EA011878B1

EA011878B1 - Респираторно-синцитиальный вирус с перекрестно компенсированным геномным дефицитом

Info

Publication number: EA011878B1
Application number: EA200601218A
Authority: EA
Inventors: Виллем Люйтэйс; Мира Норели Видйойоатмодьо
Original assignee: Де Стат Дер Недерланден, Вертегенвордигд Дор Де Министер Ван Волксгезондхейд, Велзейн Ен Спорт
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-24
Publication date: 2009-06-30
Also published as: NZ548107A; CY1118741T1; ZA200605218B; NO20062967L; CA2551009A1; PT1699919T; US20180207211A1; BRPI0418093A; NO334756B1; EP2500419A1; LT1699919T; JP4814799B2; ES2670713T3; EP1699919B1; KR101266715B1; TR201808496T4; US10967014B2; WO2005061698A1; CA2551009C; IL176500A0

Abstract

Настоящее изобретение относится к пневмовирусным вирионам, содержащим вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только с вирусного генома, не имеет инфекционности, и при этом вирион включает в себя данный белок в форме и количестве, которые требуются для инфекционности вириона. Изобретение относится к способам продукции данных пневмовирусных вирионов и их применения при лечении и профилактике пневмовирусной инфекции и заболевания. Предпочтительный пневмовирусный вирион представляет собой вирион респираторно-синцитиального вируса, в котором предпочтительно инактивирован и перекрестно компенсирован ген белка прикрепления G.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области вакцинации, и более конкретно к вакцинам против заболевания, вызванного пневмовирусами, такими, например, как респираторно-синцитиальный вирус (К8У). Изобретение относится к вирионам В8У, несущим геном В8У, в котором инактивирован ген, существенный для инфекционности, в то время как соответствующий продукт гена дикого типа перекрестно дополняет вирион. Изобретение далее относится к способам продукции таких вирионов К.8У и к их применению в вакцинах и способах вакцинации против пневмовирусов.

Предшествующий уровень техники

Респираторно-синцитиальный вирус человека классифицирован как род Рпеитоу1ги8, семейство Рагатухоу1гикек. Он является основной причиной тяжелого заболевания нижних дыхательных путей детей, пожилых людей и субъектов с иммунодефицитом. Он также является важным фактором заболевания верхних дыхательных путей у старших детей и взрослых. В настоящее время в данной области нет доступной эффективной вакцины против Ь-К8У.

К.8У представляет собой оболочечный РНК-вирус, который экспрессирует два основных антигена на своей поверхности: белок прикрепления С и белок слияния Р. Оба белка, как оказывается, индуцируют защитные антитела. С является детерминантой двух известных подгрупп 11-К8У А и В. В двух группах имеется антигенное различие. С-белок характеризуется высокой степенью вариации лишь с 53% аминокислотной гомологией между группами А и В и до 20% различий в последовательностях белка С в пределах группы А (МиЛоп, 1988; Сапе, 1991).

Пассивная иммунизация обогащенным К.8У иммуноглобулином (Ке^рщат) или синтетическими гуманизированными моноклональными антителами против Р (РаЛз/итаЬ) в настоящее время применяется для лечения и защиты новорожденных при определенной предрасположенности (например, недоношенности) к инфекции К.8У (ВоЬшкоп, 2000, Сгеепоидй, 2000). Патология К.8У имеет два основных аспекта: повреждение клеток, вызванное самим вирусом, и повреждение ткани, вызванное избыточной реакцией иммунной системы. Последнее является сильно осложняющим фактором при конструировании вакцин.

Инфекции К.8У являются сезонными, ограниченными зимним периодом и с пиком в северном полушарии примерно в конце года. К.8У инфицирует каждого ребенка до 2 лет, во многих случаях дважды. Пожилые субъекты в среднем инфицируются раз в 2 года, в зависимости от условий; люди в близком контакте с младенцами и маленькими детьми имеют 50%-й риск. Вирус распространяется контактным путем, капельным путем или через контаминированные поверхности. К.8У неэффективно распространяется через аэрозоли; вирусные частицы относительно нестабильны. Внутреннее распространение вируса из верхних дыхательных путей (ИНТ) в нижние дыхательные пути (ВИТ) происходит преимущественно путем ингаляции вирусных частиц, продуцируемых в эпителии ИВТ во время первичной инфекции. Распространение путем образования синцития (одного из патологических свойств вируса, откуда и происходит его название) не следует сбрасывать со счета, и оно может играть вторичную роль при инфекции ЬВТ.

Обычно патология К.8У начинается в ИВТ; входными воротами являются нос и, в меньшей степени, глаза, а не рот. Когда заболевание ограничено тканями ИВТ, оно ограничено обычной простудой, хотя у взрослых иногда и весьма тяжелой. Однако, когда вирус достигает ЬВТ, у незащищенных субъектов могут развиться бронхиолит и пневмония. У маленьких детей это может представлять угрозу жизни, примерно 1/100 требуют госпитализации и механической вентиляции, из них 1% может погибнуть. У пожилых индуцированное К.8У заболевание ЬВТ может представлять собой основную причину госпитализации; полагают, что К.8У вызывает 25% гриппоподобных заболеваний.

Иммунный ответ в отношении К.8У является комплексным. Обычно воздействие 11-К8У создает ответ, который защищает от заболевания ЬВТ. Данный ответ убывает в пожилом возрасте, вызывая более высокую чувствительность к К.8У у пожилого населения. Эффективная длительная защита против заболевания ИНТ оказывается невозможной: повторная инфекция обычна, даже в течение одного сезона, и это не вызвано изменчивостью вируса. В защите против инфекции К.8У используются антитела против вирусных белков Р и С, циркулирующие в крови, которые могут предотвращать заболевание ЬВТ. Инфекция ИНТ может контролироваться антителами против Р и С, находящимися в слизистой, но они имеют ограниченное время жизни.

СЭ8+ Т-клетки против не идентифицированных на данный момент вирусных белков требуются для удаления вируса из инфицированных тканей, но они оказываются короткоживущими или неэффективно рекрутируются из своих резервуаров. Более вероятно, это вызвано экспрессированными К.8У факторами, возможно, кодируемыми С-геном (8пк1а1кйаейот, 1997а).

Важным аспектом заболевания К.8У является иммунное усиление патологии. В ограниченных случаях клеточный иммунный ответ может обострять заболевание К.8У под действием цитокинов, высвобождающихся из привлекаемых в избытке гранулоцитов, на инфицированные ткани. В данную реакцию вовлечена предрасположенность хозяина, но, возможно, также и время возникновения первой инфекции К.8У после рождения. Неожиданно ранние испытания вакцин с инактивированным формалином К.8У показали, что в данных условиях вакцинации преобладала иммунно усиленная патология по сравнению с

- 1 011878 инфекцией дикого типа (К1т, 1969). Факторы, содержащиеся в Βδν, как оказывается, ответственны за данный феномен и явно высвобождаются при обработке формалином. В течение 40 лет после этого было постепенно показано, что вирусный белок С является преобладающим медиатором данных проблем, но механизм остается неясным (5>пк1а1к11ае1югп. 1997Ь). В любом случае, вакцинация белком С без контекста вириона (т.е. в препаратах инактивированного вируса, в виде экспрессирующего продукта, надлежащим образом не встроенного в мембрану или в виде пептидов), как кажется, вызывает иммунное усиление в модельных системах. Таким образом, хотя С в некоторый степени вносит вклад в иммунитет против Βδν, его свойства также осложняют конструирование вакцины.

Первые живые вакцины-кандидаты против Βδν включали в себя пассированные на холоде или чувствительные к температуре мутанты. Первые были аттенуированы путем культивирования при сниженной температуре, что приводит к зависимости от низких температур для роста, в то время как последние мутанты были получены, так что они зависят от специфичной, обычно высокой, температуры для репликации путем химического или радиационного мутагенеза. Такие живые вирусные вакцины-кандидаты оказываются либо недостаточно аттенуированными, либо чрезмерно аттенуированными (Сготее, 1998).

Субъединичные вакцины-кандидаты происходят из К.8У-Р или из С-белка, причем они являются основными мишенями для нейтрализующих антител. Субъединичная вакцина-кандидат РРР2, очищенный Р-белок, является безопасной для Βδν-серопозитивных пациентов, но не обеспечивает полной защиты против инфекции ЬКТ и ассоциированного заболевания (СопхаКх, 2000). Другим подходом к субъединичной вакцине является ВВС2Ыа, которая состоит из полипептида, содержащего аминокислоты 130-230 й-К.8У-С, слитого с альбуминсвязывающим доменом стрептококкового белка С (Ротеег, 1997). ВВС2Ыа индуцирует ответ Т-хелперов типа 2 у новорожденных мышей и не характеризуется иммунопатологией легких (81едп51, 1999). Пока не имеется данных по протекции. Применение новых адъювантов для сбалансированного гуморального и клеточного иммунного ответа в настоящее время исследуется на экспериментальных животных (Р1о1шску, 2003).

Применение векторов на основе плазмидной ДНК, кодирующих антигены Р8У-Р и -С, в качестве вакцин-кандидатов исследовано на экспериментальных животных. Данные вакцины индуцируют протективные реакции у грызунов (Ь1, 2000), но в одном исследовании мыши, иммунизированные ДНК-вакциной-кандидатом на основе К.8У-Р, характеризовались слегка усиленной воспалительной реакцией в легких после стимуляции вирусом дикого типа (ВетЬпйде, 2000). Возможность применения плазмидных ДНК-вакцин у людей пока не известна, и, вероятно, потребуется по меньшей мере 15 лет до того, как данный подход будет достаточно исследован и, что более важно, принят, особенно для новорожденных. Вакцины-кандидаты, основанные на векторных системах доставки, сконструированы из живых рекомбинантных векторов, экспрессирующих белки К.8У. Например, рекомбинантный вирус коровьей оспы, экспрессирующий К.8У-Р и -С, обеспечивал защиту у мышей, но не имел данного эффекта у шимпанзе (СоШпк, 1990). Вопрос в том, безопасны ли данные системы (в частности, вирус коровьей оспы) и могут ли они использоваться в свете существующих (материнских) антител против поксвирусов в популяции при том, что основной целевой группой являются новорожденные.

Некоторые вакцины-кандидаты основаны на рекомбинантном живом К.8У, полученном путем обратной генетики. Одно из направлений исследований сконцентрировано на аттенуировании данных вирусов путем введения отдельной или комбинированных мутаций, ответственных за адаптацию к холоду и чувствительность к температуре рекомбинантного вируса. Ни одна из данных вакцин не была подходящей из-за избыточного или недостаточного аттенуирования. Другое направление исследований сконцентрировано на делеции одного или нескольких вирусных неструктурных генов. Доступны ограниченные данные по поведению данных вирусов в модельных системах (Лп, 2003).

Альтернативным подходом к разработке вакцин против К8У является применение бычьего К.8У. Химерный бычий К8У с человеческим Р-белком или с человеческими белками Р и С оценивали на предмет его эффективности у шимпанзе. Данная вакцина-кандидат была ограничена по репликации до такой степени, что животные оказывались незащищенными после стимуляции 11-Р8 V дикого типа (ВисЫоЙх, 2000).

Таким образом, в настоящее время не имеется эффективной вакцины против й-Κδν, доступной в данной области. Все вакцины-кандидаты против Βδν, которые были тестированы на экспериментальных животных, не могут быть использованы на человеке. Так, в данной области имеется длительная потребность в вакцинах Βδν, которые эффективны и безопасны, и целью настоящего изобретения является предоставление таких вакцин.

Описание изобретения

Определения

В данном документе и в формуле изобретения включать в себя означает, что объекты, следующие за этим выражением, включены, в то время как объекты, не указанные конкретно, не исключены. Кроме того, ссылка на единственное число не исключает возможности присутствия нескольких элементов, кроме случаев, когда контекст явно требует, чтобы элемент присутствовал в единственном числе. Таким образом, единственное число обычно означает по меньшей мере один.

Используемый здесь термин вирион относится к вирусной частице, которая содержит нуклеокап

- 2 011878 сидный белок, вирусный геном и репликазный комплекс в липидной оболочке, который содержит вирусные структурные гликопротеины.

Термины инфекционность вируса, инфекционный вирус, инфекционная вирусная частица или инфекционный вирион означают вирусы, вирусные частицы или вирионы, которые способные проникать в подходящие клетки-хозяева и инициировать цикл репликации вируса, независимо от того, приводит ли это к продукции инфекционного вируса или нет.

Подробное описание изобретения

В первом аспекте настоящее изобретение относится к вириону пневмовируса. Вирион включает в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и при этом вирион содержит данный белок в форме и количестве, которое требуется для инфекционности вириона.

Пневмовирус предпочтительно представляет собой респираторно-синцитиальный вирус (В8У), более предпочтительно человеческий или бычий КБУ. Человеческий КБУ может быть вирусом подгруппы А или В и предпочтительно представляет собой клинический изолят, более предпочтительно изолят, который не подвергался интенсивному пассированию ίη νίίτο (предпочтительно пассирован менее 10, 8, 6 или 5 раз, как описано в примерах). Поэтому любой штамм или изолят КБУ может использоваться в контексте настоящего изобретения, при этом понятно, что изобретение лишь иллюстрируется посредством конкретного человеческого изолята КБУ 98-25147-Х, обозначенного как изолят КБУ X. Далее предпочтительно, чтобы вирус представлял собой недавний клинический изолят, причем недавний определяется как впервые выделенный менее чем 10, 8, 6, 4, 3 или 2 года тому назад. Следует понимать, что, хотя нуклеотидные последовательности в вирионе не обязательно должны соответствовать недавнему изоляту, предпочтительно, чтобы аминокислотные последовательности белков, присутствующих в вирионе согласно изобретению, были идентичны белкам, встречающимся в недавнем клиническом изоляте.

Вирусный геном включает в себя по меньшей мере одну мутацию по меньшей мере в одном вирусном гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, при этом инфекционность вируса определяется, как определено выше. Таким образом, белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, представляет собой белок, необходимый для способности вириона согласно изобретению проникать в подходящую клетку-хозяин и инициировать цикл репликации вируса, при этом цикл репликации не обязательно приводит к продукции новых инфекционных вирионов. В предпочтительных вирионах согласно изобретению мутация вызывает неспособность вирионов к инфекционности ίη νίνο, т.е. в подходящем организме-хозяине, при этом вирионы могут оставаться инфекционными для подходящих клеток-хозяев, культивируемых ίη νίΐΓο.

В предпочтительном вирионе согласно изобретению мутантный ген, кодирующий белок, необходимый для инфекционности пневмовируса, представляет собой ген, кодирующий структурный белок вируса. Структурный белок пневмовируса понимается здесь как белок, который присутствует в вирионах инфекционного вируса дикого типа. Предпочтительные гены, кодирующие структурные белки, подлежащие мутации в вирионах согласно изобретению, представляют собой гены, кодирующие белок присоединения С и/или белок слияния Р, причем белок С является наиболее предпочтительным. Делеция и/или функциональная инактивация гена, кодирующего белок С, служит нескольким целям и предотвращает некоторое количество проблем и осложнений современных вакцин-кандидатов против К.8У. Одной из целей является безопасность вакцины: К.8У без белка С является высокоаттенуированным в своем хозяине (Каггоп, 1997; 8сЬш1б1, 2002), поскольку он не будет иметь возможности эффективно инфицировать клетки-хозяева. Одним из осложнений является то, что белок С сильно вовлечен в индукцию нежелательных иммунологических реакций, включая усиление иммунопатологии (Αίναη, 1993, 5>пк1а1к11ас1югп. 1997Ь) и возможное смещение иммунного ответа в направлении состояния аллергии (и астмы) при некоторой генетической предрасположенности (Ореп511а\\\ 2003; РееЬ1е§, 2003). Это может предотвращаться делецией или инактивацией гена С. Пневмовирусный вирион согласно изобретению, включающий в себя вирусный геном, который имеет инактивирующую мутацию в гене, кодирующем белок присоединения С, и включающий в себя белок присоединения С в форме и в количестве, которые требуются для инфекционности вириона, обозначается как ДС+С (пневмо)вирус или вирион. Сходным образом, вирион, который имеет инактивирующую мутацию в гене, кодирующем белок присоединения С, но который перекрестно не компенсирован функциональным количеством белка С, обозначается как ДС (пневмо)вирус или вирион.

Таким образом, пневмовирусные вирионы согласно изобретению временно и функционально восстанавливаются кодируемым вне вируса белком, который необходим для инфекции. Предпочтительно, если кодируемый вне вируса белок, необходимый для инфекции, представляет собой белок присоединения С и/или белок слияния Р, при этом белок С наиболее предпочтителен. Предпочтительно, чтобы кодируемый вне вируса белок, необходимый для инфекции, соответствовал по вирусной подгруппе (А или В) гену, который присутствует в вирионе. Более предпочтительно, если кодируемый вне вируса белок, необходимый для инфекции, гомологичен геному, который присутствует в вирионе, при этом подразу

- 3 011878 мевается, что белок имеет ту же аминокислотную последовательность, что и аминокислотная последовательность, кодируемая в геноме вируса перед его инактивацией. Альтернативно, это может означать, что кодируемый вне вируса белок имеет ту же аминокислотную последовательность, которая присутствует в вирионах дикого типа, в которых аминокислотные последовательности с одним или несколькими кодируемыми внутри них белками имеют 100% идентичность в отношении соответствующих им белков в вирионе согласно изобретению.

В вирионах согласно изобретению мутация в гене необходимого структурного белка представляет собой мутацию, которая приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из одного вирусного генома, не имеет данного белка или экспрессирует биологически неактивированный белок. Продукция вируса только из вирусного генома, как понимается, означает вирус, продуцируемый исключительно из вирусного генома, присутствующего в вирионах и в отсутствие какой-либо кодирующей последовательности, перекрестно дополняющей вирусный геном. Вирусный геном, присутствующий в вирионах, таким образом, не может направлять экспрессию необходимого вирусного белка. Это может достигаться различными путями, известными специалисту, включая, например, инактивацию кодона инициации трансляции, введение стоп-кодонов вблизи Ν-конца кодируемого белка, одну или несколько мутаций со сдвигом рамки считывания, делецию из гена одного или нескольких фрагментов. Предпочтительно, когда ген инактивируется делецией по меньшей мере 10, 20, 50, 75, 90 или 95% последовательности, кодирующей необходимый структурный белок. Наиболее предпочтительным, однако, является вирион, в котором мутация включает в себя делецию (целой) последовательности, кодирующей белок.

В объем изобретения однозначно включены вирионы, в которых присутствует более одной мутации. В частности, несколько генов, кодирующих вирусный белок, могут включать в себя мутации, которые инактивируют или изменяют функцию интересующего белка или которые вызывают отсутствие белка в вирионах, как описано выше. Например, мутации, связанные с пассированием на холоде или чувствительностью к нагреванию, известные в данной области, могут комбинироваться с инактивацией необходимых структурных белков, описанных согласно изобретению выше.

Клиренс пневмовирусов, подобных КЯУ. из инфицированного организма-хозяина требует надлежащего клеточного иммунитета, который не сможет эффективно развиться без инфицирования эпителиальных клеток вирусом. Однако мутантные пневмовирусы согласно изобретению не имеют генетической информации для белка, необходимого при инфекции клеток-хозяев ίη νίνο. Поэтому настоящее изобретение относится к способам продукции мутантных пневмовирусов, которые включают в себя репликацию мутантных пневмовирусов в клетках, которые компенсируют (перекрестно) отсутствие белка, необходимого для инфекции.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу продуцирования определяемых выше мутантных пневмовирусных вирионов. Способ представляет собой способ продуцирования пневмовирусных вирионов, при этом вирионы включают в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности (ίη νίνο) пневмовируса, при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и при этом вирион содержит данный белок в форме и количестве, которое требуется для инфекционности вириона. Способ включает в себя стадии: (а) инфицирования культуры первой клеткихозяина пневмовирусом, содержащим вирусный геном, который имеет определенную выше мутацию, при этом клетка-хозяин включает в себя экспрессирующий вектор, который временно или постоянно направляет экспрессию в клетке-хозяине белка в форме и в количестве, которое требуется для инфекционности вириона; и (Ь) получения вирионов из инфицированной культуры клетки-хозяина. Получение вирионов из инфицированной культуры клетки-хозяина может включать в себя получение из культуральной среды, или получение из клеток, или и то, и другое.

Первая клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяин, в которой пневмовирус способен к репликации, с одновременной перекрестной экспрессией белка, который требуется для инфекционности вириона. Подходящие клетки-хозяева для данной цели представляют собой, например, клеточные культуры почки африканской зеленой мартышки (такие, например, как Уего, лот ЕСАСС 1087, 134 пассаж, 1990, одобренные ЕМЕА).

В предпочтительном способе изобретения пневмовирус, который применяется для инфицирования культуры первой клетки-хозяина, продуцируют способом, включающим в себя стадии: (а) предоставления второй клетке-хозяину одного или нескольких экспрессирующих векторов, которые направляют в клетке-хозяине экспрессию (ί) вирусной геномной РНК, которая имеет мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности пневмовируса (ίη νίνο), при этом мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не характеризуется инфекционностью, и (ίί) пневмовирусного полимеразного ферментного комплекса и необязательно одного или нескольких дальнейших вирусных белков; и (Ь) культивирования второй клетки-хозяина, за счет чего продуцируются вирионы. В предпочтительном способе вирионы, продуцируемые второй клеткой-хозяином, амплифицируют одной или несколькими дальнейшими стадиями инфекции клеток с использованием клеток-хозяев, таких же или отличающихся от вторых клеток-хозяев.

Вторая клетка-хозяин может представлять собой любую клетку-хозяин, в которой пневмовирус

- 4 011878 способен к репликации с одновременной перекрестной экспрессией белка, который требуется для инфекционности вириона, или без нее. Подходящие для данной цели клетки-хозяева представляют собой, например, клеточные культуры почки африканской зеленой мартышки (такие, например, как клетки Уето, лот ЕСАСС 10-87, 134 пассаж, 1990, одобренные ЕМЕА) или клетки Нер-2. Вторая клетка-хозяин может быть такой же, как и первая клетка-хозяин, или может отличаться от нее.

В способах согласно изобретению вирусная геномная РНК транскрибируется из копии вирусной ДНК, которая находится под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага, и за счет этого (второй) клетке-хозяину предоставляется экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию в данной клетке-хозяине ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага. Предпочтительно, когда ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага представляет собой полимеразу Т7, Т3 или 8Р6.

Ферментный комплекс пневмовирусной полимеразы, который экспрессируется из одного или нескольких экспрессирующих векторов во второй клетке-хозяине, по меньшей мере, включает в себя белки Ь, Р, Ν, экспрессированные с их соответствующих генов или кДНК, в экспрессирующих векторах. Для усиленной эффективности вирусной сборки и упаковки голой вирусной геномной РНК один или несколько дальнейших вирусных белков необязательно экспрессируются во вторых клетках-хозяевах. Предпочтительные вирусные белки для данной цели включают в себя белки вирусной матриксной мембраны, из которых белок М2-1 является особенно предпочтительным. Белки Ь, Р, Ν, М2-1, С или Е предпочтительно происходят из вирусного генома вирусного изолята, который введен и экспрессирован в клетке-хозяине, но альтернативно также могут использоваться гомологичные белки из других гетерологичных вирусных или невирусных источников.

Специалисту в данной области понятно, что различные экспрессирующие векторы и регуляторные последовательности (такие, как промоторы) доступны в данной области для экспрессии вирусной геномной РНК, ДНК-зависимой РНК-полимеразы, ферментного комплекса пневмовирусной полимеразы и необязательных дальнейших вирусных белков, а также необходимого структурного белка, в первых и/или вторых клетках-хозяевах (см., например, 8атЬтоок аиб Виззе11 (2001) Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬота1огу Мапиа1 (3гб ебйюп), Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1огу, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬота1огу Ртезз, №\ν Уотк).

Для обратной генетики РНК-вирусов, т. е. экспрессии рекомбинантного РНК-вируса, такого как вирионы согласно изобретению, кДНК-копию вирусной геномной РНК клонируют в плазмиды и помещают под контроль последовательностей, которые обеспечат синтез РНК с ДНК в некоторых условиях. Обычно промоторную последовательность РНК-полимеразы бактериофага (например, РНК-полимеразы Т7) помещают выше ДНК-копии РНК-генома, в то время как подходящий терминатор для РНК-полимеразы помещают ниже генома. Последовательности саморасщепляющегося рибозима помещают выше терминаторных последовательностей для обеспечения синтеза РНК с правильными терминальными нуклеотидами. Правильные терминальные последовательности, в основном, требуются для высвобождения вируса из синтетической РНК. Для несегментированных РНК-вирусов с отрицательной цепью совместная экспрессия полимеразного ферментного комплекса (белки Ν, Р и Ь для парамиксовирусов) с геномной или антигеномной РНК требуется для получения рекомбинантного вируса (подвергнуто обзору №итапи, 2002, и иллюстрировано здесь примерами).

Другие предпочтительные способы могут включать в себя любую дальнейшую стадию выделения и/или очистки вирионов согласно изобретению и/или составление с использованием данных вирионов фармацевтических композиций. Способы выделения и/или очистки вирионов хорошо известны специалистам-вирусологам. Такие способы, например, включают в себя различные способы центрифугирования (например, дифференциальное центрифугирование или центрифугирование в градиенте плотности) или способы хроматографии. Способ введения вирионов согласно изобретению в фармацевтическую композицию, по меньшей мере, включает в себя стадию смешивания вирионов с фармацевтически приемлемым носителем, определяемым ниже.

В дальнейшем аспекте изобретение относится к композиции, содержащей описанный выше вирион или вирион, полученный определяемым выше способом, и фармацевтически приемлемый носитель. Композиция предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию, которая предпочтительно подходит для применения в качестве вакцины, т. е. композиция предпочтительно представляет собой вакцину.

Еще в одном аспекте изобретение относится к фармацевтическому препарату, содержащему в качестве активного ингредиента вирион согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые стабилизирующие средства, осмотические средства, буферные средства, диспергирующие средства и т. п. также могут включаться в фармацевтические композиции. Предпочтительная форма зависит от предназначенного пути введения и терапевтического применения. Фармацевтический носитель может представлять собой любое совместимое нетоксичное вещество, подходящее для доставки восстановленных вирусных мембран пациенту. Примерами фармацевтически приемлемых носителей для интраназальной доставки являются вода, буферные солевые растворы, глицерин, полисорбат 20, кремофор ЕЬ и водная смесь каприлового/капринового глицерида и может забуфериваться с предоставлением окружающей среды с нейтральным рН.

Для введения путем ингаляции фармацевтические композиции согласно изобретению подходящим

- 5 011878 образом доставляются в виде аэрозольного спрея из упаковок под давлением, или небулайзера, где вирионы присутствуют в носителе, как описано для интраназальной доставки, но с применением подходящей сжатой жидкости для распыления, например дихлордифторметана, трихлортрифторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением дозированная единица может определяться предоставлением клапана для доставки отмеренного количества.

Способы получения интраназальной или ингалируемой композиции хорошо известны в данной области и более подробно описаны в различных источниках, включая, например, Кеттд1ои'к Рйагтасеибса1 8с1еисе (15111 еб., Маск РиЫкЫид, Еак!ои, РА, 1980) (включен сюда полностью в качестве ссылки). Вирионы могут, таким образом, вводиться в качестве активных компонентов в любой препарат для вакцинации, который может, например, включать в себя носители, адъюванты, стабилизаторы, солюбилизаторы, консерванты и другие наполнители, известные в данной области, для обеспечения или для способствования эффективному введению препарата для вакцинации субъектов, предпочтительно человека и домашних или сельскохозяйственных животных (таких, как коровы, свиньи, лошади, козы, овцы).

В дальнейшем аспекте изобретение относится к способу вакцинации против пневмовирусной инфекции или для профилактики или терапии (профилактика или лечение) путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества вирионов (или фармацевтической композиции, содержащей вирионы) согласно изобретению, описанных выше, или вирионов, которые можно получить, как описано выше, субъекту нуждающемуся в профилактике или терапии. Предпочтительно, если вирионы вводят интраназально.

Изобретение, сходным образом, относится к описанным выше вирионам согласно изобретению или к вирионам, которые можно получить, как описано выше, для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно средства для вакцинации против пневмовирусной инфекции или для ее профилактики или лечения. Изобретение далее относится к применению вирионов согласно изобретению в производстве лекарственного средства для вакцинации против пневмовирусной инфекции или для ее профилактики или лечения. Предпочтительно, когда лекарственное средство представляет собой препарат для интраназального введения.

Композиции, включающие в себя вирионы согласно изобретению, для вакцинации предпочтительно вводятся интраназально подходящим хозяевам. В одном из вариантов осуществления телят следует защитить от инфекции Ь-В8У. Еще в одном варианте осуществления людей, предпочтительно детей и пожилых лиц или лиц с иммунодефицитом, защищают от инфекции 11-В8У. Препараты предпочтительно включают в себя препараты, подходящие для введения в виде интраназальных капель или спрея, предпочтительно назального спрея. ΔΟ+С-пневмовирусные частицы в композиции инфицируют эпителиальные клетки верхних дыхательных путей только один раз, поскольку вирионы второго поколения, продуцируемые из исходно инфицированных эпителиальных клеток ИВТ, не имеют белок присоединения С, кодирующая последовательность которого была удалена из генома. Поэтому данные Δ^β^^^ι не являются инфекционными ίη νίνο в организмах-хозяевах. Однако исходный единичный цикл инфекции обеспечивает развитие соответствующего клеточного иммунитета, который способен к ответу и клиренсу инфекции дикого типа, которые развиваются против пневмовируса, или против К.8У, в частности, в то время как защитные антитела против Е, т.е. антитела, которые будут предотвращать инфекцию нижних дыхательных путей, будут индуцироваться вакциной и неинфекционным потомством. Антитела против Е эффективны в ограничении инфекции К.8У, как показано за счет эффективности лечения Ра1Мти/аЬ, который представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против Е. Это является основой эффективности рекомбинантных живых аттенуированных пневмовирусных вакцин согласно изобретению. Данные живые вирусные вакцины решают несколько проблем, ассоциированных с современными вакцинами-кандидатами против пневмовирусов. Присутствие С-белка в его природном контексте в вирионе обеспечивает развитие подходящего клеточного иммунитета, в то время как нежелательные эффекты иммунитета против выделенного С-белка, который большей частью отвечает за усиление иммунного ответа при патологии Ь-К.8У и 11-В8У у крупного рогатого скота и человека, соответственно, предотвращаются.

Описание фигур

Фиг. 1. Диаграмма конструирования рК.8УХАС. Верхняя линия соответствует геномной РНК-изоляту В8У X с указанными генами. Нижние четырехугольники соответствуют продуктам ОТ-ПЦР и олигонуклеотидным дуплексам, использованным для конструирования. Числа внутри четырехугольников означают номера олигонуклеотидов. Указаны включенные для клонирования сайты рестрикции. Окончательная схема клонирования приведена ниже: окружности - это плазмиды, а стрелки показывают последовательность клонирования.

Фиг. 2. Выравнивания показывают различия между последовательностями изолята К.8У X и ρΒδνΧΔΠ Последовательности показаны как выравнивание геномного направления. Для рΚ.8УXΔС показаны нуклеотидные отличия только от изолята К.8У X. Подобные последовательности показаны точками (.) и пробелами (-). Сигналы генного старта подчеркнуты одной линией, гены стоп-сигналов подчеркнуты двойной линией, и гены указаны в заголовках. Контуры четырехугольников включали участки

- 6 011878 узнавания рестриктаз, полученных из нуклеотидных замен.

Фиг. 3. Определение маркеров последовательностей в продуктах амплификации К8У с помощью ОТ-ПЦР с расщеплением: а) М1и1, Ь) Хта1, с) ЕехА-Ι, й) 8паБ-1.

Фиг. 4. Графики роста изолята К8У X и изолята ДО-К8У X. Уето (сплошные линии) и Нер-2 (пунктирные линии) клетки инфицировали вирусом с ΜΟΙ=0,1 и инкубировали при 37°С. За указанное время колонии клеток собрали и определили титры ССГО50 в клетках Уето.

Табл. 1. Праймеры, использованные для диагностической ОТ-ПЦР на РНК из К8У, инфицировавшего Уего клетки.

Табл. 2. Результаты экспериментов иммунизации хлопковых крыс, защита против инфицирования К8У и К8У-индуцированной патологии с помощью иммунизации изолятом ДО-К8У X.

Примеры

Данное изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, которые применяются для иллюстрации конкретных вариантов изобретения и не предназначены для ограничения общего объема или какого-либо аспекта изобретения.

Пример 1. Вирусный изолят, выделение, размножение и хранение вируса.

Основой для рекомбинантного клона 11-К8У является клинический изолят К8У, полученный из диагностической лаборатории Медицинского Центра Лейденского Университета. Этот вирус, названный 98-25147-Х, закодированный после пациента, от которого он был выделен, получили в диагностическом тесте на клетках Нер-2 за период 21-24 декабря 1998. Впоследствии его определили как изолят подтипа А и назвали изолят К8У X. Вирус пересаживали 4 раза на клетках Нер-2 во флаконах Т75 в ΌΜΕΜ (О1Ьсо), 10% РС8, реп/81тер/д1и и затем 5 раз на клетках Уего во флаконах Т75 на ΌΜΕΜ (О1Ьсо), 10% РС8, реп/йгер/Ди. Полученный вирусный изолят К8У X использовали как рабочий маточный раствор и хранили при -135°С в 25 или 45% сахарозе.

Пример 2. Конструирование кДНК кодирующей вирусный геном.

Общую РНК получили с помощью экстракции фенолгуанидинизотиоцианатом (Тихо! 1пуЦгодеп) матричного изолята К8У X, инфицировавшего Уего клетки. кДНК получили с помощью обратной транскрипции, используя Т11еппо5спр1 Дпуйтодеп) обратную транскриптазу с применением случайных гексамерных праймеров. Эту кДНК использовали как матрицу для ПЦР с применением высокоточной Тад полимеразы (1пуйтодеп), используя специфические праймеры, содержащие участки узнавания рестриктаз. Праймеры конструировали на основании опубликованных последовательностей К8У-Л2 (инвентарный номер ОепЬапк Μ74568) апй К8У-К882 (инвентарный номер ОепЬапк и39662).

Продукты ПЦР вначале были по отдельности клонированы в различные векторы: пары праймеров, векторы, участки распознавания рестриктаз и названия полученных векторов приведены ниже.

К8У021/К8У047: рСАР вектор (Коске), затупленный Μ1υ N1, рСАР3 (8Η/Μ/Ρ область). К8У018/019: рСАР вектор, затупленный Μ1υ N1, рСАР2 (О область).

К8У016/К8У017: РИС21, Μ1υ Ι/Ват ΗΙ, рИК5 (Μ2-2/Μ2-1/Ρ область).

К8У024/К8У025а: РИС21, Ват ΗΙ/АД II, рИК1 (Ν82/Ν81 область).

К8У022/К8У023: РИС21, ЕсоК У, рИК4 (Ν область).

К8У014/К8У015: РИС21, Крп Ι/Μ1υ I, рИК2 (Ь область).

Секвенировали по меньшей мере два отдельных клона, полученных из двух независимых матриц кДНК; участки, содержащие отличия между двумя клонами, секвенировали в третьем клоне. При необходимости клоны восстанавливали, используя стандартные молекулярно-биологические технологии, известные специалистам в данной области. Были получены и секвенированы дополнительные ПЦР-продукты, покрывающие участки связывания праймеров, использованных для клонирования. 5'-геномные концы определяли с помощью полиаденилирования геномной РНК, следующей за ОТ-ПЦР с олиго(й)Т, содержащей праймер АЬО018: ТТААААОСТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ, и N81 генный праймер К8У 126: ААТТСТ6СА06СССАТСТСТААССААА66А0Т.

Этот фрагмент клонировали в рИС21, используя НшйШ/РШ. 3'-Конец определили с помощью КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) лигирующей ПЦР. Все последовательности собрали для получения согласованной последовательности К8УШ (8ес.| Ю №. 1).

Все последовательности были подтверждены с помощью секвенирования путем циклов ПЦР с использованием набора ВЦЭуе (етипаЮг (АррНей Вюкуйетк) и проанализированы с помощью генетического анализатора АВI Рп5т310.

Пример 3. Конструирование полноразмерной плазмиды изолята ДО-К8У X.

Полноразмерная кДНК, охватывающая весь геном изолята К8У X, была сконструирована с помощью последовательного лигирования ПЦР-фрагментов (фиг. 1). Ттайет конец начинали с промотора для полимеразы Т7 бактериофага. Для получения корректного 3'-конца лидирующий конец кДНК соединяли с рибозимом вируса гепатита дельта (НО УК), следующим за терминатором транскрипции Т7 РНК полимеразы (см. фиг. 1).

Во-первых, два положения комплементарных олигомеров, кодирующих НОУК, и Т7 терминаторные К8У026/К8У027 олигомеры и К8У028/029 олигомеры фосфорилировали Т4 ДНК киназой, гибриди- 7 011878 зовали и лигировали в клон рИК1 (содержащий гены Ν81/Ν82) с помощью КзтПТЫоП, дающего плазмиду риК3. Затем фрагмент Хта 1/8ехА I клона рИК4, содержащий Ν, лигировали в плазмиду рИКЗ через Хта 1/8ехА I. Эта плазмида (рИКб) содержит область от гена N до З'-лидирующей последовательности, соединенной с НЭУВ и Т7 терминатором.

Во-вторых, Хта Ι/Есо КУ фрагмент плазмиды рСАРЗ вставили в плазмиду рИК5, используя Хта I и заполненный Ηίηά III участок. В результате получили плазмиду рИК8. Затем рИК 8 расщепили В55Н II и Βκί^ν I, концы были заполнены полимеразой К1епо\\· и вновь лигированы. Эта плазмида содержит гены М2-2, М2-1, Ρ, 8Н, М и Р и называется рИК9.

Для синтеза низкокопийного количества вектора для кДНК изолята К.8У X два комплементарных олигомера В8У011: АССТТСССССССССТССАССССССАССССТССАТССССТАССАТ, и В8У012: ССАТССТАССССАТССАССССТССССССТССАСССССССССА, фосфорилировали Т4 ДНК киназой, гибридизовали и вставили в плазмиду рАСУС184 (Νονν Епд1ап6 Вю1аЬ§), обработанную щелочной фосфатазой и расщепленную С1а !/ΗίηΗ III. Полученную плазмиду назвали рАСУС18 4-МС8. Затем вставили фрагмент М1и РКпр I плазмиды рИК2, содержащий Т7 промотор и Ь ген, эту промежуточную плазмиду назвали рАСУС1. Затем область от N гена до З'-лидирующей последовательности, включающую соединенные НЭУВ и Т7 терминаторную последовательность рИКб, добавили к рАСУС1, используя Хта ΡΝοΙ I. Получилась промежуточная плазмида рАСУС2. В завершение, Хта I/М1и I фрагмент рИК9, содержащий М2-2, М2-1, Ρ, 8Н, М и Р гены, вставили в рАСУС2, получив плазмиду рАСУСЗ, включающую целый геном К.8У штамма Х без С гена. Анализ последовательности последней плазмиды выявил делецию в НЭУВ области, которая была репарирована, и полученную плазмиду назвали рВ8УХАС.

В дополнение к конструированию рВ8УХАС. сконструировали рАСУС24, в которой вставку геномного изолята К.8У Х комплементарно перевернули с помощью обратной ПЦР. Из этой конструкции может быть синтезирована антигенная К.8У РНК. В рАСУС24 Т7 промотор предваряет З'-лидирующую последовательность, в то время как НЭУК и Т7 терминатор присоединены к 5'-1тайег последовательности.

Все участки узнавания рестриктаз, использованные для конструирования рКБУХАС, локализованы внутри К.8У интергенных областей и не изменяют кодирующие последовательности или аГГес! сигналы транскрипции (как показано на фиг. 2).

Пример 4. Конструирование вспомогательных плазмид.

Вспомогательные плазмиды, экспрессирующие несколько белков В8У, были сконструированы, как следует далее. Все требуемые гены были получены из лабораторного штамма К.8У-А2 (АТСС #УВ1З02). Вирус очистили на Нер-2 клетках методом бляшек и затем использовали для заражения Уего клеток. Общую РНК выделили из этих клеток с помощью экстракции фенолгуанидинизотиоцианатом (Тпхок Шуйтодеп) и подвергли ОТ-ПЦР, используя высокоточную Тад-полимеразу (!пу|1годеп) и положение праймеров, специфичных к В8У-генам Ь, Р, Ν и М2-1, соответственно. Впоследствии ПЦР-продукты клонировали в экспрессирующие плазмиды пкДНКЗ, пкДНКб или рСй используя участки узнавания рестриктаз. Клонированные последовательности подтвердили с помощью секвенирования путем циклов ПЦР, используя набор терминаторов ВщЭуе (Аррйеб Вюкуйетк), и проанализировали на генетическом анализаторе АВI РтктЗ10.

Пример 5. Конструирование линий С-продуцирующих клеток Уего.

Клеточные линии, продуцирующие В8У-С белок, были сконструированы с использованием различных способов.

В способе 1 С ген либо из В8У-А2, либо из изолята К.8У Х, или С ген из В8У-А2, в котором внутренний инициирующий трансляцию кодон был поврежден с помощью модификации, используя праймеры К.8У0ЗЗ и К.8У 0З4, клонировали в экспрессирующий вектор пкДНКЗ или пкДНКб Дпуйтодеп) с применением ОТ-ПЦР на РНК из К.8У-А2 или изолята К.8У Х, инфицировавшего клетки Уего, используя праймеры. Плазмиды ввели в Уего клетки, используя химические агенты СаС1₂, соосаждение, основанное на липосомах, или электропорацию (Аи8иЬе1, 1989). Были применены два способа для выделения стабильных клеточных линий. В первом способе через 72 ч после трансфекции клетки были разделены с использованием различных разведений в свежей среде, содержащей селективную среду, зеоцин для пкДНКЗ и бластицидин для пкДНКб. Клетки получали питание через селективную среду каждые З-4 дня до тех пор, пока не идентифицировали фокусы образования клеток. Единичные колонии собирали и переносили на 9б-луночную плашку или засевали в различных разведениях для получения единичных клеток на 9б-луночной плашке. Антибиотикорезистентные колонии тестировали на экспрессию В8У-С с помощью иммуноокрашивающих технологий или РАС8, используя В8У С-специфические антитела. Колонии, экспрессирующие С, пересаживали и классифицировали как стабильные клеточные линии, экспрессирующие С. Второй способ включает РАС8 сортировку с использованием В8У-С специфических антител через 72 ч после трансфекции. В8У-С экспрессирующие клетки засевали в последовательном разведении для получения единичных клеток в 9б-луночную плашку и культивировали в селективной среде. Единичные клеточные колонии пересаживали на селективную среду и затем снова тестировали на экспрессию В8У-С, полученного в клеточных линиях, экспрессирующих В8У-С.

В способе 2 Б1р-!п система Дпуйтодеп) использовалась для получения Уего клеток с сайтами инсер

- 8 011878 ции генов-мишеней в хромосомных положениях, которые обеспечивают различные уровни экспрессии гена мишени. Ген К8У-С, полученный из плазмид в способе 1, но с модификацией (включала использование праймера Е8У151) близлежащей последовательности С кодона, инициирующего трансляцию, для обеспечения более высоких уровней трансляции, был введен в каждую из этих клеточных линий с использованием общего для данной системы способа, с получением в клеточных линиях Уего стабильно экспрессирующих различных уровней С белка.

В способе 3 в клетках Уего временно экспрессировали С белок с помощью трансфекции экспрессирующими плазмидами, содержащими С ген по способу 1, или с помощью инфицирования модифицированным вирусом коровьей оспы Апкага (МУА) (8ийег, 1992) или вирусами чумы птиц (Зрейиег, 1990), экспрессирующими С белок.

Пример 6. Конструирование клеточных линий бактериофагов, продуцирующих Т7-полимеразу.

Ген Т7-полимеразы бактериофага амплифицировали путем ПЦР из плазмиды рРКТ7 (уаи Сепшр, 1997), содержащей этот ген, используя праймеры АЬС022 и АЬС023. Продукты ПЦР клонировали в пкДНК6Ь-вектор с применением Ншб ΙΙΙ/ХЬа I, получая плазмиду рс6Т7ро1. Клетки Уего трансфицировали, используя липофектамин 2000, как рекомендовано разработчиками (1пуйгодеи). Через 72 ч после трансфекции клетки разделяли и выращивали в свежей среде, содержащей бластицидин. Клетки подкармливали свежей средой каждые 3-4 дня и дважды разделяли для получения наибольших объемов культуры. Через 20 суток после трансфекции бластицидин-резистентные клетки трансфицировали репортерной плазмидой рТ7-1КЕ82-ЕСЕР, используя липофектамин 2000. Для конструирования плазмиды рТ7-1КЕ82-ЕСЕР первая плазмида рТ7-ЕСЕР была сконструирована с помощью вставки посредством Ншб111/ВатН1 в плазмиду р-ЕСЕР-Ы1 (С1опе1ес11) участка комплементарных олигомеров, кодирующего последовательность Т7-промотора (АЬС32: АССТААТАССАСТСАСТАТАСССАСАССССТ, и АЬС33: САТСАССССТСТСССТАТАСТСАСТССТАТТ). Затем сконструировали плазмиду рТ7-1КЕ82-ЕСЕР с помощью клонирования фрагмента Т7-ЕСЕР плазмиды рТ7-ЕСЕР в плазмиду р-1КЕ82-ЕСЕР посредством ХтаЕЫоП. Клетки, экспрессирующие ЕСЕР, фракционировали с помощью ЕАС8 и выращивали в ограничивающем разведении для получения единичных клеточных колоний. Единичные колонии, экспрессирующие Т7 РНК-полимеразу, тестировали на стабильность, выращивали до наибольшего объема культуры и сохраняли.

Пример 7. Способ получения рекомбинантного вирусного изолята ДС-К.8У X.

Нер-2 клетки культивировали в ИМЕМ+10% ЕС8 (бычья эмбриональная сыворотка)+пенициллин/стрептомицин/глутамин, тогда как клетки Уего и их производные культивировали в М199+5% РСЗ+реп/81гер/д1и. Клетки выращивали в течение ночи до 80% слияния в 10 мм² чашках при 37°С. Для Уего и Нер-2 клеток клетки заражали модифицированным вирусом Апкага-Т7 (МУА-Т7) (8ийег, 1992; \Ууай. 1995) или Го\\'1рох-Т7 вирусом (Впйои, 1996) с МО1=3 (множественность инфекции 3) и инкубировали при 32°С 60 мин перед трансфекцией, давая возможность экспрессии Т7 полимеразы бактериофага. Клетки (Нер-2, Уего или Уего-Т7) отмывали в среде Орйтет (Орйтет 1 с глютамаксом, 1иуйгодеи) и затем трансфицировали вспомогательными плазмидами, кодирующими гены Ν, Р, Ь и М2.1 К.8У и плазмидой рКЗУХДС, используя липофектамин 2000 (1иуйгодеи) в Орйтет (общий объем 500 мкл). Были добавлены следующие количества плазмид: 1,6 мкг рКЗУХДС, 1,6 мкг пкДНК6-А2-Н 1,2 мкг пкДНК3-Р, 0,4 мкг пкДНК6-А2-Ь, 0,8 мкг пкДНК6-А2-М2.1. Через 3-4 ч инкубации при 32°С добавили 500 мкл среды Орйтет с 2% ЕС8 и инкубировали клетки 3 дня при 32°С. Затем клетки соскребали и смесь снятых клеток и среды, содержащей высвобожденный вирус, использовали для заражения свежих культур Уего или Нер-2 клеток, выращенных в ИМЕМ+2% ЕС8+реп/5йер/д1и. Последнюю процедуру повторяли 4-5 раз для получения матричного вируса в высоком титре.

Идентификацию изолята ДС-К.8У X подтвердили с помощью ОТ-ПЦР на РНК, выделенной из изолята ДС-К.8У X, заразившего Уего клетки, и расщепления полученных продуктов уникальными рестриктазами, у которых участки узнавания были включены в рКБУХДС (фиг. 2). Изолят К8У X использовали в качестве контроля.

Для идентификации маркеров последовательности в К8У клетки Уего инфицировали изолятом К8У X или изолятом ДС-К.8У X с МО1=0,1. Через 72 ч после заражения из культуральной надосадочной жидкости выделяли РНК и использовали как матрицу для ОТ-ПЦР. Праймеры конструировали так, чтобы они фланкировали вставленные маркеры последовательности в вирусе рекомбинантного изолята ДСК.8У X. Полученные после ОТ-ПЦР продукты расщепляли соответствующими рестриктазами. Были получены следующие продукты рестрикции (фиг. 3):

a) ПЦР с праймером К8У065 (СТССАТТСТТССАТТТААТС) и К8У093 (СААСАТААСАСТСТАСААТАСТСТС) и рестрикция М1и-1 давали ожидаемые фрагменты 937 п.н. для изолята К8У X и 459 и 478 п.н. для изолята ДС-К.8У X;

b) ПЦР с праймерами К8У105 (СТТССАТТСАСАСАСАСТТ) и К8У113 (АСТАТТАСССААТССТСС) с последующим расщеплением Хта-Ι давала ожидаемые фрагменты 880 п.н. для изолята К8У X и 656 и 224 п.н. для изолята ДС-К.8У X;

c) ПЦР с праймерами К8У112 (СССАСТСААТТТАТСАТТАС) и К8У160 (ААТТССАТССАТССА

- 9 011878

САСААСССАСААТСА) и рестрикция 8ехА-1 давали ожидаемые фрагменты 694 п.н. для изолята К8У X и 492 и 202 п.н. для изолята А6-К.8У X;

б) ПЦР с праймерами К8У098 (ТССТАСТТСТСТТСТСССТСС) и К8У114 (АТССССААСТСАТТСТТСА) с последующим расщеплением 8паБ-1 давала ожидаемые фрагменты 1820 п.н. для изолята К.8У X и 507 и 387 п.н. для изолята АС-К8У X.

Ростовые характеристики изолята АС-И8У X в сравнении с изолятом К8У X определяли на клетках Уего и Нер-2 (фиг. 4).

Таблица 1 Праймеры, использованные для диагностической ОТ-ПЦР на РНК из К.8У, инфицировавшего клетки Уего

Название праймера	Последовательность
КЗУ065	6ТССАТТСТТССАТТТААТС
КЗУ093	СААСАТААСА6ТСТАСААТАСТ6ТС
Р5У098	ТССТАСТТСТСТТСТСССТСС
КЗУ105	СТТССАТТСАСАСАСАСТТ
К5У112	СССАСТСААТТТАТСАТТАС
Й5У113	АСТАТТАСССААТССТСС
КЗУ114	АТ С С С СААСТСАТТ6ТТСА
НЗУ160	ААТТССАТССАТССАСАСААСССАСААТСА

Пример 8. Способ получения рекомбинантного вирусного изолята АС+С-И8У X.

Вирусный изолят АС-И8У X, полученный из трансфицированных клеток Уего, пересаживали несколько раз для получения титров не менее 10⁵ КОЕ/мл (колониеобразующие единицы на мл). Затем различные то1 этого вируса использовали для заражения Уего клеток, продуцирующих И8У-С белок. Полученный изолят АС+С-И8У X собирали со среды и/или из клеток и анализировали на наличие белка С в вирионах с помощью иммунодетектирующих технологий.

Титры заражения определяли на клетках Уего или Нер-2 и чистоту АС генома определяли, используя ОТ-ПЦР на вирусной РНК, экстрагированной из клеток, зараженных вирусом изолята АС+С-И8У X. Вирус хранили при -135°С в 25 или 40% сахарозе.

Пример 9. Способ защиты в модели на хлопковых крысах против К8У-инфекции и К8У-индуцированной патологии с помощью иммунизации изолятом АС-К8У X.

Протекционные эксперименты были выполнены на хлопковых крысах (8щтобоп Ы8р1би8, в возрасте 5-6 недель, 4-6 животных обоего пола на группу). В предварительных экспериментах было показано, что это животное является чувствительным к К8У-инфекции и дает тяжелую вакцин-опосредованную легочную патологию, как описано Рппсе, 2001, что очень похоже на ситуацию с человеком. После интраназальной аппликации К8У легочная патология характеризовалась наличием воспалительного инфильтрата внутри и вокруг бронхов/бронхиол и гиперплазией эпителия. Более тяжелую патологию увидели при внутримышечной иммунизации формалин-инактивированным К8У-А2 с последующим интраназальным введением К8У-А2. В дополнение к вышеупомянутой патологии наблюдались периваскулярный и перибронхиолярный инфильтрат и альвеолит, характеризующие иммунно-опосредованную патологию. Эти наблюдения использовали как внутренний контроль для всей иммунизации и экспериментов с загрузкой антигеном. Заражение и иммунизацию хлопковых крыс К8У-вакцинами осуществляли интраназально в обе ноздри. Патологию в легких хлопковых крыс определяли с помощью световой микроскопии и титры вируса определяли за различные отрезки времени после загрузки антигеном или после заражения/иммунизации на клетках Уего, используя серийные разведения легочных гомогенатов, К8Успецифической ЕЫ8А для получения ССГО5₀ титров и иммуноокрашиванием с применением К8У-специфических антител для получения КОЕ-титров. После двукратной иммунизации изолятом АС-И8У X хлопковые крысы были полностью защищены против инфекции и патологии в легких, обусловленных изолятом К8У X. Результаты нескольких экспериментов суммированы в табл. 2.

- 10 011878

Таблица 2

			Заражение:		ν-	Легочная	Легкое С³
			Изолят ΔΟκεν х Κ5ν-Α2 изолят κεν х	5 5 5	100 100 100	патология на 5 день после заражения Есть, умеренная Есть, сильная Есть, сильная	Ниже уровня детекции 25 45
Сутки иммунизации 0 и 21	Е¹	V²	Сутки введения 42	Е¹	V²	Легочная патология на 5 сутки после введения	Легкое Е³
2х изолят Δ6~Η5ν X	5	100	изолят κεν х	5	100	Нет	Детекция ниже
Имитация		100	Изолят κεν X	5	100	Есть, сильная	5

'Логарифм титра вируса КОЕ/мл.

²Объем в мкл на животное, по половине этого объема в каждую ноздрю. ³Логарифм титра вируса на грамм легкого, предел детекции 10² СС1Б₅₀.

Ссылки

А1\сап \ν.Η.. Кесогб Е.М., Орепкка\у Р.1. Ркепо!урю апб Гипс!юпа1 скагас!епка!юп οί Т се11 киек крееШе ίοτ шбМбиа1 гекр1га1огу куисуба1 упик рго!етк. 1. 1ттиио1. 1993, 150 (12): 5211-8.

Е.М. АикиЬе1, К. Вгеи!, КЕ. Ктдк!ои, Ό.Ό. Мооге, 1.6. 8е1бтап, ТА. 8тбк, К. 8ΐπ.ι1ι1. Сиггеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1окп \νίΚν апб 8оик, Ыете Уогк, 1997.

ВетЬпбде 6.Р., Кобпдпех Ν., 6агаа-Веа!о К., Ксокои С., Ме1его 1.А., Тау1ог 6. ΌΝΑ еисобтд !ке абасктеи! (6) ог Гикюи (Е) рго!ет оГ гекриа!огу купсука1 упик тбисек рго!ес!юп ш !ке аЬкепсе оГ ри1тоиагу тВаттабои. 1. 6еи Упо1. 2000, 81 (Р! 10): 2519-23.

Вп!!оп Р., 6гееи Р., Кокет 8., Ма\\бШ К.Ь., Репхек Ζ., Сауападк Ό., 8к1ииег М.А. Ехртеккюи оГ Ьас!епоркаде Т7 КNΑ ро1утегаке т ау1ап апб таттакап се11к Ьу а гесотЬтаи! Го\\1рох У1гик. 1. 6еи Упо1. 1996, 77 (Р1 5): 963-7.

Вис111ю1х И.1., 6гапхо\у Н., 8ски1б! К., νΐιίΗ^^ 8.8., Мигрку В.К., СоШпк Р.Ь. СШтепс Ьоуте гекриа!огу куисуба1 упик \\бк д1усорго!ет деие киЬкШиОопк Ггот китап гекриа!огу куисуба1 У1гик (НК8У): еГГес1к ои кок! гаиде аиб еуаШаОоп ак а куе-а!!еппа!еб НК8У уассте. 1. Упо1. 2000, 74 (3): 1187-99.

Сапе Р.А., Ма!!ке\ук Б.А., Рпид1е С.К. 1беи1Шсабои оГ уалаЫе ботатк оГ !ке а!!асктеп! (6) рго!ет оГ киЬдгоир А гекрпа!огу куисуба1 у1гикек. 1. 6еи У1го1. 1991, 72 (Р! 9): 2091-6.

СоШпк Р.Ь., Ршсе11 К.Н., Ьоибои ν.Τ., Еамтепсе Ь.А., Скапоск К.М., Мигрку В.К. ЕтаШакоп т сШтрапхеек оГ уасаша упик гесотЬтапк !ка! ехргекк !ке кигГасе д1усорго!етк оГ китап гекрпа!огу купсу!1а1 уник. Уассте. 1990, 8 (2): 164-8.

Сго\уе 1.Е. 1г. 1ттиие гекропкек оГ шГап!к !о шГесбои \\бк гекриа!огу упикек апб куе а!!епиа!еб гекриа!огу уник сапб1ба!е уассшек. Уассте. 1998, 16 (14-15): 1423-32. Кеу1ете.

6опха1ех 1.М., Каггои К.А., Е1ске1Ьетдет М., ’№а1кк Е.Е., Бе1адагха ν.ν., Веиией К., Скапоск К.М., Мигрку В.К., С1етеп!к-Мапп М.Ь., Еа1кеу А.К. ЕуаШаОоп оГ !ке куе а!!епиа!еб ср!к 248/404 К8У уассте ш сотЫиабои \\бк а киЬиик К8У уассте (РЕР-2) т кеакку уоиид аиб о1бег абикк. Уассте. 2000, 18 (17): 1763-72.

бгееиоидк А., Ткотак М. Кекрпа!огу куисуба1 упик ртеуеибои: рак! апб ргекеп! к!га!ед1ек. Ехрег! Орш. Ркагтасо!кег. 2000, 1 (6): 1195-201.

Ли Н., Скеид X., Тгата-Ботде У.Ь., Рагк Н.1., ΖΙμι.! Н., 8о1ке К., КетЬ1е 6. ЕтаШаОоп оГ гесотШпап! гекрпа!огу куисуба1 упик деие бе1е!юп ти!ап!к т АГпсап дгееи тоикеук Гог !кеи ро!епба1 ак куе а!!епиа!еб уассте сапб|ба!ек. Уассте. 2003, 21 (25-26): 3647-52.

Каггои К.А., Виоиадипо Б.А., 6еогдш А.Е., Vк^!екеаб 8.8., Абатик 1.Е., С1етеп!к-Мапп М.Ь., Натк Б.О., Каибо1рк У.В., ибет 8.А., Мигрку В.К., 81бки М.8. Кекрпа!огу куисуба1 у1гик (К8У) 8Н апб 6 рго!етк аге ио! еккепба1 Гог упа1 терксабои ш убто: с11шса1 еуаШаОоп апб то1еси1аг скагас!епка!юп оГ а со1б-раккадеб, а!!епиа!еб К8У киЬдгоир В ти!ап1. Ргос. №11. Асаб. 8сГ И8А. 1997, 94 (25): 13961-6.

К1т Н.\\^;., Сапско1а 1.6., Вгапб! С.Б., Ру1ек 6., Скапоск К.М., 1еикеи К., Раггоб К.Н. Кекриакту

- 11 011878 купсуНа1 уш.1к б1кеаке ίη Н1Гап(к бекрйе рпог аб1штк(га(юп оГ апйдешс шасНуа!еб уассше. Ат. ί. Ер1бетю1. 1969, 89 (4): 422-34.

Ь1 X., 8атЬНага 8., Ь1 С.Х., ЕуакукНуп М., Ратпд!оп М., Са!епш 1., 1атек О., Са!ек С., Ии В.Р., К1еш М. Рго1ес11он адатк! гекрпаЮгу купсуНа1 У1гик шГесНоп Ьу ΌΝΑ йттиш/айот ί. Ехр. Меб. 1998, 188 (4): 681-8.

ЬоПапб 1.Н., О'Соппог 1.Р., СНа((ег(оп М.Ь., Мохеу Ε.Ό., Раббоск Ь.Е., №1кН Ό.Β., Эека! 8.А. РаИей/итаЬ Гог гекриа!огу купсу!1а1 уиик ргорку1ах1к ίη ЫдН-пкк тГап(к: а сок(-еГГес(1уепекк апа1ук1к. С1ш. ТНег. 2000, 22 (11): 1357-69.

МиГкоп М.А., Ве1кНе Β.Β., Огуе11 С., №ггЬу Е. Векриа!огу купсуНа1 νίπΐδ ер1беткк: уаг1аЬ1е боттапсе оГ киЬдгоирк А апб В к!гатк атопд сЬИбгеп, 1981-1986. 1. 1пГес!. И1к. 1988, 157 (1): 143-8.

Nеитаηη С., ΧνΐιίΙΙ М.А., Кауаока Υ. А бесабе айег (Не депегаНоп оГ а педаНуе-кепке ΒΝΑ уиик Ггот с1опеб с^NΑ - уНа( Науе уе 1еатеб? ί. Сеη У1го1. 2002, 83 (Р( 11): 2635-62. Веу1еу.

ОрепкНау Р.к, Иеап С.8., Си11еу Р.1. Ьшкк Ье(уееп гекриа!огу купсу!га1 У1гик ЬгопсНю1Шк апб сННбНооб ак(Нта: сНшсД апб гекеагсН арргоасНек. Реб1а!г. 1пГес(. Э|к. 1. 2003, 22 (2 8ирр1): 858-64; бисиккюп 864-5. Веу1еу.

РееЬ1ек В.8. 1г., НакЫто1о К., СгаНат Β.8. ТНе сотр1ех ге1а(юпкН|р Ье(уееп гекриа!огу купсу!1а1 уиик апб а11егду ίη 1ипд бйкеаке. У1га1. Iттиηο1. 2003; 16 (1): 25-34. Веу1еу.

Р1о(шску Н., 81едг1к! С.А., АиЬгу 1.Р., ВотеГоу Ι.Υ., Согуайа Ν., Nдиуеπ Τ.Ν., Роуег и.Р. ЕпНапсеб ри1топагу пптипора(Но1о8у Го11оутд ηеοηаίа1 ргпшпд уНН Гогта1ш-шас1гуа1еб гекрйа(огу купсуНа1 У1гик Ьи! по! уНН (Не ΒΒС2NΑ уассше сапб1ба!е. Уассше. 2003, 21 (19-20): 2651-60.

Роуег и.Р., Р1о(шску-СПс.|тп Н., Никк Т., ВоЬег! А., Тгибе1 М., 8(аН1 8., иН1еп М., Nдиуеπ Τ.Ν., Βίηζ Н. 1пбисНоп оГ рго(ес(|уе пппшпНу ίη гобеп!к Ьу уасс1па!1оп \уНН а ргокагуоНсаЛу ехргеккеб гесотЬтап! Гикюп рго!еш соп(аттд а гекр1га!огу купсуНД У1гик С рго!еш Ггадтеп!. Уйо1оду. 1997, 230 (2): 155-66.

Ргтсе С.А., СигНк 8.1, Υίιιι К.С., Рог!ег Ό.Ό. Уассте-епНапсеб гекр1га!огу купсуНД У1гик б1кеаке ίη со((оп га!к Го11оушд шипшЮаНоп уНН Ьо! 100 ог а пеу1у ргерагеб геГегепсе уассше. 1. Сеп У1го1. 2001, 82: 2881-8.

ВоЬткоп В.Р., №1На(а М.С. Векр1га!огу купсуНД У1гик (В8У) тшшпе д1оЬг.1Нп апб ра1^ν^ζитаЬ Гог ргеуепНоп оГ В8У 1пГес!1оп. Ат. 1. Неа1(Н 8ук!. РНагт. 2000, 57 (3): 259-64. Веу1еу. Егга(ит ίη: Ат. 1. Неа1(Н 8ук!. РНагт. 2000 Арг 1; 57 (7): 699.

8атЬгоок 1., ЕгйксН Е.Р., МатаНк Т. Мо1еси1аг С1отпд. А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пб еб. Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989.

8сНш16! и., Βеуе^ 1., Ро1к!ег и., СегкНут Ь.1., Βη^ι^Η И.1. Мисока1 шипш^аНоп уНН 1ше гесотЬтап! Ьоуше гекр1га!огу купсу!1а1 У1гик (ΒΒ8Ύ) апб гесотЬтап! ΒΒ8Υ 1аск1пд (Не епуе1оре д1усорго!еш С рго!ес!к адДпк! сНа11епде уНН у|1б-(уре ΒΒ8Υ. 1. У1го1. 2002, 76 (23): 12355-9.

81едпк! С.А., Р1о(Дску-СПс.|шп Н., Согбоуа М., Βетеу М., ΒοηηеΓοу Ι.Υ., Nдиуеπ ΈΝ., ЕатЬег! Р.Н., Роуег и.Р. Рго(ес(|уе еГДсасу адДпк! гекрпа!огу купсу!1а1 упик Го11оутд типпе пеопа!а1 ^шшиη^ζа!^οп уНН ΒΒС2Nа уассше: шПиепсе оГ аб)пуап(к апб та(егпа1 ап!1Ьоб1ек. 1. 1пГес!. И1к. 1999, 179 (6): 1326-33.

8реНпег Ό., ИпШеп В., Ьесосд ЕР. Сопк(гис(юп оГ Гоу1рох упик уес!огк уНН т!егдешс ткегНопк: ехргеккюп оГ (Не Ье!а-да1ас!ок1баке депе апб (Не теак1ек упик Гикюп депе. 1. У1го1. 1990, 64 (2): 527-33.

8пк1а(кНасНогп А., Βπιαα^ Т.1. УНпк-креаПс СЭ8+ Т 1утрНосу(ек боупгеди1а(е Т Не1рег се11 !уре 2 су!окше кесгеНоп апб рДтопагу еокшорЫНа бигшд ехрептеп(а1 типпе гекр1га!огу купсу!1а1 упик шГес!юп.

1. Ехр. Меб. 1997а, 186 (3): 421-32.

8пк1а!кНасНот А., ΒπιααΕ Т.1. Упик-кресгПс тетогу апб еГГес!ог Т 1утрНосу(ек ехДЬН бЛГегеп! су!окше гекропкек !о апНдепк бигшд ехрептеп(а1 типпе гекр1га!огу купсу!1а1 У1гик шГесНоп. 1. У1го1. 1997Ь, 71 (1): 678-85.

8и!!ег С., Мокк Β. №пгер11са(тд уасаша уес!ог еГПаеп(1у ехргеккек гесотЬтап! депек. Ргос. Να!1. Асаб. 8с1. И8А. 1992, 89 (22): 10847-51.

Уап Сепшр Н.С., уап Вцп Р.А., V^б^ο^οа!шοб^ο М.К, Моогтапп Р.1. Весоуегу оГ тГес(юик с1аккюа1 куше Геуег У1гик (С8РУ) Ггош Ги11-1епд!Н депотю сЭНА с1опек Ьу а к\уте к1бпеу се11 11пе ехргеккшд Ьас(епорНаде Т7 ВNΑ ро1утегаке. 1. У1го1. МеШобк. 1999, 78 (1-2): 117-28.

Vуа!! Ь.8., Мокк Β., ВοζепЬ1а!! 8. ВерНсаЕоп-бейаеп! уасаша У1гик епсобшд Ьас!егшрНаде Т7 ВNΑ ро1утегаке Гог (гапкгеп! депе ехргеккюп ίη шашша1^ап се11к. Угго1оду. 1995, 210 (1): 202-5.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вирион пневмовируса, включающий в себя вирусный геном, который имеет мутацию в гене, кодирующем белок прикрепления С или белок слияния Р, или мутацию в обоих генах, причем указанные белки необходимы для инфекционности пневмовируса, причем мутация включает делецию последовательности, кодирующей указанный белок, или инактивацию указанного гена или такова, что указанный кодируемый белок является биологически неактивным, и вирион включает в себя указанный нативный белок в форме и в количестве, требуемых для инфекционности вириона.
2. Вирион по п.1, где пневмовирус представляет собой респираторно-синцитиальный вирус.
3. Вирион по п.1 или 2, в котором ген кодирует белок прикрепления С.
4. Вирион по любому из пп.1-3, в котором мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый

- 12 011878 только из вирусного генома, не имеет белка.
5. Вирион по п.1, в котором мутация включает в себя делецию последовательности, кодирующей белок.
6. Способ продуцирования пневмовирусного вириона, как он определен в любом из пп.1-5, где способ включает в себя стадии:

(a) инфицирования культуры первой клетки-хозяина пневмовирусом, содержащим вирусный геном, имеющий мутацию, как она идентифицирована в любом из пп.1-5, причем клетка-хозяин включает в себя экспрессирующий вектор, который направляет в клетке-хозяине экспрессию указанного нативного белка, как он определен в любом из пп.1-5; и (b) получения вирионов из инфицированной культуры клеток-хозяев.
7. Способ по п.6, в котором продуцируется пневмовирус, применяемый для инфицирования культуры первой клетки-хозяина, где способ включает в себя стадии:

(a) предоставления второй клетке-хозяину одного или нескольких экспрессирующих векторов, которые направляют в клетке-хозяине экспрессию:

ί) вирусной геномной РНК, имеющей мутацию в гене, кодирующем белок, необходимый для инфекционности (ш у1уо) пневмовируса, причем мутация приводит к тому, что вирус, продуцируемый только из вирусного генома, не имеет инфекционности, где мутация и белок являются теми, что определены в любом из пп.1-5;

ίί) пневмовирусного полимеразного ферментного комплекса и, необязательно, одного или нескольких дополнительных вирусных белков; и (b) культивирования второй клетки-хозяина, за счет чего продуцируются вирионы.
8. Способ по п.7, который дополнительно включает в себя амплификацию вирионов, продуцируемых второй клеткой-хозяином, путем одной или нескольких стадий дальнейшего инфицирования клеток, с использованием клеток-хозяев, которые являются такими же, что и вторая клетка-хозяин, или отличны от нее.
9. Способ по п.7 или 8, в котором вирусная геномная РНК транскрибируется с копии вирусной ДНК, которая находится под контролем промотора ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага, и при этом предоставляется клетка-хозяин с экспрессирующим вектором, который направляет экспрессию ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага в клетке-хозяине.
10. Способ по п.9, в котором ДНК-зависимая РНК-полимераза бактериофага представляет собой полимеразу Т7, Т3 или 8Р6.
11. Способ по любому из пп.7-10, в котором ферментный комплекс пневмовирусной полимеразы, по меньшей мере, включает в себя белки Ь, Р, Ν.
12. Способ по пп.7-11, в котором один или несколько дополнительных вирусных белков являются мембранным белком матрикса пневмовируса, предпочтительно белком М2-1.
13. Способ по любому из пп.6-12, в котором пневмовирус является респираторно-синцитиальным вирусом.
14. Способ по любому из пп.6-13, в котором ген, кодирующий белок, необходимый для инфекционности, представляет собой ген, кодирующий белок прикрепления С.
15. Композиция, содержащая эффективное количество вириона по любому из пп.1-5 или вирион, который можно получить способом по любому из пп.6-14, и фармацевтически приемлемый носитель, такой как вода или буферный солевой раствор, в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения пневмовирусной инфекции.
16. Применение вириона по любому из пп.1-5 для производства лекарственного средства для профилактики или лечения пневмовирусной инфекции.
17. Применение по п.16, в котором лекарственное средство представляет собой препарат для интраназального введения.
18. Способ профилактики или лечения пневмовирусной инфекции, предусматривающий стадию введения субъекту композиции, содержащей вирион по любому из пп.1-5 в количестве, эффективном для профилактики или лечения инфекции.
19. Способ по п.18, в котором композицию вводят интраназально.