JP2019141062A - インフルエンザウイルスワクチン及びその使用 - Google Patents

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パレセ ピーター
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Abstract

【課題】交差防御免疫応答を誘導するキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの提供。【解決手段】インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)由来のHAのステムドメイン及びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。【選択図】なし

Description

本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された
助成番号AI070469、AI086061、及びHHSN266200700010Cの下で米国政府による支援を受け
て行われた。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
(1.序論)
本明細書に提供されるのは、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、
及びそれを含む組成物、それを含むワクチン、並びにそれらの使用方法である。
(2.背景)
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)のファミリー
に属するエンベロープ型のRNAウイルスである(Palese及びShawの文献、2007, オルトミク
ソウイルス科:ウイルス及びその複製(Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replic
ation)、第5版.フィールズのウイルス学(Fields' Virology)、B.N. Fields, D. M. Knipe
、及びP.M. Howley編. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philad
elphia, USA, p1647-1689)。A型インフルエンザウイルスの自然宿主は主に鳥類であるが
、A型インフルエンザウイルス(鳥類起源のものを含む)は、ヒト及び他の動物宿主(コウモ
リ、イヌ、ブタ、ウマ、海洋哺乳動物、及びイタチ類)に感染し、疾病を引き起こすこと
もできる。例えば、アジアで広がっているH5N1 A型鳥インフルエンザウイルスは、中国及
びインドネシアのブタで発見されており、その宿主範囲を広げて、A型インフルエンザに
感染しやすいと一般に考えられていなかったネコ、ヒョウ、及びトラを含むようになって
もいる(CIDRAP-鳥インフルエンザ:農業及び野生生物での注意事項(Avian Influenza: Agr
icultural and Wildlife Considerations))。動物におけるインフルエンザウイルス感染
の出現は、ヒトパンデミックインフルエンザ株を発生させる可能性がある。
A型及びB型インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、不顕性感染から死を
もたらすこともある原発性ウイルス肺炎まで重症度が異なる呼吸器疾患を引き起こす。感
染の臨床的効果は、インフルエンザ株の病原性、並びに宿主の暴露、病歴、年齢、及び免
疫状態によって様々である。季節性インフルエンザに起因する累積罹病率及び死亡率は、
比較的高い発病率のためにかなり高い。通常の季節では、インフルエンザは、全世界で30
0万〜500万症例の重症疾患及び最大500,000人の死亡を引き起こすことができる(世界保健
機構(2003)、インフルエンザ:概説(Influenza: Overview); 2003年3月)。米国では、イン
フルエンザウイルスは、人口のおよそ10〜15％に感染し(Glezen及びCouch RBの文献(1978
)、1974〜76年のヒューストン地区のパンデミック間期インフルエンザ(Interpandemic in
fluenza in the Houston area, 1974-76.)、N Engl J Med 298:587-592); Foxらの文献(1
982)、1975〜1979年のシアトルの家族におけるインフルエンザウイルス感染。II.病気に
侵された家庭における感染パターン、並びに年齢及び事前抗体と感染及び関連疾病の発生
との関係(Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. Pattern
of infection in invaded households and relation of age and prior antibody to occ
urrence of infection and related illness.)、Am J Epidemiol 116:228-242)、毎年約3
0,000人の死亡と関連する(Thompson WWらの文献(2003)、米国におけるインフルエンザ及
び呼吸器合胞体ウイルスと関連する死亡(Mortality Associated with Influenza and Res
piratory Syncytial Virus in the United States.)、JAMA 289:179-186); Belsheの文献
(2007)、ワクチンに関するトランスレーショナルリサーチ:インフルエンザを一例として(
Translational research on vaccines: influenza as an example.)、Clin Pharmacol Th
er 82:745-749)。
毎年の流行に加え、インフルエンザウイルスは、たまに起こるパンデミックの原因であ
る。例えば、A型インフルエンザウイルスは、1918年、1957年、1968年、及び2009年に発
生したようなパンデミックを引き起こすことができる。主要なウイルス抗原である血球凝
集素(HA)に対する予め形成された免疫がないために、パンデミックインフルエンザは、単
年で人口の50％よりも多くに影響を及ぼすことができ、しばしば流行性インフルエンザよ
りも重い疾患を引き起こす。明確な例は、およそ5000万人〜1億人が死亡した、1918年の
パンデミックである(Johnson及びMuellerの文献(2002)、報告の更新: 1918〜1920年の「
スペイン風邪(Spanish)」による全世界の死亡者数(Updating the Accounts: Global Mort
ality of the 1918-1920 "Spanish")、Influenza Pandemic Bulletin of the History of
Medicine 76:105-115。1990年代後半の高病原性鳥H5N1インフルエンザウイルス(Claasら
の文献(1998)、高病原性鳥インフルエンザウイルスと関連するヒトA型インフルエンザH5N
1ウイルス(Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian infl
uenza virus.)、Lancet 351:472-7)の出現以降、それが次のパンデミックウイルスとなる
かも知れないという懸念がある。さらに、H7及びH9株は、これらの株が時折ヒトに感染す
るので、新たなパンデミックの候補である。
インフルエンザウイルス感染を防御する有効な方法は、ワクチン接種によるものである
;しかしながら、現在のワクチン接種手法は、循環している株とワクチンに含まれる分離
株との間で良好な一致が得られることを当てにしている。そのような一致は、因子の組合
せのために得るのが困難であることが多い。第一に、インフルエンザウイルスは絶えず変
化を遂げており: 3〜5年毎に、A型インフルエンザウイルスの優勢株は、既存の抗体応答
を避けるのに十分な抗原連続変異(antigenic drift)を経た変異体に取って代わられる。
そのため、ワクチン製剤に含まれるべき分離株は、世界保健機関(WHO)の共同研究センタ
ーの集中的な監視努力に基づいて、毎年選択されなければならない。第二に、ワクチンの
製造及び流通に十分な時間を与えるために、株は、インフルエンザシーズンの開始の約6
カ月前に選択されなければならない。ワクチン株選択委員会の予測が不正確で、ワクチン
接種の有効性が大幅に低下することもある。
A型インフルエンザウイルスの新規亜型がヒト集団に侵入する可能性も、現在のワクチ
ン接種戦略にとって大きな課題となっている。インフルエンザウイルスのどの亜型及び株
が次のパンデミックをもたらすかを予測することは不可能なので、現在の株特異的手法を
用いて、パンデミックインフルエンザワクチンを調製することはできない。
(3.概要)
一態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルスの保存されたHA
ステムドメインに対する交差防御免疫応答を誘導するキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチドである。本明細書に提供されるキメラインフルエンザHAポリペプチドは、
安定な(例えば、適切に形成された)HAステムドメイン及び該ステムドメインと異種である
球状HAヘッドドメインを含む(すなわち、該ヘッドドメイン及びステムドメインは、異な
る株及び/又は亜型のインフルエンザウイルスに由来する)。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H1亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
、及び(ii)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含
む(本明細書では「cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれること
もある)。具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カ
リフォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/
2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッ
ドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメ
イン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/イ
ンドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様イン
フルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、c
H5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフォルニ
ア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/安徽/1/20
05(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態
様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A
/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様イ
ンフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海(Quinghai)/1A/2005(H5) HA
の球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエンザウイルスHA
の球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAの
ステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメ
イン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/シチメンチョ
ウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の
具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォル
ニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/
244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)様
インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。具体的な実施態様において、
本明細書に提供されるcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのH1亜型のイ
ンフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメインは、集団の大部分が未感作であ
るH1亜型由来のものである。ある実施態様において、本明細書に提供されるcH5/1キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのH1亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝
集素のステムドメインは、今後のH1N1ワクチン株、例えば、2013年、2014年、2015年、20
16年、2017年、2018年、2019年、2020年、2021年、2022年、2023年、2024年、2025年、20
26年、2027年、2028年、2029年、2030年、2031年、2032年、2032年、2033年、2034年、又
は2035年に使用されるH1N1ワクチン株由来のものである。
具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、A
/プエルトリコ/8/34(「PR8」) HAのステムドメインを含まず、A/ベトナム/1203/2004(H5)
HAの球状ヘッドドメインを含まない。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクト
リア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011
(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球
状ヘッドドメイン(又はA/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘ
ッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2)のステムドメイ
ン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン) HA
であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A
/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様
インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様におい
て、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクト
リア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/
安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011
(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HA
の球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエンザウイルスHA
の球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのス
テムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムド
メイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/シチメンチ
ョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別
の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/
361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴ
ル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5
)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステム
ドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチュー
セッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1
/2011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) H
Aの球状ヘッドドメイン(又はA/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球
状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/
2011(H3N8) HAのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N
8)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッド
ドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N
8) HAのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様イン
フルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又
はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具
体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイン(
又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAの
ステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッ
ドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インド
ガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の
具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)のステムドメイン(
又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAの
ステムドメイン) HAであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又は
A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン
)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAの
ステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエ
ンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)様インフルエンザウイルスH
Aの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インデ
ィアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体
的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/
2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HA
の球状ヘッドドメイン(又はA/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球
状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステ
ムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムド
メイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005
(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様
において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/
インディアナ/10/2011(H3N2)のステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様イ
ンフルエンザウイルスHAのステムドメイン) HAであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイ
ン(又はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディ
アナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A
/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエン
ザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011
(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイル
スHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又
はA/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイ
ン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又は
A/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、c
H5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハク
チョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴ
ル/244/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/20
09(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様
において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/
パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエン
ザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又は
A/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/2009
(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球
状ヘッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘ
ッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(
又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5
/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/200
5(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球
状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメ
イン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり
、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/イン
ドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)
様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パー
ス/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイ
ン(又はA/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッド
ドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又は
A/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ
/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/
2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるcH5/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのH3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
は、集団の大部分が未感作であるH3亜型由来のものである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのH3亜型のインフ
ルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメインは、今後のH3N2ワクチン株、例えば
、2013年、2014年、2015年、2016年、2017年、2018年、2019年、2020年、2021年、2022年
、2023年、2024年、2025年、2026年、2027年、2028年、2029年、2030年、2031年、2032年
、2032年、2033年、2034年、又は2035年に使用されるH3N2ワクチン株由来のものである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるcH5/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメインを含まず、A/
パース/16/2009(H3) HAのステムドメインを含まない。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H7亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。
具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/
361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実
施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N
2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘ
ッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメ
イン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)
であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A
/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエン
ザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(
H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルス
HAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/444/04
(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様
において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/
ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様イ
ンフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)様インフルエンザウイルスHAの
球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステ
ムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメ
イン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/アルバー
タ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/ビクトリア/361/2011
(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッド
ドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメイン
(又はA/ビクトリア/361/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マ
ガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/ネーデルラン
ト/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステム
ドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチュー
セッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1
/2011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルス
HAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセ
ッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2
011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメ
イン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) H
Aのステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA
/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具
体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイン(
又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウイルスHAの
ステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッ
ドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニ
ワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)であ
る。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステ
ムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザ
ウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメイン
(又はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイ
ン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HA
のステムドメイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又
はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムド
メイン(又はA/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)様インフルエンザウイ
ルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン
(又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドド
メイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インデ
ィアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体
的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/
2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7)
HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHA
の球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAの
ステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステ
ムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドド
メインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様イ
ンフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において
、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディ
アナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA
/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具
体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/1
0/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2
012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)様インフルエ
ンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/20
11(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイ
ルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又
はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)
である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/
インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7
/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39
482/93(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイ
ルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2)
HAのステムドメイン(又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)様インフルエンザウイルスHAの
ステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッ
ドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/
マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)
である。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/20
09(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様
において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/
パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエン
ザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメイン(
又はA/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)で
ある。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/1
6/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球
状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドド
メイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/
パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状
ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイ
ン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、
cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワト
リ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/20
12(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態
様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A
/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエ
ンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメ
イン(又はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドド
メイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメイン(又はA/
パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93
(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイルスHA
の球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステム
ドメイン(又はA/パース/16/2009(H3N2)様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)で
あり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/
マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/ネーデルラ
ント/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるcH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのH3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
は、集団の大部分が未感作であるH3亜型由来のものである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのH3亜型のインフ
ルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメインは、今後のH3N2ワクチン株、例えば
、2013年、2014年、2015年、2016年、2017年、2018年、2019年、2020年、2021年、2022年
、2023年、2024年、2025年、2026年、2027年、2028年、2029年、2030年、2031年、2032年
、2032年、2033年、2034年、又は2035年に使用されるH3N2ワクチン株由来のものである。
具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、A
/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)の球状ヘッドドメインを含まない。別の具体的な実施態
様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、A/パース/16/2009(
H3)のステムドメインを含まない。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本明
細書では「cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある)
。
具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/
2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレ
ーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ベ
トナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の
具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/20
04様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッド
ドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又は
B/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘ
ッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(
又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5
/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン
/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様イン
フルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、c
H5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2
506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHA
のステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘ
ッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/
シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)
である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレー
シア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴ
ル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5
)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様
インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、c
H5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2
006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムド
メイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ベトナム/1203/2004(H
5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様に
おいて、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フ
ロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHA
のステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘ
ッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドネ
シア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエン
ザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/安徽/
1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実
施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又
はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)で
ある。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/20
06様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) H
Aの球状ヘッドドメイン(又はA/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイ
ルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステム
ドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり
、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオ
ハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モ
ンゴル/244/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコン
シン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態
様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B
/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメイン(
又はA/ベトナム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)であ
る。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコ
ンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHA
の球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステム
ドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)
であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A
/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウ
イルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HA
のステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムド
メイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海
/1A/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な
実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイ
ンは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様イ
ンフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球
状ヘッドドメイン(又はA/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスH
Aの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステ
ムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン
)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、
A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョ
ウ/モンゴル/244/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/
2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリ
スベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイル
スHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ベトナ
ム/1203/2004(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体
的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様イン
フルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメ
イン(又はA/インドネシア/5/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン
)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベ
ン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメイン(又はA/安徽/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン
)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベ
ン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/インドガン/青海/1A/2005(H5)様インフルエンザウイル
スHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステ
ムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)で
あり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/
シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/シチメンチョウ/ト
ルコ/1/2005(H5)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフ
ルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球
状ヘッドドメイン(又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)様インフルエンザウイ
ルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)H7亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本明
細書では「cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある)
。
具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/
2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレ
ーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA
/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である
。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2
506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘ
ッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイ
ン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレ
ーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HA
の球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッ
ドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又
はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハ
リスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7
)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレ
ーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウ
イルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメイン(
又はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイ
ン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレ
ーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7)
HAの球状ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイルスHAの球
状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメ
イン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり
、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガ
モ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/ネーデルラント
/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様
インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、c
H7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2
006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムド
メイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ネーデルラント/21
9/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施
態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイ
ルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/50
4/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施
態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイ
ルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/44
4/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施
態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイ
ルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(
又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメ
イン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリ
ダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(
H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウ
イルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステ
ムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レ
ア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエ
ンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HA
のステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン
)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、
A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/ネーデル
ラント/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコン
シン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態
様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B
/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフル
エンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメイ
ン(又はA/ネーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン
)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィ
スコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7)
HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘ
ッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン
(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、c
H7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/4
44/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルス
HAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステ
ムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン
)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、
A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ
/CPA1/2012(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様
インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状
ヘッドドメイン(又はA/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球
状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメ
イン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レ
ア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエ
ンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2
010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのス
テムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マ
ガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)で
ある。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/
2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様にお
いて、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリ
スベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイル
スHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ネ
ーデルラント/219/03(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別
の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008
様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメ
イン(又はA/カナダ/504/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)であ
る。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/6
0/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッ
ドドメイン(又はA/カナダ/444/04(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン
)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベ
ン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/201
2(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)様インフルエン
ザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 H
Aのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメ
イン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/アルバー
タ/24/2001(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的
な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフ
ルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメイン(
又はA/レア/NC/39482/93(H7)様インフルエンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である
。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/
2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH7/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7
) HAの球状ヘッドドメイン(又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)様インフルエンザ
ウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)異なるB型インフルエンザウイルス株由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本
明細書では「cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある
)。
具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/20
04様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様におい
て、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシ
ア/2506/2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイル
スHAのステムドメイン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/リー/1940様インフル
エンザウイルスHAの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cB/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/
2004 HAのステムドメイン(又はB/マレーシア/2506/2004様インフルエンザウイルスHAのス
テムドメイン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、B/アザラシ/ネーデルラント/1/99 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/アザラシ
/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルスの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様イ
ンフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cB/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006
HAのステムドメイン(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメ
イン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/リー/1940様インフルエンザウイルスの
球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメイン
(又はB/フロリダ/4/2006様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cB/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネー
デルラント/1/99 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99様イン
フルエンザウイルスの球状ヘッドドメイン)である。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシ
ン/1/2010様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様
において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウ
ィスコンシン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエン
ザウイルスHAのステムドメイン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドの球状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/リー/1940様
インフルエンザウイルスの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において
、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコン
シン/1/2010 HAのステムドメイン(又はB/ウィスコンシン/1/2010様インフルエンザウイル
スHAのステムドメイン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネーデルラント/1/99 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/
アザラシ/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルスの球状ヘッドドメイン)である
。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/20
08様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様におい
て、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベ
ン/60/2008 HAのステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイルスHA
のステムドメイン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘ
ッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/リー/1940様インフルエン
ザウイルスの球状ヘッドドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HA
のステムドメイン(又はB/ブリスベン/60/2008様インフルエンザウイルスHAのステムドメ
イン)であり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、B/アザラシ/ネーデルラント/1/99 HAの球状ヘッドドメイン(又はB/アザラシ/ネーデ
ルラント/1/99様インフルエンザウイルスの球状ヘッドドメイン)である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H4亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/09 HAのステムドメイン(又はA/パース/16/09様インフ
ルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH4/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/09 HAの
ステムドメイン(又はA/パース/16/09様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ア
ヒル/チェコ/56の球状ヘッドドメイン(又はA/アヒル/チェコ/56様インフルエンザウイル
スHAの球状ヘッドドメイン)である。
具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドは可溶性であり、例えば、組成物、例えば、本明細書に記載の組成物中で可溶性で
ある。可溶性キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを作製する例示的な方法は、
以下の第6.6.1.2節に記載されている。
前述のキメラインフルエンザHAポリペプチドを設計する場合、得られるタンパク質の安
定性を維持するように注意を払うべきである。これに関して、ある実施態様において、A
型インフルエンザウイルス由来のステムドメインを含むキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドについて、図1でAp及びAqとして特定されているシステイン残基を維持する
ことが推奨されるが、それは、これらのシステイン残基が、以下の第5.1節でより詳細に
論じられるように、HAストークの安定性に寄与するからである。例えば、最良の安定性を
得るために、HA球状ドメインを全体として(図1に示すように、Apシステイン残基とAqシス
テイン残基の間で)「交換する」ことが好ましいが、それは、得られる立体構造が、天然
の構造に最も近いからである。同様に、B型インフルエンザウイルスのステムドメインを
含むキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、該キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインが得られるA型インフルエンザウイルスの球状ヘッ
ドドメイン中に存在するシステインを利用することができる(例えば、図36参照)。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ、2つ、又はそれより多くを含む免疫原性組成物(
例えば、ワクチン製剤)である。ある実施態様において、本明細書に提供される免疫原性
組成物(例えば、ワクチン製剤)は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド(複数可)、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(
複数可)もしくは本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(複数可
)をコードするように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルス(例えば、生もしく
は死滅ウイルス);又は本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(
複数可)もしくは本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(複数可
)をコードするように改変されたゲノムを含むベクターもしくは細胞を含むことができる
。ある実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物は、(i)本明細書に記載
のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH5/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチド、本明細書に記載のcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、もしく
は本明細書に記載のcHB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド;(ii)本明細書に
記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH5/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの組合せ;もしくは本明細書に記載のcH5/1キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの組合せ;(iii)本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドと本明細書に記載のcH5/B、cH7/B、もしくはcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのいずれかの組合せ;又は(iv)本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドと本明細書に記載のcH5/B、cH7/B、もしくはcB/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのいずれかの組合せを含むことができる。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を含むワクチン製剤である。具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つを含む一価ワクチンである。別の具体的な実
施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのうちの2つ(すなわち、2つの異なるキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド)を含む二価ワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細
書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
うちの3つ(すなわち、3つの異なるキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む
三価ワクチンである。
本明細書に提供されるワクチン製剤は、任意の形態の本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドを含むことができる。例えば、本明細書に提供されるワク
チン製剤は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1
つ又は複数を含むサブユニットワクチン(例えば、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチド、例えば、可溶性キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む組成物);
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を
発現する生インフルエンザウイルス(例えば、弱毒化された生インフルエンザウイルス);
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を
コードするゲノムを含む生インフルエンザウイルス(例えば、弱毒化された生インフルエ
ンザウイルス);本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの
1つ又は複数を含む死滅インフルエンザウイルス;本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数をコードするゲノムを含む死滅インフルエ
ンザウイルス;本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1
つ又は複数を含有するウイルス/ウイルス様粒子(「VLP」);スプリットウイルスワクチン(
ここで、該ウイルスは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のうちの1つもしくは複数を発現し、及び/又は本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのうちの1つもしくは複数をコードするゲノムを含む);本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現するウ
イルス発現ベクター(例えば、非インフルエンザウイルス発現ベクター);並びに本明細書
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現する
細菌発現ベクターを含むことができる。
本明細書に記載のワクチン製剤は、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA
ステムドメインに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体を誘発することができる。そ
のような「普遍的な」ワクチンを用いて、インフルエンザウイルス亜型にわたる交差防御
免疫応答を誘導及び/又は増強することができる。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患又
は感染に対して免疫する方法であって、該対象に、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載のワクチン
製剤を含む組成物を投与することを含む、方法である。ある実施態様において、対象を、
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしく
は複数又は本明細書に記載のワクチン製剤を含む第一の組成物で初回免疫し、後に、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複
数又は本明細書に記載のワクチン製剤を含む同じもしくは異なる組成物(例えば、異なる
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物;同じキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを異なる状況で含む組成物(例えば、第一の組成物は、
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むサブユニットワクチンを含み、
異なる組成物は、同じキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイルス
ベクターを含む)、又は異なるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを異な
る状況で含む組成物)で追加免疫する。該対象を、1回又は複数回、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に
記載のワクチン製剤を含む組成物で追加免疫することができる。ある実施態様において、
該対象を複数回追加免疫する場合、第一及び第二の追加免疫は、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記
載のワクチン製剤を含む異なる組成物によるものであり、かつ各々の追加免疫は、該対象
を初回免疫するために使用される本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載のワクチン製剤を含む組成物
と異なる組成物を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、対象(例えば、ヒト対象)をイ
ンフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、本明細書に記載のベクター、本明細書に
記載の免疫原性組成物、又は本明細書に記載のワクチン製剤の有効量の第一の用量を投与
すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、本明細書に記載のベク
ター、本明細書に記載の免疫原性組成物、又は本明細書に記載のワクチン製剤の有効量の
第二の用量を投与することを含む、方法であり、ここで、(i)該第一及び第二の用量のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ベクター、該免疫原性組成物、
もしくはワクチン製剤のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、同じであ
るか又は異なっており(例えば、第一の用量で投与されるキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドは、第二の用量で投与されるキメラインフルエンザ血球
凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドと異なっている);及び/或いは(ii)両方の用量で投
与される免疫原性組成物又はベクター又はワクチン製剤のタイプは、同じであるか又は異
なっている。ある実施態様において、本方法は、該対象が該第二の用量を受容してから30
日〜6カ月後に、該対象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の免疫原性組成物、又は本明細書
に記載のワクチン製剤の有効量の第三の用量を投与することを含み、ここで、(i)キメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ベクター、該免疫原性組成物、もし
くはワクチン製剤のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、該第一及び/
又は第二の用量のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと同じであるか又は
異なっており;並びに(ii)両方の用量で投与される免疫原性組成物又はベクター又はワク
チン製剤のタイプは、同じであるか又は異なっている。ある実施態様において、2つ、3つ
、又はそれより多くのキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、第一、第二
、及び/又は第三の用量の部分として投与され、ここで、ある用量の各々のキメラHAポリ
ペプチドは互いに異なっている。いくつかの実施態様において、ベクター、免疫原性組成
物、又はワクチン製剤の第一、第二、及び/又は第三の用量は、2つ、3つ、又はそれより
多くのキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含み、ここで、ある用量で投
与されるベクター、免疫原性組成物、又はワクチン製剤の各々のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチドは互いに異なっている(例えば、第一の用量で投与されるキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドは、第二の用量で投与される
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドと異なっている、など)
。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、1〜5歳のヒト対象をイン
フルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、本明細書に記載のベクター、本明細書に記
載の免疫原性組成物、又は本明細書に記載のワクチン製剤の有効量の第一の用量を投与す
ること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に、本明細
書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、本明細書に記載のベクタ
ー、本明細書に記載の免疫原性組成物、又は本明細書に記載のワクチン製剤の有効量の第
二の用量を投与することを含む、方法であり、ここで、(i)該第一及び第二の用量のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ベクター、該免疫原性組成物、も
しくはワクチン製剤のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、同じである
か又は異なっており(例えば、第一の用量で投与されるキメラインフルエンザ血球凝集素(
HA)ポリペプチドの球状ヘッドは、第二の用量で投与されるキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドと異なっている);及び/或いは(ii)両方の用量で投与
される免疫原性組成物又はベクター又はワクチン製剤のタイプは、同じであるか又は異な
っている。ある実施態様において、本方法は、該対象が該第二の用量を受容してから30日
〜6カ月後に、該対象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチド、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の免疫原性組成物、又は本明細書に
記載のワクチン製剤の有効量の第三の用量を投与することを含み、ここで、(i)第一及び
第二の用量のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ベクター、該免
疫原性組成物、もしくはワクチン製剤のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドは、同じであるか又は異なっており(例えば、第一の用量で投与されるキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドは、第二の用量で投与されるキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドと異なっている);及び/或いは(ii)
両方の用量で投与される免疫原性組成物又はベクター又はワクチン製剤のタイプは、同じ
であるか又は異なっている。ある実施態様において、2つ、3つ、又はそれより多くのキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、第一、第二、及び/又は第三の用量の
部分として投与され、ここで、ある用量の各々のキメラHAポリペプチドは互いに異なって
いる。いくつかの実施態様において、該ベクター、該免疫原性組成物、又はワクチン製剤
の第一、第二、及び/又は第三の用量は、2つ、3つ、又はそれより多くのキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含み、ここで、ある用量で投与されるベクター、免
疫原性組成物、又はワクチン製剤中の各々のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは互いに異なっている(例えば、第一の用量で投与されるキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドは、第二の用量で投与されるキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドと異なっている、など)。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載のワクチン
製剤を含むキットである。本明細書に提供されるキットは、1以上のさらなる構成要素、
例えば、キット中に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうち
の1つ又は複数に特異的に結合する抗体をさらに含むことができる。
作業実施例(例えば、第6節、実施例)は、とりわけ、HAステムドメインを含み、かつ異
種HA球状ヘッドドメインを提示するキメラインフルエンザHAポリペプチドをコードする構
築物の産生、及び該ステムドメインと該ヘッドドメインの両方に対する抗体と交差反応す
るこれらの構築物からの安定なキメラHAポリペプチドの産生を示している。該作業実施例
は、多数の異なる株及び亜型のインフルエンザウイルスに対する対象の防御的免疫応答の
生成におけるそのような構築物の使用も示している、すなわち、該実施例は、本明細書に
記載のキメラインフルエンザHAポリペプチドを普遍的なインフルエンザワクチンとして使
用することができることを示している。
(3.1 用語)
アミノ酸位置に関して使用される場合の、「約(about)」又は「約(approximately)」と
いう用語は、配列中の特定のアミノ酸位置、又はそのアミノ酸位置からN末端方向もしく
はC末端方向に、5、4、3、2、もしくは1残基以内にある任意のアミノ酸を指す。
本明細書で使用されるように、数字と一緒に使用される場合の「約(about)」又は「約(
approximately)」という用語は、言及された数字の1、5、又は10％以内の任意の数字を指
す。ある実施態様において、「約(about)」という用語は、記載された正確な数を包含す
る。
本明細書で使用されるように、核酸配列との関連における「断片」という用語は、親配
列由来の連続するヌクレオチドの一部を含むヌクレオチド配列を指す。具体的な実施態様
において、この用語は、親配列由来の5〜15、5〜25、10〜30、15〜30、10〜60、25〜100
、150〜300個、又はそれより多くの連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。別
の実施態様において、この用語は、親配列の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40
、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、200、250
、275、300、325、350、375、400、425、450、又は475個の連続するヌクレオチドのヌク
レオチド配列を指す。
本明細書で使用されるように、アミノ酸配列との関連における「断片」という用語は、
親配列由来の連続するアミノ酸残基の一部を含むアミノ酸配列を指す。具体的な実施態様
において、この用語は、親配列由来の2〜30、5〜30、10〜60、25〜100、150〜300個、又
はそれより多くの連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を指す。別の実施態様において、
この用語は、親配列の少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65
、70、75、80、85、90、95、100、110、125、150、175、又は200個の連続するアミノ酸残
基のアミノ酸配列を指す。
本明細書で使用されるように、「疾患」及び「障害」という用語は互換的に使用され、
対象の状態を指す。具体的な実施態様において、「疾患」という用語は、細胞もしくは対
象におけるウイルスの存在に起因するか、又はウイルスによる細胞もしくは対象への侵入
による病理学的状態を指す。ある実施態様において、該状態は対象の疾患であり、その重
症度は、免疫原性組成物の投与によって該対象の免疫応答を誘導することにより低下する
。
本明細書で使用されるように、対象への療法の投与との関連における「有効量」という
用語は、予防及び/又は治療効果(複数可)を有する療法の量を指す。ある実施態様におい
て、対象への療法の投与との関連における「有効量」は、以下の効果のうちの1つ、2つ、
3つ、4つ、又はそれより多くを達成するのに十分である療法の量を指す:(i)インフルエン
ザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の重症度を軽減もしくは改善する;(ii
)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の持続期間を短縮する;
(iii)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の進行を予防する;
(iv)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の退行をもたらす;(
v)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の発症もしくは開始を
予防する;(vi)インフルエンザウイルス感染、それと関連する疾患もしくは症状の再発を
予防する;(vii)ある細胞から別の細胞、ある組織から別の組織、もしくはある器官から別
の器官へのインフルエンザウイルスの伝播を低下させもしくは予防する;(ix)ある対象か
ら別の対象へのインフルエンザウイルスの伝播を予防しもしくは低下させる;(x)インフル
エンザウイルス感染と関連する器官不全を軽減する;(xi)対象の入院を減少させる;(xii)
入院期間を短縮する;(xiii)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連する疾患を
有する対象の生存を増加させる;(xiv)インフルエンザウイルス感染もしくはそれと関連す
る疾患を消失させる;(xv)インフルエンザウイルスの複製を阻害しもしくは低下させる;(x
vi)宿主細胞(複数可)へのインフルエンザウイルスの侵入を阻害しもしくは低下させる;(x
viii)インフルエンザウイルスゲノムの複製を阻害しもしくは低下させる;(xix)インフル
エンザウイルスタンパク質の合成を阻害しもしくは低下させる;(xx)インフルエンザウイ
ルス粒子の会合を阻害しもしくは低下させる;(xxi)宿主細胞(複数可)からのインフルエン
ザウイルス粒子の放出を阻害しもしくは低下させる;(xxii)インフルエンザウイルス力価
を低下させる;及び/又は(xxiii)別の療法の予防もしくは治療効果(複数可)を増強もしく
は改善する。
ある実施態様において、有効量は、インフルエンザウイルス疾患からの完全な防御をも
たらすのではなく、未処置の対象と比較してインフルエンザウイルスの力価の低下又は数
の減少をもたらす。ある実施態様において、有効量は、未処置の対象と比べて、0.5倍、1
倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍、150倍
、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又はそれより大きい
インフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様において、有効量
は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log
以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5
log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2〜8log、2〜9log、2〜10log、3
〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、
5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9logのイン
フルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数、又は
総負荷量の低下の利点としては、感染症状の重症度がより低くなること、感染症状がより
少なくなること、及び感染と関連する疾患の長さが短縮することが挙げられるが、これら
に限定されない。
「血球凝集素」及び「HA」は、当業者に公知の任意の血球凝集素を指す。ある実施態様
において、血球凝集素は、インフルエンザ血球凝集素、例えば、A型インフルエンザ血球
凝集素、B型インフルエンザ血球凝集素、又はC型インフルエンザ血球凝集素である。典型
的な血球凝集素は、シグナルペプチド(本明細書では任意)、ステムドメイン、球状ヘッド
ドメイン、内腔ドメイン(本明細書では任意)、膜貫通ドメイン(本明細書では任意)、及び
細胞質ドメイン(本明細書では任意)を含む、当業者に公知のドメインを含む。ある実施態
様において、血球凝集素は、単一のポリペプチド鎖、例えば、HA0からなる。ある実施態
様において、血球凝集素は、四次結合した複数のポリペプチド鎖、例えば、HA1及びHA2か
らなる。当業者は、未成熟なHA0が切断されてシグナルペプチド(約20アミノ酸)を放出し
、成熟した血球凝集素HA0を生じさせることができることを認識しているであろう。血球
凝集素HA0は、別の部位で切断されて、HA1ポリペプチド(約320アミノ酸、球状ヘッドドメ
インとステムドメインの一部とを含む)及びHA2ポリペプチド(約220アミノ酸、ステムドメ
インの残り、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインを含む)を生じさせる
ことができる。ある実施態様において、血球凝集素は、シグナルペプチド、膜貫通ドメイ
ン、及び細胞質ドメインを含む。ある実施態様において、血球凝集素は、シグナルペプチ
ドを欠く、すなわち、血球凝集素は成熟した血球凝集素である。ある実施態様において、
血球凝集素は、膜貫通ドメインもしくは細胞質ドメイン、又は両方を欠く。本明細書で使
用されるように、「血球凝集素」及び「HA」という用語は、翻訳後プロセシング、例えば
、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N結合型グリコ
シル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)によって修飾さ
れる血球凝集素ポリペプチドを包含する。
本明細書で使用されるように、「キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ド」、「キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド」、「キメラ血球凝集素ポリペプ
チド」、及び「キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」という用語は、インフル
エンザウイルス血球凝集素ステムドメイン及びインフルエンザウイルス血球凝集素球状ヘ
ッドドメインを含むインフルエンザ血球凝集素を指し、ここで、該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ヘッドドメインは、該インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインと
異種である(すなわち、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インと異なる株又は亜型のインフルエンザウイルス由来のものである)。
「HA1のN末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのス
テムドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施態様
において、HA1のN末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸HA1N-termからApまで
にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1N-termは、当業者によって認識されているよ
うなHA1のN末端アミノ酸である。Apは、HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基
とジスルフィド結合を形成するか、又はそれを形成することができる、HA1のN末端ステム
セグメント中のシステイン残基である。残基Apは、図1のA型インフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド中で特定されている。例示的なHA1のN末端ステムセグメントが本明細書に記載
されている。ある実施態様において、HA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝集素由来
のHA1のアミノ酸1〜52にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系では、1は、
シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を指すことに
留意されたい。当業者は、他のインフルエンザHAポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメ
ントに対応するアミノ酸残基、例えば、H1血球凝集素由来のHA1のHA1のN末端ステムセグ
メントに対応するアミノ酸残基を容易に認識することができるであろう(例えば、図1参照
)。
「HA1のC末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのス
テムドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施
態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸AqからHA1C-term
までにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1C-termは、当業者によって認識されてい
るようなHA1ドメインのC末端アミノ酸である。残基Aqは、図1のA型インフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端ステムセグメントが本明細書
に記載されている。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、H3血球凝集
素由来のHA1のアミノ酸277〜346にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系で
は、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を
指すことに留意されたい。当業者は、他のインフルエンザHAポリペプチドのHA1のC末端ス
テムセグメントに対応するアミノ酸残基、例えば、H1血球凝集素由来のHA1のHA1のC末端
ステムセグメントに対応するアミノ酸残基を容易に認識することができるであろう(例え
ば、図1参照)。
「HA2」は、当業者に公知のインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA2ドメインに対
応するポリペプチドドメインを指す。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン、
内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインからなる(例えば、その内容が引用
により完全に組み込まれる、Scheiffleらの文献、2007, EMBO J. 16(18):5501-5508参照)
。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン、内腔ドメイン、及び膜貫通ドメイン
からなる。ある実施態様において、HA2は、ステムドメイン及び内腔ドメインからなり;そ
のような実施態様において、HA2は可溶性であることができる。ある実施態様において、H
A2はステムドメインからなり;そのような実施態様において、HA2は可溶性であることがで
きる。
本明細書で使用されるように、ポリペプチド、核酸、又はウイルスとの関連における「
異種」という用語は、通常天然で見られないか、又は通常天然で関心対象のポリペプチド
、核酸、もしくはウイルスと関連していない、ポリペプチド、核酸、又はウイルスをそれ
ぞれ指す。例えば、「異種ポリペプチド」は、異なるウイルス、例えば、異なるインフル
エンザ株もしくは亜型、又は無関係なウイルスもしくは異なる種に由来するポリペプチド
を指すことができる。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素の球状ヘッドドメインとの関連において使用される場合、異種とい
う用語は、それが、通常、関連しているのが見られない(例えば、HAのヘッドドメイン及
びステムドメインが、天然では、一緒に見られない)インフルエンザHAステムドメインと
関連しているインフルエンザHA球状ヘッドドメインを指す。
本明細書で使用されるように、対象への2以上の療法の投与との関連における「併用」
という用語は、複数の療法(例えば、複数の予防剤及び/又は治療剤)の使用を指す。「併
用」という用語の使用は、療法が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第一の療
法(例えば、第一の予防剤又は治療剤)は、対象への第二の療法の投与の前に(例えば、5分
、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、
72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間
前に)、それと同時に、又はその後に(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4
時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間
、4週間、5週間、6週間、8週間、もしくは12週間後に)投与することができる。
本明細書で使用されるように、「感染」という用語は、細胞又は対象におけるウイルス
の侵入、その増殖、及び/又は存在を意味する。一実施態様において、感染は、「活動性
」感染、すなわち、ウイルスが細胞又は対象で複製している感染である。そのような感染
は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織、及び/又は器官から、他の細胞、組織、及び/
又は器官へのウイルスの伝播を特徴とする。感染はまた、潜伏性の感染、すなわち、ウイ
ルスが複製していない感染であってもよい。
本明細書で使用されるように、「インフルエンザウイルス疾患」という用語は、細胞又
は対象におけるインフルエンザウイルス(例えば、A型もしくはB型インフルエンザウイル
ス)の存在、又は細胞もしくは対象へのインフルエンザウイルスの侵入に起因する病理学
的状態を指す。具体的な実施態様において、この用語は、インフルエンザウイルスによっ
て引き起こされる呼吸器疾患を指す。
本明細書で使用されるように、「IFN欠損システム」又は「IFN欠損基体」という語句は
、IFNを産生しないか、又は低レベルのIFNを産生する(すなわち、同じ条件下のIFNコンピ
テントなシステムと比較して、5〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50
〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、もしくはそれより大きいIFN発現の低下)か、IF
Nに応答しないか、もしくはそれにあまり効率的には応答せず、及び/又はIFNによって誘
導される1以上の抗ウイルス遺伝子の活性が欠損している、システム、例えば、細胞、細
胞株、及び動物、例えば、ブタ、マウス、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、ラットな
どを指す。
本明細書で使用されるように、「様」という用語は、「インフルエンザ様ウイルス」と
の関連において使用される場合、言及されたインフルエンザウイルスの異なる分離株を表
すインフルエンザウイルスを指し、ここで、該異なる分離株のアミノ酸配列、もしくは該
異なる分離株のHAのアミノ酸配列は、言及されたインフルエンザウイルスのアミノ酸配列
もしくは言及されたインフルエンザウイルスのHAのアミノ酸配列と同一であるかもしくは
ほぼ同一であり;及び/又は該異なる分離株に対する免疫応答は、言及されたインフルエン
ザウイルスに対する完全な防御を付与し、その逆もまた同じである。ある実施態様におい
て、言及されたインフルエンザウイルスのアミノ酸配列とほぼ同一であるアミノ酸配列を
有するインフルエンザウイルス分離株は、言及されたインフルエンザウイルスのアミノ酸
配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は
99.5％同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、「インフルエンザ様ウ
イルス」を表すインフルエンザウイルス分離株は、言及されたインフルエンザウイルスの
HAのアミノ酸配列とほぼ同一であるアミノ酸配列を有するHAを含み、例えば、インフルエ
ンザ様ウイルスのHAは、言及されたインフルエンザウイルスのHAのアミノ酸配列と少なく
とも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又は99.5％同一で
あるアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用されるように、「log」という数値用語は、log10を指す。
本明細書で使用されるように、インフルエンザウイルスの株又は亜型(例えば、H1亜型)
に関する、「集団の大部分が未感作である」という語句は、ヒト集団の50％超が暴露され
ていないと推定されるインフルエンザウイルスの株又は亜型を指す。具体的な実施態様に
おいて、「集団の大部分が未感作である」という語句は、ヒト集団の少なくとも60％、70
％、75％、80％、85％、90％、95％、又は99％が暴露されていないと推定されるインフル
エンザウイルスの株又は亜型を指す。
本明細書で使用されるように、「感染多重度」又は「MOI」という語句は、感染細胞当
たりの感染性ウイルス粒子の平均数である。MOIは、添加した感染性ウイルス粒子の数(添
加したml×PFU/ml)を、添加した細胞の数(添加したml×細胞/ml)で割ることによって決定
される。
本明細書で使用されるように、「核酸」という用語は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノ
ムDNA)及びRNA分子(例えば、mRNA)及びヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNA又はRN
Aの類似体を含むことが意図される。核酸は、一本鎖又は二本鎖であることができる。
本明細書で使用されるように、「ポリペプチド」という用語は、当業者に公知であるよ
うなアミド結合によって連結されたアミノ酸のポリマーを指す。本明細書で使用されるよ
うに、ポリペプチドという用語は、共有アミド結合によって連結された単一のポリペプチ
ド鎖を指すことができる。この用語は、非共有結合的相互作用、例えば、イオン接触、水
素結合、ファンデルワールス接触、及び疎水性接触によって会合する複数のポリペプチド
鎖を指すこともできる。当業者は、この用語が、例えば、翻訳後プロセシング、例えば、
シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化(例えば、N結合型グリコシ
ル化)、プロテアーゼ切断、及び脂質修飾(例えば、S-パルミトイル化)によって修飾され
ているポリペプチドを含むことを認識しているであろう。
本明細書で使用されるように、インフルエンザウイルス疾患を予防するための対象への
療法(複数可)の投与との関連における「予防する(prevent)」、「予防する(preventing)
」、及び「予防」という用語は、療法又は療法の組合せの投与から得られる予防的な/有
益な効果のうちの1つ又は複数を指す。具体的な実施態様において、インフルエンザウイ
ルス疾患を予防するための対象への療法(複数可)の投与との関連における「予防する(pre
vent)」、「予防する(preventing)」、及び「予防」という用語は、療法又は療法の組合
せの投与から得られる以下の効果のうちの1つ又は複数を指す:(i)インフルエンザウイル
ス疾患又はその症状の発症又は開始の阻害;(ii)インフルエンザウイルス疾患又はそれと
関連する症状の再発の阻害;並びに(iii)インフルエンザウイルスの感染及び/又は複製の
低下又は阻害。
本明細書で使用されるように、天然供給源、例えば、細胞から得られるポリペプチド(
抗体を含む)との関連において使用される場合の「精製された」及び「単離された」とい
う用語は、天然源由来の夾雑物質、例えば、土壌粒子、鉱物、環境由来の化学物質、並び
に/又は天然源由来の細胞性物質、例えば、限定されないが、細胞破片、細胞壁物質、膜
、オルガネラ、細胞内に存在する核酸、炭水化物、タンパク質、及び/もしくは脂質の大
部分を実質的に含まないポリペプチドを指す。したがって、単離されたポリペプチドには
、細胞性物質及び/又は夾雑物質の(乾燥重量で)約30％、20％、10％、5％、2％、又は1％
未満を有するポリペプチド調製物が含まれる。本明細書で使用されるように、化学合成さ
れるポリペプチド(抗体を含む)との関連において使用される場合の「精製された」及び「
単離された」という用語は、ポリペプチドの合成に関与する化学物質前駆体又は他の化学
物質を実質的に含まないポリペプチドを指す。具体的な実施態様において、キメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは化学合成される。別の具体的な実施態様において
、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチド、インフルエンザ血球凝集素ヘ
ッドドメインポリペプチド、及び/又はキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは
単離される。
本明細書で使用されるように、ウイルスとの関連における「複製」、「ウイルスの複製
」、及び「ウイルス複製」という用語は、ウイルスの増殖をもたらすウイルスの生活環の
段階のうちの1つもしくは複数、又は全てを指す。ウイルスの生活環の段階には、宿主細
胞表面へのウイルス付着、宿主細胞への貫入又は侵入(例えば、受容体媒介性エンドサイ
トーシス又は膜融合によるもの)、脱外被(ウイルスカプシドがウイルス酵素又は宿主酵素
によって除去及び分解され、それにより、ウイルスゲノム核酸が放出される過程)、ゲノ
ム複製、ウイルスメッセンジャーRNA(mRNA)の合成、ウイルスタンパク質合成、及びゲノ
ム複製のためのウイルスリボ核タンパク複合体の会合、ウイルス粒子の会合、ウイルスタ
ンパク質の翻訳後修飾、及び溶解又は出芽による宿主細胞からの遊離、並びに埋め込まれ
たウイルス糖タンパク質を含むリン脂質エンベロープの獲得が含まれるが、これらに限定
されない。いくつかの実施態様において、「複製」、「ウイルスの複製」、及び「ウイル
ス複製」という用語は、ウイルスゲノムの複製を指す。他の実施態様において、「複製」
、「ウイルスの複製」、及び「ウイルス複製」という用語は、ウイルスタンパク質の合成
を指す。
本明細書で使用されるように、「ステムドメインポリペプチド」、「HAステムドメイン
」、「インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチド」、及び「HAスト
ークドメイン」という用語は、インフルエンザ血球凝集素のステムドメインを構成する1
以上のポリペプチド鎖を含み又は該ポリペプチド鎖からなるポリペプチドを指す。ステム
ドメインポリペプチドは、単一のポリペプチド鎖、2つのポリペプチド鎖、又はより多く
のポリペプチド鎖であり得る。通常、ステムドメインポリペプチドは、単一のポリペプチ
ド鎖(すなわち、血球凝集素HA0ポリペプチドのステムドメインに対応する)又は2つのポリ
ペプチド鎖(すなわち、血球凝集素HA2ポリペプチドと関連している血球凝集素HA1ポリペ
プチドのステムドメインに対応する)である。具体的な実施態様において、ステムドメイ
ンポリペプチドは、A型インフルエンザH1もしくはH3のインフルエンザウイルス血球凝集
素、又はB型インフルエンザのインフルエンザウイルス血球凝集素に由来する。
本明細書で使用されるように、「インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポ
リペプチド」、「インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメイン」、「HA球状ヘッド
ドメイン」、及び「HAヘッドドメイン」という用語は、インフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインを指す。例えば、A型インフルエンザウイルスについて、球
状ヘッドドメインは、一般に、HA分子のHA1部分の2つの重要なシステイン残基間に存在す
ると理解されている。これらのシステイン残基は、様々なA型インフルエンザウイルスに
ついて、図1で「Ap」及び「Aq」として特定されている。
本明細書で使用されるように、「対象」又は「患者」という用語は互換的に使用され、
動物(例えば、鳥、爬虫類、及び哺乳動物)を指す。具体的な実施態様において、対象は鳥
である。別の実施態様において、対象は、非霊長類(例えば、ラクダ、ロバ、シマウマ、
ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、及びマウス)並びに霊長類(例え
ば、サル、チンパンジー、及びヒト)を含む哺乳動物である。ある実施態様において、対
象は非ヒト動物である。いくつかの実施態様において、対象は家畜又はペットである。別
の実施態様において、対象はヒトである。別の実施態様において、対象はヒト乳児である
。別の実施態様において、対象はヒト小児である。別の実施態様において、対象はヒト成
人である。別の実施態様において、対象はヒト高齢者である。別の実施態様において、対
象はヒト早産児である。
本明細書で使用されるように、「ヒト早産児」という用語は、妊娠37週未満で生まれる
ヒト乳児を指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト乳児」という用語は、新生児から1歳までのヒト
を指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト小児」という用語は、1歳から18歳までのヒトを
指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト成人」という用語は、18歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用されるように、「ヒト高齢者」という用語は、65歳以上のヒトを指す。
本明細書で使用されるように、「季節性インフルエンザウイルス株」という用語は、対
象集団が季節毎に暴露されるインフルエンザウイルスの株を指す。具体的な実施態様にお
いて、季節性インフルエンザウイルス株という用語は、A型インフルエンザウイルスの株
を指す。具体的な実施態様において、季節性インフルエンザウイルス株という用語は、H1
又はH3亜型、すなわち、現在、ヒト対象集団内に存続している2つの亜型に属するインフ
ルエンザウイルスの株を指す。他の実施態様において、季節性インフルエンザウイルス株
という用語は、B型インフルエンザウイルスの株を指す。
本明細書で使用されるように、「療法(複数)」及び「療法」という用語は、ウイルス感
染又はそれと関連する疾患もしくは症状の予防又は治療において使用することができる任
意のプロトコル(複数可)、方法(複数可)、化合物(複数可)、組成物(複数可)、製剤(複数
可)、及び/又は薬剤(複数可)を指すことができる。ある実施態様において、「療法(複数)
」及び「療法」という用語は、当業者に公知のウイルス感染又はそれと関連する疾患もし
くは症状の予防又は治療において有用な生物学的療法、支持療法、及び/又は他の療法を
指す。いくつかの実施態様において、「療法」という用語は、(i)キメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸、(ii)キメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチド、又は(iii)キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコード
する核酸を含むかもしくはキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むベク
ターもしくは組成物を指す。いくつかの実施態様において、「療法」という用語は、キメ
ラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに特異的に結合する抗体を指す。
本明細書で使用されるように、「治療する(treat)」、「治療」、及び「治療する(trea
ting)」という用語は、対象への療法(複数可)の投与との関連において、療法又は療法の
組合せの有益な又は治療的な効果を得るためにインフルエンザウイルス疾患又は感染を治
療することを指す。具体的な実施態様において、そのような用語は、療法又は療法の組合
せの投与から得られる以下の効果のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれより多く
を指す:(i)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の重症度の
軽減又は改善;(ii)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状の
持続時間の短縮;(iii)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症状
の退行;(iv)インフルエンザウイルスの力価の低下;(v)インフルエンザウイルス感染又は
それと関連する疾患と関連する器官不全の軽減;(vi)対象の入院の減少;(vii)入院期間の
短縮;(viii)対象の生存の増加;(ix)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患
もしくは症状の消失;(x)インフルエンザウイルス感染又はそれと関連する疾患もしくは症
状の進行の阻害;(xi)ある細胞、組織、器官、又は対象から別の細胞、組織、器官、又は
対象へのインフルエンザウイルスの伝播の予防;(xii)宿主細胞(複数可)へのインフルエン
ザウイルスの侵入の阻害又は低下;(xiii)インフルエンザウイルスゲノムの複製の阻害又
は低下;(xiv)インフルエンザウイルスタンパク質の合成の阻害又は低下;(xv)宿主細胞(複
数可)からのインフルエンザウイルス粒子の放出の阻害又は低下;並びに/或いは(xvi)別の
療法の治療効果の増強又は改善。
本明細書で使用されるように、いくつかの実施態様において、ウイルスとの関連におけ
る「野生型」という語句は、一般的であり、自然に循環しており、かつ疾患の典型的な発
生をもたらすウイルスの型を指す。他の実施態様において、ウイルスとの関連における「
野生型」という用語は、親ウイルスを指す。
(4.図面の簡単な説明)
A型インフルエンザウイルス血球凝集素の17種の亜型の代表的な配列(それぞれ、配列番号1〜16及び35)のCLUSTALWによる配列アラインメントを示す。Apと表記された残基は、Aqと表記された残基(HA1のC末端ステムセグメント中のシステイン残基)とジスルフィド結合を形成するか、又はそれを形成することができるHA1のN末端ステムセグメント中のシステイン残基である。Bqと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のC末端の短いステムセグメントのおおよそのN末端アミノ酸を表す。Cqと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のC末端の長いステムセグメントのおおよそのN末端アミノ酸を表す。Cpと表記された残基は、本明細書に記載のHA1のN末端の長いステムセグメントのおおよそのC末端アミノ酸を表す。
保存されたH1ストークドメイン及び異種亜型HA由来の様々な球状ヘッドドメインを有するキメラHAの概略図を示す。
抗体及び反応性血清を誘導し、解析するための新規のインフルエンザワクチン及び診断ツールプラットフォームを示す。A)キメラHAの発現。A/PR/8/34 HAのストークドメイン及びA/カリフォルニア/4/09の球状ヘッドドメインからなるキメラHA(キメラHA)並びに野生型HA(PR8-HA及びCAL09-HA)並びにGFP対照を293T細胞で発現させた。上のウェスタンブロットはPR8特異的抗体(PY102)でプロービングしたのに対し、下側のブロットはCal09に特異的な抗体(39C2)でプロービングした。B) Aで発現されたHA構築物の模式図。キメラHAは、A/PR/8/34 HAストークドメイン及び2009 A/カリフォルニア/04/09球状ヘッドドメインから構成される。
キメラHAの概略図を示す。A)キメラHAの基本構造。球状ヘッドは、ジスルフィド結合Cys 52-Cys 277で好都合に交換することができる。B)完全に保存されたストークドメイン及び様々な球状ヘッドドメインからなるキメラHAの順次投与による初回免疫-追加免疫体制。
H1 HAのストーク及びH3 HAの球状ヘッドを有するキメラHAの作製を記載している。A/PR/8/34 HAのストークドメイン及びHK/68の球状ヘッドドメインからなるキメラHA(キメラH3)並びに野生型HA(PR8-HA及びHK68 HA)を293T細胞で発現させた。上のウェスタンブロットはPR8特異的抗体でプロービングしたのに対し、下側のブロットはH3に特異的な抗体でプロービングした。
A/香港/1/1968(H3)、A/パース/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/ベトナム/1203/04(H5)、及びA/マガモ/アルバータ/24/01(H7)の血球凝集素タンパク質配列の配列比較を示す。Cys52及びCys277アミノ酸残基が(H3付番に基づいて)指定されている。黒い陰影は、保存されたアミノ酸を示す。黒の波線は、HAの球状ヘッド領域を表す。HA1及びHA2の始点が示されている。A/香港/1/1968(H3)、A/パース/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/ベトナム/1203/04(H5)、及びA/マガモ/アルバータ/24/01(H7)の各々のHAのN末端からCys52までのアミノ酸配列が提示されており、それぞれ、配列番号23〜28に対応する。A/香港/1/1968(H3)、A/パース/16/2009(H3)、A/PR/8/34(H1)、A/Cal/4/09(H1)、A/ベトナム/1203/04(H5)、及びA/マガモ/アルバータ/24/01(H7)の各々のHAのCys277からC末端までのアミノ酸配列が提示されており、それぞれ、配列番号29〜34に対応する。
キメラ血球凝集素の概略図を示す。(A)キメラPR8-cH1 HAの構築図。キメラHAを、A/PR/8/34(H1) HAのCys52とCys277の間に位置する球状ヘッドドメインと、A/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとを交換することにより構築した。得られるキメラHAは、A/PR/8/34(H1) HAのストーク領域をA/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとともに有しており、PR8-cH1と表記されている。(B)様々な野生型HA及びキメラHA、例えば、(左から右に)野生型PR8 HA、キメラPR8-cH1 HA、キメラPR8-cH5 HA、野生型パースHA、及びキメラパース-cH7 HAのフォールディングされた構造の概略図。全長HA構造は、タンパク質データベース(PDB)からダウンロードした: PR8 HA(PDB ID 1RU7)及びパースHA(HK68 HA、PDB ID 1MQNで表される)。最終的な画像は、PyMol(Delano Scientific)で作成した。
キメラHA構築物の表面発現及び機能解析を示す。(A)キメラHA構築物の表面発現を一過性にトランスフェクトした細胞で評価した。トランスフェクションから24時間後、293T細胞をトリプシン処理し、キメラHAタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーにより解析した。上のパネルで、模擬トランスフェクトした細胞(左の陰影領域)が、PR8 HAをトランスフェクトした細胞(右)又はPR8-cH1をトランスフェクトした細胞(右)又はPR8-cH5をトランスフェクトした細胞(右)と比較されている。下のパネルで、模擬トランスフェクトした細胞(左の陰影領域)が、パースをトランスフェクトした細胞及びパース-cH7構築物をトランスフェクトした細胞(右)と比較されている。(B)キメラHAを発現するルシフェラーゼコード偽粒子を用いて、MDCK細胞を感染させた。ルシフェラーゼアッセイで生成された相対光単位(RLU)は、キメラHAを発現する偽粒子が細胞に侵入することができたことを示す。
キメラ血球凝集素を有する組換えウイルスの作製を記載している。(A)組換えウイルスのウェスタンブロット解析。模擬感染させた又は表示されたウイルス(16hpi)に2のMOIで感染させたMDCK細胞由来の抽出物を調製し、抗体:抗A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗A/Cal/09/HA(H1)(29C1)、抗A/VN/HA(H5)(M08)、抗H3/HA(12D1)、抗H7(NR-3125)、抗A/NP(HT103)、及び内部ローディング対照としての抗GAPDHでプロービングした。(B)抗体:抗A/NP(HT103)、抗A/H1 HA(6F12)、抗A/PR8/HA(PY102)、抗A/Cal/09/HA(29C1)、抗A/VN/HA(M08)、抗H3/HA(12D1)、及び抗A/H7ウイルス(NR-3152)を用いる、組換えウイルスに感染させたMDCK細胞の免疫蛍光解析。
組換えウイルスの増殖動態及びプラーク表現型を記載している。(A)10日齢の発育鶏卵を、卵1個当たり100pfuの野生型ウイルス又は組換えウイルスに感染させ、ウイルス増殖を感染後72時間モニタリングした。(B)組換えウイルスのプラーク表現型をプラークアッセイにより評価した。MDCK細胞を、野生型ウイルス又は組換えウイルスのいずれかに感染させ、感染から48時間後に免疫染色して、A/NPに対する抗体(HT103)を用いてプラーク表現型を明らかにした。
キメラH6血球凝集素をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光解析を示す。293T細胞に、キメラH6血球凝集素を発現する1μgのpCAGGSプラスミドをトランスフェクトした。DNA(A)、Cal/09感染(B)、DNA及びCal/09感染(C)、又はCal/09スプリットワクチン(D)を受容した動物由来の血清をトランスフェクト細胞に添加し、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可視化した。
DNA初回免疫及びキメラウイルス追加免疫が、致死的インフルエンザウイルス感染により感染させた動物に防御を付与することを示す。動物を、DNAのみ、キメラH9ウイルスのみ、DNA初回免疫及びキメラH9ウイルス追加免疫、又は不活化PR8ウイルスのいずれかで処理した。その後、マウスを、鼻腔内に注入される5×104PFUのPR8ウイルスに感染させ、動物の体重を14日間モニタリングした。
ELISAにより決定したときのcH6タンパク質に対するストーク特異的抗体の反応性を示す。
キメラHA(cHA)タンパク質(A)及びMDCK細胞でのcHA発現(B)の模式的表示を示す。キメラHA(cHA)タンパク質及び組換えキメラウイルス。(A)cHAの模式的表示。球状ヘッドドメインは、残基C52とC277(H3付番)の間の介在アミノ酸配列として定義される。このジスルフィド結合をヘッドとストークの境界として用いて、外来のHAヘッドを異種ストークの上に導入した。ストークドメインは、HA1及びHA2サブユニットの残りの部分として定義される。CT、細胞質尾部; SP、シグナルペプチド; TM、膜貫通ドメイン。全長HA構造は、タンパク質データベース(PDB)からダウンロードした: PR8(H1) HA(PDB ID 1RU7)及びA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99 HA[A/ブタ/香港/9/98(H9; PDB ID 1JSD)により表される]。最終的な画像は、PyMol(Delano Scientific)で作成した。H6 HAの構造は公開されていないので、PR8 HAのヘッドフォールディングの画像がcH6/1構築物に使用されている。(B)cHAの発現を確認するための免疫蛍光。MDCK細胞を、WT PR8ウイルスもしくはcH9/1 N3ウイルスのどちらかに感染させるか、又は該細胞を模擬感染させた。PR8ウイルスのヘッド及びストークに特異的な抗体並びにH9反応性を有する抗体を用いて、cHA発現を確認した。(倍率バー:40倍)。
パンデミックH1N1ウイルスに感染した成人患者がHAストークと反応する高力価の中和抗体を有することを示す。pH1N1感染成人(n＝9)、pH1N1に感染していない小児(n＝5)、及びpH1N1ウイルスに感染していない成人(n＝11)の血清と、cH6/1タンパク質(A)、cH9/1タンパク質;(B)HA2タンパク質のLAH(抗LAH抗体を陽性対照として使用した);(C)H5 HAタンパク質(H5 HAに対して作製されたマウスポリクローナル血清を陽性対照として使用し、汎H3抗体12D1を陰性対照として使用した);(D)(13)、又はH3 HAタンパク質(12D1を陽性対照として使用し、H5 HAに対して作製されたマウスポリクローナル血清を陰性対照として使用した);(E)との反応性。全てELISAにより評価した;データ点は、プール試料のSE付き平均力価又は反応性を表す。
パンデミックH1N1ウイルスに感染した成人患者がHAストークに特異的である高力価の中和抗体を有することを示す(A及びB)。pH1N1感染者(n＝14)及びpH1N1に感染していない成人(n＝5)由来の血清を別々にプールし、両方のプール由来の全IgGを精製した。ストーク抗体の中和能力を、cH9/1 N3ウイルスを用いるプラーク減少アッセイにより評価した。データ点は、2回の実験の平均及びSEを表す。プラークを抗H9抗体G1-26で免疫染色した。(B)は、上部に沿って示した血清の4つの希釈液のプラーク減少を示す。(C)シュードタイプ粒子中和アッセイは、ヒト精製IgG調製物(pH1N1感染成人及びpH1N1に感染していない成人由来の血清)の中和抗体活性を測定する。全IgG濃度は、50、10、及び2μg/mLであった。陽性対照として、ストーク特異的モノクローナル抗体6F12を使用した。
cH6/1及びcH9/1タンパク質の発現及び機能を示す。A)2μgのcH6/1及びcH9/1タンパク質のクマシーゲル。M、マーカータンパク質。(B)バキュロウイルス発現cHAタンパク質のウェスタンブロット解析。レーン1、cH6/1タンパク質;レーン2、cH9/1タンパク質;レーン3、WT PR8 HA;レーン4、WT H3 HA。ブロットを、PR8ウイルスのストークと反応することが知られている抗体(ウサギポリクローナル抗HA2)又はH3ウイルスのストークと反応することが知られている抗体(マウスmAb 12D1)及びH6ウイルスの球状ヘッドと反応することが知られている抗体(ヤギポリクローナル抗H6)又はH9ウイルスの球状ヘッドと反応することが知られている抗体(マウスmAb G1-26)でプロービングして、バキュロウイルス発現cHAの同一性を確認した。mAb 12D1は、HA0とHA2の両方と反応する(H3タンパク質調製物は切断されて、2つの異なるバンドを生じる)。(C)cH9/1 N3再集合体ウイルスのプラークアッセイ。再集合体cH9/1 N3ウイルスのプラーク表現型は、WT PR8ウイルスによって作られるプラークと同様である。プラークをPY102及び抗H9抗体G1-26で免疫染色した。
インフルエンザウイルスHAのストークに対するモノクローナル抗体がcHAに結合し、それを中和することを示す。(A)ストーク抗体C179を用いて、cH6/1バキュロウイルス発現タンパク質に対する反応性をELISAにより試験した。C179はcH9/1と用量依存的な形で反応した。(B)ストーク抗体C179を用いて、cH9/1バキュロウイルス発現タンパク質に対する反応性をELISAにより試験した。C179はcH9/1と用量依存的な形で反応した(C及びD)。抗体6F12は、cH9/1 N3ウイルス複製を中和する。6F12を用いて、cH9/1 N3ウイルスを中和するストーク特異的モノクローナル抗体の能力をプラーク減少アッセイにより評価した。Dは、mAb 6F12の5つの希釈液(100、20、4、0.8、及び0.16μg/mL)を用いるcH9/1 N3ウイルスのプラーク減少を示す。プラークを抗H9抗体G1-26で免疫染色した。
キメラ血球凝集素の概略図を示す。図19Aは、野生型及びcH1/1ウイルスの図を示す。キメラHAを、PR8(H1) HAのCys52とCys277の間に位置する球状ヘッドドメインと、A/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとを交換することにより構築した。得られるキメラHAは、A/PR/8/34(H1) HAのストーク領域をA/カリフォルニア/4/09(H1) HAの球状ヘッドドメインとともに有しており、cH1/1と表記されている。図19Bは、様々な野生型及びキメラHAのフォールディングされた構造の理論的概略図を示す。左から右に:野生型PR8 HA、キメラcH1/1 HA、キメラcH5/1 HA、野生型パースHA、キメラcH7/3 HA、及びキメラcH5/3 HA。
本研究で使用されるH1 HAとH3 HAとH5 HAとH7 HAのアミノ酸同一性を比較した表を示す。アミノ酸同一性パーセントは、ClustalWを用いて計算した(シグナルペプチドを除く)。アミノ酸同一性パーセントは、全長HA、並びに球状ヘッドドメイン及びストークドメインについて比較されている。灰色の棒は、100％同一性を示す。
キメラHA構築物の表面発現を示す。キメラHA構築物の表面発現を一過性にトランスフェクトした又は一過性に感染させた細胞で評価した。トランスフェクションから48時間後、293T細胞をトリプシン処理し、キメラHAタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリーにより解析した。上のパネルでは、模擬トランスフェクトした細胞(灰色)が、PR8 HAをトランスフェクトした細胞(黒線)又はcH1/1をトランスフェクトした細胞(黒線)又はcH5/1をトランスフェクトした細胞(黒線)と比較されている。真ん中のパネルでは、模擬トランスフェクトした細胞(灰色)が、パース/09をトランスフェクトした細胞、cH7/3をトランスフェクトした細胞(黒線)、及びcH5/3構築物をトランスフェクトした細胞(黒線)と比較されている。下のパネルでは、MDCK細胞を、パース/09、cH7/3、及びcH5/3を発現する組換えウイルスに感染させた。感染から12時間後、様々なHAの細胞表面発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した。
MDCK細胞に侵入するキメラHAの能力を示す。キメラHAを発現するルシフェラーゼコード偽粒子を用いて、MDCK細胞に形質導入した。ルシフェラーゼアッセイで生成される相対光単位(RLU)は、キメラHAを発現する偽粒子が細胞に侵入することができることを示す。
組換えcHA発現ウイルスに感染させた細胞のウェスタンブロット解析を示す。模擬感染させた又は表示されたウイルスに2のMOIで感染させたMDCK細胞由来の抽出物を調製し、16hpiで、抗体:抗A/PR8/HA(H1)(PY102)、抗A/Cal/09/HA(H1)(29E3)、抗A/VN/HA(H5)(mAb #8)、抗H3/HA(12D1)、抗H7(NR-3152)、抗A/NP(HT103)、及びローディング対照としての抗GAPDHでプロービングした。
抗体:抗A/NP(HT103)、抗A/H1 HA(6F12)、抗A/PR8/HA(PY102)、抗A/Cal/09/HA(29E3)、抗A/VN/HA(mAb #8)、抗H3/HA(12D1)、及び抗A/H7ウイルス(NR-3152)を用いる、組換えウイルスに感染させたMDCK細胞の免疫蛍光解析を示す。
野生型ウイルス及び組換えウイルスの増殖動態及びプラーク表現型を示す。(A)10日齢の発育鶏卵を、卵1個当たり100pfuの野生型ウイルス又は組換えウイルスに感染させ、ウイルス増殖を感染後72時間モニタリングした。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(B)組換えウイルスのプラーク表現型をプラークアッセイにより評価した。MDCK細胞を野生型ウイルス又は組換えウイルスのどちらかに感染させた。感染から48時間後、細胞を固定し、免疫染色し、A/NPに対する抗体(HT103)を用いてプラーク表現型を明らかにした。
ストーク特異的モノクローナル抗体がcHA発現ウイルス及びシュードタイプ粒子を中和することを示す。cHA発現ウイルス又はシュードタイプ粒子を中和するmAb(KB2)の能力をプラーク減少アッセイ又はシュードタイプ粒子阻害アッセイにより評価した。MDCK細胞を、表示された量(ug/mL)のmAbの存在下で、又は抗体なしで、cHA発現ウイルスもしくはシュードタイプ粒子に感染させるか、又はこれらで形質導入した。プラーク形成又はルシフェラーゼ活性を読出しとして用いて、mAbによる阻害の程度を決定した。該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)ウイルス複製を用量依存的な形で中和し、100ug/mLを超える濃度で100％阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(B)該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)シュードタイプ粒子の侵入も用量依存的な形で阻害し、4ug/mL超で完全に阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。シュードタイプ阻害アッセイは独立に処理された。
cHA構築物の順次ワクチン接種がHAストーク特異的抗体を誘発し、致死的感染からの防御をもたらすことを示す。マウスを、アジュバントとともに鼻腔内及び腹腔内投与される20μgのcH9/1タンパク質で初回免疫した。3週間後、マウスを、アジュバントとともに鼻腔内及び腹腔内投与される20μgのcH6/1タンパク質で追加免疫した。対照として、マウスを、BSAを用いて同様の様式で初回免疫及び追加免疫するか、又はマウスに不活化FM1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、最後のワクチン接種から3週間後に、5LD50のA/フォートモンマス/1/1947(FM1)ウイルスに感染させた。(A)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした(BSA＋BSAは、グラフの最下線である)。(B)感染からの防御を評価するために、マウスを14日間毎日計量した。(C)感染後の生存率を示すカプランマイヤー曲線。cH9/1＋cH6/1ワクチン接種マウスは、BSA対照と比べて統計的により高い生存率を有していた(p＝0.0003)。
cH6/1のワクチン接種がcH9/1 N1ウイルス感染からの防御を媒介するストーク特異的免疫を誘発することを示す。インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスのワクチン接種の前に刺激するために、動物にYAM-HAウイルスを接種した。3週間後、動物に、cH6/1又はBSAのワクチンを、アジュバントとともに、鼻腔内及び腹腔内接種した。対照動物に野生型B/山形/16/1988を接種し、同様の様式でBSAをワクチン接種するか、又は不活化cH9/1 N1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、ワクチン接種から3週間後に、250LD50のcH9/1 N1ウイルスに感染させた。(A)感染からの防御を評価するために、マウスを8日間毎日計量した。3〜5日目に、YAM-HA＋cH6/1動物は、YAM-HA＋BSAコホートと比べて統計的により小さい重量減少を示した(p＜0.05)。(B)生存を示すカプランマイヤー曲線。統計的に異なる生存率は、YAM-HA＋BSAコホートと比べたYAM-HA＋cH6/1群(p＝0.038)、並びに未感作動物及びWT YAM＋BSA動物と比べたYAM-HA＋cH6/1群(p＜0.0001)で見られた。YAM-HA＋BSAコホートの生存率は、WT-YAM＋BSAコホートの生存率と統計的に異なってはいなかった(p＝0.058)。(C)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした。(D)cH5/1ウイルスを用いるプラーク減少アッセイの結果が示されている。(E)動物にワクチンを接種し、採血し、全IgGをH5に基づく偽粒子侵入阻害アッセイのために回収した。阻害パーセントを、対照と比べたルシフェラーゼ発現の減少として評価した。
cH6/1のワクチン接種がマウスを致死的H5インフルエンザウイルス感染から防御することを示す。インフルエンザウイルスの感染又はインフルエンザウイルスのワクチン接種の前に刺激するために、動物にYAM-HAウイルスを接種した。3週間後、動物に、cH6/1又はBSAのワクチンを、アジュバントとともに、鼻腔内及び腹腔内接種した。対照動物に野生型B/山形/16/1988を接種し、同様の様式でBSAをワクチン接種するか、又は不活化cH5/1 N1ウイルスを筋肉内投与した。動物から採血し、10LD50のPR8バックグラウンドの2:6 H5再集合体に感染させた(例えば、Steelらの文献、2009, J Virol 83:1742-1753参照)。(A)生存を示すカプランマイヤー曲線。YAM-HA＋cH6/1群をYAM-HA＋BSAコホートと比較したとき、生存率の差が統計的有意性に達した(p＝0.06)。(B)生存の長さは、平均して、BSAをワクチン接種した動物(p＝0.037)、並びに未感作対照及びWT YAM/BSA対照(p＜0.001)よりもYAM-HAを接種した動物及びcH6/1をワクチン接種した動物で長かった。(C)ワクチン接種によって誘発されるストーク反応性の程度を評価するために、ELISAプレートにcH5/1 N1ウイルスをコーティングした。1:50血清希釈を％最大重量減少に対してプロットした。1つの値は外れ値であることが明らかになり、解析から除外された。線形回帰については、R2＝0.56及びp＝0.02であった。
cHAのワクチン接種がH1N1ウイルス感染からの防御を媒介するストーク特異的免疫を誘発することを示す。(A〜F)動物を、cH9/1をコードするDNAで初回免疫し、その後、cH6/1をワクチン接種し、cH5/1可溶性タンパク質(n＝10)又はBSA(n＝5)で追加免疫し、一方、陽性対照マウスは、不活化ウイルスを筋肉内に受容した(n＝5)。(A)動物にワクチンを接種し、FM1ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な体重減少が初期体重のパーセンテージの変化として示されている。(B)(A)の感染マウスの生存を示すグラフ。(C)動物にワクチンを接種し、pH1N1ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な体重減少が初期体重のパーセンテージの変化として示されている。(D)(C)の感染マウスの生存を示すグラフ。(E)動物にワクチンを接種し、PR8ウイルスに感染させ;マウスを毎日計量した。経時的な体重減少が初期体重のパーセンテージの変化として示されている。(F)(E)の感染マウスの生存を示すグラフ。(G)上でA〜Fに及び下でH〜Iに記載したようにワクチン接種し、5 LD50のA/FM/1/1947(A、B)、10 LD50のA/ネーデルラント/602/2009(C、D)、又は5 LD50のA/PR/8/1934(E、F、H、I)に感染させた動物由来の血清のH1 HAに対する反応性。(H)動物は、上でA〜Fに記載されているようにワクチン接種されたか(四角、n＝4)、又は未感作であったが(三角、n＝3)、陽性対照マウスは、不活化PR8ウイルスを筋肉内に受容した(X印、n＝5)。PR8ウイルスの感染前に、CD8 T細胞を除去した。マウスを毎日計量した。経時的な体重減少が初期体重のパーセンテージの変化として示されている。(I)(H)の感染マウスの生存を示すグラフ。(J)動物に、A〜Fについて記載されているようにワクチンを接種した。全IgGを、H2に基づく偽粒子侵入阻害アッセイで使用するために精製した。阻害パーセントを、対照と比べたルシフェラーゼ発現の減少として評価した。Fab断片CR6261を陽性対照として使用した。
野生型HA及び発現構築物の概略図。(A)未切断の全長インフルエンザウイルス血球凝集素。シグナルペプチドは左端の成分であり、HA細胞外ドメインは真ん中の成分であり、膜貫通及び細胞内ドメインは右端の成分である。(B)三量体化ドメインを有する発現構築物。膜貫通及び細胞内ドメインを、位置V503(H3付番)で、トロンビン切断部位(左から3番目の成分)、T4三量体化ドメイン(左から4番目の成分)、及びヘキサヒスチジンタグ(6×hisタグ、左から5番目の成分)と交換した。(C)三量体化ドメインを有さない発現構築物。膜貫通及び細胞内ドメインを、それぞれ、アミノ酸位置509(H1、H2、及びH5)又は508(H3)(H3付番)で、ヘキサヒスチジンタグ(6×hisタグ、右端の成分)と交換した。
三量体化ドメインの導入は、組換えHAにおけるオリゴマーの安定性及び形成に影響を及ぼす。(A)還元性、変性SDS-PAGEによる三量体化ドメインを有する又は三量体化ドメインを有さない組換えHAの解析。三量体化ドメインあり(+)で発現された組換えHAは、なし(-)で発現されたHAよりも高い安定性を示す。未切断のHA(HA0)及び切断産物(HA1/分解産物; HA2)が矢印で示されている。(B)架橋されたHAの還元性、変性SDS-PAGE解析。様々なHA種がブロット中に示されている。高分子多量体はHで示され、三量体はTで示され、二量体はDで示され、単量体はMで示されている。(C)左パネル(囲み1〜4):抗ヘキサヒスチジンタグ抗体でプロービングされたB由来の還元され、変性し、かつ架橋されたグループ1 HAのウェスタンブロット解析。右パネル(右端の囲み): SDS-PAGEで解析されたBS3を有する架橋対照(IgG)。様々な種(完全抗体、重鎖、軽鎖)が矢印で示されている。マーカーバンドの分子量が各々のパネルの左側に示されている。
組換えPR8(H1)及びCal09(H1) HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性PR8 HAに対するストーク反応性抗体C179、CR6261、及び6F12並びにヘッド反応性抗体PY102及びPR8抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性Cal09 HAに対するストーク反応性抗体C179、CR6261、及び6F12並びにヘッド反応性抗体7B2及びCal09抗血清の結合。
組換えJAP57(H2)及びVN04(H5) HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性JAP57 HAに対するストーク反応性抗体C179及びCR6261並びにヘッド反応性抗体8F8及びH2抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性VN04 HAに対するストーク反応性抗体C179及びCR6261並びにヘッド反応性抗体mAb#8及びH5抗血清の結合。
グループ2 HAに対するストーク反応性抗体の結合。(A)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性HK68 HAに対するストーク反応性抗体12D1及びCR8020並びにヘッド反応性抗体XY102及びH3抗血清の結合。(B)三量体化ドメインを有さない(T4三量体ドメインなし、三角の線)又は三量体化ドメインを有する(T4三量体ドメインあり、四角の線)組換え可溶性Wisc05 HAに対するストーク反応性抗体12D1及びCR8020並びにH3抗血清の結合。
B型インフルエンザウイルス(B/フロリダ/4/2006)のステムドメイン及びH5亜型のA型インフルエンザウイルス(A/ベトナム/1203/2004)の球状ヘッドドメインを含む例示的なキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(配列番号21)を示す。
HAストークに基づくワクチン接種戦略が異なるH3N2ウイルスの感染からの広範な防御をもたらすことを示す。(A)ワクチン接種戦略の模式的表示(各々の抗原の単量体形態が示されている)。(B〜E)動物に、cH4/3 HAをコードするプラスミドDNAをワクチン接種し、その後、組換え可溶性cH5/3、次いで、cH7/3タンパク質で追加免疫した(先端が下向きの灰色の三角; n＝9又は10匹の動物)。陽性対照動物は、マッチする感染株を含む不活化ワクチンを受けた(灰色の丸; n＝5匹の動物)。初回免疫のみの動物(先端が上向きの灰色の三角; n＝5匹の動物)は、DNA初回免疫、次いで、2回の無関係なタンパク質の追加免疫を受けた。未感作動物(黒い四角; n＝5匹の動物)を感染のさらなる対照として使用した。(B) Phil82(H3N2)ウイルス感染時の体重減少曲線。(C) Phil82感染時のカプラン-マイヤー生存曲線。(D) X-31(H3N2)ウイルス感染時に観察される罹病率。(E) X-31(H3N2)感染後の生存曲線。対照群(cH4/3DNA-BSA-BSA)と比べたワクチン接種群(cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)の生存は、両方の感染実験について極めて有意である(それぞれ、P＝0.0008及び0.0001)。(F及びG)マウスモデルで致死ではないウイルスに対するワクチンの防御幅をさらに試験するための肺力価測定実験。ワクチン接種動物(BcH7/3-cH5/3-cH4/3)及び対照動物(Bwt-BSA-BSA)を、5×104PFUのH3N2変異体(F)又は1×105PFUのヒトH3N2 A/ワイオミング/03/03(G)に感染させた。感染後3日目に、両方の群由来の動物の肺を摘出し、ホモジナイズし、50％組織培養感染用量(TCID50)を測定した。
cHA構築物のワクチン接種がストーク反応性抗体の先在力価を防御的レベルにまで増強することができることを示す。(A〜G)ヒト集団に存在するストークドメインに対する先在免疫を模倣するために、動物にcH7/3 HAを発現する組換えB型インフルエンザウイルスを致死量未満で感染させた。その後、これらを組換え可溶性cH5/3(又はcH5/3N1感染動物の場合、全長H3 HA)、その後、cH4/3タンパク質で追加免疫した(先端が下向きの濃灰色の三角; n＝10匹の動物)。陽性対照動物は、マッチする感染株を含む不活化ワクチンを受けた(濃灰色の丸; n＝5匹の動物)。初回免疫のみの動物(先端が上向きの濃灰色の三角; n＝5匹の動物)は、組換えB型インフルエンザによる初回免疫、その後、2回の無関係なタンパク質の追加免疫を受けた。さらなる対照群は、野生型B型インフルエンザウイルスに感染させられ、その後、2回の無関係なタンパク質の追加免疫を受ける(先端が下向きの薄灰色の三角; n＝5)か、又は未感作である(黒い四角; n＝5)かのいずれかであった。(B〜D)ウイルス感染後の体重減少曲線。(B)現在のヒトH3N2分離株はマウスで病原性がないので、代用感染株としての最近のヒトH3N2分離株由来のHAのストークドメインを発現するマウス病原性cH5/3N1ウイルスを用いて、現代のストークドメインに対する効力を試験した。X-31(H3N2; A/香港/1/68由来のHA及びNA)(C)及びPhil82(H3N2)(D)ウイルスの感染時の体重減少;(E) A/cH5/3N1感染後のカプラン-マイヤー生存曲線;(F) Phil82(H3N2)感染後の生存曲線;(G) X-31(H3N2)感染後の生存曲線。BcH7/3-cH5/3-cH4/3群とBcH7/3-BSA-BSA群を比較したとき、統計解析により、全ての感染について高い有意性が明らかになった(P＝0.082、P＜0.0001、及びP＜0.0001)。
誘発される抗ストーク応答が直近のワクチン株を含む複数のH3N2株に対して交差反応性であることを示す。誘発される抗ストーク応答は、直近のワクチン株を含む複数のH3N2株に対して交差反応性である。(A〜E) cHA構築物(先端が下向きの濃灰色の三角、cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)をワクチン接種した動物、初回免疫のみの動物(先端が上向きの濃灰色の三角)、又は未感作動物(黒い四角)から回収された血清のPhil82(H3N2、ウイルス全体)(A)、X-31ウイルス(H3N2; A/香港/1/68ウイルス由来のHA及びNAを発現する)(B)、H3N8ウイルス(C)、現在のインフルエンザワクチン株Vic11(H3N2、ウイルス)(D)、又はパース09タンパク質(H3)(E)に対するELISA反応性。(F〜H) cHA構築物をワクチン接種した動物(先端が下向きの濃灰色の三角、B/cH7/3ウイルス-cH5/3タンパク質-cH4/3タンパク質)、初回免疫のみの動物(先端が上向きの濃灰色の三角)、野生型B型インフルエンザウイルスに感染させられ、その後、BSAによる2回の追加免疫を受けた対照動物(先端が下向きの薄灰色の三角)、又は未感作動物(黒い四角)から回収された血清のVic11 H3N2(F)又はPhil82 H3N2(G)又はX-31 H3N2(H)ウイルスに対するELISA反応性。
cHAワクチン接種戦略により誘発される抗H3 HAストーク抗体の幅が直近の中国のH7N9ウイルスを含むグループ2 HAの他のメンバーにまで及ぶことを示す。(A)抗H7球状ヘッドドメイン抗体がこのシリーズの実験で観察される効果に関与しないことを保証するために、図37に示されるワクチン接種スキームを修正した。動物は、同じ初回免疫(cH4/3 HAをコードするDNA)及び第一の追加免疫(cH5/3タンパク質)を受けたが、第二の追加免疫をH3タンパク質と置き換えた(cH4/3DNA-cH5/3-H3;先端が上向きの灰色の三角、n＝10匹の動物)。陽性対照動物は、不活化レアH7ウイルスワクチンを受けた(灰色の丸、n＝5)。初回免疫のみの動物(先端が上向きの灰色の三角、n＝5匹の動物)は、DNA初回免疫、次いで、2回の無関係なタンパク質の追加免疫を受けた。未感作動物(黒い四角、n＝5匹の動物)をさらなる対照として使用した。(B)レアH7(H7N1)ウイルスの感染時の体重減少曲線。(C)カプラン-マイヤー生存曲線。ワクチンは、死亡に対する良好な防御をもたらした(P＝0.0088、対照cH4/3DNA-BSA-BSAと比べたcH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)。(D、E)レアH7ウイルス(D)又は最近の上海13 H7N9(E)ウイルスによって発現されるHAタンパク質に対するワクチン接種動物(先端が下向きの灰色の三角、cH4/3DNA-cH5/3-cH7/3)、対照動物(先端が上向きの灰色の三角、cH4/3DNA-BSA-BSA)、又は未感作マウス(黒い四角)由来の血清のELISA反応性。(F)ワクチン(BcH7/3-cH5/3-cH4/3)及び対照(Bwt-BSA-BSA)を受容したマウスを、1×105PFUのH10N7ウイルスに感染させ、感染後3日目にワクチン接種マウスの肺におけるウイルスTCID50の20倍の減少を測定した。(G)ワクチン接種マウスcH4/3DNA-cH5/3-H3から回収された血清は、一連のグループ2 HAタンパク質を認識する。MDCK細胞に、それぞれのHAをコードするプラスミドをトランスフェクトし、16時間後、0.5％パラホルムアルデヒドで固定した。反応性を、ワクチンを受けたマウス由来の血清を用いる免疫蛍光によって検出した。未感作動物から回収された血清を陰性対照として使用した。マウスモノクローナル抗ストーク抗体(FBE9[未発表、自社で作製したもの])及びヒトモノクローナル抗ストーク抗体(FI6)(Cortiらの文献、2011, Science 333:850-856.)を陽性対照として使用した。
キメラHAワクチン接種により誘発されるポリクローナル応答がストークドメインに対するものであり、インビトロとインビボの両方でウイルス感染を中和することを示す。(A)グループ1 HAタンパク質(H1)に対するELISAは、cHAワクチン(先端が下向きの濃灰色の三角、B/cH7/3-cH5/3-cH4/3)により誘発される交差反応応答がHAタンパク質中の受容体結合部位の保存された部分に対するものではないことを示す。(B)cHA構築物をワクチン接種された動物(先端が下向きの濃灰色の三角、B/cH7/3-cH5/3タンパク質-cH4/3タンパク質)、初回免疫のみの動物(薄先端が上向きの灰色の三角、B/cH7/3-無関係なタンパク質-無関係なタンパク質)、ベクター対照(先端が下向きの薄灰色の三角、Bwt-無関係なタンパク質-無関係なタンパク質)、及び未感作動物(黒い四角)由来の鼻洗浄液のELISA反応性。(C)ワクチン接種動物(B/cH7/3ウイルス-cH5/3タンパク質-cH4/3タンパク質)、未感作動物、初回免疫のみの動物(B/cH7/3ウイルス-BSA-BSA)、及びベクター対照動物(Bwtウイルス-BSA-BSA)由来の血清中の抗体アイソタイプ。(D)cHAワクチン接種動物(先端が下向きの濃灰色の三角、B/cH7/3-cH5/3-cH4/3)、ベクター対照(先端が下向きの薄灰色の三角、Bwt-無関係なタンパク質-無関係なタンパク質)、及び未感作動物(黒い四角)由来の血清を用いるVic11(H3)シュードタイプ粒子中和アッセイ。血清希釈の逆数(reciprocal serum dilution)がx軸に示されている。H3ストーク反応性モノクローナル抗体(12D1)を、123μg/mlの開始濃度で、陽性対照(灰色の丸)として使用した。(E)ワクチン接種を受けた動物(先端が下向きの濃灰色の三角、BcH7/3-cH5/3-cH4/3、n＝5匹の動物)、ベクター対照(先端が下向きの薄灰色の三角、Bwt-BSA-BSA、n＝5匹の動物)、未感作動物(黒い四角、n＝5匹の動物)、及び陽性対照動物(不活化Phil82ウイルスワクチンを受けたもの、n＝5匹の動物)由来の血清を用いる受動伝達感染実験(Phil82 H3N2ウイルス)。カプラン-マイヤー生存曲線が示されている(Bwt-BSA-BSA群と比べたBcH7/3-cH5/3-cH4/3について、P＜0.026)。
ワクチンにより誘発される応答の幅を示すグループ2インフルエンザウイルス血球凝集素の選択されたメンバーの系統発生を示す。タンパク質配列をGenBankからダウンロードし、Megaバージョン5.1のClustalWアルゴリズムを用いて多重アラインメントを実施した。FigTreeソフトウェア及び近隣結合法を用いて系統樹を構築した。スケールバーは、5％のアミノ酸変化を表す。それぞれの株に対する前向きに試験されたcHA-ワクチン接種マウスの交差防御/交差反応性は、株名の後ろの括弧内に示されている(免疫蛍光[IF]、感染、ELISA、及び肺力価)。表示のない株名は試験されなかった。
H3ストークに基づくcHAのワクチン接種によって、マウスがH7N9ウイルスの感染から防御されることを明らかにしている。(A)ワクチン接種レジメンの模式的表示。構造は、タンパク質データベースの構造# 1RU7に基づくものである。(B〜G)のマウスは、cH4/3タンパク質(H4ヘッドをH3ストークと組み合わせたもの)をコードするDNA初回免疫を受け、その後、cH5/3(H5ヘッドがH3ストークの上にある)及び全長H3タンパク質で追加免疫された。最後の免疫から4週間後、これらの動物をH7N9ウイルスに感染させた。体重減少曲線を(B〜D)に示し、生存曲線を(E〜G)に示す。(C及びD)における破線は、(B)に示される「PIC i.n.＋i.m.」群の最大平均体重減少(7日目)を示す。(B)及びEに示されるマウス(PIC i.n.＋i.m.)を、アジュバントとしてのポリI:Cの存在下、鼻腔内及び筋肉内に、cH4/3タンパク質及びcH5/3タンパク質で順次追加免疫した。(C)及び(F)の動物は、同じタンパク質を追加免疫として受けたが、筋肉内にのみ免疫を受けた(PIC i.m.)。(D)及び(G)のマウスは、水中油型アジュバントとともに筋肉内にのみ免疫された(OIW i.m.)。対照群の動物は、それぞれのアジュバントとともに及びそれぞれの経路により、BSAを受容した。陽性対照動物(同じ群を3つ全ての実験条件と比較した)には、不活化されたマッチする感染ウイルスを筋肉内にワクチン接種した。
水中油型(OIW)アジュバントの調製及び特徴を示す。(A) OIWアジュバント調製のスキーム。OIWエマルジョンを20〜40mLスケールで調製する。Span-85をスクアレンに溶解させ、ポリソルベート80を脱イオン水に溶解させ、その後、クエン酸塩-クエン酸バッファーと混合する。油相画分及び水相画分を合わせ、ボルテックス処理により混合して粗エマルジョンにし、その後、これを、12,000psiでLV1マイクロフルイダイザー(Microfluidics, Westwood, MA)に通す。溶出液を回収し、合計5回、マイクロフルイダイザーに再通過させて、安定かつ均質なエマルジョンを得る。最後に通過したものを0.22μmフィルターに通して濾過し、滅菌ガラスバイアルに充填する。(B)微量液操作によって調製されたOIWアジュバントの粒径をMalvern Nano 3ZSでの動的光散乱により決定した。示されたサイズは、2つの独立に調製されたバッチのZ平均の平均値である。最後のマイクロフルイダイザーの通過及び滅菌濾過の後の多分散性が8〜11％の範囲であったので、これらの調製物は単峰性であると考えられる。
H3ストークに基づくcHAのワクチン接種によって、マウスにおいてH7血球凝集素に対する高い抗体力価が誘導されることを示す。(A) H7(A/上海/1/13) HAに対するcHAワクチン接種マウスのIgG終点力価。対応のないt検定を用いて片側p値を計算した。(B)異なる経路により及び異なるアジュバントを用いてワクチン接種されたマウス由来の血清中のH7 HAに対する免疫グロブリンアイソタイプ分布。解析は、1:200希釈で実施した。
(5.詳細な説明)
一態様において、本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルスの保存されたHA
ステムドメインに対する交差防御免疫応答を誘導するキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチドである。本明細書に提供されるキメラインフルエンザHAポリペプチドは、
安定なHAステムドメイン及び該ステムドメインと異種である球状HAヘッドドメインを含む
(すなわち、該ヘッドドメイン及びステムドメインは、インフルエンザウイルスの異なる
株及び/又は亜型に由来する)。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を含む組成物(例えば、本明細書に記載の
可溶性キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドを含むウイルス、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするように改変されたゲノムを含むウイルス、本明細書
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む発現ベクター、本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするように改変されたゲノ
ムを含む発現ベクター、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
をコードする核酸などを含む組成物)である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を含むワクチン製剤である。具体的な実
施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのうちの1つを含む一価ワクチンである。別の具体的な実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドのうちの2つ(すなわち、2つの異なるキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチド)を含む二価ワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの3
つ(すなわち、3つの異なるキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む三価ワ
クチンである。本明細書に提供されるワクチン製剤は、例えば、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を含むサブユニットワクチ
ン(例えば、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、例えば、可溶性キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む組成物);本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現する生インフルエンザウイルス(例
えば、弱毒化された生インフルエンザウイルス);本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数をコードするゲノムを含む生インフルエン
ザウイルス(例えば、弱毒化された生インフルエンザウイルス);本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現する死滅インフルエ
ンザウイルス;本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1
つ又は複数をコードするゲノムを含む死滅インフルエンザウイルス;本明細書に記載のキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を含有するウイルス/ウ
イルス様粒子(「VLP」);スプリットウイルスワクチン(ここで、該ウイルスは、本明細書
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つもしくは複数を発現
し、及び/又は本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1
つもしくは複数をコードするゲノムを含む);本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現するウイルス発現ベクター(例えば、非イ
ンフルエンザウイルス発現ベクター);並びに本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのうちの1つ又は複数を発現する細菌発現ベクターを含むことができ
る。
本明細書に記載のワクチン製剤は、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA
ステムドメインに対する極めて強力でかつ広域中和性の抗体を誘発することができる。そ
のような「普遍的な」ワクチンを用いて、インフルエンザウイルス亜型にわたる交差防御
免疫応答を誘導及び/又は増強することができる。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、対象をインフルエンザウイルス疾患又
は感染に対して免疫する方法であって、該対象に、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載のワクチン
製剤を含む組成物を投与することを含む、方法である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのうちの1つもしくは複数又は本明細書に記載のワクチン
製剤を含むキットである。本明細書に提供されるキットは、1以上のさらなる構成要素、
例えば、該キット中に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのう
ちの1つ又は複数に特異的に結合する抗体をさらに含むことができる。
(5.1 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
本明細書に提供されるのは、インフルエンザウイルス血球凝集素球状ヘッドドメインポ
リペプチド及びインフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドを含むか
又はこれらからなるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドであり、ここ
で、該インフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドは、該インフルエ
ンザウイルス血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である(例えば、該インフル
エンザウイルス血球凝集素球状ヘッドドメインポリペプチド及び該インフルエンザウイル
ス血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、異なるインフルエンザウイルス血球凝集素
亜型に由来する)。キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
イン及び球状ヘッドドメインは、A型インフルエンザウイルス血球凝集素ステムドメイン
及び球状ヘッドドメイン(例えば、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12
、H13、H14、15、H16、H17、及びH18)並びに/又はB型インフルエンザウイルス血球凝集素
ステムドメイン及び球状ヘッドドメインに基づくことができる。
全長インフルエンザ血球凝集素は、通常、HA1ドメイン及びHA2ドメインを含む。ステム
ドメインは、HA1ドメインの2つのセグメント及びHA2ドメインの大部分又は全てによって
形成される。該HA1ドメインの2つのセグメントは、一次配列中で、球状ヘッドドメイン(
例えば、図1でAp及びAqとして表記されている残基間のアミノ酸残基参照)によって隔てら
れている。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドは、そのような構造を維持している。すなわち、ある実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、HA1ド
メイン及びHA2ドメインから構成される安定なステム構造、並びに(一次配列中で)HA1ドメ
インの2つのセグメントを隔てる球状ヘッドドメインを含み、ここで、該球状ヘッドドメ
インは、HA1ドメイン及びHA2ドメインの他のセグメントによって形成されるステムドメイ
ンと異種である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H1亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリ
フォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な
実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイ
ンは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/20
09様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘ
ッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムド
メイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)で
あり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/
インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様におい
て、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフ
ォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエ
ンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別
の具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォ
ルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/200
5(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/1キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1
N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのス
テムドメイン)であり、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別
の具体的な実施態様において、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、A/カリフォルニア/4/2009(H1N1) HAのステムドメイン(又はA/カリフォ
ルニア/4/2009様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であり、cH5/1キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴ
ル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインである。別の具
体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H
5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HA
のステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘ
ッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体
的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球
状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステム
ドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメ
インは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な
実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイ
ンは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/20
05(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2
) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイ
ンである。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステム
ドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N
8) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の
具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメイ
ンであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは
、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様に
おいて、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼ
ニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメインであり、cH5/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5)
HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセ
ッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッド
ドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N
8) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインで
ある。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのス
テムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである
。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインである。別の
具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004
(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2)
HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具
体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの
球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのス
テムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体
的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/
1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011
(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドド
メインである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるcH5/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドドメインを含まない。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは
、A/パース/16/2009(H3) HAのステムドメインを含まない。
別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインである。別の具体的
な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球
状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメ
インであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様
において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/
パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインで
ある。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青
海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/3
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H
3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン
である。別の具体的な実施態様において、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH5/3
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョ
ウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H7亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインである。別の具
体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/0
3(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2
) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的
な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球
状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステム
ドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメ
インは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体
的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2
001(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3
N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の
具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/ビクトリア/361/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラ
ント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステム
ドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N
8) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別
の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメ
インであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
は、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様におい
て、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガ
タアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメインであり、cH7/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HA
の球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッ
ツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッ
ドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H
3N8) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインであ
る。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステ
ムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドド
メインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施
態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8) HAのステムドメインであり、cH7
/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネ
ーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインである。別の
具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219
/03(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H
3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
球状ヘッドドメインは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体
的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの
球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのス
テムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の
具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステ
ムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/
24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/インディアナ/10/20
11(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、A/インディアナ/10/2011(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデ
ルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインである。別の具体的
な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの
球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムド
メインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様にお
いて、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パー
ス/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメインであ
る。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリス
コ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7
/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009
(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインで
ある。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HAのステムドメインであり、cH7/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/
93(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/2009(H3N2) HA
のステムドメインであり、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘ
ッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである
。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるcH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインを含ま
ない。別の具体的な実施態様において、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドは、A/パース/16/2009(H3) HAのステムドメインを含まない。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)H5亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本明
細書では「cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある)
。具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインである。別の具体的な実
施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘ
ッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイン
であり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A
/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様にお
いて、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレ
ーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである
。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A
/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004
HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインであ
る。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/
モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインである。別の具体的な実施
態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘッドド
メインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH5/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドネシ
ア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006
HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状
ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実
施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり
、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/シチ
メンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様
において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/
フロリダ/4/2006のステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘ
ッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインである。別の具体的
な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの
球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムド
メインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイ
ンは、A/インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態
様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B
/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメイン
である。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH5/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/
青海/1A/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5
/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン
/1/2010 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの球状ヘッドドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメ
インである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、
cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハ
クチョウ/モンゴル/244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインである。別の具体的な
実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイ
ンは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ベトナム/1203/2004(H5) HAの球状ヘ
ッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインで
あり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/
インドネシア/5/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様におい
て、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリス
ベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/安徽/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別
の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/インドガン/青海/1A/2005(
H5) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH5/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのス
テムドメインであり、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。別
の具体的な実施態様において、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH5/Bキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/オオハクチョウ/モンゴル/
244/2005(H5) HAの球状ヘッドドメインである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)H7亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本明
細書では「cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある)
。具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインである。別の具体的な実
施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状
ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメイ
ンであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは
、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において
、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシ
ア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CP
A1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/20
04 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球
状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインである
。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H
7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのス
テムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインである。別の具体的な実施
態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状ヘッド
ドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH
7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/50
4/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのス
テムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態
様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B
/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッ
ドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、
cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/
アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様におい
て、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/フロリ
ダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメインである
。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/
12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインである。別の具体的
な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメ
インは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HA
の球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステム
ドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメ
インは、A/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様に
おいて、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウ
ィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメイン
である。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH7/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハ
リスコ/CPA1/2012(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において
、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコ
ンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドド
メインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり
、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/
NC/39482/93(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/
1/2010 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメイ
ンである。
別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインである。別の具体的な
実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイ
ンは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ネーデルラント/219/03(H7) HAの球状
ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイン
であり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A
/カナダ/504/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、c
H7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/6
0/2008 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
の球状ヘッドドメインは、A/カナダ/444/04(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具
体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(
H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのス
テムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッド
ドメインは、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7) HAの球状ヘッドドメインである。別の具
体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステム
ドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/レア/NC/39482/93(H7) HAの球
状ヘッドドメインである。別の具体的な実施態様において、cH7/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメイ
ンであり、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは
、A/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7) HAの球状ヘッドドメインである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)B型インフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン及び(i
i)異なるB型インフルエンザウイルス株由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む(本
明細書では「cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることもある
)。具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのス
テムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインである。別の具体的な実
施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメインであ
る。別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、B/マレーシア/2506/2004 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネーデル
ラント/1/99 HA(又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルス)の球状
ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインである。別の具体的な実施態
様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、B/
フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドの球状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメインである。別の具
体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムド
メインは、B/フロリダ/4/2006 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネーデルラント/1/99 HA(又
はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルス)の球状ヘッドドメインで
ある。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインである。別の具体的な
実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメイン
は、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメインで
ある。別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドのステムドメインは、B/ウィスコンシン/1/2010 HAのステムドメインであり、cB/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネーデ
ルラント/1/99 HA(又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルス)の球
状ヘッドドメインである。
別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインである。別の具体的な実
施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは
、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/リー/1940 HAの球状ヘッドドメインである
。別の具体的な実施態様において、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの
ステムドメインは、B/ブリスベン/60/2008 HAのステムドメインであり、cB/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B/アザラシ/ネーデルラン
ト/1/99 HA(又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99様インフルエンザウイルス)の球状ヘッ
ドドメインである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、(i)H3亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素のステムドメイン
及び(ii)H4亜型のインフルエンザウイルス由来の血球凝集素の球状ヘッドドメインを含む
(本明細書では「cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド」と呼ばれることも
ある)。具体的な実施態様において、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
のステムドメインは、A/パース/16/09 HAのステムドメイン(又はA/パース/16/09様インフ
ルエンザウイルスHAのステムドメイン)である。別の具体的な実施態様において、cH4/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのステムドメインは、A/パース/16/09 HAの
ステムドメイン(又はA/パース/16/09様インフルエンザウイルスHAのステムドメイン)であ
り、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、A/ア
ヒル/チェコ/56の球状ヘッドドメイン(又はA/アヒル/チェコ/56様インフルエンザウイル
スHAの球状ヘッドドメイン)である。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは単量体である。ある実施態様において、本明細書に提供されるキメライ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは多量体である。ある実施態様において、
本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは三量体で
ある。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。通常、シグナルペプチドは、ポリペプチド
発現及び翻訳の間又はその後に切断されて、成熟キメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドを生じる。ある実施態様において、同じく本明細書に提供されるのは、シ
グナルペプチドを欠く成熟キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである
。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドがシグナ
ルペプチドを含む実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に公知の任意のインフ
ルエンザウイルスシグナルペプチドに基づくことができる。ある実施態様において、シグ
ナルペプチドは、A型インフルエンザシグナルペプチドに基づく。ある実施態様において
、シグナルペプチドは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H1
4、H15、H16、H17、及びH18からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素のシ
グナルペプチドに基づく(例えば、A型インフルエンザウイルス血球凝集素H18の例につい
ては、Tongらの文献、2013. PLoS Path. 9(10): e1003657. Doi:10.1371/journal.ppat.1
003657を参照されたい)。ある実施態様において、シグナルペプチドは、当業者に有用で
あると考えられる任意のシグナルペプチドであることができる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、内腔ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドが内腔ドメインを含む実施態様において、内腔ドメインは
、当業者に公知の任意のインフルエンザ内腔ドメインに基づくことができる。ある実施態
様において、内腔ドメインは、A型インフルエンザ内腔ドメインに基づく。ある実施態様
において、内腔ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13
、H14、H15、H16、H17、及びH18からなる群から選択されるA型インフルエンザ血球凝集素
の内腔ドメインに基づく。ある実施態様において、内腔ドメインは、当業者に有用である
と考えられる任意の内腔ドメインであることができる。ある実施態様において、内腔ドメ
インは、ステムドメインと同じ血球凝集素由来のものである。ある実施態様において、内
腔ドメインは、ステムドメインHA2サブユニットのようなインフルエンザウイルス株又は
亜型由来のものである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドが膜貫通ドメインを含む実施態様において、膜貫通ドメ
インは、当業者に公知の任意のインフルエンザ膜貫通ドメインに基づくことができる。あ
る実施態様において、膜貫通ドメインは、A型インフルエンザ膜貫通ドメインに基づく。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10
、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、及びH18からなる群から選択されるA型インフル
エンザ血球凝集素の膜貫通ドメインに基づく。ある実施態様において、膜貫通ドメインは
、当業者に有用であると考えられる任意の膜貫通ドメインであることができる。ある実施
態様において、膜貫通ドメインは、ステムドメインと同じ血球凝集素由来のものである。
ある実施態様において、膜貫通ドメインは、ステムドメインHA2サブユニットのようなイ
ンフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、細胞質ドメインを含む。本明細書に提供されるキメラインフルエンザ
ウイルス血球凝集素ポリペプチドが細胞質ドメインを含む実施態様において、細胞質ドメ
インは、当業者に公知の任意のインフルエンザ細胞質ドメインに基づくことができる。あ
る実施態様において、細胞質ドメインは、A型インフルエンザ細胞質ドメインに基づく。
ある実施態様において、細胞質ドメインは、H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10
、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、及びH18からなる群から選択されるA型インフル
エンザ血球凝集素の細胞質ドメインに基づく。ある実施態様において、細胞質ドメインは
、当業者に有用であると考えられる任意の細胞質ドメインであることができる。ある実施
態様において、細胞質ドメインは、ステムドメインと同じ血球凝集素由来のものである。
ある実施態様において、細胞質ドメインは、ステムドメインHA2サブユニットのようなイ
ンフルエンザウイルス株又は亜型由来のものである。
ある実施態様において、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドは、1以上のポリペプチドドメインをさらに含む。有用なポリペプチドド
メインは、ポリペプチドの部分の精製、フォールディング、及び切断を容易にするドメイ
ンを含む。例えば、Hisタグ (His-His-His-His-His-His, 配列番号:17)、FLAGエピトープ
、又は他の精製タグは、本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドの精製を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、Hisタグ
は、配列(His)nを有し、ここで、nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、1
5、16、17、18、19、20、又はそれより大きい。バクテリオファージT4フィブリチン由来
のフォルドンドメイン、又は三量体化ドメインは、本明細書に提供されるポリペプチドの
三量体化を容易にすることができる。いくつかの実施態様において、三量体化ドメインは
、三量体又は四量体コイルドコイルの形成を可能にする野生型GCN4pII三量体化ヘプタッ
ド反復又は修飾されたGCN4pII三量体化ヘプタッド反復を含む。例えば、Weldonらの文献
、2010, PLoSONE 5(9): e12466を参照されたい。フォルドンドメインは、当業者に公知の
任意のフォルドン配列を有することができる(例えば、その内容が引用により完全に本明
細書中に組み込まれる、Papanikolopoulouらの文献、2004, J. Biol. Chem. 279(10):899
1-8998参照)。例としては、
Figure 2019141062
 が挙げられる。フォルドンドメインは、本明細書に提供される可溶性ポリペプチドの三量
体化を容易にするのに有用であることができる。切断部位を用いて、ポリペプチドの一部
の切断、例えば、精製タグもしくはフォルドンドメイン又は両方の切断を容易にすること
ができる。有用な切断部位としては、トロンビン切断部位、例えば、配列
Figure 2019141062
 を有するものが挙げられる。ある実施態様において、切断部位は、タバコエッチ病ウイル
ス(TEV)プロテアーゼによって認識される切断部位(例えば、アミノ酸配列Glu-Asn-Leu-Ty
r-Phe-Gln-(Gly/Ser)(配列番号20))である。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドは、可溶性ポリペプチドである。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのインフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドは、図1でAp及びAq
としてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で特定されているシステイン残基を維持
している、すなわち、図1でAp及びAqとしてインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド中で
特定されているシステイン残基は、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチド中で維持されている。したがって、ある実施態様において、本明細書
に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの一次配列中:(i)インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントは、図1でApとして特
定されているシステイン残基で終わり、(ii)インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポ
リペプチドのC末端セグメントは、図1でAqとして特定されているシステイン残基から始ま
り;及び(iii)インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(これは、インフル
エンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である)は、インフルエンザ血球凝
集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントとC末端セグメントの間にある。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys52)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Apに近い残基で終わる。例
えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6
、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1
〜Ap-3、Ap-3〜Ap-5、Ap-5〜Ap-8、Ap-8〜Ap-10の範囲で終わる。例えば、Ap-10で終わる
HA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝集素のLys42で終わる。ある実施態様において
、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端
ステムセグメントは、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、Ap+10
で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1〜Ap+5、Ap+5〜Ap+10の範囲
で終わる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるキメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエンザ血球凝集素と類似した三次元構造を
形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及びインフルエンザ血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドの終点との関連で選択されるべきである。そのような実施
態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(これは、インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である)は、一次配列中、インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントとC末端セグメントの
間に位置する。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys277)から正確に始まるのではなく、配列上及び構造上Aqに近い残基から始ま
る。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5
、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10周辺から始まる。ある実施態様において、本明細書に
記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメ
ントは、Aq-1〜Aq-5、Aq-5〜Aq-10の範囲から始まる。例えば、Aq-10で終わるHA1のC末端
ステムセグメントは、H3血球凝集素のイソロイシン262から始まる。ある実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末
端ステムセグメントは、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+1
0から始まる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq+1〜Aq+3、Aq+3〜Aq+5、Aq
+5〜Aq+8、Aq+8〜Aq+10の範囲から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得ら
れるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエンザ血
球凝集素と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメ
ント及びインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドの始点との関連で選択さ
れるべきである。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチド(これは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種
である)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端
セグメントとC末端セグメントの間に位置する。
一例において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチ
ドのHA1のN末端ステムセグメントは、血球凝集素アミノ酸位置45〜48(H3付番を使用)のう
ちのいずれか1つで終わることができ、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、血球凝集素アミノ酸位置282〜287(H3付番を
使用)うちのいずれか1つから始まることができ;及び異種ヘッドドメインは、アミノ酸位
置46〜49のうちのいずれか1つから始まり、かつアミノ酸位置284〜289(H3付番を使用)の
うちのいずれか1つで終わることができる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのステムドメインがB型インフルエンザウイルスに由来する場合、HA1のN末端
ステムセグメントは、例えば、HAのアミノ酸35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、又は50(一次アミノ酸配列中)で終わることができ、HA1のC末端ステ
ムセグメントは、例えば、HAのアミノ酸280、281、282、283、284、285、286、287、288
、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、又は300(一次アミノ酸配
列中)から始まることができる。したがって、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、B型インフルエンザウイルスステムドメインのHA1
のN末端ステムセグメントとHA1のC末端ステムセグメントの間に挿入される。例えば、イ
ンフルエンザウイルスB/香港/8/73(PDB:2RFT: GenBank:M10298.1)のHAにおいて、HA1のN
末端ステムセグメントは、「D」を位置1として、アミノ酸DRICT(配列番号22)から始まり
、かつアミノ酸位置42(一次配列中)で終わり;及びHA1のC末端ステムセグメントは、アミ
ノ酸位置288(一次配列中)から始まり、かつHAのC末端の最後まで続く。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドは、熱ショックタンパク質(例えば、Hsp10、Hsp20、Hsp30、Hsp40、Hsp60、Hsp70
、Hsp90、もしくはHsp100)とともに、又はそれなしで、異種タンパク質、例えば、主要組
織適合性複合体(MHC)にコンジュゲートさせることができる。ある実施態様において、本
明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、免疫調節分子、例
えば、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを免疫細胞にターゲッティング
するタンパク質、例えば、B細胞にターゲッティングするタンパク質(例えば、C3d)又はT
細胞にターゲッティングするタンパク質にコンジュゲートさせることができる。ある実施
態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、
自然免疫系を刺激するタンパク質、例えば、インターフェロン1型、アルファ、ベータ、
又はガンマインターフェロン、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロ
ニー刺激因子(GM-CSF)、インターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-1
2、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、C
D40リガンド(CD40L)、及び薬物誘導性CD40(iCD40)にコンジュゲートさせることができる
。
本明細書に提供されるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは、本明
細書に記載の技術を含む、当業者により知られる及び当業者に好適と考えられる任意の技
術に従って調製することができることが当業者によって理解されるであろう。ある実施態
様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは単離される。
(5.2 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
)をコードする核酸である。遺伝暗号の縮重のために、本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする任意の核酸が本明細書に包含される。あ
る実施態様において、HA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、HA2
ドメイン、内腔ドメイン、膜貫通ドメイン、及び/もしくは細胞質ドメインをコードする
天然のインフルエンザウイルス核酸に対応するか、又は該核酸とハイブリダイズすること
ができる核酸を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドを産生する。
また、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチド)をコードする核酸にハイブリダイズすることができる核酸である。ある実施態様
において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチドをコードする核酸の断片にハイブリダイズすることができる核酸であ
る。他の実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする全長核酸にハイブリダイズすることが
できる核酸である。核酸のハイブリダイゼーション条件の一般的なパラメータは、Sambro
okらの文献、分子クローニング-実験マニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Man
ual)(第2版)、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Yo
rk(1989)、及びAusubelらの文献、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in M
olecular Biology)、第2巻、Current Protocols Publishing, New York(1994)に記載され
ている。ハイブリダイゼーションは、高いストリンジェンシー条件、中間のストリンジェ
ンシー条件、又は低いストリンジェンシー条件の下で実施することができる。当業者は、
低いストリンジェンシー条件、中間のストリンジェンシー条件、及び高いストリンジェン
シー条件は、その全てが相互作用する複数の因子に左右され、また、当該核酸によっても
決まることを理解するであろう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、核酸(複数可)
の融点の5℃以内の温度、低い塩濃度(例えば、250mM未満)、及び高い共溶媒濃度(例えば
、1〜20％の共溶媒、例えば、DMSO)を含むことができる。他方、低いストリンジェンシー
条件は、核酸(複数可)の融点より10℃を超えて低い温度、高い塩濃度(例えば、1000mM超)
、及び共溶媒の欠如を含むことができる。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドをコードする核酸は、単離される。ある実施態様において、「単離された」
核酸は、核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子を指す。
つまり、単離された核酸は、天然ではそれと関連していない異種核酸を含むことができる
。他の実施態様において、「単離された」核酸、例えば、cDNA分子は、組換え技術によっ
て産生されたとき、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないものであるか、又
は化学合成されたとき、化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないもので
あることができる。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、それが単離される
か又は組換え産生される細胞の細胞成分から核酸が分離されている核酸調製物が含まれる
。したがって、細胞物質を実質的に含まない核酸には、(乾燥重量で)約30％、20％、10％
、又は5％未満の他の核酸を有する核酸調製物が含まれる。「培養培地を実質的に含まな
い」という用語には、培養培地が調製物の容量の約50％、20％、10％、又は5％未満であ
る核酸調製物が含まれる。「化学物質前駆体又は他の化学物質を実質的に含まない」とい
う用語には、核酸の合成に関与する化学物質前駆体又は他の化学物質から核酸が分離され
ている調製物が含まれる。具体的な実施態様において、そのような核酸調製物は、(乾燥
重量で)約50％、30％、20％、10％、5％未満の化学物質前駆体又は関心対象の核酸以外の
化合物を有する。
さらに、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチドの個々の成分をコードする核酸であり、例えば、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメイン、HA1のN末端ステ
ムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、及び/又はHA2ドメインが本明細書に提供さ
れる。本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの成分をコー
ドする核酸は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを生
じるように、当業者に公知の標準的な分子生物学の技術を用いてアセンブルすることがで
きる。
(5.3 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
)をコードする核酸を含む、発現ベクターを含む、ベクターである。具体的な実施態様に
おいて、該ベクターは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドをコードする核酸の発現を導くことができる発現ベクターである。発現ベクターの非
限定的な例としては、プラスミド及びウイルスベクター、例えば、複製欠損レトロウイル
ス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びバキュロウイルスが挙げられるが、これ
ら限定されない。発現ベクターとしては、限定されないが、トランスジェニック動物及び
非哺乳動物細胞/生物、例えば、哺乳動物のN結合型グリコシル化を行うように改変されて
いる哺乳動物細胞/生物を挙げることもできる。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの成分をコードする発現ベクターである。その
ようなベクターを用いて、1以上の宿主細胞で該成分を発現させることができ、該成分を
、当業者に公知の技術を用いて、単離し、リンカーとコンジュゲートさせることができる
。
発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に好適な形態の本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む。具体的な実施態様に
おいて、発現ベクターは、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、発現される
核酸に機能的に連結された1以上の調節配列を含む。発現ベクターにおいて、「機能的に
連結された」とは、関心対象の核酸が、(例えば、インビトロ転写/翻訳系での、又はベク
ターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞での)核酸の発現を可能にする形で調節配列(
複数可)に連結されていることを意味するものとする。調節配列には、プロモーター、エ
ンハンサー、及び他の発現制御エレメント(例えば、ポリアデニル化シグナル)が含まれる
。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞で核酸の構成的発現を導くもの、特定の宿主細
胞でのみ核酸の発現を導くもの(例えば、組織特異的調節配列)、及び特定の薬剤による刺
激によって核酸の発現を導くもの(例えば、誘導可能な調節配列)が含まれる。発現ベクタ
ーの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、タンパク質の所望の発現レベルのような因
子によって決まり得ることが当業者には理解されるであろう。「宿主細胞」という用語は
、核酸で形質転換又はトランスフェクトされる特定の対象細胞、及びそのような細胞の子
孫又は可能性のある子孫を含むことが意図される。そのような細胞の子孫は、後続の世代
で起こり得る突然変異もしくは環境の影響又は宿主細胞ゲノムへの核酸の組込みのために
、核酸で形質転換又はトランスフェクトされる親細胞と同一でなくてもよい。
発現ベクターは、原核生物細胞(例えば、大腸菌(E. coli))又は真核生物細胞(例えば、
昆虫細胞(バキュロウイルス発現ベクターを使用、例えば、引用により完全に本明細書中
に組み込まれる、Treanorらの文献、2007, JAMA, 297(14):1577-1582参照)、酵母細胞、
植物細胞、藻類、もしくは哺乳動物細胞)を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現のために設計することができる。酵母宿主細胞の
例としては、分裂酵母(S. pombe)、出芽酵母(S. cerevisiae)、及びピキア・パストリス(
P. pastoris)、並びに下記の実施例が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳動物宿
主細胞の例としては、Crucell Per.C6細胞、Vero細胞、CHO細胞、VERY細胞、BHK細胞、He
La細胞、COS細胞、MDCK細胞、293細胞、3T3細胞、又はWI38細胞が挙げられるが、これら
に限定されない。ある実施態様において、宿主細胞は、骨髄腫細胞、例えば、NS0細胞、4
5.6 TG1.7細胞、AF-2クローン9B5細胞、AF-2クローン9B5細胞、J558L細胞、MOPC 315細胞
、MPC-11細胞、NCI-H929細胞、NP細胞、NS0/1細胞、P3 NS1 Ag4細胞、P3/NS1/1-Ag4-1細
胞、P3U1細胞、P3X63Ag8細胞、P3X63Ag8.653細胞、P3X63Ag8U.1細胞、RPMI 8226細胞、Sp
20-Ag14細胞、U266B1細胞、X63AG8.653細胞、Y3.Ag.1.2.3細胞、及びYO細胞である。昆虫
細胞の非限定的な例としては、Sf9、Sf21、Ao/Tn 38、High Five、キンウワバ(Trichoplu
sia ni)、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)、及びカイコガ(Bombyx mori)が挙げられる
。特定の実施態様において、哺乳動物細胞培養系(例えば、チャイニーズハムスター卵巣
又はベビーハムスター腎臓細胞)が、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
の発現に使用される。別の実施態様において、植物細胞培養系が、キメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に使用される。植物細胞培養系を利用するタンパク質
の産生のための植物細胞及び方法については、例えば、米国特許第7,504,560号;第6,770,
799号;第6,551,820号;第6,136,320号;第6,034,298号;第5,914,935号;第5,612,487号;及び
第5,484,719号、並びに米国特許出願公開第2009/0208477号、第2009/0082548号、第2009/
0053762号、第2008/0038232号、第2007/0275014号、及び第2006/0204487号を参照された
い。具体的な実施態様において、植物細胞培養系は、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に使用されない。
ある実施態様において、植物(例えば、タバコ属の植物)を、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を発現するように改変することができる。具体的な実施
態様において、植物を、当技術分野で公知の方法を用いるアグロインフィルトレーション
によって、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現す
るように改変する。例えば、関心対象の遺伝子、例えば、本明細書に記載のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする遺伝子をコードする核酸を、アグロバ
クテリウムの株に導入する。その後、この株を液体培地中で増殖させ、得られる細菌を洗
浄し、バッファー溶液に懸濁させる。その後、アグロバクテリウムが関心対象の遺伝子を
植物細胞の一部に形質転換するように、植物を、本明細書に記載のflキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含むアグロバクテリウムに(例えば、
注射又は浸漬によって)暴露させる。その後、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを該植物によって一過性に発現させ、当技術分野で公知かつ本明細書に記載の方
法を用いて単離することができる(具体的な例については、Shojiらの文献、2008, Vaccin
e, 26(23):2930-2934;及びD’Aoustらの文献、2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930
-940を参照されたい)。具体的な実施態様において、植物は、タバコ植物(例えば、タバコ
(Nicotiana tabacum))である。別の具体的な実施態様において、植物は、タバコ植物の近
縁種(例えば、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana))である。別の具体的な実施
態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを大
豆種で発現させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをトウモロコシ種で発現させる。別の具体的な実施態様
において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコメ種
で発現させる。
他の実施態様において、藻類(例えば、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii))
を改変して、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、例え
ば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるこ
とができる(例えば、Rasalaらの文献、2010, Plant Biotechnology Journal(2010年3月7
日にオンラインで発表)参照)。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドを発現させるために使用される植物は、N-グリコシル化系(例えば、細菌又は哺乳
動物のN-グリコシル化系)の構成要素を発現するように改変されている、すなわち、該植
物は、N-グリコシル化を行うことができる。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるため
に使用することができる植物細胞、及び植物細胞培養系を利用するタンパク質の産生方法
は、例えば、米国特許第5,929,304号;第7,504,560号;第6,770,799号;第6,551,820号;第6,
136,320号;第6,034,298号;第5,914,935号;第5,612,487号;及び第5,484,719号、米国特許
出願公開第2009/0208477号、第2009/0082548号、第2009/0053762号、第2008/0038232号、
第2007/0275014号、及び第2006/0204487号、並びにShojiらの文献、2008, Vaccine, 26(2
3):2930-2934、及びD’Aoustらの文献、2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940に
記載されている(これらは、引用により完全に本明細書中に組み込まれている)。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸
を含む宿主細胞は単離することができ、例えば、該細胞は、対象の体外にあるか、又はト
ランスフェクト/形質転換されていない宿主細胞から単離される(すなわち、分離される)
。ある実施態様において、該細胞は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチドをコードする核酸を発現するように改変される。
発現ベクターは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって宿主細胞に導
入することができる。そのような技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共
沈、DEAE-デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション、及びエレクト
ロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞を形質転換又はトラン
スフェクトするための好適な方法は、Sambrookらの文献、1989、分子クローニング-実験
マニュアル(Molecular Cloning - A Laboratory Manual)、第2版、Cold Spring Harbor P
ress, New York、及び他の実験マニュアルに見出すことができる。ある実施態様において
、宿主細胞は、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含
む発現ベクターで一過性にトランスフェクトされる。他の実施態様において、宿主細胞は
、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクタ
ーで安定にトランスフェクトされる。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクター及びト
ランスフェクション技術によっては、細胞のごく一部だけが外来性DNAをそのゲノムに組
み込むことができることが知られている。これらの組込み体を同定及び選択するために、
(例えば、抗生物質耐性用の)選択マーカーをコードする核酸が、通常、関心対象の核酸と
一緒に宿主細胞に導入される。選択マーカーの例としては、薬剤、例えば、G418、ハイグ
ロマイシン、及びメトトレキセートに対する耐性を付与するものが挙げられる。導入され
た核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定することができる
(例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する)。
宿主細胞を用いる本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
の組換え発現の代替法として、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコー
ドする核酸を含む発現ベクターを、例えば、T7プロモーター調節配列及びT7ポリメラーゼ
を用いて、インビトロで転写及び翻訳することができる。具体的な実施態様において、共
役転写/翻訳系、例えば、Promega TNT(登録商標)、又は転写及び翻訳に必要な成分を含む
細胞溶解物もしくは細胞抽出物を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドを産生することができる。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが産生されると、
それは、タンパク質の単離又は精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、ク
ロマトグラフィーによるもの(例えば、イオン交換、親和性、特に、特定の抗原、もしく
は該抗原と関連する「タグ」(例えば、HISタグ、strepタグ/strep IIタグ、マルトース結
合タンパク質、グルタチオンS-トランスフェラーゼタグ、mycタグ、HAタグ)に対する親和
性によるもの、プロテインAによるもの、及びクロマトグラフィー(例えば、サイジングカ
ラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、逆相クロマトグラ
フィー、疑似移動床クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、モノリスクロ
マトグラフィー、対流相互作用媒質クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー))
、遠心分離、示差溶解性、限外濾過、沈殿、又はタンパク質の単離もしくは精製のための
任意の他の標準的な技術によって単離又は精製することができる。具体的な実施態様にお
いて、本明細書に記載の単離/精製されたキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドは可溶性であり、例えば、当業者に公知の任意の方法、例えば、本明細書に記載の方
法を用いて可溶性にされる(例えば、第6.6.1.2節参照)。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを産生する方法である。一実施態様において、本方法は、ポリペプチドが産生
されるように、ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を好適な培地中で培養する
ことを含む。いくつかの実施態様において、本方法は、ポリペプチドを培地又は宿主細胞
から単離することをさらに含む。
(5.4 インフルエンザウイルスベクター)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチド)を含むインフルエンザウイルスである。具体的な実施態様において、
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、インフルエンザ
ウイルスのビリオンに組み込まれる。インフルエンザウイルスは、該ウイルスを免疫細胞
などの特定の細胞型にターゲッティングする部分にコンジュゲートさせることができる。
いくつかの実施態様において、インフルエンザウイルスのビリオンは、本明細書に記載の
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに加えて、異種ポリペプチドをそれら
に組み込んでいるか、又は異種ポリペプチドを発現する。異種ポリペプチドは、免疫増強
活性を有するか又はインフルエンザウイルスを特定の細胞型にターゲッティングするポリ
ペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原に結合する抗体又は特定の細胞型の表面の
特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むインフルエ
ンザウイルスは、当業者に公知の技術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフ
リープラスミドレスキューを用いて、ビリオンの産生の間にキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドをトランスに供給することによって産生することができる。或いは
、血球凝集素機能がトランスに提供されているウイルスに感染しやすい細胞で本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲ
ノムを含む親インフルエンザウイルスの複製は、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを含む子孫インフルエンザウイルスを産生する。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチド)を発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウイルス
である。具体的な実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲノムは、子孫インフ
ルエンザウイルスによって発現される本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチドをコードするように改変される。別の具体的な実施態様において、親イ
ンフルエンザウイルスのゲノムは、発現されて、子孫インフルエンザウイルスのビリオン
に組み込まれる本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコ
ードするように改変される。したがって、親インフルエンザウイルスの複製によって生じ
る子孫インフルエンザウイルスは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチドを含む。親インフルエンザウイルスのビリオンは、同じ又は異なる型、亜
型、又は株のインフルエンザウイルスに由来するステムドメイン又はヘッドドメインを含
むキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをそれらに組み込んでいてもよい。
或いは、親インフルエンザウイルスのビリオンは、インフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドの活性(例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素の受容体結合及び/又は融
合活性)のうちの1つ又は複数を機能的に代替することができる部分をそれらに組み込んで
いてもよい。ある実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの
活性のうちの1つ又は複数は、(i)インフルエンザウイルスと異種のポリペプチドの細胞外
ドメインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの膜貫通ドメイン、又は
膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タンパク質によって提供さ
れる。具体的な実施態様において、親インフルエンザウイルスのビリオンは、(i)インフ
ルエンザウイルス以外の感染性病原体の受容体結合性/融合原性ポリペプチドの細胞外ド
メインが(ii)インフルエンザウイルス血球凝集素の膜貫通ドメイン、又は膜貫通ドメイン
及び細胞質ドメインに融合したものを含む融合タンパク質をそれらに組み込んでいてもよ
い。インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの1以上の活性を提供する融合タン
パク質、及びそのような融合タンパク質を発現するように改変されたインフルエンザウイ
ルスの産生方法の説明については、例えば、2007年6月7日に公開された国際特許出願公開
WO 2007/064802号、及び米国特許出願公開第2012/0122185号を参照されたく;これらは各
々、引用により完全に本明細書中に組み込まれている。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドのうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザウイルスは、キメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインが由来する源と同じ
源(例えば、インフルエンザウイルス株又は亜型)に由来するものである、ノイラミニダー
ゼ(NA)、又はその断片を含む。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフル
エンザウイルスは、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの球状ヘッドドメイン
が由来する源と同じ源(例えば、インフルエンザウイルス株又は亜型)に由来するものであ
る、ノイラミニダーゼ(NA)、又はその断片を含み、ここで、該球状ヘッドドメインは、該
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHA1及び/又はHA2サブユニットのステム
ドメインと異種である。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドのうちの1つ又複数を発現するように改変されたインフルエンザ
ウイルスは、キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドのHAステムドメインが由来す
る源と同じ源(例えば、インフルエンザウイルス株又は亜型)に由来するものである、ノイ
ラミニダーゼ(NA)、又はその断片を含む。
いくつかの実施態様において、親インフルエンザウイルスのビリオンは、異種ポリペプ
チドをそれらに組み込んでいる。ある実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲ
ノムは、子孫インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチド及びキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするように改変される。具体的な実施
態様において、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、異種ポリペプチド、
又は両方は、子孫インフルエンザウイルスのビリオンに組み込まれる。
異種ポリペプチドは、インフルエンザウイルスを特定の細胞型にターゲッティングする
ポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原を認識する抗体、又は特定の細胞型の
表面の特異的受容体に結合するリガンドであってもよい。いくつかの実施態様において、
ターゲッティングポリペプチドは、ウイルスの標的細胞認識機能を代替する。具体的な実
施態様において、異種ポリペプチドは、インフルエンザウイルスを、インフルエンザウイ
ルスが天然で感染するのと同じ細胞型にターゲッティングする。他の具体的な実施態様に
おいて、異種ポリペプチドは、子孫インフルエンザウイルスを、免疫細胞、例えば、B細
胞、T細胞、マクロファージ、又は樹状細胞にターゲッティングする。いくつかの実施態
様において、異種ポリペプチドは、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の細胞特異的マーカ
ー(例えば、CD44など)を認識して、それに結合する。一実施態様において、異種ポリペプ
チドは、ウイルスを樹状細胞にターゲッティングするDC-SIGNである。別の実施態様にお
いて、異種ポリペプチドは、ウイルスを免疫細胞にターゲッティングする抗体(例えば、
単鎖抗体)であり、この抗体は、それがインフルエンザウイルスビリオンに組み込まれる
ように、別のポリペプチド由来の膜貫通ドメインと融合されていてもよい。いくつかの実
施態様において、抗体は、CD20抗体、CD34抗体、又はDEC-205に対する抗体である。ター
ゲッティング機能のあるポリペプチドを発現するようにウイルスを改変する技術は当技術
分野で公知である。例えば、その各々の内容が引用により完全に本明細書中に組み込まれ
る、Yangらの文献、2006, PNAS103:11479-11484及び2008年1月24日に公開された米国特許
出願公開第20080019998号及び2007年1月25日に公開された第20070020238号を参照された
い。
別の実施態様において、異種ポリペプチドは、ウイルス付着タンパク質である。その付
着タンパク質(複数可)をこの態様で使用することができるウイルスの非限定的な例は、以
下の群:ラッサ熱ウイルス、B型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイル
ス(NDV)、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、
ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、アルファウイルス、例えば、
セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、及びアウラウイルス(E1、E2、及びE3など
の表面糖タンパク質を含む)、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス、フォーミーウイ
ルス、並びにSARS-CoVウイルスから選択されるウイルスである。
一実施態様において、フラビウイルス表面糖タンパク質、例えば、デングウイルス(DV)
Eタンパク質を使用することができる。いくつかの実施態様において、アルファウイルス
ファミリー由来のシンドビスウイルス糖タンパク質が使用される(K. S. Wang, R. J. Kuh
n, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Straussの文献、J. Virol. 66, 4992(1992))。ある実
施態様において、異種ポリペプチドは、NDV HNもしくはFタンパク質;ヒト免疫不全ウイル
ス(HIV)gp160(又はその産物、例えば、gp41もしくはgp120); B型肝炎ウイルス表面抗原(H
BsAg);ヘルペスウイルスの糖タンパク質(例えば、gD、gE);或いはポリオウイルスのVP1に
由来する。
別の実施態様において、異種ポリペプチドは、当技術分野で公知の任意の非ウイルスタ
ーゲッティング系に由来する。ある実施態様において、非ウイルス病原体、例えば、細胞
内細菌又は原虫のタンパク質が使用される。いくつかの実施態様において、細菌ポリペプ
チドは、例えば、クラミジア(Chlamydia)、リケッチア(Rikettsia)、コクセリア(Coxelia
)、リステリア(Listeria)、ブルセラ(Brucella)、又はレジオネラ(Legionella)によって
提供される。いくつかの実施態様において、原虫のポリペプチドは、例えば、マラリア原
虫(Plasmodia)種、リューシマニア属(Leishmania)種、トキソプラズマ原虫(Toxoplasma g
ondii)、又はクルーズトリパノソーマ(Trypanosoma cruzi)によって提供される。他の例
示的なターゲッティング系は、完全に本明細書中に組み込まれる、Waehlerらの文献、200
7、「遺伝子治療のための標的ウイルスベクターの改変(Engineering targeted viral vec
tors for gene therapy)」、Nature Reviews Genetics 8:573-587に記載されている。
ある実施態様において、インフルエンザウイルスによって発現される異種ポリペプチド
は、免疫増強(免疫賦活)活性を有する。免疫増強ポリペプチドの非限定的な例としては、
刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、抗体、及び他の作用物質、例えば、Flt-3リガン
ドが挙げられるが、これらに限定されない。免疫増強活性のあるポリペプチドの具体的な
例としては:インターフェロン1型、アルファ、ベータ、もしくはガンマインターフェロン
、コロニー刺激因子、例えば、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、イン
ターロイキン(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL
-23、腫瘍壊死因子(TNF)-β、TNFα、B7.1、B7.2、4-1BB、CD40リガンド(CD40L)及び薬物
誘導性CD40(iCD40)が挙げられる(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、
Hanks, B. A.らの文献、2005. Nat Med 11:130-137参照)。
A型及びB型インフルエンザウイルスのゲノムは8本(8)の一本鎖のマイナスセンスセグメ
ントからなる(C型インフルエンザウイルスは7本(7)の一本鎖のマイナスセンスセグメント
からなる)ので、親インフルエンザウイルスのゲノムは、組換えセグメント、並びに当業
者に公知の技術、例えば、リバースジェネティクス及びヘルパーフリープラスミドレスキ
ューを用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(及
び任意の他のポリペプチド、例えば、異種ポリペプチド)を発現するように改変すること
ができる。一実施態様において、組換えセグメントは、キメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチド、並びにvRNAの適切な複製、転写、及びパッケージングに必要とされる
3'及び5'組込みシグナルをコードする核酸を含む(Fujiiらの文献、2003, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 100:2002-2007; Zhengらの文献、1996, Virology 217:242-251、これらは
両方とも、引用により完全に本明細書中に組み込まれる)。具体的な実施態様において、
組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスと異なる又は同じ型、亜型、又は株に由
来するインフルエンザウイルスのセグメントの3'及び5'非コード及び/又は非翻訳配列を
使用する。いくつかの実施態様において、組換えセグメントは、インフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドの3'非コード領域、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チドの非翻訳領域、及びインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの5'非コード領
域を含む。具体的な実施態様において、組換えセグメントは、キメラインフルエンザ血球
凝集素(HA)ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメント、HA1のC末端ステムセグメント、
球状ヘッドドメイン、及び/又はHA2として、インフルエンザウイルスの型、亜型、又は株
と同じ型、亜型、又は株であるインフルエンザウイルスのHAセグメントの3'及び5'非コー
ド並びに/又は非翻訳配列を含む。ある実施態様において、キメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイルスのHA
セグメントを代替することができる。いくつかの実施態様において、キメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエンザウイ
ルスのNS1遺伝子を代替することができる。いくつかの実施態様において、キメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする組換えセグメントは、親インフルエン
ザウイルスのNA遺伝子を代替することができる。本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現させるために使用することができる例示的なインフル
エンザウイルス株としては、アンアーバー/1/50、A/アンアーバー/6/60、A/プエルトリコ
/8/34、A/サウスダコタ/6/2007、A/ウルグアイ/716/2007、A/カリフォルニア/07/2009、A
/パース/16/2009、A/ブリスベン/59/2007、A/ブリスベン/10/2007、A/レニングラード/13
4/47/57、B/ブリスベン/60/2008、B/山形/1/88、A/パナマ/2007/99、A/ワイオミング/3/0
3、及びA/WSN/33が挙げられる。
いくつかの実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素遺伝子セグメントは
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする。具
体的な実施態様において、インフルエンザ血球凝集素遺伝子セグメント及び少なくとも1
つの他のインフルエンザウイルス遺伝子セグメントは、該インフルエンザ血球凝集素遺伝
子セグメント及び該少なくとも1つの他の遺伝子セグメントを組換えインフルエンザウイ
ルスの複製時に一緒に分離することを可能にするパッケージングシグナルを含む(Gao及び
Paleseの文献、2009, PNAS 106:15891-15896;国際出願公開WO11/014645号;及び米国特許
出願公開第2012/0244183号参照)。
いくつかの実施態様において、親インフルエンザウイルスのゲノムは、二シストロン性
である組換えセグメントを用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチドを発現するように改変することができる。二シストロン性技術は、内部リ
ボソーム侵入部位(IRES)配列の使用により、複数のタンパク質のコード配列の単一mRNAへ
の改変を可能にする。IRES配列は、RNA分子へのリボソームの内部動員を導き、キャップ
非依存的に下流の翻訳を可能にする。簡潔に述べると、あるタンパク質のコード領域が、
第二のタンパク質のオープンリーディングフレーム(ORF)に挿入される。挿入は、IRES並
びに適切な発現及び/又は機能に必要な任意の非翻訳シグナル配列に連なる。挿入は、第
二のタンパク質のORF、ポリアデニル化、又は転写プロモーターを妨害してはならない(例
えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Garcia-Sastreらの文献
、1994, J. Virol. 68:6254-6261及びGarcia-Sastreらの文献、1994 Dev. Biol. Stand.
82:237-246参照)。例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米
国特許第6,887,699号、米国特許第6,001,634号、米国特許第5,854,037号、及び米国特許
第5,820,871号も参照されたい。当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意のIRESを本
発明に従って使用することができる(例えば、BiP遺伝子のIRES、GenBankデータベースエ
ントリーHUMGRP78のヌクレオチド372〜592;又は脳心筋炎ウイルス(EMCV)のIRES、GenBank
データベースエントリーCQ867238のヌクレオチド1430-2115)。したがって、ある実施態様
において、親インフルエンザウイルスは、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドと、別のポリペプチド、例えば、親インフルエンザウイルスによって発現される遺伝
子とを発現する二シストロン性RNAセグメントを含むように改変される。いくつかの実施
態様において、親インフルエンザウイルス遺伝子は、HA遺伝子である。いくつかの実施態
様において、親インフルエンザウイルス遺伝子は、NA遺伝子である。いくつかの実施態様
において、親インフルエンザウイルス遺伝子は、NS1遺伝子である。
当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドを含むインフルエンザウイルス及び本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを含むインフルエンザウ
イルスを産生することができる。例えば、リバースジェネティクス技術を用いて、そのよ
うなインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べると、リバースジェネ
ティクス技術は、一般に、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンの生成に必
要なパッケージングシグナルに必須である、マイナス鎖ウイルスRNAの非コード領域を含
む合成組換えウイルスRNAの調製を含む。組換えRNAは、組換えDNA鋳型から合成され、精
製されたウイルスポリメラーゼ複合体によってインビトロで再構成されて、細胞をトラン
スフェクトするために使用することができる組換えリボ核タンパク質(RNP)を形成する。
インビトロ又はインビボのどちらかでの合成RNAの転写の間にウイルスポリメラーゼタン
パク質が存在する場合、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組換えRN
Pは、感染性ウイルス粒子中にレスキューすることができる。前述の技術は、その各々が
引用により完全に本明細書中に組み込まれる、1992年11月24日に出願された米国特許第5,
166,057号; 1998年12月29日に出願された米国特許第5,854,037号; 1996年2月20日に公開
された欧州特許公開EP 0702085A1号;米国特許出願第09/152,845号; 1997年4月3日に公開
された国際特許公開PCT WO 97/12032号; 1996年11月7日に公開されたWO 96/34625号;欧州
特許公開EP A780475号; 1999年1月21日に公開されたWO 99/02657号; 1998年11月26日に公
開されたWO 98/53078号; 1998年1月22日に公開されたWO 98/02530号; 1999年4月1日に公
開されたWO 99/15672号; 1998年4月2日に公開されたWO 98/13501号; 1997年2月20日に公
開されたWO 97/06270号;及び1997年6月25日に公開されたEPO 780 475A1号に記載されてい
る。
或いは、ヘルパーフリープラスミド技術を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むインフルエンザウイルス、及び本明細書に記載の
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変されたゲノムを
含むインフルエンザウイルスを産生することができる。簡潔に述べると、ウイルスセグメ
ントの全長cDNAを、プラスミドベクターへのPCR産物の挿入を可能にする独特の制限部位
を含むプライマーによるPCRを用いて増幅させる(Flandorferらの文献、2003, J. Virol.
77:9116-9123; Nakayaらの文献、2001, J. Virol. 75:11868-11873;これらは両方とも、
引用により完全に本明細書中に組み込まれる)。プラスミドベクターは、正確なマイナス
の(vRNAセンス)転写物が発現されるように設計される。例えば、正確なマイナスの(vRNA
センス)転写物がポリメラーゼIプロモーターから産生されるように、プラスミドベクター
は、切断されたヒトRNAポリメラーゼIプロモーターとデルタ型肝炎ウイルスリボザイム配
列の間にPCR産物を配置するように設計することができる。各々のウイルスセグメントを
含む別個のプラスミドベクター並びに必要なウイルスタンパク質を含む発現ベクターを細
胞にトランスフェクトして、組換えウイルス粒子の産生をもたらすことができる。別の例
では、必要なウイルスタンパク質をコードするウイルスのゲノムRNAとmRNAの両方が発現
されるプラスミドベクターを使用することができる。ヘルパーフリープラスミド技術の詳
細な説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO
01/04333号;米国特許第6,951,754号、第7,384,774号、第6,649,372号、及び第7,312,064
号; Fodorらの文献、1999, J. Virol. 73:9679-9682; Quinlivanらの文献、2005, J. Vir
ol. 79:8431-8439; Hoffmannらの文献、2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-611
3; Neumannらの文献、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350; Enami及びEnam
iの文献、2000, J. Virol. 74(12):5556-5561;並びにPleschkaらの文献、1996, J. Virol
. 70(6):4188-4192)を参照されたい。
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、本明細書に記載の方法によるその使用を
可能にする力価までウイルスを増殖させる任意の基体中で増殖させることができる。一実
施態様において、該基体は、対応する野生株ウイルスについて測定される力価と同等の力
価までウイルスを増殖させる。ある実施態様において、該基体は、インフルエンザウイル
スにとって、又はHA機能が由来するウイルスにとって生物学的に関連するものである。具
体的な実施態様において、例えば、NS1遺伝子中の突然変異による弱毒化インフルエンザ
ウイルスは、IFN欠損基体中で増殖させることができる。例えば、好適なIFN欠損基体は、
インターフェロンを産生するかもしくはインターフェロンに応答するその能力に欠陥があ
る基体であってもよく、又はIFN欠損基体をインターフェロン欠損増殖環境を必要とし得
る任意の数のウイルスの増殖のために使用することができる基体である。例えば、その各
々の内容全体が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2003年6月3日に出願された
米国特許第6,573,079号、2005年2月8日に出願された同第6,852,522号、及び2009年2月24
日に出願された同第7,494,808号を参照されたい。具体的な実施態様において、ウイルス
を発育卵(例えば、鶏卵)中で増殖させる。具体的な実施態様において、ウイルスを8日齢
、9日齢、8〜10日齢、10日齢、11日齢、10〜12日齢、又は12日齢の発育卵(例えば、鶏卵)
中で増殖させる。ある実施態様において、ウイルスをMDCK細胞、Vero細胞、293T細胞、又
は当技術分野で公知の他の細胞株で増殖させる。ある実施態様において、ウイルスを発育
卵に由来する細胞で増殖させる。
本明細書に記載のインフルエンザウイルスは、当業者に公知の任意の方法によって単離
及び精製することができる。一実施態様において、ウイルスは、一般に、周知の清澄化手
順、例えば、勾配遠心分離及びカラムクロマトグラフィーによって細胞培養物から取り出
され、細胞成分から分離され、望ましい場合、当業者に周知の手順、例えば、プラークア
ッセイを用いて、さらに精製することができる。
ある実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウ
イルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメント
は、A型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施態様に
おいて、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又はイン
フルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上のA型イ
ンフルエンザウイルス亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、B型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施
態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又
はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上
のB型インフルエンザウイルス亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイ
ルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは
、A型インフルエンザウイルス亜型もしくは株とB型インフルエンザウイルス亜型もしくは
株の組合せから得られるか、又はそれらに由来する。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエ
ンザウイルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグ
メントは、C型インフルエンザウイルスから得られるか、又はそれに由来する。ある実施
態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイルス、又
はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは、2以上
のC型インフルエンザウイルス亜型もしくは株から得られるか、又はそれらに由来する。
他の実施態様において、本明細書に記載されているように使用されるインフルエンザウイ
ルス、又はインフルエンザウイルスポリペプチド、遺伝子、もしくはゲノムセグメントは
、C型インフルエンザウイルス亜型もしくは株とA型インフルエンザウイルス及び/もしく
はB型インフルエンザウイルス亜型もしくは株の組合せから得られるか、又はそれらに由
来する。
ある実施態様において、本明細書に提供されるインフルエンザウイルスは、弱毒化表現
型を有する。具体的な実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、A型インフ
ルエンザウイルスに基づく。他の実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、
B型インフルエンザウイルスに基づく。さらに他の実施態様において、弱毒化インフルエ
ンザウイルスは、C型インフルエンザウイルスに基づく。他の実施態様において、弱毒化
インフルエンザウイルスは、A型インフルエンザ、B型インフルエンザ、及び/又はC型イン
フルエンザウイルスの1以上の株又は亜型由来の遺伝子又はゲノムセグメントを含むこと
ができる。いくつかの実施態様において、弱毒化骨格ウイルスは、A型インフルエンザウ
イルス及びB型インフルエンザウイルス由来の遺伝子を含む。
具体的な実施態様において、ウイルスが少なくとも部分的に感染性を保持し、インビボ
で複製することができるが、非病原性である不顕性レベルの感染をもたらす低い力価を生
じさせることしかできないような、インフルエンザウイルスの弱毒化が望ましい。そのよ
うな弱毒化ウイルスは、ウイルス又はその免疫原性組成物が免疫応答を誘導するために対
象に投与される本明細書に記載の実施態様に特に好適である。インフルエンザウイルスの
弱毒化は、例えば、化学的突然変異誘発によって作製されるウイルス突然変異体の選択、
遺伝子操作によるゲノムの突然変異、弱毒化された機能を有するセグメントを含む再集合
体ウイルスの選択、又は条件的ウイルス突然変異体(例えば、低温適応ウイルス)の選択な
どの、当技術分野で公知の任意の方法によって達成することができる。或いは、天然に存
在する弱毒化インフルエンザウイルスを、インフルエンザウイルスベクターのためのイン
フルエンザウイルス骨格として使用することができる。
一実施態様において、インフルエンザウイルスは、親インフルエンザウイルスのHA遺伝
子を本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと置換すること
によって、少なくとも部分的に弱毒化することができる。いくつかの実施態様において、
インフルエンザウイルスは、細胞のインターフェロン(IFN)応答に拮抗するウイルスの能
力を損なわせる突然変異したNS1遺伝子を発現するようにインフルエンザウイルスを改変
することによって、少なくとも部分的に弱毒化することができる。インフルエンザウイル
スNS1遺伝子に導入することができる突然変異の種類の例としては、欠失、置換、挿入、
及びそれらの組合せが挙げられる。NS1遺伝子全体のどこにでも(例えば、N末端、C末端、
もしくはその間のどこか)、及び/又はNS1遺伝子の調節エレメントに、1以上の突然変異を
導入することができる。一実施態様において、弱毒化インフルエンザウイルスは、NS1のC
末端から5個、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、8
5、90、95、99、100、105、110、115、120、125、126、130、135、140、145、150、155、
160、165、170、もしくは175個のアミノ酸残基からなる欠失、又はC末端から5〜170、25
〜170、50〜170、100〜170、100〜160、もしくは105〜160個のアミノ酸残基の欠失をもた
らすインフルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含む。別の実施態様
において、弱毒化インフルエンザウイルスは、それがアミノ酸残基1〜130、アミノ酸残基
1〜126、アミノ酸残基1〜120、アミノ酸残基1〜115、アミノ酸残基1〜110、アミノ酸残基
1〜100、アミノ酸残基1〜99、アミノ酸残基1〜95、アミノ酸残基1〜85、アミノ酸残基1〜
83、アミノ酸残基1〜80、アミノ酸残基1〜75、アミノ酸残基1〜73、アミノ酸残基1〜70、
アミノ酸残基1〜65、又はアミノ酸残基1〜60のNS1タンパク質をコードするように、イン
フルエンザウイルスNS1遺伝子の突然変異を有するゲノムを含み、ここで、N末端アミノ酸
は、1番である。NS1突然変異及び突然変異したNS1を含むインフルエンザウイルスの例に
ついては、例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、米国特許第
6,468,544号及び第6,669,943号;並びにLiらの文献、1999, J. Infect. Dis. 179:1132-11
38を参照されたい。
別の実施態様において、インフルエンザウイルスは、該ウイルスのNA又はM遺伝子を文
献に記載されているように突然変異させることによって、少なくとも部分的に弱毒化する
ことができる。
(5.5 非インフルエンザウイルスベクター)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチド)を含む非インフルエンザウイルスである。具体的な実施態様において
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、非インフルエ
ンザウイルスのビリオンに組み込まれる。具体的な実施態様において、本明細書に記載の
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、精製された(例えば、プラーク精
製された)又は単離されたウイルスに含まれる/該ウイルスによって発現される。非インフ
ルエンザウイルスは、該ウイルスを、特定の細胞型、例えば、免疫細胞にターゲッティン
グする部分に結合させることができる。いくつかの実施態様において、インフルエンザウ
イルスのビリオンは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドに加えて、異種ポリペプチドをそれらに組み込んでいるか、又は異種ポリペプチドを発
現する。異種ポリペプチドは、免疫増強活性を有するか又は非インフルエンザウイルスを
特定の細胞型にターゲッティングするポリペプチド、例えば、特定の細胞型の表面の抗原
に結合する抗体もしくは特定の細胞型の表面の特異的受容体に結合するリガンドであって
もよい。そのような異種ポリペプチドの例については、上の第5.4節を参照されたい。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含有/発現する
非インフルエンザウイルスは、当業者に公知の技術を用いて産生することができる。本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む非インフルエンザ
ウイルスは、当技術分野で公知の技術を用いて、ビリオンの産生の間にキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをトランスに供給することによって産生することができ
る。或いは、血球凝集素機能がトランスに提供されているウイルスに感染しやすい細胞で
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改
変されたゲノムを含む非インフルエンザ親ウイルスの複製は、キメラインフルエンザ血球
凝集素(HA)ポリペプチドを含む子孫ウイルスを産生する。
限定されないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然変異体、突然変異を誘発さ
せたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含む、任意のウイルス型、亜
型、又は株を、非インフルエンザウイルスベクターとして使用することができる。具体的
な実施態様において、非インフルエンザ親ウイルスは、天然に存在するウイルスではない
。別の具体的な実施態様において、非インフルエンザ親ウイルスは、遺伝子改変ウイルス
である。ある実施態様において、エンベロープ型ウイルスが、本明細書に記載の膜結合型
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に好ましい。
例示的な実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、ニューカッスル病
ウイルス(NDV)である。別の実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、
ワクシニアウイルスである。別の実施態様において、非インフルエンザウイルスベクター
は、バキュロウイルス(例えば、BacMam[Invitrogen]など)である。他の例示的で、非限定
的な実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ
随伴ウイルス(AAV)、B型肝炎ウイルス、レトロウイルス(例えば、ガンマレトロウイルス
、例えば、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)ゲノムもしくはマウス白血病ウイルス(MLV)、例
えば、モロニーマウス白血病ウイルス、腫瘍レトロウイルス、もしくはレンチウイルスな
ど)、アルファウイルス(例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス)、ラブドウイルス(例えば
、水疱性口内炎ウイルス(VSV)もしくはパピローマウイルス)、ポックスウイルス(例えば
、ワクシニアウイルス、MVA-T7ベクター、もしくは鶏痘など)、メタニューモウイルス、
麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス(例えば、単純ヘルペスウイルス)、又はフォーミーウイ
ルスである。例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Lawrie及
びTuminの文献、1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109(レトロウイルスベクタ
ー); Bettらの文献、1993, J. Virol. 67, 5911(アデノウイルスベクター); Zhouらの文
献、1994, J. Exp. Med. 179, 1867(アデノ随伴ウイルスベクター); Dubenskyらの文献、
1996, J. Virol. 70, 508-519(ワクシニアウイルス及び鶏痘ウイルスを含むポックスファ
ミリー由来のウイルスベクター並びにアルファウイルス属由来のウイルスベクター、例え
ば、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルスに由来するもの);米国特許第5,643,57
6号(ベネズエラウマ脳炎ウイルス); WO 96/34625号(VSV); Oheらの文献、1995, Human Ge
ne Therapy 6, 325-333; Wooらの文献(WO 94/12629号); Xiao及びBrandsmaの文献、1996,
Nucleic Acids. Res. 24、2630-2622(パピローマウイルス);並びにBukreyev及びCollins
の文献、2008, Curr Opin Mol Ther. 10:46-55(NDV)を参照されたい。
具体的な実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、NDVである。任意
のNDV型、亜型、又は株は、限定されないが、天然に存在する株、変異体、もしくは突然
変異体、突然変異を誘発させたウイルス、再集合体、及び/又は遺伝子改変ウイルスを含
む、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するよう
に改変される骨格の役割を果たすことができる。具体的な実施態様において、遺伝子操作
のための骨格の役割を果たすNDVは、天然に存在する株である。ある実施態様において、
遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、溶解性株である。他の実施態様において
、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、非溶解性株である。ある実施態様にお
いて、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、長潜伏期性株である。いくつかの
実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、亜病原性株である。
他の実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、短潜伏期性株で
ある。NDV株の具体的な例としては、73-T株、アルスター株、MTH-68株、イタリアン(Ital
ien)株、ヒックマン(Hickman)株、PV701株、ヒッチナー(Hitchner)B1株、ラソタ(La Sota
)株、YG97株、MET95株、及びF48E9株が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な
実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、ヒッチナーB1株であ
る。別の具体的な実施態様において、遺伝子操作のための骨格の役割を果たすNDVは、ラ
ソタ株である。
一実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターのための骨格として使用され
るNDVは、修飾Fタンパク質を発現するように改変されており、この修飾Fタンパク質中で
は、該Fタンパク質の切断部位が1つ又は2つの追加のアルギニン残基を含む部位に置き換
えられ、この突然変異切断部位がフリンファミリーの遍在性に発現されるプロテアーゼに
よって活性化されるようになる。そのような修飾Fタンパク質を発現するNDVの具体的な例
としては、rNDV/F2aa及びrNDV/F3aaが挙げられるが、これらに限定されない。突然変異し
た切断部位を有する修飾Fタンパク質を産生するためにNDVのFタンパク質に導入される突
然変異の説明については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Parkら
の文献、2006、「二重特異性を有する改変されたウイルスワクチン構築物:鳥インフルエ
ンザ及びニューカッスル病(Engineered viral vaccine constructs with dual specifici
ty: Avian influenza and Newcastle disease.)」、PNAS USA 103:8203-2808を参照され
たい。
一実施態様において、非インフルエンザウイルスベクターは、ポックスウイルスである
。ポックスウイルスベクターは、ワクチンベクターに好適な配列を提供するポックスウイ
ルス科の任意のメンバー、特に、ワクシニアウイルス又はアビポックスウイルス(例えば
、カナリア痘ウイルス、鶏痘など)に基づくことができる。具体的な実施態様において、
ポックスウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターである。好適なワクシニアウ
イルスとしては、コペンハーゲン(VC-2)株(Goebelらの文献、Virol 179:247-266, 1990;
Johnsonらの文献、Virol. 196:381-401, 1993)、改変コペンハーゲン株(NYVAC)(米国特許
第6,265,189号)、WYETH株、及び改変アンカラ(MVA)株(Antoineらの文献、Virol. 244:365
-396、1998)が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なポックスウイルスとし
ては、望ましい特性を提供し、高度に弱毒化されているALVAC及びTROVACベクターなどの
鶏痘株が挙げられる(例えば、米国特許第6,265,189号; Tartagliaらの文献、AIDS研究レ
ビュー(AIDS Research Reviews)、Koffら編、第3巻、Marcel Dekker, N. Y., 1993;及びT
artagliaらの文献、1990, Reviews in Immunology 10:13-30、1990参照)。
インフルエンザポリペプチドを発現させるために非インフルエンザウイルスを改変する
方法は、そのようなウイルスを弱毒化させ、増殖させ、かつ単離及び精製する方法と同様
に当技術分野で周知である。NDVベクターに関するそのような技術については、その各々
が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 01/04333号;米国特許第7,44
2,379号、第6,146,642号、第6,649,372号、第6,544,785号、及び第7,384,774号; Swayne
らの文献(2003)、Avian Dis. 47:1047-1050;及びSwayne文献(2001)、J. Virol. 11868-11
873を参照されたい。ポックスウイルスに関するそのような技術については、例えば、Pic
ciniらの文献、Methods of Enzymology 153:545-563, 1987;国際公開WO 96/11279号;米国
特許第4,769,330号;米国特許第4,722,848号;米国特許第4,769,330号;米国特許第4,603,11
2号;米国特許第5,110,587号;米国特許第5,174,993号; EP 83 286号; EP 206 920号; Mayr
らの文献、Infection 3:6-14, 1975;並びにSutter及びMossの文献、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 89:10847-10851, 1992を参照されたい。ある実施態様において、非インフルエン
ザウイルスは、弱毒化されている。
特に、対象への投与のための組成物中で使用するための、非インフルエンザウイルスベ
クターの選択のための例示的な検討事項は、安全性、低毒性、安定性、細胞型特異性、及
び免疫原性、特に、非インフルエンザウイルスベクターによって発現される本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの抗原性である。
(5.6 ウイルス様粒子及びウイロソーム)
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)は、ウイルス様粒子(VLP)ベ
クター、例えば、精製された/単離されたVLPに組み込むことができる。VLPは、通常、ウ
イルスの構造タンパク質(複数可)に一般的に由来するウイルスポリペプチド(複数可)を含
む。いくつかの実施態様において、VLPは複製することができない。ある実施態様におい
て、VLPはウイルスの完全なゲノムを欠いていてもよく、又はウイルスのゲノムの一部を
含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、VLPは細胞に感染することができない
。いくつかの実施態様において、VLPは、当業者に公知又は本明細書に記載のウイルス性
標的部分(例えば、ウイルス表面糖タンパク質)又は非ウイルス性標的部分(例えば、抗体
もしくはタンパク質)のうちの1つ又は複数をその表面に発現する。いくつかの実施態様に
おいて、VLPは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド及
びウイルス構造タンパク質、例えば、HIV gagを含む。具体的な実施態様において、VLPは
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド及びHIV gagポリ
ペプチドを含む。
組換えで産生されるVLPを産生して特徴付けるための方法は、インフルエンザウイルス(
Brightらの文献(2007)、Vaccine. 25:3871)、ヒトパピローマウイルス1型(Hagneseeらの
文献(1991)、J. Virol. 67:315)、ヒトパピローマウイルス16型(Kirnbauerらの文献、Pro
c. Natl. Acad. Sci.(1992) 89:12180)、HIV-1(Hafferらの文献(1990)、J. Virol. 64:26
53)、及びA型肝炎(Winokurの文献(1991) 65:5029)を含む、いくつかのウイルスに基づい
て記載されており、これらの文献の各々は、完全に本明細書中に組み込まれている。NDV
タンパク質を含むVLPを発現させる方法は、その各々が完全に本明細書中に組み込まれる
、Pantuaらの文献(2006)、J. Virol. 80:11062-11073、及び2009年3月12日に公開された
米国特許出願公開第20090068221号に提供されている。具体的な実施態様において、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPは、バキュロ
ウイルスを用いて生成される。他の実施態様において、本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPは、293T細胞を用いて生成される。
具体的な実施態様において、VLP、例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPは、細胞(例えば、293T細胞)で発現される。ある実
施態様において、VLPは、シアル酸を含む表面糖タンパク質を発現する細胞で発現される
。そのような実施態様に従って、細胞は、ノイラミニダーゼ(例えば、ウイルス又は細菌
のノイラミニダーゼ)の存在下で培養される。ある実施態様において、VLP、例えば、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むVLPは、シアル酸
を含む表面糖タンパク質を発現しない細胞で発現される。
具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、ウイロソームに組み込むことができる。本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイロソームは、当業者に公知の技術を用いて
産生することができる。例えば、ウイロソームは、精製されたウイルスを破壊し、ゲノム
を抽出し、ウイルスタンパク質(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチド)及び脂質で粒子を再構成させて、ウイルスタンパク質を含む脂質
粒子を形成させることによって産生することができる。
(5.7 細菌ベクター)
具体的な実施態様において、細菌は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド)を発現するように改変することができる。本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現用の好適な細菌としては、リステリア、サルモネ
ラ(Salmonella)、赤痢菌(Shigella)種、ヒト結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、大腸
菌、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)、ウシ流産菌(Brucella abortus)、マルタ熱菌(B
rucella melitensis)、ライム病ボレリア(Borrelia burgdorferi)、乳酸菌(Lactobacillu
s)、カンピロバクター(Campylobacter)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ビフィズス菌(B
ifidobacterium)、及び野兎病菌(Francisella tularensis)が挙げられるが、これらに限
定されない。具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変された細菌は、弱毒化されている。異種ポリ
ペプチドを発現するように改変された細菌の産生技術は当技術分野で公知であり、本明細
書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの発現に適用することがで
きる。例えば、その各々が引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2008年10月9日
に公開された米国特許出願公開第20080248066号及び2007年9月6日に公開された米国特許
出願公開第20070207171号を参照されたい。ある実施態様において、本明細書で使用され
る細菌ベクターは、N結合型グリコシル化を行う能力を保有し、例えば、そのような細菌
は、N-グリコシル化機構を天然に保有するか(例えば、カンピロバクター)、又はN-グリコ
シル化機構を保有するように遺伝子改変されている。
(5.8 キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の作製)
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)、そのようなポリペプチド
をコードする核酸、又は本明細書に記載のそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベ
クターを用いて、インフルエンザに対する、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドのストーク領域に対する中和抗体を誘発することができる。具体的な実施態
様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、その
ようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含む
ベクターを非ヒト対象(例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど)に投与して、
抗体の産生を含む免疫応答を誘導することができ、この抗体は、当業者に公知の技術(例
えば、免疫親和性クロマトグラフィー、遠心分離、沈殿など)を用いて単離することがで
きる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドに対するヒト抗体は、ヒト抗体を産生することができる非ヒト対象(例えば、トラ
ンスジェニックマウス)を用いて作製することができる。例えば、ヒト抗体は、機能的な
内在性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現す
ることができるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ヒト
重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、又は相同組換えによってマウ
ス胚性幹細胞に導入することができる。或いは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領
域を、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入することができる。マ
ウス重鎖及び軽鎖遺伝子免疫グロブリン遺伝子を、相同組換えによるヒト免疫グロブリン
遺伝子座の導入によって、個別に又は同時に、非機能的にすることができる。特に、JH領
域のホモ接合性欠失は、内在性抗体の産生を妨げる。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、
胚盤胞に顕微注入して、キメラマウスを生じさせる。その後、キメラマウスを交配させて
、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。このトランスジェニックマウスが有す
るヒト免疫グロブリン導入遺伝子はB細胞分化の間に再編成し、その後、クラススイッチ
ング及び体細胞突然変異を経る。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有用な
IgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するこの技術
の概説については、Lonberg及びHuszarの文献、Int. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)を参
照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するこの技術並びにそのような
抗体を産生するプロトコルの詳細な議論については、例えば、引用により完全に本明細書
中に組み込まれる、PCT公開WO 98/24893号; WO 92/01047号; WO 96/34096号; WO 96/3373
5号;欧州特許第0 598 877号;米国特許第5,413,923号;第5,625,126号;第5,633,425号;第5,
569,825号;第5,661,016号;第5,545,806号;第5,814,318号;第5,885,793号;第5,916,771号;
及び第5,939,598号を参照されたい。Abgenix社(Freemont, Calif.)、Genpharm(San Jose,
Calif.)、及びMedarex社(Princeton, N.J.)などの会社に、選択された抗原に対するヒト
抗体を提供することを請け負わせることができる。さらに、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに結合するヒト抗体が生成されるように、非ヒト
対象に、ヒト末梢血白血球、脾細胞、又は骨髄を移植することができる(例えば、Trioma
Techniques XTL)。
或いは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを用いて
、抗体ライブラリーから抗体をスクリーニングすることができる。例えば、単離されたキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを固体支持体(例えば、シリカゲル、樹
脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、ポリスチ
レンビーズ、アルミナゲル、又は多糖、磁気ビーズ)に固定し、抗体への結合についてス
クリーニングすることができる。代替法として、抗体を固体支持体に固定し、単離された
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドへの結合についてスクリーニングする
ことができる。任意のスクリーニングアッセイ、例えば、パニングアッセイ、ELISA、表
面プラズモン共鳴、又は当技術分野で公知の他の抗体スクリーニングアッセイを用いて、
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに結合する抗体についてスクリーニン
グすることができる。スクリーニングされる抗体ライブラリーは、市販の抗体ライブラリ
ー、インビトロで作製されたライブラリー、又はインフルエンザに感染した個体から抗体
を同定及びクローニング又は単離することによって得られたライブラリーであることがで
きる。特定の実施態様において、抗体ライブラリーは、インフルエンザウイルス大発生の
生存者から作製される。抗体ライブラリーは、当技術分野で公知の方法に従って作製する
ことができる。特定の実施態様において、抗体ライブラリーは、抗体をクローニングし、
それをファージディスプレイライブラリー又はファージミドディスプレイライブラリーで
用いることによって作製される。
本明細書に記載の方法で同定される抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の生
物学的アッセイを用いて、中和活性及び自己反応性の欠如について試験することができる
。一実施態様において、非ヒト動物又は抗体ライブラリーから単離された抗体は、複数の
インフルエンザ亜型由来の血球凝集素ポリペプチドを中和する。いくつかの実施態様にお
いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのような
ポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドをコードする
ベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、インフルエンザH3ウイルスを中和する。い
くつかの実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリ
ペプチドを含むベクターを用いて誘発又は同定される抗体は、1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、もしくは16種、又はそれより多くのインフルエンザウイル
スの亜型又は株を中和する。一実施態様において、中和抗体は1以上のA型インフルエンザ
ウイルス及び1以上のB型インフルエンザウイルスを中和する。特定の実施態様において、
中和抗体は、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A
66、D80、E88、E90、H98、C179(ハイブリドーマFERM BP-4517により産生される; Takara
Bio社(Otsu, Shiga, Japan)により販売されているクローン)、及び/又はAI3C(FERM BP-45
16);もしくはEkiert DCらの文献(2009)、高度に保存されたインフルエンザウイルスエピ
トープの抗体認識(Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epit
ope.)、Science(2009年2月26日にScience Expressで発表された); Kashyapらの文献(2008
)、トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生の生存者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリ
ーはウイルス中和戦略を明らかにする(Combinatorial antibody libraries from survivo
rs of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization stra
tegies.)、Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Suiらの文献(2009)、鳥及びヒト
A型インフルエンザウイルスの広域スペクトル中和のための構造及び機能的基礎(Structur
al and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human inf
luenza A virus.)、Nat Struct Mol Biol 16: 265-273;米国特許第5,589,174号、第5,631
,350号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;国際公開WO 2007/134237として公開された
国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/
US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号として公開された国際出願PCT/EP2007/05935
6号;及び国際公開WO 2009/079259号として公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記
載されている任意の他の抗体でもなく、該抗体と同じエピトープに結合するものでもない
。他の実施態様において、中和抗体は、Wangらの文献(2010)「異なる血球凝集素による連
続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広域防御性モノクローナル抗体(Broadly P
rotective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequentia
l Immunization with Different Hemagglutinins)」、PLOS Pathogens 6(2):1-9に記載さ
れている抗体ではない。特定の実施態様において、中和抗体は、Ig VH1-69セグメントを
使用していない。いくつかの実施態様において、中和抗体と抗原との相互作用は、重鎖に
よってのみ媒介されるものではない。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを
用いて同定又は誘発される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫
活性部分、すなわち、血球凝集素ポリペプチドに特異的に結合する抗原結合部位を含む分
子が含まれる。免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG
、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及
びIgA2)、又はサブクラスであることができる。抗体には、モノクローナル抗体、多重特
異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Fv(scFv)、単鎖抗体、Fab断片、F(a
b')断片、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本明細
書に記載の方法を用いて誘発又は同定される抗体に対する抗Id抗体を含む)、並びに上記
のいずれかのエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを
用いて誘発又は同定される抗体は、診断的免疫アッセイ、受動免疫療法、及び抗イディオ
タイプ抗体の作製で使用することができる。受動免疫療法で使用される前の抗体を修飾す
ることができ、例えば、抗体をキメラ化又はヒト化することができる。キメラ抗体及びヒ
ト化抗体の作製に関する概説については、例えば、その各々が引用により完全に本明細書
中に組み込まれる、米国特許第4,444,887号及び第4,716,111号;並びに国際公開WO 98/466
45号、WO 98/50433号、WO 98/24893号、WO 98/16654号、WO 96/34096号、WO 96/33735号
、及びWO 91/10741号を参照されたい。さらに、血球凝集素ポリペプチドを中和する抗体
の能力及び該ポリペプチドに対する抗体の特異性を、受動免疫療法で抗体を使用する前に
試験することができる。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを
用いて誘発又は同定される抗体を用いて、療法の効力及び/又は疾患の進行をモニタリン
グすることができる。この目的のために、限定されないが、少し例を挙げれば、放射性免
疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、沈降
反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放
射線測定法、蛍光免疫アッセイ、プロテインA免疫アッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ
などの技術を用いる、競合的及び非競合的アッセイ系を含む、当技術分野で公知の任意の
免疫アッセイ系を使用することができる。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを
用いて誘発又は同定される抗体は、抗イディオタイプ抗体の作製で使用することができる
。その後さらに、インフルエンザの特定の抗原、例えば、血球凝集素ポリペプチドの中和
エピトープに結合する抗体の亜集団を産生するために、該抗イディオタイプ抗体を免疫に
使用することができる(引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Jerneの文献、1974
, Ann. Immunol.(Paris) 125c:373; Jerneらの文献、1982, EMBO J. 1:234)。本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコ
ードする核酸、又はそのような核酸もしくはポリペプチドを含むベクターを用いて誘発又
は同定される抗体は、ミモトープ(mimotope)の設計に使用することができる。その後さら
に、ミモトープ中にコードされるインフルエンザの特定の抗原、例えば、血球凝集素ポリ
ペプチドの中和エピトープに結合する抗体のサブ集団を産生するために、該ミモトープを
免疫に使用することができる(引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Jerneの文献
、1974, Ann. Immunol.(Paris) 125c:373; Jerneらの文献、1982, EMBO J. 1:234)。
(5.9 キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドによる細胞の刺激)
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチド)によってエクスビボで細胞を刺激する方法である。そのような細胞
、例えば、樹状細胞を、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体
を作製するためにインビトロで使用することができるか、又はそれ自体を、例えば、当技
術分野で公知の養子移入技術によって対象に投与することができる。養子移入技術の説明
については、例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、2008年1月24日に公
開された米国特許出願公開第20080019998号を参照されたい。ある実施態様において、本
明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドによってエクスビボで
刺激された細胞を対象に投与する場合、該細胞は、哺乳動物細胞(例えば、CB-1細胞)では
ない。
1つの非限定的な例において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドを発現するように改変されたベクター、例えば、インフルエンザウイルスベ
クターを用いて、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現し、インフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫刺激特性を提示する樹状細胞(DC)を
作製することができる。そのようなDCは、メモリーT細胞を拡大するために使用されるこ
とができ、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに特異的な細胞傷害性Tリ
ンパ球クローンを含む、T細胞の強力なスティミュレーターである。引用により完全に本
明細書中に組み込まれる、Strobelらの文献、2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218を
参照されたい。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、該ポリペプチ
ドを標的細胞、例えば、DCと接触させ、該ポリペプチドを標的細胞に送達するのを可能に
する任意の方法で標的細胞に送達することができる。ある実施態様において、本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを本明細書に記載されているよ
うに対象に送達する。いくつかのそのような実施態様において、該ポリペプチドと接触さ
せた細胞を単離し、増殖させることができる。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドをインビトロで標的細胞に送達する。当業者に公知の技術を用いて、該ポリペプチ
ドを標的細胞に送達することができる。例えば、標的細胞を、組織培養プレート、チュー
ブ、又は他の容器中の該ポリペプチドと接触させることができる。該ポリペプチドを培地
に懸濁させ、培養プレートのウェル、チューブ、又は他の容器に添加することができる。
該ポリペプチドを含む培地を、細胞のプレーティングの前に、又は細胞をプレーティング
した後に添加することができる。標的細胞は、該ポリペプチドを細胞と接触させるのに十
分な量の時間、該ポリペプチドとともにインキュベートすることが好ましい。ある実施態
様において、該細胞を、該ポリペプチドとともに、約1時間以上、約5時間以上、約10時間
以上、約12時間以上、約16時間以上、約24時間以上、約48時間以上、約1時間〜約12時間
、約3時間〜約6時間、約6時間〜約12時間、約12時間〜約24時間、又は約24時間〜約48時
間インキュベートする。キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドがウイルス中
にある、ある実施態様において、標的細胞を接触させることは、該細胞をウイルスに感染
させることを含む。
標的細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びモルモットを含む、任意の
種由来のものであることができる。いくつかの実施態様において、標的細胞は、健康な対
象又は治療を必要とする対象から得られるDCである。ある実施態様において、標的細胞は
、ポリペプチドに対する免疫応答を刺激することが望ましい対象から得られるDCである。
対象から細胞を得る方法は、当技術分野で周知である。
(5.10 組成物)
本明細書に記載の核酸、ベクター、ポリペプチド、細菌、抗体、又は細胞(本明細書で
は「活性化合物」と呼ばれることもある)を組成物に組み込むことができる。具体的な実
施態様において、組成物は、医薬組成物、例えば、免疫原性組成物(例えば、ワクチン製
剤)である。本明細書に提供される医薬組成物は、組成物を対象に投与することができる
任意の形態であることができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、動物及び/
又はヒト投与に好適である。組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する
方法で使用することができる。
一実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を含む。別の実施態様において、
医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチド)をコードする核酸を含む。別の実施態様において、医薬組
成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチド)をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。別の実施態様にお
いて、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を含むインフルエンザウイルス又は非インフルエン
ザウイルスを含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体と
の混合物中に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例
えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を発現するよ
うに改変されたゲノムを有するインフルエンザウイルス又は非インフルエンザウイルスを
含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を含むウイルス様粒子又は
ウイロソームを含む。別の実施態様において、医薬組成物は、医薬として許容し得る担体
との混合物中に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(
例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)を発現する
か又は該ポリペプチドを発現するように改変された細菌を含む。別の実施態様において、
医薬組成物は、医薬として許容し得る担体との混合物中に、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチド)で刺激された細胞を含む。
いくつかの実施態様において、医薬組成物は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドを利用する療法に加えて1以上の他の療法を含むことができ
る。
本明細書で使用されるように、「医薬として許容し得る」という用語は、動物、より具
体的にはヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局に承認されているか
、又は米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する
。「担体」という用語は、医薬組成物がそれとともに投与される、希釈剤、アジュバント
、賦形剤、又はビヒクル体を指す。生理食塩水溶液及び水性デキストロース溶液及びグリ
セロール溶液は、特に注射用溶液のための液体担体として利用することもできる。好適な
賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米
、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレ
ート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコ
ール、水、エタノールなどが挙げられる。好適な医薬担体の例は、E. W. Martin著、「レ
ミントンの医薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」に記載されている。製剤
は、投与様式に適するべきである。
具体的な実施態様において、医薬組成物は、対象への意図された投与経路に適するよう
に製剤化される。例えば、医薬組成物は、非経口、経口、皮内、経皮、結腸直腸、腹腔内
、及び直腸投与に適するように製剤化することができる。具体的な実施態様において、医
薬組成物は、静脈内、経口、腹腔内、鼻腔内、気管内、皮下、筋肉内、局所、皮内、経皮
、又は肺投与用に製剤化することができる。具体的な実施態様において、医薬組成物は、
鼻腔内投与用に製剤化される。別の具体的な実施態様において、医薬組成物は、筋肉内投
与用に製剤化される。
ある実施態様において、生体分解性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水
物、ポリエチレングリコール(PEG化)、ポリメタクリル酸メチルポリマー、ポリラクチド
、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル
、及びポリ乳酸を担体として使用することができる。いくつかの実施態様において、活性
化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤のように、身
体からの速やかな消失からの化合物の保護を増大させる担体を用いて調製される。そのよ
うな製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。リポソーム又はミセルを医薬として許
容し得る担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第4,522,811号
に記載されているような、当業者に公知の方法によって調製することができる。ある実施
態様において、医薬組成物は、1以上のアジュバントを含む。
具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、一価製剤、例えば、
本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載
のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH7/3キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチド、本明細書に記載のcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチド、本明細書に記載のcHB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、又は本
明細書に記載のcH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む一価製剤であ
る。
他の具体的な実施態様において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、多価製剤、例え
ば、二価及び三価製剤である。一例において、多価製剤は、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現する複数のベクターを含む。ある実施態様
において、多価製剤は、単一のベクターを用いて発現される本明細書に記載の1以上の異
なるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むことができる。ある実施態
様において、多価製剤は、異なるキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含み、
ここで、各々のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、同じインフルエンザ血
球凝集素球状ヘッドドメイン及び異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを含む
。異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、異なるインフルエンザウイルス株
、亜型、又は群に由来するものであることができる。例えば、二価製剤は、2つのキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含むことができ、ここで、該2つのキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘッドドメイ
ン及び2つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステ
ムドメインを含む。別の例において、三価製剤は、3つのキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドを含むことができ、ここで、該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドは、同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘッドドメイン及び3つの異なるイン
フルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを含む。具体
的な実施態様において、本明細書に提供される二価ワクチン製剤は、本明細書に記載のcH
5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH5/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドの組合せ;又は本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドと本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドの組合せを含むことができる。具体的な実施態様において、本明細書に提供
される三価ワクチン製剤は、(i)本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドと本明細書に記載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドと
本明細書に記載のcH5/B、cH7/B、もしくはcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドのいずれかの組合せ;又は(ii)本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドと本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
と本明細書に記載のcH5/B、cH7/B、もしくはcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドのいずれかの組合せを含むことができる。ある実施態様において、二価又は三価ワ
クチン製剤は、本明細書に記載のcH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
含む。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤、例えば、水銀誘導体
のチメロサールをさらに含む。具体的な実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物
は、0.001％〜0.01％のチメロサールを含む。他の実施態様において、本明細書に記載の
医薬組成物は、防腐剤を含まない。具体的な実施態様において、チメロサールは、本明細
書に記載の医薬組成物の製造時に使用され、チメロサールは、医薬組成物の生産後の精製
工程を通して除去される、すなわち、医薬組成物は、微量のチメロサールを含む(精製後
に、1用量当たり＜0.3μgの水銀;そのような医薬組成物は、チメロサール非含有製品とみ
なされる)。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質(例えば、オボ
アルブミン又は他の卵タンパク質)をさらに含む。本明細書に記載の医薬組成物中の卵タ
ンパク質の量は、1mlの医薬組成物に対して、約0.0005〜約1.2μgの卵タンパク質である
ことができる。他の実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、卵タンパク質を
含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、限定されないが、ゲンタマイ
シン、ネオマイシン、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB)、及びカナマイシン、スト
レプトマイシンを含む、1以上の抗微生物剤(例えば、抗生物質)をさらに含む。他の実施
態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、いかなる抗生物質も含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ウイルスを不活化するために
使用される1以上の成分、例えば、ホルマリンもしくはホルムアルデヒド、又は洗剤、例
えば、デオキシコール酸ナトリウム、オクトキシノール9(Triton X-100)、及びオクトキ
シノール10をさらに含む。他の実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ウイ
ルスを不活化するために使用されるいかなる成分も含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンをさらに含む。他の
実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、ゼラチンを含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の緩衝剤、例えば、リ
ン酸緩衝剤及びスクロースリン酸グルタミン酸緩衝剤をさらに含む。他の実施態様におい
て、本明細書に記載の医薬組成物は、緩衝剤を含まない。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、1以上の塩、例えば、塩化ナ
トリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸一ナトリウム、及びアルミ
ニウム塩(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン(硫酸アルミニ
ウムカリウム)、又はそのようなアルミニウム塩の混合物)をさらに含む。他の実施態様に
おいて、本明細書に記載の医薬組成物は、塩を含まない。
具体的な実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物は、低添加剤インフルエンザ
ウイルスワクチンである、すなわち、該医薬組成物は、インフルエンザウイルスワクチン
中に一般に見られる1以上の添加剤を含まない。低添加剤インフルエンザワクチンは記載
されている(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 09/00121
7号として公開された国際出願PCT/IB2008/002238号参照)。
本明細書に記載の医薬組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、又はデ
ィスペンサーに含めることができる。
本明細書に記載の医薬組成物は、使用前に保存することができ、例えば、該医薬組成物
は、冷凍して(例えば、約-20℃もしくは約-70℃で)保存するか;冷蔵条件で(例えば、約4
℃で)保存するか;又は室温で保存することができる(インフルエンザワクチンを含む組成
物を冷蔵しないで保存する方法については、引用により完全に本明細書中に組み込まれる
、国際公開WO 07/110776号として公開された国際出願PCT/IB2007/001149号を参照された
い)。
ある実施態様において、本明細書に記載の医薬組成物中の活性化合物が、本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するように改変された細胞
である場合、該医薬組成物中の細胞は、哺乳動物細胞(例えば、CB-1細胞)ではない。
(5.10.1 サブユニットワクチン)
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むサブユニットワクチンである。いくつかの
実施態様において、サブユニットワクチンは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチド、及び1以上の表面糖タンパク質(例えば、インフルエンザウイ
ルスノイラミニダーゼ)、他のターゲッティング部分、又はアジュバントを含む。具体的
な実施態様において、サブユニットワクチンは、本明細書に記載の単一のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。他の実施態様において、サブユニットワクチ
ンは、本明細書に記載の2つ、3つ、4つ、又はそれより多くのキメラインフルエンザ血球
凝集素(HA)ポリペプチドを含む。具体的な実施態様において、サブユニットワクチンで使
用されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、膜結合型ではない、すな
わち、可溶性である。
本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドの有効量を含む。ある実施態様において、本明細書に提供されるサブユニッ
トワクチンは、約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、7
0、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、又は150
μgの本明細書に記載の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む
。ある実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、約5〜10、10
〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110
、110〜120、120〜130、130〜140、又は140〜150μgの本明細書に記載の1以上のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される一価のサブユニットワクチンは、7.
5μg〜90μgの本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含
む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される二価のサブユニットワクチン
は、7.5μg〜90μgの本明細書に記載の第一のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチド及び7.5μg〜90μgの本明細書に記載の第二のキメラインフルエンザ血球凝集素(
HA)ポリペプチドを含む。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される三価の
サブユニットワクチンは、7.5μg〜90μgの本明細書に記載の第一のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、7.5μg〜90μgの本明細書に記載の第二のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、及び7.5μg〜90μgの本明細書に記載の第三のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、約10μg〜約60μg
の本明細書に記載の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、約0.001
％〜0.01％のチメロサール、約0.1μg〜約1.0μgの鶏卵タンパク質、約1.0μg〜約5.0μg
のポリミキシン、約1.0μg〜約5.0μgのネオマイシン、約0.1μg〜約0.5μgのベータプロ
ピオラクトン、及び約0.001〜約0.05w/v％のノニルフェノールエトキシレートを含むサブ
ユニットワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、45μgの
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、1.0μg以下の水銀
(チメロサール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μ
g以下のポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む0.5ml用量を含むか又はそれ
からなる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは
、1用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以下のノニルフェ
ノールエトキシレートをさらに含むか又はそれらからなる。いくつかの実施態様において
、0.5ml用量のサブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、45μgの
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、25.0μgの水銀(チ
メロサール由来)、1.0μg以下の鶏卵タンパク質(すなわち、オボアルブミン)、3.75μg以
下のポリミキシン、及び2.5μg以下のネオマイシンを含む5.0mlの多用量バイアル(1用量
当たり、0.5ml)からなる。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるサブユニ
ットワクチンは、1用量当たり、0.5μg以下のベータプロピオラクトン及び0.015w/v％以
下のノニルフェノールエトキシレートをさらに含むか又はそれらからなる。
具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、発育鶏卵で増殖させたインフル
エンザウイルスを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチンの成分(例えば、本
明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖
させたウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様において、サブユニットワクチ
ンは、発育鶏卵で増殖させなかったインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわ
ち、サブユニットワクチンの成分(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球
凝集素(HA)ポリペプチド)は、発育鶏卵で増殖させなかったウイルスから単離される)。別
の具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、哺乳動物細胞、例えば、不死化
ヒト細胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 07/045674
号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号参照)、イヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細
胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 08/032219号とし
て公開された国際出願PCT/IB2007/003536号参照)、Vero細胞、PerC.6細胞、又はアヒル細
胞、例えば、EB66細胞で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される(すなわ
ち、サブユニットワクチンの成分(例えば、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチド)は、哺乳動物細胞で増殖させたウイルスから単離される)。別の具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるサブユニットワクチン中のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドは、発現ベクター、例えば、ウイルスベクター、植物ベクター、又
は細菌ベクターを用いて調製される(すなわち、サブユニットワクチン中のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、発現ベクターから得られる/単離される)。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む一価のサブユニットワクチンである。具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチド)を含む一価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、
本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば
、第5.1節に記載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む一価のサ
ブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは
、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH7/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む一価のサブユニットワクチンである
。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチド)を含む一価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド(例えば、第5.1節に記載のcH7/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含
む一価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載
のB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む一価のサブユニットワクチン
である。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメライン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH4/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチド)を含む一価のサブユニットワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。ある
実施態様において、本明細書に提供されるのは、2つのキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンであり、ここで、該2つのキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエ
ンザ血球凝集素球状ヘッドドメインを含み、かつ該2つのキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドの各々は、2つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエ
ンザ血球凝集素ステムドメインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集
素ステムドメインは、2つの異なるインフルエンザ株、亜型、又は群由来のものである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチド及びcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二
価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実
施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド及びcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユ
ニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH
5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
及びcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチ
ンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提
供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH5/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド及びcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価の
サブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるの
は、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcB/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提
供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH7/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド及びcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサ
ブユニットワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド及びcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
含む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提
供されるのは、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド及びcB/Bキメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユニットワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド及びcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含
む二価のサブユニットワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、本明細書に記載のcH4/3キメラ血球凝集素ポリペプチドを含む二価のサブユ
ニットワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
を含むウイルスを含む三価のサブユニットワクチンである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるのは、3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価
のサブユニットワクチンであり、ここで、該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘッ
ドドメインを含み、かつ該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの各々は
、3つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムド
メインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、3
つの異なるインフルエンザウイルス株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施態
様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチド、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、及びcH5/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブユニットワクチンである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチド、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、及びcH7/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブユニットワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチド、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、及びcB/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブユニットワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチド、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、及
びcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブユニットワクチ
ンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド、及びcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブユニッ
トワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチド、及びcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価のサブ
ユニットワクチンである。ある実施態様において、三価のサブユニットワクチンは、本明
細書に記載のcH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素を含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、A/ベトナ
ム/1203/2004(H5)の球状ヘッドドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドを含まない。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニ
ットワクチンは、A/パース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドを含まない。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサブユニットワクチンは、A/マガモ
/アルバータ/24/2001(H7)の球状ヘッドドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドを含まない。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるサ
ブユニットワクチンは、A/パース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH7/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含まない。
(5.10.2 生ウイルスワクチン)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワク
チン)である。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、組成物を投与される
対象で産生される子孫ウイルスによって発現される本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするように改変されている生ウイルスを含む免疫
原性組成物(例えば、ワクチン)である。具体的な実施態様において、キメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、膜結合型である。他の具体的な実施態様において、キ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、膜結合型ではない、すなわち、それ
は、可溶性である。特定の実施態様において、生ウイルスは、上の第5.4節に記載されて
いるような、インフルエンザウイルスである。他の実施態様において、生ウイルスは、上
の第5.5節に記載されているような、非インフルエンザウイルスである。いくつかの実施
態様において、生ウイルスは弱毒化されている。いくつかの実施態様において、免疫原性
組成物は、本明細書に記載の2つ、3つ、4つ、もしくはそれより多くの異なるキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むか、又はそれらを発現するように改変され
ている、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの生ウイルスを含む。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、本明細書に記載の1
以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む約105〜約1010蛍光焦点
単位(FFU)の弱毒化生インフルエンザウイルス、約0.1〜約0.5mgのグルタミン酸一ナトリ
ウム、約1.0〜約5.0mgの加水分解ブタ(procine)ゼラチン、約1.0〜約5.0mgのアルギニン
、約10〜約15mgのスクロース、約1.0〜約5.0mgの二塩基性リン酸カリウム、約0.5〜約2.0
mgのリン酸二水素カリウム、及び約0.001〜約0.05μg/mlの硫酸ゲンタマイシンを含む免
疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物
(例えば、ワクチン)は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックされる。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、1用量当たり、本明細書に記
載の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む106.5〜107.5FFUの
弱毒化生インフルエンザウイルス、0.188mgのグルタミン酸一ナトリウム、2.0mgの加水分
解ブタゼラチン、2.42mgのアルギニン、13.68mgのスクロース、2.26mgの二塩基性リン酸
カリウム、0.96mgのリン酸二水素カリウム、及び0.015μg/ml未満の硫酸ゲンタマイシン
を含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原
性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.2ml用量を含む充填済み噴霧器としてパックさ
れる。
具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に
、発育鶏卵で増殖させる。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルスを、本明細書に記載の免疫原性
組成物中でのその使用の前に、発育鶏卵で増殖させない。別の具体的な実施態様において
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む生ウイルス
を、本明細書に記載の免疫原性組成物中でのその使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不
死化ヒト細胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 07/045
674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号参照)、イヌ腎臓細胞、例えば、MDC
K細胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 08/032219号と
して公開された国際出願PCT/IB2007/003536号参照)、Vero細胞、PerC.6細胞、又はアヒル
細胞、例えば、EB66細胞で増殖させる。
対象でのウイルスの増殖は、自然感染で起こるものと同様の種類及び程度の長期刺激を
もたらし、そのため、かなりの長期持続性免疫を付与することができるので、対象への投
与用の生ウイルスを含む免疫原性組成物が好ましい場合がある。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む一価の生ウイルスワクチンである。具体的
な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノムを含むウイルスを含む一価の生ウ
イルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH
5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む一価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、
本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば
、第5.1節に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲ
ノムを含有し及び/又は該ゲノムを含むウイルスを含む生ウイルスワクチンである。別の
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価の
生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは
、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH7/1キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲ
ノム含むウイルスを含む一価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例
えば、第5.1節に記載のB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価の生ウイルスワクチンである
。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価
の生ウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。ある実施態様において、本明細書
に提供されるのは、2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価の生
ウイルスワクチンであり、ここで、該2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘッドドメ
インを含み、かつ該2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの各々は、2つの
異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを
含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、2つの異な
るインフルエンザ株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施態様において、本明
細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードす
るゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む
二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイル
スワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルス並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコード
するゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンで
ある。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウ
イルス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを
含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含
むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本
明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコード
するゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含
む二価の生ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的
な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイ
ルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書
に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲ
ノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価
の生ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的
な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイ
ルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的
な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の
生ウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む三価の生ウイルスワクチンである。ある実施態様において、本明細書
に提供されるのは、3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価の生
ウイルスワクチンであり、ここで、該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘッドドメ
インを含み、かつ該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの各々は、3つの
異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステムドメインを
含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、3つの異な
るインフルエンザウイルス株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
コードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、
並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH5/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の生ウイルスワクチンである
。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の生ウイルス
ワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の生ウイルス
ワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲ
ノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲ
ノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三
価の生ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される
のは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
コードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/Bキメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイ
ルスを含む三価の生ウイルスワクチンである。ある実施態様において、本明細書に提供さ
れるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含
有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の生ウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、生ウイルスワクチンの一部であるキメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドは、生ウイルスの表面(例えば、生インフルエンザウイルスの表面)
に見出される及び/又は発現される。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される生ウイルスワクチンは、A/ベトナム
/1203/2004(H5)の球状ヘッドドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。別の
具体的な実施態様において、本明細書に提供される生ウイルスワクチンは、A/パース/16/
2009(H3)のステムドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
コードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される生ウイルスワクチンは、A/マガモ/
アルバータ/24/2001(H7)の球状ヘッドドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まな
い。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される生ウイルスワクチンは、A/パ
ース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。
(5.10.3 不活化ウイルスワクチン)
一実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む不活化ウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、
ワクチン)である。具体的な実施態様において、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、膜結合型である。特定の実施態様において、不活化ウイルスは、上の第5.
4節に記載されているような、インフルエンザウイルスである。他の実施態様において、
不活化ウイルスは、上の第5.5節に記載されているような、非インフルエンザウイルスで
ある。いくつかの実施態様において、免疫原性組成物は、本明細書に記載の2つ、3つ、4
つ、又はそれより多くの異なるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む
、2つ、3つ、4つ、又はそれより多くの不活化ウイルスを含む。ある実施態様において、
不活化ウイルス免疫原性組成物は、1以上のアジュバントを含む。
当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドを含むウイルスを不活化することができる。一般的な方法は、不活化のため
にホルマリン、熱、又は洗剤を使用する。例えば、引用により完全に本明細書中に組み込
まれる、米国特許第6,635,246号を参照されたい。他の方法としては、引用により完全に
本明細書中に組み込まれる、米国特許第5,891,705号;第5,106,619号及び第4,693,981号に
記載されているものが挙げられる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫原性組成物の各用量が、約7.
5μg〜約90μg又は約15〜約60μgの本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチド、約1.0〜約5.0mgの塩化ナトリウム、約20〜約100μgの一塩基リン酸ナト
リウム、約100〜約500μgのリン酸水素ナトリウム、約5〜約30μgのリン酸二水素カリウ
ム、約5〜約30μgの塩化カリウム、及び約0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを含むような
、不活化インフルエンザウイルスを含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。いく
つかの実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml又は単一
の0.5mlの用量としてパックされる。他の実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワ
クチン)は、多用量製剤としてパックされる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、免疫原性組成物の各用量が、1用
量当たり、約7.5μg〜約90μg又は約15〜約60μgの本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、約0.001％〜0.01％のチメロサール、約1.0〜約5.0mgの
塩化ナトリウム、約20〜約100μgの一塩基リン酸ナトリウム、約100〜約500μgのリン酸
水素ナトリウム、約5〜約30μgのリン酸二水素カリウム、約5〜約30μgの塩化カリウム、
及び約0.5〜約3.0μgの塩化カルシウムを含むような、不活化インフルエンザウイルスを
含む免疫原性組成物(例えば、ワクチン)である。いくつかの実施態様において、免疫原性
組成物(例えば、ワクチン)は、単一の0.25ml又は単一の0.5mlの用量としてパックされる
。他の実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、多用量製剤としてパッ
クされる。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)
は、単一の0.25ml用量としてパックされ、1用量当たり、22.5μgの本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、2.05mgの塩化ナトリウム、40μgの一塩
基リン酸ナトリウム、150μgのリン酸水素ナトリウム、10μgのリン酸二水素カリウム、1
0μgの塩化カリウム、及び0.75μgの塩化カルシウムを含む。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される免疫原性組成物(例えば、ワクチン)
は、単一の0.5ml用量としてパックされ、1用量当たり、45μgの本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リ
ン酸ナトリウム、300μgのリン酸水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μg
の塩化カリウム、及び1.5μgの塩化カルシウムを含む。
具体的な実施態様において、免疫原性組成物(例えば、ワクチン)は、5.0mlのワクチン(
1用量当たり、0.5ml)を含むか又はそれからなる多用量製剤としてパックされ、1用量当た
り、24.5μgの水銀(チメロサール由来)、45μgの本明細書に記載のキメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチド、4.1mgの塩化ナトリウム、80μgの一塩基リン酸ナトリウム
、300μgのリン酸水素ナトリウム、20μgのリン酸二水素カリウム、20μgの塩化カリウム
、及び1.5μgの塩化カルシウムを含む。
具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性
組成物中での使用の前に、発育鶏卵で増殖させる。別の具体的な実施態様において、本明
細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む不活化ウイルスを
、その不活化及びその後の本明細書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、発育鶏卵
で増殖させない。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む不活化ウイルスを、その不活化及びその後の本明細
書に記載の免疫原性組成物中での使用の前に、哺乳動物細胞、例えば、不死化ヒト細胞(
例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 07/045674号として公
開された国際出願PCT/EP2006/067566号参照)、イヌ腎臓細胞、例えば、MDCK細胞(例えば
、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、国際公開WO 08/032219号として公開され
た国際出願PCT/IB2007/003536号参照)、Vero細胞、PerC.6細胞、又はアヒル細胞、例えば
、EB66細胞で増殖させる。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む一価の不活化ウイルスワクチンである。具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価の不
活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるの
は、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/3
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む一価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド(例えば、第5.1節に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコ
ードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価の不活化ウイルスワ
クチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/Bキメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウ
イルスを含む一価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本
明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、
第5.1節に記載のcH7/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノ
ムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価の不活化ウイルスワクチンである
。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cB/Bキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のB/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価
の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のc
H4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルスを含む一価の不活化ウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるのは、2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む二価
の不活化ウイルスワクチンであり、ここで、該2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘ
ッドドメインを含み、かつ該2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの各々
は、2つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステム
ドメインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、
2つの異なるインフルエンザ株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施態様にお
いて、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド
をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/3キメラインフル
エンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイ
ルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明
細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードす
るゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む
二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを
含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活
化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは
、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/
又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
コードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/
Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにc
H5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様におい
て、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを
コードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
スを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにc
H7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにc
B/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は
該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二
価の不活化ウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む三価の不活化ウイルスワクチンである。ある実施態様において、本明
細書に提供されるのは、3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む三価
の不活化ウイルスワクチンであり、ここで、該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集素球状ヘ
ッドドメインを含み、かつ該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの各々
は、3つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集素ステム
ドメインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインは、
3つの異なるインフルエンザウイルス株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH5/3キメライン
フルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含む
ウイルス、並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノ
ムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の不活化ウイルスワクチンである
。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の不活化ウイ
ルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/
1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルス、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む
三価の不活化ウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の不活化ウイ
ルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/
1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む
三価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを
含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含
むウイルスを含む三価の不活化ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において
、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコ
ードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価の不活化ウイルスワ
クチンである。
具体的な実施態様において、不活化ウイルスワクチンの一部であるキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドは、不活化ウイルスの表面(例えば、不活化インフルエンザウ
イルスの表面)に見出される及び/又は発現される。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される不活化ウイルスワクチンは、A/ベト
ナム/1203/2004(H5)の球状ヘッドドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される不活化ウイルスワクチンは、A/パ
ース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペ
プチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。
具体的な実施態様において、本明細書に提供される不活化ウイルスワクチンは、A/マガ
モ/アルバータ/24/2001(H7)の球状ヘッドドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含ま
ない。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供される不活化ウイルスワクチンは
、A/パース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない。
(5.10.4 スプリットウイルスワクチン)
一実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドを含む免疫原性組成物は、スプリットウイルスワクチンである。いくつかの実施態様
において、スプリットウイルスワクチンは、本明細書に記載の2つ、3つ、4つ、又はそれ
より多くの異なるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。ある実施態
様において、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、膜結合型である/膜
結合型であった。ある実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、1以上のアジ
ュバントを含む。
スプリットウイルスワクチンの産生技術は当業者に公知である。非限定的な例として、
インフルエンザウイルススプリットワクチンは、洗剤で破壊された不活化粒子を用いて調
製することができる。本明細書に記載の方法による使用に適合させることができるスプリ
ットウイルスワクチンの一例は、筋肉内使用のためのfluzone(登録商標)インフルエンザ
ウイルスワクチン(ゾーン精製、サブビリオン)であり、これを、発育鶏卵で増殖させたイ
ンフルエンザウイルスから調製される滅菌懸濁剤として製剤化する。ウイルス含有液を回
収し、ホルムアルデヒドで不活化する。インフルエンザウイルスを、連続フロー遠心分離
機を用いて、線形ショ糖密度勾配溶液中で濃縮し、精製する。その後、ウイルスを、非イ
オン性界面活性剤、オクトキシノール-9(Triton(登録商標) X-100−Union Carbide社の登
録商標)を用いて化学的に破壊し、「スプリットウイルス」を生じさせる。その後、この
スプリットウイルスを、化学的手段によってさらに精製し、リン酸ナトリウム緩衝等張塩
化ナトリウム溶液に懸濁させる。
ある実施態様において、本明細書に提供されるのは、約7.5μg〜約90μg又は約10μg〜
約60μgの本明細書に記載の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、
約0.01〜約1.0mgのオクトキシノール-10(TRITON X-100(登録商標))、約0.5〜0.5mgのα-
トコフェリルハイドロジェンスクシネート、約0.1〜1.0mgのポリソルベート80(Tween 80)
、約0.001〜約0.003μgのヒドロコルチゾン、約0.05〜約0.3μgの硫酸ゲンタマイシン(ge
ntamcin)、約0.5〜約2.0μgの鶏卵タンパク質(オボアルブミン)、約25〜75μgのホルムア
ルデヒド、及び約25〜75μgのデオキシコール酸ナトリウムを含むスプリットウイルスワ
クチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワクチンは、45
μgの本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、0.085mg以下
のオクトキシノール-10(TRITON X-100(登録商標))、0.1mg以下のα-トコフェリルハイド
ロジェンスクシネート、0.415mg以下のポリソルベート80(Tween 80)、0.0016μg以下のヒ
ドロコルチゾン、0.15μg以下の硫酸ゲンタマイシン、1.0以下の鶏卵タンパク質(オボア
ルブミン)、50μg以下のホルムアルデヒド、及び50μg以下のデオキシコール酸ナトリウ
ムを含む0.5ml用量を含むか又はそれからなる。いくつかの実施態様において、0.5ml用量
のサブユニットワクチンは、充填済み注射器にパックされる。
具体的な実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させたイ
ンフルエンザウイルスを用いて調製される。別の具体的な実施態様において、スプリット
ウイルスワクチンは、発育鶏卵で増殖させなかったインフルエンザウイルスを用いて調製
される。別の具体的な実施態様において、スプリットウイルスワクチンは、哺乳動物細胞
、例えば、不死化ヒト細胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、WO 07
/045674号として公開された国際出願PCT/EP2006/067566号参照)、イヌ腎臓細胞、例えば
、MDCK細胞(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、WO 08/032219号とし
て公開された国際出願PCT/IB2007/003536号参照)、Vero細胞、PerC.6細胞、又はアヒル細
胞、例えば、EB66細胞で増殖させたインフルエンザウイルスを用いて調製される。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む一価のスプリットウイルスワクチンである
。具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価
のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記
載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価のスプリットウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポ
リペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価のス
プリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供され
るのは、cH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のc
H5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルスを含む一価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のcH7/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価のスプリッ
トウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは
、cB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(例えば、第5.1節に記載のB/Bキメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノ
ム含むウイルスを含む一価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド(例えば、第5.1節に記載のcH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド)をコ
ードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む一価のスプリットウイル
スワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。ある実施態様において、
本明細書に提供されるのは、2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む
二価のスプリットウイルスワクチンであり、ここで、該2つのキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集
素球状ヘッドドメインを含み、かつ該2つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの各々は、2つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集
素ステムドメインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメ
インは、2つの異なるインフルエンザ株、亜型、又は群由来のものである。具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/3キメラ
インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様に
おいて、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/3キメラインフ
ルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウ
イルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において
、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコ
ードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH5/Bキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス
を含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明
細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードす
るゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスをコー
ドするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルス
ワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲ
ノム含むウイルス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチ
ンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別
の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並
びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにc
H7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにcB/Bキ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲ
ノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別
の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並
びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の具
体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並びにc
B/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は
該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有
し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別
の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス並
びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び
/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH7/Bキメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス並びにcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し
及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む二価のスプリットウイルスワクチンである。別の
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含
む二価のスプリットウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム
含むウイルスを含む三価のスプリットウイルスワクチンである。ある実施態様において、
本明細書に提供されるのは、3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含む
三価のスプリットウイルスワクチンであり、ここで、該3つのキメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチドは、あるインフルエンザウイルス由来の同じインフルエンザ血球凝集
素球状ヘッドドメインを含み、かつ該3つのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの各々は、3つの異なるインフルエンザウイルス由来の異なるインフルエンザ血球凝集
素ステムドメインを含む。ある実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ステムドメ
インは、3つの異なるインフルエンザウイルス株、亜型、又は群由来のものである。具体
的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH5/3キ
メラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲ
ノム含むウイルス、並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコード
するゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価のスプリットウイルスワ
クチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメ
ラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノ
ム含むウイルス、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノ
ムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価
のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供
されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを
含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/Bキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含
むウイルスを含む三価のスプリットウイルスワクチンである。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエ
ンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイル
ス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及
び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価のスプリット
ウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、
cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又
は該ゲノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコード
するゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcH7/Bキメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを
含む三価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施態様において、本明細
書に提供されるのは、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードする
ゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、cH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素
ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルス、並びにcB/B
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該
ゲノム含むウイルスを含む三価のスプリットウイルスワクチンである。別の具体的な実施
態様において、本明細書に提供されるのは、cH4/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリ
ペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含む三価のスプ
リットウイルスワクチンである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワクチンは、A/
ベトナム/1203/2004(H5)の球状ヘッドドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝
集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まな
い。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワクチン
は、A/パース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集
素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含まない
。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワクチンは、A/
マガモ/アルバータ/24/2001(H7)の球状ヘッドドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ
血球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを
含まない。別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるスプリットウイルスワ
クチンは、A/パース/16/2009(H3)のステムドメインを含むcH7/3キメラインフルエンザ血
球凝集素ポリペプチドをコードするゲノムを含有し及び/又は該ゲノム含むウイルスを含
まない。
(5.10.5 アジュバント)
ある実施態様において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含むか、又はそれ
と併用投与される。本明細書に記載の組成物との併用投与のためのアジュバントは、該組
成物の投与前に、それと同時に、又はその後に投与されてもよい。いくつかの実施態様に
おいて、「アジュバント」という用語は、本明細書に記載の組成物とともに又はその一部
として投与した場合、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドに対する免疫応答を強化し、増強し、及び/又は増進させるが、その化合物を単独で投
与した場合、該ポリペプチドに対する免疫応答を生じさせない化合物を指す。いくつかの
実施態様において、アジュバントは、該ポリペプチドに対する免疫応答を生じさせ、アレ
ルギーも他の有害反応も生じさせない。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、B細胞
及び/又はT細胞の刺激、並びにマクロファージの刺激を含むいくつかの機構によって、免
疫応答を増強することができる。
ある実施態様において、アジュバントは、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペ
プチドに対する固有の応答を、該応答の定性的形態に影響を及ぼす該ポリペプチドの立体
構造変化を引き起こすことなく強化する。アジュバントの具体的な例としては、アルミニ
ウム塩(ミョウバン)(例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、及び硫酸アル
ミニウム)、3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)(GB 2220211号参照)、MF59(Novart
is)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、ポリソルベート80(Tween 80; IC
L Americas社)、イミダゾピリジン化合物(国際公開WO 2007/109812号として公開された国
際出願PCT/US2007/064857号参照)、イミダゾキノキサリン化合物(国際公開WO 2007/10981
3号として公開された国際出願PCT/US2007/064858号参照)、Matrix-M(iscanova)、MVA(the
Jenner Institute、Oxford)、ISCOMATRIX(CSL Behring)、AddaVax(Invivogen)、ポリI:C
(Invivogen)、センダイウイルスCantell株欠陥干渉RNA由来のインビトロ転写されたRNAヘ
アピン、及びサポニン、例えば、QS21(Kensilらの文献、ワクチンの設計:サブユニット及
びアジュバント手法(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach)(Powell及び
Newman編、Plenum Press, NY, 1995);米国特許第5,057,540号参照)が挙げられるが、これ
らに限定されない。いくつかの実施態様において、アジュバントは、フロイントアジュバ
ント(完全又は不完全)である。他のアジュバントは、任意に免疫賦活剤、例えば、モノホ
スホリル脂質Aと組み合わせた、水中油型エマルジョン(例えば、スクアレン又はピーナッ
ツ油)である(Stouteらの文献、N. Engl. J. Med. 336, 86-91(1997)参照)。別のアジュバ
ントは、CpGである(Bioworld Today, 1998年11月15日)。そのようなアジュバントは、他
の特定の免疫刺激剤、例えば、MPLもしくは3-DMP、QS21、重合体もしくは単量体のアミノ
酸、例えば、ポリグルタミン酸もしくはポリリジン、又は上の第5.4節に記載されている
他の免疫増強剤とともに、又はそれらなしで使用することができる。別の実施態様におい
て、アジュバントは、物理的アジュバント、例えば、マイクロニードル及びマイクロニー
ドルパッチである。別の実施態様において、アジュバントは、Toll様受容体(TLR)刺激分
子、例えば、フラジェリン(McSorleyらの文献、2002. J. Immunol. 169:3914-3919)であ
る。本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの異なる製剤は
、異なるアジュバントを含んでいてもよく、又は同じアジュバントを含んでいてもよいこ
とを理解すべきである。
(5.11 予防的及び治療的使用)
一態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の活性化合物(例えば、
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペ
プチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例
えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は
組成物(例えば、ワクチン製剤)を利用して、対象の免疫応答を誘導する方法である。具体
的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドに対
する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメライン
フルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド又はその免疫原性組成物(例えば、そのワクチン
製剤)の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウ
イルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対
象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする
核酸又はその免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対
象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は
、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含有もしくは発現するウイルスベクター又はその免疫原性組成物の有効量を投
与することを含む。さらに別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝
集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細
書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細胞又はその
医薬組成物の有効量を投与することを含む。ある実施態様において、本方法で使用される
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、哺乳動物細胞、
植物細胞、又は昆虫細胞に由来する本明細書に記載の精製されたキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチドである。
具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに
対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のサブユニ
ットワクチン(第5.10.1節参照)を投与することを含む。別の実施態様において、対象のイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それ
を必要とする対象に、本明細書に記載の生ウイルスワクチン(第5.10.2節参照)を投与する
ことを含む。特定の実施態様において、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。
別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する
免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルス
ワクチン(第5.10.3節参照)を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフ
ルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必
要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイルスワクチン(第5.10.4節参照)を投与
することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス血球凝集素ポリ
ペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載
のウイルス様粒子ワクチン(第5.6節参照)を投与することを含む。別の実施態様において
、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する方法は、それを必
要とする対象に、本明細書に記載のウイロソーム(第5.6節参照)を投与することを含む。
別の実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ポリペプチドに対する免疫応答を誘導
する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集
素(HA)ポリペプチドを発現するか又は発現するように改変された細菌又はその組成物(第5
.7節参照)を投与することを含む。ある実施態様において、本方法で使用される本明細書
に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、哺乳動物細胞、植物細胞
、又は昆虫細胞に由来する本明細書に記載の精製されたキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチドである。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物(例えば
、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの任意の亜型
又は株によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するの
に有効である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(
例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの同じ
亜型内の1以上の株によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は
治療するのに有効である。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又
は組成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイル
スの同じ亜型の複数の株によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び
/又は治療するのに有効である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物(例えば
、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、(i)H1N1及びH1N2亜型;(ii)H1N1及びH3N
1亜型;(iii)H1N2及びH3N2亜型;並びに/又は(iv)(i)〜(iii)とB型インフルエンザの組合せ
のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療す
るのに有効である。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製
剤)によって誘導される免疫応答は、一方のHAグループ(例えば、H1、H2、H5、H6、H8、H9
、H11、H12、H13、H16、H17、及びH18を含むグループ1)に属し、もう一方のHAグループ(
例えば、H3、H4、H7、H10、H14、及びH15を含むグループ2)に属さないインフルエンザウ
イルスの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療
するのに有効である。例えば、誘導される免疫応答は、H11、H13、H16、H9、H8、H12、H6
、H1、H5、及び/又はH2からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引
き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効であり得る
。或いは、誘導される免疫応答は、H3、H4、H14、H10、H15、及び/又はH7からなるHAグル
ープに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感
染を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。いくつかの実施態様において、本明細
書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は
、インフルエンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの亜型によって引き起こされ
るインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。ある実施態様
において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導
される免疫応答は、インフルエンザウイルスの6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14
、又は15の亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治
療するのに有効である。具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組
成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、H1 HAグループに属するイ
ンフルエンザウイルスの1つ、2つ、もしくはそれより多くの株、及び/又はH2 HAグループ
に属するインフルエンザウイルスの1つ、2つ、もしくはそれより多くの株によって引き起
こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。別の具
体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製
剤)によって誘導される免疫応答は、H1 HAグループに属するインフルエンザウイルスの1
つ、2つ、もしくはそれより多くの株; H3 HAグループに属するインフルエンザウイルスの
1つ、2つ、もしくはそれより多くの株;及び/又は1つ、2つ、もしくはそれより多くのB型
インフルエンザウイルス株によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及
び/又は治療するのに有効である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物(例えば
、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、H1N1亜型とH2N2亜型の両方によって引
き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。他
の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)に
よって誘導される免疫応答は、H1N1亜型とH2N2亜型の両方によって引き起こされるインフ
ルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効ではない。いくつかの実施態様
において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導
される免疫応答は、H1N1、H2N2、及びH3N2亜型によって引き起こされるインフルエンザウ
イルス感染を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実施態様において、本
明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応
答は、H3N2亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治
療するのに有効である。他の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物
(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、H3N2亜型によって引き起こされ
るインフルエンザウイルス感染を予防及び/又は治療するのに有効ではない。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製
剤)によって誘導される免疫応答は、一方のHAグループに属し、もう一方のHAグループに
属さないインフルエンザウイルスの亜型によって引き起こされるインフルエンザウイルス
疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。例えば、誘導される免疫応答は、H11、H1
3、H16、H9、H8、H12、H6、H1、H5、及び/又はH2からなるHAグループに属するインフルエ
ンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療
するのに有効であり得る。或いは、誘導される免疫応答は、H3、H4、H14、H10、H15、及
び/又はH7からなるHAグループに属するインフルエンザウイルスによって引き起こされる
インフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効であり得る。いくつかの
実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によ
って誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの1つ、2つ、3つ、4つ、又は5つの
亜型のいずれかによって引き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治
療するのに有効である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物
(例えば、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの6つ
、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、又は15の亜型のいずれかによって引き起こされ
るインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。いくつかの実
施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物(例えば、ワクチン製剤)によっ
て誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルスの同じ亜型内の1以上の株によって引
き起こされるインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療するのに有効である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物(例えば
、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に起
因する症状を軽減するのに有効である。インフルエンザウイルス疾患/感染の症状として
は、体の痛み(特に、関節及び咽喉)、発熱、吐き気、頭痛、ひりひり痛む目、疲労、咽喉
炎、赤くなった目又は皮膚、並びに腹痛が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物(例えば
、ワクチン製剤)によって誘導される免疫応答は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹
患している対象の入院を減少させるのに有効である。いくつかの実施態様において、本明
細書に記載の活性化合物又は組成物に(例えば、ワクチン製剤)よって誘導される免疫応答
は、インフルエンザウイルス疾患/感染に罹患している対象の入院期間を短縮するのに有
効である。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の活性化合物(例えば
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(
例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又
は組成物(例えば、ワクチン製剤)を利用して、対象のインフルエンザウイルス感染を予防
及び/又は治療する方法である。一実施態様において、対象のインフルエンザウイルス感
染を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、その
ようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター、又は上記のいずれか1つの組成物
を投与することを含む。具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス感染
を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のサブユニットワ
クチン、生ウイルスワクチン、不活化ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、
又はウイルス様粒子ワクチンを投与することを含む。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような
ポリペプチド含有もしくは発現するベクター、もしくはそのようなポリペプチドで刺激さ
れた細胞、又は本明細書に記載の組成物(例えば、ワクチン製剤)を利用して、対象のイン
フルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法である。具体的な実施態様におい
て、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対
象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド又はその免疫
原性組成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエン
ザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸又はその免疫原性組
成物の有効量を投与することを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイ
ルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド含有もしくは発現するウイルスベクター又は
その免疫原性組成物の有効量を投与することを含む。さらに別の実施態様において、対象
のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、それを必要とする対象に、本
明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細胞又は
その医薬組成物の有効量を投与することを含む。
具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載されるサブユニットワクチンを投与する
ことを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療
する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の生ウイルスワクチンを投与する
ことを含む。特定の実施態様において、生ウイルスワクチンは、弱毒化ウイルスを含む。
別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法は、
それを必要とする対象に、本明細書に記載の不活化ウイルスワクチンを投与することを含
む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法
は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のスプリットウイルスワクチンを投与する
ことを含む。別の実施態様において、インフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイルス様粒子ワクチンを投与するこ
とを含む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療す
る方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のウイロソームを投与することを含
む。別の実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方法
は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドを発現するかもしくは発現するように改変された細菌又はその組成物を投与す
ることを含む。
具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は治療する方
法は、多価ワクチン(例えば、二価又は三価ワクチン)をその対象に投与することを含み、
ここで、該多価ワクチンは、2以上のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含
む。ある実施態様において、第二の多価ワクチン(例えば、二価又は三価ワクチン)は、該
対象に、追加免疫として投与され、ここで、該第二の多価ワクチンは、2以上のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを含み、かつ該第二の多価ワクチンは、該第一の多
価ワクチンと異なっている。具体的な実施態様において、第二の多価ワクチンのキメライ
ンフルエンザ血球凝集素ポリペプチドは、該キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ドの血球凝集素球状ヘッドドメインに関して、第一の多価ワクチンのキメラインフルエン
ザ血球凝集素ポリペプチドと異なっている。ある実施態様において、第二の多価ワクチン
のキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの血球凝集素ステムドメインは、第一の
多価ワクチンのキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドの血球凝集素ステムドメイ
ンと同じである。
別の態様において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の中和抗体を投与する
ことによって対象のインフルエンザウイルス疾患を予防及び/又は治療する方法である(第
5.9節参照)。具体的な実施態様において、対象のインフルエンザウイルス疾患を予防又は
治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の中和抗体又はその医薬組成
物の有効量を投与することを含む。特定の実施態様において、該中和抗体は、モノクロー
ナル抗体である。ある実施態様において、該中和抗体は、CR8114、CR8020(Ekiertらの文
献、2011. Science. 333(6044): 843-850)、FI6(Cortiらの文献、2011. Science. 333(60
44) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669)、B型インフルエンザウイルスストークmAb
である3A2、10C4、もしくは5A7(Yasugiらの文献、2013. PLoS Pathog. 9(2): e1003150)
、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17、H40、A66、D80、E
88、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM BP-4516)、又はEkiert DCらの文献(2009
)、高度に保存されたインフルエンザウイルスエピトープの抗体認識(Antibody Recogniti
on of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope.)、Science(2009年2月26日にScien
ce Expressで発表された); Kashyapらの文献(2008)、トルコH5N1鳥インフルエンザ大発生
の生存者由来のコンビナトリアル抗体ライブラリーはウイルス中和戦略を明らかにする(C
ombinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influen
za outbreak reveal virus neutralization strategies.)、Proc Natl Acad Sci U S A 1
05: 5986-5991; Suiらの文献(2009)、鳥及びヒトA型インフルエンザウイルスの広域スペ
クトル中和のための構造及び機能的基礎(Structural and functional bases for broad-s
pectrum neutralization of avian and human influenza A virus.)、Nat Struct Mol Bi
ol 16: 265-273;米国特許第5,589,174号、第5,631,350号、第6,337,070号、及び第6,720,
409号;国際公開WO 2007/134237として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開
WO 2009/036157号として公開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/0289
46号として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号とし
て公開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載されている任意の他の抗体ではない。
他の実施態様において、該中和抗体は、Wangらの文献(2010)「異なる血球凝集素による連
続免疫後のH3インフルエンザウイルスに対する広域防御性モノクローナル抗体(Broadly P
rotective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequentia
l Immunization with Different Hemagglutinins)」、PLOS Pathogens 6(2):1-9に記載さ
れている抗体ではない。
ある実施態様において、本明細書に提供される、対象(例えば、ヒト又は非ヒト動物)の
インフルエンザウイルス疾患又は感染を予防又は治療する方法は、当業者に公知かつ本明
細書に記載のインビボ及びインビトロアッセイによって測定したとき、対象でのインフル
エンザウイルスの複製の低下をもたらす。いくつかの実施態様において、インフルエンザ
ウイルスの複製は、約1log以上、約2log以上、約3log以上、約4log以上、約5log以上、約
6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜
8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5lo
g、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8l
og、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、7〜9log、又は8〜9log低下する。
(5.11.1 併用療法)
様々な態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしく
は発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチド
で刺激された細胞、又は中和抗体は、1以上の他の療法(例えば、抗ウイルス療法、抗細菌
療法、又は免疫調節療法)との併用で対象に投与することができる。いくつかの実施態様
において、本明細書に記載の医薬組成物(例えば、免疫原性組成物)は、1以上の療法との
併用で対象に投与することができる。1以上の他の療法は、インフルエンザウイルス疾患
の治療もしくは予防に有益であることができるか、又はインフルエンザウイルス疾患と関
連する症状もしくは状態を改善することができる。いくつかの実施態様において、1以上
の他の療法は、鎮痛剤、解熱薬、又は呼吸を楽にするかもしくは助ける療法である。ある
実施態様において、療法は、5分未満の間隔、30分未満の間隔、1時間の間隔、約1時間の
間隔、約1〜約2時間の間隔、約2時間〜約3時間の間隔、約3時間〜約4時間の間隔、約4時
間〜約5時間の間隔、約5時間〜約6時間の間隔、約6時間〜約7時間の間隔、約7時間〜約8
時間の間隔、約8時間〜約9時間の間隔、約9時間〜約10時間の間隔、約10時間〜約11時間
の間隔、約11時間〜約12時間の間隔、約12時間〜18時間の間隔、18時間〜24時間の間隔、
24時間〜36時間の間隔、36時間〜48時間の間隔、48時間〜52時間の間隔、52時間〜60時間
の間隔、60時間〜72時間の間隔、72時間〜84時間の間隔、84時間〜96時間の間隔、又は96
時間〜120時間の間隔で投与される。具体的な実施態様において、2以上の療法が、同じ患
者(patent)診察時に投与される。
当業者に周知の任意の抗ウイルス剤を、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細
書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチド
をコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、
ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は医薬組
成物と併用することができる。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、その受容体へのウ
イルスの付着、細胞内へのウイルスの内在化、ウイルスの複製、又は細胞からのウイルス
の放出を阻害し及び/又は低下させる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タン
パク質 抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、及び小分子が挙げられる。特に、抗ウイ
ルス剤としては、ヌクレオシド類似体(例えば、ジドブジン、アシクロビル、ガンシクロ
ビル、ビダラビン、イドクスウリジン、トリフルリジン、及びリバビリン)、フォスカー
ネット、アマンタジン、ペラミビル、リマンタジン、サキナビル、インジナビル、リトナ
ビル、α-インターフェロン及び他のインターフェロン、AZT、ザナミビル(Relenza(登録
商標))、並びにオセルタミビル(Tamiflu(登録商標))が挙げられるが、これらに限定され
ない。他の抗ウイルス剤としては、インフルエンザウイルスワクチン、例えば、Fluarix(
登録商標)(GlaxoSmithKline)、FluMist(登録商標)(MedImmune Vaccines)、Fluvirin(登録
商標)(Chiron社)、Flulaval(登録商標)(GlaxoSmithKline)、Afluria(登録商標)(CSL Biot
herapies社)、Agriflu(登録商標)(Novartis)、又はFluzone(登録商標)(Aventis Pasteur)
が挙げられる。
具体的な実施態様において、抗ウイルス剤は、ウイルス抗原に特異的である免疫調節剤
である。特定の実施態様において、ウイルス抗原は、血球凝集素ポリペプチド以外のイン
フルエンザウイルスポリペプチドである。他の実施態様において、ウイルス抗原は、イン
フルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドである。
当業者に公知の任意の抗細菌剤を、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコ
ードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイ
ルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は医薬組成物
と併用することができる。抗細菌剤の非限定的な例としては、アミカシン、アモキシシリ
ン、アモキシシリン-クラブラン酸、アンホテリシンB、アンピシリン、アンピシリン(Amp
icllin)-スルバクタム、アプラマイシン、アジスロマイシン、アズトレオナム、バシトラ
シン、ベンジルペニシリン、カスポファンギン、セファクロル、セファドロキシル、セフ
ァレキシン、セファロチン、セファゾリン、セフジニル、セフェピム、セフィキシム、セ
フメノキシム、セフォペラゾン、セフォペラゾン-スルバクタム、セフォタキシム、セフ
ォキシチン、セフピロム、セフポドキシム、セフポドキシム-クラブラン酸、セフポドキ
シム-スルバクタム、セフプロジル、セフキノム、セフタジジム、セフチブテン(Ceftibut
in)、セフチオフル、セフトビプロール、セフトリアキソン、セフロキシム、クロラムフ
ェニコール、フロルフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフ
ロキサシン、クリンダマイシン、クロキサシリン、コリスチン、コトリモキサゾール(ト
リムトプリム/スルファメトキサゾール)、ダルババンシン、ダルフォプリスチン/キノプ
リスチン、ダプトマイシン、ジベカシン、ジクロキサシリン、ドリペネム、ドキシサイク
リン、エンロフロキサシン、エルタペネム、エリスロマイシン、フルクロキサシリン、フ
ルコナゾール、フルシトシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロ
キサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、イミペネム、イトラコナゾール、カナマ
イシン、ケトコナゾール、レボフロキサシン、リンコマイシン、リネゾリド、ロラカルベ
フ、メシルナム(アムジノシリン)、メロペネム、メトロニダゾール、メジオシリン、メズ
ロシリン-スルバクタム、ミノサイクリン、モキシフロキサシン、ムピロシン、ナリジキ
シン酸、ネオマイシン、ネチルマイシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフ
ロキサシン、オキサシリン、ペフロキサシン、ペニシリンV、ピペラシリン、ピペラシリ
ン-スルバクタム、ピペラシリン-タゾバクタム、リファンピシン、ロキシスロマイシン、
スパルフロキサシン、スペクチノマイシン、スピラマイシン、ストレプトマイシン、スル
バクタム、スルファメトキサゾール、テイコプラニン、テラバンシン、テリスロマイシン
、テモシリン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン-クラブラン酸、チゲサ
イクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トロバフロキサシン、タイロシン、バンコ
マイシン、バージニアマイシン、及びボリコナゾールが挙げられる。
いくつかの実施態様において、併用療法は、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチド又は本明細書に記載の1以上の発現ベクターによる能動免疫、
並びに本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを用いて作製
及び/又は同定された1以上の中和抗体による受動免疫を含む。いくつかの実施態様におい
て、併用療法は、本明細書に記載の1以上の発現ベクターによる免疫、及び本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細胞の投与(例えば
、養子移入によるもの)を含む。
いくつかの実施態様において、併用療法は、本明細書に記載の2以上の異なる発現ベク
ターの投与を含む。
いくつかの実施態様において、併用療法は、もう一方のHAグループ(例えば、グループ2
)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多くのHA亜型に対する免疫応答を誘導する活性化合物(
例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのよう
なポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクタ
ー(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞
)と併用した、一方のHAグループ(例えば、グループ1)の1つ、2つ、3つ、又はそれより多
くのHA亜型に対する免疫応答を誘導する活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、
そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもし
くは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)による能動免疫を含む。
いくつかの実施態様において、併用療法は、本明細書に記載の2以上のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドによる能動免疫を含む。
(5.11.2 患者集団)
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、未感作の対象
、すなわち、インフルエンザウイルス感染に起因する疾患を有していないか、又はインフ
ルエンザウイルス感染症に感染したことがなく、かつ現在それに感染していない対象に投
与することができる。一実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、
インフルエンザウイルス感染を獲得する危険のある未感作の対象に投与される。一実施態
様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、本明細書に記載のキメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが免疫応答を誘導する、特定のインフルエンザウイ
ルスによって引き起こされる疾患を有していないか、又は特定のインフルエンザウイルス
に感染したことがなく、かつそれに感染していない対象に投与される。本明細書に記載の
活性化合物又は組成物は、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが免疫応答
を誘導する、インフルエンザウイルス、又はインフルエンザウイルスの別の型、亜型、も
しくは株に感染している対象、及び/或いはそれらに感染したことがある対象に投与する
ことができる。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、インフルエン
ザウイルス感染と診断された患者に投与される。いくつかの実施態様において、本明細書
に記載の活性化合物又は組成物は、症状が現われるか又は症状が重くなる前に(例えば、
患者が入院を必要とする前に)、インフルエンザウイルス感染患者に投与される。いくつ
かの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、該活性化合物又は組
成物のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのヘッドドメインが由来したイ
ンフルエンザウイルスの型と異なる型のインフルエンザウイルスに感染しているか、又は
そう診断された患者に投与される。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、キメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのヘッドドメインのHAグループと同じHAグループに
属するインフルエンザウイルスに感染している可能性があるか又はそれに感染している患
者に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、キ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのヘッドドメインの亜型と同じ亜型のイ
ンフルエンザウイルスに感染している可能性があるか又はそれに感染している患者に投与
される。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与され
るべき対象は、動物である。ある実施態様において、該動物は、鳥である。ある実施態様
において、該動物は、イヌである。ある実施態様において、該動物は、ネコである。ある
実施態様において、該動物は、ウマである。ある実施態様において、該動物は、ウシであ
る。ある実施態様において、該動物は、哺乳動物、例えば、ウマ、ブタ、マウス、又は霊
長類、好ましくは、ヒトである。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき
対象は、ヒト成人である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成
物が投与されるべき対象は、50歳を超えるヒト成人である。ある実施態様において、本明
細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、高齢のヒト対象である。
ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与されるべき
対象は、ヒト小児である。ある実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成
物が投与されるべき対象は、ヒト乳児である。ある実施態様において、本明細書に記載の
活性化合物又は組成物が投与される対象は、月齢6カ月未満の乳児ではない。具体的な実
施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、2歳
以下のヒトである。別の具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組
成物が投与されるべき対象は、5歳以下のヒトである。別の具体的な実施態様において、
本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべき対象は、1〜5歳のヒトである。
具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(すなわち、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与され
るべき対象は、月齢6カ月を超える任意の乳児又は小児及び50歳を超える任意の成人であ
る。他の実施態様において、該対象は、妊娠個体である。別の実施態様において、該対象
は、インフルエンザシーズン(例えば、通常、北半球の11月から4月)中に妊娠の可能性又
はその予定がある個体である。具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物
又は組成物が投与されるべき対象は、1、2、3、4、5、6、7、又は8週間前に出産した女性
である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与され
るべきヒト対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因
する疾患の危険が高い任意の個体(例えば、免疫障害又は免疫不全個体)である。いくつか
の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象
は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因する疾患の危険
が高い個体(例えば、免疫障害又は免疫抑制個体)と密接に接触する任意の個体である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与され
るべきヒト対象は、インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス感染に起因
する合併症もしくは疾患に対する感受性を増大させる任意の疾病に罹患した個体である。
他の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物は、インフルエンザウイ
ルス感染によって、個体が罹患するか又は個体が危険に暴露される別の疾病の合併症が増
加する可能性を有する対象に投与される。特定の実施態様において、インフルエンザウイ
ルス合併症に対する感受性を増大させる疾病、又はインフルエンザウイルスによってその
疾病と関連する合併症が増加する疾病は、例えば、肺を侵す疾病、例えば、嚢胞性線維症
、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、喘息、又は細菌感染症(例えば、インフルエンザ菌(Ha
emophilus influenzae)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、レジオネラ・ニュ
ーモフィラ(Legionella pneumophila)、及びトラコーマ病原体(Chlamydia trachomatus)
によって引き起こされる感染症);心血管疾患(例えば、先天性心臓疾患、鬱血性心不全、
及び冠動脈疾患);内分泌障害(例えば、糖尿病)、神経学的障害及びニューロン発達障害(
例えば、脳、脊髄、末梢神経、及び筋肉の障害(例えば、脳性麻痺、癲癇(発作性疾患)、
脳卒中、知的障害(例えば、精神遅滞)、筋ジストロフィー、及び脊髄損傷))である。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物が投与され
るべきヒト対象は、グループホーム、例えば、老人ホームに在住する個体である。いくつ
かの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対
象は、グループホーム、例えば、老人ホームで勤務するか、又はそこでかなりの時間を過
ごす。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与され
るべきヒト対象は、医療従事者(例えば、医師又は看護士)である。いくつかの実施態様に
おいて、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与されるべきヒト対象は、喫煙者で
ある。具体的な実施態様において、本明細書に記載の活性化合物又は組成物が投与される
べきヒト対象は、免疫障害又は免疫抑制を起こしている。
さらに、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような
ポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、
そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物を投与することができる、インフ
ルエンザの合併症を発症する危険が高い対象には、以下の者が含まれる:合併症の危険が
高い者にインフルエンザウイルスを伝染させることができる個体、例えば、6カ月未満の
乳児を含むことになる家族を含む、高リスク個体がいる家族の構成員、6カ月未満の乳児
と接触する個体、又は老人ホームもしくは他の長期介護施設に住む個体と接触する個体;
長期にわたる肺、心臓、又は循環障害を有する個体;代謝性疾患(例えば、糖尿病)を有す
る個体;腎臓障害を有する個体;血液障害(貧血又は鎌状赤血球症を含む)を有する個体;弱
くなった免疫系(医薬品、悪性腫瘍、例えば、癌、臓器移植、又はHIV感染に起因する免疫
抑制を含む)を有する個体;長期アスピリン療法を受けている(そのため、インフルエンザ
に感染した場合、ライ症候群を起こす可能性が高い)小児。
他の実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核
酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクター
もしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物の投与の対象には
、以下の、生後6カ月以上の健康な個体が含まれる:4月から9月にかけて、例えば、熱帯地
方及び南半球などの、インフルエンザの大発生が起こり得る外国及び地域に旅行する予定
のある者;インフルエンザウイルスが循環している世界の地域から来た者を含む可能性が
ある大きな組織的観光団の一員として旅行する者;学校もしくは大学に通い、寄宿舎に住
むか、もしくは施設環境に住む者;又は自分がインフルエンザで病気になる危険を減らし
たい者。
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載
のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベ
クターもしくは細菌)、そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物の投与が禁
忌である対象には、インフルエンザワクチン接種が禁忌である以下の任意の個体が含まれ
る:生後6カ月未満の乳児;及び免疫原性製剤の生産で使用される卵、卵製品、又は他の成
分に対してアナフィラキシー反応(ショックが続発することが多い呼吸困難を引き起こす
アレルギー反応)を経験したことがある個体。ある実施態様において、本明細書に記載の
活性化合物又は組成物の投与が、免疫原性製剤の生産で使用される1以上の成分のために(
例えば、卵又は卵製品の存在のために)禁忌である場合、活性化合物又は組成物を、該活
性化合物又は組成物の投与を禁忌にする成分を含まない方法で生産することができる(例
えば、該活性化合物又は組成物を、卵又は卵製品を使用しないで生産することができる)
。
いくつかの実施態様において、以下の患者集団の1つ又は複数に生ウイルスワクチンを
投与しないことが望ましい場合がある:高齢者;生後6カ月未満の乳児;妊娠個体; 1歳未満
の乳児; 2歳未満の小児; 3歳未満の小児; 4歳未満の小児; 5歳未満の小児; 20歳未満の成
人; 25歳未満の成人; 30歳未満の成人; 35歳未満の成人; 40歳未満の成人; 45歳未満の成
人; 50歳未満の成人; 70歳を超える高齢者; 75歳を超える高齢者; 80歳を超える高齢者;
85歳を超える高齢者; 90歳を超える高齢者; 95歳を超える高齢者;その年齢層でのアスピ
リン及び野生型インフルエンザウイルス感染と関連する合併症が理由で、アスピリンもし
くはアスピリン含有医薬品を服用している小児及び若者(2〜17歳);喘息又は他の反応性気
道疾患の病歴がある個体;重度のインフルエンザ感染の素因となり得る慢性の医学的基礎
疾患を有する個体;ギランバレー症候群の病歴がある個体;発熱を伴う急性の重篤な疾患を
有する個体;又は中程度もしくは重度の病気である個体。そのような個体については、本
明細書に記載の不活化ウイルスワクチン、スプリットウイルスワクチン、サブユニットワ
クチン、ウイロソーム、ウイルス様粒子、又は非ウイルスベクターの投与が好ましい場合
がある。ある実施態様において、生ウイルスワクチンを投与することが好ましい対象には
、2〜17歳の健康な小児及び若者、並びに18〜49歳の健康な成人が含まれ得る。
ある実施態様において、生ウイルスベクターを含む免疫原性製剤は、他の生ウイルスワ
クチンと同時に投与されない。
(5.12 投与様式)
(5.12.1 送達経路)
本明細書に記載の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプ
チド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのよう
なポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、種々の経路によって対象に送達するこ
とができる。これらには、鼻腔内、気管内、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内
、結膜内、及び皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様にお
いて、組成物は、局所投与用に、例えば、皮膚への塗布用に製剤化される。具体的な実施
態様において、投与経路は、例えば、鼻スプレーの一部としての、鼻腔内へのものである
。ある実施態様において、組成物は、筋肉内投与用に製剤化される。いくつかの実施態様
において、組成物は、皮下投与用に製剤化される。ある実施態様において、組成物は、注
射による投与用には製剤化されない。生ウイルスワクチンのための具体的な実施態様にお
いて、ワクチンは、注射以外の経路による投与用に製剤化される。
例えば、抗原が、ウイルスベクター、ウイルス様粒子ベクター、又は細菌ベクターであ
る場合、ベクターが由来する骨格ウイルス又は細菌の天然の感染経路から免疫原性組成物
を導入することが好ましいと考えられる。或いは、ポリペプチドが由来するインフルエン
ザウイルスの天然の感染経路から本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドを導入することが好ましい場合がある。激しい分泌性及び細胞性免疫応答を
誘導する抗原、特に、ウイルスベクターの能力を有利に使用することができる。例えば、
ウイルスベクターによる気道の感染は、インフルエンザウイルスからの防御を同時に伴っ
て、例えば、泌尿器系での強い分泌性免疫応答を誘導することができる。さらに、好まし
い実施態様において、任意の好適な経路によって医薬組成物を肺に導入することが望まし
い場合がある。肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー、及び噴霧剤として使用する
ためのエアゾール化剤を含む製剤の使用によって利用することもできる。
具体的な実施態様において、サブユニットワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態
様において、生インフルエンザウイルスワクチンは、鼻腔内投与される。別の実施態様に
おいて、不活化インフルエンザウイルスワクチン又はスプリットインフルエンザウイルス
ワクチンは、筋肉内投与される。別の実施態様において、ウイルス様粒子又はその組成物
は、筋肉内投与される。
いくつかの実施態様において、インビトロで本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチドで刺激された細胞は、当業者に公知の技術を用いて対象に導入
(又は再導入)することができる。いくつかの実施態様において、該細胞は、真皮内に、真
皮下に、又は末梢血流中に導入することができる。いくつかの実施態様において、対象に
導入される細胞は、有害な免疫応答を回避するために、その対象に由来する細胞であるこ
とが好ましい。他の実施態様において、同様の免疫バックグラウンドを有するドナー宿主
に由来する細胞を使用することもできる。有害な免疫原性応答を回避するように設計され
たものを含む、他の細胞を使用することもできる。
(5.12.2 投薬量及び投与頻度)
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患の治療及び/又は予防で
有効である活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチド含有
もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペ
プチドで刺激された細胞)又は組成物の量は疾患の性質によって決まり、標準的な臨床技
術によって決定することができる。
製剤で使用すべき正確な用量は、投与経路、及び感染又はそれに起因する疾患の重篤度
によっても決まり、臨床医の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。例え
ば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態(年齢、体重、健康を含む)、患
者がヒトであるか動物であるかということ、投与される他の医薬品、及び治療が予防的で
あるか治療的であるかということによって異なり得る。通常、患者はヒトであるが、トラ
ンスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療投薬量は、
安全性及び有効性を最適化するために最適に調節される。
ある実施態様において、最適な投薬量範囲の特定を助けるために、インビトロアッセイ
が利用される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られる用量応答曲線
から推定することができる。
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸
の例示的な用量の範囲は、患者1人当たり、約10ng〜1g、100ng〜100mg、1μg〜10mg、又
は30〜300μgの核酸、例えば、DNAである。
ある実施態様において、(例えば、スプリットウイルスワクチン及びサブユニットワク
チン中に提供される)本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドの例示的な用量の範囲は、患者1キログラム当たり、約0.5μg〜1.0μg、1.0μg〜2.0μ
g、2.0μg〜5.0μg、5.0μg〜10μg、15μg〜25μg、25μg〜50μg、50μg〜100μg、100
μg〜500μg、又は500μg〜1.0mgのキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドで
ある。他の実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドの例示的な用量の範囲は、1用量当たり、約0.5μg〜1.0μg、1.0μg〜2.0μg
、2.0μg〜5.0μg、5.0μg〜10μg、15μg〜25μg、25μg〜50μg、50μg〜100μg、100
μg〜500μg、250μg〜500μg、500μg〜1.0mg、又は750μg〜1mgのキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチドであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、3回、又
は4回以上、対象に投与することができる。
感染性ウイルスベクターの用量は、1用量当たり、ビリオン数が10〜100個、又はそれよ
り多くまで様々であることができる。いくつかの実施態様において、ウイルスベクターの
好適な投薬量は、102、5×102、103、5×103、104、5×104、105、5×105、106、5×106
、107、5×107、108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011、5×1011、
又は1012pfuであり、必要とされるだけの間隔で、1回、2回、3回、又はそれより多くの回
数、対象に投与することができる。
ある実施態様において、VLPの例示的な用量の範囲は、患者1キログラム当たり、約0.01
μg〜約100mg、約0.1μg〜約100mg、約5μg〜約100mg、約15μg〜約50mg、約15μg〜約25
mg、約15μg〜約10mg、約15μg〜約5mg、約15μg〜約1mg、約15μg〜約100μg、約15μg
〜約75μg、約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg、約15μg〜約45μg、約20μg〜約40μg
、又は約25〜約35μgである。
一実施態様において、不活化ワクチンは、それが約5μg〜約50μg、約10μg〜約50μg
、約15μg〜約100μg、約15μg〜約75μg、約15μg〜約50μg、約15μg〜約30μg、約20
μg〜約50μg、約25μg〜約40μg、約25μg〜約35μgのキメラインフルエンザ血球凝集素
(HA)ポリペプチドを含むように製剤化される。
ある実施態様において、活性化合物、すなわち、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような
ポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、
そのようなポリペプチドで刺激された細胞、又は組成物は、単一用量として1回、対象に
投与される。例えば、過去にインフルエンザに暴露されたことがない対象(例えば、高齢
対象)は、本明細書に記載の活性化合物又はその組成物の複数回の投与を必要とする場合
があるのではなく、むしろ、本明細書に記載の活性化合物又はその組成物による単回免疫
でワクチン接種が十分である場合がある。或いは、過去にインフルエンザに暴露されたこ
とがない対象(例えば、高齢対象)は、本明細書に記載の活性化合物又はその組成物の複数
回の投与を必要とする場合があるが、ワクチン接種が十分となるために、未感作の対象(
すなわち、過去にインフルエンザに暴露されたことがない対象)が必要とするほどは、そ
のような投与を必要としない場合がある。したがって、ある実施態様において、未感作の
対象は、本明細書に記載の活性化合物又はその組成物による第一の免疫(例えば、初回免
疫)、次いで、本明細書に記載の活性化合物又はその組成物による1回、2回、又はそれよ
り多くの回数のさらなる免疫(例えば、追加免疫)を必要とする場合がある。
具体的な実施態様において、対象に、本明細書に記載の複数の活性化合物又はその組成
物が連続して(例えば、免疫レジメンの一部として)投与される場合、後続の投与(すなわ
ち、第一の投与の後に行われる投与)で使用される活性化合物又はその組成物のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、第一の投与で使用される活性化合物又はそ
の組成物のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと異なっている。具体的な
実施態様において、後続の投与で使用される活性化合物又はその組成物のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、第一の投与で使用される活性化合物又はその組成
物のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと異なる球状ヘッドドメインを含
むが、第一の投与で使用される活性化合物又はその組成物のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドと同じHAステムドメインを含むが、同じHAステムドメインを含む。
具体的な実施態様において、後続の投与で使用される活性化合物又はその組成物のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、第一の投与で使用される活性化合物又は
その組成物のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと異なる球状ヘッドドメ
イン及び異なるHAステムドメインを含む。
ある実施態様において、活性化合物又は組成物(例えば、活性化合物を含む組成物)は、
単一用量として、次いで3〜6週間後に第二の用量として、対象に投与される。ある実施態
様において、活性化合物又は組成物は、単一用量として、次いで3〜6週間後に第二の用量
として、対象に投与され、次いで3〜6週間後に、第三の用量が投与される。ある実施態様
において、第二及び/又は第三の投与は、異なる活性化合物又は組成物を利用することが
できる。具体的な実施態様において、投与される活性化合物又は組成物中の各々のキメラ
インフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、互いに異なってお
り、例えば、第一及び第二の、又は第一、第二、及び第三の投与は、各々、異なる活性化
合物又は組成物を使用し、ここで、投与される各々の活性化合物又は組成物中のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの少なくとも球状ヘッドドメインは異なってい
る。これらの実施態様に従って、2回目の接種の後に、例えば、3〜6カ月、6〜9カ月、又
は6〜12カ月間隔で、追加免疫接種を対象に投与することができる。ある実施態様におい
て、追加免疫接種は、異なる活性化合物又は組成物を利用することができる。ある実施態
様において、第一の(初回免疫)投与は、全長血球凝集素もしくはその断片(又はそれらを
コードする核酸)を含み、第二の(追加免疫)投与は、本明細書に記載のキメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド(或いはそれをコードする核酸、それを含むVLP、又はそ
れを発現するウイルスもしくは細菌)の投与を含む。いくつかの実施態様において、同じ
活性化合物又は組成物の投与を繰り返すことができ、投与は、少なくとも1日、2日、3日
、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6カ月の間隔を空
けることができる。ある実施態様において、活性化合物又は組成物は、単一用量として1
年に1回、対象に投与される。
小児への投与のための具体的な実施態様において、少なくとも1カ月間隔で与えられる
、2用量の活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチド含有も
しくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、そのようなポリペプ
チドで刺激された細胞)又は組成物が小児に投与される。成人への投与のための具体的な
実施態様において、単一用量が与えられる。別の実施態様において、少なくとも1カ月間
隔で与えられる、2用量の活性化合物又は組成物が成人に投与される。別の実施態様にお
いて、若年小児(6カ月〜9歳)には、1カ月間隔で与えられる2用量の活性化合物又は組成物
を初めて投与することができる。特定の実施態様において、その最初のワクチン接種の年
に1用量だけ投与された小児には、その翌年に2用量が投与されるべきである。いくつかの
実施態様において、インフルエンザワクチン、例えば、本明細書に記載の免疫原性製剤を
初めて投与される2〜8歳の小児には、4週間の間隔で投与される2用量が好ましい。ある実
施態様において、3歳を超える対象に好ましい場合がある0.5mlとは対照的に、生後6〜35
カ月の小児には、半用量(0.25ml)が好ましい場合がある。
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、2用量の本明細書に記載のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドもしくはその組成物及び/又は本明細書
に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つもしくは複数を乳児に
投与し、ここで、第一の用量で使用されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、第二の用量で使用されるキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘ
ッドドメインと異なる株又は亜型由来のものである。第一及び第二の投与は、少なくとも
1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少なくとも6
カ月隔てることができる。
具体的な実施態様において、ヒト乳児への投与のために、3用量の本明細書に記載のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドもしくはその組成物及び/又は本明細書
に記載の核酸、ベクター、VLP、もしくはウイロソームのうちの1つもしくは複数を乳児に
投与し、ここで、第一、第二、及び第三の用量で使用されるキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドのインフルエンザウイルス血球凝集素ヘッドドメインは、インフル
エンザウイルスの異なる株又は亜型由来のものである。第一、第二、及び第三の投与は、
少なくとも1日、2日、3日、5日、10日、15日、30日、45日、2カ月、75日、3カ月、又は少
なくとも6カ月隔てることができる。
特定の実施態様において、活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエン
ザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような
ポリペプチド含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、
そのようなポリペプチドで刺激された細胞)又は組成物は、秋又は冬に、すなわち、各半
球のインフルエンザシーズンの前又はその期間中に、対象に投与される。一実施態様にお
いて、第二の用量をインフルエンザシーズンのピークの前に与えることができるように、
小児には、該シーズンの初め、例えば、北半球で9月下旬又は10月初旬に第一の用量が投
与される。
抗体(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを
用いて作製及び/又は同定された抗体)による受動免疫について、投薬量の範囲は、患者の
体重1kg当たり、約0.0001〜100mg、より一般的には0.01〜5mgである。例えば、投薬量は
、体重1kg当たり、1mgもしくは10mg又は1〜10mgの範囲、つまり、70kgの患者の場合、そ
れぞれ、70mgもしくは700mg又は70〜700mgの範囲であることができる。例示的な治療レジ
メンは、1年もしくは数年の間、又は数年間隔で、2週間毎に1回、又は月に1回、又は3〜6
カ月毎に1回の投与を必要とする。いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2
以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与される各抗体の投薬量は示
された範囲に含まれる。抗体は、通常、複数の機会に投与される。単一の投薬の間隔は、
毎週、毎月、又は毎年であることができる。間隔は、患者でキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の血液レベルを測定することにより示されるように、
不規則であることもできる。
(5.13 生物学的アッセイ)
(5.13.1 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの活性を試験するため
のアッセイ)
本明細書に開示されるベクターでキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの
発現を試験するためのアッセイは、当技術分野で公知の任意のアッセイを用いて実施する
ことができる。例えば、ウイルスベクターへの組込みについてのアッセイは、ウイルスを
増殖させること、ショ糖クッションに通す遠心分離によってウイルス粒子を精製すること
、及び当技術分野で周知の方法を用いる免疫アッセイ、例えば、ウェスタンブロットによ
るキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド発現についてのその後の解析を含む
。血球凝集素ポリペプチドがキメラであるかどうかを判定する方法は当業者に公知であり
、かつ本明細書に記載されている。
一実施態様において、本明細書に開示されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドは、当技術分野で公知の抗体抗原相互作用についての任意のアッセイを用いて、
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、例えば、該ポリペプチドのストーク領
域に対する中和抗体に特異的に結合するその能力を試験することにより、適切なフォール
ディング及び機能性についてアッセイされる。そのようなアッセイで使用される中和抗体
には、例えば、Ekiertらの文献、2009, Science Express, 2009年2月26日; Kashyapらの
文献、2008, Proc Natl Acad Sci USA 105: 5986-5991; Suiらの文献、2009, Nature Str
uctural and Molecular Biology, 16:265-273; Wangらの文献、2010, PLOS Pathogens 6(
2): 1-9;米国特許第5,589,174号、第5,631,350号、第6,337,070号、及び第6,720,409号;
国際公開WO 2007/134237号として公開された国際出願PCT/US2007/068983号;国際公開WO 2
009/036157号として公開された国際出願PCT/US2008/075998号;国際公開WO 2008/028946号
として公開された国際出願PCT/EP2007/059356号;及び国際公開WO 2009/079259号として公
開された国際出願PCT/US2008/085876号に記載されている中和抗体が含まれる。これらの
抗体には、とりわけ、CR6261、CR6325、CR6329、CR6307、CR6323、2A、D7、D8、F10、G17
、H40、A66、D80、E88、E90、H98、C179(FERM BP-4517)、AI3C(FERM BP-4516)、CR8114、
CR8020(Ekiertらの文献、2011. Science. 333(6044): 843-850)、FI6(Cortiらの文献、20
11. Science. 333(6044) 850-856, DOI: 10.1126/science.1205669)、B型インフルエンザ
ウイルスストークmAbである3A2、10C4、又は5A7(Yasugiらの文献、2013. PLoS Pathog. 9
(2): e1003150)が含まれる。
別の実施態様において、本明細書に開示されるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドは、例えば、NMR、X線結晶学的方法、又は二次構造予測法、例えば、円二色性
などの、当技術分野で公知の任意の方法を用いるキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポ
リペプチドの構造又は立体構造の決定により、適切なフォールディングについてアッセイ
される。
(5.13.2 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを用いて作製された抗
体の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の抗体は、当業者に公知の種々の方法(例えば、ELISA、表面プラズモン
共鳴ディスプレイ(BIAcore)、ウェスタンブロット、免疫蛍光、免疫染色、及び/又は微量
中和アッセイ)で特徴付けることができる。いくつかの実施態様において、抗体は、キメ
ラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド、又は該ポリペプチドを含むベクターに特
異的に結合する能力についてアッセイされる。そのようなアッセイは、溶液中で(例えば
、Houghtenの文献、1992, Bio/Techniques 13:412 421)、ビーズ表面で(Lamの文献、1991
, Nature 354:82 84)、チップ表面で(Fodorの文献、1993, Nature 364:555 556)、細菌を
用いて(米国特許第5,223,409号)、胞子を用いて(米国特許第5,571,698号;第5,403,484号;
及び第5,223,409号)、プラスミドを用いて(Cullらの文献、1992, Proc Natl. Acad. Sci.
USA 89:1865 1869)、又はファージを用いて(Scott及びSmithの文献、1990, Science 249
:386 390; Cwirlaらの文献、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378 6382;及びFeli
ciの文献、1991, J. Mol. Biol. 222:301 310)実施することができる(これらの参考文献
の各々は、引用により完全に本明細書中に組み込まれている)。
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の特異的結合及び他の
抗原との交差反応性は、当技術分野で公知の任意の方法により評価することができる。特
異的結合及び交差反応性を解析するために使用することができる免疫アッセイには、少し
例を挙げれば、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッ
セイ)、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反
応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定法、蛍光免疫
アッセイ、プロテインA免疫アッセイなどの技術を用いる、競合的及び非競合的アッセイ
系が含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイはルーチンであり、かつ当
技術分野で周知である(例えば、引用により完全に本明細書中に組み込まれる、Ausubelら
編の文献、1994、分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biolog
y)、第1巻、John Wiley & Sons社, New York参照)。
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体の結合親和性及び抗体
抗原相互作用の解離速度は、競合的結合アッセイにより決定することができる。競合的結
合アッセイの一例は、漸増する量の非標識抗原の存在下での標識抗原(例えば、3H又は125
I)と関心対象の抗体とのインキュベーション、及び標識抗原に結合した抗体の検出を含む
放射性免疫アッセイである。キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する
抗体の親和性及び結合解離速度は、スキャッチャードプロット解析によるデータから決定
することができる。二次抗体との競合も放射性免疫アッセイを用いて決定することができ
る。この場合、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、漸増する量の非標
識二次抗体の存在下で、標識化合物(例えば、3H又は125I)にコンジュゲートした試験抗体
とともにインキュベートされる。
ある実施態様において、抗体結合親和性及び速度定数は、KinExA 3000システム(Sapidy
ne Instruments, Boise, ID)を用いて測定される。いくつかの実施態様において、表面プ
ラズモン共鳴(例えば、BIAcore動態)解析を用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドに対する抗体の結合及び解離速度を決定する。BIAcore動態解析は、その表
面にキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する抗体が固定されたチップ
からのキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドの結合及び解離を解析すること
を含む。典型的なBIAcore動態試験は、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ドが固定されているセンサーチップ表面への、0.005％のTween20を含むHBSバッファー中
の様々な濃度の250μLの抗体試薬(mAb、Fab)の注入を含む。流速は、75μL/分で一定に保
たれる。解離データは、必要に応じて15分間又はそれよりも長い間回収される。各々の注
入/解離サイクルの後、結合抗体は、希酸、通常、10〜100mM HClの短い1分間の投入を用
いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド表面から除去されるが、状況が許
せば、他の再生剤が利用される。より具体的には、結合速度kon及び解離速度koffの測定
のために、ポリペプチドを、標準的なアミンカップリング化学、すなわち、EDC/NHS法(ED
C＝N-ジエチルアミノプロピル)-カルボジイミド)を用いて、センサーチップ表面に直接固
定する。簡潔に述べると、pH4又はpH5の10mM NaOAc中のポリペプチドの5〜100nM溶液を調
製し、約30〜50RU相当のポリペプチドが固定されるまで、EDC/NHS活性化表面に流す。こ
の後、1MのEt-NH2を注入して、未反応の活性エステルの「キャップ」を外す。参照目的の
ために、同一の固定条件下で、ポリペプチドを含まないブランク表面を調製する。適当な
表面が調製されたら、抗体試薬のそれぞれの好適な希釈系列をHBS/Tween-20中に調製し、
直列につながれたポリペプチドセル表面と参照セル表面の両方に流す。調製される抗体濃
度の範囲は、平衡結合定数KDの推定値によって異なる。上記のように、結合した抗体は、
適当な再生剤を用いて、各注入/解離サイクル後に除去される。
抗体の中和活性は、当業者に公知の任意のアッセイを用いて決定することができる。本
明細書に記載の抗体は、当業者に公知の技術を用いて、その宿主細胞受容体(すなわち、
シアル酸)へのインフルエンザウイルス、又はキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを含む任意の他の組成物(例えば、VLP、リポソーム、もしくは洗剤抽出物)の結
合を阻害するその能力についてアッセイすることができる。例えば、インフルエンザウイ
ルス受容体を発現する細胞を、抗体の存在下又は非存在下で、本明細書に記載のキメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物と接触させることができ、抗原の
結合を阻害する抗体の能力を、例えば、フローサイトメトリー又はシンチレーションアッ
セイにより測定することができる。本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(H
A)ポリペプチドを含む組成物、又は抗体を、検出可能な化合物、例えば、放射性標識(例
えば、32P、35S、及び125I)又は蛍光標識(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、
ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒド
、及びフルオレサミン)で標識して、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(
HA)ポリペプチドを含む組成物と細胞受容体との間の相互作用の検出を可能にすることが
できる。或いは、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが
その受容体に結合するのを阻害する抗体の能力を無細胞アッセイで決定することができる
。例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組
成物を抗体と接触させることができ、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
を含む組成物が細胞受容体に結合するのを阻害する抗体の能力を決定することができる。
具体的な実施態様において、抗体を固体支持体上に固定し、インフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドを含む組成物を検出可能な化合物で標識する。或いは、本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む組成物を固体支持体上に固
定し、抗体を検出可能な化合物で標識する。ある実施態様において、本明細書に記載のキ
メラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが細胞受容体に結合するのを阻害する抗
体の能力は、対照(例えば、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドが細胞受
容体に結合するのを阻害することが知られている抗体)と比べた抗体の結合阻害率を評価
することにより決定される。
他の実施態様において、本明細書に記載の方法で使用するのに好適な抗体は、インフル
エンザウイルスの受容体結合を阻害しないが、それでもなお本明細書に記載のアッセイで
中和することが分かっている。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法に従
って使用するのに好適な抗体は、当技術分野で公知又は本明細書に記載のアッセイでウイ
ルスと宿主膜との融合を低下させるか、又はそれを阻害する。
一実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、レポーターを含むインフルエンザ
ウイルスと、該ウイルスに感染させることができる宿主細胞とを用いるインビトロアッセ
イでアッセイされる。レポーター活性が、陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体
の非存在下でのレポーター活性)と比較して阻害されるか又は低下する場合、抗体は融合
を阻害する。
一実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、細胞融合のモデル系を用いて検出
される。例示的な細胞融合アッセイにおいて、細胞(例えば、HeLa細胞)に、本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードするプラスミドをトラン
スフェクトし、抗体の存在下でキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド融合機
能を可能にする緩衝液(例えば、pH 5.0の緩衝液)に接触及び暴露させる。抗体は、それが
陰性対照(例えば、対照抗体の存在下又は抗体の非存在下でのシンシチウム形成)と比較し
てシンシチウム形成を低下させるか又は阻害する場合、中和性である。
他の実施態様において、ウイルスと宿主膜との融合は、インビトロでのリポソームに基
づくアッセイを用いてアッセイされる。例示的なアッセイにおいて、宿主細胞受容体は、
レポーターの半分を含むリポソームへと再構築される。本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドは、レポーターのもう半分を含む別の組のリポソーム
へと再構築される。2つのリポソーム集団を一緒に混合すると、融合は、レポーターの再
構成、例えば、比色定量的に検出することができる酵素反応により検出される。レポータ
ー活性が、抗体の非存在下又は対照抗体の存在下で行われるアッセイでのレポーター活性
と比較して低下するか又は阻害される場合、抗体は融合を阻害する。ある実施態様におい
て、融合を阻害する抗体の能力は、対照の存在下での融合率と比べた抗体の存在下での融
合率を評価することにより決定される。
(5.13.3 刺激された細胞の活性を試験するためのアッセイ)
本明細書に記載の方法に従って刺激された細胞は、例えば、関心対象のポリヌクレオチ
ド又は遺伝子(複数可)の組込み、転写、及び/又は発現、組み込まれた遺伝子のコピー数
、並びに組込みの位置について解析することができる。そのような解析は、いつでも実施
することができ、かつ当技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。他の
実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド
による標的細胞の刺激の成功は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の方法を用いて、
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する中和抗体の産生を検出するこ
とにより決定される。
ある実施態様において、刺激された細胞、例えば、DCが投与される対象を、細胞の位置
、キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする、ベクターによって送
達されるポリヌクレオチドもしくは遺伝子の発現、免疫応答(例えば、キメラインフルエ
ンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドに対する中和抗体の産生)の刺激について解析し、及び/
又は当技術分野で公知もしくは本明細書に記載の任意の方法によって、インフルエンザウ
イルス感染もしくはそれと関連する疾患と関連する症状についてモニタリングすることが
できる。
レポーターアッセイを用いて、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)
ポリペプチドのターゲッティングの特異性を決定することができる。例えば、骨髄細胞の
混合集団を対象から取得し、インビトロで培養することができる。キメラインフルエンザ
血球凝集素(HA)ポリペプチドを骨髄細胞の混合集団に投与することができ、キメラインフ
ルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドと関連するレポーター遺伝子の発現を培養細胞でア
ッセイすることができる。いくつかの実施態様において、混合細胞集団中の刺激された細
胞の少なくとも約50％、より好ましくは、少なくとも約60％、70％、80％、又は90％、さ
らにより好ましくは、少なくとも約95％は、樹状細胞である。
(5.13.4 抗ウイルス活性アッセイ)
本明細書に記載の抗体又はその組成物は、抗ウイルス活性についてインビトロで評価す
ることができる。一実施態様において、抗体又はその組成物は、インフルエンザウイルス
の増殖に対するその効果についてインビトロで試験される。インフルエンザウイルスの増
殖は、当技術分野で公知又は本明細書に記載の任意の方法により(例えば、細胞培養で)評
価することができる。具体的な実施態様において、細胞は、0.0005及び0.001、0.001及び
0.01、0.01及び0.1、0.1及び1、もしくは1及び10のMOI、又は0.0005、0.001、0.005、0.0
1、0.05、0.1、0.5、1、5、もしくは10のMOIで感染させられ、補充された無血清培地とと
もにインキュベートされる。ウイルス力価は、血球凝集素プラーク又は本明細書に記載の
任意の他のウイルスアッセイにより上清中で決定される。ウイルス力価を評価することが
できる細胞としては、EFK-2細胞、Vero細胞、MDCK細胞、初代ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)
、H292ヒト上皮細胞株、及びHeLa細胞が挙げられるが、これらに限定されない。インビト
ロアッセイには、当技術分野で周知又は本明細書に記載の方法を用いて、インビトロで、
培養細胞におけるウイルス複製の変化(例えば、プラーク形成により決定される)、或いは
ウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット解析により決定される)又はウイ
ルスRNAの産生(例えば、RT-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を測定
するものが含まれる。
非限定的な例において、標的哺乳動物細胞株の単層を様々な量(例えば、3プラーク形成
単位(pfu)又は5pfuの多重度)のウイルス(例えば、インフルエンザ)に感染させ、その後、
様々な希釈の抗体(例えば、0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、又は10μg/ml)の存在下又は
非存在下で培養する。感染した培養物を感染から48時間後又は72時間後に回収し、適当な
標的細胞株(例えば、Vero細胞)に対する当技術分野で公知の標準的なプラークアッセイに
より力価を測定する。
血球凝集アッセイの非限定的な例において、細胞を抗体と接触させ、同時に又はその後
(例えば、1のMOIで)ウイルスに感染させ、ウイルス複製を可能にする条件下で(例えば、2
0〜24時間)ウイルスをインキュベートする。抗体は、感染の全過程で存在することが好ま
しい。次に、ウイルスの複製及びウイルス粒子の放出を、0.5％のニワトリ赤血球を用い
る血球凝集アッセイにより決定する。例えば、Kashyapらの文献、PNAS USA 105:5986-599
1を参照されたい。いくつかの実施態様において、化合物は、それが、ウイルス力価の約7
5％低下に相当する少なくとも2ウェルのHAだけウイルスの複製を低下させる場合、ウイル
ス複製の阻害剤とみなされる。具体的な実施態様において、阻害剤は、このアッセイで、
ウイルス力価を50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以
上、85％以上、90％以上、又は95％以上低下させる。他の具体的な実施態様において、阻
害剤は、対象におけるインフルエンザウイルス力価の約1log以上、約2log以上、約3log以
上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約10
log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log〜8
log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log、4
〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8log、
7〜9log、又は8〜9logの低下をもたらす。インフルエンザウイルス力価のlog低下は、陰
性対照と比較したもの、別の処置と比較したもの、又は抗体投与前の患者における力価と
比較したものであることができる。
(5.13.5 細胞毒性アッセイ)
当技術分野で周知の多くのアッセイを用いて、活性化合物又はその組成物への暴露後の
細胞(感染もしくは未感染)又は細胞株の生存率を評価し、それにより、該化合物又は組成
物の細胞毒性を決定することができる。例えば、細胞増殖は、ブロモデオキシウリジン(B
rdU)の取込み(例えば、Hoshinoらの文献、1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campanaらの
文献、1988, J. Immunol. Meth. 107:79参照)、(3H)チミジンの取込み(例えば、Chen, J.
の文献、1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J.の文献、1995, J. Biol. Chem. 270:1
8367 73参照)を測定することによるか、直接的な細胞カウントによるか、又は既知の遺伝
子、例えば、癌原遺伝子(例えば、fos、myc)もしくは細胞周期マーカー(Rb、cdc2、サイ
クリンA、D1、D2、D3、Eなど)の転写、翻訳、もしくは活性の変化を検出することにより
アッセイすることができる。そのようなタンパク質及びmRNA及び活性のレベルは、当技術
分野で公知の任意の方法により決定することができる。例えば、市販の抗体を含む抗体を
用いる公知の免疫診断方法、例えば、ELISA、ウェスタンブロッティング、又は免疫沈降
により、タンパク質を定量することができる。当技術分野で周知かつルーチンの方法を用
いて、例えば、ノーザン解析、RNアーゼ保護、又は逆転写と関連するポリメラーゼ連鎖反
応を用いて、mRNAを定量することができる。細胞生存率は、トリパンブルー染色又は当技
術分野で公知の他の細胞生死マーカーを用いて評価することができる。具体的な実施態様
において、細胞のATPレベルを測定して、細胞生存率を決定する。
具体的な実施態様において、細胞生存率は、細胞内ATPレベルを測定する、当技術分野
で標準的なアッセイ、例えば、CellTiter-Gloアッセイキット(Promega)を用いて、3日及
び7日の期間で測定される。細胞ATPの低下は、細胞毒性効果を示すものである。別の具体
的な実施態様において、細胞生存率は、ニュートラルレッド取込みアッセイで測定するこ
とができる。他の実施態様において、形態変化の目視観察には、肥大、粒状度、ギザギザ
の縁を有する細胞、薄膜状の外観、円形化、ウェル表面からの剥離、又は他の変化が含ま
れ得る。こうした変化には、観察された細胞毒性の程度に従って、T(100％毒性)、PVH(部
分的毒性-非常に強い-80％)、PH(部分的毒性-強い-60％)、P(部分的毒性-40％)、Ps(部分
的毒性-わずか-20％)、又は0(毒性なし-0％)という呼称が与えられる。50％細胞阻害(細
胞毒性)濃度(IC50)は、これらのデータの回帰分析により決定される。
具体的な実施態様において、細胞毒性アッセイで使用される細胞は、初代細胞及び細胞
株を含む動物細胞である。いくつかの実施態様において、細胞はヒト細胞である。ある実
施態様において、細胞毒性は、以下の細胞株のうちの1つ又は複数で評価される: U937、
ヒト単球細胞株;初代末梢血単核細胞(PBMC); Huh7、ヒト肝芽細胞腫細胞株; 293T、ヒト
胚性腎細胞株;及びTHP-1、単球細胞。ある実施態様において、細胞毒性は、以下の細胞株
のうちの1つ又は複数で評価される: MDCK、MEF、Huh 7.5、Detroit、又はヒト気管気管支
上皮(HTBE)細胞。
活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チド)又はその組成物は、動物モデルでインビボ毒性について試験することができる。例
えば、活性化合物の活性を試験するために使用される、本明細書に記載の動物モデル及び
/又は当技術分野で公知の他のものを用いて、これらの化合物のインビボ毒性を決定する
こともできる。例えば、動物に様々な濃度の活性化合物を投与する。その後、該動物を、
致死率、体重減少もしくは体重増加失敗、及び/又は組織損傷を示し得る血清マーカーの
レベル(例えば、全般的な組織損傷の指標としてのクレアチンホスホキナーゼレベル、肝
損傷の可能性の指標としてのグルタミン酸シュウ酸トランスアミナーゼ又はピルビン酸ト
ランスアミナーゼのレベル)について経時的にモニタリングする。これらのインビボアッ
セイは、投薬量の他に、様々な投与様式及び/又はレジメンの毒性を試験するように適合
させることができる。
活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チド)の毒性及び/又は効力は、例えば、LD50(集団の50％に致死的な用量)及びED50(集団
の50％で治療的に有効な用量)を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的
な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比が治療指数
であり、それは、比LD50/ED50と表すことができる。大きい治療指数を示す活性化合物が
好ましい。毒性のある副作用を示す活性化合物を使用してもよいが、感染していない細胞
に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより、副作用を軽減するために、そのよう
な薬剤を罹患組織の部位にターゲッティングする送達系を設計するよう、注意を払うべき
である。
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトで使用するための活性化合
物の投薬量の範囲を定める際に使用することができる。そのような薬剤の投薬量は、循環
濃度の範囲内にあることが好ましく、この範囲には、ほとんど又は全く毒性のないED50が
含まれる。投薬量は、利用される剤形及び利用される投与経路によって、この範囲内で異
なり得る。本明細書に記載の方法で使用される任意の活性化合物について、有効用量を、
細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量を動物モデルで定めて、循環血
漿濃度範囲を得ることができ、この循環血漿濃度範囲には、細胞培養で決定されるIC50(
すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)が含まれる。そのような情報
を用いて、ヒトでの有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、
例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。投薬量の決定に関す
るさらなる情報が本明細書に提供される。
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを用いて、例えば、ウイルス感染又はそれと関
連する状態もしくは症状を測定することにより、本明細書に記載の活性化合物及び組成物
の予防的及び/又は治療的有用性を評価することができる。
(5.13.6 インビボでの抗ウイルス活性)
活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チド)及びその組成物は、ヒトで使用する前に所望の治療的又は予防的活性についてイン
ビボでアッセイすることができる。例えば、インビボアッセイを用いて、活性化合物もし
くはその組成物及び/又は別の療法を投与することが好ましいかどうかを決定することが
できる。例えば、インフルエンザウイルス疾患を予防するための活性化合物又はその組成
物の使用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させる前に、組成物を
投与することができる。或いは、又はさらに、動物をインフルエンザウイルスに感染させ
るのと同時に、活性化合物又はその組成物を動物に投与することができる。インフルエン
ザウイルス感染又はそれと関連する疾患を治療するための活性化合物又はその組成物の使
用を評価するために、動物をインフルエンザウイルスに感染させた後に、化合物又は組成
物を投与することができる。具体的な実施態様において、活性化合物又はその組成物は、
動物に複数回投与される。
活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプ
チド)及びその組成物は、限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブ
タ、フェレット、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、モルモットなどを含む動物モデル系で、
抗ウイルス活性について試験することができる。具体的な実施態様において、活性化合物
及びその組成物は、マウスモデル系で試験される。そのようなモデル系は広く使用されて
おり、かつ当業者に周知である。具体的な実施態様において、活性化合物及びその組成物
は、マウスモデル系で試験される。インフルエンザウイルスのための動物モデルの非限定
的な例がこの節で提供される。
一般に、動物をインフルエンザウイルスに感染させ、同時に又はその後に、活性化合物
もしくはその組成物、又はプラセボで処置する。或いは、動物を、活性化合物もしくはそ
の組成物、又はプラセボで処置し、その後、インフルエンザウイルスに感染させる。これ
らの動物から得られる試料(例えば、血清、尿、喀痰、精液、唾液、血漿、又は組織試料)
は、当技術分野で周知の方法、例えば、ウイルス力価の変化(例えば、プラーク形成によ
り決定される)、ウイルスタンパク質の産生(例えば、ウェスタンブロット、ELISA、もし
くはフローサイトメトリー解析により決定される)、又はウイルス核酸の産生(例えば、RT
-PCRもしくはノーザンブロット解析により決定される)を測定する方法により、ウイルス
複製について試験することができる。組織試料中のウイルスの定量のために、組織試料を
、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でホモジナイズし、清澄化されたホモジネートの希釈物
を、細胞(例えば、Vero、CEF、又はMDCK細胞)の単層表面に37℃で1時間吸着させる。他の
アッセイにおいて、組織病理学的評価、好ましくは、ウイルスが感染の標的にすることが
知られている器官(複数可)の評価を感染後に実施する。ウイルス特異的モノクローナル抗
体を用いて、ウイルス免疫組織化学検査を実施することができる。
活性化合物もしくはその組成物が投与される感染対象におけるウイルスの力価、活性化
合物もしくはその組成物が投与される感染対象の生存期間、活性化合物もしくはその組成
物が投与される感染対象における免疫応答、活性化合物もしくはその組成物が投与される
感染対象における症状の数、持続時間、及び/もしくは重症度、並びに/又は活性化合物も
しくはその組成物が投与される感染対象における1以上の症状の開始までの時間が評価さ
れるインビボアッセイを用いて、ウイルスの病原性に対する活性化合物(例えば、本明細
書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)又はその組成物の効果を
決定することもできる。当業者に公知の技術を用いて、そのような効果を測定することが
できる。ある実施態様において、活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比べて、
0.5倍、1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、125倍
、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、もしくは1,000倍、又はそれより
大きいインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。いくつかの実施態様において、
活性化合物又はその組成物は、未処置の対象と比べて、約1log以上、約2log以上、約3log
以上、約4log以上、約5log以上、約6log以上、約7log以上、約8log以上、約9log以上、約
10log以上、1〜3log、1〜5log、1〜8log、1〜9log、2〜10log、2〜5log、2〜7log、2log
〜8log、2〜9log、2〜10log、3〜5log、3〜7log、3〜8log、3〜9log、4〜6log、4〜8log
、4〜9log、5〜6log、5〜7log、5〜8log、5〜9log、6〜7log、6〜8log、6〜9log、7〜8lo
g、7〜9log、又は8〜9logのインフルエンザウイルスの力価の低下をもたらす。
インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス剤の試験用に開発された、インフルエンザ
ウイルス動物モデル、例えば、フェレット、マウス、モルモット、リスザル、マカク、及
びニワトリが記載されている。例えば、Sidwellらの文献、Antiviral Res., 2000, 48:1-
16; Lowen A.C.らの文献、PNAS., 2006, 103:9988-92;及びMcCauleyらの文献、Antiviral
Res., 1995, 27:179-186及びRimmelzwannらの文献、Avian Diseases, 2003, 47:931-933
を参照されたい。インフルエンザのマウスモデルについて、インフルエンザ感染マウスに
投与される活性化合物の抗ウイルス活性をアッセイするために使用することができるパラ
メータの非限定的な例としては、肺炎関連死、血清α1酸糖タンパク増加、動物体重、血
球凝集素によりアッセイされる肺ウイルス、プラークアッセイによりアッセイされる肺ウ
イルス、及び肺の組織病理学的変化が挙げられる。統計解析を実施して、有意性(例えば
、0.05以下のP値)を計算する。
他のアッセイにおいて、動物モデル対象の感染後に、組織病理学的評価を行う。鼻甲介
及び気管を、上皮変化及び上皮下炎症について調べることができる。肺を、細気管支上皮
の変化、及び大、中、小、又は末端細気管支における細気管支周囲炎症について調べるこ
とができる。肺胞を、炎症性変化についても評価する。中細気管支は、以下のように、0
〜3+のスケールで等級付けられる:0(正常:繊毛性頂端境界及び基底偽重層核を有する中位
から高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている;最小限の炎症); 1+(輪郭が円柱状か
つ均一で増殖がわずかに増加した上皮層;繊毛がなおも多くの細胞に見られる); 2+(減弱
から顕著な増殖までの範囲の上皮層における顕著な変化;破壊された細胞及び管腔境界で
の不規則な層輪郭); 3+(著しく破壊され、無秩序になった上皮層、内腔には壊死細胞が見
られる;減弱した細気管支もあれば、反応性増殖が顕著な細気管支もある)。
気管は、以下のように、0〜2.5+のスケールで等級付けられる: 0(正常:繊毛性頂端境界
、基底偽重層核を有する中位から高い円柱状の上皮細胞により裏打ちされている。頂端境
界と核との間に明らかな細胞質。時折見られる扁平上皮細胞の小さな増殖巣); 1+(上皮層
の限局的扁平上皮化生); 2+(上皮層の大部分の広範囲の扁平上皮化生、繊毛は限局的に明
白な場合がある); 2.5+(明白な繊毛が極めて少ない広範囲の扁平上皮化生)。
ウイルス免疫組織化学検査は、ウイルス特異的モノクローナル抗体(例えば、NP-、N-、
又はHN-特異的モノクローナル抗体)を用いて行われる。染色は、以下のように、0〜3+に
等級付けられる:0(感染細胞なし); 0.5+(ほとんど感染細胞なし); 1+(ほとんど感染細胞
なし、広く離れた個々の細胞として); 1.5+(ほとんど感染細胞なし、広く離れた単体とし
て、及び小クラスターで); 2+(通常、上皮層が裏打ちする細気管支の一部の、又は肺胞内
の小さな小葉下病巣(sublobular foci)の、隣接細胞のクラスターを侵す、適度な数の感
染細胞); 3+(細気管支の上皮層の大部分を侵すか、又は肺胞内の大きな小葉下病巣に広が
る、多数の感染細胞)。
一例において、ウイルス感染の動物モデルで肺病変を誘導し、感染を引き起こす能力を
、野生株ウイルス及び模擬ウイルスを用いて比較する。肺病変は、目視検査で健康である
肺葉の割合として評価することができる。感染から5日後、動物をペントバルビタールの
静脈内投与により安楽死させ、その肺全体を取り出す。肉眼的病変に侵された各肺葉の表
面の割合を目視で見積もる。割合を平均化して、各々の動物の7つの肺葉についての平均
値を得る。他のアッセイにおいて、鼻スワブを検査して、ウイルス負荷量又は力価を決定
することができる。検死時に鼻スワブを採取して、感染後のウイルス負荷量を決定するこ
とができる。
一実施態様において、ウイルスを組織試料中で定量する。例えば、組織試料をリン酸緩
衝生理食塩水(PBS)中でホモジナイズし、清澄化されたホモジネートの希釈物を、細胞(例
えば、MDCK細胞)の単層表面に37℃で1時間吸着させる。次に、感染させた単層に、0.1％
ウシ血清アルブミン(BSA)、0.01％DEAE-デキストラン、0.1％NaHCO3、及び1％寒天を含む
最小必須培地の溶液を重層する。プラークを可視化することができるまで、プレートを2
〜3日インキュベートする。PR8感染試料由来のウイルスの力価を測定するための組織培養
感染量(TCID)アッセイを以下のように実施する。96ウェルプレート中の細胞(例えば、MDC
K細胞)のコンフルエントな単層を、培地中の清澄化された組織ホモジネートの対数希釈物
とともにインキュベートする。接種から2〜3日後に、各ウェルからの0.05mlのアリコート
を、ウイルス増殖について、血球凝集アッセイ(HAアッセイ)により評価する。
(5.13.6.1.1 ヒトでのアッセイ)
一実施態様において、インフルエンザウイルスの複製を調節する活性化合物(例えば、
本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)又はその組成物を
感染ヒト対象で評価する。この実施態様に従って、活性化合物又はその組成物をヒト対象
に投与し、ウイルスの複製に対する活性化合物又は組成物の効果を、例えば、生体試料(
例えば、血清又は血漿)中のウイルス又はウイルス核酸のレベルを解析することにより決
定する。ウイルス複製を変化させる活性化合物又はその組成物は、対照で処置した対象又
は対象群におけるウイルス複製のレベルを、活性化合物又はその組成物で処置した対象又
は対象群におけるウイルス複製のレベルと比較することにより同定することができる。或
いは、ウイルスの複製の変化は、活性化合物又はその組成物の投与の前後で対象又は対象
群におけるウイルス複製のレベルを比較することにより同定することができる。当業者に
公知の技術を用いて、生体試料を取得し、mRNA又はタンパク質の発現を解析することがで
きる。
別の実施態様において、インフルエンザウイルス感染/疾患と関連する1以上の症状の重
症度に対する活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA
)ポリペプチド)又はその組成物の効果を感染対象で評価する。この実施態様に従って、活
性化合物もしくはその組成物又は対照をインフルエンザウイルス感染に罹患しているヒト
対象に投与し、ウイルス感染の1以上の症状に対する活性化合物又は組成物の効果を決定
する。1以上の症状を軽減する活性化合物又はその組成物は、対照で処置した対象を活性
化合物又は組成物で処置した対象と比較することにより同定することができる。具体的な
実施態様において、活性化合物(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝
集素(HA)ポリペプチド)又はその組成物の投与は、インフルエンザウイルス疾患又は感染
に起因するヒト又はヒト集団の入院の減少をもたらす。別の具体的な実施態様において、
活性化合物又はその組成物の投与は、インフルエンザウイルス疾患又は感染を有するヒト
又はヒト集団における呼吸(respiratory)/呼吸(breathing)補助の必要性を低下させる。
別の具体的な実施態様において、活性化合物又はその組成物の投与は、インフルエンザウ
イルス疾患又は感染を有するヒト又はヒト集団の罹患期間の短縮をもたらす。別の具体的
な実施態様において、活性化合物又はその組成物の投与は、例えば、全身又は肺プレチス
モグラフィーにより評価される肺容量の改善(例えば、増加)をもたらす。別の実施態様に
おいて、活性化合物又はその組成物を健康なヒト対象に投与し、ワクチンとしての効力に
ついてモニタリングする(例えば、対象を、インフルエンザウイルス感染の症状の開始;対
象に感染するインフルエンザウイルスの能力;並びに/又はインフルエンザウイルス感染と
関連する1以上の症状の軽減/不在についてモニタリングする)。感染性疾患を熟知してい
る医師に公知の技術を用いて、活性化合物又はその組成物がインフルエンザウイルス疾患
と関連する1以上の症状を軽減するかどうか決定することができる。
(5.14 対象における抗体の評価)
別の態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ド又は本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するウ
イルスを用いて、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(例えば、本明細書に
記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド)に対する対象(例えば、未感作
の対象もしくは免疫/ワクチン接種された対象)又は対象集団の抗体応答を評価することが
できる。具体的な実施態様において、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チド又はキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを発現するウイルスを用
いて、対象又は対象集団におけるステム特異的抗体の存在を評価することができる。
具体的な実施態様において、インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド(例えば
、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド又は本明細書に記
載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するウイルス)で免疫/ワク
チン接種されたことがある対象又は対象集団の抗体応答を評価して、該対象又は対象集団
におけるストーク特異的抗体の種類を特定する。そのような評価は、本明細書に記載のイ
ンフルエンザウイルスHAポリペプチドポリペプチド(複数可)(例えば、本明細書に記載の
キメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド又は本明細書に記載のキメラインフル
エンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを発現するウイルス)の投与に対する臨床応答を決定
する際に重要な代用マーカー/エンドポイントの同定を可能にすることができる。そのよ
うな手法において、対象又は対象集団由来の生体試料、例えば、血液を単離し、抗体の存
在について直接試験することができるか、又は(例えば、血清を得るために)処理し、その
後、抗体の存在について試験することができる。そのような抗体試験は、当技術分野で公
知のアッセイ、例えば、ELISAを利用することができる。
別の具体的な実施態様において、未感作の対象(すなわち、インフルエンザウイルスHA
ポリペプチドポリペプチド(複数可)(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血
球凝集素(HA)ポリペプチド)もしくはインフルエンザウイルスHAポリペプチドポリペプチ
ド(複数可)(例えば、本明細書に記載のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチ
ド)を発現するウイルスで免疫/ワクチン接種されたことがない対象)又は未感作の対象の
集団の抗体プロファイルを評価して、該対象又は対象集団が、様々なインフルエンザウイ
ルス株又は亜型に対する球状ヘッド特異的及び/又はステム特異的抗体を保有するかどう
かを決定する。そのような評価は、該対象又は対象集団への投与に好適である、キメライ
ンフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチド又はキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリ
ペプチドを発現するウイルスの作製を可能にすることができる。そのような評価は、患者
のための免疫戦略を決定することができる。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるのは、特定のインフルエンザウ
イルス株又は亜型のステムドメインに特異的である対象中の抗体の存在を評価/検出する
方法であって、該対象由来の生体試料(例えば、血液、血清)を、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドとインビトロで接触させることを含み、
ここで、該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが関心対象の株又は亜
型由来のステムドメインを含む、方法である。別の具体的な実施態様において、本明細書
に提供されるのは、特定のインフルエンザウイルス株又は亜型のステムドメインに特異的
である対象中の抗体の存在を評価/検出する方法であって、該対象由来の生体試料(例えば
、血液、血清)を、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプ
チドを発現/含有するウイルスとインビトロで接触させることを含み、ここで、該キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが関心対象の株又は亜型由来のステムド
メインを含む、方法である。
(5.15 キット)
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の医薬/免疫原性組成物の1以上の成分、例
えば、本明細書に提供される1以上の活性化合物を充填した1以上の容器を含む医薬パック
又はキットである。医薬又は生物学的製品の製造、使用、又は販売を規制する行政機関に
より規定された形式での通知を、そのような容器(複数可)に任意で関連付けることができ
、その通知は、この機関による、ヒト投与のための製造、使用、又は販売の承認を示して
いる。
本明細書に包含されるキットは、本明細書に記載の方法に従って使用することができる
。一実施態様において、キットは、1以上の容器中に、本明細書に記載の活性化合物、好
ましくは本明細書に記載の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを
含む。ある実施態様において、キットは、本明細書に記載のワクチン、例えば、スプリッ
トウイルスワクチン、サブユニットワクチン、不活化インフルエンザウイルスワクチン、
又はインフルエンザ生ウイルスワクチンを含み、ここで、該ワクチンは、本明細書に記載
の1以上のキメラインフルエンザ血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む。具体的な実施態様
において、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチド及び該キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを
用いて対象中に存在する抗体を評価するための説明書を含むキットである。別の具体的な
実施態様において、本明細書に提供されるのは、試料中のHAステムドメイン特異的抗体の
存在をアッセイする方法で使用するための本明細書に記載のキメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチドを含むキットである。
具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、本明細書に記載のcH5/1
キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチドをコード
する核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルス
ベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)、本明細書に記
載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチド
をコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、
ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)、本明
細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリ
ペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(
例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細
胞)、本明細書に記載のcH5/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはその
ようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現する
ベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激
された細胞)、本明細書に記載のcH7/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或
いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは
発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチ
ドで刺激された細胞)、本明細書に記載のcHB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプ
チド(或いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有
もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポ
リペプチドで刺激された細胞)、或いは本明細書に記載のcH4/3キメラインフルエンザ血球
凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリ
ペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又
はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)を含む。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、本明細書に記載のcH
5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチドをコー
ドする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイル
スベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)と本明細書に
記載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチ
ドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば
、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)の組
合せ;或いは本明細書に記載のcH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或い
はそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発
現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチド
で刺激された細胞)と本明細書に記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチ
ド(或いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有も
しくは発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリ
ペプチドで刺激された細胞)の組合せを含む。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、本明細書に記載のcH
5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチドをコー
ドする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイル
スベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)と本明細書に
記載のcH5/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチ
ドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば
、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)と本
明細書に記載のcH5/B、cH7/B、又はcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(
或いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしく
は発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプ
チドで刺激された細胞)のいずれかの組合せを含む。
別の具体的な実施態様において、本明細書に提供されるキットは、本明細書に記載のcH
5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチドをコー
ドする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば、ウイル
スベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)と本明細書に
記載のcH7/3キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(或いはそのようなポリペプチ
ドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしくは発現するベクター(例えば
、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプチドで刺激された細胞)と本
明細書に記載のcH5/B、cH7/B、又はcB/Bキメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチド(
或いはそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのようなポリペプチドを含有もしく
は発現するベクター(例えば、ウイルスベクターもしくは細菌)、又はそのようなポリペプ
チドで刺激された細胞)のいずれかの組合せを含む。
(6.実施例)
(6.1 実施例1:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド)
この実施例は、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチド、及び該キメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの投与を含む、対象において高レベルの
交差中和性HAストーク抗体を誘導する方法を記載している。この実施例に記載されている
ように、インフルエンザウイルスによって、及びキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素を発現するように改変された細胞によって良好に発現されるキメラインフルエンザウイ
ルス血球凝集素を作製した。キメラインフルエンザウイルス血球凝集素のステムドメイン
とヘッドドメインの両方の抗体認識から明らかなように、該キメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素を、その適切な立体構造で回収することに成功した。
図2は、インフルエンザウイルスのH1亜型のステム/ストークドメイン及び他のインフル
エンザウイルス亜型(H2、H3、及びH5)の異種球状ヘッドドメインを含む、キメラインフル
エンザウイルス血球凝集素(HA)を示している。図2の戦略概要に従って、H1N1(PR8-H1N1)
インフルエンザウイルスに由来するステムドメイン及び2009パンデミックH1 HA(Cal/09)
の球状ヘッドドメインから構成されるキメラHAを含むインフルエンザウイルスを作製した
。2つのウイルスのHAの球状ヘッドドメインが非常に異なっているのに対し(〜70％アミノ
酸同一性)、ステムドメインは極めて保存されているが、それでも異なっている(〜89％ア
ミノ酸同一性)。図3に示すように、同じステムドメインを有するが、同じ亜型内の非常に
異なるHAヘッドを有するキメラHAを発現させた。
さらに、A/PR/8/34 HAのストークドメイン及びHK/68の球状ヘッドドメインからなるキ
メラHA(キメラH3)、並びに野生型HA(PR8-HA及びHK68 HA)を293T細胞で発現させた。図5は
、(H1亜型HAに由来する)同じステムドメインを有し、かつ異種亜型(H3)由来の球状ヘッド
を有する安定なキメラHAを発現させることも可能であることを示している。
このように、HAステムドメインを完全に共有するが、その球状ヘッドが極めて異なって
いるHA免疫原を設計した。これらの構築物による免疫の繰返しは、HAの共通のステムドメ
インに対する高レベルの交差中和抗体を生じさせるはずである。したがって、改善された
ワクチン戦略は、不変のステム/ストークドメイン及び変化する球状ヘッドを有するキメ
ラHAを用いて、強力な交差中和性抗ステムドメイン抗体を誘導する。例えば、A/PR/8/34
由来のH1 HAの不変のステムドメインを異なるグループ1 HA(H1、H2、H5、H9)由来の球状
ヘッドと一緒に用いて、一連の組換え不活化ウイルス、組換え弱毒化ウイルス、又は組換
えHAのいずれかを作製することができる(図4)。例えば、X31ウイルスのH3 HAのステムド
メインに基づくグループ2 HAの一連の類似物は、H3、H4、及びH7球状ヘッドと組み合わせ
て、グループ2 HAの普遍的なワクチンの基礎を提供することができる。組換えウイルスを
、PR/8又は低温適応インフルエンザウイルスなどの、インフルエンザウイルスワクチン骨
格上にレスキューし、標準的な技術により増殖させ、不活化又は弱毒化ワクチンとして使
用することができる。組換えHAを、哺乳動物様のグリコシル化を行うことができる昆虫細
胞(MIMIC Sf9)において、又は例えば、293 TもしくはVero細胞の一過性トランスフェクシ
ョンにより発現させることができ、その後、C末端hisタグを援用するNi-キレートクロマ
トグラフィーにより精製することができる。他の戦略としては、キメラHAを発現するDNA
ワクチン、又はキメラHAを発現する他のベクター、例えば、アデノウイルスベクターの使
用を挙げることができる。
(6.2 実施例2:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを発現するウイル
ス)
この実施例は、異なる血球凝集素亜型由来の種々の球状ヘッド及びストーク組合せを包
含するいくつかの機能的キメラインフルエンザウイルス血球凝集素、並びにこれらのキメ
ラ血球凝集素を発現する、野生型インフルエンザウイルスの増殖特性と同様の増殖特性を
有していた、組換えインフルエンザウイルスを記載している。
(6.2.1 材料及び方法)
(6.2.1.1 細胞及びウイルス)
293T及びMDCK細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type C
ulture Collection)(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10％胎仔ウシ血清(HyClone; Ther
mo Scientific)及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco, Invitrogen)を補充したダル
ベッコの最小必須培地(DMEM)中又はMEM(Gibco, Invitrogen)中で維持した。
全てのA/PR/8/34組換えウイルスを、10日齢の発育鶏卵中、37℃で2日間増殖させた。
(6.2.1.2 プラスミドの構築)
異なるキメラ血球凝集素をコードするプラスミドを、以前に記載されているような組換
えウイルスを作製するためのリバースジェネティックスプラスミドの構築を基に改変した
同様の戦略により構築した(例えば、Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びH
aiらの文献、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。簡潔に述べると、キメラHAの様々な
セグメントを、SapI部位を含むプライマーでPCRにより増幅させ、SapIで消化し、ヒトRNA
ポリメラーゼIプロモーター及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーターを含むpDZベクタ
ー(例えば、Quinlivanらの文献、2005, J Virol 79:8431-8439参照)のSapI部位に、多重
セグメントライゲーションによりクローニングした。
(6.2.1.3 フローサイトメーター解析)
細胞表面における血球凝集素タンパク質のレベルを評価するために、293T細胞に、製造
業者の指示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの適当なプラスミド
をトランスフェクトした。トランスフェクションから24時間後、細胞をトリプシン処理し
、2％FBSを含むPBSに懸濁させた後、それらを、1/1000希釈のH1 HAに対するモノクローナ
ル抗体(mAb) 6F12、又は1/400希釈のH3 HAに対するmAb 12D1(Wangらの文献、2010, PLoS
Pathog 6:e1000796参照)で染色した。染色された細胞をBeckman Coulter Cytomics FC 50
0フローサイトメーターで計数し、結果を、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。
(6.2.1.4 偽粒子生成及び侵入アッセイ)
偽粒子産生のための手順を以前の研究を基に改変した(例えば、Evansらの文献、2007,
Nature 446:801-805;及びSuiらの文献、2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009参照)。簡
潔に述べると、293-T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイルス(V1-GLuc)、(ii)H
IV Gag-Pol、(iii)異なるキメラ血球凝集素タンパク質、及び(iv)A型インフルエンザPR8
ノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコトランスフェクトした。トラン
スフェクションから72時間後、上清を回収し、その後、濾過した(0.45μm孔径)。偽粒子
を用いる形質導入及び感染アッセイは全て、1μg/mlのポリブレン(Sigma, St. Louis, MO
)の存在下で実施した(Suiらの文献、2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009参照)。
侵入アッセイは、MDCK細胞を、異なるキメラ血球凝集素を有し、G-Lucレポーターを含
む偽粒子に感染させることにより実施した。感染から24時間後、細胞を新鮮な培地で3回
洗浄して、偽粒子接種材料中に存在するG-Lucタンパク質を除去した。感染から48時間後
、ルシフェラーゼアッセイを実施した(Evansらの文献、2007, Nature 446:801-805参照)
。
(6.2.1.5 組換えキメラA型インフルエンザウイルスのレスキュー)
プラスミドDNAからのA型インフルエンザウイルスのレスキューを、以前に記載されてい
る通りに実施した(例えば、Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びHaiらの文
献、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。組換え野生型(rWT)PR8ウイルスを作製するた
めに、293T細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、1μgの8
つのpDZ PR8レスキュープラスミドの各々をコトランスフェクトした。異なるキメラHAを
発現するウイルスを同じ方法で作製したが、HAプラスミドを対応するキメラプラスミドに
置き換えて、対応するキメラウイルスを回収した。感染から6時間後、培地を、0.3％ウシ
血清アルブミン(BSA)、10mM HEPES、及び1.5μg/ml TPCK(L-1-トシルアミド-2-フェニル
エチルクロロメチルケトン)処理トリプシンを含むDMEMと交換した。トランスフェクショ
ンから24時間後、ウイルス含有上清を8日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のイン
キュベーションの後、尿膜腔液を回収し、ウイルスの存在について、ニワトリ赤血球の血
球凝集により、及びMDCK細胞におけるプラーク形成によりアッセイした。
(6.2.1.6 ウイルス増殖動態アッセイ)
組換えウイルスの複製特徴を解析するために、10日齢の発育鶏卵に100pfuの各々それぞ
れのウイルスを接種した。尿膜腔液を回収し、その後、0、9、24、48、及び72感染後時間
(hpi)でのウイルス増殖についてアッセイした。尿膜腔液中に存在するウイルスの力価をM
DCK細胞でのプラークアッセイにより決定した。
(6.2.1.7 プラークの免疫染色)
プラークを、A型インフルエンザNPタンパク質に対するmAb(HT103)による免疫染色によ
り可視化した。
(6.2.1.8 ウェスタンブロット及び間接免疫蛍光解析)
12ウェルディッシュのうちの1つのウェルのコンフルエントなMDCK細胞を、37℃で1時間
、表示された組換えインフルエンザウイルスに感染させるか(2の感染多重度[MOI])、又は
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に模擬感染させた。12感染後時間(hpi)で、細胞を、以前に記
載されている通りに1×タンパク質ローディングバッファーに溶解させた(例えば、Haiら
の文献、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。還元された細胞ライセートを、A/NPに対
するmAb(HT103)、A/PR8/HAに対するmAb(PY102)、A/Cal/09/HAに対するmAb(29C1)、A/VN/H
Aに対するmAb(M08)(20)、A/H3/HAに対するmAb(12D1)を使用することによって、ウェスタ
ンブロット解析により解析した。パース-cH7の検出は、BEI Resourcesから入手されるA/F
PV/オランダ/27(H7)ウイルスに対するヤギポリクローナル血清のNR-3152を使用した。mAb
抗 グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)ローディング対照抗体はAbcam
製であった。関心対象のタンパク質は全て、増強化学発光タンパク質検出系(PerkinElmer
Life Sciences, Boston, MA)を用いて可視化した。
免疫蛍光解析のために、15-mmカバースリップ上のコンフルエントなMDCK細胞の単層に
、組換えウイルスを2のMOIで感染させた。15hpiで、細胞を固定し、メタノール-アセトン
(比率、1:1)で、-20℃で20分間透過処理した。0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清
アルブミンでブロッキングした後、細胞を、上記のように、A/NPに対する抗体(HT103)、A
/H1/HAに対する抗体(6F12)、A/PR8/HAに対する抗体(PY102)、A/Cal/09/HAに対する抗体(2
9C1)、A/VN/HAに対する抗体(M08)(20)、A/H3/HAに対する抗体(12D1)、及びA/H7ウイルス
に対する抗体(NR-3152)とともに1時間インキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで3
回洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウス免疫グロブリンG(IgG;
Invitrogen, Carlsbad, CA)又はAlexa Fluor 594コンジュゲート抗ヤギ免疫グロブリンG(
IgG, Invitrogen, Carlsbad, CA)とともに1時間インキュベートした。最後に3回洗浄した
後、感染細胞を、Olympus IX70顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡法により解析した。
(6.2.2 結果)
(6.2.2.1 キメラ血球凝集素の作製)
Cys52-Cys277ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の保存に関する情報を得るた
めに、H1、H3、H5、及びH7亜型のA型インフルエンザウイルスHA配列のアラインメントを
作成した(図6参照)。免疫優性抗原性部位が球状ヘッドドメイン上に存在することが主な
原因で、HA1サブユニットの配列は、HA2サブユニットの配列よりも保存されていない。よ
り保存されたHA2鎖は、HA分子をウイルスエンベロープに固定するストーク領域を含む。
このアラインメントは、Cys52及びCys277並びに両末端に向かうアミノ酸が選択された亜
型にわたって保存されていることを示している。これ以降、Cys52に対してN末端及びCys2
77に対してC末端の血球凝集素配列をストークドメインと定義する(図6)。介在配列は、こ
の実施例において、ヘッドドメインであるとみなされる。
パンデミックH1 Cal/09 HA球状ヘッドドメインをPR8(H1) HA由来のストーク領域ととも
に含むキメラ血球凝集素構築物(PR8-cH1)を最初に作製した(図7A)。VN1203(H5) HA由来の
球状ヘッドをPR8(H1) HA由来のストークとともに含むキメラHA(PR8-cH5)も作製した(図7B
)。インフルエンザHAの全16種の亜型は2つの系統発生学的グループ(グループ1及び2)に分
類され(例えば、Suiらの文献、2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273参照)、H1 HAとH5
HAは両方ともグループ1に属するので、A/アルバータ/24/01(H7)ヘッドドメインをA/パー
ス/16/2009(H3) HA(パース-cH7)由来のストーク領域とともに有するキメラHAを作製する
ための同様の戦略(図7B)を適用した。H7とH3は両方とも、グループ2の系統発生学的グル
ープ由来のメンバーである(例えば、Suiらの文献、2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-2
73参照)。
次に、様々なキメラHA構築物が発現されて細胞表面に輸送されているかどうかを検討し
た。それぞれ、PR8及びH3ストークドメイン特異的抗体で表面染色した後、一過性にトラ
ンスフェクトした293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)解析を実施した(図8A)。図8A
に示すように、3つ全てのキメラ構築物の発現を検出した。この検出により、ゴルジ複合
体から細胞表面へのキメラHAの輸送が分断されないことが示される。
次に、様々なキメラHAの侵入特徴を、MDCK細胞を、キメラHA、野生型A型インフルエン
ザPR8 NA、及びHIVベースのルシフェラーゼを含むレトロウイルスHAシュードタイプ化粒
子に感染させることにより調べた。キメラHAタンパク質によって媒介される侵入効率は、
ルシフェラーゼの読出しにより検出した。同程度のレベルのシュードタイプ化粒子媒介性
ルシフェラーゼ送達が、PR8-cH5及びパース-cH7キメラHA並びに対応する野生型タンパク
質について観察された(図8B)。PR8-cH1 HAは、他のHA構築物と比べてより低いルシフェラ
ーゼレベルを示した。
(6.2.3 キメラ血球凝集素を有する組換えインフルエンザウイルスの作製)
上の結果を考慮して、キメラHAがウイルス粒子全体との関連で最終的に機能的であるか
どうかということが、キメラHAのみを発現する組換えA型インフルエンザウイルスのレス
キューを可能にすることを確かめた。以前に発表されたプロトコル(例えば、Fodorらの文
献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びHaiらの文献、2008, J Virol 82:10580-10590)を
用いて、異なるキメラHAの全てを含むウイルスを作製するのに成功した。得られたウイル
スをプラーク精製し、10日齢の発育卵中で増幅させ、キメラセグメントをRT-PCRにより解
析し、シークエンシングした。どの場合も、ウイルスは、予想されたキメラHAセグメント
を有し、他のHAセグメントを有さないことが分かった。
キメラウイルスの同一性を感染細胞のウェスタンブロッティング及び間接免疫蛍光によ
りさらに示した(図9A及び9B)。MDCK細胞を、rWT A/PR8、野生型A/パース、PR8-cH1、PR8-
cH5、及びパース-cH7ウイルスに感染させた(図9A及び9B)。PR8-cH1及びPR8-cH5キメラHA
タンパク質を、ぞれぞれ、Cal/09 HAに対する抗体(29C1)又はVN/04 HAに対する抗体(M08)
のどちらかを用いて、対応する試料中で検出した(Steelらの文献、2009, J Virol 83:174
2-1753参照)(図9A)。汎H3ストークmAbの12D1(Wangらの文献、2010, PLoS Pathog 6:e1000
796参照)を用いて、パースcH7-HAと野生型パースHAの間での同程度の発現レベルが観察さ
れた。抗H7抗体(NR-3152)を使用したとき、陽性バンドは、パース-cH7感染試料でしか検
出されなかった。
免疫蛍光研究について、感染条件は、ウェスタン解析の感染条件と同様であった。感染
細胞を、図9Bに示すように、対応する抗体で染色した。感染細胞は全て、予想されたHA発
現及び予想されたA/NPタンパク質発現を示した(図9B)。
(6.2.4 組換えウイルスの複製特徴)
ウイルスの増殖特性を、10日齢の発育鶏卵中、37℃で評価した(図8A)。キメラHAを発現
する組換えウイルスの増殖動態との比較のために、rWT PR8ウイルスを含めた。PR8-cH5ウ
イルスに関して、PR8ウイルスと比較して同様の複製パターンが観察された。パース-cH7
ウイルスに関して、rWT PR8ウイルスと比較して、9hpiでウイルス力価が2倍低下した。そ
れにもかかわらず、それは、48hpiで、野生型ウイルスと同様のピーク力価(1×109 PFU/m
l)に達した。全ての時点を通した力価の低下によって示されるように、rWT PR8ウイルス
と比較すると、PR8-cH1ウイルスは弱毒化されていた。それにもかかわらず、このキメラ
ウイルスですら、約108 PFU/mlというかなりのピーク力価に達した。キメラウイルスの各
々のプラーク表現型もMDCK細胞で評価した。図8Bに示すように、全てのウイルスが同程度
のサイズのプラークを形成した。これらの結果から、キメラHA構築物がインビボで正しく
フォールディングし、生物学的に機能的であることが確認される。
(6.2.5 結論)
ヘッドドメインとストークドメインの境界を定める保存されたジスルフィド結合Cys52-
Cys277を利用することにより、異なるHA球状ヘッドドメインを有するキメラHAタンパク質
を有するインフルエンザウイルスを作製するための新しい戦略を開発した。したがって、
もとのヘッドドメインを別のHAのヘッドドメインと置換することにより、同じストークを
有するが、異なる球状ヘッドを有する一連のキメラHAを作製した。この設計を、PR8スト
ークドメインをCal/09及びVN H5球状ヘッドとともに含む、多数の亜型にわたって検討し
た。さらに、H7球状ヘッドをH3ストークドメイン上に配置した。これらの構築物は、両方
の系統発生学的グループのインフルエンザHAタンパク質を網羅する。各々の構築物は細胞
表面に発現し、図7に示すように融合活性を保持した。キメラHAを有する組換えウイルス
の作製により、HAが正しくフォールディングし、生物学的機能を保持することがさらに立
証された。
(6.3 実施例3:キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドの診断的適用及び
キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドによるマウスのワクチン接種)
この実施例は、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを診断目的で利
用することができること、及びキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを
発現するウイルスをワクチンで利用することができることを示している。
(6.3.1 材料及び方法)
(6.3.1.1 細胞及びプラスミド)
293T細胞及びMDCK細胞をATCCから入手し、それぞれ、各々10％胎仔ウシ血清(HyClone)
、及び100ユニット/mlのペニシリン-100μg/mlのストレプトマイシン(Pen/Strep, Gibco)
を補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)及び最小必須培地(どちらもGibco製)中
で維持した。10％胎仔ウシ血清を補充したTNM-FH(Sigma-Aldrich)とHyclone SFX昆虫培地
(ThermoScientific)とを、Sf9及びBTI-TN5B1-4(High Five)細胞培養に使用した。
A/マガモ/スウェーデン/81/02(「cH6」)ウイルス又はA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99(
「cH9」)ウイルスのどちらかに由来する球状ヘッドドメインを含むA/プエルトリコ/8/193
4(PR8)のストークを有するキメラ血球凝集素構築物を同様の技術を用いて作製した。キメ
ラH6構築物については、様々な成分をPCRにより増幅させ、以前に記載されたクローニン
グ戦略を用いてpDZプラスミドにクローニングした(例えば、Fodorらの文献、1999, J Vir
ol 73:9679-82;及びHaiらの文献、2008, Journal of Virology 82:10580-90参照)。簡潔
に述べると、キメラ血球凝集素(cHA)の様々な成分を、Sap I部位を含むプライマーでPCR
により増幅させ、Sap Iで消化し、pDZプラスミドのSap I部位にクローニングした。バキ
ュロ転移プラスミドの作製のために、cH6をPCRにより増幅させ、BamHI及びNotIで切断し
、C末端T4ファージフォルドン及び6-hisタグを有する修飾されたpBacPAK8(Gentech)バキ
ュロ転移ベクターにインフレームでクローニングした(Meierらの文献、2004, J Mol Biol
344:1051-69参照)。全てのプラスミドの配列をサンガーシークエンシングにより確認し
た。
(6.3.1.2 組換えcH9ウイルスのレスキュー)
組換えワクチンウイルスをレスキューするために、PR8由来の7つの野生型ウイルスセグ
メントのvRNA及びmRNAをコードする8つのリバースジェネティックスプラスミドと、cH9と
を、以前に記載されている通りに使用した(Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-82;
及びPleschkaらの文献、1996, J Virol 70:4188-92)。簡潔に述べると、293T細胞に、Lip
ofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのプラスミドの各々をトランスフェク
トした。トランスフェクションから12時間後、培地を、0.3％ウシ血清アルブミン、10mM
HEPES、及び1.5μg/mLのTPCK(l-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)
処理トリプシンを含むDMEMと交換した。トランスフェクションから2日後、ウイルス含有
上清を10日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のインキュベーションの後、尿膜腔
液を回収し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの存在についてアッセイした。
その後、レスキューされたcH9ウイルスを10日齢の卵中で増殖させ、次いで、37℃で48時
間インキュベートした。ウイルスストックの力価を、以前に記載されている通りにプラー
クアッセイにより測定した(例えば、Steelらの文献、2009, Journal of Virology 83:174
2-53参照)。cH9の配列を逆転写PCR産物のシークエンシングにより確認した。
(6.3.1.3 組換えバキュロウイルス作製、タンパク質発現、及び精製)
cH6を保有する組換えバキュロウイルス(rBV)を作製するために、プラスミド及びBaculo
gold DNA(BDBioschiences)を、製造業者の指示に従ってCellfectin II(Invitrogen)を用
いて、Sf9細胞にコトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、TNM-FH培地(Gemi
ni Bioproducts, West Sacramento, CA)中で増殖させたSf9細胞で増幅させ、力価を、以
前に記載されている通りにプラークアッセイにより決定した(例えば、Steelらの文献、20
09, Journal of Virology 83:1742-53参照)。
HyClone SFX昆虫細胞培地(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)中で増殖させたHi
gh Five細胞(Krammerらの文献、2010, Mol Biotechnol 45:226-34参照)を、500mlの振盪
フラスコ中、10の感染多重度(MOI)及び1×106細胞/mlの細胞密度で、cH6を発現するrBVに
感染させた。感染から96時間後、細胞を回収し、室温で2000×gで10分間の低速遠心分離
により、上清から分離した。cH6タンパク質の精製のために、上清を回収し、Ni-NTA樹脂(
Qiagen)とともに4℃で2時間インキュベートした。スラリーをカラムに充填し、洗浄バッ
ファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl, 20mMイミダゾール、pH 8)で3回洗浄した。タンパク
質を溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH 8)で0.5mlずつ
溶出させ、タンパク質含量についてブラッドフォード試薬で試験し、タンパク質を含む画
分をプールした。タンパク質の純度及び同一性を、SDS-PAGE、クマシー染色、及びウェス
タンブロットにより試験した。タンパク質濃度をブラッドフォード試薬で決定した。
(6.3.1.4 マウス実験)
全ての処置のために、マウスを0.1mLのケタミン/キシラジン混合物(1.5mgケタミン及び
0.3mgキシラジン)の腹腔内注射で麻酔した。
マウス50％致死用量(LD50)を、4匹のマウスの群をインフルエンザウイルスの10倍連続
希釈液に感染させることにより、BALB/cマウス(Charles River Laboratories)で決定した
。体重を2週間にわたってモニタリングした。その体重の25％超を失ったマウスを実験的
エンドポイントに達したものとみなし、安楽死させた。LD50値をReed及びMeunchの方法に
より計算した(Reed及びMeunchの文献、1938, Am. J. Hyg. 27:493-497参照)。
A/カリフォルニア/04/09(Cal/09)ウイルス感染後に産生されるステム抗体を評価する実
験のために、以前に記載されているような電気刺激の適用(TriGrid送達系、Ichor Medica
l Systems)(例えば、Luxembourgらの文献、2007, Expert Opinion on Biological Therap
y 7:1647-64参照)に加えて、雌の8〜10週齢BALB/cマウスを、PR8ウイルス由来の全長HAを
コードする80μgの発現プラスミドの筋肉内投与で最初に初回免疫した。3週間後、マウス
を、50μl容量中の致死未満用量の104PFU Cal/09で鼻腔内に追加免疫した。対照動物は、
DNAのみ又はCal/09ウイルスのみ又は2009-2010ワクチン(Cal/09スプリットワクチン)の筋
肉内注射のいずれかを受容した。追加免疫から3週間後、又は対照動物について同等の時
点で、マウスから採血し、血清を回収して、cH6に対する反応性を下記のような免疫蛍光
により試験した。
ワクチン構築物としてのcH9ウイルスの効力を試験する実験のために、PR8全長DNAを上
記の通りに投与した。初回免疫から3週間後、マウスに、鼻腔内に注入される103PFUのcH9
ウイルスを接種した。対照動物は、DNAのみ又はCal/09ウイルスのみ又は精製不活化PR8ウ
イルスのいずれかを筋肉内に受容した。追加免疫から3週間後、又は対照動物について同
等の時点で、マウスを5×104 LD50のPR8ウイルスの鼻腔内接種で感染させた。マウスを感
染後14日間計量した。その初期体重の27.5％超を失ったマウスを安楽死させ、死亡と記録
した。
(6.3.1.5 キメラ血球凝集素の発現を確認するための免疫蛍光)
293T細胞のコンフルエントな単層に、1μgのpDZ cH6プラスミドをトランスフェクトし
た。トランスフェクションから48時間後、細胞を固定し、0.1％Tween 20を含むPBS中の1
％ウシ血清アルブミンでブロッキングした。その後、細胞を、上記の4つの実験群(PR8 DN
Aのみ、Cal/09のみ、PR8 DNA及びCal/09感染、又はCal/09スプリットワクチンのみ)の各
々の動物からプールされた血清とともにインキュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで
3回洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488コンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)ととも
に1時間インキュベートした。感染細胞を、Olympus IX70顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡法に
より解析した。
(6.3.1.6 ELISA)
96ウェルELISAプレート(Nunc, MaxiSorp)に、50mlのバキュロウイルス発現cH6をコーテ
ィングし、4℃で一晩インキュベートした。プレートを3％ミルク/PBSでブロッキングし、
その後、PBS/0.1％Tween(PBST)で洗浄した。ワクチン接種マウス由来の血清をPBSに連続
希釈し、プレートに添加し、次いで、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレー
トをPBSTで洗浄し、1:2500希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG(GE Healt
hcare)とともにインキュベートした。PBSTでさらに洗浄した後、SigmafastOPD基質(Sigma
)を添加した。反応を3M H2SO4で停止させ、光学密度測定を490nmで行った。
(6.3.2 結果)
(6.3.2.1 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドは診断的適用に使用す
ることができる)
免疫マウスによるH6ステムドメインに対する抗体の産生をアッセイする解析ツールとし
ての役割を果たすH6インフルエンザウイルス亜型の血球凝集素由来の球状ヘッドドメイン
及びPR8ウイルスの血球凝集素由来のステム/ストークドメインを含むキメラ血球凝集素構
築物を作製した。免疫マウスはH1ウイルスの球状ヘッドにのみ暴露されたので、実験動物
で生成される抗体は、それらがそのH1ステムに対するものであった場合、キメラH6血球凝
集素(cH6)に対してのみ反応することとなった。
図11A及び11Dに示すように、DNAのみ又はパンデミックスプリットワクチンによる処置
は、ワクチン接種マウスにおいてステム反応性抗体を誘発しなかった。逆に、Cal/09のみ
の感染は、ステム反応性抗体を生成させたが(図11B)、DNAエレクトロポレーション及び感
染によって誘発されるほどではなかった(図11C)。交差反応性H1ステム抗体であるC179を
トランスフェクションの対照として使用した(図11E)。予想された通り、PR8の球状ヘッド
に対する抗体であるPY102は、トランスフェクトされたcH6 HAに反応しなかった(図11F)。
図13に示すように、ステム抗体結合を検出するツールとしてのcH6キメラインフルエン
ザウイルス血球凝集素ポリペプチドの有用性をELISAにより確認した。
(6.3.2.2 キメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドはワクチンで使用する
ことができる)
図12に示すように、不活化PR8ウイルスをワクチン接種した動物は致死感染から防御さ
れたが、DNAのみを受容した動物は、感染後5日までに感染が原因で完全に死亡した。cH9
ウイルスのみを受容した動物も感染から防御されず、生存率はわずか25％であった。対照
的に、最初にDNAで初回免疫し、その後、cH9ウイルスで追加免疫した動物は、感染から防
御され、生存率は、不活化ウイルス調製物をワクチン接種した動物と統計的に同じであっ
た。
(6.4 実施例4: 2009パンデミックH1N1インフルエンザウイルスの感染によって誘発され
る血球凝集素ストーク抗体)
この実施例は、ステムドメイン特異的抗体を研究するために使用されたキメラインフル
エンザウイルス血球凝集素ポリペプチドを記載している。これらのポリペプチドを用いて
、2009パンデミックH1N1ウイルスの感染が血球凝集素ステムに対するウイルス中和抗体の
力価の上昇を誘発することが明らかにされた。キメラインフルエンザウイルス血球凝集素
ポリペプチドに加えて、従来の血球凝集阻害アッセイで検出されないインフルエンザウイ
ルス中和抗体を測定するために使用することができるアッセイも記載されている。
(6.4.1 材料及び方法)
(6.4.1.1 細胞及びプラスミド)
293T及びMDCK細胞をATCCから入手し、それぞれ、各々10％胎仔ウシ血清(HyClone)及び1
00ユニット/mlのペニシリン-100μg/mlのストレプトマイシン(Pen/Strep, Gibco)を補充
したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)及び最小必須培地(どちらもGibco製)中で維持
した。10％胎仔ウシ血清を補充したTNM-FH培地(Gemini Bioproducts)と、Hyclone SFX昆
虫培養培地(ThermoScientific)とを、Sf9及びBTI-TN5B1-4(High Five)細胞培養に使用し
た。
A/マガモ/スウェーデン/81/02(cH6/1)ウイルス又はA/ホロホロチョウ/香港/WF10/99(cH
9/1)ウイルスのどちらかに由来する球状ヘッドドメインを含むA/プエルトリコ/8/1934(PR
8)のストークを有するキメラ血球凝集素(cHA)構築物を、以前に記載された方法を用いて
作製した(Haiらの文献、2008, J Virol 82, 10580; Fodorらの文献、1999, J Virol 73,
9679)。簡潔に述べると、キメラ血球凝集素(cHA)の様々な成分を、Sap I部位を含むプラ
イマーでPCRにより増幅させ、Sap Iで消化し、pDZプラスミド(Quinlivanらの文献、2005,
J Virol 79, 8431)のSap I部位にクローニングした。バキュロ転移プラスミドの作製の
ために、cH6/1及びcH9/1をPCRにより増幅させ、BamHI及びNotIで切断し、C末端T4ファー
ジフォルドン及び6-hisタグを有する修飾されたpFastBac(Invitrogen)バキュロ転移ベク
ターにインフレームでクローニングした(Meierらの文献、2004, J Mol Biol 344, 1051)
。全てのプラスミドの配列をサンガーシークエンシングにより確認した。
(6.4.1.2 組換えバキュロウイルス作製、タンパク質発現、及び精製)
組換えcH6/1及びcH9/1タンパク質を作製するために、バキュロ転移ベクターを、製造業
者の指示に従って、大腸菌株DH10Bac(Invitrogen)中に形質転換した。正しい表現型を示
すDH10Bacコロニーを採取し、増殖させ、バクミドをPlasmid Midi Kit(Qiagen)を用いて
調製した。
cH6/1又はcH9/1遺伝子を保有するバクミドを、製造業者の指示に従ってCellfectin II(
Invitrogen)を用いて、Sf9細胞にトランスフェクトした。組換えバキュロウイルスを、TN
M-FH培地(Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA)中で増殖させたSf9細胞で増幅させ
、力価をプラークアッセイにより決定した(Kingらの文献、2007, Methods Mol Biol 388,
77)。
HyClone SFX昆虫細胞培地(Thermo Fisher Scientific)中で増殖させたHigh Five細胞を
、500mlの振盪フラスコ中、10の感染多重度(MOI)及び1×106細胞/mlの細胞密度で、cH6/1
又はcH9/1を発現する組換えバキュロウイルスに感染させた(Krammerらの文献、2010, Mol
Biotechnol 45, 226)。感染から96時間後、細胞を回収し、2000×g及び室温で10分間の
低速遠心分離により、上清から分離した。cHAタンパク質の精製のために、上清を回収し
、Ni-NTA樹脂(Qiagen)とともに4℃で2時間インキュベートした。スラリーをカラムに充填
し、洗浄バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH 8)で3回洗浄し
た。タンパク質を溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH 8
)で0.5mlずつ溶出させ、タンパク質含量についてブラッドフォード試薬で試験し、タンパ
ク質を含む画分をプールした。プール画分をPBS中でバッファー交換し、10kD分子量カッ
トオフを有するAmicon Ultra遠心分離フィルターユニット(Millipore)を用いて、スイン
グ式バケットローター中で濃縮した。タンパク質の純度及び同一性を、SDS-PAGE、クマシ
ー染色、及びウェスタンブロットにより試験した。以下の抗体:抗H6ヤギ抗血清(BEI, #NR
-663)、G1-26(抗H9、マウス; BEI# NR-9485)、3951(ウサギ、抗HA2 PR8)(Gravesらの文献
、1983, Virology 126, 106)、PY102(抗PR8ヘッド、マウス)、及び12D1(抗H3ストーク、
マウス)(Wangらの文献、2010, PLoS Pathog 6, e1000796)を用いて、cHAの発現を確認し
た。最終的なタンパク質濃度をブラッドフォード試薬で決定した。
(6.4.1.3 組換えcHA発現ウイルスのレスキュー)
cH9/1を発現する組換えウイルスをレスキューするために、PR8由来の6つの野生型ウイ
ルスセグメントのvRNA及びmRNAをコードするリバースジェネティックスプラスミド、並び
にA/マガモ/アルバータ/24/01ウイルス及びcH9/1由来のN3 NAをコードするプラスミドを
、以前に記載されている通りに使用した(Haiらの文献、2008, J Virol 82, 10580; Fodor
らの文献、1999, J Virol 73, 9679, 27)。簡潔に述べると、293T細胞に、製造業者の指
示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのプラスミドの各々を
トランスフェクトした。トランスフェクションから12時間後、培地を、0.3％ウシ血清ア
ルブミン、10mM HEPES、及び1.5μg/mLのTPCK(l-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロ
ロメチルケトン)処理トリプシン(Sigma T1426)を含むDMEMと交換した。トランスフェクシ
ョンから2日後、ウイルス含有上清を10日齢の発育鶏卵中に接種した。37℃で2日間のイン
キュベーションの後、尿膜腔液を回収し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの
存在についてアッセイした。その後、レスキューされたcH9/1ウイルスを10日齢の卵中で
増殖させ、次いで、37℃で48時間インキュベートした。ウイルスストックの力価を、TPCK
トリプシンの存在下、以前に記載されているMDCK細胞でのプラークアッセイにより測定し
た(Steelらの文献、2009, J Virol 83, 1742)。cH9/1 RNAの配列を逆転写PCR産物のシー
クエンシングにより確認した。
(6.4.1.4 キメラ血球凝集素の発現を確認するための免疫蛍光)
MDCK細胞のコンフルエントな単層を、2のMOIでcH9/1N3ウイルスに感染させた。感染か
ら48時間後、細胞を固定し、0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清アルブミンでブロ
ッキングした。その後、細胞をマウスmAb:抗NP抗体HT103、PY102、抗H9(BEI NR#9485)、
又は汎H1ストーク特異的抗体(6F12)とともにインキュベートした。0.1％Tween 20を含むP
BSで3回洗浄した後、細胞をAlexa Fluor 488コンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)と
ともに1時間インキュベートした。感染細胞をOlympus IX70顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡法
により解析した。
(6.4.1.5 ヒト血清試料)
ヒト血清試料を回収し、施設内プロトコルに準拠して使用した。血清を3つの患者コホ
ート: pH1N1に感染していない成人、pH1N1に感染していない小児、及びpH1N1ウイルスに
感染した成人から回収した。血清をpH1N1に感染した患者から症候性感染の最初の3週間以
内に回収した。プール血清を用いる実験については、等容量の各々の試料を混合して、プ
ールを作製した。感染の確認は、Wrammertらによって、RT-PCR及び血清学的アッセイによ
り実施された(Wrammertらの文献、2011, J Exp Med 208, 181-193)。
(6.4.1.6 血球凝集素阻害アッセイ)
血球凝集の非特異的阻害因子を除去するために、回収された血清を、トリプシン-熱-過
ヨウ素酸処理によるか又はRDE処理により、最初に不活化した(Coleman, Dowdleの文献、1
969, Bull World Health Organ 41, 415(1969)。血球凝集阻害(HI)アッセイを実施して、
cH9/1N3及びA/アヒル/フランス/MB42/76(H6 HA)(Desselbergerらの文献、1978, Proc Nat
l Acad Sci U S A 75, 3341(Jul, 1978))ウイルスとの反応性を、以前に記載されている
通りに試験した(Lowenらの文献、2009,. J Virol 83, 2803)。HI活性が1:10希釈の血清で
見られない場合、試料を陰性とみなす。
(6.4.1.7 ELISA)
96ウェルELISAプレート(Qiagen HisSorb又はNunc Immulon 2)に、PBSに希釈した50ulの
バキュロウイルス発現cH6/1、cH9/1、もしくは全長血球凝集素(H5 HA、BEI NR#660; H3 H
A、BEI NR#15171)タンパク質、又はH1配列(PR8)の長いαヘリックス(LAH)(Wangらの文献
、2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979)をコーティングし、4℃で一晩インキュ
ベートした。プレートを0.5％ミルク/2％ヤギ血清/PBSでブロッキングし、その後、PBS/0
.1％Tween(PBST)で3回洗浄した。モノクローナル抗体、ヒト対象由来血清、及び対照とし
て使用されるマウス血清をPBS又はブロッキングバッファーに連続希釈し、その後、プレ
ートに添加し、次いで、室温で1時間インキュベートした。その後、プレートをPBSTで3回
洗浄し、アルカリホスファターゼ(AP)(Meridian Life Science)又は抗マウスAP(Invitrog
en)に結合させたヤギ抗ヒトIgG[Fc]の1:5000希釈液とともにさらに1時間インキュベート
した。PBSTで3回洗浄した後、p-ニトロフェニルホスフェート基質(Sigma)を添加した。10
分後、反応をNaOHで停止させ、光学密度測定を405nmで行った。
(6.4.1.8 プラーク減少アッセイ)
感染した成人及び未感作(pH1N1ウイルスに感染していない)患者由来血清を最初にプー
ルし、IgGタンパク質の精製のために、プロテインGセファロース(GE Healthcare)を含む
重力流カラムに充填した。カラムをPBSで洗浄した。ポリクローナル抗体を0.1Mグリシン
バッファー(pH 2.7)で溶出させた。2M Tris-HClバッファー(pH 10)を1:10の比率ですぐに
添加して、pHをもとに戻した。溶出液をPBS中でバッファー交換し、50kD MWカットオフを
有するAmicon Ultra-15遠心分離フィルターユニット(Millipore)を用いて、スイング式バ
ケットローター中で濃縮した。タンパク質濃度を、A280法を用いてNanoDrop 2000分光光
度計で測定した。非特異的血清阻害因子の除去を、多数のウイルス株を用いて、精製IgG
調製物中にHI活性が存在しないことを示すHI試験で確認した(データは示さない)。ストー
ク反応性抗体の中和能力を、以前に記載されている通りに評価した(Wangらの文献、2010,
PLoS Pathog 6, e1000796)。ウイルスを、1ウェル当たり100プラーク形成単位を生じさ
せる濃度にまで最初に希釈した。その後、プール血清由来の様々な濃度のIgGをウイルス
とともに室温で1時間共インキュベートした。MDCK細胞を播種した6ウェルプレートをPBS
で洗浄し、その後、200ulのウイルス-IgG混合物に感染させた。37℃で45分間のインキュ
ベーションの後、ウイルス及びIgGを細胞から吸引し、適切な抗体濃度及びTPCKトリプシ
ンを含む寒天オーバーレイを各々のウェルに添加した。プレートを37℃で2日間インキュ
ベートした。プラークを、抗H9抗体G1-26を用いる免疫染色により可視化した(Bouvierら
の文献、2008, J Virol 82, 10052)。
(6.4.1.9 シュードタイプ粒子中和アッセイ)
シュードタイプ粒子産生の手順を以前の研究を基に改変した(Evansらの文献、2007, Na
ture 446, 801)。簡潔に述べると、293-T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイル
ス(V1-GLuc)、(ii)HIV Gag-Pol、(iii)キメラcH9/1血球凝集素タンパク質、及び(iv)B型
インフルエンザ/山形/16/88ノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコトラ
ンスフェクトした(Tscherneらの文献、2010, J Virol Methods 163, 336)。V1-GLucプラ
スミドは、細胞から分泌され、細胞上清中で検出することができるルシフェラーゼタンパ
ク質をコードしている。トランスフェクションから48時間後、上清を回収し、その後、cH
9/1粒子調製物を精製するために濾過した(0.45μm孔径)。その後、粒子を(感染後に線形
範囲内のルシフェラーゼ活性を与えることが判明している量で)様々な濃度(50μg/ml、10
μg/ml、及び2μg/ml)の精製ヒトIgGとともにインキュベートし、MDCK細胞に添加した。
感染が6時間進行した後、細胞を洗浄し、新鮮な上清を細胞に加えた。シュードタイプ粒
子を用いる感染は全て、1μg/mlポリブレン(Sigma, St. Louis, MO)の存在下で実施した(
Tscherneらの文献、2010, J Virol Methods 163, 336)。感染から48時間後、ルシフェラ
ーゼアッセイを実施した。
(6.4.2 結果)
(6.4.2.1 キメラ血球凝集素に基づく試薬の開発)
解析ツールとしての役割を果たすキメラ血球凝集素(cHA)構築物を作製して、ヒト血清
中のストーク抗体の存在を評価した。C52とC277の間に存在し、かつHAストークとヘッド
の境界の線引きをするジスルフィド結合を利用することにより、PR8ウイルスのHA由来の
ストークドメインの上にH6又はH9血球凝集素の球状ヘッドドメインをコードする発現プラ
スミドを人為的に作製した(図14A)。ストーク抗体を含むヒト血清試料は、H6又はH9ウイ
ルスに対する血球凝集素阻害(HI)活性について陰性である可能性が高い(これらのウイル
ス亜型に対して事前に暴露されていないことによる)が、H1血球凝集素ストークに対して
事前に暴露されているためにcH6/1又はcH9/1構築物と反応するであろうと仮定した。これ
らのツール、組換え発現cHAタンパク質、及びcHAを発現するウイルスを用いて、ヒト血清
試料中のストーク抗体の相対量を評価し、該ストーク特異的抗体によって媒介される中和
活性を測定することができた。
解析的アッセイ用のcH6/1及びcH9/1タンパク質を生成させるために、キメラHAをコード
するプラスミドを作製し、バキュロウイルス発現系で可溶性タンパク質として発現させた
。2μgの全タンパク質のクマシー染色から、これらの調製物における高い純度が示唆され
る(図17A)。cH9/1のわずかな移動の遅れは、cH9/1ヘッド上での占められたグリコシル化
部位の数の増加の結果であると考えられる。cHAタンパク質を、HAの様々な部分と反応す
る抗体を用いるウェスタンブロット解析によりさらに特徴付けた。図17Bに示すように、c
H6/1、cH9/1、及びPR8由来の全長HAのみが、PR8ストークに特異的なウサギポリクローナ
ル抗血清と反応した。H6、H9、及びPR8のヘッドドメインに対するモノクローナル抗体に
より、キメラ構築物がPR8ストークの上に外来のヘッドを発現することが確認された。H3
タンパク質は、陰性対照として使用され、汎H3抗体12D1を使用した場合にのみ検出された
(Wangらの文献、2010, PLoS Pathog 6, e1000796)。
中和ストーク抗体を検出する目的で、キメラ分子を発現する組換えウイルスもレスキュ
ーした。過去1世紀にわたるヒトインフルエンザウイルスは全て、N1又はN2亜型のNAをコ
ードしているので、cH9/1N3再集合体ウイルスのレスキューにより、どの(N1又はN2)ノイ
ラミニダーゼ抗体活性も測定することなく、ストーク特異的抗体の中和能力の評価が可能
になると推論された。cH9/1N3ウイルス(H9球状ヘッドHAと、N3亜型ノイラミニダーゼとと
もに、H1ストークを発現する)を、リバースジェネティックスを用いてレスキューし、高
力価になるまで発育鶏卵中で増殖させた。このウイルスのプラークアッセイ表現型は、PR
8野生型ウイルスのプラークアッセイ表現型と同様であった(図14C)。ウイルス継代後のH9
ヘッドの存在を確認するために、細胞をcH9/1N3ウイルスに感染させた。その後、感染細
胞を、H9亜型血球凝集素タンパク質に特異的な抗体であるマウスmAb G1-26でプロービン
グした。汎H1ストーク特異的抗体6F12を用いて、野生型PR8ウイルス感染細胞とcH9/1N3ウ
イルス感染細胞の両方を検出した(図14B)。
(6.4.2.2 ストーク特異的抗体はcHAに結合し、それを中和する)
cH6/1及びcH9/1タンパク質をツールとして用いて、ステム抗体を検出することができる
ことを確認するために、これらのcHAの使用を、HAストークと反応することが知られてい
る抗体で最初に検証した。実際、H1 HAのストークと反応する抗体であるマウスmAb C179(
Okunoらの文献、1993, J Virol 67, 2552)は、ELISAにより、用量依存的な形でバキュロ
ウイルス発現cH6/1及びcH9/1タンパク質に結合した(図18A及びB)。
次に、cH9/1N3ウイルスの複製がモノクローナル抗体6F12によって阻害され得るかどう
かを確認した。このモノクローナル抗体は、H1インフルエンザウイルスに対する中和活性
を有する(データは示さない)。抗体6F12は、プラーク減少アッセイにおいて、用量依存的
な形でcH9/1N3ウイルスに結合して、それを中和することができ(図18C及びD)、4μg/mlを
超える濃度で100％阻害が見られた。これらの結果は、キメラタンパク質及び組換えcH9/1
N3ウイルスを用いて、中和活性を有するストーク抗体を検出することができるという仮説
を立証した。
(6.4.2.3 pH1N1に感染した患者は、cHAに結合し、それを中和する高力価の抗体を有する
)
cH6/1及びcH9/1可溶性タンパク質を用いて患者血液試料中のストーク反応性抗体を定量
する前に、HI活性用の血清を、これら2つのHA亜型を発現するウイルスに対して試験した
。A/アヒル/フランス/MB42/76(H6)及びcH9/1N3ウイルスを用いて、回収された成人及び小
児血清試料の全てがHI陰性であることが確認された(結果は示さない)。
次に、血清とcH6/1及びcH9/1タンパク質との反応性をELISAにより試験した。pH1N1ウイ
ルスに感染していない成人及び小児対象から回収された血清は、どちらのタンパク質とも
ほとんど反応性を示さなかった。しかしながら、pH1N1インフルエンザウイルスに感染し
た患者から回収された血清は、両方のcHA構築物に対する結合の増強を示し、pH1N1感染者
由来の血清プールを未感染の成人及び小児の血清プールと比較したとき、IgG反応性の違
いは、(同等の光学密度測定値を生じる希釈液と比べて)30倍を超えて大きかった(図15A及
びB)。したがって、陰性のHIデータを考慮することにより、cHAタンパク質との反応性が
ストークドメイン中で生じると推論された。
ヒト血清のプール試料を用いて、HAステムの一部である、長いαヘリックス(LAH)に対
するIgG結合も試験した。これらのIgGは、マウスにおける防御的免疫を媒介することが以
前に示されていた(Wangらの文献、2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979)。pH1N1
に感染した患者由来の血清は、H1 LAHと反応する抗体を含有していたが、パンデミックウ
イルスに暴露されていない患者は、最小限のLAH特異的血清抗体を有していた(図15C)。
H5血球凝集素亜型は、H1 HAと同じ系統発生学的グループにあり、極めてよく似たスト
ーク構造を共有する(Ekiertらの文献、2009, Science 324, 246)。興味深いことに、pH1N
1に暴露された患者では、H5タンパク質と反応する血清抗体特異性が増大したが(図15D)、
相同なH5亜型ウイルスに対する血清HI活性が全くなかった(データは示さない)。この結果
は、pH1N1ウイルスへの暴露によって、ストーク特異的抗体により媒介されるある程度の
抗H5免疫が付与された可能性があることを示唆した。
重要なことに、pH1N1に感染した患者では、H3血球凝集素タンパク質に特異的な血清抗
体が増加しなかった(H3は、H1及びH5 HAとは別の系統発生学的グループにある)(図15E)。
この結果は、pH1N1感染患者由来の血清中のストーク特異的抗体の力価の増強が通常の免
疫刺激の機能ではなく;むしろ、H1ストーク抗体特異性がパンデミックウイルス株の感染
によって選択的に増大したことを示している。
次に、これらのヒト試料中に見られるこれらのストーク反応性抗体が中和能力を有する
かどうかを評価した。感染した成人及び未感染の成人由来の血清試料をプールし、血球凝
集素ヘッドに結合する非特異的阻害因子(例えば:シアル酸含有分子及びレクチン)を除去
するために、全IgGを精製した。これらの純粋なIgG調製物を用いて、55.5μg/mL全血清Ig
Gを超える抗体濃度での完全阻害プラーク形成(図16A及びB)が達成された。ELISAデータに
よると、pH1N1感染者由来の血清を未感染の成人の血清と比較したとき、中和活性の約30
倍の違いが観察された。mAb 6F12を標準として用いて、6F12によって媒介される中和活性
とポリクローナルヒトIgG調製物によって媒介される中和活性との比較を行うことができ
た。cHAウイルスの100％中和をもたらした6F12の濃度とヒトIgGの濃度を比較することに
より、最後の30日間にpH1N1に感染した患者由来の全ヒトIgGの7％が中和ストーク抗体を
含むと推測された。
最後に、ストーク反応性抗体の中和能力を、シュードタイプ粒子感染アッセイを用いて
評価した。このアッセイは、宿主細胞へのウイルス侵入時に生成されるルシフェラーゼ活
性の読出しを有する。cH9/1タンパク質を発現するシュードタイプ化粒子を精製ヒトIgGと
ともにインキュベートし、中和活性を、細胞上清中のルシフェラーゼ酵素活性の欠如をも
たらす粒子侵入の阻害により測定した(方法参照)。プラーク減少アッセイと一致して、シ
ュードタイプ化粒子アッセイも、10μg/mlを超える全IgG濃度で粒子の100％中和を示した
(図16C)。
(6.4.3 結論)
血球凝集素タンパク質の球状ヘッドに結合する抗体も含む調製物中でのストーク特異的
抗体の選択的検出を可能にする、キメラ血球凝集素タンパク質及び該キメラタンパク質を
発現するウイルスの形態の、新規の解析ツールを開発した。これらの新規の血球凝集素構
築物は、不変のH1亜型ストークを異なる血球凝集素亜型由来の球状ヘッドドメインととも
に(例えば: H1ストークをH6ヘッドとともに)有している。これを、血球凝集素タンパク質
(19)のシステイン52と277の間に存在するジスルフィド結合を利用することにより達成し
、介在配列を異なるHA亜型の配列と交換した。
これらのキメラ血球凝集素(cHA)構築物を用いて、pH1N1ウイルス感染が確認されたヒト
の小コホートが、未感染の成人及びpH1N1ウイルスに感染していない小児対照と比べて高
い力価のストーク特異的な中和抗体を生成させることが示された。これらの知見は、pH1N
1感染に応答して生成される、血球凝集素(hemagglutintin)ストークと反応する抗体が、2
009年のインフルエンザパンデミック以前に循環していた季節性H1N1ウイルスの絶滅の一
因となった可能性が高いという仮説を支持する。
(6.5 実施例5:キメラ血球凝集素:異なる亜型及び系統発生学的グループに由来する球状
ヘッドドメイン及びストークドメインを発現するインフルエンザウイルス)
この実施例は、異なる血球凝集素亜型及び異なる系統発生学的グループ由来の種々の球
状ヘッド及びストーク組合せを包含するいくつかの機能的キメラインフルエンザウイルス
血球凝集素、並びにこれらのキメラ血球凝集素を発現し、野生型インフルエンザウイルス
の増殖特性と同様の増殖特性を有する組換えインフルエンザウイルスを記載している。こ
れらのキメラ組換えウイルスは、野生型インフルエンザウイルスの増殖特性と同様の増殖
特性を保有しており、ウイルス学的及び免疫学的アッセイでドメイン特異的抗体を測定す
るための試薬として使用することができる。
(6.5.1 材料及び方法)
(6.5.1.1 細胞及びウイルス)
293T及びMDCK細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type C
ulture Collection)(ATCC)から入手し、10％胎仔ウシ血清(HyClone; Thermo Scientific)
及びペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco, Invitrogen)を補充したダルベッコの最小必
須培地(DMEM)又はMEM(Gibco, Invitrogen)のどちらかの中で維持した。A/プエルトリコ/8
/1934(PR8)及びA/パース/16/2009(パース/09)野生型(Alexander Klimov, CDCにより親切
に提供されたもの)及び組換えウイルスを、特定病原菌を含まない10日齢の発育鶏卵(Char
les River)中、37℃で2日間増殖させた。
(6.5.1.2 プラスミドの構築)
様々なキメラ血球凝集素をコードするプラスミドを、以前に記載されているものと同様
の戦略を用いて構築した(例えば、Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びHai
らの文献、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。簡潔に述べると、キメラHAの様々なセ
グメントを、SapI部位を含むプライマーでPCRにより増幅させ、SapIで消化し、アンビセ
ンス発現ベクターであるpDZベクターのSapI部位に、多重セグメントライゲーションによ
りクローニングした。このベクターでは、vRNA転写がヒトRNAポリメラーゼIプロモーター
及びマウスRNAポリメラーゼIターミネーターによって制御され、mRNA/cRNA転写がニワト
リβアクチンポリメラーゼIIプロモーターによって制御される(例えば、Quinlivanらの文
献、2005, J Virol 79:8431-8439参照)。本発明者らは、Daniel Perez(メリーランド大学
)に対して、H7 HAプラスミド(Genbank ID: DQ017504)のことで深く感謝している。A/プエ
ルトリコ/8/1934(PR8)遺伝子をコードするプラスミドを以前に記載されている通りに使用
した(Haiらの文献、2008, J Virol 82:10580-10590)。
(6.5.1.3 ヌクレオチド配列受託番号)
本研究で使用される構築されたcHA遺伝子は全て、受託番号IRD-RG-684014、IRD-RG-684
022、IRD-RG-684030、及びIRD-RG-684038の下、インフルエンザ研究データベース(Influe
nza Research Database)に寄託されている。キメラcH1/1、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3は、
それぞれ、A/プエルトリコ/8-RGcH1-1/34、A/プエルトリコ/8-RGcH5-1/34、A/パース/16-
RGcH7-3/09、及びA/パース/16-RGcH5-3/09として記載されている。
(6.5.1.4 フローサイトメトリー解析)
細胞表面での血球凝集素タンパク質発現のレベルを評価するために、293T細胞に、製造
業者の指示に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの適当なプラスミド
をトランスフェクトするか、又はMDCK細胞をcHA発現組換えウイルスに感染させた。トラ
ンスフェクションから48時間後、293T細胞をトリプシン処理し、2％FBSを含むPBSに再懸
濁させ、その後、モノクローナル抗体(mAb) 6F12(これは、本発明者らの実験室で作製さ
れた、グループ1 HAのストークドメインに広く反応するmAbである(データは示さない))(5
μg/ml)で、又はH3 HAに対するmAb 12D1(5μg/mL)で染色した(Wangらの文献、2010, PLoS
Pathog 6:e1000796参照)。感染から12時間後、MDCK細胞をトリプシン処理により再懸濁
させ、mAb 12D1で染色した。染色された細胞をBeckman Coulter Cytomics FC 500フロー
サイトメーターで解析し、結果を、FlowJoソフトウェアを用いて解析した。
(6.5.1.5 偽粒子生成及び侵入アッセイ)
偽粒子産生のための手順を以前の研究を基に改変した(例えば、Evansらの文献、2007,
Nature 446:801-805及びTscherneらの文献、2010, J Virol Methods 163:336-43参照)。
簡潔に述べると、本発明者らは、293T細胞に、(i)所望のレポーターを含むプロウイルス(
V1-Gaussiaルシフェラーゼ)(Evansらの文献、2007, Nature 446:801-805)、(ii)HIV Gag-
Pol(Evansらの文献、2007, Nature 446:801-805)、(iii)キメラ血球凝集素タンパク質、
及び(iv)B/山形/16/88ウイルスノイラミニダーゼ(NA)をコードする4つのプラスミドをコ
トランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後、上清を回収し、その後、濾
過した(0.45μm孔径)。シュードタイプウイルス様粒子(VLP)の存在を血球凝集アッセイに
より評価した。異なるVLP調製物を同じ4血球凝集単位に調整した後、MDCK細胞に接種した
。形質導入の効率を増大させるために、偽粒子を用いる以下のアッセイは全て、1μg/mL
ポリブレン(Sigma)の存在下で実施した(例えば、Evansらの文献、2007, Nature 446:801-
805及びTscherneらの文献、2010, J Virol Methods 163:336-43参照)。
侵入アッセイは、MDCK細胞に、異なるキメラ血球凝集素を発現し、かつGaussiaルシフ
ェラーゼレポーターを含有する偽粒子を形質導入することにより実施した。形質導入から
24時間後、細胞を新鮮な培地で3回洗浄して、接種材料中に存在する残留Gaussiaルシフェ
ラーゼタンパク質を除去した。形質導入から48時間後、ルシフェラーゼアッセイを実施し
た(Evansらの文献、2007, Nature 446:801-805)。
(6.5.1.6 組換えキメラインフルエンザAウイルスのレスキュー)
プラスミドDNAからのA型インフルエンザウイルスのレスキューを以前に記載されている
通りに実施した(例えば、Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びHaiらの文献
、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。組換え野生型(rWT)PR8ウイルスを作製するため
に、293T細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、1μgの8つのpDZ PR8レスキ
ュープラスミドをコトランスフェクトした。cHA発現組換えウイルスを作製するために、
野生型HAプラスミドを、所望のキメラHAをコードするプラスミドと置き換えた。トランス
フェクションから6時間後、培地を、0.3％ウシ血清アルブミン(BSA)、10mM HEPES、及び1
.5μg/ml TPCK(L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン)処理トリプシン
(Sigma)を含むDMEMと交換した。トランスフェクションから24時間後、8日齢の発育鶏卵に
ウイルス含有上清を接種した。37℃で2日間のインキュベーションの後、尿膜腔液を回収
し、ニワトリ赤血球の血球凝集により、ウイルスの存在についてアッセイした。ウイルス
ストックの力価を、以前に記載されている通りに、MDCK細胞でのプラークアッセイにより
測定した(Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682、Haiらの文献、2008, J Virol 8
2:10580-10590)。
(6.5.1.7 ウイルス増殖動態アッセイ)
組換えウイルスの複製特徴を解析するために、10日齢の発育鶏卵に、100プラーク形成
単位(pfu)の野生型又はcHA発現組換えウイルスを接種した。尿膜腔液を回収し、その後、
0、9、24、48、及び72感染後時間(hpi)で、ウイルス増殖についてアッセイした。尿膜腔
液中に存在するウイルスの力価を、上で言及されている通りに、MDCK細胞でのプラークア
ッセイにより決定した。
(6.5.1.8 プラークの免疫染色)
プラークを、以前に記載されているプロトコルを用いて、A型インフルエンザ核タンパ
ク質(NP)に対するmAb HT103で免疫染色することにより可視化した(Bouvierらの文献、200
8, Journal of Virology 82:10052-8;及びSteelらの文献、2009, J Virol 83:1742-53)。
(6.5.1.9 ウェスタンブロット及び間接免疫蛍光解析)
コンフルエントなMDCK細胞を、表示された組換えインフルエンザウイルスに感染させる
か(2の感染多重度[MOI])、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に37℃で1時間模擬感染させた
。12hpiで、細胞を、以前に記載されている通りに、1×SDSローディングバッファーに溶
解させた(例えば、Haiらの文献、2008, J Virol 82:10580-10590参照)。還元された細胞
ライセートを、A型インフルエンザウイルス核タンパク質(NP)に対するモノクローナル抗
体(mAb)(HT103)、PR8 HAヘッドドメインに対するモノクローナル抗体(PY102)、Cal/09 HA
ヘッドドメインに対するモノクローナル抗体(29E3)、VN/04 HAヘッドドメインに対するモ
ノクローナル抗体(mAb #8)、及びHAストークに対して反応する汎H3抗体である12D1を用い
るウェスタンブロット解析により解析した。H7ヘッドドメインを検出するために、ポリク
ローナルヤギ血清NR-3152(A/FPV/オランダ/27(H7)ウイルスに対して作製されたもの、BEI
Resources)を使用した。抗グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)抗体(A
bcam)をローディング対照に使用した。増強化学発光タンパク質検出系(PerkinElmer Life
Sciences)を用いて、タンパク質を可視化した。
免疫蛍光解析のために、15-mmカバースリップ上のMDCK細胞のコンフルエントな単層を
、2のMOIで組換えウイルスに感染させた。15hpiで、細胞を固定し、メタノール-アセトン
(比率、1:1)で、-20℃で20分間透過処理した。0.1％Tween 20を含むPBS中の1％ウシ血清
アルブミンでブロッキングした後、細胞を、上記の抗体及びmAb 6F12とともに1時間イン
キュベートした。0.1％Tween 20を含むPBSで3回洗浄した後、細胞を、Alexa Fluor 594コ
ンジュゲート抗マウスIgG(Invitrogen)又はAlexa Fluor 594コンジュゲート抗ヤギIgG(In
vitrogen)とともに1時間インキュベートした。最後の3回の洗浄の後、感染細胞を、Olymp
us IX70顕微鏡を用いる蛍光顕微鏡法により解析した。
(6.5.1.10 プラーク減少アッセイ)
プラーク減少アッセイを以前に記載されている通りに実施した(Wangらの文献、2010, P
LoS Pathog 6:e1000796参照)。Cal/09又はVN/04球状ヘッドドメインがPR8ストークの上に
あるものから構成されるcHAを発現する約60〜80pfuの組換えウイルスを、様々な濃度(100
、20、4、0.8、0.16、及び0.032ug/ml)のmAb KB2(これは、本発明者らの実験室で作製さ
れた広域中和性抗HAストーク抗体である(データは示さない))とともに、又はそれらなし
で、240uLの全容量中、室温で60分間インキュベートした。6ウェルプレート中のMDCK細胞
のコンフルエントな層をPBSで2回洗浄し、その後、抗体-ウイルス複合体とともに37℃で4
0分間インキュベートした。その後、接種材料を吸引除去した後に、上記の濃度の抗体を
補充した又は抗体を補充していないTPCK-トリプシン寒天オーバーレイを各々のウェルに
添加した。プレートを37℃で2日間インキュベートした。その後、プラークを、抗A型イン
フルエンザNP抗体HT103を用いる免疫染色により可視化した(Bouvierらの文献、2008, Jou
rnal of Virology 82:10052-8;及びSteelらの文献、2009, J Virol 83:1742-53)。
(6.5.1.11 シュードタイプ粒子中和アッセイ)
シュードタイプ粒子産生の手順は上記のものと同じであり、VN/04(H5)ヘッド又はCal/0
9(H1)ヘッドのどちらか及びPR8(H1)ストークから構成されるcHA構築物をB型インフルエン
ザ/山形/16/88ウイルスNAとともに使用した。その後、粒子を、100μg/mLから0.032μg/m
Lまでの5倍希釈の様々な濃度のmAb KB2とともにインキュベートした。その後、これらの
混合物をMDCK細胞に添加した。形質導入が6時間進行した後、細胞を洗浄し、新鮮な培地
を細胞に加えた。シュードタイプ粒子を用いる形質導入は全て、1μg/mLポリブレン(Sigm
a, St. Louis, MO)の存在下で実施した(Tscherneらの文献、2010, J Virol Methods 163:
336-43)。形質導入から48時間後、侵入がmAb KB2によって遮断された程度をアッセイする
ために、ルシフェラーゼアッセイを実施した。
(6.5.2 結果:)
(6.5.2.1 キメラ血球凝集素の作製)
Cys52-Cys277ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が保存されているかどうかを
確かめるために、H1、H3、H5、及びH7亜型のA型インフルエンザウイルスHA配列のアライ
ンメントを本研究で使用した。これらのシステイン残基は、HA亜型にわたって極めて保存
されているので、グループ1 HAとグループ2 HAの両方について、Cys52-Cys277ジスルフィ
ド結合を、ヘッドドメインとストークドメインの間を線引きする点として使用した。Cys5
2とCys277の間の配列をヘッド領域と定義し、分子の残りの部分をストークと定義するこ
とにより、種々のHA亜型由来の新規のヘッド及びストーク組合せをコードする構築物を作
製することができることが理論的に説明された(図19A及びB)。
血球凝集素亜型のストーク領域間に存在するアミノ酸同一性度により、本発明者らは、
ヘッドドメインの交換が可能であり得るとの意をさらに強くした。ヘッドドメインと比べ
て、より高いパーセンテージのアミノ酸同一性が、全ての亜型にわたってストークドメイ
ン中に見られた(図20)。
インフルエンザHAの16種の亜型は全て、2つの系統発生学的グループに分類される(Pale
se及びShawの文献、2006, オルトミクソウイルス:ウイルス及びその複製(Orthomyxovirid
ae: the virus and their replication)、フィールズのウイルス学(Fields virology)、
第5版、1647-1690)。より高いパーセンテージのアミノ酸同一性が特定のグループのスト
ーク領域内で観察されたので(図20)、及びグループ1ウイルス由来のヘッドドメイン及び
ストークドメインを含む1つのcHAウイルスの作製に成功していたので(Picaらの文献、201
2, PNAS 109:2573-8)、グループ内cHAの作製を試みた。グループ1については、パンデミ
ックH1 Cal/09 HA又はVN/04球状ヘッドドメインのどちらかをPR8(H1)HA由来のストーク領
域とともにコードする2つのキメラ血球凝集素構築物(それぞれ、cH1/1及びcH5/1)を作製
した(図19B)。同様の戦略を適用して、異なるグループ2インフルエンザ株由来のヘッドド
メイン及びストークドメイン: Alb/01(H7、グループ2)由来のヘッド及びパース/09(H3、
グループ2)HA由来のストーク領域を発現するキメラHA(cH7/3)を作製した(図19B)。最後に
、ヘッドドメイン及びストークドメインを交換して、パース/09 HA(H3、グループ2)スト
ークの上にVN/05 HA(H5、グループ1)のヘッドドメインを含むグループ間キメラHA(cH5/3)
を作製することができるかどうかを評価した(図19B)。
これらのプラスミドの構築後、様々なキメラHA構築物が発現されて、野生型HAのように
細胞表面に輸送されることができるかどうかを明らかにするために、実験を実施した。そ
れぞれ、H1及びH3ストークドメイン特異的抗体で表面染色した後、一過性にトランスフェ
クトされた293T細胞の蛍光活性化セルソーター(FACS)解析を実施した。この方法を用いて
、4つ全てのキメラ構築物の細胞表面発現を検出した(図21)。しかしながら、野生型PR8 H
Aと比べて、より少ない表面タンパク質発現がcH1/1構築物について検出され、これは、こ
のキメラDNA構築物についてのCal/09 HAのヘッドドメインと関連する固有の性格又はより
低いトランスフェクション効率に起因する可能性があった。さらに、cH7/3構築物とcH5/3
構築物の細胞表面発現パターンに違いがあったことは注目すべきことである。この「二重
ピーク」発現パターンは、トランスフェクション条件でのみ観察され、再現性があった。
それは、cH7/3発現組換えウイルスの感染によっても、cH5/3発現組換えウイルスの感染に
よっても検出されなかった(図21)。したがって、これらのデータは、cHAがゴルジ複合体
から細胞表面へと輸送されることができることを示している。
次に、ルシフェラーゼレポーター構築物を含有し、かつcHA及び野生型B/山形/16/88ウ
イルスNAを粒子表面に発現するレトロウイルスシュードタイプ粒子を用いて、MDCK細胞の
形質導入による様々なcHAの侵入特徴を調べた。cHAタンパク質によって媒介される侵入効
率をルシフェラーゼの読出しにより検出した。同程度のレベルのシュードタイプ粒子媒介
性ルシフェラーゼ発現が、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3キメラHA、並びに対応する野生型タ
ンパク質について観察された(図22)。cH1/1 HAをコードする粒子は、他のHA構築物と比べ
てより低いルシフェラーゼレベルを発現し、これは、プロデューサー細胞株におけるcH1/
1発現がより低く、したがって、粒子1つ当たりのHA三量体がより少ないことか、又はcH1/
1 HAの侵入特性の効率がより低いことかのどちらかによるものである可能性があった。シ
ュードタイプ粒子を4血球凝集素単位に標準化したとき、赤血球に対する結合の違いのた
めに、シュードタイプ粒子の実際の量が変化し得るということもあり得る。
(6.5.2.2 キメラ血球凝集素を有する組換えインフルエンザウイルスの作製)
本発明者らのcHA構築物は効率的に発現され、細胞表面に輸送されることが明らかにさ
れていたので、cHAをコードする組換えインフルエンザウイルスをレスキューすることが
できるかどうかを評価するための研究を実施した。以前に発表されたプロトコル(例えば
、Fodorらの文献、1999, J Virol 73:9679-9682;及びHaiらの文献、2008, J Virol 82:10
580-10590参照)を用いて、様々なcHAを含むウイルスを作製するのに成功した。得られた
ウイルスをプラーク精製し、10日齢の発育卵中で増幅させ、キメラセグメントをRT-PCRに
より解析し、シークエンシングした。どの場合も、ウイルスは、予想されたキメラHAセグ
メントを有し、他のHAセグメントを有さないことが分かった(データは示さない)。
レスキューされたウイルスにおけるcHAの存在を感染細胞のウェスタンブロット(図23)
及び間接免疫蛍光(図24)によりさらに確認した。MDCK細胞を、rWT PR8、野生型パース/09
、cH1/1、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3ウイルスに感染させた。cH1/1及びcH5/1キメラHAタン
パク質を、それぞれ、Cal/09(H1) HAのヘッドドメインに対して反応する抗体(29E3)(Medi
naらの文献、2010, Nature Communications 1:28)又はVN/04(H5) HAのヘッドドメインに
対して反応する抗体(mAb #8)(Steelらの文献、2009, J Virol 83:1742-53)を用いて、対
応する試料中で検出した(図23)。汎H3抗ストークmAbの12D1を用いて、cH7/3とcH5/3と野
生型パースHAの間で同程度の発現レベルが観察された(Wangらの文献、2010, PLoS Pathog
6:e1000796参照)。野生型パースHAは、ゲル上でのより遅い移動を示し、これは、球状ヘ
ッドドメイン中のグリコシル化部位の数がより多いためである可能性が高い。cH7/3又はc
H5/3感染試料に対して、それぞれ、抗H7ポリクローナル抗体(NR-3152)又は抗H5モノクロ
ーナル抗体(mAb #8)を使用することにより、正確なHAヘッドドメインがH3ストークの上に
発現することが確認された。陽性バンドは、どちらの場合にも検出された。
免疫蛍光研究について、感染条件は、ウェスタンブロット解析に使用した条件と同様で
あった。感染細胞を、図23で使用されているような対応する抗体で染色した。感染細胞は
全て、キメラ及び野生型HA、並びにA型インフルエンザウイルスNPの予想される発現を示
した(図24)。
(6.5.2.3 組換えウイルスの複製特徴)
野生型及び組換えウイルスの増殖特性を、10日齢の発育鶏卵中、37℃で評価した(図25A
)。キメラHAを発現する組換えウイルスの増殖動態の比較のために、rWT PR8ウイルスを含
めた。cH5/1及びcH5/3ウイルスは、rWT PR8ウイルスの複製動態と同程度の複製動態を示
した。cH7/3ウイルスは、48hpiで、rWT PR8と同様のピーク力価(1×109PFU/mL)にまで増
殖したが、9hpiで、rWT PR8ウイルスと比べてウイルス力価が2log低下した。全ての時点
でのウイルス力価の低下によって示されるように、cH1/1ウイルスは、rWT PR8ウイルスと
比べて弱毒化された。それにもかかわらず、cH1/1ウイルスは、約108PFU/mLというかなり
のピーク力価に達した。パース/09野生型ウイルスは、発育卵中で同程度のピーク力価に
まで増殖する(データは示さない)。
キメラウイルスの各々のプラーク表現型もMDCK細胞で評価した。図25Bに示すように、
全てのウイルスが同程度の大きさのプラークを形成した。これらのデータを合わせて、キ
メラHA構築物が正確にフォールディングし、生物学的に機能的であることが確認される。
(6.5.2.4 ストーク特異的抗体はcHA発現ウイルス及び偽粒子を中和することができる)
最後に、ストーク特異的抗体を、本発明者らが新たに作製した、cHAを発現する組換え
ウイルスを中和する能力について試験した。プラーク減少アッセイを、広範なグループ1
反応性を有するHAストーク特異的抗体であるmAb KB2の存在下で、又は抗体なしで実施し
た。mAb KB2が、同様の効率でかつ用量依存的な形で、全てのcHA発現ウイルスを中和する
ことが示された。100ug/mLで、mAb KB2は、cH1/1及びcH5/1ウイルスを、100％の効率で完
全に中和することができ、4ug/mL程度の低い濃度でもいくらかの中和活性があった(図26A
)。
これらの結果を確認するために、シュードタイプ粒子阻害アッセイをmAb KB2を用いて
実施した。cH1/1又はcH5/1及びB型インフルエンザウイルスNAを発現するシュードタイプ
粒子を、mAb KB2の存在下で又は抗体なしで、MDCK細胞に添加した。形質導入から48時間
後、上清を回収し、ルシフェラーゼ活性を測定した。予想された通り、mAb KB2は、cH1/1
及びcH5/1シュードタイプ粒子の侵入を、4ug/mLを超える濃度で、用量依存的な形で阻止
した。シュードタイプ粒子の侵入を阻害するのに、プラーク減少アッセイで使用される濃
度と比べてより低い濃度のmAb KB2で十分であったが、シュードタイプ粒子の表面でのHA
三量体の組込みがより少ないと想定されていたので、これは予想された結果であった(Cor
tiらの文献、2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1663-73)。全ウイルス
をシュードタイプ粒子と対比させて含むアッセイにおいて、mAbの中和能力が異なるとい
うこの現象は、他の研究で認められている(Cortiらの文献、2010, The Journal of Clini
cal Investigation 120:1663-7321; Suiらの文献、2009, Nature Structural & Molecula
r Biology 16:265-73)。
(6.5.3 結論)
ヘッドドメインとストークドメインの境界を定める保存されたジスルフィド結合Cys52-
Cys277を利用することにより、異なるHA球状ヘッドドメインを有するキメラHAタンパク質
を有するインフルエンザウイルスを作製するための新しい戦略を開発した。したがって、
もとのヘッドドメインを別のHAのヘッドドメインと置換することにより、同じストークを
有するが、異なる球状ヘッドを有する一連のキメラHAを作製した。この設計を、PR8スト
ークドメインをCal/09及びVN H5球状ヘッドとともに含む、多数の亜型にわたって検討し
た。さらに、H7球状ヘッドをH3ストークドメイン上に配置した。これらの構築物は、両方
の系統発生学的グループのインフルエンザHAタンパク質を網羅する。各々の構築物は細胞
表面に発現し、融合活性を保持した。キメラHAを有する組換えウイルスの作製により、HA
が正しくフォールディングし、生物学的機能を保持することがさらに立証された。
(6.6 実施例6:普遍的なインフルエンザワクチンとしてのキメラ血球凝集素構築物)
この実施例は、独特な血球凝集素ヘッド及びストーク組合せを含むタンパク質である、
キメラ血球凝集素(cHA)構築物のワクチン接種により誘発されることができるストーク特
異的免疫応答の防御効力を示している。
(6.6.1 材料及び方法)
(6.6.1.1 細胞及びウイルス)
293T及びMDCK細胞をATCCから入手し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)及び最小必
須培地(どちらもGibco製)中で維持した。各々に、10％胎仔ウシ血清(HyClone)及び100ユ
ニット/mlのペニシリン-100μg/mlのストレプトマイシン(Pen/Strep, Gibco)を補充した
。
インフルエンザウイルスA/フォートモンマス/1/1947(FM1)及びA/ネーデルラント/602/2
009をマウス肺で継代し、その後、10日齢の発育鶏卵中で48時間増殖させた。多塩基性切
断部位が除去された低病原性A/ベトナム/1203/04(VN04):PR8 2:6再集合体ウイルス(例え
ば、Steelらの文献、2009, J Virol 83:1742-1753参照)と、B/山形/16/1988ウイルスとを
、ぞれぞれ、10日齢の発育鶏卵中、37℃で48時間又は33℃で72時間増殖させた。
組換えインフルエンザウイルスを上記のような及び以前に記載されているようなリバー
スジェネティックス系により産生した(例えば、Quinlivanらの文献、2005, J Virol 79:8
431-8439参照)。H9ウイルスのHA球状ヘッドドメインがH1ストーク(PR8ウイルス由来)の上
にあるものを発現するウイルスであるcH9/1 N1ウイルスと、cH5/1(H5ヘッド(VN04)、H1ス
トーク)N1ウイルスとを、以前に記載されているのと同様の方法でレスキューした(例えば
、Picaらの文献、2012, PNAS USA 109:2573-2578参照)。YAM-HAウイルスを作製するため
に、B/山形/16/1988(WT YAM) HAの細胞外ドメインをA/プエルトリコ/8/1934ウイルス HA
の対応するドメインと置換した(例えば、Haiらの文献、2011, Journal of virology 85:6
832-6843参照)。他の7つのWT YAMウイルスセグメントをコードするリバースジェネティッ
クプラスミドは、以前の研究で構築された(例えば、Haiらの文献、2008, J Virol 82:105
80-10590参照)。レスキューの後、cHA発現組換えウイルスを、10日齢の発育鶏卵中、37℃
で48時間増殖させた。YAM-HAウイルスを、8日齢の発育鶏卵中、33℃で72時間増殖させた
。
組換えウイルス及び野生型ウイルスの力価を、上記のように、TPCKトリプシンの存在下
、MDCK細胞(ATCC)で測定した。ELISAアッセイで使用するために、cH5/1 N1ウイルスを30
％ショ糖クッション上で部分精製した。cH9/1 N1、cH5/1 N1、及びFM1ウイルスを勾配遠
心分離で精製し、陽性対照ワクチンとして使用されるように、PBSに希釈した(1:4000)ホ
ルムアルデヒドで不活化した。
(6.6.1.2 cH6/1及びcH9/1タンパク質構築物の作製)
可溶性cH6/1及びcH9/1タンパク質を、上記のような及び以前に記載されているようなバ
キュロウイルス発現系を用いて生成させた(例えば、Picaらの文献、2012, PNAS USA 109:
2573-2578参照)。簡潔に述べると、バキュロ転移ベクターを最初に作製し、次いで、Sf9
細胞へのバクミドのトランスフェクションを行った。その後、組換えバキュロウイルスを
用いて、High Five細胞に10のMOIで感染させた。感染から96時間後、上清を回収し、その
後、Ni-NTA樹脂(Qiagen)とともに4℃で2時間インキュベートして、Hisタグ化組換えcHAタ
ンパク質を精製した。スラリーをカラムに充填し、洗浄した後、pH 8の溶出バッファー(5
0mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール)中で溶出させた。タンパク質を含むプー
ル画分をPBS中でバッファー交換し、10-kDa分子質量カットオフを有するAmicon Ultra遠
心分離フィルターユニット(Millipore)を用いて、スイング式バケットローター中で濃縮
した。タンパク質の純度及び同一性を、SDS/PAGE、クマシー染色、及びウェスタンブロッ
トにより試験した。最終的なタンパク質濃度をブラッドフォード試薬で決定した。
(6.6.1.3 動物)
動物に、食餌及び水を自由に利用することを許し、12時間の明/暗周期で維持した。全
ての鼻腔内処置のために、雌の6〜8週齢BALB/cマウス(Jackson Laboratories)を0.1mlの
ケタミン/キシラジン(0.15mgケタミン及び0.03mgキシラジン)の腹腔内(IP)注射で麻酔し
た。
(6.6.1.4 ワクチン接種及び感染実験)
未感作の6〜8週齢の雌BALB/cマウスに、cH9/1タンパク質を、アジュバントR848(Invitr
ogen)の存在下で鼻腔内に(10ug)、及びMF59様アジュバント(Invitrogen)であるAddavaxと
ともに腹腔内に(10ug)ワクチン接種した。初回免疫から3週間後、動物をcH6/1タンパク質
又はBSA(BioRad)で追加免疫した。追加免疫ワクチン接種も鼻腔内(10ug)及び腹腔内(10ug
)に投与したが、ポリI:Cをアジュバント(Invitrogen)とした。不活化FM1ウイルス(1ug)を
50ulの容量で陽性対照として筋肉内投与した。追加免疫から3週間後、動物から採血し、
血清を回収し、動物を5 LD50のFM1ウイルスに感染させた。体重を感染後14日間モニタリ
ングした。
他の実験において、動物を、cH9/1をコードするプラスミドDNA(80ug、TriGrid送達系;
Ichor Medical Systems)で初回免疫し、次いで3週間後、ポリI:Cとともに鼻腔内(10ug)及
び筋肉内(10ug)投与されるcH6/1又はcH9/1(対照)タンパク質で追加免疫した。3週間後、c
H5/1又はcH9/1(対照)タンパク質で追加免疫を繰り返した。対照動物にも同じく、cH9/1を
コードするDNAをDNA電気穿孔したが、(処置群と同様の方法で)BSAで2回追加免疫した。陽
性対照動物は、不活化FM1もしくはPR8ウイルス(1μg)又は1μgのpH1N1一価スプリットワ
クチンのどちらかを筋肉内に受容した(BEI)。次いで、追加免疫から3〜5間後、動物を、5
LD50のPR8もしくはFM1、又は10 LD50のpH1N1ウイルスに感染させた。感染の48及び24時
間前に、CD8+ T細胞除去に使用される動物を、300μgの抗CD8+ T細胞抗体(ATCCから購入
したハイブリドーマ株2.43由来のもの)で処置し(例えば、M.L. Salemの文献、2000, Int.
J. Immunopharmacol. 22:707参照)、5 LD50のPR8ウイルスに感染させた。体重を感染後1
4日間モニタリングした。20％カットオフを全てのウイルスに使用した。
他の実験のために、マウスにYAM-HA又はWT YAMウイルスを接種し、次いで3週間後、ポ
リI:Cの存在下、BSA又はcH6/1タンパク質を筋肉内及び腹腔内にワクチン接種した。未感
作動物は、さらなる対照としての役割を果たした。全ての動物から採血し、ワクチン接種
から3〜5週間後、250 LD50のcH9/1 N1ウイルス、又はPR8バックグラウンドで多塩基性切
断部位が除去された10 LD50の2:6再集合体H5ウイルス(例えば、Steelらの文献、2009, J
Virol 83:1742-1753参照)に感染させた。ホルムアルデヒドで不活化したcH9/1 N1ウイル
ス(1ug)及びcH5/1 N1ウイルスを、適切なウイルス感染の陽性対照として、50ulの容量で
筋肉内投与した。動物が感染後にその初期体重の30％超を失った場合、施設内ガイドライ
ンに準拠して、動物を安楽死させた。20％カットオフを低病原性のcH9/1 N1及びA/ネーデ
ルラント/602/2009ウイルスの感染に使用した。これら2つのウイルスを用いる感染につい
ては、全ての対照の死亡又は大幅な体重減少を評価するために、よりストリンジェントな
用量を使用した(250又は10 LD50)。
(6.6.1.5 酵素結合免疫吸着アッセイ)
Immulon 4HBX(Thermo Scientific)プレートに、5ug/mLになるまでPBSに希釈した部分精
製cH5/1 N1ウイルスを一晩コーティングした。プレートを、3％脱脂粉乳を含む0.1％Twee
n 20-PBS(TPBS)で1時間ブロッキングし、その後、1％粉乳を含むTPBSに連続希釈したマウ
ス血清とともに、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、プレートを、アルカ
リホスファターゼ(AP)結合抗マウスIgG(γ鎖特異的、Invitrogen)とともに室温で1時間イ
ンキュベートした。その後、プレートをTPBSで3回洗浄し、p-ニトロフェニルホスフェー
ト(PNPP)基質(Zymed)で発色させ、0.5M NaOHで停止させ、405nmの光学密度で読み取った
。全ての実験のために、Synergy 4(BioTek)プレートリーダーを使用した。
ストーク特異的抗体力価を上記のようなELISAにより検出した。ストーク特異的反応性
を定量するために、PR8抗原を用いて、ELISAプレートをコーティングした。ワクチン接種
マウスにおけるストーク特異的抗体の中和能力を検出するために、血清をプールし、全血
清IgGを精製した。
H5 HAを発現する偽粒子を、以前に記載されている通りに、偽粒子侵入アッセイで使用
した(例えば、Haiらの文献、2012, J. Virol. 86:5774-5781及びN. Picaらの文献、2012,
PNAS 109:2573-2578参照)。侵入すると、偽粒子は、ルシフェラーゼレポーターを発現す
る。IgGによるこの侵入の阻害を、IgG処置していない対照と比べた発現のパーセンテージ
として定量した。動物は、H5球状ヘッドドメインに暴露されていなかったので、これらの
アッセイは、ワクチン接種によって産生されるストーク特異的抗体がウイルスを中和する
程度を決定した。モノクローナル抗体CR6261、及びB型インフルエンザ野生型感染マウス
由来の精製IgGを対照として使用した。
(6.6.1.6 プラーク減少中和アッセイ(PRNA))
まず、mAbの希釈液を、60〜80プラーク形成単位(pfu)のウイルス(cH9N1 A型インフルエ
ンザウイルス)とともに、RTで1時間、シェーカー上でプレインキュベートした。その後、
ウイルス及び精製IgG混合物を用いて、MDCK細胞の単層に、2連で、12ウェルフォーマット
で感染させ、10分毎に間欠的に揺り動かしながら、37℃で1時間インキュベートした。寒
天オーバーレイに、対応するIgG希釈液を補充した。2感染後日(dpi)で、単層を4％ PFA/1
×PBSで30分間固定した。細胞を、5％NF-ミルク/1×PBSで、RTで30分間ブロッキングし、
状況に応じて、いずれかのH9特異的モノクローナル抗体(5μg/mL)とともに、RTで1時間イ
ンキュベートした。HRPにコンジュゲートした抗マウス二次抗体を1:1000希釈で二次抗体
として使用した。プラークを、TrueBlueペルオキシダーゼ基質(KPL社)を用いて可視化し
、反応を水道水で停止させた。プラークを各々の抗体について計数し、mAbなしの群と比
べて、パーセント阻害を計算した。
(6.6.1.7 統計学的検定)
統計解析を、片側スチューデントT検定(Prism4, GraphPad)を用いて実施した。図29Cに
ついて、値は全て、平均値の標準誤差付きの平均としてプロットされている。生存の差は
、ログランク有意検定によるカプランマイヤー生存解析で計算した。
P値を用いる解析については、0.05又はそれ未満のP値を統計的有意とみなす。分散が、
統計的に異なるものと決定される場合は、ウェルチの補正を使用した。0.05又はそれ未満
のP値を統計的有意とみなす。ストーク血清反応性を図29Cの最大体重減少と比較したとき
、Iglewicz及びHoaglinの方法(Iglewicz, B.及びH., D.の文献、1993. 第16巻:外れ値の
検出及び処理方法(How to detect and handle outliers.)、E. Mykytka(編)、品質管理に
おけるASQC基本参考文献:統計的技術(The ASQC Basic References in Quality Control:
Statistical Techniques). American Society of Quality Control)参照)に従って、1つ
の値を外れ値(修正Z-スコア＞平均を上回る3.5標準偏差)として検出し、解析から除外し
た。
(6.6.2 結果)
(6.6.2.1 cHA構築物の順次ワクチン接種はHAストーク特異的抗体を誘発し、致死的イン
フルエンザ感染からの防御をもたらす)
異なる抗原性を有するウイルス由来の球状ヘッドドメインを発現する構築物が、HAのス
トークドメインに対するポリクローナル応答を刺激することができると仮定した。これを
検証するために、まず、マウスに、HAのストークがA/プエルトリコ/8/1934(PR8)ウイルス
に由来するものであり、かつヘッドがH9分離株に由来するものであるcH9/1可溶性タンパ
ク質を、アジュバントとともにワクチン接種した。初回免疫から3週間後、分子のストー
クドメインに対する液性応答を刺激する目的で、マウスを、第二の可溶性cHAであるcH6/1
(H6ウイルス由来のヘッド、PR8ウイルス由来のストーク)で追加免疫した。(不活化FM1ウ
イルスをワクチン接種したマウスは、陽性対照としての役割を果たした)。追加免疫から3
週間後、マウスから採血して、H1ストークドメインに対する血清反応性を評価し、その後
、マウスに適応したA/フォートマウンモス(Fort Mounmoth)/1/1947(FM1)ウイルスに感染
させた。図27Aに示すように、ワクチン接種マウスは、HAストークドメインに対する血清
抗体応答を生じさせた。FM1に感染した後、動物は、相当な量の体重を失ったが(図27B)、
7日後に、90％の全生存率を取り戻した(図27C)。マウスがH9及びH6ウイルスの球状ヘッド
ドメインにしか暴露されていなかったとしても、全てのマウスがFM1ウイルスに対してHI
陰性であることが立証され、それにより、ワクチン接種から誘発される防御がストークド
メインに特異的な免疫応答の結果であることが確認された。したがって、PR8に基づくcHA
のワクチン接種は、FM1ウイルス感染に対して防御的であるストーク特異的免疫をもたら
す。
(6.6.2.2 cH6/1タンパク質のワクチン接種はcH9/1 N1ウイルス感染からの防御を媒介す
るストーク特異的免疫を誘発する)
2つの異なる可溶性cHA構築物を投与することにより、抗体応答をストークに対して生じ
させたが、FM1感染後、かなりの程度の罹病が見られた。マウスは、インフルエンザウイ
ルスに対して免疫学的に未感作であるので、HAストークに対する高い血清抗体力価を誘導
するために、インフルエンザウイルスへの多重暴露と、それに続く、抗原性が異なるヘッ
ドの導入が必要とされる可能性があった。血球凝集素ストークに対する特異性を有する血
清抗体力価の刺激の増強は、感染も必要とする可能性があり、cHAタンパク質のみによる
初回免疫及び追加免疫後の強力な防御が観察されない理由を説明することができる。
ウイルス血球凝集素に対する免疫応答を刺激するが、他のウイルスタンパク質に対する
防御的免疫を生じさせないために、PR8ウイルス由来のHAの細胞外ドメインを発現する組
換えB/山形/16/1988ウイルス(YAM-HA)を構築した(例えば、Haiらの文献、2011, Journal
of virology 85:6832-6843参照)。インフルエンザウイルスへの事前暴露を模倣するため
に、マウスにYAM-HAを接種し、次いで3週間後、BSA又はcH6/1タンパク質をワクチン接種
した。さらなる対照として、マウスを野生型B/山形/16/1988(WT YAM)ウイルスに感染させ
、BSAをワクチン接種した。その後、HAストークのみに対する免疫応答の防御的性質を決
定的に示すために、cH9/1(H9ヘッド、H1ストーク)を発現するA型インフルエンザウイルス
を感染ウイルスとして使用した。この場合も、動物は、H1及びH6ウイルス由来の球状ヘッ
ドドメインに暴露されるので、cH9/1 HAを発現するウイルスの感染後に見られる防御は、
H1ストークドメインに対する免疫の結果である可能性が最も高い。
図28Aに示すように、YAM-HAに暴露された後にcH6/1タンパク質ワクチンを受けた動物は
、PR8バックグラウンドでcH9/1を発現するウイルスの250 LD50感染から完全に防御された
。cH6/1可溶性タンパク質をワクチン接種した動物は、BSAをワクチン接種した動物と比べ
て統計的により少ない体重を3、4、及び5日目に失った。この体重減少からの防御は、BSA
をワクチン接種したコホートと比べて、cH6/1をワクチン接種した群における生存の延長
をもたらした(p＝0.038;図28B)。未感作動物及びWT YAMを接種した動物は、感染から防御
されず、他のワクチン接種群で見られた防御はいずれも、ウイルスの複製の結果ではなく
、代わりに、H1ストークドメインに対する特異的な応答であったことを示している。動物
は、H1及びH6ウイルス由来の球状ヘッドドメインに暴露され、かつcH9/1感染ウイルスに
対してHI陰性であったので、ここで見られた防御は、H1ストークドメインに対する免疫の
結果であると考えられる。
HAストークに対する特異性を有するモノクローナル抗体が、季節性H1N1ウイルスに感染
した又は該ウイルスに対するワクチン接種を受けた個体から単離され(例えば、Cortiらの
文献、2010, The Journal of clinical investigation 120:1663-1673; Cortiらの文献、
2011, Science 333:850-856; Ekiertらの文献、2011, Science 333:843-850; Suiらの文
献、2009, Nat Struct Mol Biol 16:265-273; Throsbyらの文献、2008, PLoS One 3:e394
2参照)、かつストーク力価が、より低いレベルではあるが、pH1N1ウイルスに感染してい
ない個体で認められる(例えば、Picaらの文献、2012, PNAS USA 109:2573-2578参照)こと
は注目すべきことである。したがって、YAM-HA接種動物がある程度のストーク力価を生じ
させることができることは驚くべきことではない。しかしながら、cH6/1構築物のワクチ
ン接種は、血清ストーク力価を4倍(同等のOD値を生じさせる希釈の逆数(reciprocal dilu
tions))増大させ(図28C)、動物を大幅な体重減少及び死亡から防御した(図28A及び28B)。
cH6/1構築物のワクチン接種が、ウイルスを100％の効率で中和するストーク特異的IgGの
産生を誘発したのに対し(YAM-HA＋BSA)(図28D)、初回免疫のみの動物由来の血清は、バッ
クグラウンドを辛うじて上回る中和レベルを示した(YAM-HA＋BSA)。実際、YAM-HAを接種
し、その後、BSAをワクチン接種した動物は、WT YAMウイルスを接種し、BSAをワクチン接
種した動物と統計的に同様の生存率を有していた(p＝0.058)。対照的に、cH6/1タンパク
質をワクチンとして使用すると、WT YAMを接種した動物の生存と比較した場合に極めて有
意な率である、感染からの100％の生存がもたらされた(p＜0.0001)。生存は、YAM-HAを接
種し、BSAをワクチン接種したマウスの生存と比較した場合にも増加した(p＝0.038)。こ
れらの差は、偽粒子侵入アッセイでは反映されなかったが、それは、YAM-HA＋BSAマウス
及びYAM-HA＋cH6/1マウス由来のIgGが、H5 HAをコードする偽粒子の侵入を同様の効率で
阻害したためである(図28E)。後者のアッセイのみが、偽粒子の侵入を阻止する抗体の能
力を検出することに留意するのは重要なことである。したがって、侵入の下流でのストー
ク抗体の作用及び/又は感染(免疫)細胞とのその相互作用は、このアッセイでは検出され
ない。これにより、中和の差がこれら2つの群で観察されず、インビボでの知見を反映し
なかった理由を説明することができる。それにもかかわらず、これらの感染プロトコルに
よって誘発される抗体は、ストーク特異的であり、かつ広域中和性であった。感染ウイル
スは、H1ウイルス由来のストークドメインのみをコードするので、見られた防御が、cH6/
1ワクチン接種によって刺激されるHAストークドメインに対する宿主免疫応答の結果であ
ったと結論付けることができる。
(6.6.2.3 cH6/1タンパク質のワクチン接種は致死的H5インフルエンザウイルス感染から
マウスを防御する)
次に、cH6/1タンパク質のワクチン接種がH5ウイルスの感染からマウスを防御すること
ができるかどうかを確かめた。上記のように、マウスに接種及びワクチン接種し、PR8バ
ックグラウンドでA/ベトナム/1203/2004ウイルス由来のHA及びNAを発現する10 LD50の2:6
再集合体ウイルスに感染させた(例えば、Steelらの文献、2009, J Virol 83:1742-1753参
照)。予想された通り、未感作動物及びWT YAMウイルスを接種した動物は感染から防御さ
れず、8日目までに感染が原因で死亡した。YAM-HAウイルスを接種し、BSAをワクチン接種
した動物は、感染から辛うじて防御され、生存率は40％であった。防御の増大は、動物に
cH6/1タンパク質をワクチン接種したときに見られ、生存は90％であった。2つのワクチン
群間の生存率の差は、統計的有意に接近したが(p＝0.06)、cH6/1タンパク質をワクチン接
種したマウスは、統計的により長い時間生存した(p＝0.037)(図29A及び29B)。HAストーク
に対する反応性と、H5感染後のモニタリング期間にわたる％最大体重減少とを比較したと
き、より高い血清ストーク力価を有する動物が感染後により少ない体重を失う傾向にある
逆相関が検出され(図29C)、cH6/1がHAストークに基づく免疫を増強することができるとい
う考えを支持した。
ワクチン接種マウスが、それに対して免疫学的に感作されておらず、かつHI陰性である
HA球状ヘッドドメインを有する感染ウイルスを用いて、これらの結果は、ワクチン接種後
の感染からの防御が、HAストークに対する免疫応答のみに基づいていたことを示している
。受容体結合部位に対する交差反応性抗体が、ここで見られた防御において役割を果たし
得る可能性を排除するために、マウスを全てHIについて試験し、そのそれぞれの感染ウイ
ルスに対してHI陰性であることが分かった。
(6.6.2.4 cHAのワクチン接種はH1N1ウイルス感染からの防御を媒介するストーク特異的
免疫を誘発する)
ストーク特異的抗体は、ヒト血清中で検出されている(例えば、図15A及び15B; M. Thor
sbyらの文献、2008, PLoS One 3:e3942、D.C. Ekiertらの文献、2009, Science 324:246-
251、D.C. Ekiertらの文献、2011, Science 333:843-850、J. Wrammertらの文献、2011,
J. Exp. Med. 208:181-193、及びN. Picaらの文献、2012, PNAS 109:2573-2578参照)。過
去のインフルエンザウイルスHAへの暴露がストーク特異的免疫応答の強力な生成にとって
重要である可能性があるので、マウスにおけるインフルエンザウイルスに対する先在免疫
を再現することができるかどうかを確認した。これにより、ウイルス感染後の罹病からよ
り効率的に防御されると仮定した。これを達成するために、マウスを、cH9/1をコードす
るDNA発現ベクターで初回免疫し(例えば、J. Steelらの文献、2010, MBio 1(1), pii:e00
018-10参照)、その後、可溶性cH6/1タンパク質、次いで、cH5/1タンパク質(H5ヘッド、H1
ストーク)で追加免疫し、最後に、一連のH1N1ウイルスに感染させた(図30A〜30F)。FM1(
図30A及び30B)、A/ネーデルラント/602/2009(pH1N1)(図30C及び30D)、並びにPR8ウイルス
(図30E及び30F)に感染させた後、全てのcHAワクチン接種動物は感染から防御され、ある
としても、最小量の体重減少しか示さなかった。対照的に、cH9/1 DNAによる初回免疫の
後にBSAを受容した陰性対照動物は、1匹の動物を除いて、相当な量の体重を失い、9日目
までに感染が原因で死亡した(図30A〜30F)。感染実験の各々におけるcHAワクチン接種動
物の生存は、対照の生存と有意に異なっていた(図30B、30D、及び30F)。誘発された防御
がストーク特異的液性免疫の結果であることを確認するために、血清がELISAによりH1 HA
に結合することができるにもかかわらず、全てのマウスが各々の感染ウイルスに対してHI
陰性であることを確認し(図30G)、本発明者らのワクチン接種プロトコルによるストーク
特異的抗体の産生が確認された。HAストーク内のエピトープに対するCD8 T細胞が、ここ
で見られた防御において役割を果たし得る可能性があるので(例えば、M. Tamuraらの文献
、J. Virol. 72:9404-9406参照)、マウスにワクチンを接種し、モノクローナル抗体2.43
を投与することによってCD8 T細胞を除去し、その後、PR8に感染させた(M.L. Salemの文
献、2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707-718)。除去は、体重減少にも生存転帰にも
影響を及ぼさず、ワクチン接種によって誘発される防御における液性応答の関与を示唆し
た(図30H及び30I)。したがって、ヘッドではなく、HAストークに対する適応的液性免疫応
答が、3つの異なるH1N1ウイルスに対する防御をもたらしていた。
cHAに基づくワクチン接種プロトコルが、他の亜型に対する中和能力を有するストーク
特異的抗体を誘導したことをさらに立証するために、H2 HAを有する偽粒子の侵入を阻止
するワクチン接種マウス由来の精製IgGの能力を試験した。偽粒子は、侵入後にルシフェ
ラーゼレポーター遺伝子を発現するので、中和活性を、細胞上清中のルシフェラーゼ酵素
活性の欠如によって測定した(R. Haiらの文献、2012, J. Virol. 86:5774-5781及びN. Pi
caらの文献、2012, PNAS 109:2573-2578)。感染後に見られる防御と一致して、ワクチン
接種マウスから精製されるIgGは、用量依存的な形でかつ陽性対照として使用されるHAス
トークに対する特異性を有するモノクローナル抗体であるCR6261の効力と同様の効力で、
偽粒子の侵入を阻害した(図30J)。したがって、ワクチン接種プロトコルは、H2と同様に
、他のグループ1 HAを中和することができる、広範な特異性を有するストーク抗体を誘発
した。
(6.6.3 結論)
この実施例は、キメラHAのワクチン接種によって誘発することができるストーク特異的
免疫応答の防御的効果を示している。HAストークに対する免疫応答がウイルス感染からの
防御に十分であること、及びこのワクチン接種プロトコルが異種亜型防御をもたらすこと
が示された。年に1度のワクチン接種の必要性をなくし、かつパンデミックに対する準備
を促進する、広範囲のインフルエンザウイルスに対する防御をもたらすための同様の戦略
をヒトで開発することができる。
(6.7 実施例7:カルボキシ末端三量体化ドメインは可溶性組換え血球凝集素基体のストー
クドメイン上の立体構造エピトープを安定化する)
この実施例は、カルボキシ末端三量体化ドメインが組換え可溶性インフルエンザウイル
ス血球凝集素上のストークエピトープの構造完全性に重要であることを示している。
(6.7.1 材料及び方法)
(6.7.1.1 細胞)
Sf9昆虫細胞(ATCC # CRL-1711)を、10％FBS(Atlanta Biologicals)、0.1％Pluronic F6
8(Sigma)、及びペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質(Gibco)混合物を補充したTMN-FH
培地(Gemini Bio-Products)中で増殖させた。BTI-TN-5B1-4細胞(High Five - Vienna Ins
titute of Biotechnologyのサブクローン)を、ペニシリン-ストレプトマイシン抗生物質
混合物(Gibco)を補充したHyClone SFX無血清培地(Fisher Scientific)中で増殖させた。
(6.7.1.2 クローニング及び組換えバキュロウイルス作製)
H1株A/プエルトリコ/8/34(PR8)、A/カリフォルニア/04/09(Cal09)、H2株A/日本/305/57
(JAP57)、H3株A/香港/1/68(HK68)、A/ウィスコンシン/67/05(Wisc05)、及びH5株A/ベトナ
ム/1203/04(VN04-多塩基性切断部位が除去されたもの; Steelらの文献、2009, J Virol 8
3: 1742-1753参照)のHAをコードする配列を、ポリメラーゼ連鎖反応によりpCAGGSプラス
ミドから増幅させ、BamHI又はStuI及びNotI制限エンドヌクレアーゼ(NEB)を用いて、修飾
されたpFastBacベクター(Invitrogen)にクローニングした。三量体化ドメインを有さない
HA及び三量体化ドメインを有するHAという2組の構築物をクローニングした:三量体化ドメ
インを有さないHA構築物は、HAのC末端膜貫通及び細胞内ドメインがヘキサヒスチジン-タ
グと置き換えられるように設計され(HA配列は、H1についてはI509、H2及びH5についてはV
509、並びにH3についてはG508で終わる; H3付番);もう1組の構築物である三量体化ドメイ
ンを有するHAもC末端膜貫通及び細胞内ドメインを欠くが(HA配列はV503で終わる-H3付番)
、C末端ヘキサヒスチジン-タグに加えて、トロンビン切断部位及びT4フォルドン三量体化
ドメインを含む(例えば、Meierらの文献、2004, J Mol Biol 344: 1051-1069参照)(図31)
。作製された組換えpFastBacクローンを、製造業者の指示に従ってDH10Bac細菌(Invitrog
en)中に形質転換し、組換えバクミドをPureLink Plasmid Filter Midiprepキット(Invitr
ogen)で調製した。Cellfectin II(Invitrogen)を組換えバキュロウイルスのレスキューに
用いて、組換えバクミドをSf9細胞中に形質転換した。全ての配列をサンガーシークエン
シングにより確認した。
(6.7.1.3 タンパク質発現、精製、及び特徴付け)
バキュロウイルスをSf9細胞で継代数3のストックになるまで増幅させ、その後、それを
用いて、BTI-TN-5B1-4(High Five)細胞に、HyClone SFX無血清培地(Fisher Scientific)
中、1×106細胞/mlで、10の感染多重度で感染させた。発現を、1000mlの振盪フラスコ中
、28℃で96時間実施した。96時間後、上清を低速遠心分離(5000g、4℃、20分)により清澄
化し、Ni-NTA(Qiagen)樹脂(250mlの培養上清に対して3mlのスラリー)とともに、室温(RT)
で2時間インキュベートした。その後、樹脂-上清混合物を10mlのポリプロピレンカラム(Q
iagen)に通した。保持された樹脂を15mlの洗浄バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、2
0mMイミダゾール、pH 8)で4回洗浄し、タンパク質を溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300m
M NaCl、300mMイミダゾール、pH 8)で溶出させた。溶出液を、30kDaのカットオフを有す
るAmicon Ultracell(Millipore)遠心分離ユニットを用いて濃縮し、バッファーをpH 7.4
のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に交換した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準
曲線とともにQuickstart Bradford Dye Reagent(Bio-Rad)を用いて定量した。タンパク質
の純度、完全性、及び同一性を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動法(SDS-PAGE)(4〜20％ポリアクリルアミド - Mini PROTEAN TGXゲル、Bio-Rad)、クマ
シー染色、及びウェスタンブロット、又は酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により評価
した。三量体化及び/又は多量体化の程度を、製造業者の奨めに従って、HAをビス-[スル
ホスクシンイミジル]スベレート(BS3 - Fisher Scientific)と架橋することにより試験し
た。簡潔に述べると、3μgのHAを、25倍モル濃度過剰のBS3クロスリンカーの存在下、30
μlのPBS中でインキュベートした。混合物をRTで30分間インキュベートし、その後、1M T
ris-HClバッファー(pH 8)を50mMの最終濃度まで添加することにより、BS3をクエンチした
。その後、SDS-PAGE並びに/又はマウス抗his一次抗体(Sigma)及び抗マウス西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ(Santa Cruz Biotechnology)もしくはアルカリホスファターゼ(Santa Cru
z Biotechnology)コンジュゲート二次抗体を用いるウェスタンブロット解析を実施した。
(6.7.1.4 酵素結合免疫吸着アッセイ)
Immunolon 4HBX(Fisher Scientific)プレートに、三量体化ドメインを有する組換えHA
及び三量体化ドメインを有さない組換えHAを、コーティングバッファー(0.1M Na2CO3/NaH
CO3、pH 9.2、50μl/ウェル)中、5μg/mlの濃度で、4℃で一晩コーティングした。その後
、プレートを、1％Tween 20及び3％脱脂粉乳を含むPBS(pH 7.4)(TBPS)で、RTで1時間ブロ
ッキングした。ブロッキング後、プレートをTPBSで1回洗浄し、その後、3倍希釈のモノク
ローナル抗体又は血清(1％粉乳を含むTPBS中、1ウェル当たり100μl-モノクローナル抗体
の出発濃度30μg/ml;血清については、1:100希釈)とともにRTで1時間インキュベートした
。その後、プレートを100μlのTPBSで3回洗浄し、1:3000希釈(1ウェル当たり50μl)の西
洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスIgG(Santa Cruz Biotechnology)又は
抗ヒトFab二次抗体(Sigma)とともに、RTでさらに1時間インキュベートした。さらに3回洗
浄した後、プレートを、SigmaFAST OPD基質(Sigma)(100ul/ウェル)を用いて発色させ、3M
HCl(50μl/ウェル)で停止させ、490nmの吸光度で、Synergy 4(BioTek)プレートリーダー
で読み取った。得られた読出しから、二次抗体のみとともにインキュベートしたウェルか
らの値をバックグラウンド減算した。
安定性研究のために、三量体化ドメインを有するPR8ウイルス由来のHAを4℃で60日間、
又は-80℃で保存し、1回(標準)、2回、3回、又は4回の凍結-解凍サイクルに供した。スト
ーク結合抗体と比べたヘッド結合抗体の安定性を、PY102及びC179モノクローナル抗体を
用いて比較した。ELISAにおける抗体-HA組合せを、二回反復を使用する安定性研究を除き
、三回反復で行った。
(6.7.2 結果)
(6.7.2.1 C末端三量体化ドメインはHAを安定化し、三量体形成を誘導する)
様々なグループ1及びグループ2 HAの細胞外ドメインを、バキュロウイルス発現系で、C
末端T4ファージ三量体化ドメインを有する又はC末端T4ファージ三量体化ドメインを有さ
ない可溶性形態で発現させた(図31)。感染から96時間後、タンパク質を回収し、Ni-NTAカ
ラムを用いて、C末端ヘキサヒスチジン-タグを介して精製した。精製タンパク質を、超遠
心スピンカラムを用いて濃縮し、タンパク質の完全性及び不純度についてSDS-PAGE及びク
マシー染色により評価し、ブラッドフォード試薬で定量した。アミノ酸配列と、多塩基性
切断部位のないバキュロウイルス発現全長HAは通常切断されないという事実とに基づくと
、HAの細胞外ドメインは、グリコシル化を考慮しなければ、単量体当たり約60kDaの予想
分子質量(すなわち、三量体当たり180kDa)を有することになる。60kDaの切断されていな
いHAバンド(HA0)に加えて、約40kDa(HA1)及び25kDa(HA2)のバンドが存在することによっ
て示されるように、三量体化ドメインを有さないCal09(H1)、JAP57(H2)、及びVN04(多塩
基性切断部位のないH5) HAは、一部切断されて、HA1とHA2になるように思われた。非還元
変性SDS-PAGEで、三量体化ドメインを有するCal09、JAP57、及びVN04 HAについて60kDaの
バンドだけが存在することに基づき、これらのタンパク質は、大部分が、切断されていな
いHA0として発現されると仮定することができる(図32A)。さらに、三量体化ドメインのな
いWisc05(H3) HAの調製物は、抗ストーク抗体(12D1)でプロービングしたときに反応性が
ある40kDaの分解産物を示した。したがって、この種は、非特異的切断の産物である可能
性が高かった。三量体化ドメインを有するWisc05 HAは、HA0バンドとしてのみ出現した(
図32A)。PR8及びHK68 HAは、三量体化ドメインがなくても、非常に安定である(HA0として
存在する)ように見えた。
HAの三量体化を示すために最近使用される親水性の11オングストロームの化学クロスリ
ンカーのBS3を用いて、T4三量体化ドメインを有するHA又はT4三量体化ドメインを有さな
いHAを架橋した(例えば、Weldonらの文献、2010, PLoS One 5参照)。架橋後、試料を還元
変性ローディング色素に希釈し、還元変性SDS-PAGEゲル上で分離した。三量体化ドメイン
を有さないグループ1 HAは、ランニングゲル中をほとんど泳動せず、大部分がスタッキン
グゲルに保持される高分子量オリゴマーを形成した(図32B及び32C)。最も強い表現型は、
VN04及びJAP57の場合に検出され;他のグループ1 HAは、さらなる三量体(約230kDa)、二量
体(130〜150kDa)、及び単量体(60kDa)も形成した(図32B及び32C)。三量体化ドメインを有
するグループ1 HAは、大部分が、SDS-PAGEゲル上で約230kDに泳動する三量体を形成し、
また、ランニングゲル中に明確なバンドを形成した。しかしながら、それらは、二量体(
約130〜150kDa、Cal09の場合に最も強い)及び単量体(60kDa)も形成した。グループ2 HAは
、異なる形で挙動し: HK68 HAは、主に三量体を形成し、三量体化ドメインの存在を問わ
ず、ある程度、二量体を形成した。Wisc05 HAは、三量体化ドメインの非存在下で、主に
二量体化を示したが、T4ドメインを有するHAは、大部分が三量体化した。
(6.7.2.2 C末端三量体化ドメインはHA基体に対するストーク反応性抗体の結合を強く増
強する)
三量体化ドメインを有するHA基体及び三量体化ドメインを有さないHA基体に対するこれ
らの抗体の示差結合を明らかにするために、HA構築物に対する一連の広域反応性中和抗体
の反応性を評価した。ストーク特異的抗体mAb C179、マウスmAb 6F12、ヒトmAb CR6261(
全てグループ1特異的);並びにマウスmAb 12D1及びヒトmAb CR8020(両方ともグループ2特
異的)を本実験で使用した。最近単離され、H1 HaとH5 Haの両方に対する反応性を有する
ことが特徴付けられた4つの他のストーク反応性抗体、KB2、BD3、GG3、及びIB11も本実験
で使用した。対照として、HAの球状ヘッドドメインに結合することが知られている株特異
的抗体を使用した。さらなる対照として、インフルエンザウイルス株(PR8、Cal09、H3、V
N04)に致死量未満で感染させた又はVLP(JAP57)をワクチン接種したマウスの血清を使用し
た。抗体C179、CR6261、及び6F12は、試験された両方のH1 HA(Cal09及びPR8)に対する強
い結合表現型を示した。それらが、三量体化ドメインを有するHAにのみ結合し(図33A及び
33B);三量体化ドメインを有さないHAに対する結合が観察されなかったことは注目すべき
ことである。同様の結合特徴は、他の4つのストーク反応性広域中和性H1-H5抗体で見られ
た。対照的に、ヘッド特異的抗体、例えば、7B2(Cal09)及びPY102(PR8)は、三量体化ドメ
インの発現とは無関係にHAと反応し、これらの知見は、Cal09又はPR8感染動物由来の血清
を用いて確認された(図33A及び33B)。
この作用は、H1亜型に特異的なものではなく−三量体化ドメインを有するJAP57(H2)及
びVN04(H5) HA並びに三量体化ドメインを有さないJAP57(H2)及びVN04(H5) HAに対するC17
9及びCR6261の結合を試験したとき、同様の表現型が観察され、その場合、これらの抗体
は、三量体化形態のタンパク質とのみ反応した(図34A及び34B)。同じ結果は、4つのH1-H5
抗体の反応性を評価したときに見られた。ヘッド特異的抗体8F8(JAP57)及びmAb#8(VN04)
又はポリクローナル抗H2もしくは抗H5血清は、両方の形態のHAを同程度によく認識した。
グループ2 HA結合抗体については、異なるパターンが出現した。ストーク抗体とグルー
プ2 HAとの反応性に対する三量体化ドメインの効果を検証するために、広域反応性抗体CR
8020及び12D1を使用した。CR8020がグループ2 HA中の立体構造エピトープに結合するのに
対し、12D1は、HA2サブユニットの長いαヘリックス(LAH)内の線状エピトープに結合する
と考えられる。三量体化ドメインを有するHK68及びWisc05 HAに対するCR8020結合は、三
量体化ドメインを有さないHAに対する結合と比べて大きく増強された(図35A及び35B)。し
かしながら、三量体化ドメインの欠如は、グループ1 HAで見られるように、結合を完全に
無効化するものではななかった。12D1は、三量体化ドメインを有するHAと三量体化ドメイ
ンを有さないHAを区別しなかった(図35)。
(6.7.3 結論)
T4三量体化ドメインは可溶性HA分子の三量体化の成功を可能にし、バキュロウイルス発
現後のこれらの分子の安定性を大きく増大させる。
(6.8 実施例8: H1インフルエンザウイルスのステムドメイン及びH5インフルエンザウイ
ルスの球状ヘッドドメインを含むキメラHAを発現するインフルエンザウイルス(cH5/1))
この実施例は、H1インフルエンザウイルスのステムドメイン及びH5インフルエンザウイ
ルスの球状ヘッドドメインを含むキメラHAを発現するインフルエンザウイルス(すなわち
、cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを発現するように改変されたゲノ
ムを含むインフルエンザウイルス)の人為的作製及びレスキューを示している。
cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを発現するインフルエンザウイル
スのレスキュー用のプラスミドは、A/カリフォルニア/04/09のHA遺伝子を保有するレスキ
ュープラスミド中の球状ヘッドドメインのコドン(53〜276、H3付番)をA/ベトナム/1203/0
4(H5)の球状ヘッドドメインと置換することにより構築した。構築物の配列をサンガーシ
ークエンシングにより確認し、293T細胞における発現を、上記の方法に従って、ウェスタ
ンブロット解析を用いて試験した。
レスキュー用の組換えウイルスの作製を、上の実施例5に記載の手法を用いて達成した
。cH5/1Cal09 HAをコードするプラスミドを、A型インフルエンザウイルス(PR8骨格)の7つ
の他のゲノムセグメントをコードする7つの相補的レスキュープラスミドとともに、293T
細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後の1日目に、上清を回収し、10
日齢の発育卵中に直接接種した。接種後48時間の卵を4℃に冷却し、尿膜腔液を回収した
。ウイルスの増殖を血球凝集アッセイにより評価した。陽性の卵由来の上清をMDCK細胞上
でプラーク形成させ、単一のプラークを採取し、発育卵中で再び増殖させた。プラーク精
製したウイルス由来のRNAを単離し、逆転写し、配列をサンガーシークエンシングにより
確認した。ウイルスクローンの同定は、厳密にH1ストーク反応性である抗体(6F12)及びA/
ベトナム/1203/04(H5)に対する株特異的抗ヘッド抗体による染色によって証明され、A/カ
リフォルニア/04/09のHA遺伝子及びA/ベトナム/1203/04(H5)の球状ヘッドドメインを含む
cH5/1キメラインフルエンザ血球凝集素ポリペプチドを発現するように改変されたゲノム
を含むインフルエンザウイルスの作製及び単離が確認された。
(6.9 実施例9 血球凝集素ストークに基づく普遍的ワクチン構築物はグループ2のA型イ
ンフルエンザウイルスを防御する)
この実施例は、H3血球凝集素(グループ2)のストークドメインを含むキメラHAポリペプ
チドの投与を含むワクチン接種戦略が、対象において、異種H3、H10、H14、H15、及びH7(
新規の中国のH7N9ウイルスに由来する)血球凝集素に極めて交差反応性である広域中和性
抗ストーク抗体を誘導することを示している。この実施例は、これらの抗ストーク抗体が
、H7亜型を含む様々なグループ3の血球凝集素を発現するインフルエンザウイルスに対す
る広範な防御を付与することも示している。
(6.9.1 材料及び方法)
(細胞及びウイルス)
Madin-Darbyイヌ腎臓細胞(MDCK; ATCC CCL-34)及びヒト胚腎臓293T細胞(ATCC CRL-1126
8) をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collecti
on)から購入し、それぞれ、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)(Gibco)及び最小必須培
地(Gibco)中で維持した。両方の培地に、10％胎仔ウシ血清(FBS; HyClone)及び100ユニッ
ト/mlのペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン(Pen-Strep; Gibco)を補充した。
キメラ及び組換えインフルエンザウイルスを、以前に記載されている通りに、プラスミ
ドベースのリバースジェネティックスにより産生した(Margineらの文献、2013, J. Virol
. 87:4728-4737; Haiらの文献、2012. J. Virol. 86:5774-5781; Krammerらの文献、2013
. J. Virol. 87:6542-6550)。ウイルス株A/ビクトリア/361/11(H3N2; Vic11)、A/パース/
16/09(H3N2; パース09)、A/フィリピン/2/82(H3N2; Phil82)、X-31(H3N2; A/香港/1/68由
来のHA及びNAを有するA/プエルトリコ/8/34の6:2再集合体)、A/レア/ノースカロライナ/3
9482/93(H7N1;レアH7)、A/cH5/3N1(A/ベトナム/1203/04のH5球状ヘッドドメイン、パース
09由来のH3ストークドメイン、並びにA/プエルトリコ/8/34のNA及び内部遺伝子を発現す
る)、A/ワイオミング/03/03(H3N2; WyoH3)、A/ハシビロガモ/アラスカ/7MP1708/07(H3N8)
、A/マガモ/内陸アラスカ/10BM01929/10(H10N7)、並びにB/cH7/3(B/山形/16/88バックグ
ラウンドでA/パース/16/09由来のH3ストークドメインの上にA/マガモ/アルバータ/24/01
由来のH7球状ヘッドを発現する)を、8又は10日齢の発育鶏卵中、37℃で48時間(A型インフ
ルエンザウイルスの場合)又は33℃で72時間(B型インフルエンザウイルスの場合)増殖させ
た(Haiらの文献、2012. J. Virol. 86:5774-5781; Haiらの文献、2011. J. Virol. 85:68
32-6843)。A/インディアナ/10/11(H3N2変異体、H3N2v)をMDCK細胞で増殖させた。ウイル
ス力価を、トシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)処理トリプシンの存在下、
MDCK細胞で決定した。Vic11、パース09、Phil82、X-31、レアH7、及びA/cH5/3N1ウイルス
を、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)用に、ショ糖密度超遠心により精製した。陽性対
照として使用される株(Phil82、X-31、レアH7、及びA/cH5/3N1)の精製した調製物をホル
マリン処理により不活化した。ウイルスは全て、バイオセーフティーレベル2の条件下で
取り扱った。cH5/3及びcH7/3タンパク質を発現するウイルスは、低病原性の表現型と関連
するもとのH3切断部位を含有し、通常、ヒトにとって安全であると考えられるA/プエルト
リコ/8/34バックグラウンド(Beareらの文献、1975. Lancet ii:729-732)中でレスキュー
された。利用されたH7N1分離株は、鳥類の種でも同様に低病原性の表現型を示す(Joseph
らの文献、2007. J. Virol. 81:10558:10566)。Sf9細胞(ATCC CRL-1711)は、10％FBS、1
％Pluronic F68(Sigma)、及びPen-Strep(Gibco)を補充したキンウワバ培地製剤Hink(TNM-
FH)(Gemini Bio-products)中で維持した。BTI-TN-5B1-4(High Five)細胞(ATCC CRL-10859
)は、Pen-Strep(Gibco)を含むHyClone SFX無血清昆虫細胞培地(Fisher Sci- entific)中
で増殖させた。
(組換えタンパク質発現)
cH4/3(A/アヒル/チェコ/56由来のH4球状ヘッドドメインをパース09由来のH3ストークド
メインと組み合わせたもの)、cH5/3(A/ベトナム/1203/04由来のH5球状ヘッドドメインを
パース09由来のストークドメインと組み合わせたもの)、cH7/3(A/マガモ/アルバータ/24/
01由来のH7球状ヘッドがパース09のH3ストークドメインの上にある)、及びパース09 HAの
発現用の組換えバキュロウイルスを、別の場所に記載されている通りに作製し(Margineら
の文献、2013. J. Virol. 87:4728-4737; Krammerらの文献、2012. PLoS One. 7:e43603.
doi:10.1371/journal.pone.0043603)、Sf9細胞で増殖させた。発現のために、High Five
細胞を組換えバキュロウイルスに約10の感染多重度で感染させ、フェルンバッハフラスコ
に移し、振盪させながら、28℃でインキュベートした。感染から96時間後、培養上清を低
速遠心分離(5,500相対遠心力[RCF]、10分、4℃)により回収し、その後、回転シェーカー
中、75rpmで振盪させながら、Ni-ニトリロ三酢酸(NTA)樹脂(Qiagen)とともに室温(RT)で3
時間インキュベートした。その後、樹脂-上清混合物を10mlポリプロピレンカラム(Qiagen
)に通し、洗浄バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、20mMイミダゾール、pH 8)で4回洗
浄し、溶出バッファー(50mM Na2HCO3、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8)で溶出させ
た。溶出画分を濃縮し、Amicon Ultra遠心分離フィルターユニット(Millipore; 30-kDa分
子量カットオフ)を用いて、バッファーをリン酸緩衝生理食塩水(PBS; pH 7.4)と交換した
。精製タンパク質の純度、同一性、及び完全性を、SDS-PAGE及びウェスタンブロッティン
グ又はELISAにより評価し、タンパク質濃度を、ブラッドフォード試薬(Bio-Rad)を用いて
測定した。ワクチン構築物によって誘導されるストーク反応性抗体を評価するためのELIS
Aで使用する場合、ELISA用の可溶性A/パース/16/09 H3、A/上海/1/13 H7、及びA/PR/8/34
H1 HAを、同様の方法で、しかし、GCN4pII三量体モチーフ及びC末端Strep-Tag IIを有す
る融合タンパク質として発現させ、StrepTactin樹脂(GE Healthcare)に通して、バックグ
ラウンドシグナルを回避した(Krammerらの文献、2013. J. Virol. 87:6542-6550)。
(動物、ワクチン接種、及び感染)
動物実験は全て、6〜8週齢の雌BALB/cマウス(Jackson Laboratories)を用いて、マウン
ト・サイナイ・アイカーン医科大学(Icahn Sinai School of Medicine at Mount Sinai)
の施設内動物管理及び使用委員会のガイドラインに完全に準拠して行われた。動物に、食
餌及び水を自由に与え、12時間の明暗周期で維持した。全ての鼻腔内処置のために、0.1m
lのケタミン-キシラジン混合物(0.15mg/kg及び0.03mg/kg)を腹腔内投与することにより、
動物を麻酔した。
最初の実験のために、未感作の6〜8週齢のBALB/cマウスに、TriGrid送達系(Ichor Medi
cal Systems)を用いるインビボエレクトロポレーションにより、cH4/3 HAをコードするDN
Aを左腓腹筋にワクチン接種した(Margineらの文献、2013. J. Virol. 87:4728-4737; Kra
mmerらの文献、2013. J. Virol. 87:6542-6550; Steelらの文献、2010. mBio 1(1):e0001
8-10. doi:10.1128/mBio.00018-10)。3週間後、動物を、各々の部位で、5μgのポリ(I・C
)(Invivogen)がアジュバントとして添加された5μgのタンパク質で、筋肉内(i.m.)及び鼻
腔内(i.n.)に追加免疫した(1群当たり、n＝9又は10匹の動物)。初回免疫のみの動物(1群
当たりn＝5)は、筋肉内と鼻腔内の両方で、同量の無関係なタンパク質(ウシ血清アルブミ
ン[BSA])を同量のアジュバントとともに受容した。3週間後、第二の追加免疫を、同じ方
法ではあるが、cH7/3タンパク質とともに投与した。H7N1感染に供されるマウスのサブセ
ットについては、cH7/3タンパク質を全長パース09 H3タンパク質に置き換えた。初回免疫
のみの動物は、対応するBSAワクチン接種を再び受けた。感染の3週間前に、陽性対照動物
(1群当たりn＝5)に、1 fl.gの不活化されたマッチする感染ウイルスを筋肉内にワクチン
接種した。未感作マウス(1群当たりn＝5)をさらなる陰性対照群として含めた。最後の追
加免疫から4週間後、動物を麻酔し、5 50％致死用量(LD50)のPhil82、X-31、又はレアH7
ウイルスに感染させた。体重を14日間毎日モニタリングし、その初期体重の25％以上を失
った動物を死亡と記録し、人道的に安楽死させた。初回免疫前及び感染前に、顎下腺出血
により、血清試料を回収した。
第二の組の実験のために、未感作の6〜8週齢BALB/cマウスに、cH7/3 HAタンパク質を発
現する致死用量未満(106PFU)の組換えB型インフルエンザウイルスベクター(B/山形/16/88
に基づく)を鼻腔内感染させた。対照動物は、同じ用量の野生型(wt) B型インフルエンザ
ウイルス(Bwt)を受容した。その後、ワクチン群のマウスを、5μgのポリ(I・C)が各々ア
ジュバントとして添加されたcH5/3タンパク質(5μg i.n.＋5μg i.m.)で追加免疫し、cH5
/3N1ウイルス感染に供した動物のサブセットを例外とした;これらの動物は、cH5/3タンパ
ク質の代わりに同じ方法で組換えパース09全長H3 HAを受容した(1群当たりn＝10)。初回
免疫のみの動物及びベクター対照動物(1群当たりn＝5)は、その代わりに、無関係なタン
パク質(BSA;ワクチン群の場合と同じ量、アジュバント、及び投与経路)による追加免疫を
受けた。最後に、3週間後、動物は、第一の追加免疫について記載されている通りに、cH4
/3タンパク質による第二の追加免疫を受けた。この場合も、初回免疫のみの動物及びベク
ター対照動物は、同じ方法で、無関係なタンパク質を受容した。未感作マウス(1群当たり
n＝5)をさらなる陰性対照群として含めた。ウイルス感染の3週間前に、陽性対照動物(1群
当たりn＝5)に、1μgの不活化されたマッチする感染ウイルスを筋肉内にワクチン接種し
た。最後の追加免疫から4週間後、動物を麻酔し、10 LD50のPhil82もしくはX-31のどちら
か又は100 LD50のcH5/3N1ウイルスに感染させた。体重減少を14日間毎日モニタリングし
、その初期体重の25％以上を失った動物を死亡と記録し、人道的に安楽死させた。初回免
疫前及び感染前に、顎下腺出血により、血清試料を回収した。肺力価測定実験については
、上記の通りに、マウスにワクチンを接種し(cHA及びBwt-BSA-BSA群、1群当たりn＝3匹の
マウス)、その後、5×104PFUのH3N2v又は1×105PFUのH3N8、WyoH3、もしくはH10N7ウイル
スに感染させた。感染後3日目に肺を回収し、ホモジナイズし、50％組織培養感染用量(TC
ID50)を以前に記載されている通りに測定した(Millerらの文献、2013. J. Infect. Dis.
207:98-105)。
受動伝達実験のために、後者の組の実験からの血清を、(B型インフルエンザ-ベクター
化)ワクチン群、陽性対照群、ベクター対照群、及び未感作動物から回収した。その後、
各々の群由来の血清を腹腔内注射により未感作マウスに伝達し(6〜8週齢、1群当たりn＝5
、マウス1匹当たり血清300μl)、伝達から2時間後、マウスを5 LD50のPhil82ウイルスに
感染させた。体重を14日間毎日モニタリングし、その初期体重の30％以上を失った動物を
死亡と記録し、安楽死させた。
(ELISA)
ELISAプレート(Immunolon 4 HBX)に、4℃で一晩、炭酸塩/重炭酸塩コーティングバッフ
ァー(pH 9.4)に希釈した精製ウイルス(4μg/ml)又は精製タンパク質(2μg/ml)のどちらか
をコーティングした。プレートを、0.1％Tween 20及び3％脱脂粉乳を含むPBS(TPBS)で、R
Tで1時間ブロッキングした。マウス血清を1:100に予め希釈し、1％脱脂粉乳を含むTPBSに
1:2ずつ連続希釈し、プレート上で、RTで1時間インキュベートした。TPBS(3×100μl/ウ
ェル)で徹底洗浄した後、プレートを、1％脱脂粉乳を含むTPBSに希釈した抗マウスIgG西
洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートIgG(Santa Cruz)とともに、RTで1時間イ
ンキュベートした。さらに3回のTPBSによる洗浄工程の後、o-フェニレンジアミン二塩酸
塩(SigmaFast OPD; Sigma)基質を用いてプレートを発色させた。3M HClを用いて反応を停
止させ、490nmの光学密度でプレートを読み取った。
鼻洗浄液中のIgAの検出を、アルカリホスファターゼ(AP)結合抗マウスIgA抗体(Souther
n Biotech)を1:500に希釈して及び37℃で3時間のインキュベーション工程で使用すること
を除き、同様のアッセイを用いて行った。血清中のアイソタイプ分布を、アイソタイピン
グキット(Invitrogen)を用いるELISAにより決定した。このキットは、各々の亜型に特異
的な多数の二次抗体及び結合の検出を可能にするAPコンジュゲート三次抗体を含む。
(シュードタイプ化粒子中和アッセイ)
シュードタイプ化粒子産生プロトコルを以前の研究(Haiらの文献、2012. J. Virol. 86
:5774-5781; Evansらの文献、2007. Nature, 446:801-805; Picaらの文献、2012. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:2573-2578)を基に改変した。簡潔に述べると、293-T細
胞に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、HIV Gag-Pol、Vic11 HAタンパク質、及びB型イ
ンフルエンザウイルスB/山形/16/88由来のノイラミニダーゼを含むプロウイルスをコード
する4つのプラスミドをコトランスフェクトした。培養上清をトランスフェクションから4
8時間後に回収し、0.45-μm孔径のフィルターユニットに通して濾過して、細胞破片を除
去した。精製されたシュードタイプ化粒子を様々な濃度の非働化マウス血清とともにイン
キュベートした後、MDCK細胞に添加した。形質導入処置を6時間実施し、その後、細胞を
洗浄し、新鮮な培地を細胞に加えた。形質導入処置を1μg/mlのポリブレン(Sigma, St. L
ouis, MO)の存在下で行った。ルシフェラーゼ活性を形質導入から48時間後に読み取った
。ストーク反応性モノクローナル抗体12D1(Wangらの文献、2010. PLoS Pathog. 6:e10007
96.doi:10.1371/journal.ppat.1000796)を123μg/mlの開始濃度で陽性対照として使用し
た。
(免疫蛍光染色)
MDCK細胞に、A/安徽/1/13(H7N9)、A/上海/1/13(H7N9)、A/ニワトリ/ハリスコ/12283/12
(H7N3)、A/マガモ/グリエフ/263/82(H14N5)、及びA/オナガミズナギドリ/西オーストラリ
ア/2576/79(H15N9)由来のHAを発現するプラスミドをトランスフェクトした。細胞にそれ
ぞれのプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから16時間後、細胞を
0.5％パラホルムアルデヒドで固定し、ワクチン接種動物(cH4/3DNA-cH5/3-H3)又は未感作
動物から回収された1:200希釈の血清で染色した。ストーク反応性抗体FI6(Cortiらの文献
、2011. Science, 333:850-856)及びFBE9(どちらも10μg/mlの濃度で使用)は陽性対照と
しての役割を果たし、一方、未感作動物から回収された血清は、陰性対照として使用され
た。Alexa 488にコンジュゲートした二次抗体を用いて、タンパク質に対する反応性を可
視化した。画像を、10倍の倍率で、LSM 510 Meta共焦点顕微鏡(Carl Zeiss MicroImaging
GmbH, Jena, Germany)で取得した。
(統計学的検定、血球凝集素モデリング、及び系統解析)
統計解析を、Prism4(GraphPad)を用いて実施した。値は全て、平均値の標準偏差付きの
平均としてプロットされている。生存の差は、ログランク有意検定によるカプラン-マイ
ヤー生存解析を用いることにより計算した。0.05又はそれ未満のP値を統計的有意とみな
す。野生型及びキメラ血球凝集素のモデルを作成するために、タンパク質データバンク(P
DB)からの構造を、PyMolソフトウェア(Delano Scientific)を用いることによりモデリン
グした。cH4/3構築物のモデリングのために、A/香港/1/68(HK68)のHA(PBD識別子[ID] 1MQ
N)を使用し、H4ヘッドドメインを異なる色で表示した(利用可能なH4構造はない)。cH5/3
HAは、HK68 HA由来のストーク(PBD ID 1MQN)及びH5ウイルスの球状ヘッド(PBD ID 2FK0)
を用いてモデリングし; cH7/3は、HK68ストークドメイン及び鳥H7ウイルス由来のヘッド
ドメイン(PDB ID 4DJ6)を用いてモデリングした。キメラ感染ウイルスは、HK68のストー
ク構造(PBD ID 1MQN)及びH5 HAのヘッド(PBD ID 4DJ6)を用いることによりモデリングし
た。系統解析を、ClustalW(EMBL-EBI)を用いて実施した。タンパク質配列をGenBankから
ダウンロードし、Megaバージョン5.1のClustalWアルゴリズムを用いて、多重アラインメ
ントを行った。FigTreeソフトウェア及び近隣結合法を用いて、系統樹を構築した。
(6.9.2 結果)
(キメラHA構築物は異なるH3N2ウイルスによる感染からの広範な防御をもたらす)
グループ2 HAを発現するインフルエンザウイルスに対する広範な防御をマウスモデルで
誘導するために、保存されたHAストークドメインに対する抗体を特異的に追加免疫した。
この目的のために、様々なヘッドドメインと組み合わせたH3ストークドメインを発現する
多数のcHA分子を構築した(Margineらの文献、2013. J. Virol. 87:4728-4737; Haiらの文
献、2012. J. Virol. 86:5774-5781)。マウスを、cH4/3 HAをコードするプラスミドDNA(H
4球状ヘッドドメイン及びH3ストークドメインを発現する)で筋肉内に(i.m.)初回免疫した
(図37A)。3週間後、マウスを、i.m.経路と鼻腔内(i.n.)経路の両方を介して、可溶性cH5/
3タンパク質(H3ストークドメインをH5球状ヘッドドメインと組み合わせたもの)で追加免
疫した。両方の応答がインフルエンザウイルス感染に対する効率的な防御に重要であるの
で、全身免疫及び粘膜免疫の誘導を確実にするために、両方の経路を利用した。3週間後
、cH7/3タンパク質(H7球状ヘッドがH3ストークの上にある)による第二の追加免疫を行っ
た(図37A)。動物を、一般的な非拘束型(可溶性の非膜結合型)ストークドメインを発現す
る抗原に繰り返し暴露させることにより、現在使用されているワクチン接種戦略によって
準優位な応答しか誘導されないこの領域の免疫原性を増強させることができるという仮説
が立てられた(Wrammertらの文献、2008. Nature 453:667-671; Margineらの文献、2013.
J. Virol. 87:4728-4737)。
対照動物は、DNA初回免疫のみ(初回免疫のみの対照)もしくは不活化されたマッチする
感染ウイルス(陽性対照)を受容したか、又は未感作であった。このワクチンがインフルエ
ンザと関連する罹病及び死亡を防御する能力を試験するために、マウスを2つの異なるH3N
2ウイルスに感染させた。全てのcHAワクチン接種動物がそれぞれの感染株に対してHI陰性
であったことは注目すべきことである。A/フィリピン/2/82ウイルス(Phil82)に感染させ
たとき、ワクチン接種動物は、陽性対照の体重減なしと比較して最小量の体重を失い、臨
床症状を発症せず、死亡から完全に防御された(図37B及びC)。しかしながら、未感作動物
は急速に体重を失い、9日目までに感染が原因で死亡した(未感作対照)。初回免疫のみの
対照も急速な体重減少を示し、これらの20％しかウイルス感染を切り抜けて生き残らなか
った。同様の結果は、香港1968 H3N2ウイルスの糖タンパク質を発現するウイルスであるX
-31に感染させたときにも観察された(図37D及びE)。
過去のデータは、致死量未満のインフルエンザウイルス感染がマウス及びヒトでストー
ク反応性抗体を誘導する1つの方法であることを示している(Margineらの文献、2013. J.
Virol. 87:4728-4737; Picaらの文献、2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:257
3-2578; Krammerらの文献、2012. J. Virol. 86:10302-10307)。ほとんどのヒト個体は、
生涯を通じてインフルエンザウイルスに複数回暴露されるので、該個体は、通常、ベース
ラインレベルのストーク反応性抗体を有する。この先在免疫をマウスモデルで模倣するた
めに、野生型B型インフルエンザウイルスHAの代わりにcH7/3 HAを発現するB型インフルエ
ンザウイルスをレスキューした。致死用量未満のこのウイルスを用いて、マウスを初回免
疫し、その後、これに、3週間の間隔で、cH5/3、次いで、cH4/3タンパク質を、i.m.とi.n
.の両方でワクチン接種した(図38A)。Phil82又はX-31のどちらかに感染させた場合、動物
は、疾患の臨床的兆候を示さず、不活化されたマッチする感染株を受容した陽性対照動物
の体重減少と同程度の最小限の体重減少を示した(図38C、D、F、及びG)。野生型B型イン
フルエンザウイルスを致死量未満で感染させ、無関係なタンパク質(BSA)と同様の方法で
ワクチン接種した対照動物、並びに未感作マウス及び初回免疫のみの対照は、急速に体重
を失い、両方の感染が原因で死亡した。次に、ストークに対する免疫が直近のH3N2分離株
を防御する能力を試験した。現代のH3N2ウイルスはマウスモデルで病原性がないので、最
近のワクチン株A/パース/16/09(パース09)のH3ストークドメイン及びA/PR/8/34(H1N1)由
来のNAを発現するcH5/3N1ウイルスをこの目的のために使用した(Haiらの文献、2012. J.
Virol. 86:5774-5781)。ストーク反応性抗体により付与される防御を評価するために(及
びH5-H5ヘッド反応性抗体を排除するために)、ワクチン接種レジメンをこのサブセットの
マウスについて改変し、全長H3をcH5/3タンパク質の代わりに投与した(図38A)。高用量(1
00マウスLD50[mLD50])のcH5/3N1ウイルスに感染させた場合、ワクチン接種動物の体重減
少に対する強力な防御及び死亡に対する完全な防御が観察された。これにより、現代のH3
N2分離株に対するHAストークに基づくワクチンアプローチの効力が示された(図38B及びE)
。マウスモデルで死亡を誘導しないさらなる異なるH3株を試験するために、肺力価測定実
験を実施した。上記の通りにワクチン接種した動物を、H3N2変異体ウイルス(H3N2v)(CDC.
July 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61:561)、鳥H3N8分離株(H3N8)、及びヒトH
3N2 A/ワイオミング/03/03株(WyoH3)に感染させた。感染から3日後、ワクチン接種動物の
肺力価が低かった(検出限界に近かった)のに対し、対照動物(Bwt-BSA-BSA)から回収され
た肺では高いウイルス力価が検出された(図37F及びG並びにデータ非表示)。まとめると、
これらのデータは、ストークに基づくワクチン接種戦略が、インフルエンザのマウスモデ
ルで異種及び異種亜型ウイルスに対する強力な防御をもたらすことができることを明白に
示している。
(キメラHA構築物のワクチン接種はストークに対する広範囲の全身及び粘膜液性応答を誘
導する)
このワクチン接種レジメンによって誘導されるストークに対する抗体応答を特徴付ける
ために、ELISAを利用した。動物は、ベクター発現HA又は組換えHAのみに暴露されるが、
任意の他のA型インフルエンザタンパク質には暴露されないので、精製ウイルスを、抗ス
トーク応答を測定するための基質として使用することができた。両方のワクチン接種レジ
メン(B型インフルエンザウイルスをベクター化するもの又はDNAを初回免疫するもの)由来
の血清を、感染株Phil82及びX-31に対する、並びに現在のH3N2ワクチン株A/ビクトリア/3
61/11(Vic11)、H3N8株、及びパース09由来のHAタンパク質に対するその反応性について試
験した。未感作であるか又はDNA初回免疫のみに暴露させた動物から回収された血清は、
低バックグラウンドレベル結合を示し、一方、ワクチン接種マウスから回収された血清で
は、5つ全てのウイルス株に対する高い反応性が見られた(図39A〜E)。同様に、ストーク
に対する高い抗体力価が、cHAを発現するB型インフルエンザウイルスで初回免疫した動物
の血清で検出された(図39F〜H)。ベクター対照(野生型B型インフルエンザウイルス)及び
未感作動物は、この場合も、バックグラウンド反応性しか示さず、一方、初回免疫のみの
群(c7/3 HAを発現するB型インフルエンザウイルス)は、中間の結合表現型を有していた。
後者の群の中間の力価は、ウイルスの複製の結果であると考えられた(Margineらの文献、
2013. J. Virol. 87:4728-4737; Krammerらの文献、2012. J. Virol. 86:10302-10307)。
アイソタイプ分布から、ワクチンによって誘導される抗体応答のプロファイルは均衡が取
れており、IgGの大部分がIgG1、IgG2a、又はIgG2bサブクラスであることが明らかになっ
た(図41C参照)。
血清IgG力価に加えて、ワクチン接種マウスの粘膜表面での分泌IgAのレベルを評価した
。これにより、ワクチンを受けたマウスの群から回収された鼻洗浄液中のパース09 H3 HA
に対する高い反応性が明らかになったのに対し、対照動物由来の鼻洗浄液は、この基質と
反応しなかった(図41B参照)。粘膜の抗ストークIgA抗体、及びウイルス感染を阻止するそ
の能力は、正式にはまだ特徴付けられていないが、それらは観察された防御に寄与すると
仮定されている。
最近、広域反応性の抗球状ヘッド抗体が文献に記載されている(Ekiertらの文献、2012.
Nature 489:526-532; Leeらの文献、2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109:17040-
17045; Krauseらの文献、2012. J. Virol. 86:6334-6340)。天然では稀であるが、これら
の抗体は、受容体結合部位の保存された領域を認識し、かつ系統発生的関連性に厳密に従
うことなく、異なる球状ヘッドドメインを認識する傾向がある。グループ1 HAとグループ
2 HAの両方のヘッドドメインに対する結合(例えば、H1-H3結合)は、これらの抗体によっ
て説明されている。cHAに基づくワクチン接種によってそのような抗体が誘導されるかど
うかを評価するために、全長H1 HAを基質とするさらなるELISAを実施した(図41A参照)。c
HAワクチン接種動物由来の血清はこの基質と反応せず、cHAワクチン接種が検出可能なレ
ベルの広域反応性抗ヘッド抗体を誘導しないことが示唆された。
(誘導された広域反応性抗体はインビトロとインビボの両方でウイルスを強力に中和する)
ワクチン接種レジメンよって誘導されるストーク抗体のインビトロでの交差中和性をさ
らに試験するために、Vic11 HAシュードタイプ化粒子を用いる侵入阻害アッセイを実施し
た。ワクチン接種動物由来の血清は、偽粒子の細胞侵入を用量依存的な形で阻害した(図4
1D参照)。対照的に、B型インフルエンザウイルスベクターに感染させた対照動物及び未感
作マウス由来の血清は、このアッセイで阻害活性を示さなかった。
インビボで観察されたワクチン誘導性防御が少なくとも部分的には血清中の中和抗体に
よるものであることを示すために、受容伝達実験を実施した。ワクチン接種動物、陽性対
照動物、B型インフルエンザウイルスベクター感染動物、又は未感作動物由来の血清を未
感作マウスに伝達し、その後、これを、Phil82ウイルスに感染させた。ワクチン接種群又
は陽性対照群由来の血清を受容したマウスが死亡から完全に防御されたのに対し、陰性対
照群のどちらか由来の血清を受容した動物はいずれも生き残らなかった(図41E参照)。こ
れらの結果は、ストークに対する液性応答がマウスを致死感染から防御するのに十分であ
ることを示している。
(キメラHA構築物のワクチン接種はストークに基づく異種亜型免疫を誘導する)
異なるグループ2 HAインフルエンザウイルスを交差中和する抗体が文献に記載されてい
る(Wangらの文献、2010. PLoS Pathog. 6:e1000796. doi:10.1371/journal.ppat.1000796
; Ekiertらの文献、2011. Science 333:843-850)。異種亜型H7N1ウイルスに対する防御を
試験し、観察された防御におけるヘッドに対する抗体のいかなる関与も排除するために、
上記のDNA-タンパク質-タンパク質ワクチン接種レジメンを使用したが、cH7/3 HAタンパ
ク質を全長H3 HAと置き換えた(図40A)。鳥H7N1 A/レア/ノースカロライナ/39482/93株(レ
アH7)に感染させたワクチン接種動物と陽性対照動物はどちらも、約15％の類似した初期
体重減少を経験した(図40B)。これは、おそらく、この実験的ウイルス感染に必要とされ
るマウス致死用量当たりのPFU数が大きいことによるものである。しかしながら、両群の
マウスは速やかに体重を回復し、ワクチン群は90％の生存率を示した。しかしながら、未
感作動物及び初回免疫のみの動物は重度の体重減少を経験し、それぞれ、生存を全く示さ
ないか、又はわずかな(20％)生存を示した。後者の実験の結果は、HAストークに対する応
答によって生じる免疫の真の異種亜型性を示している(図40C)。血清中に存在する広域中
和抗体のレベルをさらに評価するために、精製H7N1感染ウイルスを用いて、及び新規の中
国のH7N9ウイルス株(Gaoらの文献、2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897)由来の組換
えH7タンパク質を用いて、ELISAを実施した。これらの動物から回収された血清中のH7 HA
に対する高い抗体力価は、H3ストークドメインによって誘導される応答の交差反応性を明
確に示すものである(図40D及びE、図41)。さらに、肺力価をアッセイ読出しとして、H10N
7ウイルスを用いる感染実験を実施した。ワクチン接種動物の3日目の肺力価が103 TCID50
/mlの範囲であったのに対し、模擬ワクチン接種動物は、10〜100倍高い力価を示した(図4
0F)。ユーラシア及び北米系統のH7 HA、並びにH14及びH15 HAを発現する細胞に対するcHA
ワクチン接種動物由来の血清の効率的な結合は、この免疫応答の交差反応性をさらに証明
するものである(図40G及び42)。
(6.9.3 考察)
抗ストーク抗体は、ワクチン接種又は感染のどちらかによってインフルエンザウイルス
に暴露されているヒトに見出すことができるが(Margineらの文献、2013. J. Virol. 87:4
728-4737; Suiらの文献、2011. Clin. Infect. Dis. 52:1003-1009; Cortiらの文献、201
0. J. Clin. Invest. 120:1663-1673)、それらは実際、天然では稀であるように思われ、
これらの抗体のインビボレベルは低すぎて、防御を生じることができない可能性が高い。
結果として、これらの広域中和性のストーク反応性抗体のレベルを増強することができる
ワクチンは、循環しているヒトインフルエンザウイルス株、及び新たに出現した中国のH7
N9株のような潜在的パンデミック鳥ウイルスに対する普遍的な防御をもたらすことができ
る(Gaoらの文献、2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897)。HAのストークドメインの保
存に基づくと、そのような普遍的ワクチンは、3つの成分:グループ1、グループ2、及びB
型インフルエンザのストークに基づく抗原を含まなければならない可能性が高い。
H3ストークドメイン及び異なる球状ヘッドを発現するキメラHA構築物を順次ワクチン接
種された動物は、ストークドメインに対する高力価の交差反応性抗体を生じさせた。これ
らの抗体は、一連のH3N2株とH3N8ウイルスとに対して防御的であるだけでなく、鳥H7N1及
びH10N7分離株の異種亜型感染に対する強力な防御をもたらし、グループ2 HA発現ウイル
スの両方のクレードにまたがる幅の広さを示した。この幅の広さは、H3N2変異体(H3N2v)
ウイルス及びニューイングランドゼニガタアザラシから単離されたH3N8ウイルス及び人獣
共通に感染する他のH3株(Bazらの文献、2013. J. Virol. 87:6901-6910; CDC. July 2012
. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61:561; Anthonyらの文献、2012. mBio 3(4):e00166-
12. doi: 10.1128/mBio.00166-12)、並びに時折ヒトに感染するH4、H7、及びH10発現ウイ
ルス(Runstadlerらの文献、2013. Infect. Genet. Evol. 17:162-187; Kayaliらの文献、
2011. PLoS One 6:e26818. doi:10.1371/journal.pone.0026818; Arzeyらの文献、2012.
Emerg. Infect. Dis. 18:814-816; CDC. 2012. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 61:726-
727; Fouchierらの文献、2004. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101:1356-1361; Twee
dらの文献、2004. Emerg. Infect. Dis. 10:2196-2199)のパンデミックの可能性に関する
懸念の増大を考慮すると重要である。重要なのは、このワクチン接種戦略が、新たに出現
した中国のH7N9ウイルス由来のH7 HAに対する高力価のストーク反応性抗体も誘導したと
いうことである(Gaoらの文献、2013. N. Engl. J. Med. 368:1888-1897)。
ヒトは、生涯を通じてインフルエンザウイルスに複数回暴露されるため、ストークドメ
インへの特異性を有する既に存在するメモリーB細胞を有する可能性が高い。この状況を
マウスモデルで模倣するために及びストーク反応性抗体の先在力価を効率的に増強するた
めに、H3ストークドメインを無関係な球状ヘッドドメインとの組合せで発現する組換えB
型インフルエンザウイルスに致死量未満で感染させることにより、マウスをH3ストークド
メインに予め暴露させた。同じストークドメインを含有するが、異なるヘッドを含有する
cHA構築物によるその後のワクチン接種により、ストーク反応性抗体のレベルは効率的に
増強され、1968年から2009年までに及ぶ一連のH3N2インフルエンザウイルス株による感染
からマウスを防御した。ワクチン接種マウス由来の血清は、広範囲のH3N2ウイルス基体並
びにH7N1ウイルス及びH7N9 HAタンパク質基体に対する良好な反応性を示した。ワクチン
接種動物は、H3N2v、H3N8、及びH10N7感染による感染後の肺力価の低下も示した。さらに
、該血清は中和活性を示し、受動伝達感染実験でマウスを防御することができた。これら
の知見から、このワクチン接種戦略によって誘発される中和のメカニズムが明らかにされ
、おそらくはウイルス中和に基づく抗体媒介性メカニズムが防御を媒介していることが示
唆される。防御に対するCD8+及びCD4+ T細胞の寄与は、この時点では除外することができ
ないが、感染を防御するのに、血清のみの伝達で十分であった。非中和性の交差反応性抗
インフルエンザ抗体によって誘導される病原性の増強が高齢者における新規の中国のH7N9
ウイルスの高い病原性の考えられる理由として提唱されている(Skowronskiらの文献、201
3. Euro Surveill. 18:pii=20465. http://www.eurosurveillance.org/View Article.asp
x? ArticleId=20465)。高力価の交差中和性抗体を有するcHAワクチン接種動物における病
原性の増強は観察されなかった。実際、該動物は罹病及び死亡から防御され、ウイルスは
より速やかに除去された。
本実験は、グループ2 HA発現ウイルスに対する防御がストーク反応性抗体のみによって
媒介されることができることを示すために設計された。本明細書に記載されているように
、ヒトワクチン戦略は、cHA構造をインフルエンザウイルスの機能的ノイラミニダーゼ及
び全ての内部タンパク質との組合せで発現する不活化ウイルス又は弱毒化ウイルスのどち
らかに基づくことができる。ヒトがメモリー応答を有するH3 HAの球状ヘッドドメインを
、ヒトが感作されていない「外来の」無関係なヘッドドメインに置き換えると、ストーク
反応性抗体が増加することに加え(Krammerらの文献、2013. J. Virol. 87:6542-6550; Mi
llerらの文献、2013. J. Infect. Dis. 207:98-105; Picaらの文献、2012. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 109:2573-2578; Liらの文献、2012. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 109:9047-9052; Wrammertらの文献、2011. J. Exp. Med. 208:181-193; Thomsonらの
文献、2012. Front. Immunol. 3:87)、NAに対する抗体のレベルが増強されるはずである
。さらに、強力なT細胞エピトープを有する内部タンパク質の存在によって、細胞性免疫
応答(cellular arm of the immune response)も活性化され、防御に寄与する可能性が高
いことが保証される。そのようなワクチンは、循環している全てのヒトインフルエンザウ
イルス株に対する及び潜在的パンデミック亜型に対する広範な防御を保証するために、グ
ループ1、グループ2、及びB型のストーク成分を含む。非常に幼い子供を除く大部分のヒ
トは、HAのストークドメインに対する低レベルの抗体を含む、インフルエンザウイルスに
対する先在免疫を有するので、三価のキメラHAワクチンによるワクチン接種がこれらの力
価を防御的レベルにまで効率的に増強することができることが可能である。
(6.10 実施例10: H3ストークに基づくキメラ血球凝集素インフルエンザウイルス構築物
はマウスをH7N9感染から防御する)
この実施例は、H7ヘッドドメインを保有しないキメラHA構築物を用いて、対象を新規の
H7N9ウイルスから防御することができることを示している。この実施例はまた、ヒト用に
認可されているものと同様の水中油系アジュバントがキメラHAワクチン候補とともにうま
く機能したことを示している。
防御に対する粘膜応答の重要性を検討するために、粘膜免疫と全身免疫の両方を誘導す
る実験設定を適用し、全身免疫しか誘導しない実験設定と比較した。さらに、ポリI:C(PI
C)−以前に動物においてcHAとの組合せで使用するのに成功している−と一般的な水中油
型(OIW)アジュバントという2つのアジュバントを比較した(Ottらの文献、2000. アジュバ
ントMF59: 10年間の展望(The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective)、p. 211-228. O'
Hagan DT(編)、ワクチンアジュバント(Vaccine Adjuvants)、第42巻. Springer)。後者は
、ヒトへの使用が認可されているアジュバントと同様のものである(Ottらの文献、2000.
アジュバントMF59: 10年間の展望(The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective)、p. 211
-228. O'Hagan DT(編)、ワクチンアジュバント(Vaccine Adjuvants)、第42巻. Springer)
。
動物(四角、1群当たりN＝10、雌6〜8週齢BALB/cマウス)を、TriGridエレクトロポレー
ション装置(Ichor Medical Systems)を用いる筋肉内エレクトロポレーションにより、cH4
/3タンパク質(A/アヒル/チェコ/56に由来するH4ヘッドがA/パース/16/09に由来するH3ス
トークドメインの上にある)(Margineらの文献、2013. J Virol 87:10435-10446)を発現す
るDNAプラスミドで初回免疫した(図43A)。DNAワクチン接種はcHAワクチン接種レジメンに
よる広範な防御の誘導に必須ではないことに留意されたい。タンパク質のみ(DNAなし)に
よるワクチン接種により、初期の研究でのDNA初回免疫によるワクチン接種と同様の結果
が得られた(Goffらの文献、2013. PLoS One 8:e79194)。初回免疫から3週間後、動物は、
組換えcH5/3タンパク質(A/ベトナム/1203/04に由来するH5ヘッドがA/パース/16/09に由来
するH3ストークの上にある)(Margineらの文献、2013. J Virol 87:10435-10446)を受容し
た。ある群の動物は、5μgのPIC(高分子量、Invivogen)がアジュバントとして添加された
5μgのcH5/3タンパク質を鼻腔内に(i.n.)、5μgを筋肉内に(i.m.)受容した(「PIC i.n.＋
i.m.」)。第二の群は、PICのi.m.投与のみを受け(合計5μgのHA)(「PIC i.m.」)、一方、
第三の群は、一般的なOIW系アジュバントとともに5ugのcH5/3タンパク質を受容した(「OI
W i.m.」)(図43A)。3週間後、それぞれ、同じワクチン接種経路、アジュバント、及び免
疫原量を用いて、全てのマウスを全長H3タンパク質で2回追加免疫した(図43A)。ワクチン
接種に使用される全ての組換えタンパク質を、C末端のT4フォルドン三量体化ドメイン及
び精製を容易にするためのヘキサヒスチジンタグを伴って、バキュロウイルス発現系で発
現させた(Krammerらの文献、2012. PLoS One 7:e43603)。OIWアジュバント(20mMクエン酸
塩、0.5％ポリソルベート80、pH 6.5、0.5％span-85(トリオレイン酸ソルビタン)、4.3％
スクアレン)を以前に記載されている通りに調製した(Ottらの文献、2000. アジュバントM
F59: 10年間の展望(The Adjuvant MF59: A 10-Year Perspective)、p. 211-228. O'Hagan
DT(編)、ワクチンアジュバント(Vaccine Adjuvants)、第42巻. Springer)(図44)。陽性
対照(丸、n＝5)は、ホルマリン不活化A/上海/1/13 H7N9(SH1、A/上海/1/13に由来するHA
及びNA並びにA/プエルトリコ/8/34由来の内部遺伝子を有する6:2再集合体)全ウイルス調
製物の1回のi.m.ワクチン接種を受けた。陰性対照(三角、n＝4〜5)は模擬DNAワクチン接
種を受け、その後、ウシ血清アルブミン(BSA)による2回の追加免疫が、それらが比較され
るそれぞれのcHAワクチン接種レジメンと同じ量及び経路で投与された。最後の免疫から4
週間後、動物から採血し、その後、10マウス致死用量50(mLD50)のSH1ウイルスに感染させ
た。体重減少を14日間にわたってモニタリングし、その初期体重の20パーセント超を失っ
たマウスを安楽死させた。PIC i.n.＋i.m.群の動物は、PIC i.m.群の15％(図43C)と比較
したとき、その初期体重の平均10％を失い(図43B)、感染部位での粘膜免疫が防御におい
て重要な役割を果たすことを示唆した。さらに、OIW i.m.群のマウスは、平均してその初
期体重の12％しか失わなかったが(図43D)、これは、観察された生存にも反映されている
。PIC i.m.動物のわずか70％(図43F)と比較して、全てのPIC i.m.＋i.n.ワクチン接種動
物が感染を切り抜けて生き残った(図43E)。しかしながら、OIW i.m.群の生存は100％であ
り(図43F)、OIWアジュバントによるより良好な防御効果が示された。3つの異なるワクチ
ン接種レジメンによって誘発されるH7 HA抗体の力価を定量的に評価するために、組換えS
H1 H7 HAを基質として用いて、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を実施した。cHAワクチ
ン接種動物はH7ヘッドドメインに暴露されなかったので、H7に対する何らかの観察される
反応性は、主に、交差反応性抗ストーク抗体に由来すると仮定された。ヘキサヒスチジン
タグ又は三量体化ドメインに対する結合を排除するために、GCN pIIロイシンジッパー三
量体化ドメイン及びstrepタグIIを伴って発現される組換えSH1 H7 HAを利用した(Krammer
らの文献、2013. J Virol 87:6542-6550; Weldonらの文献、2010. PLoS One 5.)。最大終
点力価は、PIC i.n.＋i.m.ワクチン接種動物から回収された血清で検出され、OIW i.m.動
物がそれに次いだ(図45A)。PIC i.m.ワクチンを受けたマウスは、OIW i.m.動物よりも統
計的に有意に低い力価(p＝0.03)を有していた。この終点力価の差は、体重減少及び生存
の差と相関している。抗体アイソタイプ分布はアジュバントによって強く影響を受けるこ
とがあり、抗体の防御効率に大きな影響を与えることがある。しかしながら、3つのワク
チン接種レジメンを比較したとき、アイソタイププロファイルに顕著な違いはなかった(
図45B)。これは、−i.m.のみのワクチン接種の場合−抗体力価が防御の主な相関物であっ
たことを示唆している。ワクチン群及び対照群由来の血清を微量中和アッセイでも試験し
たが、cHAワクチン接種群の結果は、おそらくはこのアッセイの検出限界(1:20)のために
、陰性であった(データは示さない)。両方の経路で免疫された動物は筋肉内にしかワクチ
ン接種されなかった動物よりも低い罹病率を示したので、i.n.ワクチン接種によって誘導
される粘膜IgA抗体は防御に対する相当な寄与を有していたと仮定される。PIC i.n.＋i.m
.群とPIC i.m.群の間の体重減少の差は、7日目(p＝0.0383)及び8日目(0.0136)で統計的に
有意であった(対応のないt-検定)。しかしながら、これらの動物がi.m.のみの動物の2倍
の抗原も受容したことに留意すべきである。
結論として、この実施例は、ストークに基づく免疫レジメンを、H7ヘッドドメインを保
有しないcHA構築物とともに用いて、マウスを新規のH7N9ウイルスから防御することがで
きることを示している。さらに、ヒトへの使用が認可されているものと同様の水中油系ア
ジュバント((Ottらの文献、2000. アジュバントMF59: 10年間の展望(The Adjuvant MF59:
A 10-Year Perspective)、p. 211-228. O'Hagan DT(編)、ワクチンアジュバント(Vaccin
e Adjuvants)、第42巻. Springer); O'Haganらの文献、2013. Expert Rev Vaccines 12:1
3-30)は、cHAワクチン候補とともにうまく機能し、この組合せをヒトでの実験用に検討す
ることができることを示唆した。普遍的なインフルエンザウイルス防御をもたらすHAスト
ークに基づくワクチンは、株特異的季節性ワクチンに取って代わり、H7N9のような潜在的
パンデミックインフルエンザウイルス株に対する準備をさらに促進することができる。
本明細書で引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物
又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的にかつ個別に示されているかの
ように、引用により本明細書に組み込まれている。上の発明は理解の明快さの目的のため
に図及び実施例によって少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の請
求項の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えることができ
ることが、当業者には容易に明らかであろう。
「HA1のC末端ステムセグメント」は、インフルエンザ血球凝集素HA1ポリペプチドのス
テムドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施
態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、HA1ドメインのアミノ酸AqからHA1C-term
までにほぼ対応するアミノ酸残基からなる。HA1C-termは、当業者によって認識されてい
るようなHA1ドメインのC末端アミノ酸である。残基Aqは、図1のA型インフルエンザ血球凝
集素ポリペプチド中で特定されている。例示的なHA1のC末端ステムセグメントが本明細書
に記載されている。ある実施態様において、HA1のC末端ステムセグメントは、H3血球凝集
素由来のHA1のアミノ酸277〜329にほぼ対応するアミノ酸残基からなる。この付番体系で
は、1は、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸を
指すことに留意されたい。当業者は、他のインフルエンザHAポリペプチドのHA1のC末端ス
テムセグメントに対応するアミノ酸残基、例えば、H1血球凝集素由来のHA1のHA1のC末端
ステムセグメントに対応するアミノ酸残基を容易に認識することができるであろう(例え
ば、図1参照)。
キメラH6血球凝集素をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光解析を示す。293T細胞に、キメラH6血球凝集素を発現する1μgのpCAGGSプラスミドをトランスフェクトした。DNA(図11A)、Cal/09感染(図11B)、DNA及びCal/09感染(図11C)、又はCal/09スプリットワクチン(図11D)を受容した動物由来の血清をトランスフェクト細胞に添加し、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可視化した。対照として、交差反応性H1ステム抗体であるC179 (図11E)、又は、PR8の球 状ヘッドに対する抗体であるPY102 (図11F)を、トランスフェクト細胞に添加し、Alexa F luor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可 視化した。
ストーク特異的モノクローナル抗体がcHA発現ウイルス及びシュードタイプ粒子を中和することを示す。cHA発現ウイルス又はシュードタイプ粒子を中和するmAb(KB2)の能力をプラーク減少アッセイ又はシュードタイプ粒子阻害アッセイにより評価した。MDCK細胞を、表示された量(ug/mL)のmAbの存在下で、又は抗体なしで、cHA発現ウイルスもしくはシュードタイプ粒子に感染させるか、又はこれらで形質導入した。プラーク形成又はルシフェラーゼ活性を読出しとして用いて、mAbによる阻害の程度を決定した。(A)該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)ウイルス複製を用量依存的な形で中和し、100ug/mLを超える濃度で100％阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(B)該mAbは、cH1/1(黒い四角)シュードタイプ粒子の侵入も用量依存的な形で阻害し、4ug/mL超で完全に阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。シュードタイプ阻害アッセイは独立に処理された。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys52)で正確に終わるのではなく、配列上及び構造上Apに近い残基で終わる。例
えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集
素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6
、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラ
インフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap-1
〜Ap-3、Ap-3〜Ap-5、Ap-5〜Ap-8、Ap-8〜Ap-10の範囲で終わる。例えば、Ap-10で終わる
HA1のN末端ステムセグメントは、H3血球凝集素のLeu42で終わる。ある実施態様において
、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のN末端
ステムセグメントは、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、Ap+10
で終わる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球
凝集素ポリペプチドのHA1のN末端ステムセグメントは、Ap+1〜Ap+5、Ap+5〜Ap+10の範囲
で終わる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得られるキメラインフルエンザウイル
ス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエンザ血球凝集素と類似した三次元構造を
形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメント及びインフルエンザ血球凝集
素ヘッドドメインポリペプチドの終点との関連で選択されるべきである。そのような実施
態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチド(これは、インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種である)は、一次配列中、インフ
ルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端セグメントとC末端セグメントの
間に位置する。
ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポ
リペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq(例えば、H3血球凝集素由来のHA1サブユ
ニットのCys277)から正確に始まるのではなく、配列上及び構造上Aqに近い残基から始ま
る。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血
球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5
、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10周辺から始まる。ある実施態様において、本明細書に
記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメ
ントは、Aq-1〜Aq-5、Aq-5〜Aq-10の範囲から始まる。例えば、Aq-10で終わるHA1のC末端
ステムセグメントは、H3血球凝集素のイソロイシン267から始まる。ある実施態様におい
て、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末
端ステムセグメントは、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、Aq+1
0から始まる。ある実施態様において、本明細書に記載のキメラインフルエンザウイルス
血球凝集素ポリペプチドのHA1のC末端ステムセグメントは、Aq+1〜Aq+3、Aq+3〜Aq+5、Aq
+5〜Aq+8、Aq+8〜Aq+10の範囲から始まる。HA1のN末端ステムセグメントの終点は、得ら
れるキメラインフルエンザウイルス血球凝集素ポリペプチドが、野生型インフルエンザ血
球凝集素と類似した三次元構造を形成することができるように、HA1のC末端ステムセグメ
ント及びインフルエンザ血球凝集素ヘッドドメインポリペプチドの始点との関連で選択さ
れるべきである。そのような実施態様において、インフルエンザ血球凝集素ヘッドドメイ
ンポリペプチド(これは、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドと異種
である)は、一次配列中、インフルエンザ血球凝集素ステムドメインポリペプチドのN末端
セグメントとC末端セグメントの間に位置する。
中和ストーク抗体を検出する目的で、キメラ分子を発現する組換えウイルスもレスキュ
ーした。過去1世紀にわたるヒトインフルエンザウイルスは全て、N1又はN2亜型のNAをコ
ードしているので、cH9/1N3再集合体ウイルスのレスキューにより、どの(N1又はN2)ノイ
ラミニダーゼ抗体活性も測定することなく、ストーク特異的抗体の中和能力の評価が可能
になると推論された。cH9/1N3ウイルス(H9球状ヘッドHAと、N3亜型ノイラミニダーゼとと
もに、H1ストークを発現する)を、リバースジェネティックスを用いてレスキューし、高
力価になるまで発育鶏卵中で増殖させた。このウイルスのプラークアッセイ表現型は、PR
8野生型ウイルスのプラークアッセイ表現型と同様であった(図17C)。ウイルス継代後のH9
ヘッドの存在を確認するために、細胞をcH9/1N3ウイルスに感染させた。その後、感染細
胞を、H9亜型血球凝集素タンパク質に特異的な抗体であるマウスmAb G1-26でプロービン
グした。汎H1ストーク特異的抗体6F12を用いて、野生型PR8ウイルス感染細胞とcH9/1N3ウ
イルス感染細胞の両方を検出した(図14B)。
本明細書で引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的にかつ個別に示されているかのように、引用により本明細書に組み込まれている。上の発明は理解の明快さの目的のために図及び実施例によって少し詳細に記載されているが、本発明の教示に照らし、添付の請求項の精神又は範囲を逸脱することなく、一定の変更及び修正をそれに加えることができることが、当業者には容易に明らかであろう。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)由来のHAのステムドメイン及びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成２）
前記H5亜型が、インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)である、構成1記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成３）
インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)由来のHAのステムドメイン及びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成４）
前記H5亜型が、A/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のインフルエンザウイルスHAである、構成3記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成５）
インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)由来のHAのステムドメイン及びH7亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成６）
前記H7亜型が、インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)である、構成5記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成７）
インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成８）
前記H5亜型が、インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)である、構成7記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成９）
インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及びH7亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成１０）
前記H7亜型が、インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)である、構成9記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成１１）
インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及び異なる株のB型インフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成１２）
前記異なる株のB型インフルエンザウイルスが、B/リー/1940又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99である、構成11記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成１３）
構成1〜12のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする核酸。
（構成１４）
構成13記載の核酸を発現する細胞。
（構成１５）
構成13記載の核酸を発現するように改変されたゲノムを含むウイルス。
（構成１６）
構成1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス。
（構成１７）
インフルエンザウイルス、VSV、NDV、アデノウイルス、又はバキュロウイルスである、構成15記載のウイルス。
（構成１８）
インフルエンザウイルス、VSV、NDV、アデノウイルス、又はバキュロウイルスである、構成16記載のウイルス。
（構成１９）
不活化されているか又は分割されている、構成17記載のウイルス。
（構成２０）
不活化されているか又は分割されている、構成18記載のウイルス。
（構成２１）
構成1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子。
（構成２２）
構成1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
（構成２３）
構成15記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
（構成２４）
構成16記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
（構成２５）
構成17記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
（構成２６）
構成18記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
（構成２７）
構成21記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
（構成２８）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及びインフルエンザウイルス/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成２９）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン、及びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;並びに(b)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004のHAの球状ヘッドドメイン及びインフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHAの球状ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成３０）
(a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHAの球状ヘッドドメインを含む第三のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをさらに含む、構成28又は29記載の免疫原性組成物。
（構成３１）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第一の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第一のウイルス;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第二の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第二のウイルス。
（構成３２）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第一の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第一のウイルス;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;並びに(b)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004のHAの球状ヘッドドメイン及びA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第二の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第二のウイルス。
（構成３３）
(a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第三の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第三のウイルスをさらに含む、構成31又は32記載の免疫原性組成物。
（構成３４）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第一のウイルス;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第二のウイルス。
（構成３５）
以下のものを含む、免疫原性組成物:
(i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第一のウイルス;並びに
(ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHAの球状ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第二のウイルス。
（構成３６）
(a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHAの球状ヘッドドメインを含む第三のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第三のウイルスをさらに含む、構成34又は35記載の免疫原性組成物。
（構成３７）
前記免疫原性組成物中のウイルスの各々が、インフルエンザウイルス、VSV、NDV、又はアデノウイルスである、構成31〜36のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成３８）
前記免疫原性組成物中のウイルスの各々が、不活化されているか又は分割されている、構成31〜36のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成３９）
前記インフルエンザウイルスの各々が、不活化されているか又は分割されている、構成37記載の免疫原性組成物。
（構成４０）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成４１）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含み、ここで、該免疫原性組成物は、構成22〜39のいずれか一項記載の組成物である、前記方法。
（構成４２）
前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に前記免疫原性組成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、構成41記載の方法。
（構成４３）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含み、ここで、該免疫原性組成物は、構成22〜39のいずれか一項記載の組成物であり、及び該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインとは異なる、前記方法。
（構成４４）
インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成４５）
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって、対象に構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
（構成４６）
前記対象がヒトである、構成40〜45のいずれか一項記載の方法。
（構成４７）
前記対象が1〜5歳のヒト対象である、構成41又は43記載の方法。
（構成４８）
前記対象が高齢ヒト対象である、構成41又は43記載の方法。
（構成４９）
前記免疫原性組成物が、前記対象に筋肉内又は鼻腔内投与される、構成40〜48のいずれか一項記載の方法。
（構成５０）
可溶性である、構成1〜12のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成５１）
三量体化ドメインを含む、構成50記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
（構成５２）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法において使用するための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５３）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含む、前記方法において使用するための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５４）
前記方法が、前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、構成53記載の免疫原性組成物。
（構成５５）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含み、ここで、該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインとは異なる、前記方法において使用するための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５６）
対象のインフルエンザウイルス疾患を予防する方法において使用するための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５７）
対象のインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法において使用するための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５８）
前記対象がヒトである、構成52〜57のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
（構成５９）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法において使用するための医薬品の製造のための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
（構成６０）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含む、前記方法において使用するための医薬品の製造のための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
（構成６１）
前記方法が、前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、構成60記載の使用。
（構成６２）
対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含み、ここで、該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインとは異なる、前記方法において使用するための医薬品の製造のための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
（構成６３）
対象のインフルエンザウイルス疾患を予防する方法において使用するための医薬品の製造のための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
（構成６４）
対象のインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法において使用するための医薬品の製造のための、構成22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
（構成６５）
前記対象がヒトである、構成59〜64のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。

Claims (65)

  1. インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)由来のHAのステムドメイン及
    びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフル
    エンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  2. 前記H5亜型が、インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5
    /2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/ト
    ルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)である、請求項1記載の
    キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  3. インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチュ
    ーセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)由来のHAのステムドメイン
    及びH5亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフ
    ルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  4. 前記H5亜型が、A/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/20
    05(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、又はA
    /オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のインフルエンザウイルスHAである、請求項3記
    載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  5. インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/マサチュ
    ーセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)由来のHAのステムドメイン
    及びH7亜型のインフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフ
    ルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  6. 前記H7亜型が、インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/
    04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバ
    ータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7
    )である、請求項5記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  7. インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコン
    シン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及びH5亜型のインフ
    ルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血
    球凝集素(HA)ポリペプチド。
  8. 前記H5亜型が、インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5
    /2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/ト
    ルコ/1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)である、請求項7記載の
    キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  9. インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコン
    シン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及びH7亜型のインフ
    ルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血
    球凝集素(HA)ポリペプチド。
  10. 前記H7亜型が、インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/
    04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバ
    ータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7
    )である、請求項9記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  11. インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコン
    シン/1/2010、又はB/ブリスベン/60/2008由来のHAのステムドメイン及び異なる株のB型イ
    ンフルエンザウイルス由来のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイル
    ス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  12. 前記異なる株のB型インフルエンザウイルスが、B/リー/1940又はB/アザラシ/ネーデル
    ラント/1/99である、請求項11記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
    ペプチド。
  13. 請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリ
    ペプチドをコードする核酸。
  14. 請求項13記載の核酸を発現する細胞。
  15. 請求項13記載の核酸を発現するように改変されたゲノムを含むウイルス。
  16. 請求項1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス。
  17. インフルエンザウイルス、VSV、NDV、アデノウイルス、又はバキュロウイルスである、
    請求項15記載のウイルス。
  18. インフルエンザウイルス、VSV、NDV、アデノウイルス、又はバキュロウイルスである、
    請求項16記載のウイルス。
  19. 不活化されているか又は分割されている、請求項17記載のウイルス。
  20. 不活化されているか又は分割されている、請求項18記載のウイルス。
  21. 請求項1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含むウイルス様粒子。
  22. 請求項1〜12のいずれか一項記載のポリペプチドを含む免疫原性組成物。
  23. 請求項15記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
  24. 請求項16記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
  25. 請求項17記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
  26. 請求項18記載のウイルスを含む免疫原性組成物。
  27. 請求項21記載のウイルス様粒子を含む免疫原性組成物。
  28. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及び
    インフルエンザウイルス/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽
    /1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、
    又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一のキ
    メラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド;並びに
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/200
    5(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ
    /1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメイン
    を含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
  29. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン、及
    びインフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/
    安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H
    5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一
    のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド;並びに
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;並びに(b)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004のHAの球状ヘッドドメイ
    ン及びインフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/
    カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/200
    1(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHAの球状
    ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド
    。
  30. (a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコ
    ンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザ
    ウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、
    A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチ
    ョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHA
    の球状ヘッドドメインを含む第三のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペ
    プチドをさらに含む、請求項28又は29記載の免疫原性組成物。
  31. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及び
    インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安
    徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)
    、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラ
    インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第一の核酸を発現する
    ように改変されたゲノムを含む第一のウイルス;並びに
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/200
    5(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ
    /1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメイン
    を含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第二の核
    酸を発現するように改変されたゲノムを含む第二のウイルス。
  32. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及び
    インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安
    徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)
    、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含むキメラ
    インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第一の核酸を発現する
    ように改変されたゲノムを含む第一のウイルス;並びに
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;並びに(b)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004のHAの球状ヘッドドメイ
    ン及びA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/
    ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/24/2001(H7)、A/レア/NC/3948
    2/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHAの球状ヘッドドメインを含む
    キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドをコードする第二の核酸を発
    現するように改変されたゲノムを含む第二のウイルス。
  33. (a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコ
    ンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザ
    ウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、
    A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチ
    ョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHA
    の球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド
    をコードする第三の核酸を発現するように改変されたゲノムを含む第三のウイルスをさら
    に含む、請求項31又は32記載の免疫原性組成物。
  34. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及び
    インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安
    徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)
    、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一の
    キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第一のウイルス;並び
    に
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/200
    5(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ
    /1/2005(H5)、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメイン
    を含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第二のウ
    イルス。
  35. 以下のものを含む、免疫原性組成物:
    (i)インフルエンザウイルスA/カリフォルニア/4/2009(H1N1)のHAのステムドメイン及び
    インフルエンザウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安
    徽/1/2005(H5)、A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)
    、又はA/オオハクチョウ/モンゴル/244/2005(H5)のHAの球状ヘッドドメインを含む第一の
    キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む第一のウイルス;並び
    に
    (ii)(a)インフルエンザウイルスA/ビクトリア/361/2011(H3N2)、A/ゼニガタアザラシ/
    マサチューセッツ/1/2011(H3N8)、又はA/インディアナ/10/2011(H3N2)のHAのステムドメ
    イン;及び(b)インフルエンザウイルスA/ネーデルラント/219/03(H7)、A/カナダ/504/04(H
    7)、A/カナダ/444/04(H7)、A/ニワトリ/ハリスコ/CPA1/2012(H7)、A/マガモ/アルバータ/
    24/2001(H7)、A/レア/NC/39482/93(H7)、又はA/マガモ/ネーデルラント/12/2000(H7)のHA
    の球状ヘッドドメインを含む第二のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペ
    プチドを含む第二のウイルス。
  36. (a)インフルエンザウイルスB/マレーシア/2506/2004、B/フロリダ/4/2006、B/ウィスコ
    ンシン/1/2010;又はB/ブリスベン/60/2008のHAのステムドメイン;及び(b)インフルエンザ
    ウイルスA/ベトナム/1203/2004(H5)、A/インドネシア/5/2005(H5)、A/安徽/1/2005(H5)、
    A/インドガン/青海/1A/2005(H5)、A/シチメンチョウ/トルコ/1/2005(H5)、A/オオハクチ
    ョウ/モンゴル/244/2005(H5)、B/リー/1940、又はB/アザラシ/ネーデルラント/1/99のHA
    の球状ヘッドドメインを含む第三のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペ
    プチドを含む第三のウイルスをさらに含む、請求項34又は35記載の免疫原性組成物。
  37. 前記免疫原性組成物中のウイルスの各々が、インフルエンザウイルス、VSV、NDV、又は
    アデノウイルスである、請求項31〜36のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  38. 前記免疫原性組成物中のウイルスの各々が、不活化されているか又は分割されている、
    請求項31〜36のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  39. 前記インフルエンザウイルスの各々が、不活化されているか又は分割されている、請求
    項37記載の免疫原性組成物。
  40. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に請求項22〜39
    のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  41. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成
    物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日
    〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含み、
    ここで、該免疫原性組成物は、請求項22〜39のいずれか一項記載の組成物である、前記方
    法。
  42. 前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に前記免疫原性組
    成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、請求項41記載の方法。
  43. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原
    性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してか
    ら30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与するこ
    とを含み、ここで、該免疫原性組成物は、請求項22〜39のいずれか一項記載の組成物であ
    り、及び該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素
    (HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在するキメラ
    インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインとは異なる、
    前記方法。
  44. インフルエンザウイルス疾患を予防する方法であって、対象に請求項22〜39のいずれか
    一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
  45. インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法であって
    、対象に請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の有効量を投与することを含
    む、前記方法。
  46. 前記対象がヒトである、請求項40〜45のいずれか一項記載の方法。
  47. 前記対象が1〜5歳のヒト対象である、請求項41又は43記載の方法。
  48. 前記対象が高齢ヒト対象である、請求項41又は43記載の方法。
  49. 前記免疫原性組成物が、前記対象に筋肉内又は鼻腔内投与される、請求項40〜48のいず
    れか一項記載の方法。
  50. 可溶性である、請求項1〜12のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球
    凝集素(HA)ポリペプチド。
  51. 三量体化ドメインを含む、請求項50記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(H
    A)ポリペプチド。
  52. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法において使用するための、請求項
    22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  53. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成
    物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日
    〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含む、
    前記方法において使用するための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  54. 前記方法が、前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該
    免疫原性組成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、請求項53記載の免疫
    原性組成物。
  55. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原
    性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してか
    ら30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与するこ
    とを含み、ここで、該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス
    血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在
    するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインと
    は異なる、前記方法において使用するための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原
    性組成物。
  56. 対象のインフルエンザウイルス疾患を予防する方法において使用するための、請求項22
    〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  57. 対象のインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法に
    おいて使用するための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  58. 前記対象がヒトである、請求項52〜57のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
  59. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法において使用するための医薬品の
    製造のための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
  60. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に免疫原性組成
    物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してから30日
    〜6カ月後に、該対象に該免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与することを含む、
    前記方法において使用するための医薬品の製造のための、請求項22〜39のいずれか一項記
    載の免疫原性組成物の使用。
  61. 前記方法が、前記対象が前記第二の用量を受容してから30日〜6カ月後に、該対象に該
    免疫原性組成物の有効量の第三の用量を投与することをさらに含む、請求項60記載の使用
    。
  62. 対象をインフルエンザウイルスに対して免疫する方法であって、該対象に第一の免疫原
    性組成物の有効量の第一の用量を投与すること、及び該対象が該第一の用量を受容してか
    ら30日〜6カ月後に、該対象に第二の免疫原性組成物の有効量の第二の用量を投与するこ
    とを含み、ここで、該第一の免疫原性組成物中に存在するキメラインフルエンザウイルス
    血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインは、該第二の免疫原性組成物中に存在
    するキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドの球状ヘッドドメインと
    は異なる、前記方法において使用するための医薬品の製造のための、請求項22〜39のいず
    れか一項記載の免疫原性組成物の使用。
  63. 対象のインフルエンザウイルス疾患を予防する方法において使用するための医薬品の製
    造のための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
  64. 対象のインフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患を治療する方法に
    おいて使用するための医薬品の製造のための、請求項22〜39のいずれか一項記載の免疫原
    性組成物の使用。
  65. 前記対象がヒトである、請求項59〜64のいずれか一項記載の免疫原性組成物の使用。
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