ES2618523T3 - Virus respiratorio sincitial con una deficiencia genómica complementada in trans - Google Patents

Virus respiratorio sincitial con una deficiencia genómica complementada in trans Download PDF

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Abstract

Virión de un pneumovirus que comprende un genoma viral que tiene un gen de la proteína G de fijación eliminado o inactivado, donde el virión comprende una proteína G de fijación del mismo subgrupo viral que el genoma viral, en una forma y en una cantidad que es necesaria para la infectividad del virión.

Description

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Tabla III. Cebadores usados para RT-PCR de diagnóstico en el ARN de células Vero infectadas con RSV.
Tabla IV. Resultados de los experimentos de inmunización de ratas de algodón, protección contra la infección con RSV y patología inducida por RSV por inmunización de aislado X de ΔG-RSV.
Ejemplos
[0043] La invención actual se ilustra por los ejemplos no limitativos siguientes que se usan meramente para ilustrar las formas de realización específicas de la invención y no deberían leerse como limitantes del alcance general o de cualquier aspecto de la invención.
Ejemplo 1
Aislado viral, aislamiento, propagación y almacenamiento del virus
[0044] La base para el clon de RSV humano recombinante es un aislado de RSV clínico, obtenido del laboratorio de diagnóstico del Leiden University Medical Centre. Este virus, denominado 98-25147-X, codificado del paciente del que se aisló, se derivó de una prueba diagnóstica en células Hep-2 en el periodo del 21-24 de diciembre de 1998. Más tarde se determinó que era un aislado de subtipo A y se designó aislado X de RSV. El virus fue transferido 4 veces en células Hep-2 en frascos T75 en DMEM (Gibco), 10% FCS, pen/estrep/glu y posteriormente cinco veces en células Vero en frascos T75 en DMEM (Gibco), 10% FCS, pen/estrep/glu. El virus de aislado X de RSV resultante fue usado como material de trabajo y almacenado a -13500C en 25% o 45% de sacarosa.
Ejemplo 2
Construcción de ADNc de RSV-X que codifica genoma viral
[0045] ARN total se obtuvo por extracción de isotiocianato de fenol-guanidina (Trizol; Invitrogen) de células Vero infectadas con aislado X de RSV del caldo. ADNc se preparó por transcripción inversa usando transcriptasa inversa de Thermoscript (Invitrogen) usando cebadores de hexámero aleatorios. Este ADNc fue usado como modelo para PCR usando Taq polimerasa de alta fidelidad (Invitrogen) usando cebadores específicos que contenían sitios de reconocimiento de enzima de restricción (Tabla I y listado de secuencias). Los cebadores fueron diseñados basados en las secuencias publicadas de RSV-A2 (número de acceso del Genbank M74568) y RSV-RSS2 (número de acceso del Genbank U39662).
[0046] Los productos de PCR se clonaron primero individualmente en vectores diferentes: pares de cebador, vectores, sitios de reconocimiento de enzima de restricción y el nombre de vector resultante se enumeran a continuación.
RSV021/RSV047: vector pCAP (Roche), claramente en Mlu N1, pCAP3 (región SH/M/P)
RSV018/019: vector pCAP, claramente en Mlu N1, pCAP2 (región G)
RSV016/RSV017: PUC21, Mlu I /Bam HI, pUK5 (M2-2/M2-1/región F)
RSV024/RSV025a: PUC21, Bam HI/Afl II, pUK1 (región NS2/NS1)
RSV022/ RSV023: PUC21, EcoR V, pUK4 (región N)
RSV014/ RSV015: PUC21, Kpn I/Mlu I, pUK2 (región L)
[0047] Al menos dos clones individuales derivados de dos modelos de ADNc independiente fueron secuenciados; las regiones que contenían diferencias entre los dos clones fueron secuenciadas en un tercer clon. Si fue necesario, los clones se repararon utilizando técnicas de biología molecular estándar conocidas por la persona experta. Los productos de PCR adicionales que cubrían los sitios de unión de los cebadores usados para la clonación fueron obtenidos y secuenciados. Los terminales genómicos 5' fueron determinados por poli-adenilación de ARN genómico, seguido de RT-PCR con un oligo(d)T que contenía cebador ALG018:
TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
y un cebador de gen NS1 RSV 126:
AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT.
[0048] Este fragmento fue clonado en pUC21 usando Hind III/Pst I. El extremo 3' fue determinado por PCR de ligación RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc). Todas las secuencias fueron ensambladas para producir la secuencia de consenso RSV-X (SEC ID N.º: 1).
[0049] Todas las secuencias fueron confirmadas por secuenciación de ciclo de PCR utilizando el equipo terminador BigDye (Applied Biosysttems) y analizadas por un analizador genético ABI Prism 310.
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En el método 1, el gen G de bien el aislado X de RSV-A2 o RSV, o el gen G de RSV-A2, donde el codón de iniciación de la traducción interna ha sido inhabilitado por modificación usando los cebadores RSV033 y RSV034, fueron clonados en el vector de expresión pcDNA3 o pcDNA6 (Invitrogen) usando RT-PCR en el ARN de células Vero infectadas con aislado X de RSV-A2 o de RSV usando cebadores como se indica en la tabla II. Los plásmidos fueron introducidos en células Vero usando agentes químicos CaCl2, coprecipitación, liposomas
o electroporación (Ausubel 1989). Dos métodos para aislar las líneas celulares estables se usaron. En el primer método, 72 horas después de la transfección, las células se dividieron usando varias diluciones en el medio fresco que contenían medio selectivo, zeocina para pcDNA3 y blasticidina para pcDNA6. Las células fueron alimentadas con medio selectivo cada 3-4 días hasta que los focos celulares fueron identificados. Las colonias individuales fueron escogidas y transferidas a placas de 96 pocillos, o sembradas en varias diluciones para obtener células únicas en una placa de 96 pocillos. Las colonias resistentes a los antibióticos fueron evaluadas en la expresión de G de RSV por técnicas de inmunocoloración o FACS usando anticuerpos específicos de G de RSV. Las colonias que expresan G fueron transferidas, y fueron designadas como líneas celulares estables que expresan G. El segundo método comprende la selección de FACS usando anticuerpos específicos de G de RSV 72 horas después de la transfección. Las células que expresan G de RSV fueron sembradas en una dilución en serie para obtener células únicas en una placa de 96 pocillos y cultivadas con medio selectivo. Las colonias de célula única fueron transferidas en el medio selectivo y evaluadas posteriormente nuevamente para la expresión de G de RSV, dando como resultado la expresión de las líneas celulares G de RSV. En el método 2, el sistema Flp-In (Invitrogen) se utiliza para producir células Vero con sitios de inserción de gen objetivo en posiciones cromosómicas que permiten niveles diferentes de expresión del gen objetivo. El gen G de RSV, derivado de los plásmidos del método 1 pero con una modificación (introducido usando el cebador RSV151: Tabla II) del codón de iniciación de la traducción de G que rodea la secuencia para permitir niveles de traducción más altos, se insertó en cada una de estas líneas celulares utilizando el método genérico de sistema, dando como resultado líneas celulares Vero que expresan de forma estable niveles diferentes de proteína G. En el método 3, las células Vero se hicieron transitoriamente para expresar la proteína G, bien por transfección con los plásmidos de expresión que contenían el gen G gen del método 1, o por infección con el virus vaccinia modificado Ankara (MVA) (Sutter 1992) o los virus fowlpox (Spehner 1990) que expresan la proteína G.
Ejemplo 6
Construcción de polimerasa T7 de bacteriófago produciendo líneas celulares
[0058] El gen de polimerasa T7 de bacteriófago se amplifica por PCR a partir del plásmido pPRT7 (van Gennip 1997), conteniendo el gen, usando cebadores ALG022 y ALG023 (Tabla II). El producto de PCR se clona en el vector pcDNA6b, usando Hind III/Xba I, dando el plásmido pc6T7pol. Las células Vero fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 según las recomendaciones del fabricante (Invitrogen). 72 Horas después de la transfección las células fueron divididas y se cultivaron en medio fresco que contenía blasticidina. Las células fueron alimentadas con medio fresco cada 3-4 días y se dividieron dos veces para obtener volúmenes de cultivo mayores. 20 días después de la transfección, las células resistentes a la blasticidina fueron transfectadas con plásmido indicador pT7-IRES2-EGFP utilizando Lipofectamine 2000. Para la construcción del plásmido pT7-IRES2-EGFP, el primer plásmido pT7-EGFP fue construido por inserción vía HindIII/BamH1 en el plásmido p-EGFP-Nl (Clonetech) de un conjunto de oligómeros complementarios que codifican para la secuencia promotora T7 (ALG32: AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT y ALG33: GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT). El plásmido pT7-IRES2-EGFP fue luego construido mediante clonación del fragmento T7-EGFP del plásmido pT7-EGFP en el plásmido p-IRES2-EGFP vía Xma1-Not1. Las células que expresan EGFP fueron clasificadas por FACS y cultivadas en dilución limitada para obtener colonias de célula única. Colonias individuales que expresan ARNpolimerasa T7 fueron evaluadas para estabilidad, cultivadas a mayores volúmenes de cultivo y almacenadas.
Ejemplo 7
Método para producir virus de aislado X de ΔG-RSV recombinante
[0059] Células Hep-2 fueron cultivadas en DMEM + 10% FCS (suero de ternero fetal) + penicilina / estreptomicina / glutamina, mientras que células Vero y derivados de las mismas se cultivaron en M199 + 5% FCS + pen/estrep/glu. Las células se cultivaron durante toda la noche a 80% de confluencia en platos de 10 mm2 a 370C. Para células Vero y Hep-2, las células fueron infectadas con virus modificado Ankara-T7 (MVA-T7)(Sutter 1992, Wyatt 1995) o virus fowlpox-T7 (Britton 1996) en MOI = 3 (multiplicidad de infección 3) e incubadas a 320C durante 60 min antes de la transfección, para permitir la expresión de polimerasa T7 de bacteriófago. Las células (células Hep-2, Vero o Vero-T7) fueron lavadas con medio de Optimem (Optimem 1 con glutamax, Invitrogen) y posteriormente transfectadas con plásmidos auxiliares que codifican los genes N, P, L y M2.1 de RSV y con plásmido pRSVXΔG, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en OPTIMEM (volumen total 500 µl). Las cantidades siguientes de plásmidos fueron adicionadas: 1,6 µg pRSVXΔG, 1,6 µg pcDNA6-A2-N, 1,2 µg pcDNA3-P, 0,4 µg pcDNA6-A2-L, 0,8 µg pcDNA6-A2M2.1. Después de 3-4 horas de incubación a 320C, 500 µl de medio Optimem con 2% de FCS fue añadido y las células fueron incubadas a 320 C durante 3 días. Las células se rasparon entonces y la mezcla de células raspadas y el medio que contenía el virus rescatado se usó para infectar cultivos frescos de células Vero o Hep-2 cultivadas
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infección con el RSV y que exhibía una patología de pulmón mediada por vacuna grave como se describe en Prince, 2001 y que imita de cerca la situación humana. Después de la aplicación intranasal del RSV, la patología de pulmón se caracterizó por inflamación infiltrada en y alrededor de los bronquios/bronquiolos e hiperplasia de epitelio. Se vio una patología más grave tras inmunización intramuscular con RSV-A2 inactivado con formalina seguida de una 5 exposición intranasal con RSV-A2. Además de la patología anteriormente mencionada, se observó infiltrado perivascular y peribronquiolar y alveolitis, característico de una patología inmunomediada. Estas observaciones se usaron como referencia "interna" para todos los experimentos de inmunización y de exposición. La infección e inmunización de ratas algodoneras con preparaciones de RSV se hizo por vía intranasal, en ambos orificios de la nariz. Los pulmones de las ratas de algodón fueron examinados para patología con luz microscópicamente y títulos 10 de virus en diferentes momentos a post-exposición o post-infección/inmunización se determinaron en células Vero usando diluciones en serie de homogenizados de pulmón con ELISA específica de RSV para producir títulos CCID50 e inmunocoloración usando abs específico de RSV para producir títulos pfu. Después de la inmunización dos veces con aislado X de ΔG-REV, las ratas de algodón estaban completamente protegidas contra la infección y la patología provocada por el aislado X de RSV en los pulmones. Los resultados de diferentes experimentos se
15 resumen en la tabla IV.
Tabla IV:
infección con: t1 V2 patología de pulmón día 5 post infección ΔG-RSV 5 100 sí, moderado aislado X RSV-A2 5 100 sí, fuerte aislado X de RSV 5 100 sí, fuerte
pulmón t3 debajo detección 2*5 4*5
inmunización día 0 y 21 t1 V2 exposición día 42 t1 V2 patología de pulmón día 5 post exposición
pulmón t3
2x ΔG-RSV 5 100 aislado X de RSV 5 100 no
debajo
aislado X
detección
simulado 100 aislado X de RSV 5 100 sí, fuerte
5
1: títulos de virus en registros pfu/ml2: volumen en µl por animal, que es la mitad de este volumen en cada orificio de la nariz 3: títulos de virus en registros por gramo de pulmón, límite de detección es 102 CCID50
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