KR102463632B1 - 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

다량체 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신, 및 특히 인플루엔자의 검출, 예방 및/또는 치료에서의 그들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.

Description

인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도{INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF}
도입
본 발명은 의약(medicine) 분야에 관한 것이다. 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인(hemagglutinin stem domain) 폴리펩티드, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신, 및 특히 인플루엔자의 검출, 예방 및/또는 치료에서의 이들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
인플루엔자 바이러스는 중증도가 준임상적 감염으로부터 사망을 야기할 수 있는 원발성 바이러스성 폐렴까지의 범위인 호흡기 질병(통상 "인플루엔자" 또는 "플루"로 지칭)을 야기하는 주요 인간 병원체이다. 감염의 임상 효과는 인플루엔자 균주(strain)의 발병력 및 숙주의 노출, 병력, 연령 및 면역 상태에 따라 달라진다. 매년 전 세계적으로 대략 10억 명의 사람들이 인플루엔자 바이러스로 감염을 겪어, 3백만 내지 5백만의 사례에서 중증의 병이 야기되고, 300,000 내지 500,000건의 인플루엔자 관련 사망이 발생하는 것으로 추정된다. 대부분의 이들 감염은 기여도가 보다 적은 인플루엔자 B 바이러스와 함께, H1 또는 H3 헤마글루티닌 서브타입을 지니는 인플루엔자 A 바이러스에 기인할 수 있으며, 이에 따라, 대표적인 3가지 모두가 계절성 백신에 포함된다. 현행의 면역화 실행은 효과적인 계절성 인플루엔자 백신의 시기적절한 생성을 가능하게 하기 위하여, 유행하는 인플루엔자 바이러스의 조기의 확인에 의존한다. 다음 계절 동안 우세적일 균주를 예측함에 있어서 내재적인 어려움과 별개로, 항바이러스 내성 및 면역 회피는 또한 현행의 백신이 이환 및 사망을 예방하지 못하게 한다. 이에 더하여, 동물 병원소로부터 비롯되고, 인간 대 인간 확산을 증가시키도록 재배열된(reassorted) 고도의 발병력의 바이러스 균주에 의해 야기되는 범유행의 가능성은 세계의 보건에 대하여 상당한 현실적인 위협을 제기한다.
인플루엔자 A 바이러스는 자연에서 널리 분포되어 있으며, 다양한 조류 및 포유류를 감염시킬 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae)의 과에 속하는 외피(enveloped) RNA 바이러스이다. 이들의 게놈은 11가지 상이한 단백질, 1가지 핵단백질(NP), 3가지 중합효소 단백질(PA, PB1 및 PB2), 2가지 기질 단백질(M1 및 M2), 3가지 비-구조 단백질(NS1, NS2 및 PB1-F2) 및 2가지 외부 당단백질: 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다제(NA)를 암호화하는 8개의 단일 가닥 RNA 세그먼트(segment)로 구성된다. 바이러스는 HA 및 NA 단백질의 항원 구조의 차이를 기반으로 하여 분류되며, 이들의 상이한 조합은 특정 인플루엔자 바이러스 균주로 더 분류되는 독특한 바이러스 서브타입을 나타낸다. 모든 공지되어 있는 서브타입이 조류에서 관찰될 수 있지만, 현재 유행하는 인간 인플루엔자 A 서브타입은 H1N1 및 H3N2이다. 계통발생 분석에 의해, 2개의 주요 그룹으로의 헤마글루티닌의 세분이 입증되었다: 특히, 계통발생 그룹 1에서 H1, H2, H5 및 H9 서브타입, 그리고 특히, 계통발생 그룹 2에서 H3, H4 및 H7 서브타입.
인플루엔자 B형 바이러스 균주는 엄격하게 인간이다. 인플루엔자 B형 바이러스 균주 내의 HA의 항원 변이는 A형 균주에서 관찰되는 것보다 더 작다. B/Yamagata/16/88(B/Yamagata로도 지칭) 및 B/Victoria/2/87(B/Victoria) 계통으로 표시되는 바와 같은 인플루엔자 B 바이러스의 2가지의 유전학적 및 항원적으로 별개의 계통이 인간에서 유행하고 있다(문헌[Ferguson et al., 2003]). 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병의 스펙트럼은 일반적으로 인플루엔자 A 바이러스에 의해 야기되는 것보다 더 경증이지만, 입원을 필요로 하는 중증의 병이 인플루엔자 B 감염에서 여전히 빈번하게 관찰된다.
인플루엔자 바이러스를 중화시키는 항체가 주로 헤마글루티닌(HA)에 대해 유도되는 것이 알려져 있다. 헤마글루티닌 또는 HA는 바이러스 코트에 부착된 삼량체 당단백질이며 이중의 기능을 갖는다: 세포 표면 수용체 시알산으로의 결합을 담당하는 기능, 및 이것이 흡수 후에 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 매개하여 세포의 세포질 내의 바이러스 RNA의 방출을 야기하는 기능. HA는 큰 헤드 도메인(head domain) 및 보다 작은 스템 도메인을 포함한다. 바이러스 막으로의 부착은 스템 도메인에 연결된 C-말단 고정(anchoring) 서열에 의해 매개된다. 단백질은 지정된 루프에서 번역 후 절단되어, 2가지 폴리펩티드, HA1 및 HA2를 생성한다(전체 서열은 HA0으로 지칭). 막 원위 헤드 영역은 주로 HA1으로부터 유래하며, 막 근위 스템 영역은 주로 HA2로부터 유래된다(도 1).
계절성 인플루엔자 백신이 매년 갱신되어야 하는 이유는 바이러스의 큰 변이성 때문이다. 헤마글루티닌 분자에서, 이러한 변이는 특히 항원 소변이(drift) 및 대변이(shift)가 다수의 상이한 변이체를 야기하는 헤드 도메인에서 나타난다. 이것이 또한 면역우성인 영역이기 때문에, 대부분의 중화 항체는 이러한 도메인에 대해 유도되며, 수용체 결합을 방해함으로써 작용한다. 헤드 도메인의 큰 변이 및 면역우성의 조합은 또한 특정 균주로의 감염이 다른 균주에 대한 면역성을 야기하지 않는 이유를 설명한다: 제1 감염에 의해 유도되는 항체는 일차 감염의 바이러스와 밀접하게 관련된 제한된 수의 균주만을 인식한다.
최근에, 모든 또는 실질적으로 모든 인플루엔자 헤마글루티닌 구형 헤드 도메인이 결여된 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드가 기술되었으며, 이는 스템 도메인 폴리펩티드의 하나 이상의 보존된 에피토프에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 사용된다. 스템 도메인 폴리펩티드의 에피토프가 구형 헤드 도메인의 고도의 면역원성 영역보다 면역원성이 더 적어서, 이에 따라, 스템 도메인 폴리펩티드 내의 구형 헤드 도메인의 부재는 스템 도메인 폴리펩티드의 하나 이상의 에피토프에 대한 면역 반응이 발생하게 할 수 있는 것으로 여겨진다(문헌[Steel et al., 2010]). 이에 따라, 스틸(Steel) 등은 HA 일차 서열로부터 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 및 A/Hong Kong/1968(H3N2) 균주의 HA1의 아미노산 잔기 53 내지 276을 결실시키고, 이를 짧은 유연성(flexible) 연결 서열 GGGG로 대체함으로써 신규한 분자를 생성하였다. H3 HK68 작제물을 사용한 마우스의 백신접종은 그룹 1 HA와 교차 반응성인 항혈청을 유도하지 않았다. 또한 PCT/EP2012/073706호에 나타낸 바와 같이, 스템 도메인 폴리펩티드는 매우 불안정하며, 스템 영역 내의 보존된 에피토프에 결합하는 것으로 보이는 항체의 결합의 결여에 의해 입증된 바와 같이, 올바른 형태를 취하지 않았다.
또한, 문헌[Bommakanti, et al., (2010)]에서는 HA2의 아미노산 잔기 1 내지 172, 7-아미노산 링커(GSAGSAG), HA1의 아미노산 잔기 7 내지 46, 6-아미노산 링커 GSAGSA에 이어서 HA1 내에 돌연변이 V297T, I300E, Y302T 및 C305T가 있는 HA1의 잔기 290 내지 321을 포함하는 HA2 기반의 폴리펩티드를 기재하고 있다. 해당 설계는 H3 HA(A/Hong Kong/1968)의 서열을 기반으로 하였다. 폴리펩티드는 H1 서브타입(A/PR/8/34)에 대해서는 교차 보호를 제공하지 않고, H3 서브타입(A/Phil/2/82) 내의 다른 인플루엔자 바이러스 균주에 대해서만 오직 교차 보호를 제공하였다. 문헌[Bommakanti et al (2012)]에 의한 더욱 최근의 논문에, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(H1HA0HA6)로부터의 HA를 기반으로 한 스템 도메인 서열이 기재되어 있다. 이러한 폴리펩티드에서, 잔기 55 내지 302의 등가물이 결실되고, 돌연변이 I311T, V314T, I316N, C319S, F406D, F409T 및 L416D가 이루어졌다. H3 및 HA 기반의 폴리펩티드 둘 모두를 에스케리키아 콜라이(E. coli)에서 발현시켰으며, 이에 따라, 자연 발생 HA 단백질의 부분인 글리칸이 결여되어 있다. 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이에서 발현되는 경우, 주로 고분자량 응집물 및 부수적인 단량체 분획으로서 회수된다. 폴리펩티드는 9 및 0.2 μM의 2개의 겉보기 해리 상수로 CR6261에 결합한다. 저자는 마우스가 100 ㎍의 CpG7909가 보강된 20 ㎍의 단백질을 사용한 면역화(2회, 4주 간격) 후에 1 LD90의 상동성 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 바이러스를 사용한 시험감염을 견뎌낼 수 있음을 보여준다. 또한, 저자는 A/Hong Kong/1/1968 유래의 폴리펩티드에 대하여 상기 기재된 것들과 유사한 순환 순열 폴리펩티드를 기재하고 있다. 이들 폴리펩티드는 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934, H1N1 A/North Carolina/20/99 또는 H1N1 A/California/07/2009로부터의 HA의 것으로부터 유래하며, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934(즉, 동일한 서브타입 내)의 마우스의 온건한 시험감염(1LD90) 모델에서 부분적인 보호를 제공할 수 있다. 이들 폴리펩티드로 면역화된 기니 피그 유래의 혈청은 중화 검정에서 시험되는 경우 검출 가능한 중화 수준을 나타내지 않았다.
더욱 최근에, 문헌[Lu et al (2013)]에는 또한, H1N1 A/California/05/2009의 HA로부터 유래한 가용성 스템 도메인 폴리펩티드가 기재되었다. 최종 설계에서, 잔기 54 내지 303(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)의 등가물이 결실되었으며(리더 서열, 잔기 1 내지 17도 또한 존재하지 않음), 2개의 돌연변이, 즉, F407D 및 L413D가 단백질의 B-루프 내로 도입되었다. 추가로, 폴리펩티드는 C-말단 삼량체화 도메인(폴드온(foldon))을 함유하였다. 또한, 2개의 단량체간 이황화 가교가 도입되었는데, 하나는 삼량체 폴드온 도메인의 영역 내에, 하나는 위치 430 및 431에 도입되었다. 폴리펩티드는 에스케리키아 콜라이 기반의 무세포 시스템에서 생성되고(이에 따라, 자연 발생 HA 단백질의 부분인 글리칸이 결여됨), 변성 형태로 회수되며, 이는 이용 전에 재폴딩을 필요로 한다. 면역학적 또는 인플루엔자 시험감염으로부터의 보호 데이터가 나타나지 않았으며, 그래서 이러한 폴리펩티드의 면역원성 및 효능이 알려져 있지 않다.
최근의 문헌에서, 문헌[Mallajosyula et al (2014)]에는 또한 스템 도메인 폴리펩티드가 보고되어 있다. 이러한 설계에서, H1N1 A/Puerto Rico/8/1934로부터의 HA를 기반으로 하여, HA1 서열의 큰 부분(잔기 42 내지 289, SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)뿐 아니라 HA2의 N- 및 C-말단 서열의 큰 부분(각각 잔기 344 내지 383 및 457 내지 565)이 결실되었다. H3 HA 단백질에서, 결실된 부분이 광범위 중화 에피토프, 예를 들어, CR8020 및 CR8043의 것들을 함유하는 것은 주목할 만하다. 폴리펩티드는 다시 C-말단에 폴드온 삼량체화 도메인을 함유하며, 또한, 에스케리키아 콜라이에서 생성되어, 바이러스 HA 상에 자연 발생 글리칸이 결여되어 있다. 폴리펩티드는 광범위 중화 항체에 결합하며, 이는 CR6261, F10 및 FI6v3이다. 또한, 폴리펩티드를 인플루엔자 시험감염 모델(1LD90의 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934)에서 시험하였으며, 사망으로부터 마우스를 보호할 수 있었다. H1N1 A/New Caledonia/20/1999 및 H1N1 A/California/04/2009의 HA로부터 유래한 등가의 폴리펩티드는 또한, 부분적으로 보호할 수 있었다. H5N1 A/Viet Nam/1203/2004로부터 유래한 동등한 폴리펩티드는 이러한 시험감염 모델에서 오직 제한된 보호만을 제공하였다. 더욱이, 오직 하나의 인플루엔자 균주만을 사용하여 상대적으로 낮은 용량(1-2 LD90)을 투여하여 동물을 시험 감염시켜, 보편적 백신에 대한 필수조건인 다수의 인플루엔자 균주에 대한 보호가 확립되지 않았다.
따라서, 강력한 광범위 중화 항체 반응의 생성을 자극하고, 광범위한 세트의 현재 및 장래의 인플루엔자 바이러스 균주(계절성 및 유행성 둘 모두)에 대한 보호를 제공하여, 특히 인플루엔자의 효과적인 예방 및 치료를 위한 계통발생 그룹 1 및/또는 그룹 2 내의 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 서브타입에 대한 보호를 제공하는 안전하고 효과적이며 보편적인 백신이 여전히 필요하다.
요약
인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 스템 도메인 폴리펩티드의 제공 방법, 이를 포함하는 조성물, 이를 포함하는 백신 및 이들의 이용 방법이 본 명세서에 제공된다.
제1 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 스템 도메인 폴리펩티드로 지칭되는, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인을 포함하고 구형 헤드가 결여된 신규한 면역원성 다량체 폴리펩티드를 제공한다. 다량체 폴리펩티드는 대상, 특히 인간 대상에 투여되는 경우 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 막 원위 헤드 도메인에 존재하는 우성 에피토프의 부재 하에, 막 근위 스템 도메인 HA 분자의 보존 에피토프를 면역계에 제시한다. 이를 위하여, 헤드 도메인을 구성하는 HA0 단백질의 일차 서열의 일부를 제거하고, 나머지 아미노산 서열을 직접적으로 또는 일부 구현예에서는 짧은 유연성 연결 서열('링커')을 도입하여 다시 연결하여, 아미노산 사슬의 연속성을 복구시킨다. HA0 분자의 나머지 부분의 고유 3차원 구조를 안정화시키는 특정 돌연변이를 도입함으로써 생성된 서열을 더 변형시킨다. 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스의 전장 HA1 및/또는 HA2를 포함하지 않는다.
본 발명은 신규한 다량체 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하며, 상기 다량체 폴리펩티드는 적어도 제1 및 제2 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 단량체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 단량체는 각각 (a) 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결된 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함하며, 상기 HA1 C-말단 세그먼트는 (b) 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 도메인에 연결되고, 상기 HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 x, 바람직하게는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하고, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 y 내지 C-말단 아미노산을 포함하고,
(c) 폴리펩티드는 HA1과 HA2 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고;
(d) 제1 단량체는 제1 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 제2 단량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교에 의해 상기 제2 단량체에 연결된다.
이에 따라, 본 발명에 따르면, 이황화 가교는 다량체의 개별 단량체 사이에 공유적 교차 결합을 형성한다.
특정 구현예에서, 다량체 폴리펩티드는 삼량체이며, 다시 말하면, 3개의 단량체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 각각의 단량체는 하나의 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 다른 다량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교에 의해 다른 단량체에 연결된다. 사용되는 넘버링이 SEQ ID NO: 1과 관련이 있는 것이 주목된다. 해당 분야의 숙련자는 다른 HA 서열에서 동등한 위치를 결정할 수 있을 것이다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 계통발생 그룹 1로부터 유래한 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, x는 SEQ ID NO: 1의 위치 52(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, p는 SEQ ID NO: 1의 위치 18(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, y는 SEQ ID NO: 1의 위치 321(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 52를 포함하며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 321 내지 말단(즉, HA1의 C-말단 아미노산)을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 세그먼트 내의 결실은 위치 53에서의 아미노산으로부터 위치 320에서의 아미노산까지(위치 320에서의 아미노산 포함)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 신호 서열을 포함하지 않는다. 이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 18 내지 52를 포함하며, 여기서, p는 성숙 HA 분자의 제1 아미노산(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 경우에 p=18)이다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 계통발생 그룹 2로부터 유래한 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
이에 따라, 본 발명의 다량체 폴리펩티드는 적어도 2개의 단량체를 포함하며, 각각의 단량체는 HA1 도메인 및 HA2 도메인을 포함하고, 상기 HA1 도메인은 직접적으로 또는 연결 서열을 통해 HA1 C-말단 세그먼트에 연결되는 HA1 N-말단 세그먼트를 포함한다. 특정 구현예에서, HA2 도메인의 N-말단 아미노산은 HA1 C-말단 세그먼트의 C-말단 아미노산에 직접 연결된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 완전한 HA2 도메인, 즉, 막횡단 도메인 및 세포내 서열을 포함하는 HA2 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 단량체의 HA2 도메인은 절단된다(truncated). 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, HA2 도메인의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530(또는 이의 등가물)으로부터 HA2 도메인의 C-말단까지의 아미노산 서열이 제거된다.
본 발명에 따르면, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산을 HA2 도메인의 N-말단 아미노산에 연결시켜, HA1과 HA2 도메인 사이에 접합부를 형성한다. 본 발명의 폴리펩티드는 HA1 및 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기(SEQ ID NO: 1에서 아미노산 343)는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이외의 임의의 아미노산, 바람직하게는 글루타민(Q)이다.
본 발명의 면역원성 폴리펩티드에서의 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 단량체는 실질적으로 HA0보다 더 작으며, 바람직하게는 HA의 구형 헤드의 전부 또는 실질적으로 전부가 결여된다. 바람직하게는, 면역원성 단량체는 360개 이하, 바람직하게는 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 또는 270개 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 약 250 내지 약 350, 바람직하게는 약 260 내지 약 340, 바람직하게는 약 270 내지 약 330개이다.
본 발명의 폴리펩티드는 전장 HA1을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 야생형 HA, 특히 HA1 및 HA2 도메인이 기반으로 하는 HA의 아미노산 서열에 비하여, HA1 및/또는 HA2 도메인 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 더 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 그룹 1 교차-중화 항체 CR6261(WO2008/028946호에 개시된 바와 같음) 및/또는 항체 CR9114(WO2013/007770호에 기재된 바와 같음), 즉, 그룹 1 및 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스에 결합하고, 이를 중화시킬 수 있는 항체의 보존된 스템 도메인 에피토프를 포함한다. 따라서, 본 발명의 다른 양태는 HA 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하는 것이며, 상기 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드로의 상기 항체 또는 항체들의 결합에 의해 나타난 바와 같이, 항체 CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 오직 H3 인플루엔자 바이러스에만 결합하는 모노클로널 항체인 CR8020 및 CR8057(WO 2010/130636호에 기재됨)에 결합하지 않는다. 본 명세서에 제공된 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 복수의 인플루엔자 바이러스 A 및/또는 B 균주에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 면역원성 조성물(예를 들어, 백신)에 사용하기에 적합하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 그룹 2 교차-중화 항체 CR8020(WO 2010/130636호에 기재)의 보존된 스템 도메인 에피토프를 포함한다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 계통발생 그룹 1 및/또는 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스 균주에 대하여, 특히 계통발생 그룹 1 및 그룹 2 둘 모두의 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 동종 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 동일하고/거나 상이한 서브타입의 이종 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다. 추가의 구현예에서, 폴리펩티드는 계통발생 그룹 1 및 그룹 2 둘 모두의 인플루엔자 바이러스 균주 및 인플루엔자 B 바이러스 균주에 대하여 면역 반응을 생성할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 특히 계통발생 그룹 1 또는 2의 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 독립형 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에서, 또는 다른 예방 및/또는 치료적 처치, 예를 들어, (기존의 또는 장래의) 백신, 항바이러스제 및/또는 모노클로널 항체와 병용하여 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 HA 스템 도메인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 대상에서의 면역 반응의 유도 방법을 제공하며, 해당 방법은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 명세서에 제공되는 면역원성 조성물은 조성물이 대상, 예를 들어, 마우스, 페럿(ferret) 또는 인간에게 투여되게 하는 임의의 형태로 존재할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 면역원성 조성물은 인간 투여에 적합하다. 폴리펩티드, 핵산 분자 및 조성물은 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법에서 및/또는 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 보강제(adjuvant)를 포함하거나 이와 함께 투여된다.
다른 양태에서, 본 발명은 백신으로 사용하기 위한 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 특히, 계통발생 그룹 1 및/또는 2의 인플루엔자 바이러스 A 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 백신으로 사용하기 위한 면역원성 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 다양한 구현예 및 용도는 본 발명의 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 고유의 삼량체에 존재하는 바와 같은 사전 융합 상태의 HA 단량체의 모델을 보여준다. HA1은 연회색으로 나타나 있으며, HA2는 진회색으로 나타나 있다. 헬릭스 A(CR6261의 에피토프의 중요한 부분) 및 헬릭스 CD(삼량체 경계면의 부분)가 이들 2차 구조 성분을 연결하는 루프와 같이 표시된다. HA1의 C-말단 및 HA2의 N-말단도 또한 나타나 있다. 융합 펩티드는 HA2의 N-말단에 위치한다.
도 2. (a) 삼량체 및 단량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 정제된 가용성 HA
(b) s127H1(SEQ ID NO: 66), s127H1-t2(SEQ ID NO: 91)를 발현하는 배양물로부터 수득되는 배지; FL HA 삼량체 및 단량체에 대한 데이터도 또한 비교를 위하여 나타나 있음
(c) 55G7-t2의 이중 시스테인 돌연변이 변이체(SEQ ID NO: 166 내지 176)
(d) 127H1-t2의 이중 시스테인 변이체(SEQ ID NO: 177 내지 187)에 대한 CR9114 샌드위치 ELISA 결과.
도 3. 환원(a, c) 및 비환원 조건(b, d) 하의 55G7(a, b) 및 127H1-t2(c, d)의 이중 시스테인 변이체를 발현하는 배양물의 배지의 웨스턴 블롯. 각각의 레인(lane) 위의 숫자는 표 10에 열거된 바와 같은 시스테인 돌연변이의 클러스터를 지칭한다.
도 4. 127H1-t2-cl18에서 시스테인으로 돌연변이된 잔기 411 및 419의 위치를 나타내는 본 발명의 폴리펩티드의 구조 모델. 모델은 H1N1 A/California/04/2009(PDB 3LZG)의 전장 HA의 구조로부터의 잔기 53 내지 320의 결실에 의해 생성된다.
도 5. (a). 추가의 C-말단 his-태그가 있는 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 181)의 정제 동안 분취용 크기 배제 컬럼(Superdex 200)으로부터의 용리 프로파일. 분획은 도면 아래에 나타나 있다.
(b) 비환원(좌측) 및 환원 조건(우측)하에 크기 배제 컬럼으로부터 수집된 분획의 SDS-PAGE 분석. 레인 위의 숫자는 도 5a에 상응하며, M은 분자량 마커를 나타낸다.
(c) 분획 1 내지 4의 고유 PAGE. 레인 위의 숫자는 도 5a에 상응하며, M은 분자량 마커를 나타낸다.
(d) 검출을 위하여 폴리클로널 항-his-태그 항체를 사용한 분획 1 내지 4의 웨스턴 블롯. 레인 위의 숫자는 도 5a에 상응하며, M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 6. 도 5에 나타낸 바와 같이 분획 1 내지 4에서의 폴리펩티드로의 광범위 중화 항체 CR6261 및 CR9114의 결합에 대한 ELISA 결과. 폴리클로널 항-H1 HA 혈청 및 그룹 2 특이적 모노클로널 항체 CR8020으로의 결합도 또한 포함된다. 비교하기 위하여, 단량체 및 삼량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 가용성 HA에 대한 결과도 또한 나타나 있다.
도 7. 도 5에 나타낸 바와 같은 분획 1 내지 4에 대한 CR9114 샌드위치 ELISA 결과. 비교하기 위하여, 단량체 및 삼량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 가용성 HA에 대한 결과도 또한 나타나 있다.
도 8. CR8020(상측 패널), CR6261 또는 CR9114(둘 모두 하측 패널)의 Fab 단편의 부재 및 존재하에서의 분획 3의 폴리펩티드에 대한 SEC-MALS 결과. CR9114 및 CR6261의 Fab 단편과의 복합체 형성은 분자량의 증가 및 피크의 이동을 야기한다.
도 9. 이중층 간섭법(biolayer interferometry)에 의해 결정되는 바와 같은 s127H1-t2-cl18long로의 광범위 중화 항체 CR6261 및 CR9114의 결합. a 및 c는 다양한 농도의 s127H1-t2-cl18long에 노출된 고정화된 모노클로널 항체에 대한 개별 결합 곡선을 보여주며; b 및 d는 Kd를 추정하기 위해 사용되는 정상 상태 분석을 보여준다.
도 10. 음성(PBS, 3주 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존(a), 상대 체중 감소(b) 및 임상 점수(c). 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(b) 또는 사분범위(c)를 나타낸다.
도 11. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다.
도 12. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 상대 체중 변화. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
도 13. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 1회(a), 2회(b) 또는 3회(c) 면역화시킨 그룹에 대한 임상 점수. 마우스를 마지막 면역화 후 4주에 치명적인 용량(25xLD50)의 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로 시험 감염시키고 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한 나타나 있다. 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 14. 음성 대조군 및 항원으로서 s127H1-t2-cl18long(a) 또는 가용성 형태의 전장 HA(b)를 사용한 실험군의 사전-시험감염 혈청(마지막 면역화 후 4주)에 대한 ELISA 결과. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 15. 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long으로의 면역화 후에 최종 면역화 4주 후(사전-시험감염 시점)에 유도되는 항체는 경쟁 ELISA에서 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 전장 HA로의 결합을 위해 CR9114와 경쟁할 수 있다(상측). 비교를 위하여, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석한 비-결합 모노클로널 항체 CR8020에 의한 경쟁 수준은 개별 그래프 하측에 나타나 있다. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 16. (a) 음성(PBS, 3주의 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H5N1 A/Hong Kong/156/97로 시험 감염시켰다. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 3회 면역화시킨 그룹에 대한 (b) 생존, (c) 상대 체중 변화 및 (d) 임상 점수 중간값. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(c) 또는 사분범위(d)를 나타낸다. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H5N1 A/Hong Kong/156/97로 시험 감염시키고, 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한, b, c 및 d에 나타나 있다.
도 17. 항원으로서 다수의 그룹 1(H1, H5 및 H9) 및 그룹 II(H3 및 H7) 인플루엔자 균주로부터의 전장 HA의 것을 사용하여, 실시예 7에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로 3회 면역화시킨 마우스로부터의 혈청에 대한 ELISA 결과.
도 18. (a) 음성(PBS, 3주 간격으로 3회의 면역화) 및 양성(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전) 대조군에 대한 생존. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로 시험 감염시켰다. 10 ㎍의 매트릭스-M의 존재하에 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long로 3회 면역화시킨 그룹에 대한 (b) 생존, (c) 상대 체중 변화 및 (d) 임상 점수 중간값. 오차 막대는 95% 신뢰 구간(c) 또는 사분범위(d)를 나타낸다. 마우스를 마지막 면역화 4주 후에 치명적인 용량(12.5xLD50)의 H1N1 A/Brisbane/59/200으로 시험 감염시키고, 21일 동안 모니터링하였다. 비교를 위하여, 음성 대조군(PBS)도 또한, b, c 및 d에 나타나 있다.
도 19. 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long 또는 PBS로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 사용한 유사입자(pseudoparticle) 중화 검정. 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 동물로부터의 혈청에 대하여 높은 혈청 농도에서 중화가 관찰된다.
도 20. 항체 의존성 세포독성(ADCC) 대용물 검정. 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로 면역화시킨 마우스로부터의 혈청은 항원의 공급원으로서 H5N1 A/Hong Kong/156/97(a) 또는 H1N1 A/Brisbane/59/07(b)로부터의 FL HA로 트랜스펙션시킨 표적 세포를 사용하여 가장 높은 혈청 농도에서 FcγRIV 신호전달 활성의 30 내지 40배 유도를 나타낸다.
도 21. a: 다량체 형태의 본 발명의 폴리펩티드(그들의 SEQ ID NO로 표시)를 검출하기 위한 CR9114 샌드위치 ELISA. 배양 배지를 3배 단계로 희석하고 분석하였다. b: ELISA에 의한 본 발명의 폴리펩티드로 결합하는 CR9114(그들의 SEQ ID NO로 표시). 배양 배지를 3배 단계로 희석하고 분석하였다. c: ELISA에 의한 본 발명의 폴리펩티드(그들의 SEQ ID NO로 표시)로 결합하는 CR6261. 배양 배지를 3배 단계로 희석하고 분석하였다. d: ELISA에 의한 본 발명의 폴리펩티드(그들의 SEQ ID NO로 표시)로 결합하는 CR8020. 배양 배지를 3배 단계로 희석하고 분석하였다. 정제된 단백질(SEQ ID NO: 186 및 삼량체 및 단량체 형태의 전장 HA)을 위하여, 5 ㎍/㎖의 출발 농도를 사용하였다. 모든 폴리펩티드는 C-말단 인자 X 절단 가능한 his 태그 서열을 함유한다.
도 22. 본 발명의 폴리펩티드(그들의 SEQ ID NO로 표시)를 발현하는 배양물의 상청액의 웨스턴 블롯. 환원 조건하에서, 단량체 사이 이황화 가교는 환원되고, 본 발명의 폴리펩티드는 겔에서 단량체이다(죄측 패널). 산화 조건하에서, 단량체 사이 이황화 가교는 무손상 유지되며, 본 발명의 폴리펩티드는 겔에서 삼량체로 보인다. SEQ ID NO: 186에 있어서, 정제된 삼량체를 이러한 실험에 사용하였다.
도 23. 실시예 16에 기재된 바와 같은 NHP의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG ELISA 역가(항원 전장 HA). 패널 a 내지 f에서 HA의 것은 그룹 1 인플루엔자 균주(패널에서 확인)로부터 유래하며, 패널 g 내지 j에서 HA의 것은 그룹 2 인플루엔자 균주로부터 유래한다. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 24. 실시예 16에 기재된 바와 같은 NHP의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. 3가지 상이한 균주로부터의 FL HA를 패널 a 내지 c에 확인된 바와 같이 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이며, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 25. 실시예 16에 기재된 바와 같은 NHP의 면역화 후에 수득되는 혈청에서의 ADCC 생물검정 이펙터 세포를 사용하여 결정되는 대용 ADCC 활성. 3가지 상이한 균주로부터의 FL HA를 발현하는 DNA로 트랜스펙션시킨 세포를 사용하였다(패널 a 내지 c에서 확인). 데이터는 유도 배수로서 표현되며, 이는 혈청의 부재하의 백그라운드 신호에 비한 각 측정의 신호이다. 선은 개별 동물을 나타내며, 기호는 중복물의 평균/혈청 농도를 말한다.
도 26. 실시예 16에 기재된 바와 같은 NHP의 면역화 후에 수득되는 혈청을 사용한 미세중화 검정. 판독은 단계 희석된 혈청의 존재하에 웰마다 100 TCID50 H5N1 A/HK/156/97과의 인큐베이션 16시간 후에, 고정된 세포에서의 NP의 ELISA 기반의 정량화였다. 선은 개별 동물을 나타내며, 기호는 중복물의 평균/혈청 농도를 말한다.
도 27. 실시예 16에 기재된 실험에 포함되는 비인간 영장류의 온도 증가 곡선 아래 영역. 동물마다, 면역화의 시작 이전에 21일 창을 사용하여, 참조 24시간 체온 사이클을 재구성하였다. 95% CI의 상한의 부가와 함께 시험감염 후 추적 기간 동안 측정되는 체온으로부터 참조 체온을 제함으로써 시험감염 후 21일 추적 기간 동안의 체온의 순수 증가를 계산하였다. 이후에, 순수 온도 증가의 AUC를 0 내지 3일, 0 내지 8일 및 0 내지 21일의 간격으로 계산하였다. 처리 사이의 통계적 분석을 다중의 비교를 위한 터키(Tukey)-크라머(Kramer) 조정과 함께 쌍별 t-검정을 사용하여 수행하였다. 막대는 중간값을 나타낸다. 데이터 로거 실패로 인하여 동물 J10014(SEQ ID NO: 186 + 매트릭스-M 그룹) 데이터가 부재한다. 동물 Ji0403061(인플렉살(Inflexal) 그룹)은 제8일의 마지막에 사망하였으며, 0 내지 21일 간격 계산으로부터 배제하였다.
도 28. 실시예 17에 기재된 바와 같은 혈청 전달 및 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 29. 제70일의 공여자 마우스(D) 및 혈청 전달 이전(제-4일) 또는 시험감염일(제0일)의 수여자 마우스(R)의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다.
도 30. 실시예 18에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/Brisbane/59/2007로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 31. a: 실시예 18에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. b: 실시예 10에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 32. 실시예 19에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/Netherlands/602/09 로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 33. a: 실시예 19에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. b: 실시예 19에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 34. 실시예 20에 기재된 바와 같은 면역화 및 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 35. a: 실시예 20에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. b: 실시예 20에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 36. 실시예 21에 기재된 바와 같은 면역화 및 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로의 시험감염 후의 마우스의 생존(a) 및 체중 변화%(b).
도 37. a: 실시예 21에 기재된 바와 같이 면역화시킨 마우스의 전장 HA(H1N1 A/Brisbane/59/2007) ELISA 역가. 데이터를 기울기 기반의 가중 평균 접근법을 사용하여 분석하였다. 백색 기호는 LOD에서의 측정을 나타낸다. 막대는 중간값을 나타낸다. b: 실시예 21에 기재된 바와 같은 마우스의 면역화 후에 수득되는 혈청 IgG CR9114 경쟁 결합. H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 FL HA를 항원으로 사용하였다. 나타낸 데이터는 그룹 중간값이고, 오차 막대는 사분범위를 나타낸다.
도 38: 본 발명의 폴리펩티드로의 일시적인 트랜스펙션 후의 Hek293F 세포 배양물 상청액의 웨스턴 블롯(폴리클로널 항 H1).
정의
본 발명에 사용되는 바와 같은 용어의 정의가 하기에 제공된다.
본 발명에 따른 아미노산은 20개의 자연 발생(또는 '표준' 아미노산) 또는 이의 변이체, 예를 들어, D-프롤린(프롤린의 D-거울상이성질체), 또는 자연적으로 단백질에서 관찰되지 않는 임의의 변이체, 예를 들어, 노르류신 중 임의의 것일 수 있다. 표준 아미노산은 이들의 특성에 기초하여 몇몇 그룹으로 분류될 수 있다. 중요한 요인은 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 작용기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 몇몇 아미노산, 예를 들어, 다른 시스테인 잔기에 대하여 공유적 이황화 결합(또는 이황화 가교)을 형성할 수 있는 시스테인, 폴리펩티드 백본에 대하여 환을 형성하는 프롤린 및 다른 아미노산보다 유연성이 더 큰 글리신은 특별한 특성을 갖는다. 표 1은 표준 아미노산의 약어 및 특성을 보여준다.
용어 "아미노산 서열 동일성"은 통상 백분율로 표현되는 정렬된 아미노산 서열의 쌍 간의 동일성 또는 유사성 정도를 말한다. 동일성 백분율은 서열 상동성 최대 백분율을 달성하기 위하여 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 도입한 후에 펩티드에서의 상응하는 아미노산 잔기에 대하여 동일한(즉, 정렬 내의 주어진 위치에서의 아미노산 잔기가 동일한 잔기임) 또는 유사한(즉, 정렬 내의 주어진 위치에서의 아미노산 치환이 하기에 논의되는 바와 같은 보존적 치환임) 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율이다. 서열 동일성 및 유사성의 백분율을 포함하는 서열 상동성은 육안 검사 및 수학적 계산에 의해서와 같이 당업계에 널리 공지되어 있는 서열 정렬 기술을 사용하여 결정되거나, 또는 더욱 바람직하게는 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 행해진다. 예시적인 바람직한 컴퓨터 프로그램에는 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)(GCG; 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 위스콘신(Wisconsin) 패키지 버전 10.0 프로그램, 'GAP'(문헌[Devereux et al. (1984)])이 있다.
"보존적 치환"은 한 부류의 아미노산이 동일한 부류의 다른 아미노산으로 대체되는 것을 말한다. 특정 구현예에서, 보존적 치환은 폴리펩티드의 구조 또는 기능 또는 둘 모두를 변경시키지 않는다. 보존적 치환의 목적을 위한 아미노산의 부류는 소수성(예를 들어, Met, Ala, Val, Leu), 중성 친수성(예를 들어, Cys, Ser, Thr), 산성(예를 들어, Asp, Glu), 염기성(예를 들어, Asn, Gln, His, Lys, Arg), 형태 파괴물질(disrupter)(예를 들어, Gly, Pro) 및 방향족(예를 들어, Trp, Tyr, Phe)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "질병" 및 "장애"는 대상에서의 질환(condition)을 지칭하기 위하여 상호교환 가능하게 사용된다. 일부 구현예에서, 질환은 바이러스 감염, 특히 인플루엔자 바이러스 감염이다. 특정 구현예에서, 용어 "질병"은 세포 또는 대상에서의 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습에 의해 야기되는 병태(pathological state)를 말한다. 특정 구현예에서, 질환은 대상 내의 질병이며, 이의 중증도는 면역원성 조성물의 투여를 통하여 대상에서 면역 반응을 유도함으로써 감소된다.
대상으로의 치료제의 투여와 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "유효량"은 예방 및/또는 치료 효과(들)를 갖는 치료제의 양을 지칭한다. 특정 구현예에서, 대상으로의 치료제의 투여와 관련하여, "유효량"은 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상(symptom)의 중증도의 감소 또는 개선, 예를 들어, 비제한적으로, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 기간의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 진행의 예방, 인플루엔자 바이러스 감염, 이와 관련된 질병 또는 증상의 발생 또는 발병 또는 재발의 예방, 한 대상으로부터 다른 대상으로의 인플루엔자 바이러스의 확산의 예방 또는 감소, 대상의 입원 및/또는 입원 기간의 감소, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병을 지닌 대상의 생존의 증가, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 이와 관련된 질병의 제거, 인플루엔자 바이러스 복제의 억제 또는 감소, 인플루엔자 바이러스 역가의 감소; 및/또는 다른 치료제의 예방 또는 치료 효과(들)의 향상 및/또는 개선을 달성하기에 충분한 치료제의 양을 말한다. 특정 구현예에서, 유효량은 인플루엔자 바이러스 질병으로부터의 완전한 보호를 야기하지 않으나, 미처리 대상에 비하여 더 낮은 역가 또는 감소된 개수의 인플루엔자 바이러스로 이어진다. 인플루엔자 바이러스의 역가, 개수 또는 전체 부하(burden)의 감소의 이익에는 중증도가 더 낮은 감염의 증상, 더 적은 감염의 증상 및 감염과 관련된 질병의 기간의 감소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 용어 "숙주"는 벡터, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터가 도입되는 유기체 또는 세포를 말하는 것으로 의도된다. 유기체 또는 세포는 원핵 또는 진핵일 수 있다. 바람직하게는, 숙주는 분리된 숙주 세포, 예를 들어, 배양 중인 숙주 세포를 포함한다. 용어 "숙주 세포"는 단지 세포가 본 발명의 폴리펩티드의 (과)발현을 위해 변형된 것을 의미한다. 용어 숙주가 특정 대상 유기체 또는 세포뿐 아니라 이러한 유기체 또는 세포의 자손도 지칭하고자 하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향 중 어느 하나 때문에 이후의 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 유기체 또는 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본 명세서에 사용되는 용어 "숙주"의 범주 내에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함되는" 또는 "포함하는"은 용어 "비제한적으로"가 뒤따르는 것으로 간주된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "감염"은 세포 또는 대상 내의 바이러스의 배가(multiplication) 및/또는 존재에 의한 침습을 의미한다. 일 구현예에서, 감염은 "활성" 감염, 즉, 바이러스가 세포 또는 대상에서 복제하고 있는 것이다. 이러한 감염은 바이러스에 의해 처음 감염된 세포, 조직 및/또는 기관으로부터 다른 세포, 조직 및/또는 기관으로의 바이러스의 확산을 특징으로 한다. 감염은 또한 잠복 감염, 즉, 바이러스가 복제하고 있지 않은 것일 수도 있다. 특정 구현예에서, 감염은 세포 또는 대상에서의 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습에 의해 야기되는 병태를 말한다.
인플루엔자 바이러스는 속 A, B 및 C의 인플루엔자 바이러스 타입으로 분류된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 서브타입"은 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미다제(N) 바이러스 표면 단백질의 조합을 특징으로 하는 인플루엔자 A 바이러스 변이체를 말한다. 본 발명에 따르면, 인플루엔자 바이러스 서브타입은 이들의 H 번호에 의해, 예를 들어, "H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스", "H3 서브타입의 인플루엔자 바이러스" 또는 "H3 인플루엔자"에 의해, 또는 H 번호 및 N 번호의 조합, 예를 들어, "인플루엔자 바이러스 서브타입 H3N2" 또는 "H3N2"에 의해 지칭될 수 있다. 용어 "서브타입"은 구체적으로 보통 돌연변이로부터 야기되는 각각의 서브타입 내의 모든 개별 "균주"를 포함하며, 천연 분리주 및 인공 돌연변이체 또는 재배열체 등을 포함하여, 상이한 병리학적 프로파일을 보인다. 이러한 균주는 또한 바이러스 서브타입의 다양한 "분리주"로 지칭될 수도 있다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 용어 "균주" 및 "분리주"는 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 균주 또는 분리주에 대한 현행의 명명법은 예를 들어, A/Moscow/10/00(H3N2)과 같이, 보통 괄호 안에 제공되는 HA 및 NA의 항원 설명과 함께, 바이러스의 타입(속), 즉, A, B 또는 C, 처음 분리한 지리학적 위치, 균주 번호 및 분리한 해를 포함한다. 비-인간 균주는 또한 명명에 있어 기원하는 숙주를 포함한다. 인플루엔자 A 바이러스 서브타입은 이들의 계통발생 그룹을 참조하여 더 분류될 수 있다. 계통발생 분석은 2가지 주요 그룹으로의 헤마글루티닌의 세분을 보여준다: 특히, 계통발생 그룹 1("그룹 1" 인플루엔자 바이러스)에서의 H1, H2, H5 및 H9 서브타입 및 특히, 계통발생 그룹 2("그룹 2" 인플루엔자 바이러스)에서의 H3, H4, H7 및 H10 서브타입.
본 명세서에 사용되는 용어 "인플루엔자 바이러스 질병"은 세포 또는 대상에서의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 존재로부터 야기되거나, 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 세포 또는 대상의 침습으로부터 야기되는 병태를 지칭한다. 특정 구현예에서, 상기 용어는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 호흡기 병을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "핵산"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 또는 RNA 분자(예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 인식될 것과 같이 비천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 표지, 메틸화, 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드 사이 변형, 예를 들어, 비하전 연결기(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등), 하전된 연결기(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜덴트 부분(예를 들어, 폴리펩티드), 인터칼레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터(chelator), 알킬레이터(alkylator) 및 변형된 연결기(예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 포함한다. 핵산 서열에 대한 언급은 달리 특정되지 않는 한 이의 상보체를 포함한다. 따라서, 특정 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 언급은 이의 상보 서열을 지니는 이의 상보 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상보 가닥은 또한 예를 들어, 안티-센스 치료법, 혼성화 프로브 및 PCR 프라이머에 유용하다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, HA에서의 아미노산의 넘버링은 야생형 인플루엔자 바이러스의 HA0에서의 아미노산의 넘버링, 예를 들어, H1N1 인플루엔자 균주 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 아미노산의 넘버링에 기초한다. 이에 따라, 본 명세서에 사용되는 용어 "HA에서의 위치 "x"의 아미노산"은 특정 야생형 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1; 여기서, HA2 도메인의 아미노산은 이탤릭체로 나타나 있음)의 HA0에서의 위치 x의 아미노산에 상응하는 아미노산을 의미한다. 다른 인플루엔자 바이러스 균주 및/또는 서브타입에서의 동등한 아미노산이 다수의 서열 정렬에 의해 결정될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 출원에 사용된 넘버링 시스템에서, 1이 비성숙 HA0 단백질(SEQ ID NO: 1)의 N-말단 아미노산을 지칭하는 것을 주목한다. 성숙 서열은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 위치 18에서 시작한다. 생성 동안 단백질의 수송을 지시하는 리더 서열(또는 신호 서열)(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17에 상응)이 일반적으로 예를 들어, 백신에 사용되는 최종 폴리펩티드에 존재하지 않는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 리더 서열이 없는 아미노산 서열을 포함하며, 즉, 아미노산 서열은 신호 서열이 없는 HA0의 아미노산 서열에 기초한다.
"폴리펩티드"는 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 아미드 결합에 의해 연결된 아미노산의 폴리머를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 용어는 공유 아미드 결합에 의해 연결된 단일 폴리펩티드 사슬을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 또한 비공유 상호작용, 예를 들어, 이온 접촉, 수소 결합, 반데르발스 접촉 및 소수성 접촉에 의해 회합된 다수의 폴리펩티드 사슬을 지칭할 수 있다. 당업자는 상기 용어가 예를 들어, 번역 후 가공, 예를 들어, 신호 펩티드 절단, 이황화 결합 형성, 글리코실화(예를 들어, N-연결 및 O-연결 글리코실화), 프로테아제 절단 및 지질 변형(예를 들어, S-팔미토일화(palmitoylation))에 의해 변형되는 폴리펩티드를 포함하는 것을 인식할 것이다.
"스템 도메인 폴리펩티드"는 자연 발생(또는 야생형) 헤마글루티닌(HA)의 스템 도메인을 구성하는 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 전형적으로, 스템 도메인 폴리펩티드는 단일의 폴리펩티드 사슬(즉, 헤마글루티닌 HA0 폴리펩티드의 스템 도메인에 상응) 또는 2개의 폴리펩티드 사슬(즉, 헤마글루티닌 HA2 폴리펩티드와 회합된 헤마글루티닌 HA1 폴리펩티드의 스템 도메인에 상응)이다. 본 발명에 따르면, 스템 도메인 폴리펩티드는 야생형 HA 분자와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하며, 특히 야생형 HA의 하나 이상의 아미노산 잔기는 특정 야생형 HA에서의 상응하는 위치에서 자연 발생하지 않는 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명에 따른 스템 도메인 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 연결 서열을 더 포함할 수 있다.
용어 "벡터"는 제2 핵산 분자가 이것이 복제되고 일부 경우에 발현될 숙주로의 도입을 위해 삽입될 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 다시 말하면, 벡터는 이것이 연결된 핵산 분자를 수송할 수 있다. 클로닝 및 발현 벡터는 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"에 의해 고려된다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC) 및 효모 인공 염색체(YAC) 및 박테리오파지 또는 식물 또는 동물(인간 포함) 바이러스로부터 유래한 벡터를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 벡터는 제안된 숙주에 의해 인식되는 복제 원점, 및 발현 벡터의 경우에는 숙주에 의해 인식되는 프로모터 및 다른 조절 영역을 포함한다. 특정 벡터는 이들이 도입되는 숙주에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 벡터는 박테리아에서 복제할 수 있음). 다른 벡터는 숙주로의 도입시에 숙주의 게놈에 통합되고, 이에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다.
바이러스에 관련하여 본 명세서에 사용되는 용어 "야생형"은 우성이며, 자연적으로 유행하고, 전형적인 질병의 출현을 유발하는 인플루엔자 바이러스를 지칭한다.
상세한 설명
인플루엔자 바이러스는 세계 공중 보건에 상당한 영향을 가져, 매년 수백만의 중증의 병의 사례, 수천의 사망 및 상당한 경제적 손실을 야기한다. 현행의 3가 인플루엔자 백신은 백신 균주 및 밀접하게 관련된 분리주에 대하여 강력한 중화 항체 반응을 유도하나, 서브타입 내의 더욱 분기된 균주 또는 다른 서브타입으로 드물게 확대된다. 또한, 적절한 백신 균주의 선택은 많은 시험감염을 제시하며, 준최적의 보호를 빈번하게 야기한다. 추가로, 다음의 유행성 바이러스가 발생할 시기와 장소를 비롯하여 이의 서브타입을 예측하는 것은 현재 불가능하다.
헤마글루티닌(HA)은 중화 항체의 주요 표적인 인플루엔자 A 바이러스 유래의 주요 외피 당단백질이다. 헤마글루티닌은 유입 과정 동안 2가지 주요 기능을 갖는다. 먼저, 헤마글루티닌은 시알산 수용체와의 상호작용을 통하여 표적 세포의 표면으로의 바이러스의 부착을 매개한다. 두 번째로, 바이러스의 세포내 이입 후에, 헤마글루티닌은 이후에 바이러스 및 엔도솜 막의 융합을 촉발시켜, 이의 게놈을 표적 세포의 세포질로 방출시킨다. HA는 숙주 유래의 효소에 의해 절단되어, 이황화 결합에 의해 연결 유지되는 2개의 폴리펩티드를 생성하는 약 500개 아미노산의 큰 엑토도메인을 포함한다. 대다수의 N-말단 단편(HA1, 320 내지 330개 아미노산)은 바이러스-중화 항체에 의해 인식되는 대부분의 결정인자(determinant) 및 수용체 결합 부위를 함유하는 막-원위 구형 도메인을 형성한다. 보다 작은 C-말단 부분(HA2, 약 180개 아미노산)은 구형 도메인을 세포 또는 바이러스 막에 고정시키는 스템-유사 구조를 형성한다. 서브타입 간의 서열 상동성 정도는 HA2 폴리펩티드(51% 내지 80% 상동성)에서보다 HA1 폴리펩티드(서브타입들 간에 34% 내지 59% 상동성)에서 더 작다. 가장 보존된 영역은 절단 부위 근처의 서열, 특히 HA2 N-말단 23개 아미노산이며, 이는 모든 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 간에 보존된다(문헌[Lorieau et al., 2010]). 이러한 영역의 부분은 HA 전구체 분자(HA0)에서 표면 루프로서 노출되나, HA0가 HA1 및 HA2로 절단되는 경우 접근불가능하게 된다.
대부분의 중화 항체는 수용체 결합 부위를 둘러싸는 루프에 결합하며, 수용체 결합 및 부착을 방해한다. 이들 루프가 매우 가변적이기 때문에, 이들 영역을 표적화하는 대부분의 항체는 균주에 특이적이어서, 이는 현행의 백신이 이러한 제한된 균주 특이적 면역성을 유도하는 이유를 설명한다. 그러나 최근에, 광범위한 교차 중화능을 지닌 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 대한 완전 인간 모노클로널 항체가 생성되었다. 기능적 및 구조적 분석에 의해, 이들 항체가 막 융합 과정을 방해하고, 인플루엔자 HA 단백질의 스템 도메인 내의 고도로 보존된 에피토프에 대해 유도되는 것이 드러났다(문헌[Throsby et al., 2008]; 문헌[Ekiert et al. 2009], WO 2008/028946호, WO2010/130636호, WO 2013/007770호).
이들 항체의 에피토프를 안정적으로 제시하는 스템 도메인 폴리펩티드는 동시 계류 중인 특허 출원 PCT/EP2012/073706호에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 스템 도메인 폴리펩티드의 적어도 일부는 CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시하며, 마우스에서 면역원성이다. CR6261 및/또는 CR9114의 에피토프를 안정적으로 제시하는 추가의 면역원성 스템 도메인 폴리펩티드는 동시 계류 중인 특허 출원 PCT/EP2014/060997호에 기재되어 있다.
본 발명에 따르면, 이들 에피토프를 제시하는 신규한 다량체 HA 스템 도메인 폴리펩티드가 설계된다. 이들 폴리펩티드를 사용하여, 광범위한 인플루엔자 균주에 대한 보호를 유도하는 보편적 에피토프 기반의 백신을 생성할 수 있다. 이전에 기재된 스템 도메인 폴리펩티드에서와 같이, 매우 가변적인 면역 우성 부분, 즉, 헤드 도메인을 먼저 전장 HA 분자로부터 제거하여, 미니-HA로도 지칭되는 스템 도메인 폴리펩티드를 생성하여, 광범위 중화 항체에 대한 에피토프가 위치한 스템 도메인을 향해 면역 반응을 재유도시킨다. 상기 언급된 광범위 중화 항체를 사용하여, 중화 에피토프의 존재를 확인하였다.
특정 구현예에서, 본 발명의 신규한 HA 스템 폴리펩티드는 중화 항체 CR6261 및/또는 CR9114 및/또는 CR8020의 에피토프를 노출시키면서 용액 중에 안정한 삼량체를 형성한다. 개별 단량체 간의 추가의 상호작용은 단백질 및 에피토프를 더욱 안정화시켜, 폴리펩티드가 백신에 사용되는 경우 이들 에피토프의 더 나은 제시를 야기한다.
본 발명의 스템 도메인 폴리펩티드는 막 원위 헤드 도메인에 존재하는 우성 에피토프의 부재 하에, 막 근위 스템 도메인 HA 분자의 보존된 에피토프를 면역계에 제시할 수 있다. 이를 위해, 헤드 도메인을 구성하는 HA0 단백질의 일차 서열의 부분을 제거하고, 직접적으로 또는 일부 구현예에서는 짧은 유연성 연결 서열('링커')을 도입하여 재연결시켜, 폴리펩티드 사슬의 연속성을 복구시킨다. 생성된 폴리펩티드 서열은 HA0 분자의 나머지 부분의 고유 3차원 구조를 안정화시키는 특정 돌연변이를 도입함으로써 더 변형된다.
본 발명은 신규한 다량체 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드를 제공하며, 상기 다량체 폴리펩티드는 적어도 제1 및 제2 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 단량체를 포함하며, 상기 제1 및 제2 단량체는 각각 (a) 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결된 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함하며, 상기 HA1 C-말단 세그먼트는 (b) 인플루엔자 헤마글루티닌 HA2 도메인에 연결되고, 상기 HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 x, 바람직하게는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하고, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 y 내지 C-말단 아미노산을 포함하고,
(c) 폴리펩티드는 HA1과 HA2 도메인 사이의 접합부에 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고;
(d) 제1 단량체는 제1 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 제2 단량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교에 의해 상기 제2 단량체에 연결된다.
이에 따라, 본 발명에 따르면, 이황화 가교는 다량체의 개별 단량체 간에 공유적 교차 결합을 형성한다.
특정 구현예에서, 다량체 폴리펩티드는 삼량체이며, 다시 말하면, 3개의 인플루엔자 스템 도메인 단량체를 포함한다. 본 발명에 따르면, 각각의 단량체는 하나의 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 다른 다량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교에 의해 다른 단량체에 연결된다.
본 발명에 따르면, 적어도 2개의 상이한 단량체의 아미노산 위치 411 및 419(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 내의 동등한 잔기) 사이의 신규한 이황화 가교의 도입이 이량체 또는 바람직하게는 삼량체 폴리펩티드를 초래하는 것이 놀랍게도 관찰되었다. 다른 공개된 삼량체 HA-스템 구조와 대조적으로, 이러한 단량체 사이 이황화 결합된 삼량체는 잘 발현하고, 자발적으로 폴딩한다. 따라서, 기재된 바와 같이(문헌[Lu et al 2013]) 그의 3차원 구조에 도달하기 위한 재폴딩 절차가 필요하지 않다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 계통발생 그룹 1로부터 유래한 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래한다. 본 발명의 폴리펩티드는 전장 HA1을 포함하지 않는다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 계통발생 그룹 2로부터 유래한 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, HA1 및 HA2 도메인은 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 서브타입으로부터 유래된다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 단량체는 실질적으로 HA0보다 더 작으며, 바람직하게는 HA의 구형 헤드의 전부 또는 실질적으로 전부가 결여된다. 바람직하게는, 면역원성 폴리펩티드는 360개 이하, 바람직하게는 350, 340, 330, 320, 310, 305, 300, 295, 290, 285, 280, 275 또는 270개 이하의 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 면역원성 폴리펩티드는 약 250 내지 약 350, 바람직하게는 약 260 내지 약 340, 바람직하게는 약 270 내지 약 330개 아미노산 길이이다.
본 발명에 따르면, "HA1 N-말단 세그먼트"는 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 분자의 HA1 도메인의 아미노-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드 세그먼트를 지칭한다. 특정 구현예에서, HA1 N-말단 폴리펩티드 세그먼트는 HA1 도메인의 위치 1로부터 위치 x까지의 아미노산을 포함하며, 여기서, 위치 x에서의 아미노산은 HA1 내의 아미노산 잔기이다. 용어 "HA1 C-말단 세그먼트"는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인의 카르복시-말단 부분에 상응하는 폴리펩티드 세그먼트를 지칭한다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 폴리펩티드 세그먼트는 HA1 도메인의 위치 y로부터 C-말단 아미노산까지(C-말단 아미노산 포함)의 아미노산을 포함하며, 위치 y에서의 아미노산은 HA1 내의 아미노산 잔기이다. 본 발명에 따르면, y는 x보다 더 커서, HA1 N-말단 세그먼트와 HA1 C-말단 세그먼트 사이, 즉, HA1의 위치 x에서의 아미노산과 위치 y에서의 아미노산 사이의 HA1 도메인의 세그먼트는 결실되고, 일부 구현예에서는 연결 서열에 의해 대체된다.
특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 x를 포함하며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 y 내지 말단을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 세그먼트 내의 결실은 위치 x+1에서의 아미노산으로부터 위치 y-1에서의 아미노산까지(위치 y-1에서의 아미노산 포함)의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 신호 서열을 포함하지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 p 내지 x를 포함하며, 여기서, p는 성숙 HA 분자의 첫 번째 아미노산이다(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 경우에 p=18). 숙련자는 신호 펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17) 없이, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 제조할 수 있을 것이다.
다시, 본 명세서에 사용되는 아미노산 위치의 넘버링이 SEQ ID NO: 1을 언급하는 것이 주목된다. 당업자는 다른 헤마글루티닌 서열 내의 동등한 위치를 결정할 수 있을 것이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 완전한 HA2 도메인을 포함하여, 이에 따라, 막횡단 및 세포내 서열을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 포함하지 않는다. 따라서, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 절단된 HA2 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 세포내 및 막횡단 서열, 예를 들어, HA2 도메인의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530(또는 그의 동등한 위치)으로부터 HA2 도메인의 C-말단까지의 아미노산 서열을 제거하여, 세포에서의 발현 후에 가용성 폴리펩티드를 생성하였다.
본 발명에 따르면, 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 HA1과 HA2 도메인 사이의 접합부에서 프로테아제 절단에 저항성이 있으며, 다시 말하면, HA1과 HA2 사이의 이러한 접합부에서 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. HA1과 HA2에 걸쳐있는(spanning) Arg(R)-Gly(G) 서열이 트립신 및 트립신-유사 프로테아제에 대한 인식 부위이며, 전형적으로 헤마글루티닌 활성화를 위해 절단되는 것이 당업자에 알려져 있다. 본 명세서에 기재된 HA 스템 도메인 폴리펩티드가 활성화되지 않아야 하기 때문에, 본 발명의 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 프로테아제 절단에 대하여 저항성이 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 프로테아제 절단 부위가 제거되거나, HA1과 HA2에 걸쳐있는 프로테아제 부위는 프로테아제 절단에 저항성인 서열로 돌연변이된다. 본 발명에 따르면, HA1과 HA2 사이의 절단 부위의 제거는 P1 위치에서의 R(소수의 경우에는 K)에서 Q로의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서의 위치 343)의 명명의 설명에 대해서는 문헌[Sun et al, 2010]을 참조한다). 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이외의 임의의 아미노산이다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 아미노산은 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)이다. 특정 구현예에서, HA1 C-말단 스템 세그먼트의 C-말단 아미노산 잔기는 글루타민(Q)이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 H1 서브타입의 인플루엔자 바이러스의 HA에 기반한다. "기반한"은 HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인의 N-말단 세그먼트 및/또는 C-말단 세그먼트가 당업자에게 알려져 있거나, 이후에 발견되는 H1 서브타입의 임의의 자연 발생 인플루엔자 헤마글루티닌의 HA1 및/또는 HA2 도메인의 상응하는 N-말단 및/또는 C-말단 세그먼트와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 하기 기재된 바와 같이 H1 HA, 즉, H1 서브타입의 인플루엔자 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스 A/Brisbane/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO:1)로부터의 아미노산 서열을 포함하는 HA를 기반으로 한다. 또한, H1 서브타입의 HA를 포함하는 다른 인플루엔자 A 바이러스도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 표 2로부터 선택되는 인플루엔자 A H1 바이러스의 HA에 기반한 헤마글루티닌 스템 도메인을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 H1 HA1 도메인의 위치 1로부터 위치 x까지의 아미노산을 포함하는 HA1 N-말단 폴리펩티드 세그먼트를 포함하며, 여기서, x는 위치 46에서의 아미노산과 위치 60에서의 아미노산 사이의 임의의 아미노산, 예를 들어, 위치 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 또는 59에서의 아미노산이고, 바람직하게는 x는 52, 53, 55 또는 59이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 신호 서열 없이, HA1 N-말단 세그먼트, 즉, 위치 18(예를 들어, H1 HA에 있어서, 예를 들어, SEQ ID NO: 1) 또는 다른 인플루엔자 바이러스 균주에서의 동등한 위치(예를 들어, 표 2 참조)로부터 HA1 도메인 위치 x까지의 아미노산을 포함하는 HA1 N-말단 세그먼트를 포함한다. 이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1 도메인의 위치 p(SEQ ID NO: 1에서 H1 HA에 있어서 p=18 또는 다른 H1 HA에서의 동등한 위치)로부터 위치 x까지의 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, HA1 C-말단 폴리펩티드 세그먼트는 H1 HA1 도메인의 위치 y로부터 C-말단 아미노산까지(C-말단 아미노산 포함)의 아미노산을 포함하며, y는 H1 HA1의 위치 290에서의 아미노산과 위치 325에서의 아미노산 사이의 임의의 아미노산이며, 바람직하게는 y는 291, 303, 318 또는 321이다.
특정 구현예에서, x는 SEQ ID NO: 1의 위치 52(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, p는 SEQ ID NO: 1의 위치 18(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이고, y는 SEQ ID NO: 1의 위치 321(또는 다른 헤마글루티닌 내의 동등한 위치)에서의 아미노산이다. 이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 1 내지 52를 포함하며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 321 내지 말단(즉, HA1의 C-말단 아미노산)을 포함한다. 따라서, 특정 구현예에서, HA1 세그먼트 내의 결실은 위치 53에서의 아미노산으로부터 위치 320에서의 아미노산까지(위치 320에서의 아미노산 포함)의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 신호 서열을 포함하지 않는다. 이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1의 아미노산 18 내지 52를 포함하며, 여기서, p는 성숙 HA 분자의 제1 아미노산(예를 들어, SEQ ID NO: 1의 경우에 p=18)이다.
이에 따라, 특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 1 내지 52, 바람직하게는 HA1의 아미노산 잔기 18 내지 52를 포함하고, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 321 내지 343을 포함한다. 특정 구현예에서, HA1 N-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 1 내지 52, 바람직하게는 HA1의 아미노산 잔기 18 내지 52로 이루어지며, HA1 C-말단 스템 세그먼트는 HA1의 아미노산 잔기 321 내지 343으로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 스템 폴리펩티드는 상응하는 야생형 인플루엔자 바이러스 HA1 및/또는 HA2 도메인, 즉, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열에 비하여, 개별 단량체의 HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인 내에 하나 이상의 돌연변이, 즉, 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, HA2 도메인은 헬릭스 A의 C-말단 잔기를 헬릭스 CD의 N-말단 잔기에 연결하는 HA2 아미노산 서열 내에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(도 1). 헬릭스 A의 C-말단 잔기와 헬릭스 CD의 N-말단 잔기를 연결하는 H1 HA2 아미노산 서열은 아미노산 서열 MNTQFTAVGKEFN(H/K)LE(K/R)(SEQ ID NO: 7)을 포함하는 인플루엔자 HA의 잔기 402 내지 418(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 헬릭스 A의 C-말단 잔기를 헬릭스 CD의 N-말단 잔기에 연결하는 아미노산 서열, 즉, 혈청형 H1의 인플루엔자 HA의 아미노산 잔기 402 내지 418(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)을 포함하는 영역은 아미노산 서열 X1NTQX2TAX3GKEX4N(H/K)X5E(K/R)(SEQ ID NO: 8)을 포함한다.
특정 구현예에서, 위치 402, 406, 409, 413 및 416(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 나타냄)에서의 아미노산 중 하나 이상, 즉, 아미노산 X1, X2, X3, X4 및 X5 중 하나 이상은 돌연변이되고, 다시 말하면, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 야생형 인플루엔자 바이러스 내의 그들 위치에 발생하지 않는 아미노산을 포함한다.
특정 구현예에서, 위치 402에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X1은 M, E, K, V, R 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 위치 406에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X2는 F, I, N, T, H, L 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, L 또는 Y이다.
특정 구현예에서, 위치 409에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X3은 V, A, G, I, R, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 A, I 또는 F이다.
특정 구현예에서, 위치 413에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X4는 F, I, N, S, T, Y, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I, Y, M 또는 V이다.
특정 구현예에서, 위치 416에서의 돌연변이된 아미노산, 즉, X5는 L, H, I, N, R로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, 바람직하게는 I이다.
이들 돌연변이 중 하나 이상의 조합도 또한 가능하다.
특정 구현예에서, X1은 M이고, X2는 Y이고, X3은 I이고, X4는 Y이고, X5는 S이다.
본 발명에 따르면, 스템 폴리펩티드는 상응하는 야생형 인플루엔자 바이러스 HA1 및/또는 HA2 도메인, 즉, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 인플루엔자 바이러스의 아미노산 서열과 비교하여, HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인 내에 하나 이상의 추가의 돌연변이, 즉, 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, HA0 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서 잔기 343)에 가까운 하나 이상의 아미노산 잔기가 돌연변이된다. 특정 구현예에서, SEQ ID NO: 1의 위치 337, 340, 352 또는 353, 또는 다른 인플루엔자 바이러스 내의 동등한 위치에서의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되며, 다시 말하면, 스템 폴리펩티드가 기반으로 하는 야생형 인플루엔자 바이러스의 HA의 아미노산 서열 내의 상응하는 위치에서 발생하지 않는 아미노산에 의해 치환된다. 표 6은 자연 발생 아미노산 변이를 보여준다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 352 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 353 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 337 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1의 위치 340 또는 다른 인플루엔자 바이러스의 동등한 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 위치 337(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 I, E, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 340(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 352(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 D, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 위치 353(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 아미노산은 예를 들어, SEQ ID NO: 6에서의 I340N에서와 같이, 컨센서스 N-글리코실화, 예를 들어, N-X-T/S(여기서, X는 P를 제외한 임의의 자연 발생 아미노산임)를 서열에 도입한다.
특정 구현예에서, 돌연변이된 아미노산은 동일한 서브타입의 서열에서 자연적으로 발생하지 않는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 위치 337(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K이다.
특정 구현예에서, 위치 340(HA1 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 K이다.
특정 구현예에서, 위치 352(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 F이다.
특정 구현예에서, 위치 353(HA2 도메인)에서의 돌연변이된 아미노산 잔기는 T이다.
본 명세서에서, 아미노산의 넘버링이 H1 HA0에서의 아미노산의 넘버링, 특히, H1N1 인플루엔자 균주 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 아미노산의 넘버링에 기반하는 것을 다시 주목한다. 숙련자는 다른 인플루엔자 바이러스의 HA에서 동등한 아미노산을 결정할 수 있을 것이며, 이에 따라, 동등한 돌연변이를 결정할 수 있을 것이며, 예를 들어, 상이한 H1 인플루엔자 바이러스의 서열 정렬에 대해서는 표 2를 참조한다.
본 발명에 따르면, 폴리펩티드는 위치 324에서의 아미노산과 위치 436에서의 아미노산 사이에 추가의 이황화 가교를 더 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 적어도 하나의 추가의 이황화 가교는 스템 도메인 폴리펩티드 내에, 바람직하게는 H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)에서 위치 324와 436(또는 이의 동등한 위치)의 아미노산 사이에 도입된다. 이에 따라, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 HA1 도메인에 돌연변이 R324C 및 HA2 도메인에 T436C를 더 포함한다. 클러스털, 머슬 등과 같은 적합한 알고리즘을 사용하여 서열을 정렬시킴으로써 동등한 위치가 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 조작된 이황화 가교는 적어도 하나(다른 것이 이미 시스테인이라면), 그러나 통상 공간적으로 가까운 2개의 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 생성되며, 이 시스테인은 자발적으로 또는 활성 산화에 의해 이들 잔기의 황 원자 간에 공유 결합을 형성할 것이다.
특정 구현예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 H3 서브타입의 인플루엔자 바이러스의 HA에 기반한다. "기반한"은 HA1 도메인 및/또는 HA2 도메인의 N-말단 세그먼트 및/또는 C-말단 세그먼트가 당업자에게 알려져 있거나, 이후에 발견되는 H3 서브타입의 임의의 자연 발생 인플루엔자 헤마글루티닌의 HA1 및/또는 HA2 도메인의 상응하는 N-말단 및/또는 C-말단 세그먼트와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 의미한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 하기에 기재된 바와 같이 H3 HA, 즉, H3N2 바이러스 A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO: 237)의 인플루엔자 바이러스로부터의 아미노산 서열을 포함하는 HA에 기반한다. H3 서브타입의 HA를 포함하는 다른 인플루엔자 A 바이러스도 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
특정 구현예에서, 아미노산 서열 CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 193)를 SEQ ID NO: 1의 위치 419 내지 433(또는 상이한 HA에서의 동등한 위치)에 도입하거나, 아미노산 서열 RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 194)를 SEQ ID NO: 1의 위치 417 내지 433(또는 상이한 HA에서의 동등한 위치)에 도입한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 HA1 및 HA2 도메인이 유래한 HA의 아미노산 서열에 비하여 HA1 및/또는 HA2 도메인에 하나 이상의 추가의 돌연변이를 더 포함한다. 따라서, 스템 폴리펩티드의 안정성은 더욱 증가된다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 CR6261 및/또는 CR9114에 선택적으로 결합한다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 CR8020 및/또는 CR8057에 결합하지 않는다. 일 구현예에서, CR6261은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; CR9114는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, CR8057은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. CR8020은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 CR8020에 선택적으로 결합한다.
본 발명에 따르면, 특정 구현예에서, 이에 따라, CR6261, CR9114 및/또는 CR8020의 특정 에피토프를 모방하며, 예를 들어, 단독으로 또는 다른 예방적 및/또는 치료적 처치와 병용하여 생체내에 투여되는 경우 교차 중화 항체를 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로서 사용될 수 있는 다량체 폴리펩티드가 제공된다. "교차 중화 항체"에서, 항체는 계통발생 그룹 1의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 계통발생 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 적어도 2가지의 상이한 서브타입, 특히, 적어도 CR6261 및 CR9114에 의해 중화되는 모든 바이러스 균주를 중화시킬 수 있음을 의미한다.
상기 기재된 바와 같이, 폴리펩티드는 적어도 2개의 단량체를 포함하며, 여기서, 상기 단량체는 각각 0 내지 50개의 아미노산 잔기의 연결 서열에 의해 HA1 C-말단 스템 세그먼트에 공유적으로 연결되는 HA1 N-말단 스템 세그먼트를 포함하는 인플루엔자 헤마글루티닌 HA1 도메인을 포함한다. 연결 서열은 자연 발생 또는 야생형 HA에서는 발생하지 않는다. 특정 구현예에서, 링커는 하나의 아미노산 잔기, 2개 이하의 아미노산 잔기, 3개 이하의 아미노산 잔기, 4개 이하의 아미노산 잔기, 5개 이하의 아미노산 잔기, 10개 이하의 아미노산 잔기, 15개 이하의 아미노산 잔기 또는 20개 이하의 아미노산 잔기 또는 30개 이하의 아미노산 잔기 또는 40개 이하의 아미노산 잔기 또는 50개 이하의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드이다. 특정 구현예에서, 연결 서열은 G, GS, GGG, GSG, GSA, GSGS, GSAG, GGGG, GSAGS, GSGSG, GSAGSA, GSAGSAG 및 GSGSGSG로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열이다.
특정 구현예에서, HA1 N-말단 세그먼트는 HA1 C-말단 세그먼트에 직접 연결되며, 즉, 폴리펩티드는 연결 서열을 포함하지 않는다.
인플루엔자 HA는 그의 고유 형태가 세포 또는 바이러스 막 상에 삼량체로서 존재한다. 특정 구현예에서, 세포내 및 막횡단 서열을 제거하여, 세포에서의 발현 후에 분비되는(가용성) 폴리펩티드가 생성되게 한다. HA를 발현하고, 그의 분비된 엑토도메인을 정제하기 위한 방법이 기재된다(예를 들어, 문헌[Dopheide et al 2009]; 문헌[Ekiert et al 2009, 2011]; 문헌[Stevens et al 2004, 2006]; 문헌[Wilson et al 1981] 참조). 당업자는 이들 방법이 또한 분비된(가용성) 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위하여 본 발명의 스템 도메인 폴리펩티드에 직접 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 이들 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 HA의 세포내 서열 및 막횡단 도메인을 함유한다. 다른 구현예에서, 세포내 및 막횡단 서열, 예를 들어, HA2 도메인의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530(또는 그의 동등한 위치)로부터 HA2 도메인의 C-말단까지(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)의 아미노산 서열을 제거하여, 세포에서의 발현 후에 가용성 폴리펩티드를 생성하였다.
특정 구현예에서, 위치 519로부터 C-말단 아미노산까지의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실된다. 추가의 구현예에서, 위치 530으로부터 C-말단 아미노산까지의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실된다.
선택적으로, his-태그 서열(HHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHHH(SEQ ID NO: 16))은 정제 목적을 위하여 (선택적으로 절단된) HA2 도메인에 연결될 수 있으며, 선택적으로, 링커를 통해 연결될 수 있다. 선택적으로, 링커는 단백질 가수분해 절단 부위를 함유하여, 정제 후에 his-태그를 효소에 의해 제거할 수 있다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 선택적으로 링커를 통해 연결되는, 삼량체 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 서열, 즉, GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 HA2의 C-말단에 도입함으로써 더 안정화된다. 따라서, 특정 구현예에서, HA2 도메인의 C-말단 부분은 선택적으로 링커를 통해 연결되는 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)에 의해 대체된다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제를 용이하게 하기 위하여, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 태그 서열, 예를 들어, his 태그(HHHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHH(SEQ ID NO: 16)) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK)(SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합을 부가할 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(의 부분), 예를 들어, IEGR (SEQ ID NO: 24)(인자 X) 또는 LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈)를 함유할 수 있다. 또한, 처리된 단백질은 본 발명에 포함된다.
특정 구현예에서, 위치 519 내지 565의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실되고(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링), SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 4)에 의해 대체된다.
특정 구현예에서, 위치 530 내지 565의 HA2 도메인의 C-말단 부분이 결실되고(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링), SGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 4)에 의해 대체된다.
고유 HA는 세포 표면상에 삼량체로서 존재한다. 함께 삼량체를 유지시키는 개별 단량체 간의 대부분의 상호작용은 헤드 도메인 내에 위치하는 한편, 스템 도메인에서, 삼량체화는 삼량체 꼬인 코일(coiled coil) 모티프의 형성에 의해 매개된다. 헤드의 제거 후에, 삼차 구조는 불안정화되고, 이에 따라, 단백질 안정성을 증가시키기 위해 변형이 필요하다. 헬릭스 CD의 나선 경향을 강화시킴으로써, 더욱 안정한 단백질이 생성될 수 있다.
동시-계류 중인 출원 PCT/EP2014/060997호에 기재된 폴리펩티드에서, 효모 전사 활성화 단백질 GCN4로부터 유래하고, 삼량체화하는 것으로 알려져 있는 서열 MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO: 5)를 위치 419 내지 433(그의 동등한 위치)에서 CD 헬릭스에 도입하였다. 이러한 서열은 나선형 2차 구조를 형성하는 경향이 높고, 이러한 방식으로 본 발명의 폴리펩티드의 전체 안정성을 향상시킬 수 있다.
폴리펩티드의 안정성 및 다량체화 상태가 본 발명의 폴리펩티드의 일차 서열에서의 GCN4 유래 서열의 정확한 위치 및 서열에 좌우되는 것으로 추가로 나타났다.
바람직한 구현예에서, 아미노산 서열 CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 193)가 위치 419 내지 433에 도입되거나, 서열 RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 194)가 위치 417 내지 433에 도입된다.
본 발명으로 이어지는 연구에서, 폴리펩티드 s74H9(SEQ ID NO: 65), s127H1(SEQ ID NO: 66), s71H2(SEQ ID NO: 71), s86B4(SEQ ID NO: 67), s115A1(SEQ ID NO: 70), s2201C9(SEQ ID NO: 77), s55G7(SEQ ID NO: 68), s113E7(SEQ ID NO: 78), s6E12(SEQ ID NO: 69), s181H9(SEQ ID NO: 76)를 당업자에게 널리 알려져 있는 분자 생물학 기술을 사용하여 변형시켜, 위치 419 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)를 함유하는 서열 s74H9-t2(SEQ ID NO: 93), s127H1-t2(SEQ ID NO: 91), s71H2-t2(SEQ ID NO: 97), s86B4-t2(SEQ ID NO: 92), s115A1-t2(SEQ ID NO: 96), s220C9-t2(SEQ ID NO: 99), s55G7-t2(SEQ ID NO: 95), s113E7-t2(SEQ ID NO: 100), s6E12-t2(SEQ ID NO: 94), s181H9-t2(SEQ ID NO: 98)를 생성하였다.
유사한 방식으로, 위치 417 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 함유하는 폴리펩티드 s74H9-t3(SEQ ID NO: 123), s127H1-t3(SEQ ID NO: 121), s71H2-t3(SEQ ID NO: 127), s86B4-t3(SEQ ID NO: 122), s115A1-t3(SEQ ID NO: 126), s2201C9-t3(SEQ ID NO: 129), s55G7-t3(SEQ ID NO: 125), s113E7-t3(SEQ ID NO: 130), s6E12-t3(SEQ ID NO: 124), s181H9-t3(SEQ ID NO: 128)을 생성하였다.
본 발명에 따르면, 위치 411 및 419에서의 아미노산을 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 제1 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 제2 단량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교를 도입하였다. 따라서, 특정 구현예에서, 아미노산 서열 CMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 193)가 위치 419 내지 433에 도입되거나, 아미노산 서열 RMCQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 194)가 위치 417 내지 433에 도입되었다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명자들은 이전에, 백신접종 개체 유래의 일차 인간 B-세포로부터 분리된 광범위 중화 항체를 확인하였으며, 이중 일부는 그룹 1에 대해 특이적이며(예를 들어, WO 2008/028946호에 기재된 바와 같은 CR6261) 이중 일부는 그룹 2 인플루엔자 바이러스에 대하여 특이적이었다(예를 들어, WO 2010/130636호에 기재된 바와 같은 CR8020). 이들 모노클로널 항체의 에피토프의 상세한 분석에 의해, 이들 특정 항체의 교차 반응성의 결여의 이유가 드러났다. 둘 모두의 경우에, 상이한 위치에서의 그룹 1 또는 그룹 2 HA 분자에서의 글리칸의 존재는 항체가 그룹-특이적인 사실을 적어도 부분적으로 설명한다. 하기에 기재된 바와 같이, 많은 그룹 1 및 2 HA 분자와 교차 반응성인 CR9114-유사 항체의 동정으로, 인간 면역계가 인플루엔자 바이러스에 대한 매우 광범위한 중화 항체를 유도할 수 있는 것이 명백해졌다. 그러나, 연간 백신접종 계획의 필요를 고려해볼 때, 이들 항체는 서브타입 H1 및/또는 H3의 (계절성) 인플루엔자 바이러스로의 감염 또는 백신접종 후에 명백하게 유도되지 않거나, 매우 낮은 정도로만 유도된다.
본 발명에 따르면, CR6261 및/또는 CR9114 및/또는 CR8020의 특정 에피토프를 모방하며, 예를 들어, 단독으로 또는 다른 예방적 및/또는 치료적 처치와 병용하여 생체내에 투여되는 경우 교차 중화 항체를 유도하기 위한 면역원성 폴리펩티드로서 사용될 수 있는 다량체 폴리펩티드가 제공된다. "교차 중화 항체"에서, 항체는 계통발생 그룹 1의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 계통발생 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스의 적어도 2가지, 바람직하게는 적어도 3가지, 4가지 또는 5가지의 상이한 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 적어도 2가지의 상이한 서브타입, 특히, 적어도 CR6261 및/또는 CR9114 및/또는 CR8020에 의해 중화되는 모든 바이러스 균주를 중화시킬 수 있음을 의미한다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 CR6261 및/또는 CR9114에 선택적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 항체 CR8057에 결합하지 않는다. CR6261은 SEQ ID NO: 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; CR9114는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; CR8020은 SEQ ID NO: 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. CR8057은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 삼량체이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 단량체는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GCEX 8 NKX 9 ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVSGRDYKDDDDKLVPRGSPGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHH(SEQ ID NO: 145)를 포함하며,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 단량체는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GCEX 8 NKX 9 ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG(SEQ ID NO: 146)을 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 단량체는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GCEX 8 NKX 9 ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG(SEQ ID NO: 147)를 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, 폴리펩티드 단량체는 아미노산 서열:
DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX 1 PSX 2 QSQGLFGAIAGX 3 X 4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX 5 NTQX 6 TAX 7 GCEX 8 NKX 9 ERCMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI(SEQ ID NO: 148)를 포함하고,
여기서, X1은 E, I, K, V, A 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X2는 I, K, R, T, F, N, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X3은 D, F, V, Y, A, I, N, S 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X4는 I, K, R, T, E, G 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X5는 M, E, K, V, R, T로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X6은 F, I, N, S, T, Y, H 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X7은 A, G, I, R, T, V, F 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X8은 F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M 및 V로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고;
X9는 H, I, L, N, R 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
특정 구현예에서, X1은 K이고, X2는 K이고, X3은 F이고, X4는 T이고, X5는 M이고, X6은 Y이고, X7은 I이고, X8은 Y이고, X9는 S이다.
인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 하기에 기재된 기술을 포함하는 숙련자에게 적합한 것으로 여겨지는 임의의 기술에 따라 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있는 표준 방법에 의해 DNA 서열로서 합성되고, 적합한 제한 효소와 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 클로닝되고, 이후에 시험관내 또는 생체내에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터, 예를 들어 플라스미드의 일부이다. 이러한 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법에 의해 용이하게 조작될 수 있으며, 예를 들어, 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 또한, 많은 벡터는 진핵 세포의 형질전환을 위해 직접적으로 또는 그것으로부터 분리된 요망되는 단편의 형태로 사용될 수 있으며, 전체가 또는 일부가 이러한 세포의 게놈 내로 통합되어, 이들의 게놈에 요망되는 핵산을 포함하는 안정한 숙주 세포가 초래될 것이다. 사용되는 벡터는 DNA를 클로닝하는 데 적합하고 대상 핵산의 전사에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 숙주 세포가 사용되는 경우, 벡터가 통합 벡터인 것이 바람직하다. 대안적으로, 벡터는 에피솜 복제 벡터일 수 있다.
당업자는 적합한 발현 벡터를 선택하고, 본 발명의 핵산 서열을 기능적 방식으로 삽입할 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 수득하기 위하여, 발현을 추진할 수 있는 서열을 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 연결하여, 발현 가능한 형식으로 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 핵산 분자가 초래될 수 있는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 프로모터 서열은 발현되어야 하는 서열의 업스트림에 배치된다. 많은 발현 벡터, 예를 들어, 인비트로겐(Invitrogen)의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, 비디 사이언스즈(BD Sciences)로부터의 pMSCV 및 pTK-Hyg, 스트라타진(Stratagene)으로부터의 pCMV-Script 등이 당업계에서 이용 가능하며, 이는 적합한 프로모터 및/또는 전사 터미네이터 서열, 폴리A 서열 등을 수득하기 위해 사용될 수 있다. 대상 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 암호화된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 관리하는 서열에 관하여 적절하게 삽입되는 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 지칭되는 대상 폴리펩티드의 생성에 유용하다. 발현을 추진하는 서열은 프로모터, 인핸서(enhancer) 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 이들은 숙주 세포에서 작용할 수 있어서, 이에 의해 이들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 추진해야 한다. 당업자는 다양한 프로모터가 숙주 세포에서의 유전자의 발현을 수득하기 위해 사용될 수 있음을 알고 있다. 프로모터는 구성형(constitutive)이거나 조절형(regulated)일 수 있으며, 바이러스, 원핵 또는 진핵 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 수득되거나 인공적으로 설계될 수 있다. 대상 핵산의 발현은 천연 프로모터 또는 이의 유도체로부터, 또는 전적으로 이종성인 프로모터로부터 이루어질 수 있다(문헌[Kaufman, 2000]). 진핵 세포에서의 발현을 위해 널리 공지되어 있고 많이 사용되는 일부 프로모터는 바이러스, 예를 들어, 아데노바이러스로부터 유래한 프로모터, 예를 들어, E1A 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유래한 프로모터, 예를 들어, CMV 즉시 조기(immediate early, IE) 프로모터(본 명세서에서 CMV 프로모터로 지칭)(예를 들어, 인비트로겐사의 pcDNA로부터 수득 가능), 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40)으로부터 유래한 프로모터(문헌[Das et al, 1985]) 등을 포함한다. 적합한 프로모터, 예를 들어, 메탈로티오네인(MT) 프로모터, 연장 인자 1α(EF-1α) 프로모터(문헌[Gill et al., 2001]), 유비퀴틴 C 또는 UB6 프로모터(문헌[Gill et al., 2001]), 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열 충격 프로모터 등은 또한 진핵 세포로부터 유래할 수도 있다. 프로모터 기능 및 프로모터 세기에 대한 시험은 당업자에게 통상적인 상황이며, 일반적으로 예를 들어, 프로모터 서열 뒤의 시험 유전자, 예를 들어, lacZ, 루시퍼라제, GFP 등의 클로닝과 시험 유전자의 발현에 대한 시험을 포함할 수 있다. 물론, 프로모터를 그 안의 서열의 결실, 부가, 돌연변이에 의해 변경하고, 작용성에 대해 시험하여, 신규한, 약독화된 또는 개선된 프로모터 서열을 찾을 수 있다. 본 발명에 따르면, 선택된 진핵 세포에서 높은 전사 수준을 제공하는 강력한 프로모터가 바람직하다.
작제물은 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 진핵 세포(예를 들어, 식물, 진균, 효모 또는 동물 세포) 또는 에스케리키아 콜라이와 같은 적합한 원핵 발현 시스템으로 트랜스펙션될 수 있다. 일부 경우에, 적합한 '태그' 서열(예를 들어, 비제한적으로, his-, myc-, strep- 또는 flag-태그) 또는 완전한 단백질(예를 들어, 비제한적으로, 말토스 결합 단백질 또는 글루타티온 S 트랜스퍼라제)을 본 발명의 서열에 부가하여, 세포 또는 상청액으로부터 폴리펩티드의 정제 및/또는 확인을 가능하게 할 수 있다. 선택적으로, 특정 단백질 가수분해 부위를 함유하는 서열을 포함시켜, 이후에 단백질 가수분해에 의해 태그를 제거할 수 있다.
정제된 폴리펩티드를 당업계에 공지되어 있는 분광 방법(예를 들어, 원편광 분광법, 푸리에 변환 적외 분광법 및 NMR 분광법 또는 X-선 결정학)에 의해 분석하여, 헬릭스 및 베타 시트와 같은 요망되는 구조의 존재를 조사할 수 있다. ELISA, Octet 및 FACS 등을 사용하여, 이전에 기재된 광범위 중화 항체(CR6261, CR9114, CR8057)로의 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 조사할 수 있다. 따라서, 올바른 형태를 갖는 본 발명에 따른 폴리펩티드가 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 치료적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 중 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 조성물은 바람직하게는 면역원성 조성물이다. 조성물은 바람직하게는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체가 사용되는 용량 및 농도에서, 그들이 투여되는 대상에 원치 않는 또는 유해한 효과를 야기하지 않을 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]]; 문헌[Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]] 참조). 용어 "담체"는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 염수 용액 및 덱스트로스 및 글리세롤 수용액이 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 정확한 제형은 투여 방식을 따라야 한다. 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자는 바람직하게는 멸균 용액으로서 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은 멸균 여과에 의해 또는 그 자체가 당업계에 공지되어 있는 기타 방법에 의해 제조된다. 이어서, 용액은 동결건조되거나, 약제 투여 컨테이너에 채워질 수 있다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어, pH 5.0 내지 7.5 범위이다.
본 발명은 또한 인플루엔자 HA 단백질에 대한 면역 반응의 유도에 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 인플루엔자 HA 스템 도메인 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서의 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이며, 해당 방법은 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 대상은 바람직하게는 감염성 질환-유발 물질, 특히 인플루엔자 바이러스에 감염될 수 있거나, 다르게는 면역 반응의 유도로부터 이익을 얻을 수 있는 포유류이며, 예를 들어, 이러한 대상은 설치류, 예를 들어, 마우스, 페럿, 애완동물 또는 가축, 또는 비인간 영장류 또는 인간이다. 바람직하게는 대상은 인간 대상이다. 이에 따라, 본 발명은 대상에서의, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 사용한 특히 그룹 1 및/또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스, 예를 들어, H1, H2, H3, H4, H5, H7 및/또는 H10 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 대한 면역 반응의 유도 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물을 사용하여 대상에서 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 유도되는 면역 반응은 그룹 1 및/또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하고/거나 치료하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은 인플루엔자 A 및/또는 B 바이러스 중 2, 3, 4, 5 또는 6가지 서브타입에 의해 야기되는 인플루엔자 A 및/또는 B 바이러스 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 유도되는 면역 반응은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하고/거나 치료하는데 유효하다.
작은 단백질 및/또는 핵산 분자가 언제나 강력한 면역 반응을 효과적으로 유도하는 것이 아닌 것이 널리 공지되어 있기 때문에, 보강제를 첨가함으로써 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 면역원성을 증가시키는 것이 필요할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 면역원성 조성물은 보강제를 포함하거나 보강제와 병용하여 투여된다. 본 명세서에 기재된 조성물과 병용하여 투여하기 위한 보강제는 상기 조성물의 투여 전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 적합한 보강제의 예에는 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄; 스쿠알렌-워터(squalene-water) 에멀젼, 예를 들어, MF59를 비롯한 오일-에멀젼 조성물(또는 수중유 조성물)(예를 들어, WO 90/14837호 참조); 사포닌 제형, 예를 들어, QS21 및 면역자극 복합체(ISCOMS)(예를 들어, US 5,057,540호; WO 90/03184호, WO 96/11711호, WO 2004/004762호, WO 2005/002620호 참조); 예에 모노포스포릴 지질 A(MPL), 3-O-데아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 이열성 장독소 LT, 콜레라 독소 CT, 백일해 독소 PT 또는 파상풍 톡소이드 TT, 매트릭스 M(이소코노바(Isconova))이 있는 박테리아 또는 미생물 유도체가 포함된다. 또한, 공지되어 있는 면역증강 기술, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드를 면역 반응을 향상시키는 것으로 당업계에 알려져 있는 단백질(예를 들어, 파상풍 톡소이드, CRM197, rCTB, 박테리아 플라젤린 또는 기타의 것)에 융합시키는 것, 폴리펩티드를 비로좀(virosome)에 포함시키는 것 또는 이들의 조합이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 비제한적인 다른 예는 예를 들어, 문헌[Coffman et al. (2010)]에 의해 개시된다.
일 구현예에서, 본 발명의 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드는 바이러스 유사 입자(VLP) 벡터에 혼입된다. VLP는 일반적으로, 전형적으로 바이러스의 구조 단백질(들)로부터 유래하는 바이러스 폴리펩티드(들)를 포함한다. 바람직하게는 VLP는 복제할 수 없다. 특정 구현예에서, VLP는 바이러스의 완전한 게놈이 결여되거나, 바이러스의 게놈의 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, VLP는 세포를 감염시킬 수 없다. 일부 구현예에서, VLP는 당업자에게 공지되어 있는 하나 이상의 바이러스(예를 들어, 바이러스 표면 당단백질) 또는 비-바이러스(예를 들어, 항체 또는 단백질) 표적화 부분을 그들의 표면 상에 발현한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 비로좀 내로 혼입된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 비로좀은 당업자에게 공지되어 있는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 비로좀은 정제된 바이러스를 파괴하고, 게놈을 추출하고, 입자와 바이러스 단백질(예를 들어, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드) 및 지질을 다시 조립하여 바이러스 단백질을 함유하는 지질 입자를 형성함으로써 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 백신으로 사용하기 위한 인플루엔자 HA에 대하여 대상에서 면역 반응을 유도하기 위한 상기 기재된 폴리펩티드, 핵산, 벡터 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 이에 따라, 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 또는 본 명세서에 기재된 이러한 핵산 또는 폴리펩티드를 포함하는 벡터를 사용하여, 인플루엔자 바이러스에 대한, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 스템 영역에 대한 중화 항체를 유도할 수 있다. 본 발명은 특히, 계통발생 그룹 1 및/또는 계통발생 그룹 2의 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병 또는 질환의 예방 및/또는 치료에서 백신으로 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서, 백신은 계통발생 그룹 1 및/또는 2의 2, 3, 4, 5, 6가지 이상의 상이한 서브타입 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 백신은 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 의해 야기되는 인플루엔자 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 시험관내 또는 박테리아 및 진핵 세포를 포함하는 적합한 세포 발현 시스템에서의 합성 후에 사용되거나, 대안적으로 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 발현시킴으로써 이를 필요로 하는 대상에서 생체내 발현될 수 있다. 이러한 핵산 백신은 네이키드(naked) DNA, 플라스미드 또는 아데노바이러스 벡터를 비롯한 바이러스 벡터를 포함하는 임의의 형태를 취할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 면역원성 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비제한적인 예에는 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 피내, 경피, 근육내, 피하 등 또는 점막 투여, 예를 들어, 비내, 구강 등이 포함된다. 당업자는 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물을 투여하여 면역 반응을 유도할 다양한 가능성을 결정할 수 있을 것이다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물(또는 백신)은 1회를 초과하여, 즉, 소위 상동 초회감작-부스트(prime-boost) 요법으로 투여된다. 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물이 1회 넘게 투여되는 특정 구현예에서, 제2 용량의 투여는 예를 들어, 제1 용량의 투여 후 1주 이상, 제1 용량의 투여 후 2주 이상, 제1 용량의 투여 후 3주 이상, 제1 용량의 투여 후 1개월 이상, 제1 용량의 투여 후 6주 이상, 제1 용량의 투여 후 2개월 이상, 제1 용량의 투여 후 3개월 이상, 제1 용량의 투여 후 4개월 이상 등, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 면역원성 조성물의 제1 용량의 투여 후 최대 수년의 시간 간격 후에 수행될 수 있다. 또한, 2회 초과, 예를 들어, 3회, 4회 등으로 백신을 투여하여, 제1 초회감작 투여가 1회 초과의 부스팅 투여로 이어지게 하는 것이 가능하다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물은 오직 1회 투여된다.
또한, 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물이 비상동 초회감작-부스트 요법에서 초회감작으로서 또는 부스트로서 투여될 수도 있다.
본 발명은 추가로, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 핵산 및/또는 조성물을 사용한, 대상에서의 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 대상에서 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료 방법은 유효량의, 상기 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물을 인플루엔자 바이러스 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료적 유효량은 그룹 1 또는 2 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스에 의한 감염으로부터 야기되는 질병 또는 질환, 바람직하게는 H1 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 H3 서브타입의 HA를 포함하는 인플루엔자 A 바이러스에 의한 감염으로부터 야기되는 질병의 예방, 개선 및/또는 치료에 유효한 본 명세서에 정의된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 조성물의 양을 지칭한다. 예방은 인플루엔자 바이러스의 확산의 억제 또는 감소, 또는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염과 관련된 증상 중 하나 이상의 발병, 발생 또는 진행의 억제 또는 감소를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 개선은 인플루엔자 감염의 가시적인 또는 감지 가능한 질병 증상, 바이러스혈증, 또는 임의의 다른 측정가능한 징후(manifestation)의 감소를 지칭할 수 있다.
치료를 필요로 하는 대상은 그룹 1 또는 그룹 2 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스로의 감염으로부터 야기되는 질환을 이미 앓고 있는 대상 및 인플루엔자 바이러스로의 감염이 예방되어야 하는 대상을 포함한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터 및/또는 조성물은 나이브(naive) 대상, 즉, 인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기되는 질병을 갖지 않거나, 인플루엔자 바이러스 감염으로 감염된 적이 없으며 현재 감염되지 않은 대상, 또는 인플루엔자 바이러스에 이미 감염되고/거나 이에 감염된 적이 있는 대상에게 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 예방 및/또는 치료는 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 환자 그룹에 표적화될 수 있다. 이러한 환자 그룹에는 예를 들어, 노인(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 유아(예를 들어, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자 및 항바이러스 화합물로 치료된 적이 있으나 부적절한 항바이러스 반응을 보인 환자가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터는 하나 이상의 다른 활성제, 예를 들어, 기존의 또는 장래의 인플루엔자 백신, 모노클로널 항체 및/또는 항바이러스제 및/또는 항박테리아제 및/또는 면역조절제와 병용하여 대상에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 다른 활성제는 인플루엔자 바이러스 질병의 치료 및/또는 예방에 유리할 수 있거나 인플루엔자 바이러스 질병과 관련된 증상 또는 질환을 개선할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다른 활성제는 진통제, 해열 약제 또는 호흡을 완화하거나 보조하는 치료제이다.
본 발명의 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 투여 요법을 조정하여, 최적의 요망되는 반응(예를 들어, 치료 반응)을 제공할 수 있다. 적합한 투여 범위는 예를 들어, 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.5 내지 15 ㎎/㎏(체중)일 수 있다. 사용될 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자의 정확한 용량은 예를 들어, 투여 경로 및 감염 또는 이에 의해 야기되는 질병의 중증도에 따라 달라질 것이며, 진료의의 판단과 각 대상의 환경에 따라 결정되어야 한다. 예를 들어, 유효 용량은 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(연령, 체중, 건강 포함) 및 처치가 예방적 처치인지 치료적 처치인지에 따라 달라진다. 통상, 환자는 인간이나 트랜스제닉 포유류를 포함하는 비인간 포유류도 또한 치료될 수 있다. 치료 용량을 최적으로 적정하여 안전성과 효능을 최적화시킨다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여, 잠재적인 치료 후보물질로서 확인된 모노클로널 항체의 결합을 입증할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드를 진단 도구로 사용하여, 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 이러한 개체의 혈청 중의 항체가 존재하는지의 여부를 확립함으로써, 개체의 면역 상태를 시험할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 또한 환자에서 인플루엔자 감염의 존재를 검출하기 위한 시험관내 진단 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 환자로부터 수득된 생물학적 시료를 본 발명에 따른 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및 b) 항체-항원 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여, 신규한 결합 분자를 확인하거나 기존의 결합 분자, 예를 들어, 모노클로널 항체 및 항바이러스제를 개선할 수 있다.
본 발명은 하기의 실시예 및 도면에 추가로 예시된다. 실시예는 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: PCT/EP2014/060997호에 개시된 스템 기반의 폴리펩티드
PCT/EP2012/073706호에는 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드, 조성물 및 백신, 및 인플루엔자의 예방 및/또는 치료의 분야에서의 그들의 이용 방법이 개시되어 있다. PCT/EP2014/060997호에는 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유래한 스템 도메인 폴리펩티드의 추가의 서열이 개시되어 있으며, 이는 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)의 위치-지정 돌연변이에 의해 수득되었으며, CR6261(문헌[Throsby et al, 2009]; 문헌[Ekiert et al 2010]) 및/또는 CR9114의 광범위 중화 에피토프를 안정적으로 제시하였다.
하기의 단계를 행함으로써 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)를 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1)의 전장 HA로부터 유도하였다:
1. HA0 내의 절단 부위의 제거. 이러한 부위에서의 야생형 HA의 절단은 HA1 및 HA2를 초래한다. 당해 제거는 P1 위치에서의 R에서 Q로의 돌연변이에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 절단 부위(SEQ ID NO: 1에서 위치 343)의 명명법의 설명에 대해서는 문헌[Sun et al, 2010] 참조).
2. SEQ ID NO; 1로부터 아미노산 53 내지 320을 결실시킴에 의한 헤드 도메인의 제거. 서열의 나머지 N- 및 C-말단 부분을 4개 잔기의 유연성 링커, GGGG에 의해 연결하였다.
3. 변형된 HA의 융합 이전 형태의 안정성을 증가시키고, 융합 이후 형태를 불안정화시키기 위한, H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1) 내의 잔기 402 내지 418(그의 동등한 잔기)에 의해 형성되는 루프(A-헬릭스와 CD-헬릭스 사이)의 가용성의 증가. H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)에, 돌연변이 F406S, V409T, F413G 및 L416S(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)를 도입하였다.
4. H1 A/Brisbane/59/2007에서 위치 324 및 436에서의 아미노산 사이의 이황화 가교의 도입; 이것은 돌연변이 R324C 및 Y436C를 도입함으로써 달성된다(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함).
5. 위치 419 내지 433(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)에, 삼량체화하는 것으로 알려져 있는 GCN4 유래 서열 MKQIEDKIEEIESKQ(SEQ ID NO: 5)의 도입.
특정 구현예에서, 막횡단 및 세포내 도메인의 서열을 HA2의 위치 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 526, 527, 528, 529 또는 530(또는 서열 정렬로부터 결정시 그의 동등한 위치)으로부터 HA2의 C-말단(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)까지 결실시켜, 세포에서의 발현 후에 분비된(가용성) 폴리펩티드가 생성되게 하였다. 가용성 폴리펩티드를 삼량체 구조를 형성하는 것으로 알려져 있는 서열, 즉, 선택적으로 상기 기재된 바와 같은 짧은 링커를 통해 연결되는 폴드온 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 도입함으로써 더욱 안정화시켰다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제 및 검출을 용이하게 하기 위하여, 태그 서열, 예를 들어, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 히스티딘 태그(HHHHHHH(SEQ ID NO: 20) 또는 HHHHHH(SEQ ID NO: 21) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK; SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합이 선택적으로 부가될 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지되어 있는 프로토콜에 따른 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(또는 그의 부분), 예를 들어, LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈) 또는 IEGR(SEQ ID NO: 24)(인자 X)을 함유할 수 있다. 처리된 단백질도 또한 본 발명에 포함된다.
FLAG-태그, 트롬빈 절단 부위, 폴드온 및 His 서열을 조합한 이러한 C-말단 서열의 예는 SEQ ID NO: 4 FLAG-트롬빈-폴드온-His이다. 이러한 서열을 가용성 형태의 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2) 서열과 조합하여, 모체 서열(SEQ ID NO: 6)을 생성하였으며, 이를 사용하여, 돌연변이유발에 의해 본 발명의 신규한 폴리펩티드를 생성하였다. 이러한 서열은 SEQ ID NO: 1 및 2의 아미노산 1 내지 17에 상응하는 리더 서열을 함유하지 않는다.
따라서, 분자의 헤드 도메인을 암호화하는 헤마글루티닌 서열의 부분을 결실시키고, PCT/2012/073706호 및 상기에 기재된 바와 같이 링커를 통해 결실의 어느 하나의 측에 서열의 N- 및 C-말단 부분을 재연결시킴으로써 스템 도메인 폴리펩티드를 생성하였다. 헤드 도메인의 제거는 이전에 수성 용매로부터 보호된 분자의 부분이 노출되게 하여, 잠재적으로 본 발명의 폴리펩티드의 구조를 불안정화시켰다. 이런 이유로, B-루프 내의 잔기(특히 아미노산 잔기 406(각각 SEQ ID NO: 1 및 2에서 F 및 S), 409(V 및 T) 413(F 및 G) 및 416(L 및 S))를 출발점으로서 모체 서열 SEQ ID NO: 6을 사용하여 다양한 조합으로 돌연변이시켰다. 리더 서열을 제거하고, 잔기 520 내지 565를 Flag-트롬빈-폴드온--his 서열(SEQ ID NO: 4)로 대체함으로써 SEQ ID NO: 6을 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 2)로부터 생성하였다.
유사하게, 융합 펩티드 주변의 영역에서, 다수의 소수성 잔기가 용매에 노출되며, 이는 고유 전장 HA와 달리, 폴리펩티드가 절단될 수 없고, 소수성 융합 펩티드를 단백질의 내부에 매립하는 관련 입체구조 변화를 겪을 수 없다는 사실에 의해 야기된다. 이러한 문제를 다루기 위하여, SEQ ID NO: 2에서의 잔기 I337, I340, F352 및 I353 중 일부 또는 전부도 또한 돌연변이시켰다.
이러한 방식에서, 가용성 형태의 HA 스템 폴리펩티드 74H9(SEQ ID NO: 57), 127H1(SEQ ID NO: 55), 71H2(SEQ ID NO: 61), 86B4(SEQ ID NO: 56), 115A1(SEQ ID NO: 60), 2201C9(SEQ ID NO: 63), 55G7(SEQ ID NO: 59), 113E7(SEQ ID NO: 64), 6E12(SEQ ID NO: 58), 181H9(SEQ ID NO: 62)를 라이브러리의 일부로서 생성하였다.
상기 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 당업자에게 널리 공지된 프로토콜을 사용하여 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 내로 형질전환시키거나, HEK293F 세포 내로 트랜스펙션시켰다. 포유동물 세포에서의 발현을 위해 사용되는 작제물은 HA 리더 서열(SEQ ID NO: 1 및 2에서의 잔기 1 내지 17)을 함유하는 한편, 피키아 파스토리스에서의 발현을 위해 사용되는 작제물에서, HA 리더 서열을 효모 알파 인자 리더 서열(SEQ ID NO: 7)로 대체하였다. 이러한 방식으로, 발현된 단백질을 세포 배양 배지로 지향시켜, 이에 따라, 결합 및 발현이 본 발명의 폴리펩티드의 추가의 정제 없이 결정되게 하였다. 모든 서열은 FLAG-폴드온-HIS C-말단 서열(SEQ ID NO: 4)을 함유하였다.
본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 모노클로널 항체(CR6261, CR9114, CR8020)를 ELISA에 의해 결정하였다. 이를 위하여, ELISA 플레이트를 4℃에서 2 ㎍/㎖ 모노클로널 항체 용액(20 ㎕/웰)으로 하룻밤 처리하였다. 항체 용액의 제거 후에, 남아 있는 표면을 실온에서 최소 1시간 동안 PBS 중 4% 무지방 분유의 용액으로 블로킹하였다. 플레이트의 세척 후에, 20 ㎕의 세포 배양 배지(그대로 또는 희석)를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음, ELISA 플레이트를 세척하고, 20 ㎕의 항-FLAG-HRP 항체 용액(Sigma A8952, PBS-Tween 중 4% 무지방 분유의 용액 중 2000배 희석)을 첨가하였다. 인큐베이션(실온에서 1시간) 후에, 플레이트를 1회 이상 세척하고, 20 ㎕의 발광 기질(Thermoscientific C#34078)을 첨가하여, 신호를 발생시켰다. 대안적으로, 비색 검출 방법을 사용하여, 신호를 발생시켰다.
본 발명의 폴리펩티드의 발현을 균일 시간-분해 형광 검정으로부터 결정하였다(일반적인 설명을 위하여, 예를 들어, 문헌[Degorce et al., Curr. Chem. Genomics 2009 3: 22-32] 참조). 이를 위하여, 210.5 ㎕ 항-FLAG-TB(원액 26 ㎍/㎖) 및 1.68 ㎖의 항-HIS-488(원액 50 ㎍/㎖)을 배양 배지 및 50 mM HEPES + 0.1% BSA의 1 대 1 혼합물 80 ㎖에 첨가함으로써 테르븀(Tb) 표지된 항-FLAG 모노클로널 항체(공여자) 및 Alexa488 표지된 항-His 모노클로널 항체(수여자)(HTRF 용액)의 혼합물을 제조하였다. 19 ㎕의 HTRF 용액을 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 1 ㎕의 배양 배지를 첨가하였다. 여기 시에, 그리고 다른 화합물(단백질, 배지 성분 등)로부터 발생하는 간섭 단기 백그라운드 신호가 붕괴되게 하기 위한 지연 후에, 520 및 665 nm에서의 형광 방출의 비를 결정하였다. 이것은 시료 중 총 단백질 함량의 척도이며, 이를 이용하여, 상이한 실험 간의 mAb 결합 신호를 정규화시킨다.
표 3 및 표 4에 열거된 폴리펩티드를 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 피키아 파스토리스에서 발현시켰다. 배양 배지를 수집하고, 스템 도메인 폴리펩티드의 CR6261로의 결합 및 그의 발현을 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 결합 검정에서의 반응이 발현 단백질의 농도에 따라 축척되기 때문에, 각각의 발현된 서열에 대한 HTRF 검정에서의 신호에 비하여 결합 신호의 비를 비교함으로써, ELISA 결합 신호를 단백질 발현에 대하여 정규화시켰다. 모든 발현된 단백질은 SEQ ID NO: 6의 모체 서열에 비하여, 더 높은 비의 CR626 결합 대 HTRF 신호를 나타낸다.
또한, CR6261 결합 대 HTRF 신호의 비를 계산하고, 모체 서열 SEQ ID NO: 6에 대하여 계산된 비와 비교하였다. 결과는 표 3 및 표 4의 5열에 열거되어 있으며; 모든 발현된 단백질은 더 높은 비를 나타내며, 이는 상기 기재된 스템 폴리펩티드가 증가된 CR6261의 결합을 보이는 것을 나타낸다.
실시예 2: 추가의 폴리펩티드의 설계 및 특성화
상기 기재된 폴리펩티드는 CD 헬릭스 내에 효모 전사 활성화 단백질 GCN4로부터 유래한 서열 RMKQIEDKIEEIESKQ를 함유한다. 이러한 서열은 나선형 이차 구조를 형성하는 경향이 높고, 이러한 방식으로, 본 발명의 폴리펩티드의 전체 안정성을 증진시킬 수 있다. 헤마글루티닌 스템 폴리펩티드의 안정성 및 응집 상태가 폴리펩티드의 일차 서열에서의 GCN4 유래 서열의 정확한 위치와 서열에 좌우되는 것이 놀랍게도 관찰되었다.
이러한 예에서, 본 발명자들은 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)가 위치 419 내지 433(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링; 예를 들어, SEQ ID NO. 81 내지 110)에 도입되거나, 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)가 위치 417 내지 433(예를 들어, SEQ ID NO 111 내지 140)에 도입된 신규한 세트의 폴리펩티드를 설명한다.
이를 위하여, 실시예 1에 기재된 폴리펩티드, 즉, 74H9(SEQ ID NO: 57), 127H1(SEQ ID NO: 55), 71H2(SEQ ID NO: 61), 86B4(SEQ ID NO: 56), 115A1(SEQ ID NO: 60), 2201C9(SEQ ID NO: 63), 55G7(SEQ ID NO: 59), 113E7(SEQ ID NO: 64), 6E12(SEQ ID NO: 58), 181H9(SEQ ID NO: 62)를 당업자에게 널리 공지된 분자 생물학의 기술을 사용하여 변형시켜, 위치 419 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESK(SEQ ID NO: 20)를 함유하는 서열 74H9-t2(SEQ ID NO: 83), 127H1-t2(SEQ ID NO: 81), 71H2-t2(SEQ ID NO: 87), 86B4-t2(SEQ ID NO: 82), 115A1-t2(SEQ ID NO: 86), 220C9-t2(SEQ ID NO: 89), 55G7-t2(SEQ ID NO: 85), 113E7-t2(SEQ ID NO: 90), 6E12-t2(SEQ ID NO: 84), 181H9-t2(SEQ ID NO: 88)를 생성하였다.
유사한 방식으로, 위치 417 내지 433에 서열 RMKQIEDKIEEIESKQK(SEQ ID NO: 21)를 함유하는 서열 74H9-t3(SEQ ID NO: 113), 127H1-t3(SEQ ID NO: 111), 71H2-t3(SEQ ID NO: 117), 86B4-t3(SEQ ID NO: 112), 115A1-t3(SEQ ID NO: 116), 2201C9-t3(SEQ ID NO: 119), 55G7-t3(SEQ ID NO: 115), 113E7-t3(SEQ ID NO: 120), 6E12-t3(SEQ ID NO: 114), 181H9-t3(SEQ ID NO: 118)을 생성하였다.
폴리펩티드는 또한 상이한 바이러스 균주 유래의 HA 분자의 서열을 기반으로 생성될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 195 내지 201에는 H1N1 A/California/07/09 균주의 HA 서열을 기반으로 하는 폴리펩티드가 기재되어 있다.
이전에 기재된 바와 같이, 예를 들어, HA2 도메인의 잔기 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 526, 528, 529 또는 530으로부터 HA2 도메인의 C-말단(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)까지의 HA 기반의 서열의 C-말단 부분을 제거함으로써 가용성 폴리펩티드가 생성될 수 있다.
폴리펩티드는 삼량체 구조를 형성하는 것으로 공지된 서열, 즉, 선택적으로 링커를 통해 연결되는 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(SEQ ID NO: 3)을 도입함으로써 더욱 안정화될 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 절단 부위를 함유할 수 있다. 가용성 형태의 정제를 용이하게 하기 위하여, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 태그 서열, 예를 들어, his 태그(HHHHHHH(SEQ ID NO: 15) 또는 HHHHHH(SEQ ID NO: 16)) 또는 FLAG 태그(DYKDDDDK)(SEQ ID NO: 22) 또는 이들의 조합을 부가할 수 있다. 링커는 선택적으로 당업자에게 널리 알려져 있는 프로토콜에 따라 이후의 처리를 위한 단백질 가수분해 절단 부위(의 부분), 예를 들어, IEGR(SEQ ID NO: 24)(인자 X) 또는 LVPRGS(SEQ ID NO: 23)(트롬빈)를 함유할 수 있다.
잔기 519 내지 565(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)의 등가물을 변형된 트롬빈 절단 부위 및 6개의 히스티딘 태그(SEQ ID NO: 21) 둘 모두를 함유하는 서열 RSLVPRGSPGHHHHHH로 대체함으로써, SEQ ID NO: 55 내지 64 및 81 내지 90의 가용성 형태의 폴리펩티드를 생성하고, 당업자에게 널리 공지된 프로토콜에 따라 HEK293F 세포에서 발현시켰다.
비교를 위하여, PCT/EP2012/073706호에 기재된 가용성 형태의 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t2(SEQ ID NO: 52) 및 H1-미니2-클러스터1+5+6-GCN4t3(SEQ ID NO: 53)도 또한 실험에 포함시켰다. 배양 배지를 수집하고, CR6261, CR9114로의 결합을 배양 배지로부터 폴리펩티드를 직접 포획하기 위한 코팅된 mAb CR6261 또는 CR9114 및 검출 목적을 위한 C-말단 his-태그에 대하여 유도된 서양고추냉이 과산화효소(HRP) 컨쥬게이트된 항체를 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출하였다. 대안적으로, HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘과 함께 비오티닐화 CR9114를 샌드위치 ELISA에서 CR9114 포획된 폴리펩티드의 검출을 위해 사용하였다. 이러한 형식은 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재의 검출을 가능하게 한다. 시험된 모든 폴리펩티드는 ELISA에 의해 결정시, CR9114 및 CR6261에 결합할 수 있었다. CR9114 포획 - 비오티닐화 CR9114 검출 샌드위치 ELISA에 의해 검출시 증가된 수준의 다량체화가 s55G7-t2(SEQ ID NO: 95), s86B4-t2(SEQ ID NO: 92), s115A1-t2(SEQ ID NO: 96), s127H1-t2(SEQ ID NO: 91), s113E7-t2(SEQ ID NO: 100), s220C9-t2(SEQ ID NO: 99), s71H2-t3(SEQ ID NO: 127), s127H1-t3(SEQ ID NO: 121), s74H9-t3(SEQ ID NO: 123)에 대하여 관찰되었다.
추가의 특성화를 위하여 폴리펩티드의 고도로 순수한 제제를 수득하기 위하여, 가용성 형태의 127H1-t2(SEQ ID NO: 81), 86B4-t2(SEQ ID NO: 82) 및 55G7-t2(SEQ ID NO: 85)를 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터 pcDNA2004로 HEK293F 세포를 트랜스펙션시켰다. 생성 동안 단백질의 수송을 유도하는 리더 서열(또는 신호 서열)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17에 상응)이 분비된 최종 폴리펩티드에 존재하지 않을 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
폴리펩티드를 생성하기 위하여, HEK293F 세포(인비트로겐)를 300g에서 5분 동안 회전 침강시키고, SF1000 플라스크마다 300 ㎖의 사전 가온 프리스타일(Freestyle)™ 배지에 재현탁화시킴으로써 1.0*106vc/㎖를 씨딩하였다. 이러한 배양물을 멀티트론(multitron) 인큐베이터에서, 110 rpm에서 37℃, 10% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후에, 플라스미드 DNA를 9.9 ㎖의 옵티멤(Optimem) 배지에서 300 ㎖ 배양 부피 중에 1.0 ㎍/㎖의 농도로 피펫팅하였다. 병행하여, 440 ㎕의 293펙틴®을 9.9 ㎖의 옵티멤 배지에서 피펫팅하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 5분 후에, 플라스미드 DNA/옵티멤 믹스를 293펙틴®/옵티멤 믹스에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 플라스미드 DNA/293펙틴® 믹스를 세포 현탁액에 적가하였다. 트랜스펙션된 배양물을 멀티트론 인큐베이터에서, 37℃, 10% CO2 및 110 rpm에서 인큐베이션시켰다. 제7일에, 세포를 원심분리(3000g에서 30분)에 의해 배양 배지로부터 분리하는 한편, 가용성 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 추가의 처리를 위하여 0.2 ㎛ 바틀 탑(bottle top) 필터에 대하여 여과하였다.
정제 목적을 위하여, 1500 ㎖(s127H1_t2), 1800 ㎖(s86B4_t2) 및 2400 ㎖(s55G7_t2)의 배양 상청액을 세척 완충제(20 mM TRIS, 500 mM NaCl, pH 7.8)에서 사전-평형화된 24 ㎖ Ni 세파로스(Sepharose) HP 컬럼에 적용하였다. 세척 완충제 중 10 mM 이미다졸을 사용한 세척 단계 후에, 결합된 폴리펩티드를 세척 완충제 중 단계식 기울기의 300 mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리 피크를 수집하고, 농축시키고, 추가의 정제를 위해 크기 배제 컬럼에 적용하였다(Superdex 200). 55G7-t2 및 127H1-t2에 대하여, 분획을 수집하고, 풀링하고, SDS-PAGE, ELISA 및 분자량을 추정하기 위한 다중각 광산란과 병용되는 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)에 의해 분석하였다. ELISA 결과에 의해, CR6261 및 CR9114로 폴리펩티드가 결합하지만, CR8020으로는 결합하지 않는 것이 확인되었다. SEC-MALS 결과는 표 9에 요약되어 있다.
표 8은 폴리펩티드 s127H1-t2가 55G7-t2 및 86B4-t2에 비하여 높은 수율(약 30 ㎎ 단백질/ℓ(배양 상청액))을 갖는 것을 나타낸다. 대다수의 단백질은 62 kDa의 분자량을 나타내며, 이는 단량체 또는 이량체에 대하여 예상되는 것 사이이다. 단백질의 응집 상태를 확인하기 위하여, CR6261, CR9114 및 CR8020으로부터 유래한 Fab-단편의 존재하에 SEC-MALS 실험을 반복하였다. 결과는 표 8 요약되어 있다.
결과는 가용성 형태의 폴리펩티드 s127H1-t2가 CR6261 및 CR9114로부터의 Fab 단편의 존재하에 복합체를 형성하지만, CR8020으로는 그렇지 않은 것을 보여준다(SEC 크로마토그램에서 피크의 이동에 의해 증명되는 바와 같음). CR6261 및 CR9114가 그룹 1로부터 유래한 HA에 결합하는 한편, CR8020이 그렇지 않기 때문에, 이것은 Fab 단편의 결합 반응의 특이성과 일치한다. 복합체의 크기는 표 s에 열거되어 있으며, 폴리펩티드 s127H1-t2가 1 내지 2개의 Fab 단편에 결합하는 것을 나타내며, 이는 정제된 폴리펩티드 s127H1-t2의 집단 중 적어도 일부가 이량체 형태로 존재하는 것을 나타낸다.
폴리펩티드 127H1-t2 및 mAb의 CR6261 및 CR9114 간의 결합 반응을 추가로 분석할 뿐 아니라, CR6261 및 CR9114의 형태 에피토프의 존재를 확인하기 위하여, 이들 항체와 정제된 단백질의 복합체화를 바이오층 간섭법(Octet Red384, Forte Bio)에 의해 연구하였다. 이를 위하여, 비오티닐화 CR6261, CR9114 및 CR8020을 스트렙트아비딘 코팅된 센서에 고정화시키고, 이후에 먼저 정제된 폴리펩티드의 용액에 노출시켜, 회합률을 측정한 다음 세척 용액에 노출시켜, 해리율을 측정하였다.
고정화된 CR6261 및 CR9114는 둘 모두 가용성 형태의 127H1-t2로의 노출 후의 명백한 반응에 의해 입증되는 바와 같이 인식한다. 결과적으로, 폴리펩티드 s127H1-t2는 다량으로 생성되며, 광범위 중화 모노클로널 항체 CR6261 및 CR9114에 높은 친화성으로 결합할 수 있으며, 이는 이러한 스템 도메인 폴리펩티드에서의 상응하는 중화 에피토프의 존재를 확인시켜 준다. 폴리펩티드는 이량체 구조를 형성하는 경향을 갖는다.
실시예 3: 본 발명의 이황화물 안정화된 삼량체
백신 내의 면역원 상의 중화 에피토프의 제시를 개선하기 위한 하나의 방식은 단량체 면역원 사이에 추가의 상호작용을 조작하여, 단량체에 비하여 증가된 안정성을 갖는 다량체 종을 생성하는 것이다. 이러한 방법의 단점은 단량체 면역원을 함께 제공함으로써 중요한 에피토프가 잠재적으로 다음의 프로토머에 의해 차폐될 수 있다는 점이다. 따라서, 이를 피하기 위해 주의를 기울여야 한다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 폴리펩티드는 인플루엔자의 헤마글루티닌 분자로부터 유래한다. 이러한 분자는 바이러스 막 상의 그의 고유 상태가 삼량체이다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 중화 mAb CR6261 및 CR9114의 에피토프를 노출시키면서, 용액 중에서 안정적인 삼량체를 형성하는 변형된 본 발명의 폴리펩티드를 기재한다.
본 발명의 삼량체 폴리펩티드를 생성하기 위하여, 특히, 삼량체에서 개별 단량체 간의 공유적 이황화 가교를 생성하는데 집중하여, HA-스템 기반의 폴리펩티드의 단량체 종의 삼량체화를 촉진시키는 상호작용의 안정화를 설계하였다. 이를 위하여, 절단되지 않은 상태의 H1N1 A/South Carolina/1./18(PDB 1RD8) 및 H1N1 A/California/04/2009(PDB: 3LZG)로부터의 FL HA의 3차원 구조를 분석하여, 다른 단량체의 근접성 및 단백질의 형태적 특징이 잠재적으로 단량체 사이의 이황화 가교의 형성을 가능하게 할 수 있는 영역을 확인하였다. 잔기-사이 거리가 3.5 Å 미만인 11쌍의 잔기를 확인하였다(표 9). 각 쌍에 있어서, 잔기가 삼량체 구조에서 상이한 프로토머(단량체) 상에 위치하는 것을 보장하기 위하여 주의하였다. 이황화 가교의 형성을 통해 공유적으로 연결되는 삼량체 폴리펩티드를 형성하기 위한 의도로, 폴리펩티드 127H1-t2(SEQ ID NO: 160 내지 170) 및 55G7-t2(SEQ ID NO: 149 내지 159)에서 이들 잔기의 등가물(서열 정렬로부터 결정시)을 시스테인으로 돌연변이시켰다. 삼량체 HA 분자의 3-폴드 대칭을 고려하여, 성공적인 설계에 의해, 3개의 프로토머 사이 이황화 가교의 형성을 야기하여, 삼량체에서의 단량체의 각각을 2개의 다른 단량체에 공유적으로 연결하였다.
설계된 이황화 가교 및 CR9114 및 CR6261의 중화 에피토프의 존재에 대하여 시험하기 위하여, 가용성 형태의 설계된 폴리펩티드를 HEK293F 세포에서 발현시켰다. SEQ ID NO: 149 내지 170으로부터 잔기 530 내지 565(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)의 등가물을 결실시켜, 폴리펩티드 SEQ ID NO: 171 내지 192를 생성함으로써 가용성 형태를 생성하였다. 추가의 서열 EGRHHHHHHH(SEQ ID NO: 19)를 C-말단에 첨가하여, 실제로 7개의 히스티딘 정제 태그 앞에 인자 X 단백질 가수분해 절단 부위를 도입하여, 정제 및/또는 검출을 촉진시켰다.
폴리펩티드를 생성하기 위하여, HEK293F 세포(인비트로겐(Invitrogen))를 300 g에서 5분 동안 회전 침강시키고, SF250 플라스크마다 30 ㎖의 사전-가온된 프리스타일™ 배지에 재현탁화시킴으로써 1.0* 106 vc/㎖을 씨딩하였다. 이러한 배양물을 멀티트론(multitron) 인큐베이터에서 37℃, 10% CO2, 110 rpm에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후에, 플라스미드 DNA를 1 ㎖ 옵티멤 배지 중에 30 ㎖ 배양 부피에서 1.0 ㎍/㎖의 농도로 피펫팅하였다. 병행하여, 44 ㎕의 293펙틴®을 1 ㎖의 옵티멤 배지 중에 피펫팅하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후에, 플라스미드 DNA/옵티멤 믹스를 293펙틴®/옵티멤 믹스에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 플라스미드 DNA/293펙틴® 믹스를 세포 현탁액에 적가하였다. 트랜스펙션된 배양물을 멀티트론 인큐베이터에서, 37℃, 10% CO2 및 110 rpm에서 인큐베이션시켰다. 제7일에, 세포를 원심분리(3000 g에서 30분)에 의해 배양 배지로부터 분리하는 한편, 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 추가의 처리를 위하여 0.2 ㎛ 바틀 탑(bottle top) 필터에 대하여 여과하였다.
배양 배지를 수집하고, 광범위 중화 항체 CR9114의 2개 이상의 에피토프를 제시하는 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재에 대하여 샌드위치 ELISA에서 분석하였다. 먼저, CR9114 코팅된 플레이트를 사용하여, 발현된 폴리펩티드를 배양 배지로부터 직접 포획하였다. 두 번째로, HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘과 조합된 비오티닐화 CR9114를 CR9114 포획된 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 위해 사용하였다. 대조군으로서, 삼량체 및 단량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 정제된 가용성 전장 HA를 검정에 포함시켰다(도 2a). 결과는 도 2에 나타나 있다.
삼량체 전장 HA는 낮은 희석률에서 명백한 신호를 보이지만, 대략 0.0001 ㎍/㎖ 이하의 농도에서 이러한 신호는 더 이상 검출 가능하지 않다(도 2a). 단량체 전장 HA에 있어서, 낮은 희석률에서 또한 신호가 관찰되지만, 세기는 훨씬 더 낮고, 신호는 대략 0.02 ㎍/㎖ 이하에서 더 이상 검출 가능하지 않다. 아마도, 신호는 정제 동안 단량체로부터 분리될 수 없거나 시간에 따라 단량체로부터 형성되는 일부 잔류 삼량체에 의해 야기된다. 가용성 형태의 H1 미니2-클러스터1+5+6-GCN4(SEQ ID NO: 52)(도 2a) 및 127H1(SEQ ID NO: 55)(도 2b)만이 낮은 세기의 신호를 보이며, 이는 용액 중 CR9114의 에피토프를 나타내는 저농도의 다량체 폴리펩티드 또는 그의 부재를 나타낸다. 가용성 형태의 127H1-t2(SEQ ID NO: 81)(도 2b)는 이러한 검정에서 명백한 반응을 나타내며, 이는 일부 다량체 종이 존재하지만, 관찰되는 신호의 세기가 전장 HA 삼량체에 비하여 낮은 것을 나타낸다.
추가의 시스테인이 도입되는 55G7-t2에 기반하는 가용성 폴리펩티드에 대한 결과는 도 2c에 나타나 있다. 대부분의 펩티드에 있어서, 신호가 관찰되지 않거나, 오직 매우 낮은 신호만이 관찰되며, 이는 CR9114의 에피토프를 제시하는 다량체 종이 배양 배지에 존재하지 않는 것을 나타낸다. 주목할 만한 예외는 폴리펩티드 s55G7-t2-cl18long(SEQ ID NO: 175; 위치 411 및 419에 추가의 시스테인이 도입; 넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)이다. 검출 가능한 반응을 보이는 유일한 다른 폴리펩티드는 s55G7-t2-cl14long(SEQ ID NO: 171; 위치 423 및 424에 추가의 시스테인이 도입)이지만, 신호는 더 낮고, 보다 낮은 희석률에서 소멸된다.
127H1-t2를 기반으로 한 폴리펩티드에 대한 결과는 도 2d에 나타나 있다. 이와 같은 경우에, 폴리펩티드 s127H1-t2-cl14long(SEQ ID NO: 182; 위치 423 및 424에 추가의 시스테인), s127H1-t2-cl15long(SEQ ID NO: 183; 위치 430 및 431에 추가의 시스테인), s127H1-t2-cl17long(SEQ ID NO: 185; 위치 405 및 429에 추가의 시스테인) 및 s127H1-t2-cl24long(SEQ ID NO: 191; 344 및 467에 추가의 시스테인), 및 더 낮은 정도로 s127H1-t2-cl19long(SEQ ID NO: 187; 38 및 390에 추가의 시스테인) 및 s127H1-t2-cl23long(SEQ ID NO: 190; 342 및 460에 추가의 시스테인)에 대하여 명백한 반응이 관찰된다. 낮지만 검출 가능한 반응이 s127H1-t2-cl16long(SEQ ID NO: 184; 404 및 433에 추가의 시스테인)에 대하여 관찰된다. 그러나 55G7-t2의 경우에서와 같이, 위치 411 및 419에 추가의 시스테인이 도입된 변이체 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)에 대하여 최적의 결과가 수득된다.
추가의 시스테인이 있는 본 발명의 폴리펩티드를 더욱 특성화하기 위하여, 배양 상청액을 해당 분야에 널리 확립된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 검출 목적을 위하여, H1N1 (A/California/04/2009)의 HA-단백질에 대하여 유도된 폴리클로널 항체를 사용하였다. 비환원 조건하의 삼량체에 있어서, 즉, 이황화 가교가 무손상인 경우, 약 90 kDa 이상(글리코실화의 정도에 따름)에서의 단백질 밴드가 예상되는 한편, 환원 조건하에, 35 kD(본 발명의 글리코실화 단량체 폴리펩티드에 상응)에 근접한 밴드가 예상된다. 결과는 도 3a 및 도 3b에 나타나 있다. 추가의 시스테인 함유 55G7-t2의 변이체에 있어서, 환원 조건하에서 s55G7-t2-cl18long 및 s55G7-t2-cl22long에 대하여 강력한 신호가 관찰되며, s55G7-cl14long에 대하여 더 낮은 정도의 신호가 관찰된다. 비환원 조건하에서, 100 kDa 초과의 상이한 크기의 단백질의 스미어(smear)가 s55G7-t2-cl18long 및 s55G7-t2-cl22long에 대하여 관찰되었으며, 이는 공유적으로 교차-결합된 스템 도메인 폴리펩티드가 이들 시료에 존재하는 것을 나타낸다. s55G7-cl14long에 대해서도 또한 스미어가 관찰되지만, 세기는 s55G7-cl18 및 s55G7-cl22에 대하여 관찰되는 것보다 더 낮다.
환원 조건하에서 127H1-t2로부터 유래한 추가의 시스테인 함유 폴리펩티드의 웨스턴 블롯에 대한 결과(도 3c)는 s127H1-t2-cl14long, s127H1-t2-cl15long, s127H1-t2-cl16long, s127H1-t2-cl17long 및 s127H1-t2-cl18long에 대하여 강력한 신호를 나타낸다. s127H1-t2-cl17long 및 s127H1-t2-cl18long에 있어서, 100 kDa에 근접한 정의된 단백질 밴드가 비환원 조건하에서 관찰되며(도 3d), 이는 공유적으로 교차-결합된 스템 도메인 폴리펩티드를 나타낸다. 또한, 폴리펩티드 s127H1-t2-cl14long 및 s127H1-t2-cl15long는 웨스턴 블롯에서 100 kDa 근처에 조금의 세기를 보이지만, 신호는 s127H1-t2-cl17long 및 특히 s127H1-t2-cl18long에 대해서만큼 강력하지 않다. 이러한 작제물에서 이황화 가교(cl18)는 도 4에 나타낸 바와 같이 하나의 단량체의 B-루프를 다른 단량체의 CD-헬릭스의 상측에 연결시키며, 55G7-t2 및 127H1-t2의 백그라운드 둘 모두에서 가장 강력한 결과를 제공한다.
문헌[Lu et al (PNAS 2013)]에는 다수의 단량체 사이 이황화 가교를 함유하는 HA 스템 도메인 폴리펩티드가 기재되어 있다. 그들의 작제물은 에스케리키아 콜라이 기반의 무세포 시스템에서 생성되며, 본 명세서에 기재된 단백질과 대조적으로, 비폴딩된 단백질이며, 다시 폴딩될 필요가 있다. 루(Lu) 등에 의한 스템 기반의 폴리펩티드는 C-말단에 폴드온 삼량체화 도메인을 함유하며, 단량체는 다수의 이황화 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 기재된 이황화 결합은 폴드온 삼량체화 도메인 내에 또는 HA-스템 폴리펩티드의 HA 유래 부분에 위치한다. 폴리펩티드의 HA 유래의 부분에서의 4개의 잠재적인 이황화 결합이 기재되어 있으며, 이는 위치 423 및 424(클러스터 14), 및 430 및 431(클러스터 15)에서의 시스테인을 포함한다. 기재된 스템 도메인 폴리펩티드에서, 위치 430 및 431(클러스터 15)에서의 시스테인에서 최적의 결과가 수득되지만, 삼량체화는 위치 423 및 424(클러스터 14)에서의 시스테인에 대해서도 또한 관찰할 수 있었다. 둘 모두의 경우에, 추가의 이황화 가교는 C-말단 폴드온 도메인에 존재하였다. 놀랍게도, 본 명세서에서 결과는 이황화 결합된 C-말단 삼량체화 도메인의 부재하에, 위치 411 및 419에서의 시스테인을 통해 2개의 상이한 단량체를 공유적으로 연결하는 조작된 이황화물이 보다 더 많은 양의 삼량체 스템 도메인 폴리펩티드를 야기하는 것을 보여준다. 결론적으로, 본 발명자들은 전략적으로 배치되는 이황화물 쌍의 도입이 HA 스템 기반의 폴리펩티드의 다량체화를 야기할 수 있음을 밝혀냈다. 특히, 위치 411 및 419(클러스터 18)에서의 시스테인의 동시의 도입은 웨스턴 블롯 및 샌드위치 ELISA 결과로부터 입증되는 바와 같이, 용액 중 다량체 종의 형성을 야기한다.
실시예 4: 본 발명의 삼량체 폴리펩티드의 정제 및 특성화
본 발명의 폴리펩티드 127H1-t2-cl18을 더욱 특성화하기 위하여, 단백질을 정제하였다. 정제를 용이하게 하기 위하여, 단백질의 C-말단에서 막횡단 및 시토졸 도메인을 상기 기재된 바와 같이 제거하여, 가용성 버전의 단백질을 생성할 수 있다. 생성 동안 단백질의 수송을 유도하는 리더 서열(또는 신호 서열)(SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 17에 상응)이 분비되는 최종 폴리펩티드에 존재하지 않을 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명의 가용성 폴리펩티드의 비제한적인 예는 s127H-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)이다.
본 발명의 폴리펩티드의 고도로 순수한 제제를 수득하기 위하여, HEK293F 세포를 당업계에 널리 확립되어 있는 프로토콜에 따라 추가의 C-말단 his 태그 서열(EGRHHHHHHH)을 함유하는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)을 암호화하는 유전자를 함유하는 발현 벡터 pcDNA2004로 트랜스펙션시키고, 7일 동안 배양하였다. 정제 목적을 위하여, 300 ㎖의 배양 상청액을 세척 완충제(20 mM TRIS, 500 mM NaCl, pH 7.8)에서 사전-평형화된 5 ㎖ His Trap 컬럼에 적용하였다. 세척 완충제 중 10 mM 이미다졸을 사용한 세척 단계 후에, 본 발명의 결합된 폴리펩티드를 세척 완충제 중 단계식 기울기의 300 mM 이미다졸로 용리시켰다. 용리 피크를 수집하고, 완충제 교환하고, 농축시키고, 추가의 정제를 위해 크기 배제 컬럼에 적용하였다(Superdex 200). 용리 프로파일이 도 5a에 나타나 있으며, 도면에 나타낸 바와 같이 분획 1 내지 4를 수집하고, SDS-PAGE(도 5b), NATIVE PAGE(도 5c) 및 웨스턴 블롯(도 5d)에 의해 분석하였다.
SDS PAGE는 비환원 조건하에서, 분획 2 및 3에 대하여 본 발명의 공유 결합된 삼량체 폴리펩티드에 대하여 예상되는 바와 같은 100과 150 kD 사이에서 명백한 밴드를 보이는 한편, 분획 4는 본 발명의 단량체 폴리펩티드에 대하여 예상되는 크기에 근접한 37 kD 근처에 집중된 확산 밴드를 보인다. 크기의 변이는 폴리펩티드의 글리코실화의 정도의 변이로부터의 결과이며, HA로부터 유래된 다른 스템 도메인 폴리펩티드에 대하여 관찰된다. 이황화 가교의 환원시에, 분획 3에서 주요 밴드는 분획 4에 대하여 관찰되는 밴드와 매우 유사하게 약 37 kD로 이동하며, 이는 환원이 단량체화를 야기하는 것을 나타낸다. 분획 2에 있어서, 이동은 명백하게 식별될 수 없었다. 분획 1은 명백한 주요 밴드 없이 다양한 크기의 단백질을 보인다.
Native PAGE(비환원 조건)는 분획 3 및 4에서 단백질 사이의 크기의 명백한 차이를 보이며, 주요 밴드는 각각 146 내지 240 kD 및 66 kD 미만이었다. 분획 2에 있어서, 146 내지 240 kD의 약한 신호가 관찰되는 한편, 분획 1에 대하여 단백질이 검출될 수 없으며, 이는 아마도 큰 응집물의 형성 때문일 것이다.
검출을 위한 폴리클로널 항-His를 사용한 웨스턴 블롯 데이터(비환원 조건)에 의해, 명백한 밴드가 100과 150 kD 사이에 관찰되기 때문에, 분획 3에서 주요 밴드가 히스티딘 태깅된 물질임이 확인된다. 분획 2에 있어서, 예상되는 삼량체의 크기 근처에서 약한 신호가 관찰되지만, 보다 고차의 올리고머도 또한 검출되는 한편, 분획 4에 있어서, 약한 확산 신호가 37 kD 근처에서 관찰된다. 이들 데이터는 분획 2, 3 및 4에서 주요 밴드가 H1 HA로부터 유래되는 것을 확인시켜준다. 분획 1에서 단백질에 대하여 신호가 관찰되지 않았다.
CR6261, CR9114 및 CR8020의 중화 에피토프의 존재를 his-태깅된 본 발명의 폴리펩티드를 포획하기 위한 항-His-태그 모노클로널 항체의 코팅을 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다. 실험하에 mAb의 결합 후에, 서양고추냉이 퍼옥시다제에 컨쥬게이트된 이차 항체를 검출을 위해 사용하였다. 대조군으로서, 단량체 및 삼량체 전장 H1 HA(항원) 및 H1 HA에 대해 유도된 폴리클로널 혈청(검출용)을 포함시켰다. 결과는 도 6에 나타나 있다. mAb CR6261 및 CR9114로의 결합이 분획 2, 3 및 4에 대해서뿐 아니라 단량체 및 삼량체 FL HA에 대하여 명백하게 관찰된다. 분획 1에 있어서, CR9114 결합에 대하여 오직 약한 신호만이 검출되고, CR6261로의 결합에 대하여 거의 어떠한 신호도 검출되지 않는다. 어느 분획에서도, CR8020(그룹 2로부터의 HA에 특이적인 mAb)로의 결합이 관찰되지 않는다. 단량체 FL HA는 폴리클로널 항-H1 HA에 의해 인식되지만, 삼량체 FL HA에 대한 반응은 아마도 단량체에 비하여 삼량체에서 에피토프의 일부의 폐색으로 인하여, 훨씬 더 낮다. 분획 3(SDS-PAGE에서 삼량체) 및 분획 4(SDS-PAGE에서 단량체)의 결과 사이에 유사한 패턴이 관찰되며, 이는 분획 3에서의 용액 중 잘 폴딩된 삼량체 형태의 본 발명의 폴리펩티드의 존재와 일치한다.
또한, 분획 1 내지 4를 CR9114 샌드위치 ELISA에서 시험하여, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 다량체 폴리펩티드를 검출하였다(도 7 참조). 비교를 위하여, 단량체 및 삼량체 FL HA를 다시 실험에 포함시켰다. 분획 3은 삼량체 형태의 본 발명의 폴리펩티드와 일치하게, 삼량체 FL HA와 매우 유사한 반응을 나타내는 한편, 분획 2 및 4에 대한 반응은 단량체와 삼량체 FL HA 사이의 중간이다.
CR6261, CR9114 및 CR8020의 Fab 단편과 s127H1-t2-cl18long 간의 복합체 형성을 다중각 광 산란과 조합된 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 연구하여, 분획 3에서 단백질에 대한 분자량을 추정하였다(SEC-MALS)(도 8). 결과는 분획 3에 존재하는 폴리펩티드가 약 110 kD의 분자량을 갖는 것을 보여주며, 이는 삼량체의 형성과 비슷하다(글리코실화를 배제한 아미노산 서열을 기반으로 한 계산된 단량체 분자량은 29.2 kD임). 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long는 CR6261 및 CR9114로부터의 Fab 단편의 존재하에 복합체를 형성하지만(SEC 크로마토그램에서 피크의 이동에 의해 입증된 바와 같음), CR8020에서는 그렇지 않다. 이것은 Fab 단편의 결합 반응의 특이성과 일치하는데, CR6261 및 CR9114가 그룹 1로부터 유래된 HA의 것에 결합하는 한편, CR8020이 그렇지 않기 때문이다. 형성된 복합체의 크기는 각각 CR6261 및 CR9114의 Fab 단편을 사용하여 약 215 및 248 kD이며, 폴리펩티드 127H1-t2-cl18이 3개의 Fab 단편에 결합할 수 있음을 나타낸다(3개의 Fab 단편과의 복합체의 삼량체에 대하여 예상되는 분자량은 약 250 kD이며; SEC-MALS 실험으로부터 유래되는 바와 같은 분자량은 표 10에 요약되어 있다).
실시예 5: 본 발명의 폴리펩티드의 특성화
본 발명의 폴리펩티드 127H1-t2-cl18과 mAb의 CR6261 및 CR9114 간의 결합 반응을 더욱 분석하고, CR6261 및 CR9114의 형태 에피토프의 존재를 재확인하기 위하여, 정제된 단백질과 이들 항체의 복합체화를 바이오층 간섭법에 의해 연구하였다(Octet Red384, Forte Bio). 이를 위하여, 비오티닐화된 CR6261, CR9114 및 CR8020을 스트렙트아비딘 코팅된 센서 상에 고정화시킨 후에, 이를 먼저 정제된 본 발명의 폴리펩티드 127H1-t2-cl18의 용액에 노출시켜, 회합률을 측정한 다음, 세척 용액에 노출시켜, 해리율을 측정하였다. 결과는 도 9에 나타나 있다.
고정화된 CR6261 및 CR9114는 둘 모두 가용성 형태의 127H1-t2-cl18로의 노출 후의 명백한 반응에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드를 인식한다(도 9a 및 도 9b). 결합 상호작용에 대한 해리 상수를 추정하기 위하여, 2배 희석 단계를 사용하여 적정을 수행하였다. 고정화된 CR6261 또는 CR9114를 함유하는 센서를 각각 10, 5, 2.5, 1.3 및 0.63, 0.31 및 0.16 nM의 농도의 가용성 s127H1-t2-cl18long 용액에 노출시키고, 6600초 후의 최종 반응을 기록하였다. 반응을 스템 도메인 폴리펩티드 농도의 함수로서 플롯팅하고, 정상 상태 결합 모델에 대한 핏팅을 수행하여, CR6261/스템 도메인 폴리펩티드 복합체에 대하여 0.7 nM 및 CR9114 복합체에 대하여 0.5 nM의 해리 상수 Kd를 제공하였다(도 9c 및 도 9d).
결론적으로, 본 발명의 폴리펩티드 127H1-t2-cl18은 높은 결합력으로 광범위 중화 모노클로널 항체 CR6261 및 CR9114에 결합할 수 있는 공유적 삼량체를 형성하며, 이는 이러한 스템 도메인 폴리펩티드에서의 상응하는 중화 에피토프의 존재를 확인시켜 준다. 용액에서의 결합 반응의 화학량론은 1:3이며, 이는 중화 에피토프가 삼량체의 각각의 개별 단량체에 존재하는 것을 나타낸다.
실시예 6: 치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 인플루엔자 시험감염 모델에서 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 8 내지 14마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2-cl18long를 사용하여 3주 간격으로 1, 2 및 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 25xLD50 이종 시험감염 바이러스(H1N1 A/Puerto Rico/8/34)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수). 사전-시험감염 혈청(최종 면역화 4주 후에 수득)을 면역화를 위해 사용되는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로의 결합에 대하여(정확한 면역화를 확인하기 위함), 가용성 H1N1 A/Brisbane/59/07 전장 HA로의 결합에 대하여(전장 HA의 인식을 입증하기 위함), 그리고 전장 HA로의 결합을 위한 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR9114와의 경쟁에 대하여(유도되는 항체가 광범위 중화 CR9114 에피토프와 매우 근접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위함) ELISA 검정에서 시험하였다. 결과는 도 10 내지 도 15에 나타나 있다.
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 7일 후에 감염에 굴복하는 한편 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 10a). s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로 1회 면역화시킨 10마리의 마우스 중 9마리가 치명적인 시험감염을 견뎌냈으며, 2회 또는 3회의 면역화 후에 모든 마우스가 생존하였다(도 11). 또한, 2회 또는 3회 면역화시킨 동물에 대하여 체중 감소가 무시해도 될 정도였으며(도 12), 임상 징후가 관찰되지 않거나(2 또는 3회) 최소의 임상 징후가 관찰되었다(1회)(도 13). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 체중 감소의 축소 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로 면역화시킨 모든 그룹에 대하여 관찰되었다.
항원으로서 s127H1-t2-cl18long(도 14a) 또는 가용성 전장 HA(도 14b)를 사용한 최종 면역화 후 4주의 사전-시험감염 시점으로부터의 ELISA 데이터는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long이 면역원성이며, 2회 및 3회 면역화 후에 수준이 실질적으로 더 높지만, 심지어 1회의 면역화 후에도 전장 HA를 인식할 수 있는 항체를 유도하는 것을 나타낸다.
면역화에 대한 면역학적 반응을 더욱 이해하기 위하여, 경쟁 결합 ELISA를 수행하였다. 이를 위하여, 플레이트 결합된 전장 HA를 단계 희석된 혈청 시료와 인큐베이션시킨 후에, 소정의 적정된 농도의 CR9114-비오틴을 첨가하였다. 추가의 인큐베이션 후에, 당업계에 널리 공지된 프로토콜에 따라 스트렙트아비딘-컨쥬게이트된 서양고추냉이 퍼옥시다제를 사용하여 결합된 CR9114-비오틴의 양을 정량화시켰다. 데이터를 로그 희석에 대한 OD의 로버스트 선형 회귀를 사용하여 분석하고, '기울기 OD'(ΔOD/10 배수 희석)로 표현하였다. 데이터는 광범위 중화 항체 CR9114와의 결합을 위해 경쟁할 수 있는 항체의 수준이 보강된 본 발명의 폴리펩티드를 사용한 면역화에 의해 유도되는 것을 보여준다. 2회의 면역화 후에, 상기 수준은 명백하게 백그라운드 초과이며, 그들은 제3 면역화 후에 계속 상승한다(도 15, 상측). 비교로서, 비표지된 CR9114(즉, 자가-경쟁) 및 둘 모두 5 ㎍/㎖ 출발 농도로부터 단계 희석된 비-결합 모노클로널 항체 CR8020에 의해 유도되는 수준이 개별 그래프에 나타나 있다(도 15, 하측).
결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)로의 면역화가 심지어 단일의 회차의 면역화 후에도 마우스를 인플루엔자로의 치명적인 감염에 대해 보호할 수 있음을 보여주었다. 폴리펩티드는 면역원성이고, 전장 HA에 결합할 수 있는 항체를 유도한다. 유도된 항체의 적어도 일부는 모노클로널 항체 CR9114의 광범위 중화 에피토프의 에피토프에 또는 그 가까이에 결합한다.
실시예 7: 치명적인 이종아형 H5N1 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 H5N1 인플루엔자 시험감염 모델에서, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 8 내지 12마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2-cl18long를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 mg/kg)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 이종아형 시험감염 바이러스(H5N1 A/Hong Kong/156/97)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수). 결과는 도 16에 나타나 있다.
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 후 8 내지 10일에 감염에 굴복하는 한편 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 16a). s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로 면역화시킨 10마리 중 10마리의 마우스는 치명적인 시험감염을 견뎌냈다(도 16b). 또한, 체중 감소는 이들 동물에 대하여 무시해도 될 정도이고(도 16c), 추적 기간 동안 임상 증상이 관찰되지 않았다(도 16d). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 체중 감소의 축소 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰된다.
결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)로의 면역화가 이종아형 H5N1 인플루엔자 균주로의 치명적인 감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8: 본 발명의 폴리펩티드로의 면역화를 통해 유도되는 혈청의 결합의 폭의 평가
실시예 6에 기재된 바와 같은 결과는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)가 면역원성이며, 본 발명의 폴리펩티드의 설계를 위한 기본으로 사용되는 균주로부터의 FL HA를 인식할 수 있는 항체를 유도할 수 있음을 나타낸다. 또한, 실시예 7에 기재된 바와 같이 3회 면역화시킨 마우스로부터의 혈청을 당업계에 널리 공지된 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 다수의 다른 그룹 1(H1, H5 및 H9) 및 그룹 II(H3 및 H7) 인플루엔자 균주로부터의 전장 HA에 대한 결합에 대하여 시험하였다(도 17). 결과는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로 유도된 항체가 FL HA의 고유 서열에 존재하는 에피토프를 효율적으로 인식하고, 항체가 결합하는 에피토프가 상이한 그룹 1(특히, H1, H5 및 H9) 및 심지어 일부 그룹 2 인플루엔자 균주(예를 들어, H7) 중에 보존되는 것을 입증한다.
실시예 9: 치명적인 H1N1 A/Brisbane/59/2007 인플루엔자 시험감염 모델에서의 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능의 평가
치명적인 H1N1 인플루엔자 시험감염 모델에서, 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)의 보호 효능을 더욱 평가하기 위하여, 8 내지 18마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 정제된 s127H1-t2-cl18long를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델을 위한 양성 대조군으로서, 광범위 중화 항체 모노클로널 항체 CR6261(15 mg/kg)을 시험감염 1일 전에 정맥내 투여하는 한편, PBS로의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다. 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스(H1N1 A/Brisbane/59/2007)로 시험 감염시키고, 3주 동안 매일 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
결과는 PBS 대조군에서의 모든 마우스가 시험감염 후 7 내지 10일에 감염에 굴복하는 한편, 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 전 1일)이 완전히 보호되기 때문에, 실험이 유효한 것을 보여준다(도 18a). s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로 면역화시킨 10마리 중 10마리의 마우스는 치명적인 시험감염을 견뎌냈다(도 18b). 또한, 체중 감소는 감염 후 평균 4일에 약 10%이지만(도 18c), 동물은 10일 내에 완전히 회복한다. 또한, 임상 증상은 감염 후 4일에 피크에 달하지만, 감염 후 9일부터 계속 부재한다(도 18d). PBS 대조군에 비하여, 통계적으로 유의미한 증가된 생존비, 증가된 생존 시간, 체중 감소의 축소 및 감소된 임상 점수가 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long로 면역화시킨 그룹에 대하여 관찰된다.
결론적으로, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로의 면역화가 H1N1 A/Brisbane/59/2007로의 치명적인 감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여주었다.
실시예 10: 본 발명의 폴리펩티드로 면역화시킨 마우스의 혈청에서의 인플루엔자 중화 항체의 존재의 평가
인플루엔자에 대한 보호에서 역할을 수행하는 항체-매개의 이펙터 메커니즘을 더욱 조사하기 위하여, 사전-시험감염 혈청을 하기 기재된 바와 같은 H5N1 A/Vietnam/1194/04로부터 유래된 유사입자를 사용하여 유사입자 중화 검정(문헌[Alberini et al 2009])에서 시험하였다.
유사입자 중화 검정
FL HA를 발현하는 유사입자를 이전에 기재된 바와 같이 생성하였다(문헌[Temperton et al., 2007]). 소수의 변형과 함께, 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Alberini et al 2009]), 루시퍼라제 리포터 유전자를 암호화하는 H5 A/Vietnam/1194/04 유사입자를 사용한 HEK293 세포의 단일 회차의 형질도입을 사용하여 중화 항체를 결정하였다. 약술하면, 열-불활성화된(56℃에서 30분) 사전-시험감염 혈청 시료를 96-웰 편평 바닥 배양 플레이트에 3벌로, 성장 배지(2 mM L-글루타민(론자(Lonza)), 1% 비필수 아미노산 용액(론자), 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(론자) 및 10% FBS(이탈리아 페로 소재의 유로클론(Euroclone))가 보충된 EBSS(스위스 바젤 소재의 론자)가 있는 MEM 이글(Eagle))에 3배 단계 희석하고, 적정된 수의 H5 A/Vietnam/1194/04 유사입자(감염 후 106 상대 발광 단위(RLU) 제공)를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 1시간 인큐베이션 후에, 웰마다 104개의 HEK293 세포를 첨가하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 인큐베이션 후에, 루시퍼라제 기질(브리텔리에 플러스(Britelie Plus), 매사추세츠주 월섬 소재의 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))을 첨가하고, 제조처의 지침에 따라 발광측정기(미트라스(Mithras) LB 940, 독일 소재의 버솔드 테크놀로지즈(Berthold Technologies))를 사용하여 발광을 측정하였다.
실시예 6, 7 및 8에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)로 면역화시킨 동물로부터 수득된 사전 시험감염 혈청은 유사입자 중화 검정을 사용하여 높은 혈청 농도에서 검출 가능한 중화를 보였다(도 19). 이것은 면역원으로 사용되는 경우, 광범위 중화 항체를 유도하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 입증한다. 직접적인 바이러스 중화 외에, Fc-매개의 이펙터 메커니즘, 예를 들어, 항체 의존성 세포독성(ADCC) 및 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)은 실질적으로 인플루엔자에 대한 보호에 기여하며, 스템-유도 bnAb는 이들 메커니즘에 특히 효율적이다(문헌[DiLillo et al., 2014]). 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)으로의 면역화 후에 유도되는 항체가 ADCC를 유도할 수 있는지의 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 하기 기재된 바와 같이 마우스를 위해 조정된 ADCC 대용물 검정을 사용하여 사전-시험감염 혈청을 시험하였다(문헌[Parekh et al., 2012]; 문헌[A. Schnueriger et al ., 2012]; 문헌[Cheng et al 2014)]).
항체 의존성 세포독성( ADCC ) 대용물 검정
인간 폐 암종-유래 A549 상피 세포(ATCC CCL-185)를 37℃, 10% CO2에서, 10% 열 불활성화 우태아 혈청이 보충된 둘베코(Dulbecco) 변형 이글 배지(DMEM)에 유지하였다. 실험 2일 전에, A549 세포를 Opti-MEM(인비트로겐) 중 리포펙타민(Lipofectamine) 2000(인비트로겐)을 사용하여 H5 A/Hong Kong/156/97 HA 또는 H1 A/Brisbane/59/2007 HA를 암호화하는 플라스미드 DNA로 트랜스펙션시켰다. 검정 1일 전에, 트랜스펙션된 세포를 수집하고, ADCC를 위해 백색 96-웰 플레이트(코스타(Costar)에, 그리고 영상화를 위해 흑색 투명 바닥 96-웰 플레이트(비디 팔콘(BD Falcon))에 씨딩하였다. 24시간 후에, 시료를 검정 완충제(RPMI 1640(집코(Gibco)) 중 4% 극저 IgG FBS(집코)) 중에 희석하고, 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시킨 다음, 검정 완충제 중에 단계 희석하였다. ADCC 생물검정을 위하여, A549 세포를 신선한 검정 완충제로 다시 채우고, 항체 희석물 및 마우스 Fc 감마 수용체 IV(FcγRIV; 프로메가(Promega))를 발현하는 ADCC 생물검정 Jurkat 이펙터 세포를 세포에 첨가하고, 1:4.5의 표적-이펙터 비로 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 15분 동안 실온으로 평형화시킨 다음, Bio-Glo 루시퍼라제 시스템 기질(프로메가)을 첨가하였다. 10분 후에 발광을 시너지 네오(Synergy Neo)(바이오테크(Biotek))에서 판독하였다. 데이터를 혈청의 부재 하의 신호의 배수 유도로서 표현한다.
이러한 검정을 사용하여, 실시예 6, 7 및 8에 기재된 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)로 면역화시킨 동물로부터 수득한 사전-시험감염 혈청을 항원의 공급원으로서 H5N1 A/Hong Kong/156/97 또는 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로 트랜스펙션시킨 표적 세포를 사용하여 FcγRIV 신호전달 활성에 대하여 시험하였다(도 20). 둘 모두의 경우에, 시험한 가장 높은 혈청 농도에서 30 내지 40배 유도가 관찰되며, 이는 마우스에서의 ADCC/ADCP 이펙터 기능을 나타내는 FcγRIV 신호전달을 활성화시키는 항체를 유도하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 입증한다.
실시예 6 내지 9에 나타낸 이들 결과는 본 발명의 폴리펩티드 s127H1-t2l18long(SEQ ID NO: 186)의 능력이 스템-표적화, 중화 및 ADCC-매개 항체를 유도하고, 상동성, 이종 및 이종아형 그룹 I 인플루엔자 균주로의 치명적인 시험감염에 대하여 마우스를 보호할 수 있음을 보여준다.
실시예 11: H1N1 A/California/07/09로부터의 HA에 기반한 본 발명의 폴리펩 티드의 설계
실시예 1 내지 10은 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 HA에 기반한 본 발명의 폴리펩티드를 기재하고 있다. 또한, 유사한 폴리펩티드가 다른 인플루엔자 균주, 예를 들어, H1N1 A/California/07/09로부터의 다른 HA에 기반하여 설계될 수 있다. 그러므로 상기 요약된 절차에 따라, SEQ ID NO: 202 및 203에 기재된 본 발명의 폴리펩티드를 생성하였다.
실시예 12 : H1 균주로부터의 HA에 기반한 추가의 본 발명의 폴리펩티드의 설계
실시예 1 내지 11은 H1N1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1) 및 H1N1 A/California/07/09(SEQ ID NO: 252)로부터의 HA에 기반한 본 발명의 폴리펩티드를 기재하고 있다. 또한, 유사한 폴리펩티드가 다른 H1 인플루엔자 균주로부터의 HA에 기반하여 설계될 수 있으며, 이들도 또한 본 발명에 포함된다. 비제한적인 예는 H1N1 A/Texas/UR06-0526/07(SEQ ID NO: 205), H1N1 A/New York/629/95(SEQ ID NO: 206) 및 H1N1 A/AA_Marton/43(SEQ ID NO: 204)의 HA의 것이다. 그러므로 상기 요약된 절차에 따라, SEQ ID NO: 207 내지 216에 기재된 위치 411 및 419(클러스터 18)에서의 시스테인 사이에 조작된 이황화 가교를 함유하는 본 발명의 스템 도메인 폴리펩티드를 생성하였다. SEQ ID NO: 202, 203, 213 및 214는 SEQ ID NO: 8에 따른 B-루프를 생성하기 위하여 위치 415(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)에 도입되는 추가의 라이신 돌연변이를 함유하며; 이들도 또한 본 발명에 포함된다.
실시예 13: 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 특성화
설계된 이황화 가교 및 CR9114 및 CR6261의 중화 에피토프의 존재에 대하여 시험하기 위하여, 가용성 형태의 설계된 폴리펩티드를 HEK293F 세포에서 발현시켰다. SEQ ID NO: 202, 207, 209, 213으로부터 아미노산 잔기 530 내지 565(넘버링은 SEQ ID NO: 1을 언급함)의 등가물을 결실시켜, 각각 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203, 208, 210 및 214를 생성함으로써 가용성 형태를 생성하였다. 이들 서열은 다시 말하면, 리더 서열의 제거 후의 처리된 폴리펩티드의 형태를 설명하는 것이 주목된다. 추가의 서열 EGRHHHHHHH(SEQ ID NO: 19) 또는 SEQ ID NO: 208의 경우에, EGRHHHHHH를 C-말단에 첨가하여, 사실상 7 또는 6개의 히스티딘 정제 태그 앞에 인자 X 단백질 가수분해 절단 부위를 도입하여, 정제 및/또는 검출을 촉진시켰다.
폴리펩티드를 생성하기 위하여, HEK293F 세포(인비트로겐)를 300 g에서 5분 동안 회전 침강시키고, SF250 플라스크마다 30 ㎖의 사전 가온 프리스타일™ 배지에 재현탁화시킴으로써 1.0*106vc/㎖을 씨딩하였다. 이러한 배양물을 멀티트론 인큐베이터에서, 110 rpm에서 37℃, 10% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 후에, 플라스미드 DNA를 1 ㎖의 옵티멤 배지에서 30 ㎖ 배양 부피 중에 1.0 ㎍/㎖의 농도로 피펫팅하였다. 병행하여, 44 ㎕의 293펙틴®을 1 ㎖의 옵티멤 배지에서 피펫팅하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 5분 후에, 플라스미드 DNA/옵티멤 믹스를 293펙틴®/옵티멤 믹스에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 플라스미드 DNA/293펙틴® 믹스를 세포 현탁액에 적가하였다. 트랜스펙션된 배양물을 멀티트론 인큐베이터에서, 37℃, 10% CO2 및 110 rpm에서 인큐베이션시켰다. 제7일에, 세포를 원심분리(3000 g에서 30분)에 의해 배양 배지로부터 분리하는 한편, 본 발명의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 상청액을 추가의 처리를 위하여 0.2 ㎛ 바틀 탑 필터에 대하여 여과하였다.
배양 배지를 수집하고, 광범위 중화 항체 CR9114의 2개 이상의 에피토프를 제시하는 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재에 대하여 샌드위치 ELISA에서 분석하였다. 먼저, CR9114 코팅된 플레이트를 사용하여, 발현된 폴리펩티드를 배양 배지로부터 직접 포획하였다. 두 번째로, HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘과 조합된 비오티닐화 CR9114를 CR9114 포획된 본 발명의 폴리펩티드의 검출을 위해 사용하였다. 비교하기 위하여, 삼량체 및 단량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 정제된 가용성 전장 HA 및 정제된 삼량체 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)를 검정에 포함시켰다(출발 농도 5 ㎍/㎖). 결과는 도 21a에 나타나 있다.
삼량체 전장 HA는 낮은 희석률에서 명백한 신호를 보이지만, 6561 또는 그 이상(즉, 더 낮은 농도) 분의 1의 희석률에서, 이러한 신호는 더 이상 검출 가능하지 않다(도 21a). 단량체 전장 HA에 있어서, 신호가 또한 낮은 희석률에서 관찰되지만, 세기는 훨씬 더 낮고, 신호는 729분의 1의 희석률에서 더 이상 검출 가능하지 않다. 아마도, 신호는 정제 동안 단량체로부터 분리될 수 없거나 시간이 지남에 따라 단량체로부터 형성되는 일부 잔류 삼량체에 의해 야기된다. 추가의 C-말단 his 태그 서열(EGRHHHHHHH)을 함유하는 정제된 삼량체 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)(출발 농도 5 ㎍/㎖)도 또한 이러한 검정에서 명백한 신호를 초래하며, 이는 19683분의 1의 농도에서 검출 가능하지 않게 된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203, 208, 210 및 214를 함유하는 배양 배지는 이러한 검정에서 명백한 신호를 보이며, 이는 본 발명의 다량체 폴리펩티드의 존재를 나타낸다. 가장 강력한 반응이 A/California/07/09(SEQ ID NO: 203)로부터 유래된 폴리펩티드에 대하여 관찰된다. H1N1 A/AA_Marton/1943(SEQ ID NO: 214)으로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 관찰되는 검정에서의 더 약한 반응은 하기 기재된 배양 배지의 웨스턴 블롯으로부터의 결과로부터 입증되는 바와 같이 이러한 본 발명의 특정 폴리펩티드의 더 낮은 발현으로부터의 결과이다.
추가의 시스테인을 함유하는 본 발명의 폴리펩티드를 더욱 특성화하기 위하여, 배양 상청액을 당업계에 널리 확립된 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 검출 목적을 위하여, H1N1 (A/California/04/2009)의 HA-단백질에 대해 유도된 폴리클로널 항체를 사용하였다. 이황화 가교 삼량체에 있어서, 비환원 조건하에, 즉, 이황화 가교가 무손상인 경우, 약 90 kDa 이상(글리코실화의 정도에 따름)에서의 단백질 밴드가 예상되는 한편, 환원 조건하에, 35 kD(본 발명의 글리코실화 단량체 폴리펩티드에 상응)에 근접한 밴드가 예상된다. 도 22는 균주 H1N1 A/Texas/(SEQ ID NO: 208), H1N1 A/New York/629/95(SEQ ID NO: 210), H1N1 A/California/07/09(SEQ ID NO: 203) 및 H1N1 A/AA_Marton/1943(SEQ ID NO: 214)으로부터의 HA로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결과를 보여준다. 환원 조건하에서의 웨스턴 블롯은 모든 4개의 본 발명의 폴리펩티드가 비록 상이한 수준일지라도, 발현하는 것을 보여주며, 가장 높은 발현은 본 발명의 H1N1 A/California/07/09 유래 폴리펩티드(SEQ ID NO: 203)에 대해 관찰되며, 가장 낮은 발현은 H1N1 A/AA_Marton/1943 유래 폴리펩티드(SEQ ID NO: 214)에 대해 관찰된다. 이들 조건하에, 폴리펩티드는 추가의 C-말단 his 태그 서열(EGRHHHHHHH)을 함유하는 정제된 삼량체 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)와 유사하게 겔에서 단량체로서 전개된다. 비환원 조건하에, 본 발명의 삼량체 폴리펩티드의 존재를 나타내는 100 내지 150 kD의 밴드가 모든 본 발명의 폴리펩티드(s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186) 포함)에 대하여 관찰된다. H1N1 A/AA_Marton/1943(SEQ ID NO: 214)으로부터 유래된 폴리펩티드에 있어서, 단량체 밴드는 더 이상 가시적이지 않으며, 이러한 폴리펩티드의 더 낮은 발현으로 인해 낮은 세기일지라도, 삼량체에 대하여 예상되는 높이에서의 밴드가 나타난다. 또한, 약 75 kD에서 전개되는 이량체 형태가 관찰될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 개별 폴리펩티드의 글리코실화 정도의 변이로 인하여 크기가 다소 불균질하다.
CR6261 및 CR9114의 중화 에피토프의 존재를 더욱 확인하기 위하여, 배양 상청액을 ELISA에 의해 분석하였다. 먼저, 본 발명의 가용성 폴리펩티드 상의 his-태그에 대해 유도된 항체로 코팅된 플레이트를 사용하여, 발현된 폴리펩티드를 배양 배지로부터 직접 포획하였다. 두 번째로, CR9114 또는 CR6261을 첨가하고, HRP-컨쥬게이트된 염소 항-인간 항체를 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 CR9114 또는 CR6261의 검출을 위해 사용하였다. 양성 대조군으로서, 삼량체 및 단량체 형태의 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터의 정제된 가용성 전장 HA를 검정에 포함시켰다(도 21b, 도 21c). 또한, 음성 대조군으로서, 그룹 2로부터의 HA에 대해 특이적인 mAb CR8020을 사용하여 ELISA를 수행하였다. 결과는 도 21d에 나타나 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 CR9114 및 CR6261을 사용한 ELISA에서 명백한 반응을 보이며, 가장 높은 반응이 A/California/07/09(SEQ ID NO: 203)로부터 유래되는 폴리펩티드에 대하여 관찰된다. 또한, 정제된 가용성 전장 HA(단량체 및 삼량체 둘 모두)는 강력한 반응을 보인다. 예상되는 바와 같이, CR8020을 사용한 ELISA에서 반응이 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명의 폴리펩티드로의 CR6261 및 CR9114의 결합의 특이성을 확인시켜 준다.
결론적으로, 상기 결과는 상기 기재된 바와 같은 H1 HA 서열로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드가 삼량체 종을 형성하고, CR6261 및 CR9114의 중화 에피토프를 함유할 수 있는 것을 보여준다.
실시예 14: 인플루엔자 그룹 1 균주로부터의 HA에 기반한 본 발명의 추가의 폴리펩티드의 설계
실시예 1 내지 13에는 H1N1로부터의 HA에 기반한 본 발명의 폴리펩티드가 기재되어 있다. 또한, 다른 그룹 1 인플루엔자 균주로부터의 HA에 기반하여 유사한 폴리펩티드, 예를 들어, H2, H5 및 H9 HA를 함유하는 것들이 설계될 수 있다. 이들 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 균주의 비제한적인 예는 예를 들어, H2N2 A/Adachi/2/1957, H2N2 A/Singapore/1/1957, H5N1 A/Vietnam/1203/2004 및 H9N2 A/Hong Kong/69955/2008이다. 그러므로 상기 약술된 절차에 따라, SEQ ID NO: 218 내지 221, SEQ ID NO: 223 내지 226, SEQ ID NO: 228 내지 231 및 SEQ ID NO: 233 내지 236에 기재된 위치 411 및 419(클러스터 18)에서의 시스테인 사이에 조작된 이황화 가교를 함유하는 본 발명의 폴리펩티드를 생성하였다.
H5N1 A/Vietnam/1203/2004(SEQ ID NO: 227)로부터의 전장 HA가 융합 펩티드 서열 바로 앞의 SEQ ID NO: 227 내의 위치 341 내지 346에 다염기 절단 부위, 즉, 서열 RRRKTR을 함유하는 것이 주목되어야 한다. 본 발명의 폴리펩티드 228 내지 231에서, 다염기 절단 부위를 제거하고, 단일의 글루타민(Q) 잔기로 대체하여, 완전한 절단 부위를 제거하였다. 이들 서열도 또한 본 발명에 포함된다.
SEQ ID NO: 219, 221, 224 및 226은 위치 407 및 414 내지 416(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링; H2 서열에서, 위치 9, 10 및 139에서의 잔기가 SEQ ID NO: 1과 비교하여 결실되는 것을 주의)에 추가의 돌연변이를 함유하여, 시스테인인 잔기 418을 제외하고, SEQ ID NO: 8에 따른 B-루프 서열을 생성한다.
SEQ ID NO: 230 및 231은 위치 407(E407T) 및 415(N415S)(SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링)에 추가의 돌연변이를 함유한다. 이들 돌연변이는 시스테인인 잔기 418을 제외하고, SEQ ID NO: 8에 따른 B-루프 서열을 생성한다. SEQ ID NO: 236 및 236을 서열 MNTQYTAIGCEYNKSE(즉, 시스테인인 잔기 418을 제외하고, SEQ ID NO: 8에 따른 서열)를 함유하도록 더욱 변형시켰다.
실시예 15: 인플루엔자 그룹 2 균주로부터의 HA에 기반한 본 발명의 이황화 물 안정화된 삼량체의 설계
실시예 1 내지 14는 그룹 1 균주로부터의 HA에 기반한 본 발명의 폴리펩티드를 기재한 것이다. 이황화 교차-결합된 폴리펩티드도 또한 그룹 2로부터의 HA 서열, 예를 들어, H3 및 H7에 기반하여 설계될 수 있다. 이들 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 균주의 비제한적인 예는 예를 들어, H3N2 A/Hong Kong/1/1968 및 H7이다.
백신 내의 면역원 상의 중화 에피토프의 제시를 개선하기 위한 하나의 방식은 단량체 면역원 간의 추가의 상호작용을 조작하여, 단량체에 비하여 안정성이 증가된 다량체 종을 생성하는 것이다. 이러한 방법의 단점은 단량체 면역원을 함께 제공함으로써 중요한 에피토프가 잠재적으로 다음의 프로토머에 의해 차폐될 수 있다는 점이다. 따라서, 이를 피하기 위해 주의를 기울여야 한다.
본 명세서에서, 본 발명자들은 용액 중에서 안정적인 삼량체를 형성하면서, 중화 mAb CR8020 및 CR8043의 에피토프를 노출시키는 변형된 본 발명의 폴리펩티드를 기재한다.
본 발명의 삼량체 폴리펩티드를 생성하기 위하여, 특히, 삼량체에서 개별 단량체 사이의 공유적 이황화 가교를 생성하는데 집중하여, HA-스템 기반의 폴리펩티드의 단량체 종의 삼량체화를 촉진시키는 상호작용의 안정화를 설계하였다. 이를 위하여, H3N2 A/Hong Kong//1/1968(PDB: 3SDY)로부터의 FL HA의 3차원 구조를 분석하여, 다른 단량체의 근접성 및 단백질의 형태적 특징이 잠재적으로 단량체 사이의 이황화 가교의 형성을 가능하게 할 수 있는 영역을 확인하였다. 6쌍의 잔기를 확인하였다(표 11). 각 쌍에 있어서, 잔기가 삼량체 구조에서 상이한 프로토머(단량체) 상에 위치하는 것을 보장하기 위하여 주의하였다. 그 다음, 그룹 2에 기반한 스템 도메인 폴리펩티드 내의 이들 잔기의 등가물(서열 정렬로부터 결정시)을 시스테인으로 돌연변이시켜, 본 발명의 폴리펩티드를 생성하여, 이황화 가교의 형성을 통해 공유적으로 연결되는 폴리펩티드가 형성될 수 있게 하였다. 삼량체 HA 분자의 3-폴드 대칭을 고려하여, 성공적인 설계에 의해, 3개의 프로토머 사이 이황화 가교의 형성을 야기하여, 삼량체에서 단량체의 각각을 2개의 다른 단량체에 공유적으로 연결한다.
WO2013/079473호에는 광범위 중화 항체 CR8020, CR8043에 결합할 수 있는 그룹 2 균주로부터의 HA에 기반한 스템 도메인 폴리펩티드가 기재되어 있다. 표 11로부터의 이황화물 쌍을 H3N2 A/Hong Kong/1/1968(SEQ ID NO: 237)의 HA로부터 유래된 폴리펩티드 H3 HK 미니2a-링커+cl9 +10+11+12+GCN4T(본 명세서에서 SEQ ID NO: 238; WO2013/079473호에서 SEQ ID NO: 130) 및 H3 HK 미니2a-링커+cl9 +10+11+12+GCN4T-CG7-1(본 명세서에서 SEQ ID NO: 239; WO2013/079473호에서 SEQ ID NO: 174)에 도입하여, 본 발명의 폴리펩티드 240 내지 251에 도달하였다.
SEQ ID NO: 240 내지 251의 서열은 HA 리더 서열을 함유한다. 당업자는 성숙 단백질에서, 리더 서열이 절단되고, 더 이상 존재하지 않는 것이 이해할 것이다. 또한, 처리된 서열도 본 발명에 포함된다.
가용성 형태의 본 발명의 폴리펩티드는 C-말단 막횡단 영역 및 세포질 도메인의 결실에 의해 생성될 수 있다. 결실은 예를 들어, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536 또는 537로부터 C-말단까지의 잔기를 포함할 수 있다. 이들 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다. 일부 경우에, 선택적으로 단백질 가수분해 절단 부위를 함유하는, 선택적으로 짧은 링커를 통해 연결되는 C-말단 삼량체화 서열이 부가될 수 있다. 삼량체화 도메인의 예는 SEQ ID NO: 3의 폴드온 서열이다. 처리된 서열도 또한 본 발명에 포함된다.
실시예 16: 인플루엔자 백신 보호 효능 평가에 사용하기 위한 NHP pH1N1 시험감염 모델의 입증 및 NHP에서의 H1 미니-HA #4900의 면역원성 및 보호 효능
대안적인 모델에서 UFV 백신 후보물질의 면역원성 및 보호 효능을 연구할 수 있도록, 범유행성 H1N1 균주(A/Mexico/InDRE4487/2009)를 사용한 사이노몰거스 마카크(Cynomolgus macaques)(마카카 파시쿨라리스(Macaca fasicularis))에서의 비인간 영장류(NHP) 시험감염 모델이 BPRC(Rijswijk, The Netherlands)에서 이전에 확립되어 있다. 이러한 모델은 문헌[Safronetz et al (2011) J Virol .　85:1214]에 공개된 모델에 기반한다. 그러나 모델이 인플루엔자 백신의 보호 효능의 평가를 위해 사용될 수 있는지를 확립할 필요가 있다.
이러한 연구의 일차 목적은
a) 사이노몰거스 마카크에서 이전에 확립된 pH1N1 시험감염 모델을 사용하여, 사용되는 시험감염 균주와 동종인 H1N1 균주의 FL HA 15 ㎍을 함유하는 계절성 백신(인플렉살(Inflexal)® V, 계절 2013/2014; 인플렉살13/14)을 사용하여 백신-매개의 보호 효능을 측정할 수 있는지를 평가하기 위한 목적,
b) 비인간 영장류에서 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)의 면역원성을 평가하기 위한 목적이었다.
이차 목적은 이러한 pH1N1 NHP 시험감염 모델에서 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)의 보호 효능을 평가하는 것이었다.
수컷 사이노몰거스 마카크의 집단을 알파 헤르페스 바이러스, STLV, SIV, SRV 및 플루 A NP에 대한 혈청 항체의 존재, 시험감염 바이러스에 대한 HAI 역가(최대 역가의 1/10 허용)에 대하여 사전-스크리닝하고, 망투(Mantoux) 및 혈액 검사에 의해 결핵에 대하여 시험하였다. 스크리닝된 일부 동물은 이전의 CR8020 PK 연구의 일부였다. 스크리닝 후에, 연령, 체중, HAI 역가 및 PK 연구에의 포함을 고려한 무작위화된 블록 설계를 사용하여, 적합한 모델을 각각 6마리의 동물의 3개의 그룹에 무작위로 할당하였다. 15분 간격으로 체온을 측정하는 데이터 로거를 복부 이식한 후, 1개월의 회복 기간 후에, 면역화 요법을 시작하였다. 하나의 그룹에는 H1N1 A/California/07/09의 FL HA 15 ㎍을 함유하는 인간 용량(0.5 ㎖)의 인플렉살 V 13/14로의 2회의 근육내(i.m.) 면역화를 제공하였으며, 이는 건강관리 단체(CDC, RIVM)에 의해 지원되는 나이브 소아를 위한 면역화 요법 공식 지침이다. 제2 그룹에는 0.5 ㎖의 부피에 50 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 150 ㎍의 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO:186; 추가의 His-태그 함유) 단백질을 사용한 3회의 근육내 면역화를 제공하였다. 제3 그룹은 0.5 ㎖의 PBS를 근육내로 3회 투여한 음성 대조군이었다. 모든 면역화를 4주 면역화 간격으로 수행하였다. 최종 면역화 4주 후에, 동물을 모델의 셋업 동안 확립된 용량인 4x106 TCID50 H1N1 A/Mexico/InDRE4487/2009를 사용하여 기관지내로 시험 감염시켰다. 21일 추적 기간 동안, 임상 징후를 매일 기록하였다. 체중을 측정하는 동안 제1일, 제2일, 제4일, 제6일, 제8일, 제10일, 제14일 및 제21일에 동물을 마취시키고, 기관지 면봉 채취를 취하여, qPCR에 의해 바이러스 로드를 측정하였다. 연구의 마지막에, 데이터 로거를 제거하고 데이터를 분석하였다.
투여되는 백신의 면역원성을 입증하기 위하여, 혈청을 면역화 당일 및 시험감염 5일 전에 분리하였다. 둘 모두의 백신접종 처치를 위하여, 사전-시험감염 혈청 반응을 CR9114 경쟁 ELISA를 사용하여 CR9114 에피토프에 매우 근접하게 결합하는 항체를 유도하도록 백신이 인플루엔자 A 그룹 1 및 2 FL HA의 패널에 결합하는 능력의 폭에 대하여 분석하고, 반응을 경쟁%로 표현하고, 이종아형 H5N1 A/HK/156/97에 대한 미세중화 검정, 및 H1N1 A/California/07/09를 사용하여 FL HA 헤드 에피토프에 의해 매개되는 바이러스 중화를 검출하는 HAI 검정 둘 모두를 사용하여, 백신 유도된 항체(하기 참조)의 대용물 ADCC 활성 및 백신-유도된 항체의 중화 활성에 대하여 분석하였다. 후자의 균주는 백신 및 시험감염 균주에 대하여 동종이다.
대용물 ADCC 활성을 ADCC 생물검정 이펙터 세포(인간 Fc 감마 수용체 IIIA(FcγRIIIA), 인간 CD3γ, 및 루시퍼라제 리포터 유전자를 조절하는 NFAT-반응 요소(프로메가(Promega))를 발현하는 안정한 Jurkat 세포) 및 H1N1 및 H5N1 균주의 FL HA를 암호화하는 DNA로 일시적으로 트랜스펙션된 A549 표적 세포를 사용하여 결정하였다.
결과
- 기관지 바이러스 로드 AUC에서 치료군 사이에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(미도시).
- 0 내지 3일(p=0.010) 및 0 내지 8일(p=0.047) 간격 동안 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186 및 PBS 그룹 사이에, 시험감염 후 체온 증가(열)의 유의미한 차이가 관찰되었다(도 27).
- 0 내지 3일(p=0.033) 간격 동안 인플렉살13/14 그룹과 PBS 그룹 사이에 시험감염 후 체온의 증가의 유의미한 차이가 관찰되었다(도 27).
- 체온 및 임상 징후는 아마도 주로 반복된 마취에 의해 결정될 경증 증상으로 인하여 정보를 제공하지 않는 것이며, 이에 따라 도시되지 않는다.
- 동물 Ji0403061(인플렉살13/14 그룹)은 시험감염 8일 후에 사망하였다. 수의병리학자에 의한 부검으로, 사망시까지의 높은 기관지 바이러스 로드와 일치하게 바이러스성 폐렴이 사망의 원인으로 결정되었다.
- 3 x 150 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186 + 50 ㎍의 매트릭스-M의 면역화 요법은 면역원성이었다:
· 그룹 1 HA 결합 항체의 유도(도 23)
· 3가지의 상이한 그룹 1 HA 단백질에 대한 CR9114 경쟁 항체의 유도(도 24)
· 미세중화 검정을 사용한 이종아형 H5N1 균주를 중화하는 항체의 유도(도 26).
· 표적 HA로서 3가지 상이한 그룹 1 HA 단백질을 사용한 ADCC 이펙터 기능을 할 수 있는 항체의 유도(도 25)
결론: 사이노몰거스 마카크의 H1N1 인플루엔자 시험감염 모델에서 백신 매개의 질병의 개입의 입증은 열이 시험감염 후 처음 3일에 유의미하게 감소되었기 때문에, 오직 부분적으로만 성공적이었다. 3x 150 ㎍의 H1 미니-HA #4900 + 50 ㎍의 매트릭스-M으로의 3회의 면역화는 비인간 영장류에서 면역원성이다. 유도되는 항체는 HA에 결합하고, 시험되는 모든 그룹 1 전장 HA에 대한 ADCC 이펙터 기능을 할 수 있고, 또한, 이종아형 H5 균주를 중화시킨다.
실시예 17: 본 발명의 폴리펩티드로 면역화된 마우스로부터의 혈청의 수동 전달에 의한 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염으로부터의 보호
관찰되는 보호에 대한 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도되는 항체의 기여를 결정하기 위하여, 혈청 전달 연구를 수행하였다.
이러한 연구의 목적은 매트릭스-M의 존재하에 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)으로 3회 면역화시킨 마우스로부터의 혈청의 수동 전달(다수의 투여)이 H5N1 인플루엔자 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염에 대한 보호를 부여하는지 여부를 평가하는 것이었다.
암컷 BALB/c 공여자 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 C-말단 his 태그를 함유하는 30 ㎍의 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186)로 3주 간격으로 3회 면역화시키거나, 또는 PBS로 면역화시켰다. 마지막 면역화 후 4주(제70일)에, 혈청을 분리하고, 그룹마다 풀링하고, 수여자 마우스로 전달하였다(암컷 BALB/c, 6 내지 8주령, 그룹마다 n=10). 각 마우스에 시험감염 이전 3일 연속으로(제-3일, 제-2일 및 제-1일) 400 ㎕ 혈청을 복강내 제공하였다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=8). 제0일에, 마우스를 12.5xLD50 H5N1 A/Hong Kong/156/97로 시험감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
공여자 마우스에서 H1 미니-HA 변이체의 면역원성을 입증하고, 수여자 마우스로의 혈청의 전달 후에 HA-특이적 항체 수준을 평가하기 위하여, 공여자 마우스의 최종 채혈일(제70일)의 풀링된 혈청 시료, 혈청 전달 이전의 나이브 수여자 마우스의 풀링된 혈청 시료(제-4일) 및 시험감염 직전 3회의 혈청 전달 후의 수여자 마우스의 개별 혈청 시료(제0일)를 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA에서 시험하였다.
결과
- 실험군에 대한 생존 백분율이 표 12에 보고되어 있다.
- 실험은 유효하고; PBS 대조군에서 모든 마우스가 시험감염 후 13일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 9.5일), 양성 대조군(15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 186) 면역화된 마우스로부터의 혈청을 나이브 수여자 마우스로 3회 혈청 전달하여, PBS 혈청 전달 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001)(도 28a), 생존 시간의 증가(p<0.001)(도 28a), 체중 감소의 축소(p<0.001)(도 28a) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)(미도시)를 야기한다.
- 3회의 혈청 전달 후에 FL HA A/Brisbane/59/07 특이적 항체 역가는 능동 면역화 후에 수득되는 수준과 유사하다(도 29).
결론: 매트릭스-M 보강된 H1 미니-HA #4900으로의 3회의 면역화에 의해 유도되는 혈청 성분(아마도 항체)은 이종아형 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염에 대하여 마우스를 보호하기에 충분하다.
실시예 18: 치명적인 H1N1 A/Brisbane/59/07 마우스 모델에서의 보호 효능의 평가
백신으로서의 본 발명의 폴리펩티드의 이용의 추가의 근거를 제공하기 위하여, 인플루엔자로의 치명적인 시험감염에 대하여 3가지의 추가의 폴리펩티드의 보호 효능을 평가하였다. 이를 위하여, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203 및 254(둘 모두 C-말단 his-태그 함유)를 상기 기재된 바와 같이 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시키고, 정제하였다. 게다가, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186(추가의 C-말단 his-태그 함유)을 당업자에게 널리 알려져 있는 절차에 따라 SF9 곤충 세포에서 발현시키고(예를 들어, 문헌[M. Cox, Development of an influenza virus vaccine using the baculovirus-insect cell expression system, PhD thesis, Wageningen University Dec 2009] 참조), 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
본 연구의 목적은 PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/Brisbane/59/07 시험감염 모델에서 매트릭스-M과 함께 한 본 발명의 폴리펩티드의 보호 효능을 결정하는 것이었다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍의 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 ELISA 검정에서 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 시험하였다. 본 발명의 폴리펩티드 유도 항체가 CR9114 에피토프에 매우 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석률에서 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 (A-P)/Ax100)로 정의되는 '경쟁%'로 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었다.
결과
- 실험군에 대한 생존 백분율이 표 12에 보고되어 있다.
- 실험은 유효하고; PBS 대조군에서 모든 마우스(n=16)가 시험감염 후 10일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 8일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 생존비의 유의미한 증가(p<0.001)(도 30a), 생존 시간의 증가(p<0.001)(도 30a), 체중 감소의 축소(p<0.001)(도 30b) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)(미도시)를 야기한다.
- 본 발명의 폴리펩티드에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 시험되는 모든 본 발명의 폴리펩티드에 대하여 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p≤0.001)(도 31a).
- 시험된 모든 본 발명의 폴리펩티드에 대한 2회의 면역화 후의 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA 안정기에 대한 IgG 항체 역가(미도시).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 31b).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203(백그라운드 H1N1 A/California/07/2009)은 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA가 표적 항원으로 사용되는 경우 시험되는 다른 본 발명의 폴리펩티드에 비하여 유의미하게 더 낮은 CR9114 경쟁 항체를 유도한다(p≤0.013)(도 31b).
결론: 매트릭스-M 보강된 추가의 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 H1N1 A/Brisbane/59/07로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여한다.
실시예 19: 치명적인 H1N1 A/NL/602/09 마우스 모델에서의 보호 효능의 평가
백신으로서의 본 발명의 폴리펩티드의 이용에 대한 추가의 근거를 제공하기 위하여, 인플루엔자로의 치명적인 시험감염에 대한 3개의 추가의 폴리펩티드의 보호 효능을 평가하였다. 이를 위하여, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203 및 254(둘 모두 C-말단 his-태그 함유)를 상기 기재된 바와 같이 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시키고, 정제하였다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186(또한, 추가의 C-말단 his-태그 함유)을 상기 기재된 바와 같이 당업자에게 널리 알려져 있는 절차에 따라 SF9 곤충 세포에서 발현시키고(상기) 정제하였다.
이러한 연구의 목적은 PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/NL/602/09 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 추가의 삼량체 H1 미니-HA 변이체의 보호 효능을 결정하는 것이었다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험한다. 미니-HA 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 매우 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석률에서 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 (A-P)/Ax100)로 정의되는 '경쟁%'로 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었으며; 참조를 위하여 CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎎/㎖)를 포함시켰다.
결과
- 실험군에 대한 생존 백분율이 표 12에 보고되어 있다.
- 실험은 유효하고; PBS 대조군에서 모든 마우스(n=16)가 시험감염 후 8일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 6일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 유의미한 생존비의 증가(p≤0.004)(도 32a), 생존 시간의 증가(p≤0.001)(도 32a) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)(미도시)를 야기한다. 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203에 있어서, 체중 AUC의 유의미한 감소도 또한 관찰된다(p<0.001)(도 32b).
- 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p≤0.001)(도 33a).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 33b).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 삼량체 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203(백그라운드 H1N1 A/California/07/2009)은 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA가 표적 항원으로 사용되는 경우 H1N1 A/Brisbane/59/2007로부터 유래한 변이체에 비하여 유의미하게 더 낮은 CR9114 경쟁 항체를 유도한다(p≤0.002)(도 33b).
결론: 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 H1N1 A/NL/602/09로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여한다.
실시예 20: H5N1 A/Hong Kong/156/97 마우스 모델에서의 H1 mHA 삼량체 후보물질 평가 II
백신으로서의 본 발명의 폴리펩티드의 이용에 대한 추가의 근거를 제공하기 위하여, 인플루엔자로의 치명적인 시험감염에 대한 3개의 추가의 폴리펩티드의 보호 효능을 평가하였다. 이를 위하여, 본 발명의 폴리펩티드 203 및 254(둘 모두 C-말단 his-태그 함유)를 상기 기재된 바와 같이 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시키고, 정제하였다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186(또한, 추가의 C-말단 his-태그 함유)을 당업자에게 널리 알려져 있는 절차에 따라 SF9 곤충 세포에서 발현시키고 상기 기재된 바와 같이 정제하였다.
이러한 연구의 목적은 PBS 대조군에 비하여 H5N1 A/Hong Kong/156/97 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254의 보호 효능을 결정하는 것이었다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 주사를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 12.5xLD50 시험감염 바이러스로 시험 감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험하였다. 미니-HA 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 매우 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석률에서 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 (A-P)/Ax100)로 정의되는 '경쟁%'로 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었으며; 참조를 위하여 CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎍/㎖) 용액을 포함시켰다.
결과
- 실험군에 대한 생존 백분율이 표 12에 보고되어 있다.
- 실험은 유효하고; PBS 대조군에서 16마리의 마우스 중 15마리가 시험감염 후 9일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 9일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 유의미한 생존비의 증가(p<0.001)(도 34a), 생존 시간의 증가(p<0.001)(도 34a), 체중 감소의 축소(p<0.001)(도 34b) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)(미도시)를 야기한다.
- 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높다(p≤0.001)(도 35a).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 35b).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203(백그라운드 H1N1 A/California/07/2009)은 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA이 표적 항원으로 사용되는 경우 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186 및 254(백그라운드 H1N1 A/Brisbane/59/2007)에 비하여 유의미하게 더 낮은 CR9114 경쟁 항체를 유도한다(p<0.001)(도 35b).
결론: 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 이종아형 H5N1 A/Hong Kong/156/97로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여한다.
실시예 21: H1N1 A/Puerto Rico/8/34 마우스 모델에서의 H1 mHA 삼량체 후보물질 평가 II
백신으로서의 본 발명의 폴리펩티드의 이용에 대한 추가의 근거를 제공하기 위하여, 인플루엔자로의 치명적인 시험감염에 대한 3개의 추가의 폴리펩티드의 보호 효능을 평가하였다. 이를 위하여, 본 발명의 폴리펩티드 203 및 254(둘 모두 C-말단 his-태그 함유)를 상기 기재된 바와 같이 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시키고, 정제하였다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186(또한, 추가의 C-말단 his-태그 함유)을 상기 기재된 바와 같이 당업자에게 널리 알려져 있는 절차에 따라 SF9 곤충 세포에서 발현시키고 정제하였다.
이러한 연구의 목적은 PBS 대조군에 비하여 H1N1 A/Puerto Rico/8/1934 시험감염 모델에서 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254의 보호 효능을 결정하는 것이었다.
10마리의 암컷 BALB/c 마우스(6 내지 8주령)의 그룹을 10 ㎍ 매트릭스-M이 보강된 30 ㎍의 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254로 3주 간격으로 3회 면역화시켰다. 시험감염 모델에 대한 양성 대조군으로서, CR6261(15 ㎎/㎏)을 시험감염 1일 전에 투여하는 한편(n=8), PBS로의 3회의 면역화를 음성 대조군으로 제공하였다(n=16). 마지막 면역화 4주 후에, 마우스를 25xLD50 시험감염 바이러스로 시험감염시키고, 3주 동안 모니터링하였다(생존, 체중, 임상 점수).
본 발명의 폴리펩티드의 면역원성을 입증하기 위하여, 사전-시험감염 혈청(제-1일)을 H1N1 A/Brisbane/59/07로부터의 FL HA로의 결합에 대하여 ELISA 검정에서 시험한다. 미니-HA 유도된 항체가 CR9114 에피토프에 매우 인접하게 결합하는지의 여부를 결정하기 위하여, CR9114 경쟁 ELISA를 수행하였다. 경쟁 데이터를 A는 혈청이 존재하지 않는 경우 FL HA에 결합하는 CR9114의 최대 OD 신호이며, P는 주어진 희석률에서 혈청의 존재하에 FL HA에 결합하는 CR9114의 OD 신호인 (A-P)/Ax100)로 정의되는 '경쟁%'로 가시화시키거나, 기울기 OD 계량을 사용하여 표현하여, 반응을 정량화할 수 있었으며; 참조를 위하여 CR9114 및 CR8020(출발 농도 5 ㎍/㎖) 용액을 포함시켰다.
결과
- 실험군에 대한 생존 백분율이 표 12에 보고되어 있다.
- 실험은 유효하고; PBS 대조군에서 모든 마우스(n=16)가 시험감염 후 9일에 또는 그 이전에 감염에 굴복하는 한편(중간값 8일), 양성 대조군(n=8, 15 ㎎/㎏ CR6261, 시험감염 1일 전)은 완전히 보호된다(p<0.001).
- 매트릭스-M이 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254로의 3회의 면역화는 PBS 대조군에 비하여, 유의미한 생존비의 증가(p<0.001)(도 36a), 생존 시간의 증가(p<0.001)(도 36a), 체중 감소의 축소(p<0.001)(도 37b) 및 임상 점수의 감소(p<0.001)(미도시)를 야기한다.
- H1 미니-HA 변이체에 의해 유도되는 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA에 대한 사전-시험감염 IgG 항체 역가는 PBS에 비하여 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254에 대하여 유의미하게 더 높다(p<0.001)(도 37a).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 PBS에 비하여 유의미하게 더 높은 CR9114 경쟁 역가를 유도한다(p<0.001)(도 37b).
- 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 203(백그라운드 H1N1 A/California/07/2009)은 H1N1 A/Brisbane/59/07 FL HA이 표적 항원으로 사용되는 경우 H1N1 A/Brisbane/59/2007에 기반한 변이체에 비하여 유의미하게 더 낮은 CR9114 경쟁 항체를 유도한다(p≤0.001)(도 37b).
결론: 매트릭스-M 보강된 본 발명의 폴리펩티드 SEQ ID NO: 186, 203 및 254는 H1N1 A/Puerto Rico/8/34로의 치명적인 시험감염에 대하여 보호를 부여한다.
실시예 22: 상이한 H1 서열 백그라운드의 본 발명의 폴리펩티드
s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 181) 다음으로, 2개의 변이체, Tex_s127H1-t2-cl18long 및 NY_s127H1-t2-cl18long을 생성하였으며(SEQ ID NO: 208 및 210), 이는 동일한 설계 특징을 공유하지만, 균주 H1N1 A/Texas/UR06-0526/07(SEQ ID NO: 205) 및 A/New York/629/95(SEQ ID NO: 206)로부터 기원한 HA에 기반한다. 이러한 실험에서, C-말단 인자 X 절단 부위 및 6개의 히스티딘 태그가 둘 모두의 단백질에 존재한다. 발현 및 정제를 위하여, 0.6 ℓ 배양 상청액을 사용하여 절차를 시작하는 것을 제외하고, 실시예 2에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 사용하였다.
정제된 폴리펩티드를 광범위 중화 항체 CR9114의 2개 이상의 에피토프를 제시하는 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재에 대하여 샌드위치 ELISA(실시예 3에 기재된 바와 같음)에서 더욱 분석하였다. 약술하면, 코팅된 mAb CR9114를 사용하여, 정제된 단백질을 포획하고, 이후에 이를 비오티닐화 CR914 또는 CR6261과 인큐베이션시키고, 결합을 HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘에 의해 평가하였다. 생성 수율 및 다량체 샌드위치 ELISA 결과는 도 13에 나타나 있다.
도 13에 나타낸 결과는 모든 변이체가 요망되는 결합 특징을 갖는 다량체 단백질을 초래하는 것을 나타낸다. 폴리펩티드 Tex_s127H1-t2-cl18(SEQ ID NO: 208)은 s127H1-t2-cl18long과 비교하여 유사한 수율을 갖는 한편, 폴리펩티드 NY_s127H1-t2-cl18(SEQ ID NO: 210)은 s127H1-t2-cl18long(SEQ ID NO: 181)에 비하여 약 4배 더 낮은 수율을 갖는다. 시험된 모든 폴리펩티드는 ELISA에 의해 결정시 s127H1-t2-cl18long와 유사하게 CR9114 및 CR6261에 결합할 수 있었으며, 이는 다량체화의 존재를 나타낸다. 본 명세서에 나타난 결과는 함께 취합하여, 상이한 계통발생 기원의 H1 서열을 사용한 HA 스템 기반의 폴리펩티드의 성공적인 생성을 입증한다.
실시예 23: 추가의 c-말단 삼량체화 도메인이 있는 본 발명의 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 c-말단과 함께 발현될 수 있다. 상이한 길이(HA의 막횡단 도메인의 대안적인 절단으로부터 초래) 외에도, 검출 및 정제를 위한 태그 및 기능성 도메인을 항원 구조에 영향을 미치지 않고, 부가할 수 있다. 하기의 작제물은 H1 A/Brisbane/59/2007(SEQ ID NO: 1) 또는 H1 A/California/07/2009(SEQ ID NO: 252)로부터의 FL HA로부터 유래한 짧은(잔기 520 내지 C-말단 결실; SEQ ID NO: 1에 따른 넘버링) 또는 긴(잔기 520 내지 C-말단 결실) 버전의 본 발명의 폴리펩티드로의 폴드온 삼량체화 도메인(Flag- 및 His-태그가 측부 배치)의 부가를 보여준다.
작제물을 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시키고(실시예 2에 기재된 바와 같음), 여과된 배양 상청액 중 존재하는 본 발명의 폴리펩티드를 조사하였다. 발현 및 삼량체화 수준을 먼저 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯(실시예 2에 기재된 바와 같음, 도 38 참조)에 의해 평가하였다. 배양 배지를 광범위 중화 항체 CR9114의 2개 이상의 에피토프를 제시하는 다량체 형태의 폴리펩티드의 존재에 대하여 샌드위치 ELISA(실시예 3에 기재된 바와 같음)에서 더욱 분석하였다. 약술하면, 코팅된 mAb CR9114를 사용하여, 정제된 단백질을 포획하고, 이후에 이를 비오티닐화 CR914와 인큐베이션시키고, 결합을 HRP-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘에 의해 평가하였다(표 14 참조). 마지막으로, 동종 결합 연구를 수행하여, 본 발명의 폴리펩티드의 발현 수준을 확인하고, HA의 스템 상에 공지된 에피토프가 있는 널리 특성화된 모노클로널 항체(IgG)로의 그들의 결합 세기를 결정하였다. 본 명세서에, AlphaLISA 셋업(Perkin Elmer)을 확립하였으며, 이는 c-말단 Flag- 및 His-태그 및 인간 모노클로널 IgG CR9114 및 CR6261에 의존한다. 모든 시약을 PBS, 0.05% Tween-20 및 0.5 ㎎/㎖ BSA를 함유하는 완충제 중에 희석하였다.
AlphaLISA 셋업을 사용하여 발현 수준을 결정하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 여과된 세포 배양 상청액을 항-His 공여 비드 및 항-Flag 수용 비드(둘 모두 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)사 제품)의 존재하에 25 ㎕의 최종 부피 중 10 ㎍/㎖로 40배 희석하였다. 균질한 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 여기된 공여 비드(680 nm) 및 수용 비드 둘 모두가 각각의 c-말단 태그에 결합하고, 아주 근접하게 되면(약 100 nm), 에너지 전달(단일항 산소)은 수용 비드(615 nm)의 발광 신호로서 측정될 수 있다. 상동성 검정 형식에서 신호 세기는 용액 중 단백질의 양에 직접적으로 비례한다. 본 발명의 발현된 폴리펩티드에 대한 AlphaLISA 신호 세기의 평균은 도 14에 나타나 있다.
실온에서 사용되는 2개의 비드, HA를 인식하는 항-His 공여 비드(10 ㎍/㎖) 및 IgG를 인식하는 항-Fc 수용 비드(10 ㎍/㎖)를 사용하여, 실온에서 CR9114 또는 CR6261(25 ㎕ 중에 각각 1 또는 2　nM 최종 농도)과의 1시간 인큐베이션 후에, 본 발명의 폴리펩티드와 IgG 간의 상호작용을 검출하였다. 추가의 인큐베이션 시간 후에, 수용 비드의 AlphaLISA 신호를 측정하였다. 이러한 상동성 검정 형식에서의 신호 세기는 둘 모두의 결합 파트너 간의 결합 세기(친화성/결합력)에 직접적으로 비례하며, 이에 의해, 이는 미니-HA 에피토프의 무결성 및 품질에 대한 척도이다. CR9114 및 CR6261의 결합에 대한 AlphaLISA 신호 세기의 평균은 표 14에 나타나 있다.
모체 작제물 SEQ ID NO: 164(H1 A/Brisbane/59/2007 백그라운드) 및 SEQ ID NO: 211(H1 A/California/07/2009 백그라운드)은 C-헬릭스에 매립된 GCN4 삼량체화 도메인을 이미 함유한다. 이들 폴리펩티드의 가용성 버전의 c-말단에서의 추가의 폴드온 삼량체화 도메인의 삽입(또한, 본 발명에 포함)이 가능하며, 유사하거나 더 나은 발현 수준을 초래한다. 추가의 삼량체화 도메인은 웨스턴 블롯 및 다량체 ELISA 결과에 의해 입증되는 바와 같이 삼량체화 수준에 대하여 본 발명의 폴리펩티드를 더욱 개선시킬 수 있다. 광범위 중화 IgG CR9114 및 CR6261의 결합은 오직 하나의 삼량체화 도메인만을 갖는 본 발명의 폴리펩티드와 비교하여 동일하거나 더 낫다.
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SEQUENCE LISTING <110> Crucell Holland B.V. <120> INFLUENZA VIRUS VACCINES AND USES THEREOF <130> 0241 WO 00 ORD <150> EP14176459.7 <151> 2014-07-10 <160> 258 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 565 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 Full length (A/Brisbane/59/2007) <400> 1 Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr 1 5 10 15 Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile 50 55 60 Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe 100 105 110 Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 130 135 140 Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys 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Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 355 360 365 His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 370 375 380 Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu 385 390 395 400 Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 405 410 415 Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Ile 420 425 430 Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu 435 440 445 Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys 450 455 460 Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys 465 470 475 480 Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys 485 490 495 Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn 500 505 510 Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln 515 520 525 Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val 530 535 540 Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln 545 550 555 560 Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 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Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn 195 200 205 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn 210 215 220 Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys 245 250 255 Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 260 265 270 Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 275 280 285 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 290 295 300 <210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> foldon <400> 3 Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15 Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25 <210> 4 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG-thrombin-foldon-HIS <400> 4 Ser Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Pro Arg Gly 1 5 10 15 Ser Pro Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala 20 25 30 Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp 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Asn Lys Ser Glu Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys 130 135 140 Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Gln Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp 195 200 205 Glu Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr 210 215 220 Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Ser Gly 225 230 235 240 Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro 245 250 255 Gly Ser Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val 260 265 270 Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu Gly His His 275 280 285 His His His His 290 <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 HA2 amino acid sequence connecting the C-terminal residue of helix A and the N-terminal residue of helix CD <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X= H 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Asp Glu Ala Asn Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Arg Arg Pro 85 90 95 Thr Ala Tyr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 11 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SC09-114 VH PROTEIN <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Gly Thr Ser Asn Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ser Pro Ile Phe Gly Ser Thr Ala Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Ile Phe Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SC09-114 VL PROTEIN <400> 12 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ala Val Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Arg Arg 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asp Gln Arg Pro Ser Val Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Lys Gly Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SC08-057 VH PROTEIN <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Asp Ser Val Ile 20 25 30 Phe Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Cys Val 35 40 45 Ser Ile Ile Tyr Ile Asp Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg His Asn Ser Met Gly Thr Val Phe Leu 65 70 75 80 Glu Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Glu Ser Gly Asp Phe Gly Asp Gln Thr Gly Pro Tyr His 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(132)..(132) <223> X8= F, I, N, S, T, Y, G, E, K, M, V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135) <223> X9= H, I, L, N, R, S <400> 146 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Xaa Pro Ser Xaa Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Xaa Xaa Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Xaa Asn Thr Gln Xaa Thr Ala Xaa 115 120 125 Gly Lys Glu Xaa Asn Lys Xaa Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 130 135 140 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys 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<220> <221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135) <223> X9= H, I, L, N, R, S <400> 148 Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asn Gly Gly Gly Gly Lys Tyr Val Cys Ser Ala Lys Leu Arg 35 40 45 Met Val Thr Gly Leu Arg Asn Xaa Pro Ser Xaa Gln Ser Gln Gly Leu 50 55 60 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Xaa Xaa Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val 65 70 75 80 Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr 85 90 95 Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn 100 105 110 Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Xaa Asn Thr Gln Xaa Thr Ala Xaa 115 120 125 Gly Lys Glu Xaa Asn Lys Xaa Glu Arg Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp 130 135 140 Lys Ile Glu Glu Ile Glu Ser Lys Ile Trp Cys Tyr Asn Ala Glu Leu 145 150 155 160 Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn 165 170 175 Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala 180 185 190 Lys Glu Ile Gly 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Claims (23)

  1. 적어도 제1 및 제2 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 단량체를 포함하는 다량체 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드로서, 상기 제1 및 제2 단량체가 각각 하기 SEQ ID NO: 146의 아미노산 서열을 포함하고:
    DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1 PSX2 QSQGLFGAIAGX3X4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX6 TAX7 GKEX8 NKX9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDG (SEQ ID NO: 146)
    X1은 K, X2는 K, X3은 F, X4는 T, X5는 M, X6은 Y, X7은 I, X8은 Y, 및 X9는 S이고,
    제1 단량체가 제1 단량체의 위치 411에서의 아미노산과 제2 단량체의 위치 419에서의 아미노산 사이의 이황화 가교에 의해 상기 제2 단량체에 연결되며, 상기 아미노산 위치의 넘버링은 SEQ ID NO: 1을 기준으로 하는, 다량체 인플루엔자 헤마글루티닌 스템 도메인 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다량체가 삼량체인 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 하기 SEQ ID NO: 147의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1 PSX2 QSQGLFGAIAGX3X4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX6 TAX7 GKEX8 NKX9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQIEG (SEQ ID NO: 147)
    X1은 K, X2는 K, X3은 F, X4는 T, X5는 M, X6은 Y, X7은 I, X8은 Y, 및 X9는 S이다.
  4. 제1항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 하기 SEQ ID NO: 148의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
    DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLENGGGGKYVCSAKLRMVTGLRNX1 PSX2 QSQGLFGAIAGX3X4 EGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADQKSTQNAINGITNKVNSVIEKX5 NTQX6 TAX7 GKEX8 NKX9 ERRMKQIEDKIEEIESKIWCYNAELLVLLENERTLDFHDSNVKNLYEKVKSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCNDECMESVKNGTYDYPKYSEESKLNREKIDGVKLESMGVYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 148)
    X1은 K, X2는 K, X3은 F, X4는 T, X5는 M, X6은 Y, X7은 I, X8은 Y, 및 X9는 S이다.
  5. 제1항에 있어서, 각각의 폴리펩티드 단량체는 SEQ ID NO: 164, 186, 255 및 256로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩티드:
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 및 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 중 하나 이상을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드.
  10. 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 제6항에 따른 핵산 분자.
  11. 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 제7항에 따른 벡터.

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