JP2007516721A - トランスに相補されたゲノム欠損を有する呼吸器合胞体ウイルス - Google Patents
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Abstract
Description
Mufson 1988, Cane 1991 Robinson 2000, Greenough 2000 Srikiatkhachorn, 1997a Kim 1969 Srikiatkhachorn 1997b Crowe 1998 Gonzalez 2000 Power 1997 Siegrist 1999 Plotnicky 2003 Li 2000 Bembridge 2000 Collins 1990 Jin 2003 Buchholtz 2000
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその同根語は、非限定的な意味で使用されて、その後に続く項目が含まれるが、具体的に挙げられていない項目が除外されるわけではないことを意味する。さらに、情況が1つの要素及び複数の要素のうちわずか1つが存在することを明らかに必要としない限り、不定冠詞「a」又は「an」による要素の参照は、その要素の1以上の数が存在する可能性を除外しない。このように不定冠詞「a」又は「an」は、通常は「少なくとも1つ」を意味する。
表II.ヘルパープラスミドのクローニングのために、及び安定な細胞系の構築に使用したプラスミドのために使用したプライマー。
表III.RSVに感染したVero細胞由来RNAに関する診断RT−PCRに使用したプライマー。
表IV.コットンラット免疫実験の結果。ΔG−RSV単離体Xの免疫による、RSV感染及びRSV誘導性病態に対する防御。
ウイルス単離体、ウイルスの単離、増殖及び保存
組換えh−RSVクローンに関する基礎は、ライデン大学医療センター診断研究室から得られた臨床RSV単離体である。このウイルスは、それが単離された患者にちなんで98−25147−Xとコードを付けられたが、1998年12月21〜24日の期間にHep−2細胞を用いた診断検査から得られた。このウイルスは、その後亜群A単離体であると決定され、RSV単離体Xと称される。そのウイルスを、DMEM(Gibco)、10%FCS、pen/strep/gluを入れたT75ボトルでHep−2細胞を用いて4回、その後、DMEM(Gibco)、10%FCS、pen/strep/gluを入れたT75ボトルでVero細胞を用いて5回継代した。結果として生じたRSV単離体Xウイルスを作業用保存株として使用し、25%又は45%スクロース中で−135℃で保存した。
RSV−X cDNAをコードするウイルスゲノムの構築
保存株RSV単離体Xに感染したVero細胞のフェノール−グアニジンイソチオシアネート抽出(トリゾール、Invitrogen)により総RNAを得た。ランダムヘキサマープライマーを用いたサーモスクリプト(Invitrogen)逆転写酵素を使用した逆転写によりcDNAを調製した。制限酵素認識部位(表I及び配列表)を含む特異的プライマーを用いた高忠実度Taqポリメラーゼ(Invitrogen)を使用したPCR用のテンプレートとしてこのcDNAを使用した。RSV−A2(Genbankアクセッション番号M74568)及びRSV−RSS2(Genbankアクセッション番号U39662)の公表された配列に基づいて、プライマーを設計した。
RSV021/RSV047:pCAPベクター(Roche)、Mlu N1に平滑的に導入、pCAP3(SH/M/P領域)
RSV018/019:pCAPベクター、Mlu N1に平滑的に導入、pCAP2(G領域)
RSV016/RSV017:PUC21、Mlu I/Bam HI、pUK5(M2−2/M2−1/F領域)
RSV024/RSV025a:PUC21、Bam HI/Afl II、pUK1(NS2/NS1領域)
RSV022/RSV023:PUC21、EcoR V、pUK4(N領域)
RSV014/RSV015:PUC21、Kpn I/Mlu I、pUK2(L領域)
TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTと、
NS1遺伝子プライマーRSV126:
AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT
とを含むオリゴ(d)TでRT−PCRを行った。この断片をHind III/Pst Iを用いてpUC21にクローニングした。RACE(cDNA末端の迅速増幅)連結PCRによりその3’末端を決定した。全ての配列を組み立ててRSV−Xコンセンサス配列を得た(配列番号1)。
ΔG−RSV単離体X全長プラスミドの構築
RSV単離体Xの全ゲノムにわたる全長cDNAをPCR断片の逐次連結によって組み立てた(図1)。バクテリオファージT7ポリメラーゼに関するプロモータは、「トレイラー」末端に先行する。正確な3’末端を発生させるために、cDNA「リーダー」末端を、肝炎デルタウイルスリボザイム(HDVR)の後にT7 RNAポリメラーゼの転写ターミネータと融合させる(図1参照)。
ヘルパープラスミドの構築
数個のRSVタンパク質を発現しているヘルパープラスミドを以下のように構築した。全ての必要な遺伝子は、研究室株RSV−A2(ATCC番号VR1302)から得られる。ウイルスをHep−2細胞を用いてプラーク精製し、その後Vero細胞を感染させるために使用した。フェノール−グアニジンイソチオシアネート抽出(トリゾール、Invitrogen)によってこれらの細胞から総RNAを単離し、高忠実度Taqポリメラーゼ(Invitrogen)と、RSV遺伝子であるL、P、N及びM2−1それぞれに特異的な1組のプライマーとを使用したRT−PCRに供した(表II参照)。それから、表IIに示すように制限酵素認識部位を使用してPCR産物を発現プラスミドpcDNA3、pcDNA6又はpCIにクローニングした。クローンの配列をBigDyeターミネータキット(Applied Biosystems)を使用したPCRサイクル配列決定により確認し、ABI Prism310遺伝子解析装置で解析した。
G産生性Vero細胞系の構築
RSV−Gタンパク質を産生する細胞系を幾つかの方法を使用して構築した。方法1では、RSV−A2若しくはRSV単離体Xのいずれか由来のG遺伝子、又はプライマーRSV033及びRSV034を用いた修飾により内部翻訳開始コドンを無能にしたRSV−A2由来G遺伝子を、表IIに示すようなプライマーを使用して、RSV−A2由来又はRSV単離体Xに感染したVero細胞由来RNAに対するRT−PCRを用いて発現ベクターpcDNA3又はpcDNA6(Invitrogen)にクローニングした。プラスミドをリポソーム系の共沈化学薬剤CaCl2又はエレクトロポレーションのいずれかを使用してVero細胞に導入した(Ausubel 1989)。安定な細胞系を単離するための2つの方法を使用した。第1の方法では、トランスフェクションの72時間後に、選択培地と、pcDNA3についてはゼオシンと、pcDNA6についてはブラスチシジンとを含有する新鮮培地に種々に希釈したものを使用して細胞を分けた。細胞増殖巣が同定されるまで細胞に選択培地を3〜4日毎に供給した。単コロニーを釣り上げ、96ウェルプレートに移すか、又は様々な希釈を行って蒔き、96ウェルプレート中に単細胞を得た。抗生物質耐性コロニーについて、RSV G特異的抗体を使用した免疫染色法又はFACSによってRSV−Gの発現を検査した。Gを発現しているコロニーを継代し、Gを発現している安定細胞系と称した。第2の方法は、トランスフェクションの72時後にRSV−G特異的抗体を使用してFACSソーティングすることを含む。RSV−G発現細胞を系列希釈して蒔き、96ウェルプレート中に単細胞を得て、選択培地で培養した。単細胞コロニーを選択培地で継代してからRSV−Gの発現を再度検査し、RSV−Gを発現している細胞系をもたらした。
バクテリオファージT7ポリメラーゼ産生細胞系の構築
バクテリオファージT7ポリメラーゼ遺伝子を、プライマーALG022及びALG023(表II)を用いてその遺伝子を含むプラスミドpPRT7(van Gennip 1997)からPCR増幅する。Hind III/Xba Iを用いてPCR産物をpcDNA6bベクターにクローニングしてプラスミドpc6T7polをもたらす。製造業者(Invitrogen)が勧めるようにリポフェクタミン2000を使用してVero細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後に細胞を分け、ブラスチシジンを含有する新鮮培地中で成長させた。細胞に3〜4日毎に新鮮培地を供給し、2回分けて、さらに大きい培養容積を得る。トランスフェクションの20日後に、リポフェクタミン2000を使用してブラスチシジン耐性細胞にレポータープラスミドpT7-IRES2-EGFPをトランスフェクトした。プラスミドpT7-IRES2-EGFPの構築のために、 Hind III/Bam HIを介してプラスミドp-EGFP-N1(Clonetech)に、T7プロモータ配列をコードする1組の相補性オリゴマー(ALG32:AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT及びALG33:GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)を挿入することにより、第1プラスミドpT7-EGFPを構築した。次に、Xma I-Not Iを介してプラスミドp-IRES2-EGFPにプラスミドpT7-EGFPのT7-EGFP断片をクローニングすることによってプラスミドpT7-IRES2-EGFPを構築した。EGFPを発現している細胞をFACSでソーティングし、限界希釈して成長させて単細胞コロニーを得た。安定性に関してT7 RNAポリメラーゼを発現している単コロニーを検査し、より大きな培養容積まで成長させ保存した。
組換えΔG−RSV単離体Xウイルスを産生する方法
Hep−2細胞をDMEM+10%FCS(ウシ胎仔血清)+ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン中で培養した。一方、Vero細胞及びその誘導体をM199+5%FCS+pen/strep/glu中で培養する。細胞を37℃で10mm2の皿で80%の集密度になるまで一晩成長させた。Vero及びHep−2細胞については、修飾ウイルスAnkara-T7(MVA−T7)(Sutter 1992, Wyatt 1995)又は鶏痘T7ウイルス(Britton 1996)をMOI=3(感染多重度3)で細胞に感染させ、トランスフェクション前に32℃で60分間インキュベートしてバクテリオファージT7ポリメラーゼの発現を可能にした。細胞(Hep−2、Vero又はVero−T7細胞)をOptimem培地(glutamaxを加えたOptimem1、Invitrogen)で洗浄してから、Optimemに溶かしたリポフェクタミン2000(Invitrogen)(合計体積500μl)を使用して、RSVのN、P、L及びM2.1遺伝子をコードするヘルパープラスミド及びプラスミドpRSVXΔGをトランスフェクトした。次の量のプラスミドを添加した:pRSVXΔGを1.6μg、pcDNA6-A2-Nを1.6μg、pcDNA3-Pを1.2μg、pcDNA6-A2-Lを0.4μg、pcDNA6-A2-M2.1を0.8μg。32℃で3〜4時間インキュベートした後で、2%FCSを加えたOptimem培地500μlを添加して、細胞を32℃で3日間インキュベートした。次に、細胞を剥がし、剥がれた細胞とレスキューされたウイルスを含有する培地との混合物を使用してDMEM+2%FCS+pen/strep/glu中で成長したVero又はHep−2細胞の新鮮培養物に感染させた。後者の手順を4〜5回繰り返して高力価のウイルス保存株を得た。
a)プライマーRSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC)及びRSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)を用いたPCR並びにMlu-Iを用いた消化は、RSV単離体Xに関して937bp、並びにΔG−RSV単離体Xに関して459及び478bpの予想される断片をもたらした。
b)プライマーRSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT)及びRSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)を用いたPCRに続くXma-Iを用いた消化は、RSV単離体Xに関して880bp、並びにΔG−RSV単離体Xに関して656及び224bpの予想される断片をもたらした。
c)プライマーRSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG)及びRSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)を用いたPCR並びにSexA-Iを用いた消化は、RSV単離体Xに関して694bp、並びにΔG−RSV単離体Xに関して492及び202bpの予想される断片をもたらした。
d)プライマーRSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG)及びRSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)を用いたPCRに続くSnaB-Iを用いた消化は、RSV単離体Xに関して1820bp、並びにΔG−RSV単離体Xに関して507及び387bpの予想される断片をもたらした。
組換えΔG+G−RSV単離体Xウイルスを産生する方法
トランスフェクトされたVero細胞から得られたΔG−RSV単離体Xウイルスを数回継代して少なくとも105pfu/ml(mlあたりのプラーク形成単位)の力価を得た。次に、このウイルスの種々のMOIを用いてRSV−Gタンパク質を産生しているVero細胞系に感染させた。結果として生じたΔG+G−RSV単離体Xを培地及び/又は細胞から採集し、免疫検出法によりビリオンでのGタンパク質の存在に関して分析した。Vero又はHep−2細胞を用いて感染性力価を決定し、ΔG+G−RSV単離体Xウイルスを感染させた細胞から抽出したウイルスRNAについて、RT−PCRを用いてΔGゲノムの完全性を決定した。ウイルスを25%又は40%スクロース中で−135℃で保存した。
ΔG−RSV単離体Xの免疫によりコットンラット動物モデルでRSV感染及びRSV誘導性病態に対して防御する方法
コットンラット(Sigmodon hispidus、5〜6週齢、1群4〜6匹、雌雄)で防御実験を実施した。最初の実験では、この動物はRSV感染に感受性であること及びPrince, 2001に記載されたように、ヒトの状況を厳密に模倣する重症のワクチン介在性肺病態を呈することが示された。RSVの鼻腔内適用後に、肺の病態は気管支/細気管支内及びその周囲の炎症性浸潤と上皮の過形成とを特徴とした。ホルマリン不活化RSV−A2を筋肉内免疫後に、RSV−A2の鼻腔内攻撃を行うことに対応して、さらに重症の病態が見られた。上に言及した病態以外に、免疫介在性病態の特徴である血管周囲及び気管支周囲の浸潤並びに肺胞炎が観察された。これらの観察を、全ての免疫及び攻撃実験に関する「内部」基準として使用した。RSV製剤を用いたコットンラットの感染及び免疫を両方の鼻孔の鼻腔内で行った。病態に関してコットンラットの肺を光学顕微鏡的に検診し、肺ホモジネートの系列希釈を使用して、Vero細胞に関して、CCID50力価を得るためのRSV特異的ELISA及びpfu力価を得るためのRSV特異的抗体を使用した免疫染色で、攻撃後又は感染/免疫後の種々の時点でウイルス力価を決定した。ΔG−RSV単離体Xで2回免疫後に、コットンラットは肺でのRSV単離体Xによって引き起こされる感染及び病態に対して完全に防御された。数回の実験からの結果を表IVにまとめる。
Claims (19)
- ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含む前記ニューモウイルスのビリオンであって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、前記ビリオンが前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質を含むビリオン。
- ニューモウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項1に記載のビリオン。
- 遺伝子がG付着タンパク質をコードする、請求項1又は2に記載のビリオン。
- 変異がウイルスゲノムのみから産生されたウイルスからタンパク質を欠如させる、請求項1から3のいずれか一項に記載のビリオン。
- 変異がタンパク質をコードする配列の欠失を含む、請求項1に記載のビリオン。
- ビリオンが、ニューモウイルスのインビボ感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスビリオンを産生する方法であって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、前記ビリオンが前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質を含み、
(a)前記変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスを第1宿主細胞の培養物に感染させる段階であって、前記宿主細胞が、前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質の、前記宿主細胞における発現を指令する発現ベクターを含むステップと
(b)感染した前記宿主細胞培養物から前記ビリオンを回収するステップと
を含む方法。 - 第1宿主細胞培養の培養物に感染させるために使用されるニューモウイルスが産生される方法であって、
(a)第2宿主細胞における、
i)前記ニューモウイルスの(in vivo)感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムRNAであって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させる、ウイルスゲノムRNAと、
ii)ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体と、場合によっては1つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質と
の発現を指令する1つ又は複数の発現ベクターを前記第2宿主細胞に提供するステップと、
(b)ビリオンを産生するために前記第2宿主細胞を培養するステップと
を含む、請求項6に記載の方法。 - 第2宿主細胞により産生されたビリオンを、前記第2宿主細胞と同一又は異なる宿主細胞を用いる1つ又は複数のさらなる細胞感染ステップにより増幅することをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- ウイルスゲノムRNAが、バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼプロモータの制御下にあるウイルスDNAコピーから転写され、宿主細胞に、前記宿主細胞における前記バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼの発現を指令する発現ベクターを提供する、請求項7又は8に記載の方法。
- バクテリオファージDNA依存性RNAポリメラーゼがT7、T3又はSP6ポリメラーゼである、請求項9に記載の方法。
- ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体が少なくともL、P、Nタンパク質を含む、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質がニューモウイルスマトリックス膜タンパク質、好ましくはM2−1タンパク質である、請求項7から11のいずれか一項に記載の方法。
- ニューモウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項6から12のいずれか一項に記載の方法。
- 感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子が、G付着タンパク質をコードする遺伝子である、請求項6から13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のビリオン、又は請求項6から14のいずれか一項に記載の方法で得ることができるビリオンと、薬学的に許容できる担体とを含む組成物。
- ニューモウイルス感染の予防又は治療のための薬剤を製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のビリオンの使用。
- 薬剤が鼻腔内投与のための製剤である、請求項16に記載の使用。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載のビリオンを、ニューモウイルス感染を予防又は治療するための有効量で含む組成物を対象に投与するステップを含む、前記感染を予防又は治療する方法。
- 組成物が鼻腔内投与される、請求項18に記載の方法。
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