CN105517568B

CN105517568B - 防止病毒组分聚集的方法

Info

Publication number: CN105517568B
Application number: CN201480034489.2A
Authority: CN
Inventors: A·G·范特厄维尔; W·A·M·巴克; Y·E·托马森
Original assignee: Nederlanden Volksgezondheid Welzijn en Sport VWS
Current assignee: Intravacc LLC
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2020-07-07
Anticipated expiration: 2034-06-17
Also published as: HUE040108T2; ES2689150T3; BR112015031541A2; DK3010537T3; KR20160019477A; LT3010537T; EP3010537A2; US10080793B2; EP3010537B1; WO2014204303A3; HK1223845A1; PL3010537T3; RS57864B1; PT3010537T; CN105517568A; SI3010537T1; KR102219672B1; HRP20181606T1; WO2014204303A2; US20160184423A1

Abstract

本发明涉及防止和/或减少病毒组分聚集的方法。

Description

防止病毒组分聚集的方法

技术领域

本发明涉及防止和/或减少病毒组分聚集的方法。因此本发明涉及生物制药的生产和配制领域，以及疫苗学领域。

背景技术

聚集是生产(生物)药品(尤其是蛋白质例如单克隆抗体和病毒)中的常见问题。有关蛋白质聚集的更多背景可参考下述综述(Wei Wang,2005)。聚集可与较高的生产/制造损失、不稳定性、保质期减少、给药后副作用、不同免疫原性反应，直至疾病的形成本身(例如阿尔茨海默病、帕金森病(Taylor et al.2002)、朊病毒脑病和亨廷顿病)相关。可通过仔细选择生产过程中所用的缓冲液或培养基来防止聚集(Gu et al.,2003,Cromwell etal.2006)。已知添加化合物例如尿素或胍可稳定蛋白质。然而，这些试剂也影响蛋白质结构和功效。抑制或防止聚集并非总是成功，不得不进行妥协，这可能导致生产、储存期间(相对)较高的产物损失或随时间的功效损失。

还已知在生产病毒组分(例如基于Sabin的灭活脊髓灰质炎病毒)期间发生不希望的聚集，这可能导致病毒(组分)生产中纯化产物回收(产量)的大幅变化。因此需要生产病毒组分的改良方法。

病毒是感染剂，其仅能在活细胞内部复制，根据病毒不同，其可感染不同类型生物体例如动物、植物、细菌和古生菌(Koonin EV et al.2006)。病毒由两种或三种不同部分组成：遗传材料和病毒蛋白包被，有时补充有脂双层膜或包膜。病毒包被由多种蛋白质组成，其形成高度复杂的四级结构，螺旋、二十面体或甚至更复杂的结构。有关病毒的更多背景参见下述参考文件(Fields Virology,2007)。

研究中我们关注脊髓灰质炎病毒和流感病毒分别作为未包膜和包膜病毒的模型。通常，脊髓灰质炎病毒常用作病毒去除验证研究中未包膜RNA病毒的模型，作为小核糖核酸病毒的代表(Millipore技术手册:AN1650EN00,www.bioreliance.com/library/？id＝90,http://www.criver.com/files/pdfs/bps/bp_r_viral_tse-clearance_studies.aspx)。此外，脊髓灰质炎病毒已被良好研究，可获得有关其的大量科技文献，这使得其成为合适的候选。使用不同株系的流感病毒作为包膜病毒的代表。由于变异性(抗原漂移)，流感病毒每年都引起广泛关注。全球都在研究流感病毒，同时病毒负荷使其成为任何疫苗改良的可靠目标。高度变异性使流感病毒成为快速检测本发明针对许多变异进行减少和防止聚集的合适代表，显示出本技术可用于广泛的范围。

脊髓灰质炎还称为脊灰或小儿麻痹，其是由三种相关病毒血清型：脊髓灰质病毒1型、2型和3型引起的感染型病毒疾病。脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。人类中，脊髓灰质炎病毒主要通过粪-口或口-口传播获得。感染后，脊髓灰质炎病毒在胃肠道繁殖，并从该处进入中枢神经系统。此类感染可引起瘫痪。脊髓灰质炎无法治愈。然而，其可通过疫苗预防。现在，市售可得两种安全且有效的脊髓灰质炎疫苗：Oral PolioVaccine(OPV)和Inactivated Polio Vaccine(IPV)。OPV基于脊髓灰质炎病毒的减毒株(所谓Sabin株，以首次开发OPV的Albert Sabin命名)，该疫苗通过口腔途径给予。相反，IPV基于使用纯化的野生型脊髓灰质炎病毒株，其经化学杀伤并通过肌肉内注射给予。IPV由Jonas Salk首次开发[关于脊髓灰质炎和脊髓灰质炎疫苗可得到数篇综述:Koch andKoch,1985；Duchene et al.,1990；Kew et al.2005；Heinsbroek and Ruitenberg,2010]。

两种可得的脊髓灰质炎疫苗(OPV和IPV)均提供高水平的针对麻痹型脊髓灰质炎的保护。因此OPV是全球脊髓灰质炎根除的优秀疫苗选择，因为其具有容易给药和较廉价的优势。然而，一些情况中OPV可引起疫苗相关的麻痹型脊髓灰质炎(VAPP)或可能产生源自疫苗的脊髓灰质炎病毒(VDPV)，一旦成功根除就应优选停止[Kew et al.,2005；Heymann etal.,2005&2006；Chumakov et al.,2007；Nathanson&Kew,2010；Aylward and Tangermann,2011]。这还没有算上OPV可能回复为野生型变体(Lee et al 2012)。因此，越来越需要新型、安全和有效的脊髓灰质炎疫苗。全球根除后脊髓灰质炎接种政策的方向依赖于但不限于IPV的可用性和价格[Heinsbroek and Ruitenberg,2010；Thompson and Tebbens,2012]。

为了在脊髓灰质炎根除后停止使用OPV，以及降低每剂量IPV的成本，采用了许多不同方法。这些方法包括但不限于：a)基于减毒Sabin脊髓灰质炎病毒株的IPV(Sabin-IPV)[Bakker et al.,2011；Hamidi&Bakker,2012]；b)基于新设计的其他脊髓灰质炎病毒种株的IPV[Chumakov et al.,2008；Robinson HL 2008；Hamidi&Bakker,2012]；c)产自有效支持脊髓灰质炎病毒复制的其他哺乳动物细胞的IPV[Hamidi&Bakker,2012；Sanders etal.,2012；Crucell,US0027317,2011]。在所有此类开发中，可通过在上游和下游过程优化(例如更有效地使用生物反应器的生产量)中实施已知方法，以及全面的现代化(例如使用无动物组分的细胞和病毒培养基、一次性滤器等)来实现成本价格降低。

现在，IPV最通常是基于使用三种野生型高毒力株：Mahoney(1型脊髓灰质炎病毒)、MEF-1(2型脊髓灰质炎病毒)和Saukett(3型脊髓灰质炎病毒)。脊髓灰质炎病毒在哺乳动物细胞培养物中分别生长。随后，数个纯化步骤后，用福尔马林(甲醛)灭活脊髓灰质炎病毒，之后其可与最终所需的制剂混合并填充。

流感病毒引起急性呼吸道感染，具有显著的患病率和死亡率。流行性最广的是学龄儿童。小孩、年长者和患有肺和心脏疾病、糖尿病或严重哮喘的人有患严重流感的风险。临床上，流感包括伴随肌痛、头疼和咳嗽的急性发热性疾病。

虽然已知流感达数个世纪，仍长期不知晓其致病剂。首例人类流感病毒于1933年分离。

该病毒可在含胚蛋上增殖(仍为常见实践方法，之后补充了在细胞培养物中生长病毒的能力)，显著方便了对病毒的研究能力。

流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的RNA病毒，其由脂质包膜围绕的八区段RNA组成。包膜上存在两种主要蛋白质(抗原)：神经氨酸酶(NA/N)和血凝素(HA/H)。血凝素是蛋白质，其将病毒与呼吸道上皮的细胞结合，随后将病毒膜和上皮细胞膜融合，允许细胞进入。神经氨酸酶是病毒酶，其促进新产生的病毒颗粒从感染细胞中释放。

除了人之外，流感病毒还可感染广范围的动物种类，与人最相关的为鸟和猪，这是因为这些物种的病毒通常也可感染人类。流感病毒的显著特征是变异性。变异性由免疫选择驱动，表明病毒会不断尝试躲避宿主的免疫。这可通过逐步突变其抗原(称为抗原漂移)或通过与相关株系交换编码抗原的整个RNA区段(抗原转移)来实现。免疫选择涉及针对表面抗原的抗体应答，和涉及较低程度的T细胞应答，其主要针对内部蛋白质。

由于抗原漂移，针对季节性流感的新疫苗需要每年生产，其包括每个季度中循环病毒株上表达的抗原。抗原转移或一系列的抗原漂移突变可能引起大流行。针对大流行爆发保护需要使用新开发的含大流行病毒所表达抗原的有力疫苗。

如本文所述，发明人鉴定到生产病毒组分和含所述病毒组分的改良组合物的改良方法，其中聚集得到防止或减少。

发明内容

本发明的第一方面涉及生产包含肠道病毒颗粒组合物的方法，所述方法包括步骤：a)制备含肠道病毒颗粒的培养基；b)从培养基中纯化所述肠道病毒颗粒，其中在纯化的至少部分期间存在碱性氨基酸或其衍生物，其浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集；和任选地下述步骤的至少一个：c)灭活所述肠道病毒颗粒；和d)配制所述肠道病毒颗粒，其中所述碱性氨基酸或其衍生物选自：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、胍基丁胺、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、N-ε-甲酰基-L-赖氨酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸、二盐酸α-甲基-DL-组氨酸、其盐及其组合。

优选在所述方法中，在步骤c)的至少部分期间存在碱性氨基酸或其衍生物，其浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集，且其中任选地，在步骤d)期间也存在浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的碱性氨基酸或其衍生物以配制药物组合物，所述药物组合物含所述肠道颗粒和任选的足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的浓度的碱性氨基酸或其衍生物。

更优选地，所述方法中优选的在步骤b)、c)和d)的至少一个的整个期间维持所述碱性氨基酸或其衍生物的浓度，所述浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集。

根据本发明的方法中，碱性氨基酸或其衍生物的浓度优选为至少0.01mM、优选为0.01-1000mM的范围。

根据本发明的方法中，肠道病毒颗粒优选为选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、埃可病毒和肠道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒。更优选地，肠道病毒颗粒包含脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3。在一个实施方式中，肠道病毒颗粒优选为肠道病毒的病毒样颗粒。

本发明方法中，包含肠道病毒颗粒的组合物优选为疫苗。更优选地，所述疫苗是灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

本发明还涉及使用选自下组的碱性氨基酸或其衍生物：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、胍基丁胺、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、N-ε-甲酰基-L-赖氨酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸、二盐酸α-甲基-DL-组氨酸、其盐及其组合，用于防止或减少肠道病毒颗粒的聚集，其中优选地所述肠道病毒颗粒为选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、埃可病毒、鼻病毒和肠道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒，更优选地，所述肠道病毒颗粒是血清型1、2和3中至少一种的脊髓灰质炎病毒，最优选地，所述肠道病毒颗粒是灭活脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

本发明另一方面涉及包含病毒的病毒颗粒和碱性氨基酸或其衍生物的组合物，所述病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)或正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，所述碱性氨基酸或其衍生物选自：精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、胍基丁胺、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、N-ε-甲酰基-L-赖氨酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸、二盐酸α-甲基-DL-组氨酸、其盐及其组合，其中：a)组合物中碱性氨基酸或其衍生物的总浓度高于培养基中存在的碱性氨基酸或其衍生物的总浓度；b)所述组合物不含缓冲液，且优选不含酚红；和/或，c)所述组合物基本由病毒颗粒、碱性氨基酸或其衍生物和任选地，水或其他液体运载体组成，所述碱性氨基酸或其衍生物的总浓度为至少0.01mM。优选在组合物中，相比不含所述碱性氨基酸或其衍生物的对应组合物中病毒聚集体的形成，所述组合物中病毒聚集体的形成减少。

本发明另一方面涉及上述组合物用作药物。

发明详述

我们惊奇地发现碱性氨基酸(例如精氨酸)和其数种衍生物可用于在疫苗生产的不同病毒(包膜(即流感病毒)和未包膜(即脊髓灰质炎病毒))过程中以及(中间)病毒产物储存期间防止聚集形成，并用于溶解(分散/分解)已经形成的聚集体。这些病毒源自不同培养系统(流感病毒的含胚蛋和脊髓灰质炎病毒的细胞培养基)。因此，已实现显著更高的病毒生产回收率和/或更好地移除污染物而保持生物活性产物。这种更高的病毒产量是无法预见的，其提供了超出已知病毒纯化方法的显著经济优势。

先前显示将碱性氨基酸防止聚集用于单克隆抗体(Arakawa T,et al,2004；US2012264918)and proteins(Baynes BM,2004 and 2005)。然而其未在高度复杂的四级蛋白质结构例如病毒中得到佐证。Clostridium Toxoid(US 2011/0045025)的案子中，精氨酸甚至促进聚集。

此外，还显示碱性氨基酸例如精氨酸具有杀病毒活性(Yamasaki H,et al,2008；Utsunimoya H,et al,2009；Arakawa T,et al,2009)，使其不可能作为用于病毒和病毒组分加工期间的物质。

使用碱性氨基酸抑制正常蛋白质聚集的方法已被鉴定。本发明中，我们发现可针对由数种不同蛋白质“嵌段”组成(多蛋白质/多亚基结构)并形成稳定四级结构(本案中为病毒疫苗或生物复合物)的高度复杂结构的聚集进行抑制、减少和/或防止。本领域技术人员理解一些蛋白质单独形成三级结构，一些情况中可通过碱性氨基酸稳定化。然而，病毒由多种这些(不同)四级结构一起组成并键合/集合以形成具有螺旋、二十面体或甚至更复杂结构的(临时)/稳定产物(四级结构)。本发明测试的病毒之一具有此类复杂结构，因其由膜包封组成。病毒与正常复杂(生物)四级蛋白质结构不同，其能通过利用宿主细胞而复制并繁殖/再生自身并可通过自然选择进行进化(Holes EC 2007；Taylor DJ,et al 2013)。此外一些病毒具有形成用于转运基因组材料至宿主细胞中的特定结构的能力(Sun L,et al2014)或被其他病毒(所谓噬菌体)寄生的能力(Pearson H,2008；and Desnues,C,et al2010)。

包膜和未包膜病毒进入细胞都需要细胞受体和病毒包被或包膜之间的相互作用。其对某些宿主细胞特异，类似钥匙和锁。该病毒四级结构需要维持在正确的构型/结构(部分形成所述病毒包被)，因其初始功能是在细胞间传递中保护基因组(例如免受热、pH、UV等)以及结合至易感宿主细胞，在实体内部或从外部环境进入完全新的个体/宿主实体。

考虑病毒组分的结构的复杂性、工作量和复杂度，本领域技术人员无法预见使用碱性氨基酸能防止或减少聚集同时病毒结构保持完整并且感染型、特异性和免疫原性得到保留。

因此，在第一方面，本发明涉及防止和/或减少病毒组分聚集的方法，包括使用碱性氨基酸或其衍生物或其混合物。防止和/或减少病毒组分聚集的方法优选用于生产含病毒组分的组合物的方法或其部分中。

碱性氨基酸或其衍生物

碱性氨基酸可为药学上可接受的任何D-或L-氨基酸。碱性氨基酸可为氯化物的形式(例如结合一个或多个盐酸盐)或其他偶联化学形式。该氨基酸包括3个标准“蛋白性”或“天然”氨基酸：组氨酸、精氨酸、赖氨酸及其衍生物。组氨酸、精氨酸和/或赖氨酸可为光学D-或L-异构体或其混合物，虽然优选氨基酸为L-异构体。

碱性氨基酸的衍生物可为本领域技术人员可以合成的任何衍生物形式：参见例如：

http://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemistryproducts.html？TablePage＝1625523或Sigma Aldrich的“氨基酸衍生物”产品目录或其他任何商业来源。

碱性氨基酸的衍生物可为组氨酸、精氨酸或赖氨酸的手性或异构形式。碱性氨基酸的衍生物可为组氨酸、精氨酸或赖氨酸的代谢产物。优选的赖氨酸衍生物选自：氨甲环酸、N-ε-甲酰基-L-赖氨酸和赖氨酸的单或二盐酸盐例如DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯。优选的精氨酸衍生物选自：N-α-乙酰基-L-精氨酸、胍基丁胺、胍基丁胺硫酸盐和精氨酸的单或二盐酸盐例如二盐酸L-精氨酸乙基酯。优选的组氨酸衍生物选自：3-甲基-L-组氨酸和组氨酸的单或二盐酸盐例如二盐酸α-甲基-DL-组氨酸。

在优选的实施方式中，碱性氨基酸或其衍生物选自：L-精氨酸、D-精氨酸、L-赖氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸的手性/异构/外消旋形式、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、精氨酸、赖氨酸、组氨酸的代谢产物、N--乙酰L-精氨酸、胍基丁胺、胍基丁胺硫酸盐、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、N-ε-甲酰基-L-赖氨酸、赖氨酸单盐酸盐、组氨酸单盐酸盐、精氨酸单盐酸盐、赖氨酸二盐酸盐、组氨酸二盐酸盐、精氨酸二盐酸盐、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸盐L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸和二盐酸α-甲基-DL-组氨酸、精氨酸-谷氨酸、精氨酸-乙酸、精氨酸-天冬氨酸盐、精氨酸-硫酸盐、赖氨酸-谷氨酸盐、赖氨酸-乙酸盐、组氨酸-乙酸盐、丁酰基-L-精氨酸、Nα-椰油酰-L-精氨酸乙基酯、盐酸N-[3-烷基(12,14)氧-2-羟丙基]-L-精氨酸、L-精氨酸椰酸酯。还涵盖碱性氨基酸或其衍生物可与盐形式组合，所述盐形式例如精氨酸-谷氨酸，精氨酸-乙酸，精氨酸-天冬氨酸等。

碱性氨基酸或其衍生物可加入含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中，获得范围为0.01-1000mM或0.015-1000mM的终浓度，或至少0.01、0.015、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、81、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000mM和/或少于1000mM、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、490、480、470、460、450、440、430、420、410、400、390、380、370、360、350、340、330、320、310、300、290、280、270、260、250、240、230、220、210、200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、1、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.1、0.05、0.015或0.01mM。若多于一种不同碱性氨基酸或其衍生物存在于所述组合物或溶液中(如本文下述)，上述鉴定的浓度表示碱性氨基酸或其衍生物的总浓度。若仅使用一种碱性氨基酸或其衍生物，则碱性氨基酸或其衍生物的总浓度与所述氨基酸的浓度同义。应理解碱性氨基酸或其衍生物可作为添加剂(还称为赋形剂、助溶剂、共溶质)、作为固体(待溶于混合物)、作为(浓缩的)水性溶液加入含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中，所述水性溶液是在水中或缓冲液中或针对含有所述碱性氨基酸或其衍生物的水或缓冲液通过例如透析来交换而获得。

根据病毒特性，本领域技术人员可调节浓度达到所需的防止或减少聚集的效果。例如，对于脊髓灰质炎病毒来说，碱性氨基酸或其衍生物的浓度优选不超过100mM或不超过150mM。

优选的碱性氨基酸是精氨酸，更优选L-精氨酸。含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中的L-精氨酸的优选浓度为0.01-1000mM、0.015-1000mM、0.05-1000mM、0.1-1000mM、0.5-1000mM、0.8-1000mM、1-1000mM、0.1-900mM、0.8-900mM、1-900mM、0.1-800mM、0.8-800mM、0.1-700mM、0.5-700mM、1-600mM、5-500mM、10-400mM、15-300mM、20-200mM、25-200mM、30-200mM、35-200mM、40-200mM、45-200mM、50-300mM、或70-250mM。在脊髓灰质炎病毒的情况中150mM获得良好结果，流感病毒的情况中350mM获得良好结果。

精氨酸的优选衍生物或产物是胍基丁胺。含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中的胍基丁胺的优选浓度为0.01-1000mM、0.015-1000mM、0.05-1000mM、0.1-1000mM、0.5-1000mM、0.8-1000mM、1-1000mM、0.1-900mM、0.8-900mM、1-900mM、0.1-800mM、0.8-800mM、0.1-700mM、0.5-700mM、1-600mM、5-500mM、10-400mM、15-300mM、20-200mM、25-200mM、30-200mM、35-200mM、40-200mM、45-200mM、50-300mM、或70-250mM。100mM和25mM获得良好结果。

优选的另一碱性氨基酸是赖氨酸，更优选L-赖氨酸。含病毒组分和其聚集体的组合物或溶液中的L-赖氨酸的优选浓度为0.01-1000mM、0.015-1000mM、0.05-1000mM、0.1-1000mM、0.5-1000mM、0.8-1000mM、1-1000mM、0.1-900mM、0.8-900mM、1-900mM、0.1-800mM、0.8-800mM、0.1-700mM、0.5-700mM、1-600mM、5-500mM、10-400mM、15-300mM、20-200mM、25-200mM、30-200mM、35-200mM、40-200mM、45-200mM、50-300mM、或100-250mM。150mM和75mM获得良好结果。

含碱性氨基酸或其衍生物的溶液优选为中性pH，例如范围为6.0-8.0或6.5-7.5的pH，或约7.0的pH。更优选地，所述溶液的pH低于所用碱性氨基酸的的pH。该溶液优选包含缓冲液以维持pH在所示值。原则上，溶液中可使用任何药学上可接受的缓冲液，其优选在所示pH值范围中具有有效缓冲能力。缓冲液优选以0.5-100mM的浓度存在，更优选1-75mM，最优选2-40mM，例如20或40mM。

用于溶液中的合适缓冲液包括但不限于McIlvaine缓冲液(0.1M柠檬酸和0.2M磷酸氢二钠的混合物)、柠檬酸盐缓冲液、磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液和组氨酸缓冲液。

更优选地，本文所用各碱性氨基酸或其衍生物优选缓冲至pH7。更优选所述缓冲液是浓度为20或40mM的磷酸缓冲液。

然而，本发明还涵盖不需要缓冲液或无缓冲液的情况。该情况中，所述组合物或溶液包含下述成分或由其组成：病毒组分和本文限定的碱性氨基酸或其衍生物且不含其它缓冲液。优选所述组合物或溶液由病毒组分和本文限定的碱性氨基酸组成。

本发明涵盖如下内容：多于一种碱性氨基酸和/或多于一种其衍生物用于本发明方法中，以防止和/或减少病毒组分的聚集。碱性氨基酸的优选组合是含精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组合。本发明还涵盖在本发明方法的给定步骤(即上游加工、下游加工步骤、灭活步骤和/或配制步骤)中使用给定碱性氨基酸或其衍生物以及在该相同方法的其他步骤中使用不同碱性氨基酸或其衍生物。例如胍基丁胺可加入浓缩材料中，而精氨酸可在下游纯化步骤中使用，例如色谱步骤中。

可在所述方法的任何步骤期间添加或存在碱性氨基酸，且其可以但不必须在所述方法的所有步骤期间存在。需要时，通过过滤、色谱或透析，碱性氨基酸可容易地被移除或替换(参见实施例6)。

病毒组分

本文所用“病毒组分”表示生物学剂，在将其以优选药学上可接受的形式施用于哺乳动物(尤其是人)时具有生理活性或激活生理相应。病毒组分可由宿主生物体生产或可从其获得，所述宿主生物体例如动物、植物、细菌或真菌。病毒组分可为基于蛋白的试剂、即包含蛋白质材料(例如蛋白质、多肽和肽)的试剂。病毒组分还可包含或由核酸组成，所述核酸例如DNA、RNA或核酸类似物。病毒组分还可包含膜脂质例如OMV’s、脂质体、病毒体。

优选的病毒组分包含或病毒或病毒体或由其组成，优选感染哺乳动物的病毒，优选感染人类的病毒。所述病的可为包膜病毒但优选未包膜病毒。应理解本文术语“病毒”或“病毒组分”包括天然存在(例如天然分离物)的野生型以及“人工”减毒、突变、嵌合、假型和缺陷型病毒。术语“病毒”或“病毒组分”还包括重组病毒，即用重组DNA技术构建的病毒，例如缺陷型病毒，例如缺少(部分)一种、多种或所有病毒基因，以及基因治疗载体，其中部分基因组由一种或多种感兴趣的基因替代。

优选实施方式中，病毒组分是病毒颗粒。本发明所用术语“病毒颗粒”包括完整病毒体以及病毒样颗粒，其大小和/或衣壳组分与对应野生型病毒体相同或相似，但不含完整病毒基因组或不含核酸和/或缺少病毒核心蛋白(例如核蛋白)(的全部补体)。

本发明方法和组合物可用的病毒组分优选来自病毒，所述病毒选自小核糖核酸病毒和负链ssRNA病毒，包括正粘病毒和副粘病毒。

优选的小核糖核酸病毒是肠道病毒。

肠道病毒是小核糖核酸病毒科的成员，其为一较大且变异多的小RNA病毒组，特征为单正链基因组RNA。所有肠道病毒都含约7500碱基的基因组，且已知具有高突变率，这是由于其低保真度复制和频繁重组。感染宿主细胞后，所述基因组以加帽非依赖方式翻译为单一多蛋白，随后通过病毒编码的蛋白酶加工为结构衣壳蛋白和非结构蛋白，其主要参与病毒复制。肠道病毒属包括下属12个种：肠道病毒A(以前称为人类肠道病毒A)、肠道病毒B(以前称为人类肠道病毒B)、肠道病毒C(以前称为人类肠道病毒C)、肠道病毒D(以前称为人类肠道病毒D)、肠道病毒E(以前称为牛肠道病毒组A)、肠道病毒F(以前称为牛肠道病毒组B)、肠道病毒G(以前称为猪肠道病毒B)、肠道病毒H(以前称为猿肠道病毒A)、肠道病毒J、鼻病毒A(以前称为人类鼻病毒A)、鼻病毒B(以前称为人类鼻病毒B)和鼻病毒C(以前称为人类鼻病毒C)。这12个种之内是如下血清型：

柯萨奇病毒：

-血清型CV-A2、CV-A3、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A7、CV-A8、CV-A10、CV-A12、CV-A14和CV-A16(肠道病毒A种下发现)。

-血清型CV-B1、CV-B2、CV-B3、CV-B4、CV-B5、CV-B6和CV-A9(肠道病毒B种下发现)。

-血清型CV-A1、CV-A11、CV-A13、CV-A17、CV-A19、CV-A20、CV-A21、CV-A22和CV-A24(肠道病毒C种下发现)。

艾柯病毒：

-血清型E-1、E-2、E-3、E-4、E-5、E-6、E-7、E-9、E-11、E-12、E-13、E-14、E-15、E-16、E-17、E-18、E-19、E-20、E-21、E-24、E-25、E-26、E-27、E-29、E-30、E-31、E-32、和E-33(肠道病毒B种下)。

肠道病毒:

-EV-A71、EV-A76、EV-A89、EV-A90、EV-A91、EV-A92、EV-A114、EV-A119、SV19、SV43、SV46和BA13型(肠道病毒A种下发现)。

-EV-B69、EV-B73、EV-B74、EV-B75、EV-B77、EV-B78、EV-B79、EV-B80、EV-B81、EV-B82、EV-B83、EV-B84、EV-B85、EV-B86、EV-B87、EV-B88、EV-B93、EV-B97、EV-B98、EV-B100、EV-B101、EV-B106、EV-B107、EV-B110和SA5型(肠道病毒B种下发现)。

-typesEV-C95、EV-C96、EV-C99、EV-C102、EV-C104、EV-C105、EV-C109、EV-C116、EV-C117和EV-C118(肠道病毒C种下发现).

-typesEV-D68、EV-D70、EV-D94、EV-D111和EV-D120(肠道病毒D种下发现).

-types:EV-H1(肠道病毒H种下发现).

-types:SV6、EV-J103、EV-J108、EV-J112、EV-J115和EV-J121(肠道病毒J种下发现).

人类鼻病毒:

-HRV-A1、HRV-A2、HRV-A7、HRV-A8、HRV-A9、HRV-A10、HRV-A11、HRV-A12、HRV-A13、HRV-A15、HRV-A16、HRV-A18、HRV-A19、HRV-A20、HRV-A21、HRV-A22、HRV-A23、HRV-A24、HRV-A25、HRV-A28、HRV-A29、HRV-A30、HRV-A31、HRV-A32、HRV-A33、HRV-A34、HRV-A36、HRV-A38、HRV-A39、HRV-A40、HRV-A41、HRV-A43、HRV-A44、HRV-A45、HRV-A46、HRV-A47、HRV-A49、HRV-A50、HRV-A51、HRV-A53、HRV-A54、HRV-A55、HRV-A56、HRV-A57、HRV-A58、HRV-A59、HRV-A60、HRV-A61、HRV-A62、HRV-A63、HRV-A64、HRV-A65、HRV-A66、HRV-A67、HRV-A68、HRV-A71、HRV-A73、HRV-A74、HRV-A75、HRV-A76、HRV-A77、HRV-A78、HRV-A80、HRV-A81、HRV-A82、HRV-A85、HRV-A88、HRV-A89、HRV-A90、HRV-A94、HRV-A95、HRV-A96、HRV-A98、HRV-A100、HRV-A101、HRV-A102和HRV-A103型(鼻病毒A种下发现)。

-typesHRV-B3、HRV-B4、HRV-B5、HRV-B6、HRV-B14、HRV-B17、HRV-B26、HRV-B27、HRV-B35、HRV-B37、HRV-B42、HRV-B48、HRV-B52、HRV-B69、HRV-B70、HRV-B72、HRV-B79、HRV-B83、HRV-B84、HRV-B86、HRV-B91、HRV-B92、HRV-B93、HRV-B97、和HRV-B99型(鼻病毒B种下发现)。

-HRV-C1、HRV-C2、HRV-C3、HRV-C4、HRV-C5、HRV-C6、HRV-C7、HRV-C8、HRV-C9、HRV-C10、HRV-C11、HRV-C12、HRV-C13、HRV-C14、HRV-C15、HRV-C16、HRV-C17、HRV-C18、HRV-C19、HRV-C20、HRV-C21、HRV-C22、HRV-C23、HRV-C24、HRV-C25、HRV-C26、HRV-C27、HRV-C28、HRV-C29、HRV-C30、HRV-C31、HRV-C32、HRV-C33、HRV-C34、HRV-C35、HRV-C36、HRV-C37、HRV-C38、HRV-C39、HRV-C40、HRV-C41、HRV-C42、HRV-C43、HRV-C44、HRV-C45、HRV-C46、HRV-C47、HRV-C48、HRV-C49、HRV-C50和HRV-C51型(鼻病毒C种下发现)。

脊髓灰质炎病毒:

-血清型PV-1、PV-2、和PV-3(肠道病毒C种下发现)。

优选的肠道病毒包括柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、艾柯病毒和肠道病毒68、69、70、71和73(例如EV-D68、EV-B69、EV-D70和EV-A71型)。最优选病毒为脊髓灰质炎病毒。病毒组分可包括脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3的一种或多种，但优选所述病毒组分包含所有三种脊髓灰质炎病毒血清型1、2和3。合适的血清型1脊髓灰质炎病毒株系包括但不限于Sabin1、Mahoney、Brunenders、Brunhilde、CHAT和Cox株系的一种或多种。合适的血清型2脊髓灰质炎病毒株系包括但不限于Sabin 2、MEF-1和Lansing株系的一种或多种。合适的血清型3脊髓灰质炎病毒株系包括但不限于Sabin 3、Saukett H和G和Leon株系的一种或多种。优选的实施方式中，病毒组分是或包括三价灭活脊髓灰质炎疫苗，例如Salk-IPV，其针对1型包含灭活的脊髓灰质炎病毒Mahoney株、针对2型包含灭活的脊髓灰质炎病毒MEF-1株且针对3型包含灭活的脊髓灰质炎病毒Saukett株，或者例如sIPV，其包含灭活的脊髓灰质炎病毒Sabin-1、-2和-3株系(van Wezel et al,1978；Montagnon et al,1983&1984)。VLP(病毒样颗粒)页涵盖在本发明范围中。

在其他实施方式中，病毒是负链ssRNA病毒(Mononegavirales)。负链ssRNA病毒包括下述病毒：

玻那病毒科(Bornaviridae):

玻那病毒属(Bornavirus) 玻那病病毒

弹状病毒科(Rhabdoviridae):

弹状病毒属(Vesiculovirus) 印第安纳州水泡性口炎病毒

狂犬病病毒属(Lyssavirus) 狂犬病病毒

短暂热病毒属(Ephemerovirus) 牛暂时热病毒

粒外弹状病毒属(Novirhabdovirus) 传染性造血组织坏死病病毒

纤丝病毒科(Filoviridae):

马尔堡病毒属(Marburgvirus) 维多利亚湖马尔堡病毒

埃博拉病毒属(Ebolavirus) 伊尔埃博拉病毒

副粘病毒科(Paramyxoviridae):

副粘病毒亚科(Paramyxovirinae):

腮腺炎病毒属(Rubulavirus) 流行性腮腺炎病毒

禽副粘病毒属(Avulavirus) 新城疫病毒

呼吸道病毒属(Respirovirus) 仙台病毒

亨尼帕病毒属(Henipavirus) 亨德拉病毒

麻疹病毒属(Morbillivirus) 麻疹病毒

肺炎病毒亚科(Pneumovirinae):

肺炎病毒属(Pneumovirus) 人呼吸道合胞病毒

偏肺病毒属(Metapneumovirus) 禽流感偏肺病毒

正粘病毒科(Orthomyxoviridae):

甲型流感病毒属(Influenzavirus A) 甲型流感病毒

乙型流感病毒属(Influenzavirus B) 乙型流感病毒

丙型流感病毒属(Influenzavirus C) 丙型流感病毒

托高土病毒属属(Thogotovirus) 托高土病毒

鲑传贫病毒属(Isavirus) 传染性鲑鱼贫血病毒

布尼亚病毒科(Bunyaviridae):

正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus) 布尼安维拉病毒

汉坦病毒属(Hantavirus) 汉坦病毒

内罗病毒属(Nairovirus) 达格毕病毒

白蛉病毒属(Phlebovirus) 裂谷热病毒

沙粒病毒科(Arenaviridae):

沙粒病毒属(Arenavirus) 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒

优选的负链ssRNA病毒是属于副粘病毒科或正粘病毒科的病毒。副粘病毒科的优选病毒是如上所列的属于副粘病毒属或肺炎病毒亚科的病毒。优选的肺炎病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)，更优选人或牛RSV。人RSV可为亚组A或B病毒，优选为临床分离物，更优选为体外未充分传代的分离物(优选传代少于10、8、6或5次)。优选(人或牛)RSV病毒是病毒基因组的病毒，其中所述病毒基因组含有缺失或失活的G附着蛋白质基因，例如在其病毒基因组中具有突变从而病毒基因组不编码功能性G附着蛋白质，例如WO 2005/061698和Widjojoatmodjo et al,2010所述的RSVΔG和RSVΔG+G病毒体。副粘病毒亚科的优选病毒包括腮腺炎病毒属(流行性腮腺炎病毒)和麻疹病毒属(麻疹病毒)。

在其他实施方式中，病毒组分时正粘病毒科的病毒或病毒体。优选的正粘病毒是流感病毒。流感病毒可为流感病毒A、B或C属的流感病毒，其中A最优选。优选的流感病毒A病毒亚型包括H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7，包括2009年大流行猪源流感病毒A(H1N1)病毒(SOIV或H1N1v)。

病毒组分优选以每毫升1x 10⁰-7x 10¹⁶活和/或死或灭活颗粒的量存在于组合物或溶液中。活颗粒的数量通过例如空斑形成单位、细胞培养物或组织培养物50％感染剂量(CCID₅₀或TCID₅₀)和其他合适的病毒学试验确定，用于确定病毒组分的效价。死或灭活颗粒的数量通过定量抗原含量的试验确定，例如蛋白质试验、或确定血凝集单位或脊髓灰质炎D抗原或N抗原单位的试验来。优选所述病毒组分以下述含量存在于所述组合物或溶液中：每毫升至少1x 10¹、1x 10²、1x 10³、1x 10³、1x 10⁴、1x 10⁵、1x 10⁶、1x 10⁷、1x 10⁸、1x 10⁹or1x 10¹⁰1x 10¹¹、1x 10¹²、1x 10¹³活和/或死或灭活颗粒，和/或多至每毫升7x 10¹⁶、1x 10¹⁶、1x 10¹⁵活和/或死或灭活颗粒。

所述组合物或溶液中病毒组分的含量还可表达为溶液的每毫升所述病毒组分的重量。优选溶液中所述病毒组分的重量/ml数为1fg/ml-10g/ml。更优选地，所述组合物或溶液中病毒组分以下述量存在：至少10^-15、10^-14、10^-13、10^-12、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4、g/ml和/或多至10^-3、10^-2、10^-1、或10⁰g/ml。所述组合物或溶液中所述病毒组分的重量可通过本领域已知方法确定，包括例如蛋白质试验。因此上述生物药物试剂的重量还可表达为每毫升蛋白质克数，以确定合适的蛋白质试验(例如Bradford试验；Zor andSelinger,1996)。

优选实施方式中，组合物或溶液中存在的病毒组分为或包括脊髓灰质炎病毒，所述组合物或溶液中脊髓灰质炎病毒的量优选为至少0.01,0.1,1.0,或10DU/ml和多至10.000,1.000或100DU/ml，其中1DU如WHO建议所述进行限定(TRS,N0980,目录2,2014)World Health Organization WHO Technical Report series,Recommendations for theproduction and control of poliomyelitis vaccine(inactivated)或者其中1DU用Westdijk et al.2011或Ten Have et al.2012所述的ELISA限定或确定。在一个实施方式中，含所述病毒组分的组合物或溶液是或包含疫苗，优选多价脊髓灰质炎病毒(疫苗)，应理解各脊髓灰质炎病毒血清型以至少0.01,0.1,1.0,或10DU/ml和多至10.000、1.000或100DU/ml的量存在。

优选实施方式中，组合物或溶液中存在的病毒组分是或包含RSV。更优选地，所述组合物或溶液中的RSV含量至少为1x 10¹、1x 10²、1x 10³、1x 10³、1x 10⁴TCID₅₀/ml且多至7x 10¹⁶、1x 10¹⁶、1x 10¹⁵、1x 10¹⁴TCID₅₀/ml，其中RSV的TCID₅₀根据Widjojoatmodjo etal.2010所述进行限定和确定。

聚集

根据本发明内容，聚集表示组分之间的相互作用，此处为病毒组分(例如病毒颗粒)之间。然而，聚集还涵盖病毒颗粒和组合物或溶液中存在的材料之间的聚集，所述材料例如杂质如宿主细胞蛋白。此类相互作用可为共价或非共价、可溶或不溶性、可逆或不可逆。聚集可在生产病毒组分的方法中任何步骤发生：培养步骤、纯化步骤、灭活和/或配置步骤。聚集还可在病毒组分一产生时即发生。如此形成的聚集作为颗粒存在，当前的指导限制了最终许多(生物)药物中所能允许的颗粒数量(美国和欧洲药典)。

组合物或溶液中的病毒组分可以可溶颗粒存在(如上所述的活、死或减毒的)。病毒组分还可作为所述组合物或溶液中的聚集物存在。通常病毒组分的此类聚集物应移除。组合物或溶液中存在含病毒组分的聚集物可通过对反射或投射性质与某一波长之间的函数关系进行定量来直接评估。波长范围200-1000nm。通常选择450或590nm。光密度优选如实施例3中进行评估。光密度降低表明光散射减弱，这对应于积聚减少。

或者，含病毒组分的组合物或溶液中存在的聚集物可通过测量浊度(FTU/NTU)、区域流体分配、电子显微镜或光散射例如DLS或MALS来进行评估。市售可试剂盒，其可针对具体应用进行调整(例如ProteoStat from Enzo life science part#ENZ-51023-KP002的ProteoStat)。

或者，含病毒组分的组合物或溶液中存在的聚集物可通过使用尺寸排阻色谱或非变性条件下的凝胶电泳来进行评估，其中产物和聚集物在柱上或凝胶平板上分离并定量，或利用上述技术的组合(Li Y,2009)。关于聚集检测的分析技术更过背景参见下述综述DasTK 2012和/或Wei Wang,2005。

功能基团的可用性可通过例如ELISA或生物传感器试验进行评估，其中测量中的增加对应于聚集减少。对于脊髓灰质炎病毒来说，先前已公开基于D-抗原表位的快速ELISA试验(ten Have et al.2012)。D-抗原含量的增加表明可利用/可获得更多表位用于测量，这表明聚集减少。

本文中，聚集减少、防止或降低可表示：

-光密度(例如590nm处)降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多，和/或

-D-抗原含量增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多。

所述光密度降低或D抗原含量的增加优选通过与具有下述特征的含病毒组分的组合物或溶液中存在的聚集物的含量进行比较来评估(通过评估例如光密度或D抗原含量)，其中所述特征为：

-未添加碱性氨基酸或其衍生物或

-通过不添加碱性氨基酸或其衍生物的方法生产或获得或

-碱性氨基酸或其衍生物的总浓度小于0.01mM。

含病毒组分的组合物或溶液优选光学或视觉透明，表明多数材料在溶液中且几乎不存在聚集物。更优选含组分的所述组合物或溶液光学或视觉透明持续至少1、2、3个月。

碱性氨基酸可通过本领域已知的方法检测，包括例如分光光度法、荧光法、HPLC、NMR和质谱。

生产含病毒组分的组合物的方法

本发明的防止和/或减少病毒组分聚集的方法的优选实施方式中，所述方法用于生产含病毒组分的组合物的方法，或作为该方法的一部分。因此，该实施方式涉及生产含病毒组分的组合物的方法，其中所述方法包括下述步骤：a)制备含病毒组分的培养基；b)从培养基中纯化所述病毒组分，其中在纯化的至少部分期间碱性氨基酸或其衍生物以足以防止或减少所述病毒组分聚集的浓度存在；和任选地下述步骤至少之一：c)灭活所述病毒组分；和d)配制所述病毒组分，其中所述碱性氨基酸或其衍生物如前所定义。

所述过程中优选所述碱性氨基酸或其衍生物在纯化步骤b)中或其整个期间保持浓度，所述浓度足以防止或减少病毒组分聚集。更优选所述碱性氨基酸或其衍生物还在至少部分步骤c)和/或步骤d)期间以足以防止或减少病毒组分聚集的浓度存在。更优选所述碱性氨基酸或其衍生物还在步骤c)和/或步骤d)中或其整个期间以足以防止或减少病毒组分聚集的浓度保持。碱性氨基酸或其衍生物适于防止或减少病毒组分聚集的浓度如上所示。

优选所述过程中病毒组分是如上所述的肠道病毒的组分。更优选所述病毒组分是如上所述的肠道病毒颗粒，即肠道病毒的病毒颗粒，包括病毒样颗粒。

本文定义的病毒组分和颗粒通常在多步骤过程中使用。所述过程可包括下述步骤：

a)生产含病毒组分的(粗制)培养基的步骤。该步骤可包括培养产病毒组分的细胞，但还可包括重建病毒组分的步骤，例如用于生产病毒样颗粒。这些步骤可涉及上游加工步骤(USP)，产生从中回收和/或纯化病毒组分的粗制培养基或组合物；和

b)下游加工或纯化步骤(DSP)。

对于IPV生产(图1)，在步骤b)之后进行灭活步骤作为步骤c)。配制步骤(d)还可在步骤b)或c)的末尾进行。

这些过程本领域已知且可根据待生产的病毒组分的性质进行调整。

本文定义的碱性氨基酸或其衍生物可在任何步骤(a、b、c和/或d)期间添加以辅助产品加工。

例如步骤a)中，合适的宿主生物体用作复制病毒组分。该培养步骤引导含病毒组分的组合物或溶液的生产。对于IPV生产来说，合适的细胞优选哺乳动物细胞。已知数种哺乳动物细胞是复制脊髓灰质炎病毒用于IPV生产的合适底物。根据欧洲药典(6.0；01/2008:0214)，用于此目的时，病毒可在下述细胞中增殖：人二倍体细胞系(例如WI-38或MRC-5)、连续细胞系(如Vero)、或初级、次级、或三级猴肾细胞(MKC)、或PerC6或CAP细胞。脊髓灰质炎病毒可在海拉细胞中培养。最新发展参见Hamidi et al 2012。

若病毒是脊髓灰质炎病毒，则优选Vero细胞系。为了复制脊髓灰质炎病毒，优选下述三种野生型毒株：Mahoney(1型脊髓灰质炎病毒)、MEF-1(2型脊髓灰质炎病毒)、Saukett(3型脊髓灰质炎病毒)。还可将其他野生型株系，例如Brunhilde(1型脊髓灰质炎病毒)用于制备IPV。或者，Sabin脊髓灰质炎病毒株可用于IPV生产(Verdijk et al.,2011)。优选地，所述细胞在微载体上培养，如Van Wezel A.L.等1978所述。优选的微载体是Cytodex 1。IPV的优选培养步骤参见实验部分。最新发展参见Hamidi et al 2012,Widjojoamodjo et al2010,Thomassen et al 2013a。

步骤b)中，病毒组分从包含其的组合物或溶液中纯化，所述组合物或溶液在步骤a)中提供、生产或获得。有多种方法根据病毒性质来纯化病毒组分。这些纯化步骤可通过澄清、离心、浓缩、透析、尺寸排阻色谱(SEC)和/或离子交换色谱(IEC)来进行。对于IPV来说，该纯化优选通过澄清进行，然后浓缩、然后尺寸排阻色谱(SEC)、然后离子交换色谱(IEC)。澄清可在步骤a)生产的混合物上用滤器进行。浓缩可用切向流过滤(TFF)、还称为交叉流过滤(CFF)或超滤(UF)来进行。IPV生产的优选纯化步骤参见实验部分和Thomassen et al2010 and 2013。对于RSV，通常澄清后有浓缩、密度梯度离心以及后续使用稳定剂的透析。对于流感病毒，离心后可由过滤和浓缩/透析。密度梯度离心步骤后配制前可进行灭活和另一透析步骤。

产生含病毒组分的组合物或溶液的过程可由两个步骤a)和b)组成。所述过程可包括其他步骤，称为灭活步骤，如下所述步骤c)。步骤c)中，数个纯化步骤后灭活病毒组分。灭活脊髓灰质炎株以在疫苗中安全使用的方法本领域已知，包括但不限于使用福尔马林或β丙内酯的灭活(参见Jonges et al 2010)。所述过程后可为配制步骤(d)。

因此，本发明的过程或方法优选使得病毒组分获自包括上游加工和下游加工步骤以及任选的灭活步骤和/或配制步骤的过程。因此，碱性氨基酸或其衍生物可在任何这些步骤中使用，优选在下游加工和/或灭活和/或配制步骤期间。

脊髓灰质炎病毒的优选生产过程描述于实验部分。

本发明方法可用于防止病毒组分聚集。碱性氨基酸或其衍生物可用在步骤a)、步骤b)和/或步骤c)和/或步骤d)中。优选所述碱性氨基酸或其衍生物用在步骤b)和/或步骤c)中更优选所述碱性氨基酸或其衍生物用在步骤b)中。这表示碱性氨基酸或其衍生物可用在步骤b)中的任何纯化技术中，在其中一些之中或所有之中。更优选，所述碱性氨基酸或其衍生物加入SEC的洗脱缓冲液中和/或IEC的洗脱缓冲液中。然而，本发明还涵盖在引导含病毒颗粒的组合物或溶液的生产中的任何步骤中使用碱性氨基酸或其衍生物。此类步骤包括：收获步骤、步骤a)、步骤b)、步骤c)、捕获色谱的洗脱期间、中间物或最终产物的储存步骤期间、配制步骤d)期间。优选碱性氨基酸或其衍生物的终浓度如上所述。

使用碱性氨基酸或其衍生物防止病毒组分聚集

本发明方法可用于减少病毒组分聚集。优选所述病毒组分获自含如上所述步骤a)、b)和任选c)和/或d)的过程。该方法中，碱性氨基酸或其衍生物加入含病毒组分的组合物或溶液中。因此，本发明一方面涉及使用如上所述的碱性氨基酸或其衍生物防止或减少病毒组分聚集，其中病毒组分优选如上所述，更优选病毒组分是如上所述肠道病毒颗粒。

本发明中，当使用该碱性氨基酸或其衍生物使组合物或溶液中的聚集物含量相对于具有下述特征的含病毒组分的组合物或溶液中存在的聚集物的含量(例如通过评估光密度和/或D抗原含量)减少或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％时(使用590nm处O、D的测量或使用本文前述任何其他方法进行评估)，称为使用碱性氨基酸或其衍生物防止或减少或降低组合物或溶液中病毒组分的聚集，其中所述特征为：

-未添加碱性氨基酸或其衍生物或

-通过不添加碱性氨基酸或其衍生物的方法生产或获得或

-碱性氨基酸或其衍生物的总浓度小于0.01mM。

本文中，当使用碱性氨基酸或其衍生物使得溶液中活或死或灭活颗粒的效价相比未使用碱性氨基酸或其衍生物的溶液中代表性活或死或灭活颗粒的效价增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％时，称为使用碱性氨基酸或其衍生物防止或减少组合物或溶液中病毒组分的聚集。效价如前所述评估。

当使用碱性氨基酸或其衍生物使得脊髓灰质炎病毒D抗原单位相比添加所述碱性氨基酸或其衍生物之前的脊髓灰质炎病毒D抗原单位数量增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、100％时，称为使用碱性氨基酸或其衍生物防止或减少组合物或溶液中作为IPV的病毒组分的聚集。

含病毒组分的组合物

在另一方面，本发明提供含病毒组分的组合物或溶液根据本发明的“含病毒组分的组合物或溶液”包括溶液、优选水性溶液，根据本发明其包含病毒组分。含病毒组分的组合物可获自前述方法。含病毒组分的优选组合物获自前述第一方面的方法。然而，获自其他方法而非本发明方法的含病毒组分的组合物明显也包括在内。组合物中的病毒组分优选如前所述的病毒组分。本发明的组合物中优选的病毒组分是负链ssRNA病毒的组分(优选颗粒)，包括属于副粘病毒属或正粘病毒属的病毒。副粘病毒科的优选病毒是如上所列的属于副粘病毒属或肺炎病毒亚科的病毒。肺炎病毒亚科(肺炎病毒)的优选病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)，更优选人或牛RSV。人RSV可为亚组A或B病毒。副粘病毒亚科的优选病毒包括腮腺炎病毒属(流行性腮腺炎病毒)和麻疹病毒属(麻疹病毒)。在其他实施方式中，组合物中的病毒组分为正粘病毒属病毒的组分，优选颗粒。优选的正粘病毒是包括流感病毒，包括流感病毒A、B或C属的流感病毒，其中A最优选。优选的流感病毒A病毒亚型包括H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3和H10N7，包括2009年大流行猪源流感病毒A(H1N1)病毒(SOIV或H1N1v)。

在第一实施方式中，含病毒组分的组合物以本文所述总浓度包含本文所述的碱性氨基酸或其衍生物。

在第二实施方式中，所述组合物包含本文所述碱性氨基酸或其衍生物，其浓度高于培养基、优选培养物培养基中碱性氨基酸或其衍生物的总浓度。本文中，“更高”或“高于”表示至少高1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％或高5、10、20、50或100倍。优选的培养物培养基是实验部分所用的M199。该培养基的碱性氨基酸或其衍生物总浓度为0.81mM:0.33mM L-精氨酸、0.1mM组氨酸和0.38mM L-赖氨酸。培养物培养基中碱性氨基酸或其衍生物的性质和可能的浓度可变化。在一个实施方式中，本发明组合物或溶液包含碱性氨基酸或其衍生物，其总浓度高于0.81M。该总浓度可高于0.85mM、0.90mM、0.95mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM或高于1.7mM。该组合物或溶液可包含病毒组分，本文前述的碱性氨基酸或其衍生物和常用于此类组合物或溶液中的任何其他可能的分子。该分子包括前述缓冲液和/或常用于培养物培养基中的任何其他分子。

在第三实施方式中，所述组合物或溶液包括本文鉴定的碱性氨基酸或其衍生物、病毒组分且不含本文前述的缓冲液。此类缓冲液常用于培养物培养基。所述组合物或溶液中不含的优选缓冲液组分是苯酚红。

在第四实施方式中，提供组合物或溶液，其由病毒组分和总浓度为至少0.01mM的碱性氨基酸或其衍生物组成或基本由其组成。优选所述组合物或溶液由病毒组分和至少0.02mM、0.025mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM的碱性氨基酸或其衍生物组成或基本由其组成。所述组合物或溶液中所述碱性氨基酸或其衍生物的性质以及病毒组分的性质如本文所述。所述组合物或溶液优选除了本文具体鉴定的病毒组分、碱性氨基酸或其衍生物和任选的水之外不含任何其他分子。

在一个实施方式中，在本文鉴定的组合物或溶液的任何中的病毒聚集物的形成都低于不含所述碱性氨基酸或其衍生物的对应组合物中病毒聚集物的形成。本文中，降低或低于表示相比不含所述碱性氨基酸或其衍生物的对应组合物中病毒聚集物的量，所形成的病毒聚集物的量降低或减少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。这种降低可在一段时间内观察到，所述一段时间为至少1分钟、1小时、6小时、24小时、48小时、72小时、一周或更长。

优选地，本发明提供的任何组合物或溶液用于预防或治疗底物/药物，更优选用于诱导个体针对所述病毒组分的免疫应答。该组合物可经进一步配置并可称为制剂或药物组合物，用作预防或治疗底物/药物，更优选用于诱导个体针对所述病毒组分的免疫应答。

为了用作预防或治疗物质/药物，所述制剂可用作液体制剂(悬浮液)作为干燥制剂或其可通过溶解(例如用水或其他稳定液体)所述干燥制剂而重建。所述制剂优选重建为其原始体积，即干燥前体积。优选所述制剂时诱导(个体)针对疾病或感染疾病或癌症的免疫应答的制剂。应理解给予本发明制剂的个体或对象可为人但也可为动物，例如农场动物或宠物，包括例如哺乳动物(食草动物、食肉动物和杂食动物)、鸟、爬行动物、(例如畜、禽、牛、小牛、猪、猫)。更优选所述制剂时针对(感染)疾病的疫苗。因此所述制剂优选为预防或治疗感染疾病的制剂。在其他实施方式中，本发明涉及使用本发明所述的方法获得的制剂生产诱导免疫应答的药物，用于接种疫苗和/或用于预防或治疗感染疾病。在另一实施方式中，本发明涉及通过给予有需要的对象有效量的制剂来针对感染剂诱导免疫应答的方法。免疫应答优选针对病毒组分中的抗原进行诱导。抗原优选为引起感染疾病的病原体的抗原或诱导针对该病原体的免疫应答的抗原。病原体优选是本文所述的病毒。本发明制剂可以重建或不重建的形式通过鼻内、肠胃外、肌肉内、皮下和/或透皮途径给予。

本文及其权利要求中，“包含”或“包括”用于非限制性意思，表示其后所列项目均包含在内，但未具体涉及的项目并不排除在外。此外，不定冠词“一个”、“一种”并不排除多于一个成员的可能性，除非明确表示需要一个且仅一个成员。因此不定冠词“一个”或“一种”通常表示“至少一个”或“至少一种”。

为了使用方便，本文术语IPV涵盖最终产物以及其尚未灭活的(加工)中间物。

本发明引用的所有专利和文献通过引用其全文纳入本文。

下述实施例仅出于示例目的，并不旨在以任何方式限制本发明范围。

附图说明

图1：灭活的脊髓灰质炎疫苗生产过程示意图。上游加工期间，细胞用两步预培养步骤进行扩增，然后进行细胞培养和病毒培养。下游加工由下述步骤组成：澄清、浓缩、尺寸排阻色谱和离子交换色谱、然后灭活。为了获得三价脊髓灰质炎疫苗，针对各脊髓灰质炎病毒类型分别进行该程序，然后混合用于终产物配制(Bakker,2011)。

图2：在含聚合病毒的溶液中添加不同碱性氨基酸或其衍生物对破坏现存聚集的效果。预期无添加(0mM)会导致最大的聚集，其设定为100％聚集的病毒。当碱性氨基酸或其衍生物以不同浓度进行不同添加时显示出减少。通过590nm的吸光度测量来进行聚集检测。其他波长也可使用，产生不同光谱。进行图2(A)中的实验，使用未包封的脊髓灰质炎病毒，图2(B)使用包封的流感病毒。图2C,2D和2E显示三种不同碱性氨基酸(L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸)对三种不同流感病毒株(流感病毒A/Uruguay H3N2(NIBSC)流感病毒B/Florida/4/2006(NIBSC)和流感病毒A/PR/8/34(NIBSC))的聚集的分别效果。图2F,2G和2H显示三种不同碱性氨基酸(L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸)对三种不同脊髓灰质炎病毒(Sabin)亚型1、2和3的聚集的分别效果。

图3：使用例如Thomassen,2013b所述的常规IPV生产过程对比本发明的优化过程的Sabin-IPV大鼠效力(Albrecht P et al.1984)。Salk-IPV用作参考标准(设为1)。用优化过程(即防止聚集的方法)制备的Sabin-IPV产生的疫苗相比Thomassen 2013b所述制备的Sabin-IPV在大鼠中具有相当或更好的免疫原性。Salk-IPV用作内部参考标准(设为1)。

图4：通过透析从脊髓灰质炎病毒(Sabin 2型)SEC产物中移除L-精氨酸。通过透析从脊髓灰质炎病毒(Sabin 2型)SEC产物中移除L-精氨酸引起病毒聚集。一定量的L-精氨酸(方块)通过透析移除，10体积后所有L-精氨酸均被移除。用吸光度测量法测量聚集的病毒(菱形)。完全移除L-精氨酸后，脊髓灰质炎病毒聚集物以时间依赖的方式形成。因此L-精氨酸的移除，如之后的测量和导电性变化所示，导致光散射增加(UV增加)，这是由于病毒聚集物形成所引起。

图5：不同碱性氨基酸或其衍生物对脊髓灰质炎病毒聚集物减少的效果。不同化合物清楚地显示出效果，取决于其类型和浓度。例如胍基丁胺、L-赖氨酸和3种碱性氨基酸的混合物，在低浓度范围至50mM中产生最显著的减少。在所有情况中，如UV所测，均可观察导起始材料的聚集减少，所述减少依赖于其浓度。

实施例

实施例1：病毒生产

细胞以实验室规模培养。使用不同系统。灭活的减毒脊髓灰质炎病毒株系以实验室规模生产。

所述过程起始于Vero细胞的培养。VERO细胞系源自非洲绿猴肾细胞(MKC)(ATCCCCL-81)。用安瓿瓶从良好表征的冷冻细胞库中开始培养。为了获得合适量的细胞以孵育生物反应器，在TC-烧瓶中用单层培养物的种子培养从含5％胎牛血清的M199培养基开始。M199培养基如Morgan J.F.等(1955)或Morgan J.F.等(1950)所述。其含有的碱性氨基酸量为：L-精氨酸0.33mM、L-组氨酸0.1mM、L-赖氨酸0.38mM(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.86.html)。

在四个T烧瓶、三个Hyper烧瓶和三个细胞工厂(Cell factories)中通过次级培养继续进行种子培养。细胞工厂总表面积为3*6320cm²。通过胰蛋白酶作用脱离细胞。完整的种子培养约2周。

生物反应器中的VERO细胞(使用较早初期MKC)培养在微载体中进行(Cytodex 1GE Healthcare,产品编号17-0448-**)。该技术于20世纪60年代由van Wezel(1978)在RIVM开发。微载体为Vero细胞的结合提供大的表面积。微载体上的培养以批量模式在5L(升)生物反应器(工作体积3L)中起始。用3L E-MEM培养基操作5L生物反应器，所述培养基补充有牛血清(BS)(依氏极限必需培养基(Minimum Essential Medium Eagle),Sigma Aldrich,M4642)。用4g/L Cytodex 1微载体和E-MEM培养基准备生物反应器。当培养条件稳定后，用生物反应器孵育种子培养中的细胞，初始细胞浓度0.8*10⁶细胞/ml。所述培养以批量模式起始持续一天并以再循环模式在再循环瓶中使用12L E-MEM培养基继续持续3天。再循环模式中细胞开始以多层方式生长。该方法可在5L生物反应器中实现4.0–4.5*10⁶细胞/ml的细胞浓度。

通过胰蛋白酶作用将细胞从微载体上脱离。释放的细胞用于起始20L中的细胞培养。用3g/L微载体和补充BS的E-MEM培养基准备20L生物反应器。孵育后终工作体积为16L。孵育水平为0.2*10⁶细胞/ml。以批量模式操作20L生物反应器。孵育进行3-4天，取决于从5L生物反应器向20L生物反应器转移细胞后的迟滞期。监控代谢物例如葡萄糖和谷氨酰胺以检查是否需要添加葡萄糖或谷氨酸盐以维持优化的生长条件。

在20L生物反应器中进行病毒增殖。将培养基从E-MEM转换为M199，以产生病毒增殖的有利条件。温度从37℃降至32.5℃。溶解氧比例(DO％)从50％降至25％。多重性感染水平(MOI)为0.01。病毒增殖和裂解进行3-5天，这取决于病毒亚型。通过光学显微检察细胞病理学效应(CPE)来监控病毒增殖和裂解。当CPE≥90％时和/或当氧气消耗停止时病毒完成培养，此时可收获病毒用于纯化(下游过程，DSP)。

生物反应器包含75μm钢网格滤器其将微载体留在反应器中。通过两个连续一次性滤器澄清病毒收获物，包括细胞碎片。深层过滤盒已纳入硅藻土(HC Pod滤器级C0HCMillipore#MC0HC054H1)。最终滤器是双层0.5/0.2μm滤器(Millipore Express SHCopticap XL#KHGES015FF3)。

脊髓灰质炎病毒生产过程中的浓缩步骤通过可用切向流过滤(TFF)(还称为交叉流过滤(CFF)或超滤(UF))来进行。总浓度因子是700-800。为了避免大量产物损失在TFF系统的死体积中，连续使用两个系统。两个系统都使用100kD平面筛选过滤盒(0.2m² and50cm² resp)。病毒颗粒得以保留，小分析最终进入滤液而被移除。

尺寸排阻色谱(SEC)是通过尺寸分离颗粒和分子的纯化技术。大分子洗脱速度比小分子快。柱子用GE healthcare的CL6B填充。第一峰可包括聚集物和高分子量分子例如宿主细胞蛋白质(HCP’s)。第二峰是具有大多数脊髓灰质炎病毒的产物峰。SEC期间，脊髓灰质炎病毒颗粒用低离子强度(20mM)pH 7.0±0.2的磷酸缓冲液洗脱。

优选用GE Healthcare的基于DEAE-配体的基质Sephadex A50进行离子交换色谱(IEX)。该特定树脂从供应商处以干燥粉末形式提供，需要用户制备。这涉及树脂的溶胀和清洗，柱填充和柱平衡。该单元操作的目的是将负电荷组分结合至基质。RNA/DNA/宿主细胞蛋白是结合至柱基质的主要部分。脊髓灰质炎病毒与基质具有有限的相互作用。

离子交换色谱获得的纯化病毒经稳定化并稀释至特定强度(可应用时)。稳定化和稀释用M199培养基进行。所需浓度取决于病毒类型。

最终将Glycine加入至终浓度为5g/L，进行灭活制备。

稳定化、稀释和制备的纯化病毒用甲醛以终浓度2-3mM(或1:4000)灭活。灭活37℃进行13天。灭活6-8天后，进行中间物过滤以移除可能的聚集物。

灭活13天后，无菌单价库已可在2-8℃储存。此时所获的灭活脊髓灰质炎病毒称为单价批次。

混合/配制

通过以预定浓度将所需血清型混合在一起获得批次。其可为单一(1型、2型或3型)、双/二价(1型和2型或1型和3型或2型和3型)或三价混合物(1型和2型和3型)制剂。此外，制剂可与其他疫苗结合，所述疫苗例如白喉、百日咳、破伤风、肝炎、流感嗜血杆菌、脑膜炎，肺炎球菌和/或其他。优化过程

如上所述进行相同程序的优化过程，除了下述不同：

·产物过滤完成后，澄清步骤用培养基冲洗

·浓缩步骤中的第二过滤不是50cm²100kD过滤盒，而是115cm²中空纤维用作第二100kD滤器(Spectrum labs#D02-E100-05-N)。

·SEC期间缓冲液改变为补充有碱性氨基酸例如L-精氨酸的pH7.0±0.2的磷酸缓冲液。

·离子交换色谱期间，用于制备基质和洗脱产物的缓冲液变为补充有碱性氨基酸例如L-精氨酸的pH 7.0±0.2的磷酸缓冲液。

改善的过程产生较高的D抗原产量(DU/ml)(具有相当或更好的免疫原性，如免疫大鼠的血清上进行的脊髓灰质炎病毒中和细胞培养基实验所测)(图3)。

表1中给出了当前过程和优化过程(通过添加碱性氨基酸进行改良)的回收率(基于D抗原产量的百分比)，以及脊髓灰质炎病毒1型和2型的总加工产量。脊髓灰质炎病毒或IPV产物的抗原性用脊髓灰质炎病毒D抗原ELISA进行测试(ten Have et al.2012)。

表1：当前过程和改良纯化过程观察到的脊髓灰质炎病毒产量比较：

实施例2聚集物水平降低

可通过添加碱性氨基酸或其衍生物的浓缩溶液来实现病毒聚集的减少。任何技术人员均可根据具体需要调整该方法。参见图2A和2B。

在其他实验中，制备碱性氨基酸的母液并将其加入包含聚集形式的不同病毒的批次中。溶液以1:1比例添加。以590nm吸光度测量聚集(Biowave DNA,WPA)。添加碱性氨基酸前测量的聚集病毒设定为100％。添加不同浓度氨基酸对聚集病毒百分比的效果如图2C、2D和2E所示，显示三种不同碱性氨基酸(分别为L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸)对三种不同流感病毒株(流感病毒A/Uruguay H3N2(NIBSC)流感病毒B/Florida/4/2006(NIBSC)和流感病毒A/PR/8/34(NIBSC))的效果。图2F、2G和2H的结果显示三种不同碱性氨基酸(L-精氨酸、L-赖氨酸和L-组氨酸)对三种不同脊髓灰质炎病毒(Sabin)亚型1、2和3的分别效果。

实施例3非实时(offline)添加(溶解现存聚集物)

根据稍作改动的Salk-IPV生产方案用20mM磷酸缓冲液生产聚集病毒(Sabin批次1型、2型和3型；SEC和IEX之后的中间产物部分)。所获病毒部分-80℃冷冻待用。冷冻确实有助于和/或提高聚集效果。

使用实验室蛋基于由下述步骤组成的过程生产流感病毒(含聚集物)：孵育胚胎蛋(株：A/Uruguay/H3N2(NIBSC))、孵育、冷却和随后通过盘堆(disk-stack)离心然后深层过滤(GE Healthcare)进行收获。通过蔗糖密度梯度离心纯化病毒，然后β丙内酯灭活和过滤。最后进行透析/浓缩。

用校准的pH计(Orion scientific)和凝胶-电极(Mettler Toledo)测量pH并用硫酸或氢氧化钠校正。

作为聚集测量值的光密度在直径10mm的塑料一次性小试管(Greiner)或石英小试管中用Biowave DNA分光光度仪(WPA)在波长450&590nm处进行测定。

ELISA-实验；脊髓灰质炎病毒或IPV产物的抗原性用ELISA进行测试(ten Have etal.2012)。

病毒产物用于非实时测试，其不同添加剂的浓度范围如表2所示。在测试试管中称重添加剂，并向其中添加1或2ml产物，混合溶液和添加剂。当添加剂溶解时，测量pH变化并校正(若需要)为初始产物pH。1小时后测量光密度。

表2：测试添加剂的防止或破坏病毒聚集能力

非实时添加不同添加剂在清除聚集物方面表现不同，它们以不同摩尔浓度清除聚集物，并得到不同产物(图2A和2B)。无添加时测量的初始聚集病毒产物设为100％，空白缓冲液溶液用作阴性对照，例如无聚集形成0％。

向病毒添加M199能从所有病毒产物中清除已形成的聚集物，无论是-80℃储存的材料还是新鲜制备的溶液。对于脊髓灰质炎病毒来说，这导致可用D-抗原表位增加22％+/-12，如ELISA-试验(ten Have et al,2012)所测。

实施例4流感病毒的快速纯化(概念验证)

根据下述方案使用精氨酸纯化流感病毒作为概念验证。如下制备病毒料液：从10.000SPF(无特定病原体)鸡胚蛋的收获物在第11天用流感病毒A/Uruguay H3N2病毒(EID50/ml 9.17)孵育，使用位于具有HVAC滤器的风淋室中的半自动孵育器。孵育前，蛋和针头用70％乙醇灭菌。所述蛋在35℃孵育72小时持续3天，然后冷却过夜至约4℃，其中约12小时内温度有效低于8℃。在风淋室中的半自动孵育器中进行去帽蛋的尿囊液收获。用Westfalia盘叠分离器以65L/h、1巴背压、10.000rpm的连续离心对粗制收获的尿囊溶液进行澄清，然后用两个平行的10英寸2.0μm GE ULTA填充胶囊深层滤器(GE Healthcare)进行过滤。

从所获批次分离到约3L用于小规模测试。

3L再次被分为2部分，各部分用中空滤器(GE Healthcare#UFP-750-E-3X2MA)浓缩约15倍，并针对PBS(GIBCO)或补充有0.35M L-精氨酸(Sigma-Aldrich)的PBS(GIBCO)进行透析(10体积)。

从如此获得的浓缩和透析材料中取10ml在90cm床高的尺寸排阻柱(柱vl11/100Millipore)上进行测试，所述株含有Sepharose 6 fast flow matrix(GEHealthcare)，使用PBS或补充有0.35M L-精氨酸的PBS和Akta探测器色谱系统(GEHealthcare)。

所有样品在分析前用甲醛进行灭活。

分析试验

SRID(单径向免疫扩散)试验基于平面琼脂凝胶中存在的抗体和从凝胶中的施用点扩散的抗原之间的反应。一旦抗体和抗原浓度相等，即发生环形沉淀。沉淀物用考马斯亮蓝染色并且所述环的大小用作测量浓度。

使用直接夹心型ELISA(酶联免疫吸附试验)测量卵清蛋白浓度。根据ELISA试剂盒(Serazym卵清蛋白ELISA:目录编号E041C,Seramun Diagnostica GmbH Wolzig)的供应商的说明进行试验。两种不同稀释的独立重复用作样品。含抗原的样品吸入包被有多克隆抗卵清蛋白抗体的ELISA平板孔中。加入连接辣根过氧化物酶的抗卵清蛋白，然后清洗未结合底物。加入底物引发蓝色显像。该过程通过添加硫酸而停止；颜色从蓝变黄。450nm处的吸光度用作定量。630nm滤器用作对照(Biotek读取器以及KC-jr和KC4软件)。

结果

从色谱运行上收集的材料在SRID试验中检测血凝素抗原的量。分析显示补充有0.35m L-精氨酸的材料中血凝素抗原量提高8％。

此外，从中空纤维所得的浓缩和透析(UF/DF)材料(含补充的L-精氨酸单盐酸盐)在样品中包含显著更低的(多至76％)卵清蛋白，表明存在L-精氨酸单盐酸盐时透析在移除杂质方面有效得多。

实施例5：添加至脊髓灰质炎病毒色谱的效果

在聚集发生后将其破坏是解决问题的一个方法。然而，生产中更重要的是从源头防止聚集发生。(脊髓灰质炎)病毒加工期间，在SEC期间将形成的聚集物移除并将其作为杂质结合至IEX(DEAE)柱，这会导致较高的产物损失(多至70％)。

根据表3在不同溶液中进行色谱分离。起始材料是-80℃冷冻或新鲜制备的浓缩的脊髓灰质炎病毒。在色谱分离期间仅对添加L-精氨酸HCL的20mM硫酸缓冲液进行测试，紧随对照。

确定产量(以D-抗原回收率的方式)，结果示于表4和表5(nd＝未完成)。

表3：色谱添加

表4：不同洗脱缓冲液的SEC(尺寸排阻色谱)回收率(基于每毫升D-抗原的百分比(％))结果

表5：不同洗脱缓冲液的离子交换色谱回收率(基于每毫升D-抗原的百分比(％))结果

将L-精氨酸添加至洗脱缓冲液可具有积极效果，这主要在1型和2型的SEC期间观察到，对于IEX来说2型的效果特别清楚。加入备选1(M199)似乎也有益，然而纯化期间该化合物显示出在IEC上的生产量降低，这就大幅限制了其相比备选2的可用性。

在另一实验中，生产高细胞浓度产物批次(半批次方法Thomassen等2014)，其由2亚型Sabin感染并根据Thomassen等2013a和实施例1的优化过程进行纯化，直到产生400倍浓缩的批次(通过回收、过滤和超滤)。将该材料分装并储存在-80℃。融化该材料并利用Akta探索系统(GE Healthcare)上的Cl6B-树脂通过尺寸排阻色谱进行纯化，使用不同浓度添加不同碱性氨基酸至对照20mM磷酸缓冲液中。变化和结果如下表6所示。产物浓度(D-抗原)是三次重复的平均[ten Have et al,2012]，计算产物增加并以百分比差异显示。

表6：使用不同浓度添加不同碱性氨基酸至对照20mM磷酸缓冲液中的2型Sabin的尺寸排阻色谱

从表6可以看出不同添加和不同浓度对尺寸排阻色谱的产物回收率的效果。在所用情况中产物产量均从中等(2％)增加至高(57％)，清楚地表明添加碱性氨基酸的改善。

实施例6：使用透析从脊髓灰质炎病毒中间物纯化产物(SEC)中移除L-精氨酸

加入碱性氨基酸至含病毒颗粒的溶液能溶解和/或防止聚集形成。通过移除碱性氨基酸，预期聚集会再发生。这通过生产脊髓灰质炎病毒(2型Sabin)批次进行阐明，使用尺寸排阻色谱(xk26/80柱中的Cl6B，均来自GE Healthcare)并使用含L-精氨酸的洗脱缓冲液。如本发明已知，所获病毒产物溶液随后使用100kD中空纤维针对相似缓冲液(其中不含添加剂，以相同速率移除过滤物，从而保持恒定滞留物体积)进行清洗/透析。

使用分光光度仪(Biowave DNA,WPA)对吸光度(作为聚集物含量的测量)进行非实时测量，使用NMR测量L-精氨酸浓度。用Pendotech一次性感应器实时跟踪压力和电导率。

一个透析体积对应于系统中存在的总病毒产物体积(75ml)。以恒定流量和TMP(总时间2.5小时)使系统运行10个透析体积，并在各透析体积交换后取样(并校正体积)用于分析。

结果示于图4，显示出在3-4个透析体积后，L-精氨酸浓度快速下降至低于所用NMR的检测极限(1mM)。对应于L-精氨酸浓度的这种降低，吸光度发生增加，表明病毒颗粒发生聚集。L-精氨酸还可通过电导率间接跟踪。与L-精氨酸移除并行的电导率的快速下降至最终电导率2.9mS/cm(对应于对照缓冲液)，表明添加剂已移除。10次透析体积后，当达到所述电导率时，吸光度相比起始值增加两倍多。这清楚地表明碱性氨基酸的添加时聚集减少(如UV所示)的原因，并且所述过程可逆(即可移除添加剂)，使得聚集再次发生。

实施例7：存在或不存在碱性氨基酸时纯化野生型脊髓灰质炎病毒

生产2型野生型脊髓灰质炎病毒并用Thomassen等(2013a)所述的程序中的色谱步骤纯化。用两种不同SEC柱在40mM磷酸缓冲液(pH7.0+/-0.2)中纯化材料。一种缓冲液含添加剂(150mM L-精氨酸)，另一种不含添加剂。所获两种产物随后在IEX(DEAE琼脂糖快流，GEHealthcare)上纯化，同样使用两种前述缓冲液。表7显示IEX的结果。可以清楚地看出存在添加剂得到更高的产物产量，如ELISA(Ten Have R et al,2012)和峰面积所测，产量几乎翻倍。在两种情况中，纯化均得到高纯度病毒产物(如Koch and Koch1985所测定基于UV比例，数据未显示)。

表7：存在或不存在150mM L-精氨酸时野生型脊髓灰质炎病毒的SEC和IEX纯化峰面积对应于脊髓灰质炎病毒含量。所测D-抗原对应于免疫原性病毒。

在另一实验中，再生产3型野生型脊髓灰质炎病毒并用Thomassen等(2013a)所述的程序中的色谱步骤纯化。

用一个SEC柱在常规40mM磷酸缓冲液(pH 7.0+/-0.2)中纯化材料。所获产物分为2个等量部分。对一个部分，加入含L-精氨酸的高度浓缩缓冲液至终浓度149mM，而另一部分则加入相同量的常规缓冲液以补偿稀释效果。

随后两种产物均在IEX(DEAE琼脂糖快流,GE Healthcare)上纯化，使用40mM磷酸缓冲液，含或不含添加剂(150mM L-精氨酸)，取决于待纯化的部分。表8显示IEX的结果。依然很明显添加剂导致产物产量(基于峰面积)。在两种情况中，纯化均得到高纯度病毒产物(如Koch and Koch 1985所测定基于UV比例，数据未显示)。

表8：存在或不存在150mM L-精氨酸时3型野生型脊髓灰质炎病毒的IEX纯化

从实施例7可清楚地看出添加可采取不同方式以获得效果，直接和共洗脱或之后作为高度浓缩母液化合物添加均可以。所有情况中含添加剂的产物显示出较高产量。不同形式的添加剂，例如液体，通过透析或作为高度浓缩的母液都会产生较高的产量。

实施例8：存在或不存在碱性氨基酸时纯化嵌合脊髓灰质炎病毒

获得实验脊髓灰质炎病毒，代表野生型病毒(Salk-开发的IPV的基础)和减毒病毒(Sabin株)的组合/嵌合/杂合。该病毒通过遗传修饰进一步削弱以使其在哺乳动物中生物活性更低，从而进一步防止任何严重疾病/逆转。

该实验病毒用已知生产过程(Bakker et al,2011和Thomassen et al,2013a)在实验室规模进行生产以评估其效力。对于色谱分离部分，使用普通20mM磷酸缓冲液(对照)和含150mM L-精氨酸的20mM磷酸缓冲液。结果适于表9，其显示个体单元操作(％)的产量和组合色谱单元操作的产量。表9清楚表明L-精氨酸添加剂的有益效果，因为实现了较高的总回收率。

表9：个体单元操作(SEC和IEX)和组合单元操作的嵌合脊髓灰质炎病毒产率(％)

实施例9：存在碱性氨基酸时的混合模式/多模式色谱

在洗脱缓冲液中使用添加剂打开了新型纯化选择的大门，例如使用混合模式/多模式色谱分离替代传统离子交换。静电和疏水效应均可用于进行颗粒的二维分离，甚至可用于分离关联紧密(关于等电点)的颗粒。

结果示于表10.HEA Hypercell芳香族色谱树脂(Pall Corporation)用于纯化2型Sabin。所述产物的纯化根据Koch and Koch(1985)所述基于UV 260/280比确定，其中纯脊髓灰质炎病毒的目标比例范围为1.60-1.80。无L-精氨酸存在时，HEA-纯化的病毒的UV260/280比为0.98，而存在150mM L-精氨酸的HEA柱纯化病毒突然达到高纯度，如UV 260/280比1.76所示，即达到上述目标范围。

表10脊髓灰质炎病毒产物在多模式色谱树脂上的纯度

使用新且更现代的树脂为病毒纯化提供了新的选择。

实施例10：不同碱性氨基酸或其衍生物对脊髓灰质炎病毒聚集减少的效果

烟囱型底部透明的黑色96孔板用于针对聚集的中间纯化批次的脊髓灰质炎病毒(Sabin 1型，源自普通磷酸缓冲液中的尺寸排阻色谱步骤)筛选不同化合物和浓度。

在96深孔板中通过混合浓缩的母液和缓冲液(均为pH 7.0+/-0.2)至预定摩尔浓度来制备各种化合物的母液，之后将其以与待测试的病毒制备相等的量(1:1)加入所述黑色96孔板。

所得平板在振荡平台上混合，5分钟后测量吸光度(590nm)。结果示于图5。

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缩写

AU-吸光度单位

CCID50-50％细胞培养物感染剂量

CFF-交叉流过滤

cm-厘米

CPE-细胞病理学影响

DEAE-二乙氨基乙醇

DF-透析

DLS-动态光散射

DNA-脱氧核糖核酸

DO-溶解氧

DSP-下游加工

DU-D-抗原单位

EID50-50％卵传染剂量

ELISA-酶联免疫吸附测定

E-MEM-依氏极限必需培养基

FTU-福尔马肼浊度单位

HCP-宿主细胞蛋白

HEA-己胺

HPV-人乳头瘤病毒

HVAC-加热、通风和空调

IEC/IEX-离子交换色谱

IPV-灭活脊髓灰质炎病毒疫苗

kD-千道尔顿

M199-培养基199

MALS-多角光散射

MKC-猴肾细胞

mM-毫摩尔

MOI-感染复数

mS-毫西门子

NIBSC-国家生物学标准与控制研究所

nm-纳米

NMR-核磁共振

NTU-比浊浊度单位

OD-光密度

OPV-口服脊髓灰质炎疫苗

PBS-磷酸缓冲盐水

RIVM-国家公共卫生和环境研究所

RNA-核糖核酸

RSV-呼吸道合胞病毒

SEC-尺寸排阻色谱法

sIPV-基于Sabin的灭活脊髓灰质炎病毒疫苗

SPF-无特定病原体

SRID-单一径向双向免疫扩散法

TCID50-50％组织培养物感染剂量

TFF-切向流过滤

UF-超滤

USP-上游加工

UV-紫外线

VAPP-疫苗相关的麻痹型脊髓灰质炎

VDPV-疫苗衍生的脊髓灰质炎病毒

VLP-病毒样颗粒

Claims

1.一种生产包含肠道病毒颗粒的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：

a)制备含有肠道病毒颗粒的培养基；

b)从培养基纯化所述肠道病毒颗粒，其中在纯化的至少部分期间存在浓度为0.5-1000mM的碱性氨基酸或其衍生物，所述浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集；

其中所述碱性氨基酸或其衍生物选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、胍基丁胺、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸、其盐及其组合。

2.如权利要求1所述的方法，还包括下述步骤至少之一：

c)灭活所述肠道病毒颗粒；和

d)配制所述肠道病毒颗粒。

3.如权利要求2所述的方法，其中在步骤c)的至少部分期间存在所述碱性氨基酸或其衍生物，其浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集。

4.如权利要求3所述的方法，其中在步骤d)期间也存在浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的所述碱性氨基酸或其衍生物以配制药物组合物，所述药物组合物包含所述肠道病毒颗粒。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述药物组合物还包含足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集的浓度的所述碱性氨基酸或其衍生物。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在步骤b)、c)和d)的至少一个的整个过程中维持所述碱性氨基酸或其衍生物的浓度，所述浓度足以防止或减少所述肠道病毒颗粒聚集。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述碱性氨基酸或其衍生物的浓度为5-1000mM的浓度。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述肠道病毒颗粒是肠道病毒的病毒样颗粒。

9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述肠道病毒颗粒是选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、埃可病毒、鼻病毒和肠道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述肠道病毒颗粒包含血清型1、2和3的脊髓灰质炎病毒。

11.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述包含肠道病毒颗粒的组合物是疫苗。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述疫苗是灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。

13.碱性氨基酸或其衍生物在防止或减少肠道病毒颗粒聚集中的用途，所述碱性氨基酸或其衍生物选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸-HCl、赖氨酸-HCl、组氨酸-HCl、胍基丁胺、二盐酸L-精氨酸乙酯、氨甲环酸、DL-5-羟赖氨酸盐酸盐、二盐酸L-赖氨酸甲基酯、3-甲基-L-组氨酸、其盐及其组合，其中以0.5-1000mM的浓度使用。

14.如权利要求13所述的用途，其中肠道病毒颗粒是选自脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A病毒、柯萨奇B病毒、埃可病毒、鼻病毒和肠道病毒68、69、70、71和73的肠道病毒的肠道病毒颗粒。

15.如权利要求14所述的用途，其中所述肠道病毒颗粒是血清型1、2和3的至少一种的脊髓灰质炎病毒。

16.如权利要求15所述的用途，其中所述肠道病毒颗粒是灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。