CN105463021A - 表达h3n2犬流感ha蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法 - Google Patents

表达h3n2犬流感ha蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法 Download PDF

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涂黎晴
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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。本发明将犬流感HA基因依次插入pMD18-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后，成功将HA基因进行修饰后，再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-△E3载体中，成功构建及病毒包装后在MDCK细胞中获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体，扩大了犬流感疫苗的研发市场，为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。

Description

表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地，涉及一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。
背景技术
2004年（Crawfordetal.,2005）首次在美国佛罗里达州猎狗身上分离到马源H3N8病毒，揭示该病毒可通过跨物种转播。时隔一年，人类在犬身上发现H3N8犬流感。之后几年在欧美几个国家均不间断的出现H3N8犬流感，然而在亚洲板块各国却鲜见该亚型病的流行。根据报道，在亚洲主要以H3N2亚型为主。2002年在南韩、2006年中国广州等地先后报道出H3N2犬流感，中国广州华南农业大学兽医学院外科教研室，历经10年不间断地进行犬流感流行情况进行跟踪调查，结果显示，在中国主要以H3N2犬流感流行为主，通过基因序列比对发现，各流行病毒株的基因同源性极其高，毒力检测均未见大幅变化，检测发现TCID50介于103～104之间。面对H5N1、H1N1在犬身上发现的个别案例，及各地逐年递增的H3N2犬流感流行病例，其流行控制仍是重点、不容小视。
发明内容
本发明从本国国情出发，针对主要流行亚型H3N2病毒，开展疫苗研制的前期工作，旨在提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，为犬流感防疫做出实施有效的技术参考。
本发明的另一个目的是提供一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，在pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间插入SEQIDNO：2所示基因片段。
一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法，包括如下步骤：
S1.PCR扩增获得SEQIDNO：1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列；
S2.将权利要求1所述的HA基因插入pMD18-T质粒中，构建重组质粒pMD18-T-HA；
S3.同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-C1载体，酶切产物连接后构建重组质粒pEGFP-C1-HA；
S4.同时双酶切重组质粒pEGFP-C1-HA和pVAXE3载体，酶切产物连接后构建重组载体pVAXE3-HA。
优选地，PCR扩增的引物序列如SEQIDNO：3～4所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将犬流感HA基因依次插入pMD18-T、pEGFP-C1、pVAX-E3质粒后，成功将HA基因进行修饰后，再将修饰后的HA基因片段重组到pPoly2-CAV2-△E3载体中，成功构建并获得稳定遗传的pPoly2-CAV2-HA疫苗载体，扩大了犬流感疫苗的研发市场，为后期犬流感疫苗的研制及相关的基础研究提供支持。
附图说明
图1为HA基因的PCR扩增产物的凝胶电泳图，1为基因Marker，2为扩增产物条带；3为阴性对照。
图2为pMD18-T-HA质粒酶切鉴定结果，1为Marker：6000bp；2，3为pMD18-T-HA经NheI和BamHI双酶切结果；4为pMD18-T-HA质粒。
图3为pEGFP-C1-HA质粒酶切鉴定结果，1为Marker:6000bp；2为pEGFP-C1-HA质粒经AseI和MluI双酶切结果；3为pEGFP-C1-HA质粒。
图4为pVAXE3-HA质粒酶切鉴定结果，1为NheI单酶切质粒；2为XhoI单酶切质粒；3为PpuMI单酶切质粒；4、质粒；5、Marker:1kb；6、Marker:2000bp。
图5为重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变（100X）。
图6为重组病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鉴定，M、Marker：2000bp；1、CAV2病毒DNA为模版；2、H2O为模版；3、重组病毒pPoly2-CAV2-HADNA为模版；4、重组pPoly2-CAV2-HA质粒为模版。
图7为电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒样颗粒（68000X）。
图8为间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达，A：PBS感染MDCK；B：重组病毒pPoly2-CAV2-HA感染MDCK；C：CAV-2感染MDCK。
图9为WB检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达。
图10为重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测。
图11为HA基因在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
下列实施例中使用到的MDCK细胞购买于ATCC细胞库，pVAXE3载体、pPoly2-CAV2-△E3载体由华南农业大学兽医学院寄生虫教研室袁子国老师惠赠；pMD18T载体购自大连宝生物工程公司；感受态DH5α（天根）购自广州真知生物有限公司。
实施例1
1、HA基因的扩增：通过NCBI上CIVH3N2亚型的HA基因进行比对分析，选取同源系数较高的一株病毒（Canine/Guangdong/1/2006(H3N2)）为模版，设计HA基因的ORF序列扩增引物。上游引物加入NheI酶切位点，下游引物加入BamHI酶切位点。
F：5’-GCTAGCATGAAAACTGTTATTGCTTTAAGC-3’；
R：5’-GGATCCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3’。
PCR扩增反应的体系和条件参考本领域常规的方法，PCR产物经凝胶电泳检测后结果见图1，切胶回收PCR扩增产物，经测序正确后备用，HA基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。
2、pMD18T-HA重组质粒的构建及鉴定：配置下列反应：无菌水1.8μL、pMD18-T载体0.2μL、PCR扩增产物3.0μL、SolutionI5μL，以上成分混匀后，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态细胞DH5α，通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得pMD18T-HA质粒，经NheI和BamHI酶切鉴定（图2）并送件测序结果正确后进行后续实验。
3、pEGFP-C1-HA重组质粒的构建及鉴定：用NheI和BamHI同时双酶切pEGFP-C1载体和pMD18T-HA重组质粒，胶回收纯化载体大片段和HA片段，载体大片段长约4000bp。通过T4连接酶将酶切后的载体大片段和切下的HA片段16℃连接过夜，连接产物转化感受态细胞DH5α，通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得pEGFP-C1-HA重组质粒，质粒经AseI和MluI双酶切鉴定（如图3），胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段，经测序后发现酶切后目的片段长2537bp，-20℃保存用于后续实验。
4、pVAXE3-HA重组质粒的构建及鉴定
去磷酸化及粘性末端补平：SspI酶切pVAXE3载体，获得7003bp的线性化片段△pVAXE3。用小肠碱性磷酸酶CIAP进行去磷酸化。具体操作如下：目的片段1～20pmol、10XCIAPbuffer5μL、CIAP（10～30U/μL）1～2μL、无菌水补齐到50μL，将该体系溶液置于37℃水浴锅30min；在加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混合液充分混匀后，10000prm离心5min，弃掉上清，如此重复一次；加入氯仿/异戊醇（24:1）50μL充分混匀后，10000prm离心5min，弃掉上清；依次加入5μL的3MNaAc、125μL冰乙酸，-20℃预冷30min，10000prm离心10min，弃掉上清；加入200μL预冷的70%无水乙醇洗涤沉淀，10000prm离心10min，弃掉上清，如此重复一次；超净台中自然晾干；用15μL的无菌水溶解沉淀。-20℃存储备用。
步骤3中回收的2537bp的目的片段含有“CMV-HA-polyA”。用KlenowFragment酶进行补粘性末端。具体操作如下25μL体系：目的片段25ng，无菌水补齐到19μL后，依次加入10XKlenowFragmentbuffer2.5μL、dNTP2.5μL、KlenowFragment1μL，将该体系溶液置于37℃水浴锅3h；在转入65℃水浴锅5min；用无水乙醇沉淀法收集去磷酸化片段。-20℃存储备用。
连接：将平端处理的“CMV-HA-polyA”片段与去磷酸化的△pVAXE3按照摩尔数比值为1：1的比例混合，在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜，将连接产物转化感受态细胞DH5α，通过液态培养基扩繁，质粒提取试剂盒，获得pVAXE3-HA重组质粒。分别用NheI、XhoI、PpuMI酶切鉴定（图4），NheI酶切得到4252bp、2177bp、1288bp、1432bp、397bp片段，XhoI酶切得到6100bp、2446bp、1000bp片段；PpuMI酶切得到4396bp、2424bp、1795bp、381bp、332bp、172bp、36bp片段。将鉴定正确的质粒送样测序。
5、pPoly2-CAV2-HA的构建及鉴定：pVAXE3-HA与pPoly2-CAV2-△E3分别用SalI和NruI双酶切后，用胶回收试剂盒收集4016bp、27147bp片段。在T4连接酶下连接两种片段，将连接产物转化感受态细胞DH5α获得更多的克隆子，用去内毒素大提试剂盒提取质粒，经核酸定量检测仪检测浓度及纯度，将合格的重组质粒pPoly2-CAV2-HA置于-20℃备用，pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间插入的基因片段序列如SEQIDNO：2所示。
实施例2重组病毒pPoly2-CAV2-HA的包装及鉴定
本实施例中使用的Canine/Guangdong/1/2006(H3N2)细胞由华南农业大学兽医学院外科教研室分离留存；CAV-2病毒由广州华南农业大学寄生虫教研室袁子国老师惠赠。
一、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的包装：用PmeI和AscI双酶切重组质粒pPoly2-CAV2-HA，通过大片段胶回收试剂盒纯化线性化的大片段，长约28000bp。在纯化酶切后的大片段时必须轻柔操作，最后用洗脱液进行洗脱时，应将同样的洗脱液重复利用洗脱2～3次，可提高洗脱浓度。经紫外分光光度计核酸检测仪测定片段的浓度及OD260/OD280的比值，其比值介于1.7～2.1则结果可行，此法同样适用于重组质粒的定量。
将定量好的重组质粒和线性化片段同时转染MDCK，要求MDCK的转染密度在70～80%，转染前用PBS润洗3次，再加入2mL的无血清的MEM以备用。以6孔板转染为例，用Opti-MEM稀释核酸（总量2.5ug（质粒：片段=1：1））至125μL，按照脂质体Lip2000的量为3μL/孔与122μL/孔的Opti-MEM混合，最后将125μL的核酸稀释液与125μL脂质体稀释液混匀后，室温静置5min。将混合物加入预先润洗好的细胞培养液中，无需换液，每24小时观察一次细胞，以PBS空白对照组的细胞为参照。当空白组细胞死亡50%以上时，可终止观察，并收集实验组细胞和上清液，经反复冻融3次后，将冻融液用0.22μm过滤膜过滤后-80℃保存备用。
本发明解决了大片段、大质粒转染细胞需借用电转或Ca2+等高效率较麻烦的难题，完成了脂质体轻松介导转入大基因的工作。需注意的是1）转染的条件，实则根据载体与大片的摩尔比值来优化，n质粒：n片段=1：1～3之间进行优化，本发明结果显示1：1最佳，1：2次之，故该比值范围可做参考。2）转染操作手法需特别注意，将脂质体稀释液加入核酸稀释液时，应将枪头插入液面，缓缓打入，混合时不可用枪吹打，轻柔旋转EP管即可。应用该发明中的操作方法可提高转染效率。
二、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的鉴定
1、重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK细胞上的细胞病变：将步骤一中疑似包装好的冻融液和对照组（CAV2和PBS）的冻融液分别接种MDCK。37℃、5%CO2培养箱孵育1h后，更换成病毒维持液，每隔24h进行观察，直到正常细胞对照组死亡50%，则可收集细胞及上清液进行冻融处理。如此盲传3～6代，直到重组病毒致使MDCK细胞出现明显的CAV2病变情况，即在48h后出现明显的细胞肿胀变圆，葡萄串样典型的腺病毒病变（见图5)。
2、重组病毒pPoly2-CAV2-HA的PCR鉴定：收集病变细胞，用基因组抽提试剂盒抽提病毒DNA，并以此为模版进行PCR鉴定。PCR扩增引物如下：
HA(F)：5’-GCTAGCATGAAAACTGTTATTGCTTTAAGC-3’；
HA(R)：5’-GGATCCTCAAATGCAAATGTTGCACC-3’。
PCR扩增程序：94℃预变性1min；94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环35次；72℃终延伸10min。将PCR产物进行凝胶电泳检测（图6）。
3、电镜观察重组病毒pPoly2-CAV2-HA的病毒样颗粒：重组病毒感染MDCK细胞后，经6次盲传纯化后，取第7代病变细胞的上清液。用腺病毒纯化试剂盒进行纯化，配制0.5%磷钨酸溶液进行负染色，置于电镜下观察病毒形态。可见病毒粒子呈正二十面体结构，病毒表面由五邻粒和六邻粒构成的衣壳，此为腺病毒样病毒粒子特征（见图7)。
4、重组病毒pPoly2-CAV2-HA(rCAV2-HA)的血凝特性：收集重组病毒致80%MDCK细胞明显病变的上清液，经0.22μm过滤膜过滤后。与大鼠、猪、豚鼠、兔、人“O”型血进行血凝反应。结果显示，重组腺病毒只与大鼠、人“O”型血凝集，不与其他血发生凝集（见表1）。
表1重组病毒pPoly2-CAV2-HA的血凝特性检测
豚鼠血 兔血 猪血 人“O”血 大鼠血
rCAV2-HA － － － 27 25
CAV2 － － － 29 27
PBS － － － － －
5、间接免疫荧光检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达：重组病毒感染MDCK后，待细胞发生50%的葡萄串样病变时，弃掉上清液，用PBS轻柔洗涤细胞3次。用4%多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗三遍，每次5min，
用0.2～0.5%tritonX-100（PBS配制）对细胞进行透化处理10min，PBS洗三遍，每次5min，10%的山羊血清封闭30min，PBS洗涤两遍，加入一抗（鼠源HA单克隆抗体），室温孵育1h，PBS洗三遍，每次5min，加入羊抗鼠IgG-FITC二抗，室温孵育30～45min，PBS洗四遍，每次5min。倒置荧光显微镜下观察HA表达情况（见图8）。
6、蛋白免疫印迹法检测HA在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达：重组病毒感染MDCK后，待细胞发生50%的葡萄串样病变时，弃掉上清液，收集病变细胞和正常细胞，总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。灌制10%的SDS-PAGE凝胶，蛋白上样量为20μg/孔，蛋白上样前加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃孵育5min，恢复室温后再上样。上层胶电压为80V，下层胶电压为100V。以200mA45min中的湿转法将胶上蛋白转印到硝酸纤维素膜上。对膜做如下处理：1×TBST洗涤3次，每次10min；5%的脱脂奶粉封闭2h；1×TBST洗涤3次，每次10min；孵育一抗（犬源的CIV(H3N2)多抗），4℃过夜；1×TBST洗涤3次，每次10min；孵育二抗（羊抗狗IgG-HRP抗体）37℃摇床孵育1h；1×TBST进行洗涤3次，每次10min；采用ECL化学发光检测试剂盒进行曝光（如图9），曝光时间为4h。
7、重组病毒pPoly2-CAV2-HA在MDCK中的病毒滴度稳定性检测：经过鉴定成功后的重组腺病毒被接种到MDCK细胞上，待80%细胞出现明显的细胞病变后，收集上清液和细胞，反复冻融三次后，经0.22μm过滤膜过滤，用于继续传代，如此收集第6代到13代之间的病毒，进行TCID50检测，采用Reed-Muench法计算TCID50值（如图10）
8、HA基因在重组病毒pPoly2-CAV2-HA中的表达稳定性检测：按照步骤7中病毒传代的方法，将病毒传至30代，并收集第10代、20代、30代的感染细胞，用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，BCA定量法标定蛋白量，蛋白加入5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲，100℃孵育5min，恢复室温后再上样，上样量为30μg/孔。按照步骤6中方法进行SDS-PAGE凝胶电泳和蛋白转印。对膜对如下处理：1XTBST洗涤3次，每次10min；5%的脱脂奶粉封闭2h；1XTBST洗涤3次，每次10min；孵育一抗（鼠源的HA(CIVH3N2)单克隆抗体），4℃过夜；1XTBST洗涤3次，每次10min；孵育二抗（IRDye800CWGoatanti-mouseIgG（H+L））37℃摇床孵育1h；1XTBST进行洗涤3次，每次10min。近红外成像仪中采集蛋白表达信息（如图11）。
SEQUENCELISTING
<110>华南农业大学
<120>表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法
<130>
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>1712
<212>DNA
<213>HA基因序列
<400>1
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cttccaggaaatgaaaataatgctgcaacactatgcctgggacatcatgcagtgccgaac120
gggacaacagtgaaaactatcacagacgatcaaattgaggtgaccaacgccaccgagcta180
gtccaaaactcctcaacagggaaaatatgcaacaatccccacaagatccttgatgggagg240
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<213>pPoly2-CAV2-E3插入的基因片段序列
<400>2
tattagattattgaccatgttctttttgttagaatcttccgggacatgaaaataatgctg60
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tagaaatgaggcagtgaacaatcggttccagatcaaaggtgttgagctaaagtctggata1560
caaagactggatcttgtggatttcctttgccatatcatgctttttgctttgtgttgtctt1620
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<210>3
<211>30
<212>DNA
<213>引物F
<400>3
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<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>引物R
<400>4
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<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>HA(F)
<400>5
gctagcatgaaaactgttattgctttaagc30
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>HA(R)
<400>6
ggatcctcaaatgcaaatgttgcacc26

Claims (3)

1.一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体，其特征在于，在pPoly2-CAV2-△E3质粒的SalI和NruI酶切位点之间插入SEQIDNO：2所示基因片段。
2.一种表达H3N2犬流感HA蛋白的重组犬腺病毒疫苗载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.PCR扩增获得SEQIDNO：1所示的犬流感病毒H3N2亚型的HA基因序列；
S2.将权利要求1所述的HA基因插入pMD18-T质粒中，构建重组质粒pMD18-T-HA；
S3.同时双酶切重组质粒pMD18-T-HA和pEGFP-C1载体，酶切产物连接后构建重组质粒pEGFP-C1-HA；
S4.同时双酶切重组质粒pEGFP-C1-HA和pVAXE3载体，酶切产物连接后构建重组载体pVAXE3-HA。
3.根据权利要求1的构建方法，其特征在于，PCR扩增的引物序列如SEQIDNO：3～4所示。
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