KR101266715B1 - 트랜스로 상보되는 게놈 결손의 호흡기 세포융합 바이러스 - Google Patents

트랜스로 상보되는 게놈 결손의 호흡기 세포융합 바이러스 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 뉴모바이러스 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자내에 돌연변이를 갖는 바이러스 게놈을 포함하는 뉴모바이러스 비리온으로서, 상기 돌연변이는 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스에 대해서 감염성을 결여시키고, 상기 비리온은 비리온의 감염성에 필요한 양 및 형태로 단백질을 포함하는 것인 뉴모바이러스 비리온에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴모바이러스 비리온의 제조방법, 및 뉴모바이러스 감염 및 질환을 치료 또는 예방하기 위한 상기 비리온의 용도에 관한 것이다. 바람직한 뉴모바이러스 비리온은 바람직하게는 G 부착 단백질이 불활성화되어 있고 트랜스(in trans)로 상보되는 호흡기 세포융합 바이러스의 비리온이다.
Figure R1020067014600
호흡기 세포융합 바이러스, 뉴모바이러스, 비리온, 게놈, 결여

Description

트랜스로 상보되는 게놈 결손의 호흡기 세포융합 바이러스{RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS WITH A GENOMIC DEFICIENCY COMPLEMENTED IN TRANS}
발명의 분야
본 발명은 예방접종 분야, 및 보다 구체적으로 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 등의 뉴모바이러스에 의해 야기되는 질환에 대한 백신에 관한 것이다. 본 발명은 감염성에 필수적인 유전자가 불활성화되어 있는 RSV 게놈을 가지며, 상응하는 야생형 유전자 산물이 비리온에 트랜스(in trans)로 상보되는 RSV 비리온에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 RSV 비리온의 제조방법, 백신에서의 그의 용도 및 뉴모바이러스에 대한 예방접종 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
인간 호흡기 세포융합 바이러스는 뉴모바이러스 속의 파라믹소바이러스 패밀리로 분류된다. 이 바이러스는 유아, 중장년 및 면역기능이 저하된 사람에게서 중증 하부 기도 질환의 주요 원인이 된다. 이 바이러스는 또한 좀 더 나이든 어린이 및 성인의 상부 기도 질환의 중요한 인자이다. 현재, 당업계에서 이용할 수 있는 효과적인 h-RSV 백신은 없다.
RSV는 그의 표면에서 두개의 주 항원, 즉 부착 단백질 G 및 융합 단백질 F를 발현하는 인벨롭(enveloped) RNA 바이러스이다. 이 두 단백질은 보호 항체를 자극하는 것으로 나타났다. G는 공지된 두 h-RSV 서브그룹 A 및 B의 결정인자이다. 두 그룹간에 항원차를 확인할 수 있다. G 단백질은 그룹 A내에서 최대 20%의 G 단백질 서열 차이 및 그룹 A와 B 사이에 53% 아미노산 상동성만으로 고도의 변이를 나타낸다(Mufson 1988, Cane 1991).
현재 RSV 감염에 대한 특정 질환소질(예: 조산)의 신생아를 치료 및 보호하기 위해 RSV-강화 면역글로불린(레스피감(Respigam)) 또는 F에 대한 합성 인간화 모노클로날 항체(팔리비주마브(Palivizumab))를 사용한 수동 면역화가 이용되고 있다(Robinson 2000, Greenough 2000). RSV 병리는 바이러스 자체에 의한 세포 손상 및 면역계 과잉반응에 의한 조직 손상이라는 두가지 주요 측면을 가진다. 후자는 백신 설계를 매우 복잡하게 만드는 요인이 되고 있다.
RSV 감염은 매해 말즈음 북반구에서 절정을 이루는 겨울에 한정되는 계절적 질환이다. RSV는 두살 미만의 거의 모든 유아를 대부분 2회 감염시킨다. 나이가 더 든 사람은 대체로 환경에 따라 2년 주기로 감염되며, 유아 및 영아와 긴밀히 접촉한 사람은 50%의 위험성이 있다. 바이러스는 긴밀한 접촉, 비말 또는 오염된 피부를 통해 확산된다. RSV는 에어졸을 통해 유효하게 확산되지 않으며; 바이러스 입자는 비교적 불안정하다. 상부 기도(URT)로부터 하부 기도(LRT)로의 바이러스 내부 확산은 주로 일차 감염동안 URT 상피에서 형성된 바이러스 입자를 흡입함으로써 발생한다. 융합체 형성에 의한 확산(이를 칭하게 된 바이러스의 병리 특성중 하나)은 제어가 불가능하고, LRT 감염에 이차적인 역할을 수행할 수 있다.
일반적으로, RSV 병리는 URT에서 시작하며; 코, 다소 덜한 정도로 눈을 통해 유입되나, 입을 통해 유입되지는 않는다. URT 조직으로 제한된 경우, 질환은 성인에게 심각한 경우도 있긴 하지만 보통 감기에 한정된다. 그러나, 바이러스가 LRT에 도달하면, 보호받지 않은 사람에게 세기관지염 및 폐렴이 발생할 수 있다. 영유아에서, 이는 생명을 위협할 수 있으며, 약 1/100이 입원 및 의학적 호흡을 필요로 하고; 이중 1%는 사망하게 된다. 중장년층에서 RSV에 기인한 LRT 질환은 입원의 주 원인이며, RSV가 독감 유사 질환 25%를 초래할 것으로 여겨지고 있다.
RSV에 대한 면역 반응은 복잡하다. 일반적으로, h-RSV에 대한 노출은 LRT 질환을 보호하는 반응을 증강시킬 것이다. 이러한 반응은 노인에게서 약해져 노인 집단이 RSV에 매우 감수성이 되게 만든다. URT 질환에 대한 효과적인 장기 보호는 가능하지 않은 것으로 나타났다: 재감염이 심지어 같은 계절에도 자주 일어나며, 이는 바이러스 변이에 의해 야기되지 않는다. RSV 감염에 대한 보호에 LRT 질환을 예방할 수 있는, 혈액 순환 바이러스 단백질 F 및 G에 대한 항체가 연루된다. URT 감염은 F 및 G의 점막 항체에 의해 조절이 가능하나, 이들은 제한된 수명을 갖는다. 미확인 바이러스 단백질로서 CD8+ T 세포는 감염 조직으로부터 바이러스를 제거하는데 필요하나, 이들은 수명이 짧고 이들의 저장소로부터 효과적으로 보충되지 않는 것으로 나타났다. 가장 유망하게, 이는 아마도 G 유전자에서 코딩되는 RSV-발현 인자에 의해 야기될 것이다(Srikiatkhachom, 1997a).
RSV 질환의 주요 특징은 병리의 면역 증강이다. 제한된 상황으로, 세포 면역 반응은 과도하게 유발된 과립구로부터 방출된 감염 조직 또는 시토킨의 작용으로 RSV 질환을 악화시키게 된다. 숙주 질환소질이 이 반응 및, 또한 때에 따라 출생후 최초 RSV 감염 시기에 관련된다. 불행히도, 포르말린-불활성화된 RSV를 사용한 초기 백신 사용은 이들을 예방접종한 경우 wt 감염시에 면역 증강된 병리가 우세해 지는 것으로 나타났다(Kim 1969). RSV에 함유된 인자가 이러한 현상에 관여하며, 포르말린 처리에 의해 방출되는 것이 명백한 것으로 나타났다. 그로부터 40년 동안, 바이러스 G 단백질이 이들 문제의 주 매개체인 것으로 서서히 드러났으나, 메카니즘은 밝혀지지 않았다(Srikiatkhachorn 1997b). 임의 경우에, 비리온중 G 단백질에 의한 예방접종(즉, 불활성화된 바이러스 제조시에, 펩티드 형태 또는 막에 적절히 삽입되지 않은 발현 산물로서)은 모델 시스템에서 면역을 증강시킬 것으로 생각된다. 즉, G가 RSV 면역에 어느 정도 기여하지만, 그의 성질은 또한 백신 설계를 복잡하게 만들기도 한다.
초기 생 RSV 백신 후보로서 저온 계대배양(cold passaged) 또는 온도-민감 돌연변이체가 포함되었다. 전자는 감온 상태에서 배양하여 성장을 저온 의존성으로 유도하여 약독화시킨 반면, 후자 돌연변이체는 화학적 또는 조사선 돌연변이유발에 의한 복제를 특정, 보통 고온 의존성이 되도록 제조되었다. 이들 생 바이러스 백신 후보들은 저약독화 또는 과약독화인 것으로 나타났다(Crowe 1998).
아단위 백신 후보가 항체 중화의 주 표적인 RSV-F 또는 G 단백질로부터 유래된다. 후보 아단위 백신, PFP2, 정제 F 단백질은 RSV-양성혈청반응 환자에 안전하나, LRT 감염 및 수반 질환을 충분히 보호하지 못한다(Gonzalez 2000). 다른 아단 위 백신 해결 수단은 연쇄구균 G 단백질의 알부민-결합 도메인에 융합된 h-RSV-G의 아미노산 130-230을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 BBG2Na이다(Power 1997). BBG2Na는 새끼 마우스에서 T 헬퍼(helper) 2 타입 반응을 유도하고, 폐 면역병리를 유도하지 않는다(Siegrist 1999). 아직까지 보호에 대한 데이터는 없다. 균형을 이룬 체액 및 세포 면역 반응에 새로운 어쥬번트를 사용하는 것이 현재 동물 모델에서 시험중에 있다(Plotnicky 2003).
백신 후보로 RSV-F 및 G 항원을 코딩하는 플라스미드-DNA 벡터를 사용하는 것이 동물 모델에서 연구되고 있다. 이들 백신은 설치류에서 보호 반응을 유도하지만(Li 2000), 한 조사실험에서 RSV-F DNA 백신 후보로 면역화된 마우스는 wt 바이러스 접종후 다소 증가된 폐 염증 반응을 나타내었다(Bembridge 2000). 인간에서 플라스미드 DNA 백신의 사용 가능 여부가 아직 알려지지 않았으며, 이러한 연구가 충분히 연구되고 보다 결정적으로 특히 신생아에 수용되기 까지는 아마 적어도 15년은 족히 걸릴 것이다. 벡터 전달 시스템에 기초한 후보 백신이 RSV 단백질을 발현하는 생 재조합 벡터로 작제되었다. 예를 들어, RSV-F 및 G를 발현하는 재조합 우두 바이러스는 마우스에서 보호 효과를 제공하지만, 침팬지에서는 이러한 보호 효과를 나타내지 않았다(Collins 1990). 문제는 이들 시스템이 안전하고(특히 우두 바이러스) 사회적으로 폭스바이러스에 대한 기존 항체(모체)에 비추어 사용가능하며 주요 표적 그룹이 신생아인지의 여부이다.
수개의 백신 후보가 역 유전에 의해 생성된 재조합 생 RSV를 기본으로 한다. 한 연구가 한랭적응(cold-adaptation) 및 온도 민감성에 관여하는 개별 또는 조합 돌연변이를 재조합 바이러스에 도입하여 이들 바이러스를 약독화시키는 것에 역점을 두었다. 과약독화 또는 저약독화로 인해, 이들 백신 후보중 어느 것도 사용가능하지 않았다. 다른 연구는 하나 이상의 바이러스성 비구조 유전자 결실에 초점을 맞추었다. 모델 시스템에서 이들 바이러스 거동에 대한 제한된 데이터만을 입수할 수 있었다(Jin 2003).
RSV 백신 개발에 대한 다른 시도는 소 RSV를 사용하는 것이다. 인간 F 단백질 단독 또는 인간 F 및 G 단백질 둘 다를 가지는 키메라 소 RSV를 침팬지에서 그의 효과에 대해 평가하였다. 이 백신 후보는 야생형 h-RSV 접종후 복제가 동물이 보호되지 않을 정도로 제한되었다(Buchholtz 2000).
따라서, 현재 당업계에 이용가능한 효과적인 h-RSV 백신은 없다. 동물 모델에서 시험된 모든 RSV 백신 후보는 사용가능하지 않다. 따라서, 당업계에서는 효과적이면서 안전한 RSV 백신이 절실하며, 이러한 백신을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
발명의 설명
정의
본 발명의 명세서 및 청구범위에서, "포함하기 위하여" 및 그의 어형 변화는 낱말뒤의 항목을 포함하려는 비한정적인 의미로 사용되나, 구체적으로 언급되지 않은 항목을 제외시키는 것은 아니다. 또한, 단수는 하나 및 오직 하나의 원소만이 필요하다고 명확히 기술되지 않은 한, 복수개의 원소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서, 단수는 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
본 원에 사용된 용어 "비리온"은 바이러스 구조의 당단백질을 함유하는 리피드 인벨롭내 뉴클레오캅시드 단백질, 바이러스 게놈 및 레플리카제 복합체를 포함하는 바이러스 입자를 의미한다.
용어 "바이러스의 감염성", "감염 바이러스", "감염 바이러스 입자" 또는 "감염 비리온"은 감염된 새로운 바이러스를 생산할지 안할지의 여부에 상관없이 적절한 숙주 세포로 도입되어 바이러스 복제 사이클을 개시할 수 있는 바이러스, 바이러스 입자 또는 비리온을 의미한다.
제 1 측면으로, 본 발명은 뉴모바이러스의 비리온에 관한 것이다. 비리온은 뉴모바이러스 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 가지는 바이러스 게놈을 포함하며, 이때 돌연변이는 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스에 대해서 감염성을 결여시키며, 비리온은 비리온의 감염성에 필요한 양 및 형태로 단백질을 포함한다.
뉴모바이러스는 바람직하게는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 보다 바람직하게는 인간 또는 소 RSV이다. 인간 RSV는 서브그룹 A 또는 B 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 임상 분리체, 보다 바람직하게는 시험관내에서 상당한 정도로 계대배양되지 않은 분리체이다(바람직하게는 실시예에 기술된 바와 같이 10, 8, 6 또는 5 회 미만으로 계대배양). 따라서, 임의의 RSV 균주 또는 분리체가 본 발명에 사용될 수 있으며, 본 발명은 RSV 분리체 X에 대해 특정 인간 RSV 분리체 98-25147-X 만을 예시하고 있다고 이해하여야 한다. 바이러스가 최근 임상 분리체인 것이 또한 바람직하며, 이때 최근은 10, 8, 6, 4, 3, 또는 2 년 미만전에 최초 분리된 것으로 정의된다. 비리온내 뉴클레오타이드 서열이 최근 분리체의 것에 상응할 필요는 없지만, 본 발명의 비리온에 존재하는 단백질의 아미노산 서열이 최근 임상 분리체의 단백질과 동일한 것이 바람직하다고 이해하여야 한다.
바이러스 게놈은 뉴모바이러스 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 바이러스 유전자에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기에서 바이러스 감염성은 상기 정의된 바와 같다. 따라서, 뉴모바이러스 감염성에 필수적인 단백질은 본 발명의 비리온을 적합한 숙주 세포에 도입하여 바이러스 복제 사이클을 개시할 수 있는 능력에 필수적인 단백질이며, 이때 복제 사이클이 반드시 새로운 감염 비리온을 생산할 필요는 없다. 본 발명의 바람직한 비리온에서, 돌연변이는 비리온에 대해 생체내, 즉 적합한 숙주 유기체에서 감염성을 결여시키며, 이때 비리온은 시험관내에서 배양된 적합한 숙주 세포에 대해 여전히 감염성일 수 있다.
본 발명의 바람직한 비리온에서, 뉴모바이러스 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 돌연변이화된 유전자는 바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 유전자이다. 본 원에서 뉴모바이러스의 구조 단백질은 야생형 감염 바이러스의 비리온에 존재하는 단백질인 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 비리온에서 돌연변이화될 구조 단백질을 코딩하는 바람직한 유전자는 부착 단백질 G 및/또는 융합 단백질 F를 코딩하는 유전자이며, 이때 G 단백질이 가장 바람직하다. G 단백질을 코딩하는 유전자의 결실 및/또는 기능 불활성화는 수개의 목적을 제공하며, 현재 RSV 백신 후보가 갖고 있는 다수의 문제 및 복잡한 문제를 방지한다. 한가지 목적은 백신 안정성이다: G 단백질을 함유하지 않는 RSV는 숙주 세포를 효과적으로 감염시킬 수 없기 때문에, 그의 숙주에서 고도로 약독화된다(Karron 1997, Schmidt 2002). 한가지 복잡한 문제는 원치않는 면역 반응을 야기하고, 증강된 면역 병리를 포함하며(Alwan 1993, Srikiatkhachorn 1997b), 특정 유전자 질환소질하에 앨러지(및 천식)에 걸리기 쉬운 상태로 면역 시스템을 왜곡시킬 가능성(Openshaw 2003, Peebles 2003)에 G 단백질이 상당히 관여한다는 것이다. 이는 G 유전자 결실 또는 불활성화로 예방될 것이다. 비리온 감염성에 필요한 양 및 형태의 G 부착 단백질을 포함하고 G 부착 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 불활성화시키는 바이러스 게놈을 포함하는 본 발명의 뉴모바이러스 비리온은 "△G+G" (뉴모)바이러스 또는 비리온으로 지칭된다. 마찬가지로, G 부착 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 불활성화시키나, 기능적인 양의 G 단백질로 트랜스로 상보되지 않는 비리온은 "△G" (뉴모) 바이러스 또는 비리온으로 지칭된다.
따라서, 본 발명의 뉴모바이러스 비리온은 감염에 필수적인 외부 코딩 단백질로 일시적으로 및 기능적으로 재구성된다. 바람직하게, 감염에 필수적인 외부 코딩 단백질은 부착 단백질 G 및/또는 융합 단백질 F이며, G 단백질이 가장 바람직하다. 바람직하게, 감염에 필수적인 외부 코딩 단백질은 비리온에 존재하는 게놈과 동일한 바이러스 서브그룹(A 또는 B)을 갖는다. 보다 바람직하게, 감염에 필수적인 외부 코딩 단백질은 비리온에 존재하는 게놈과 상동성이며, 이는 단백질이 그의 불활성화 전에 바이러스 게놈에 코딩된 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미한다. 또한, 이는 하나 이상의 내부 코딩 단백질을 가지는 아미노산 서열이 본 발명의 비리온내 그의 카운터파트와 100% 일치하는 야생형 비리온에 존재하는 아미노산 서열과 외부 코딩 단백질의 아미노산 서열이 동일하다는 것을 의미하기도 한다.
본 발명의 비리온에서, 필수 구조 단백질의 유전자내 돌연변이는 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스에 대해서 단백질을 결여시키거나 생물학적으로 불활성화된 단백질을 발현시키는 돌연변이이다. 바이러스 게놈으로부터만 생산되는 바이러스 생산은 바이러스 게놈을 트랜스로 상보하는 임의의 코딩 서열 부재하에 비리온에 존재하는 바이러스 게놈으로부터 독점적으로 바이러스가 생산되는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 비리온에 존재하는 바이러스 게놈은 필수 구조 단백질의 발현을 지시할 수 없다. 이는 예컨대 해독 개시 코돈의 불활성화, 코딩 단백질의 N-말단에 인접한 정지 코돈의 도입, 하나 이상의 프레임-이동(frame-shift) 돌연변이, 유전자로부터 하나 이상의 단편 결실을 비롯한 당업자들에게 알려진 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 바람직하게, 유전자는 필수 구조 단백질을 코딩하는 서열의 적어도 10%, 20%, 50%, 75%, 90% 또는 95% 결실에 의해 불활성화된다. 그러나, 돌연변이가 단백질을 코딩하는 (전체) 서열의 결실을 포함하는 비리온이 가장 바람직하다.
복수개의 돌연변이가 존재하는 비리온이 명백히 본 발명내에 포함된다. 특히, 복수개의 바이러스 단백질을 코딩하는 유전자는 대상 단백질의 기능을 변경시키거나 불활성화시키거나, 또는 단백질에 상술된 비리온을 결여시킨 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 저온 계대배양 또는 열-민감성 돌연변이를 본 원에 상술된 필수 구조 단백질의 불활성화와 결합시킬 수 있다.
감염 숙주 유기체로부터 RSV 등의 뉴모바이러스 제거는 적절한 세포 면역성을 필요로 하며, 이는 바이러스에 의한 상피 세포의 감염없이 효과적으로 마운팅되지 않을 것이다. 그러나, 본 발명의 돌연변이체 뉴모바이러스는 생체내 숙주 세포의 감염에 필수적인 단백질에 대한 유전 정보가 결여되어 있다. 따라서, 본 발명은 감염에 필수적인 단백질의 부재하에 상보되는(트랜스) 세포에서 돌연변이체 뉴모바이러스의 복제를 포함하는, 돌연변이체 뉴모바이러스의 제조방법을 개시한다.
다른 측면으로, 본 발명은 상기 정의된 돌연변이체 뉴모바이러스 비리온의 제조방법에 관한 것이다. 이 방법은, 비리온이 뉴모바이러스의 (생체내) 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 갖는 바이러스 게놈을 포함하고, 상기 돌연변이가 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스에 대해서 감염성을 결여시키며, 상기 비리온은 비리온의 감염성에 필요한 양 및 형태로 단백질을 포함하는 것인 뉴모바이러스 비리온의 제조방법이다. 이 방법은 (a) 비리온의 감염성에 필요한 양 및 형태의 단백질의 일시적 또는 구조적 발현을 숙주 세포에서 지시하는 발현 벡터를 포함하는 제 1 숙주 세포의 배양물을 상술된 돌연변이를 가지는 바이러스 게놈을 포함하는 뉴모바이러스로 감염시키는 단계; 및 (b) 감염된 숙주 세포 배양물로부터 비리온을 회수하는 단계를 포함한다. 감염된 숙주 세포 배양물로부터의 비리온의 회수는 배양 배지로부터의 회수뿐 아니라 세포로부터의 회수중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
제 1 숙주 세포는 비리온의 감염성에 필요한 단백질을 트랜스로 동시 발현하거나 하지 않고 뉴모바이러스를 복제할 수 있는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 이 목적에 적합한 숙주 세포는 예컨대 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 배양물(예: 베로, ECACC lot 10-87, 134번째 계대배양, 1990, EMEA 승인)이다.
본 발명의 바람직한 방법으로, 제 1 숙주 세포 배양물을 감염시키기 위해 사용되는 뉴모바이러스는 (a) (i) 뉴모바이러스의 (생체내) 감염성에 필수적인 단백질을 코딩하는 유전자내에 돌연변이를 갖는 바이러스 게놈 RNA로서, 상기 돌연변이는 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스에 대해서 감염성을 결여시키는 것인 바이러스 게놈 RNA; 및 (ii) 뉴모바이러스 폴리머라제 효소 복합체 및 임의로 하나 이상의 추가의 바이러스 단백질의 발현을 숙주 세포에서 지시하는 하나 이상의 발현 벡터를 제 2 숙주 세포에 제공하는 단계; 및 (b) 제 2 숙주 세포를 배양하여 비리온을 생산하는 단계를 포함하는 방법으로 생산된다. 바람직한 방법으로, 제 2 숙주 세포에 의해 생산된 비리온은 제 2 숙주 세포와 동일하거나 상이한 숙주 세포를 사용하여 하나 이상의 추가의 세포 감염 단계로 증폭된다.
제 2 숙주 세포는 비리온의 감염성에 필요한 단백질을 트랜스로 동시 발현하거나 하지 않고 뉴모바이러스가 복제할 수 있는 임의의 숙주 세포일 수 있다. 이 목적에 적합한 숙주 세포는 예컨대 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 배양물(예: 베로, ECACC lot 10-87, 134번째 계대배양, 1990, EMEA 승인) 또는 Hep-2 세포이다. 제 2 숙주 세포는 제 1 숙주 세포와 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 바이러스 게놈 RNA는 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 있는 바이러스 DNA 카피로부터 전사되며, (제 2) 숙주 세포는 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제의 발현을 숙주 세포에서 지시하는 발현 벡터와 함께 제공된다. 바람직하게, 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 폴리머라제는 T7, T3 또는 SP6 폴리머라제이다.
제 2 숙주 세포에서 하나 이상의 발현 벡터(들)로부터 발현되는 뉴모바이러스 폴리머라제 효소 복합체는 적어도 발현 벡터(들)내 그의 상응하는 유전자 또는 cDNA's로부터 발현된 L, P, N 단백질을 포함한다. 네이키드(naked) 바이러스 게놈 RNA의 패키징 및 바이러스 어셈블리의 효율 향상을 위해, 임의로 하나 이상의 추가의 바이러스 단백질이 제 2 숙주 세포에서 발현된다. 이 목적에 바람직한 바이러스 단백질은 바이러스 매트릭스 막 단백질을 포함하며, M2-1 단백질이 특히 바람직하다. L, P, N, M2-1, G 또는 F 단백질은 바람직하게는 숙주 세포에 도입되고 발현되는 바이러스 분리체의 바이러스 게놈으로부터 유래되나, 또한 다른 이종 바이러스 또는 비바이러스원으로부터의 동종 단백질이 사용될 수 있다.
당업자들은 각종 발현 벡터 및 조절 서열(예컨대 프로모터)을 제 1 및/또는 제 2 숙주 세포에서 바이러스 게놈 RNA, DNA-의존성 RNA 폴리머라제, 뉴모바이러스 폴리머라제 효소 복합체 및 임의의 추가의 바이러스 단백질뿐 아니라 필수 구조 단백질을 발현하여 입수할 수 있음을 알고 있다(참조예: Sambrook and Russell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
RNA 바이러스의 역 유전, 즉 본 발명의 비리온과 같은 재조합 RNA 바이러스의 발현을 위해, 바이러스 게놈 RNA의 cDNA 카피를 플라스미드로 클로닝하고 특정 조건하에서 DNA로부터 RNA를 합성하도록 서열 조절하에 위치시킨다. 일반적으로, 박테리오파지 RNA 폴리머라제(예: T7 RNA 폴리머라제)의 프로모터 서열을 RNA 게놈의 DNA 카피 상류에 위치시키고, RNA 폴리머라제의 적절한 터미네이터(terminator)를 게놈 하류에 위치시킨다. 자가-절단 리보자임 서열을 터미네이터 서열 상류에 위치시켜 적당한 말단 뉴클레오티드를 가지는 RNA를 합성토록 한다. 적당한 말단 서열은 일반적으로 합성 RNA로부터 바이러스를 구조하기 위해 필요하다. 비세그먼트 네거티브 스트랜드 RNA 바이러스의 경우, 게놈 또는 항-게놈 RNA와 함께 폴리머라제 효소 복합체(파라믹소바이러스에 대한 N, P 및 L 단백질)의 공발현이 재조합 바이러스를 수득하는데 필요하다[Neumann(2002)에 의한 논문 및 본 원의 실시예 참조].
다른 바람직한 방법은 본 발명의 비리온을 분리 및/또는 정제하고 이들 비리온을 약제학적 조성물로 제제화하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 비리온을 분리 및/또는 정제하는 방법은 당업자들에게 익히 알려져 있다. 이 방법은, 예를 들어 각종 원심분리 기술(예: 분별 또는 밀도 원심분리) 또는 크로마토그래피 기술을 포함한다. 본 발명의 비리온을 약제학적 조성물로 제제화하는 방법은 적어도 비리온을 후술하는 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 상기 언급되었거나 상술된 방법으로 수득할 수 있는 비리온 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 백신 사용에 적합한 약제학적 조성물이며, 즉 조성물은 바람직하게는 백신이다.
또 다른 측면으로, 본 발명은 활성 성분으로 본 발명에 따른 비리온 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 약제학적으로 허용되는 안정화제, 삼투제, 완충제, 분산제 등이 또한 약제학적 조성물에 도입될 수 있다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 형태 및 치료 응용에 따라 달라진다. 약제학적 담체는 재구성된 바이러스막을 환자에 전달하기에 적합한 임의의 상용성인 비독성 담체일 수 있다. 비강내 전달에 약제학적으로 허용되는 담체로는 물, 완충 염수, 글리세린, 폴리소르베이트 20, 크레모포어 EL(cremophor EL) 및 카프릴/카프르 글리세리드의 수성 혼합물이 예시되며, 중성 pH 환경을 제공하도록 완충될 수 있다.
흡입 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 편의상 압축 팩 또는 네뷸라이저(nebuliser)로부터 에어졸 형태로 전달되며, 이때 비리온은 비강내 전달에 대해 상술된 담체에 존재하고, 적합한 추진체, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 가스를 사용한다. 압축 에어졸의 경우, 투여 단위는 소정량을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다.
비강내 또는 흡입용 조성물의 제조방법은 당업계에 익히 알려졌으며, 각종 문헌, 예를 들어 그의 전체내용이 본 원에 참고로 포함되는 Remington's Pharmaceutical Science(15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)에 보다 상세히 기술되었다. 비리온은 임의의 예방접종용 제제중에 활성 성분으로 제제화될 수 있으며, 추가로, 예방접종용 제제가 개체, 바람직하게는 인간 및 살아있는 가축(예: 소, 돼지, 말, 염소, 양)에 효과적으로 투여되도록 하거나 투여에 도움이 될 수 있는 담체, 어쥬번트, 안정화제, 가용화제, 보존제 및 당업계에 공지된 다른 부형제를 포함할 수 있다.
추가의 측면으로, 본 발명은 상기 언급되었거나 상술된 방법으로 수득할 수 있는 치료 또는 예방적으로 유효한 양의 본 발명의 비리온(을 포함하는 조성물)을 예방 및 치료를 요하는 피험체에 투여하여, 뉴모바이러스 감염을 예방접종하거나 예방 또는 처치(방지 또는 치료)하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 비리온은 비강내로 투여된다.
본 발명은 또한 약제, 바람직하게는 뉴모바이러스 감염을 예방접종하거나 예방 또는 처치하기 위한 약제로 사용하기 위한 상기 언급되었거나 상술된 방법으로 수득할 수 있는 본 발명의 비리온에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴모바이러스 질환 또는 감염의 예방접종, 예방 또는 처치용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 비리온의 용도에 관한 것이다. 바람직하게, 약제는 비강내 투여용 제제이다.
본 발명의 예방접종용 비리온을 포함하는 조성물은 바람직하게는 적절한 숙주에 비강내로 투여된다. 일례로, 송아지는 b-RSV 감염으로부터 보호될 것이다. 다른 예로, 인간, 바람직하게는 유아, 중장년 및 면역기능이 저하된 사람이 h-RSV 감염으로부터 보호될 것이다. 제제는 바람직하게는 비강내에 소적 또는 스프레이, 바람직하게는 비강용 스프레이로 투여하기에 적합한 제제를 포함한다. 조성물내 △G+G-뉴모바이러스 입자는 초기 감염된 URT 상피 세포로부터 생산된 2 세대 비리온에 코딩 서열이 게놈으로부터 제거된 G 부착 단백질이 결여되어 있기 때문에, 상부 기도의 상피 세포를 단 한번 감염시킬 것이다. 따라서, 이들 △G-비리온은 숙주 유기체에서 생체내 비감염성이다. 그러나, 감염의 최초 단일 사이클이 뉴모바이러스 또는 RSV에 대해 마운팅될 적절한 세포 면역성, 즉 야생형 바이러스 감염을 제거할 수 있는 반응이 발생되도록 할 수 있으며, 특히 F 보호 항체, 즉 하부 기도 감염을 방지할 항체가 백신 및 비감염 자손에 의해 유도될 것이다. 팔리비무자브 처리 효과로부터 알 수 있는 바와 같이, F에 대한 인간화 모노클로날 항체인 항-F 항체는 RSV 감염을 제한하는데 유효하다. 이는 본 발명의 재조합 생 약독화 뉴모바이러스 백신의 효능에 기초한다. 이들 생 바이러스 백신은 현재 뉴모바이러스 백신 후보가 갖고 있는 다수의 문제를 해결한다. 비리온내 자연 G-단백질의 존재는 적절한 세포 면역성이 생기도록 할 수 있으면서, 각각 소 및 인간의 b-RSV 및 h-RSV 병리의 면역 증강에 크게 관여하는 분리된 G 단백질의 바람직하지 않은 영향을 방지한다.
도 1은 pRSVX△G 작제물을 나타내는 도면이다. 위쪽 라인은 제시된 유전자를 가지는 RSV 분리체 X 게놈 RNA를 나타낸다. 아래 박스는 작제물에 사용된 RT-PCR 산물 및 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 나타낸다. 박스내 번호는 표 I에 표시된 올리고뉴클레오티드 번호를 나타낸다. 클로닝을 위해 도입된 제한 부위가 표시되었다. 최종 클로닝 도식을 아래에 나타내었다: 원은 플라스미드를 나타내고, 화살표는 클로닝 순서를 나타낸다.
도 2는 RSV 분리체 X 및 pRSVX△G의 서열차를 나타낸다. 서열을 게놈 센스로 정렬화시켰다. pRSVX△G의 경우, RSV 분리체 X와 상이한 뉴클레오티드만이 표시되었다. 유사 서열이 점(.)으로 표시되었고, 갭은 (-)로 표시되었다. 유전자 출발 신 호는 한줄로 밑줄을 그어 나타내었고, 유전자 중지 신호는 두줄로 밑줄을 그어 나타내었으며, 유전자는 캡션화하였다. 박스는 도입된 뉴클레오티드 변화로 인한 제한 효소 인식 부위를 개략적으로 나타낸다.
도 3은 RSV RT-PCR 증폭 산물, 소화 다이제스트내 서열 마커를 확인하여 나타낸 것이다: a) MluI, b) XmaI, c) SexA-I, d) SnaB-I.
도 4는 RSV 분리체 X 및 △G-RSV 분리체 X의 성장 곡선이다. 베로(실선) 및 Hep-2(점선) 세포를 MOI=0.1로 바이러스 감염시키고, 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 제시된 시간후, 세포를 수확하고, 베로 세포상에서 CCID50 역가를 결정하였다.
표 I는 RSV 분리체 X를 RT-PCR 클로닝하는데 사용된 프라이머이다.
표 II는 안정한 세포주 작제를 위해 사용된 플라스미드 및 헬퍼 플라스미드를 클로닝하는데 사용된 프라이머이다.
표 III은 SV 감염 베로 세포로부터의 RNA에 대한 진단 RT-PCR을 위해 사용된 프라이머이다.
표 IV는 목화나무쥐(cotton rat) 면역화 실험에서 △G-RSV 분리체 X 면역화에 따른 RSV 감염 및 RSV-유도된 병리로부터의 보호 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명이 하기 비한정적인 실시예로 예시된다. 이들 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 보다 상세히 설명한 목적으로 주어지며 본 발명의 일반적인 범위 또는 임의 측면을 한정하는 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예 1
바이러스 분리체, 바이러스 분리, 증식 및 저장
재조합 h-RSV 클론에 대한 기준은 레이든 대학 메디컬 센터 진단 연구소(Leiden University Medical Centre diagnostic laboratory)로부터 입수한 임상 RSV 분리체이다. 98-25147-X로 명명되며 환자로부터 분리후 코딩된 이 바이러스는 1998년 12월 21-24일에 Hep-2 세포에서 진단 시험으로부터 유도되었다. 이는 후에 서브타입 A 분리체인 것으로 결정되었고 RSV 분리체 X로 지칭되었다. 바이러스를 T75 용기중에서 Hep-2 세포에 대해 DMEM(Gibco), 10% FCS, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민으로 4회 계대배양하고, 이어서 T75 용기중에서 베로 세포에 대해 DMEM(Gibco), 10% FCS, 페니실린/스트렙토마이신/글루타민으로 5회 계대배양하였다. 생성된 RSV 분리체 X 바이러스를 실험 보존물(stock)로 사용하고 -135 ℃에서 25% 또는 45% 수크로스중에 저장하였다.
실시예 2
RSV-X cDNA를 코딩하는 바이러스 게놈의 작제
보존 RSV 분리체 X로 감염된 베로 세포를 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트로 추출하여(Trizol, Invitrogen) 전체 RNA를 수득하였다. 랜덤 헥사머 프라이머를 사용하여 Thermoscript(Invitrogen) 역전사효소로 역전사를 실시하여 cDNA를 제조하였다. 이 cDNA는 제한 효소 인식 부위(표 I 및 서열 목록)를 함유하는 특이적 프라이머 및 고도의 정확성을 나타내는 Taq 폴리머라제(Invitrogen)를 사용한 PCR에 대한 템플레이트로 사용된다. 공지 서열의 RSV-A2(유전자은행 취득번호 M74568) 및 RSV-RSS2(유전자은행 취득번호 U39662)를 기초로 하여 프라이머를 설계하였다.
PCR 산물을 먼저 상이한 벡터에서 개별적으로 클로닝하였다: 프라이머 쌍, 벡터, 제한 효소 인식 부위 및 생성된 벡터를 하기에 열거하였다:
RSV021/RSV047: pCAP 벡터(Roche), Mlu N1, pCAP3(SH/M/P 영역)으로 둔단(blunt)
RSV018/019: pCAP 벡터, Mlu N1, pCAP2(G 영역)로 둔단
RSV016/RSV017: PUC21, Mlu I/Bam HI, pUK5(M2-2/M2-1/F 영역)
RSV024/RSV025a: PUC21, Bam HI/Afl II, pUK1(NS2/NS1 영역)
RSV022/RSV023: PUC21, EcoR V, pUK4(N 영역)
RSV014/RSV015: PUC21, Kpn I/Mlu I, pUK2(L 영역).
두개의 독립적인 cDNA 템플레이트로부터 유래된 적어도 두개의 개별 클론을 시퀀싱하고; 두 클론간의 차이를 가지는 영역을 세번째 클론상에 시퀀싱하였다. 필요에 따라, 클론을 당업자들에게 알려진 일반적인 분자 생물학 기술에 따라 복구하였다. 클로닝에 사용된 프라이머의 결합 부위를 커버하는 추가의 PCR 산물을 수득하고 시퀀싱하였다. 게놈 RNA의 폴리-아데닐화후, 올리고(d) T 함유 프라이머 ALG018로 RT-PCR하여 5' 게놈 말단을 결정하였다:
TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 및
NS1 유전자 프라이머 RSV 126:
AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT.
Hind III/Pst I를 사용하여 상기 단편을 pUC21에 클로닝하였다. RACE(cDNA 말단의 신속한 증폭) 결찰 PCR로 3'-말단을 결정하였다. 모든 서열을 어셈블하여 RSV-X 공통 서열(Seq ID No. 1)을 수득하였다.
BigDye 터미네이터 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 PCR 사이클 시퀀싱으로 모든 서열을 확인하고, ABI 프리즘 310 유전자 분석기를 사용하여 분석하였다.
실시예 3
△G-RSV 분리체 X 전장 플라스미드의 작제
전체 RSV 분리체 X 게놈에 걸쳐 있는 전장 cDNA를 PCR 단편의 순차 결찰에 의해 어셈블하였다(도 1). "트레일러" 말단 앞에 박테리오파지 T7 폴리머라제에 대한 프로모터가 위치한다. 정확한 3' 말단을 생성하기 위해, cDNA "리더" 말단에 간염 델타 바이러스 리보자임(HDVR)을 융합시킨 후, T7 RNA 폴리머라제 전사 터미네이터를 융합시켰다(도 1 참조).
먼저, T7 터미네이터 RSV026/RSV027 올리고 및 RSV028/029 올리고와 HDVR을 코딩하는 상보 올리고머 두 세트를 T4 DNA 키나제로 포스포릴화하고, 하이브리드화한 후, Rsr II/Not I에 의해 클론 pUK1(유전자 NS1/NS2 함유)에 결찰시켜 플라스미드 pUK3을 제공하였다. 그후, N을 함유하는 클론 pUK4의 Xma I/SexA I 단편을 Xma I/SexA I에 의해 플라스미드 pUK3에 결찰시켰다. 이 플라스미드(pUK6)는 N 유전자로부터 HDVR 및 a T7 터미네이터에 융합된 3' 리더 서열까지의 영역을 함유한다.
그 다음으로, Xma I 및 채워진 Hind III 부위를 사용하여 플라스미드 pCAP3의 XmaI/Eco RV 단편을 플라스미드 pUK5에 삽입하였다. 이에 따라 플라스미드 pUK8을 수득하였다. 이어서, pUK 8을 BssH II 및 BsiW I로 소화 처리하고, 말단에 클레 노우(Klenow) 폴리머라제를 충전한 후 재결찰시켰다. 이 플라스미드는 유전자 M2-2, M2-1, F, SH, M 및 P를 함유하며, pUK9로 칭하였다.
RSV 분리체 X cDNA에 대한 저-카피수 벡터를 합성하기 위하여, 두 상보 올리고, RSV011: AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT 및 RSV012: CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCA를 T4 DNA 키나제로 포스포릴화하고, 하이브리드화한 후, 처리한 알칼리 포스파타제에 삽입하고, Cla I/Hind III로 소화 처리하여 플라스미드 pACYC184를 수득하였다(New England Biolabs). 생성된 플라스미드를 pACYC184-MCS로 칭하였다. 이어서, T7 프로모터 및 L 유전자를 함유하는 pUK2의 Mlu I-Knp I 단편을 삽입하고, 이 중간 플라스미드를 pACYC1로 칭하였다. 그후, Xma I/Not I를 사용하여 N 유전자로부터 pUK6의 융합 HDVR 및 T7 터미네이터 서열을 포함한 3'-리더 서열 까지의 영역을 pACYC1에 첨가하였다. 이에 따라 중간 플라스미드 pACYC2를 수득하였다.
마지막으로, M2-2, M2-1, F, SH, M 및 P 유전자를 함유하는 pUK9의 Xma I/Mlu I 단편을 pACYC2에 삽입하여 G 유전자가 결여된 균주 X의 전체 RSV 게놈을 포함하는 플라스미드 pACYC3을 수득하였다. 후자 플라스미드의 서열 분석으로 HDVR 영역이 결실되었음을 알았으며, 이를 복구하여 생성된 플라스미드를 pRSVX△G로 칭하였다.
작제물 pRSVX△G 이외에, 게놈 RSV 분리체 X 삽입체가 역 PCR을 통해 역 상보되는 작제물 pACYC24를 생성하였다. 작제물로부터, 항게놈 RSV RNA를 합성할 수 있다. pACYC24에서, T7 프로모터가 3'-리더 서열에 선행하고, HDVR 및 T7 터미네이 터가 5'-트레일러 서열에 융합된다.
pRSVX△G를 작제하는데 사용된 모든 제한 효소 인식 부위는 RSV 유전자간 영역에 위치하며, 코딩 서열을 변경시키지 않거나, 전사 신호에 영향을 미치지 않는다(도 2에 도시).
실시예 4
헬퍼 플라스미드 작제
수개의 RSV 단백질을 발현하는 헬퍼 플라스미드를 다음과 같이 작제하였다. 필요한 모든 유전자는 랩-균주(lab-strain) RSV-A2(ATCC #VR1302)로부터 유래된다. 바이러스를 Hep-2 세포에서 플라크-정제한 후, 베로 세포를 감염시키는데 사용하였다. 페놀-구아니딘 이소티오시아네이트로 추출(Trizol, Invitrogen)하여 이들 세포로부터 전체 RNA를 분리하고, 고도의 정확성을 나타내는 Taq 폴리머라제(Invitrogen) 및 각각 RSV 유전자 L, P, N 및 M2-1에 특이적인 한 세트의 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 적용하였다(참조: 표 II). 이어서, PCR 산물을 표 II의 제한 효소 인식 부위를 사용하여 발현 플라스미드 pcDNA3, pcDNA6 또는 pCI에 클로닝하였다. BigDye 터미네이터 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 PCR 사이클 시퀀싱으로 클론 서열을 확인하고, ABI 프리즘 310 유전자 분석기로 분석하였다.
실시예 5
G-생산 베로 세포주 작제
여러 방법으로 RSV-G 단백질을 생산하는 세포주를 작제하였다:
방법 1에서, 표 II의 프라이머를 사용하여 RSV-A2로부터의 RSV 또는 RSV 분 리체 X로 감염된 베로 세포에 RT-PCR을 이용하여, 프라이머 RSV 033 및 RSV 034를 사용하여 내부 해독 개시 코돈을 이용할 수 없게 만든 RSV-A2 또는 RSV 분리체 X로부터의 G 유전자, 또는 RSV-A2로부터의 G 유전자를 발현 벡터 pcDNA3 또는 pcDNA6(Invitrogen)에 클로닝하였다. 화학 약품 CaCl2, 공침전, 리포좀-기초 또는 전기천공(electroporation)(Ausubel 1989)을 이용하여 플라스미드를 베로 세포에 도입하였다. 안정한 세포주를 분리하기 위해 두가지 방법이 이용되었다. 첫번째 방법에서, 트랜스펙션(transfection) 72 시간후, 세포를 다양하게 희석하여 선택 배지, pcDNA3에 대해 제오신(zeocin) 및 pcDNA6에 대해 블라스티시딘을 함유하는 신선 배지에 분주하였다. 세포소가 동정될 때까지 세포에 선택 배지를 3-4일마다 공급하였다. 단일 콜로니를 채취하여 96-웰 플레이트로 옮기거나, 또는 다양하게 희석하고 시딩하여 96-웰 플레이트에서 단일 세포를 수득하였다. 항생제 내성 콜로니를 면역염색 기술 또는 RSV G-특이적 항체를 사용한 FACS로 RSV-G 발현에 대해 시험하였다. G 발현 콜로니를 계대배양하고, G를 발현하는 안정한 세포주로 하였다. 두번째 방법은 트랜스펙션 72 시간후 RSV-G 특이적 항체를 사용하여 FACS 분류하는 단계를 포함한다. RSV-G 발현 세포를 일련의 희석으로 시딩하여 96-웰 플레이트에서 단일 세포를 수득한 후, 선택 배지에서 배양하였다. 단일 세포 콜로니를 선택 배지에서 계대배양하고, RSV-G 발현에 대해 시험하여 RSV-G를 발현하는 세포주를 수득하였다.
방법 2에서, Flp-In 시스템(Invitrogen)을 사용하여 상이한 수준의 표적 유 전자 발현을 허용하는 염색체 위치에 표적 유전자 삽입 부위를 가지는 베로 세포를 제조하였다. 방법 1의 플라스미드로부터 유래되나, 해독 수준을 높이도록 서열 주위 G 해독 개시 코돈을 변형(프라이머 RSV 151을 사용하여 도입: 표 II)시킨 RSV-G 유전자를 시스템의 일반적인 방법을 이용하여 각 세포주에 삽입하여 상이한 수준의 G 단백질을 안정하게 발현하는 베로 세포주를 수득하였다.
방법 3에서, 방법 1로부터의 G 유전자를 함유하는 발현 플라스미드로 트랜스펙션시키거나, 또는 G 단백질을 발현하는 변이 우두 바이러스 앙카라(MVA)(Sutter 1992) 또는 수두 바이러스(Spehner 1990)로 감염시켜 베로 세포가 일시적으로 G 단백질을 발현하도록 만들었다.
실시예 6
박테리오파지 T7-폴리머라제 생산 세포주의 작제
프라이머 ALG022 및 ALG023을 사용하여 유전자를 함유하는 플라스미드 pPRT7(van Gennip 1997)로부터 박테리오파지 T7 폴리머라제 유전자를 PCR 증폭시켰다(표 II). Hind III/Xba I를 사용하여 PCR 산물을 pcDNA6b 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pc6T7pol을 수득하였다. 베로 세포를 제조업자가 추천하는 리포펙타민 2000 (Invitrogen)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 72 시간후, 세포를 블라스티시딘을 함유하는 신선한 배지에 분주하여 증식시켰다. 3-4일마다 신선한 배지를 세포에 공급하고, 2회 분주하여 큰 부피의 배지로 만들었다. 트랜스펙션 20 시간후, 블라스티시딘 내성 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 리포터 플라스미드 pT7-IRES2-EGFP로 트랜스펙션하였다. 플라스미드 pT7-IRES2-EGFP를 작제하기 위해, T7 프로모터 서열을 코딩하는 한 세트의 상보 올리고머(ALG32: AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT 및 ALG33: GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)를 Hind III/BamH 1에 의해 플라스미드 p-EGFP-N1(Clonetech)에 삽입하여 1차 플라스미드 pT7-EGFP를 작제하였다. 이어서, 플라스미드 pT7-EGFP의 T7-EGFP 단편을 Xmal-Not1에 의해 플라스미드 p-IRES2-EGFP에 클로닝하여 플라스미드 pT7-IRES2-EGFP를 작제하였다. EGFP를 발현하는 세포를 FACS로 분류하고, 제한적으로 희석하여 증식시켜 단일 세포 콜로니를 수득하였다. T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 단일 콜로니를 안정성에 대해 시험하고, 보다 큰 부피의 배지로 증식시킨 후, 저장하였다.
실시예 7
재조합 △G-RSV 분리체 X 바이러스의 생산 방법
Hep-2 세포를 DMEM + 10% FCS(소 태아 혈청) + 페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 배양하고, 베로 세포 및 그의 유도체를 M199 + 5% FCS + 페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 배양하였다. 세포를 10 ㎟ 디시에서 37 ℃로 80% 합류(confluence)되도록 밤새 배양하였다. 베로 및 Hep-2 세포를 변이 바이러스 앙카라-T7(MVA-T7)(Sutter 1992, Wyatt 1995) 또는 수두-T7 바이러스(Britton 1996)로 MOI=3(감염 3의 다중도)으로 감염시키고, 트랜스펙션전에 박테리오파지 T7 폴리머라제를 발현하도록 32 ℃에서 60 분간 인큐베이션하였다. 세포(Hep-2, 베로 또는 베로-T7 세포)를 Optimem 배지(글루타맥스를 함유한 Optimem 1, Invitrogen)로 세척하고, Optimem(총 부피 500 ㎕)에서 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 RSV의 N, P, L 및 M2.1 유전자를 코딩하는 헬퍼 플라스미드 및 플라스미드 pRSVX△G로 트랜스펙션하였다. 하기 양의 플라스미드를 첨가하였다: 1.6 ㎍ pRSVX△G, 1.6 ㎍ pcDNA6-A2-N, 1.2 ㎍ pcDNA3-P, 0.4 ㎍ pcDNA6-A2-L, 0.8 ㎍ pcDNA6-A2-M2.1. 32 ℃에서 3-4 시간동안 인큐베이션한 후, 2% FCS를 함유한 Optimem 배지 500 ㎕를 가하고, 세포를 32 ℃에서 3 일간 인큐베이션하였다. 그후, 세포를 스크래핑하고(scraped), 스트래핑 세포와 구조된 바이러스를 함유하는 배지의 혼합물을 사용하여 DMEM + 2% FCS + 페니실린/스트렙토마이신/글루타민에서 증식시킨 베로 또는 Hep-2 세포의 신선 배지를 감염시켰다. 후자의 과정을 4-5회 반복하여 고 역가 바이러스 보존물을 수득하였다.
△G-RSV 분리체 X로 감염된 베로 세포로부터 분리된 RNA에 대해 RT-PCR을 실시하고, 수득한 산물을 제한 부위가 pRSVX△G에 도입된 유일한 제한 효소로 소화 처리하여 △G-RSV 분리체 X 바이러스의 아이덴티티를 확인하였다(도 2). RSV 분리체 X가 대조군으로 사용되었다.
RSV내 서열 마커를 동정하기 위해, 베로 세포를 RSV 분리체 X 또는 △G-RSV 분리체 X로 MOI=0.1로 감염시켰다. 감염 72 시간후, 배양 상등액으로부터의 RNA를 분리하고, RT-PCR 템플레이트로 사용하였다. 재조합 △G-RSV 분리체 X 바이러스내 삽입 서열 마커가 인접하도록 프라이머를 설계하였다. RT-PCR후, 수득한 산물을 적절한 재한 효소로 소화 처리하였다. 하기 소화 산물을 수득하였다(도 3):
a) 프라이머 RSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC) 및 RSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)로 PCR을 실시하고 Mlu-I로 소화 처리하여 RSV 분리체 X에 대해 937 bp이고, △G-RSV 분리체 X에 대해 459 및 478 bp인 예상 단편을 수득하였다.
b) 프라이머 RSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT) 및 RSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)로 PCR을 실시하고 Xma-I로 소화 처리하여 RSV 분리체 X에 대해 880 bp이고, △G-RSV 분리체 X에 대해 656 및 224 bp인 예상 단편을 수득하였다.
c) 프라이머 RSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG) 및 RSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)으로 PCR을 실시하고 SexA-I로 소화 처리하여 RSV 분리체 X에 대해 694 bp이고, △G-RSV 분리체 X에 대해 492 및 202 bp인 예상 단편을 수득하였다.
d) 프라이머 RSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG) 및 RSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)로 PCR을 실시하고 SnaB-I로 소화 처리하여 RSV 분리체 X에 대해 1820 bp이고, △G-RSV 분리체 X에 대해 507 및 387 bp인 예상 단편을 수득하였다.
△G-RSV 분리체 X 및 RSV 분리체 X의 성장 특성을 베로 및 Hep-2 세포에 대해 비교 결정하였다(도 4).
표 III
RSV 감염 베로 세포로부터의 RNA에 대한 진단 RT-PCR을 위해 사용된 프라이머
프라이머 명 서열
RSV065 GTCCATTGTTGGATTTAATC
RSV093 CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC
RSV098 TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG
RSV105 GTTGGATTGAGAGACACTT
RSV112 CCCAGTGAATTTATGATTAG
RSV113 AGTATTAGGCAATGCTGC
RSV114 ATCCCCAAGTCATTGTTCA
RSV160 AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA
실시예 8
재조합 △G+G-RSV 분리체 X 바이러스의 생산방법
트랜스펙션 베로 세포로부터 유래된 △G-RSV 분리체 X 바이러스를 수회 계대배양하여 적어도 105 pfu/㎖(㎖당 플라크 형성 단위)의 역가를 얻었다. 이어서, 이 바이러스를 상이한 moi로 사용하여 RSV-G 단백질을 생산하는 베로 세포주를 감염시켰다. 배지 및/또는 세포로부터 생성된 △G+G-RSV 분리체 X를 수확하고, 면역검출 기술에 따라 비리온내 G 단백질의 존재를 분석하였다. 베로 또는 Hep-2 세포에 대한 감염성 역가를 결정하고, △G+G-RSV 분리체 X 바이러스로 감염된 세포로부터 추출한 바이러스 RNA에 대해 RT-PCR을 실시하여 △G-게놈의 통합성을 결정하였다. 바이러스를 -135 ℃에서 25% 또는 40% 수크로스중에 저장하였다.
실시예 9
목화나무쥐 동물 모델에서 △G-RSV 분리체 X 면역화에 의한 RSV 감염 및 RSV-유도 병리에 대한 보호방법
목화나무쥐(Sigmodon hispidus, 5-6 주령, 그룹당 4-6 마리의 암수 동물)에서 보호 실험을 실시하였다. 최초 실험에서, 이 동물은 Prince, 2001에 기술된 바와 같이, RSV 감염에 대해 감수성이고 중증의 백신-매개 폐 병리를 보이는 것으로 나타났으며, 이는 인간의 상태와 매우 유사한 것이다. RSV의 비강내 적용후, 기관지/세기관지내 및 주변 염증 침윤 및 상피 과다형성으로 폐 병리가 특성화되었다. 포르말린-불활성화된 RSV-A2를 근육내 면역화시킨 후, RSV-A2를 비강내로 적용하였더니 병리가 보다 심각해진 것으로 나타났다. 이와 같은 병리 이외에, 면역-매개 병리 특성인 혈관주위 및 세기관지주위 침윤 및 폐포염이 관찰되었다. 이들 관찰이 모든 면역화 및 적용 실험에 대한 "내부" 기준으로 사용되었다. RSV 제제에 의한 목화나무쥐의 감염 및 면역화를 양 콧구멍에 비강내로 수행하였다. 목화나무쥐의 폐를 병변에 대해 광현미경으로 조사하고, RSV 특이적 ELISA로 CCID50 역가를 구하고, RSV 특이적 abs를 사용한 면역염색화로 pfu 역가를 구하여 적용후 또는 감염/면역화후 상이한 시점에 바이러스 역가를 일련의 폐 균등물 희석액을 사용하여 베로 세포에 대해 결정하였다. △G-RSV 분리체 X로 2회 면역화후, 목화나무쥐는 폐에서 RSV 분리체 X에 의해 야기된 병리 및 감염으로부터 완벽하게 보호되었다. 수회 실시한 실험 결과를 표 IV에 나타내었다.
표 IV
감염: t 1 V 2 감염 5일후 폐 병리 폐 t 3

△G-RSV 5 100 있음, 적당 검출 아래
분리체 X
RSV-A2 5 100 있음, 강력 2*5
RSV 분리체 X 5 100 있음, 강력 4*5
면역일 t 1 V 2 적용일 t 1 V 2 적용 5일후 폐 t 3
0 및 21 42 폐 병리
2×△G-RSV 5 100 RSV 분리체 X 5 100 없음 검출 아래
분리체 X
mock 100 RSV 분리체 X 5 100 있음, 강력 5
1: 바이러스 역가(log pfu/㎖)
2: 동물 한마리당 부피(㎕), 갓 태어난 새끼에게는 각각 이 부피의 반
3: 바이러스 역가(폐 1 g당 log), 검출 한계는 102 CCID50
참조문헌
Figure 112006051614715-pct00001
Figure 112006051614715-pct00002
Figure 112006051614715-pct00003
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서열목록
Figure 112006051614715-pct00005
Figure 112006051614715-pct00006
Figure 112006051614715-pct00007
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Figure 112006051614715-pct00012
Figure 112006051614715-pct00013
Figure 112006051614715-pct00014
Figure 112006051614715-pct00015
Figure 112006051614715-pct00016
SEQUENCE LISTING <110> NVI Nederlands Vaccin Instituut <120> A Respiratory Syncytial Virus with a genomic deficiency complemented in trans <130> P210823 pct <160> 33 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 15213 <212> DNA <213> Human respiratory syncytial virus <400> 1 acgagaaaaa aagtgtcaaa aactaatatc tcgtagttta gttaatatac atataaacca 60 attagatttg ggtttaaatt tattcctcct agatcaaaat gataatttta ggattagttc 120 actagaagtt attaaaaatt atataattat taattttaaa taactataat tgaatacagt 180 gttagtgtgt agccatggga atttttatta taagattttt gttcattatt cattatggaa 240 gttgtataac aaactacctg tgattttaat cagtttttta agttcattgg ttgtcaagct 300 gtttaacaat tcacttagat gaggatatgt agattctacc atatataaat gattatagtt 360 taattctgtt gatctgaaat ttaaaacatg attgaaccac tttaagatgt tcatgtgctt 420 atgatttata agtttattgc tgaaaacttc attacgtcca gctatagaat aagatagtat 480 atctccacta acaacactct ttagtttaga caatgcagta ttaattcctt tttttgttat 540 agggtaacaa agaaagggta tcaaactctt aatatttgca tcaatagact ctttatcagc 600 cttcttaggc atgatgaaat 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cgattaacat cgctaagaac g 41

Claims (19)

  1. G 부착 단백질을 코딩하는 유전자에 결실을 갖거나 이 유전자가 불활성화된 바이러스 게놈을 포함하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 비리온으로서, 이 비리온의 감염성에 필요한 형태와 양으로 G 부착 단백질을 포함하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 비리온.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스 게놈으로부터만 생산된 바이러스는 상기 단백질이 결여된 것인 비리온.
  3. G 부착 단백질을 코딩하는 유전자에 결실을 갖거나 이 유전자가 불활성화된 바이러스 게놈을 포함하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 비리온의 제조 방법으로서, 상기 비리온은 이 비리온의 감염성에 필요한 형태와 양으로 G 부착 단백질을 포함하고, 상기 방법은
    (a) G 부착 단백질을 코딩하는 유전자에 결실을 갖거나 이 유전자가 불활성화된 바이러스 게놈을 포함하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 의해 제1 숙주 세포의 배양물을 감염시키는 단계로서, 상기 숙주 세포는 숙주 세포에서의 비리온의 감염성에 필요한 형태와 양으로 G 부착 단백질의 발현을 지시하는 발현 벡터를 포함하는 것인 단계; 및
    (b) 감염된 숙주 세포 배양물로부터 비리온을 회수하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제1 숙주 세포의 배양물을 감염시키는 데 사용되는 인간 호흡기 세포융합 바이러스가
    (a) 제2 숙주 세포에서의
    (i) G 부착 단백질을 코딩하는 유전자에 결실을 갖거나 이 유전자가 불활성화된 바이러스 게놈 RNA; 및
    (ii) 뉴모바이러스 폴리머라제 효소 복합체
    의 발현을 지시하는 하나 이상의 발현 벡터를 제2 숙주 세포에 제공하는 단계; 및
    (b) 제2 숙주 세포를 배양하여 비리온을 생산하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것인 제조 방법.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 발현 벡터는 제2 숙주 세포에서의 하나 이상의 추가의 바이러스 단백질의 발현을 지시하는 것인 제조 방법.
  6. 제4항에 있어서, 제2 숙주 세포와 동일하거나 상이한 숙주 세포를 이용하는 하나 이상의 추가의 세포 감염 단계에 의해 제2 숙주 세포가 생산한 비리온을 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
  7. 제4항 또는 제6항에 있어서, 상기 바이러스 게놈 RNA가 박테리오파지 DNA 의존성 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절 하에 있는 바이러스 DNA 카피로부터 전사되며, 제2 숙주 세포에 제2 숙주 세포에서의 박테리오파지 DNA 의존성 RNA 폴리머라제의 발현을 지시하는 발현 벡터가 제공되는 것인 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 박테리오파지 DNA 의존성 RNA 폴리머라제가 T7, T3 또는 SP6 폴리머라제인 제조 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 뉴모바이러스 폴리머라제 효소 복합체가 적어도 L, P, N 단백질을 포함하는 것인 제조 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 바이러스 단백질이 뉴모바이러스 매트릭스 막 단백질을 포함하는 것인 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 뉴모바이러스 매트릭스 막 단백질이 M2-1 단백질인 제조 방법.
  12. G 부착 단백질을 코딩하는 유전자에 결실을 갖거나 이 유전자가 불활성화된 바이러스 게놈을 포함하는 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 비리온, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, G 부착 단백질을 코딩하는 전체 서열이 바이러스 게놈으로부터 결실된 것인 약학 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 비리온이 비리온의 감염성에 필요한 형태와 양으로 인간 호흡기 세포융합 바이러스의 G 부착 단백질을 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 비강내 투여를 위한 것인 약학 조성물.
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  18. 삭제
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