KR20160019477A - 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 및/또는 감소시키는 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하는 방법{Methods for the prevention of aggregation of viral components}
본 발명은 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 및/또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 생물약제의 제조 및 제형 분야 및 백신학 분야에 관한 것이다.
어그리게이션은 (생물-) 약제, 특히 모노클로날 항체 및 바이러스와 같은 단백질의 생성시 잘 알려진 문제이다. 단백질 어그리게이션에 대한 보다 많은 배경기술은 하기 리뷰(Wei Wang, 2005)에서 찾아볼 수 있다. 어그리게이션은 높은 생산/제조 손실, 불안정성, 감소된 수명, 투여시 역효과, 상이한 면역반응, 및 질병 형성(예를 들어, 알츠하이머 파킨슨(Taylor 등, 2002), 프리온 뇌병증 및 헌팅턴 병과 같은) 자체까지 관련될 수 있다. 어그리게이션은 생산 공정에 적용된 버퍼 또는 매체의 조심스런 선택에 의해 저해될 수 있다(Gu 등, 2003, Cromwell 등, 2006). 우레아 또는 구아니듐염과 같은 화합물의 첨가는 단백질을 용해시키는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 제제는 또한 단백질 구조 및 효능에 영향을 미친다. 어그리게이션을 억제 또는 저해하는 것은 항상 성공적인 것은 아니며, 절충안이 이루어져야 하는데 이는 제조 중에 (상대적으로) 높은 산물 손실, 보관 또는 시간 경과에 따른 손실을 일으킬 수 있다.
예를 들어, Sabin 기초 불활성화된 폴리오바이러스와 같은 바이러스 성분의 생산 중에, 원하지 않는 어그리게이션이 또한 일어나는 것으로 알려져 있으며, 이는 바이러스(성분) 제조시 정제 산물 회수(수율)의 큰 변화를 일으킬 수 있다. 따라서, 바이러스 성분의 생산을 위한 향상된 방법이 요구된다.
바이러스는 살아있는 세포 내부에서만 복제할 수 있는 감염성 제제이며, 바이러스에 따라 이들은 동물, 식물, 박테리아 및 고세균류와 같이 다양한 타입의 유기체를 감염시킬 수 있다(Koonin EV 등, 2006). 바이러스는 2 또는 3개의 구별되는 부분, 유전 물질 및 바이러스 단백질 코트로 구성되며, 때때로 지질 2중층막 및 엔벨로프로 보충된다. 바이러스 코트는 다중 단백질로 이루어지며, 이는 나선형, 이소카헤드럴(isocahedral) 또는 심지어 보다 복잡한 구조로 고 복합 제4급 구조를 형성한다. 바이러스에 대한 보다 자세한 배경기술은 하기 참고문헌(Fields Virology, 2007)에서 찾아볼 수 있다.
본 출원인의 시험에서, 논-엔벨로프 및 엔벨로프 바이러스에 대한 모델로서, 각각 폴리오바이러스 및 인플루엔자에 초점을 두었다. 폴리오바이러스는 보통 일반적으로 피코르나바이러스를 대표하는 것으로 바이러스 제거 유효 시험시 논-엔벨로프 RNA 바이러스에 대한 비특이적 모델 바이러스로 사용된다(기술적 내용 Millipore: AN1650EN00, www.bioreliance.com/library/?id=90,
http://www.criver.com/files/pdfs/bps/bp_r_viral_tse-clearance_studies.aspx).
또한, 폴리오바이러스는 많은 과학적 문헌이 이용가능한 잘 연구된 바이러스이며, 이로써 폴리오바이러스는 적절한 후보자가 된다. 엔벨로프 바이러스의 대표로서, 다양한 스트레인의 인플루엔자가 사용되었다. 인플루엔자는 이의 변이성(항원 변이)에 기인하여 매년 많은 문제를 일으키는 바이러스이다. 인플루엔자는 전세계적으로 연구되고, 그 질병에 기인하여 어느 백신 개선을 위해 가능성이 높은 표적에 부담이 주어진다. 높은 변이성은 인플루엔자 바이러스가 많은 변이에 대한 어그리게이션을 감소 및 저해하는 방법을 신속히 시험하기에 적절한 대표적인 것이 되도록 하며, 이러한 기술이 사용될 수 있는 광범위한 범위를 나타낸다.
회백색 마비 또는 영아마비라고도 불리는 소아마비는 3가지 관련 바이러스 혈청형, 폴리오바이러스 타입 1, 2 및 3에 의해 야기되는 감염성 바이러스 질병이다. 폴리오바이러스는 피코르나비리데과의 엔테로바이러속에 속한다. 인간에서, 폴리오바이러스는 대변-구강 또는 구강-구강 전염에 의해 주로 얻어진다. 감염 후, 폴리오바이러스는 위장관에서 증식하고, 이로부터 중추 신경계에 들어갈 수 있다. 이러한 감염은 마비를 일으킬 수 있다. 소아마비는 치료될 수 있다. 그러나, 이는 예방접종에 의해 예방될 수 있다. 현재, 시장에서 입수가능한 두 가지 안전하고 효과적인 소아마비 백신이 있다: 구강 소아마비 백신(OPV), 및 불활성화 소아마비 백신(IPV). OPV는 폴리오바이러스의 약독화된 생균 스트레인(OPV를 최초로 개발한 알버트 사빈 이후에 소위 Sabin 스트레인이라 칭하여짐)에 기초하며, 이 백신은 구강 경로를 통해 투여된다. 이와 상반적으로, IPV는 정제된 와일드-타입 폴리오바이러스 스트레인을 이용하는 것에 기초하며, 이는 화학적으로 사멸되고 주사에 의해 근육 내 투여된다. IPV는 조나스 사크(Jonas Salk)에 의해 처음 개발되었다[소아마비 및 소아마비 백신에 대해 유용한 여러 리뷰가 있음: Koch 및 Koch, 1985; Duchene 등, 1990; Kew 등, 2005; Heinsbroek 및 Ruitenberg, 2010].
유용한 소아마비 백신(OPV 및 IPV) 모두 마비성 회백수염(paralytic poliomyelitis)으로부터 높은 보호 수준을 제공한다. 따라서 지금까지 OPV는 투여 용이성 및 비싸지 않은 비용의 여러 장점을 가지므로 세계적인 소아마비 근절을 위해 선택된 백신이다. 그러나, 일부 경우에 OPV는 백신 관련 마비성 회백수염(VAPP)을 일으키거나, 또는 백신 유래 폴리오바이러스(VDPV)를 일으킬 수 있어, 소아마비 근절이 성공적이게 되면 이는 바람직하게 중단되어야 한다[Kew 등, 2005; Heymann 등, 2005 & 2006; Chumakov 등, 2007; Nathanson & Kew, 2010; Aylward 및 Tangermann, 2011]. 또한 OPV는 와일드 타입 변이체로 되돌아가는 것이 배제되지 않는다(Lee 등, 2012). 따라서, 새롭고, 안전하고, 효과적인 소아마비 백신에 대한 필요성이 증가하고 있다. 세계적인 소아마비 근절 후 백신 정책에 대한 방향은 특히 IPV의 이용가능성 및 가격에 좌우된다[Heinsbroek 및 Ruitenberg, 2010; Thompson 및 Tebbens, 2012].
소아마비 근절 후 OPV의 사용을 중지하기 위해, 그리고 투여 당 IPV의 비용을 줄이기 위해, 다양한 접근이 이어져 오고 있다. 그 중에서, 이들 접근은 a) 약독화 Sabin 폴리오바이러스 스트레인에 기초한 IPV(Sabin-IPV)[Bakker 등, 2011; Hamidi & Bakker, 2012]; b) 새롭게 디자인된 대안적인 폴리오바이러스 시드 스트레인에 기초한 IPV[Chumakov 등, 2008; Robinson HL 2008; Hamidi & Bakker, 2012]; c) 폴리오바이러스 복제를 효율적으로 뒷받침하는 대안적인 포유류 세포로부터 생산된 IPV[Hamidi & Bakker, 2012; Sanders 등, 2012; Crucell, US0027317, 2011]를 포함한다. 이러한 모든 개발에 있어서, 원가 감소의 기회는 상향 흐름 및 하향 흐름 공정 최적화(예, 바이오리액터 성능의 보다 효율적인 사용)에서 공지 방법의 실행 및 전체적인 현대화(예, 동물-컴포넌트-프리 세포(animal-component-free cell) 및 바이러스 배양 배지, 일회용 필터 등을 이용함)에 의해 실현될 수 있다.
현재, IPV는 가장 일반적으로 3가지 와일드-타입 악성 스트레인, Mahoney(타입 1 폴리오바이러스), MEF-1(타입 2 폴리오바이러스) 및 Saukett(타입 3 폴리오바이러스)를 사용하는 것에 기초한다. 폴리오바이러스는 포유류 세포 배양에서 개별적으로 성장된다. 후속적으로, 여러 정제 단계 후, 폴리오바이러스는 포르말린(포름알데히드)을 사용하여 불활성화되고, 그 후 이들은 최종의 원하는 제형으로 혼합되고 채워질 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 급성 호흡 감염을 일으키며, 상당한 질병률 및 사망률을 갖는다. 유병률은 학령 아동에서 가장 높다. 어린 유아, 노인, 및 폐 및 심장 질환, 당뇨병이나 심한 천식과 같은 컨디션을 가진 자들은 중증 인플루엔자에 대해 위험에 처해 있다. 임상적으로, 인플루엔자는 근육통, 두통 및 기침과 함께 급성 열병을 포함한다.
인플루엔자 질병이 수세기 동안 알려져 왔으나, 원인 인자는 오랫동안 알려지지 않았었다. 최초의 인간 인플루엔자 바이러스는 1933년에 분리되었다.
바이러스는 부화 알에서 증식될 수 있으며(아직도 통상적인 수행이며, 이후에 세포 배양시 바이러스를 성장시키는 능력이 보완됨), 이는 바이러스를 연구하기 위한 능력을 크게 촉진하였다.
인플루엔자 바이러스는 오르소믹소비리데과의 RNA 바이러스이며, 8개의 RNA 세그먼트 주위에 지질 엔벨로프로 구성된다. 엔벨로프 상에 2개의 주요 단백질(항원)이 존재한다: 뉴라미다아제(NA/N) 및 헤마글루티닌(HA/N). 헤마글루티닌은 바이러스를 호흡 상피의 세포에 부착시키고, 후속적으로 바이러스 멤브레인을 상피 세포의 멤브레인과 융합시켜 바이러스가 진입되도록 하는 단백질이다. 뉴라미다아제는 감염된 세포로부터 새로 생성된 바이러스 파티클의 방출을 촉진하는 바이러스 효소이다.
인간 이외에도, 인플루엔자 바이러스는 광범위한 범위의 동물 종을 감염시킬 수 있으며, 인간과 가장 관련된 것은 조류 및 돼지이다. 왜냐하면 이러한 종으로부터 바이러스는 일반적으로 또한 인간을 감염시킬 수 있기 때문이다. 인플루엔자 바이러스의 두드러진 특징은 변이성이다. 변이는 면역 선별에 의해 유도되며, 이는 바이러스가 계속해서 숙주 면역성을 탈출하려고 시도하는 것을 의미한다. 이는 항원 변이로 알려진 항원의 점진적 돌연변이에 의해, 또는 항원대변이(antigenic shift)라고 알려진, 항원을 코딩하는 전체 RNA 세그먼트를 관련 스트레인으로 스와핑함으로써 일어날 수 있다. 면역 선별은 표면 항원에 대한 항체 반응 및 T-세포 반응에 대한 보다 적은 정도와 관련되며, 이는 주로 내부 단백질에 대한 것이다.
항원 변이에 기인하여, 계절적인 인플루엔자에 대한 새로운 백신이 해마다 생성될 필요가 있으며, 이는 각 계절에 순환하는 바이러스 스트레인에서 발현되는 항원을 함유한다. 항원대변이, 또는 일련의 항원 변이 돌연변이는 유행병을 일으킬 수 있다. 유행성 집단발병(outbreake)에 대한 보호는 유행성 바이러스에 의해 발현된 항원을 함유하는 새로 개발된 강력한 백신의 사용을 필요하게 만든다.
본 명세서에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 어그리게이션이 저해되거나 감소되는 바이러스 성분의 생산을 위한 향상된 방법 및 이러한 바이러스 성분을 포함하는 향상된 조성물을 확인하였다.
제1견지로, 본 발명은 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 엔테로바이러스 파티클을 함유하는 배지를 생성하는 단계; b) 상기 배지로부터 엔테로바이러스 파티클을 정제하는 단계로서, 이에 의해 상기 정제의 적어도 일부 동안, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 농도로 존재하는, 엔테로바이러스 파티클의 정제; 및, 임의로, c) 엔테로바이러스 파티클의 불활성화; 및 d) 엔테로바이러스 파티클의 포뮬레이션 중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, N-ε-포밀-L-리신, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, α-메틸-DL-히스티딘 디하이드로클로라이드, 이의 염 및 이의 조합을 포함한다.
상기 방법에서 바람직하게 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 c)의 적어도 일부 동안 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도로 존재하며, 그리고 여기서 임의로, 또한 단계 d) 중에 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도로 존재하여 엔테로바이러스 파티클 및 임의로 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도의 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 약학 조성물이 제형화된다.
보다 바람직하게, 상기 방법에서 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도는 바람직하게 단계 b), c) 및 d) 중 적어도 하나의 전체 기간에 걸쳐 유지된다.
본 발명에 따른 방법에서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도는 바람직하게 적어도 0.01mM의 농도, 바람직하게 0.01-1000mM의 농도이다.
본 발명에 따른 방법에서, 엔테로바이러스 파티클은 바람직하게 폴리오바이러스, 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, 에코바이러스 및 엔테로바이러스 68, 69, 70, 71 및 73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 엔테로바이러스의 것이다. 보다 바람직하게, 엔테로바이러스 파티클은 혈청형 1, 2 및 3의 폴리오바이러스를 포함한다. 일 구현으로, 엔테로바이러스 파티클은 바람직하게 엔테로바이러스의 바이러스-유사(virus-like) 파티클이다.
본 발명에 따른 방법에서, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물은 바람직하게 백신이다. 보다 바람직하게, 백신은 불활성화 소아마비 백신(Inactivated Polio Vaccine, IPV)이다.
본 발명은 또한 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, N-ε-포밀-L-리신, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, α-메틸-DL-히스티딘 디하이드로클로라이드, 이의 염 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 사용하는 용도에 관한 것이며, 여기서 바람직하게 엔테로바이러스 파티클은 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스 및 엔테로바이러스 68, 69, 70, 71 및 73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 엔테로바이러스의 것이며, 보다 바람직하게, 엔테로바이러스 파티클은 혈청형 1, 2 및 3 중 적어도 하나의 폴리오바이러스이며, 보다 바람직하게, 엔테로바이러스 파티클은 불활성화 소아마비 백신(Inactivated Polio Vaccine, IPV)이다.
다른 견지로, 본 발명은 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 또는 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하는 바이러스의 바이러스 파티클, 및 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, N-ε-포밀-L-리신, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, α-메틸-DL-히스티딘 디하이드로클로라이드, 이의 염 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 여기서 a) 상기 조성물 내 상기 염기성 아미노산 또는 유도체의 총 농도는 배지에 존재하는 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도 보다 더 높으며; b) 상기 조성물은 버퍼를 포함하지 않으며, 그리고 바람직하게 페놀 레드를 포함하지 않으며; 그리고/또는, c) 상기 조성물은 상기 바이러스 파티클, 적어도 0.01mM의 총 농도로 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 및 선택적으로 물 또는 다른 액체 담체로 필수적으로 구성된다. 바람직하게, 상기 조성물에서, 상기 조성물 내 바이러스 집합체의 형성은 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하지 않는 이에 상응하는 조성물 내 바이러스 집합체의 형성에 비해 감소된다.
다른 견지로, 본 발명은 약제로 사용되는 상기 정의된 조성물에 관한 것이다.
도 1: 불활성화 소아마비 백신 제조 공정의 개요도. 상향 흐름 공정 중에, 세포들은 세포 배양 및 바이러스 배양 전에 두 개의 사전배양을 이용하여 증식된다. 하향 흐름 공정은 정화(clarification), 농축, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피, 그 다음 불활성화로 구성된다. 3가 소아마비 백신을 얻기위해, 이 절차는 마지막 산물 제형화를 위한 혼합 전에 개별적으로 각 소아마비 바이러스 타입에 대해 후속된다(Bakker, 2011).
도 2: 집합된 바이러스를 함유하는 용액에 다양한 염기성 아미노산 및 유도체들의 첨가가 기존 어그리게이션을 분해하는데 미치는 영향. 무첨가(0mM)는 최대 어그리게이션을 일으키는 것으로 추정되었으며, 100% 집합된 바이러스로 설정되었다. 다양한 농도의 다양한 염기성 아미노산 및 이의 유도체의 첨가가 사용된 경우에 감소가 나타난다. 어그리게이션의 검출은 590nm에서 흡광도 측정을 이용하여 수행되었다. 다른 스펙트럼을 일으키는 다른 파장이 또한 사용될 수 있다. 도 2a에서 수행된 실험은 논-엔벨로프 폴리오바이러스를 이용하여 수행되었으며, 도 2b에서 수행된 실험은 엔벨로프 인플루엔자 바이러스를 이용하여 수행되었다. 도 2c, 2d 및 2e는 각각 3개의 다른 염기성 아미노산(L-아르기닌, L-리신 및 L-히스티딘)이 3개의 다른 인플루엔자 스트레인(인플루엔자 A/우루과이 H3N2(NIBSC) 인플루엔자 B/플로리다/4/2006(NIBSC) 및 인플루엔자 A/PR/8/34(NIBSC))의 어그리게이션에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 도 2f, 2g 및 2h는 각각 3개의 다른 염기성 아미노산(L-아르기닌, L-리신 및 L-히스티딘)이 3개의 다른 폴리오바이러스(Sabin) 서브타입 1, 2 및 3의 집합에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3: 본 발명에 따른 최적화된 공정과 비교한 예를 들어 Thomassen, 2013b에 의해 기재된 바와 같은 일반 IPV 제조 공정을 이용한 Sabin-IPV 래트 효력(Albrecht P 등, 1984). 살크-IPV가 레퍼런스 스탠다드로 사용된다(1로 설정됨). 최적화된 공정, 즉 어그리게이션을 저해하는 방법을 이용하여 Sabin-IPV를 제조하고, Thomassen 2013b에 의해 기재된 바와 같이 제조된 Sabin-IPV에 비해 래트에서 대등하거나 보다 우수한 면역원성을 갖는 백신을 생산하였다. 살크-IPV는 내부 레퍼런스 스탠다드로서 사용된다(1로 설정됨).
도 4: 디아필트레이션에 의한 폴리오바이러스(Sabin 타입 2) SEC 산물로부터 L-아르기닌의 제거. 디아필트레이션에 의한 폴리오바이러스(Sabin 타입 2) SEC 산물로부터 L-아르기닌의 제거는 바이러스의 어그리게이션을 촉발한다. 10 용량의 모든 L-아르기닌이 제거된 후에 디아필트레이션에 의해 소정 양의 L-아르기닌(정사각형)이 제거된다. 집합된 바이러스(다이아몬드)는 흡광도 측정을 이용하여 측정되었다. A-아르기닌의 완전한 제거 후, 폴리오바이러스 집합체는 시간 의존 방식으로 형성된다. 따라서 측정 및 전도성에 이어서 L-아르기닌의 제거는 바이러스 집합체의 형성에 의해 야기되는 광 산란성을 증가시킨다(UV 증가).
도 5: 다양한 염기성 아미노산 및 이의 유도체가 폴리오바이러스 집합체의 감소에 미치는 영향. 다양한 화합물은 분명히 이들의 타입 및 농도에 따라 다른 영향을 보여준다. 예를 들어, 아그마틴, L-리신 및 3개의 염기성 아미노산의 혼합물에 있어서, 보다 낮은 농도에서 가장 깊은 감소는 최대 50mM까지의 범위이다. 모든 경우에, UV에 의한 측정시 출발 물질로부터 집합체의 감소는 분명히 가시적이며, 이들의 농도에 따라 달랐다.
본 발명자들은 백신 제조시 다양한 바이러스(엔벨로프(즉, 인플루엔자) 및 논-엔벨로프(즉, 폴리오바이러스))의 프로세싱 중뿐만 아니라 (중간) 바이러스 산물의 보관 중 모두에서 (예를 들어, 아르기닌과 같은) 염기성 아미노산, 및 이의 여러 유도체가 집합체 형성의 저해를 위해 그리고 이미 형성된 집합체의 가용화(용해/분해)를 위해 사용될 수 있음을 예기치 않게 발견하였다. 이러한 바이러스는 다양한 배양 시스템으로부터 유도된다(부화 알에 의해서 인플루엔자가 유도되며, 세포 배양에 의해 폴리오바이러스가 유도됨). 결과적으로, 생물학적 활성 산물을 유지하면서, 현저히 더 높은 바이러스 산물 회수가 달성되며 그리고/또는 보다 우수한 오염물의 제거가 이루어진다. 이러한 보다 더 높은 바이러스 수율은 공지진 바이러스 정제 방법에 비해 현저하게 경제적인 장점을 제공하며, 예상치 못한 것이었다.
염기성 아미노산을 이용한 어그리게이션의 저해는 모노클로날 항체(MAbs) 및 단백질(Baynes BM, 2004 및 2005)에 대해 이전에 나타난바 있다. 그러나, 바이러스와 같이 매우 복잡한 제4급 단백질 구조물에 대해서는 입증되지 않았다. 클로스트리듐 톡소이드(US2011/0045025)의 경우에, 아르기닌은 심지어 어그리게이션을 촉진하였다.
더욱이, 아르기닌과 같은 염기성 아미노산은 또한 살 바이러스 활성을 갖는 것으로 나타났으며(Yamasaki H, 등, 2008; Utsunimoya H, 등, 2009; Arakawa T, 등, 2009), 이는 이들을 바이러스 및 바이러스 성분의 프로세싱 중에 사용하기에 어려운 제제인 것으로 만든다.
염기성 아미노산을 이용한 정상 단백질의 어그리게이션을 억제하는 방법은 이미 확인되었다. 본 발명에서, 본 발명자들은 (바이러스 백신 또는 생물학적 복합체에 대한 경우와 같이) 안정한 제4급 구조물을 형성하는 여러 다양한 단백질들 "블록들(blocks)"(폴리 단백질/다중 서브유닛 구조물)을 구성하는 고 복합 구조물에 대해 어그리게이션이 억제되고, 감소되고, 그리고/또는 저해될 수 있음을 발견하였다. 당해 기술분야의 숙련자는 일부 단백질이 단독으로 일부 경우에 염기성 아미노산에 의해 안정화될 수 있는 3차 구조를 형성한다는 것을 이해한다. 그러나, 바이러스는 다중의 이러한 (다양한) 3차 구조물로 함께 구성되며, 결합/조립되어 나선형, 이소카헤드럴(isocahedral) 또는 심지어 보다 복잡한 구조를 갖는 (일시적으로)/안정한 산물(제4급 구조)을 형성한다. 본 발명에서 시험된 바이러스들 중 하나는 멤브레인 엔벨로프를 포함하여 구성되기 때문에 이러한 종류의 복합 구조를 갖는다. 바이러스는 이들이 숙주 세포를 이용하여 이들 자체를 복제 및 증식/생산할 수 있으며 자연 선택에 의해 진화할 수 있는 견지에서 일반 복합 (생물학적) 제4급 단백질과 상이하다(Holes EC 2007; Taylor DJ 등, 2013). 또한 일부 바이러스는 숙주 세포 내로 게놈 물질을 수송하기 위해 특수화된 구조를 형성하는 능력을 갖거나(Sun L 등, 2014) 또는 다른 바이러스, 소위 바이로파지(virophage)에 의해 기생화되는 것으로 나타났다(Pearson H, 2008; 및 Desnues, C, 등 2010).
엔벨로프 및 논-엔벨로프 바이러스 모두 세포 내로의 진입은 세포 리셉터와 바이러스 코트 또는 엔벨로프 사이의 상호작용을 필요로 한다. 이들은 자물쇠에 대한 열쇠와 같이 특정 숙주 세포에 대해 특이적이다. 이러한 바이러스 제4급 구조물은 이의 일차 기능이 세포들 사이의 수송시 게놈을 (예, 열, pH, UV 등으로부터) 보호하고, 또한 엠바디먼트((embodiment) 내에 내부적으로 또는 외부 환경에서 완전히 새로운 개체/숙주 엠바디먼트로 민감한 숙주 세포에 대해 바인딩하는 것이기 때문에, 올바른 형태/구조로 (부분적으로 바이러스 코트를 형성) 유지될 필요가 있다.
바이러스 성분의 구조의 복합성, 작동 및 복잡성의 견지에 비추어, 당해 기술분야의 숙련자는 염기성 아미노산의 사용이 바이러스 구조를 본래 상태로 유지하고 감염성, 특이성 및 면역원성이 유지되면서 어그리게이션을 저해하거나 감소시킬 수 있다는 것을 예측할 수 없다.
따라서, 제1견지로, 본 발명은 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 또는 이의 혼합물의 사용을 포함하는 바이러스 성분의 어그리게이션의 저해 및/또는 감소 방법에 관한 것이다. 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 및/또는 감소시키는 방법은 바람직하게 바이러스 성분을 포함하는 조성물을 제조하는 방법 또는 그 일부에 적용된다.
염기성 아미노산 또는 이의 유도체
염기성 아미노산은 약학적으로 허용되는 어느 D- 또는 L-아미노산일 수 있다. 염기성 아미노산은 염화물 형태(예, 하나 또는 그 이상의 염산에 바인딩된 형태) 또는 다른 결합된 화학적 형태일 수 있다. 이러한 아미노산은 3개의 스탠다드 '프로티노제닉(proteinogenic)' 또는 '자연(natural)' 아미노산, 히스티딘, 아르기닌, 리신 뿐만 아니라 이의 유도체를 포함한다. 히스티딘, 아르기닌 및/또는 리신은 광학 D- 또는 L-이성질체 또는 이의 혼합물일 수 있으나, 바람직하게 아미노산(들)은 L-이성질체이다.
염기성 아미노산의 유도체는 당해 기술분야의 숙련자에 의해 합성될 수 있는 이의 어느 유도체 형태일 수 있다. 참조예: http://www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemistryproducts.html?TablePage=1625523 또는 Sigma Aldrich의 "Amino Acid Derivatives" 제품 카타로그 또는 이외의 다른 상업적 공급처.
염기성 아미노산의 유도체는 히스티딘, 아르기닌 또는 리신의 키랄 또는 이성체 형태일 수 있다. 염기성 아미노산의 유도체는 히스티딘, 아르기닌 또는 리신의 대사 산물일 수 있다. 리신의 바람직한 유도체는 트라넥사민산, N-ε-포밀-L-리신, 및 DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드 및 L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드와 같은 리신의 모노 또는 디하이드로클로라이드염으로부터 선택된다. 아르기닌의 바람직한 유도체는 N-α-아세틸 L-아르기닌, 아그마틴, 아그마틴 설페이트염, 및 L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드와 같은 아르기닌의 모노 또는 디하이드로클로라이드염으로부터 선택된다. 히스티딘의 바람직한 유도체는 3-메틸-L-히스티딘 및 α-메틸-DL-히스티딘 디하이드로클로라이드와 같은 히스티딘의 모노 또는 디하이드로클로라이드염으로부터 선택된다.
바람직한 구현으로, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 L-아르기닌, D-아르기닌, L-리신, L-히스티딘, 아르기닌, 리신, 히스티딘의 키랄/이성체/라세미체 형태, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아르기닌, 리신, 히스티딘의 대사 산물, N-α-아세틸 L-아르기닌, 아그마틴, 아그마틴 설페이트염, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, N-ε-포밀-L-리신, 리신의 모노하이드로클로라이드염, 히스티딘의 모노하이드로클로라이드염, 아르기닌의 모노하이드로클로라이드염, 리신의 디하이드로클로라이드염, 히스티딘의 디하이드로클로라이드염, 아르기닌의 디하이드로클로라이드염, DL-5-하이드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘 및 α-메틸-DL-히스티딘 디하이드로클로라이드, 아르기닌-글루타메이트, 아르기닌-아세테이트 아르기닌-아스파테이트, 아르기닌-설페이트, 리신-글루타메이트, 리신-아세테이트, 히스티딘-아세테이트, 부티로일-L-아르기닌, Nα-코코일-L-아르기닌 에틸 에스테르, N-[3-알킬(12, 14)옥시-2-히드록시프로필]-L-아르기닌 하이드로클로라이드, L-아르기닌 코코에이트로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 또한 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 아르기닌-글루탐산, 아르기닌-아세테이트산, 아르기닌-아스파테이트산 등과 같은 염 형태와 조합될 수 있음이 예상된다.
염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 바이러스 성분 및 이의 집합체를 포함하는 조성물 또는 용액에 0.01-1000mM 또는 0.015-1000mM 범위, 또는 적어도 0.01, 0.015, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, 0.5, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 81, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 또는 1000mM 및/또는 1000mM, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 1, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.1, 0.05, 0.015 또는 0.01mM 미만의 범위의 최종 농도를 얻도록 첨가될 수 있다. 만일 하나 이상의 별개의 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 상기 조성물 또는 용액에 존재하는 경우에, 후술하는 바와 같이, 상기 나타낸 농도는 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도를 가리킨다. 만일 하나의 염기성 아미노산 또는 이의 하나의 유도체가 사용되는 경우에, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도는 상기 아미노산의 농도와 동일하다. 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 바이러스 성분 및 이의 집합체를 포함하는 조성물 또는 용액에, 첨가제(부형제, 공용매 또는 공존 용질이라고도 지칭됨)로서, (혼합물에 용해될) 고형물로서, 물이나 버퍼에 담긴 (농축) 수용액으로서 첨가되거나, 또는 예를 들어 디아필트레이션을 통해 상기 염기성 아미노산을 포함하는 물이나 버퍼에 대해 교환될 수 있는 것으로 이해된다.
바이러스의 정체(identity)에 따라, 당해 기술분야의 숙련자는 어그리게이션의 저해 또는 감소에 원하는 효과를 이루도록 농도를 조정할 수 있다. 예를 들어 폴리오바이러스에 대해, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도는 바람직하게 100mM 이하 또는 150mM 이하이다.
바람직한 염기성 아미노산은 아르기닌이며, 보다 바람직하게 L-아르기닌이다. 상기 바이러스 성분 및 이의 집합체를 포함하는 상기 조성물 또는 용액에서 L-아르기닌의 바람직한 농도는 0.01-1000mM, 0.015-1000mM, 0.05-1000mM, 0.1-1000mM, 0.5-1000mM, 0.8-1000mM, 1-1000mM, 0.1-900mM, 0.8-900mM, 1-900mM, 0.1-800mM, 0.8-800mM, 0.1-700mM, 0.5-700mM, 1-600mM, 5-500mM, 10-400mM, 15-300mM, 20-200mM, 25-200mM, 30-200mM, 35-200mM, 40-200mM, 45-200mM, 50-300 mM, 또는 70-250mM 범위이다. 우수한 결과는 폴리오바이러스의 경우에 150mM로 획득되었으며, 인플루엔자 바이러스의 경우에 350mM로 획득되었다.
아르기닌의 바람직한 유도체 또는 산물 형태는 아그마틴이다. 바이러스 성분 및 이의 집합체를 포함하는 상기 조성물 또는 용액에서 아그마틴의 바람직한 농도는 0.01-1000mM, 0.015-1000mM, 0.05-1000mM, 0.1-1000mM, 0.5-1000mM, 0.8-1000mM, 1-1000mM, 0.1-900mM, 0.8-900mM, 1-900mM, 0.1-800mM, 0.8-800mM, 0.1-700mM, 0.5-700mM, 1-600mM, 5-500mM, 10-400mM, 15-300mM, 20-200mM, 25-200mM, 30-200mM, 35-200mM, 40-200mM, 45-200mM, 50-300mM 또는 70-250mM 범위이다. 우수한 결과는 100mM을 사용한 경우 및 25mM을 사용한 경우에 획득되었다.
다른 바람직한 염기성 아미노산은 리신이며, 보다 바람직하게는 L-리신이다. 바이러스 성분 및 이의 집합체를 포함하는 상기 조성물 또는 용액에서 리신의 바람직한 농도는 0.01-1000mM, 0.015-1000mM, 0.05-1000mM, 0.1-1000mM, 0.5-1000mM, 0.8-1000mM, 1-1000mM, 0.1-900mM, 0.8-900mM, 1-900mM, 0.1-800mM, 0.8-800mM, 0.1-700mM, 0.5-700mM, 1-600mM, 5-500mM, 10-400mM, 15-300mM, 20-200mM, 25-200mM, 30-200mM, 35-200mM, 40-200mM, 45-200mM, 50-300mM 또는 100-250mM 범위이다. 우수한 결과는 150mM을 사용한 경우 및 75mM을 사용한 경우에 획득되었다.
염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 용액은 바람직하게 예를 들어, 6.0-8.0 또는 6.5-7.5 범위 내 pH, 또는 약 7.0의 pH와 같이 중성 pH를 갖는다. 보다 바람직하게, 상기 용액의 pH는 사용되는 염기성 아미노산의 pI 미만이다. 이 용액은 바람직하게 상기 나타낸 값으로 pH를 유지하기 위해 버퍼를 포함한다. 원칙적으로 어느 약학적으로 허용되는 버퍼가 상기 용액에 사용될 수 있으며, 이는 바람직하게 상기 나타낸 바와 같은 pH 값의 범위 내에서 효과적인 완충 성능을 갖는다. 상기 버퍼는 바람직하게 0.5-100mM 범위, 보다 바람직하게 1-75mM 범위, 그리고 가장 바람직하게 20 또는 40mM과 같이 2-40mM의 범위 내의 농도로 존재한다.
상기 용액에 사용하기에 적절한 버퍼는 이에 한정하는 것은 아니나 McIlvaine 버퍼(0.1M 시트르산과 0.2M 디소듐 포스페이트의 혼합물), 시트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, HEPES 버퍼, PIPES 버퍼 및 히스티딘 버퍼를 포함한다.
보다 바람직하게, 본 발명에 사용되는 각각의 염기성 아미노산 또는 유도체는 바람직하게 pH 7로 완충된다. 보다 바람직하게 상기 버퍼는 20 또는 40mM의 농도의 포스페이트 버퍼이다.
그러나, 또한 버퍼가 필요없거나 버퍼가 존재하지 않는 것이 본 발명의 정황에 포함된다. 이 경우에, 상기 조성물 또는 용액은 본 명세서에 정의된 바와 같이 바이러스 성분 및 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하거나 이로 구성되며 추가의 버퍼는 포함되지 않는다. 바람직하게 상기 조성물 또는 용액은 본 명세서에 정의된 바와 같이 상기 바이러스 성분 및 염기성 아미노산으로 구성된다.
하나 이상의 염기성 아미노산 및/또는 이의 하나 이상의 유도체가 바이러스 성분의 어그리게이션의 저해 및/또는 감소를 위해 본 발명의 방법에 사용되는 것이 본 발명의 정황에 포함된다. 염기성 아미노산의 바람직한 조합은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하는 조합이다. 또한 본 발명의 방법의 주어진 단계에서(즉, 상향 흐름 프로세싱, 하향 흐름 프로세싱, 불활성화 단계 및/또는 제형화 단계) 주어진 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 예상되며, 그리고 이와 동일한 방법의 다른 단계에서 구별되는 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 예상된다. 예를 들어, 아그마틴이 농축 물질에 첨가될 수 있으며, 한편 아그리닌은 예를 들어 크로마토그래피 단계 중과 같이 하향 흐름 정제 프로세스 단계 중에 사용될 수 있다.
상기 염기성 아미노산은 상기 방법의 어느 단계 중에 첨가되거나 존재할 수 있으나 상기 방법의 모든 단계 중에 존재할 필요가 없을 수 있다. 상기 염기성 아미노산은 여과, 크로마토그래피 또는 투석의 수단에 의해 필요에 따라 쉽게 제거되거나 교환될 수 있다(실시예 6 참조).
바이러스 성분
본 명세서에서 "바이러스 성분(viral component)"은 포유류에 적용시, 특히 인간에 적용시, 바람직하게는 약학적으로 허용되는 형태로 적용시 생리학적으로 활성적이거나 생리학적 반응을 활성화시키는 생물학적 제제를 칭한다. 바이러스 성분은 동물, 식물 또는 균류와 같은 숙주 유기체에 의해 생산되거나 이로부터 획득될 수 있다. 바이러스 성분은 단백질-기초 물질, 즉 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드와 같은 단백질성 물질을 포함하는 물질일 수 있다. 바이러스 성분은 예를 들어, DNA, RNA 또는 핵산 유사체와 같은 핵산을 더 포함하거나 이러한 핵산으로 구성될 수 있다. 바이러스 성분은 예를 들어, OMV의 멤브레인 지질, 리포좀, 바이로좀(virosomes)과 같은 멤브레인 지질(들)을 더 포함할 수 있다.
바람직한 바이러스 성분은 바이러스 또는 비리온을 포함하거나 이로 구성되며, 바람직하게 포유류를 감염시키는 바이러스, 바람직하게는 인감을 감염시키는 바이러스를 포함하거나 이로 구성된다. 상기 바이러스는 엔벨로프 바이러스일 수 있으나, 바람직하게 논-엔벨로프 바이러스이다. 본 명세서에서 용어 '바이러스(virus)' 또는 "바이러스 성분(viral component)"은 자연적으로 발생하는 것과 같은 와일드 타입 바이러스(예, 자연 분리체)뿐만 아니라, '인공(man-made)'의 약독화된, 돌연변이, 키메릭, 슈도- 및 디펙티브 바이러스를 포함한다. 용어 '바이러스(virus)' 또는 "바이러스 성분(viral component)"은 또한 재조합 바이러스, 즉 예를 들어 바이러스 게놈의 일부가 하나 이상의 관심있는 유전자(들)로 대체된 하나 이상의 또는 모든 바이러스 유전자 및 유전자 치료 벡터(의 일부)가 결핍된 디펙티브 바이러스와 같은 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작된 바이러스를 포함한다.
바람직한 구현으로, 바이러스 성분은 바이러스 파티클이다. 본 발명의 정황으로, 용어 "바이러스 파티클(virus particle)"은 완전한 비리온뿐만 아니라, 이에 상응하는 와일드 타입 바이러스 비리온과 동일하거나 유사한 크기 및/또는 캡시드 조성을 가지나, 완전한 바이러스 게놈을 함유하지 않거나 바이러스 코어 단백질(예, 뉴클레오프로틴)의 (전체 컴플리먼트) 핵산을 함유하지 않거나 그리고/또는 결핍된 바이러스-유사 파티클을 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법 또는 조성물에 사용될 수 있는 바이러스 성분은 바람직하게 피코르나바이러스 및 오르소믹소바이러스 및 파라믹소바이러스를 포함하는 네가티브-스트랜드 ssRNA 바이러스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 바이러스로부터 얻어진 것이다.
바람직한 피코르나바이러스는 엔테로바이러스이다.
엔테로바이러스는 단일 파지티브-스트랜드 게노믹 RNA로 특징되는 소 RNA 바이러스의 크고 다양한 그룹인, 피코르나바이러스과의 멤버이다. 모든 엔테로바이러스는 약 7,500 베이스의 게놈을 함유하며, 저-충실도(low-fedelity) 및 빈번한 재조합에 기인하여 고 돌연변이율을 갖는 것으로 알려져 있다. 숙주 세포의 감염 후, 게놈은 캡(cap)-독립적 방식으로 단일 폴리프로틴으로 번역되고, 이는 후속적으로 바이러스-암호화된 프로테아제에 의해 주로 바이러스의 복제에 관련되는 구조 캡시드 단백질 및 비구조 단백질로 프로세싱된다. 엔테로바이러스속은 하기 12종을 포함한다: 엔테로바이러스 A(예전의 인간 엔테로바이러스 A), 엔테로바이러스 B(예전의 인간 엔테로바이러스 B), 엔테로바이러스 C(예전의 인간 엔테로바이러스 C), 엔테로바이러스 D(예전의 인간 엔테로바이러스 D), 엔테로바이러스 E(예전의 보바인 엔테로바이러스 그룹 A), 엔테로바이러스 F(예전의 보바인 엔테로바이러스 그룹 B), 엔테로바이러스 G(예전의 포신 엔테로바이러스 B), 엔테로바이러스 H(예전의 시미언 엔테로바이러스 A), 엔테로바이러스 J, 리노바이러스 A(예전의 인간 리노바이러스 A), 리노바이러스 B(예전의 인간 리노바이러스 B) 및 리노바이러스 C(예전의 인간 리노바이러스 C). 이러한 12종 중에서 혈청형은 다음과 같다:
콕사키바이러스:
- 혈청형 CV-A2, CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A7, CV-A8, CV-A10, CV-A12, CV-A14 및 CV-A16(엔테로바이러스 A종 하에서 발견됨).
- 혈청형 CV-B1, CV-B2, CV-B3, CV-B4, CV-B5, CV-B6 및 CV-A9(엔테로바이러스 B종 하에서 발견됨).
- 혈청형 CV-A1, CV-A11, CV-A13, CV-A17, CV-A19, CV-A20, CV-A21, CV-A22 및 CV-A24(엔테로바이러스 C종 하에서 발견됨).
에코바이러스:
- 혈청형 E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, E-9, E-11, E-12, E-13, E-14, E-15, E-16, E-17, E-18, E-19, E-20, E-21, E-24, E-25, E-26, E-27, E-29, E-30, E-31, E-32, 및 E-33(엔테로바이러스 B종 하에서 발견됨).
엔테로바이러스:
- 타입 EV-A71, EV-A76, EV-A89, EV-A90, EV-A91, EV-A92, EV-A114, EV-A119, SV19, SV43, SV46 및 BA13(엔테로바이러스 A종 하에서 발견됨).
- 타입 EV-B69, EV-B73, EV-B74, EV-B75, EV-B77, EV-B78, EV-B79, EV-B80, EV-B81, EV-B82, EV-B83, EV-B84, EV-B85, EV-B86, EV-B87, EV-B88, EV-B93, EV-B97, EV-B98, EV-B100, EV-B101, EV-B106, EV-B107, EV-B110 및 SA5(엔테로바이러스 B종 하에서 발견됨).
- 타입 EV-C95, EV-C96, EV-C99, EV-C102, EV-C104, EV-C105, EV-C109, EV-C116, EV-C117 및 EV-C118(엔테로바이러스 C종 하에서 발견됨).
- 타입 EV-D68, EV-D70, EV-D94, EV-D111 및 EV-D120(엔테로바이러스 D종 하에서 발견됨).
- 타입: EV-H1(엔테로바이러스 H종 하에서 발견됨).
- 타입: SV6, EV-J103, EV-J108, EV-J112, EV-J115 및 EV-J121(엔테로바이러스 J종 하에서 발견됨).
인간 리노바이러스:
- 타입 HRV-A1, HRV-A2, HRV-A7, HRV-A8, HRV-A9, HRV-A10, HRV-A11, HRV-A12, HRV-A13, HRV-A15, HRV-A16, HRV-A18, HRV-A19, HRV-A20, HRV-A21, HRV-A22, HRV-A23, HRV-A24, HRV-A25, HRV-A28, HRV-A29, HRV-A30, HRV-A31, HRV-A32, HRV-A33, HRV-A34, HRV-A36, HRV-A38, HRV-A39, HRV-A40, HRV-A41, HRV-A43, HRV-A44, HRV-A45, HRV-A46, HRV-A47, HRV-A49, HRV-A50, HRV-A51, HRV-A53, HRV-A54, HRV-A55, HRV-A56, HRV-A57, HRV-A58, HRV-A59, HRV-A60, HRV-A61, HRV-A62, HRV-A63, HRV-A64, HRV-A65, HRV-A66, HRV-A67, HRV-A68, HRV-A71, HRV-A73, HRV-A74, HRV-A75, HRV-A76, HRV-A77, HRV-A78, HRV-A80, HRV-A81, HRV-A82, HRV-A85, HRV-A88, HRV-A89, HRV-A90, HRV-A94, HRV-A95, HRV-A96, HRV-A98, HRV-A100, HRV-A101, HRV-A102 및 HRV-A103(리노바이러스 A종 하에서 발견됨).
- 타입 HRV-B3, HRV-B4, HRV-B5, HRV-B6, HRV-B14, HRV-B17, HRV-B26, HRV-B27, HRV-B35, HRV-B37, HRV-B42, HRV-B48, HRV-B52, HRV-B69, HRV-B70, HRV-B72, HRV-B79, HRV-B83, HRV-B84, HRV-B86, HRV-B91, HRV-B92, HRV-B93, HRV-B97, 및 HRV-B99(리노바이러스 B종 하에서 발견됨).
- 타입 HRV-C1, HRV-C2, HRV-C3, HRV-C4, HRV-C5, HRV-C6, HRV-C7, HRV-C8, HRV-C9, HRV-C10, HRV-C11, HRV-C12, HRV-C13, HRV-C14, HRV-C15, HRV-C16, HRV-C17, HRV-C18, HRV-C19, HRV-C20, HRV-C21, HRV-C22, HRV-C23, HRV-C24, HRV-C25, HRV-C26, HRV-C27, HRV-C28, HRV-C29, HRV-C30, HRV-C31, HRV-C32, HRV-C33, HRV-C34, HRV-C35, HRV-C36, HRV-C37, HRV-C38, HRV-C39, HRV-C40, HRV-C41, HRV-C42, HRV-C43, HRV-C44, HRV-C45, HRV-C46, HRV-C47, HRV-C48, HRV-C49, HRV-C50 및 HRV-C51(리노바이러스 C종 하에서 발견됨).
폴리오바이러스:
- 혈청형 PV-1, PV-2 및 PV-3(엔테로바이러스 C종 하에서 발견됨).
바람직한 엔테로바이러스는 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, 에코바이러스 및 엔테로바이러스 68, 69, 70, 71 및 73(예, 타입 EV-D68, EV-B69, EV-D70 및 EV-A71)을 포함한다. 보다 바람직하게 상기 바이러스는 폴리오바이러스이다. 바이러스 성분은 폴리오바이러스 혈청형 1, 2 및 3 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 바람직하게 바이러스 성분은 3가지 모든 바이러스 혈청형 1, 2 및 3을 포함한다. 혈청형 1 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나 Sabin 1, Mahoney, Brunenders, Brunhilde, CHAT 및 Cox 스트레인 중 하나 이상을 포함한다. 혈청형 2 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나 Sabin 2, MEF-1 및 Lansing 스트레인 중 하나 이상을 포함한다. 혈청형 3 폴리오바이러스의 적절한 스트레인은 이에 한정하는 것은 아니나 Sabin 3, Saukett H 및 G, 및 Leon 스트레인을 포함한다. 바람직한 구현으로, 바이러스 성분은 예를 들어, 타입 1에 대해서 불활성화 폴리오 바이러스 Mahoney 스트레인, 타입 2에 대해서 불활성화 폴리오 바이러스 MEF-1 스트레인 및 타입 3에 대해서 불활성화 폴리오 바이러스 사우케트 스트레인을 함유하는 살크-IPV(Salk-IPV)와 같이, 또는 불활성화 폴리오 바이러스 Sabin-1, -2 및 -3 스트레인을 함유하는 sIPV와 같이 3가 불활성화 소아마비 백신이거나 이를 포함한다(van Wezel 등, 1978; Montagnon 등, 1983 & 1984). VLP(Virus-like Particles, 바이러스-유사 파티클)이 또한 본 발명의 범위 내로 예상된다.
다른 구현으로, 바이러스는 네가티브-스트랜드 ssRNA 바이러스(모노네가바이럴즈(Mononegavirales))이다. 네가티브-스트랜드 ssRNA 바이러스는 하기 바이러스들을 포함한다:
보나비리데(Bornaviridae):
보나바이러스(Bornavirus) 보르나병 바이러스(Borna disease virus)
랩도비리데(Rhabdoviridae):
베지큘로바이러스(Vesiculovirus) 수포성 구내염 인디아나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus)
리사바이러스(Lyssavirus) 광견병 바이러스(Rabies virus)
에페머로바이러스 ( Ephemerovirus) 소 유행열 바이러스(Bovine ephemeral fever virus)
노비르합도바이러스 ( Novirhabdovirus) 전염성 조혈괴사증 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus)
필로비리데(Filoviridae):
마르부르그바이러스(Marburgvirus) 빅토리아 호수 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus)
에볼라바이러스(Ebolavirus) 자이레 에볼라바이러스(Zaire ebolavirus)
파라믹소비리데(Paramyxoviridae):
파라믹소비리나에(Paramyxovirinae):
루불라바이러스(Rubulavirus) 유행성이하선염 바이러스(Mumps virus)
아불라바이러스(Avulavirus) 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus)
레스피로바이러스(Respirovirus) 센다이 바이러스(Sendai virus)
헤니파바이러스(Henipavirus) 헨드라 바이러스(Hendra virus)
모빌리바이러스(Morbillivirus) 홍역 바이러스(Measles virus)
뉴모비리나에 ( Pneumovirinae ):
뉴모바이러스(Pneumovirus) 인간 호흡기 합포체 바이러스(Human respiratory syncytial virus)
메타뉴모바이러스(Metapneumovirus) 조류 메타뉴모바이러스(Avian metapneumovirus)
오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae):
인플루엔자바이러스 A(Influenzavirus A) 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus)
인플루엔자바이러스 B(Influenzavirus B) 인플루엔자 B 바이러스(Influenza B virus)
인플루엔자바이러스 C(Influenzavirus C) 인플루엔자 C 바이러스(Influenza C virus)
토고토바이러스(Thogotovirus) 토고토 바이러스(Thogoto virus)
이사바이러스(Isavirus) 감염성 연어 빈혈증 바이러스(Infectious salmon anemia virus)
버냐비리데(Bunyaviridae):
오르소버냐바이러스(Orthobunyavirus) 버냐워라 바이러스(Bunyamwera virus)
한타바이러스(Hantavirus) 한탄 바이러스(Hantaan virus)
나이로바이러스(Nairovirus) 더그비 바이러스(Dugbe virus)
플레보바이러스(Phlebovirus) 리프트 밸리열 바이러스(Rift Valley fever virus)
아레나비리데(Arenaviridae):
아레나바이러스(Arenavirus) 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus)
바람직한 네가티브-스트랜드 ssRNA 바이러스는 파라믹소비리데 또는 오르소믹소비리데에 속하는 바이러스이다. 파라믹소비리데의 바람직한 바이러스는 파라믹소비리나에 또는 뉴모비리나에에 속하는 상기 열거된 바이러스이다. 뉴모바이러스는 바람직하게 호흡기 합포체 바이러스(RSV)이며, 보다 바람직하게 인간 또는 보바인 RSV이다. 인간 RSV는 서브그룹 A 또는 B 바이러스일 수 있으며, 바람직하게 임상적 분리체이며, 보다 바람직하게는 시험관에서 광범위하게 패시지되지 않은(바람직하게 10, 8, 6 또는 5회 미만으로 패시지된) 분리체이다. 바람직하게 (인간 또는 보바인) RSV 바이러스는 예를 들어, 바이러스 게놈 내에 돌연변이를 가져 이에 의해 바이러스 게놈이 예를 들어, WO 2005/061698 및 Widjojoatmodjo 등, 2010에 기재된 바와 같은 RSV ΔG 및 RSV ΔG+G 비리온과 같은 기능성 G 결합 단백질을 암호화하지 않는, 결실되거나 불활성화된 G 결합 단백질 유전자를 갖는 바이러스 게놈을 포함하는 바이러스이다. 파라믹소비리데의 바람직한 바이러스는 루불라바이러스(유행성 이하선염 바이러스) 및 모빌리바이러스(홍역 바이러스)를 포함한다.
다른 구현으로, 바이러스 성분은 오르소믹소비리데의 바이러스 또는 비리온이다. 바람직한 오르소믹소비리데는 인플루엔자 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C의 인플루엔자 바이러스일 수 있으며, 이 중 인플루엔자 바이러스 A가 가장 바람직하다. 인플루엔자 A 바이러스의 바람직한 서브타입은 2009 전 세계적 유행성 돼지 기원 인플루엔자 A(pandemic swine origin influenza A)(H1N1) 바이러스(SOIV 또는 HIN1v)를 포함하여 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7를 포함한다.
바이러스 성분은 바람직하게 ml 당 1 × 100 내지 7 × 1016 살아있는 및/또는 사멸되거나 불활성화된 파티클 범위의 양으로 조성물 또는 용액에 존재한다. 살아있는 파티클의 수는 예를 들어 플라크 형성 유닛, 세포 배양 또는 조직 배양 50% 감염 도즈(CCID50 또는 TCID50) 및 바이러스 성분의 타이터를 측정하는 다른 적절한 바이러스학적 어세이에 의해 측정될 수 있다. 사멸 또는 불활성화된 파티클의 수는 예를 들어, 단백질 어세이 또는 헤마글루티닌 유닛이나 폴리오 D-항원 또는 N-항원 유닛을 검출하는 어세이와 같이 항원의 양을 정량화하는 어세이를 이용하여 측정될 수 있다. 바람직하게 바이러스 성분은 ml 당 적어도 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109 또는 1 x 1010 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013 의 살아있는 그리고/또는 사멸 또는 불활성화된 파티클의 양으로, 그리고/또는 ml 당 7 x 1016, 1 x 1016, 1 x 1015 의 살아있는 그리고/또는 사멸 또는 불활성화된 파티클의 양으로 존재한다.
상기 조성물 또는 용액에서 바이러스 성분의 양은 또한 용액의 ml 당 상기 바이러스 성분의 중량으로 표현될 수 있다. 바람직하게 바이러스 성분은 1fg/ml 내지 10g/ml 범위의 중량/ml로 용액에 존재한다. 보다 바람직하게, 바이러스 성분은 적어도 10-15, 10-14, 10-13, 10-12,10-11, 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4, g/ml 및/또는 최대 10-3, 10-2, 10-1, or 100 g/ml의 양으로 상기 조성물 또는 용액에 존재한다. 상기 조성물 또는 용액에서 상기 바이러스 성분의 중량은 예를 들어, 단백질 어세이를 포함하여 당해 기술분야에 알려진 수단에 의해 측정될 수 있다. 생물약학 제제의 상술한 중량은 이에 따라 또한 ml 당 그람 단백질로 표현될 수 있으며, 이는 적절한 단백질 어세이(예, Bradford 어세이; Zor 및 Selinger, 1996)로 측정된다.
조성물 또는 용액에 존재하는 바이러스 성분이 폴리오바이러스이거나 이를 포함하는 바람직한 구현으로, 상기 조성물 또는 용액에서 폴리오바이러스의 양은 적어도 0.01, 0.1, 1.0 또는 10DU/ml이며, 최대 10.000, 1.000 또는 100DU/ml이며, 여기서 1DU는 WHO 권고(TRS, N0 980, Annex 2, 2014), 세계 보건 기구 WHO 기술 보고서 시리즈, 회백수염 백신(불활성화)의 제조 및 조절을 위한 권고에 기재된 바와 같이 정의되어 있는 것이거나, 또는 여기서 1DU는 Westdijk 등, 2011 또는 Ten Have 등, 2012에 기재된 바와 같이 ELISA로 정의되고 검출된다. 상기 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액은 백신이거나 이를 포함하며, 바람직하게 다가 폴리오바이러스(백신)가 존재하는 구현에서, 각 폴리오 바이러스 혈청형은 적어도 0.01, 0.1, 1.0 또는 10DU/ml의 양으로 존재하며, 최대 10.000, 1.000 또는 100DU/ml의 양으로 존재한다.
바람직한 구현으로, 조성물 또는 용액에 존재하는 바이러스 성분은 RSV이거나 이를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 조성물 또는 용액에서 RSV의 양은 적어도 1 x 101, 1 x 102, 1 x 103, 1 x 103, 1 x 104 TCID50/ml이며, 최대 7 x 1016, 1 x 1016, 1 x 1015, 1 x 1014 TCID50/ml이며, 여기서 RSV에 대한 TCID50은 Widjojoatmodjo 등, 2010에 의해 기재된 바와 같이 정의되고 측정된다.
어그리게이션
발명의 정황으로, 어그리게이션은 성분들 간의 상호작용을 의미하며, 여기서는 바이러스 파티클과 같은 바이러스 성분들 간을 상호작용을 의미한다. 그러나, 어그리게이션은 또한 숙주 세포 단백질과 같은 불순물처럼 조성물이나 용액에 존재하는 물질을 갖는 바이러스 파티클의 어그리게이션을 포함한다. 이러한 상호작용은 공유결합이거나 비공유결합, 가용성 또는 불용성, 가역성 또는 비가역성일 수 있다. 어그리게이션은 바이러스 성분을 제조하는 프로세스 중 어느 단계에서, 즉, 배양 단계, 정제 단계, 불활성화 및/또는 제형화 단계에서 조우될 수 있다. 또한 어그리게이션은 바이러스 성분이 제조되면 조우될 수 있다. 형성된 어그리게이션은 파티클로서 존재하며, 현재의 가이드라인은 (생물)약제의 최종 품목(lot)(미국 및 유럽 약전)에서 허용되는 파티클 수를 한정한다.
조성물 또는 용액에서 바이러스 성분은 상술한 바와 같이 살아있거나, 사멸되거나 약화된 가용성 파티클로 존재할 수 있다. 바이러스 성분은 또한 상기 조성물이나 용액에 집합체로 존재할 수 있다. 보통 이러한 바이러스 성분의 집합체는 제거되어야 한다. 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액에서 집합체의 존재는 특정 파장의 함수로서 반사 또는 전파 특성을 정량화함으로써 직접 평가될 수 있다. 파장은 200 및 1000nm 범위를 포함한다. 보통 450 또는 590nm가 선택된다. 바람직하게 광학 밀도가 실시예 3에서 수행된 바와 같이 평가된다. 광학 밀도의 감소는 어그리게이션의 감소에 상응하는 광 산란 감소를 나타낸다.
변형적으로, 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액에서 집합체의 존재는 탁도(FTU/NTU), 필드 플로우 프랙셔닝(Field flow fractioning), 전자 현미경 또는 DLS 또는 MALS와 같은 광 산란을 측정함으로써 평가될 수 있다. 입수가능한 상업용 키트가 존재하며, 이는 특정 적용을 위해 맞춰질 수 있다(예, ProteoStat, Enzo life science part# ENZ-51023-KP002).
변형적으로, 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액에서 집합체의 존재는 크기 배제 크로마토그래피 또는 비-변성 조건 하에서의 겔-전기영동을 이용하여 평가될 수 있으며, 여기서 산물과 집합체는 컬럼 상에 또는 겔 슬랩에서 분리되며 상기 기술에 의해 또는 이의 조합에 의해 정량화된다(Li Y, 2009). 어그리게이션 분석 기술에 대한 보다 많은 배경기술은 Das TK 2012 및/또는 Wei Wang, 2005에서 찾아볼 수 있다.
작용기의 유용성은 예를 들어 ELISA 또는 바이오센서 어세이에 의해 평가될 수 있으며, 여기서 측정치의 증가는 어그리게이션의 감소에 상응한다. 폴리오바이러스에 대해서, D-항원 에피토프에 기초한 패스트 ELISA 어세이가 이미 기재되어 있다(ten Have 등, 2012). D-항원 양의 감소는 보다 많은 에피토프가 어그리게이션 감소를 나타내는 측정에 대해 유용/접근가능하다.
이러한 정황으로, 어그리게이션의 감소 또는 저해 또는 저하는:
- 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 (예를 들어 590nm에서) 광학 밀도의 감소, 및/또는
- 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 D-항원 양의 증가
를 의미할 수 있다.
상기 광학 밀도의 감소 또는 D-항원 양의 증가는 바람직하게 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액에서 (예를 들어 광학 밀도 또는 D-항원 양의 평가를 통해) 존재하는 집합체의 양과 비교하여 평가되며, 여기서:
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 첨가되지 않거나 또는
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 첨가되지 않는 방법으로 제조되거나 획득가능하거나 또는
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도는 0.01mM 미만이다.
바람직하게, 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액은 광학적으로 또는 시각적으로 투명하며, 이는 대부분의 물질이 용액에 존재하며 집합체가 거의 존재하지 않음을 나타낸다. 보다 바람직하게, 상기 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액은 적어도 1, 2, 3 개월간 광학적으로 또는 시각적으로 투명하다.
염기성 아미노산은 예를 들어 광도계, 형광, HPLC, NMR 및 질량 분석법을 포함하는 당해 기술분야에 잘 알려진 수단에 의해 검출될 수 있다.
바이러스 성분을 포함하는 조성물 제조방법
바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 및/또는 감소하는 방법의 바람직한 구현으로, 상기 방법은 바이러스 성분을 포함하는 조성물을 제조하는 방법 또는 그 일부에 적용된다. 따라서, 이 구현은 a) 바이러스 성분을 함유하는 배지를 제조하는 단계; b) 상기 배지로부터 바이러스 성분을 정제하는 단계로서, 이에 의해 정제의 적어도 일부 중에 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 또는 감소하기에 충분한 농도로 존재하는, 바이러스 성분을 정제하는 단계; 및 선택적으로 c) 바이러스 성분의 불활성화; 및 d) 바이러스 성분의 제형화 중 적어도 하나의 단계를 포함하며, 여기서 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 상기 정의한 바와 같은, 바이러스 성분을 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게 상기 방법에서, 염기서 아미노산 또는 이의 유도체는 정제 단계 b)의 전체 기간 중이나 이에 걸쳐 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도로 유지된다. 보다 바람직하게, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 또한 단계 c) 및/또는 단계 d) 중 적어도 일부 중에 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도로 존재한다. 보다 바람직하게, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 c) 및/또는 단계 d) 중 전체 기간 중이나 이에 걸쳐 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 충분한 농도로 유지된다. 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키기기 위한 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 적절한 농도는 상기 주어진 바와 같다.
바람직하게 상기 방법에서 바이러스 성분은 상기 정의한 바와 같이 엔테로바이러스의 성분이다. 보다 바람직하게, 바이러스 성분은 엔테로바이러스 파티클, 즉 바이러스-유사 파티클을 포함하여 상기 정의한 바와 같은 엔테로바이러스의 바이러스 파티클이다.
본 명세서에 나타낸 바이러스 성분 및 파티클은 일반적으로 다중 단계 공정으로 생성된다. 이러한 공정은 하기 단계를 포함할 수 있다.
a) 바이러스 성분을 포함하는 (크루드) 배지를 제조하는 단계. 이 단계는 바이러스 성분을 생산하는 세포를 배양하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 바이러스 성분이 재구성되는, 예를 들어 바이러스-유사 파티클을 생성하기 위해 재구성되는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 이로부터 바이러스 성분이 회수되거나 및/또는 정제될 크루드 배지 또는 조성물을 제조하는 상향 흐름 공정 단계(up-stream processing steps, USP)로 지칭될 수 있다.
b) 하향 흐름 공정 또는 정제 단계(DSP)
IPV 생산을 위해(도 1 참조), 불활성화 단계가 단계 b) 다음에 단계 c)와 같이 수행된다. 또한 제형화 단계 (d)가 단계 b) 또는 c)의 마지막에 수행될 수 있다.
이러한 공정은 당해 기술분야의 숙련자에게 알려져 있으며 생산될 바이러스 성분의 아이덴티티에 따라 조절될 수 있다.
본 명세서에 정의된 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 산물의 공정에서 보조하기 위한 어느 단계(a, b, c 및/또는 d) 중에 첨가될 수 있다.
예를 들어, 단계 a)에서, 적절한 숙주 유기체가 바이러스 성분을 복제하기 위해 사용된다. 이러한 배양 단계는 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액의 생산을 이끈다. IPV 생산을 위해 적절한 세포는 바람직하게 포유류 세포이다. 여러 포유류 세포가 IPV 생산을 위한 폴리오바이러스 복제에 적절한 기질인 것으로 알려져 있다. 유럽 약전(6.0; 01/2008:0214)에 따르면, 이러한 목적으로, 상기 바이러스는 인간 이배체 세포주(예, WI-38 또는 MRC-5), 지속성 세포주(예, Vero)에서, 또는 1차, 2차 또는 3차 원숭이 신장 세포(MKC)에서, 또는 PerC6에서, 또는 CAP 세포에서 증식될 수 있다. 폴리오바이러스는 HeLa 세포에서 배양될 수 있다. 최근의 진전 상황은 Hamidi 등, 2012에 기술되어 있다.
만일 바이러스가 폴리오바이러스인 경우에, Vero 세포주가 바람직하다. 폴리오바이러스 복제를 위해, 하기의 3가지 와일드-타입의 악성 스트레인이 바람직하다: 마호니(Mahoney)(타입 1 폴리오바이러스), MEF-1(타입 2 폴리오바이러스) 및 사우케트(Saukett)(타입 3 폴리오바이러스). 브룬힐드(Brunhilde)(타입 1 폴리오바이러스)와 같은 다른 와일드-타입 스트레인이 또한 IPV의 제조에 사용될 수 있다. 변형적으로, Sabin 폴리오바이러스 스트레인이 IPV 제조에 사용된다(Verdijk 등, 2011). 바람직하게, 세포들은 Van Wezel A.L. 등, 1978에 기재된 바와 같이 마이크로캐리어 상에서 배양된다. 바람직한 마이크로캐리어는 사이토덱스 1(Cytodex 1)이다. IPV를 위한 바람직한 배양 단계는 실험 부분에 기재한다. 최근의 진전 상황은 Hamidi 등, 2012, Widjojoamodjo 등, 2010, Thomassen 등, 2013a에 기재되어 있다.
단계 b)에서, 바이러스 성분은 단계 a)에서 제조, 생산 또는 획득된 이들을 포함하는 조성물 또는 용액으로부터 정제된다. 바이러스의 아이덴티티에 따라 바이러스 성분을 정제하는 다양한 방식이 있다. 이러한 정제 단계는 정화(clarification), 원심분리, 농축, 디아필트레이션(diafiltration), 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피(IEC)에 의해 수행될 수 있다. IPV를 위해 바람직하게, 이러한 정제는 정화, 그 다음 농축, 그 다음 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 그 다음 이온 교환 크로마토그래피(IEC)로 수행된다. 정화는 필터를 사용하여 단계 a)에서 생산된 혼합물에서 수행될 수 있다. 농축은 교차 흐름 여과(CEF)로도 알려진 접선유동여과(tangential flow filtration, TFF) 또는 한외여과(UF)를 이용하여 수행될 수 있다. IPV 생산을 위한 바람직한 정제 단계는 실험 부분 및 Thomassen 등, 2010 및 2013에 기술된다. RSV에 대해서, 일반적으로 정화는 후속적으로 농축, 밀도 구배 원심분리 및 후속적으로 안정화제를 이용한 디아필트레이션이 이어진다. 인플루엔자에 대해서, 원심분리는 후속적으로 여과 및 농축/디아필트레이션이 이어질 수 있다. 밀도 구배 원심분리 단계가 수행되는 경우에, 제형화가 일어나기 전에 불활성화가 후속적으로 이어지고 또한 디아필트레이션이 이어질 수 있다.
바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액을 형성하는 공정은 두 단계 a) 및 b)로 구성될 수 있다. 상기 공정은 하기에 기술한 바와 같이 불활성화 단계라고 불리는 부가적인 단계, 단계 c)를 포함할 수 있다. 단계 c)에서, 여러 정제 단계 후, 바이러스 성분은 불활성화된다. 백신에 안전한 사용을 위해 폴리오 바이러스 스트레인을 불활성화시키는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이에 한정하는 것은 아니나, 예를 들어 포르말린 또는 베타-프로피올락톤을 이용한 불활성화(Jonges 등, 2010)를 포함한다. 상기 공정은 후속적으로 제형화 단계 (d)가 이어진다.
따라서, 본 발명의 공정 또는 방법은 바람직하게 바이러스 성분이 상향 흐름 공정 및 하향 흐름 공정 단계 및 선택적으로 불활성화 단계 및/또는 제형화 단계를 포함하는 공정에 의해 획득가능한 것이다. 따라서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 이러한 단계들 중 어느 단계 중에, 바람직하게는 하향 흐름 공정 및/또는 불활성화 및/또는 제형화 단계 중에 사용될 수 있다.
폴리오바이러스에 대한 바람직한 제조공정은 실험 부분에 기술된다.
본 발명의 방법은 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하기 위해 적용될 수 있다. 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 a), 단계 b) 및/또는 단계 c) 및/또는 단계 d)에서 사용될 수 있다. 바람직하게 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 b) 및/또는 단계 c)에서 사용된다. 보다 바람직하게, 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 b)에서 사용된다. 이는 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 단계 b)에서, 이들의 일부에, 이들 모두에 사용되는 어느 정제 기술에 사용될 수 있음을 의미한다. 심지어 보다 바람직하게, 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 SEC의 용리 버퍼에 및/또는 IEC의 용리 버퍼에 첨가된다. 그러나, 바이러스 파티클을 포함하는 조성물 또는 용액의 생산을 일으키는 어느 단계에 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 사용하는 것이 또한 예상된다. 이러한 단계는 포획 크로마토그래피의 용리 중에, 중간물 또는 최종 산물의 보관 단계 중에, 제형화 단계 d) 중에 수거 단계, 단계 a), 단계 b), 단계 c)를 포함한다. 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 바람직한 최종 농도는 본 명세서에 이미 전술하였다.
바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하는데 사용하는 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 용도
본 발명의 방법은 바이러스 성분의 어그리게이션을 감소시키는데 적용될 수 있다. 바람직하게, 이러한 바이러스 성분은 상술한 바와 같이 단계 a), b) 및 선택적으로 c) 및/또는 d)를 포함하는 공정에 의해 획득가능하다. 이러한 방법에서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액에 첨가된다. 따라서, 일 견지로, 본 발명은 본 명세서에서 상기 정의된 아미노산 또는 이의 유도체를 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해 또는 감소하는데 사용하기 위한 용도에 관한 것으로, 여기서 바이러스 성분은 바람직하게 본 명세서에서 상기 정의한 바와 같으며, 보다 바람직하게 바이러스 성분은 본 명세서에서 상기 정의한 바와 같은 엔테로바이러스 파티클이다.
본 발명의 정황에서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 사용은 이러한 염기성 아미노산 또는 유도체의 사용이 590nm에서 OD의 측정을 이용하거나 또는 본 명세서에서 전술한 어느 다른 방법을 이용하여 평가시, 바이러스 성분을 포함하며,
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 첨가되지 않거나 또는
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 첨가되지 않는 방법으로 생산되거나 획득가능하거나 또는
- 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도가 0.01mM 미만인
조성물 또는 용액에 (예를 들어, 광학 밀도 및/또는 D-항원 양 평가에 의해) 존재하는 집합체의 양에 비해,
상기 조성물 또는 용액에서 집합체의 양의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100%의 감소 또는 저하를 일으키는 경우에, 조성물 또는 용액에서 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는 것을 나타낸다.
본 발명의 정황에서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 사용은 이러한 염기성 아미노산 또는 유도체의 사용이 용액에서 살아있거나 사멸된 또는 불활성화된 파티클의 타이터가 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 사용되지 않은 용액에서 살아있거나 사멸된 또는 불활성화된 파티클의 타이터에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% 증가를 일으키는 경우에, 조성물 또는 용액에서 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는 것을 나타낸다. 타이터는 본 명세서에서 전술한 바와 같이 평가된다.
본 발명의 정황에서, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 사용은 이러한 염기성 아미노산 또는 유도체의 사용이 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 첨가 전의 폴리오 D-항원 유닛의 수와 비교하여 폴리오 D-항원 유닛의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100%의 증가를 일으키는 경우에, 조성물 또는 용액에서 IPV와 같은 바이러스 성분의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는 것을 나타낸다.
바이러스 성분을 포함하는 조성물
다른 견지로, 바이러스 성분을 포함하는 조성물 또는 용액이 제공된다. 본 발명에 따른 "바이러스 성분을 포함하는 조성물(composition comprising viral components)"은 바이러스 성분을 포함하는 본 발명에 따른 용액, 바람직하게는 수용액을 포함하는 것으로 이해된다. 바이러스 성분을 포함하는 조성물은 본 명세서에 전술한 바와 같은 방법으로 획득가능하거나 획득된다. 바이러스 성분을 포함하는 바람직한 조성물은 본 명세서에 상기 정의된 바와 같은 제1견지의 방법으로 획득가능하다. 그러나, 본 발명의 방법 이외의 다른 방법으로 획득된 바이러스 성분을 포함하는 조성물은 분명히 여기에 포함된다. 상기 조성물에서 바이러스 성분은 바람직하게 상기 정의한 바와 같은 바이러스 성분이다. 본 발명의 조성물에서 바람직한 바이러스 성분은 파라믹소비리데 또는 오르소믹소비리데에 속하는 바이러스를 포함하는 네가티브-스트랜드 ssRNA 바이러스의 성분, 바람직하게는 파티클이다. 파라믹소비리데의 바람직한 바이러스는 파라믹소비리나에 또는 뉴모비리나에에 속하는 (상기 열거한 바와 같은) 바이러스이다. 뉴모비리나에(뉴모바이러스)의 바람직한 바이러스는 호흡기 합포체 바이러스(RSV)이며, 보다 바람직하게 인간 또는 보바인 RSV이다. 인간 RSV는 서브그룹 A 또는 B 바이러스일 수 있다. 파라믹소비리나에의 바람직한 바이러스는 루불라바이러스(유행성 이하선염 바이러스) 및 모빌리바이러스(홍역 바이러스)를 포함한다. 다른 구현으로, 상기 조성물 내의 바이러스 성분은 오르소믹소비리데에 혹하는 바이러스의 성분, 바람직하게는 파티클이다. 바람직한 오르소믹소비리데는 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C 속의 인플루엔자 바이러스를 포함하는 인플루엔자 바이러스이며, 이 중 인플루엔자 바이러스 A가 가장 바람직하다. 인플루엔자 A 바이러스의 바람직한 서브타입은 2009 전 세계적 유행성 돼지 기원 인플루엔자 A(pandemic swine origin influenza A)(H1N1) 바이러스(SOIV 또는 HIN1v)를 포함하여 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7를 포함한다.
제1구현으로, 바이러스 성분을 포함하는 조성물은 본 명세서에서 상기 명시한 바와 같이 총 농도로 상기 정의한 바와 같이 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함한다.
제2구현으로, 상기 조성물은 배지, 바람직하게는 배양 배지에 존재하는 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도 보다 더 높은 총 농도로 상기 정의한 바와 같은 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함한다. 이러한 정황에서, "보다 높은(higher)"이란 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 더 높거나 또는 5, 10, 20, 50 또는 100배 더 높음을 의미한다. 바람직한 배지는 실험 부분에 사용된 바와 같이 M199이다. 이러한 배지는 0.81mM의 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도: 0.33mM L-아르기닌, 0.1mM 히스티딘 및 0.38mM L-리신을 갖는다. 배지에서 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도의 아이덴티티 및 추정 농도는 다를 수 있다. 일 구현으로, 본 발명의 조성물 또는 용액은 0.81mM 보다 높은 총 농도로 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함한다. 상기 총 농도는 0.85mM, 0.90mM, 0.95mM, 1mM, 1.1mM, 1.2mM, 1.3mM, 1.4mM, 1.5mM, 1.6mM 보다 더 높거나, 또는 1.7 mM 보다 더 높을 수 있다. 이러한 조성물 또는 용액은 상기 정의한 바와 같은 바이러스 성분, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 및 이러한 조성물 또는 용액에 일반적으로 존재하는 어느 다른 가능한 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 상기 정의한 바와 같은 버퍼 및/또는 배지에 일반적으로 존재하는 어느 다른 분자를 포함한다.
제3구현으로, 상기 조성물 또는 용액은 본 명세서에 나타낸 바와 같이 염기성 아미노산 또는 이의 유도체, 바이러스 성분 두 가지 모두를 포함하며, 본 명세서에 상술한 바와 같은 버퍼를 포함하지 않는다. 이러한 버퍼는 일반적으로 배지에 존재한다. 상기 조성물 또는 용액에 포함되지 않는 바람직한 버퍼 성분은 페놀 레드이다.
제4구현으로, 바이러스 성분 및 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 적어도 0.01mM의 총 농도로 구성되거나 또는 이로 필수적으로 구성되는 조성물 또는 용액이 제공된다. 바람직하게 상기 조성물 또는 용액은 바이러스 성분 및 적어도 0.02mM, 0.025mM, 0.03mM, 0.04mM, 0.05mM, 0.06mM, 0.07mM, 0.08mM, 0.09mM, 0.1mM, 0.2mM, 0.3mM, 0.4mM, 0.5mM, 0.6mM, 0.7mM, 0.8mM의 염기성 아미노산 또는 이의 유도체로 구성되거나 또는 이로 필수적으로 구성되는 조성물 또는 용액이다. 이 조성물 또는 용액에 존재하는 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 및 바이러스 성분의 아이덴티티는 본 명세서에 전술한 바와 같다. 이러한 조성물 또는 용액은 바람직하게 본 명세서에 분명히 나타낸 것들, 즉 상기 바이러스 성분, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 및 선택적으로 물 외에 어느 다른 분자를 포함하지 않는다.
일 구현으로, 본 명세서에 나타낸 어느 상기 조성물 또는 용액에서, 바이러스 집합체의 형성은 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하지 않는 이에 상응하는 조성물 내의 바이러스 집합체의 형성에 비해 감소된다. 이러한 정황에서, 감소는 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하지 않는 이에 상응하는 조성물 내의 바이러스 집합체의 양에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 감소 또는 저하를 의미한다. 이러한 감소는 적어도 1분, 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간, 1주 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 관찰될 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 제공되는 어느 조성물 또는 용액은 예방 또는 치료적 물질/약제로서 사용하기 위한 것이며, 보다 바람직하게는 상기 바이러스 성분에 대해 개체에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다. 이 조성물은 추가로 제형화될 수 있으며, 제제 또는 약학 조성물로 지칭될 수 있으며, 예방 또는 치료적 물질/약제로서 사용하기 위한 것이며, 보다 바람직하게는 상기 바이러스 성분에 대해 개체에서 면역 반응을 유도하기 위해 사용된다.
예방 또는 치료적 물질/약제로서 사용하기 위해, 제제는 액상 제제(서스펜션)로서, 건조된 제제로서 사용되거나 또는 예를 들어 물이나 다른 적절한 액체를 이용하여 건조된 제제를 용해함으로써 재구성될 수 있다. 제제는 바람직하게 이의 본래 용량, 즉 건조 전 용량으로 재구성된다. 바람직하게제제는 질병 또는 감염성 질병이나 암에 대해 (개체에서) 면역 반응을 유도하기 위한 제제이다. 본 발명의 제제를 투여받는 개체 또는 환자는 인간일 수 있으나, 예를 들어 (가축, 가금류, 캐틀(cattle), 보바인(bovine), 돼지, 고양이와 같은) 포유류(초식 동물, 육식 동물 및 잡식성 동물), 조류, 파충류를 포함하는 농장 동물 또는 애완 동물과 같은 동물일 수 있다. 보다 바람직하게, 제제는 (감염성) 질병에 대한 백신용 제제이다. 따라서 제제는 바람직하게 감염성 질병의 예방 또는 치료용 제제이다. 다른 구현으로, 본 발명은 전술한 바와 같이 본 발명에 따른 방법으로 획득가능하거나 획득되는 제제를, 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조를 위해, 예방접종 및/또는 감염성 질병의 예방 또는 치료를 위해 사용하는 용도에 관한 것이다. 다른 구현으로, 본 발명은 유효량의 상기 제제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 감염원에 대해 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 면역 반응은 바람직하게 바이러스 성분에 존재하는 항원에 대해 유도된다. 항원은 바람직하게 감염성 질병을 일으키는 병원체의 항원이거나 상기 병원체에 대해 면역 반응을 유도하는 항원이다. 병원체는 바람직하게 상기 정의된 바이러스이다. 본 발명의 제형은 비강내, 비경구, 근육내, 피하 및/또는 경피 경로를 통해 재구성을 거쳐서 또는 재구성 없이 투여될 수 있다.
본 문헌 및 이의 청구범위에서, 동사 "포함하다(to comprise)" 및 이의 활용형은 상기 단어에 후속하는 아이템이 포함되나, 특별히 언급되지 않은 아이템이 배제되지 않는 것을 의미하는 비한정적 견지로 사용된다. 또한, 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 정황상 하나가 존재하고 단지 하나의 구성요소를 분명히 필요로하는 것이 아닌 한, 하나 이상의 구성요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "하나의(a 또는 an)"는 일반적으로 "적어도 하나(at least one)"를 의미한다.
사용의 용이성을 위해, 본 문헌에서 용어 IPV는 최종 산물뿐만 아니라 아직 불활성화되지 않은 이의 (공정) 중간물 모두를 포함하는 것으로 사용된다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌 참조는 이의 전체 문헌이 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
하기 실시예는 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위로 어느 방식으로 한정하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 바이러스 생산
실험실-스케일에서의 세포 배양. 다양한 시스템의 사용. 실험실-스케일에서의 불활성화 약화된 폴리오바이러스 스트레인의 생산.
공정은 Vero 세포의 배양으로 시작된다. VERO 세포주는 아프리카 그린 원숭이 신장세포(MKC)(ATCC CCL-81)로부터 기원한다. 배양은 잘 특성화된 동결 세포 은행으로부터 얻은 앰플로 시작된다. 바이오리액터에 접종할 적절한 양의 세포를 얻기 위해, TC-플라스크 내의 단층 배양물을 함유한 시드 트레인(seed train)을 5% 우태아 혈청을 함유하는 M199로 시작된다. M199 배지는 Morgan J.F. 등(1955) 또는 Morgan J.F. 등(1950)에 기술된 대로이다. 이는 mM 양의 염기성 아미노산, 즉 L-아르기닌 0.33mM, L-히스티딘 0.1mM, L-리신 0.38mM을 포함한다(http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation.86.html).
시드 트레인은 4개의 T-플라스크, 3개의 하이퍼 플라스크 및 3개의 셀 팩토리(cell factories)에서 계대 배양으로 이어진다. 셀 팩토리는 3*6320㎠의 총 표면적을 갖는다. 세포들은 트립신처리에 의해 분리된다 전체 시드 배양은 약 2주 걸린다.
바이오리액터에서 VERO 세포(초기 일차 MKC가 사용됨) 배양은 마이크로 캐리어(Cytodex 1 GE Healthcare, 제품 번호 17-0448-**)에서 수행된다. 이 기술은 1960년대 말 van Wezel(1978)에 의해 RIVM으로 개발되었다. 마이크로 캐리어는 Vero 세포의 부착을 위한 큰 표면적을 제공한다. 마이크로 캐리어에서 배양은 5L(리터) 바이오리액터(3L 작업량)에서 배치 모드로 시작된다. 5L 바이오리액터는 소혈청(BS)(Minimum Essential Medium Eagle, Sigma Aldrich, M4642)이 보충된 3L E-MEM 배양 배지로 수행된다. 바이오리액터는 4g/L Cytodex 1 마이크로 캐리어 및 E-MEM 배양 배지로 준비된다. 배양 배지 조건이 안정한 경우에, 바이오리액터는 0.8*106cells/ml의 초기 세포 농도로 시드 트레인의 세포로 접종된다. 배양은 1일간 배치 모드로 시작되어, 재순환 보틀 내의 12L E-MEM 배지로 3일간 재순환 모드로 이어진다. 재순환 모드에서 세포들은 다층으로 성장하기 시작한다. 이 방식으로 5L 바이오리액터에 4.0-4.5*106cells/ml의 세포 농도에 이를 수 있다.
세포들은 트립신처리에 의해 마이크로 캐리어로부터 분리된다. 방출된 세포들을 사용하여 20L 세포 배양에 들어간다. 20L 바이오리액터는 3g/L 마이크로 캐리어 및 BS가 보충된 E-MEM 배양 배지로 준비된다. 접종 후 최종 작업량은 16L이다. 접종 수준은 0.2*106cells/ml이다. 20L 바이오리액터는 배치 모드로 수행된다. 배양은 5L 바이오리액터로부터 세포를 20L 바이오리액터로 이송한 후 유도기(lag phase)에 따라 3-4일 소요된다. 글루코즈 또는 글루타민의 공급이 최적 성장 조건을 유지하는데 필요한지 여부를 체크하기 위해 글루코즈 및 글루타민과 같은 대사물이 모니터된다.
바이러스 증식은 상기 20L 바이오리액터에서 수행된다. 바이러스 증식에 우호적인 조건을 생성하기 위해 E-MEM에서 M199로의 배지 전환이 수행된다. 온도는 37℃에서 32.5℃로 낮춰진다. 용존 산소 퍼센트(DO%)는 50%에서 25%로 낮춰진다. 감염 수준의 다중도(MOI)는 0.01이다. 바이러스 제조 및 용해는 바이러스 서브타입에 따라 3-5일 소요된다. 바이러스 증식 및 용해는 세포병리학적 영향(Cytopathological effect, CPE)의 현미경 검사에 의해 모니터된다. 바이러스 배양은 CPE가 90% 이상인 경우 및/또는 산소 소비가 중단된 경우에 종료되고, 그 시점에 정제(하향 흐름 공정, DSP)를 위해 수거될 수 있다.
바이오리액터는 반응기에서 마이크로 캐리어를 보유하기 위해 스틸 75㎛ 메쉬를 함유한다. 세포 찌꺼기(debris)를 함유하는 바이러스 수거물은 연속적으로 두 개의 일회용 필터에 의해 정화된다. 뎁스 필터 카세트는 규조토를 포함하였다(HC Pod 필터 등급 C0HC Millipore # MC0HC054H1). 최종 필터는 이중층 0.5/0.2㎛ 필터(Millipore Express SHC opticap XL #KHGES015FF3)이다.
폴리오 생산 공정에서 농축 단계는 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration, TFF)(교차 흐름 여과(CEF) 또는 한외여과(UF)로도 알려짐)에 의해 수행된다. 총 농축 인자는 700-800이다. TFF 시스템의 불용 체적(dead volume)에서 산물의 높은 손실을 피하기 위해, 두 시스템이 연속적으로 사용된다. 두 시스템 모두 100kD 플랫 스크린 필터 카세트(0.2m2 및 50cm2 resp)를 사용한다. 바이러스 파티클이 보유되고, 여과물 내에 소 분자가 최종적으로 남고 제거된다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 크기에 의해 파티클 및 분자를 분리하는 정제 기술이다. 대 분자가 이보다 작은 소 분자에 비해 더 신속히 용리된다. 컬럼은 GE 헬스케어의 CL6B로 포장된다. 첫 번째 피크가 집합체 및 숙주 세포 단백질(Host Cell Proteins, HCP's)과 같은 고분자량 분자를 함유할 수 있다. 두 번째 피크는 대부분의 폴리오바이러스를 함유하는 산물 피크이다. SEC 중에, 폴리오바이러스 파티클이 저 이온성 강도를 갖는 포스페이트 버퍼(20mM, pH 7.0±0.2)로 용리된다.
이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 바람직하게 GE 헬스케어의 DEAE-리간드 베이즈드 매트릭스, Sephadex A50으로 수행된다. 이 특정 수지는 공급자로부터 건조 분말로서 제공되며, 사용자에 의해 제조될 필요가 있다. 이는 수지의 팽창 및 린싱, 컬럼 패킹 및 컬럼 평형을 포함한다. 이 유닛 수행의 목적은 매트릭스에 음 하전된 성분을 바인딩하는 것이다. RNA/DNA/숙주 세포 단백질은 컬럼 매트릭스에 바인딩되는 주 성분이다. 폴리오 바이러스는 매트릭스와 제한된 상호작용을 갖는다.
이온 교환 크로마토그래피로부터 획득된 정제된 바이러스는 안정화되고 (적용가능한 경우) 특정 강도로 희석된다. 안정화 및 희석은 M199 배지로 수행된다. 요구되는 농도는 바이러스 타입에 따라 달라진다.
최종적으로 글리신은 불활성화 제조물에 5g/L의 최종 농도로 첨가된다. 안정화되고, 희석 및 제조된, 정제된 바이러스는 2-3mM(또는 1:4000)의 최종 농도로 포름알데히드를 이용하여 불활성화된다. 불활성화는 13일 소요되며, 37℃의 온도에서 수행된다. 6-8일의 불활성화 후에, 중간 여과를 수행하여 있을지 모르는 집합체를 제거한다.
13일의 불활성화 후에, 멸균 모노밸런트 풀(monovalent pool)이 2-8℃ 보관을 위해 준비된다. 이 시점에 획득된 불활성화 폴리오 바이러스를 모노밸런트 벌크라 지칭한다.
혼합/ 제형화
미리 측정된 농도로 필요로 하는 혈청형들을 함께 혼합함으로써 벌크를 제조한다. 이는 단일(타입 1, 타입 1 또는 타입 3), 2가(bi/divalent)(타입 1 및 타입 2 또는 타입 1 및 타입 3 또는 타입 2 및 타입 3) 또는 3가 혼합물(타입 1 및 타입 2 및 타입 3) 제형일 수 있다. 또한, 제형은 디프테리아, 백일해, 파상풍, 간염, 헤모필루스, 수막염, 폐렴 구균 및/또는 이외의 다른 백신과 조합될 수 있다.
최적화된 공정
최적화된 공정은 상술한 바와 같이 동일한 절차에 따르며 하기 편차를 갖는다:
Figure pct00001
정화 단계는 산물 여과가 종료된 후에 배지로 플러싱된다.
Figure pct00002
농축 단계에서 제2필터는 50㎠ 100kD 카세트 필터가 아니라, 115㎠ 홀로우 섬유가 제2 100kD 필터로 사용된다(Spectrum labs # D02-E100-05-N).
Figure pct00003
SEC 중에 버퍼는 L-아르기닌과 같은 염기성 아미노산이 보충된 포스페이트 버퍼(pH 7.0±0.2)로 교체된다.
Figure pct00004
이온 교환 크로마토그래피 중에 매트릭스 제조 및 용리를 위해 사용된 버퍼는 L-아르기닌과 같은 염기성 아미노산이 보충된 포스페이트 버퍼(pH 7.0±0.2)로 교체된다.
개선된 방법은 (면역화된 래트의 혈청에서 폴리오바이러스 중화 세포 배양 어세이에 의해 측정될 수 있는 바와 같이 대등하거나 보다 우수한 면역원성을 갖는) 보다 높은 D-항원 수율(DU/ml)을 제공한다(도 3).
표 1에 현재의 공정 및 최적화된 공정(염기성 아미노산의 첨가에 의한 변형)에 대한 회수율(D-항원 수율에 기초한 퍼센트)을 나타내었으며, 또한 폴리오바이러스 타입 1 및 2에 대한 총 공정 수율을 나타내었다. 폴리오바이러스 또는 IPV 산물의 항원성을 폴리오 D-항원 ELISA를 이용하여 시험하였다(ten Have 등, 2012).
현재의 공정 및 개선된 정제 공정에 대해 관찰된 폴리오바이러스 수율의 비교
공정 단계 수율(%)
현재의 공정 첨가된 L-아르기닌을 이용한 공정
공정 단계 폴리오바이러스 서브타입 1 폴리오바이러스 서브타입 2 폴리오바이러스 서브타입 1 폴리오바이러스 서브타입 2
SEC 69±2.1 51±0.8 77±6.0 70±3.8
IEX(DEAE) 94±19.2 32±4.5 93±8.3 82±7.1
전체 40±1.5 4±0.9 54 27
실시예 2 집합체 수준의 감소
바이러스 어그리게이션의 감소는 염기성 아미노산 또는 유도체의 (농축된) 용액의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 어느 숙련자는 특정 요구에 대해 이 방법을 미세 조정할 수 있다. 도 2a 및 2b 참조.
추가 실험으로, 염기성 아미노산의 스톡 용액을 제조하고, 집합된 형태로 다양한 바이러스를 함유하는 배치에 첨가하였다. 용액은 1:1 비율로 첨가되었다. 어그리게이션은 590nm에서 흡광도로 측정되었다(Biowave DNA, WPA). 염기성 아미노산의 첨가 전에 측정된 집합된 바이러스는 100%로 설정되었다. 3개의 다양한 인플루엔자 스트레인(인플루엔자 A/우루과이 H3N2(NBSC), 인플루엔자 B/플로리다/4/2006(NIBSC) 및 인플루엔자 A/PR/8/34(NBSC))에 대해 3개의 다양한 염기성 아미노산, 각각 L-아르기닌, L-리신 및 L-히스티딘이 미치는 영향을 나타내기 위해, 다양한 농도의 아미노산 첨가가 집합된 바이러스의 퍼세트에 미치는 영향을 도 2c, 2d 및 2e에 나타내었다. 도 2f, 2g 및 2h에 3개의 다양한 폴리오(Sabin) 서브타입 1, 2 및 3에 대해 각각 3개의 다양한 염기성 아미노산(L-아르기닌, L-리신 및 L-히스티딘)이 미치는 영향에 대한 결과를 도시하였다.
실시예 3 오프라인 첨가(존재하는 어그리게이션 용해)
집합된 바이러스는 20mM 포스페이트 버퍼로 조금 변형된 Salk-IPV 생산 프로토콜에 따라 생산되었다(Sabin 배치 타입 1, 2 및 3; SEC 및 IEX 후에 중간 산물 분획). 획득된 바이러스 분획은 사용하기 전까지 -80℃에 동결되었다. 동결은 어그리게이션 효과를 우호적으로 촉진시키고 그리고/또는 증진시켰다.
(집합체를 함유한) 인플루엔자는 부화 알에 접종하고(스트레인: A/우루과이/H3N2 (NIBSC)), 배양하고, 냉각하고 그 다음 디스크-스택(disk-stack) 원심분리에 의한 후속적인 수거, 그 다음 뎁스 여과(GE Healthcare)로 구성되는 실험실 에그 베이즈드 공정을 이용하여 생산되었다. 바이러스는 수크로즈 밀도 원심분리에 의해 정제되고, 그 다음 여과를 이용한 β-프로피오락톤 불활성화가 후속되었다. 최종적으로 디아필트레이션/농축이 수행되었다.
pH는 겔-일렉트로드(Mettler Toledo)로 보정된 pH 미터(Orion scientific)를 사용하여 측정되고, 황산 또는 수산화나트륨을 사용하여 맞춰졌다.
어그리게이션의 측정값으로서 광학 밀도는 10mm의 직경을 가진 플라스틱 일회용 큐벳(Greiner) 또는 석영 큐벳에서 파장 450 & 590nm에서 Biowave DNA 스펙트로미터(WPA)를 이용하여 측정하였다.
ELISA-어세이; 폴리오 바이러스 또는 IPV 산물의 항원성은 ELISA(ten Have 등, 2012)를 이용하여 시험하였다.
바이러스 산물은 표 2에 따라 다양한 첨가제의 농도 범위로 오프라인 시험에 사용되었다. 첨가제는 시험 튜브에서 칭량되고, 이에 1 또는 2ml의 산물을 첨가하고, 그 용액과 첨가제를 혼합하였다. 첨가제가 용해된 경우에, pH 변화를 측정하고 (필요에 따라) 초기 산물 pH로 보정하였다. 1시간 후에, 광학 밀도를 측정하였다.
바이러스의 어그리게이션을 저해하거나 분해하는 능력에 대해 시험된 첨가제들
첨가제 비고
L-아르기닌
D-아르기닌 L-아르기닌의 키랄 형태
L-리신
N-α-아세틸 L-아르기닌 아르기닌의 유도체
아그마틴 설페이트염 아르기닌의 유도체
혼합물 조성:
글리신
알라닌
l-발린
l-루신
l-이소루신
l-프롤린
히드록시-l-프롤린
l-세린
l-트레오닌
l-글루타민산
l-글루타민
l-아스파르트산
l-아스파긴		 배지 M199에 사용된 것과 동일한 농도
M199(50개가 넘는 성분들의 혼합물) 세포 배양 배지
다양한 몰 농도 및 다른 산물로 집합체를 정화하는데 있어서 다양한 첨가제의 오프라인 첨가가 다양하게 수행된다(도 2a 및 2b). 초기 집합된 바이러스 산물은 무첨가시 측정된 100%로 설정되고, 블랭크 버퍼 용액은 예를 들어 0%에 도달하는 무 어그리게이션(no aggregation)과 같이 음성 컨트롤로 사용되었다.
바이러스에 M199의 첨가는 -80℃ 보관 물질 또는 새로 제조된 용액에 보관된 모든 바이러스 산물로부터 형성된 집합체를 정화하는 것이 가능하였다. 폴리오바이러스에 있어서, 이는 ELISA-어세이(ten Have 등, 2012)에서 측정시 유용한 D-항원 에피토프의 22% +/-12 증가를 일으켰다.
실시예 4 인플루엔자의 신속한 정제(개념 증명)
인플루엔자는 하기 프로토콜에 따라 아르기닌을 이용하여 개념 증명으로서 정제되었다. 바이러스 공급물은 HVAC 필터가 장착된 다운 플로우 부스(down flow booth)에 위치한 반자동 접종 기계를 사용하여 인플루엔자 A/우루과이 H3N2 바이러스(9.17의 EID50/ml)로 11일에 접종된 10.000 SPF(특정 병원체 무함유) 부화 계란의 수거물로부터 제조되었다. 접종 전, 계란 및 바늘은 70% 에탄올을 이용하여 멸균처리되었다. 계란은 35℃에서 72시간, 즉 3일간 배양되고, 약 4℃에서 밤새 냉각되고, 약 12시간 동안 실질적으로 8℃ 미만의 온도로 두었다. 껍질이 벗겨진 계란으로부터 요막액의 수거는 다운 플로우 부스에서 반자동 수거 기계로 수행되었다. 미처리된 그대로의 수거된 요막액의 정화는 65L/h, 1bar 역압, 10.000rpm에서 웨스트팔리아(Westfalia) 디스크 스택 분리기 연속 원심분리한 다음, 두 개의 병렬 10인치 2.0㎛ GE ULTA 프라임 캡슐 뎁스 필터(GE Healthcare)를 사용한 여과로 수행되었다.
획득된 배치로부터 약 3L를 소 스케일 시험을 위해 분리하였다.
그 3L를 다시 2 부분으로 나누고, 각 부분을 홀로우 섬유(GE Healthcare #UFP-750-E-3X2MA)를 이용하여 약 15배 농축하고, 0.35M L-아르기닌(Sigma-Aldrich)이 보충된 PBS(GIBCO) 또는 PBS(GIBCO)에 대해 10 용량으로 디아필트레이션하였다.
이에 따라 얻어진 농축 및 디아필트레이션된 물질로부터, 10ml를 Akta 익스플로러 크로마토그래픽 시스템(GE Healthcare)을 이용하고, 0.35M L-아르기닌이 보충된 PBS 또는 PBS를 사용하여 Sepharose 6 패스트 매트릭스(GE Healthcare)를 함유하는 90cm 베드하이트(bedheight)(컬럼 vl11/100 Millipore)의 크기 배제 컬럼에서 시험하였다.
모든 시료들은 분석 전에 포름알데히드를 사용하여 불활성화되었다.
분석 어세이
SRID(single radial immunodiffusion, 일원 방사선 면역 확산법) 어세이는 편평한 아가로즈 겔에 존재하는 항체와 상기 겔 내의 적용 지점으로부터 확산하는 항원 사이의 반응에 기초한다. 항체와 항원의 농노가 동일하게 되면, 고리 형상의 침전이 일어난다. 침전물은 쿠마시 브릴리언트 블루를 사용하여 염색되고, 고리의 크기는 농도의 측정값으로 사용하였다.
오발부민 농도를 직접 샌드위치 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, 효소 연결 면역 흡수 측정검사)를 이용하여 측정하였다. 어세이는 ELISA 키트(Serazym Ovalbumin ELISA: Cat. No. E041C, Seramun Diagnostica GmbH Wolzig)의 공급자의 지시에 따라 수행되었다. 두 가지 다른 희석의 독립적인 복제물이 샘플로 사용되었다. 항원을 함유하는 샘플은 폴리클로날 항-오발부민 항체로 코팅된 ELISA 플래이트에 파이펫팅되었다. 호스 래디쉬 퍼옥시다아제에 연결된 항-오발부민을 첨가한 다음, 바인딩되지 않은 물질들을 세척하여 제거하였다. 기질의 첨가는 청색을 형성하기 시작하였다. 이 처리는 황산 첨가에 의해 정지되었으며, 색은 청색에서 노랑색으로 변하였다. 450nm에서 흡광도는 양에 대한 측정값이었다. 630nm 필터가 레퍼런스(KC-jr 및 KC4 소프트웨어가 장착된 Biotek 리더)로 사용되었다
결과
헤마글루티닌 항원 함량에 대한 SRID 어세이에서 색층분석 수행으로부터 수집된 물질을 시험하였다. 분석은 0.35m L-아르기닌이 보충된 물질에서 8퍼센트 더 높은 헤마글루티닌 항원 함량을 나타내었다.
또한 보충된 L-아르기닌 모노 하이드로클로라이드를 함유한 홀로우 섬유로부터 농축 및 디아필트레이션된 (UF/DF) 물질은 샘플에 존재하는 현저히 더 낮은 (최대 76%) 오발부민을 함유하였으며, 이는 디아필트레이션이 L-아르기닌 모노 하이드로클로라이드의 존재시 불순물을 제거하는데 훨씬 더 효과적이었음을 나타낸다.
실시예 5: 폴리오바이러스 크로마토그래피에 대한 첨가의 영향
어그리게이션이 발생된 후에 어그리게이션을 분해하는 것은 문제를 해결하는 유일한 방법이다. 그러나, 제조 중에 어그리게이션의 시작으로부터 어그리게이션을 저해하는 것이 보다 더 중요하다. (폴리오) 바이러스의 공정 중에, 형성된 집합체는 SEC 중에 제거되고, IEX(DEAE) 컬럼에 대한 불순물로서 바인딩하며, 이는 높은(최대 70%까지) 산물 손실을 이끈다.
크로마토그래픽 분리는 표 3에 따른 다양한 용액에서 수행되었다. 출발 물질은 -80℃ 냉동기나 새로이 제조된 농축 폴리오바이러스이다. 20mM 포스페이트 버퍼에 유일하게 L-아르기닌 HCL 첨가는 컨트롤 다음에 크로마토그래픽 분리 중에 시험되었다.
수율(D-항원 회수율면에서)을 측정하고, 그 결과를 표 4 및 5에 나타내었다(nd=수행하지 않음(not done)).
크로마토그래피 첨가
컨트롤 변형 1 변형 2
SEC 20mM 포스페이트 pH 7.0 M199 20mM 포스페이트 + 150mM L-아르기닌 pH 7.0
IEX 20mM 포스페이트 pH 7.0 M199 20mM 포스페이트 + 150mM L-아르기닌 pH 7.0
다양한 용리 버퍼를 이용한 SEC(크기-배제 컬럼 크로마토그래피) 회수율(밀리리터 당 D-항원에 기초한 퍼센트(%)) 결과
폴리오바이러스 회수율(%)
배치 폴리오바이러스 타입 컨트롤: 포스페 이트 버퍼 변형 1: M199 변형 2: L-아르기닌
1 1 30 16 73
2 1 67 nd 81
3 2 72 59 66
4 2 66 nd 69
5 3 71 64 58
6 3 75 nd 73
7 3 83 nd 68
다양한 용리 버퍼를 이용한 이온-교환 컬럼 크로마토그래피 회수율(밀리리터 당 D-항원에 기초한 퍼센트(%)) 결과
폴리오바이러스 회수율(%)
배치 폴리오바이러스 타입 컨트롤: 포스페이트 버퍼 변형 1: M199 변형 2: L-아르기닌
1 1 37 102 99
2 1 100 nd 87
3 2 nd 21 90
4 2 28 nd 83
5 3 58 76 93
6 3 87 nd 92
7 3 100 nd 105
용리 버퍼에 L-아르기닌의 첨가는 우호적인 영향을 가질 수 있으며, 이는 타입 1 및 2에 대해 SEC 중에 주로 관찰되며, 한편 IEX에 있어서 이는 타입 2에 대해 특히 분명하다. 변형 1(M199)의 첨가 또한 유익한 것으로 보이나, 정제 중에 이 화합물은 IEC에 대한 성능을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 변형 2와 비교할 경우에 이의 사용이 상당히 제한되는 것이다.
추가 실험에서, 높은 세포 밀도 산물 배치(반-배치 기법, Thomassen 등, 2014)가 제조되고, Sabin 서브타입 2로 감염되고, (수거, 여과 및 한외여과에 의해) 400배 농축된 배치가 생성될 때까지 Thomassen 등, 2013a 및 실시예 1 최적화된 공정에 따라 정제되었다. 이 물질은 분액하여 -80℃에 보관하였다. 이 물질을 해동하고, 컨트롤 20mM 포스페이트 버퍼에 다양한 농도로 다양한 염기성 아미노산 첨가를 이용하고 Akta 익스플로러 시스템(GE Healthcare)에서 C16B-수지로 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 변화 및 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 산물 농도(D-항원)는 3회 반복수행의 평균이며(ten Have 등, 2012), 산물 증가는 퍼센트 차이로 산출하고 나타내었다.
컨트롤 20mM 포스페이트 버퍼에 다양한 농도로 다양한 염기성 아미노산 첨가를 이용한 Sabin 서브타입 2의 크기 배제 크로마토그래피
총 첨가 농도(mM) D-항원(산물/ml) % 산물 증가
컨트롤 0 2330 -
L-아르기닌





 0.81 3065 32
2.5 3273 40
5 3285 41
25 3134 35
50 3200 37
100 2993 28
150 2993 28
D-아르기닌
 2.5 3394 46
25 3101 33
L-리신

 2.5 3226 38
25 2735 17
150 2420 4
L-히스티딘
 2.5 2929 26
150 2386 2
D-히스티딘
 2.5 3577 54
25 3649 57
아그마틴 75 3318 42
2.5mM D-His + 2.5mM L-Lys 5 3418 47
25mM D-His + 25mM L-Lys 50 2735 17
50mM L-Arg + 50mM L-His + 50mM L-Lys 150
 3220 38
표 6으로부터 다양한 첨가 및 다양한 농도가 크기 배제 크로마토그래피로부터 산물의 회수율에 영향을 미친다는 것을 분명히 알 수 있다. 모든 케이스에서, 산물 수율은 중간 정도(2%) 내지 높은 정도(57)로 증가하였으며, 이는 첨가된 염기성 아미노산으로부터 향상되었음을 보여준다.
실시예 6: 디아필트레이션을 이용한 폴리오 바이러스 중간물 정제된 산물( SEC )로부터 L-아르기닌의 제거
바이러스 파티클 함유 용액에 염기성 아미노산의 첨가는 집합체를 용해하고 그리고/또는 집합체 형성을 저해한다. 염기성 아미노산을 제거함으로써 다시 어그리게이션이 되돌아오는 것으로 예측된다. 이는 L-아르기닌을 함유하는 용리 버퍼를 이용한 크기 배제 크로마토그래피(axk26/80 컬럼 내의 Cl6B, 모두 GE Healthcare)를 이용하여 폴리오 바이러스(Sabin 타입 2) 배치를 생성함으로써 예증된다. 획득된 바이러스 산물 용액은 후속적으로, 여과물이 제거되는 동일한 비율로 첨가제를 사용하지 않고 유사한 버퍼 용액에 대해 100kD 홀로우 섬유를 이용하여 당해 기술분야에 알려진 바와 같이세척/디아필트레이션되었으며, 이에 따라 일정한 투석유물(retentate) 용량이 유지되었다.
집합체의 양에 대한 측정값으로서, 흡광도를 스펙트로미터(Biowave DNA, WPA)를 이용하여 오프라인으로 측정하였으며, L-아르기닌 농도는 NMR을 이용하여 측정하였다. 그 다음에 압력 및 전도성을 Pendotech 일회용 센서를 이용하여 인라인으로 측정하였다.
1 디아필트레이션 용량은 시스템에 존재하는 총 바이러스 산물 용량(75ml)에 상응한다. 시스템은 일정한 플럭스 및 TMP로 10 디아필트레이션 용량에 대해 운전되도록 두었으며(총 시간 2.5시간), 샘플은 분석을 위해 각 디아필트레이션 용량 교환 후에 취해졌다(그리고 용량에 대해 보정되었다).
결과를 도 4에 나타내었으며, 이는 L-아르기닌 농도가 3-4 디아필트레이션 용량 후에 사용된 NMR의 검출 한계(1mM) 이하로 신속히 감소됨을 나타내었다. 이러한 L-아르기린의 감소된 농도에 상응하여 흡광도가 증가하였으며, 이는 바이러스 파티클의 어그리게이션을 나타낸다. L-아르기닌은 또한 간접적으로 전도성에 의해 나타날 수 있다. 전도성은 L-아르기닌의 제거와 동시에 신속히 저하되어 컨트롤 버퍼에 상응하는 2.9mS/cm의 최종 전도성에 이르며, 이는 첨가제가 제거되었음을 나타낸다. 흡광도는 상기 전도성 값에 도달한 경우에 출발값에 비해 10 디아필트레이션 용량 후에 2배 이상되었다. 이는 분명히 염기성 아미노산의 첨가가 (UV에 의해 가시화된) 어그리게이션 감소의 원인이었음을 보여주며, 또한 그 공정이 가역적임을, 즉 어그리게이션이 복귀되기는 하나 상기 첨가제가 제거될 수 있음을 보여준다.
실시예 7: 염기성 아미노산의 존재 또는 부재하에서 와일드 타입 폴리오 바이러스의 정제
와일드 타입 폴리오 바이러스 타입 2를 제조하고 Thomassen 등(2013a)에 의해 기재된 바와 같은 방법으로 크로마토그래픽 단계까지 정제하였다. 그 물질을 40mM 포스페이트(pH 7.0 +/-0.2) 버퍼에서 두 개의 다른 SEC 컬럼을 사용하여 정제하였다. 한 버퍼는 첨가제(150mM L-아르기닌)을 함유하였으며, 다른 한 버퍼는 첨가제를 함유하지 않았다. 획득된 두 산물 모두 후속적으로 상기 언급된 두 버퍼를 사용하여 다시 한번 IEX(DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)에서 정제하였다. 표 7은 IEX에 대한 결과를 보여준다. 상기 첨가제는 ELISA(Ten Have R 등, 2012) 및 피크 면적에 의한 측정시 산물 수율을 거의 두 배 더 높은 산물 수율을 형성한다는 것이 명확하다. 두 경우 모두에서, 정제는 우수한 순도 바이러스 산물을 형성하였다(Koch 및 Koch 1985에 의해 측정되는 UV 비율을 기준으로 함. 데이타로는 나타내지 않음).
150mM L-아르기닌의 존재 또는 부재하에서 와일드 타입 폴리오 바이러스의 SEC 및 IEC 정제. 피크 면적은 폴리오 바이러스 양에 상응한다. 측정된 D-항원은 면역원성 바이러스에 상응한다.
150mM L-아르기닌 무함유 150mM L-아르기닌 함유
피크 면적(mAU*ml) 3621 6006
폴리오 바이러스 D-항원(DU/ml) 994 1845
추가 실험으로, 와일드 타입 폴리오 바이러스 타입 3이 다시 제조되고 Thomassen 등(2013a)에 의해 기재된 바와 같은 방법으로 크로마토그래픽 단계까지 정제하였다. 그 물질을 일반 40mM 포스페이트(pH 7.0 +/-0.2) 버퍼에서 하나의 SEC 컬럼을 사용하여 정제하였다. 획득된 산물은 2 가지 동일한 양 부분으로 나뉘었다. 한 부분에, L-아르기닌을 함유하는 고 농축 버퍼를 첨가하여 149mM의 최종 농도를 생성하고, 다른 한 부분에는 희석 영향을 보상하기 위해 동일한 양의 일반 버퍼를 첨가하였다.
두 산물 모두 후속적으로, 정제될 부분에 따라 첨가제(150mM L-아르기닌)를 함유하거나 함유하지 않은 40mM 포스페이트 버퍼를 사용하여 IEX(DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare)에서 정제하였다. 표 8은 IEX에 대한 결과를 보여준다. 상기 첨가제는 상기 첨가제가 (피크 면적에 근거하여) 산물 수율을 형성하였음이 명확하다. 두 경우 모두에서, 정제는 우수한 순도 바이러스 산물을 형성하였다(Koch 및 Koch 1985에 의해 측정되는 UV 비율을 기준으로 함. 데이타로는 나타내지 않음).
150mM L-아르기닌의 존재 또는 부재하에서 와일드 타입 폴리오 바이러스 타입 3의 IEC 정제.
150mM L-아르기닌 무함유 150mM L-아르기닌 함유
산물 피크 면적(mAU*ml) 3887 4789
실시예 7로부터 상기 첨가는 직접적이며 공동 용리로 또는 차후에 고 농축 스톡 화합물로서 효과적인 다른 방식으로 이루어질 수 있으며 문제가 되지 않았음을 분명히 알 수 있다. 모든 경우에, 상기 첨가제를 함유하는 산물은 보다 높은 수율을 나타내었다. 디아필트레이션을 통한 고형물로서 또는 고 농축 스톡으로서 다른 첨가 형태는 또한 보다 높은 수율을 모두 형성할 것이다.
실시예 8: 염기성 아미노산의 존재 또는 부재하에서 키메릭 폴리오 바이러스의 정제
와일드 타입 바이러스(Salk-발달 IPV의 베이시스) 및 약화된 바이러스(Sabin 스트레인) 모두의 조합/키메라/하이브리드를 나타내는 실험적인 폴리오 바이러스가 획득되었다. 이 바이러스는 또한 유전적 변형에 의해 기능을 못하게 되어 어느 심각한 병/리버설을 더욱 저해하는 것에 대해 포유류에서 생물학적으로 덜 활성적으로 되었다.
이 실험적인 바이러스는 이의 잠재력을 평가하기 위해 실험실 스케일로 기존의 제조 공정(Bakker 등, 2011 및 Thomassen 등, 2013a)을 이용하여 제조되었다. 크로마토그래픽 분리부에 대해, 플레인 20mM 포스페이트 버퍼(컨트롤), 및 150mM L-아르기닌을 함유하는 20mM 포스페이트 버퍼 두 가지 모두를 사용하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었으며, 이는 개별 유닛 수행 및 복합 크로마토그래픽 유닛 수행의 수율(%)를 나타낸다. 표 9는 보다 높은 전체 회수율이 얻어져 L-아르기닌 첨가제의 유익한 효과를 분명히 보여준다.
개별 유닛 수행(SEC 및 IEX) 및 복합 크로마토그래픽 유닛 수행의 키메릭 폴리오 바이러스 수율(%)


수율(%)
타입 1 타입 2
컨트롤 첨가제 컨트롤 첨가제
SEC 67 90 60 100
IEX 75 88 59 70
복합 SEC & IEX 50 79 35 70
실시예 9: 염기성 아미노산의 존재하에서 혼합- 모드 /다중 크로마토그래피
용리 버퍼에서 첨가제의 사용은 일반 이온 교환 대신에 혼합-모드/다중 크로마토그래피 분리의 사용과 같은 새로운 정제 옵션에 대한 길을 연다. 이로써 정전기 및 소수성 효과는 파티클의 2차원적 분리를 가능케 하며, 심지어 등전점과 관련하여 가깝게 관련된 파티클이 분리되는 것을 가능케 하는 역할을 한다.
일 예가 표 10에 주어진다. HEA Hypercell 지방족 크로마토그래픽 수지(Pall Corporation)를 사용하여 Sabin 타입 2를 정제한다. 산물의 순도는 Koch 및 Koch(1985)에 따른 UV 260/280 비율에 근거하여 측정하며, 이에 의해 순수 폴리오 바이러스의 표적 비율은 1.60-1.80 범위 내이다. L-아르기닌 존재가 없는 경우에, HEA-정제된 바이러스는 0.98의 UV 260/280 비율을 가지나, 150mM L-아르기닌의 존재하에서 HEA 컬럼에서 정제된 바이러스는, 1.76의 UV 260/280 비율에 의해 나타난 바와 같은 고 순도, 즉 표적 범위 내에 도달한다.
다중 크로마토그래픽 수지에서 바이러스 폴리오 산물의 순도
표적 컨트롤 첨가제
UV 260/280 비율 1.60-1.80 0.98 1.76
새롭고 보다 현대적인 수지의 사용은 바이러스 정제에 대하여 새로운 옵션을 생성한다.
실시예 10: 다양한 염기성 아미노산 및 이의 유도체가 폴리오 바이러스의 어그리게이션 감소에 미치는 영향
중간 정제된 폴리오 배치(플레인 포스페이트 버퍼에서 크기 배제 크로마토그래피 단계로부터 유래된 Sabin, 타입 1)에 대해 다양한 화합물 및 농도를 스크리닝하기 위해 투명 바닥의 굴뚝 모양의 검은 96-웰 플래이트가 사용되었다.
농축된 스톡 용액을 버퍼(모두 pH 7.0 +/- 0.2)와 미리 정해진 몰 농도로 혼합하여 다양한 화합물의 스톡 용액을 96-디프 웰 플래이트에 제조하고, 그 다음 이를 시험될 바이러스 제조물과 동량으로(1:1) 상기 검은 90-웰 플래이트에 첨가하였다.
그 결과 얻어진 플래이트를 쉐이커 플랫폼에서 혼합하고, 5분 후에 흡광도(590nm)를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
참고문헌
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009

약어
AU - Absorbance units(흡광도 유닛)
CCID50 - 50% cell culture infectious dose(50% 세포 배양 감염 도즈)
CFF - Cross Flow Filtration(교차류 여과)
cm - centimeter(센티미터)
CPE - Cytopathological Effect(세포병리학적 영향)
DEAE - Diethylaminoethanol(디메틸아미노에탄올)
DF - Diafiltration(디아필트레이션)
DLS - Dynamic Light Scattering(동적 광산란)
DNA - Deoxyribonucleic acid(디옥시리보핵산)
DO - Dissolved Oxygen(용존 산소)
DSP - Down Stream Processing(하향 흐름 공정)
DU - D-antigen Unit(D-항원 유닛)
EID50 - 50% egg infectious dose(50% 알 감염 도즈)
ELISA - Enzyme-linked immuno sorbent assay(효소 연결 면역 흡수 측정검사)
E-MEM - Eagle's minimal essential medium(이글스 최소 필수 배지)
FTU - Formazin Turbidity Unit(포마진 탁도 유닛)
HCP - Host Cell Protein(숙주 세포 단백질)
HEA - hexylamine(헥실아민)
HPV - Human papillomavirus(인간 파필로마바이러스)
HVAC - Heating, Ventilation, and Air Conditioning(가열, 환기, 및 에어 컨디셔닝)
IEC/IEX - Ion Exchange Chromatography(이온 교환 크로마토그래피)
IPV - inactivated polio Vaccine(불활성화된 소아마비 백신)
kD - kiloDalton(킬로달톤)
M199 - Medium 199
MALS - Multi Angle Light Scattering(다중각 광산란)
MKC - Monkey kidney cell(원숭이 신장 세포)
mM - milliMolar(밀리몰)
MOI - multiplicity of infection(감염 다중도)
mS - milli-Siemens(밀리지멘스)
NIBSC - National Institute for Biological Standards and Control(국립 생물 표준 통제 연구원)
nm - nanometer(나노미터)
NMR - nuclear magnetic resonance(핵 자기 공명)
NTU - Nephelometric Turbidity Unit(혼탁도 유닛)
OD - Optical Density(광학 밀도)
OPV - Oral Polio Vaccine(경구 소아마비 백신)
PBS - Phosphate Buffered Saline(인산 완충 염수)
RIVM - National Institute for Public Health and Environment(국립 공중 건강 환경 연구원)
RNA - Ribonucleic Acid(리보핵산)
RSV - Respiratory Syncytial Virus(호흡기 세포융합 바이러스)
SEC - Size exclusion Chromatography(크기 배제 크로마토그래피)
sIPV - Sabin-based inactivated Polio Vaccine(Sabin-베이즈드 불활성화 소아마비 백신)
SPF - Specific pathogen Free(특정 병원체 무함유)
SRID - Single Radial Immunodiffusion(일원 평판 면역확산법)
TCID50 - 50% Tissue Culture Infective Dose(50% 조직 배양 감염 도즈)
TFF - Tangential Flow Filtration(접선 유동 여과)
UF - Ultra Filtration(한외 여과)
USP - Upstream processing(상향 흐름 공정)
UV - Ultra Violet(자외선)
VAPP - Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis(백신 관련 마비성 폴리오)
VDPV - Vaccine Derived Poliovirus(백신 유래 폴리오 바이러스)
VLP - Virus Like Particle(바이러스 유사 파티클)

Claims (14)

  1. a) 엔테로바이러스 파티클을 함유하는 배지를 생성하는 단계;
    b) 상기 배지로부터 엔테로바이러스 파티클을 정제하는 단계로서, 이에 의해 상기 정제의 적어도 일부 동안, 염기성 아미노산 또는 이의 유도체가 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 농도로 존재하는, 엔테로바이러스 파티클의 정제단계; 및,
    임의로, c) 엔테로바이러스 파티클의 불활성화; 및
    d) 엔테로바이러스 파티클의 포뮬레이션
    중 적어도 하나를 포함하며, 여기서 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, 이의 염 및 이의 조합을 포함하는,
    엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 단계 c)의 적어도 일부 중에 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 농도로 존재하며, 그리고 여기서, 선택적으로 또한 단계 d) 중에 염기성 아미노산 또는 이의 유도체는 엔테로바이러스 파티클 및 선택적으로 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 농도의 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 약학 조성물을 제형화하기 위해 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 농도로 존재하는, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해 또는 감소시키기에 충분한 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도는 단계 b), c) 및 d) 중 적어도 하나의 전체 기간에 걸쳐 유지되는, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 농도는 적어도 0.01mM, 바람직하게 0.01-1000mM의 범위 내 농도인, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클은 엔테로바이러스의 바이러스-유사(virus-like) 파티클인, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클은 폴리오바이러스, 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스 및 엔테로바이러스 68, 69, 70, 71 및 73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 엔테로바이러스의 것인, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클은 혈청형 1, 2 및 3의 폴리오바이러스를 포함하는, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물은 백신인, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    백신은 불활성화된 소아마비 백신(Inactivated Polio Vaccine, IPV)인, 엔테로바이러스 파티클을 포함하는 조성물을 생성하는 방법.
  10. 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, 이의 염 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 엔테로바이러스 파티클의 어그리게이션을 저해하거나 감소시키는데 사용하는 용도.
  11. 제10항에 있어서,
    엔테로바이러스 파티클은 폴리오바이러스, 콕사키 A 바이러스, 콕사키 B 바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스 및 엔테로바이러스 68, 69, 70, 71 및 73으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 엔테로바이러스의 것이며, 바람직하게, 엔테로바이러스 파티클은 혈청형 1, 2 및 3 중 적어도 하나의 폴리오바이러스이며, 보다 바람직하게, 엔테로바이러스 파티클은 불활성화 소아마비 백신(Inactivated Polio Vaccine, IPV)인, 용도.
  12. 파라믹소비리데(Paramyxoviridae) 또는 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하는 바이러스의 바이러스 파티클, 및 아르기닌, 리신, 히스티딘, 아르기닌-HCl, 리신-HCl, 히스티딘-HCl, 아그마틴, L-아르기닌 에틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 트라넥사민산, DL-5-히드록시리신 하이드로클로라이드, L-리신 메틸 에스테르 디하이드로클로라이드, 3-메틸-L-히스티딘, 이의 염 및 이의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물이며, 여기서
    a) 상기 조성물 내 상기 염기성 아미노산 또는 유도체의 총 농도는 배지에 존재하는 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체의 총 농도 보다 더 높으며;
    b) 상기 조성물은 버퍼를 포함하지 않으며, 그리고 바람직하게 페놀 레드를 포함하지 않으며; 그리고/또는,
    c) 상기 조성물은 상기 바이러스 파티클, 적어도 0.01mM의 총 농도로 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체 및 선택적으로 물로 필수적으로 구성되는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 조성물 내 바이러스 집합체의 형성은 상기 염기성 아미노산 또는 이의 유도체를 포함하지 않는 이에 상응하는 조성물 내 바이러스 집합체의 형성에 비해 감소되는, 조성물.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    약제로 사용되는, 조성물.
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