JP4413999B2 - クローニングされたヌクレオチド配列からの弱毒化呼吸シンシチウムウィルスワクチンの製造 - Google Patents
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Description
ヒト呼吸シンシチウムウィルス(RSV)は1才未満の幼児における肺炎及び細気管支炎の原因として他の全ての微生物病原体を上まわる。事実上全ての子供が2才までに感染し、そして再感染がそれより高年令の子供及び青少年において頻繁に認められる(Chanockら、Viral Infections of Humans、第3版、A.S.Evans編、Plenum Press,N.Y.(1989))。RSVは呼吸気管障害による小児病院への入院の5分の1以上の原因となっており、そして米国のみで年間推定91,000人の入院及び4,500人の死亡の原因である。ほとんどの健康な成人はRSV感染症に基づく重篤な病気をもたないが、老齢患者及び免疫無防備状態の個体は往々にしてこの病原体に由来する重篤且つ可能として生命を脅かす感染症に苦しんでいる。
RSVに対する有効なワクチン剤の開発のための何10年もの研究にもかかわらず、RSV感染症に関わる重篤な罹病及び著しい死亡を防ぐための安全且つ有効なワクチンは得られていない。有効なワクチンを開発できないことはある程度、小さな幼児達がRSV抗原に対してわずかな血清及び分泌性抗体応答しかもたないことに関係ある。即ち、これらの個体はRSVに由来する一層重篤な感染症に苦しみ、一方で蓄積した免疫力はそれより高年齢の子供及び成人をウィルスの一層著しい攻撃から守るようである。一の抗ウィルス性化合物リババリンはひどく感染した幼児の処置における展望を示しているが、それが入院期間を短縮する又は補助治療についての幼児のニーズを少なくするということは示されていない。
RSV感染症における免疫のメカニズムは最近になって注目を浴びている。分泌性抗体が上方呼吸気管を保護するうえで最も重要なようであり、一方高レベルの血清抗体は下方呼吸気管におけるRSV感染症に対する抵抗において主たる役割を果たしていると考えられている。RSVに対する力価の中和抗体を含む精製ヒトイムノグロブリンが、幼児及び低年令の子供における重篤な下方呼吸気管障害のための一定の状況における免疫治療アプローチに有用であることが証明されうる。しかしながら、免疫グロブリン調製品はいくつかの欠点、例えば血液搬送ウィルスの可能性並びに調製及び貯蔵のおける費用等に悩まされている。
ホルマリン不活性化ウィルスワクチンが1960年代中頃においてRSVに対して試験されたが、RSV感染症又は障害を防御することができず、そして事実上その後のウィルスによる感染の際の症状を悪化させてしまった。(Kimら、Am.J.Epidemiol.,89:422-434(1969)、Chinら、Am.J.Epidemiol.89:449-463(1969);Kapikianら、Am.J.Epidemiol.,89:405-421(1969))。
より最近になって、RSVに対するワクチン開発は弱毒化RSV突然変異体を焦点としている。Friedewaldら、J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968)はRSVの低温継代突然変異体(cold passaged mutant)(cpRSV)を報告しており、それは候補ワクチンとなるのに十分に弱毒化されているようである。この突然変異体はその野生型親ウィルスと比べて26℃にて若干効率の良くなった増殖を示すが、その複製は温度感受性ではなく、有意義に低温適合されてもいない。しかしながら、この低温継代突然変異体は成人にとっては弱毒化されていた。RSVに事前に感染した幼児及び子供(即ち、血清陽性個体)にとって十分に弱毒化され、且つ免疫原性であるにもかかわらず、このcpRSV突然変異体は血清陰性幼児の上方呼吸気管に対して低レベルのビルレンスを保持していた。
同様に、Gharpureら、J.Virol.3:414-421(1969)は温度感受性RSV(tsRSV)突然変異体の単離を報告しており、それも有望なワクチン候補であった。一の突然変異体ts−1が診療所及びボランティアにおいてかなり評価された。この突然変異体は成人ボランティアにおいて無症候性感染症を供し、そして免疫の45日後での野生型ウィルスの負荷に対する抵抗を授けた。ここでも、血清陽性幼児及び子供は無症候性感染症を帯びたが、血清陰性幼児は鼻炎及びその他の温和な症状を示した。更に、温度感受性の部分的又は完全消失を示すウィルスはワクチンから回収可能なウィルスのごく一部しか占めておらず、そして温和な鼻炎以外の病気の症状とは関係ないにもかかわらず、ts表現型の不安定されが検出された。
これら及びその他の研究は、一定の低温継代且つ温度感受性RSV株があまり弱毒化されておらず、そして一定のワクチン受容者、特に血清陰性幼児に温和な病気の症状を引き起こし、一方でその他のものは過剰に弱毒化されており、保護免疫応答を誘引するのに十分なほどに複製できないことを示した(Wrightら、Infect.Immun.,37:397-400(1982))。更に、候補となるワクチン突然変異体の遺伝子的不安定性はその温度感受性表現型の損失を供し、有効なRSVワクチンの開発を更に妨げる。一般にHodesら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.145:1158-1164(1974),McIntoshら、Pediatr.Res.8:689-696(1974)及びBelsheら、J.Med.Virol.,3:101-110(1978)を参照のこと。
弱毒化RSウィルスワクチンアプローチを捨てて、研究者は感染細胞のリゼートから精製RSウィルスエンベロープ糖タンパク質を利用して潜在的なサブユニットワクチン候補を試験した。この糖タンパク質はコットンラットの肺におけるRSウィルス感染症に対する防御を誘導したが(Walshら、J.Infect.Dis.155:1198-1204(1987))、その抗体は非常に弱い中和活性を有し、そして精製サブユニットワクチンによるげっ歯類の免疫は病気の相乗作用を招いた(Murphyら、Vaccine 8:497-502(1990))。
F又はGエンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニアウィルス組換体を基礎とするワクチンも開発されている。これらの組換体は真性ウィルス対応物から区別されるRSV糖タンパク質を発現し、そしてこのワクシニア−RSV F及びG組換ウィルスにより皮内感染された小げっ歯類はウィルス感染性を中和する特異的抗体を高レベルで示した。事実、ワクシニア−F組換体によるコットンラットの感染は下方呼吸気管におけるRSVの複製に対するほぼ完璧な防御及び上方気管における有意な防御を刺激した。Olmstedら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7462-7466(1986)。しかしながら、ワクシニアF及びワクシニアG組換体によるチンパンジーの免疫は上方呼吸気管におけるRSV負荷に対してほとんど防御を供せず(Collinsら、Vaccine 8:164-168(1990))、そして下方呼吸気管において相反する防御を供した(Croweら、Vaccine 11:1395-1404(1993))。
弱毒化RSV株、サブユニットワクチン、及びRSVワクチン開発のためのその他の戦略の充実していない展望は、新規のRSVワクチンの組換操作のための遺伝子標的の同定及び生きた弱毒化RSV組換体に新たな表現型特性を供するように遺伝子変化を組込む組換RSVの操作のための方法の開発のための新たな方法を必要とする。しかしながら、RSV及びその他のネガティブセンスRNAウィルスのゲノムRNAの操作は今まで困難であると証明されてきた。この観点における主たる障害にはこのようなウィルスの裸ゲノムDNAの非感染性、組織培養におけるウィルス増殖の弱さ、時間のかかる複製サイクル、ビリオンの不安定さ、複雑なゲノム、及び遺伝子生成物の強靱な統合が挙げられる。
分断されていないネガティブ鎖RNAウィルスの直接遺伝子操作のための方法は最近になって開発されはじめている(Conzelmann,J.Gen.Virol.77:381-89(1996);Paleseら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:11354-58(1996)参照のこと)。
ヌクレオカプシドN、リンタンパク質P及び大型ポリメラーゼサブユニットLの存在下でのcDNAコード化抗ゲノムRNAからの感染性狂犬病ウィルス、水疱性口内炎ウィルス(VSV)、麻疹ウィルス及びセンダイウィルスについての有効な釣り出しが達成されている(Garcinら、EMBO J.14:6087-6094(1995);Lawsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:4477-81(1995);Radeckeら、EMBO J.14:5773-5784(1995);Schnellら、EMBO J.13:4195-203(1994);Whelanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92:8388-92(1995))。RSVの効率的な釣り出しは更なるタンパク質、M2 ORF1転写伸長因子も必要とする(Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-7(1995))。
感染性RSVの釣り出しは数多くの要因により複雑となっている。詳しくは、RSVはパラミクソウィルス(Paramyxovirus)、ルブラウィルス(Rubulavirus)及びモルビリウィルス(Morbillivivus)属の一層よく特性決定されたパラミクソウィルスからそれとニューノモウィルス(Pneumovirus)属のその他の構成員とを区別するいくつかの特性を有する。これらの相違にはmRNAの数の多さ、ゲノムの3’末端においての異常な遺伝子順序、糖タンパク質及びM2遺伝子の順序における種間変動、遺伝子間領域における大きな多彩性、ムチン様特性を示す付加タンパク質、多大な株間配列多彩性、及びその他の分断されていないネガティブ鎖RNAウィルスにおいて見い出されていないいくつかのタンパク質が挙げられる。
以上の観点において、RSVが寄与する重篤な健康問題、特に幼児及び子供の病気を緩和するための安全且つ有効なワクチンを操作するための手段及び方法について当業界において緊急なるニーズが存在する。かなり驚くべきことに、本発明はこれら及び関連のニーズを満足せしめる。
発明の概要
本発明は単離された弱毒化呼吸シンシチウムウィルス(RSV)をデザイン及び製造するための新規の方法及び組成物を提供する。本発明のRSVは野生型もしくは選定のRSV突然変異親ストックに生物学的に誘導されたものであるか、又は表現型特異的遺伝子変化を組込むように組換操作されたものである。ワクチン用途のためにデザイン且つ選定されたRSVは少なくとも2、そして時折り少なくとも3つの弱毒突然変異を有する。一の態様において、少なくとも一の弱毒突然変異はRSVポリメラーゼ遺伝子に認められ、そして温度感受性(ts)表現型を供するポリメラーゼタンパク質内のアミノ酸変化を特定するヌクレオチド置換を包括する。典型的な生物学的に誘導された組換RSVは大型ポリメラーゼ遺伝子Lの中に1又は複数のヌクレオチド置換を含み、Phe521のLeu,Gln831のLeu,Met1169のVal及びTyr1321のAsnの変化により例示されるアミノ酸Phe521,Gln831,Met1169又はTyr1321でのアミノ酸変化をもたらしている。他方、又は更に、本発明のRSVは別のRSV遺伝子、例えばM2遺伝子においてヌクレオチド置換を含んで成りうる。
弱毒突然変異はRSV遺伝子のコード部分、又はcis調節配列の如き非コード部分において選定されうる。典型的な非コード突然変異には、ヌクレオチド7605でのM2遺伝子開始配列における1又は複数の塩基置換により例示されるが如き、遺伝子開始配列において1又は複数の塩基変化を含む。好ましくは、2又は3つの突然変異が弱毒突然変異を特定するコドン、例えばアミノ酸Phe521,Gln831,Met1169又はTyr1321においてのts突然変異を特定するコドンにおいて組込まれ、これによりts表現型からの復帰の任意の傾向が低まっている。
本発明のその他の態様において、生物学的に誘導された又は組換RSVを選定又は操作し、例えばポリメラーゼ遺伝子において、新規の生物学的に誘導されたワクチン株cpts-530/1009,ATCC No.VR 2451により例示されるが如きアミノ酸Phe521及びMet1169にて、生物学的に誘導された株cpts-530/1030,ATCC No.VR 2455により例示されるが如きPhe521及びTyr1321にて、生物学的に誘導されたRSV株cpts-248/404により例示されるが如きGln831及びnt 7605におけるM2遺伝子開始突然変異にて、又は組換RSV rA2cp/248/404/530により例示されるが如きnt 7605におけるM2遺伝子開始突然変異及びPhe521にて組込む。
選定の弱毒突然変異を導入することのできる生物学的に誘導されたRSVには野生型RSV、宿主域制限型低温継代RSV、宿主域制限型低温継代RSVの低温適応型突然変異体、又は温度感受性株が挙げられる。例えば、低温継代呼吸シンシチアウィルス又はcpRSV株、例えば少なくとも2つの温度感受性突然変異が導入されたcpRSVでありうる。弱毒化RSVウィルスは、cpts RSV 248(ATCC VR 2450),cpts 248/404(ATCC VR 2454),cpts 248/955(ATCC VR 2453),cpts RSV 530(ATCC VR 2452),cpts 530/1009(ATCC VR 2451)又はcpts 530/1030(ATCC VR 2455)により例示されるが如きサブグループAであるか、又はB−1 cp 52/285(ATCC VR 2542)もしくはB−1 cp-23により例示されるが如きサブグループBであってよく、それぞれはブダペスト条約の規則のもとでアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC),12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USAに寄託され、そして上記の識別受託番号が承認されている。
本発明の別の観点において、単離された感染性組換RSVを提供し、それはRSVゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオカプシド(N)タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質(P)、大型(N)ポリメラーゼタンパク質、及びRNAポリメラーゼ伸長因子から構築されたものである。このRNAポリメラーゼ伸長因子はRSVのM2(ORF1)でありうる。単離された感染性RSVはウィルス又はサブウィルス粒子であってよい。このゲノム又はアンチゲノムは野生型RSV配列、弱毒化表現型を特定する生物学的に誘導された突然変異配列、あるいは野生型RSVゲノムもしくはアンチゲノム又は任意の生物学的に誘導されたRSV株において見い出されない操作された突然変異もしくは突然変異の組合せを含んで成る組換的に修飾されたRSV配列をコードする組換RSV配列を含んで成りうる。
感染性RSVクローンは任意のRSV又はRSV様ウィルス、例えばヒト、ウシ又はネズミRSV(マウスの肺炎ウィルス)又は鳥類ウィルス(七面鳥鼻気管炎ウィルス)又はその他のウィルス、例えばパラインフレンザウィルス(PIV)に由来するコード又は非コードヌクレオチド配列を含みうる。典型的な観点において、当該組換RSVは異種RSV配列と組換式に連結されたヒトRSVゲノム又はアンチゲノム配列のキメラを含んで成る。典型的な異種配列には別のヒトRSV株に由来する配列と組合さったRSV配列(例えばcpts RSV 248,cpts 248/404,cpts 248/955,cpts RSV 530,cpts 530/1009、又はcpts 530/1030)、又は非ヒトRSVもしくはその他のウィルス、例えばPIVに由来するサブグループ(例えば、RSVサブグループA及びサブグループB配列の組合せ)が含まれる。
本発明の一の態様において、例えば野生型又は生物学的に誘導された突然変異配列と比べてゲノム又はアンチゲノムが組換式に改変された組換RSVを提供する。組換式に改変されたRSVクローン内に組込まれた突然変異は、選定のRSVタンパク質の発現及び/又は機能を改変し、所望の表現型変化を生み出す能力、又は様々なその他の目的に基づいて選定されうる。所望の表現型変化には、例えば培養中のウィルス増殖力、温度感受性、グループサイズ、弱毒化及び免疫原性の変化が挙げられる。例えば、ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列は弱毒化、温度感受性、低温適応性、小プラークサイズ、宿主域の制限、遺伝子発現における変化、又は免疫原エピトープにおける変化を選定するヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により改質されうる。
一の観点において、少なくとも一つの弱毒突然変異がRSVポリメラーゼ遺伝子Lの中に認められ、且つ(ts)表現型を特定するヌクレオチド置換を包括する組換RSVが提供される。典型的なRSVクローンはPhe521,Gln831,Met1169又はTyr1321でのポリメラーゼ遺伝子におけるアミノ酸変化をもたらすヌクレオチド置換を含む。好ましくは、2又は3つの突然変異が弱毒突然変異を特定するコドンの中に含まれている。その他の典型的なRSVクローンは少なくとも二つの弱毒ts突然変異を含む。
生物学的に誘導された弱毒RSVに認められる突然変異は個別に又は組合せて全長RSVクローンの中に導入することができ、そして導入突然変異を含む釣り出した組換ウィルスの表現型は容易に決定できる。典型的な態様において、野生型RSVと比べて弱毒化された生物学的に誘導されたウィルスにより示されるアミノ酸変化、例えば低温継代RSV(cpRSV)又は更に弱毒化されたRSV株、例えばcpRSVの温度感受性誘導体(cpts RSV)により示される変化が組換RSVクローン内に組込まれている。野生型又は生物学的に誘導された突然変異RSV配列からのこれらの変化は得られるクローンにおける所望の特徴、例えば弱毒化又は更に弱毒化された表現型を特定する。これらの変化は好ましくは対応の野生型又は生物学的に誘導された突然変異配列と比べて2又は3つのヌクレオチド変化を利用して組換ウィルスの中に導入する。
本発明は更に感染性クローンのゲノム又はアンチゲノムの中に選定の組合せで導入された多重表現型特異的突然変異を有する組換RSVを提供する。表現型の評価と組合せたこの方法は弱毒化、温度感受性、低温適応性、小プラークサイズ、宿主域制限等の如き所望の特徴を有する突然変異組換RSVを提供する。このようにして同定した突然変異を「メニュー」へと重ね合わせ、そしてワクチンウィルスを弱毒化、免疫原性及び安定性の選定レベルへと計算するために様々な組合せにおい導入する。好適な態様において、本発明は生物学的に誘導されたRSVから採用した1又は複数の突然変異、例えばcp及びts突然変異に、同一又は異なる遺伝子の関与する別のタイプの突然変異の補足を提供する。ここでの突然変異のための標的遺伝子には、付加(G)タンパク質、融合(F)タンパク質、小疎水性(SH)、RNA結合性タンパク質(N)、リンタンパク質(P)、大型ポリメラーゼタンパク質(L)、転写伸長因子(M2)、M2 ORF2、マトリックス(M)タンパク質、並びに2つの非構造タンパク質NS1及びNS2が含まれる。これらのタンパク質それぞれは、全体的に又は部分的に、単独で又はその他の所望の修飾と組合さって、新規のRSV組換体を達成せしめるよう選択的に欠失、置換又は転位されていてよい。一の観点において、SH遺伝子を欠失させてin vitroでの高められた増殖力及び/又はin vitroでの弱毒化を含む新しい表現型特徴を有する組換RSVを供する。関連の観点において、この遺伝子欠失、又はその他の選定された非本質的な遺伝子もしくは遺伝子セグメント欠失、例えばNS1又はNS2遺伝子欠失を、組換RSVにおいて、弱毒化表現型を特定する1又は複数の突然変異、例えば生物学的に誘導された弱毒化RSV突然変異から直接採用される突然変異(又は、例えばこの突然変異を特定するコドンにおいて多重ヌクレオチド変化を導入することによる/修飾形態における突然変異)と組合せる。例えば、このSH遺伝子又はNS2遺伝子はcpts 248/404,cpts 530/1009,cpts 530/1030又はその他の選定の突然変異RSV株から採用した1又は複数cp及び/又はts突然変異との組合せにおいて欠失されてよく、様々な突然変異の併合効果により高まったウィルス収率、高まった弱毒化及び弱毒化表現型からの復帰に対する遺伝子耐性を有する組換RSVが生み出される。
更に、様々なその他の遺伝子改変を、単独で、又は生物学的に誘導された突然変異RSVから採用した1又は複数の弱毒性点突然変異と一緒に感染性組換RSVに組込むために組換RSVゲノム又はアンチゲノムにおいて作り出すことができうる。異種遺伝子(例えば、様々なRSV株又はサブグループ又は非RSV起源に由来)を全体的又は部分的に挿入してよく、遺伝子の順序を変え、遺伝子重複を除去し、RSVゲノムプロモーターをそのアンチゲノム対応物と交換し、遺伝子の一部を除去又は置換し、また遺伝子全体を欠失さえもすることができる。当該配列における別の又は更なる修飾、例えば様々な遺伝子間領域等における固有制限部位(例えば、G及びF遺伝子の間の固有StuI部位)の挿入を操作性を促進するために施してよい。非翻訳遺伝子配列は外来遺伝子の挿入のためのキャパシティーを高めるために除去してよい。
典型的な態様において、一のRSVの個々の遺伝子、遺伝子セグメント又は単一もしくは多重ヌクレオチドは異種RSV又はその他の配列に由来する対応配列により置換されてよい。例えば、選定の異種遺伝子セグメント、例えば一のRSVに由来する選定タンパク質のサイトプラズマテール、トランスメンブランドメインもしくはエクトドメイン、エピトープ部位もしくは領域、結合性部位もしくは領域、活性部位もしくは活性部位を含む領域等をコードするものを別のRSVにおける対応遺伝子セグメントと置換して、新規の組換体、例えば別のRSVのエクトドメインに融合された一のRSVのサイトプラズマテール及び/又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現する組換体を供することができる。一の態様において、一のRSV株又はサブグループのF及び/又はG防御抗原を別の株又はサブグループのRSVクローンへと置換して免疫宿主における株又はサブグループの双方に対する交差防御免疫応答を刺激することのできる組換ウィルスを作り出すことができる。更なる観点において、遺伝子又は遺伝子セグメントの変更、例えば置換された異種F及び/又はG遺伝子又は遺伝子フラグメントを包括する突然変異を有するキメラRSVクローンを、生物学的に誘導された突然変異RSV株、例えばcpts 248/404,cpts 530/1009、又はcpts 530/1030から採用する1又は複数の弱毒性ts又はcp点突然変異を導入することにより更に改質する。また更なる観点において、1又は複数のヒトRSVコード又は非コードポリヌクレオチドをウシ又はネズミRSVに由来する対応配列により、単独で又は1又は複数の選定cp又はts突然変異と組合せて置換し、新規の弱毒化ワクチン株を供する。一の態様において、キメラウシ−ヒトRSVはヒトRSV NP遺伝子又は遺伝子セグメントの対応のウシNP遺伝子又は遺伝子セグメントによる置換を含み、かかるキメラは任意的にSH遺伝子欠失、1又は複数のcp又はts点突然変異、又は様々なこれら及び本明細書に開示のその他の突然変異を組込むように構築されうる。
他方、RSVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は非RSV配列、例えばサイトカイン、T−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は意図する宿主における保護免疫応答を誘導することのできる微生物病原体(例えばウィルス、細菌又は真菌)のタンパク質をコードするように改質してよい。
本発明の別の観点において、感染性弱毒化ワクチンウィルスを供するための上記の構造及び表現型変化は組換RSVに導入するための新規の方法を提供する。一の態様において、RSVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを提供する。更に、N,P,L及びRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質をコードする1又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る同一又は異なる発現ベクターを提供する。当該ベクターは細胞又は無細胞リゼートで同時発現され、これにより感染性RSV粒子が供される。当該RSVゲノム又はアンチゲノム並びにN,P,L及びRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質は同一又は異なる発現ベクターにより同時発現されうる。ある状況においては、N,P,L及びRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質はそれぞれ異なる発現ベクター上でコードされる。RSVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子はヒト、ウシもしくはネズミRNA配列に由来するか、又は異なるRSVもしくは非RSV配列のキメラ、例えばサブグループB RSVに由来する配列に作用可能式に連結されたサブグループA RSV、又はPIV配列に作用可能式に連結されたRSV配列を含むポリヌクレオチド配列でありうる。当該RSVゲノム又はアンチゲノムは点突然変異、部位特異的ヌクレオチド変化及び遺伝子全体又は遺伝子セグメントを包括する変化等の1又は複数のヌクレオチドの挿入、転位、欠失又は置換により野生型又は生物学的に誘導された突然変異RSV株から改質されうる。これらの変化は典型的には得られる組換RSVにおける選定の表現型変化、例えば弱毒化、温度感受性、低温適応性、小プラークサイズ、宿主域制限、遺伝子発現の変化又は免疫原性エピトープの変化をもたらす表現型変化を特定する。
その他の態様において、本発明はRSVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、並びにRSVのN,P,L及びRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質をコードする1又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを含む細胞又は無細胞リゼートを提供する。発現により、ゲノム又はアンチゲノム並びにN,P,L及びRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質は組合さって感染性RSV粒子、例えばウィルス又はサブウィルス粒子となる。
本発明の弱毒化RSVは感染ヒト宿主において防御免疫応答を誘導することができ、しかも免疫宿主において許容されない重篤な呼吸障害の症状を引き起こすことがない程に十分に弱毒化されている。この弱毒化ウィルスは細胞培養上清液中に存在し得、培養物から単離されるか、又は部分的もしくは完全に精製され得る。このウィルス又は凍結乾燥してもよく、そして適宜貯蔵又は宿主への搬送のために様々なその他の成分と組合せてよい。
本発明は更に生理学的に許容される担体及び/又はアジュバントと、単離された弱毒化RSV株とを含んで成る新規のワクチンを提供する。一の態様において、当該ワクチンは少なくとも2、そして時折り3以上の弱毒性突然変異を含んで成り、その少なくとも一つは呼吸シンシチアウィルスポリメラーゼ遺伝子におけるアミノ酸Phe521,Gln831,Met1169又はTyr1321においての温度感受性置換を供する。その他の態様において、当該ワクチンは組換弱毒化RSVを含んで成る。このワクチンは103〜106PFUの弱毒化ウィルスの用量で処方されうる。このワクチンは抗原性サブグループAもしくはBのいづれかの弱毒化ウィルスを含んで成ってよく、又は双方のサブグループA及びBのウィルスは流行性RSV感染症に対するより包括的な適用範囲のためのワクチン製剤の中に組合せてよい。
別の観点において、本発明は流行性RSVに対するより包括的な適用範囲のための個体の免疫系の刺激又はRSVに対する防御の誘導のための方法を提供する。当該方法は免疫学的に十分な量の本発明の弱毒化呼吸シンシチアウィルスにおいて処方されたワクチンを投与することを含んで成る。一の態様において、当該ワクチンは多重弱毒性突然変異を有する感染性RSVを含んで成り、その少なくとも一つはL遺伝子におけるアミノ酸Phe521,Gln831,Met1169又はTyr1321においてts置換を特定する。別の態様において、当該ワクチンは組換弱毒化RSVを含んで成る。当該ウィルスは典型的には許容される担体及び/又はアジュバントと一緒に投与されるであろう。当該方法はサブグループA及び/又はサブグループBの弱毒化ウィルスを個体に103〜106PFUの量で、スプレー、液滴、エアゾール等により上方呼吸気管へと投与することを含みうる。一般に当該弱毒化ウィルスは当該ウィルスに対する抗体について血清陰性である個体に、又は終胎盤獲得母体抗RSV抗体を保有する個体に経鼻投与する。
【図面の簡単な説明】
図1はマウスの肺における一連のサブグループA呼吸シンシチアウィルスの複製とチンパンジーにおけるその複製との間の実質的に完璧な相関を示すグラフである。
図2及び3はRSVアンチゲノムRNAをコードするcDNAの構築を示し、ここで図2はcDNA及びコードされたアンチゲノムRNAの構造を示す(スケール通りではない)。当該図面の目的に関し、及び以降の全ての実施例に関し、サブグループA RSVの株A2の特定のcDNA及びウィルスを使用した。アンチゲノムのダイアグラムは下記の特徴を有する:T7プロモーターにより寄与される5’末端非ウィルスGトリプレット、位置1099(1ntの長さを付加する)、1139,5611及び7559(番号は新しい制限部位の第一塩基である)においての4つの配列マーカー、リボザイム及びタンデムT7ターミネーター、並びにリボザイム切断(切断部位は矢印で示す)により3’末端に寄与する単独非ウィルス3’−リン酸化U残基。非ウィルス5’−GGG及び3’−U残基はアンチゲノムについてここで及び以降に示す長さの他の中には含まれていない。しかしながら、位置1099のヌクレオチド挿入は含まれており、それ故cDNA誘導化アンチゲノムの番号は生物学的に誘導されたアンチゲノムよりもこの位置から1ヌクレオチド下流となっている。D46の5’→3’ポジティブセンス配列(そのゲノム自体はネガティブセンスである)をSEQ ID NO:1に示し、ここで4位のヌクレオチドはC又はGのいづれかでよい。また、この図及び全体における制限部位に付与されている配列位置は説明ガイドを意図しており、そして単独で関与するヌクレオチドの全てを規定するものではない。ここで及び全体の制限フラグメントに付与されている長さの値も説明的なものであり、なぜなら長さは消化後に残る接着末端の如き要因に基づき変動しうるからである。完全アンチゲノムをまとめるうえで示すクローニングされたcDNAセグメントも示す。枠は組立てを促進する修飾であるプラスミドベクターからのBamHI部位の除去を示す:天然BamHI−SalIフラグメント(BamHI部位は下線を付したポジティブセンスにおける最上線分において示す)をPCR作表BglII−SalIフラグメントと交換した(BglII部位は下線を付した最下線分において示す;イタリック体で示すその4nt接着末端はBamHIのそれと適合する)。これは単一のnt変化(下線を付した中央線分)をもたらし、それはアミノ酸レベルでサイレントであった。図3はcDNAコードアンチゲノムRNAに含まれている配列マーカーを示し、ここで配列はポジティブセンスであり、そしてリーダー領域補完の第一ntに対して1として番号付けした;RSVサブグループA及びBのそれぞれを示す株A2と18537との間の表示はドットで示す;cDNAの中の制限部位を示す配列には下線を付した;遺伝子開始(GS)及び遺伝子終止(GE)転写シグナルは枠で囲った;位置1141でのN翻訳オープンリーディングフレームの開始コドンはイタリック体とし、そして制限部位は各配列の下に示す。最上配列において、1個のC残基が位置1099に挿入され、NS2−N遺伝子間領域内にAflII部位を設けており、そしてN翻訳オープンリーディングフレームのすぐ上流の位置1139及び1140のAGはCCに置き換えられ、新たなNcoI部位が設けられている。中央配列において、位置5612及び5616のそれぞれでのG及びUの置換はG−F遺伝子間領域において新たなStuI部位を設けている。最下配列において、位置7560のC置換はF−M2遺伝子間領域において新たなSphI部位を設けている。
図4は突然変異の挿入、完全アンチゲノム構築体の集成及び組換ウィルスの回収に関与するcDNA(ほぼスケール通り)の構造を示す。4タイプの突然変異を最下列に示すpUC118−又はpUC119担持cDNAサブクローンの中に挿入した。即ち、L遺伝子における6つのサイレント制限部位(最上のD53ダイアグラムに下線を付した)、F遺伝子における2つのHEK変化(H)、5つのcp変化(cp)、並びに様々な生物学的突然変異誘発工程に特異的な突然変異248,404,530,1009及び1030(表示通り)を挿入した。突然変異誘発サブクローンを中央列に示すD50(リーダーから、このリーダーのすぐ上流にT7プロモーターがあるM2−L重複の最初に至るRSVアンチゲノムを示す)又はD39(M2−L重複からトレーラーに至るRSVアンチゲノムを示し、リボザイム及びT7ターミネーターはトレーラーのすぐ下流にある)中間プラスミドの中に挿入した。適当なD50及びD39を最上列に示すように全長D53アンチゲノムDNAへと集成した(RTTはハンマーヘッドリボザイムの位置を示し、2つのT7転写ターミネーターが続く)。
図5は組換RSVを回収するために用いた6つの突然変異アンチゲノムcDNAの地図を示す。これらの組換体のts表現型を図の右側に示す。
図6はRSV転写シグナルが隣接するCAT ORFを含むRSVアンチゲノムをコードするD46/1024 CAT DNAの構築を示す(スケール通りでなく、RSV特異的セグメントはべた塗り枠で示し、そしてCAT配列は白抜き枠で示す)。CAT遺伝子転写カセットの起源はRSV−CATミニゲノムcDNA6196とした(最上のダイアグラム)。このRSV−CATミニゲノムはリーダー領域、GS及びGEシグナル、非コード(NC)RSV遺伝子配列及びCAT ORFを含み、XmaI制限エンドヌクレアーゼはGSシグナルの前、且つGEシグナルの後にある。これらの要素のヌクレオチド長を示し、そしてXmaI部位を囲む配列(ポジティブセンス)をダイアグラムの上に示す。8−ヌクレオチドXmaIリンカーを親プラスミドD46のStuI部位の中に挿入してプラスミドD46/1024を構築した。D46は完全アンチゲノムcDNAであり、そしてD53と同等である。命名における相違はこれらが2種類の調製品を代表することを示す。プラスミド6196のXma−XmaIフラグメントをプラスミドD46/1024の中に挿入してプラスミドD46/1024CATを構築した。D46 cDNAによりコードされるRNAを下に示し、T7プロモーターにより寄与される3つの5’末端非ウィルスG残基及びハンマーヘッドリボザイムの切断により寄与される3’末端リン酸化U残基を含む。アンチゲノムについて示すヌクレオチドの長さはこのような非ウィルスヌクレオチドを含まない。L遺伝子は遺伝子重複を示すようにずらして描いた。
図7はRSVアンチゲノムをコードする親野生型D46プラスミド(上)及びSH遺伝子の欠失したD46/6368誘導体(F)のダイアグラムを示す(スケール通りでない)。これらRSV遺伝子は白抜き三角形で示し、GS及びGE転写シグナルは上流端及び下流端それぞれの上にべた塗り枠で示す。T7ファージプロモーター(左)並びにRNA転写体(右)の3’末端を作るために用いたハンマーヘッドリボザイム及びT7ターミネーターを小白抜き枠で示す。D46のScaI及びPacIフラグメントを短い合成フラグメントと交換し、D46/6368を得た。D46の中のSH遺伝子に隣接する配列及びD46/6368の中の操作領域の配列を対応のプラスミド地図の上に枠に囲んで示す。D46におけるScaI−PacIフラグメントの配列及びD46/6368におけるその交換を太字で示し、そして上方を向いた矢印で境界を定めている。M GE,SH GS,SH GE及びG GS部位に上線を付した。D46/6368における新たなM−G遺伝子間領域をこのダイアグラムの中の下方に65とラベルし、そのヌクレオチド長を示した。SH−マイナスD46/6368構築体のポジティブ−センスT7転写体を下に示す。T7プロモーターにより寄与される3つの5’末端非ウィルスG残基及び3’末端U残基を示す(Collinsら、1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-11567;引用することで本明細書に組入れる)。これらの非ウィルスヌクレオチドは長さの尺度に含まれていない。
図8はSH座における欠失を確認するためのD46野生型又はD46/6368 SH−マイナスウィルスを感染された細胞由来の全細胞内RNAのRT−PCR分析の結果を提供する。RTはSH遺伝子の上流にアニーリングするポジティブセンスプライマーで実施し、そしてPCRは更にSH遺伝子の下流にアニーリングするネガティブセンスプライマーを採用する。レーン:(1及び5)マーカーは1KbのDNAラダー(Life Technologies,Gathersburg,MD);(2)RT−PCRにかけたD46/6368 RNA;(3)RT−PCRにかけたD46 RNA;(4)PCRのみにかけたD46/6368 RNA。PCR生成物を2.5%のアガロースゲルに電気泳動し、そしてエチジウムブロミドで染色した。一部のマーカーDNAフラグメントのヌクレオチド長を右に示す。
図9はD46野生型及びD46/6368 SH−マイナスウィルスによりコードされるRNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションを示す。全細胞RNAを感染細胞から単離し、そして事前変性工程抜きでオリゴ(dT)クロマトグラフィーに、選定RNAがサンドイッチハイブリダイゼーションによりゲノムDNAをも含む条件下でかけた。RNAをホルムアルデヒド−アガロースゲルで電気泳動し、そしてニトロセルロース膜にブロッティングした。レプリケートブロットを個別に、表示の通り、M,SH,G,F,M2又はL遺伝子の〔32P〕ラベル化DNAプローブにハイブリダイゼーションさせた。レーン:(1)D46/6368 RNA;(2)D46 RNA;(3)未感染HEp−2細胞RNA。ゲノムRNA(gen.),mRNA(大文字)及び読み取り転写体(小文字)の位置を左に示す。読み取り転写体P−M及びM−Gの位置(Mプローブ)、並びにG−F及びF−M2転写体の位置(Fプローブ)は一致した。平行で泳動し、そしてファージラムダの〔32P〕ラベル化DNAとのハイブリダイゼーションにより識別化された0.24〜9.5kbのRNAラダー分子量マーカー(Life Technologies)の位置を右に示す。
図10はD46野生型又はD46/6368 SH−マイナスウィルスで感染されたHEp−2細胞の中で合成した〔35S〕−ラベル化RSVタンパク質のSDS−PAGEを示す。タンパク質を精製ビオリンに対して生起させた抗血清による免疫沈殿にかけ、そしてプレキャスト勾配4%〜20%トリス−グリシンゲル(Novex,San Diego,CA)における電気泳動により分析した。ウィルスタンパク質の位置を左に示す;マーカータンパク質(Kaleidoscope Prestained Standards,Bio-Rad,Richmond,CA)の位置及び分子量を右に示す。
図11〜13はHEp−2細胞(図11)、293細胞(図12)及びAGMK−21細胞(図13)におけるD46野生型及びD46/6368 SH−マイナスウィルスの増殖曲線を提供する。25cm2培養フラスコ中の三重細胞単層をいづれかのウィルスで2PFU/細胞で感染し、そして37℃でインキュベーションした。アリコートを表示の時点で取り、−70℃で保存し、そして抗体染色によるプラークアッセイと平行に力価検定した。示している各点は3つの感染細胞単層の平均力価である。
図14及び15はD46野生型ウィルス、D46/6368 SH−マイナスウィルス又は生物学的に誘導されたcpts 248/404ウィルスを経鼻接種せしめたマウスの上方(図14)及び下方(図15)呼吸器官におけるウィルス複製の速度を示す。24通りのグループにおけるマウスに106PFUの表示ウィルスを鼻内接種した。各グループ由来の6匹のマウスを表示の日に殺し、そして鼻介骨及び肺組織を除去し、そしてホモジナイズし、そして感染性ウィルスのレベルを個々の検体に基づくプラークアッセイにより決定し、そして平均log10力価を決定した。
図16は野生型対応物と比較した転写生成物及びSHマイナスウィルスの遺伝子順序の対比を示す。上部パネルは野生型親組換ウィルスと比較したSHマイナスウィルスにより生産された一定のmRNAの量の分析をまとめている。細胞内mRNAをSHマイナス又は野生型ウィルスで感染させた細胞から単離し、そして遺伝子特異的プローブとのノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。ハイブリダイゼーションした放射能の量を定量し、そしてSHマイナスウィルス対その野生型親により生産された個々のmRNAそれぞれの相対量を示す。FパネルはM遺伝子(遺伝子順序で5位)からL遺伝子(10位)に至る野生型ウィルスの遺伝子順序を示す。これを、G,F,M2及びL遺伝子の遺伝子順序における位置がSH遺伝子の欠失により変えられているSHマイナスウィルスのそれと比較した。
図17はD46アンチゲノムプラスミドを示し、それは任意の異種配列が組換ウィルスの中に挿入されないようにSH遺伝子が欠失していることにより修飾されている。SH遺伝子に隣接する配列を上に示す。MGE,M−SH遺伝子間(IG)、SH GS,SH GE及びSH−G IG配列を示す。欠失により除去された領域に下線を付し、欠失部位は上向き三角形で表示する。この欠失に由来するアンチゲノムはD46/6340である。
図18はNS2タンパク質をコードする翻訳オープンリーディングフレーム(ORF)へのタンデム翻訳停止コドンの導入を示す。プラスミドD13はアンチゲノムcDNAの左端を含む、T7プロモーター(影付き枠)、リーダー領域、並びにNS1,NS2,N,P,M及びSH遺伝子を含む。D13のcDNAインサートのみを示す。T7プロモーター並びにNS1及びNS2遺伝子を含むAatII−AflIIフラグメントをpGemベクターの中にサブクローニングし、そして部位特異的突然変異誘発を利用して当該配列により示される領域内のNS2 ORFを改質せしめた。コドン18〜26の野生型配列を示し(コードアミノ酸は下記に示す)、そして上記3つのヌクレオチドはマーカーとして2つの終止コドン(ter)及びXhoI部位(下線)を導入するために作った3つの置換である。得られるcDNA及びその後回収したウィルスをNS2−ノックアウト(KO)と称する。
図19はHEp−2細胞における野生型RSV(D53)、対、NS2−ノックアウトRSVによる感染性ウィルスの製造と比較する。単層を三重でいづれかのウィルスにより3pfu/細胞の仕込みmoiで感染させ、そしてサンプルを表示の間隔で取り、そしてプラークアッセイ及び免疫染色により定量した。
図20はNS1及びNS2遺伝子の遺伝子終止(GE)シグナルの改変を示す。T7プロモーター(影付き)から位置4623のPacI部位に至るアンチゲノムcDNAの左手端を示すプラスミドD13のcDNAインサートを示す。T7プロモーター並びにNS1及びNS2遺伝子を含むAatI−AflIIフラグメントをpGemベクターの中にサブクローニングした。それを2つの部位において同時に部位特異的突然変異誘発により修飾した。即ち、NS1及びNS2GEシグナルをそれぞれ修飾してN遺伝子について自然に見い出せるものと同一にした。野生型NS1及びNS2GEシグナルの配列を示し(そして完全アンチゲノム配列に対する配列位置により同定し)、そしてヌクレオチド置換を線分の上に示す。NS2GEシグナルの野生型配列における点線は当該突然変異がGEシグナルの長さを1ヌクレオチド伸ばしたことを示す。
図21はNS1タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の欠失を示す。D13 cDNAの左側は下に示す。D13はリーダーからSH遺伝子の末端に至るアンチゲノムcDNAの左側を含み、T7プロモーターはリーダーのすぐ上流にある。欠失点(上向矢印)のいづれか側上の配列を上に示す。欠失はNS1ORFの翻訳開始部位直前からNS2ORFの直前にまで及ぶ。即ち、それはNS1GS及び上流非コード領域をNS2ORFに融合させる効果を有する。このことはリーダー近位位置に基づくNS1遺伝子に及びうる任意のcis作用性配列要素の中断を妨げる。
図22はNS2mRNAをコードするポリヌクレオチド配列の欠失を示す。前述の通り、D13 cDNAの左側を、欠失点(上向き矢印)のいづれか側上の配列と一緒に示す。この欠失はNS1遺伝子のすぐ下流からNS2遺伝子のすぐ下流にまで及ぶ。かくして、NS2mRNAをコードする配列は全体が欠失されており、その他の配列は中断されていない。得られるcDNA及びその後回収した組換ウィルスをΔNS2と称する。
図23はGプロテインの分泌形態についての翻訳開始部位の除去を示す。298アミノ酸Gプロテインを白抜き長方形で示し、シグナル−アンカー配列をべた塗りしてある。位置45〜53のアミノ酸配列を上に示し、アミノ酸48をメチオニンからイソロイシンへと、そしてアミノ酸49をイソロイシンからバリンへと変える2つのヌクレオチド置換を示す。前者の突然変異は分泌形態の翻訳開始部位を排除する。2つの突然変異はMfeI部位も構築し、それは突然変異の検出のための好都合な方法を供する。得られるcDNA及びその後回収したウィルスをM48Iを称する(メチオニン48→イソロイシン48)。
図24は野生型RSV(D53)による感染性ウィルスの生成、対、回収D53/M481膜G突然変異ウィルスの2つの単離のそれの対比結果を示す。
特定の態様の説明
本発明はヒトにおいて使用するために適当な生物学的に誘導した組換RSVを提供する。本明細書に記載の弱毒化RSVは不完全に弱毒化されたRSV株、例えば温度感受性(ts)もしくは低温継代(cp)RSウィルスに、又は野生型ウィルス、例えばRSV株A2に特異的な弱毒突然変異を導入及び/又は組合せることにより製造される。生物学的に誘導されたRSVにおける突然変異は自然に生じたものであるか又は公知の突然変異誘発もしくは類似の手順により選定のRSV株に導入したものであってよい。例えば、不完全に弱毒化した親RSV株は化学突然変異誘発因子の添加された細胞培養物中でのウィルス増殖の際の化学突然変異誘発により、増殖制限突然変異を導入する最適に満たない温度での継代にかけたウィルスの選択により、又は概して本明細書及び本明細書に引用することで組入れるUSSN 08/327,263号に記載の通りにして細胞培養物内で小プラーク(sp)を生成する突然変異されたウィルスの選択により製造されうる。
「生物学的に誘導されたRSV」とは組換手段によって製造されたものでない任意のRSVを意味する。即ち、生物学的に誘導されたRSVには、全てのサブグループ及び株の天然RSV、例えば野生型ゲノム配列を有する天然RSV及び対照の野生型RSV配列に由来するゲノム変異を有するRSV、例えば弱毒表現型を特定する突然変異を有するRSV等が含まれる。同様に、生物学的に誘導されたRSVにはとりわけ人工突然変異誘発及び選択手順により親RSV株から誘導されたRSV突然変異体が含まれる。
本発明の満足たる弱毒化RSウィルスを製造するため、不完全又は部分的に弱毒化された親ウィルス株、例えばts−1もしくはts−4突然変異体、又はcpRSVに突然変異を導入するのが好ましい。サブグループAのウィルスに関し、不完全に弱毒化された親ウィルスは好ましくはts−1もしくはts−1NG又はcpRSVであり、それらはサブグループAのA2株の幅広く知られた突然変異体であるか、又はそのサブグループの誘導体である。その他の態様において、弱毒表現型に関わる特定の突然変異を同定し、そしてワクチン用途に適する株に導入する。特定の弱毒突然変異を導入する株は野生型ウィルスであるか、又は既に部分的に弱毒化されたものであってよく、この場合更なる突然変異が株を、例えば哺乳宿主における所望の制限複製レベルに至るまで、ワクチンにおける防御を授けるのに十分な免疫原性を保持しながら更に弱毒化する。
サブグループA又はBウィルスの部分的に弱毒化された突然変異体は野生型ウィルスを許容の細胞支持体において生物学的にクローニングし、そしてその低温継代突然変異体を展開し、このウィルスを化学突然変異誘発にかけてts突然変異体を生成する、又はその小プラークもしくは類似の表現型突然変異体を選択することにより製造されうる(例えば、本明細書に引用することで組入れるMurphyら、国際公開番号WO93/21310を参照のこと)。サブグループBのウィルスに関し、典型的な弱毒化親ウィルスはcp52/2B5であり、それはサブグループBのB1株の突然変異体である。本明細書に記載の更なる誘導化のために有用である非弱毒化サブグループA又はB株から部分弱毒化突然変異体を作り出すために様々な選択技術を組合せてよい。更に、弱毒化表現型を特定する突然変異を個別に、又は不完全に弱毒化されたサブグループAもしくはBウィルスとの組合せにおいて導入し、ワクチンにおいて所望のレベルの弱毒化及び免疫原性を授ける多重の規定弱毒突然変異を有するワクチンウィルスを作り出すことができうる。
所望の部分弱毒化親株を選択したら、本発明に係るヒトに利用するのに許容されるワクチンを作り出すのに十分な更なる弱毒化が本明細書に記載のいく通りかの手段で達成されうる。例えば、cpRSV突然変異体はいく通りかの手段で更に突然変異誘発されうる。一の態様において、その手順は部分弱毒化ウィルスを細胞培養物の中で斬進的に低くなる弱毒温度における継代に委ねることを含む。例えば、野生型ウィルスは典型的には約34〜37℃で培養するが、部分的に弱毒化した突然変異体は最適に満たない温度、例えば20〜26℃での細胞培養物(例えば一次ウシ腎細胞)における継代により製造する。即ち、本発明の一の方法において、cp突然変異体又はその他の部分的に弱毒化された株、例えばts−1又はspをMRC−5又はVero細胞における継代により、約20〜24℃、好ましくは20〜22℃の温度に至る低温での効率的な増殖に適応させる。低温継代の際の突然変異RSウィルスのこの選択は、部分弱毒化親と比べ、当該誘導株における任意の残留ビルレントを実質的に排除する。他方、特異的な突然変異、例えば、ts,sp又はcaを司る突然変異を突然変異誘発又はその他の方法を介して組換バージョンに導入し、cp突然変異体を更に突然変異誘発せしめることができる。
本発明の一の態様において、この不完全に弱毒化したRSV株を化学突然変異誘発にかけてts突然変異を導入する、又はウィルスが既にtsとなっている場合、弱毒化誘導体に基づくts表現型の高められた安定性を授けるのに十分な更なるts突然変異を導入する。RSウィルスへのts突然変異の導入のための手段には、突然変異誘発因子、例えば5−フルオロウリジン又は5−フルオロウラシルの約10-3〜10-5M、好ましくは約10-4Mの濃度での存在下におけるウィルスの複製、例えば、Gharpueら、J.Virol.3:414-421(1969)及びRichardsonら、J.Med.Virol.3:91-100(1978)に記載の一般的な手順に従う約100μg/mlの濃度でのニトロソグアニジンに対するウィルスの曝露、又は特異的なts突然変異の遺伝子的導入が挙げられる。その他の化学突然変異誘発因子も使用してよい。弱毒化はほぼ全てのRSウィルス遺伝子におけるts突然変異の結果であり得、そして本明細書において特定する通り、ts突然変異は典型的にはポリメラーゼ(L)遺伝子に関わっている。
本発明の典型的な弱毒化RSVにおける複製の温度感染性レベルは許容の温度でのその複製をいくつかの制限温度でのそれと比較することにより決定される。許容温度でのその複製と比べ100分の1以下にウィルスの複製が減じる最低温度をシャットオフ温度と呼ぶ。実験動物及びヒトにおいて、RSVの複製及びビルレントは共に突然変異体のシャットオフ温度に相関する。39℃のシャットオフ温度を有する突然変異体の複製は適度に制限され、一方38℃のシャットオフを有する突然変異体はあまり複製せず、そして病気の徴候は主に上方呼吸気管に限定される。35〜37℃のシャットオフ温度を有するウィルスは典型的にはヒトにおいて完全に弱毒化されるであろう。即ち、tsである本発明の弱毒化RSVは約35〜39℃、そして好ましくは35〜38℃の範囲におけるシャットオフ温度を有するであろう。部分的に弱毒化された株へのts突然変異の追加は本発明のワクチン組成物において有用な多重弱毒化ウィルスを供する。
鼻内投与のための候補ワクチンとしてのいくつかの弱毒化RSV株が低温継代の際に既に弱毒化されたウィルスへの多重突然変異の導入のための数ラウンドの化学突然変異誘発を利用して開発されている(例えば引用することで本明細書に組入れる、Connorsら、Virology 208:478-484(1995);CroweらVaccine 12:691-699(1994);及びCroweらVaccine 12:783-790(1994))。げっ歯類、チンパンジー、成人及び幼児における評価は、一定のこれらの候補ワクチン株は比較的遺伝子的に安定であり、高度に免疫原性であり、そして十分に弱毒化されていることがあることを示唆する。いくつかのこのような弱毒化ウィルスのヌクレオチド配列分析は、下記に例示する通り、各レベルの増大した弱毒化が特定のヌクレオチド及びアミノ酸置換に関わっていることを示唆する。本発明は、突然変異を個別に、又は様々な組合せにおいて感染性RSVクローンのゲノム又はアンチゲノムに導入することにより、サイレントな人為的突然変異、対、表現型相違を司るものとを区別する能力を提供する。親及び誘導ウィルスの表現特徴の評価と組合せたこのプロセスは所望の特徴、例えば弱毒化、温度感受性、低温適応性、小プラークサイズ、宿主域制限、等を担う突然変異を同定する。このようにして同定した突然変異を「メニュー」へと重ね、そして単独又は組合せにおいて導入し、ワクチンウィルスを所望通りに適当なレベルの弱毒化、免疫原性、弱毒化表現型からの復帰に対する遺伝子抵抗性、等へと計算する。
ts表現型を有する更に弱毒化されたRSVを構築するための一連のランダム化学突然変異誘発により導入された特定の突然変異は配列分析及び親バックグランド、例えばcpRSVバックグランドとの比較により同定される。典型的な態様において、ポリメラーゼ(L)遺伝子内でのcpts RSV 248を構築するためのヌクレオチド10,989(AをTに変え、アミノ酸残基831においてgln→lewアミノ酸置換を供する)又はヌクレオチド10,060(CをAに変え、アミノ酸残基521においてphe→leuアミノ酸置換を供する)の置換はcpts RSV 530を供した。このような併合弱毒突然変異は親cpRSVについて決定されたものよりも強い弱毒化表現型を特定する。cpts RSV 48は38℃のシャットオフ温度を有し、それは弱毒化されており、免疫原性であり、そして血清陰性チンパンジーにおける野生型RSV負荷に対して完全防御性であり、そして従来評価されたRSV突然変異体よりもin vivo複製の際に遺伝子的に安定である。表現型復帰に対する遺伝子抵抗及びin vivo複製の制限の寄与はこの典型的な株が追加の突然変異を導入すべき所望の親株であることも示唆する。
別の典型的な態様において、cpts RSV 248突然変異体を化学突然変異誘発にかけ、そして親株よりも例えば高い温度感受性又は小さいプラーク表現型特性を有する一連の更に弱毒化された突然変異体が出来上がる。cpts RSV 248/404を命名する一のかかる突然変異体はヌクレオチド7605での追加の突然変異(TをCに変える)の結果である36℃の低まったシャットオフ温度を特徴とし、この突然変異は非コード式の高度に保存された遺伝子開始cis作用調節配列にあり、そしてアミノ酸変化は供さないものである。
本発明の別の態様において、RSV突然変異体は2以上の弱毒突然変異を有するように製造される。例えば、39℃のシャットオフ温度を有する多重弱毒化ウィルスcpts RSV 530を化学突然変異誘発にかけて非弱毒化バックグランドにおける弱毒表現型を特定する1又は複数の追加の突然変異を導入する。一例において、クローンcpts RSV 530/1009を単離し、そしてポリメラーゼ(L)遺伝子内の12,002での単一ヌクレオチド置換(AをGに変え、アミノ酸残基1169でのmet→valアミノ酸置換を供する)に基づき36℃のシャットオフ温度を有すると決定された。
本発明は更に例えばcDNAから組換式方法により製造された感受性RSVを提供する。一の態様において、感染性RSVはRSVゲノム又はアンチゲノムRNAをコードするcDNAの、転写式複製ヌクレオカプシドを構築するのに必要なウィルスタンパク質、好ましくは主要ヌクレオカプシド(N)タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質(P)、大型(L)ポリメラーゼタンパク質、及び転写伸長因子M2 ORF1タンパク質をコードする1又は複の配列との細胞内同時発現により製造される。
cDNAから感染性RSVを作り出す能力は特定の操作式変化、例えば部位特異的弱毒突然変異及び広域なその他の組換変化を組換ウィルスのゲノムに導入し、安全で効率的なRSVワクチンを製造することを可能にする。
本発明の感染性組換RSVはここでは、生物学的に誘導された弱毒化RSV株中の特定の突然変異、例えばts,ca,att及びその他の表現型を特定する突然変異を同定するためにここで採用する。従って、本発明は生物学的に誘導された突然変異を、幅広いその他の所望の変化と一緒に、組換RSVワクチン株へと組込むことを可能にする。例えば、cDNAからウィルスを作り出す能力は、弱毒化RSVワクチン候補において認められる突然変異の組込みが個別に又は様々な選定の組合せにおいて全長cDNAクローンに導入されること、及び導入された突然変異を含む釣り出した組換ウィルスの表現型が容易に決定されることを可能にする。典型的な態様において、弱毒化された生物学的に誘導されたウィルス、例えば低温継代RSV(cpRSV)又はそれに由来する更に弱毒化された株、例えばcpRSVの温度感受性誘導体(cptsRSV)において同定されたアミノ酸変化が組換RSVクローンに組込まれている。野生型又は生物学的に誘導された突然変異RSV配列由来のこれらの変異は野生型又は不完全に弱毒化された親RSV表現型と比べ、例えば弱毒された又は更に弱毒化された表現型の如き所望の特性を得られるクローンにおいて特定する。
所望の表現型、例えばcp又はts表現型に関わる特定の生物学的に誘導された突然変異を同定して感染性RSVクローンに組込むことにより、本発明は同定した突然変異においての、又はその領域内でのその他の部位特異的修飾を供する。生物学的に誘導されたRSV内において製造された弱毒突然変異は単一ヌクレオチド変化であるが、その他の部位特異的突然変異も生物学的に誘導された又は組換RSVに組換技術により組込むことができうる。本明細書において用いる部位特異的突然変異には1〜3から約5〜15又はそれ以上の改変ヌクレオチド(例えば、野生型RSV配列、選定の突然変異RSV株の配列又は突然変異誘発に委ねた親組RSVクローンから改変)の挿入、置換、欠失又は転位が含まれる。かかる部位特異的突然変異は選定の生物学的に誘導された点突然変異において、又はその領域内において組込まれうる。他方、これらの突然変異はRSVクローン内の様々なその他の部分、例えばcis作用性調節配列又はタンパク質活性部位、結合性部位、免疫原性エピトープ等をコードするヌクレオチド配列において、又はその付近において導入されうる。部位特異的RSV突然変異は典型的には所望の弱毒表現型を保持するが、弱毒化に無関係な実質的に改変された表現特性、例えば高まったもしくは広くなった免疫原性、又は向上した増殖力を示しうる。所望の部位特異的突然変異の更なる例には弱毒点突然変異を特定するコドン内での更なる安定化ヌクレオチド突然変異を組込むようにデザインした組換RSVが含まれる。可能なら、2以上のヌクレオチド置換を親突然変異体又は組換RSVクローンにおける弱毒アミノ酸変化を特定するコドンに導入し、弱毒化表現型からの復帰に対する遺伝的抵抗を有する生物学的に誘導された又は組換RSVが供される。その他の態様において、部位特異的ヌクレオチド置換、付加、欠失又は転位を、標的としたヌクレオチド位置に対して例えば1〜3,5〜10、そして15個までのヌクレオチド上流(N末端方向)又は下流(C末端方向)、又はより5’もしくは3’側に導入し、例えば現存のcis作用性調節因子を構築又は除去する。
単一及び多重点突然変異及び部位特異的突然変異に加えて、本明細書に開示する組換RSVへの変化には欠失、挿入、置換又は遺伝子全体もしくは遺伝子セグメントの転位が含まれる。これらの突然変異は変化の種類に応じて少数の塩基(例えば15〜30個の塩基、又は35〜50個の塩基、又はそれより多くの塩基)又は大きなヌクレオチドブロック(例えば50〜100,100〜300,300〜500,500〜1,000塩基)に影響を及ぼす(即ち、少数の塩基を変えて免疫原エピトープ又は小遺伝子セグメントを挿入又は除去し、一方で大型塩基ブロックは遺伝子又は大型遺伝子セグメントを付加、置換、欠失又は転位させるときに関わってくる)。
更なる観点において、本発明は生物学的に誘導されたRSVから採用する突然変異、例えばL遺伝子内に主に認められるcp及びts突然変異への、組換RSVクローンにおける同一又は異なる遺伝子に関与する更なるタイプの突然変異の追加を提供する。RSVは10種のmRNA及び10又は11種のタンパク質をコードする。そのうちの3つはトランスメンブラン界面タンパク質、即ち付加Gタンパク質、侵入に関与する融合Fタンパク質、及び小型の疎水性SHタンパク質である。G及びFは主要ウィルス中和及び防御性抗原である。4種類の更なるタンパク質、即ち、RNA結合剤タンパク質N、リンタンパク質P、大型ポリメラーゼタンパク質L、及び転写伸長因子M2 ORF1がウィルスヌクレオカプシドに一体化している。マトリックスMタンパク質は内部ビリオンの一部であり、そしておそらくはヌクレオカプシドとエンベロープとの会合を媒介する。最後に、2つの非構造タンパク質NS1及びNS2があり、機能は不明である。これらのタンパク質はその発現レベルの観点において特異的に改変され得、又は全体もしくは部分的に、単独でもしくはその他の所望の修飾と組合さって、組換RSVにおいて欠失、置換もしくは転位され、新規の感染性RSVクローンが得られうる。
かくして、生物学的に誘導されたRSV突然変異体から採用した弱毒突然変異に加えて、又はそれと組合さって、本発明は感染性RSVクローンの組換操作に基づく全体的に新しい弱毒化方法も提供する。本発明のこの観点に従うと、様々な改変をこれより感染性組換RSVへの組込みのためにRSVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド配列の中に設けることができるようになる。より詳しくは、組換RSVにおける所望の構造的及び表現型変化を達成せしめるため、本発明は親RSV配列から選定のヌクレオチドもしくは複数のヌクレオチドを欠失、置換、導入もしくは転位させる修飾の導入、及び感染性RSVクローン内に完全遺伝子もしくは遺伝子セグメントを欠失、置換、導入もしくは転位させる突然変異の導入を可能にする。
感染性組換RSVの所望の修飾は典型的には所望の表現型変化、例えばウィルス増殖、温度感受性、宿主免疫応答を誘導する能力、弱毒化、等の変化を特定するように選定される。これらの変化は例えば特定の遺伝子又は遺伝子領域(例えば、タンパク質構造ドメイン、例えばサイトプラズマ、トランスメンブラン又は細胞外ドメイン、免疫原性エピトープ、結合領域、活性部位、等をコードする遺伝子セグメント)を除去、導入又は転位するための親RSVクローンの突然変異誘発により供されうる。これに関して注目の遺伝子はRSVゲノムの全遺伝子:3’−NS1−NS2−N−P−M−SH−G−F−M2−L−5’、並びにその他のRSV、その他のウィルス、及び様々なその他の本明細書に表示の非RSV起源に由来する異種遺伝子が含まれる。更に提供するのは、例えば選定のRSVコード配列内に終止コドンを導入することにより;作用可能式に連結されたプロモーターに対するRSV遺伝子の位置を変えることにより;発現率を変えるように上流開始コドンを導入することにより;表現型(例えば、増殖、転写による温度制限、等)を変えるようにGS及び/もしくはGE転写シグナルを修飾することにより(例えば、位置を変えることにより、現存の配列を改変することにより、又は現存の配列を異種配列で置換することによる);並びにウィルス複製、選定の遺伝子の転写、又は選定のタンパク質の翻訳における定量的又は定性的変化を特定する様々なその他の欠失、置換、付加又は転位による、選定の遺伝子の発現を単に改変又は除去する修飾である。
本明細書に記載の通り、ワクチン剤として利用するための弱毒及び免疫原の向上した特性を授ける一連の組換ウィルスを構築するのにcDNAを基礎とする方法を利用する。これに関する所望の表現型変化はとりわけ弱毒化表現型からの復帰に対する抵抗、培養物又は選定の宿主環境における弱毒化の向上、免疫原特性(例えば、誘導免疫応答の増強、又は軽減により決定)、選定のウィルス生成物の転写及び/もしくは翻訳の上昇調節もしくは下降調節である。外来遺伝子を全体的又は部分的に挿入する、遺伝子の順序を変える、遺伝子重複を除去する、RSVゲノムプロモーターをそのアンチゲノム対応物と交換する、遺伝子の一部(例えば糖タンパク質遺伝子のサイトプラスマテール)を付加する(例えば、現存の配列を二倍にするため又は異種配列を組込むため)、除去する又は置換する、更には遺伝子全体を欠失させてよい。
本発明の一の観点において、選定の遺伝子セグメント、例えば一のRSVから選定のタンパク質又はタンパク質領域をコードするもの(例えば、サイトプラスマテール、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位含有領域、等)を、同一又は異なるRSV又はその他の起源に由来する対応遺伝子セグメントと置換し、野生型又は親RSV株と比べて所望の表現型変化を有する新規の組換体を供する。例えば、このタイプの組換体はその他のRSVのエクトドメインに融合した一のRSVのサイトプラスマテール及び/又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現しうる。このタイプのその他の典型的な組換体は重複(duplicate)タンパク質領域、例えば重複免疫原性領域を発現する。本明細書において用いる「対応」遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質又はタンパク質領域は典型的には異種起源に由来する(例えば、別のRSV遺伝子、又は別のRSV株における同じ(即ち、相同性又は対立形質の)遺伝子又は遺伝子セグメントを代表するものと由来する)。これとの関係で選定される典型的な対応物は大まかな構造的特徴を共有しており、例えば各対応物は同等の構造「ドメイン」、例えばサイトプラスマドメイン、トランスメンブランドメイン、エクトドメイン、結合部位又は領域、エピトープ部位又は領域、等をコードしうる。対応ドメイン及びそれをコードする遺伝子セグメントはある範囲のサイズ及びアミノ酸(又はヌクレオチド)配列変動を有する種の組立てを包括し、その範囲はドメイン又は遺伝子セグメント変異体間での共通の生物学的活性により規定される。例えば、本発明における対応遺伝子セグメントによりコードされる2種類の選定タンパク質ドメインは実質的に同種の活性、例えば膜スパンニング機能を供する機能、特異的結合活性、免疫学的認識部位、等を共有しうる。より典型的には、対応物間、例えば選定のタンパク質セグメント又はタンパク質間で共有される特異的な生物活性は実質的に定量的な観点で似かよっており、即ち、それらは関連の定量的活性プロフィールにおいて30%以上、好ましくは20%以上、より好ましくは5〜10%以上相違しないであろう。
対応遺伝子及び遺伝子セグメント、並びにその他の本発明における組換RSVを製造するうえで関与するポリヌクレオチドは好ましくは選定のポリヌクレオチド対照配列、例えばその他の選定の対応配列との実質的な配列同一性を共有する。本明細書において用いる「対照配列」とは配列対比の基礎として利用される規定の配列、例えば全長cDNAもしくは遺伝子の配列、又は完全cDNAもしくは遺伝子配列である。一般に対照配列は長さにおいて少なくとも20個のヌクレオチドであり、しばしば長さにおいて少なくとも25個のヌクレオチドであり、そして往々にして長さにおいて少なくとも50個のヌクレオチドである。2種類のポリヌクレオチドはそれぞれ(1)2種類のポリヌクレオチド間で類似の配列(即ち、完全ポリヌクレオチド配列の一部)を含んで成り、そして(2)更に2種類のポリヌクレオチド間で相違する配列を更に含んで成るため、2種類の(又はそれより多くの)ポリヌクレオチド間での配列対比は典型的には2種類のポリヌクレオチドの配列を「対比ウィンドー」で行い、配列類似性の局所領域を同定及び比較する。本明細書で用いる「対比ウィンドー」とは少なくとも20の連続ヌクレオチド位置の概念的なセグメントを意味し、ここでポリヌクレオチド配列は少なくとも20個の連続ヌクレオチドの対照配列と比較され、そしてここでこの対比ウィンドーにおけるポリヌクレオチド配列の部分は2本の配列の最適アラインメントのために対照配列(それは付加又は欠失を含んで成らない)と比べ20%以下の付加又は欠失(即ち、ギャップ)を含んで成りうる。対比ウィンドーをアラインニングするための配列の最適アラインメントはSmith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似の方法についてのサーチにより(それぞれ引用することで本明細書に組入れる)、これらのアルゴリズムのコンピューター処理により(GAP,BESTFIT,FASTA及びTFASTA,Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI:引用することで本明細書に組入れる)又は目視により行われることができ、そして様々な方法により構築された最良のアラインメント(即ち、対比ウィンドーで配列類似性の最大パーセンテージをもたらす)を選定する。「配列同一性」とは2つのポリヌクレオチド配列が対比ウィンドーで同一(即ち、ヌクレオチド、対、ヌクレオチド基準で)であることを意味する。「配列同一性のパーセンテージ」は2つの最適にアラインニングさせた配列を対比ウィンドーで対比させ、双方の配列において同一の核酸塩基(例えばA,T,C,G,U又はI)が認められる位置の数を決定して対合した位置を数を得、対合した位置の数を対比ウィンドーにおける位置の総数(即ち、ウィンドーサイズ)で除く、そしてその結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算される。本明細書で用いる「実質的に同一性」なる語はポリヌクレオチド配列の特徴を意味し、ここで当該ポリヌクレオチドは対照配列と比べて少なくとも85%の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95%の配列同一性、より通常には少なくとも99%の配列同一性を、少なくとも20のヌクレオチド位置の対比ウィンドーで、しばしば少なくとも20〜25のヌクレオチド位置の対比ウィンドーで有する配列を含んで成り、ここで当該配列同一性のパーセンテージは当該対照配列を対比ウィンドーで当該配列の20%以下を占める欠失又は付加を含みうるポリヌクレオチド配列と比較することにより計算する。当該対照配列は大きめの配列のサブセットでありうる。
このようなポリヌクレオチド配列の関係に加えて、本発明の組換RSVによりコードされるタンパク質及びタンパク質領域は典型的には保存関係を有するように、即ち、選定の対照ポリペプチドと実質的に配列同一性又は配列類似性を有するようにも選定される。ポリペプチドに適用される通り、「配列同一性」なる語はペプチドが対応の位置において同一のアミノ酸を共有することを意味する。「配列類似性」なる語はペプチドが対応の位置において同一又は類似のアミノ酸(即ち、保存性置換)を有することを意味する。「実質的に配列同一性」なる語は、2つのペプチド配列が、例えばプログラムGAP又はBESTFITによりデフォルトギャップウェイトを利用して最適にアラインメントさせたとき、少なくとも80%の配列同一性、好ましくは少なくとも90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%以上の配列同一性(例えば、99%の配列同一性)を共有することを意味する。「実質的類似性」なる語は、2つのペプチド配列が対応の配列類似性パーセンテージを共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は保存性アミノ酸置換により相違する。保存性アミノ酸置換は類似の側鎖を有する残基の相互交換を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンである;脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリン及びスレオニンである;アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギン及びグルタミンである;芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンである;塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニン及びヒスチジンである;そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステイン及びメチオニンである。好適な保存性アミノ酸置換は:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。20種の汎用アミノ酸の立体異性体(例えばD−アミノ酸)、非天然アミノ酸、例えばα,α−ジ置換化アミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非汎用アミノ酸も本発明のポリペプチドの適当な成分でありうる。非汎用アミノ酸の例には:4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、t−N,N,N−トリメチルリシン、t−N−アセチルリシン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリン、N−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシルリシン、W−N−メチルアルギニン、並びにその他の類似のアミノ酸及びイミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)が含まれる。更に、アミノ酸はグリコシル化、リン酸化等により修飾されていてよい。
本発明の別の観点において、cDNA発現されたゲノム又はアンチゲノムから生成された感染性RSVは任意のRSV又はRSV様株、例えばヒト、ウシ、ネズミ等、又は任意の肺炎ウィルス、例えばマウス又は七面鳥鼻気管炎ウィルスのものであってよい。防御性免疫応答を引き起こすため、RSV株は免疫する被検体に内因性であるもの、例えばヒトを免疫するのに用いるヒトRSVであってよい。内因性RSVらのゲノム又はアンチゲノムはところで様々な起源の組合せ、例えば様々なRSV種、サブグループもしくは株に由来する、又はRSV及びその他の呼吸性病原体、例えばPIVに由来する遺伝子又は遺伝子セグメントの組合せからRSV遺伝子又は遺伝子セグメントを発現させるように修飾されうる(例えば、Hoffmanら、J.Virol.71:4272-4277(1977);Durbinら、Virology(1997)(印刷中);Murphyら、米国特許出願第60/047,634号、発明の名称RECOVERY OF INFECTIOUS PARAINFLUENZA VIRUS FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES 1997年5月27日出願:引用することで本明細書に組入れるを参照のこと;そして感染性PIVクローンを製造するための下記のプラスミド:p3/7(131)(ATCC 97990);p3/7(131)2G(ATCC 97889);及びp218(131)(ATCC 97991)はそれぞれブダペスト条約の規則に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852,U.S.A.に寄託され、そして上記の表示の受託番号が承認されている。
本発明の一定の態様において、ヒトRSVの個々の内部遺伝子が例えばウシ、ネズミもしくはその他のRSV対応物、又はPIVの如きその他の呼吸性病原体に由来する外来遺伝子の対応物と交換された組換RSVを提供する。これとの関係におけるRSV遺伝子又は遺伝子セグメントの置換、欠失等はNS1,NS2,N,P,M,SH,M2(ORF1),M2(ORF2)及びL遺伝子の一部もしくは全体、又はG及びF遺伝子の非免疫原部分の一部を含みうる。また、ヒトRSV cis作用性配列、例えばプロモーター又は転写シグナルを例えばそのウシRSV対応物と置き換えてよい。反復すると、ヒト弱毒遺伝子又はcis作用性配列をウシRSVゲノム又はアンチゲノムバックグランドに挿入することにより生きた弱毒化ウシRSVを作る手段を提供する。
異種遺伝子又はcis作用性要素を担持する組換RSVを宿主域制限及びワクチン用途に好まれるその他の所望の表現型のために選定される。典型的な態様において、ウシRSV配列を例えばPasteyら、J.Gen.Viol.76:193-197(1993);Pasteyら、Virus Res.29:195-202(1993);Zamoraら、J.Gen.Virol.73:737-741(1992);Mallipeddiら、J.Gen.Virol.74:2001-2004(1993);Mallipeddiら、J.Gen.Virol.73:2441-2444(1992);及びZamoraら、Virus Res.24:115-121(1992)(それぞれ引用することで本明細書に組入れる)において供されている通りのウシRSV構造及び機能の有用な説明に基づき、且つ本明細書に開示の方法及び組成に従い、ヒトRSVへの導入のために選定される。その他の態様において、組換RSV内での導入のための注目の突然変異をGタンパク質のサイトプラスマテールを欠くマウスの肺炎ウィルス(ヒトRSVのネズミ対応物)の組織培養順応非病原株を経てモデル化される(Randhawaら、Virology 207:240-245(1995))。従って、本発明の一の観点において、1又は複数のヒトRSV糖タンパク質、F,G及びSHのサイトプラスマ及び/又はトランスメンブランドメインは付加、欠失、修飾、又は異種対応配列(例えばウシRSV又はネズミ肺炎ウィルスのF,G又はSHタンパク質のサイトプラスマ又はトランスメンブランドメイン由来の配列)で置換され、所望の弱毒化が達成される。別の例として、Fタンパク質の切断部位もしくはその付近のヌクレオチド配列、又はGタンパク質の推定付加ドメインは点突然変異、部位特異的変化、又は遺伝子全体もしくは遺伝子セグメントに関与する改変により修飾され、組織培養におけるウィルス増殖及び/又は実験動物における感染症及び病原性に対する新たな効果が奏されうる。
かくして、ヒトに対する投与を意図する感染組換RSVは例えば弱毒化の目的のためにウシ又はネズミRSV又はPIVの如きに由来する遺伝子を含むように修飾されたヒトRSVであってよい。例えば、PIVに由来する遺伝子又は遺伝子セグメントを挿入することにより、PIV及びRSVの双方に対する二価ワクチンが提供される。他方、異種RSV種、サブグループもしくは株、又は異なる呼吸性病原体、例えばPIVに修飾を施し、例えばヒトRSV感染症に対する防御を誘導するようエピトープ又はタンパク質をコードする遺伝子を含むようにすることができる。例えば、ヒトRSV糖タンパク質遺伝子をウシ糖タンパク質遺伝子で置換し、これによりヒトRSV界面糖タンパク質を担持するようになり、且つ残りのウシ遺伝子バックグランドに基づきヒト宿主において制限された複製能力を保持するであろう得られるウシRSVはヒトRSV株に対するヒトにおける防御性免疫応答を誘導できうる。
ワクチン開発のための感染性RSVへのその他のタイプの弱毒突然変異の分析及び組込む能力はRSVクローン中での標的とする変化の幅広い組立に及ぶ。例えば、SH遺伝子の欠失は増強した増殖力を含む新規の表現型特徴を有する組換RSVを供する。本発明において、SH遺伝子欠失(又は任意のその他の選定の非本質的な遺伝子もしくは遺伝子セグメント欠失)を組換RSVにおいて、弱毒化表現型、例えば生物学的に誘導された弱毒化RSV突然変異から採用した点突然変異を特定する1又は複数の更なる突然変異と組合せる。典型的な態様において、このSH遺伝子又はNS2遺伝子をcpts 248/404,cpts 530/1009,cpts 530/1030もしくはその他の選定の突然変異RSV株から採用した1又は複数のcp及び/又はts突然変異と組合せて欠失させ、種々の突然変異の併合効果に基づきウィルス収率の増大した、弱毒化の増強した、そして遺伝子的に表現型復帰する組換RSVを供する。この観点において、増殖にとって本質的でない任意のRSV遺伝子、例えばSH,NP,NS1及びNS2遺伝子を除去又は何らかの形で修飾し、ビルレンス、病原性、免疫原性及びその他の表現型特徴に対する所望の効果を奏することができうる。例えば、SHの如き非本質的遺伝子の欠失による除去は培養における増強したウィルス増殖をもたらす。何ら理論に拘束されたいわけでもないが、この効果はウィルスゲノムの短くなったヌクレオチド長にある程度基づくようである。一の典型的なSHマイナスクローンにおいて、この修飾ウィルスゲノムは長さ14.825ntであり、野生型よりも398ヌクレオチド短い。例えばRSVゲノムのどこかのその他のコード又は非コード領域、例えばP,M,F及びM2遺伝子におけるゲノムサイズを短くする類似の突然変異を操作することにより、本発明はRSV増殖を改善せしめるためのいくつかの容易に入手できる方法及び材料を提供する。
更に、様々なその他の改変を感染性組換RSVへの組込みのために組換RSVゲノム又はアンチゲノムにおいて、単独で、又は生物学的に誘導された突然変異RSVから採用した1もしくは複数の弱毒点突然変異と一緒に設けることができうる。異種遺伝子(例えば、異なるRSV株もしくはタイプ、又は非RSV起源由来)を全体的又は部分的に挿入し、遺伝子の順序を変え、遺伝子重複を除去し、RSVゲノムをそのアンチゲノム対応物と交換し、遺伝子の一部を除去又は置換し、更には遺伝子全体を欠失させてよい。当該配列における種々の又は更なる修飾、例えば様々な遺伝子間領域又はいづれかの箇所における固有制限部位の挿入(例えば、GとF遺伝子との間の固有StuI部位)を操作性を促進するために施すことができる。非翻訳遺伝子配列は外来配列を挿入するためのキャパシティーを増大させるために除去してよい。
典型的な態様において、一のRSVの個々の遺伝子、遺伝子セグメント又は単一もしくは多重ヌクレオチドを異種RSV又はその他の起源に由来する対応配列で置換してよい。例えば、選定の異種遺伝子セグメント、例えば一のRSV由来の選定のタンパク質のサイトプラスマテール、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位含有領域等を別のRSVにおける対応遺伝子セグメントと置換し、新規の組換体、例えば別のRSVのエクトドメインに融合した一のRSVのサイトプラスマテール及び/又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現する組換体を供する。この観点における有用なゲノムセグメントはタンパク質の小機能ドメイン、例えばエピトープ部位をコードする遺伝子セグメントの場合における約15〜35ヌクレオチドから、大型のドメイン又はタンパク質領域をコードする遺伝子セグメントについての約50,75,100,200〜500及び500〜1,500又はそれより長いヌクレオチドに範囲する。一の態様において、一のRSV株又はサブグループのF及び/又はG防御性抗原を別の株又はサブグループのRSVクローンに置換し、免疫化宿主における株又はサブグループの双方に対する交差防御性免疫応答を刺激することのできる組換ウィルスを作り出す。更なる観点において、遺伝子又は遺伝子セグメントの改変を包括する突然変異、例えば置換された異種F及び/又はG遺伝子又は遺伝子セグメントを有するキメラRSVクローンを、生物学的に誘導されたRSV株、例えばcpts 248/404,cpts 530/1009又はcpts 530/1030から採用した1又は複数の弱毒ts又はcp点突然変異を導入することにより更に修飾する。
更なる別の観点において、ポリヌクレオチドをコードする又はコードしない1又は複数のヒトRSVをウシ又はネズミRSV由来の対応配列で、単独で又は1もしくは複数の選定cpもしくはts突然変異と組合せて置換し、新規の弱毒化ワクチン株を供する。一の態様において、キメラウシ−ヒトRSVはヒトRSV NP遺伝子又は遺伝子セグメントの対応のウシNP遺伝子又は遺伝子セグメントによる置換を含み、かかるキメラは任意的にSH,NP,NS1,NS2もしくはその他の遺伝子欠失、1もしくは複数のcpもしくはts点突然変異、又はこれら及び本明細書に開示のその他の突然変異の様々な組合せを含むように構築されていてよい。ヒトRSVコード配列(例えばNS1,NS2,NP等のため)又は非コード配列(例えばプロモーター、遺伝子末端、遺伝子開始、遺伝子間領域又はその他のcis作用性要素)の対応のウシ又はネズミRSV配列による置換は様々な可能な弱毒作用を有する弱毒化組換体を供する。例えば、宿主域効果は、他の有用な弱毒効果のうち、とりわけヒト細胞において効率的に機能しない異種RSV遺伝子により、異種配列もしくはタンパク質と生物学的に相互反応性であるヒトRSV配列もしくはタンパク質(例えば、ウィルス転写、翻訳、組立、等のために置換化配列又はタンパク質と通常協力し合う配列又はタンパク質)との非適合性により生じうる。
本発明の更なる別の観点において、外来遺伝子又は遺伝子セグメント、そしてある場合においては非コードヌクレオチド配列のRSVゲノムへの挿入は更に追加の所望の表現型効果を供するゲノム長の所望の増大をもたらす。増大したゲノム長はインサートの長さにある程度依存して、得られるRSVの弱毒化をもたらす。更に、組換RSVに挿入された遺伝子からの一定のタンパク質の発現はタンパク質の作用に基づきウィルスの弱毒化をもたらすであろう。これはワクシニアウィルスにおいて発現されるIL−2について発表されており(例えば、Flexnerら、Nature 33:259-62(1987))、そしてガンマーインターフェロンについても予測されるであろう。
本発明の組換RSVにおける完全ウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントの変化に関わる欠失、挿入、置換及びその他の突然変異は免疫抑制された個体の場合において特に重要である非常に安定なワクチン候補を供する。これらの突然変異の多くは得られるワクチン株の弱毒化をもたらし、一方その他は種々のタイプの所望の表現型変化を特定するであろう。例えば、宿主免疫力を特異的に妨害するタンパク質をコードする一定のウィルス遺伝子が知られている(例えば、Katoら、EMBO.J.16:578-87(1997)参照のこと;引用することで本明細書に組入れる)。ワクチンウィルスにおけるかかる遺伝子の除去はビルレント及び病原性を下げる並びに/又は免疫原性を高めるものと予測される。
本発明において更に提供するのは、例えば選定のコード配列内に終止コドンを導入することにより;遺伝子の位置を変える又は上流開始コドンを導入してその発現率を改変することにより;GS及び/又はGE転写シグナルを変えて表現型(例えば、増殖力、転写に対する温度制限、等)を改変することにより、RSVクローンから遺伝子又は遺伝子セグメントを除去することなく、選定の遺伝子又は遺伝子セグメントの発現を改変又は除去する組換RSVにおける遺伝子修飾である。これに関する好適な突然変異にはcis作用性シグナルに向けられた突然変異が含まれ、これは例えばRSVミニゲノムの突然変異分析により同定されうる。例えば、リーダー及びトレーラー並びに隣接配列の挿入及び欠失分析はウィルスプロモーター及び転写シグナルを同定し、そしてRNA複製又は転写の様々な度合いの低下に関わる一連の突然変異を提供する。このようなcis作用性シグナルの飽和突然変異誘発(これにより、各位置はヌクレオチド選択肢のそれぞれへと修飾される)はRNA複製又は転写が低下(又はある場合には増大)した数多くの突然変異をも同定する。任意のこのような突然変異を本明細書に記載の通りにして完全アンチゲノム又はゲノムの中に挿入できる。完全アンチゲノムcDNAを利用するtrans−作用性タンパク質及びcis−作用性RNA配列の評価及び取り扱いはRSVミニゲノムの利用により補助され(例えば、Grosfeldら、J.Virol.69:5677-5686(1995);引用することで本明細書に組入れる)、そのヘルパー依存性状況は複製独立感染性ウィルスにおいて回収されるには阻害性でありすぎる突然変異の特性決定において有用である。
本発明のRSVにおけるその他の突然変異はゲノムの3’末端のアンチゲノムに由来するその対応物による置換を包括し、それはRNA複製及び転写における変化に関わっている。更に、遺伝子間領域(Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4594-4598(1986);引用することで本明細書と組入れる)を短くするもしくは長くする、又は配列の内容を変えることができ、そして天然の遺伝子重複(Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5134-5138(1987);引用することで本明細書に組入れる)を本明細書に記載の方法により除去するか又は別の遺伝子間領域へと変えてよい。
一の典型的な態様において、特異的なRSVタンパク質、例えば防御性F及びG抗原の発現レベルはその天然配列を、合成的に作られ、そして効率的な翻訳と一致するようにデザインされたもので置換することにより高めることができる。これとの関連で、コドン用法は哺乳類ウィルスタンパク質の翻訳レベルにおける主要要因でありうることが示された(Haasら、Current Biol.6:315-324(1996))。主要防御性抗原であるRSVのF及びGタンパク質をコードするmRNAのコドン用法の調査はこの用法が劣った発現と一致することを示した。かくして、コドン用法は本発明の組換方法により選定遺伝子の向上した発現を達成するように改良されうる。
別の典型的な態様において、選定のRSV遺伝子の翻訳開始部位(好ましくは3位にヌクレオチドを含む)を囲む配列を、単独で、又は上流開始コドンの導入と組合せて、翻訳の上昇一又は下降調節を特定することによりRSV遺伝子発現を調節するよう修飾する。
他方、又は本明細書に開示のその他のRSV修飾と組合せて、RSV遺伝子発現はウィルスの選定遺伝子の転写GSシグナルを改変することにより調節できうる。一の典型的な態様において、NS2のGSシグナルを規定の突然変異(例えば下記の404(M2)突然変異)を含ませるように修飾してウィルス複製にts制限を付加させる。
本発明における更なる追加のRSVクローンは転写GEシグナルに対する修飾を含む。例えば、NS1及びNS2遺伝子のGEシグナルをN遺伝子のそれへと置換又は突然変異するRSVクローンを提供し、それは読過しmRNAのレベルを下げ、そして下流遺伝子からのタンパク質発現を増大させる。得られる組換ウィルスは増大した増殖速度及び増大したプラークサイズを示し、RSVゲノムにおけるcis作用性調節因子の修飾によるRSV増殖特性の改変の一例を担う。
別の典型的な態様において、Gタンパク質の発現はG mRNAの修飾により増大する。このGタンパク質は膜結合及び分泌形態の双方として発現され、後者の形態はG翻訳オープンリーディングフレーム内の開始部位での翻訳開始により発現される。この分泌形態は発現されたGタンパク質の半分ほどを占めうる。内部開始部位の除去(例えば、配列変更、欠失等)は、単独で、又は上流開始部位の配列内容の改変と共に、Gタンパク質発現における所望の変化を供する。Gの分泌形態の除去は典型的な組換RSVに対する宿主免疫応答の質をも改善し、なぜならGの可溶性形態は中和抗体を捕捉する「おとり」を担うと考えられるからである。また、可溶性Gタンパク質はTh2偏向応答のその優先的な刺激に基づき高まった免疫病原性に関わる。
別の態様において、RSV遺伝子発現のレベルは転写レベルにおいて改質される。一の観点において、RSV遺伝子地図における選定の遺伝子の位置はよりプロモーター近位又はプロモーター遠位の位置へと変えることができ、これにより当該遺伝子は効率が一層高く又は一層低くなって発現されるであろう。この観点に従うと、特異的な遺伝子の発現の調節が達成され、遺伝子の発現は野生型レベルと比べ2倍、より典型的には4倍から10倍以上にまで低下又は上昇する。一例において、このNS2遺伝子(RSV遺伝子地図において順序は2番目)をSH遺伝子(6番目)と位置交換し、NS2の発現の推定の低下が供される。位置変化による選定RSV遺伝子の増大した発現は10倍、30倍、50倍、又は100倍以上にまで達し、往々にして相反性の位置的に置換された遺伝子についての発現レベルにおけるつり合いのとれた低下が伴う。
その他の典型的な態様において、F及びG遺伝子を単独で又は一緒によりプロモーター近位もしくはプロモーター遠位の部位にまで(組換)RSV遺伝子地図内で移転させ、より高い又はより低い遺伝子発現レベルが達せられる。これら及びその他の移転変更は、例えばRNA複製に関与する選定のウィルスタンパク質の低まった発現に基づき弱毒化表現型を有する新規のRSVクローンを供する。
本発明のより詳細な観点において、ウィルス遺伝子、例えばNS2遺伝子の発現が、例えば翻訳オープンリーディングフレーム(ORF)への2つのタンデム翻訳終止コドンの導入により、当該遺伝子又はそのセグメントが欠失されることなく翻訳レベルにおいて除去された組換RSVを提供する。これは選定遺伝子が翻訳レベルにおいてサイレンス化され、その遺伝子が欠失していない生存ウィルスを供する。これら「ノックアウト」ウィルス形態は遅くなった増殖速度及び組織培養における小さいプラークサイズを示す。かくして、本発明の方法及び組成物は主要ウィルス防御抗原のいづれでもないウィルス遺伝子の発現の除去された更なる追加の新規のタイプのRSV弱毒突然変異を提供する。これに関連して、遺伝子又は遺伝子セグメントが欠失されずに製造された「ノックアウト」ウィルス表現型は、標的タンパク質の合成を復活せしめうる修正突然変異を効率的に排除するよう本明細書に記載の通りにして欠失突然変異誘発により択一的に製造されうる。RSVについてのいくつかのその他の「ノックアウト」を別のデザインを利用して設けることができる。例えば、ORFへの翻訳終止コドンの挿入、又はRNA校訂部位の中断は、選定遺伝子の発現のサイレンス化又は弱毒化の択一性を供する。これら及びその他のノックアウトを設けるための方法は当業界において公知である(例えば、Kretzschmarら、Virology 216:309-316(1996);Radeckeら、Virology 217:418-412(1996);及びKatoらEMBO J.16:178-587(1987);及びSchneiderら、Virology 277:314-322(1996)に記載;それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。
その他の態様において、ワクチン製剤において有用なRSVは循環ウィルスにおける抗原ドリフトに合うように簡単に修飾されうる。典型的には、この修飾はG及び/又はFタンパク質内であろう。GもしくはF遺伝子全体、又はその特定の免疫原性領域をコードするセグメントとRSVゲノム又はアンチゲノムcDNAの中に、感染性クローンにおける対応の領域の交換により、又は当該遺伝子の1もしくは複数のコピーをいくつかの抗原形態が示されるように付加することにより組込む。この修飾RSV cDNAから作った子孫ウィルスを次に出現株に対するワクチン化プロトコールに利用する。更に、遺伝子追加としてのRSVサブグループBのGタンパク質遺伝子の組込みはヒト集団に存在する比較的多彩なサブグループA及びB株の広いスペクトルをカバーするように応答を拡大するであろう。
本発明の感染性RSVクローンは本明細書に開示の方法及び組成物に従って、その免疫原性を高め、且つ野生型RSVもしくは不完全に弱毒化された親ウィルスもしくはクローンによる感染により供されるものよりも高いレベルの防御を誘導するように操作することができる。例えば、異種RSV株もしくはタイプ、又は非RSV起源、例えばPIV由来の免疫原性エピトープを、RSVゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列における適当なヌクレオチド変更により追加できうる。他方、組換RSVは所望されない免疫病原性反応に関わるエピトープを同定及び除去(例えば、アミノ酸挿入、置換又は欠失により)するように操作されうる。その他の態様において、追加の遺伝子を、転写シグナルの独立のセットのコントロール下にあるRSVゲノム又はアンチゲノムの中に又はその近くに挿入する。注目の遺伝子には、サイトカイン(例えばIL−2〜IL−15、特にIL−2,IL−6及びIL−12、等)、ガンマーインターフェロンをコードするもの、並びにTヘルパー細胞エピトープに富むタンパク質が挙げられる。追加のタンパク質は独立のタンパク質として、又はRSVタンパク質の一つ、例えばSHの第二コピーから操作したキメラとして発現されうる。これはRSVに対する免疫応答を定量的及び定性的に改質及び改善する能力を供する。
本発明の別の観点において、組換RSVはその他の呼吸気管病原体、例えばパラインフレンザウィルス(PIV)の防御抗原のためのベクターとして、例えばPIVに由来するかかる防御抗原をコードする配列を本明細書に記載の通りに感染性ワクチンウィルスを作り出すのに用いてRSVゲノム又はアンチゲノムに組込むことにより採用できうる。PIV cDNAのクローニング及びその他の開示は米国特許暫定特許出願、発明の名称PRODUCTION OF PARAINFLUENZA VIRUS FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES,1997年5月27日出願、出願番号60/047,575に記載され、それは引用することで本明細書に組入れる。別の態様において、RSVゲノム又はアンチゲノム配列及び少なくとも一のPIV配列、例えばRSV及びPIV1,PIV2,PIV3又はウシPIVの双方に由来する配列を含むポリヌクレオチドのキメラを含んで成る修飾RSVを提供する。例えば、RSVの個々の遺伝子はヒトPIV由来の対応の遺伝子、例えばPIV1,PIV2又はPIV3のHN及び/又はF糖タンパク質遺伝子と置換してよい。他方、選定の異種遺伝子セグメント、例えばHPIV1,HPIV2又はHPIV3のHN又はFのサイトプラスマテール、トランスメンブランドメイン又はエクトドメインは、例えばRSVクローンにおける同じ遺伝子における対応の遺伝子セグメントで、RSVクローン内の別の遺伝子内で、又はRSVゲノムもしくはアンチゲノムの非コード配列へと置換することができる。一の態様において、HPIV3のHN又はFに由来する遺伝子セグメントをRSVタイプAにおける対応の遺伝子セグメントで置換し、キメラタンパク質、例えばRSVのエクトドメインに融合したRSVのサイトプラスマテール及び/又はトランスメンブランドメインを有する融合タンパク質をコードする構築体にし、PIV及びRSVの双方に対する新規の弱毒化ウィルス及び/又は多価ワクチン免疫原を供する。
組換RSVに対する上記の修飾に加え、RSVクローンにおける別の又は追加の修飾、例えば様々な遺伝子間領域又はその他の箇所への固有制限部位(例えばGとF遺伝子間の固有StuI部位)の挿入を操作性の促進のために設けることができる。非翻訳遺伝子配列を外来配列の挿入のためのキャパシティーを高めるために除去できうる。
上記の規定の突然変異の感染性RSVクローンへの導入は様々な公知の方法により達成できうる。「感染性クローン」とは合成又はそうでないcDNA又はその生成物を意味し、それは感染性ウィルスのゲノム又はサブウィルス粒子を供するよう鋳型を担うことのできるゲノム又はアンチゲノムRNAへと転写される。かくして、規定の突然変異は慣用の技術(例えば部位特異的突然変異誘発)によりゲノム又はアンチゲノムのcDNAコピーへと導入できうる。本明細書に記載の通りに完全アンチゲノム又はゲノムcDNAを組立てるためのアンチゲノム又はゲノムcDNAサブフラグメントの利用は各領域を別々に操作でき(小さめのcDNAは大きめのものよりも操作し易い)、そして完全DNAへと容易に組立てることができるという利点を有する。かくして、この完全アンチゲノムもしくはゲノムDNA、又はその任意のサブフラグメントはオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発のための鋳型として利用できうる。これは一本鎖ファージミド形態の中間体を介し、例えばBio−Rad Laboratories(Richmond,CA)のMuta−gene(登録商標)キットを利用し、又は鋳型として二本鎖プラスミドを直接利用する方法、例えばStratagene(La Jolla,CA)のChameleon突然変異誘発キットを用いて、又は注目の突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーもしくは鋳型のいづれかを利用するポリメラーゼ連鎖反応により成し遂げられうる。次に突然変異させたサブフラグメントを完全アンチゲノム又はゲノムcDNAへと組立てることができる。様々なその他の突然変異誘発技術が公知であり、そしてRSVアンチゲノムもしくはゲノムcDNAにおいて注目の突然変異を設けるうえで利用するのに有用である。突然変異は単一のヌクレオチド変化から、1もしくは複数の遺伝子もしくはゲノム領域を含む大型cDNA断片の変換に至るまで様々でありうる。
かくして、一の例示的な態様において、突然変異はBio−Radから入手できるミューター遺伝子ファージミドin vitro突然変異誘発キットを利用して導入する。簡単には、RSVゲノム又はアンチゲノムの一部をコードするcDNAをプラスミドpTZ18Uの中にクローニングし、そしてCJ236細胞(Life Technologies)を形質転換するのに用いる。ファージミド調製品は製造者の推漿に従って調製される。オリゴヌクレオチドはゲノム又はアンチゲノムの所望の位置での改変ヌクレオチドの導入により突然変異誘発のためにデザインする。遺伝子的に改変されたゲノム又はアンチゲノムフラグメントを含むプラスミドを次に増幅させ、そして突然変異させた断片を全長ゲノム又はアンチゲノムクローンの中に再導入する。
規定の突然変異を感染性RSVに導入する能力はRSVの分子生物学及び病原学的分析を含む幾多の用途を有する。例えば、NS1,NS2,SH,M2(ORF1)及びM2(ORF2)タンパク質を含むRSVタンパク質の機能は、その発現レベルを除去もしくは低下させる、又は突然変異タンパク質を供する突然変異の導入により調査及び操作されうる。下記の一の具体例において、ウィルス遺伝子、即ちSH遺伝子の発現がmRNAコード配列及び隣接転写シグナルの欠失により除去されているRSVウィルスを構築する。驚くべきことに、このウィルスは回収できるだけでなく、組織培養においてそれは効率的に増殖する。事実、その増殖力は、感染性ウィルスの収率及びプラークサイズの双方に基づき、野生型のそれよりも実質的に増強していた。SH欠失及び本発明のその他のRSV誘導体に由来する組織培養物におけるこの向上した増殖力はRSVワクチンを開発するための有用な手段を提供し、それはその他の系におけるワクチンウィルスの製造を複雑にする組織培養におけるRSVの劣った収率の問題を解決する。この欠失は遺伝子復帰に対して非常に安定であり、それに由来するRSVクローンをワクチン剤として極めて有用なものにする。
本発明は更に1又は複数の単離されたポリヌクレオチド、例えば1又は複数のcDNAから感染性RSVを製造するための方法を提供する。本発明に従うと、RSVゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAを必須のウィルスタンパク質との細胞内又はin vitro同時発現のために構築し、感染性RSVを形成する。「RSVアンチゲノム」とは子孫RSVゲノムの合成のための鋳型を担う単離されたポジティブセンスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、複製式中間体RNAに対応するRSVゲノムのポジティブセンスバージョン又はアンチゲノムであるcDNAを構築し、転写複製式ヌクレオカプシドを作製するのに必要なタンパク質をコードする相補性配列、即ち、N,P,L及びM2(ORF1)タンパク質をコードする配列のポジティブセンス転写体とのハイブリダイゼーションの可能性を最少限にする。RSVミニゲノム系において、ゲノム及びアンチゲノムはRSVにより又はプラスミドにより相補されようと関係なく釣り出しにおいて同等に活性であり、ゲノム又はアンチゲノムのいづれも利用でき、それ故その選択は方法論又はその他の基準に基づいてできることが示唆される。
天然RSVゲノムは典型的にはネガティブセンスポリヌクレオチド分子を含んで成り、それは相補性ウィルスRNAを介して、11種のウィルスタンパク質、即ち、非構造種NS1及びNS2,N,P、マトリックス(M)、小疎水性体(SH)、糖タンパク質(G)、融合体(F)、M2(ORF1)、M2(ORF2)、及びLをコードする。実質的には、Minkら、Virology 185:615-624(1991),StecらVirology 183:273-287(1991)及びConnorsら、Virol.208:478-484(1995)に記載されている(これらは引用することで本明細書に組入れる)。本発明の目的のため、本発明の組換RSVのゲノム又はアンチゲノムはそれによりコードされるウィルス又はサブウィルス粒子が感染性となるのに必要な遺伝子又はその一部のみを含めばよい。更に、当該遺伝子又はその一部には複数のポリヌクレオチド分子、即ち、別のヌクレオチド分子に由来する相補性等により供されうる遺伝子が施されていてよい。
組換RSVとは組換発現系から直接もしくは間接的に誘導されたRSVもしくはRSV様ウィルスもしくはサブウィルス粒子、又はそれらより生成されたウィルスもしくはサブウィルス粒子から増幅させたものを意味する。当該組換発現系はRSV遺伝子発現において調節的役割を有する少なくとも一の遺伝子要素、例えばプロモーター、RSV mRNAへと転写される構造又はコード配列、並びに適当な転写開始及び終止配列を含んで成る作用可能式に連結された転写ユニットを含んで成る組換発現ベクターを採用するであろう。
cDNA発現されたゲノム又はアンチゲノムから感染性RSVを作り出すため、このゲノム又はアンチゲノムを(i)RNA複製できるヌクレオカプシドを作る;並びに(ii)RNA複製及び転写の双方のために子孫ヌクレオカプシドをコンピテントにする;のに必要なRSVタンパク質と一緒に発現させる。このゲノムヌクレオカプシドによる転写はその他のRSVタンパク質を供し、そして大量の感染を開始せしめる。他方、大量感染のために必要な追加のRSVタンパク質を同時発現により供給することができる。
RSVアンチゲノムは本発明において利用するために、例えば完全アンチゲノムを凝集するうえで代表されるクローニングされたcDNAセグメントを組立てることにより、RSV mRNA又はゲノムRNAの逆転写コピーのポリメラーゼ連鎖反応により(PCR;例えば米国特許第4,683,195及び4,683,202号、並びにPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Innisら編、Academic Press,San Diego(1990);引用することで本明細書に組入れる)構築されうる。例えば、アンチゲノムの左端を含み、適当なプロモーター(例えばT7 RNAポリメラーゼプロモーター)及びSH遺伝子に相補性のリーダー領域に広がるcDNAを適当な発現ベクター、例えばプラスミド(例えばpBR322)又は様々な有用なコスミド、ファージもしくはDNAウィルスベクターにおいて組立てる。このベクターは組立てを促進するようにデザインされた突然変異誘発及び/又は固有制限部位を含む合成ポリリンカーの挿入により修飾してよい。例えば、本明細書に記載のプラスミドベクターはpBR322から、PstI−EcoRIフラグメントの慣用の制限酵素部位を含む合成DNAによる交換により誘導される。ベクターとしてのpBR322の利用は本来ヌクレオチド欠失又は挿入を受けるRSV配列のヌクレオチド3716−3732を安定化させ、そしてこのプラスミドの増殖はnt 4499付近に本来起こる人工重複及び挿入を避けるために細菌株DH10Bの中で行った。調製のし易さのため、G,F及びM2遺伝子を、L及びトレーラー配列ができるように、独立のベクターの中で組立てることができる。アンチゲノムプラスミドの右端(例えばL及びトレーラー配列)は所望の追加の配列、例えば隣接リボザイム及びタンデムT7転写ターミネーターを含みうる。当該リボザイムは単一非ウィルスヌクレオチドを含む3’末端を供するであろうハンマーヘッドタイプ(例えば、Grosfeldら、J.Virol.69:5677-5686(1995))であるか、又は3’末端から非RSVヌクレオチドを消失させるであろう肝炎デルタウィルスのそれの如き任意のその他の適当なリボザイム(Perrottaら、Nature 350:434-436(1991))であってよい。中央セグメント(例えばG乃至M2断片)をリーダー乃至SHプラスミドの適当な制限部位に挿入し、これによりそれはL−トレーラー−リボザイム−ターミネーター断片のための受容体となり、完全アンチゲノムを供する。本明細書に記載の具体例において、当該リーダー先端は、至適活性のために3つの転写G残基を含むT7 RNAポリメラーゼのプロモーターに接するように構築した。転写は3つの非ウィルスG’をアンチゲノムの5’末端に付与する。これら3つの非ウィルスG残基を排除して非ウィルスヌクレオチドのない5’末端を供することができる。ほぼ正確な3’末端を作るため、ハンマーヘッドリボザイムに隣接するようにトレーラー先端を構築し、それは切断により単一の3’リン酸化U残基をコードされるRNAの3’末端に付与する。
本発明の一定の態様において、転写式複製RSVヌクレオカプシドを作り上げるのに必要なタンパク質をコードする相補性配列を1又は複数のヘルパーウィルスにより供する。かかるヘルパーウィルスは野生型又は突然変異であってよい。好ましくは、かかるヘルパーウィルスはRSV cDNAによりコードされるウィルスから表現型で区別されうる。例えば、当該ヘルパーウィルスとは免疫学的に反応し、RSV cDNAによりコードされるウィルスとは反応しないモノクローナル抗体を提供することが所望される。かかる抗体は中和抗体であってよい。ある態様において、当該抗体はヘルパーウィルスを組換ウィルスから分離するためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて利用できうる。かかる抗体の獲得を補助するため、RSV cDNAの中に突然変異を導入してHN又はF糖タンパク質遺伝子におけるようにヘルパーウィルスからの抗原多彩性を供することができる。
様々なヌクレオチド挿入及び欠失をRSVゲノム又はアンチゲノムの中に施してよい。野生型ヒトRSVのゲノムのヌクレオチド長(15,222ヌクレオチド)は6の倍数であり、そしてパラミクソウィルス及びモービリウィルス(Morbillivirus)属は典型的には「6の法則」を遵守し、即ち、ゲノム(又はミニゲノム)はそのヌクレオチド長が6の倍数であるときにのみ効率的に複製する(エンカプシデートNPタンパク質に対するヌクレオチド残基の正確な配置のために必要と考えられる)。単一の残基の増加によるRSVゲノム長の変化は複製効率に対して何ら効果を及ぼさず、そして継代を経たいくつかの異なるミニゲノム突然変異体の分析は長さの相違がつり合い変化なく維持されることを示した。かくして、RSVは6の倍数であるゲノム長の厳格な要件を欠き、そしてヌクレオチド挿入及び欠失は本発明の組換RSVの複製を損うことなくRSVゲノム又はアンチゲノムの中で施すことができる。
当該ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAを構築するための別の手段にはサブユニットcDNA成分の数を1又は2の断片数ほどの少なさへと減らす改良PCR条件を利用する逆転写−PCRによるものが含まれる(例えば、Chengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5695-5699(1994);SamalらJ.Virol 70:5075-5082(1996)に記載;引用することで本明細書に組入れる)。その他の態様において、種々のプロモーター(例えばT3,SP6)又は種々のリボザイム(例えば、肝炎デルタウィルスのそれ)が利用されうる。種々のDNAベクター(例えばコスミド)がより大型のサイズのゲノム又はアンチゲノムによく合うように増殖のために利用できうる。
RNA複製のために必要なN,P及びLタンパク質はプロセッシブ転写のためにM2(ORF1)タンパク質の如きRNAポリメラーゼ伸長因子を必要とする。かくして、ネガティブ鎖RNAウィルスのためのM2(ORF1)又は実質的に同等の転写伸長因子が感染性RSVの製造のために必要であり、そして大量感染の際の機能性ヌクレオカプシドの必須成分である。M2(ORF1)タンパク質についてのニーズは転写伸長因子としてのその役割と一致する。ネガティブ鎖mRNAのためのRNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質の発現についてのニーズは本発明の特徴である。M2(ORF1)は完全M2遺伝子の発現により供給されるが、この形態においては第二のORF2も発現され、そしてRNA複製に対して阻害効果を有する。従って、完全M2遺伝子を利用する感染性ウィルスの製造のため、2つのORFの活性は、転写伸長活性を供するようM(ORF1)の十分な発現を可能にし、且つRNA複製を阻害するためにM(ORF2)は十分に発現されないようバランスをとるべきである。他方、ORF1タンパク質はORF2を欠くように又は欠陥ORF2をコードするように操作されたcDNAが供される。ウィルス生産の効率は追加のウィルスタンパク質遺伝子、例えばエンベロープ構成成分をコードするもの(即ち、SH,M,G,Fタンパク質)の同時発現によっても向上しうる。
当該ゲノム又はアンチゲノム、そして別々にN,P,L及びM2(ORF1)タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド(例えばcDNA)をトランスフェクション、エレクトロポレーション、機械式挿入、形質導入、等により大量RSV感染を支持することのできる細胞、例えばHEp−2、ERhL−DBS2,MRC及びVero細胞に挿入する。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは培養細胞の中に、例えばリン酸カルシウム媒介トランスフェクション(Wiglerら、Cell 14:725(1978);Corsaro and Van der Eb,Virology 52:456(1973))、エレクトロポレーション(Neumannら、EMBO J.1:841-845(1982))、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション(Ausubelら(編)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY(1987))、カチオン性媒介トランスフェクション(Hawley-Nelsonら、Focus 15:73-79(1993))、又は市販のトランスフェクション試薬、例えばLipofect ACE(登録商標)(Life Technologies)により導入できる(上記文献はそれぞれ引用することで本明細書に組入れる)。
N,P,L及びM2(ORF1)タンパク質はゲノム又はアンチゲノムをコードするものと同一又は異なる1又は複数のベクター及びその様々な組合せによりコードされる。それ自体ベクター又はN,P,LもしくはM2(ORF1)タンパク質をコードするベクター、又は完全ゲノムもしくはアンチゲノムによりコードされる追加のタンパク質を含ませてよい。ゲノム又はアンチゲノムの発現及びトランスフェクションプラスミド由来のタンパク質は、例えば各cDNAをT7 RNAポリメラーゼのプロモーターのコントロール下に置くことにより達成され、それはT7 RNAポリメラーゼの発現系、例えばT7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスMVA株組換体(Wyattら、Virology 210:202-205(1995):引用することで本明細書に組入れる)による感染、トランスフェクション又は形質導入により供給される。当該ウィルスタンパク質及び/又はT7 RNAポリメラーゼは形質転換哺乳類細胞から、又は事前形成mRNAもしくはタンパク質のトランスフェクションによっても供与されうる。
他方、アンチゲノム又はゲノムの合成はin vitro(無細胞)で、併合転写−翻訳反応、それを次ぐ細胞へのトランスフェクションにより行われうる。又は、アンチゲノムもしくはゲノムRNAをin vitroで合成し、そしてRSVタンパク質を発現する細胞の中にトランスフェクションしてよい。
ここで提供する生物学的に誘導されたRSV株及び組換RSV株の宿主から候補ワクチンウィルスを選択するため、生存力、弱毒化及び免疫原性の基準を周知の方法に従って決定する。本発明のワクチンにおいて最も所望されるであろうウィルスは生存力を維持し、安定な弱毒表現型を有し、免疫宿主において複製を示し(たとえ低レベルでも)、そして野生型ウィルスからのその後の感染により引き起こされる重篤な病気に対する防御を供するのに十分なワクチン接種者における免疫応答の供与を効率的に誘導するものでなくてはならない。明らかに、今までに知られ且つ報告されているRSウィルス突然変異体はこのような基準の全てを満たしていない。事実、公知の弱毒化ウィルスについて報告されている結果に基づく予測に反して、本発明のウィルスは従来の突然変異体よりも生存性であり、且つ一層弱毒化されているだけでなく、従来研究されてきた突然変異体よりもin vivoで遺伝的に安定であり、防御性免疫応答を刺激する能力を保持し、そしてある状況においては多重修飾により供される防御を拡大する。例えば、種々のウィルス株もしくはサブグループに対する防御、又は種々の免疫学的基礎、例えば分泌性、対、血清性イムノグロブリン、細胞性免疫力、等による防御を誘導する。本発明がなされる前はin vivo複製を経たts表現型の遺伝子的不安定さはtsウィルスにとって当然であった(Murphyら、Infect.Immum.37:235-242(1982))。
ワクチン用途及びその他の目的のためのRSVウィルスの増殖のため、RSV増殖を可能にするいくつかの細胞系を利用できうる。RSVは様々なヒト及び動物細胞において増殖する。ワクチン用途のための弱毒化RSウィルスを増殖するために好適な細胞系にはDBS−FRhL−2,MRC−5及びVero細胞が含まれる。最高のウィルス収率は通常上皮細胞系、例えばVero細胞で成し遂げられる。細胞に典型的には約0.001〜1.0又はそれ以上の感染多重度でウィルスを接種し、そしてウィルスの複製を許容する条件、例えば約30〜37℃で約3〜5日間、又は適切な力価が達成されるようウィルスに必要な長さにわたり培養する。細胞培養物からウィルスを除去し、そして細胞成分から典型的には周知の浄化手順、例えば遠心分離により分離し、そして当業者に周知の手順を利用して所望通りに更に精製してよい。
本明細書に記載の通りに弱毒化されたRSVは様々な周知、且つ一般に受け入れられているin vitro及びin vivoモデルにおいて試験し、適切な弱毒化、表現型復帰に対する抵抗、及びワクチン用途のための免疫原性について試験できうる。in vitroアッセイにおいて、修飾ウィルス(例えば多重に弱毒化された生物学的に誘導されたRSV又は組換RSV)をウィルス複製の温度感受性、即ちts表現型及び小プラーク表現型について試験する。修飾ウィルスはRSV感染の動物モデルにおいて更に試験する。様々な動物モデルが発表され、そして引用することで本明細書に組入れるMeignierら、編Animal Models of Respiratory Syncytial Virus Infection,Merieux Foundation Publication(1991)にまとめられている。RS感染のコットンラットモデルは米国特許第4,800,078号及びPrinceらVirus Res 3:193-206(1985)に記載され(それらは引用することで本明細書に組入れる)、そしてヒトにおける弱毒化及び効能を示唆するものと信じられている。チンパンジーを利用するRSV感染症の霊長類モデルはヒトにおける弱毒化及び効能の示唆であり、そしてRichardsonらJ.Med.Virol.3:91-100(1978);WrightらInfect.Immun.37:397-400(1982);CroweらVaccine 11:1395-1404(1993)に詳細に記載されている。それらは引用することで本明細書に組入れる。
RSV候補の弱毒化レベルに関するげっ歯類とチンパンジーとに由来するデーターの相互関係は図1を参照することにより実証され、それはマウスの肺における呼吸シンシチウムサブグループAウィルスのスペクトルの複製とチンパンジーにおけるその複製とを相関させたグラフである。wtRSVのそれと比較した複製の相対レベルは実質的に同一であり、マウスがワクチンRSV候補の弱毒化レベルをまず特性決定するためのモデルを担うこととなる。マウス及びコットンラットモデルは候補RSウィルスがチンパンジーにおいて不適当な増殖を示す状況において極めて有用である。このRSVサブグループBウィルスはチンパンジーにおいてあまり増殖しないRSウィルスの例である。
更に、感染したコットンラットにおけるRSV中和抗体の治療効果はRSVで感染したサル及びヒトの免疫療法によるその後の実験に非常に相関することが示された。事実、コットンラットはRSV中和抗体による免疫療法に対する感染したサル、チンパンジー及びヒトの応答のための信頼できる実験的代替物であることが認められた。例えば、処置動物の血清中のかかる抗体のレベルにより測定されるコットンラットにおける治療効果に関わるRSV中和抗体の量(即ち、1:302〜1:518の血清RSV中和力価)はサル(即ち、1:539の力価)又はヒト幼児もしくは子供(即ち、1:877)について実証されたものと同じ範囲にある。コットンラットにおける治療効果は肺におけるウィルス効果における数百分の一以上の低下により実証され(Princeら、J.Virol.61:1851-1854)、一方サルにおいては治療効果は肺ウィルス力価の50分の1の低下と観察された(Hemmingら、J.Infect.Dis.152:1083-1087(1985))。最後に、重篤な細気管支炎又は肺のために入院した幼児及び子供における治療効果は処置したグループにおける酸素付加の著しい上昇及び処置した患者の上方呼吸気管から回収可能なRSVの量の著しい低下により証明された。(Hemmingら、Antimicrob.Agents Chemother.31:1882-1886(1987))。従って、これらの研究に基づき、コットンラットは幼児及び小児におけるRSVワクチンの効果を推定するための関連モデルを構成する。マウスを含むその他のげっ歯類も同様に有用であり、なぜならこれらの動物はRSV複製を可能にし、そしてヒトのそれにより近いコア(core)温度を有するからである(Wrightら、J.Infect.Dis.122:501-512(1970)及びAndersonら、J.Gen.Virol.71:(1990))。
上記の説明に従い、且つ下記の実施例に基づくと、本発明はワクチン用途のための単離された感染性RSV組成物も提供する。ワクチンの成分である弱毒化ウィルスは単離され、且つ典型的には純粋な形態にある。単離されたとは野生型ウィルスの天然環境、例えば感染個体の鼻咽頭以外におけるRSVを意味する。更に一般的には、単離されたとは細胞培養物又はその他の人工媒質の成分としての弱毒化ウィルスを含むことを意味する。例えば、本発明の弱毒化RSVは感染された細胞培養物により産生され、この細胞培養物から分離され、そして天然でないRSウィルス、例えばF−タンパク質に対する中和モノクローナル抗体に対する抵抗により弱毒すべきと選定されたものを含む安定剤に加える。
本発明のRSVワクチンは活性成分として本明細書に記載の通りに製造された免疫学的に有効な量のRSVを含む。生物学的に誘導されたRSV又は組換RSVはワクチン製剤に直接利用するか、又は凍結乾燥してよい。凍結乾燥ウィルスは典型的には約4℃で維持されるであろう。用意が整ったら、凍結乾燥ウィルスを安定化溶液、例えば食塩水、又はSPG,Mg++及びHEPESを含んで成る溶液の中に、アジュバントを伴って又は伴わないで、更に下記に説明する通りに再構築する。この生物学的に誘導された又は組換式に修飾されたウィルスは宿主、生物学的に許容される担体及び/又はアジュバントと一緒に導入してよい。有用な担体は当業界において周知であり、そして例えば水、緩衝水、0.4%の食塩水、0.3%のグリシン、ヒアルロン酸等を含む。得られる水性溶液をそのまま使用されるように包装するか、又は凍結乾燥し、その凍結乾燥調製品を、前述の通り、投与の前に無菌溶液と混合する。当該組成物は生物学的条件に近づけるのに必要とされる薬理学的に許容される助剤、例えばpH調整及び緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等を含みうる。許容されるアジュバントには不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又はみょうばんが含まれ、それらは当業界において周知の材料である。好適なアジュバントにはStimulon(商標)QS−21(Aquila Biopharmaceuticals,Inc.,Worchester,MA)、MPL(商標)(3−O−脱アセチル化モノホスホリル脂質A;RIBI Immuno Chem Research,Inc.,Hamilton,MT)及びインターロイキン−12(Genetics Institute,Cambridge,MA)も含む。
本明細書に記載の通りにRSVワクチン組成物によりエアロゾール、液滴、経口、局所又はその他のルートを介して免疫したら、宿主の免疫系はRSVウィルスタンパク質、例えばF及びG糖タンパク質に特異的な抗体を産生することにより当該ワクチンに応答する。ワクチン化の結果として、この宿主はRSV感染症に対して少なくとも部分的もしくは完璧に免疫されるか、又は中程度もしくは重篤なRSV障害、特に下方呼吸気管の障害の発症に対して抵抗性となる。
ワクチンを投与する宿主はRSV又は非常に近縁のウィルスに対して感受性であり、且つワクチン用株の抗原に対する防御性免疫応答を構築できる任意の哺乳動物であってよい。即ち、適当な宿主にはヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、げっ歯類、等が含まれる。従って、本発明は様々なヒト及び脊椎動物用のワクチンを構築するための方法を提供する。
本発明の弱毒化RSVを含むワクチン組成物はRSウィルス感染症にかかり易い又はその危険性のある患者に、RSVに対する個体の免疫応答能力を誘導する又は高めるのに十分な「免疫学的に有効な量」において投与する。ヒト被検体の場合、本発明の弱毒化ウィルスは例えば引用することで本明細書に組入れるWrightらInfect.Immun.37:397-400(1982),KimらPediatrics 52:56-63(1973)及びWrightらJ.Pediatr.88:931-936(1976)に記載のよく確立されたヒトRSVワクチンプロトコールに従って投与する。簡単には、成人又は子供に、典型的には0.5mlの容量中の生理学的に許容される希釈剤又は担体中の免疫学的に有効な量のRSVワクチンを液滴を介して鼻口内接種する。これは非複製式ワクチンによる非経腸的免疫と比べて簡単、且つ安全な利点を有する。またこれは局所呼吸気管免疫の直接的な刺激を供し、それはRSVに対する抵抗において主要な役割を果たす。更に、このワクチン化モードは非常に若い者において典型的に認められるRSV特異的母体由来血清抗体の免疫抑制効果を回避する。また、RSV抗原の非経腸的投与は時折り免疫病理学的合併症を伴うことがあるが、これは生きたウィルスで観察されることがない。
全ての被検体において、投与するRSVワクチンの正確な量並びに投与の時期及び反復は被検体の健康状態及び体重、投与モード、製剤の種類、等に基づき決定されるであろう。用量は一般に患者当り約103〜約106プラーク形成単位(PFU)又はそれ以上のウィルスに範囲し、より一般的には患者当り約104〜105PFUのウィルスとする。いづれにせよ、当該ワクチン製剤は、例えばとりわけ他の方法のうちで補体固定、プラーク中和、及び/又は酵素連結免疫収着アッセイによる決定に従い、抗RSV免疫応答を効率的に刺激又は誘導するのに十分な量の本発明の弱毒化RSVを供与すべきである。これに関連して、個体は更に上方呼吸障害の徴候又は症状についてモニターする。チンパンジーへの投与のように、当該ワクチンの弱毒化ウィルスはワクチン受容者の鼻咽頭内で野生型ウィルスの約10分の1以下のレベルで、又は不完全に弱毒化されたウィルスのレベルと比べて約10分の1以下のレベルで増殖する。
新生児及び幼児において、複数回の投与が十分なレベルの免疫力を誘引するのに必要でありうる。投与は生後1ヶ月以内で始め、そして幼児期において間隔を置いて、例えば2ヶ月、6ヶ月、1年及び2年目において、天然(野生型)RSV感染症に対する十分な防御レベルを維持するのに必要なだけ行うべきである。同様に、反復もしくは重篤な感染症に極めてかかり易い成人、例えば看護人、託児所従業者、小児の家族の構成員、高齢者、心肺機能の損われた個体は、防御性免疫応答を樹立及び/又は維持するために複数回の免疫を必要としうる。誘導免疫レベルは中和分泌抗体及び血清抗体の量を測定することによりモニターでき、そして用量を調整するか又は所望の防御レベルを維持するのに必要なだけワクチンを繰り返す。更に、別の受容グループへの投与のために別のワクチンウィルスを処方することがある。例えば、サイトカイン又はその他のT細胞エピトープに富むタンパク質を発現する操作したRSV株が、幼児よりも成人にとって極めて好都合でありうる。本発明に従って製造したRSVワクチンは多重RSVサブグループもしくは株に対する防御を達成するためにその他のRSVサブグループもしくは株のウィルスと組合せてよく、又は例えばこのような株の防御性エピトープをコードする選定の遺伝子セグメントを本明細書に記載の通りにして一のRSVクローンへと操作することができる。典型的には、様々なウィルスを混合して同時に投与してよいが、別々に投与してもよい。例えば、2種類のRSVサブグループのF糖タンパク質はアミノ酸配列において11%しか相違しないため、この類似性はRSV又はF抗原で免疫化され、そして異種の株の負荷された動物において観察されるような交差防御免疫応答の基礎となる。即ち、一つの株による免疫は同じ又は別のサブグループの別の株に対して防御しうる。
本発明のワクチンは、個体が後に野生型RSVで感染されたとき、重篤な下方呼吸気管障害、例えば肺炎及び細気管支炎に対する防御である免疫応答の供与を誘導する。天然の循環ウィルスは特に上方呼吸気管において感染症を引き起こすことができ続けるが、ワクチン化及び可能としては野生型ウィルスによるその後の感染を介する抵抗の強化の結果としての鼻炎の可能性は著しく低まる。ワクチン化後、相同性(同じグループの)野生型ウィルスをin vitro及びin vivoで中和することのできる宿主誘導型血清及び分泌抗体の検出可能なレベルがある。多くの場合、宿主抗体は別の非ワクチンサブグループの野生型ウィルスも中和するであろう。
本発明の弱毒化RSウィルスはヒトにおいて自然に循環している野生型ウィルスと比べたときに非常に著しいビルレンスの低下を示す。この弱毒化ウィルスは感染症の症状がほとんどの免疫個体において生じないである程十分に弱毒化されている。ある状況においてはこの弱毒化ウィルスはワクチン化されていない個体に付与することさえもできうる。しかしながら、そのビルレンスはワクチン化又は偶発的な宿主における重篤な下方呼吸気管感染症が生じない程に十分に消失している。
ワクチンウィルスの弱毒化レベルは例えば免疫宿主の呼吸気管の中に存在するウィルスの量を定量し、そして野生型ウィルス又はその他候補ワクチン株として評価された弱毒化RSウィルスにより産生される量と比較することにより決定されうる。例えば、本発明の弱毒化ウィルスは、野生型ウィルスの複製レベルと比べ、高度に感受性である宿主、例えばチンパンジーの上方呼吸気管において、例えば10〜1000分の1の著しい複製制限の度合いを有するであろう。また、チンパンジーの上方呼吸気管における弱毒化RSVワクチン株の複製レベルは、血清陰性ヒト幼児において不完全に弱毒化されていることが事前に実証されたRSV A2 ts−1突然変異体のそれよりも低いであろう。上方呼吸気管におけるウィルスの複製に関係する鼻炎の発症を更に抑制するため、理想的なワクチン候補ウィルスは上方及び下方呼吸気管の双方において制限された複製レベルを示すであろう。しかしながら、本発明の弱毒化ウィルスはワクチン化個体に防御を授けるようヒトにおいて十分に感染性且つ免疫原性でなくてはならない。感染宿主の鼻咽頭におけるRSVウィルスのレベルを決定するための方法は論文において周知である。検体を鼻咽頭分泌物の吸引又は洗い流しにより入手し、そして実験室手順によりウィルスを組織培養物又はその他において定量する。例えば、Belsheら、J.Med.Virology 1:157-162(1977);Friedeweldら、J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968);GharpueらJ.Virol.3:414-421(1969);及びWrightらArch.Ges.Virusforsch.41:238-247(1973)を参照のこと。このウィルスはチンパンジーの如き宿主動物の鼻咽頭において簡単に測定されうる。
ある状況においては、本発明のRSVワクチンをその他の因子、特にその他の小児ウィルスに対する防御応答を誘導するワクチンと組合せるのが所望されうる。例えば、本発明のRSVワクチンは、例えば引用することで本明細書に組入れるClementsらJ.Clin.Microbiol.29:1175-1182(1991)に記載のパラインフレンザウィルスワクチンと同時に投与してよい。本発明の別の観点において、RSVはその他の呼吸気管病原体、例えばパラインフレンザの防御抗原のためのベクターとして、かかる防御抗原をコードする配列を、本明細書記載の通りに感染性RSVを製造するのに用いるRSVゲノム又はアンチゲノムに組込むことにより、採用することができる。
本発明の更なる別の観点において、呼吸気管の一過性遺伝子治療のためのベクターとして組換RSVを利用する。この態様に従うと、当該組換RSVゲノム又はアンチゲノムは注目の遺伝子生成物をコードすることのできる配列を含む。注目の遺伝子生成物はRSV発現をコントロールするものと同一又は異なるプロモーターのコントロール下にある。組換RSVゲノム又はアンチゲノムとN,P,L及びM2(ORF1)タンパク質との同時発現により作られ、且つ注目の遺伝子生成物をコードする配列を含む感染性RSVを患者に投与する。投与は典型的にはエアゾール、ニュブライザー、又はその他の処置すべき患者の呼吸気管への局所適用による。組換RSVを治療的又は予防的レベルの所望の遺伝子生成物の発現をもたらすのに十分な量で投与する。この方法で投与する代表的な遺伝子生成物の例には一過性発現に極めて適切なもの、例えばインターロイキン−2、インターロイキン−4、ガンマーインターフェロン、GM−CSF,G−CSF、エリトロポイエチン、並びにその他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維症トランスメンブラン伝達調節因子(CFTR)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒素、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスRNA及びワクチン抗原をコードするものが含まれる。
以下の実施例は例示であり、限定ではない。
実施例I
低温継代RSVの突然変異誘導体の単離及び特性決定
本例は一層高度に弱毒化され、それ故RSVワクチン製剤における使用に好適である誘導体ts及びsp突然変異体を製造するための不完全弱毒化宿主域制限cpRSVの化学突然変異誘発を述べる。
低温継代RSV(cpRSV)の親ストックを調製した。ヒトにおいて不完全に弱毒化されたcpRSV親ウィルスであるFlow Laboratories Lot 3131ウィルスをMRC−5細胞の中で25℃で2回継代し、MRC−5細胞の中で25℃で2回最終的に希釈し、次いでMRC−5の中で3回継代して突然変異誘発のためのcpRSV懸濁物を構築した。
cpRSVをMRC−5細胞の中で親ストックを32℃において培地中の4×10-4Mの濃度の5−フルオロウラシルの存在下で増殖させることにより突然変異誘発させた。この濃度は5−フルオロウラシル抜きの培地と比べ、細胞培養物中での5日間の増殖に基づきウィルス力価の100分の1の低下により実証される通り、事前研究において最高であると実証された。次にこの突然変異誘発ストックをアガー上層のもとに維持したVero細胞に基づくプラークアッセイにより分析し、そして適当なインキュベーション期間の後、拾い、そして各プラークの子孫をVero細胞の新鮮な単層上での増殖により別に増幅させた。cpRSV突然変異ウィルスの単一プラークの子孫を接種した各組織培養物の内容物を、Vero細胞に対する細胞病理性効果が最大であるときに改めて回収した。温度感受性(ts)又は小プラーク(sp)表現型を示す子孫ウィルスを、これらのプラークプールをHEp−2細胞で32℃及び38℃にて力価検定することにより調べた。sp表現型(32℃にて親ウィルスと比べ50%以上縮小したプラークサイズ)又はts表現型(32℃と比べ制限温度(37〜40℃)にて100分の1以上の力価の減少)を示す任意のウィルスを更に評価した。これらの株をVero細胞に基づく一連のプラーク精製により3回生物学的にクローニングし、次いでVero細胞で増幅させた。クローニングした株を32,37,38,39及び40℃で力価検定し(プラーク形成効率(EOP)アッセイにおいて)、そのsp及びts表現型を確認した。一部のクローニング株の力価は許容温度(32℃)においてさえも比較的低いため、これらのウィルスをHEp−2細胞の中で1回継代してin vitro分析のためのウィルス懸濁物を構築した。突然変異したcpRSVの子孫の表現型を表1に示す。
突然変異子孫の一つは小プラーク表現型を有し、RSV cpsp 143(spは小プラーク(sp)表現型を意味する)及び残りの突然変異子孫はts表現型を有する。RSV cpts突然変異体は37℃〜40℃の温度範囲でのin vitro単層培養物においてプラークを生成する能力における変動を示し、cpts 368は40℃にてプラークを生成する能力を保持し、一方最も温度感受性(ts)であるウィルスcpts 248は38℃にてプラークを生成しなかった。即ち、いくつかの突然変異誘発cpRSV子孫はプラーク形成の温度感受性に関してそのcpRSV親ウィルスとは著しい相違を示した。
マウスにおける複製及び遺伝子安定研究
BALB/cマウスの上方及び下方呼吸器官におけるcpRSV誘導突然変異体の複製レベルを次に研究した(表2)。最大の温度感受性を示す2つの突然変異体cpts 530及びcpts 248(表1参照)はマウスの鼻介骨における複製において約7〜12分の1制限された(表2)。しかしながら、どのウィルスもcpRSV親ウィルスと比べて肺における複製において制限されなかった。肺よりも鼻介骨におけるこの複製の大いなる制限はts突然変異の特徴ではない。ts突然変異体は一般により暖かい下方呼吸器官における複製において一層制限されている(Richman and Murphy,Rev.Infect.Dis.1:413-433(1979)。肺及び鼻介骨において生成されたウィルスは仕込んだウィルスのts特性を保持していた(データーは示していない)。この発見はcp親ウィルスの突然変異の背景に基づくts突然変異の組合せが、今までに研究されてきたts突然変異体で認められるものよりもin vivo複製の後に高度なts表現型安定レベルを有するcpRSV ts子孫を供することを示唆した。
cpRSV誘導突然変異体のts表現型の遺伝子安定性レベルを更に進展させるため、ヌードマウスの肺及び鼻介骨に存在するウィルスのプラーク形成効率をtsであるものうちとりわけ2種類の突然変異cpRSV子孫、即ち、cpts 248及びcpts 530について研究した。ヌードマウスを選定したのはそれらが機能性T細胞の先天的な欠如により免疫無防備状態であり、そしてウィルスはこのような宿主においてはるかに長い期間複製できるからである。この長い複製期間は改変した表現型を有するウィルス突然変異体の出現を優先する。12日目に存在するウィルス(注意:正常マウスにおいて、ウィルスはこの時点でもはや検出されない)を特性決定し、そして無変のts表現型を保持することが見い出された(表3)。予想通り、陽性コントロールとしてこの試験に含ませたts−1突然変異体はin vivoで不安定なts表現型を示した。即ち、げっ歯類におけるts突然変異ウィルスの従前の評価に反し、これらの結果はげっ歯類において長期複製を経たcpRSV誘導突然変異体のts表現型の高レベルな安定性が達成されたことを示し、これは本発明のウィルスにおける有意義、且つ今までに達成されていない非常に所望される特性を示す。
チンパンジー
cpRSV ts誘導体の弱毒化レベルをヒトに最も近縁な宿主である血清陰性チンパンジーにおいて評価した。チンパンジー又はフクロウザル(owl monkey)の試験は引用することで本明細書に組入れるRichardsonら、J.Med.Virol.3:91-100(1979);CroweらVaccine 11:1395-1404(1993)の一般プロトコールに従って実施した。約104プラーク形成単位(PFU)の突然変異弱毒化ウィルスを含む1mlの懸濁物を各動物に鼻内付与する。別の手順はRSVを上方及び下方呼吸気管の双方に各部位において104PFUを導入する用量にて接種することである。チンパンジーを10日間毎日、次いで20日目まで3〜4日毎にサンプリングにかける。チンパンジーの下方呼吸気管はSnyderらJ.Infec.Dis.154:370-371(1986)及びCroweらVaccine 11:1395-1404(1993)のプロトコールに従う気管洗浄によりサンプリングできうる。いくつかの動物には4〜6週後に野生型ウィルスを負荷する。動物を鼻咽頭検体を採取する日に呼吸障害の徴候について評価する。鼻炎を0〜4+で採点し、2+以上は有意な上方呼吸障害の証拠と考える。
ウィルスを上記の通りのRSV感受性HEp−2細胞への接種により鼻及び咽喉スワブ抗体並びに気管洗浄液から単離する。ウィルスの量は引用することで本明細書に組入れるSchnitzerらJ.Virol.17:431-438(1976)に記載のHEp−2細胞を利用するプラーク技術により直接決定することもできる。血清検体は引用することで本明細書に組入れるMillsら、J.Immunol.107:123-130(1970)に記載の通りにしてウィルスの投与前及びRSV中和抗体の決定のための3〜4週間後の接種時において集める。
最もtsであり、且つ弱毒化されたcpRSV誘導体(cpts 248)を研究し、そして野生型RSV及びcpRSV親ウィルスと比較した(表4)。cpRSV親ウィルスの複製は野生型と比べて鼻咽頭内で若干減少し、野生型ウィルスと比べ鼻炎の程度の減少があり、そして野生型と比べ下方呼吸気管におけるウィルス複製の約600分の1の低下がある。明らかに、cpウィルスはチンパンジーの下方呼吸気管における複製において有意な制限があり、それは動物又はヒトにおけるcpRSVの従前の評価から今まで同定されていない非常に所望される特性である。より有意義には、cpts 248ウィルスは野生型と比べて鼻咽頭内における複製において10分の1制限されており、そしてこの制限は鼻炎の著しい軽減に関連する。これらの発見はcpRSV誘導化突然変異体が生存RSVワクチンについての2通りの非常に所望される特性、即ち、高度に感受性である血清陰性チンパンジーの上方及び下方呼吸気管の双方における弱毒化の徴候を有することを示唆する。cpts 248で免疫したチンパンジーの呼吸気管の中に存在するウィルスの遺伝子安定性のレベルを次に評価した(表5)。呼吸気管分泌物中に存在するウィルスはts表現型を保持し、そしてこれは40℃にて力価が100分の1減少し、且つ40℃にて小プラーク表現型を示す8日目のチンパンジーNo.3由来のウィルスでさえも認められ、この複製がまだ温度感受性であることを示唆する。これはこの試験以前に同定された最も遺伝子的に安定なts突然変異体である。cpts 248及びcpts 530ウィルスのts表現型の増大した安定性はin vivo ts表現型に寄与する突然変異の遺伝子的安定性に対するcp突然変異量の効果に反映する。即ち、cp 3131親ウィルスに既に存在する突然変異との関係におけるts突然変異はその非存在下で予測されるであろうものよりも安定なようである。この重要な特性は今までに観察も報告もされていない。cpts 248によるチンパンジーの感染は高力価の血清中和抗体並びにF及びG糖タンパク質に対する抗体を誘導した(表6)。有意義には、cpts 248による免疫は動物を野生型RSV負荷から保護し(表6)、この突然変異体がヒトに近縁する宿主において有効なワクチンウィルスとして機能することを示唆する。
このような上記の発見はcpts 248ウィルスが生存RSVワクチンのための幾多の所望の特性、例えば1)上方及び下方呼吸気管に対する弱毒化;2)免疫抑制動物における長期複製を経た後でさえものの、in vivo複製後の強まった遺伝子的安定性;3)満足たる免疫原性;並びに4)野生型RSVによる負荷に対する有意義な防御効率;を有する。このcpts 530ウィルスはcpts 248と類似のプラーク形成温度感受性、類似のマウスの鼻介骨における複製の制限の度合い、及び免疫不全ヌードマウスにおける高レベルの遺伝子安定性を共存し、従ってこれもRSウィルスワクチン株である。
更なる弱毒化
RVウィルスはこれらの実験研究において用いた生後1〜2年のチンパンジーよりもヒト幼児において下方呼吸気管障害を起こさせ易いため、そしてチンパンジーにとって満足なように弱毒化された突然変異体が血清陰性幼児及び子供に対してはそうとは限らないことがわかっているため、上方呼吸気管において制限された複製及び弱毒化という非常に未解明のts突然変異特性並びに高度なレベルの遺伝子安定性を有するcpts 248及び530誘導体を更に突然変異させた。
cpts 248よりも高度な温度感受性を示す又は小プラーク表現型を有する子孫ウィルスを更に研究した。1又は複数の更なるts突然変異を有する突然変異誘導体を5−フルオロウラシル突然変異誘発により作った(表8)。cpts 248親株よりも温度感受性(ts)であるts突然変異体を同定し、そしてその一部は小プラーク(sp)表現型を有していた。これらのcpts 248誘導体をマウスに投与した。cpts 248/804,248/955,248/404,248/26,248/18及び248/240突然変異体はそのcpts 248親ウィルスよりもマウスの上方及び下方呼吸気管における複製において制限されていた(表9)。即ち、そのcpts 248親ウィルスよりも弱毒化されたcpts 248の生存突然変異体を同定し、そしてこれらcpts 248の誘導体はマウスにおいて広域の複製効率を示し、cpts 248/26が最も制限されていた。マウスの鼻介骨及び肺の中に存在するウィルスのts表現型は仕込んだウィルスのそれとほぼ同じであり、遺伝子安定性が示唆された。cpts 248の高度に弱毒化された誘導体cpts 248/404ウィルスは野生型と比べ鼻咽頭における複製において1000分の1制限されていた。少なくとも3つの弱毒突然変異を有するcpts 248/404突然変異性も4匹の血清陰性チンパンジーの上方及び下方呼吸気管における複製において非常に制限されており、そして感染症は鼻炎を誘導しなかった(表10)。ここでも、このウィルスは野生型と比べて高度の複製制限を示し、鼻咽頭において60,000分の1、そして肺において100,000分の1低下していた。にもかかわらず、その後RSV野生型ウィルスを負荷した2匹のチンパンジーは非常に抵抗性であった(表11)。
cpts 248/404の5つの小プラーク突然変異体を化学突然変異誘発により上記と同じようにして誘導した。一回増幅したプラーク子孫の懸濁物をHEp−2細胞での32℃でのプラーク力価検定により小プラーク(sp)表現型についてスクリーニングし、そしてウィルスの作業用懸濁物を前述の通りに調製した。
突然変異cpts 248/404ウィルスの5つのプラーク子孫は安定なsp表現型を示した。各突然変異体のシャットオフ温度は35℃以下であり(表12)、cpts 248/404ウィルスのかかるsp誘導体をそれぞれが後天的な追加のts突然変異も有することを示唆した。106.3p.f.u.のcpts 248/404のsp誘導体によるBalb/cマウスの鼻内接種を経て、ウィルスはいづれのかかるsp誘導体により接種の施されたマウスの鼻介骨内においても検出できなかった。しかしながら、ウィルスが一例の肺において低力価で検出された。これらの結果は野生型RSVと比べての鼻介骨における複製の>300分の1の制限及び肺における>10,000分の1の制限を示唆する。
cpts 530ウィルスの更なるts誘導体も作製した(表13)。cpts 248誘導体のように、cpts-530誘導体はcpts 530親株よりもマウスにおける複製において制限されていた。一の突然変異体cpts-530/1009はマウスの鼻介骨における複製において30分の1制限されていた。このcpts 530誘導体は血清陰性チンパンジーの上方及び下方呼吸気管における複製においても非常に制約されていた(表14)。野生型ウィルスと比べ、鼻咽頭においてはcpts 530は複製において30分の1制限され、一方cpts 530/1009は100分の1制限されていた。双方のcpts突然変異体は、たとえその突然変異体を気管に直接接種したときでも、野生型と比べて下方呼吸気管をおいて非常に制限されていた(20,000〜32,000分の1)。また、cpts 530/1009,cpts 530又はcpRSVで事前に感染されたチンパンジーは鼻咽頭において有意なウィルス複製制限を示し、そしてその後の野生型RSVの併合式鼻内及び気管内負荷を経て有意な鼻炎を発症しなかった(表15)。更に、任意の突然変異体で予め感染されたチンパンジーは野生型負荷ウィルスの複製に対する下方呼吸気管における完璧な抵抗を示した。
これらの結果は従来の研究の際に得られた経験から完全に予測できないものであった。例えば、当初の研究の結果は単一サイクルの5−フルオロウラシル突然変異誘発に由来するRSV ts突然変異体のin vivo特性が従来予測できないことを示唆する。更に、このようにして作製した最初の4種のts突然変異体の一つがその他の突然変異体と同じプラーク形成シャットオフ温度を示すにもかかわらず、それは感受性チンパンジー並びに感受性幼児及び小児において試験したときには過剰に弱毒化されていた(Wrightら、Infect Immun.37(1):397-400(1982))。このことは、37〜38℃のプラーク形成シャットオフ温度をもたらすts表現型の獲得が感受性チンパンジー、幼児及び子供に対する所望の弱毒化レベルを有する突然変異を確実に供さないことを示唆する。事実、今までに知られたts突然変異体による研究の結果は、低温継代、それに続く化学突然変異誘発の2連続サイクルによる3種の独立の突然変異(又は突然変異のセット)のRSVへの導入が、チンパンジー(そして外挿により、小児)に対する感染力を保持し、且つRSV障害の予防のために用いるべき生きたウィルスワクチンに必要な所望のレベルの弱毒化、免疫原性及び防御効能を発揮する生存性突然変異体を生み出すことができるという所見の任意の基礎を供することが完全にできなかった。
上記の結果は本発明のcpRSVの所定のts誘導体がマウス及びチンパンジーに対する満足たるレベルの感染力を有し、且つ有意義な弱毒度を示すことを明確に実証する。これらの突然変異誘導体は弱毒化され、そしてin vivoでの複製後に極めて遺伝子的に安定であるように見えた。このような突然変異体はチンパンジーにおけるRSV感染症に対する有意な抵抗も誘導した。
かくして、かかるcpRSV誘導体は重篤なヒトRSV障害を予防するためにデザインされた生きたRSVワクチンにおいて利用するために適当なウィルス株を担う。
チンパンジーにおけるcpts突然変異体に対する継代獲得血清RSV抗体の効果
チンパンジーにおける本発明の様々なcpts突然変異体の弱毒化、免疫原性及び防御効能に対する継代獲得した血清RSV抗体の効果を調べるため、cpts 248,cpts 248/404及びcpts 530/1009のin vivo複製を免疫の2日前にRSV免疫グロブリンを点滴した血清陰性チンパンジーにおいて評価した(表16)。抗体を順々に継代移転させ、母体由来RSV抗体をもつ乳児において得られる症状をシュミレートする。このようにして、防御性免疫応答の誘導を排除する程に高度に弱毒化されたウィルスの複製が中程度から高力価の継代抗体をもつ乳児において抑制されうるかどうかを調べるため、継代RSV抗体の存在下で各表示突然変異体の免疫原性を評価することが可能である。また、継代獲得抗体の存在下での免疫に対する抗体応答の性質を特定する並びにウィルス負荷に対する抗体応答の程度及び機能的活性を特定することが可能とするであろう。鼻咽頭におけるウィルス複製のレベル及び弱毒化された突然変異体についての内連の臨床評点はこのような動物の感染を点滴していない血清陰性チンパンジーのそれと比べたとき、血清RSV抗体の存在により変化しない又はわずかにしか変化しなかった。対照的に、継代獲得抗体の存在は下方呼吸気管におけるcpts 248のウィルス複製を効率的に防いだ。その他の2つの突然変異体は既に肺において高度に制限されているため、継代抗体の類似の効果はこれらの突然変異体に対しては評価できない。
ヒトRSV免疫グロブリンの点滴はやや高度なRSV F抗体レベル(力価1:640〜1:1600)及び中和抗体(力価1:199〜1:252)を供したが、バックグランドを検出可能な程に上まわる有意な量の血清RSV G抗体を供しなかった(表17)。cpts 248/404,cpts 530/1009又はcpts 248による免疫の前にヒトRSV抗体を点滴したチンパンジーは免疫後28日目に試験した点滴を施していない免疫動物と比べ、免疫後42日目に10分の1の量のRSV F抗体及び約半分の力価の中和抗体しか示さなかった。点滴を施したヒトIgGは大量のRSV F及びRSV中和抗体を含んでいたため、42日目の血清サンプル中に存在する点滴に由来する残留抗体は免疫に応答してde novo生産された抗体と区別できなかった。チンパンジーにおけるヒト血清IgG抗体の半減期を考慮すると(Princeら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6944-6948)、cptsの免疫の42日後の下及び中和抗体の観察されたレベルは点滴の残留物について予測されるものよりも高かった。更に、点滴を施した動物の免疫後のRSV G抗体応答はこれらのチンパンジーに免疫に対する免疫応答が備っていることを確証する。
免疫の4〜6週間後、チンパンジーに野生型RSVを負荷した。各動物はその下方呼吸器官において、ヒトIgGを免疫の2日前に点滴しようとしなかろうと、完璧な抵抗を示した(表18)。点滴を施していない動物は負荷に対する中和抗体応答をほとんど又は全く示さなかった(表17)。対照的に、点滴を施したチンパンジーは、ウィルス複製が著しく制限されているにもかかわらず(表17及び18)、野生型ウィルス負荷に対して異常に高力価なRSV中和抗体を示した。更に、抗体の存在下での免疫を経て、最低レベルのウィルス複製及び免疫を示す最も弱毒化されたウィルスcpts 248/404は最大の負荷後中和抗体力価を有していた(表17)。対照的に、最低に弱毒化されたウィルスcpts 248は点滴を施した3つの動物グループのうち最低の負荷後中和抗体力価を有した。抗体の存在下での免疫により誘導された抗体の量を増やすため、中和抗体、対、ELISA F抗体力価の比により測定される抗体の存在下での免疫により誘導された抗体の量の上昇は血清陰性動物における免疫により誘導されたものよりも有意に高かった(表17)。点滴を施した負荷負の免疫動物において生産された抗体の中和/ELISA F比は点滴を施していない動物におけるそれの約10〜20倍高く、そして免疫に利用する突然変異体に関係なく全てのグループにおいて一貫していた(表17)。
生きたウィルスワクチンによる免疫時での継代獲得抗体の存在はワクチンに対する免疫応答を3通りに変えうる。第一に、ワクチンウィルスの複製レベルにおける有意な低下が生じることがあり、これは低下した免疫原性をもたらす。継代移転されたRSV抗体はワクチンウィルス、特に最も欠陥性の突然変異体の複製を制限し、そしてその免疫原性を大いに低下させうる。本明細書に示す結果は下方呼吸器官における最低の弱毒化突然変異体(cpts 248)の複製が事実上継代獲得血清IgG RSV抗体の存在により消失し、一方上方呼吸気管内での複製は有意な影響が及ぼされないことを示唆する。試験した最低の弱毒化突然変異体cpts 248の複製は抗体の存在下で下方呼吸気管において≧200分の1(即ち、完璧に)制限された。より弱毒化された突然変異体cpts 530/1009及びcpts 248/404の下方呼吸気管における複製レベルは血清陰性動物においてさえも非常に制限された。従って、ウィルス複製に対する継代抗体の有意義な効果は検出できなかった。3種の弱毒化突然変異体それぞれによる免疫は上方及び下方呼吸器官の双方において野生型負荷に対する高度な防御を継代獲得したRSV抗体が免疫時に存在していようとなかろうと、誘導した。即ち、継代免疫したチンパンジーの上方呼吸器官におけるワクチンウィルスの複製レベルは点滴を施していない動物において誘導されたものに匹敵する野生型ウィルス負荷に対する高度なレベルの抵抗を誘導するのに十分であった。
第二に、継代抗体は誘導された抗体の量及び機能活性の低下を引き起こさせることにより感染症に対する免疫応答を改変しうる。このため、継代抗体の存在下での生きたウィルス免疫に対する抗体応答の程度及び特徴を分析した。免疫された点滴を施した動物の後免疫血清ELISA IgG F抗体力価は点滴を施していない血清陰性動物の後免疫F力価の10分の1であった。この血清RSV中和抗体応答はかかる動物において2分の1であり、平均して点滴を施していない動物の2分の1であった。免疫後に検出した一部のELISA F及び中和抗体は点滴に由来する残留抗体であるため、既に存在している抗体により引き起こされる中和及びF抗体応答の事実上の低下はおそらくは見かけよりも更に有意であろう。更に、使用したヒト免疫グロブリン調製品はRSVのG糖タンパク質に対する低レベルの抗体を含んだ(表17)。これは候補ワクチンウィルスによる感染に対するチンパンジーのIgG RSV G糖タンパク質抗体応答の検査を必要とさせた。G抗体応答は4倍以上の増大を示し、それぞれの継代免疫動物がワクチンウィルスにより感染されたことを示し、それにはウィルスを死滅させないcpts 248/404で免疫されたチンパンジーが含まれる。免疫に対するG抗体応答の程度は継代移転抗体により悪影響を及ぼされないようである。
第三に、継代獲得抗体の存在下での免疫動物のRSV野生型ウィルス負荷に対する抗体応答を変えることができる。点滴を施していない抗体の非存在下で免疫したチンパンジーはその後のRSV負荷に対して有意な抵抗を示した。更に、これらの動物は負荷ウィルスに対する有意な抗体応答を示すことができなかった。6匹の点滴を施した免疫動物それぞれはRSVに対する有意な抵抗も示したが、負荷に対する非常に増強された抗体応答が観察された。cpts 530/1009又はcpts 248/404で免疫した処置動物における後負荷F又はG抗体レベルは10倍以上増大し、一方中和抗体応答は800倍ほどの増大を示した。これらの結果は生まれた直後の生きた弱毒化突然変異を有する母体抗体をもつ幼児の反復免疫が効率的な抵抗及び高い質の関連の増強二次抗体応答を刺激しうることを示唆する。負荷ウィルスの有意な複製なしでの二次感染に対する増強した免疫応答を司るメカニズムは理解されていない。免疫時での血清抗体の存在は、点滴を施した動物における免疫に対するごくわずかな抗体応答を可能にするが、その後のRSV負荷を経た非常に機能活性な抗体を高揚するB細胞レパートリーの発達を優先する。
本明細書において報告する結果は、弱毒化RSVウィルスワクチンがはじめてRSVワクチンのための標的集団、即ち、母体からの終胎盤移転の結果として継代獲得RSV中和抗体を有する生後4〜6週の幼児を擬態する動物モデルにおいて効能を示した点において非常に有意義である。この発見の重要性は、前述の通り、継代移転されたRSV抗体がcptsワクチンの複製を阻害し、それを非免疫原性且つ非防御性にするという高い予測が驚くべきことに示されないという点で明らかである。
実施例II
cpRSV突然変異体を弱毒化するための低温適応の利用
本例はヒトワクチンにおいて利用するために一層弱毒化された誘導株を供するための株の徐々に低めた温度での更なる継代による不完全に弱毒化された宿主域制限cpRSV株への増殖制限突然変異の導入を述べる。
かかる低温適応(ca)手法は、血清陰性児において不完全に弱毒化されたものであるcpRSV 3131ウィルスに更なる弱毒化を導入するため、用いた。
第一戦略では、Flow Laboratoriesから入手した低温継代RSV A2(cpRSV 3131)の親ストックを実施例1に記載の通りにMRC−5細胞内での25℃での継代により調製した。簡単には、低温継代ウィルスをMRC−5又はVero細胞単層培養物に≧0.01の感染多重度で接種し、そしてこの感染細胞をその後の継代まで3〜14日間インキュベーションした。ウィルスを20回20〜22℃で継代し、より弱毒化したウィルスを誘導した。ウィルス複製の最初の徴候が明らかとなるやいなや(即ち、3〜5日)、複製を低温で効率的にできるようにするため迅速継代の技術が突然変異の選択が好ましい。更に、RSVサブグループB株、St.Louis/14617/85クローン1A1を一次アフリカングリーンモンキー腎細胞において単離し、MRC細胞(1A1-MRC14)において継代及びクローニングし、そしてMRC−5又はVero細胞において32〜22℃で52回低温継代した。
第二の戦略はクローニングしていない親cpRSV 3131ウィルスの生物学的にクローニングした誘導体を採用する。このウィルスはウシ胎児腎(BEK)細胞においても生物学的にクローニングした〔この組織は本来cpRSV 3131ウィルスを誘導するために用いられている:Friedewaldら、J.Amer.Med.Assoc.204:690-694(1968)参照〕。このクローニングしたウィルスをVero細胞において低温で10日間の間隔で継代する。他方、cpRSV 3131ウィルスをMRC−5細胞の中で2系列の終末希釈(TD2P4)によりクローニングし、そしてMRC−5又はVero細胞において10日間の間隔で継代する。
第三の戦略は低温で大きめのプラークを生成する突然変異体の選別を包括する。25℃で大プラークを生成するプラークD1と命名したRSV 3131誘導体ウィルスが同定された。このウィルスはcp 3131−1(BEK)系列の第3継代(P3)レベルに由来する。P3ウィルスにより生成される最大のプラークを32℃で増幅させ、次いで25℃で再プラーク形成させた。ここでも最大のプラークを選び、増幅し、そして再プラーク形成させた。5回のかかるサイクルの後、大プラーク突然変異ウィルスD1が単離された。D1は25℃でのプラーク、対、プラーク精製の2回の更なるサイクルにより生物学的にクローニングした。
生物学的にクローニングしたウィルスD1は、cp 3131又は野生型ウィルスA2とは25℃にて区別できる均一に大きいプラークを生成する。かくして、D1は25℃での大プラークサイズの基準により低温適応される。プラーク形成効率の研究はD1が温度感受性であることを実証する。37℃にて、D1プラークは野生型RSV又はcp 3131のそれから区別され、D1がこの温度での増殖において制限されないことを示唆する。これと一致して、D1は37℃及び40℃(即ち、試験した最高温度)にてVero細胞単層においてかなりの細胞病理作用を供する。
実施例III
ts-RSVへの更なる弱毒突然変異の導入
本例はより完璧に弱毒化された株を作るための親ウィルスとしてのts突然変異体の利用を述べる。2つのRSV A2 ts突然変異体、即ちts−4及びts−1 NG−1をこの方法のために選定した。2通りの方法をRSV ts突然変異体への更なる突然変異の導入のために選んだ。第一に、不完全に弱毒化されたRSV ts突然変異体を化学突然変異誘発にかけ、そしてプラーク形成に関して一層温度感受性である突然変異子孫を更なる分析のために選んだ。第二に、このRSV ts突然変異体を低温で継代してca表現型、即ち、野生型親ウィルスと比べて至適温度以下で複製する高まった能力を有するRSV nts突然変異体を選定した。
ts−1 NG1ウィルスの親ストックを生きた呼吸シンシチウムウィルス(A−2)ts−1 NG−1突然変異体、MRC−5増殖ウィルスFlow Laboratories Lot M4から調製した。ニトロソグアニジンを利用する2ラウンドの突然変異誘発によりts−1突然変異体から誘導されたこの突然変異体は2種以上の独立ts突然変異をもつが、感受性チンパンジーにおいて著しい鼻炎を誘導し続けた。このウィルスをVero細胞で32℃で2回継代し、突然変異誘発のためのts−1 NG−1懸濁物を構築した。次いでこのウィルスを4×10-4Mの5−フルオロウラシルの存在下で増殖して複製の際の更なる突然変異を誘導するか、又は5−フルオロウラシル処理の後に36℃で5−アザシチジンに曝露した。次にこの突然変異誘発したストックをアガー上層下に維持したVero細胞でのプラークアッセイにより分析し、そして適当なインキュベーション間隔の後、プラークを顕微鏡で同定した。586のプラークを拾い、そして各プラークの子孫を別々にVero細胞の新鮮単層上での増殖により増幅させた。突然変異誘発したts−1 NG−1ウィルスの単一のプラークの子孫を接種した各組織培養物の内容物をVero細胞に対する細胞病理効果が最大と認められたときに個別に回収した。ts−1 NG1よりも温度感受性である子孫ウィルスは32℃及び36℃でのHEp2細胞でのこれらのプラークプールの力価検定により調べた。ts−1 NG1よりも高い温度感受性(即ち、32℃と比べて制限温度(36℃)で力価の100分の1以上の低下)を示す任意のウィルスを更に調べた。tsRSV ts−1 NG−1親ウィルスよりもtsである6つのプラーク子孫を同定し、そしてこれらの株をVero細胞での系列プラーク精製により3回生物学的にクローニングし、次いでVero細胞で増幅させた。クローニングした株を32℃,35℃,36℃,37℃及び38℃で力価検定し(プラーク形成効率アッセイ)、そのts表現型を確認した。HEp−2細胞でのアッセイにより作製したプラーク形成効率データーを6つの突然変異体の表現型を更に確認せしめた(表19)。
最もtsな2つのウィルス、A−20−4及びA−37−8はそのts−1 NG1親ウィルスと比べてマウスにおいて非常に弱毒化されており、高まったレベルの温度感受性の獲得が強化された弱毒に付随することを示唆した(表20)。これらのウィルスはマウスに対して感染性であり、なぜならそれらは抗体応答を誘導するからである。このts−1 NG1/A−20−4ウィルスはチンパンジーにとって弱毒化されており(表21)、そしてts−1 NG1/A−20−4によるチンパンジーの感染は野生型ウィルス負荷に対する抵抗を誘導した(表22)。有意義に、鼻炎は起こらなかった。
ts−4ウィルスの突然変異誘発も、ts−1 NG1ウィルスの突然変異誘発と同じ方法を用いて実施した。突然変異を低温継代によりts−4ウィルスにも導入した。ts−4ウィルスは43回の低温継代を経て22℃で高力価へと複製した。RSV ts−4親ウィルスよりもtsである6つのプラーク子孫が同定された(表23)。ts−4 cp−43はBalb/cマウスにおける複製において更に制限される(表24)。
実施例IV
RSVサブグループBワクチン候補
本例はRSVサブグループBウィルスワクチン候補の開発を述べる。本発明のサブグループA突然変異体の開発のために用いたのと同じ手法をサブグループBウィルスに利用した。野生型B−1 RSウィルスの親ストックをVero細胞において低温(20〜25℃)で52回低温継代し、そしてこのウィルスを19及び52回目の継代においてプラーク精製にかけた。52回目の継代懸濁物に由来するクローンのうちの3つを個別にクローニングし、そしてRSV B−1 cp 52/2B5と命名する一のクローンを更なる評価のために選別し、なぜならそれはコットンラットの上方及び下方呼吸気管において非常に弱毒化されていたからである(表25)。cpRSV B−1ウィルスの種々の継代レベルでのいくつかのクローンの評価はRSV B−1 cp 52/2B5突然変異体がその弱毒表現型に個別に寄与する多重の突然変異を維持していることを示唆する。このRSV B−1 cp 52/2B5突然変異体は免疫抑制されたコットンラットにおける長期複製を経てその弱毒化表現型を保持していた(表26)。この高レベルの遺伝子安定レベルの発見はそれが弱毒表現型に寄与する3つの突然変異を有することを一致する。
サブグループA突然変異体を類似の方法でサブグループB突然変異を特性決定するための更なる評価をカリビアングリーンモンキー(表27及び28)並びにチンパンジー(表29)で実施した。RSV B−1 cp−23又はcp 52/2B5のいづれかで免疫したサルはRSV B−1野生型ウィルスの複製に対して抵抗性であり、RSV B−1野生型ウィルスの非常に弱毒化された誘導体による感染が野生型負荷に対する抵抗を誘導するのに十分であることを示唆する(表27)。
グリーンモンキーと同様に、血清陰性チンパンジーにおける結果は上方及び下方呼吸器官におけるRSV B−1 cp 52/2B5の弱毒を明示した。
RSV B−152/2B5突然変異体を5−フルオロウラシルで更に突然変異誘発し、そして得られるプラークを拾い、そしてts表現型について32°、対、38℃でスクリーニングした。選定したcpts突然変異体をVero細胞において3回プラーク精製し、次いでVero細胞において2回増幅させた。その結果、RSV B−1 cp 52/2B5の7つのcpts突然変異体が同定され(表30)、そしてコットンラットにおけるその複製レベルを調べた(表31)。これらの突然変異体のうちの一つ、即ちcpts 176を更に突然変異誘発し、そして一連の突然変異誘導体を得、それらはRSV B−1 cpts 176親ウィルスよりもin vitroでtsであった(表32)。
本発明のサブグループA突然変異体と同じように、サブグループB突然変異体は感染性であり、そしてコットンラット、サル及びチンパンジーにとって有意な度合いの弱毒化を示す。in vivo弱毒にもかかわらず、RSV B−1 cp突然変異ウィルスはサルにおいて野生型負荷に対する抵抗を誘導した。RSV B−1 cpts 52/2B5ウィルスのts突然変異体は弱毒化されており、そしてRSV B−1 52/2B5親ウィルスよりもコットンラットの鼻咽頭及び肺において制限された複製レベルを示した。
RSV Bサブグループワクチン候補の評価及び操作において役立たせるため、野生型B−1ウィルスの完全ヌクレオチド配列を決定した〔SEQ ID NO:2〕。この配列を前述の弱毒化B−1誘導体cp−52/2B5(cp−52)の配列と比較した。この配列分析はcp−52におけるSH及びG遺伝子のほとんどに及ぶ大きな欠失を示し、いづれの遺伝子についての推定ORFを有さなかった。より詳しくは、cp−52ウィルスのSH及びG遺伝子に広がる領域のほとんどが欠失しており、SH遺伝子開始シグナル並びにG遺伝子の3’(下流)末端の一部及びその遺伝子末端シグナルのみが残っていた。残りのSH:G領域はORFのない約91ヌクレオチドのキメラ転写体をコードできうる。cp−52のノーザンブロット分析は多重固有ポリ転写体がSH:G読み過しmRNAを含むことを確証せしめ、SH:G遺伝子接合部にわたる欠失突然変異と一致する。ウェスタンブロット及び免疫染色アッセイはインタクトG糖タンパク質がcp−52ウィルスにより生成されないことを確証せしめた。この長い欠失に加えて、cp−52ウィルスは7つのヌクレオチド相違を含み(表33)、その5つはコード変化であり(F遺伝子内に1つ、そしてL遺伝子内に4つ)、1つはサイレントであり(F遺伝子)、そして1つは非コード式G:F遺伝子間領域である。重要なことに、このRSV突然変異体はSH及びGタンパク質の不在にもかかわらず、組織培養において極めて感染性であり続いている。これらのデーターは新規クラスの複製コンピテント欠失突然変異体を同定し、それは組換RSVワクチン候補を開発するための別の又は組合せアプローチを供する。
cp−52継代系列における様々な継代レベルにおいて単離したその他のサブグループBは継代レベルに依存して様々なcp−52突然変異を含む(表34)。これとの関連における典型的なサブグループB突然変異体はRSV B−1 cp−12,RSV B−1 cp−23,RSV B−1 cp−32,RSV B−1 cp−42を含む。表34は典型的なBサブグループ突然変異体間でのこれらの特異的な突然変異の分布を示す(ネガティブセンスとして)。この突然変異の様々な分布は表示の株におけるこれらの突然変異の弱毒効果の一層精錬された特性選定を可能にする。例えば、cp−23はヌクレオチド位置5626,6460,14164及び14596においてcp−52に認められる突然変異を含むが(表34)、cp−52において欠失しているSH及びG遺伝子領域における親B−1野生型株とは相違しない。cp−42はcp−52と同じSH及びG欠失を含む、一方cp 32はSH及びG遺伝子内の配列の際立った欠失を示す。
実施例V
二価のRSVサブグループA及びBワクチン
サブグループA及びBウィルスによる研究は、in vitroで、Vero細胞単層培養物において野生型A2及びB−1ウィルスの間でも、cpts 530/1009及びRSV B−1 cp 52/2B5誘導体の間でも干渉が認められないことを示す。コットンラットにおける二価感染のin vivo結果を表34に示す。これらの結果はA−2及びB−1野生型RSV間、並びにcpts 530/1009及びRSV B−1 cp 52/2B5間で干渉がないことを示すin vitro結果を確証せしめた。従って、各ワクチンウィルスは野生型ウィルスに対する相同型の免疫力を誘導するであろうことが予測され、なぜならこの二価ワクチンの各成分は二重感染において単独感染の際に認められるものに匹敵するレベルで複製するからである。各ウィルスは単独でRSV野生型負荷に対する相同型防御を誘導できる。
実施例VI
ポリメラーゼ(L)遺伝子における単一突然変異はts表現型を誘導する
本例は、RSVワクチン調製品において使用するのに一層極めて弱毒化され且つ適切であるts株cpts 248及びcpts 530を作り上げるための、不完全弱毒化宿主域制限cpRSVの化学突然変異誘発により作製したポリメラーゼ遺伝子(L)における特異的突然変異を述べる。上記実施例に記載の通り、cpts 248は血清陰性チンパンジーにおける野生型負荷に対して弱毒化され、免疫原性であり、そして完璧に防御性であることが認められ、そして従来評価されていたtsRSV突然変異体よりもin vivo複製の際により遺伝子的に安定である。前述の通り、cpts 248株を化学突然変異誘発にかけ、残留反応性を更に低め、cpts 248/404等の高まった温度感受性又は小プラーク表現型をもつ一連の突然変異体を作り上げた。同じようにして、cpts 530/1009をcpts 530から誘導した。
cpts 248及びcpts 530の高まった弱毒化及びts表現型の遺伝子基礎を、これらのウィルスの完全ゲノム配列をcpRSV親ウィルスの予め決定した配列のそれと比較することにより決定した。cpRSVの完全ヌクレオチド配列を決定し、そしてRSV A2野生型ウィルス(直接継代系列の一部でない研究室の株)のそれ、並びにその低温継代野生型親ウィルス(RSV A2/HEK7)の配列と比較した。cpRSVはそのRSV A2/HEK7親ウィルスとは5個のヌクレオチド変化により相違し、それらは1つは核タンパク質(N)において、2つは融合タンパク質(F)遺伝子において、そして2つはポリメラーゼ(L)遺伝子においてある。cpts 248,cpts 248/404,cpts 530,cpts 530/1009及びcpts 530/1030の完全15,222ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を決定した。
ランダム化学突然変異誘発によるRSV突然変異体cpts 248及びcpts 530のそのcpRSV親からの誘導は実施例1に記載した。精製ウィルスRNAの起源として用いるウィルスの製造のために細胞を感染させるのに用いたウィルス懸濁物は、Vero細胞単層培養において液体培地の中で4個継代し、次いで生物学的にクローニングした(即ち、アガーのもとでVero細胞単層における3回のプラーク間継代)ウィルス含有浄化組織培養上清液とした。
細胞単層をcpts 248,cpts 248/404,cpts 530,cpts 530/1009又はcpts 530/1030ウィルスにより0.1の感染多重度(moi)で感染した。全RNAを中程度のCPEが観察されたときに感染細胞単層から調製した(平均に感染後4〜5日)。上清流体を吸引除去し、そして感染細胞単層をグアニジニウムイソチオシアネートによる溶解、それに次ぐフェノール−クロロホルム抽出により回収した。RNAをSuperscript II TM逆転写酵素(Life Technologies)ランダムヘキサマープライマー及びその製造業者により供されたプロトコールに記載の反応条件を利用して転写した。
得られるcDNAをTE−100スピンカラム(Clontech,Palo Alto,CA)を利用してプライマーから分け、そしてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において鋳型として用いて全RSVゲノムに広がる10の重複DNAクローン系列を作製した。PCRのためのオリゴヌクレオチドプライマーはプロトタイプA2ウィルスのヌクレオチド配列からデザイン(Minkら、Virology 185:615-624(1991);StecらVirology 183:273-287(1991);CollinsらProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:9663-9667(1991);Connorsら、Virology 208:478-484(1995))、そして予めRSV A2野生型ウィルス及びその誘導体cpRSV親ウィルスの双方を増幅することが実証された。ウラシル含有オリゴヌクレオチドプライマーをClone AmpウラシルDNAグリコシラーゼ系(Life Technologies)を用いてpAMP1ベクターの中にRSV配列をクローニングするために用いた。PCR反応は製造業者(Perkin-Elmer,Norwalk,CT)に従って実施し、そしてそれぞれ92.5℃で1分、55℃で1分及び72℃で3分のサイクル34回にわたり実施した。各フラグメントを1%のアガロース/TAEゲルで電気泳動し、Geneclean IIシステム(Bio 101,Vista,CA)により回収し、そしてpAMP1ベクターの中にクローニングした。各フラグメントの2以上の独立クローンを個々のPCR反応から作製した。3’リーダー領域の分析のため、ウィルスRNA(vRNA)をMinkら、Virology 185:615-624(1991)に記載の通りにして50μlの反応でポリアデニル化した。37℃で10分のインキュベーション後、反応を0.5MのEDTA 2μlで停止させた。このポリアデニル化RNA生成物をフェノールクロロホルムによる抽出及びエタノール沈殿により精製し、次いでcDNAへと逆転写させ、PCRにより増幅し、そして3’RACEシステム(Life Technologies)による迅速増幅を利用してクローニングした。同様にして、5’トレーラー領域の分析のため、vRNAをcDNAへと逆転写させ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ及びdCTPを用いてテール付けし、カラム精製し、二本鎖にし、そしてPCRにより増幅し、そして5’RACEシステム(Life Technology)を利用してクローニングした。
cpts 248に関するクローン化DNAを合成オリゴヌクレオチドプライマー(プラスミドプライマー又はRSV特異的プライマーのいづれか)、〔α35S〕dATP及びSequenase 2.0(United States Biochemicals,Cleveland,OH)を用いてジデオキシヌクレオチド法により二本鎖プラスミドから配列決定した。観察した配列と以前に公開された親ウィルスcpRSVのそれとの相違をフォワード及びリバース方向の双方における2以上のクローンの配列決定並びにクローニングしていないPCR生成物の配列決定により確認した。
cpts 248/404,cpts 530,cpts 530/1009及びcpts 530/1030のヌクレオチド配列を別の技術により決定した。cptsRSV突然変異ウィルスのゲノムを代表する3〜10の重複DNAを総合感染化細胞RNA又はvRNAのRT-PCRにより作製した。各クローンの完全ヌクレオチド配列をNCI Frederick Cancer(Frederick,MD)にある自動DNAシーケンサーにより、各プラスミドインサートについてファージM13において構築したM13音波処済ランダムライブラリーに基づきTaqキット(ABI,Foster City,CA)を利用して決定した。双方の鎖を配列決定し、そしてcpRSV及びcptsRSV突然変異配列間の相違をSequenase 2.0(USB,Cleveland,OH)を利用して第2の独立に誘導したRT−PCR生成物の手動配列決定(前述)により確認した。3’及び5’末端配列を上記の通りに決定した。
cpts 248,cpts 248/404,cpts 530,cpts 530/1009及びcpts 530/1030株の15,222ヌクレオチドRNAゲノムの完全ヌクレオチド配列を決定した。cpRSV及びRSV A2/HEK7(野生型)親ウィルス(Connersら、Virology 208:478-484(1995))の公開配列に対する変化をこれらcptsRSV突然変異体の独立に誘導したcDNAクローンに基づき確認し、そしてcpRSVの別のクローンを配列決定することによりcpRSVウィルスにおいて再検定した。cpRSVウィルスの配列における多義性(ambiguity)(A2/HEK7野生型ウィルスと比較して)を同定した。この多義性はネガティブセンスゲノムの3’末端から1,938位に認められ、そして391アミノ酸−ヌクレオカプシド(N)タンパク質のアミノ酸位置267でのアミノ酸変化(Val又はIle)をコードすると予測されるヌクレオチド異質(heterogeneity)(ポジティブセンスにおけるG又はA)より成る。即ち、cpRSVは事実上ウィルスの混合集団より成る。これはConnersら前掲における1938位での変化の検出を当初できなかったことの原因である。1,938位でのA突然変異を有するウィルスはcpts 248誘導体及びcpts 530シスタークローンの直接の親株である。即ち、cpts誘導体の直接の親ウィルスであったcpRSVはそのA2/HEK親株とは5個のアミノ酸の相違を含む。
cpRSVとcpts 248との間での単一のヌクレオチド相違がヌクレオチド位置10,989に見られた(AからTへの変化)(表36)。この突然変異はポリメラーゼ(L)翻訳オープンリーディングフレーム内に認められ、2,165アミノ酸Lタンパク質におけるアミノ酸位置831でのgln→leuの推定アミノ酸変化をコードする。cpts 248/404突然変異体はそのcpts 248親株とは2つのヌクレオチド相違をもち、1つはL遺伝子の中のヌクレオチド12,046にあり(T→A)、そしてもう一つはM2遺伝子中の転写開始シグナル配列中のヌクレオチド7605にある(T→C)。L遺伝子におけるヌクレオチド置換はLタンパク質における1183位でのasp→gluのアミノ酸変化をもたらした。2ラウンドの独立したcpRSVの突然変異誘発を経て、cpts 248/404ウィルスはL遺伝子における2つのヌクレオチド変化(2個のアミノ酸の置換に対応)及びM2遺伝子の転写開始シグナルにおける1つのヌクレオチド変化を獲得した。その野生型先祖株A2/HEK7と比べ、cpts 248/404突然変異体は7個のアミノ酸(Lにおいて4つ、Fにおいて2つ、そしてNにおいて1つ)、そしてM2遺伝子の転写開始シグナルにおける1個のヌクレオチドにおいて相違した。
cpts 530は親株cpRSVとは10,060位でのC→Aの1個の更なるヌクレオチド置換により相違し、これはLタンパク質の521位でのphe→leuアミノ酸変化をもたらす(表37)。cpts 530/1009突然変異体はヌクレオチド12,002において1個のヌクレオチド置換(A→G)を有し、Lタンパク質のアミノ酸1169でのmet→valの置換をもたらしている。その野生型先祖株A2/HEK7と比べ、cpts 530/1009突然変異体は7個のアミノ酸において相違する(Lにおいて4つ、Fにおいて2つ、そしてNにおいて1つ)。
cpts 530/1030突然変異体はヌクレオチド12458において1個の更なるヌクレオチド置換を有し(T→A)、Lタンパク質のアミノ酸1321でのTyr→Asn置換をもたらしている。そのwt先祖株A2/HEKと比べ、このcpts 530/1030突然変異体は7個のアミノ酸において相違する(Lにおいて4つ、Fにおいて2つ、そしてNにおいて1つ)。
かくして、cpts 248及びcpts 530それぞれのts及び弱毒表現型はポリメラーゼ遺伝子における1個のヌクレオチド置換が関わっている。cpts 530及びcpts 530/1009又はcpts 530/1009間でのts及び弱毒表現型の斬進的な増大もそれぞれLにおける1個のアミノ酸変化が関わっている。これら4つの例(即ち、cpts 248,cpts 530,cpts 530/1009又はcpts 530/1030)において、Lにおける1個且つ異なるアミノ酸置換は先祖株に対してts及び弱毒表現型を授ける。このようなアミノ酸置換は5つのcpRSV突然変異と協同作用し、動物における複製を経たts表現型の安定性を高める。cpts 248及びcpts 248/404の間で観察された弱毒性及び温度感受性における斬進的な増大は2個のヌクレオチド変化が関わっており、いづれか又は双方ともts及び弱毒表現型に寄与する。ts及び弱毒表現型に単独で関わっているLにおける4つの特異的な部位(即ち、cpts 530,cpts 530/1009,cpts 530/1030及びcpts 248ウィルスに特異的なもの)並びにcpts 248/404における一又は双方の部位は、突然変異すると弱毒化を供しうるRSVゲノム又はLタンパク質のコア領域として、ここで概説した発見により同定された。Lタンパク質における4つの部位にある特異的な突然変異は特異的なアミノ酸置換であるが、これらの部位及び特異的な部位の約5個のアミノ酸内での連続アミノ酸においてのその他のアミノ酸置換及びフレーム挿入又は欠失も弱毒化を供しうるようである。
Lにおけるコードされたアミノ酸変化はパラミキソウィルスポリメラーゼタンパク質間での最高の配列保存性領域、推定ATP結合部位(Stecら、Virology 183:273-287(1991))、又はRNA依存性RNA及びDNAポリメラーゼのモチーフに相同性であると考えられている領域には関与しないようである(Pochら、EMBO J.8:3867-3874(1989))。これらの突然変異の効果は、突然変異が3’及び5’ゲノム末端内、且つ短い遺伝子開始及び遺伝子終止配列にないことを条件に、ヌクレオチドレベルよりはむしろアミノ酸レベルにあるようである。これらの領域は効率的なエンカプシデーション、転写、複製及びビリオンへのパッケージングのために必要な全てのcis作用RNA配列を含むと考えられる(Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9663-9667(1991);Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996)、それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。
これらの結果はtsRSV突然変異体の第一全長配列を供する。これらの結果は更に、肺炎ウィルスがアミノ酸変化又は例えばGS配列における変化をもたらす1個のヌクレオチドの置換により弱毒化されることを示唆する。cpts 248及びcpts 530ウィルスはin vitro及びin vivoの双方においてts表現型の高度な安定性を有するため、この表現型は一つの異なるアミノ酸変化に関わっていることが驚くべきことに事実である。重要なことには、cpts 248/404,cpts 530/1009及びcpts 530/1030に弱毒表現型に寄与する少なくとも3つの突然変異を含み、その2つはtsであり、そして1つは非tsであり(例えば5つのcp突然変異)、そしてこれはin vitro及びin vivoでのこれらのウィルスの高レベルな安定性のある程度非限定的な説明となる。
RSVワクチンウィルス株の完全配列及びその親ウィルスの決定はワクチンウィルス生産の際の及び臨床試験におけるボランティアによる死滅(shedding)の際のワクチンウィルスの安定性の遺伝子レベルでの分析を可能にする。cpts 248,cpts 530,cpts 248/404,cpts 530/1009及びcpts 530/1030ウィルスの弱毒及びts表現型の遺伝子基礎の決定は重要な新たな機会を提供する。以降に記載の組換方法に従うと、完全RSV cDNAの部位特異的突然変異誘発により新規のワクチン候補を作製することが容易に可能となり、それから感染性ウィルスを回収することができる。例えば、cpts 248/404ウィルスの如きのcDNAクローンにアミノ酸位置521(cpts 530突然変異体における)もしくは1169(cpts 530/1009突然変異体における)にあるts突然変異の一方もしくは双方及びその他の弱毒化もしくは安定化突然変異を所望通りに付加することが可能である。このようにして、cpts 248/404ウィルスの弱毒化のレベルは斬進的に増大でき、そして安全性及び免疫原性の双方について所望される特異的な弱毒化レベルを有するワクチン株が合理的な作製されうる。同様に、cpts 530/1009及びcpts 530/1030突然変異体の弱毒化レベルはcpts 248/404ウィルスへの1又は複数の弱毒性突然変異の特異的な導入により上昇しうる。生物学的に誘導された突然変異株からの複数の弱毒性突然変異の組込まれた組合せ組換ウィルスのこのような例は、遺伝子的に安定であり、十分に弱毒化されたウィルスを慣用のアプローチにより単離及び製造することを達成するに至る幾多の問題を解消する。更に、このような組換cpts RSV突然変異体の表現型安定性は、可能なら、弱毒表現型を授けることで知られる特異的なアミノ酸を特定するコドンでの2以上のヌクレオチド置換を導入することにより増強しうる。このようにして弱毒表現型の安定性は全長RSV cDNAの部位特異的突然変異誘発により強化されうる。
実施例VII
RSVアンチゲノムをコードするcDNAの構築
RSV株A2のアンチゲノムをコードするcDNAクローンを図2に示すように構築した。このcDNAはプライマーとして合成オリゴヌクレオチドを、そして鋳型として細胞内RSV mRNA又は精製ビリオンから単離したゲノムRNAを用い、逆転写(RT)及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりセグメントで合成した。最終cDNAにはリーダー末端においてT7 RNAポリメラーゼのプロモーターが隣接し、それは至適活性のための3個の転写G残基を含んだ。転写はアンチゲノムの5’末端に対するこれら3個の非ウィルスG1の付加をもたらすであろう。ほぼ正確な3’末端を作り上げるため、cDNAトレーラーを前述のハンマーヘッドリボザイムに隣接するように構築し、そのリボザイムは切断によりコードRNAの3’末端に1個の3’−ホスホリル化U残基を付与するであろう(Grosfeldら、J.Virol.69:5677-5686(1995):引用することで本明細書に組入れる)。このリボザイム配列にはT7 RNAポリメラーゼのターミネーターのタンデムペアーが続く。(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)リポーター遺伝子を含むcDNAコード化RSVミニゲノムに対する3個の5’G残基及び1個の3’U残基の付加はRSVが相補したときのCATの発現に何ら影響を及ぼさなかった。)
図2はcDNA及びコード化アンチゲノムRNAの構造を示す。アンチゲノムのダイアグラム(頂部)は下記の特徴を含む:T7プロモーターにより寄与される5’末端非ウィルスGトリプレット、1099(これは1nt長くする)、1139,5611及び7559での4つの配列マーカー、リボザイム及びタンデムT7ターミネーター、並びにリボザイム切断による3’末端に寄与する1個の非ウィルス3’ホスホリル化U残基(切断部位は矢印で示す)。
完全アンチゲノムを概して占めるクローン化cDNAセグメント(図2、中央)はRSV mRNA又はゲノムRNAのRT−PCRにより構築した。この完全アンチゲノムcDNAはD46又はD53と呼ぶ。異なる名称は同一のプラスミドの異なる調製品を意味する。アンチゲノムの左端を含み、T7プロモーター及びSH遺伝子に対して相補性な領域に広がり、且つD13と称されるcDNAをpBR322の1のバージョン(図2、下)において組立てた。そのバージョンにおいては天然BamHI部位が突然変異誘発により失われており、そしてPstI−EcoRIフラグメントは組立てを促進するためにデザインした固有制限部位(BstBI,BstXI,PacI,BamHI,MluI等)を含む合成ポリリンカーで交換されている。図2における枠はBamHI部位の除去を示す。天然BamHI−SalIフラグメント(BamHI部位は下線を付してポジティブセンスにおける上線分において示す)をPCR作製BglII−SalIフラグメントと交換した(BglII部位は下線を付して下線分において示す;その4nt接着末端(イタリック体)はBamHIと適合する)。これは1nt変化(下線を付した中線分)をもたらし、それはアミノ酸レベルでサイレントであった。ベクターへのこれらの修飾はアンチゲノムcDNAにおけるBamHI部位を固有にすることによりcDNAの構築を助長した。
G,F及びM2遺伝子を、L、トレーラー並びに隣接するリボザイム及びタンデムT7転写ターミネーターとして別のプラスミドの中で組立った。G乃至M2ピースを次にリーダー乃至SHプラスミドのPacI−BamHIウィンドーの中に挿入した。これはBamHI乃至MluIウィンドーに挿入されたL−トレーラーリボザイム−ターミネーターピースのための受容体となり、完全アンチゲノムを供する。
4つの制限部位マーカー(図3)を、RT−PCRにおてい用いるオリゴヌクレオチドプライマーに変化を組込むことによる本来の構築の際にアンチゲノムcDNAの中に導入した。これは組立てを促進するために行い、組換ウィルスを同定する手段を供し、そして感染性RSVに変化を導入する能力を具体化する。3つの部位は遺伝子間領域にあり、そして4番目は非翻訳遺伝子領域の中にあり、そしてそれらは全部で5ntの置換及び1ntの挿入を包括する。これはコードアンチゲノムの長さを野生型のそれから1つ伸ばし、全部で15,223ntにする(SEQ ID NO:1、これはD46の5’から3’に至るポジティブ−センス配列を示し、一方でゲノム自体はネガティブ−センスである;4位はGでもCでもよいことに注意)。
配列マーカーを図3に示すようにcDNAコード化アンチゲノムRNAに挿入した。配列はポジティブセンスであり、そしてリーダー領域相補体の第1ntに対して1と番号付けした;サブグループA及びBのそれぞれを代表する株A2及び18537(Johnson and Collins,J.Gen.Virol.09:2901-2906(1988);引用することで本明細書に組入れる)の間の一致はドットで示す;cDNAにおける制限部位を示す配列には下線を付した;GS及びGE転写シグナルは枠で囲った;1141位のN翻訳オープンリーディングフレームの開始コドンはイタリック体とし、そして配列マーカーを各配列の下に示す。最上配列において、1個のC残基を1099位に挿入してNS2−N遺伝子間領域の中にAflII部位を構築し、そしてN翻訳オープンリーディングフレームのすぐ上流の1139及び1140位にあるAGをCCと交換して新たなNcoI部位を構築した。中央配列において、5612及び5616位それぞれのG及びUの置換はG−F遺伝子間領域において新たなStuI部位を構築した。そして、図3の最下配列において、7560位でのC置換はF−M2遺伝子間領域における新たなSphI部位を構築した。
cDNAは全て組立ての前に、ほとんどの場合複数の独立cDNAから、その全体を配列決定した。個々のRNAタンパク質をコードするプラスミドはGrosfeldら、J.Virol.69:5677-5686(1995)及びCollinsら前掲(1995)に記載されている。それぞれ引用することで本明細書に組入れる。完全cDNAも組立ての後に全体を配列決定した。
実施例VIII
組換RSVのトランスフェクション及び回収
cDNA発現化アンチゲノムから感染性RSVを製造するための本発明の方法は、それと、(i)RNA複製できるアンチゲノムヌクレオカプシドを生成し、且つ(ii)子孫ゲノムヌクレオカプシドをRNA複製及び転写の双方に対してコンピテントにするのに十分であるRSVタンパク質との同時発現を包括する。ゲノムヌクレオカプシドによる転写は全ての他のRSVタンパク質を供し、そして大量感染を開始せしめる。
当該アンチゲノムをコードするプラスミド担持cDNAを、タンパク質N,P,L及びM2(ORF1)をコードするプラスミドと一緒に、T7 RNAポリメラーゼを発現する最近発表されたワクシニアウィルスMVA株組換体(Wyattら、Virol.210:202-205(1995);引用することで本明細書に組入れる)で感染を施したHEp−2細胞にトランスフェクションした。このMVA株は鳥類細胞において自由に増殖し、一方哺乳動物においては感染性ウィルスの生産性を著しく低めるビリオン成熟における後期段階にてブロッキングがある宿主域突然変異体である。HEp−2細胞において、MVA組換体はより汎用されているWRベース組換体(Fuerstら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8122-8126(1986))に、T7ポリメラーゼの発現レベル及び細胞病原性の点で似かよっているが、生成される子孫のレベルは上清液が最少限の細胞病原性をもって新たな細胞へと継代されうるほどに十分に低いものであった。これはトランスフェクションされたワクシニアウィルス感染細胞において生成されうる任意の組換RSVの回収を促進するであろう。
組換RSVのトランスフェクション及び回収は下記の通りに実施した。HEp−2細胞の単層培養物に、6穴ディッシュのウェル1個当り、最終容量0.1mlのOpti−MEM(Life Technology)培地の中で5種のプラスミド、即ち、0.4μgづつのアンチゲノム、N及びPプラスミド、並びに0.1μgづつのL及びM2(ORF1)プラスミドを混合することにより調製した1mlの感染−トランスフェクション培地を与えた。これを12μlのLipofect ACE(Life Technologies)を含む0.1mlのOpti−MEMと組合せた。室温で15分のインキュベーション後、これを2%の熱不活性化胎児牛血清及びT7 RNAポリメラーゼをコードする1.5×106pfuの株MVAワクシニアウィルス組換体(Wyattら、前掲)と組合せた。これを当該細胞に加え、そして1日後に2%の血清を含むOpti−MEMで置き換えた。培養物を32℃でインキュベーションし、そして3回目に回収した。32℃でのインキュベーションを利用し、なぜならMVAウィルスは若干温度感受性であり、そしてこの低めの温度ではるかに効率的であることがわかったからである。
3回目の後トランスフェクション浄化培養上清液を新たなHEp−2細胞に継代し、そしてメチルセルロース(その後の抗体染色のため)又はアガロース(プラーク単離のため)をかぶせた。メチルセルロースの下で5日間インキュベーションした後、細胞をMurphyら、Vaccine 8:497-502(1990)の一般手順に従い、RSV Fタンパク質に対する3種のネズミモノクローナル抗体の混合物、それに続く西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗マウス抗体を利用する間接西洋ワサビペルオキシダーゼ法により固定及び染色した。
数多くのRSV株プラークが細胞病原性のバックグランドに対して検出され、それはおそらくはMVA−T7組換ウィルスのレベルの低さに原因する。プラークは茶−黒色により示される通り大量のRSV Fタンパク質を含み、そしてRSVの細胞病原効果、特にシンシチウム形成を示した。
RSV様プラークをプレートから拾い、それをアガロースの下でインキュベーションし、そしてニュートラルレッドで染色した。それらを繁殖させ、そしてプラークアッセイ及び抗体染色によりRSV株A2の実験室株と比較した。トランスフェクション化培養物に由来するプラークは実験室株に非常に似ていた。一の相違はこのトランスフェクション化培養物に由来するプラークが実験室株に由来するそれよりも若干小さく、中心があまりはっきりしないことにあった。この組換ウィルスはこの特定の野生型単離体とは表現的に相違し得、おそらくは細胞間流布において若干一層制限され、そして低い細胞殺傷率を示すであろう。放出されたウィルスの増殖に関し、HEp−2細胞における組換ウィルス、対、実験室ウィルスの収率は32℃又は37℃において本質的に同じであった。事前の研究において、当該組換ウィルス及び実験室ウィルスは細胞内RSV mRNA及びタンパク質の沈着に関して区別できなかった。
プラーク精製した三重継代組換RSVを実験室ウィルスと平行して、4つの挿入マーカーが隣接する3組のプライマーペアーを用いるRT−PCRにより分析した。3つの独立したプラーク精製組換RSV単離体を平行に未感染コントロール培養物で増殖させた。浄化培地上清液をポリエチレングリコール及び高塩で処理して(Zoller and Smith,DNA 3:479-488(1984))ウィルスを沈殿させ、そしてRNAをTrizol(商標)(Life Technologies)によりこのペレットから抽出した。これらのRNAを、RNAの添加していない又は株A2の実験室単離体由来の0.1μgのRNAの更なるコントロールと平行に、DNAaseで処理し、再精製し、50ngづつのランダムヘキサマーとアニールさせ、そして逆転写酵素と共に又は抜きで標準のRT条件下(40μlの反応体)でインキュベーションした(Connorsら、Virol.208:478-484(1995);引用することで本明細書に組入れる)。各反応体のアリコートを3通りの合成デオキシオリゴヌクレオチドプライマーペアーを用いたPCRにかけた(94℃で45S,37℃で30S,72℃で1分のサイクルを35回)。プライマーペアー(A):ポジティブセンス925−942位及びネガティブセンス1421−1440位は、NS2とN遺伝子との間の接合部及びN遺伝子内において挿入されたAflII及びNcoI部位を含む516bp(組換ウィルスの場合は517bp)の推定生成物を供する。プライマーペアー(B):ポジティブセンス5412−5429位及びネガティブセンス5930−5949位は、GとF遺伝子との間の接合部において挿入されたStuI部位をまたぐ538bpの推定生成物を供する。プライマーペアー(C):ポジティブセンス7280−7297位及びネガティブセンス7690−7707位は、FとM2遺伝子との間の接合部において挿入されたSphI部位をまたぐ428bpフラグメントを供する。PCR生成物を1%のアガロース及び2%の低融点アガロースを含む中性ゲルで、HaeII消化X174 DNA分子長マーカーと平行に電気泳動させ、そしてエチジウムブロミドで染色して目視化することにより分析した。予測サイズのPCR生成物が製造された。それぞれ生産性はRT段階に依存し、それぞれが夾雑cDNAではなくRNAに由来することを示唆する。
PCR生成物を制限酵素による消化により分析した。AflII又はNcoIによるプライマーペアーAの生成物の消化は推定177及び340bp(AflII)又は217及び300bp(NcoI)に相当するフラグメントを供した。StuIによるプライマーペアーBの生成物の消化は推定201及び337bpに相当するフラグメントを供した。プライマーペアーCとSphIとの反応に由来する生成物の消化は推定147及び281bpに相当する生成物を供した。これらの消化物は上記の通りにしてゲル電気泳動により分析した。AflIIにより消化されずに残ったPCR生成物の存在は、再消化により確認された通り、不完全消化による。即ち、制限酵素消化は組換ウィルスを代表するPCR生成物が予測の制限部位マーカーを含み、一方実験室株を代表するものはそれを含まないことを示した。クローン化PCR生成物のヌクレオチド配列分析はこれらの配列が制限部位マーカーをまたいでいることを確証せしめた。
表38において示す通り、N,P,L及びM2(ORF1)により相補されたRSV生産の効率は比較的高く、3回の実験において0.4μgの仕込みアンチゲノムcDNA及び1.5×106の細胞当り平均9.9〜94.8個のプラークに範囲した。これらのプラークは液体上層に由来するため、もとのトランスフェクションの各ウェルの中に存在する感染細胞の数はわからない。ほぼ全てのトランスフェクションウェル(表38において56のうちの54)がウィルスを生成した。感染細胞当り放出されたRSVの収率は理想的な条件下でさえも典型的には非常に低く(〜10pfu)、そして多くのウェルはこの量の何倍(169プラークまで)も生成するため、多くのトランスフェクション細胞ウェルの中に複数のRSV生産細胞が存在したようである。
表38に示すように、任意のプラスミドを入れないと、RSVは回収されなかった。M2(ORF1)の要件は、完全遺伝子M2(ORF1+2)でも、その仕込cDNAのレベルが低いとき(1.5×106細胞当り0.016μg)、満たされることができる(表38)。高いレベルにおいては、ウィルスの生産性は著しく低まり、M2(ORF2)に関わるミニゲノムRNA合成の阻害も大量感染の際に完全ゲノムに及ぶことが示唆される。
これらの結果は感染性RSVの生産性が、N,P及びLに加えてM2(ORF1)タンパク質の発現に非常に依存することを示した。更に、両ORFを含む完全cDNAもRSVの生産を支えているにもかかわらず、M2(ORF1)の発現の最適な方法はORF2が欠失した操作cDNAに由来することが示された。
かくして、本発明はRSVによる転写が、ここではM2(ORF1)と命名し、そして以前まで22K又はM2(Collinsら、J.Virol.54:65-71(1985))と称されていた第4タンパク質を必要とする点で、以前に発表されたセグメント化していないネガティブ鎖RNAウィルスに由来するものと異なることを証明する。M2(ORF1)タンパク質はプロセッシブ順列転写に必須のRNAポリメラーゼ伸長因子であることが見い出された。CollinsらProc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996)。この要件は、本発明の一部として、感染性RSVに特異的な所定の変化を導入する能力を供する。
実施例IX
RSV株cpts 530の表現型特異的突然変異を組込むために修飾された感染組換RSVの構築
本例は本明細書に記載の組換方法を利用した感染性RSVへの特異的な所定の突然変異の導入を例示する。前述の通り、cpts 530 RSVの完全ヌクレオチド配列を決定し、そして親cpRSVに存在することで知られる5つの突然変異を更なる弱毒化誘導体において残した。一の追加のヌクレオチド変化がヌクレオチド(nt)位置10060において同定され、それは大ポリメラーゼ(L)タンパク質におけるアミノ酸位置521でのフェニルアラニン→ロイシン変化をもたらす(表37,39参照)。この1個のアミノ酸置換を野生型A2 RSVの全長cDNAクローンの中に単独で、又はcp突然変異と組合せて導入した。突然変異cDNAから回収した感染性ウィルスの分析はこの1個の突然変異が40℃にてHEp−2細胞単層培養物における組換cp 530のプラーク形成の完全な制限を特定することを示唆し、そして温度感受性レベルは5つのcpRSV突然変異の存在により影響されなかった。これらの発見は、Lタンパク質におけるアミノ酸位置521でのフェニルアラニン→ロイシン変化が、cpts 530のts表現型を特定する突然変異であることを特定する。同様に、一の更なるヌクレオチド変化がcpts 530/1009組換体において、そのcpts 530親ウィルスとの比較において同定された(表37)。12002位でのこのヌクレオチド置換はLにおける1169位でのアミノ酸変化を供し、その位置では野生型ウィルスにおけるメチオニンがcpts 530/1009突然変異体においてバリンと交換されている。この突然変異を組換RSVにも導入し、そして回収されたウィルスは温度感受性であった。このような発見は1169位でのメチオニン→バリン変化を、cpts 530のそれよりも高いレベルのcpts 530/1009の温度感受性を特定する突然変異と特定する。
530,530/1009及び530/1030組換ウィルス間での温度感受性レベルをRSV−CAT又はRSV−ルシフェラーゼミニゲノム(前述)により、酵素アッセイ又はノーザンブロット分析によりモニターして確認した。例えば、37℃の高い温度では、野生型Lタンパク質に対する選定の突然変異体により生じたルシフェラーゼ活性は、1009,530及び二重突然変異pTM1−L支持プラスミドについて18.4%,1.5%及び0.4%であった。このような典型的な突然変異は、wtLタンパク質と比較して、32℃でのL機能を1009については活性70%、530については活性40%、そして530/1009Lタンパク質については活性12.5%低下させた。転写及び複製に対するこのような突然変異の効果は、ミニゲノムシステムを、単独で、又は本明細書に開示の組換ウィルス法と組合せて利用して決定することもできる。
cpts 530及びcpts 1009特異的突然変異を規定の弱毒化組換RSVワクチンウィルスに組込むため、本明細書に記載のcDNAベース回収システムを下記の通りに利用した。以前発表されたRSV A2野生型全長cDNAクローン(Collinsら前掲(1995))をcDNAクローンにおけるnt位置1009におけるCの1個のヌクレオチド挿入(これはAflII部位を構築する)及び座4での全部で6個の異なるヌクレオチド置換を含むようにオリジナル構築体においてデザインした。かくして、天然ウィルス及びcDNAに由来する組換ウィルスについてのヌクレオチド番号付けは1099位以降では1ntづれている。上記表36及び37におけるヌクレオチド番号は天然ウィルスについての位置を意味し、一方cDNAクローン(表39)及びcDNAクローンに由来する組換ウィルスについてのそれは1ヌクレオチド多い。6つのヌクレオチド置換のうちの1つはゲノムセンスにおけるリーダー配列のnt位置4でのG→C変化である。このヌクレオチド変化は非組換RSVにおいて検出され、そして組織培養物又はマウスにおけるウィルス複製の温度感受性に対する効果を有することは認められなかった(Firestoneら、Virology 225:419-522(1996);引用することで本明細書に組入れる)。表39は本例及び以降の実施例におけるRSV cDNAの中に挿入された様々な突然変異を挙げている。
ポジティブセンスRSVアンチゲノムをコードする全長RSV cDNAクローンD53を組立てるために中間クローン(D50及びD39)を利用した。D50プラスミドはリーダーからT7プロモーターの下流のM2−L重複に至るまでのRSVゲノムを含み、一方D39プラスミドは全長L遺伝子及びトレーラー、それに続くハンマーヘッドリボザイム並びにBamHI及びMluI制限部位により境界付けされている2つのT7ターミネーター(長さ約7kb)をコードする。感染性ウィルスを釣り出すためにトランスフェクションにおいて利用した全長RSV cDNAクローン(D53)はD39プラスミドのBamHI−MluIフラグメントをD50プラスミドの中に挿入することにより組立てた(米国特許出願第08/720,132号及び公開PCT出願PCT/US96/15524を参照のこと:それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。D50を更に複数のピースに分け、それぞれを突然変異誘発の促進の目的のためにファージミドプラスミドの中に入れた:1のピースはN遺伝子を含むXbaI−EcoRIフラグメント(cDNA pUC118.D50N)であり、そして1のピースはF及びM2遺伝子を含むStuI−BamHIフラグメントである(pUC118.F−M2)。D39を更に2ピースに分け、それぞれを別々のファージミドプラスミドに入れた:1ピース(左半分、cDNA pUC119.L1)はBamHI部位からヌクレオチド12255にあるPmlI部位に及び(ここで制限部位の位置に付けた配列位置は説明ガイドであり、単独で関与する全てのヌクレオチドを正確に規定するものではない)、そして他方のピース(右半分、cDNA pUC119.L2)はPm/I部位からT7ターミネーターの終わりに至る。
突然変異を標準の手順(例えばKunkelら、Methods Enzymol,54:367-382(1987);引用することで本明細書に組入れる)に従い、図4の最下行に示すpUC118−及びpUC119−ベース構築体の中に入れた。これらのプラスミドを、E.コリのdut ung株、本件の場合、CJ236の中で繁殖させ、そして一本鎖DNAをヘルパーファージ、本件の場合、M13K07での感染により調製した。それぞれ1又は複数の注目のヌクレオチド変化を含むホスホリル化合成オリゴヌクレオチドを調製し、単独で又は組合せ一本鎖鋳型にアニールし、そしてT4 DNAポリメラーゼによる直接DNA合成に用いた。これらの生成物をライゲーションし、そしてE.コリの非dut ung株、本件の場合、DH5アルファー又はDH10Bの中に形質転換せしめた。形質転換コロニーのミニプレプDNAを制限酵素消化又は突然変異した領域のヌクレオチド配列分析により突然変異の存在についてスクリーニングした。適当な突然変異を含むフラグメントをpUC構築体からD50又はD39プラスミドに戻し、それを全長クローンD53へと組立てた。組換ウィルスをHEp−2細胞において、D53プラスミドをN,P,L及びM2(ORF1)タンパク質をコードする支持プラスミドの混合物と上述の通りに相補させることにより回収した。
4タイプの突然変異が本例及び生物学的に誘導された突然変異を導入する特異的な組換RSVを説明する以降の実施例に関わっている(表36,37,39参照)。
(1)第一グループの突然変異はまとめて「当該部位」突然変異と呼ぶL遺伝子の中に導入された6つの翻訳的にサイレントな新しい制限部位マーカーを含む。これらの6つの当該部位はBsu36I,SanBI,PmeI,PsrII,BstEII及び第二の下流SnaBI部位であり、そして図4においてD53ダイアグラムの上にて下線を付してある。集約的に「当該部位」突然変異と呼ぶこれら6つの変化をcDNA構築の促進の目的のために挿入した。また、D53と支持プラスミド、即ち、N,P,M2(ORF1)及びLプラスミドとの間でのトランスフェクションの際に組換が起こりうる(GarcinらEMBO J.14:6087-6094(1995);引用することで本明細書に組入れる)。Lにおけるこれらの制限部位はD53構築体の中にあるが、L支持プラスミドの中にはなく、それ故Lにおける組換が生じなかったことを確証するマーカーを担う。これは特に重要であり、なぜなら多くの弱毒突然変異がLに認められるからである。
(2)第二グループの突然変異はF遺伝子内の2個のアミノ酸変化を包括する(図4、表39)。cpRSV、それ故その全ての誘導体はHEK−7と呼ぶ野生型ウィルスより誘導される。オリジナルのD53 cDNAはHEK−7のそれとは7位での1個のヌクレオチド置換により相違する。1つはヌクレオチドであり、それはオリジナルD53においてはC(ネガティブセンスにおいて)、そしてHEKウィルスにおいてはGである。しかしながら、生物学的に誘導されたウィルスはいづれかの記号を含むことが示され、そしてこの2つの間で変動でき、従ってこの相違は人為的と考えられ、従ってここでは更に検討しない。4つのその他のヌクレオチド置換はアミノ酸レベルでサイレントであった;これらはFにおける6222及び6387位での2つ変化であり、一方はF−M2遺伝子間領域における7560位、そして他方はLにおける10515位にある。これらも重要とは考えず、そして更に検討することはしない。最後に、2つのヌクレオチド置換があり、それぞれF遺伝子内にあり、それぞれアミノ酸置換をもたらしている(表39)。まとめて「HEK」と呼ぶこれら2つの変化はD53の中に、コード化組換野生型ウィルスがアミノ酸レベルにおいて生物学的に誘導されたcpts突然変異体のHEK−7野生型親株と同一となるであろうように導入した。これらの変化はcDNA及び回収ウィルスにおける導入突然変異の存在をモニターする目的のために新たな制限酵素認識部位を導入するためにもデザインされていることに注目すべきである。
(3)第三グループの突然変異はまとめて「cp」突然変異と呼ぶcpRSVウィルスの中に見い出せる5個のアミノ酸置換を包括する。これらは全ての生物学的に誘導されたcptsウィルスの中に存在し、そして弱毒表現型に寄与する。生物学的に誘導されたcpRSVにおいて、これらのアミノ酸変化それぞれは単一のヌクレオチド変化による。表39に示す通り、アミノ酸コード変化をcDNAの中に導入して組換ウィルスを作ると、5例のうち4例においてそれぞれのコード変化は2つのヌクレオチド置換を包括するようになされ、このことは組換RSVが野生型への復帰に対して非常に抵抗性なものとする。これらの変化のうちの4つは新たな制限酵素部位を導入するようにデザインされており、一方5番目は現存の部位を排除するようにデザインされており、それ故組換ウィルスから作ったcDNA又はRT−PCR生成物における制限部位の有無により突然変異の存在をモニターする方法が供される。
(4)第四グループの突然変異は個々の生物学的に誘導されたcptsウィルス(表39、図4)に特異的な点突然変異を包括し、それらはそれらが獲得された生物学的段階の後に命名した。例えば、下記の実施例におけるcpRSVからのcpts 248/404ウィルスの誘導は2段階の突然変異誘発を包括する。第一はcpts 248ウィルスを供し、これは1個のアミノ酸変化を支持し、それ故248突然変異と呼ぶ。cpts 248に適用する第二の突然変異誘発段階はcpts 248/404ウィルスを供し、それは404(L)突然変異と呼ぶLにおけるアミノ酸変化及び404(M2)突然変異と呼ぶM2における遺伝子開始(GS)シグナルのヌクレオチド変化を含む。残りの突然変異、即ち、530,1009及び1030はそれぞれ1個の(別々の)アミノ酸変化を包括する。404(M2)突然変異は注目すべきであり、なぜならそれはGS転写シグナルを包括し(そしてタンパク質コード配列には関与しない)、またこの突然変異はミニゲノムシステムにおいてmRNAの合成のために重要であることが示されているからである。Kuoら、J.Virol.71:4944-4953(1977)(引用することで本明細書に組入れる)。表36,37及び39と概略してある通り、248,404(L)及び1009突然変異のアミノ酸コード変化を改善された遺伝子安定性の目的で2つのヌクレオチド置換を用いて組換ウィルスに挿入した。また、組換ウィルスに対する248,404(M2),404(L)及び1009突然変異を、モニターの目的のために新たな制限部位を導入するようにそれぞれデザインし、一方1030突然変異は現存の部位を排除するためにデザインした。
本例において、複数のpUC118−及びpUC119−ベース構築体をD50及びD39プラスミドから誘導し、そして所望の突然変異をこれらの構築体の中に導入した(図4,5)。適当な突然変異を含むフラグメントをpUC構築体から表示の通りにD50又はD39プラスミドに戻し、それを全長クローンへと組立てた。このようにして、6通りのタイプのD53全長誘導クローンを作った(図4,5)。図5において、D53構築体はFにおいて2つのHEK突然変異を欠く(図4参照)。
突然変異誘発をMuta−Gene(登録商標)ファージミドin vitro突然変異誘発キット(Bio-Rad,Hercules,CA)を用い、その製造業者の推奨通りに実施した。突然変異させた構築体をコンピテントE.コリDH10B(Life Technologies)に形質転換せしめた。形質転換コロニーのミニプレプDNAを制限酵素消化(下記参照)又は突然変異領域のヌクレオチド配列分析により突然変異は存在についてスクリーニングした。
6つの翻訳的にサイレントな制限部位マーカー、530突然変異(521phe→leu)及び5つのcp突然変異(表39)をpUCベース構築体の中に導入し、そして図4及び5に示す通りにD50及びD39プラスミドの中にサブクローニングした。様々な全長cDNA構築体を上記の突然変異の様々な組合せを含むD50及びD39構築体を用いて組立てた。
最終cDNA構築体において、530及びcp突然変異の存在を配列分析により確認し、一方サイレントな制限部位の存在は制限エンドヌクレアーゼ分析により決定した。各D53ベース構築体を様々な制限酵素(例えばHpaI,AccI,HindIII,PstI)を用いて分析し、そして新たに作製した全長cDNAクローンの制限パターンを予め釣り出した野生型全長cDNAクローンのそれと比較した。この制限分析は100nt以上の挿入又は欠失が全長プラスミドの細菌性増幅の際に生じたかを決定するために用いた。
トランスフェクションは既に発表されている通りに実施した(Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92:11563-11567(1995);引用することで本明細書に組入れる)。簡単には、HEp−2細胞の単層にT7 RNAポリメラーゼを発現する組換ワクシニアウィルスMVA株(MVA−T7)を1のMOIで感染せしめ、そしてD53アンチゲノム構築体とN,P,L及びM2(ORF1)pTM1支持プラスミドとによりLipofect ACE(Life Technologies)を利用してトランスフェクションせしめた。釣り出したウィルスの増幅のために3日目に上清液(浄化培地)を新鮮なHEp−2細胞に継代した。この第一増幅に由来するウィルス懸濁物を感染の5日後に回収し、そしてHEp−2細胞の単層上への様々な希釈率での接種後、プラーク測定のためにメチルセルロースを、又はプラーク回収及び生物学的クローニングのためにアガロースをかぶせた。プラーク測定は既に発表されているモノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ染色手順を利用して実施した(Murphyら、Vaccine,8:497-502(1990);引用することで本明細書に組入れる)。回収された組換ウィルスを3回の連続プラーク精製により生物学的にクローニングし、次いでHEp−2細胞での2回の継代を経てウィルス懸濁物を作るために用いた。この生物学的クローニングは回収ウィルスの均質集団を確保するために重要であり、なぜならRSVの全長cDNAを代表するプラスミドとRSV遺伝子を含む支持プラスミドとの間で、第一の釣り出し段階の際に組換が起こりうるからである(GarcinらEMBO J.,14:6087-6094(1995);引用することで本明細書に組入れる)。これら生物学的にクローニングされ、且つ増幅させたウィルス懸濁物を組換ウィルスの更なる分子遺伝子又は表現型特性決定において利用した。2つの生物学的にクローニングした組換ウィルスを各cDNA構築体のために作製したが(図5)、cpL 530−部位及びcp 530−部位については一つの生物学的クローンのみを作製した。各ケースにおいて、シスタークローンがあるとき、それらは下記の遺伝子及び生物学的分析に基づき区別できなかった。D53−530部位(他に、A2 ts 530−s cl1cp又はts 530−部位と命名)に相当する上記の構築体の代表例はブダペスト条約の規則に従いATCCに寄託してあり、そして受託番号VR−2545が付与されている。
上記の通りに作製した組換RSVを遺伝子的に特性決定し、それらが事実上各導入突然変異を含むかどうかを決定した。HEp−2細胞の単層を生物学的にクローニングした組換ウィルスで感染させ、そして総RNAを上記の通り感染の4〜5日後に回収した。RTをランダムヘキサマープライマーを用いて実施し、そして作製したcDNAをAdvantage(商標)cDNA PCRキット(Clontech Lab.Inc.,Palo Alto,CA)を用いるPCRにおいて鋳型として用い、組換RSVゲノムの全長のほとんどを占める3つのフラグメントを作製した。このPCRフラグメントはnt位置1−5131,5949−10751及び8501−15179の間のRSVゲノムに対応する。また、nt位置9665及び10209の間の530突然変異の領域におけるL遺伝子の一部を占める544bpのフラグメントを作った。この短いPCRフラグメントをサイクル配列決定において用い(71001デルタTAQ(商標)*サイクルシーケンシングキット、USB,Cleveland,OH)、回収組換ウィルスの中の530突然変異の有無を確認し、一方で大PCR生成物は制限酵素消化において用いてサイレント制限部位マーカー及び特異的な制限部位でマーキングしたcp突然変異の存在を確認した。
上記の方法に従って作った組換RSVが所望の表現型、即ち、組込まれた配列変化により特定される表現型を含むかを確認するため、組換RSV及び非組換コントロールウィルスのプラーク形成効率(EOP)を決定した。詳しくは、HEp−2単層培養物を利用する温度制御式湯浴の中での32,37,38,39及び40℃でのプラーク力価を既に発表されている通りに行った(Croweら、Vaccine,11:1395-1404(1993);FirestoneらVirology 225:419-522(1996);それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。プラークの同定及び測定は表示の抗体染色を利用して実施した。
組換ウィルス並びに野生型及び生物学的に誘導された突然変異cpts 530ウィルスの温度感受性レベルを表40に示す。これらのデーターはサイレント制限部位又はcp突然変異の導入がts表現型を供しないことを示す。この後者の所見はcpRSVがts*ウィルスであるという我々の以前の発見と一致する(Croweら、Vaccine,12:691-699(1994))。
上記の発見は生物学的に誘導されたcpts 530ウィルスのts表現型が上述の単一突然変異によりこの弱毒化RSV株に固有であることを特定する。cpts 530株の遺伝子分析をこれとの関連でA2野生型ts+親ウィルスの全長cDNAクローンへの導入、それに次ぐ530突然変異を担持するts組換ウィルスの回収により確認した。このウィルス並びに530及びcp突然変異を含む更なる組換ウィルスの温度感受性レベルの分析は、530突然変異により特定される温度感受性レベルが5つのcp突然変異により影響されなかったことを示す。かくして、本発明の方法及び組成物は530突然変異をts表現型特異的突然変異として特定し、それはそのcpRSV親のそれに勝るモデル宿主におけるcpts 530の更なる弱毒化に寄与するものである(Croweら、Vaccine,12:783-90(1994),Croweら、Vaccine,13:847-855(1995);それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。
以上の発見に加えて、1009突然変異又は1030突然変異の組換RSVへの、cpts 530突然変異との組合せにおける導入は、温度感受性レベルが対応の生物学的に誘導されたcpts 530/1009及びcpts 530/1030 RSV突然変異体のそれと同じある組換体を作製せしめる。
上記の発見は生きた弱毒化RSVワクチンを開発するための本発明の組換方法及びRSVクローンの重要な利点である。組換RSVへの選定の突然変異の挿入及びRSV A2 cDNAクローンからの突然変異体の回収は比較的効率的であった。本例において利用したアンチゲノムcDNAクローンはオリジナルの構築体において、6つのヌクレオチド置換及び1つのヌクレオチド挿入に関わる5つの異なる座での変化を含むように修飾されている。24の更なるヌクレオチドの置換に関わる更に12の座での突然変異を含む突然変異されたウィルスも述べる。530突然変異のみが組織培養において検出可能な表現型を授けるという事実は、この大型のRNAゲノムの比較的操作のし易さを示唆する。ワクシニアウィルスにより媒介される支持プラスミドと全長クローンとの組換が起こりうるが(Garcinら、EMBO J.14:6087-6094(1995))、その頻度はここで分析された10のウィルスそれぞれが、それらが由来するcDNAクローンの中に存在する突然変異を有するほどに十分に低い。即ち、所望レベルの弱毒化を達成するため、RSVの中に順次に更なる弱毒性突然変異を導入することは容易である。
弱毒性突然変異の直接同定のための本RSV回収システムの実証済みの用途及び組換RSVの操作の確立された成功はその他の所望の突然変異の同定及び生きた感染性RSVクローンへのその組込みを可能にする。cpRSVウィルスの臨床研究及び配列分析による従前の発見はcpRSVの中に存在する5つの非ts突然変異のセットが血清陰性ヒトのための弱毒性突然変異であることを示唆した(Connersら、Virology,208:478-84(1995),Firestoneら、Virology,225:419-522(1996),Friedwaldら、JAMA,203:690-694(1968),Kimら、Pediatrics,48:745-755(1971);それぞれ引用することで本明細書に組入れる)。これら及びその他の突然変異をここに記載の方法を利用して弱毒化及び/又はts表現型に対するその確認された特異性について選定し、そして弱毒性突然変異のメニューへと組立てることができる。ts及び非ts双方のこれら及びその他の弱毒性突然変異はRSV A2野生型へと導入でき、弱毒性及び免疫原性との適正なバランスについて選定された生きた弱毒化ウィルスを作り上げることができる。これとの関連で、530及びその他の同定されたts突然変異がヒトにおいてRSVに対する防御性免疫応答を誘導するG及びF糖タンパク質にないことは有利である。これは、F及びGの外に突然変異を有する弱毒化RSV cDNA骨格の開発を可能にし、かかる骨格はRSVサブグループBのF及びG糖タンパク質又は上皮学的に異なるサブグループA株のそれらをA2F及びG糖タンパク質で置換できうるcDNA支持体を担うことができる。このようにして、生きた弱毒化RSVワクチンはサブグループA株内での抗原性ドリフトに合うようにす早く改良でき、そしてサブグループBワクチン成分もす早く製造できうる。
実施例X
RSV株cpts 248/404の表現型特異的突然変異を組込むように修飾された感染性組換RSVの構築
本例は本明細書に記載の組換手順及び材料を用いて感染性RSVの中に所定の弱毒性突然変異を導入するため更なるデザインを例示する。
RSV A2 cpts 248突然変異体の従前の配列分析もL遺伝子におけるアミノ酸位置831でのグルタミン→ロイシン置換の単一突然変異を特定した(表39;Croweら、Virus Genes,13:269-273(1996);引用することで本明細書に組入れる)。この突然変異は本明細書における方法により弱毒性且つtsであることが確認された。更に弱毒化されたRSV突然変異cpts 248/404の配列分析は2個の更なる突然変異、即ち、M2遺伝子開始配列におけるnt変化及びLタンパク質におけるアミノ酸位置1183でのアスパラギン酸→グルタミン酸を示した(表39;Firestoneら、Virology 225:419-522(1996);引用することで本明細書に組入れる)。
生物学的に誘導された弱毒化RSV株cpts 248/404を上記方法に従って組換ウィルス(rA2cp/248/404)として再構築した。rA2cp/248/404ウィルスをコードするcDNA 53を当該部位、HEK,cp,248及び404変化の挿入により構築した(表39)。組換ウィルス(rA2cp/248/404)を回収し、プラーク精製し、そして増幅させた。組換ウィルスにおける突然変異の存在をウィルスRNAのRT−PCR、それに次ぐ制限酵素消化もしくはヌクレオシド配列決定又はその両者により分析した。rA2cp/248/404組換体をpTMLwt又はpTML248/404支持プラスミドのいづれかを用いて回収した。その後者は生物学的に誘導されたcpts 248/404突然変異体の中に存在するLにおける突然変異の全てを含む(表39,530,1009又は1030ウィルスに特異的な突然変異を含まない)。支持プラスミドとしてのpTML248/404の利用は支持プラスミドとの相同組換による全長クローンに存在する248/404突然変異の消失を排除する。
組換ウィルスを当該部位及びHEK突然変異(表41においてrA2)のみが存在するD53 DNAから回収し、これらの変化が予想通り事実上表現的にサイレントであることを実証する。当該部位、HEK及びcp突然変異を含む組換ウィルスを回収し(表41ではrA2cpと呼ぶ)、cp突然変異により特定される表現型を評価した。また、表41に示す通り、当該部位、HEK及びcpバックグランドを(i)248突然変異(rA2cp/248)、(ii)2つの404突然変異(rA2cp/404);及び404(M2)突然変異(rA2cp/404(M2))及び404(L)突然変異(rA2cp/404(L))と共に含む別のウィルスを構築した。
これらをウィルスを平行して、32℃,36℃,37℃,38℃及び39℃にてHEp−2細胞においてプラークを形成する能力について評価した。この対比は全てのウィルスが32℃でプラークを形成することを示し、そして様々なウィルス調製品の力価が互いにほぼ3log10単位以内にあることを示し、それはRSVの個々の調製品間で典型的に認められる実験変動範囲内である。追加した「当該部位」及びHEK突然変異の野生型組換ウィルスへの導入(ウィルスA2を作るため)は、生物学的に誘導された野生型ウィルス(ウィルスA2wt)と比べ、高温で増殖するその能力に関して当該ウィルスを改変しなかった。これは予測の結果であり、なぜなら突然変異が由来する生物学的に誘導されたcpRSVがts表現型を有さないからである;その突然変異は宿主域多様性である。Lにおける404突然変異はts突然変異でないようであり、なぜならrA2cp/404(L)はtsでないからである。しかしながら、この突然変異は本来弱毒性であることが証明されており、それは本明細書における方法に従う更なる分析により決定される。かくして、cpts 248/404ウィルスにおける2つの特異的な突然変異のうち、404 M2突然変異のみがtsである。248及び404突然変異の更なる追加(rA2cp/248/404ウィルスを作るため)はその生物学的に誘導された同等のウィルスと本質的に同等なts表現型を供し、それは36℃〜37℃でプラークを形成する能力が、その温度でピンポイントプラークが形成されることをもって著しく損なわれていることで証明された。これらの組換ウィルスは組織培養における増殖に対して効果を有さないと推定される様々な突然変異、及びts表現型を供するものと予測される更なる突然変異を含んでいた。各タイプの突然変異はこのような予想と一致する結果を供し、RSVゲノムが合理的に予想できる手段で操作できうることが実証される。
表41は248及び404突然変異誘発段階に特異的な突然変異の更なる特性決定を示す。詳しくは、ウィルスを当該部位、HEK及びcpバックグランドを、(i)248突然変異(ウィルスrA2cp/248を作るため)、(ii)2つの404突然変異(ウィルスrA2cp/404);又は404(M2)突然変異(ウィルスrA2cp/404(M2))(表39)の追加と共に用いて構築した。これら3つのウィルスはそれぞれts表現型を示し、これらの突然変異がtsであるという直接的な同定を供した。248突然変異は低めレベルの温度感受性を供し、一方404(M2)突然変異は非常にtsであり、そして404(L)突然変異の追加により強化されなかった。404(M2)突然変異がtsであることは驚くべきことであり、なぜならそれは転写開始、又は遺伝子開始(GS)シグナルにおける点突然変異であり、そしてこのタイプの突然変異がtsであることは示されていなかったからである。
実施例XI
多重弱毒化親ウイルスからの所定の弱毒化変異体を組み合わせる組換えRSVの作製
本実施例は、1つの生物学的に得られたRSV株(特にcpts 284/404)からの3つの弱毒性変異及び他のRSV株(cpts 530)からの更なる弱毒性変異を組み込む多重に弱毒化された組換えRSV(rA2cp/248/404/530)を生産するための組合せデザインを詳述する。この組換えRSVは、RSVワクチンにおける弱毒化のレベルを細かく調節するために弱毒化変異を段階的に操作するための本発明の方法であって、多重変異がワクチン株の更なる弱毒化された表現型に寄与し、遺伝→安定性を増強させることを特徴とする方法を例示する。
先の実施例IX及びXのcDNA及び方法を、当該部位HEK,cp,248,404及び530の変化を含む、D53 cDNAを作製するのに用いた(表39)。これは、4つの別個の生物学的に誘導されたウイルス、即ちcpRSV cpts 248,cpts 248/404及びcpts 530からの弱毒性変異の組合せに関する。組換ウイルス(rA2cp/248/404/530)を回収し、プラーク精製して増幅した。変異の存在はウイルスRNAのRT−PCRの後の制限酵素消化もしくはヌクレオチド配列決定又はそれら両方により分析した。rA2cp/248/404/530はLにおいて248変異を欠いていたが、530変異及び他の248/404変異を有していた。
rA2cp/248/404ウィルスを上述のように、その32℃,36℃,37℃,38℃及び39℃においてHEp−2細胞内でプラークを形成する能力について評価した(表41)。32℃において全てのウィルスがプラークを形成し、この温度における増殖の効率において野生型と同様であった。rA2cp/248/404/530ウィルスはts表現型に関して生物学的に得られたcpts248/404ウィルスと本質的に等価であった。このことは、37℃においてプラークを形成する能力が大きく害されたことにより証明された。これにより、rA2cp/248/404バックグラウンドへの530変異の添加はそのts表現型を増加させなかったが、その組換え体はLにおいて248変異を欠いていた。
このこと及び先の実施例に基づいて、本発明は、生物学的に得られたRSV変異体、例えば248,404,530,1009、又は1030生物学的変異体から同定及び確認されている変異のセットからの2以上のts変異を含む広範囲の種々の組換えウィルスの回収を可能にする。このような組換えウィルスの例は、248/404/530変異、248/404/1009変異、248/404/1030変異、248/404/530/1009変異、248/404/530/1030変異、248/404/530/1030変異、248/404/1009/1030変異の組合せ、又は本明細書に開示される弱毒性変異の他の組合せを有するRSVを含む。更に、生物学的に誘導されたRSV変異体から同定された1又は複数のts変異を組み込む組換えRSVは、本明細書に開示される他の変異、例えば弱毒性遺伝子欠失又はRSV遺伝子発現を調節する変異と組み合わせることができる。1つのこのような例は、生存能力のあるワクチン候補を生産する組換えクローンにおいて248/404変異をSH遺伝子欠失と組み合わせることである。更に、生物学的に誘導されたRSVからのいずれかの1又は複数のts変異並びに本明細書に開示されるいずれかの1又は複数の他の変異、例えば遺伝子又は遺伝子セグメントの欠失、置換、付加及び/又は転位を組み込むことができる他の組合せ変異体の宿主が供される。ts変異を弱めるよりむしろ宿主範囲を弱めるcp変異も、本発明における1又は複数の他の変異と共に含まれ得る。これは、弱毒化、免疫原性及び遺伝子安定性の個々の及び組合わせたレベルに関して広い範囲を示すウィルスのパネルを供する。生物学的に誘導されたRSV変異体からのこれらの弱毒化変異は、組換えRSVにおいて要求される表現型変化を更に特定する本明細書で同定される種々の他の構造的改変と更に組み合わせて優れたワクチン特性を有するなお更なるRSVを作り出すことができる。
実施例XIII
更なる外来遺伝子を発現する感染性RSウィルスの回収
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードする更なる遺伝子を含む組換えRSVを作製するために上述の方法を用いた。CATコーディング配列を、ウィルスRNA依存性RNAポリメラーゼのための転写シグナルであるRSV特異的遺伝子開始及び遺伝子終了モチーフに隣接させた。(Kuoら、J.Virol.70:6892-6901(1996)(引用により本明細書に組み込まれる))。RSV/CATキメラ転写カセットを、完全なcDNAコード化ポジティブセンスRSVアンチゲノムのG及びF遺伝子の間の遺伝子間領域に挿入し、感染性CAT発現性組換えRSVを回収した。CAT mRNAは有効に発現され、G及びFmRNAのレベルは野生型組換えRSVにより発現されるレベルに相当した。CAT含有及び野生型ウィルスは、主要なウィルスタンパク質の合成のレベルに関して同様であった。
CAT遺伝子を含むRSVアンチゲノムRNAをコードするcDNAの作製のためにプラスミドD46を用いた。(プラスミドD46及びD53(後者は上述される)は同じアンチゲノムcDNAの異なる調製物である。)完全な15,223−ヌクレオチドRSVアンチゲノムをコードするD46(野生型RSVのそれより1ヌクレオチド長い)を、上述のように、組換え感染性RSVを作り出すのに用いた。その作製の間、アンチゲノムcDNAをマーカーとして4つの新しい制限部位を含むように改変した。これらのうちの1つ、G及びF遺伝子の間のゲノム間領域内に位置したStuI部位(野生型ゲノムの3’−5’配列内の位置5611−5616)を、外来CAT遺伝子のための挿入部位として選択した。RSV GSシグナルが上流端に、及びRS GEシグナルが下流端に隣接したCAT ORFのコピーを、上述のRSV−CATミニゲノムから得た(本明細書に引用により組み込まれるCollinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9663-9667(1991)及びKuoら、J.Virol.70:6892-6901(1996))。このRSV/CAT転写カセットのStuI部位への挿入は、コードされたアンチゲノムの長さを全部で15,984ヌクレオチドまで増加させた(ブダペスト条約下でATCCに寄託され、受託番号VR−2544を受けた)D46/1024 CAT cDNAを作り出した。そして、野生型RSVは10の主要なサブゲノムmRNAをコードするが、D46/1024 CATアンチゲノムから予想される組換えウィルスは、CAT遺伝子を11のmRNAとしてコードするであろう。作製のストラテジーを図6に示す。
上述のようなcDNAにコードされたアンチゲノムRNAからの感染性RSVの生産は、ウィルスのRNA複製及び転写のために必要かつ十分であるアンチゲノムRNA又はN.P.L.もしくはM2(ORF1)タンパク質を別個にコードする5つのcDNAのHEp−2細胞内での同時発現に関連した。cDNA発現は、MVA株に基づくワクシニア−T7組換えウィルスにより供されるT7RNAポリメラーゼにより誘発される。MVA−T7組換えウィルスは継代に基づき広範囲の細胞病原性を引きおこすのに十分な感染性の子孫を作り出し、それゆえワクシニアウィルス複製のインヒビターであるシトシンアラビノシドを、トランスフェクション後24時間に加え、最初の6回の継代の間、維持した。しかしながら、シトシンアラビノシドの使用は要求されず、本明細書の後の実施例には用いなかった。
2つのアンチゲノムcDNA:D46cDNA及びD46/1024 CAT cDNAをRSVの回収についてテストした。各々が感染性の組換えRSVを作り出した。D46/1024 CAT組換えウィルスが感染した細胞は、豊富なレベルのCAT酸素を発現した。各々のウィルスについて、トランスフェクション上清を新鮮な細胞に植え継ぎ、全部で8つの一連の継代を、5〜6日間の間隔で、細胞当り0.1未満のPFUの感染の多重度で行った。
D46/1024 CATゲノム内のCAT配列をRSV GS及びGEシグナルに隣接させた。これにより付加的な別個のホツアデニル化されたmRNAとして発現されるはずである。この予想されるmRNAの存在を、8台目の継代におけるD46/1024 CATウィルス又はD46ウィルスを感染させた細胞からのRNAのノーザンブロットハイブリダイゼーションによりテストした。ネガティブセンスCAT特異的リボプローブとのハイブリダイゼーションは、ポリ(A)を含まない735ヌクレオチドを含むであろう予想されるCAT mRNAである適切な大きさのバンドである主要なバンドを検出した。この種はオリゴ(dT)ラテックス粒子により有効に保持され、このことはそれがポリアデニル化されたことを示す。特定の場合において、G−CAT読み過しmRNAであろう適切な大きさのものであるわずかなより大きなCAT特異的種を検出した。D46/1024 CATウィルスを、細胞内RNAを調製するために用いられる感染の前に、低い多重度の感染で8つの継代を行った。CAT遺伝子が欠失されたなら生じたであろうより短い形態のCAT mRNAの証拠はなかった。
複製ブロットを、CAT,SH,G又はF遺伝子に特異的なネガティブセンスリボプローブとハイブリダイズさせた。ここで、その後者2つの遺伝子は、挿入されたCAT遺伝子に隣接している。そのブロットは、サブゲノムSH,G及びFmRNAの発現が2つのウィルスについて類似していることを示した。D46/1024 CAT及びD46について、3つのRSV mRNAバンドの各々においてハイブリダイズした放射能の量を比較するためにリン光像分析を用いた。D46/1024 CATとD46との間の放射能の比を各々のmRNAについて決定した:SH,0.77:G,0.87;及びF,0.78。均一性からのずれは、おそらくD46に対してD46/1024 CATについてすこし少いRNAが充填されたことを示す。但し、D46/1024 CAT RSVについてmRNA蓄積の全体のレベルがすこし少いことも可能である。3つの比率が類似していることの証明は、これらmRNAの各々の発現のレベルがD46/1024 CAT対D46についてほぼ同じであったことを確認する。これにより、G及びF遺伝子の間のCAT遺伝子の挿入は、いずれの遺伝子の転写のレベルにも劇的に影響を与えなかった。
ウィルスタンパク質合成をキャラクタライズするために、感染したHEp−2細胞を(35S)メチオニンで標識し、そして細胞リゼートを直接に又は標識された抗原の回収が本質的に完全である条件下での免疫沈降の後に、PAGEにより分析した。精製されたRSVに対して生じたウサギ抗血清での沈降は、D46/1024 CAT及びD46ウィルスが両方とも主なウィルスタンパク質F1,N,P,M、及びM2の同じような量を発現することを示した。M2タンパク質の同様のレベルが各々のウィルスについて回収されたことは、その遺伝子が挿入されたCAT遺伝子の下流にあるので注目すべきであった。その挿入のすぐ下流に位置した遺伝子によりコードされるFタンパク質の蓄積も、3つの抗Fモノクローナル抗体の混合物での免疫沈降により検査した。各々のウィルスについて同じようなレベルの下、サブユニットが回収された。上述の主要なウィルスタンパク質のリン光像分析を、いくつかの独立した実験について行い、特定のサンプル間の変異性を示したが、全体として、回収されたタンパク質のレベルに基づいて2つのウィルスを区別することはできなかった。抗CAT抗体での沈降は、D46/1024 CATについての単一性を回収したが、D46ウィルスについては回収されなかった。全部の標識したタンパク質の分析は、N.P及びMタンパク質が、免疫沈降なしで検出することができず(後者は細胞の種との同時マイグレーションにより複雑であったが)、2つのウィルスが同様のパターンを示すことを確認した。独立した実験のリン光像分析により確認すると、CATタンパク質のそれに対応する位置は、D46のそれと比較してD46/1024 CATパターンにおいてより多くの放射能を含んでいた。これは、CATタンパク質が沈降なしで、全ての標識されたタンパク質の中から検出することができることを示した。但し、この証明に、感染していない及びD46が感染したパターンにおける一緒に泳動するバックグラウンドの存在により複雑であった。
組換えRSVのゲノムの予想される位置内のCAT遺伝子の存在を確認するためにRT−PCRを用いた。全ての細胞内RNAを、D46/1024 CAT及びD46 RSVの両方の継代8の細胞ペレットから単離した。RSV位置5611−5616におけるStuI制限エンドヌクレアーゼ部位である挿入の部位に隣接する2つのプライマー:位置5412−5429に相当する上流ポジティブセンスプライマー及び位置5730−5711に相当する下流ネガティブセンスプライマーを選択した。RTステップのためにポジティブセンスプライマーを用い、そして両方のプライマーをRCRに含めた。
D46ウィルスのRT−PCRは、更なる外来配列のないG/F遺伝子接合部である318ヌクレオチドの予想されるフラグメントに対応する単一産物を作り出した。D46/1024 CATウィルスRNAの分析は、その電気泳動移動度が挿入された(AT転写カセットを含むG/F遺伝子接合部を示す予想される1079ヌクレオチドフラグメントに十分に対応する単一産物を作り出した。後者のPCRは単一の主要なバンドを作り出し;検出可能なより小さい産物の存在は、組換えゲノムの集団がこの領域内に欠失を伴う大量の分子を含んでいなかったことを示す。RTステップなしでD46/1024 CATウィルスRNAでPCR分析を行った場合、バンドが見られなかったことは、その分析がRNAに特異的であることを確認する。これにより、RT−PCR分析は、D46/1024 CAT組換えウィルスのゲノムRNA内の予想される位置における予想される長さの挿入物の存在を確認した。
CAT遺伝子の安定性を測定するため酵素発現を用いた。3代目から始まる継代の全てからの細胞ペレットを、CAT発現についてテストした。ウィルスD46/1024 CATについて、これらのアッセイ全てが、(14C)標識化クロランフェニコールのアセチル化形態への変換を示した。発現の安定性を研究するために、継代3又は8各々からの20又は25の個々のプラークからのウィルスを、CAT発現について分析した。全てのサンプルが陽性であり、CATの発現のレベルは、細胞リゼートの等価のアリコートのアッセイにより判断して継代8からの25の単離物の各々について同様であった。これは、各々の単離物によりコードされたCATタンパク質の活性が変異により害されることなく保持されていることを示した。
プラーク形態及び大きさを決定するために、第2継代で始めて、各々の継代段階から収集された培地上清の8分の1(即ち0.5ml)を用いて6ウェルプレート内の新鮮なHEp−2細胞に感染させて、それを5〜7日間、メチルセルロース積層下でインキュベートした。次にそれら細胞を固定し、RSV Fタンパク質に対するモノクローナル抗体、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼに連結した第2抗体とのインキュベーションにより染色した。早くから、試験管内での温度の範囲にわたるプラーク形成の効率、及び以前に感染していないチンパンジーの気管に接種した時に複製して病気を引きおこす能力に関して、天然の野生型RSV単離物から、cDNAD46から生産された組換えRSVを区別することができないことが観察された。これにより、D46組換えRSVに有毒な野生型株であると考えられた。D46及びD46/1024 CAT組換えウィルスにより生産されたプラークを抗体染色により比較した。プラーク形態に2つのウィルスについて極めて類似していた。但し、CAT含有組換えプラークの平均直径は、各々のウィルスについての30の無作為に選択したプラークの測定に基づいて、D46ウィルスのそれの90%であった。
D46及びD46/1024 CATウィルスの組織培養における複製の効率を、単一ステップ増殖サイクルにおいて比較した。細胞の3回複製した単層に、いずれかのウィルスを感染させ、12時間の間隔でサンプルをとり、プラークアッセイにより定量した。その結果は、D46に対してD46/1024 CATウィルスの生産が遅く、20倍低い最大力価に達したことを示した。
これらの結果は、外来遺伝子、この例においてCAT遺伝子を発現するヘルパー独立性RSVである組換え体を作製することが可能である。組換えRSVはCATタンパク質をコードする予想されるポリアデニル化サブゲノムmRNAの発現を指揮し、ここでそのタンパク質は、酵素アッセイにより及び放射能免疫沈降法により検出される。他の例は、同じCAT部位に挿入されたルシフェラーゼ遺伝子を有するか又はSH及びG遺伝子の間に挿入された(ATもしくはルシフェラーゼ遺伝子を有するRSV組換え体を作った。これらのウィルスも増殖の減少を示すが、回収された多数の野生型組換えウィルスは成長の減少を示さない。このことは、増殖の減少は、実際、ゲノム内の他所での変異の機会によるよりむしろ挿入された遺伝子に関連することを示す。弱毒化のレベルは、挿入された遺伝子の長さの増加に伴って増加するようである。外来遺伝子の組換えRSVへの挿入がその複製のレベルを削減し、試験管内の継代の間、安定であったことの発見は、これがワクチン使用のための弱毒化に影響を与えるための更に他の手段を供することを示唆する。また、抗ウィルス活性を有するタンパク質、例えばとりわけγ−インターフェロン及びIL−2を発現する遺伝子の組換えRSVへの挿入は、発現される抗ウィルスタンパク質の活性のため、ウィルスを弱毒化するであろう。
改変された増殖特性を有するRSVの回収を証明することに加えて、本明細書の例は、他の重要な方法、及び組換えRSV及び他の非セグメント化ネガティブ鎖ウィルスの遺伝子発現についての利点を証明する。例えば、本明細書に供されるデータは、外来コーディング配列を、別個のmRNAとして発現される別個の転写カセットとして導入することができることを示す。これらの結果は、RSVが、ゲノム長の実質的な増加、例えば(AT遺伝子の場合の762ヌクレオチドから全部で15,984ヌクレオチドへ(野生型RSVのそれの1.05倍)の増加を許容することを示す。上手く回収されたルシフェラーゼ遺伝子はほぼ3倍長い。
ウィルスのRNA依存性RNAポリメラーゼは、校正及び修復メカニズムの欠如により誤りの傾向の高い性質を有することが知られている。RNAウィルスゲノムにおいて、変異の頻度は、平均で部位当り10-4〜10-5程度高いと評価される(Holland J;Curr.Top.Microbiol.Immunol.176:1-20(1992)及びその中の引用文献)。ここで生産した組換えD46/1024 CAT RSVの場合、外来遺伝子の正確な発現はウィルス複製とは無関係であり、自由に変異を蓄積するであろう。本明細書に記載される継代は、細胞当り0.1PFU未満の感染の多重度に関し、各々の継代の存続時間は、多重の回数の感染が関連することを示した。RSVを感染させた組織培養細胞からの感染性ウィルスの収率は低いが、細胞内高分子合成はしっかりしており、感染性ウィルスの貧弱な収率はRNA複製のレベルの低さよりむしろパッケージングにおける効率の悪いステップのためであるようである。これにより、8の一連の継代を通してのCATの維持はRNA複製の回数の多さに関連する。非本質的CAT遺伝子が完全であり続け、8代目の継代においてテストした25の単離物の各々において十分に機能的なタンパク質をコードすることができたことは驚くべきことであった。また、継代8から単離したRNAのRT−PCR分析は、CAT遺伝子内で欠失を検出しなかった。
CAT転写カセットが、(先に用いたF−Gゲノム間よりプロモーターに近い1つの位置にある)SH−Gゲル間領域内に工作されているXmaI部位へ挿入された第2の感染性RSV−CAT組換え体を作製した。この組換え体の増殖特性は、D46/1024 CAT組換え体のそれに似ていたが、CAT発現のレベルは、そのより多くのプロモーター近位位置と一致して、ほぼ2〜3倍高かった。このことは、外来遺伝子は、ゲノム内の第2の異なる部位に挿入することができ、そしてそれによりその発現のレベルを変えることができることを示す。原則として、その挿入がmRNAコーディング単位を破壊せず、そのゲノムの両端に見い出されるシス作用性配列要素を妨害しない限り、ゲノムのいずれの部分も外来タンパク質をコードする転写単位の挿入を受け入れることができるはずである。
CAT遺伝子をルシフェラーゼ(LVC)マーカー酵素で置きかえた感染性組換えRSVも回収した。LVCコーディング配列は約1,750bp(CATの大きさの3倍)であり、F及びLを除くいずれのRSV遺伝子よりも長い。それを、SH−G又はG−Fゲノム間領域のいずれかに挿入し、感染性ウィルスを回収した。LVCウィルスは、組織培養における増殖に関して、CATウィルスに対して更に弱毒化された。このことは、ゲノムの大きさの増加が増殖効率を減少させることを示唆する。これらのCAT及びLVCウィルスのキャラクタリゼーションは、ウィルス遺伝子発現及び増殖への外来遺伝子の大きさの効果、例えば転写シグナルの更なるセットの導入によりどれだけになるか及びゲノム長の増加によりどれだけになるかを決定するであろう。
ミニレプリコンシステムにおいて、RSV−CATミニゲノムを、転写単位がミニゲノムでなくポジティブセンスアンチゲノム内で“センス”方向にあるように改変した、これにより、サブゲノムmRNAは、ポリメラーゼがアンチゲノム複製中間体を転写することができる場合にのみ作ることができる。興味あることに、プラスミドで発現されたN,P,L及びM2 ORF1タンパク質により補足した場合、この逆RSV−CATミニゲノムはサブゲノムのポリアデニル化された翻訳可能なmRNAを合成することができた。有効で、mRNA合成は、ミニゲノム転写についての場合でそうであるように、M2 ORF1タンパク質に依存した。そのアンチゲノム鋳型に対するmRNAのレベルは、標準のミニレプリコンにより作られたミニゲノム鋳型に対するmRNAの比率とほぼ同じであった。このことは、アンチゲノム及びゲノムは、外来転写単位を受容するのに用いることができることを示す。これにより、外来遺伝子の発現は、それをゲノム転写順におくことなく達成することができる。これは、外来遺伝子がゲノムの転写プログラムの部分でなく、これによりこれらの遺伝子の発現の相対的レベルを乱さないであろう点で有利である。
2つのRSV抗原性サブグループ間の抗原性の差のほとんどはGグリコプロテイン内にあるので、二価ワクチンを作り出すために更なる遺伝子として異種サブグループのGタンパク質を発現するように組換えRSVを作製することができる。特定の他のRSウィルス、例えばヒト、パラインフルエンザ3ウィルスのエンベロープタンパク質遺伝子も、組換えRSVによる発現のために挿入することができる。他の使用は、感染性RSVの免疫原性を増強するためのインターロイキン6のような免疫モジュレーターの同時発現を含む。他の使用、例えば遺伝子療法のためのベクターとして本明細書に記載される改変されたRSVを用いることも供される。
実施例XIII
SH遺伝子の欠失を有する組換えRSV
この例は、SH遺伝子の発現が、SH mRNA及びタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の除去により排除されている組換えRSVの生産を記述する。SHタンパク質は、アミノ酸位置14〜41において予測されるトランスメンブランドメインを含む小さな(株A2の場合64アミノ酸)タンパク質である。それは、L末端が露出されるように膜内に配向しており、L末端及びN末端ドメインの両方において潜在的なグリコシル化部位がある(引用により本明細書に組み込まれるCollinsら、J.Gen.Virol.71:3015-3020(1990))。感染した細胞において、株A2のSHタンパク質は4つの主要な形態;(i)最も豊富である全長のグリコシル化されていない形態であるSHO(Mr 7500)(引用により本明細書に組み込まれるOlmstedら、J.Virol.63:2019-2029(1989));(ii)単一のN−連結炭水化物鎖を含む全長の形態であるSHg(Mr 13,000〜15,000);(iii)単一のN連結炭水化物鎖がポリラクトサミノグリカンの付加により修飾されているSHgの改変型であるSHp(Mr 21,000〜40,000)(引用により本明細書に組み込まれるAndersonら、Virology 191:417-430(1992));(iv)2番目のメチオニンコドン(位置23)から始まり、種々の形態の中で、それのみは細胞表面に輸送されないようであるトランケートされた非グリコシル化形態であるSHt(Mr 4800)において蓄積する。SHO及びSHp形態は、精製された型において検出されていることは、ビリオン形態発生のレベルでの選択性があることを示唆する(Collinsら、前掲、(1993))。
パラミキソウィルスの中で、直示的に類似するSHタンパク質が、サルウィルス5(Hiebertら、J.Virol.55:744-751(1985)、引用により本明細書に組み込まれる)、ウシRSV(Samalら、J.Gen.Virol.72:1715-1720(1991)、引用により本明細書に組み込まれる)、ムンプスウィルス(Elangoら、J.Virol.63:1413-1415(1989)、引用により本明細書に組み込まれる)、及びシチメンチョウ鼻気管炎ウィルス(Lingら、J.Gen.Virol.73:1709-1715(1992)、引用により本明細書に組み込まれる)において見い出されている。フィロウィルスの小さな疎水性VP24タンパク質は、表面タンパク質であると考えられており(Bukreyerら、Biochem.Mol.Biol.Int.35:605-613(1995)、引用により本明細書に組み込まれる)、パラシキソウィルスSHタンパク質の類似物であるとも予想される。
SHタンパク質の機能は、これまで規定されていなかった。プラスミドコードされたタンパク質を発現する細胞における融合アッセイにおいて、RSVタンパク質によるCV−1細胞の有効な融合は、F,G及びSHタンパク質の同時発現を要求する(Heminwayら、Virology 200:801-805(1994)、引用により本明細書に組み込まれる)。理論に結びつけるわけではないが、RSV SHタンパク質のいくつかの機能:(i)それがウィルスの付着又は浸透を増強し得ること(Heminwayら、前掲);(ii)それがビリオン形態発生に関連し得ること;又は(iii)それがウィルスの増殖において直接の役割とは別の“ぜいたくな”機能、例えばセンダイウィルスのVタンパク質について現在記載されている宿主免疫系の構成物との相互作用を有し得ること(Katoら、EMBO J.16:178-587(1997)、引用により本明細書に組み込まれる)が存在するのかもしれない。先の機能(i)又は(ii)は、種々のウィルスの特定の疎水性タンパク質について他人により示唆されている膜透過性を改変する活性に関連し得る(Maramoroshら(eds),Advancein Virus Research 45:61-112(1995);Schubertら、FEBS Lett(1996);Lambら、Virology 229:1-11(1997)、各々引用により本明細書に組み込まれる)。これらのSHタンパク質の潜在的な活性の全ては、RSV組換えワクチンにおいて更なる利点を与えるため、本明細書に記載される方法及び戦略に従って本発明の範囲内に組み込まれ得る。
所定のSH遺伝子機能の破壊を有する組換えRSVを作り出すために、親RSVクローンからその全体においてSH遺伝子を削除した。上述のプラスミドD46プラスミドは、組換えRSVを回復させるのに上手く用いられたRSVの株A2の完全なアンチゲノムRNAをコードするクローンである(米国特許出願08/720,132;米国仮特許出願60/007,083、各々引用により本明細書に組み込まれる)。このアンチゲノムは天然のゲノムより1nt長く、いくつかの付加的な制限部位マーカーを含む。D46プラスミドを、完全なSH遺伝子が削除されるように改変してプラスミドD46/6368を作った(図7)。
プラスミドD46/6368の作製は、2つの親サブクローン:L遺伝子の始まりにリーダー領域を含むゲノムの左側の端に結合したT7プロモーターを含むD50、並びにハンマーヘッドリボザイムに下流端において結合したM2の端及びL遺伝子並びにタンデムT7転写ターミネーターを含むD39に関する。D50プラスミドをScaI(完全な15,233ヌクレオチドアンチゲノム配列中の位置4189)及びPacI(位置4623)で消化し、生じた435bpフラグメントを、2つの相補的オリゴヌクレオチドから作製した短いDNAフラグメントで置換した。この典型的な削除において、ScaI及びPacIの間に位置した435bpフラグメントは、M遺伝子の極めて下流の端、そのGEシグナル、及びそのGE配列の最後の6つのヌクレオチドを除いた完全なSH遺伝子に相当する(図7)。これを、2つの合成の部分的に相補的なオリゴヌクレオチド
(ポジティブセンス鎖;M GE配列を下線で、XmaI部位をイタリックで、そしてScaIの半分の部位並びに左及び右の各々のPacI粘着端をボールドイタリックで示す)及び
(ネガティブセンス鎖)で置換した。このD50/6368と呼ぶcDNAを用いてアンチゲノムの残りの部分を含むD39のBamHI−MluIフラグメントを受容させた。これは、野生型プラスミドD46によりコードされるアンチゲノムより398nt短い14,825ntの長さのアンチゲノムである、削除された配列を除いて完全なアンチゲノムをコードするプラスミドD46/6368を生じた。その挿入物の配列を、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。後の研究においてこの位置に挿入物を容易に置くことができるように、XmaI部位を任意に導入した。
ウィルスのトランスフェクション、増殖及び継代、プラーク精製、並びにウィルスプラークの抗体染色を、2つの改良:(i)ワクシニアウィルスのインヒビターであるシトシンアラビノシドを用いなかったこと;(ii)トランスフェクションに用いたHEp−2細胞を32℃又は37℃のいずれかでインキュベートし、全ての回収されたウィルスを37℃で繁殖させたことを除いて、全般的に先に記載の手順に従って行った。
全てのRNA及びポリ(A)+RNAを評価するために、細胞をはぎとり、100μlの水に再度懸濁し、そして全ての細胞内RNAを、製造元の推奨に従ってTrizolTM試薬(Life Technologies)を用いて単離した(但し、イソプロパノール沈降の後に、フェノール−クロロホルムで2回、RNAを抽出し、次にエタノール沈降を行った)。ポリ(A)+RNAを、Oligotex mRNAキット(Qiagen,Chatsworth,CA)を用いて単離した。
逆転写及びポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)を行うために、SH遺伝子をcDNAにコピーし、増幅させた。全ての細胞内RNAを、プライマーとしてポジティブセンス合成オリゴヌクレオチド
を用いてSuperscript II(Life Technologies)での逆転写にかけた。このプライマーは、SH遺伝子の上流にあるヌクレオチド3958〜3975に相補的である。cDNA産物のアリコートを、プライマーとして上述のオリゴヌクレオチドをネガティブセンスオリゴヌクレオチド
と一緒に用いるPCRにおけるテンプレートとして用いた。この後者のプライマーは、SH遺伝子の下流にあるゲノムのヌクレオチド4763〜4782に相当する。最初の2分、変性ステップを行い、その間、Taq DNAポリメラーゼを加え、次に33サイクルを行った(94℃で1分の変性;39℃で1分のアニーリング;72℃で2分の伸長)。次にその産物を、2.5%アガロースゲルで分析した。
ノーザンブロットハイブリダイゼーションのために、ホルムアルデヒドの存在下でアガロースゲルでの電気泳動によりRNAを分離し、ニトロセルロースにブロットした。そのブロットを、合成ヘキサマー(Boehringer Mannheim, Indianapolis,IN)を用いてランダムプライミングで、クレノウポリメラーゼによりcDNAから試験管内で個々に合成したM,SH,G,F,M2及びL遺伝子の〔32P〕−CTP標識化DNAプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイズした放射能を、Molecular Dynamics(Sunnyvale,CA)Phospbor Imager 445 SIを用いて定量した。
35Sメチオニン標識化、免疫沈降、及びポリアクリルアミドゲル電気泳動手順を、上述の通り行った(Bukreyerら、前掲)。プレキャスト4%〜20%トリス−グリシンゲル(Novex)を用いて電気泳動を行った。
試験管内増殖分析のために、HEp−2,293,CV−1,Vero,MRC−5、アフリカミドリザル腎臓(AGMK)、ウシ鼻介骨(BT)、及びMDBK細胞単層を、単一ステップ増殖サイクル分析に用いた。各々の型の細胞について、3つの25cm2培養フラスコに、107 PFUのD46/6368(SH−)又はD46(野生型組換え)ウィルスを感染させた。2%胎児ウシ血清(FBS)(Summit)を含むOpti−MEM(Life Technologies)を、HEp−2,Vero,293,BT,MRC−5、及びAGMK細胞について用い;1%又は2% FBSを含むE−MEM(Life Technologies)を、各々MDBK又はBT細胞に用いた。37℃で3時間の吸着の後、細胞を各々4mlの培地で3回、洗い、4mlの培地を加え、そしてその細胞を5% CO2と供に37℃でインキュベートした。次に、接種後種々の時間(下記参照)において、培地上清の200mlアリコートを除去し、500mMの硫酸マグネシウム及び50mMのHEPES緩衝液(pH7.5)を含むように調節し、新しく凍結し、そしてタイトレーションまで−70℃で保存し;取り出した各々のアリコートを等量の新鮮な培地に置き換えた。タイトレーションのため、HEp−2細胞(24ウェルプレート)にアリコートの10倍希釈物を感染させ、2% FBS及び0.9%メチルセルロース(MCB試薬)を含むOpti−MEMを重層した。7日のインキュベーションの後、培地を除去し、その細胞単層を4℃で80%メタノールで固定した。そのプラークを、RSV Fタンパク質に特異的な3つのモノクローナル抗体の混合物と、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgGとインキュベートした(Murphyら、Vaccine 8:497-502(1990)、引用により本明細書に組み込まれる)。
SH遺伝子機能を欠く感染性の組換えRSVの回収は、上述の手順に従い、D46/6368プラスミドを、N,P,L及びM2 ORF1タンパク質をコードするプラスミドと供にHEp−2細胞に同時移入し、その細胞に、T7 RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスのMVA株の組換え体を同時に感染させた。平行した培養物に、同じ条件下でD46野生型cDNAを移入した。培地上清をトランスフェクション後3日に収集し、一回、植え継いだ。37℃での6日のインキュベーションの後に、各々のもとのトランスフェクションを示す培地上清のアリコートを新鮮なHEp−2細胞にプレートし、メチルセルロース重層下で6日間、インキュベートし、そしてRSV Fタンパク質に特異的に3つのモノクローナル抗体の混合物、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした第2抗体との反応により染色した。野生型組換えウィルス対SH−ウィルスのプラークの形態は、後者のプラークの方が大きいことを除いて極めて似ていた。顕著なのは、対照及びSH−ウィルスの各々により形成されたプラークはシンシチウムを含んでいたことである。
回収されたD46/6368ウィルスのゲノム内のSH遺伝子の欠損を確認するために、細胞に、野生型又はSH−組換えウィルスの一継代を感染させ、そして全ての細胞内RNAを回収し、RT−PCRにより分析した。ゲノム位置3958〜3975においてSH遺伝子の上流とアニーリングしたポジティブセンスプライマーでRTを行った。SH遺伝子の下流のヌクレオチド4763〜4782を供するネガティブセンスプライマーと一緒に同じプライマーを用いてPCRを行った。図8に示すように、野生型D46ウィルスは、位置3958及び4782の間の予想される826bpフラグメントに対応する単一のPCR産物を作り出した(レーン3)。D46/6368ウィルスの場合、PCR産物はより短く、欠失を含む予想される426bpフラグメントに対応した(レーン2)。PCR産物の形成がRTステップに依存したことは、予想される通り、それらがDNAよりもRNAから得られることを示す。これにより、RT−PCR分析は、D46/6368ウィルスのゲノムが、SH座において予想される398ヌクレオチド欠失を含むことを示す。
SH遺伝子の上流及び下流に位置した遺伝子の転写を検査するために、ポリ(A)+mRNAを、D46又はD46/6368ウィルスを感染させた細胞から単離し、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した(図9)。細胞内RNAは、意図的には、ポリ(A)+選択の前には変性させず;これにより以下に示すように、選択されたmRNAは、mRNAへのサンドイッチハイブリダイゼーションによりゲノムRNAも含んでいた。これは、mRNA及びゲノムの同時の分析を許容し、そして各々のmRNAの発生量を、同じゲルレーン内に含まれるゲノムRNAに関係づける能力は、レーン間のmRNAの発生量を比較することを可能にする。そのブロットを、ランダムプライシングによりcDNAクローンから合成され、これにより両方の極性のプローブを含む〔32P〕標識化DNAプローブとハイブリダイズさせた。選択されたプローブは、個々に、M,SH,G,F,M2、及びL遺伝子であることを示した(図9)。
SHプローブは野生型D46ウィルスの場合にサブゲノムSH mRNA及びゲノムRNAの両方にハイブリダイズしたが、D46/6368ウィルスの場合はハイブリダイズしなかった。他のRSV遺伝子に特異的なプローブは各々の場合、両方のウィルスについて、ゲノムに、及び予想される主要なモノシストロニックmRNAにハイブリダイズした。更に、いくつかの上述のジシストロニック読み過しmRNA、例えばF−M2,G−F及びP−M mRNAも両方のウィルスで検出された。
G特異的プローブは、M及びG遺伝子の読み過しであると思われるD46/6368ウィルスに特有の新規の種とハイブリダイズした。この組合せは、間にあるSH遺伝子の欠失により可能であった。D46/6468に特有の同じ種は更にM特異的プローブとのみハイブリダイズし、D46の方はそうでなかった。
次に、D46対D46/6368の各々のmRNAについて、合成の相対的レベルを定量した。各々の対に関する比較について、所定のゲルレーン内のmRNAの量を、ゲノムの量に対して標準化した。この比較は、D46/6368対D46が、示される比率(D46に対するD46/6368)において次のmRNA:M(1.1),G(1.3),F(0.61),M2(0.32)、及びL(0.17)を発現したことを示した。
D46対D46/6368 RSVクローンにより合成されたウィルスタンパク質を比較するために、HEp−2細胞を、細胞当り2PFUの感染の入力多重度で感染させて、感染後16〜20時間の〔35S〕メチオニンとのインキュベーションにより標識した。細胞ライゼートを調製し、直接に又は精製されたRSVビリオンに対して生じたウサギ抗血清を用いる免疫沈降法の後に分析した。全ての及び免疫沈降したタンパク質を、4〜20%勾配ゲルでのPAGEにかけた(図10)。
D46ウィルスの場合、免疫沈降したタンパク質のパターンは、SHタンパク質の非グリコシル化形態であるSHO、及びN−グリコシル化形態であるSHgを含んでいたが、D46/6368ウィルスについてはいずれの種も明らかでなかった(図10)。D46の場合の全ての感染した細胞タンパク質のパターンにおいてもSHOタンパク質を検出することができたが、D46/6368ではそうではなかった。他方、D46対D46/6368により合成されたタンパク質のパターンは本質的に区別できなかった。免疫沈降したタンパク質のパターンにおけるN,P,M,F1、及びM2タンパク質のリン光イメージャー分析は、両方のウィルスにより等量が作られたことを示した(図10)。
上述の通り、プラークアッセイによりD46及びD46/6368ウィルスの予備的比較は、試験管内での増殖における差異を示した。それゆえ、我々は、HEp−2細胞におけるプラークの大きさに関して2つのウィルスを更に比較した。単層が若くかつ過剰に成長しないことを確実にすることに特に注意を払った。なぜなら、これらの可変性はプラークの大きさに影響を与えることがあるからである。メチルセルロース下での37℃での7日のインキュベーションの後、その単層をメタノールで固定し、写真をとった。これは、プラークの大きさにおいて著しい差異を示した。各々のウィルスの30のプラークの測定は、D46/6368ウィルスのプラークが、D46ウィルスのそれより平均して70%大きいことを示した。
D46及びD46/6368ウィルスの複製の効率を比較するために、異なる種及び異なる組織源を示す8つの異なる細胞系について、増殖曲線分析を行うために更なる実験を行った(表42)。細胞の各々の型の三重の単層に、いずれかのウィルスを感染させ、そして12又は24時間間隔でサンプルをとり、プラークアッセイ及び抗体染色により定量した。驚くことに、D46/6368ウィルスは、3つの細胞系、即ちHEp−2,293及びAGMK−21細胞において、D46野生型に対してより高いタイターまで増殖した。HEp−2細胞(図11)において、感染後36時間の子孫D46/6368ウィルスのタイターは、D46ウィルスについてのそれより2.6倍大きかった。293細胞(図12)において、D46/6368ウィルスの収量は感染後36時間においてD46ウィルスのそれより2倍大きく、この差は、感染後60及び84時間において各々4.8及び12.6倍に増加した。AGMK−21細胞において(図13)、D46/6368ウィルスの収量は感染後36時間において3.2倍であった。MRC−5,Vero,CV−1,MDBK及びBT細胞において、変異及び野生型ウィルスの中での複製における大きな差は観察されず、このことは、SH−RSVの増殖が宿主の範囲による効果により実質的に影響を受けなかったことを示す。
これら及び本明細書における他の発見は、SH遺伝子の欠失が回復可能な感染性のRSVばかりでなく、感染性のウィルスの収量及びプラークの大きさの両方に基づき組織培養において実質的に改良された増殖を示す組換えRSVを作り出すことを示す。SH欠失により特定される組織培養におけるこの改良された増殖は、例えば培養において貧弱なRSV収量の問題を克服することにより、RSVワクチンを開発するための有用な道具を供する。更に、これらの欠失は、遺伝子復帰変異に対して極めて安定であり、それから得られたRSVクローンをワクチン剤として特に役立つものにする。
マウスにおいて典型的なSH欠失クローンの複製、免疫原性及び保護効率を評価するため、24のグループにおける呼吸病原体のない13週齢のBALB/cマウスに、0日目に光メトキシフルラン麻酔下で、鼻内に、動物当り106PFUで、野生型組換えD46ウィルス、SH−組換えD46/6368ウィルス、又は生物学的に得られたかぜを通した(cold-passaged)(cp)温度感受性(ts)のウィルスcpts 248/404(Firestoneら、前掲(1996)、引用により本明細書に組み込まれる)において接種した。この後者のウィルスは、げっ歯動物、チンパンジー及びヒトにおいて広範囲にキャラクタライズされており、マウスの上方及び下方の気管における複製に高度限定される。接種後4,5,6及び8日目の各々において、各々のグループからの6つのマウスをCO2窒息により殺し、そして鼻介骨及び肺組織を別個に得て、ホモジナイズし、そして上述の抗体染色手順を用いるウィルスの定量のためのプラークアッセイに用いた。
上方気管において、SH−D46/6368ウィルスは、弱毒化表現型を示した(図14)。本例において、その複製のレベルは野生型のそれより10倍近く、cpts 248/409ウィルスのそれに相当した。対照的に、下側の気管において(図15)、D46/6368ウィルスの複製のレベルは野生型のそれに極めて似ていたが、cpts 248/404ウィルスは高度に制限された。更なる研究において、親D46 cDNAによりコードされる組換えウィルスは、十分に複製を許容する実験動物である無経験チンパンジーにおける複製及び毒性に関して野生型表現型を有することを決定した。これは、研究室株からのものであるとしてアセンブルした親組換えウィルスは、複製を許容する宿主における複製及び毒性に必要な完全な遺伝子の十分な補足物を含む。これら及び典型的な遺伝子欠失RSV株の他の特性は、方法及び株のホストをワクチン使用のために利用できるものにする。
組換えRSVの免疫原性及び保護効能を更に評価するために、マウスの4つの更なるグループに、上述のように、野生型組換え体そのSH−誘導体、もしくはcpts 248/404ウィルスを接種するか、又は偽感染させた。4週間後に、マウスを麻酔し、血清サンプルをとり、そして動物当り106PFUの生物学的に得られたRSV株A2の負荷接種物を鼻内に投与した。4日後、動物を殺し、鼻介骨及び肺組織を収集し、上述のように感染性RSVについてアッセイした。RSV Fタンパク質に結合する血清IgG抗体を、RSV Long株が感染した細胞からイムノアフィニティー精製されたFグリコプロテインを用いてELISAにおいて定量した(Murphyら、前掲、1990)。
D46野生型、D46/6368 SH−、及びcpts 248/404ウィルスについての免疫原性アッセイは、0日目に3つのウィルスを感染させたマウスが高レベルのF特異的血清抗体を発達させたことを示した(表43)。これらのテスト宿主全ては、上方及び下方の気管において、RSVチャレンジウィルスの複製に対して高い耐性であった。これにより、SH−変異体は、マウスにおいてRSV特異的血清抗体及び保護を誘導する能力に基づいてその野生型の親から区別することができなかった。
異なるRSV及び異なるニューモウィルスのSH遺伝子の比較は、有用なRSV組換えワクチンを作り出すための更なる道具及び方法を供する。例えば、2つのRSV抗原性サブグループA及びBは、特定のSHドメインにおいて比較的高い保存の程度を示す。これら2つのドメインにおいて、RSV A及びBのN末端領域及び予測されるトランスメンブランドメインは、アミノ酸レベルにおいて84%の同一性を示し、C末端の予測される外部ドメインはより拡散的である(約50%の同一性)(Collinsら、前掲、1990)。2つのヒトRSVサブグループB株8160及び18537のSH遺伝子の比較は、1つのアミノ酸の差異のみを同定した(Andersonら、前掲)。ヒト対ウシRSVのSHタンパク質は、約40%の同一性であり、(i)上述のものに似た保存された残基の非対称の分布;(ii)極めて類似した疎水性プロフィール;(iii)1つの部位が疎水性領域の各々の側にある2つのN連結グリコシル化部位の存在;及び(iv)各々のSHタンパク質の中央の疎水性領域のカルボキシ末端側の1つのシステイン残基を含む主な構造上の特徴を共有する(Andersonら、前掲)。これら及び他の配列類似性及び差異を評価することにより、感染性RSVクローン内に置換された又は挿入され得る異種配列から選択を行うことができ、例えば多種特異的免疫原効果を有するワクチンを作り出すことができる。
D46及びD46/6368についての転写分析は、本例において他の重要な発見を作り出した。両方のウィルスについて全体の転写レベルは実質的に同一であるが、ノーザンブロット分析は、個々のmRNA種の蓄積において特定の差異を示した。顕著には、SH遺伝子の上流に位置したM遺伝子の転写は2つのウィルスについて実質的に同じである。しかしながら、SH遺伝子の欠失は、その下流に隣接したG遺伝子についての転写を増加させた(図16)。これらの結果に基づいて、選択されたRSV遺伝子の転写レベルは、単にRSVマップ上の遺伝子の各々の極性又は近接性を変えることにより調節することができる。例えば、D46ウィルスG遺伝子は遺伝子の順番で7番目であるが、SH遺伝子の欠失はそれを6番目にし、転写のレベルを増加させる。遺伝子の順番におけるこの変化に関連する観察される転写の増加は、他の組換えウィルスシステムにおいて報告されている2.5〜3倍の増加より小さかった(例えば、Kuoら、前掲(1996)を参照のこと)。
先の研究において示された他の重要な発見は、G遺伝子の下流の遺伝子の各々(F,M2及びL)がSH−変異体においてあまり有効に発現されなかったこと、及びこれらの下流遺伝子により示されるD46/6368対野生型D46ウィルスについての極性により急な勾配があることであった(図16)。顕著なのは、SH欠失の後に左にあるD46/6368の工作されたM−G遺伝子間領域は65ntの長さであった。比較において、株A2における最も長い天然の遺伝子間領域は44ntのM−SH,46ntのF−M2、及び52ntのG−F遺伝子間領域であり、株18537は56ntのF−M2遺伝子間領域を有する(引用により本明細書に組み込まれるJohnsonら、J.Gen.Virol.69:2901-2906(1988))。1〜52ntの大きさの範囲である株A2の天然の遺伝子間領域は、ジシストロニックミニゲノムにおいて転写読み過し及び極性へのそれらの効果に関して実質的に異ならなかった(Kuoら、前掲(1996))、しかしながら、本発明の方法による52nt G−F領域より長い領域のテストは、その後にポリメラーゼがより厳格に影響を受ける上限を確立し得る。これにより、SH−欠失クローンにおいて観察される遺伝子順序の変化が生ずるG遺伝子転写の予想より低い増加、並びにその下流の遺伝子の転写の減少は、M及びGの間に工作された遺伝子間領域の長さの増加にあり得る。この点において、本発明におけるRSVクローンの遺伝子内領域の選択された長さの調節は、有用なRSVワクチンを作り出すためのなお更なる道具及び方法を供すると予想される。
上述の発見は、RSV遺伝子発現のレベルを変えるための2つの更なる方法を供する。第1に、非本質的遺伝子の欠失は下流の遺伝子の発現を上昇制御することができる。第2に、野生型遺伝子間領域より長い挿入は、下流遺伝子の転写を減少させるための方法を供する。下流遺伝子の発現のレベルの減少は、複製を許容するホスト、例えばチンパンジー及びヒトにおいて組換えRSVの弱毒化表現型を特定すると予想される。
SH−ウィルスが組織培養において十分に増殖し、上気道において部位特異的な弱毒性を示すことの発見は、ワクチン開発のための新しい利点を与える。生きているウィルスワクチンとして評価されている現在のRSV株は、例えば、cp変異体(次第に低い温度にする広範囲の継代の間に得られ;cpRSV株を作り出す)。典型的なcp変異体は、N,F及びLにおける5つのアミノ酸置換に関し、温度感受性又は低温適応性を与えない。これらの変異は、更に、組織培養において増殖に大きな影響を与えない。それらは、宿主範囲の変異である。なぜなら、それらは下気道においてほぼ100倍、チンパンジー及びヒトの気道の複製を制限するからである。他の変異の典型的な型であるts変異は、cpRSVの化学的変異誘発によって得られた。この型の変異は、上気道から下気道への体温の増加の勾配により、下気道におけるウィルス複製を優先的に制限する傾向がある。これらのcp及びts変異体と対照的に、本明細書に記載されるSH−変異体は、上気道においてより大きな制限の明白な表現型を有する。これは、極めて若い幼児に用いるためのワクチンウィルスのために特に要求される。なぜなら、上気道の複製の制限は、そのメンバーが支配的に鼻を通して呼吸するこの攻撃されやすい年齢のグループにおいて安全なワクチン投与を確実にするのに要求されるからである。更に、いずれの年齢グループにおいても、上気道における複製の減少は、中耳炎からの羅患率を減少させるであろう。これらの利点に加えて、例えばほぼ400nt及び全mRNAの除去を含むSH欠失変異の性質は、極めて復帰しにくいであろう変異の型を示す。
実施例XIV
異種配列の導入のないSH遺伝子の欠失を有する組換えRSV
この例は、先の実施例XIIIにおいて行われたような異種配列を導入することなく、SHタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を除去することによりSHタンパク質の発現が除去されている組換えRSVの生産を記述する。この例において、SHコーディング配列が除去されているRSVクローンD46/6368は、最も長い天然の株A2遺伝子間領域についての52ヌクレオチドと比較して65ヌクレオチドの長さに広げられたM−G遺伝子間領域も特徴とした。また、この操作された遺伝子間領域は、SmaI部位を含む異種配列を含んでいた。これらの変化は、特定の有利な結果、例えば下流遺伝子の転写の効率の減少を作り出す。しかしながら、他の適用のためには、本実施例に詳述されるように異種配列の導入により達成されない欠失又は変化を作り出すことが要求される(図17)。
上述のD13プラスミド(実施例VIIを参照のこと)は、リーダー領域を含むゲノムの左手端に結合したT7プロモーター、並びにNS1,NS2,N,P,M、及びSH遺伝子を含む(完全な15,223アンチゲノム配列内の配列位置1〜4623)。ScaI(位置4189)からPacI(位置4623)のフラグメントを、2つの部分的に相補的な合成オリゴヌクレオチド:
(ポジティブセンス鎖、ScaI半分部位を左側にイタリックで、PacI粘着端をイタリックで右に、そしてGEシグナルの部分を下線で示す)、及び
(ネガティブセンス、ScaI半分部位を右側にイタリックで、そしてGEシグナルの部分を下線で示す)で置換した。この変異はM GEシグナル、M−SH遺伝子間領域及び完全なSH遺伝子を欠失させ、M遺伝子のそれを置換するためSH GEシグナルを上方に動かす効果を有した。異種ヌクレオチドは導入しなかった。D13/6340と呼ぶ生じたcDNAを、G−F−M2 cDNA断片(実施例VIIIを参照のこと)に連結して、リーダー領域からL遺伝子の始まりまでを貫くD50/6340を作り出した。
(F及びM2遺伝子を含む位置5613〜8501を貫く)D50/6340のStuI−BamHIフラグメントを切り出し、上述のF遺伝子への2つの“HEK”変化を含むことを除いて同遺伝子型であるD50−COR#1の等価なフラグメントで置換した。生じたD50/6340 HEKを用いて、アンチゲノムcDNA及びその隣接するリボザイムの残り並びにT7転写ターミネーターを含むD39 sites#12のBamHI−MluIフラグメントを受容させた(実施例IXを参照のこと)。D39 sites#12は、“当該部位”変異を含むD39の型である(表39を参照のこと)。これは、SH遺伝子を欠如し“HEK”及び“当該部位”変化を含むアンチゲノムをコードするプラスミドD46/6340 HEKを生じた。そのD46/6340アンチゲノムcDNAはその親D46 cDNAより417bp短い。ScaI PacI合成挿入物の配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確認した。次にそのcDNAを上手く用いて上述の手順により、組換えウィルスを回収した。その回収したD46/6340 SH欠失ウィルスは、そのプラーク表現型及び増殖特性に基づき実施例XIIIに記載されるD46/6368 SH欠損ウィルスに似ていた。
実施例XV
NS2タンパク質発現のノックアウト
本実施例は、RSVタンパク質NS2の合成の除去を詳述する。この例におて除去のために選択された方法は、翻訳されるオープンリーディングフレーム(ORF)への終止コドンの導入であった。
D13は、T7プロモーター、リーダー領域、並びにNS1,NS2,N,P,M及びSH遺伝子を含む完全なアンチゲノムcDNAの左手端を示すcDNAである(配列位置1〜4623)(図18)。T7プロモーター並びにNS1及びNS2遺伝子を含むこのcDNAのAatII− AflIIフラグメントをpGemベクター内にサブクローニングし、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発にかけて、翻訳レベルにおいてサイレントであり、マーカーとして機能するXhoI部位と共に、NS2 ORF内に2つの翻訳停止コドンを導入した(図18)。その変異の配列を確認し、そしてAatII− AflIIフラグメントをD13に挿入し、次にそれをG,F及びM2遺伝子を含むPacI−BamHIフラグメントに連結して、挿入された変異を含むcDNA D50を作り出した。次にこれをD39の挿入物に連結して完全なアンチゲノムcDNAを作り出し、それを組換えウィルスを回収するのに用いた。組換えRSV中の変異の存在を、RT−PCR産物の配列決定により、及びXhoI消化により確認した。更に、NS2タンパク質の合成の欠如を、NS2のC末端を示す合成ペプチドに対して生じたウサギ抗血清を用いてウエスタンブロット分析により確認した。
図19は、SH−ウィルスについて上述される方法を用いる、NS2−ノックアウトウィルスを組換え野生型と比較する増殖曲線を示す。これらの結果は、感染性ウィルスの遊離の速度が、野生型と比べてNS2−ノックアウトウィルスで減少したことを示す。更に、変異及び野生型ウィルスのプラークの比較は、NS2−ノックアウトの方が大きさがかなり小さかった。これにより、この型の変異は、変化した表現型、この場合、ウィルス増殖の比率の減少及び試験管内でのプラークの大きさの減少を作り出すために生存可能な組換えRSV内に組み込むことができる。それゆえ、これら及び他のノックアウト法及び変異体は、試験管内でのプラークの大きさの減少と生体内での弱毒化との間の周知の相関に基づいて、なお更なる組換えRSVワクチン剤を供する。
実施例XVI
シス作用性調節配列要素の変化によるRSV表現型の調節
この例は、典型的な遺伝子NS1及びNS2のシス作用性転写シグナルを変えることによる組換えRSVウィルスの増殖特性の調節を詳述する。
ゲノムの左手端を示すD13のサブクローニングしたAatII− AflIIフラグメントをオリゴヌクレオチド特異的変異誘発にかけてNS1及びNS2遺伝子のGEシグナルの変化を導入した(図20)。NS1 GEシグナルはシグナルヌクレオチド置換を保持し、他方NS2のそれは3つの置換及び1つの挿入を保持した。これらの変化は、各々のシグナルをN遺伝子の天然のGEシグナルと同一であるように変える効果を有した。
これらの変異を、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認し、そしてAatII− AflIIフラグメントをD13に置換し、次にそれを上述のステップを通してとり、その変異を含む完全なD53 DNAを作製した。このクローンを、組換えウィルスを回復させるのに用いた。
GE変異体ウィルスをHEp−2細胞において分析し、プラークの大きさ及び増殖曲線に関して野生型ウィルスと比較した。これは、それらプラークが野生型のものより(平均30%)大きく、増殖の速度及びウィルスの収量が増加したことを示した。これらの結果は、例えば読み過しmRNAのレベルを減少させ、下流遺伝子からのタンパク質の発現を増加させるために、シス調節要素を変えることによる遺伝子発現の改変と一致する。生じた組換えウィルスは、好ましくは、増殖速度の増加及びプラークの大きさの増加を示すが、これはゲノム又はアンチゲノム内のシス作用性調節要素を変えることによりRSV表現型を変える一例を供する。本明細書のこれら及び他の例は、有効なワクチン剤を供するのに有利である表現型変化に特異的な広範囲のRSV変異を示す。
実施例XVII
NS1遺伝子の欠失を有する組換えRSV
この例は、NS1タンパク質の発現がそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の除去により削除されている組換えRSVの生産を記述する。NS1タンパク質は、3’から5’のRSV遺伝子地図内の1番目の遺伝子によりコードされる小さな139アミノ酸種である(Collins及びWertz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3208-3212(1983)、及びCollins及びWertz,Virol.243:442-451(1985))。そのmRNAは、RSV mRNAが最も豊富であり、このことは、遺伝子発現の効率が、3’端のプロモーターからの距離の増加に伴い減少するような転写の勾配があるという一般的な発見と一致する。NS1タンパク質は、注意深い定量的比較が行われている最中であるが、最も豊富に発現されるRSVタンパク質のうちの1つであると考えられている。その豊富さにかかわらず、NS1タンパク質の機能は、まだ明白に同定されていない。ミニゲノムの転写及びRNA複製がプラスミドにより供給されるウィルスタンパク質によりドライブされる再構成されたミニゲノムシステム(Grosfeldら、J.Virol.69:5677-5680(1995),Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996))において、NS1タンパク質は転写及びRNA複製の両方のための負の調節タンパク質であると思われる。これにより、それは調節タンパク質であり得よう。同定されるであろう他の機能が存在する可能性が高い。NS1タンパク質は、他のパラシキソウィルスにおける周知の類似体を有さない。理論に結びつけるつもりはないが、NS1タンパク質のいくつかの機能:(i)それが先に示唆されるようにウィルス調節因子であり得ること、(ii)それがウィルス増殖サイクルのいくつかの他の点に関連し得ること、(iii)それが、宿主細胞と相互作用して、例えばアポトーシスを防ぎ得ること、及び(iv)それが、宿主免疫系と相互作用して、例えばインターフェロン生産、抗原プロセッシング又はBもしくはT細胞機能のような宿主防御システムに関して阻害し得ることが存在し得る。これらの全てのNS1タンパク質の潜在的な活性は、RSV組換えワクチンにおいて更なる利点を与え得る。
NS1遺伝子機能の所定の破壊を有する組換えRSVを生産するために、NS1タンパク質をコードする配列を、親RSV cDNAから、その全体において削除した。この典型的削除において、変異誘発反応のための基質はプラスミドD13であった。このプラスミドは上述され、T7 RNAプロモーター、リーダー領域、並びにNS1,NS2,N,P,M、及びSH遺伝子を含む完全なアンチゲノムcDNAの左手端を含む(配列位置1〜4623)。Byrappaら(Byrappaら、Genome Res.5:409-407(1995)の方法により変異誘発を行った。この方法は、要求される変化を組み込む合成プライマーをプラスミド上の反対の方向に面するように作り、次にそれをPCRにより増幅し、連結し、そしてバクテリアに形質転換するものである。正PCRプライマーは、
(NS2 ORFの2番目のコドンをイタリックで示す)であ、逆PCRプライマーは、
(NS2 ORFの開始コドンの相補鎖をイタリックで示す)である。高い忠実度のポリメラーゼでのPCRのためのテンプレートとしてD13を用いた。NS1 ORFのAUG開始部位のすぐ上流からNS2 ORFのAUG開始部位のすぐ上流までを貫くように削除を行った(図21)。これは、NS1コーディング配列、NS1 GEシグナル、NS1−NS2遺伝子間領域、及びNS2 GSシグナルを含む529bpの削除である。それは、NS1遺伝子の上流端、即ちそのGS及び非タンパク質コーディング領域をNS2 ORFに融合する効果を有した。NS1遺伝子のこの部分は、リーダー領域のすぐ隣りであり、これにより転写又はRNA複製において重要な配列を含むであろうので、発現的に保持した。変異を含む領域を、配列分析により確認した。次に、Aat2及びAvr2部位の間の約2230bpのセグメント(図21)を切り出し、D13の新しいコピーに挿入した。これは、RSV cDNA内の他所でのPCRの誤差の可能性を排除するであろうステップである。NS1(D13ΔNS1)の欠失を含むD13プラスミドを用いて“HEK”及び“sites”変化を含む完全なアンチゲノム(D53ΔNS1)を作製した。
次に、D53ΔNS1プラスミドを用いてウィルスを回復させた。興味深いことに、回復されたRSV ΔNS1ウィルスは、組織培養において小さなプラークを形成した。欠失の存在はRT−PCRにより確認した。RSV ΔNS1ウィルスがたとえ効率が悪くなっても増殖することができるという事実は、NS1タンパク質を、ウィルス増殖重要できない補助タンパク質として同定した。RSV ΔNS1のプラークの大きさは、NS2タンパク質の発現が翻訳停止コドンのそのコーディング配列への導入により除去される上述のNS2−ノックアウトウィルスのものに似ていた(実施例XV)。その小さなプラーク表現型は、弱毒性変異に一般に関連する。これによりこの型の変異は、変化した表現型を作るために、生存可能な組換えRSV内に組み込むことができる。それゆえ、これら及び他のノックアウト法及び変異体は、試験管内でのプラークの大きさ及び生体内での弱毒化の間の周知の相関に基づいて、更なる組換えRSVワクチン剤を供するであろう。
実施例XVIII
NS2遺伝子の欠失を有する組換えRSV
この例は、NS2タンパク質の発現がそのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の除去により排除されている組換えRSVの生産を記述する。先の実施例XVにおいて、NS2遺伝子の発現が、コーディング配列の削除でなくコーディング配列への2つの翻訳停止コドンの導入により排除されている(NS2ノックアウト又はNS2−KOと呼ぶ)組換えウィルスを作った。原型のNS2−KOウィルスにおけるNS2タンパク質の発現の排除は、試験管内での小さなプラークの表現型及びウィルス増殖の速度の減少に関連する。次の分析は、NS2 KOの継代に基づき、野生型増殖特性に回復した低レベルのウィルスを回収することが可能であることを示した。配列分析は、2つの導入した翻訳停止コドンが、親野生型ウィルスと異なるコーディングアサインメントであるにかかわらず、センスコドンに変異したことを示した。これは、野生型表現型を説明するウエスタンブロット分析により確認して、NS2タンパク質の合成を復帰させるのに十分であった。本ストラテジーは、改良型を供する。なぜなら完全なNS2遺伝子が除去され、これにより同じ部位の回復がおこり得ないからである。
NS2タンパク質は、遺伝子の順番で2番目の遺伝子によりコードされる小さな124アミノ酸タンパク質である(Collins及びWertz,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3208-3212(1983)、及びCollins及びWertz,Virol.243:442-451(1985))。そのmRNAはRSV mRNAの中で2番目に豊富であり、NS2タンパク質は、注意深い定量的比較が行われている最中であるが、最も豊富に発現されるRSVタンパク質の1つと考えられる。その豊富さにかかわらず、NS2タンパク質の機能は、まだ同定されていない。ミニゲノムの転写及びRNA複製がプラスミドにより補給されるウィルスタンパク質によりドライブされる再構成されたRNAミニゲノムシステム(Grosfeldら、J.Virol.69:5677-5686(1995)、Collinsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:81-85(1996))においてNS2タンパク質は転写及びRNA複製の両方に対して適度な負の調節効果を有していた。この効果を観察するためには比較的高レベルのNS2タンパク質発現が要求されるが、その重要性は不明である。これにより、NS1タンパク質について示唆されるように、NS2は、(i)ウィルス調節因子であり得、(ii)ウィルス増殖サイクルの特定の他の点に関連し得、(iii)宿主細胞と相互作用して、例えばアポトーシスを防ぎ得、そして(iv)宿主防御系と相互作用して、例えばインターフェロン生産又は抗原プロセッシングもしくはBもしくはT細胞機能のような宿主免疫系に関して阻害し得る。これらのNS2タンパク質の潜在的な活性の全ては、RSV組換えワクチンにおいて更なる利点を与えるために、本明細書に記載される方法及びストラテジーに従って本発明に組み込まれ得る。
NS2遺伝子機能の所定の破壊を有する組換えRSVを生産するために、そのmRNAをコードする配列を、親RSV cDNAから削除した。この典型的削除において、変異誘発反応のための基質はプラスミドD13であった。このプラスミドは上述され、T7 RNAプロモーター、リーダー領域、並びにNS1,NS2,N,P,M、及びSH遺伝子を含む完全なアンチゲノムcDNAの左手端を含む(配列位置1〜4623)。Byrappaら(Byrappaら、Genome Res.5:409-407(1995)の方法により変異誘発を行った。この方法は、要求される変化を組み込む合成プライマーをプラスミド上の反対の方向に面するように作り、次にそれをPCRにより増幅し、連結し、そしてバクテリアに形質転換するものである。正PCRプライマーは、
(NS2 N遺伝子間領域を下線で示し、N GSシグナルの最初のヌクレオチドをイタリックで示す)であり、逆PCRプライマーは、
(NS1 GEシグナルの相補鎖をイタリックで示す)である。高い忠実度のポリメラーゼでのPCRのためのテンプレートとしてD13を用いた。NS1 GEシグナルのすぐ下流からNS2 GEシグナルのすぐ下流を貫くように削除を行った(図22)。これにより、その変異は、NS1−NS2遺伝子間領域及び完全なNS2遺伝子を含む522ヌクレオチドを削除した(図22)。
その欠失を含むD13プラスミドにおいて、変異の領域を配列分析により確認した。次にAat2及びAvr2部位の間の約2230bpのセグメント(図22)を切り出し、D13の新しいコピーに挿入した。このステップは、RNA cDNA内の他所でのPCR誤差の可能性を排除するでうろうステップである。NS2の欠失を含むD13プラスミド(D13ΔNS2)を用いて、“sites”及び“HEK”変化の全てを含む完全なアンチゲノム(D53ΔNS2)を作製した。
次にD53ΔNS2プラスミドを用いてウィルスを回復させた。NS2−KOウィルスについて上述される通り(実施例XVを参照のこと)、RSV ΔNS2は小さなプラークを作り出した。欠失の存在は、RT−PCRにより確認した。RSV ΔNS2ウィルスが効率が悪いにかかわらず、増殖することができるという事実は、NS2タンパク質を、ウィルス増殖に不要である補助タンパク質として同定した。小さなプラーク表現型は弱毒化変異に一般に関連し、これにより、変化した表現型を作り出すために生存できる組換えRSV内に組み込まれ得る。それゆえ、これら及び他のノックアウト法及び変異体は、試験管内でのプラークの大きさ及び生体内での弱毒化の間の周知の相関に基づいて、なお更なる組換えRSVワクチン剤を供するであろう。
実施例XIX
Gグリコプロテインの分泌される形態のための翻訳開始部位の除去
この例は、Gグリコプロテインの分泌される形態のための翻訳開始部位を削除した組換えRSVの生産を記述する。RSV Gタンパク質は、2つの形態、固体されたII型一体化膜タンパク質として及び本質的に全ての膜アンカーを欠如し、分泌されるN末端が切除された形態として合成される(Hendricksら、J.Virol.62:2228-2233(1988))。それら2つの形態は、2つの異なる開始部位における翻訳の開始により誘導されることが示されており:長い方の形態はG ORFの最初のAUGで始まり、2番目の方は、コドン48のORFの2番目のAUGで始まり、更にタンパク質分解により処理される(Robertsら、J.Virol.68:4538-4546(1994))。この2番目の開始部位の存在は高度に保存されており、今日まで配列決定されたヒト、ウシ及びヒツジRSVの全ての株に存在する。Gタンパク質の可溶性形態は、中和性抗体を捕獲するためのおとりとして機能することにより宿主の免疫性を静め得るであろうことが示唆されている。また、可溶性のGは、Th2に偏った応答の優先的な刺激に関連しており、そのことは、次に、RSVへの後の露出に基づく免疫原性の増加に関連するようである。RSVワクチンウィルスに関して抗体トラッピング又は免疫系の不均衡な刺激を最小化することが極めて要求されるであろう。そしてGタンパク質の分泌される形態の発現を排除することが要求されよう。これは、その機能が、直接ウィルスを弱毒化するのではなく宿主の免疫応答を定性的及び/又は定量的に変えることであろう変異の型を示すであろう。
G,F及びM2遺伝子を有するプラスミドpUC19(実施例VIIを参照のこと)を、Byrappaら(Byrappaら、Genome Res.5:404-407(1995))の手順によるPCR変異誘発におけるテンプレートとして用いた。正PCRプライマーは
であり、逆プライマーは、
(2つのヌクレオチド変化の相補鎖を下線で示す)であった。これは、2つのアミノ酸コーディング変化(図23を参照のこと)、即ち翻訳開始部位を排除するAUG−48からAUU−48への変化、及び変異をモニターする目的のためのMteI部位の挿入に寄与するAUA−49からGUA−49への変化を生じた。
その変異の部位の周辺の配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確認した。次に、G遺伝子を含むPacI−StuIフラグメントを、上述され、リーダーからL遺伝子の始まりまでの最初の9つの遺伝子を含むプラスミドD50内に置換した。次に、これを用いて、ウィルスを回復させるのに用いる完全なアンチゲノムDNAであるD53/GM48Iを作製した。これらの変異は、組換えワクシニアウィルスにより他のRSV遺伝子からの単離において、G cDNAが発現される条件下で、Gの分泌される形態の発現を排除することが以前に示されている(Robertsら、J.Virol.68:4538-4546(1994))。
回復させたD53/M48Iウィルスの2つの単離物を、野生型組換えRSVと平行して、試験管内で増殖速度について評価した(図24)。これは、両方のウィルスが、野生型でのものよりいくらかゆっくりと増殖し、いくらか低い力価までであることを示した。この増殖の差は、分泌される形態のAUG−48が除去されるのでおこると予想されるGタンパク質の発現の減少によるものであり得、ここで本実施例において、膜に結合した形態のAUG−1はその発現を増加するように改変しなかった。本質的に、G ORFのAUG−1の発現は、副次的に最適であると考えられる。なぜなら、それは、G ORFのAUG−1に重複する短いORFをオープオする他の読み枠内の他のAUGによりG配列内で前にあり、これによりその発現を減少させるであろうからである。このORFを除去するようなアンチゲノムcDNAの更なる改変が十分な増殖特性を回復させるであろうことが予想される。あるいは、単独で又は協同して機能する位置48及び49の変異は、Gタンパク質の機能に有害であり得る。位置49のアミノ酸は、その天然のコーディングアサインメントに回復することができ、異なるアミノ酸置換は、十分な増殖特性を回復し得る位置48において選択することができよう。これらの可能性は、本明細書に記載される方法及び材料で直ちに評価することができる。それにもかかわらず、D53/GM48Iウィルスの回復は、分泌される形態のための翻訳開始部位を排除することができること、及びこのウィルスは、現在、実験動物及びヒトにおいて評価のために利用できることを示す。
上述の発明は明確に理解することを目的として、実例及び実施例によりいくらか詳細に記載されているが、添付の請求の範囲内において、特定の変換及び改良を行うことがでることは明らかであろう。
配列表
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)名称:米国政府
(B)通り:Box OTT
(C)市:Bethesda
(D)州:Maryland
(E)国:米国
(F)郵便番号:20892
(G)電話番号:
(H)ファックス番号:
(I)テレックス番号:
(ii)発明の名称:クローニングされたヌクレオチド配列からの弱毒化呼吸シンシチウムウィルスワクチンの製造
(iii)配列の数:14
(iv)コンピューター読取フォーム:
(A)媒体タイプ:フロッピーディスク
(B)コンピューター:IBM PCコンパチブル
(C)作動システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントインリリース#1.0,バージョン#1.25
(v)本出願のデーター:
(A)出願番号:US
(B)出願日:1997年7月15日
(C)分類:
(vi)先の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/047,634
(B)出願日:1997年5月23日
(vi)先の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/046,141
(B)出願日:1997年5月9日
(vi)先の出願のデーター:
(A)出願番号:US 60/021,773
(B)出願日:1996年7月15日
(vii)代理人情報:
(A)名称:Parmelee,Steven W.
(B)登録番号:31,990
(C)参照/事件番号:17634−000510
(viii)通信情報:
(A)電話:206-467-9600
(B)ファックス:415-576-0300
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Claims (30)
- 弱毒化感染性RSV粒子であって、組換RSVゲノム又はアンチゲノム、主要ヌクレオカプシド(N)タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質(P)、大型(L)ポリメラーゼタンパク質及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子を含んで成り、ここで当該ゲノム又はアンチゲノムはSH,NS1及びNS2遺伝子の少なくとも1つの発現が消失又は調節されるように修飾されている、RSV粒子。
- 前記SH遺伝子が欠失している、請求項1記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記NS1遺伝子が欠失している、請求項1記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記NS2遺伝子が欠失している、請求項1記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記NS1,NS2又はSH遺伝子のcis作用性調節配列がRSV N遺伝子の異種調節配列により置換されている、請求項1記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記RSVゲノム又はアンチゲノムがその遺伝子間部位に挿入された1又は数個の制限部位をコードするポリヌクレオチドをコードする、請求項1〜5のいずれか1項記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記1又は数個の制限部位をコードするポリヌクレオチドがRSVゲノム又はアンチゲノムのヌクレオチド5611位と5616位の間に挿入される、請求項6記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- 前記組換RSVゲノム又はアンチゲノムが、Nタンパク質におけるVal 267、Lタンパク質におけるCys 319、Lタンパク質におけるPhe 521、Lタンパク質におけるGln 831、Lタンパク質におけるMet 1169、Lタンパク質におけるAsp 1183、Lタンパク質におけるHis 1690の突然変異、M2遺伝子の遺伝子開始におけるヌクレオチド7605でのTからCへの突然変異からなる群から選ばれる少なくとも1つの点突然変異をコードする、請求項1〜7のいずれか1項記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- サブウィルス粒子である、請求項1〜8のいずれか1項記載の弱毒化感染性RSV粒子。
- RSVの感染の予防又は処置のための医薬品の製造のための請求項1〜9のいずれか1項記載の弱毒化感染性RSV粒子の使用。
- 前記医薬品が前記弱毒化RSV粒子を103〜106PFUの用量で投与するように処方された、請求項10記載の使用。
- 前記医薬品が上方呼吸器官に投与されるように処方された、請求項10又は11記載の使用。
- 前記医薬品がスプレー、液滴又はエアゾールにより投与されるように処方された、請求項10〜12のいずれか1項記載の使用。
- 前記医薬品がRSVに対する抗体について血清陰性である個体又はRSVに対する終胎盤獲得母体抗体を有する個体に投与するように処方された、請求項10〜13のいずれか1項記載の使用。
- 生理学的に許容される担体中の免疫学的に十分な量の請求項1〜9のいずれか1項記載の前記弱毒化RSV粒子を含んで成る、RSVに対する防御を誘導するワクチン。
- 103〜106PFUの前記弱毒化RSV粒子の用量において処方されている、請求項15記載のワクチン。
- 前記弱毒化RSV粒子を上方呼吸器官に投与するように処方された、請求項15又は16記載のワクチン。
- SH,NS1又はNS2遺伝子の少なくとも1つの発現が消失又は調節されるように修飾されている部分又は完全RSVゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 前記SH遺伝子が欠失している、請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記NS1遺伝子が欠失している、請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記NS2遺伝子が欠失している、請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記NS1,NS2又はSH遺伝子のcis作用性調節配列がRSV N遺伝子の異種調節配列により置換されている、請求項18記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記部分又は完全RSVゲノム又はアンチゲノムが、Nタンパク質におけるVal 267、Lタンパク質におけるCys 319、Lタンパク質におけるPhe 521、Lタンパク質におけるGln 831、Lタンパク質におけるMet 1169、Lタンパク質におけるAsp 1183、Lタンパク質におけるHis 1690の突然変異、M2遺伝子の遺伝子開始におけるヌクレオチド7605でのTからCへの突然変異からなる群から選ばれる少なくとも1つの点突然変異をコードする、請求項18〜22のいずれか1項記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記部分又は完全RSVゲノム又はアンチゲノムがその遺伝子間部位に挿入された1又は数個の制限部位をコードするポリヌクレオチドをコードする、請求項18〜22のいずれか1項記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記1又は数個の制限部位をコードするポリヌクレオチドがRSVゲノム又はアンチゲノムのヌクレオチド5611位と5616位の間に挿入される、請求項24記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 発現ベクターであって:
i)哺乳動物細胞又はインビトロで作用するプロモーター;及びかかるプロモーターが作用可能式に連結された
ii)請求項18〜25のいずれか1項記載のポリヌクレオチド;及びかかるポリヌクレオチドが作用可能式に連結された
iii)哺乳動物細胞又はインビトロで作用する転写ターミネーター;
を含んでなる発現ベクター。 - 感染性RSV粒子の製造方法であって、請求項26記載の発現ベクターをN,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質を培養細胞内で同時発現させ、前記細胞又は前記当該細胞を培養するための培地から、前記感染性RSV粒子を単離する、ことを含んでなる方法。
- 前記N,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質の少なくとも1つを、前記N,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質のその他を発現するベクターとは別のベクターから発現させる、請求項27記載の方法。
- 前記N,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質の少なくとも2つを、前記N,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質のその他を発現するベクターとは別のベクターから発現させる、請求項27記載の方法。
- 前記N,P,L及びM2 ORF1 RSV RNAポリメラーゼ伸長因子タンパク質の全てを同一のベクターから発現させる、請求項27記載の方法。
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