캡슐에서, 활성 화합물은 안정제와 함께 또는 안정제 없이, 적절한 액체, 예를 들면, 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 부유된다.

장관외 투여용 제약학적 조성물에는 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 주사를 위하여, 본 발명의 제약학적 조성물은 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 양립하는 완충액, 예를 들면, Hank 용액, 링거액, 또는 생리학적 완충액에서 조제된다. 수성 주사 현탁액은 이런 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 솔비톨, 또는 덱스트란을 함유한다. 부가적으로, 활성 용제 또는 운반제의 현탁액은 지방 오일, 예를 들면, 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 함유한다. 선택적으로, 현탁액은 적절한 안정제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 약물을 또한 함유한다.

비강 투여를 위하여, 투과되는 특정 장벽에 적합한 침투제가 조제에 사용된다. 이런 침투제는 당분야에 널리 공지되어 있다.

2. 제조와 저장

본 발명의 제약학적 조성물은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정-제조, 유화, 캡슐화, 피포 또는 냉동건조 공정으로 제조될 수 있다.

염으로 제공되는 제약학적 조성물은 염산, 황산, 아세트산, 젖산, 주석산, 사과산, 숙신산 등과 같은 다수의 산으로 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태인 수성 또는 다른 친양자성 용제에서 더욱 용해된다. 다른 경우에, 바람직한 제조물은 4.5 내지 5.5의 pH 범위에서 1 mM - 50 mM 히스티딘, 0.1% - 2% 수크로오스, 2% - 7% 만니톨에 담긴 냉동건조 분말인데, 이는 사용에 앞서 완충액과 혼합된다.

수용가능한 담체에서 조제된 본 발명의 화합물을 함유하는 제약학적 조성물을 제조한 이후, 이들 조성물은 적절한 용기에 넣고 지정된 질환의 치료를 위한 투여 용량, 빈도, 방법과 같은 정보를 표시할 수 있다.

3. 치료 효과량

본 발명에 사용하기 적합한 제약학적 조성물에는 의도된 목적을 달성하는 효과량으로 활성 성분이 함유된 조성물이 포함된다. 효과량의 결정은 당업자의 능력 범위에 속한다.

임의의 화합물에서 치료 효과량은 세포 배양 검사, 또는 동물 모델, 일반적으로, 조류, 생쥐, 토끼, 개 또는 돼지에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델은 원하는 농도 범위와 투여 경로를 달성하는 데에도 이용된다. 이후, 이런 정보를 활용하여 인간에게 적합한 투여 용량과 경로를 결정할 수 있다.

치료 효과량은 예로써 바이러스 감염에 의해 유발된 증상 또는 이상을 예방하거나 완화시키는 단백질 또는 이의 항체, 길항제, 또는 저해제의 함량을 의미한다. 이런 화합물의 치료 효능과 독성은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준 제약학적 절차, 예를 들면, ED50(개체군의 50%에 치료 효과적인 용량)과 LD50(개체군의 50%를 치사시키는 용량)으로 결정할 수 있다. 치료 효과와 독성 효과 사이의 용량 비율은 치료 지수이며, 비율 LD50/ED50으로 표시될 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 제약학적 조성물이 선호된다. 세포 배양 검사와 동물 연구로부터 획득된 데이터는 인간에게 적합한 용량 범위를 결정하는데 이용된다. 이들 화합물의 용량은 전혀(또는 거의) 독성 없이 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 위치한다. 용량은 투여량, 환자의 감수성, 투여 경로에 따라 상기 범위에 변한다.

정확한 용량은 치료되는 환자에 맞게 개별 의사 또는 수의사에 의해 선택된다. 용량과 투여는 충분한 수준의 활성 부분을 제공하거나 원하는 효과를 유지하기 위하여 조정된다. 고려해야 하는 추가적인 인자는 질병 상태의 심각도; 개체의 연령, 체중, 성별; 식이, 투여 시간과 빈도, 약물 조합, 반응 감수성, 내성/치료 반응 등이다. 장기간 작용하는 제약학적 조성물은 특정 제제의 반감기와 청소율에 따라, 매 3-4일 간격, 매주 간격, 또는 격주 간격으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 조성물은 사용되는 조성물의 원하는 용량과 유형에 따라, 전체에서 대략 0.5% 내지 50%의 화합물을 함유한다. 하지만, 화합물의 양은 효과량, 다시 말하면, 치료를 필요로 하는 개체에 원하는 용량을 제공하는 각 화합물의 함량으로 최적 정의된다. 부속적인 조합의 활성은 조성물의 특성에 좌우되지 않는데, 그 이유는 상기 조성물이 편의와 경비 절감의 목적으로만 선택되고 조제되기 때문이다. 임의의 조합이 원하는 형태의 조성물로 조제될 수 있다.

투여 경로에 따라, 재조합 단백질, 형질전환된 식물 세포, 또는 형질전환된 외래유전자도입 식물의 용량은 일일 개체당 0.1 내지 100,000 ㎍, 예를 들면, 일일 개체당 1 ㎍, 10 ㎍, 100 ㎍, 500 ㎍, 1 ㎎, 1O ㎎, 또는 최대 1 g의 전체 용량이 된다. 한 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 1 ng 내지 0.5 ㎎이다. 다른 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 1 ㎍ 내지 50 ㎍이다. 다른 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 1 내지 25 ㎍이다. 다른 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 2 내지 25 ㎍이다. 다른 구체예에서, 용량은 체중 ㎏당 2 내지 15 ㎍이다. 가령, 한 구체예에서, HN 항원은 2.5 내지 5 ㎍의 범위에서 피하 투여되고, IN은 0.5 내지 12 ㎍의 범위에서 안구 투여된다; HA 항원은 1 내지 5 ㎎의 범위에서 피하 투여되고, IN은 24 내지 26 ㎍의 범위에서 안구 투여된다; VP2 항원은 8 내지 17 ㎍의 범위에서 피하 투여되고, LT 항원은 50 내지 100 ng의 범위에서 경구, 2 내지 1O ㎍의 범위에서 피하투여되고, IN은 2 내지 10 ㎍의 범위에서 안구 투여된다; 특정 용량과 전달 방법에 관한 보도는 기존 문헌에서 제공된다(참조: U.S. Patent No. 4,657,760; 5,206,344; 5,225,212). 단백질 또는 이들의 저해물질에서보다는 뉴클레오티드에 대하여 상이한 제제가 이용된다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 조건, 위치 등에 특이적이다.

본 발명에 따른 백신의 효능 검사

본 발명에 따른 백신의 효능은 백신의 투여가 치료되거나 예방되는 바이러스 감염 증상, 또는 목적 병원균에 의해 유발되는 질환의 증상을 적어도 5%, 바람직하게는 10-20%, 더욱 바람직하게는 25-100% 예방하거나 완화시킨다는 것을 예증함으로써 결정된다.

본 발명에 따른 백신의 효능은 목적하는 식물 유래된 단백질을 이용한 백신접종에 따른 항체 생산을 측정하고; 목적하는 식물 유래된 단백질을 이용한 백신접종에 따른 항체 생산을 검출하고, 여기서 상기 항체는 혈구응집을 제거하고; 접종되고, 이후 본 발명의 면역보호성 항원을 포함하는 백신으로 공격된 개체의 치사율을 평가함으로써 결정된다.

본 발명을 전반적으로 기술하였기 때문에, 실례의 목적으로 제공되고 달리 명시하지 않는 경우에 본 발명의 범위를 한정하지 않는 아래의 실시예를 참조하면 본 발명은 더욱 명확하게 이해된다.

실시예 1: 벡터

유전자 작제: NDV 균주 “Lasota”(GenBank 수탁 AF077761)의 HN 유전자의 코딩 서열은 코돈 사용빈도 및 의사 mRNA 가공과 불안정, 또는 게놈 DNA의 메틸화를 매개할 수 있는 원치않는 서열 모티프의 존재를 분석하였다(참조: Adang MJ, Brody MS, Cardineau G. Eagan N. Roush RT, Shewmaker CK, Jones A, Oakes JV, McBride KE(1993) The construction and expression of Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in protoplasts and potato plant. Plant Mol. Biol 21:1131-1145). 식물-최적화된 코딩 서열은 토마토와 감자 코돈 사용빈도를 반영하는 하이브리드 코돈 차등으로 설계하였다(Ausubel F., et al., eds.(1994)Current Protocols in Molecular Biology, vol. 3, p. A.1C.3 Haq TA, Mason HS, Clements JD, Arntzen CJ(1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science 268:714-716). 설계된 서열은 도 1에 도시한다. 합성 HN 유전자는 상업적 공급업체(Retrogen)에 의해 조합되고, pCR-Blunt에 클론된 유전자의 5'(p4187-4203-1) 또는 3'(p42111-4235-1c-1) 절반을 보유하는 2개의 독립된 플라스미드에 수용되었다.

플라스미드 작제: 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 식물 형질전환을 위한 이원 벡터는 도 2에 도시된 벡터 pBBV-PHAS-iaaH에 기초하여 작제하였는데, 이는 US 특허 5,879,903; 5,637,489; 5,276,268; 5,273,894에 기술된 식물 선별 마커 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(PAT)를 이용하고 WO 97/48819에 기술된 구조성 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(CsVMV)에 의해 구동된다. iaaH 유전자와 파세올린 프로모터 서열은 PacI으로 pBBV-PHAS-iaaH의 절단으로 결실시키고 재결찰시켜 pCVMV-PAT를 형성하였다; 이후, Klenow 효소로 충전함으로써 단일 HindIII 부위를 결실시키고 재결찰시켜 pCP!H를 형성하였다. 상기 CsVMV 프로모터는 주형 pCP!H에서 프라이머 CVM-Asc(5'-ATGGCGCGCCAGAAGGTAATTATCCAAG SEQ ID NO: 5)와 CVM-Xho(5'-ATCTCGAGCCATGGTTTGGATCCA SEQ ID NO: 6)를 이용한 PCR로 말단-맞춤하고, 산물은 EcoRV-절단되고 T-꼬리 pBluescriptKS에 클론하여 pKS-CVM7를 만들었다. pCP!H의 유전자 지도는 도 3에 도시한다. HN 발현 카세트 pKS-CHN은 벡터 pKS-CVM7/NcoI-EcoRI와 3개의 삽입체 단편을 결찰시켜 작제하였다: NcoI/PstI에서 HN 5' 절반, PstI/KpnI에서 HN 3' 절반, KpnI-EcoRI(Haq 1995)에서 콩 vspB 3' 요소. 이후, 이원 T-DNA 벡터 pCHN은 벡터 pCP!H/AscI-EcoRI 및 pKS-CHN의 AscI-EcoRI 단편의 결찰로 조합하였다. pCHN의 유전자 지도는 도 4에 도시한다.

US Pat No. 5,824,798에 기술된 과립 결합된 전분 합성효소(GBSS) 프로모터를 이용하여 다른 벡터를 만들었다. 이들 구조체는 중국 감자 재배종 “Dongnong”에 대한 GenBank 수탁 X83220 서열로부터 설계된 프라이머를 이용하여 영향 감자(Solanum tubersum L. cv)“Desiree”의 게놈 DNA로부터 증폭된 프로모터 단편을 이용하여 만들었다. -1800 bp에서 5' 영역에 상보적인 전방 프라이머 “GSS-1.8F”(5'-gatctgacaagtcaagaaaattg SEQ ID NO:8)와 함께, 돌연변이 프라이머 “GSS-Nco”(5'-tgccatggtgatgtgtggtctacaa SEQ ID NO:7)를 이용하여 번역 개시 코돈과 부분적으로 겹치는 Nco I 부위를 발생시켰다; 1825 bp PCR 산물은 T-꼬리 pBluescriptKS에 클론하여 pKS-GBN를 만들고 서열분석하였다. 프라이머 “GSS-1.8F”와 함께, 돌연변이 프라이머 “GSS-Xho”(5'-agctcGAGCTGTGTGAGTGAGTG SEQ ID NO:9)를 이용하여 전사 개시 부위의 인접 3' 영역에Xhol 부위를 발생시켰다; 1550 bp PCR 산물은 T-꼬리 pBluescriptKS에 클론하여 pKS-GBX를 만들고 서열분석하였다.

US Pat No. 5,891,665에 기술된 TEV 5'UTR(비번역 영역)을 보유하는 GBSS 프로모터 발현 카세트는 HindIII/XhoI로 절단된 벡터 pTH210과 pKS-GBX의 HindIII/XhoI 단편의 결찰로 조합하였는데, 이는 CaMV 35S 프로모터의 811 bp GBSS 프로모터로의 치환을 유도하여 pTH252A를 만들었다(참조: Haq TA, Mason HS, Clements JD, Arntzen CJ(1995) Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants. Science 268:714-716). HN 유전자는 NcoI/PstI에서 HN 5' 절반과 PstI/KpnI에서 HN 3' 절반으로 결찰로 pTH252A/NcoI- KpnI에 삽입하고 pHN252A를 만들었다. 이원 T-DNA 벡터 pgHN은 NsiI과 EcoRI로 절단된 벡터 pGLTB(도 11) 및 단편 pHN252A/NsiI-KpnI과 pTH210/KpnI-EcoRI의 결찰로 만들었다. pgHN의 유전자 지도는 도 5에 도시한다.

US Pat No. 5,824,798에 기술된 GBSS 5'UTR을 보유하는 GBSS 프로모터 발현 카세트는 HindIII/NcoI로 절단된 벡터 pTH210(Haq 1995)과 pKS-GBN의 HindIII/NcoI 단편의 결찰로 조합하였는데, 이는 CaMV 35S 프로모터/TEV 5'UTR의 1084 bp GBSS 프로모터/5'UTR로의 치환을 유도하여 pTH251A를 만들었다. 이원 T-DNA 벡터 pgHN151은 pCLT105(도 12) 및 단편 pTH251A/HindIII-NcoI과 pHN252A/NcoI-KpnI의 결찰로 만들었다. pgHN151의 유전자 지도는 도 6에 도시한다.

인트론과 콩 파세올린 3' 요소와 함께 GBSS 5'UTR을 보유하는 GBSS 프로모터 발현 카세트(US 특허 5,270,200; 6,184,437; 6,320,101)를 작제하였다. 먼저, pCP!H는 유일 KpnI 부위에서 절단하고 T4 DNA 중합효소로 평활말단을 발생시키며 재결찰시켜 pCP!HK를 만들었는데, 이는 KpnI 부위가 결실된다. pCP!HK는 NsiI로 절단하고, 이후 T4 DNA 중합효소로 평활말단을 발생시키며 PacI로 절단하였다. 생성 벡터는 SacI로 절단된 pgHN151로부터 2848 bp 단편으로 결찰시키고, 이후 T4 DNA 중합효소로 평활말단을 발생시키고 PacI로 절단하여 pgHN153을 만들었다. pgHN153의 유전자 지도는 도 7에 도시한다.

키메라 구조성 프로모터(40CS△MAS US 특허 5,001,060; 5,573,932; 5,290,924)를 이용하여 HN에 대한 다른 발현 벡터를 작제하였다. 플라스미드 pAGM149는 EcoRV로 절단하고 BamHI로 부분 절단하였다. 상기 단편은 PmeMstI로 절 단된 pCHN 및 BamHMstI로 pKS-CHN의 절단으로 수득된 합성 HN 유전자의 5' 절반과 결찰시켰다. 생성된 pMHN은 도 8에 도시한다.

AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)의 HA 유전자를 보유하는 플라스미드는 David Suarez(SEPAL, Athens, GA)로부터 수득하였다. 이는 PCR로 말단-맞춤하여 5'와 3' 말단에 각각 제한 부위 NcoI과 KpnI를 부가하고, 35S 프로모터, TEV 5'-UTR, vspB 3' 말단을 보유하는 벡터 pIBT210.1(Haq et al., 1995)에 삽입시켰다. 발현 카세트는 HindIII과 EcoRI(부분) 절단으로 이원 벡터 pGPTV-Kan(Becker et al., Plant Mol. Biol 1992; 20: 1195-7)에 이전하여 pIBT-HAO를 만들었다. pIBT-HAO로부터 HA 유전자/vspB3' 말단 단편은 NcoI과 EcoRI(부분) 절단으로 수득하고 pKS-CVM7에 삽입하여 pKS-CHA를 만들었다. CsVMV 프로모터, HA 유전자, vspB3' 말단을 보유하는 카세트는 AscI과 EcoRI(부분) 절단으로 pKS-CHA로부터 수득하고 pCP!H와 결찰시켜 pCHA(도 9)를 만들었다.

NDV HN의 식물-최적화된 뉴클레오티드 서열을 보유하는 쌍떡잎식물 발현 벡터를 작제하였다. 완성된 구조체는 아래의 유전자 카세트를 보유하였다; 이원 발현 벡터에서 아기장대(Arabidopsis thaliana)(At) 유비퀴틴 3(Ubi3) 프로모터 v2/ 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌 뉴우라미니다아제(NDV-HN)/ vspb 3'UTR:: 카사바 베인 모자이크 바이러스(CsVMV) 프로모터/ PAT 선별가능 마커/ 아기장대(Arabidopsis thaliana)(At) ORE 25 3'UTR.

상기 발현 카세트는 3-원 결찰을 완결함으로써 조합하였다(도48). 이원 벡터 pCGUS는 CsVMV 프로모터와 GUS 유전자를 제거함으로써 변형하였다. 효소 HindIII과 KpnI(New England Biolabs)을 이용한 제한 효소 절단으로 8310 bp의 DNA 단편을 유리시켰다. NDV-HN 유전자는 1731 bp의 NcoI/ KpnI(New England Biolabs) 제한 효소 절단 DNA 단편으로서 플라스미드 pCHN로부터 분리시켰다. 최종적으로, AtUbi3 프로모터 v2는 NcoI / HindIII(New England Biolabs) 제한 효소 절단체로서 pDAB7121로부터 분리시켰다. 생성 반응으로 1732 bp의 DNA 단편을 산출하였다. 이들 3가지 효소 절단의 DNA는 “QiaexII 겔 추출 키트”(Qiagen)를 통하여 아가로스 겔로부터 절개하였다. 3-원 결찰은 동몰 농도의 3가지 DNA 단편을 이용하여 완결하였다. 결찰은 “T4 DNA Ligase”(New England Biolabs)로 촉매하였다. 생성된 결찰 산물은 “One Shot Top1O 화학 적격 대장균(E. coli)”(Invitrogen)에 형질전환시켰다. 2개의 콜로니는 상시 형질전환체로부터 분리하였다. 제한 효소 절단을 통항 최초 스크리닝은 양 클론이 예상된 DNA 띠 패턴을 산출한다는 것을 지시하였다. 이들 제한 효소 반응은 아래의 효소를 이용하여 완결하였다; EcoRV, FspI, HindIII, NcoI, SacI, ScaI(New England Biolabs). 정확한 구조체의 추가적인 확인은 AtUbi 3' 프로모터 v2/ NDV-HN 경계에서 염기서열 반응을 수반하였다. 프라이머 pUHN2(tag ttg gag cct egg gta ct)와의 염기서열 반응은 “Beckman CEQ Quick Start Kit”(Beckman Coulter)를 이용하여 완결하였다. 이런 염기서열 반응의 결과는 AtUbi3' 프로모터 v2 DNA 단편이 의도된 NcoI 제한 부위에서 NDV-HN DNA 단편과 결찰된다는 것을 지시하였다. NDV-HN / pCGUS 경계와 pCGUS / AtUbi3' 프로모터 v2 경계를 교차하는 염기서열 반응은 추가적인 단계를 요하였다. 양 경계의 PCR 반응을 완결하였다. NDV-HN / pCGUS 경계와 pCGUS/ AtUbi3'프로모터 v2 경계는 “FailSafe PCR Kit”(Epicenter)를 이용하여 PCR 증폭하였다. NDV-HN / pCGUS 경계의 2가지 반응은 PCR 프라이머 KpnI 5'(act aat act taa tga taa ca)와 KpnI 3'(ata cac tac ctc cac atg tt)와 함께 FailSafe 완충액 B와 C를 이용하여 완결하였다. pCGUS / AtUbi3' 프로모터 v2 경계의 PCR 반응은 PCR 프라이머 HindIII 5'(tgccggttttcaggtaac ata)와 HindIII 3'(agt tag gcc cga ata gtt tga a)와 함께 FailSafe 완충액 B와 C를 이용하여 완결하였다. 모든 PCR 반응에서 예상된 길이(600bp)의 DNA 단편이 산출되었다. 경계 영역의 PCR 증폭물은 “pCR2.1-TOPO를 포함하는 TOPO TA 클로닝 키트”(Invitrogen)에 클론하였다. 증폭된 경계 영역을 보유하는 클론은 EcoRI 제한 효소 절단(New England Biolabs)을 통하여 확인하였다. 이들 경계 접점에서 의도된 결찰이 달성되었는 지를 확증하기 위하여, M13 역 염기서열 프라이머(aac agc tat gac cat g)와 함께 “Beckman CEQ Quick Start Kit”(Beckman Coulter)를 이용하여 염기서열 반응을 완결하였다. 이들 염기서열 반응의 결과는 정확한 결찰 반응이 pCGUS/ NDV-HN과 pCGUS/ At Ubi 3 프로모터 v2 경계에서 달성된다는 것을 지시하였다.

실시예 2: 외래유전자도입 황색종 연초( Nicotiana tabacum )의 제조

형질전환 3-4일전에, 1주된 NT-1 배양액은 2 ㎖ NT-1 배양액을 40 ㎖ NT-1 배지에 첨가함으로써 새로운 배지에 계대배양하였다. 계대배양액은 100 rpm의 교반기에서 25 ± 1℃ 암실에 유지시켰다.

NT-1 배지

시약	ℓ당
MS 염	4.3 g
MES 원액(20X)	50 ㎖
B1 이노시톨 원액(1OOX)	10 ㎖
Miller I 원액	3 ㎖
2,4-D(1 ㎎/㎖)	2.21 ㎖
수크로오스	30 g
pH 5.7± 0.03

B1 이노시톨 원액(100x)(1 ℓ)

티아민 HCl(Vit B1) - 0.1 g

MES(20x)(1 ℓ)

MES(2-N-모르폴리노에탄설폰산)- 10 g

미오이노시톨 - 10 g

Miller I(1 ℓ)

KH₂PO₄ - 60 g

목적하는 발현 벡터를 보유하는 근두암종병(Agrobacterium tumefacien)은 글리세롤 원액으로부터 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신을 함유하는 LB 배지의 평판에 스트리킹(streaking)하였다. 박테리아 배양액은 30℃에서 24 내지 48시간동안 암실에서 배양하였다. 적절하게 형성된 하나의 콜로니를 선별하고 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신을 함유하는 3 ㎖ YM 배지에 이전하였다. 액체 배양액은 OD₆₀₀이 0.5 - 0.6이 될 때까지 250 rpm의 배양 교반기에서 30℃ 암실에서 배양하였다. 이는 대략 24시간이 소요되었다.

LB 배지

시약	ℓ당
Bacto-트립톤	10 g
효모 추출액	5 g
NaCl	10 g
Difco Bacto 아가	15 g

YM 배지

시약	ℓ당
효모 추출액	400 ㎎
만니톨	10 g
NaCl	100 ㎎
MgSO4ㆍ7H2O	200 ㎎
KH2PO4	500 ㎎

(대안으로, 분말 형태의 YM은 구입할 수 있다(Gibco BRL; catalog #10090-011). 액체 배양 배지를 만들기 위하여, 11.1 g을 1 ℓ 물에 첨가한다).

형질전환 당일에, NT-1 배양액 ㎖당 1 ㎕의 20 mM 아세토시링원(acetosyringone)을 첨가하였다. 아세토시링원 원액은 형질전환 당일에 아세톤에서 제조하였다. NT-1 세포는 상처를 입혀 형질전환 효율을 증가시켰다. 상처를 발생시키기 위하여, 현탁 배양액은 10 ㎖ 구경 무균 피펫을 통하여 반복(20회)적으로 휘저었다. 4 ㎖의 현탁액은 각 10, 60 x 15 mm 페트리 평판에 이전하였다. 한 평판은 비-형질전환된 대조로서 남겨두었다. 대략 50 내지 100 ㎕의 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액을 나머지 9개의 각 평판에 첨가하였다. 이들 평판은 파라 필름(parafilm)으로 감싸고, 이후 100 rpm의 교반기에서 25 ± 1℃ 암실에서 3일동안 배양하였다.

세포는 무균 50 ㎖ 원뿔 원심분리 튜브에 이전하고 NTC 배지(500 ㎎/ℓ 카르베니실린을 함유하고 증기멸균이후 첨가되는 NT-1 배지)로 최종 부피를 45 ㎖로 만들었다. 이들은 혼합하고, 이후 스윙 버컷 로터(swinging bucket rotor)가 구비된 원심분리기에서 1000 rpm으로 10분동안 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 생성된 펠렛은 45 ㎖ NTC에 재부유시켰다. 세척은 반복하였다. 현탁액은 원심분리하고, 상층액은 버리고, 펠렛은 40 ㎖ NTC에 재부유시켰다. 5 ㎖ 분량은 NTCB10 배지(8 g/ℓ 아가/아가로 고체화되고 10 ㎎/ℓ 비알라포스(bialaphos)로 보충되며 증기멸균이후 첨가되는 NTC 배지)를 함유하는 각 페트리 평판(150 x 15 ㎜)에 도말하였다. 평판은 파라필름으로 둘러싸고, 이후 25± 1℃ 암실에 유지시켰다. 배양실로 옮기기에 앞서, 평판은 무균건조대(laminar flow hood)에서 개방하여 과량의 액체를 증발시켰다. 6 내지 8주후, 추정 형질전환체가 나타났다. 이들은 선별하고 새로운 NTCB5(8 g/ℓ 아가/아가로 고체화되고 5 ㎎/ℓ 비알라포스(bialaphos)로 보충되며 증기멸균이후 첨가되는 NTC 배지)에 이전하였다. 이들 평판은 파라필름으로 감싸고 25± 1℃ 암실에서 배양하였다.

추정 형질전환체는 비-형질전환된 사멸 세포의 배경에서 유합조직의 작은 덩어리로 나타났다. 이들 유합조직은 NTCB5 배지로 이전하고 수주동안 성장시켰다. 각 추정 형질전환체의 일부는 ELISA 분석을 위하여 선별하였다. 적어도 2회에 걸친 ELISA 분석이후, 최대 항원 수준을 보이는 세포주를 선별하였다. 이후, 각 선별 세 포주에 대한 전체 유합조직 물질은 평판 배양액 및 때로는 액체 배양액에서 증폭시켰다. 형질전환된 생성 NT-1 세포주는 뉴캐슬병 바이러스(Lasota 균주)로부터 유래된 HN 단백질을 발현하고 축적하며, 또는 형질전환된 세포주 CHA는 조류 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 HA 단백질을 발현하였다. 이들 세포주는 핵 크로모좀 DNA에 안정적으로 통합된 플라스미드의 T-DNA 영역의 확인되지 않은 숫자의 사본을 보유한다. 외래유전자도입 CHN NT-1 세포는 HN-특이적 ELISA에 의한 측정에서, 전체 가용성 단백질의 최대 1% 수준으로 HN을 축적한다.

Bialaphos® 저항성에 대하여 선별된 외래유전자도입 NT1 세포와 감자 세포주는 증식시키고 ELISA로 HN 발현을 평가하였다. 고도-발현 NT1 세포주는 액체 현탁 배양액에서 확립시켰다. 구조성 프로모터 구조체(pCHN, pMHN)를 보유하는 감자 세포주는 잎 조직에서 발현을 조사하고, 선별된 세포주는 흙으로 이전하고 온실에서 배양하여 평가를 위한 덩이줄기를 획득하였다. 덩이줄기-특이적 GBSS 프로모터 구조체(pGHN, pGHN151, pGHN153)를 보유하는 감자 세포주는 시험관내에서 발생된 미세덩이줄기를 이용하여 발현을 조사하였다.

CsVMV 프로모터를 이용한 pCHN-형질전환된 NT1 세포주에서 HN 발현.

고체 배지에서 성장하는 유합조직으로부터 검사된 NT1 세포주에서 HN의 발현은 도 19에 도시한다. 최대 발현 세포주는 CHN-5(8.5 ng/㎍ TSP)와 CHN-18(6.2 ng/㎍ TSP)이었다. 세포주 CHN-1과 CHN-5는 액체 현탁 배양액에서 확립하였다. 이들 배양액에서 단위 세포괴(cell mass)당 HN의 발현은 도 20에 도시한다. 세포주 CHN-5는 세포괴 g당 6.7 ㎍의 HN 발현을 보였다. 도 20에 도시된 동일한 세포주는 수회 평가하고, 일부 새로운 세포주에서는 마지막 시점에서, NT1 세포주에서 HN의 발현 안정성을 분석하였다(도 21). 세포주 CHN-5와 CHN-7로부터 추출물의 웨스턴 블랏팅은 단클론 항체로 탐침하는 경우에 참고 표준과 동시-이동하는 단일 반응성 띠를 보이고, 다클론 항혈청으로 탐침하는 경우에 좀더 작은 추가의 띠를 보였다(도 22).

새로운 세포의 냉동-건조와 추출물의 4℃ 보관의 효과.

항원 안정성에 대한 건조 효과를 검사하기 위하여, 냉동-건조된 NT1 세포는 추출하고 ELISA로 검사하였다. 냉동-건조된 세포의 추출물은 새로운 세포괴당 HN 함량에서 손실 또는 명백한 증가를 보이지 않았다(도 23). 더 나아가, 4℃에서 1주일동안 보관된 새로운 세포의 추출물은 ELISA로 분석된 HN 함량에서 증가를 보였다(도 23). 다른 막-결합된 바이러스 단백질, B형 간염 표면 항원에서 유사한 효과가 관찰되었다. 이는 정확한 이황화 결합을 형성하여 적절한 항원성 에피토프의 전시를 유도하는 시스테인 잔기의 산화에 기인하는 것으로 생각된다.

식물-발현된 HN항원의 입자 행동.

미립자 구조를 형성하는 NT1 세포-발현된 항원의 조합을 평가하기 위하여, 수크로오스 구배 침강을 가공되지 않은 세포 추출물에 수행하였다. 도 24에 도시된 프로필은 NT1-세포 유래된 HN이 2가지 피크의 ELISA 반응 물질을 보인다는 것을 지시한다. 한 피크는 불활화된 바이러스 입자와 함께 동시-침강되는 반면, 다른 피크는 더욱 느리게 침강되면서도 여전히 미립자 특성을 보였다. 이들 데이터는 HN 단백질이 ER 막에 정확하게 삽입된다는 증거를 제공한다.

(4Ocs)△MAS 프로모터를 이용한 pMHN-형질전환된 NT1 세포주에서 HN 발현.

pCHN-형질전환된 NT1 세포주에 비하여, pMHN으로 형질전환된 여러 NT1 세포주에서 HN 발현은 도 25에 도시한다. pMHN-형질전환된 세포주에서 발현은 적어도 pCHN-형질전환된 세포주에서만큼 높았고, HN의 최대 축적은 세포괴 g당 대략 30 ㎍에서 관찰되었다. pCHN-형질전환된 NT1 세포에서 최대 HN 발현은 세포괴 g당 20 ㎍ 미만이었다. Bialaphos® 저항성 NT1 세포주를 또한 산출하고 상기한 바와 같이 ELISA로 HA 발현을 분석하였다. 일차 검사에서, 한가지 pCHA-형질전환된 세포주만 이전에 산출된 pGPTV-HAO 세포주 #12에서와 유사한 수준으로 HA를 축적하였다(도 13). 본 실험에서, 발현 범위는 최대 2.5 ng/㎍ TSP이었다. 이들 세포주와 새로운 pCHA-형질전환된 세포주를 이용한 반복 실험에서, HA 축적 범위는 세포주 CHA-13에서 최대 18 ng/㎍ TSP이었다(도 14). 상기 군으로부터 선별된 세포주는 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 검사된 모든 pCHA-세포주에서, ~68 kDa의 예상된 크기에서 반응성 띠가 관찰되었다(도 15). 이들 데이터는 HA 단백질이 정확하게 가공되어 신호 펩티드를 제거하고, 안정적인 형태로 축적된다는 것을 입증한다. 비-변성 웨스턴 블랏에 의한 pGPTV-HAO-형질전환된 NT1 세포에 관한 이전의 연구(비공개 연구)에서는 HA가 올리고머 구조, 아마도 AIV 비리온의 표면에서 발생하는 고유 삼합체를 조합하는 것을 입증하였다.

실시예 3: 냉동건조보관

세포 배양: NT-1 담배 현탁 배양액(비-외래유전자도입과 외래유전자도입 세포주)은 250 ㎖ Erlenmeyer 플라스크에 유지시켰다. 먼저, 이들 세포는 변형된 액 체 Linsmaier와 Skoog 배지(LS)(1965)에서 배양하였다. LSg로 명명된 상기 배지는 LS 염과 비타민, 30 g 1^-1 글루코오스, 0.05 ㎎ 1^-1 2,4-디클로로펜옥시아세트산(2,4-D)을 함유하였다. 상기 배지의 pH는 5.8로 조정하였다. 배양액은 6 ㎖의 7-일된 배양액을 50 ㎖ LSg 배지에 이전함으로써 매주 새로운 배지로 이전하였다.

LSg 배지에서 이들 세포의 불량한 성장에 기초하여, KCMS와 NT-1로 명명된 다른 2가지 배지를 조사하였다. KCMS는 Murashige와 Skoog(MS)(1962) 염, 1.3 ㎎ 1^-1 티아민, 200 ㎎ 1^-1 KH₂PO₄, 30 g 1^-1 수크로오스, 0.2 ㎎ 1^-1, 0.1 ㎎ 1^-1 키네틴을 함유하였다. NT-1 배지는 MS 염, 180 ㎎ 1^-1 KH₂PO₄, 0.5 ㎎ 1^-1 2-N-모르폴리노에탄설폰산, 1 ㎎ 1^-1 티아민, 100 ㎎ 1^-1 미오이노시톨, 30 g 1^-1 수크로오스, 2.21 ㎎ 1^-1 2,4-D를 함유하였다. 양 배지의 pH는 5.7로 조정하였다. 새로운 배지로의 이전을 위하여, 2 ㎖의 7-일된 배양액은 48 ㎖ KCMS 또는 NT-1에 이전하였다. 모든 현탁 배양액은 100 rpm의 회전 교반기에서 25℃ 암실에 유지시켰다.

사전배양: 계대배양이후 3일(후기 지수성장기) 시점에, 세포는 배지의 1/3을 1M 만니톨(0.3M의 최종 농도)로 치환함으로써 개별 배지(LSg, KCMS, 또는 NT-1)에서 24시간 내지 72시간동안 사전배양하였다.

열 쇼크 처리: 사전배양이후, 배양액은 100 rpm의 회전 교반기에 37℃에서 2시간동안 위치시켰다. 이들은 유리화(vitrification) 앞서 4시간동안 25℃에서 교 반기에 환원시켰다.

유리화: PVS2/100%로 명명된 유리화 용액은 0.4 M 수크로오스 용액에 담긴 30% 글리세롤, 15% 에틸렌 글리콜, 15% DMSO를 함유하였다. PVS2/20% 용액은 PVS2/100%를 희석하여 만들었다. 양 용액은 pH 5.8로 조정하고 증기멸균하며, 이후 4℃에서 보관하였다.

유리화 과정을 개시하기 위하여, 4 ㎖의 차가운 PVS2/20%를 1 ㎖ 안정된 세포 용적의 세포에 첨가하였다. 생성물은 얼음 위에서 5분동안 배양하고, 이후 9 ㎖의 전체 용적이 달성될 때까지 1 ㎖의 차가운 PVS2/100%를 1-분 간격으로 첨가하였다. 생성물은 7500-8000 rpm에서 1분동안 원심분리하였다. 상층액을 버리고, 이후 0.5㎖ PVS2/100%를 2회, 1-분 간격으로 첨가하였는데, 세포는 얼음 위에 남겨두었다. 그 다음, 1 ㎖ PVS2/100%를 3회 1-분 간격으로 첨가하였다. 0.5 ㎖의 상기 혼합물은 6개의 극저온 스트로(cryogenic straw)(Continental Plastic Corporation, Delavan, WI) 각각에 이전하였다. 이들 스토로는 각 단부에서 고온 겸자로 가열 밀봉하고 액체 질소에 즉시 담갔다. 나머지 2 ㎖는 냉동시키지 않고 대조로 이용하였다.

회수: 액체 질소에서 1시간이후, 유리화된 세포는 40℃ 수조에서 3 - 5초동안 해동시키고, 이후 7 ㎖의 차가운 1.2 M 수크로오스로 즉시 희석하였다. 세포는 20분동안 축축한 얼음 위에 유지시키고, 이후 7500 - 8000 rpm에서 3분동안 원심분리하였다. 세포는 60 x 15 ㎜ 조직 배양 평판에서 0.75% 아가로스(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)를 함유하는 LSg 또는 NT-1 고체화 배지 위에 두 층의 필터 페이퍼(42.5 mm Whatman)로 이전하였다. 배양액은 25℃ 암실에 유지시켰다. 도말이후 2일 시점에, 이들 세포는 새로운 NT-1 고체화 배지에 이전하였다. 외래유전자도입 세포주는 먼저, 세포 성장이 적절하게 확립되고 작은 평판을 덮을 때까지 선별제가 없는 배지에 도말하였다. 이후, 이들 세포는 적절한 선별인자를 함유하는 배지에 이전하였다.

그 다음, 이들 세포는 대략 2주마다 새로운 배지로 이전하였다. 세포가 평판에서 배지의 표면을 거의 덮을 만큼 성장하면, 이들 세포는 필터 페이퍼로부터 떼어내고 좀더 큰 평판(100 x 15 mm)으로 이전하였다. 유합조직이 다시 평판을 덮게 되면, 이들 세포는 유지를 위하여 8 g 1^-1 아가(Sigma, St. Louis, MO)로 고체화된 NT-1 배지로 이전하였다.

실시예 4: 항원 제조

HN, HA 또는 빈 대조를 발현하는 전체 NT-1 세포는 세포 배양액으로부터 직접 수거하고, Spectramesh 30 필터를 Buchner 깔때기에 위치시키고 약한 진공을 이용하여 세포와 배지를 상기 필터에 통과시킴으로써 여과하여 과량의 배지를 제거하였다. 0.5 g의 세포는 2 ㎖의 완충액(둘베코 인산염 완충액과 1 mM EDTA)에 집어넣고, 이후 얼음 위에서 15 내지 20초동안 초음파처리하였다. 초음파처리는 가변적인 시간동안 8의 출력 조절(output control), 60회 작업량 사이클(duty cycle)에서 교체가능 마이크로팁(microtip)이 달린 Branson 450 초음파장치를 이용하여 수행하였다. 이후, 초음파처리물질은 사용 때까지 얼음 위에 위치시켰다.

실시예 5: 항원 추출

비-세정제 처리가 형질전환된 NT-1 세포로부터 ELISA 신호를 방출하고, 생물학적 활성의 유지를 가능하게 할 수 있는 지를 조사하기 위하여, 세정제 없는 처리 및 다양한 수준의 초음파처리의 비교를 수반하는 일련의 처리 과정을 설정하였다. 이의 결과는 추출 완충액에서 20초 초과의 초음파처리가 NT-1 세포를 보유하는 pCHN으로부터 HN의 혈구응집 활성을 완전히 파괴하면서도 ELISA 신호를 파괴하지는 못한다는 점에서 현저하였다. 대조적으로, DPBS에서 20초동안 초음파처리는 ELISA 신호에 의해 검출되는 항원을 방출할 뿐만 아니라 가용성 단백질 추출물이 우수한 혈구응집 활성을 보였다(표 1 참조).

¹ Native NDV는 2분동안 초음파처리하였다. Ext. buffer - 50 mM 나트륨 아스코르베이트, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0.1% Triton X-100 pH 7.2; DPBS - 둘베코 인산염 완충액; sonic. - 초음파처리; F/T - 냉동-해동; nd - 본 실험에서 수행되지 않음.

세정제없이 추출된 식물-유래된 HN은 고유 바이러스에 대하여 생산된 다클론 항체가 식물-유래된 HN에 의한 RBC의 혈구응집을 인식하고 저해할 수 있는 지를 결정하기 위한 혈구응집 저해 검사에서 항원으로 이용하였다. 이의 결과는 고유 항체가 고유 바이러스에서와 유사한 방식으로 식물-유래된 HN의 혈구응집 에피토프를 인식한다는 것을 지시한다(표 2). 표 2의 데이터는 또한, 비-혈구응집 단백질을 발현하는 대조 NT-1 세포 또는 NT-1 세포가 적혈구 세포를 응집시키지 않고 NDV 특이적 혈청에 의한 영향도 받지 않는다는 것을 입증한다. 본 실험에서, 식물-유래된 단백질의 추출물은 4 HA 단위로 희석하고, 이후 NDV 특이적 다클론 항혈청으로 처리하였다. 4 HA 단위는 혈청의 적정에 이용되는 바이러스의 표준량이다.

* 표준 바이러스(stock virus)는 표준의 1:4 희석물, 4HA 단위가 양성 HA를 발생시키지만 1:8의 희석물이 혈구를 응집시키지 않도록 희석된다. 이는 항체를 적정하는데 이용되는 바이러스 농도이며, 바이러스의 4 HA 단위를 간섭하는 항체의 종점 희석도는 항체 제조물의 HAI 역가로 간주된다.

상기 데이터는 세정제를 이용하지 않고 세포 파괴의 정도를 감소시키는 추출 방법의 활용이 HN 또는 HA를 발현하는 형질전환된 NT-1 세포주에 대한 혈구응집 활성을 유지하는 세포외 분획물을 산출한다는 것을 입증한다. 비-세정제 추출된 NT-1 세포가 백신 효능에 유관한 추가의 생물학적 활성을 보유하는 지를 결정하기 위하여, HN 추출물에서 병아리 세포 수용체에 결합하는 능력을 검사하였다. 면역-형광 염색은 고유 바이러스 또는 pCHN-18 추출물로 처리된 CEF 세포가 구별되지 않음을 지시하였다. 따라서, 식물-유래된 HN은 표적 세포 표면에서 수용체에 결합할 수 있는 바이러스-유사 능력을 유지한다.

상기한 혈구응집과 면역형광 검사와 함께, 표 1과 2로부터 종합된 데이터는 HN 단백질 유래된 외래유전자도입 NT-1 세포가 정확하게 가공되고 조제되는 경우에 면역학적 특징과 생물학적 특징을 유지한다는 것을 암시한다. 상기한 데이터에서 가장 중요한 점은 고유 바이러스에 대한 항혈청이 HAI 검사에서 식물-유래된 HN을 인식한다는 것이다. 배경에 비하여 적어도 4배 높은 역가의 HAI 활성을 보유하는 병아리는 독력 바이러스의 공격으로부터 거의 보호된다. 상기한 바와 같이 비-세정제에서 추출된 식물 유래된 단백질이 표적 동물 종에서 항체를 생산하는 지를 조사하기 위하여, HA와 HN 단백질을 제조하고 병아리와 토끼에 접종하였다.

실시예 6: 정량적 ELISA

HN

HN에 대한 정량적 ELISA는 검사를 시작하기 전날에 평판을 피복함으로써 수행된다. 웰당 50 ㎕의 포획 항체(0.01M 붕산염 완충액에서 희석(1:500)된 50% 글리세롤에 담긴 토끼 항-HN)는 각 편평 바닥 96-웰 마이크로역가 평판의 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 2℃ - 7℃에서 하룻밤(12-18시간)동안 배양한다. 피복된 ELISA 평판은 실온에서 평형화시키고(대략 20-30분), 이후 PBS-T로 세척당 200-300 ㎕/웰로 3회 세척한다. 전체 평판은 웰당 200 ㎕의 3% 탈지유 차단 용액을 첨가함으로써 비-특이적 반응을 예방한다. 그 다음, 평판은 37℃± 2℃에서 2시간(± 10분)동안 배양한다(평판 커버 또는 등가물로 덮임). 1% 탈지유 Blocker에서 HN 참고 항원(Ag)은 250 ng HN/㎖의 농도로 첨가한다; 실험 항원은 1% Blocker에서 희석한다. HN ELISA 평판은 PBS-T로 1회 세척하고, 웰당 100 ㎕의 희석된 HN 참고 항원과 HN 검사 샘플을 B열에 첨가한다. 웰당 50 ㎕의 1% Blocker를 나머지 모든 웰에 첨가한다. 이들 샘플은 B열에서부터 G열까지 웰당 50 ㎕를 이전함으로써 평판에서 연속 희석하는데, 각 이전에 앞서 피펫으로 4-5회 혼합한다. 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다; ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척한다. 3% Blocker에 녹인 50% 글리세롤(1:2000)에 담긴 50 ㎕의 NDV HN 4A 복수액을 각 웰에 첨가하고, 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다. ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척하고 3% Blocker에 녹인 50% 글리세롤(1:3000)에 담긴 50 ㎕의 토끼 항-생쥐 IgG를 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다. ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척하고 50 ㎕의 ABTS 과산화효소 기질 용액(적어도 30분동안 실온에서 평형화됨)을 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 실온의 암실에서 15-20분동안 배양한다. 웰의 흡광도(OD)는 405 nm의 파장(492nm 참고 필터)에서 판독한다. HN 참고 항원의 최초 희석액은 0.7 - 1.0 OD인데, 이는 ELISA에 대한 양성 대조로서 기능한다.

HA

HA의 정량적 ELISA를 위하여, 평판은 검사를 시작하기 전날에 피복한다. 웰당 50 ㎕의 포획 항체(0.01M 붕산염 완충액에서 희석(1:1000)된 50% 글리세롤에 담긴 염소 항-Hav5)는 각 편평 바닥 96-웰 마이크로역가 평판의 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 2℃ - 7℃에서 하룻밤(12-18시간)동안 배양한다. 피복된 ELISA 평판은 실온에서 평형화시키고(대략 20-30분), 이후 PBS-T로 세척당 200-300 ㎕/웰로 3회 세척한다. 전체 평판은 웰당 200 ㎕의 3% 탈지유 차단 용액을 첨가함으로써 비-특이적 반응을 예방한다. 그 다음, 평판은 37℃± 2℃에서 2시간(± 10분)동안 배양한다(평판 커버 또는 등가물로 덮임). 1% 탈지유 Blocker에서 AIV-HA(요막액) 참고 항원을 1000 ng HN/㎖의 농도로 첨가하고, 실험 항원은 1% Blocker에서 희석한다. HA ELISA 평판은 PBS-T로 1회 세척하고, 웰당 100 ㎕의 희석된 HA 참고 항원과 HA 검사 샘플을 B열에 첨가한다. 웰당 50 ㎕의 1% Blocker를 나머지 모든 웰에 첨가한다. 이들 샘플은 B열에서부터 G열까지 웰당 50 ㎕를 이전함으로써 평판에서 연속 희석하는데, 각 이전에 앞서 피펫으로 4-5회 혼합한다. 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다; ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척한다. 3% Blocker에 녹인 50% 글리세롤(1:2000)에 담긴 50 ㎕의 병아리 항-AIV 다클론 항혈청을 각 웰에 첨가하고, 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다. ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척하고 3% Blocker에 녹인 50% 글리세롤(1:3000)에 담긴 50 ㎕의 염소 항-병아리 IgG를 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 37℃± 2℃에서 1시간(± 10분)동안 배양한다. ELISA 평판은 PBS-T로 3회 세척하고 50 ㎕의 ABTS 과산화효소 기질 용액(적어도 30분동안 실온에서 평형화됨)을 각 웰에 첨가한다. 평판은 덮고 실온의 암실에서 15-20분동안 배양한다. 웰의 흡광도(OD)는 405 nm의 파장(492nm 참고 필터)에서 판독한다. HA 참고 항원의 최초 희석액은 0.7 - 1.0 OD인데, 이는 ELISA에 대한 양성 대조로서 기능한다.

실시예 7: 혈청 ELISA

NDV-HN

평판은 토끼 α-NDV 집합된 항혈청(물에 녹인 50% 글리세롤과 1:2 혼합됨)으로 피복하고 0.01 M 붕산염 완충액(100 ㎕/웰)에 희석한다. 평판은 2-7℃에서 하룻밤동안 배양하고 덮어 감싸며, 이후 실온에서 대략 20-30분동안 평형화시킨다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T(1X PBS + 0.05% Tween-20)로 3X 세척한다. 평판은 PBS-T에 녹인 5% 탈지유(차단 완충액)(200 ㎕/웰)로 차단하고 37℃에서 2시간동안 배양한다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 1X 세척한다. NDV 요막액은 차단 완충액에서 1:200 희석한다. 100 ㎕/웰의 희석된 항원을 평판에 첨가하고, 평판은 37℃에서 1시간동안 배양한다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 3X 세척한다. 검사 병아리 혈청 샘플을 희석한다(1:50). 음성 대조 혈청을 희석한다(1:50)(Neg. Control 27NOV00). 양성 대조 혈청을 희석한다(1:10,000 또는 1:20,000)(SPAFAS Chicken α-NDV 혈청). 모든 혈청 샘플은 차단 완충액에서 희석한다. 100 ㎕/웰의 음성 대조 혈청은 B-G열 칼럼 1에 첨가한다; 200 ㎕/웰의 양성 대조 혈청을 A열 칼럼 2-3에 첨가한다; 200 ㎕/웰의 검사 혈청 샘플은 A열의 적절한 칼럼에 첨가한다. 이는 샘플당 8회 희석된 4개의 샘플/평판을 가능하게 한다. 100 ㎕/웰의 차단 완충액을 나머지 모든 웰에 첨가한다. 양성 대조 혈청과 검사 샘플 혈청은 평판에서 연속 2배 희석한다. 샘플은 A열에서부터 H열까지 평판에서 희석하고 나머지 100 ㎕/웰을 폐기한다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하고, 이후 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 3X 세척한다. 염소 α-병아리 IgG(H&L)-HRP를 차단 완충액에서 희석한다(1:3000). 100 ㎕/웰의 희석된 공액체를 각 평판에 첨가한다. 공액체가 평판에 첨가되면, ABTS 기질을 실온의 암실에서 평형화시킨다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하고, 이후 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 3X 세척한다. 100 ㎕/웰의 미리-가열된 ABTS 기질을 각 평판에 첨가하고, 평판 간에 2-3분동안 대기한다. 평판은 양성 대조의 최초 희석액이 0.7 내지 1.0의 흡광도에 도달하면, Tecan Sunrise 평판 판독기 또는 등가물에서 405/490 nm 이중 파장에서 판독한다.

AIV-HA

평판은 0.01 M 붕산염 완충액에서 희석된(1:1000) 토끼 α-HA 집합된 항혈청으로 피복하고 2-7℃에서 하룻밤동안 배양하고 덮는다. 평판은 실온에서 대략 20-30분동안 평형화시키고, Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T(PBS 원액 + 0.05% Tween-20)로 3X 세척한다. 평판은 PBS-T에 녹인 5% 탈지유(차단 완충액)(200 ㎕/웰)로 차단하고 37℃에서 2시간동안 배양한다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 1X 세척한다. 불활성화된 T/W/68 AIV 요막액은 차단 완충액에서 희석하고(1:100), 100 ㎕/웰의 희석된 항원을 평판에 첨가한다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양한다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 3X 세척한다. 검사 병아리 혈청 샘플을 희석한다(1:50). 음성 대조 혈청을 희석한다(1:50). 양성 대조 혈청을 희석한다(1:25600)(USDA/SEPRL Chicken α-AIV(T/W/68 항혈청). 모든 혈청 샘플은 차단 완충액에서 희석한다. 100 ㎕/웰의 음성 대조 혈청은 B-G열 칼럼 1에 첨가한다; 200 ㎕/웰의 양성 대조 혈청을 A열 칼럼 2-3에 첨가한다; 200 ㎕/웰의 검사 혈청 샘플은 A열의 적절한 칼럼에 첨가한다; 100 ㎕/웰의 차단 완충액을 나머지 모든 웰에 첨가한다. 양성 대조 혈청과 검사 샘플 혈청은 평판에서 연속 2배 희석하고, 나머지 100 ㎕/웰을 폐기한다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양한다. 평판은 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 PBS-T(300 ㎕/웰)로 3X 세척한다. 염소 α-병아리 IgG(H&L)-HRP를 차단 완충액에서 희석하고(1:3000), 100 ㎕/웰의 희석된 공액체를 각 평판에 첨가한다. 공액체가 평판에 첨가되면, ABTS 기질을 실온의 암실에서 평형화시킨다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하고, 이후 Titertek M96 평판 세척기 또는 등가물을 이용하여 300 ㎕/웰에서 PBS-T로 3X 세척한다. 100 ㎕/웰의 평형화된 ABTS 기질을 각 평판에 첨가하고, 평판 간에 2-3분동안 대기한다. 평판은 양성 대조의 최초 희석액이 0.7 내지 1.0의 흡광도에 도달하면, Tecan Sunrise 평판 판독기 또는 등가물에서 405/490 nm 이중 파장에서 판독한다.

실시예 8: 토끼에서 항원성

상기한 바와 같이 비-세정제에서 추출된 식물 유래된 단백질이 표적 동물 종에서 항체를 발생시키는 지를 조사하기 위하여, HA와 HN 단백질을 제조하고 토끼에 접종하였다. 3개월된 뉴질랜드 토끼는 표 3에 제시된 투약 일정에 따라 HA-AIV 또는 HN-NDV로 접종하였다. 일차 접종을 위하여, 항원은 완전 Freund 보조약(CFA)과 혼합하고, 모든 추가 접종에 불완전 Freund 보조약을 이용하였다. 양 단백질에 의해 유도된 항체 역가는 표 4에 제시한다. 이의 결과는 2회 접종이후, HAI 항체 역가가 양 단백질에 의해 유도된다는 것을 지시한다. 하지만, AIV-HA 접종된 토끼의 역가는 NDV-HN 단백질에 의해 유도된 역가보다 높았다. 이는 AIV/HA 단백질이 NDV-HN보다 AIV-HA 단백질 단위당 더욱 낮은 전체 생물학적 활성(혈구응집)을 보인다는 점에서 유의하다(표 3 칼럼 4). 양 단백질로부터 정량 방법이 정확하다고 가정하는 경우에, 이는 식물로부터 유래된 AIV-HA 단백질이 NDV-HN 단백질보다 단백질 단위당 더욱 강하다는 것을 지시한다. 또한, 이는 이런 방식으로 조제된 AIV-HA 단백질이 병아리에서 면역원성이라는 것을 암시한다.

¹ 모든 NT-I 샘플은 비 냉동-건조된 물질로부터 제공된다. BCA(bicinchoninic acid) - Pierce Chemical BCA 단백질 검사 키트의 일차 성분; TSP - 전체 가용성 단백질.

병아리에서 식물 유래된 항원의 효능을 검사하기 위하여, HN 단백질은 2일된 병아리와 10일된 병아리에게 접종하였다. 이들 연구에 이용되는 용량 농도는 표 5에 제시한다. 모든 백신 접종물은 25℃ 교반기 플라스크에서 15-20일 성장된 NT-1 세포의 가용성 분획물로 조제하였다. 양 시험에 이용된 보조약은 MPL-TDM(Corixa, Inc)이었다. 비강내 군에는 보조약으로서 MPL 단독을 제공하였다.

실시예 9: 가금에서 공격

2일된 SPF 병아리는 표 5에 도시된 접종당 HN 단백질 함량으로, NT-1로부터 유래된 생물학적 활성(혈구응집 양성) NDV-HN 단백질을 이용하여 다양한 경로로 접종하였다. 본 시험의 혈청학적 공격 결과는 표 6에 제시한다. 모든 대조군은 접종물에서 NDV-HN 항원을 섭취하지 않는 병아리가 100% 폐사된 반면, SQ로 20 ㎍의 고유 NDV를 섭취한 대조 병아리가 100% 생존했다는 점에서 예상대로 반응하였다. 실험 치료군에서, 군 #3(보조약 없는 SQ 접종)은 75% 보호되고, 군 #4(보조약과 함께 SQ 접종)는 80% 보호되었다. IN과 경구 경로로 접종된 나머지 치료군은 100% 폐사되었다. 하지만, 군 6에서 2마리 병아리가 지연된 폐사를 보였는데, 이는 이들 병아리가 백신접종에 감작화되었음을 지시한다(표 9 참조).

^* 사료와 혼합된 세포 질량당 습식 중량 발현에 기초한 용량; IN-비강내; SQ-피하; OG-경구 위관 영양; OF-사료 혼합물에서.

모든 병아리는 NDV의 10² EID₅₀ Texas GB 균주를 섭취하였다. 병아리는 최종 백신접종이후 24일에 공격한다. 굵게 표시된 번호의 병아리는 지연된 폐사를 보였다(표 9 참조).

후속 시험에서, 18마리의 10일된 SPF 병아리는 표 7에 기술된 일정과 용량에 따라 접종하였다. 본 시험의 결과는 표 8에 제시한다. 한 대조군(#3), 비-백신접종되고 비-공격된 치료군을 이용하여 수용 시설이 이들 병아리의 전반적인 건강에 부정적인 영향을 주지 않음을 입증하였다. 또한, 본 시험에서 대조군은 예상대로 반응하였다. 양 시험으로부터 병아리들이 동일한 시설에서 공격되었기 때문에, 치료군 #2는 양 가금 시험을 위한 양성 대조로서 기능하였다. NT-1 세포로부터 유래된 HN으로 SQ 접종된 나머지 군에서, 군 #7에서 100% 생존, 군 5와 6에서 각각 80% 생존, 군 4에서 60% 생존이 관찰되었다(표 8 참조).

결론: HA와 HN 단백질의 혈구응집의 회복을 제공하는 과정을 이용하여, 이들 식물-유래된 단백질에 대한 제조물을 피하(SQ) 경로로 2가지 개별 동물 종에 접종하여 혈구응집을 저해하는 항체(HAI 항체)가 유도될 수 있는 지를 결정하였다. 한 시험에서, HN 단백질은 높은 혈구응집 활성 대 전체 가용성 단백질 비율을 보유하도록 조제하였다. 이후, 이들 물질은 SQ, 비강내(IN), 경구 경로로 접종하였다. 이의 결과는 NT-1 세포로부터 유래된 HA-AIV과 HN-NDV 단백질이 이런 방식으로 조제되는 경우에 토끼에서 혈구응집 저해(HAI) 항체를 유도한다는 것을 지시한다. 이에 더하여, 병아리에서 SQ 경로로 접종된 NT-1로부터 유래된 HN-NDV는 (HAI)항체를 유도하고 독력 NDV 공격으로부터 보호를 제공한다(표 6과 8).

모든 병아리는 NDV의 10⁴ EID₅₀ Texas GB 균주를 섭취한 군 1과 비-공격 대조인 군 3을 제외하고 NDV의 10² EID₅₀ Texas GB 균주를 섭취하였다. 병아리는 최종 백신접종이후 31일에 공격한다. 굵게 표시된 번호의 병아리는 지연된 폐사를 보였다(표 9 참조). n/c - 공격되지 않음.

전형적으로, 공격이후 높은 역가 반응은 우수한 감작 면역화를 지시하긴 하지만, 조류들이 고유 또는 재조합 유래된 NDV 항원에 의해, 검출가능한 HAI 또는 ELISA 항체 역가 없이 보호되는 사례는 드물지 않다(Winterfield, R. W., Dhillon, A. S., and L.J. Alby, 1979. Vaccination of Chickens against Newcastle Disease with Live and Inactivated Newcastle Disease Virus. Poultry. Sci. 59: 240-246). 체액 항체 반응이 검출될 수 없는 백신접종된 조류에서 면역 보호를 제공하는데 세포 면역 반응 또는 국소 면역 반응이 관여하는 것으로 제안되었다(Agrawal, P.K. and D. L. Reynolds. 1991. Evaluation of the cell mediated immune response of chickens vaccinated with Newcastle disease virus as determined by the under-agarose leukocyte-migration inhibition technique. Avian Dis. 35: 360-364).

일부 경우에, 28일에 백신접종 일정의 종점에서 검출가능한 역가가 관찰되긴 하지만, 공격에 대한 보호는 관찰되지 않았다. 하지만, 이런 상황이 발생하는 모든 경우에, 공격 이전(공격 당일) 또는 이후에 검출가능한 항체 역가가 관찰되지 않았는데, 이는 이들 조류가 효과적으로 감작화되지 않았음을 지시한다(표 4와 6을 비교한다). 2가지 가금 시험에서 관찰되는 차이점은 일차 시험에 이용된 항원이 HN ㎍당 더욱 높은 생물학적 활성을 보유한다는 사실에 기인한다. 상기 시험에 이용된 항원은 후자 시험에서 항원보다 단백질 ㎍당 적어도 2배 높은 수준의 혈구응집 활성을 보였다(표 5와 7을 비교한다). 이는 비-보조된 항원으로 치료된 조류(group #3, 표 6)에서 28일 시점에 검출가능한 ELISA와 HAI 역가가 나타나는 반면, 비-보조된 항원(군 #4, 표 8)에서 28일 시점에 ELISA 역가가 나타나지 않는 한가지 이유이다. 이들 결과에 기여하는 다른 차이점은 조류의 연령이다. 일차 시험에서 조류는 출생이후 2일 시점에 백신접종되는 반면, 이차 시험에서 조류는 출생이후 10일 시점에서 백신접종되었다.

보조약 역시 이들 시험에서 항원을 조제하는데 중요한 특징으로 생각된다. 보조약 효과는 높은 용량의 NT-1 유래된 NDV-HN을 이용하는 경우에는 분명하지 않지만(군 3과 4를 비교한다, 표 6; 군 6과 7을 비교한다, 표 8), 낮은 용량의 NDV-HN을 이용하는 경우에는 분명한 보조약 효과가 관찰된다(군 4와 5를 비교한다, 표 8). 이에 더하여, 비강내 경로로 접종된 군에서 100% 폐사가 관찰되긴 하지만, 보조약을 섭취한 군에서 2마리 조류(#923과 #1088)는 모든 음성 대조 생쥐가 공격으로 인하여 폐사되고 3일이 경과한 8일까지 죽지 않았다(표 9). 보조된 항원을 섭취하는 비강내 군에서 지연된 폐사의 유의성은 현저하진 않지만, 2마리 조류 #923과 #1088이 시험 21일에 검출가능한 HAI 항체 역가를 보이고 다른 치료군보다 용량당 적은 항원으로 치료된다는 점은 흥미롭다(표 5 참조).

본원에 제시된 데이터로부터, 형질전환된 NT-1 세포로부터 형질전환된 HN-NDV가 NDV에 대한 독력 공격에 유효하다는 것은 명백하다. 식물 유래된 항원에 대한 면역 반응은 고유 항원에 대한 면역 반응과 여러 면에서 유사성하다. 1) 항체 역가가 공격전 고유 항원에 대하여 더욱 높긴 하지만, SQ 접종된 20 ㎍ 용량이 고유 항원과 식물 유래된 항원 모두에 대하여 공격으로부터 보호를 제공한다. 2) 항체 역가는 양 연구에서 백신접종후 24일과 31일 시점에 공격이 수행된다는 점에서 유사한 반응 지속 기간을 보인다. 3) 백신접종 일정의 종결 시점과 공격이후 양성 HAI 항체 반응(상기 배경)을 유도하는 모든 조류는 NDV 연관된 병리로부터 보호되었다.

경구 또는 비강내 경로로 접종된 어떤 조류도 공격으로부터 보호되지 못하였다. 경구 투여된 조류의 경우에, 접종당 전체 습식 세포로서 700 내지 2400 ㎍의 HN-NDV와 함께 NT-1 세포로부터 100 내지 300 ㎍의 HN-NDV 가용성 단백질의 접종물은 3회 투여이후 검출가능한 항체 역가를 유도하지 않았고 어떤 조류도 공격으로부터 보호되지 못하였다. NT-1로부터 HN-NDV가 적혈구와 닭 배아 섬유아세포(CEF)에 대한 분명한 결합 능력을 보유하고 있기 때문에, 고유 수용체에 결합할 수 있는 능력은 본 연구에서 조류 점막 표면에서 항원 샘플링 부위에 대한 결합이나 전달을 보충하지 않았다.

본원에 제시된 데이터는 외래유전자도입 NT-1 세포 배양액으로부터 유래된 HN-NDV 항원이 SQ 투여되는 경우에 독력 공격으로부터 보호를 제공한다는 것을 입증한다. 더 나아가, 경구 치료군에서 수 ㎎의 항원을 공급함에도 불구하고, 전신 구획에서 HAI 항체는 유도되지 않았고 공격으로부터 보호 역시 관찰되지 않았다. 따라서, 상기 데이터에 도시된 바와 같이, 점막 표면에서 항원 제시 부위에 대한 자연적 친화성 또는 침입성을 보유하지 않는 항원은 점막 표면을 감작화시키는 단백질의 보조를 통하여 이들 부위로 표적되어야 한다.

실시예 10: 외래유전자도입 감자의 제조와 분석

이원 벡터 pCHN, pgHN, pMHN, pCHA를 이용하여 감자(cv. Desiree)를 형질전환시키고, 외래유전자도입 덩이줄기는 NDV로부터 재조합 HN 항원, 또는 조류 인플루엔자 바이러스로부터 재조합 HA 항원의 발현을 분석하였다.

식물 물질. 영향 감자(Solanum tubersum cv) Desiree의 시험관내 식물은 Dr. Steven Slack, Department of Plant Pathology, Cornell University에 의해 제공되었다. 증식을 위하여, 결절 분절은 MS 염(Murashige and Skoog, 1962), 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 0.4 ㎎/ℓ 티아민, 20 g/ℓ 수크로오스, 8 g/ℓ 아가/아가(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; catalog # A-1296)를 함유하고 CM으로 명명된 지맥 증식 배지로 이전하였다. 배지의 pH는 아가/아가의 첨가에 앞서 pH 5.7로 조정하였다. 한 결절 외식체는 각 검사 튜브에 위치시키고 74 μE m^-2s^-1에서 16시간(명)/8시간(암)의 광주기(photoperiod)하에 24± 1℃에 유지시켰다. 본 명세서에서 광원은 냉온 형광 전구(F40CW와 F40WW)(Philips Lighting Co., www.lighting.philips. com/index.htm)의 조합이었다. 결절 외식체는 매 6주마다 수거하고 새로운 배지에 이전하였다.

아그로박테리움(Agrobacterium) 준비. 목적하는 유전자 구조체를 보유하는 근두암종병(Agrobacterium tumefacien)은 10 g/ℓ Bacto 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출액, 10 g/ℓ NaCl, 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신, 15 g/ℓ Difco Bacto 아가(Difco Laboratories, Detroit, MI; catalog #DF 0140-01)를 함유하는 LB 배지의 페트리 평판에서 -80℃에 유지된 글리세롤 원액으로부터 스트리킹(streaking)하였다. 4개의 적절하게 형성된 콜로니는 무균 피펫 팁으로 채집하고, 이후 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신을 함유하는 50 ㎖의 YM 배지(Gibco BRL cat.# 10090-011)에 첨가하였다. 배양액은 100 rpm의 교반 배양기에서 28℃에서 24시간동안 배양하거나, 또는 배양액이 0.5 - 0.7의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 OD에 도달하는 데에는 대략 24시간이 소요된다. 원하는 OD가 달성될 때까지, 세포는 8000 rpm으로 20℃에서 10분동안 원심분리하였다. 펠렛은 YM 선택 배지에서와 동일한 최초 용적으로 MS 액체 배지(MS 염, 2 ㎎/ℓ 글리신, 0.5 ㎎/ℓ 니코틴산, 0.5 ㎎/ℓ 피리독신, 0.4 ㎎/ℓ 티아민, 0.25 ㎎/ℓ 엽산, 0.05 ㎎/ℓ d-비오틴, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 30 g/ℓ 수크로오스, pH 5.6)에 재부유시켰다.

감염. 0.5 - 1 ㎝ 길이의 줄기 절간 분절은 6주된 시험관내 식물로부터 잘라내고 동일자로 접종하였다. 50 ㎖의 접종물당 대략 100개의 절간 외식체를 10분동안 배양하였다. 배양이후, 이들은 무균 필터 페이퍼에 블랏하고, MS 염, 2 ㎎/ℓ 글리신, 0.5 ㎎/ℓ 니코틴산, 0.5 ㎎/ℓ 피리독신, 0.4 ㎎/ℓ 티아민, 0.25 ㎎/ℓ 엽산, 0.05 ㎎/ℓ D-비오틴, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 30 g/ℓ 수크로오스(등급 II; PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 1 ㎎/ℓ 벤질아데닌(BA), 2 ㎎/ℓ 나프탈렌아세트산(NAA)(증기멸균이후 첨가됨), 6 g/ℓ 아가/아가(PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS)를 함유하고 CIM으로 명명된 배지에 이전하였다. 배지의 pH는 아가/아가의 첨가에 앞서 5.6으로 조정하였다. 100 x 20 ㎜ 페트리 평판당 100개의 외식체를 배양하였다. 모든 배양액은 74 μE m^-2s^-1에서 16시간(명)/8시간(암)의 광주기(photoperiod)하에 24± 1℃에 유지시켰다.

식물 재생. 48시간의 동시배양이후, 이들 외식체는 MS 염, 0.1 ㎎/ℓ 티아민, 0.5 ㎎/ℓ 니코틴산, 0.5 ㎎/ℓ 피리독신, 100 ㎎/ℓ 미오이노시톨, 30 g/ℓ 수크로오스, 0.5 ㎎/ℓ 인돌-3-아세트산(IAA)(증기멸균이후 첨가됨), 3 ㎎/ℓ 제아틴 리보사이드(증기멸균이후 첨가됨), 500 ㎎/ℓ 카르베니실린(증기멸균이후 첨가됨)(Agri-Bio, Miami, FL), 5 ㎎/ℓ 비알라포스(증기멸균이후 첨가됨)(Duchefa, http://www.duchefa. com/), 8 g/ℓ 아가/아가를 함유하는 3C5ZR 비알라포스 선택 배지에 이전하였다. 배지의 pH는 아가/아가의 첨가에 앞서 5.9로 조정하였다. 100 x 20 ㎜ 페트리 평판당 25개의 절간 분절을 배양하고, 이들 평판은 Nesco 필름(Karlan Research Products, Santa Rosa, CA)으로 밀봉하였다. 외식체는 1개월동안 주 간격으로, 이후 매 10 - 14일 간격으로 이전하였다. 모든 배양액은 74 μE m^-2s^-1에서 16시간(명)/8시간(암)의 광주기(photoperiod)하에 24± 1℃에 유지시켰다.

재생체가 대략 0.5 - 1 ㎝ 길이가 되면, 이들은 잘라내고 500 ㎎/ℓ 카르베니실린(증기멸균이후 첨가됨)과 5 ㎎/ℓ 비알라포스(증기멸균이후 첨가됨)의 첨가로 CM에서와 동일한 성분을 함유하는 비알라포스 선택 발아 배지에 이전하였다. GA7 Magenta 상자당 5개의 재생체를 배양하였다. 지맥이 착근되면, 각 식물로부터 지맥 정점은 유지를 위하여 검사 튜브에 담긴 CM에 이전하였다.

미세덩이줄기. 미세덩이줄기는 덩이줄기에서 발현의 조기 표시를 위하여 식물 물질에서 유도하였다. 이는 덩이줄기-특이적 프로모터, GBSS에 의해 유도되는 유전자를 보유하는 외래유전자도입 세포주에 특히 적합하다. 결절 분절은 1/2 강도 MS 염, 5 ㎎/ℓ 키네틴, 80 g/ℓ 수크로오스, 0.25 mM 안시미돌(증기멸균이후 첨가됨), 9 g/ℓ 아가/아가를 함유하는 미세덩이줄기 배지에 위치시켰다. 배지의 pH는 아가/아가의 첨가에 앞서 5.85로 조정하였다. 배양액은 18℃ 암실에 유지시켰다. 미세덩이줄기는 ELISA로 항원 발현 수준을 분석하였다.

PCR 분석. 게놈 DNA은 3-4주된 추정 형질전환체의 잎으로부터 분리하였다. 잎 샘플은 200 mM Tris HCl(pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS를 함유하는 500 ㎕의 추출 완충액에서 실온에서 균질화시켰다. 이들은 실온에 1시간동안 유지시키고, 이후 12,000 rpm에서 5분동안 원심분리하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮기고 500 ㎕의 이소프로판올을 첨가하며, 이후 샘플은 실온에서 5 - 10분동안 유지시키거나, 또는 -20℃에서 하룻밤동안 방치하였다. 그 다음, 이들 샘플은 13,000 rpm에서 5분동안 원심분리하고, 상층액은 버렸다. 생성된 펠렛은 70% 에탄올로 세척하고 건조시키며, 이후 100 ㎕의 TE 완충액에 재부유시켰다.

전방 프라이머가 CVMV 프로모터에 위치하고 후방 프라이머(PAT R2)가 PAT 유전자에 위치하도록 프라이머 세트를 설계하여 대략 500 bp 크기의 산물을 산출하였다. 증폭된 DNA 단편은 1% 아가로오스 겔에서 이동시키고 에티듐 브롬화로 염색하며 자외선하에 가시화시켰다.

잎의 ELISA 분석. 잎 물질은 튜브에 채집하고 얼음 위에 위치시켰다. 최대 항원 수준을 보이는 세포주는 증식용으로 선별하고, 이후 온실로 이전하였다.

온실 순응. 적절하게 형성된 뿌리 조직을 보유하는 식물은 Jiffy 7 용기에 이전하였다. 이들 용기는 트레이에 위치시키고 플라스틱 반구형 덮개로 덮었다. 대략 2주후, 덮개를 제거하였다. 식물은 뿌리 조직이 Jiffy 7 용기에 위치한 그물을 통하여 성장하면, Cornell 토양 혼합물을 포함하는 3 갤런 용기로 이전하였다.

pCHN-형질전환된 감자 식물에서 HN 발현. 감자(Solanum tubersum L.cv, Desiree) 식물은 pCHN으로 형질전환시키고, 재생된 Bialaphos® 저항성 식물은 ELISA로 잎에서 HN의 발현을 조사하였다. 잎 발현(도 26)에 기초하여 여러 세포주를 선별하고 증식시키며 온실 배양을 위하여 토양으로 이식하였다. 성숙 시점에서, 덩이줄기는 채집하고 추출하며 ELISA로 HN 함량을 검사하였다(도 26). HN 축적은 동일 세포주로부터 개별 덩이줄기 간에 상이했지만, 전체적으로 발현은 각 세포주 내에서 잎의 HN 함량과 상관하였다(도 26). 최적 발현은 세포주 6, 21, 27, 34의 덩이줄기에서 관찰되었고, 최대 축적은 새로운 덩이줄기 덩어리 g당 ~11 ㎍ HN에서 관찰되었다.

감자 덩이줄기-발현된 HN 항원의 입자 행동. 특정 구조를 형성하는 NT1 세포-발현된 항원의 조합을 평가하기 위하여, pCHN-형질전환된 감자 덩이줄기 추출물에서 수크로오스 구배 침강을 수행하였다. 도 27에 도시된 프로필은 덩이줄기-유래된 HN이 도 24에 도시된 NT1 세포-유래된 HN에서와 유사하게, ELISA 반응성 물질의 2가지 피크를 보인다는 것을 지시한다.

pGHN과 pGHN151로 형질전환된 감자 식물에서 HN 발현. 감자(Solanum tubersum L.cv, Desiree) 식물은 pGHN 또는 pGHN151로 형질전환시키고, 재생된 Bialaphos® 저항성 식물은 ELISA로 미세덩이줄기에서 HN의 발현을 조사하였다. 미세덩이줄기 발현(도 28)에 기초하여 여러 pGHN-형질전환된 세포주를 선별하고 증식시키며 온실 배양을 위하여 토양으로 이식하였다. pGHN151로 형질전환은 상대적으로 비효율적이고, 한 세포주(GHN151-6)만 미세덩이줄기에서 발현을 보였는데, 이는 온실 배양을 위하여 토양으로 이식하였다. 성숙 시점에서, 덩이줄기는 채집하고 추출하며 ELISA로 HN 함량을 검사하였다(도 28). HN 축적은 동일 세포주로부터 개별 덩이줄기 간에 상이했지만, 전체적으로 발현은 각 세포주 내에서 미세덩이줄기의 HN 함량과 상관하였다(도 29). 최적 발현은 세포주 GHN-1, 30, 47, 54의 덩이줄기에서 관찰되었고, 최대 축적은 새로운 덩이줄기 덩어리 g당 ~40 ㎍ HN에서 관찰되었다. 세포주 GHN 151-6의 덩이줄기에서 발현은 새로운 덩이줄기 덩어리 g당 6 내지 12 ㎍ HN이었다. 인트론-보유 GBSS 프로모터 구조체 pGHN151은 외래유전자도입 식물 또는 아그로박테리움(Agrobacterium)에서 불안정하고 발현이 불량한 것으로 생각된다.

덩이줄기의 ELISA 분석. 식물을 토양으로 이식하고 3 - 4 개월후, 합쳐진 조직은 분석용으로 채집하였다. 도 16에서는 pCHA 형질전환된 미세덩이줄기의 미세덩이줄기에서 HA의 발현을 도시하는데, 이의 범위는 생체중(fresh weight) g당 최대 700 ng이었다. 이는 pGPTV-HAO-형질전환된 덩이줄기(CaMV 35S 프로모터에 의해 유도된 HA 유전자)에서 관찰된 생체중 g당 최대 1 ㎍의 축적과 유사하다. 선별된 세포주는 토양으로 이식하고 온실에서 성장시켰다. 토양-성장된 식물의 잎은 샘플링하고 ELISA로 분석하였다(도 17). 잎에서 HA의 발현은 매우 불량하였는데(<0.025 ng/㎍ TSP), 이는 조직 배양 식물의 잎에서 이전의 검사 결과와 일치한다. 성숙 식물의 덩이줄기는 채집하고 추출하며 ELISA로 HA 발현을 평가하였다. 덩이줄기에서 HA의 축적은 생체중 g당 최대 500 ng/g이었다(도 18). 시험관내에서 생산된 미세덩이줄기에서 관찰되는 발현은 토양-성장된 덩이줄기에서 발현과 완전히 상관하였고(도 16과 18), 따라서 미세덩이줄기는 pCHA를 이용한 HA의 발현을 위한 우수한 모델이다.

실시예 11: 오래유전자도입 토마토의 제조와 분석

이원 벡터 pCHN, pMHN, pUHN를 이용하여 감자(품종 TA234)를 형질전환시키고, 외래유전자도입 열매와 잎은 뉴캐슬병 바이러스로부터 재조합 HA 항원의 발현을 분석하였다.

식물 물질. TA234로 명명된 감자 세포주로부터 종자를 형질전환에 이용하였다. 초기에는 Momor로 알려졌던 TA234는 품종 Moneymaker로부터 유래된 버티실리움균(Verticillium)과 담배 모자이크 바이러스 저항성 세포주이다. 종자는 20% Clorox에서 20분동안 표면 멸균하고 무균 증류수로 3회 헹구며, 이후 Magenta 상자에서 1/2 MSO 배지에 배양하였다. 이들은 74 μE m^-2s^-1에서 16시간(명)/8시간(암)의 광주기(photoperiod)하에 24± 1℃에 유지시켰다. 본 명세서에서 광원은 냉온 형광 전구(F40CW와 F40WW)(Philips Lighting Co., www.lighting.philips. com/index.htm)의 조합이었다. 종자 배양액은 자엽 성장의 단계에 따라 6 - 8일동안 유지시켰다. 떡잎은 일차 진성 잎이 출현할 때까지 잘라냈다. 떡잎 절편은 형질전환 전일에 제조된 영양층 평판에 위치시켰다. 영양층은 도말 7일전에 계대배양된 KCMS 배지에 도말된 NT1 현탁 배양된 세포로 구성되었다 (2 ㎖의 세포: 48 ㎖의 액체 KCMS). 도말된 현탁 배양액은 무균 7 ㎝ Whatman 필터 페이퍼로 덮었다. 떡잎 절편은 필터 페이퍼의 상부에 위치시켰다.

아그로박테리움(Agrobacterium) 준비. 목적하는 유전자 구조체를 보유하는 근두암종병(Agrobacterium tumefacien)은 적절한 항생제를 함유하는 LB 배지(부록 참조)의 새로운 평판에서 -80℃에 유지된 글리세롤 원액으로부터 스트리킹(streaking)하였다. DAS 구조체에서, 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신을 LB 배지에 첨가하였다. 배양액은 28℃에서 24-48시간동안 배양하였다. 배양 지속 시간은 콜로니 크기에 좌우되었다. 24시간후 핀-포인트(pin-point) 콜로니가 발생되면, 배양액은 추가로 1일동안 배양하였다.

콜로니가 적절하게 형성된 크기에 도달하면, 액체 배양을 제조하였다. 4개의 콜로니를 무균 피펫 팁으로 채집하고 DAS 구조체용 50 ㎎/ℓ 스펙티노마이신을 함유하는 50 ㎖의 YM 선택 배지에 첨가하였다. 배양액은 100 rpm의 교반 배양기에서 28℃에서 24시간동안 배양하거나, 또는 배양액이 0.5 - 0.6의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 OD에 도달하는 데에는 대략 24시간이 소요된다. 원하는 OD가 달성될 때까지, 세포는 8000 rpm으로 20℃에서 10분동안 원심분리하였다. 펠렛은 YM 선택 배지에서와 동일한 최초 용적으로 MS 액체 배지에 재부유시켰다.

감염. 떡잎 외식체는 아그로박테리움(Agrobacterium) 감염 하루전에 영양층 평판에서 배양하였다. 감염을 위하여, 이들은 10분동안 아그로박테리움(Agrobacterium) 현탁액에서 배양하고, 이후 현탁액을 제거하였다. 이들 외식체는 무균 필터 페이퍼에 블랏하고, 최초 영양 평판 배양액에서 향축면에 위치시켰다. 이들은 동시배양을 위하여 19℃ 암실에서 48시간동안 유지시켰다.

식물 재생. 동시배양이후, 떡잎 외식체는 3 ㎎/ℓ 비알라포스를 함유하는 2Z 선택 배지에서 향축면에 배양하였다. 배양액은 평열의 백색 형광 광의 16-시간 광주기하에 24± 2℃에 유지시켰다. 3주후, 배양액은 3 ㎎/ℓ 비알라포스를 함유하는 1Z 선택 배지로 이전하고, 이후 3주 간격으로 새로운 배지에 이전하였다. 지맥이 재생되기 시작하면, 배양액은 Magenta 상자에서 비알라포스를 함유하는 동일한 1Z 배지로 이전하였다. 지맥이 2 ㎝ 크기가 되면, 이들은 Magenta 상자에서 2 ㎎/ℓ 비알라포스를 함유하는 선택적 착근 배지에 이전하였다. 식물은 평열의 백색 형광 광의 16-시간 광주기하에 24± 1℃에 유지시켰다. 대략 3주후, 이들 식물로부터 잘라낸 가지를 바이알포스를 함유하는 선택 착근 배지에 다시 이전하지만, 아그로박테리움(Agrobacterium) 오염이 존재하는 지를 결정하기 위하여 티멘틴(timentin)을 포함시키지 않았다.

분석. ELISA 분석을 위하여 선별 착근 배지에서 착근된 식물을 선별하였다. 잎 물질은 채집하고 2 ㎖ 원뿔 스크루 캡 튜브에 이전하며 얼음 위에 위치시켰다. 최대 항원 수준을 보이는 세포주를 선별하기에 앞서, ELISA를 적어도 2회 수행하였다. 우수한 세포주는 증식하고 온실로 이전하였다.

온실 순응. 적절하게 발달된 뿌리 조직을 보유한 식물은 온실로 이전하였다. 이들 식물을 Cornex 혼합물을 포함하는 6-인치 용기로 이전하기에 앞서, 뿌리에서 아가 배지를 씻어냈다. 이들은 플라스틱 반구형 덮개로 덮었다. 다음 1주동안, 덮개를 점진적으로 들어 올려 식물을 순응시켰다. 대략 5주후, 식물은 Cornex 혼합물을 포함하는 3 갤런 용기로 이전하였다.

배지 성분

1/2 MSO

시약	ℓ당
MS 염	2.15 g
미오이노시톨	100 ㎎
티아민 HCl 원액(0.4 ㎎/㎖)	5 ㎖
피리독신 HCl 원액(0.5 ㎎/㎖)	1 ㎖
니코틴산 원액(0.5 ㎎/㎖)	1 ㎖
수크로오스	10 g
pH 5.8± 0.03
아가/아가	8 g

KCMS

시약	ℓ당
MS 염	4.3 g
티아민 HCl 원액(1 ㎎/㎖)	1.3 ㎖
미오이노시톨	100 ㎎
2,4-D 원액(1 ㎎/㎖)	200 ㎕
KH2PO4	200 ㎎
키네틴 원액(1 ㎎/㎖)	100 ㎕
수크로오스	30 g
pH 5.5± 0.03
아가 겔	5.2 g

LB 배지

시약	ℓ당
Bacto-트립톤	10 g
효모 추출액	5 g
NaCl	10 g
Difco Bacto 아가	15 g

YM 배지

시약	ℓ당
효모 추출액	400 ㎎
만니톨	10 g
NaCl	100 ㎎
MgSO4ㆍ7H2O	200 ㎎
KH2PO4	500 ㎎

대안으로, 분말 형태의 YM은 구입할 수 있다(Gibco BRL; catalog #10090-011). 액체 배양 배지를 만들기 위하여, 11.1 g을 1 ℓ 물에 첨가한다.

MS 액체 배지

시약	ℓ당
MS 염	4.3 g
미오이노시톨	100 ㎎
글리신	2 ㎎
니코틴산	0.5 ㎎
피리독신 HCl	0.5 ㎎
티아민 HCl	0.4 ㎎
엽산	0.25 ㎎
D-비오틴	0.05 ㎎
수크로오스	30 g
pH 5.6

2Z

시약	ℓ당
MS 염	4.3 g
미오이노시톨	100 ㎎
Nisch 비타민 원액(1000X)*	1 ㎖
수크로오스	20 g
pH 6.0± 0.03
아가 겔	5.2 g

선별 착근 배지

시약	ℓ당
MS 염	4.3 g
Nisch 비타민 원액(1000X)*	1 ㎖
수크로오스	30 g
pH 6.0± 0.03
Difco Bacto 아가	8 g

증기멸균이후 ℓ당 아래의 필터-멸균된 성분을 첨가한다:

비알라포스: 2 ㎖의 1 ㎎/㎖ 원액

티멘틴: 3 ㎖의 100 ㎎/㎖ 원액

Nitsch 비타민 원액(1000x)

시약	50 ㎖당
글리신	0.1 g
니코틴산	0.5 g
피리독신 HCI	0.025 g
티아민 HCI	0.025 g
엽산	0.025 g
d-비오틴	0.002 g

pH 7.0의 투명 용액으로 조정한다.

실시예 12: 식용 백신의 생산 시스템으로서 토마토

합성 HN 유전자의 조합. 카사바 베인 모자이크 바이러스(CsVMV)의 프로모터를 보유하고 콩 성장 저장 단백질(VSP)의 3' 요소에 의해 종결되는 HN 발현 카세트는 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 식물 형질전환을 위하여 Mason Laboratory(The Boyce Thompson Institute for Plant Research(BTI))에 의해 조합되고 이원 벡터에 삽입되었다. 상기 벡터는 식물 선별 마커 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라아제(PAT, US 특허: 5,879,903; 5,637,489; 5,276,268; 5,273, 894)를 인코딩하는 유전자를 보유한다(도 30).

토마토 형질전환과 재생. 토마토 떡잎(품종 Tanksley TA234TM2R)의 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 형질전환은 Van Eck Laboratory(BTI)에 의해 Frary & Earle[12]에 따라 수행되었다. 재생 외식체는 매 3주마다 새로운 배지로 이전하였다. 녹색 지맥은 대략 1 ㎝ 크기에 도달하면, 50 ㎎/ℓ 카나마이신, 300 ㎎/ℓ 티멘틴, 4 ㎎/ℓ IBA로 보충된 착근 배지(MS 염 4.3 g, 1 ㎖/ℓ Nitsch 비타민 1000X, 30 g/ℓ 수크로오스, 8 g/ℓ difco bacto 아가, pH 6.0)를 포함하는 GA-7 상자(Magenta Corporation, Chicago, IL)로 이전하였다. 착근된 모종은 토양으로 이전하고 12시간 광주기하에 28℃에서 유지시켰다.

단백질 추출과 ELISA 분석. 가공되지 않은 단백질 추출물은 QBiogene(Carlsbad, CA, USA) Fast Prep 기계에서, 5 ㎕ PBS당 1 ㎎의 새로운 잎, 열매 또는 NT1 세포 물질, 또는 10 ㎕ PBS당 1 ㎎의 건조된 잎, 열매 또는 NT1 세포 물질을 균질화시켜 제조하였다. 불용성 물질은 14,000 rpm의 Eppendorf 5415C 미세원심분리기에서 4℃에서 5분동안 원심분리하여 제거하였다. 생성된 샘플 상층액은 분석동안 얼음 위에 유지시키고, 이후 -80℃에 보관하였다.

96 웰 마이크로역가 평판(Costar 3590, Fisher Scientific, PA, USA check)은 0.01 M 붕산염 완충액에서 SPAFAS 병아리 항-NDV 다클론 항체(Benchmark Biolabs, NE)의 1/1000 희석액 100 ㎕/웰로 피복하였다. 이들 평판은 덮고 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 평판은 30분동안 실온으로 평형화시키고, 이후 0.05% Tween-20(PBST)을 함유하는 300 ㎕/웰의 인산염 완충액으로 3회 세척하였다. 평판은 PBST에 녹인 3% 탈지유 200 ㎕/웰로 37℃에서 2시간동안 차단하고 PBST로 3회 세척하며, 이후 50 ㎕/웰의 단백질 추출물을 첨가하였다. ELISA는 5% 탈지유 + PBS + 0.05% Tween-20에서 가공되지 않은 추출물의 일련의 2배 희석액에서 2회 중복 수행하였다. 평판은 37℃에서 1시간동안 배양하고, 이후 PBST로 3회 세척하였다. PBST에 녹인 1% 탈지유에서 1/250 희석된 100 ㎕의 일차 항체, HN Mab 4A(Benchmark Biolabs)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 평판은 PBST로 3회 세척하고, PBST에 녹인 1% 탈지유에서 1/3,000 희석된 100 ㎕/웰의 염소 항-생쥐 IgG 양고추냉이 과산화효소(HRP) 공액체(Sigma, St Louis, MO, USA)를 첨가하며 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 평판은 PBST로 4회 세척하고 50 ㎕/웰의 TMB 과산화효소 EIA 기질 키트(BioRad)를 첨가하며 실온에서 5분동안 배양하였다. ThermoMax Micropla 판독기에서 450 nm 흡광도를 측정하였다. 항-HN ELISA로 획득된 ELISA 데이터는 정제된 HN(Benchmark Biolabs)을 이용하여 작성된 표준 곡선에 대조하여 생체중 g당 ㎍으로 전환시켰다.

잎에서 HN 발현에 기초한 4개의 상위 라인이 열매 분석에 이용되었다.

핵산 추출. 10 ㎖의 추출 완충액(4% p-아미노 살리실산, 1% 1,5 나프탈렌디설폰산, 이나트륨염 수화물), 3 ㎖ CTAB 완충액, 10 ㎖ 완충액 포화된 페놀(pH 4.3)을 50 ㎖ Falcon 튜브에 첨가하고 70℃ 수조에서 10분동안 가열하였다. 대략 3.5 g의 개별 토마토 열매는 액체 질소에서 가루로 으깨고, 이후 가열된 튜브에 첨가하고 30초동안 활발하게 교반하였다. 10 ㎖의 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)을 첨가하였다. 생성된 슬러리는 30초동안 교반하고, 이후 10,000 rpm으로 4℃에서 20분동안 원심분리하였다. 수상은 50 ㎖ Falcon 튜브로 이전하고 2 볼륨의 에탄올과 혼합하며 실온에서 15분동안 침전시켰다. 이후, 추출액은 10,000 rpm으로 4℃에서 15분동안 원심분리하고, 상층액은 버렸다. 생성된 핵산 펠렛은 2 ㎖ DEPC 처리된 물에 재부유시키고 동등 용적의 4 M LiCl과 혼합하며 -20℃에서 하룻밤동안 침전시켰다. 추출물은 10,000 rpm으로 4℃에서 20분동안 원심분리하였다. 게놈은 DNA를 포함하는 상층액은 다른 튜브로 옮기고 2 볼륨의 에탄올로 침전시키며 -20℃에서 하룻밤동안 보관하였다. 한편, RNA 펠렛은 DEPC 처리된 물에 재부유시키고 -20℃에서 보관하였다. 다음날, DNA 펠렛은 10,000 rpm으로 4℃에서 20분동안 원심분리하고, 1 g/㎖ Rnase A를 함유하는 물에 재부유시켰다.

서던 분석. 50 ㎍의 토마토 게놈 또는 330 ng의 pCHN 플라스미드 DNA는 DNA ㎍당 5 단위의 제한 효소 EcoRI으로 37℃에서 20 내지 24시간동안 절단하였다. 절단되지 않은 샘플과 절단된 샘플은 1.0% TAE 아가로오스 겔에서 하룻밤동안 이동시켰다. 겔은 1회 20분 퓨린제거(depurination) 세척(0.25 M MCI), 2회 30분 퓨린제거 세척(1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH), 2회 30분 중화 세척(0.5 M TrisHCI, pH 7, 3 M NaCl)에 의한 이전을 준비하였다. 이후, DNA는 모세관 이전으로 나일론 막(Zeta-Probe 블랏팅 막, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 이전하고, 이후 Bio-Rad GS Gene Linker를 이용한 UV 가교-결합으로 고정시켰다. PCR 표지된 프로브는 pCHN 주형에서 프라이머 세트 HNa(CCG AGC AGT TTC ACA AGT GG, SEQ ID NO: 10)와 HNb(CCT GAT CTT GCT TCA CGT ACA, SEQ ID NO: 11)를 이용하여 만들었다. DIG 표지된 dCTP는 제조업자의 안내에 따라 Roche Molecular Biochemical DIG PCR Probe Synthesis 키트를 이용하여 1734 bp 앰플리콘에 통합하였다. 증폭은 iCycler Gradient Thermo Cycler(BioRad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 37회 사이클 이상으로 수행하였다. 주형은 먼저 94℃에서 5분동안 용융시키고, 이후 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 90초의 35회 사이클을 수행하였다. 최종 신장 단계는 72℃에서 5분동안 수행하고, 이후 4℃에서 침수(soaking)시켰다. 혼성화 병 및 막(membrane)당 10 ㎖ DIG Easy Hyb(Roche Scientific, Mannheim, Germany)는 혼성화 오븐에서 45℃로 사전-가열하였다. 막은 45℃에서 60분동안 사전혼성화시키고, 45℃에서 하룻밤동안 프로브 농도의 5 ㎕/㎖ DIG Easy Hyb와 혼성화시켰다. 혼성화이후 세척과 검출은 제조업자의 안내(Roche - DIG 세척과 블록 완충액 세트 및 DIG Luminescent Detection Kit)에 따라 수행하였다. 표지된 막은 필름에 노출이후 가시화시켰다.

노던 분석. 감자 형질전환체와 야생형 식물로부터 30 ㎍의 전체 RNA 및 1.25 ㎍의 라더(ladder)(높은 범위 RNA 라더, MBI Fermentas, Hanover, MD)는 포름알데히드/포름아마이드로 변성시키고 1% 아가로오스 3-(N-모르폴리노)포로판설폰산(MOPS) 포름알데히드에서 80V에서 2시간동안 이동시켰다. RNA는 상향 모세관 작용으로 제타 프로브 막(BioRad, Hercules, CA, USA)으로 이전하고 UV 가교-결합으로 고정시켰다. 이후, 막은 0.5M 나트륨 아세테이트에 녹인 0.04% 메틸렌 블루로 염색하여 RNA 이전이 성공적으로 수행되었는지의 여부를 결정하고 모든 샘플에서 RNA 농도가 유사한 지를 확인하였다. PCR 표지된 DNA 프로브는 pCHN 주형에서 프라이머 세트 HNa와 HNb를 이용하여 만들었다. DIG 표지된 dCTP는 제조업자(PCR DIG Probe Synthesis 키트, Roche Scientific, Mannheim, Germany)의 안내에 따라 1734 bp 앰플리콘에 통합하였다. 증폭은 서던 분석에서 기술된 바와 동일하게 수행하였다. 혼성화 병 및 막(membrane)당 10 ㎖ DIG Easy Hyb(Roche)는 혼성화 오븐에서 45℃로 사전-가열하였다. 막은 45℃에서 적어도 90분동안 사전혼성화시키고, 하룻밤동안 프로브 농도의 7.5 ㎕/㎖ DIG Easy Hyb와 혼성화시켰다. 혼성화이후 세척과 검출은 제조업자의 안내(Roche - DIG 세척과 블록 완충액 세트 및 DIG Luminescent Detection Kit)에 따라 수행하였다. 표지된 막은 필름에 노출이후 가시화시켰다.

웨스턴 분석. Benchmark Biolabs에 의해 공급된 정제된 HN 및 pCHN으로 형질전환된 NT1 세포주 119(BTI)는 양성 대조로 이용하였다. 20 ㎕의 단백질 추출물은 4 ㎕ 6X SDS 겔 적하 완충액(300mM Tris-HCl, pH 6.8, 600 mM DTT, 12% SDS, 0.6% 브로모페놀 블루, 60% 글리세롤)에 첨가하고 10분동안 끓이며 15% 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔에 적하하였다. 겔은 염료 앞선이 겔 바닥으로부터 대략 5 ㎜ 이동할 때까지 겔당 30 밀리암페어로 트리스-글리신 완충액(25 mM Tris, 250 mM 글리신, pH 8.3, 0.1% SDS)에서 이동시켰다. 분리된 단백질은 BioRad Trans Blot 세포(2시간동안 50 V, 또는 하룻밤동안 7 V)를 이용하여 겔로부터 PVDF 막으로 이전하였다. 모든 막 세척은 달리 명시하지 않는 경우에 실온의 PBST(PBS + 0.1% Tween-20)에서 수행하였다. 막은 혼성화 배양기(Fisher Scientific, Tustin, CA, USA)에서 완만한 회전을 이용하여, 4℃에서 하룻밤동안 또는 실온에서 2시간동안 5% 탈지유 + PBS + 0.1% Tween-20으로 차단하였다. 막은 짧게 2회 세척하고, 이후 1% 탈지유 + PBS + 0.1% Tween-20에서 1/50,000 희석된 일차 항체, 생쥐 항-HN Mab14F 항혈청(Benchmark Biolabs)과 함께 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 막은 1회 15분 세척과 3회 5분 세척에 앞서 PBST에서 짧게 씻어내고, 이후 1/30,000 희석된 항-토끼 IgG 양고추냉이 과산화효소(HRP) 공액체(Sigma)에서 37℃에서 1시간동안 완만하게 회전하면서 배양하였다. 막은 씻어내고, 이후 1회 15분 세척과 3회 5분 세척을 수행하였다. 검출은 제조업자의 안내에 따라 Amersham ECL + 키트를 이용하여 수행하였다.

혈구응집 활성. 1% 병아리 적혈구 세포(cRBC) 표준화 용액을 만들기 위하여, Alsevers 용액(Colorado Serum, Co)에 담긴 cRBC는 15 ㎖ 원뿔 튜브로 이전하고 250 g에서 10분동안 원심분리하였다. 상층액은 흡출하고, 펠렛은 칼슘과 마그네슘 없는 10 ㎖ 둘베코 인산염 완충액(DPBS)(Cellgro, Mediatech, Inc. Kansas City, MO)에 재부유시켰다. 현탁액은 250 g에서 10분동안 원심분리하였다. 세척과 재부유는 상층액이 투명해 질 때까지 반복하였다. 이런 작업이 완결되면, 세포는 펠렛하고 상층액은 흡출하여 압축된 RBC 펠렛을 남겼다. 이후, 펠렛은 1% DPBS-(용적 대 용적)에서 희석하였다. 400 ㎕의 1% RBC 용액은 작은 튜브로 이전하고 1.6 ㎖ 탈이온수를 첨가하며, 이후 20초동안 고속으로 회전시켜 세포를 용해시켰다. cRBC 용액은 용해된 세포의 540 nm 흡광도가 0.4 - 0.5가 될 때까지 사용하지 않았다. 96-웰 U 바닥 평판(Falcon)은 50 ㎕/웰의 DPBS를 첨가하기에 앞서 정전기방지 스프레이를 분무하였다. NDV HN의 양성 대조와 DPBS의 음성 대조를 포함하는 50 ㎕의 샘플은 1열에 첨가하고 반복 피펫팅을 통하여 혼합하며, 이후 50 ㎕를 다음 열로 이전함으로써 연속 희석하였다. 50 ㎕의 표준화 cRBC를 각 웰에 첨가하고, 희석액은 600 rpm의 평판 교반기에서 20 - 30초동안 배양하였다. 그 다음, 평판은 5℃에서 1시간동안 배양하고 대조 NDV HN 웰에서 혈구응집을 조사하였다. 이런 작업이 완결되면, 최종 판독을 수행하였다. HA 역가는 혈구응집에 양성인 최대 희석도의 역수로서 획득하였다.

분석. 열매 성숙은 에틸렌 생합성과 호흡의 속도 증가, 엽록소 분해, 색소 축적, 열매 연화와 같은 조직 변화, 당과 유기산의 수준 변화, 휘발성 방향족 화합물의 생산을 비롯한 다수의 생화학적, 생리학적 변화로 특성화되는 진화적으로, 유전적으로 조절된 과정이다(Brady CJ. Annu Rev. Plant Physiol. 1987; 38: 155- 178). 열매 pH와 고체 내용물(주로, 당) 간에는 명백한 상관관계가 존재한다(Benton Jones J. Tomato plant culture: in the field, greenhouse, and home garden. New York: CRC Press, 1999). 성숙도(degree of ripeness) 역시 pH에 영향을 주는 인자이다. 야생형 TA234의 성숙은 열매 pH를 유의하게 감소시키고(α = 0.05)(도 31) 전체 가용성 단백질을 전반적으로 감소시킨다(도 32). 감소의 정도가 상이하긴 하지만, 이는 다른 연구에서도 확인되었다((Benson Jones J. Tomato plant culture: in the field, greenhouse, and home garden. New York: CRC Press, 1999).

잎 조직에서 가장 높은 수준으로 HN을 발현하는 4가지 세포주는 상이한 표현형을 보유한다. 세포주 CHN-1, CHN-12, CHN-32의 표현형은 대조 식물과 구별되지 않는 반면, 세포주 CHN-10은 두껍고 주름진 잎 및 늦은 플라워 세트(flower set)와 열매 발육과 같은 배수성(polyploidy)을 암시하는 형질을 보였다. 서던 분석에서 플라스미드 대조와 게놈 샘플 간의 신호 강도를 비교하면, 이들 세포주는 1 내지 4개의 외래유전자 사본을 보유하는데(도 33), CHN-1은 2개의 사본, CHN-10은 4개의 사본, CHN-12는 1개의 사본, CHN-32는 2개의 사본을 보유하였다. CHN-10은 배수성 세포주일 가능성이 높기 때문에, 후속 연구 또는 백신 배치의 생산에 이용하지 않는다.

사전-혼성화와 혼성화 단계에 앞서 노던 막의 메틸렌 블루 염색은 겔로부터 막으로 RNA의 이전이 성공적으로 수행되고, 각 샘플에서 유사한 농도의 RNA가 존재한다는 것을 입증하였다(도 34a). HN 유전자에 특이적인 전체 RNA의 노던 분석에서, 야생형 음성 대조에서는 띠가 나타나지 않았지만 외래유전자도입 토마토 세포주에서는 대략 5000개 뉴클레오티드의 띠가 나타났다(도 34b). 프로모터와 종결인자를 포함하는 HN 유전자 발현 카세트가 2,832 bp이고 통합된 T-DNA 내에서 발현 카세트가 4,323 bp이기 때문에, 전사체는 예상보다 크며 HN 유전자의 전사동안 VSP 3' 종결 신호의 판독에 기인하는 것으로 생각되었다. 전사체 우세(transcript prevalence)는 한 세포주 내에서 및 세포주 간에 열매 성숙의 개별 단계에서 상이하였다. 세포주 CHN-10은 열매가 성숙함에 따라 HN-특이적 mRNA 함량에서 분명한 감소를 보였다(도 34b). 하지만, 노던 분석에 하나의 열매만 샘플링되었기 때문에, 다른 CHN 토마토 세포주에서 RNA 우세와 성숙 단계 간에 패턴을 인식할 수는 없었다.

외래유전자도입 세포주의 항-HN ELISA에서, 열매가 성숙함에 따라 농도가 감소하는 경향이 관찰되었다(도 35). 단계 4와 5 열매는 세포주 CHN-1(도 35a)과 CHN-10(도 35b)에서 단계 1 열매 및 CHN-32에서 단계 2 열매보다 생체중 g당 유의하게 적은 HN를 보유하였다(도 35c)(α = 0.05). HN 농도는 상이한 품종 간에 동일한 단계에서 유의한 차이가 관찰되지 않았다(α = 0.05). HN 농도는 생체중 g당 71.1 내지 3.5 ㎍이었고, 각 세포주에서 최대 농도는 CHN-1의 단계 1 열매에서 생체중 g당 67.2 ㎍, CHN-10의 단계 1 열매에서 생체중 g당 63.3 ㎍, CHN-12의 단계 1 열매에서 생체중 g당 65.4 ㎍, CHN-32의 단계 2 열매에서 생체중 g당 71.1 ㎍이었다. 이런 이유로, HN 토마토 작물을 수확하는 최적 단계는 녹색 단계(green stage) 또는 초기 채색 단계(early breaker stage)이다.

과다적하된 Lasota NDV HN 양성 대조의 웨스턴 분석에서, 대략 49, 74, 78, 90, 120, 200, 250, 250 kDa 초과의 띠가 나타났다(도 36). 78 kDa 띠는 작은 띠 분해 산물인 HN 단량체로 명명하였다. 90 kDa 띠는 상이한 당화 형태로 생각되고, 120 kDa 이상의 띠는 HN 중합체로 생각되었다. 상이한 단계에서 외래유전자도입 열매의 웨스턴 분석은 HN의 낮은 발현으로 인하여 어렵긴 했지만, 대략 78과 70 kDa 띠가 관찰되었다. 이들 띠는 외래유전자도입 토마토 식물의 잎 및 NT1 세포주 119에서도 존재했지만 토마토 또는 NT1 세포주 음성 대조에는 존재하지 않았다. 78과 70 kDa 띠는 HN 항원의 상이한 당화 형태를 대표하고, 70 kDa 띠는 HN 단량체의 절두 형태를 대표하는 것으로 생각되었다. 분해 산물로 생각되는 다른 밴드는 외래유전자도입 토마토의 잎 샘플의 경우에 대략 20과 48 kDa에서 관찰되었고, NT1 119 세포주의 경우에 48 kDa에서 관찰되었다.

NF는 토마토 열매 음성 대조 - 야생형 열매를 나타낸다; NL은 토마토 잎 음성 대조 - 야생형 잎을 나타낸다; NNT는 NT1 세포 음성 대조 - 비-형질전환된 세포주를 나타낸다; 119는 외래유전자도입 NT1 세포주 119를 나타낸다; L10은 외래유전자도입 토마토 세포주 10으로부터 잎을 나타낸다; L32는 토마토 세포주 32로부터 잎을 나타낸다; HN은 동물 유래된 Lasota NDV 바이러스를 나타낸다; M은 Bio-Rad의 정밀 플러스 단백질 전체 블루 표준을 나타낸다; 1-1은 세포주 CHN-1, 성숙 단계 1로부터 열매를 나타낸다; 1-3은 세포주 CHN-1, 성숙 단계 3으로부터 열매를 나타낸다; 1-6은 세포주 CHN-1, 성숙 단계 6으로부터 열매를 나타낸다; 32-1은 세포주 CHN-32, 성숙 단계 1로부터 열매를 나타낸다; 32-3은 세포주 CHN-32, 성숙 단계 3으로부터 열매를 나타낸다; 32-6은 세포주 CHN-32, 성숙 단계 6으로부터 열매를 나타낸다; 10-1은 CHN-10, 성숙 단계 1로부터 열매를 나타낸다. 단백질 크기는 kDa로 제시된다.

외래유전자도입 토마토의 냉동-건조된 녹색 열매와 잎의 혈구응집 검사에서, 모든 세포주에서 혈구응집 활성이 확인되었다(도 37). 활성은 세포주 CHN-1, CHN-12, CHN-32의 경우에 잎에서 가장 높았고, CHN-10 세포주만 열매에서 더욱 높은 활성을 보유하였다. 세포주 CHN-32는 열매와 잎에서 512와 2,048의 가장 높은 혈구응집 활성(도 37a) 및 HN ㎍당 10,928의 가장 높은 혈구응집 활성(도 37b)을 보였다. CHN-1 세포는 열매와 잎에서 128과 256의 두 번째로 높은 혈구응집 활성 및 HN ㎍당 3,994의 두 번째로 높은 혈구응집 활성을 보였다(도 37a와 b). 전사동안 올바르게 가공되지 않음에도 불구하고, 합성 HN 유전자는 기능성 단백질로 번역되었다.

CHN-10은 열매, 동물 시험의 표적 기관, 백신 전달에서 더욱 높은 HN 활성을 보이긴 하지만, 꽃과 열매로의 지연에 더하여 상기 세포주의 배수성 상태로 인하여 추후 연구를 위한 후보로서 부적합하였다. 4가지 세포주에서 HN 발현 수준과 HN 활성을 고려하여, CHN-1과 CHN-32 세포주가 추후 분석을 위하여 선택되었다.

웨스턴 분석, ELISA, 헤마글루티닌 활성 검사는 토마토가 ELISA에서 항원성이고 혈구응집 활성을 유지하는 정확한 크기78 kDa)의 HN 단백질을 발현할 수 있다는 것을 입증한다. CsVMV 프로모터의 조절하에 HN을 발현하는 토마토 열매를 수확하는 최적 시점은 열매 성숙의 초기 단계이다. 이는 수확까지의 시간을 2주 감소시키고 HN 발현을 대략 15-배 증가시켰다. 단백질이 정확하게 가공되긴 하지만, DNA 수준에서 유전자는 정확하게 가공되지 않는 것으로 노던 분석에서 드러났다. 5,000 뉴클레오티드 전사체는 HN 유전자 종결인자의 판독에 기인할 가능성이 높다. 세포주 CHN-1과 CHN-32는 추가 연구로의 진행을 위한 최적 세포주로서 생각되었다.

실시예 13: 토마토 열매의 성숙동안 HN 발현

미성숙 열매가 단계 1 토마토보다 높은 수준으로 HN을 발현할 수 있는 지를 결정하기 위한 성숙하는 토마토 열매에서 HN 수준.

적색-과육 토마토 품종의 열매는 성장이 완결되었음에도 여전히 녹색인 경우에 성숙하다고 한다. 이런 성숙 단계는 “녹색 단계” 또는 “단계 1”로 알려져 있다. 토마토는 일반적으로 상기 단계에서 수확되고, 이후 에틸렌에 의해 성숙된다. 이후의 단계는 녹색으로부터 황갈색 또는 핑크색으로 색채의 명백한 변화가 나타나는 “채색 단계” 또는 “단계 2”(성숙된 과방수확형 토마토는 본 단계에서 수확된다); 토마토의 10% 초과에서 30% 미만(가령, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 29%)의 표면이 녹색으로부터 황갈색, 핑크색 또는 적색으로 색채의 명백한 변화를 보이는 “전환 단계(turning stage)” 또는 “단계 3”; 열매의 30% 초과에서 60% 미만(가령, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 55, 59%)의 표면이 핑크색 또는 적색인 “핑크색 단계” 또는 “단계 4”; 열매의 60% 초과에서 90% 미만(가령, 61, 62, 63, 64, 65, 70. 75, 80, 85, 89%)의 표면이 핑크빛-적색 또는 적색인 “밝은 적색 단계” 또는 “단계 5”; 열매의 90% 초과(가령, 91, 92, 93, 94, 95, 99, 100%)의 표면이 적색인 “적색 단계” 또는 “단계 6”이다.

카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터(CsVMV)에 의해 유도된 뉴캐슬병 바이러스 헤마글루티닌 뉴우라미니다아제(HN) 단백질에 대한 합성 식물 최적화된 유전자의 발현은 토마토 열매가 성숙함에 따라 감소하였다. 단계 1 녹색 토마토 열매에서, HN 발현은 대략 생체중(FW) g당 12 ㎍이고, 토마토가 단계 6 적색 토마토 열매로 성숙함에 따라 2.5 ㎍/g FW의 근사치로 점진적으로 감소하였다.

T₀ CHN 세대(CHN-1, CHN-32)에서 우수한 각 세포주로부터 하나의 T₁ 식물을 발앙시키고 성장시켰다. 개화가 시작되면, 각 꽃을 손으로 자가-수분하여 타가-수분(cross-pollination)을 예방하고 종이 타월로 감쌌다. 개별 꽃은 날짜를 기록하고 열매를 맺게 하였다. 각 식물 세포주로부터 이들 열매는 수분 1주후, 수분 2주후, 수분 4주후, 수분 6주후, 최종적으로 단계 1 녹색 열매(대략, 수분 8주후)에서 수확하였다. HN 함량의 ELISA 분석과 냉동 건조에 앞서 열매 직경(㎜)과 과육량(g)을 기록하였다. 토마토 열매의 직경을 측정하기 위하여, 버니어 캘리퍼스를 줄기에 직각으로 토마토 열매의 가장 넓은 부분에 적용하고, ㎜ 단위로 수치를 기록하였다. 질량은 질량 저울을 이용하여 측정하였다.

HN ELISA. 0.01M 붕산염 완충액에서 1:1500 희석된 SPAFAS 병아리 α-NDV 다클론 항체를 이용하여 96 웰 ELISA 평판을 피복하였다. 100 ㎕의 희석액은 각 웰에 피펫팅하고, 이후 평판은 덮고 4℃에서 하룻밤동안 방치하였다. 다음날 아침, 평판은 24℃에서 30분동안 평형화시키고, 이후 PEST(0.05% tween)로 3회 세척하였다. 3% 탈지유 용액을 만들고 200 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 평판은 37℃에 위치시키고 2시간동안 차단하였다.

샘플을 채취하기 위하여, 코아링 툴(coring tool)(크기 1)을 수평축을 따라 토마토의 중심에 밀어 넣었다. 샘플로부터 임의의 아교질 물질 또는 씨앗을 배제시켰다. 작은 칼을 이용하여, 대략 1 ㎝의 토마토를 채집하고 샘플 튜브에 위치시키며, 이후 상기 튜브를 얼음 위에 위치시켰다. 실제 샘플 중량은 전체 중량으로부터 개별 튜브 중량을 감하여 산정하고, 이후 20 x 토마토 추출 완충액(4M NaCl(최종 농도 100 mM), 0.5M EDTA(최종 농도 1 mM), 20% Triton-x 100(최종 농도 1O%), 레우펩틴(leupeptin)(최종 농도 1O ㎍/㎖), 0.5M NaPi, pH 7.0(최종 농도 50 mM), 초순수(milliQ water)로 부피 조절됨)(중량/부피)을 튜브에 첨가하였다. 세라믹 비드를 샘플 튜브에 추가하고, 샘플은 4.0 속도로 30초동안 Fast Prep 기계를 이용하여 균질화시켰다. 균질화된 샘플은 원심분리하고, 이후 표준 곡선을 준비하는 동안 얼음 위에 놓아두었다.

평판은 2시간동안 차단한 이후, PBST(PBS + 0.05% tween)로 3회 세척하였다. NDV HN 표준 곡선을 위하여, 1OO ㎕의 232 ng/㎖ NDV 정제된 원액(1:80)을 두 번째 열의 두 번째 웰에 피펫팅하였다. 50 ㎕의 1% 탈지유를 두 번째 열의 나머지 웰 및 마이크로역가 평판의 열 3-8에서 각 웰에 피펫팅하였다. 이후, 50 ㎕의 각 식물 샘플을 두 번째 열의 웰 3-11에서 1% 탈지유에 첨가하였다. 그 다음, 정제된 NDV 및 식물 샘플은 평판에서 각 열에서 다음 열로 50 ㎕씩 피펫팅함으로써 연속 희석하였다. 샘플은 각 희석 단계이후 상하로 피펫팅함으로써 웰에서 혼합하였다. 샘플의 최초 농도는 40배 희석이었다. 평판은 37℃ 배양기로 1시간동안 환원시켰다.

1시간동안 배양한 이후, 평판은 PBST로 3회 세척하고 일차 항체를 첨가하였다. 일차 NDV HN Mab 4A는 1% 탈지유에서 1:250의 희석액으로 희석하고 각 웰에 100 ㎕를 첨가하였다. 이는 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 이후, 평판은 PBST로 3회 세척하고 이차 항체 염소 항-생쥐 IgG를 1% 탈지유에서 1:3000의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 이는 37℃에서 1시간동안 배양하였다.

평판은 PBST로 4회 세척하고 50 ㎕ TMB 기질을 각 웰에 첨가하였다. 5분후, TMB를 1N H₂SO₄로 중화시켰다. 이후, 평판은 450nm 파장에서 분광광도계에서 판독하였다.

수분 손실 비율은 각 토마토 열매로부터 씨앗을 제거하고 중량을 측정하며 -20℃에서 동결시키고 냉동 건조시키며 토마토 열매를 재칭량함으로써 측정하였다.

HN 농도에 더하여 열매 크기에서 증가를 고려하여, 선택된 각 성숙 단계에서 토마토 열매의 HN 함량은 열매 HN 농도를 열매 중량으로 곱하여 산정하였다. 이에 더하여, 본 연구로부터 획득된 데이터를 이용하여 열매를 단계 1 또는 수분 4주후에 수확하는 경우에 우수한 CHN 세포주로부터 생산되는 가능 수량을 산정하였다. 상기 모델에서, 열매가 단계 3일 때 수확된 식물 및 열매가 수분 4주후일 때 수확된 식물로부터 동일한 수량의 열매가 생산되고, 1회 수량이 50 ㎍의 항원이라고 가정하였다.

열매 생리

예상된 바와 같이, 열매 크기, 중량, 수분 손실 비율은 시간이 흐름에 따라 증가하였다(도 38, 39, 40). 동일한 식물 세포주 내에서 동일한 성숙 단계에서 반복된 측정에서 약간의 변이만 관찰되었다. 동일한 성숙 단계에서 세포주 1과 32 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(α = 0.05).

성숙하는 열매의 HN 함량

성숙하는 열매에서 HN의 농도는 수분 2주후에 최대이었고, 이후 열매가 성숙함에 따라 감소하였다(도 41). 동일한 성숙 단계에서 2가지 토마토 세포주 간에, 그리고 수분이후 첫 4주간 HN 함량 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(α = 0.05). 수분 6주후 성숙 단계 1의 열매에서보다 수분 2주후 열매에서 유의하게 많은 HN이 존재하였다(α = 0.05).

HN 함량에 더하여, 열매 크기에서 증가를 고려하여, 선별된 각 성숙 단계에서 토마토 열매의 HN 함량을 산정하였다. 열매 내에서 HN 함량은 수분 4주후에 최대이었고(CHN-1 세포주의 경우에 723 ㎍, CHN-32 세포주의 경우에 630.9 ㎍), 이후 열매가 더욱 성숙함에 따라 감소하였다(도 42). 동일한 성숙 단계에서 세포주 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(α = 0.05).

열매를 단계 1 또는 수분 4주후에 수확하는 경우에 우수한 HN 세포주에 의해 생산되는 수량을 산정하였다(표 10). 각 수확으로부터 동일한 수량의 열매가 생산되고, 1회 수량이 50 ㎍의 항원이라고 가정하였다. 이들 데이터는 33개의 열매가 단계 1에서 수확되면 126개의 수량이 생산되고, 열매가 수분 4주후에 수확되면 486개의 수량이 생산된다는 것을 지시한다. 따라서, 수확 시간은 4주 감소하고, 수량은 286% 증가한다.

HN 농도가 수분 2주후 토마토 열매에서 생체중 g당 38.8 - 42 ㎍으로 최대이었지만, 수분이후 첫 4주동안 HN 농도에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(α = 0.05). 하지만, 질량을 고려하면, 수분 4주후 토마토 열매는 평균 631 - 723 ㎍ HN이었는데, 이는 검사된 다른 성숙 단계에서보다 유의하게 높았다(α = 0.05). 성숙 단계 1 및 수분 2주후와 4주후 열매 간의 수분 손실 비율이 별다른 차이가 없기 때문에(전체 2.6% 차이), 수분 4주후에 유의하게 높은 항원 함량은 수분 함량 또는 항원의 희석도를 변화시키는 인자가 아니었다. 이들 데이터는 CsVMV 프로모터의 조절하에 HN을 발현하는 토마토 열매를 수확하는 최적 시점이 수분 4주후라는 것을 암시한다.

열매가 수분 4주후 시점에 있는 지를 용이하게 확인하기 위하여, 전체 성숙 동안 열매 중량과 직경을 기록하였다. 수분 4주후, 중량 평균은 40 g이었고, 평균 직경은 42 내지 45 ㎜이었다. 열매 크기는 유전적 특질, 온도, 일장(day length), 식물 연령의 영향을 받는다. 평균에서 적은 표준 오차는 열매 크기에서 식물간 변이와 관련하여 유전적 특질이 문제가 되지 않음을 지시하였다. 하지만, 스트레스(온도 변화, 일장, 식물 연령에 기인한)의 효과는 열매 크기가 항상, 수분이후 시점의 정확한 지표가 되는 것은 아니라는 것을 의미한다. 이런 이유로, 열매 크기를 이용하여 수분 시점을 근사하는 경우에, 상당한 온도 변화, 일장, 식물 연령을 염두에 두어야 한다.

토마토 열매의 성숙에서 조기 수확의 이점을 산정하기 위하여, 평균 생산 기간 동안 한 식물로부터 33개의 열매가 수확되고, HN의 1회 수량이 50 ㎍이라고 가정하는 보수적인 모델을 고안하였다. 상기 모델은 1회 수량이 50 ㎍ 이하일 가능성이 높고, 수분 4주후에 수확된 열매를 보유하는 식물이 대사 부담(metabolic burden)을 감소시키고 후기 단계에서 수확된 열매를 보유하는 식물보다 더욱 많은 열매를 생산할 가능성이 높다는 점에서 보수적이다. 이들 데이터는 수분 4주후에 열매를 수확함으로써, 열매를 수확하는데 요구되는 시간이 4주 감소하고 수량이 286% 증가한다는 것을 암시한다.

이런 이유로, 토마토는 열매 성숙에서 최적 시점에 수확되는 경우에 다량의 HN을 발현할 수 있다.

실시예 14: CHN-18 마스터 시드의 제조

마스터 시드 계대배양: 마스터 시드 계대배양 2를 DNA 추출에 이용하였다.

DNA 추출과 PCR 증폭: DNA 추출은 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. HN과 PAT 유전자 발현 카세트에 대한 PCR 증폭은 별개로 수행하였다. HN과 PAT 발현 카세트의 PCR 산물 간에 24 bp 중복이 존재하였다.

HN 유전자 카세트 증폭을 위하여, 50 ㎕의 PCR 반응물은 2.5 단위의 Takara Ex Tag DNA 중합효소(Takara Shuzo Co, Shiga, Japan, catalog # RROO1A), 0.2 μM의 각 프라이머(CHNO1/CHN03), MgCl₂를 함유하는 5 ㎕의 1OX 반응 완충액, 0.2 mM의 각 dNTP, 200 ng의 게놈 DNA를 함유하였다. PCR은 아래의 조건에서, Applied Biosystem(Foster City, CA)에 의해 제조된 Gen Amp PCR 9700 시스템으로 수행하였다: 94℃에서 5분의 1회 사이클; 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 3분 30초의 40회 사이클; 72℃에서 7분.

PAT 유전자 카세트 증폭을 위하여, 50 ㎕의 PCR 반응물은 2.5 단위의 Takara Ex Tag DNA 중합효소(Takara Shuzo Co, Shiga, Japan, catalog # RROO1A), 0.2 μM의 각 프라이머(CHNO2/CHN04), MgCl₂를 함유하는 5 ㎕의 1OX 반응 완충액, 0.2 mM의 각 dNTP, 200 ng의 게놈 DNA를 함유하였다. PCR은 아래의 조건에서, Applied Biosystem(Foster City, CA)에 의해 제조된 Gen Amp PCR 9700 시스템으로 수행하였다: 94℃에서 5분의 1회 사이클; 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 2분 30초의 40회 사이클; 72℃에서 7분.

PCR 산물의 클로닝: 아가로오스 겔 전기영동과 시각적 관찰이후, PCR 산물은 제조업자의 프로토콜에 따라 MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen, Valencia, CA. Catalog # 28004)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 제조업자의 프로토콜에 따라 TOPO TA Cloning® 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, Catalog # 051302)를 이용하여 pCR® II-TOPO 벡터에 클론하였다.

플라스미드 DNA 추출 플라스미드 DNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 Qiaprep Spin Minprep 키트(Qiagen, Valencia, CA, catalog # 27106)를 이용하여 추출하였다.

DNA 서열분석: 클론된 PCR 산물을 보유하는 플라스미드 DNA는 ABI PRISM® BigDye^TM 프라이머 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystem, Foster City, CA)를 이용한 염기서열분석을 위하여 Lark Technologies Inc(Houston, TX)로 발송하였다. DNA 서열은 벡터 NTI 프로그램(InforMax, Frederick, MD)을 이용하여 분석하였다.

결과

HN과 PAT 카세트로부터 DNA 서열은 조합하고 pCHN의 가상 플라스미드 지도 유전자 서열과 비교하였다. CsVMV 프로모터, HN과 PAT 코딩 서열, vspB 3' UTR, MAS 3' UTR를 비롯한 모든 유전자 요소의 DNA 서열은 가상 플라스미드 지도 pCHN에서와 동일하였다. 가상 플라스미드 지도 pCHN에 기초하여, 프라이머 CHN01/CHN02를 이용한 CHN-18 마스터 시드에 전체 유전자 삽입체를 보유하는 PCR 산물은 4757 bp이었다. 하지만, CHN-18 마스터 시드에서 전체 유전자 삽입체를 보유하는 실제 클론되고 염기서열분석된 PCR 산물은 4768 bp이었다. 서열 비교에서, 7개의 추가 DNA 염기는 PAT 코딩 서열과 MAS 3' UTR 사이의 접점 영역(폴리 클로닝 부위)에 위치하고, 다른 4개의 추가 DNA 염기는 MAS3' UTR의 3' 말단 외부에 위치하였다(도 43). 가상 플라스미드 지도와 실제 염기서열분석 데이터 간에 불일치하는 DNA 염기수는 플라스미드 지도 pCHN의 가상적인 창조 동안 발생할 가능성이 높다. 전체 삽입체 서열의 개방 해독틀 분석은 예상된 HN과 PAT 개방 해독틀만 존재하고, 11개의 DNA 염기가 현재의 HN과 PAT 개방 해독틀에서 임의의 변화를 유발하지 않고 임의의 새로운 개방 해독틀을 발생시키지 않는다는 것을 지시하였다.

결론

플라스미드 지도 pCHN의 가상 서열과의 비교를 통하여, CHN-18 마스터 시드에서 전체 게놈 삽입체의 실제 DNA 서열은 유전자 삽입체에서 모든 유전자 요소 이외에 추가의 11개 DNA 염기를 제외하고 예상된 바와 동일하였다. 이들 11개 DNA 염기는 현재의 HN과 PAT 개방 해독틀에 어떤 영향도 주지 않는다.

본 발명에 따른 작동의 원리, 바람직한 구체예, 양식은 상기한 명세서와 실시예에서 기술하였다. 하지만, 본원에서 보호받고자 하는 발명은 구체적으로 개시된 특정 형태에 한정되지 않는데, 그 이유는 이들 형태가 한정이 아닌 예시로서 간주되기 때문이다. 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다.

본 발명의 실시에는 달리 명시하지 않는 경우에, 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학, 세포 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술의 통상적인 기술이 이용된다. 이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 상세하게 기술되어 있다(참조: Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization(B.D. Harnes & S.J. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal, 1984);(Harrow, E. and Lane, D.) Using Antibodies: A Laboratory Manual(1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press; a series, Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); Short Protocols In Molecular Biology,(Ausubel et al., ea., 1995).

본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 본 발명이 특정 구체예를 인용하여 기술되긴 했지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 포섭되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> Boyce Thompson Institute for Plant Research DowAgroSciences, LLC <120> Vectors and Cells for Preparing Immunoprotective Compositions Derived from Transgenic Plants <130> 3121/2028 <150> US 60/467,998 <151> 2003-05-05 <160> 26 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1760 <212> DNA <213> Newcastle disease virus <400> 1 ccatggaccg agcagtttca caagtggctc ttgagaatga tgagagggaa gccaagaaca 60 cttggaggct tatctttcgg atagccattc tctttcttac tgttgtcacc ctagcaatct 120 ctgttgcatc attactctat tctatgggag caagcacccc ctcagactta gttggcatac 180 ccacacgaat ctctagggct gaagagaaga ttaccagtac cctaggctcc aaccaggatg 240 ttgtggaccg aatctacaaa caagttgcac ttgaaagtca acttgcatta ctcaacacag 300 aaactaccat catgaatgca atcaccagcc tatcctatca gatcaatggg gctgccaaca 360 attcaggttg gggagcccca attcatgatc cagactacat tggaggtatt ggcaaagaac 420 tcattgtaga tgatgcttca gatgttacat ctttctatcc ttcagctttc caggaacatc 480 tgaacttcat tcctgcaccc acaactggga gtgggtgcac tcggataccc tcatttgaca 540 tgagtgctac acactattgc 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Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile 145 150 155 160 Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp 165 170 175 Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln 180 185 190 Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 195 200 205 Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly 210 215 220 Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser 225 230 235 240 Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile 245 250 255 Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 260 265 270 Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser 275 280 285 Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys 290 295 300 Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val 305 310 315 320 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile 325 330 335 Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His 340 345 350 Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly 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tcatgtcatg agccagtggt ccaggtctgc 1200 ttcccgtaac cgcaggcatg tgacagaaga agcagatgtc accgtggggc cactgatctt 1260 cctggacagg aggggtgacc atgaagtaga gcagtgggct ttgccttctg acacctcagt 1320 ggtgctgctg ggcgtaggcc tggctgtggt ggtgtccctg actctgactg ctgttatcct 1380 ggttctcacc aggaggtgtc gcactgcctc ccaccctgtg tctgcttccg aataaaagaa 1440 gaaagcaata aaaaaaaaaa aaaaaaa 1467 <210> 16 <211> 373 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Val Met Val Ser Lys Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys Leu Ile Arg 1 5 10 15 Ala Ala Asp Leu Thr Leu Gly Pro Glu Ala Cys Glu Pro Leu Val Ser 20 25 30 Met Asp Thr Glu Asp Val Val Arg Phe Glu Val Gly Leu His Glu Cys 35 40 45 Gly Asn Ser Met Gln Val Thr Asp Asp Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe 50 55 60 Leu Leu His Asp Pro Arg Pro Val Gly Asn Leu Ser Ile Val Arg Thr 65 70 75 80 Asn Arg Ala Glu Ile Pro Ile Glu Cys Arg Tyr Pro Arg Gln Gly Asn 85 90 95 Val Ser Ser Gln Ala Ile Leu Pro Thr Trp Leu Pro Phe Arg Thr Thr 100 105 110 Val Phe Ser Glu Glu Lys Leu Thr Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu 115 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gccagcaggg cgaggatcgt 9060 ggcatcaccg aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc 9120 caggcggccc aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac 9180 gcccgtgatt ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc 9240 cgccgccgcc ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg 9300 tgggctgccc ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac 9360 gccggcggta gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga 9420 ataagggaca gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc 9480 cggctgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt 9540 atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg 9600 ttatgcagcg gaaaagatcc gtcgaccctt tccgacgctc accgggctgg ttgccctcgc 9660 cgctgggctg gcggccgtct atggccctgc aaacgcgcca gaaacgccgt cgaagccgtg 9720 tgcgagacac cgcggccgcc ggcgttgtgg ataccacgcg gaaaacttgg ccctcactga 9780 cagatgaggg gcggacgttg acacttgagg ggccgactca cccggcgcgg cgttgacaga 9840 tgaggggcag gctcgatttc ggccggcgac gtggagctgg ccagcctcgc aaatcggcga 9900 aaacgcctga ttttacgcga gtttcccaca gatgatgtgg acaagcctgg ggataagtgc 9960 cctgcggtat tgacacttga ggggcgcgac tactgacaga tgaggggcgc gatccttgac 10020 acttgagggg cagagtgatg acagatgagg ggcgcaccta ttgacatttg aggggctgtc 10080 cacaggcaga aaatccagca tttgcaaggg tttccgcccg tttttcggcc accgctaacc 10140 tgtcttttaa cctgctttta aaccaatatt tataaacctt gtttttaacc agggctgcgc 10200 cctggcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc cttctcgaac cctcccggcc 10260 cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc tcggccgcga acggcctcac 10320 cccaaaaatg gcaggccaag ctagcttgct tggtcgttcc ggtacgtacc gtgaacgtcg 10380 gctcgattgt acctgcgttc aaatactttg cgatcgtgtt gcgcgcctgc ccggtgcgtc 10440 ggctgatctc acggatcgac tgcttctctc gcaacgccat ccgacggatg atgtttaaaa 10500 gtcccatgtg gatcactccg ttgccccgtc gctcaccgtg ttggggggaa ggtgcacatg 10560 gctcagttct caatggaaat tatctgccta accggctcag ttc 10603

Claims (23)

1. SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하고 뉴캐슬병(newcastle disease) 바이러스의 HN 항원을 인코딩하는 분리된 식물 최적화된 뉴클레오티드 서열.
2. SEQ ID NO: 1을 포함하는 재조합 발현 벡터.
3. 제 2항에 있어서, pCHN, pGHN, pGHN151, pGHN153, pMHN, pUHN에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
4. 제 2항에 있어서, 식물-기능성 프로모터는 SEQ ID NO:1에 작동가능하게 결합되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
5. 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하고 식물 세포에서 면역보호성 항원을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터에 있어서, pCHA인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
6. 제 2항, 3항, 5항중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 면역원성 항원의 발현을 위한 외래유전자도입 식물 세포.
7. 제 6항에 있어서, 식물 세포는 감자 식물 세포, 토마토 식물 세포 또는 담배 식물 세포인 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 식물 세포.
8. 제 2항, 3항, 5항중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 외래유전자도입 식물.
9. 재조합 바이러스 항원성 단백질과 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 백신에 있어서, 상기 바이러스 항원성 단백질은 제 2항 또는 3항의 벡터에 의해 생산된 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원이고, 상기 백신은 동물에 투여이후 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신.
10. 제 9항에 있어서, HN 단백질은 SEQ ID NO:2를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
11. 제 9항에 있어서, HN 단백질은 식물 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 백신.
12. 뉴캐슬병 바이러스로부터 동물을 보호하는 방법에 있어서, 제 9항에 따른 백신의 효과량을 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 재조합 바이러스 항원성 단백질과 제약학적으로 수용가능한 담체를 함유하는 백신에 있어서, 상기 바이러스 항원성 단백질은 제 5항의 벡터에 의해 생산된 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원이고, 상기 백신은 동물에 투여이후 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신.
14. 제 13항에 있어서, HA 항원은 식물 세포에서 생산되는 것을 특징으로 하는 백신.
15. 조류 인플루엔자 바이러스부터 동물을 보호하는 방법에 있어서, 제 13항에 따른 백신의 효과량을 동물에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 12항 또는 15항에 있어서, 백신은 경구, 비강내, 복강내, 근육내, 정맥내 또는 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 12항 또는 15항에 있어서, 효과량은 체중 ㎏당 1 ㎍ 내지 50 ㎍인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 외래유전자도입 식물에서 항원을 생산하는 방법에 있어서, 아래의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:

    a) 상기 항원을 인코딩하는 벡터를 포함하는 외래유전자도입 식물을 생산하고;

    b) 상기 식물이 상기 항원을 발현하는 조건하에 식물을 배양하고;

    여기서, 상기 식물은 성숙 개시에 앞서 배양된다.
19. 제 18항에 있어서, 식물은 성숙하는 열매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 18항에 있어서, 식물은 토마토 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 19항에 있어서, 식물의 열매는 성숙 개시에 앞서 수확되는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 21항에 있어서, 항원은 수확된 열매로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 18항에 있어서, 항원은 뉴캐슬병 바이러스의 HN 항원, 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 항원, LTB, NVCP, 투명대(zone pellucida) 당단백질, HBsAg에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

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