ES2670713T3 - Virus sincitial respiratorio con una deficiencia genómica complementada en trans - Google Patents

Abstract

Uso de un virión de un virus sincitial respiratorio humano para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por virus sincitial respiratorio humano, en el que el virión comprende un genoma vírico que comprende una mutación que causa que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca únicamente de la proteína de unión G.

Description

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DESCRIPCION

Virus sincitial respiratorio con una deficiencia genómica complementada en trans Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere al campo de la vacunación, y más específicamente a vacunas contra enfermedades causadas por pneumovirus tales como p. ej., el virus sincitial respiratorio (VSR). La invención se refiere a VSR en el que el virión comprende un genoma vírico que comprende una mutación que provoca que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca de la proteína de unión G. La invención se refiere además al uso de tales viriones VSR en vacunas y a métodos para la vacunación contra VSR humano.

Antecedentes de la invención

[0002] El virus sincitial respiratorio humano se clasifica en el género pneumovirus, familia paramixovirus. Es una causa importante de enfermedad grave del tracto respiratorio inferior en bebés, ancianos y personas inmunocomprometidas. También es un factor importante en la enfermedad del tracto respiratorio superior en niños mayores y adultos. Actualmente no existe una vacuna de VSR-h eficaz disponible en la técnica.

[0003] El VSR es un virus de ARN con envoltura que expresa dos antígenos principales en su superficie: la proteína de unión G y la proteína de fusión F. Ambas proteínas parecen invocar anticuerpos protectores. La G es la determinante de los dos subgrupos conocidos de VSR-h A y B. Se pueden encontrar diferencias antigénicas dentro de los dos grupos. La proteína G muestra un alto grado de variación con solo un 53 % de homología de aminoácidos entre los grupos A y B y hasta un 20 % de diferencias en las secuencias de proteína G dentro del grupo A (Mufson 1988, Cane 1991).

[0004] La inmunización pasiva mediante inmunoglobulina enriquecida con VSR (Respigam) o anticuerpos monoclonales humanizados sintéticos contra F (Palivizumab) se usa actualmente para tratar y proteger a los neonatos de ciertas predisposiciones (por ejemplo, nacimiento prematuro) contra la infección por VSR (Robinson 2000, Greenough 2000). La patología del VSR tiene dos aspectos principales: el daño celular causado por el virus en sí y el daño tisular causado por la exagerada reacción del sistema inmunológico. Este último es un factor de gran complicación en el diseño de la vacuna.

[0005] Las infecciones por VSR son estacionales, limitadas al período invernal y con un máximo en el hemisferio norte hacia el final del año. El VSR infecta a todos los niños antes de los dos años, en muchos casos dos veces. Las personas mayores en promedio se infectan cada dos años, dependiendo del entorno; las personas en contacto cercano con bebés y niños pequeños tienen un 50 % de riesgo. El virus se propaga por contacto cercano, en gotitas o a través de superficies contaminadas. El VSR no se propaga de manera eficiente a través de aerosoles; las partículas víricas son relativamente inestables. La diseminación interna del virus desde el tracto respiratorio superior (TRS) hasta el tracto respiratorio inferior (TRI) ocurre predominantemente por la inhalación de partículas víricas producidas en el epitelio del TRS durante la infección primaria. La propagación a través de la formación de sincitio (una de las propiedades patológicas del virus, que le dio su nombre) no puede descartarse y puede jugar un papel secundario en la infección del TRI.

[0006] En general, la patología del VSR comienza en el TRS; la puerta de entrada es la nariz y en menor medida los ojos, no la boca. Cuando se restringe a los tejidos del TRS, la enfermedad se limita al resfriado común, aunque en adultos a veces es grave. Sin embargo, cuando el virus puede alcanzar el TRI, se puede producir bronquiolitis y neumonía en personas desprotegidas. En niños pequeños, esto puede ser mortal, aprox. 1/100 requerirá hospitalización y ventilación mecánica, de estos 1 % puede morir. En los ancianos, la enfermedad del TRI inducida por el VSR es una causa importante de hospitalización; se sospecha que el VSR causa el 25 % de las enfermedades similares a la gripe.

[0007] La respuesta inmunológica al VSR es compleja. En general, la exposición al VSR-h generará una respuesta que protege contra la enfermedad del TRI. Esta respuesta disminuye con la edad avanzada, lo que provoca una mayor susceptibilidad al VSR de la población de mayor edad. La protección efectiva y duradera contra la enfermedad del TRS no parece ser factible: la reinfección es muy común, incluso dentro de la misma temporada, y no es causada por la variación vírica. La protección contra la infección por VSR implica anticuerpos contra las proteínas víricas F y G que circulan en la sangre, lo que puede evitar la enfermedad de TRI. La infección del TRS puede controlarse con anticuerpos de la mucosa contra F y G, pero tienen una vida útil limitada. Se necesitan células T CD8 + contra proteínas víricas aún no identificadas para eliminar el virus de los tejidos infectados, pero parecen ser de corta duración o estar reclutadas de forma ineficaz de sus reservorios. Lo más probable es que esto esté causado por factores expresados por el VSR, posiblemente codificados en el gen G (Srikiatkhachorn, 1997a).

[0008] Un aspecto importante de la enfermedad por el VSR es la mejora inmunológica de la patología. En casos limitados, la respuesta inmunológica celular puede exacerbar la enfermedad por VSR por la acción de las

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citoquinas en los tejidos infectados liberadas de granulocitos atraídos en exceso. La predisposición del huésped está involucrada en esta reacción, pero posiblemente también en el momento de la primera infección por VSR después del nacimiento. Desafortunadamente, los primeros ensayos de vacunas con VSR inactivado con formalina mostraron que en estos contextos de vacunación predominaba la patología inmunológica mejorada sobre la infección del sexo (Kim 1969). Los factores contenidos en VSR parecen ser responsables de este fenómeno y aparentemente fueron liberados por el tratamiento con formalina. En los 40 años transcurridos desde entonces, se demostró gradualmente que la proteína G vírica es el mediador predominante de estos problemas, pero el mecanismo sigue sin estar claro (Srikiatkhachorn 1997b). En cualquier caso, la vacunación con una proteína G fuera del contexto del virión (es decir, en preparados de virus inactivados, como producto de expresión no embebido adecuadamente en una membrana o en forma de péptidos) parece estar causando una mejora inmunológica en sistemas modelo. Por lo tanto, aunque G contribuye en cierta medida a la inmunidad contra el VSR, sus propiedades también complican el diseño de la vacuna.

[0009] Los candidatos iniciales a la vacuna VSR in vivo incluyeron mutantes con pases en frío o sensibles a la temperatura. Los primeros se han atenuado cultivando a temperatura decreciente, lo que conduce a la dependencia de bajas temperaturas para el crecimiento, mientras que los últimos mutantes se han hecho dependientes de una temperatura específica, normalmente más alta para la replicación por mutagénesis química o por mutagénesis por radiación. Estos candidatos a vacunas de virus vivos parecían estar, o bien poco atenuados, o bien excesivamente atenuados (Crowe 1998).

[0010] Los candidatos a vacunas de subunidades se derivan de la proteína F o de la proteína G de VSR, que son los principales objetivos para neutralizar anticuerpos. Una candidata a vacuna de subunidad, PFP2, proteína F purificada, es segura en pacientes de VSR seropositivos, pero no proporcionó protección completa contra la infección del TRI y la enfermedad asociada (González 2000). Otro enfoque de vacuna de subunidad es BBG2Na, que consiste en un polipéptido que comprende los aminoácidos 130-230 de VSR-h-G, fusionado al dominio de unión a albúmina de la proteína G estreptocócica (Power 1997). BBG2Na induce una respuesta T colaboradora tipo 2 en ratones recién nacidos, y no provoca inmunopatología pulmonar (Siegrist 1999). No hay datos todavía sobre protección. El uso de nuevos adyuvantes para una respuesta inmunológica humoral y celular equilibrada se está investigando actualmente en modelos animales (Plotnicky 2003).

[0011] El uso de vectores de ADN plasmídico que codifican antígenos VSR-F y G como candidatos a vacunas se ha estudiado en modelos animales. Estas vacunas inducen respuestas protectoras en roedores (Li 2000), pero en un estudio los ratones inmunizados con un candidato a vacuna de ADN de VSR-F desarrollaron una respuesta inflamatoria pulmonar ligeramente mejorada tras la exposición al virus de tipo salvaje (Bembridge 2000). Todavía no se conoce la viabilidad del uso de las vacunas de ADN plasmídico en humanos y es probable que pasen al menos 15 años antes de que este enfoque sea suficientemente estudiado y, lo que es más importante, aceptado, en particular para los recién nacidos. Las vacunas candidatas basadas en sistemas de entrega de vectores se construyen a partir de vectores recombinantes vivos que expresan proteínas VSR. Por ejemplo, el virus vaccinia recombinante que expresa VSR-F y G proporcionó protección en ratones, pero careció de este efecto en chimpancés (Collins 1990). La pregunta es si estos sistemas son seguros (especialmente el virus vaccinia) y factibles a la luz de los anticuerpos (maternos) existentes contra los poxvirus en la comunidad y siendo el principal grupo objetivo los recién nacidos.

[0012] Varios candidatos a vacunas se basan en VSR vivo recombinante, generado por genética inversa. Una línea de estudio se centra en atenuar estos virus mediante la introducción de las mutaciones individuales o combinadas responsables de la adaptación al frío y la sensibilidad a la temperatura en el virus recombinante. Ninguno de estos candidatos a vacuna se pudo utilizar, ya sea por atenuación excesiva o muy baja. Otra línea de estudio se centra en la deleción de uno o más genes víricos no estructurales. Se dispone de datos limitados sobre el comportamiento de estos virus en los sistemas modelo (Jin 2003).

[0013] Un enfoque alternativo al desarrollo de la vacuna contra el VSR es el uso del VSR bovino. Se evaluó la eficacia de un VSR bovino quimérico solo con la proteína F humana o con las dos proteínas F y G humanas en chimpancés. Esta vacuna candidata se restringió en la replicación en tal grado que los animales no estaban protegidos después de la prueba de provocación de VSR-h de tipo salvaje (Buchholtz 2000). Se describen viriones de VSR humano que tienen una proteína de unión G mutada o eliminada, pero no para su uso como vacuna (Teng, 2001). Por lo tanto, actualmente no existe una vacuna de VSR-h eficaz disponible en la técnica. Todas los candidatos a vacunas para el VSR que se han probado en modelos animales son inútiles en humanos. Por lo tanto, existe desde hace mucho la necesidad de vacunas contra el VSR en la técnica que sean eficaces y seguras, y es un objetivo de la presente invención proporcionar tales vacunas.

Descripción de la invención

Definiciones

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[0014] En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo «comprender» y sus conjugaciones se utilizan en su sentido no limitante para indicar que se incluyen los elementos que siguen a la palabra, pero no se excluyen los elementos que no se mencionan específicamente. Además, la referencia a un elemento por los artículos indefinidos «un» o «una» no excluye la posibilidad de que esté presente más de un elemento, a menos que el contexto requiera claramente que exista uno y solo uno de los elementos. De este modo, los artículos indefinidos «un» o «una» significan «al menos uno».

[0015] El término «virión», tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula vírica que contiene la proteína de la nucleocápside, el genoma vírico y el complejo de replicasa en una envoltura lipídica que contiene las glicoproteínas estructurales víricas.

[0016] Los términos «infectividad de un virus», «virus infeccioso», «partícula de virus infeccioso» o «virión infeccioso» denotan virus, partículas víricas o viriones que son capaces de entrar en células huésped adecuadas e iniciar un ciclo de replicación de virus, tanto si esto lleva a la producción de un nuevo virus infeccioso como si no.

Descripción detallada de la invención

[0017] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un virión del virus sincitial respiratorio (VSR) humano . El virión comprende un genoma vírico que tiene una mutación que hace que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca de la proteína de unión G.

[0018] El VSR humano puede ser un virus del subgrupo A o del subgrupo B, y preferiblemente es un aislado clínico, más preferiblemente un aislado sin un número excesivo de pases in vitro (preferiblemente menos de 10, 8, 6 o 5 pases, como se describe en los ejemplos). Por lo tanto, cualquier cepa o aislado de VSR puede usarse en el contexto de la presente invención, por lo que se entiende que la invención solo se ejemplifica por medio del aislado particular 98-25147-X del VSR humano, denominado aislado X de VSR. Se prefiere además que el virus sea un aislado clínico reciente, donde reciente se define como aislado por primera vez hace menos de 10, 8, 6, 4, 3 o 2 años. Se entenderá que, aunque las secuencias de nucleótidos en el virión no necesitan corresponderse con las del aislado reciente, preferiblemente las secuencias de aminoácidos de las proteínas presentes en el virión de la invención son idénticas a las proteínas tal como se presentan en un aislado clínico reciente.

[0019] El genoma vírico comprende al menos una mutación que causa que el virus producido a partir del genoma vírico carezca de la proteína de unión G. En viriones preferidos de la invención, la mutación causa que el virión carezca de infectividad in vivo, es decir, en un organismo huésped adecuado, por el cual los viriones pueden ser infecciosos para células huésped adecuadas cultivadas in vitro.

[0020] En un virión preferido de la invención, el gen mutado es la proteína de unión G. La eliminación y/o la inactivación funcional del gen que codifica la proteína G sirve para varios fines y evita una serie de problemas y complicaciones de los candidatos actuales a vacuna contra el VSR. Un fin es la seguridad de la vacuna: el VSR sin proteína G está muy atenuado en su huésped (Karron 1997, Schmidt 2002) porque no podrá infectar de manera eficiente a las células del huésped. Una complicación es que la proteína G está muy implicada en la creación de respuestas inmunológicas no deseadas, incluyendo una patología inmunológica potenciada (Alwan 1993, Srikiatkhachorn 1997b) y una posible desviación del sistema inmunológico hacia un estado propenso a la alergia (y al asma) bajo ciertas predisposiciones genéticas (Openshaw 2003, Peebles 2003). Esto se evitará mediante la deleción o inactivación del gen G. Un virión del VSR humano de la invención que comprende un genoma vírico que tiene una mutación inactivadora en el gen que codifica una proteína de unión G, y que comprende la proteína de unión G en una forma y en una cantidad necesarias para la infectividad del virión se conoce como (pneumo)virus o virión «AG + G». Del mismo modo, el virión que tiene la mutación inactivante en el gen que codifica una proteína de unión G, pero que no se complementa en trans con una cantidad funcional de proteína G se denomina (pneumo)virus o virión «AG».

[0021] los viriones del VSR humano de la invención pueden así ser reconstituidos transitoria y funcionalmente con una proteína G codificada externamente. Preferiblemente la proteína G codificada externamente es del mismo subgrupo vírico (A o B) que el genoma que está presente en el virión. Más preferiblemente, la proteína G codificada externamente es homóloga al genoma que está presente en el virión, lo que significa que la proteína tiene la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos que se codificó en el genoma del virus antes de su inactivación. Alternativamente, esto puede significar que la proteína codificada externamente tiene la misma secuencia de aminoácidos que la presente en un virión de tipo salvaje cuyas secuencias de aminoácidos con una o varias proteínas internamente codificadas tienen una identidad del 100 % con su contrapartida en el virión de la invención .

[0022] En los viriones de la invención, la mutación en el gen de la proteína de unión G es una mutación que causa que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca de la proteína. Se entiende que la producción de virus solo a partir del genoma vírico significa un virus producido exclusivamente a partir del

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genoma vírico presente en los viriones y en ausencia de cualquier secuencia codificante que complemente el genoma vírico en trans. El genoma vírico presente en los viriones es por lo tanto incapaz de dirigir la expresión de la proteína de unión a G. Esto se puede lograr de varias maneras conocidas por los expertos, incluyendo, p. ej., inactivación del codón de inicio de la traducción, introducción de codones de terminación cerca del N-terminal de la proteína codificada, una o varias mutaciones de cambio de marco, deleción de uno o más fragmentos del gen. Preferiblemente, el gen se inactiva por deleción de al menos el 10, 20, 50, 75, 90 o 95 % de la secuencia que codifica la proteína estructural esencial. Sin embargo, lo más preferido es un virión en el que la mutación comprende la deleción de la secuencia (completa) que codifica la proteína.

[0023] Se incluyen explícitamente en la invención viriones en los que hay presentes más de una mutación. En particular, más de un gen codificante de proteína vírica puede comprender mutaciones que inactivan o alteran la función de la proteína en cuestión, o que hacen que la proteína carezca de los viriones como se ha descrito anteriormente. P. ej., las mutaciones de pases en frío o sensibles al calor conocidas en la técnica se pueden combinar con la inactivación de las proteínas estructurales esenciales como se describe en la invención anteriormente.

[0024] La eliminación de pneumovirus como el VSR de los organismos huésped infectados requiere una inmunidad celular adecuada, que no se montará eficazmente sin la infección de las células epiteliales por parte del virus. Sin embargo, los pneumovirus mutantes de la invención carecen de información genética de una proteína que es esencial para la infección de células huésped in vivo. Por lo tanto, la presente divulgación describe métodos para la producción de pneumovirus mutantes, que incluyen la replicación de pneumovirus mutantes en células que se complementan (en trans) la ausencia de la proteína que es esencial para la infección.

[0025] En otro aspecto, la descripción se refiere, por lo tanto, a un método para producir los viriones de pneumovirus mutantes definidos anteriormente. El método es un método para producir viriones de pneumovirus, por el que los viriones comprenden un genoma vírico que tiene una mutación en un gen que codifica la proteína de unión G que es esencial para la infectividad (in vivo) del pneumovirus, por el que la mutación provoca que un virus producido únicamente a partir del genoma vírico carezca de infectividad, y por el que el virión comprende la proteína en una forma y en una cantidad necesarias para la infectividad del virión. El método comprende los pasos de: (a) infectar un cultivo de una primera célula huésped con un pneumovirus que comprende un genoma vírico que tiene una mutación como la definida anteriormente, donde la célula huésped comprende un vector de expresión que dirige la expresión, ya sea transitoria o constitutivamente, en la célula huésped de la proteína en una forma y en una cantidad necesarias para la infectividad del virión; y, (b) recuperar los viriones del cultivo de células huésped infectadas. La recuperación de viriones del cultivo de células huésped infectadas puede incluir la recuperación desde el medio de cultivo y/o la recuperación desde las células.

[0026] La primera célula huésped puede ser cualquier célula huésped en la que el pneumovirus sea capaz de replicarse, con o sin la expresión simultánea en trans de la proteína necesaria para la infectividad del virión. Las células huésped adecuadas para este fin son, p. ej., cultivos celulares de riñón de mono verde africano (como, por ejemplo, Vero, ECACC lote 10-87, fragmento 134, 1990, aprobado por la EMA).

[0027] En un método preferido de la divulgación, el pneumovirus que se usa para infectar el cultivo de un primer cultivo de célula huésped se produce en un método que comprende las etapas de: (a) proporcionar a una segunda célula huésped uno o más vectores de expresión que dirigen la expresión en la célula huésped de: (i) un ARN genómico vírico que tiene una mutación en un gen que codifica una proteína que es esencial para la infectividad (in vivo) del pneumovirus, por el que la mutación provoca que un virus producido solo a partir del genoma vírico carezca de infectividad; y, (ii) un complejo enzimático de la polimerasa de pneumovirus y opcionalmente una o más proteínas víricas adicionales; y, (b) cultivar la segunda célula huésped mediante la cual se producen los viriones. En un método preferido, los viriones producidos por la segunda célula huésped se amplifican mediante una o más etapas de infección celular que emplean células huésped que son iguales o diferentes de la segunda célula huésped.

[0028] La segunda célula huésped puede ser cualquier célula huésped en la que el pneumovirus sea capaz de replicarse, con o sin la expresión simultánea en trans de la proteína necesaria para la infectividad del virión. Las células huésped adecuadas para este fin son, p. ej., cultivos celulares de riñón de mono verde africano (como, por ejemplo, Vero, ECACC lote 10-87, fragmento 134, 1990, aprobado por la EMA) o células Hep-2. La segunda célula huésped puede ser la misma o diferente de la primera célula anfitriona.

[0029] En los métodos de la divulgación, el ARN genómico vírico se transcribe a partir de una copia de ADN vírico que está bajo el control de un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN de bacteriófago y mediante el cual se proporciona a la (segunda) célula huésped un vector de expresión que dirige la expresión en el célula huésped de la ARN polimerasa dependiente del ADN del bacteriófago. Preferiblemente, la ARN polimerasa dependiente de ADN del bacteriófago es una polimerasa T7, T3 o SP6.

[0030] El complejo enzimático de la polimerasa de pneumovirus que se expresa a partir de uno o varios vectores

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de expresión en la segunda célula huésped incluye al menos las proteínas L, P, N expresadas a partir de sus genes o ADNc correspondientes en el vector o vectores de expresión. Para una eficacia mejorada del ensamblaje vírico y el empaquetamiento del ARN genómico vírico desnudo, opcionalmente, se expresan una o más proteínas víricas adicionales en las segundas células huésped. Las proteínas víricas preferidas para este propósito incluyen las proteínas de membrana de matriz vírica de las cuales la proteína M2-1 es particularmente preferida. Las proteínas L, P, N, M2-1, G o F se derivan preferiblemente del genoma vírico del aislado que se introduce y expresa en la célula huésped, pero, alternativamente, también se pueden usar las proteínas homólogas de otras fuentes heterólogas víricas o no víricas.

[0031] Los expertos apreciarán que una amplia variedad de vectores de expresión y secuencias reguladoras (tales como promotores) están disponibles en la técnica para la expresión del ARN genómico vírico, la ARN polimerasa dependiente de ADN, el complejo de la enzima polimerasa de pneumovirus y otras proteínas víricas opcionales, así como la proteína estructural esencial, en la primera y/o en la segunda célula huésped (ver, por ejemplo, Sambrook y Russell (2001) «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (3a edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York).

[0032] Para genética inversa de virus de ARN, es decir, la expresión de un virus de ARN recombinante tal como los viriones de la presente invención, una copia de ADNc del ARN genómico vírico se clona en plásmidos y se coloca bajo el control de secuencias que permitirán la síntesis de ARN del ADN bajo ciertas condiciones. En general, la secuencia promotora para la ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, la ARN polimerasa de T7) se coloca corriente arriba de la copia de ADN del genoma de ARN, mientras que se coloca un terminador apropiado para la ARN polimerasa corriente abajo del genoma. Las secuencias de ribozimas de autoescisión se colocan corriente arriba de las secuencias de terminación, para permitir la síntesis de ARN con los nucleótidos terminales correctos. Generalmente, se requieren secuencias terminales correctas para rescatar virus del ARN sintético. Para los virus de ARN de cadena negativa no segmentados, se requiere la coexpresión del complejo de la enzima polimerasa (proteínas N, P y L para paramixovirus) junto con el ARN genómico o antigenómico para obtener virus recombinantes (revisado por Neumann 2002 y mostrado en los ejemplos de este documento).

[0033] Otros métodos preferidos pueden comprender el paso adicional de aislar y/o purificar los viriones de la invención y/o formular estos viriones en composiciones farmacéuticas. Los métodos para aislar y/o purificar viriones son bien conocidos por los virólogos expertos. Tales métodos incluyen, p. ej., diversas técnicas de centrifugación (por ejemplo, centrifugación diferencial o por densidad) o cromatográficas. Un método para formular los viriones de la invención en una composición farmacéutica comprende al menos el paso de mezclar los viriones con un vehículo farmacéuticamente aceptable como se define a continuación.

[0034] En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición que comprende un virión como se ha definido anteriormente u obtenible en un método como el definido anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición preferiblemente es una composición farmacéutica que preferiblemente es adecuada para usar como una vacuna, es decir, la composición preferiblemente es una vacuna.

[0035] En otro aspecto más, la invención proporciona una preparación farmacéutica que comprende como ingrediente activo un virión según la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También pueden incorporarse en las composiciones farmacéuticas agentes estabilizantes, agentes osmóticos, agentes tampón, agentes dispersantes y similares todos farmacéuticamente aceptables. La forma preferida depende del modo de administración deseado y la aplicación terapéutica. El excipiente farmacéutico puede ser cualquier sustancia compatible, no tóxica, adecuada para administrar las membranas víricas reconstituidas al paciente. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables para administración intranasal son agua, soluciones salinas tamponadas, glicerina, polisorbato 20, cremophor EL y una mezcla acuosa de glicérido caprílico/cáprico, y se pueden tamponar para proporcionar un entorno de pH neutro.

[0036] Para la administración por inhalación, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran convenientemente en forma de una pulverización en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, en donde los viriones están presentes en un vehículo como se ha descrito para la administración intranasal pero con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida.

[0037] Los métodos para preparar composiciones intranasales o inhalantes son bien conocidos en la técnica y se describen con más detalle en diversas fuentes, que incluyen, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (15a ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporado como referencia en su totalidad a todos los efectos). Por lo tanto, los viriones se pueden formular como el componente activo en cualquier preparado para la vacunación, que puede además incluir, p. ej., vehículos , adyuvantes, estabilizantes, solubilizantes, conservantes y otros excipientes conocidos en la técnica, para permitir o ayudar a la administración eficiente del preparado para la vacunación de individuos, preferiblemente personas, ganado o animales de granja (tales como vacas, cerdos, caballos, cabras, ovejas).

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[0038] En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para la vacunación contra una infección por VSR humano, o para su profilaxis o terapia (prevención o tratamiento), mediante la administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de (una composición farmacéutica que comprende) los viriones de la invención como se ha definido antes, u obtenible como se ha definido antes, de un sujeto que necesita profilaxis o terapia. Preferiblemente, los viriones se administran por vía intranasal.

[0039] De manera similar, la invención se refiere a viriones de la invención como se ha definido antes, u obtenibles como se ha definido antes, para usar como medicamento, preferiblemente un medicamento para vacunación contra una infección por VSR, o para su profilaxis o terapia. La invención se refiere además al uso de los viriones de la invención en la fabricación de un medicamento para vacunación contra una enfermedad o infección por VSR humano, o para su profilaxis o terapia. Preferiblemente, el medicamento es un preparado para administración intranasal.

[0040] Las composiciones que comprenden los viriones de la invención para la vacunación se administran preferiblemente por vía intranasal a huéspedes apropiados. En una realización, los terneros deben protegerse contra las infecciones por VSR-b. En otra realización más, los seres humanos, de los cuales preferiblemente los bebés y los ancianos o los individuos inmunodeprimidos, están protegidos contra las infecciones por VSR-h. Las formulaciones preferiblemente comprenden formulaciones adecuadas para la administración como gotas o pulverizaciones intranasales, preferiblemente pulverizaciones nasales. Las partículas AG + G de pneumovirus en la composición infectarán a las células epiteliales del tracto respiratorio superior solo una vez porque los viriones de segunda generación producidos a partir de las células epiteliales del TRS inicialmente infectadas carecen de la proteína de unión G para la cual la secuencia codificante se ha eliminado del genoma . Estos viriones AG son, por lo tanto, no infecciosos in vivo en organismos huésped. Sin embargo, el ciclo individual inicial de infección permite el desarrollo de una inmunidad celular adecuada (es decir, una respuesta capaz de eliminar la infección del virus de tipo salvaje) contra el pneumovirus, o el VSR en particular, mientras que los anticuerpos protectores contra F (es decir, anticuerpos que evitarán la infección del tracto respiratorio inferior) serán provocados por la vacuna y la progenie no infecciosa. Los anticuerpos anti-F son eficaces para limitar la infección por VSR, como se demuestra por la eficacia del tratamiento con Palivimuzab, que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra F. Esta es la base de la eficacia de las vacunas recombinantes de pneumovirus vivos atenuados de la invención. Estas vacunas víricas vivas resuelven una serie de problemas asociados con los candidatos actuales a vacuna contra pneumovirus. La presencia de la proteína G en su contexto natural en el virión permite el desarrollo de una inmunidad celular apropiada, mientras que se evitan los efectos no deseados de la inmunidad contra la proteína G aislada que es en gran parte responsable de la mejora inmunológica de la patología causada por VSR-b y VSR-h en ganado y humanos, respectivamente.

Descripción de las figuras

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Figura 1: Diagrama de construcción de pRSVXAG. La línea superior representa el ARN genómico del aislado X del VSR, con los genes indicados. Las siguientes casillas representan productos de RT-PCR y dúplex de oligonucleótidos utilizados para la construcción. Los números dentro de las casillas indican los números de oligonucleótidos enumerados en la tabla I. Se indican los sitios de restricción introducidos para la clonación. El esquema de clonación final se indica a continuación: los círculos son plásmidos y las flechas muestran el orden de clonación.

Figura 2. Alineamientos que muestran las diferencias entre las secuencias del aislado X del VSR y pRSVXAG del VSR. Las secuencias se muestran como alineamiento del sentido genómico. Para pRSVXAG, solo se indican nucleótidos que difieren del aislado X del VSR X. Las secuencias similares están indicadas por puntos (.) y los gaps están indicados por (-). Las señales de inicio de genes están subrayadas, las señales de parada de genes están doblemente subrayadas, y los genes están indicados en los pies de foto. Las casillas describen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción resultantes de los cambios introducidos en los nucleótidos.

Figura 3. Identificación de marcadores de secuencia en productos de amplificación por RT-PCR de VSR, se digiere: a) Mlul, b) XmaI, c) SexA-I, d) SnaB-I.

Figura 4. Curvas de crecimiento del aislado X del VSR y del aislado X del AG-VSR. Las células Vero (líneas continuas) y Hep-2 (líneas discontinuas) se infectaron con virus a MDI= 0,1 y se incubaron a 37 °C. En los momentos indicados, las células se cosecharon y se determinaron los títulos de CCID50 en las células Vero.

Tabla I. Cebadores utilizados para la clonación con RT-PCR del aislado X del VSR.

Tabla II. Cebadores utilizados para la clonación de plásmidos auxiliares y para plásmidos utilizados para la construcción de líneas celulares estables.

Tabla III. Cebadores utilizados para el diagnóstico RT-PCR de ARN de células Vero infectadas por VSR.

Tabla IV. Resultados de experimentos de inmunización con ratas algodoneras, protección contra la infección por VSR y patología inducida por VSR mediante inmunización con aislado X del AG-VSR.

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Ejemplos

[0042] La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitantes que se usan meramente para ilustrar realizaciones específicas de la invención y no deben considerarse limitantes del alcance general o de cualquier aspecto de la invención.

Ejemplo 1

Aislado vírico, aislamiento, propagación y almacenamiento del virus

[0043] La base para el clon de VSR-h recombinante es un aislado clínico de VSR, obtenido del laboratorio de diagnóstico del Centro Médico de la Universidad de Leiden. Este virus, denominado 98-25147-X, codificado según el paciente del que se aisló, se obtuvo de una prueba de diagnóstico en células Hep-2 en el período 21-24 de diciembre de 1998. Más tarde se determinó que era un aislado del subtipo A y se denominó aislado X del VSR. El virus se pasó cuatro veces en células Hep-2 en botellas T75 en DMEM (Gibco), SFB al 10 %, pen/estrep/glu y posteriormente cinco veces en células Vero en botellas T75 en DMEM ( Gibco), SFB al 10 %, pen/estrep/glu. El virus del aislado X del VSR resultante se usó como stock de trabajo y se almacenó a -135 °C en sacarosa al 25 % o al 45 %.

Ejemplo 2

Construcción del ADNc de VSR-X que codifica el genoma vírico

[0044] El ARN total se obtuvo mediante extracción de isotiocianato de fenol-guanidina (Trizol, Invitrogen) de células Vero de stock infectadas con aislado X del VSR. El ADNc se preparó mediante transcripción inversa usando la transcriptasa inversa Thermoscript (Invitrogen) y usando cebadores hexámeros aleatorios. Este ADNc se usó como plantilla para PCR usando polimerasa Taq de alta fidelidad (Invitrogen) usando cebadores específicos que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción (Tabla I y listado de secuencias). Los cebadores se diseñaron basándose en las secuencias publicadas de RSV-A2 (Genbank número de acceso M74568) y RSV-RSS2 (Genbank número de acceso U39662).

[0045] Los productos de PCR se clonaron primero individualmente en diferentes vectores: pares de cebadores, vectores, sitios de reconocimiento de enzimas de restricción y el nombre del vector resultante se enumeran a continuación. RSV021/RSV047: vector pCAP (Roche), directamente en Mlu N1, pCAP3 (región SH/M/P)

RSV018/019: vector pCAP, directamente en Mlu N1, pCAP2 (región G)

RSV016/RSV017: PUC21, Mlu I/Bam HI, pUK5 (región M2-2/M2-1/F)

RSV024/RSV025a: PUC21, Bam HI/Afl II, pUK1 (región NS2/NS1)

RSV022 / RSV023: PUC21, EcoR V, pUK4 (región N)

RSV014/RSV015: PUC21, Kpn I/Mlu I, pUK2 (región L)

[0046] Al menos dos clones individuales derivados de dos plantillas de ADNc independientes fueron secuenciados; las regiones que contienen diferencias entre los dos clones se secuenciaron en un tercer clon. Si era necesario, los clones se repararon usando técnicas estándar de biología molecular conocidas por los expertos. Se obtuvieron y secuenciaron productos de PCR adicionales que cubren los sitios de unión de los cebadores usados para la clonación. Los extremos genómicos 5' se determinaron mediante poliadenilación de ARN genómico, seguido de RT-PCR con un oligo(d)T que contiene el cebador ALG018:

TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT

y un cebador de genes NS1 RSV126:

AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT.

Este fragmento se clonó en pUC21 usando Hind III/Pst I. El extremo 3' se determinó mediante PCR de ligadura RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Todas las secuencias se ensamblaron para producir la secuencia de consenso de VSR-X (SEC ID n.° 1).

[0047] Todas las secuencias se confirmaron mediante secuenciación del ciclo de PCR usando el kit BigDye terminator (Applied Biosystems) y se analizaron mediante un analizador genético ABI Prism 310.

Ejemplo 3

Construcción del plásmido de longitud completa del aislado X de AG-VSR

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[0048] El ADNc de longitud completa que abarca todo el genoma del aislado X de VSR se ensambló mediante ligadura secuencial de fragmentos de PCR (Figura 1). El extremo «de cola» está precedido por el promotor para la polimerasa del bacteriófago T7. Para generar los extremos 3' correctos, el extremo «líder» del ADNc se fusiona con la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDVR), seguido de un terminador de la transcripción de la ARN polimerasa de T7 (véase la Figura 1).

[0049] Primero, dos conjuntos de oligómeros complementarios que codifican HDVR y el terminador de T7 RSV026/RSV027 oligo y RSV028/029 oligo se fosforilaron con ADN quinasa T4, se hibridaron y se ligaron en el clon pUK1 (que contiene los genes NS1/NS2) mediante Rsr II/Not I, dando el plásmido pUK3. Luego, el fragmento Xma I/SexA I del clon pUK4 que contiene N se ligó al plásmido pUK3 a través de Xma I/SexA I. Este plásmido (pUK6) contiene la región del gen N hasta la secuencia líder 3', fusionada al HDVR y un terminador T7.

[0050] En segundo lugar, el fragmento Xma I/Eco RV del plásmido pCAP3 se insertó en el plásmido pUK5 usando Xma I y un sitio Hind III relleno. Esto produce el plásmido pUK8. Posteriormente, pUK 8 se digirió con BssH II y BsiW I, los extremos se rellenaron con polimerasa de Klenow y se volvieron a religar. Este plásmido contiene los genes M2-2, M2-1, F, SH, M y P, y se denomina pUK9.

[0051] Para sintetizar un vector de número de copias bajo para el ADNc del aislado X de VSR, dos oligómeros complementarios, RSV011:

AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT y

RSV012: CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA

se fosforilaron con ADN quinasa T4, se hibridaron e insertaron en el plásmido pACYC184 digerido con Cla I/Hind III y tratado con fosfatasa alcalina (New England Biolabs). El plásmido resultante se denomina pACYC184-MCS. Posteriormente se insertó un fragmento Mlu I-Knp I de pUK2 que contiene el promotor T7 y el gen L, este plásmido intermedio se denomina pACYC1. Luego, la región desde el gen N hasta la secuencia líder 3', que incluye la secuencia HDVR fusionada y terminador T7 de pUK6 se añadió a pACYC1 usando Xma I/Not I. Esto da el plásmido intermedio pACYC2. Por último, el fragmento Xma I/Mlu I de pUK9 que contiene los genes M2-2, M2-1, F, SH, M y P se insertó en pACYC2, produciendo el plásmido pACYC3, que comprende todo el genoma del VSR de la cepa X que carece del gen G . El análisis de secuencia del último plásmido reveló una deleción en la región HDVR, que fue reparada y el plásmido resultante se denomina pRSVXAG.

[0052] Además del constructo pRSVXAG, se generó el constructo pACYC24, en el cual el inserto genómico del aislado X del VSR se complementa inversamente mediante PCR inversa. A partir del constructo, se puede sintetizar el ARN antigenómico del VSR. En pACYC24, el promotor T7 precede a la secuencia 3' líder, mientras que el HDVR y el terminador T7 se fusionan a la secuencia 5' de cola.

[0053] Todos los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción utilizados para construir pRSVXAG están ubicados dentro de las regiones intergénicas del VSR y no alteran las secuencias de codificación ni afectan a las señales de transcripción (como se muestra en la Figura 2).

Ejemplo 4

Construcción de plásmidos auxiliares

[0054] Los plásmidos auxiliares que expresan varias proteínas del VSR se construyeron de la siguiente manera. Todos los genes requeridos se derivan de la cepa de laboratorio RSV-A2 (ATCC #VR1302). El virus se purificó en placa en células Hep-2 y posteriormente se usó para infectar células Vero. El ARN total fue aislado de estas células mediante extracción de isotiocianato de fenol-guanidina (Trizol, Invitrogen) y se sometió a RT-PCR usando polimerasa Taq de alta fidelidad (Invitrogen) y un conjunto de cebadores específicos para los genes L, P, N y M2-1 del VSR, respectivamente (ver Tabla II). Los productos de PCR se clonaron posteriormente en los plásmidos de expresión pcDNA3, pcDNA6 o pCI, usando sitios de reconocimiento de enzimas de restricción como se indica en la tabla II. Las secuencias de clones se confirmaron mediante secuenciación del ciclo de PCR usando el kit BigDye terminator (Applied Biosystems) y se analizaron mediante un analizador genético ABI Prism 310.

Ejemplo 5

Construcción de líneas celulares Vero productoras de G

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[0055] Las líneas celulares que producen la proteína VSR-G se construyeron usando varios métodos:

[0056] En el método 1, el gen G del VSR-A2 o del aislado X del VSR, o el gen G de VSR -A2, en el que el codón interno de inicio de la traducción se había desactivado mediante modificación usando los cebadores RSV033 y RSV 034, se clonaron en los vectores de expresión pcDNA3 o pcDNA6 (Invitrogen) usando RT-PCR en ARN de VSR-A2 o células Vero infectadas con aislado X del VSR usando cebadores como se indica en la Tabla II. Los plásmidos se introdujeron en células Vero usando agentes químicos, CaCl2, coprecipitación, basándose en liposomas o electroporación (Ausubel 1989). Se usaron dos métodos para aislar líneas celulares estables. En el primer método, 72 horas después de la transfección, las células se dividieron usando varias diluciones en un medio fresco que contenía un medio selectivo, zeocina para pcDNA3 y blasticidina para pcDNA6. Las células se alimentaron con medio selectivo cada 3-4 días hasta que se identificaron los focos celulares. Las colonias individuales se recogieron y se transfirieron a una placa de 96 pocillos, o se sembraron en diversas diluciones para obtener células individuales en una placa de 96 pocillos. Las colonias resistentes a los antibióticos se probaron en la expresión de VSR-G mediante técnicas de inmunotinción o FACS usando anticuerpos específicos de VSR-G. Las colonias que expresan G se cultivaron y se designaron como líneas celulares estables que expresan G. El segundo método comprende la clasificación FACS usando anticuerpos específicos de VSR-G 72 horas después de la transfección. Las células que expresan VSR-G se sembraron en una dilución en serie para obtener células individuales en una placa de 96 pocillos y se cultivaron en medio selectivo. Las colonias de células individuales se cultivaron en un medio selectivo y posteriormente se ensayaron nuevamente para obtener la expresión de VSR-G, dando como resultado líneas celulares que expresan VSR-G.

[0057] En el método 2, el sistema Flp-In (Invitrogen) se usa para producir células Vero con sitios de inserción de genes diana en posiciones cromosómicas que permiten diferentes niveles de expresión del gen diana. El gen VSR-G, derivado de los plásmidos del método 1 pero con una modificación (introducida usando el cebador VSR 151: Tabla II) de la secuencia circundante del codón de inicio de la traducción G para permitir mayores niveles de traducción, se insertó en cada una de estas líneas celulares usando el método de sistema genérico, que da como resultado líneas celulares Vero que expresan de manera estable diferentes niveles de proteína G.

[0058] En el método 3, las células Vero se hicieron transitoriamente para expresar la proteína G, mediante transfección con los plásmidos de expresión que contienen el gen G del método 1, o mediante infección con el virus vaccinia Ankara modificado (MVA) (Sutter 1992) o el virus de la viruela aviar (Spehner 1990) que expresa la proteína G.

Ejemplo 6

Construcción de líneas celulares productoras de polimerasa del bacteriófago T7

[0059] El gen de la polimerasa del bacteriófago T7 es amplificado por PCR a partir del plásmido pPRT7 (van

Gennip 1997), que contiene el gen, usando los cebadores ALG022 y ALG023 (Tabla II). El producto de PCR se clona en el vector pcDNA6b, usando Hind III/Xba I, lo que produce el plásmido pc6T7pol. Las células Vero se transfectaron utilizando lipofectamina 2000 según lo recomendado por el fabricante (Invitrogen). 72 horas después de la transfección, las células se dividieron y crecieron en un medio fresco que contenía blasticidina. Las células se alimentaron con medio fresco cada 3-4 días y se dividieron dos veces para obtener volúmenes de cultivo más grandes. 20 días después de la transfección, las células resistentes a blasticidina se transfectaron con el plásmido indicador pT7-IRES2-EGFP usando lipofectamina 2000. Para la construcción del plásmido pT7- IRES2-EGFP, se construyó el primer plásmido pT7-EGFP insertando mediante HindIII/BamH1 en el plásmido p- EGFP-N1 (Clonetech) un conjunto de oligómeros complementarios que codifican la secuencia promotora T7 (ALG32: AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT y ALG33:

GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT). El plásmido pT7-IRES2-EGFP se construyó luego clonando el fragmento T7-EGFP del plásmido pT7-EGFP en el plásmido p-IRES2-EGFP a través de Xma1-Not1. Las células que expresan EGFP se clasificaron mediante FACS y se cultivaron en una dilución limitada para obtener colonias de células individuales. Las colonias individuales que expresan ARN polimerasa de T7 se ensayaron para determinar la estabilidad, se cultivaron a volúmenes de cultivo más grandes y se almacenaron.

Ejemplo 7

Método para producir el virus recombinante del aislado X del AG-VSR

[0060] Las células Hep-2 se cultivaron en DMEM + SBF (suero bovino fetal) al 10 % + penicilina/estreptomicina/glutamina, mientras que las células Vero y derivados de las mismas se cultivaron en M199 + FCS al 5 % + pen/estrep/glu. Las células se cultivaron durante la noche hasta el 80 % de confluencia en platos de 10 mm2 a 37 °C. Para las células Vero y Hep-2, las células se infectaron con el virus modificado Ankara-T7 (MVA-T7) (Sutter 1992, Wyatt 1995) o el virus de la viruela aviar T7 (Britton 1996) a MDI = 3

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(multiplicidad de infección 3) y se incubaron a 32 °C durante 60 minutos antes de la transfección, para permitir la expresión de la polimerasa del bacteriófago T7. Las células (células Hep-2, Vero o Vero T7) se lavaron con medio Optimem (Optimem 1 con glutamax, Invitrogen) y posteriormente se transfectaron con plásmidos auxiliares que codifican los genes N, P, L y M2.1 del VSR y con el plásmido pRSVXAG, utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen) en Optimem (volumen total 500 pl). Se añadieron las siguientes cantidades de plásmidos: 1,6 pg de pRSVXAG, 1,6 pg de pcDNA6-A2-N, 1,2 pg de pcDNA3-P, 0,4 pg de pcDNA6-A2-L , 0,8 pg de pcDNA6-A2-M2.1. Después de 3-4 horas de incubación a 32 °C, se añadieron 500 pl de medio Optimem con SBF al 2 % y las células se incubaron a 32 °C durante 3 días. A continuación, las células se rasparon y la mezcla de células raspadas y medio que contenía el virus rescatado se utilizó para infectar cultivos frescos de células Vero o Hep-2 cultivadas en DMEM + SBF al 2 % + pen/estrep/glu. Este último procedimiento se repitió 4-5 veces para obtener reservas de virus de alta titulación.

[0061] La identidad del virus del aislado X del AG-VSR se confirmó mediante RT-PCR en ARN aislado de células Vero infectadas con el aislado X del AG-VSR y la digestión de los productos obtenidos con las enzimas de restricción únicas cuyos sitios de reconocimiento se introdujo en pRSVXAG (figura 2). Se usó el aislado X del VSR como control.

[0062] Para la identificación de los marcadores de secuencia en el VSR, las células Vero se infectaron con el aislado X del VSR o con el aislado X del AG-VSR con una MDI = 0,1. 72 horas después de la infección, se aisló ARN de sobrenadante de cultivos y se usó como plantilla para RT-PCR. Los cebadores se diseñaron para flanquear los marcadores de secuencia insertados en el virus recombinante del aislado X del AG-VSR. Tras la RT-PCR, los productos obtenidos se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas. Se obtuvieron los siguientes productos de digestión (figura 3):

a) La PCR con los cebadores RSV065 (GTCCATTGTTGGATTTAATC) y RSV093

(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC) y la digestión con Mlu-I produjeron los fragmentos esperados de 937 pb para el aislado X del VSR y de 459 y 478 pb para el aislado X del AG-VSR

b) La PCR con los cebadores RSV105 (GTTGGATTGAGAGACACTT) y RSV113

(AGTATTAGGCAATGCTGC) seguida de la digestión con Xma-I produjo los fragmentos esperados de 880 pb para el aislado X del VSR y de 656 y 224 pb para el aislado X del AG-VSR

c) La PCR con los cebadores RSV112 (CCCAGTGAATTTATGATTAG) y RSV160

(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA) y la digestión con SexA-I produjeron los fragmentos esperados de 694 pb para el aislado X del VSR y 492 y 202 pb para el aislado X del AG-VSR

d) La PCR con los cebadores RSV098 (TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG) y RSV114 (ATCCCCAAGTCATTGTTCA) seguida de la digestión con SnaB-I produjo los fragmentos esperados de 1820 pb para el aislado X del VSR y de 507 y 387 pb para el aislado X del AG-VSR.

[0063] Las características de crecimiento del aislado X del AG-VSR en comparación con el aislado X del VSR se determinaron en células Vero y Hep-2 (figura 4).

Tabla III. Cebadores utilizados para el diagnóstico RT-PCR de ARN de células Vero infectadas por VSR.

Nombre del cebador

Secuencia

RSV065

GTCCATTGTTGGATTTAATC

RSV093

CAAGATAAGAGT GT ACAAT ACTGTC

RSV098

TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG

RSV105

GTTGGATTGAGAGACACTT

RSV112

CCCAGTGAATTTATGATTAG

RSV113

AGTATTAGGCAATGCTGC

RSV114

ATCCCCAAGT CATT GTT CA

RSV160

AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA

Ejemplo 8

Método para producir el virus recombinante del aislado X del AG+ G-VSR

[0064] El virus del aislado X del AG-VSR, derivado de células Vero transfectadas, tuvo varios pases para obtener títulos de al menos 105 ufp/ml (unidades formadoras de placas por ml). Luego se usaron diferentes mdi

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de este virus para infectar la línea celular Vero que produce la proteína VSR-G. El aislado X del AG+ G-VSR resultante se recolectó del medio y/o de las células y se analizó mediante técnicas de inmunodetección para buscar la presencia de la proteína G en los viriones. Las titulaciones de infectividad se determinaron en células Vero o Hep-2, y la integridad del genoma AG se determinó usando RT-PCR en ARN vírico extraído de células infectadas con el virus del aislado X del AG + G-VSR. El virus se almacenó a -135 °C en sacarosa del 25 % o 40 %.

Ejemplo 9

Método para proteger en un modelo animal de rata algodonera contra la infección por VSR y la patología inducida por VSR mediante inmunización con el aislado X del AG-VSR

[0065] Los experimentos de protección se realizaron en ratas algodoneras (Sigmodon hispidus, 5-6 semanas de edad, 4-6 animales por grupo y ambos sexos). En los experimentos iniciales, se demostró que este animal es sensible a la infección por VSR y presenta una patología pulmonar grave mediada por vacuna según lo descrito por Prince, 2001 y que imitan con mucha precisión la situación humana. Después de la aplicación intranasal del VSR, la patología pulmonar se caracterizó por un infiltrado inflamatorio dentro y alrededor de los bronquios/bronquiolos e hiperplasia del epitelio. Se observó una patología más severa después de la inmunización intramuscular con VSR-A2 inactivado con formalina seguida de un prueba de provocación intranasal con VSR-A2. Además de la patología mencionada anteriormente, se observaron infiltrados perivasculares y peribronquiolares y alveolitis, característicos de una patología inmunomediada. Estas observaciones se usaron como referencia «interna» para todos los experimentos de inmunización y prueba de provocación. La infección y la inmunización de ratas algodoneras con preparados de VSR se realizaron por vía intranasal, en ambas fosas nasales. Los pulmones de las ratas algodoneras se examinaron microscópicamente con luz para detectar patologías, y se determinaron los títulos de virus en diferentes momentos después de la prueba de provocación o después de la infección/inmunización en células Vero usando diluciones en serie de homogeneizados de pulmón con ELISA específico de VSR para producir títulos de CCID50 e inmunotinción usando ABS específico de VSR para producir títulos de ufp. Después de inmunizar dos veces con aislado X del AG-VSR, las ratas algodoneras estaban completamente protegidas contra la infección y la patología causadas por el aislado X del VSR en los pulmones. Los resultados de varios experimentos se resumen en la Tabla IV.

Tabla IV:

t1 V2 día 5 de la patología pulmón t3

infección con: pulmonar después de

la infección por debajo del

aislado X del AG-VSR 5 100 sí, moderado umbral de detección

VSR-A2 5 100 sí, fuerte 2*5

aislado X del VSR 5 100 sí, fuerte 4*5

días de inmunizad ón 0 y 21

día 5 de la patología

t1

V2 prueba de provación día 42 t1 V2 pulmonar después de la prueba de pulmón t3

provocación

2x aislado

por debajo del

5

100 aislado X del VSR 5 100 no umbral de

X del AG-

detección

VSR simulacro

100 aislado X del VSR 5 100 sí, fuerte 5

1: títulos de virus en logaritmos ufp/ml

2: volumen en pl por animal, que es la mitad de este volumen en cada orificio nasal 3: títulos de virus en logaritmos por gramo de pulmón, el límite de detección es 102 CCID50

Referencias

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5

10

15

20

25

30

35

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LISTADO DE SECUENCIAS

[0067]

<110> NVI Nederlands Vaccin Instituut

<120> Virus sincitial respiratorio con una deficiencia genómica complementada en trans

<130> P210823 EP1

<150> PCT/NL03/00930 <151> 2003-12-24

<160> 33

<170> versión de PatentIn 3.3

<210> 1 <211>15213 <212> ADN

<213> Virus sincitial respiratorio humano <400> 1

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Uso de un virión de un virus sincitial respiratorio humano para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por virus sincitial respiratorio humano, en el que el virión comprende un genoma vírico que comprende una mutación que causa que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca únicamente de la proteína de unión G
2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que la mutación en el genoma vírico es la inactivación del codón de inicio de la traducción del gen que codifica la proteína de unión G.
3. 3. Uso según las reivindicaciones 1 o 2, en el que la mutación comprende la deleción de la secuencia completa que codifica la proteína de unión G del genoma vírico.
4. 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medicamento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medicamento es un preparado para administración intranasal.
6. 6. Virión de un virus sincitial respiratorio humano para su uso en la prevención o tratamiento de una infección causada por el virus sincitial respiratorio humano, en el que el virión comprende un genoma vírico que comprende una mutación que provoca que el virus producido solo a partir del genoma vírico carezca únicamente de la unión G proteína.
7. 7. Virión para su uso según la reivindicación 6, en el que la mutación en el genoma vírico es la inactivación del codón de inicio de la traducción del gen que codifica la proteína de unión G.
8. 8. Un virión para su uso según las reivindicaciones 6 o 7, en el que la mutación comprende la deleción de la secuencia completa que codifica la proteína de unión G del genoma vírico.
9. 9. Virión para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que el medicamento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. 10. Virión para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en el que el medicamento es un preparado para administración intranasal.

    co

    co

    imagen1

    co

    4^

    Fig 2.1

    Región intergénica entre L y M2-2:

    RSV-X ATTTTGTCCCATAGCTTGAATTGTTTGAGTTAATAi

    pRSVXAG .......................................................................................

    imagen2

    TGTGGTAAGCATTAGGATTGAGTG TTA C.C.T......................................................

    imagen3

    Región intergénica entre N y NS2:

    RSV-X ATTTGCCCCATCTTTCATC*]

    pRSVXAG .................................. ........

    imagen4

    -CTCTCCTTAATTTTAAATTACT

    Fig 2.2

    co

    en

    Región de deleción del gen G

    RSV-X

    pRSVXAG

    imagen5

    GTTGTTGGTCTTAATATTTTAGTTCATTGTTATGACTATTTTTAATTAACT A...........A.....................-.C....................................................................................

    CO

    Oí

    imagen6

    Aislado X de RSV

    Fig 3

    imagen7

    Aislado X de AG-VSR

    imagen8