KR20090088946A - 씨디70에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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마르코 에이. 코치아
조나쏜 에이. 터렛
데이비드 죤 킹
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조세핀 카다렐리
마크 야마나까
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메다렉스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 CD70에 고친화도로 특이적으로 결합하는 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 바람직하게, 상기 항체는 인간 CD70에 결합한다. 소정의 구체예에서, 상기 항체는 CD70-발현 세포로 내재화할 수 있거나 항원 의존성 세포 독성을 매개할 수 있다. 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자, 발현 백터, 숙주 세포 및 본 발명의 항체를 발현하는 방법 또한 제공한다. 항체-파트너 분자 접합체, 이종특이적 분자 및 본 발명의 항체들을 포함하는 약제학적 조성물 또한 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 항-CD70 항체를 이용하여 CD70을 검출하는 방법 뿐만 아니라, 신장 암 및 림프종과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다.
항-CD70 항체, 항원-결합부, 단일클론 항체, 항체-파트너 분자 접합체

Description

씨디70에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도{HUMAN ANTIBODIES THAT BIND CD70 AND USES THEREOF}
본 발명은 CD70에 특이적으로 결합하고 바람직한 기능적 특성을 가지는 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 이들 특성은 인간 CD70에 결합하는 고친화도, CD70을 발현하는 세포에 의한 내재화, 항체 의존성 세포 독성을 매개하는 능력, 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합하는 능력, 및/또는 림프종 세포주, 예를 들어, B-세포 종양 세포주에 결합하는 능력을 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, CD70 단백질을 검출 또는 CD70을 발현하는 종양 세포와 같은, CD70을 발현하는 세포의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다.
<관련 출원>
본 출원은 2006년 12월 14일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/870,091호, 2007년 5월 1일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/915,314호 및 2007년 11월 30일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/991,702호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다.
<배경기술>
사이토카인 수용체 CD27은 종양괴사인자 수용체(member of the tumor necrosis factor receptor, TFNR) 상과(superfamily)의 멤버이며, 아포토시스(apoptosis) 또는 프로그램 세포 사멸(programmed cell death)뿐만 아니라, 세포 성장 및 분화에서 역할을 한다. CD27에 대한 리간드는 CD70이며, 이는 리간드의 종양괴사인자 군(family)에 속한다. CD70은 20개의 아미노산 친수성 N-말단 도메인 및 2개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 자리를 포함하는 C-말단 도메인을 가지는 193 아미노산 폴리펩티드이다(Goodwin, R.G. 등 (1993) Cell 73:447-56; Bowman 등 (1994) Immunol 152:1756-61). 이들 특징에 기초하여, CD70은 세포외 C-말단 부분을 가지는 유형 II 트랜스멤브레인 단백질인 것으로 결정되었다.
CD70은 일시적으로 활성인 것으로 알려져 있으나, 휴지하고 있는 T 및 B 림프구 및 수지상 세포가 아니다(Hintzen 등 (1994) J. Immunol. 152:1762-1773; Oshima 등 (1998) Int. Immunol. 10:517-26; Tesselaar 등 (2003) J. Immunol. 170:33-40). 정상 세포 상에서의 발현 뿐 아니라, CD70 발현은 신장 세포 암종, 전이성 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종 및 비인두암을 포함한 다른 유형의 암에서 보고되어 있다(Junker 등 (2005) J Urol. 173:2150-3; Sloan 등 (2004) Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt 및 Mentlein (2002) Int J Cancer 98:352-6; Hishima 등 (2000) Am J Surg Pathol. 24:742-6; Lens 등 (1999) Br J Haematol. 106:491-503). 추가적으로, CD70은 DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제자 또는 ERK 경로 억제자로 처리된 T 세포 상에서 과발현되며, 가능하게는 약물-유도 및 특발성 낭창을 야기하는 것이 알려져 있다(Oelke 등 (2004) Arthritis Rheum. 50:1850-60). CD27과 CD70의 상호작용은 또한 세포-매개 자가면역 질병 및 TNF-알파 생산의 억제에서 역할을 하는 것으로 제안되어 졌다(Nakajima 등 (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96).
따라서, CD70은 암, 자가면역 질환 및 CD70 발현으로 특징지어지는 다양한 다른 질병의 치료에 대한 가치있는 표적을 나타낸다.
<개요>
본 발명은 CD70에 특이적으로 결합하고 바람직한 기능적 특성을 가지는 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체를 제공한다. 이들 특성은 인간 CD70에 결합하는 고친화도, CD70을 발현하는 세포에 의한 내재화, 항체 의존성 세포 독성을 매개하는 능력, 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합하는 능력, 및/또는 림프종 세포주, 예를 들어, B-세포 종양 세포주에 결합하는 능력을 포함한다. 본 발명의 항체는 예를 들어, CD70 단백질을 검출 또는 CD70을 발현하는 종양 세포와 같은, CD70을 발현하는 세포의 성장을 억제하는데 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 분리된 단일클론 항체 및 이의 조성물을 사용하여 다양한 CD70 매개 질병을 치료하는 방법이 제공된다.
일 관점에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 결합하고 하기 특성 중 적어도 하나를 나타낸다:
(a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD70 에 결합하고; 및
(b) 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합하며;
(c) 림프종 세포주, 예를 들어 B-세포 종양 세포주에 결합하고;
(d) CD70-발현 세포에 의하여 내재화하며;
(e) CD70-발현 세포에 대한 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 나타내고; 및
(f) 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 세포의 성장을 억제한다.
바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 두 개를 나타낸다. 더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 세 개를 나타낸다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 네 개를 나타낸다. 보다 더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 다섯 개를 나타낸다. 더욱더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 여섯 개 모두를 나타낸다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체가 세포독소에 접합할 때 상기 항체는 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 성장을 억제한다.
바람직하게, 상기 항체는 786-O(ATCC 기탁번호 CRL-1932), A-498(ATCC 기탁번호 HTB-44), ACHN(ATCC 기탁번호 CRL-1611), Caki-1(ATCC 기탁번호 HTB-46) 및 Caki-2(ATCC 기탁번호 HTB-47)로 이루어진 군에서 선택된 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합한다.
바람직하게, 상기 항체는 다우디(Daudi)(ATCC 기탁번호 CCL-213), HuT 78(ATCC 기탁번호 TIB-161), 라지(Raji)(ATCC 기탁번호 CCL-86) 또는 그란타(Granta)-519(DSMZ 기탁번호 342) 세포들로부터 선택된 B-세포 종양 세포주에 결합한다.
대안적인 구체예에서 상기 항체는 뮤린(murine) 항체, 키메릭 항체 또는 인간화 항체이지만, 바람직하게 상기 항체는 인간 항체이다.
더 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 5.5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하거나 3 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하거나 2 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하거나 1.5 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합한다.
다른 구체예에서, 상기 항체는 786-O 신장 세포 암종 종양 세포 상에서 발현된 CD70에 결합한 후에 786-O 신장 세포 암종 종양 세포들에 의하여 내재화된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 참조 항체에 의하여 인식된 CD70 상의 에피토프에 결합을 위하여 교차-경쟁하고, 상기 참조 항체는: (a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하고; 및 (b) 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합한다.
다양한 구체예에서, 상기 참조 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 5 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
또는 상기 참조 항체는 다음을 포함한다: (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 구체예에서, 본 발명의 참조 항체는 항체 69A7Y이다. 69A7Y는 항체 69A7와 동일하지만, 아미노산 위치 100에서 C(시스테인)을 Y(티로신)으로 돌연변이시키는 서열번호 5의 VH 아미노산 서열에 보존적 변형을 포함한다. 69A7Y의 VH 아미노산 서열은 서열번호 73으로서 설명된다. C에서 Y로의 돌연변이는 69A7의 VH 뉴클레오티드 서열(서열번호 53)의 뉴클레오티드 위치 323에서 G의 A로의 단일 염기쌍 치환에 기인한다. 69A7Y의 VH 뉴클레오티드 서열은 서열번호 74로서 설명된다. 69A7Y는 서열번호 75로서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 가진다.
다른 관점에서, 본 발명은 인간 VH 3-30.3 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하는 치료제에 연결되는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부에 관한 것이며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VH 3-33 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VH 4-61 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VH 3-23 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
또한 본 발명은 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VK L18 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VK L15 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 본 발명은 또한 치료제에 연결되는 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 분리된 단일클론 항체를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 인간 VK A27 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
특히 바람직한 항체 또는 이의 항원-결합부는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 29 또는 75를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
본 발명의 다른 바람직한 항체들은 항체 또는 이의 항원 결합부를 가지며, 상기 항체는 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 (a) 서열번호 5 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 바람직한 조합은 (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 항체 69A7Y이다. 69A7Y는 항체 69A7과 동일하지만, 아미노산 위치 100에서 C(시스테인)을 Y(티로신)으로 돌연변이시키는 서열번호 5의 VH 아미노산 서열에 보존적 변형을 포함한다. 69A7Y의 VH 아미노산 서열은 서열번호 73으로서 설명된다. C에서 Y로의 돌연변이는 69A7의 VH 뉴클레오티드 서열(서열번호 53)의 뉴클레오티드 위치 323에서 G의 A로의 단일 염기쌍 치환에 기인한다. 69A7Y의 VH 뉴클레오티드 서열은 서열번호 74로서 설명된다. 69A7Y는 서열번호 75로서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3을 가진다.
본 발명의 항체는 예를 들어, 전장 항체, 예를 들어 IgG1 또는 IgG4 이소타입일 수 있다. 대안적으로, 상기 항체는 Fab 또는 Fab’2 단편과 같은 항체 단편, 또는 단일 사슬 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체를 제공하며, 이는 세포독소 또는 방사성 동위원소와 같은, 치료제에 연결된다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 세포독소(예를 들어, 본원 또는 2006년 12월 28일자로 출원된 미국 특허 출원번호 제60/882,461호 또는 2007년 11월 30일자로 출원된 미국 특허 출원번호 제60/991,300호에 기재된 세포독소, 이들은 전체가 참조로서 통합되어 있다)에 연결된(예, 티올 연결), 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체를 제공한다. 소정의 구체예에서, 면역접합체의 세포독소 및 링커는 N1 또는 N2의 구조를 가진다.
예를 들어, 다양한 구체예에서, 본 발명은 하기의 바람직한 면역접합체를 제공한다:
(i) 다음을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열번호 5 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및
(f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 여기에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합부는 세포독소에 연결된다;
(ii) 다음을 포함하는, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
또는 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
또는 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
또는 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
또는 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 29 또는 75를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
또는 다음을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체:
(a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3,
여기에서 상기 항체, 또는 이의 항원-결합부는 세포독소에 연결된다; 및
(iii) 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 면역접합체, 상기 면역접합체는 다음을 포함하는 항체에 의해 인식되는 동일한 에피토프에 결합한다(예, 인간 CD70에의 결합에 대하여 다음을 포함하는 항체와 교차-경쟁한다):
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열번호 5 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 여기에서 상기 항체, 또는 이의 항원-결합부는 세포독소에 연결된다.
본 발명은 또한 항체, 또는 이의 항원 결합부와는 다른 결합 특이성을 가지는 제2 기능적 부분(moiety)에 연결되는, 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 이중특이적 분자를 제공한다.
또한 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 핵산 분자 또한 본 발명에 포함되며, 뿐만 아니라 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 발명에 포함된다. 또한 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 이용하여 항-CD70 항체를 제조하는 방법이 제공되며, 이는 (i) 상기 숙주 세포에서 상기 항체를 발현시키는 단계 및 (ii) 상기 숙주 세포로부터 상기 항체를 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 항-CD70 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 13-18로 이루어진 군에서 선택된 CDR1 서열, 서열번호 19-24로 이루어진 군에서 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 25-30 및 75로 이루어진 군에서 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열번호 31-36으로 이루어진 군에서 선택된 CDR1 서열, 서열번호 37-42로 이루어진 군에서 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 43-48로 이루어진 군에서 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 만드며; 및
(c) 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시킨다.
또한 본 발명은 CD70에 고친화도로 특이적으로 결합하는 분리된 항-CD70 항체-파트너 분자 접합체를 제공하며, 특히 상기 접합체는 인간 단일클론 항체를 포함한다. 상기 항체-파트너 분자 접합체의 어떤 것은 CD70-발현 세포로 내재화될 수 있으며 항체 의존성 세포 독성을 매개할 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 항-70 항체-파트너 분자 접합체를 이용하여, 신장 세포 암종 암 또는 림프종과 같은 암을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명의 파트너 분자에 접합되고, 항체, 또는 이의 항원-결합부를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서에서 개시된 항체 파트너 분자 접합체에서 항체에 유리하게 접합될 수 있는 파트너 분자들은 약물, 독소, 마커 분자들(예, 방사성동위원소), 단백질 및 치료제로서의 분자들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 항체-파트너 분자 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 명세서에 개시된다.
한 관점에서, 상기 항체-파트너 분자 접합체는 화학적 링커를 통하여 접합된다. 어떤 구체예에서, 상기 링커는 펩티딜 링커이고, 본 명세서에 (L4)p-F- (L1)m으로 표시된다. 다른 링커는 하이드라진 및 디설파이드 링커들을 포함하고, 본 명세서에 각각 (L4)p-H- (L1)m 또는 (L4)p-J- (L1)m으로 표시된다. 파트너에 부착된 링커에 부가하여, 본 발명은 또한 필수적인 임의의 분자 종에 부착하기에 적절한 분리가능한(cleavable) 링커 가지(arm)를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 CD70-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 CD70-종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 CD70-발현 종양 세포를 본 발명의 항체-파트너 분자 접합체와 접촉시키는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 파트너 분자는 세포독소와 같은, 치료제이다. 특히 바람직한 CD70-발현 종양 세포는 신장 암 세포 및 림프종 세포이다.
다른 관점에서, 본 발명은 대상체 내의 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체 내의 암을 치료하기 위하여 본 발명의 항체-파트너 분자 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 파트너 분자는 세포독소와 같은, 치료제이다. 치료를 위한 특히 바람직한 암은 신장 암 및 림프종이다.
다른 관점에서, 본 발명은 대상체 내의 자가면역 질병, 염증, 또는 바이러스 감염을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 대상체 내의 자가면역 질환을 치료하기 위하여 본 발명의 항체-파트너 분자 접합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 제한적으로 해석되어서는 안 될 하기의 상세한 설명 및 실시예로부터 명확해질 것이다. 본 출원 전체에 인용된 모든 참조 문헌, 진뱅크(Genbank) 등록 번호, 특허 및 공개된 특허 출원서의 내용은 참조로서 본 명세서에 명백히 통합된다.
<상세한 설명>
본 발명은 분리된 단일클론 항체, 특히 인간 단일클론 항체에 관한 것으로, 상기 항체는 인간 CD70에 결합하고 바람직한 기능적 특성들을 가진다. 소정의 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열로부터 유도하고 및/또는 특정 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특징을 포함한다. 본 발명은 분리된 항체, 상기 항체를 만드는 방법, 항체-파트너 분자 접합체, 및 상기 항체를 포함하는 이중특이적 분자 및 본 발명의 항체, 항체-파트너 분자 접합체 또는 이중특이적 분자를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 종양 세포와 같은 CD70-발현 세포의 성장을 억제시키기 위하여 본 발명의 항-CD70 항체를 이용하는 방법뿐만 아니라, CD70 단백질을 검출하는 것과 같이, 상기 항체를 이용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 또한 본 발명은 다양한 유형의 암, 예를 들어 신장 세포 암종 또는 림프종을 치료하기 위하여 본 발명의 항-CD70 항체 및 항체-파트너 분자 접합체를 이용하는 방법을 제공한다.
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 우선 소정의 용어를 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체를 통하여 설명된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 용어 “CD70”은 변이체(variant), 이소형태(isoform), 동족체(homolog), 오솔로그(ortholog) 및 파라로그(paralog)를 포함한다. 예를 들어, 인간 CD70 단백질에 대하여 특이적인 항체는, 소정의 경우에, 인간 이외의 다른 종으로부터의 CD70 단백질과 교차-경쟁한다. 다른 구체예에서, 인간 CD70 단백질에 대하여 특이적인 항체는 인간 CD70 단백질에 대하여 완전히 특이적일 수 있으며 교차-반응성의 종 또는 다른 유형을 나타내지 않거나, 또는 소정의 다른 종으로부터의 CD70과 교차-반응할 수 있지만 다른 모든 종의 것과는 아니다(예, 영장류 CD70과는 교차-경쟁하지만 마우스 CD70과는 교차-경쟁하지 않는다). 용어 “인간 CD70”은 진뱅크(Genbank) 기탁번호 P32970(서열번호 76)을 가지는 인간 CD70의 완전한 아미노산 서열과 같은, 인간 서열 CD70을 지칭한다. 용어 “마우스 CD70”은 진뱅크 기탁번호 NP_035747을 가지는 마우스 CD70의 완전한 아미노산 서열과 같은, 마우스 서열 CD70을 지칭한다. 인간 CD70 서열은, 예를 들어, 보존적 돌연변이 또는 비-보존적 영역에서 돌연변이를 가짐으로써 진뱅크 기탁번호 P32970의 인간 CD70과는 다를 수 있으며 CD70은 진뱅크 기탁번호 P32970의 인간 CD70과 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가진다. 예를 들어, 인간 CD70의 하나의 생물학적 기능은 사이토카인 수용체 CD27에 결합하는 것이다.
특정 인간 CD70 서열은 일반적으로 진뱅크 기탁번호 P32970의 인간 CD70과 아미노산 서열에 있어서 적어도 90%가 동일할 것이고 다른 종(예, 뮤린(murine))의 CD70 아미노산 서열과 비교할 때 인간이라는 것으로서의 아미노산 서열을 식별하는 아미노산 잔기들을 함유한다. 소정의 경우에, 인간 CD70은 아미노산 서열에 있어서 진뱅크 기탁번호 P32970의 CD70과 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99%가 동일할 수 있다. 소정의 구체예에서, 인간 CD70 서열은 진뱅크 기탁번호 P32970의 CD70 서열과는 단지 10개의 아미노산 차이를 보일 수 있다. 소정의 구체예에서, 인간 CD70은 진뱅크 기탁번호 P32970의 CD70 서열과는 단지 5, 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1 개만의 아미노산 차이를 보일 수 있다. 퍼센트 동일성은 본 명세서에서 설명한 바와 같이 결정될 수 있다.
용어 “면역 반응”은, 예를 들어, 림프구, 항원 제시 세포, 식세포, 과립구, 및 상기 세포들 또는 간(항체, 사이토카인, 및 보체를 포함)에 의하여 생산되는 가용성 거대분자의 거동을 지칭하는데, 침입 병원체, 병원체에 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병리적 염증의 경우에서 있어서 정상 인간 세포 또는 조직에 선택적으로 손상을 주거나 그것을 파괴하거나 또는 그것을 인체로부터 제거하는 결과를 가져온다.
“신호 전달 경로”는 세포의 한 부분에서 세포의 또 다른 부분으로의 신호 전달에 있어서 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 사이의 생화학적 관계를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 어구 “세포 표면 수용체”는, 예를 들어, 신호를 받고 그 신호를 세포의 원형질 막을 가로질러 전달할 수 있는 분자 및 분자의 복합체를 포함한다. 본 발명의 “세포 표면 수용체”의 예는 CD70 수용체이다.
본 명세서에서 지칭되는 용어 “항체”는 온전한 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, “항원-결합부”) 또는 단일 사슬을 포함한다. “항체”는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 두개의 중쇄(H) 및 적어도 두개의 경쇄(L), 또는 이의 항원 결합부를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약자화) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL또는 Vk로 약자화) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역들은 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 불리는, 초가변 영역들로 더 나뉠 수 있는데, 이들은 골격 영역(framework region, FR)으로 불리는, 더 보존적인 영역과 섞여있다. 각 VH 및 VL은 세 개 CDR과 네 개 FR로 구성되고, 이들은 아미노 말단에서부터 카르복시 말단방향으로 하기 순서로 정렬되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 상기 항체들의 불변 영역들은, 면역계(예, 작동자(effector) 세포) 및 전통적인 보체계(classical complement system)의 제 1 요소(Clq)의 다양한 세포들을 포함한, 숙주 조직 또는 인자에 면역글로불린을 결합시키는 것을 매개할 수 있다.
용어 “항체 단편” 및 항체의 “항원-결합부”(또는 간단히 “항체부”)는, 본 명세서에 사용된 바와 같이, 항원(예, CD70)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있음을 보여 주었다. 용어 항체의 “항원-결합부” 내에 포함되는 결합 단편들의 예는, (i) Fab 단편, 즉 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 디설파이드 다리(disulfide bridge)에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) Fab’ 단편, 즉, 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3rd ed. 1993) 참조); (iv) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (v) 항체의 단일 가지(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (vi) VH 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward 등 (1989) Nature 341:544-546); (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 및 (viii) 나노바디, 즉 단일 가변 도메인 및 두 개의 불변 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 더욱이, Fv 단편의 두 개 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화 되어 있지만, 그것들은 재조합 방법들을 사용하여, 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬로서 만들어 질 수 있고, 여기에서 VL 및 VH 영역들은 짝을 이뤄 단일가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로서 공지됨; 예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; 및 Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조)를 형성하게 된다. 상기 단일 사슬 항체들은 또한 용어 항체의 “항원-결합부”의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편들은 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 기술을 사용하여 얻어질 수 있고, 상기 단편들을 본래의 항체들과 동일한 방식으로 스크리닝하여 이용할 수 있다.
“분리된 항체”는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상이한 항원 특이성들을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다(예, CD70과 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 CD70 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체들이 실질적으로 없다). 그러나, CD70에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종으로부터의 CD70 분자와 같은, 다른 항원에 교차 반응성(cross-reactivity)을 가진다. 소정의 구체예에서, 분리된 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합하지만 다른 비-인간 CD70 항원과 교차-반응하지 않는다. 더욱이, 분리된 항체는 다른 세포성 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “단일클론 항체” 또는 “단일클론 항체 조성물”은, 단일 분자 조성물의 항체 분자들의 제조물을 지칭한다. 단일클론 항체 조성물은 특정 에피토프에 대하여 단일 결합 특이성 및 친화도를 보인다.
용어 “인간 항체”는, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 골격 영역 및 CDR 영역 둘 다가 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유도되는 가변 영역을 갖는 항체들을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 항체가 불변 영역을 포함한다면, 그 불변 영역 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 상기 인간 항체들은 자연 또는 합성 변형을 포함하여, 후기 변형(later modifications)을 포함할 수 있다. 본 발명의 인간 항체들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열들에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기들(예, 시험관 내 랜덤 또는 자리-특이적(site-specific) 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이들)을 포함할 수 있다. 그러나, 본 명세서에서 사용되는, 용어 “인간 항체”는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 이식된 항체들을 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
용어 “인간 단일클론 항체”는, 골격 영역 및 CDR 영역 둘 모두 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유도된, 가변 영역을 가지는 단일 결합 특이성을 보이는 항체들을 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 인간 단일클론 항체들은, 무한증식 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 가지는, 트랜스유전자성(transgenic) 비인간 동물, 예를 들어, 트랜스유전자성 쥐로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “재조합 인간 항체”는, 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 모든 인간 항체들, 예를 들어, (a) 인간 면역글로불린 유전자들에 대하여 트랜스유전자성(transgenic)이거나 트랜스염색체성(transchromosomal)인 동물(예, 마우스)로부터 또는 이로부터 제조된 하이브리도마(하기에 설명됨)로부터 분리된 항체들, (b) 형질전환되어 인간 항체를 발현하는 숙주세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 분리된 항체들, (c) 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체들, 및 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열들을 다른 DNA 서열들로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 만들어지거나 또는 분리된 항체들을 포함한다. 상기 재조합 인간 항체들은, 골격 영역 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유도되는 가변 영역을 가진다. 그러나 소정 구체예에서, 상기 재조합 인간 항체들은 시험관 내 돌연변이유발(mutagenesis)(또는 인간 Ig 서열들에 대해 트랜스유전자성인 동물이 사용되는 경우, 생체 내 체세포 돌연변이유발)로 처리될 수 있고, 따라서 재조합 항체들의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열들은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열들로부터 유도되고 이에 관련된 것인 반면에, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 원천 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열들이다.
본 명세서에서 사용되는, “이소타입”은 중쇄 불변 영역 유전자들에 의해 암호화되는 항체 등급(예, IgM 또는 IgGl)을 지칭한다.
본 명세서에서 어구 “항원을 인식하는 항체” 및 “항원에 특이적인 항체”는 용어 “항원에 특이적으로 결합하는 항체”와 함께 상호교환적으로 이용된다.
용어 “인간 항체 유도체”는 인간 항체의 임의의 변형된 형태, 예를 들어, 항체 및 다른 제제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
용어 “인간화 항체”는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열들이 인간 골격 서열들에 접합된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다. 추가의 골격 영역 변형이 인간 골격 서열 내에서 이루어 질 수 있다.
용어 “키메릭 항체”는 가변 영역 서열들이 하나의 종으로부터 유도되고 불변 영역 서열들이 다른 종으로부터 유도된 항체들, 예를 들어, 가변 영역 서열들이 마우스 항체로부터 유도되고 불변 영역 서열들이 인간 항체로부터 유도된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
용어 “항체 의태체”는 항원을 결합하는 항체의 능력을 의태할 수 있는 분자들을 지칭하는 것으로 의도되나, 천연 항체 구조에 한정되지 않는다. 상기 항체 의태체의 예들은 어피바디(Affibodies), 디에이알핀(DARPins), 안티칼린(Anticalins), 아비머(Avimers), 및 베르사바디(Versabodies)를 포함하나 이에 제한되지 않는데, 이들 모두는, 일반적인 항체 결합을 의태하나, 구별된 메커니즘으로부터 생성되고 그것을 통해 기능하는 결합 구조를 사용한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “파트너 분자”는 항체-파트너 분자 접합체에서 항체에 접합하는 개체를 지칭한다. 파트너 분자의 예들은 약물, 독소, 마커 분자(예를 들어, 방사성동위원소와 같은 단일 원자 마커뿐만 아니라 펩티드 및 형광색소 마커와 같은 소분자 마커를 포함하나 이에 한정되지 않음), 단백질 및 치료제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, “인간 CD70에 특이적으로 결합”하는 항체는 5 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게 1 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게 6 x 10-9 M 이하, 더 바람직하게 3 x 10-9 M 이하, 더욱 더 바람직하게 2 x 10-9 M 이하의 KD로 인간 CD70에 결합하는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “Kassoc” 또는 “Ka”는, 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 지칭하는 것으로 의도되고, 반면 본 명세서에서 사용되는, 용어 “Kdis” 또는 “Kd”는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “KD”는, Kd 대 Ka 의 비율(즉, Kd/Ka)로부터 얻어지고, 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. 항체들에 대한 KD 값은 당해 분야에 설정된 방법들을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 KD를 결정하는 바람직한 방법은 표면 플라즈몬(plasmon) 공명, 바람직하게, 비아코어(Biacore®) 시스템과 같은 바이오센서 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, IgG 항체에 대한 “고친화도”라는 용어는 표적 항원에 대하여 1 x10-7 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하, 및 더욱 더 바람직하게는 1 x 10-10 M 이하의 KD를 가지는 항체를 지칭한다. 그러나, “고친화도” 결합은 다른 항체 이소타입에 대하여 다양해질 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 “고친화도” 결합은 1 x 10-7 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 x 10-9 M 이하의 KD를 가지는 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는, 단백질 또는 세포에 “실질적으로 결합하지 않는”이라는 용어는 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나 또는 고친화도로 결합하지 않는, 즉 1 x 10-6 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-5 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10-4 M 이하, 더 바람직하게는 1 x 10- 3 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 1 x 10- 2 M 이하의 KD로 단백질 또는 세포에 결합하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “대상체”는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 “비인간 동물”은 모든 척추동물, 예를 들어, 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 어류, 파충류 등과 같은, 포유 동물 및 비포유동물을 포함한다.
기호 “-”는, 결합으로서 사용되거나 결합에 수직으로 표시되거나, 나타내는 부분이 분자, 고체 지지체 등의 잔여 부분에 부착되는 지점을 나타낸다.
용어 “알킬”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이의 조합을 의미하고, 이들은 충분히 포화되거나, 단일불포화되거나 또는 다중불포화되며, 지정된 탄소 원자의 수(즉, C1-C10은 하나부터 열 개의 탄소를 의미함)를 갖는, 이가 및 다가 라디칼을 포함할 수 있다. 포화 탄화수소 라디칼의 예들은, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 사이클로헥실, (사이클로헥실)메틸, 사이클로프로필메틸, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등의 동족체(homologs) 및 이성질체(isomers)와 같은 기들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 가지는 것이다. 불포화 알킬기의 예들은, 비닐, 2-프로페닐, 크로틸, 2-이소펜테닐, 2-(부타디에닐), 2,4-펜타디에닐, 3-(1,4-펜타디에닐), 에티닐, 1- 및 3-프로피닐, 3-부티닐, 및 고도 동족체 및 이성질체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한 용어 “알킬”은, 다르게 기술되지 않으면, “헤테로알킬”과 같은, 하기에 더 자세히 정의되는 알킬의 유도체들을 포함하는 것을 의미한다. 탄화수소기에 한정되는, 알킬기는 “호모알킬(homoalkyl)”로 불리운다.
용어 “알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, -CH2CH2CH2CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 알칸으로부터 유도되는 이가 라디칼을 의미하고, 또한 “헤테로알킬렌”으로서 하기에 설명된 기들을 포함한다. 일반적으로, 알킬(또는 알킬렌)기는 1개부터 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기들이 본 발명에서 바람직하다. “저급 알킬” 또는 “저급 알킬렌”은, 일반적으로 8개 이하의 탄소 원자를 갖는, 더 짧은 사슬 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 “헤테로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 안정한 직쇄 또는 분지쇄, 또는 사이클릭 탄화수소 라디칼, 또는 이들의 조합을 의미하는데, 정해진 수의 탄소 원자와 O, N, Si, 및 S으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어지며, 여기에서 질소, 탄소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 사급화될(quaternized) 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, S, 및 Si은 헤테로알킬기의 임의의 내부 위치에 또는 알킬기가 분자의 잔여 부분에 부착되는 위치에 위치할 수 있다. 예들은, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, 및 -CH=CH-N(CH3)-CH3을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3 및 -CH2-O-Si(CH3)3와 같이, 두 개까지의 헤테로원자가 연속적일 수 있다. 유사하게, 용어 “헤테로알킬렌”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 일부로서, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-에 의하여 예시되나 이에 한정되지 않는, 헤테로알킬로부터 유도되는 이가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기에 있어서, 헤테로원자는 또한 사슬 말단의 어느 한쪽 또는 둘 다를 차지할 수 있다(예, 알킬렌옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노, 등등). 용어 “헤테로알킬” 및 “헤테로알킬렌”은 폴리(에틸렌 글리콜) 및 이의 유도체(예를 들어, Shearwater Polymers Catalog, 2001 참조)를 포함한다. 더 나아가, 알킬렌 및 헤테로알킬렌 연결기에 있어서, 연결기의 식이 쓰여진 방향에 의하여 연결기의 어떠한 방향도 암시되지 않는다. 예를 들어, 식 -C(O)2R’은 -C(O)2R’- 및 -R’C(O)2- 둘 다를 나타낸다.
용어 “저급”은 용어 “알킬” 또는 “헤테로알킬”과 조합하여 1 개부터 6개의 탄소 원자를 갖는 부분을 지칭한다.
용어들 “알콕시”, “알킬아미노”, “알킬설포닐”, 및 “알킬티오”(또는 티오알콕시)는 그들의 일반적인 의미로 사용되며, 각각, 산소 원자, 아미노기, SO2기, 또는 황 원자를 통하여 분자의 잔여 부분에 부착된 알킬기를 지칭한다. 용어 “아릴설포닐”은 SO2기를 통하여 분자의 잔여 부분에 부착된 아릴기를 지칭하며, 용어 “설피드릴”은 SH기를 지칭한다.
일반적으로, “아실 치환기”는 또한 상기에서 설명된 기로부터 선택된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “아실 치환기”는 본 발명의 화합물의 다중고리 핵에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 카르보닐 탄소에 부착되어 카르보닐 탄소의 원자가(valence)를 맞추는 기들을 지칭한다.
용어 “사이클로알킬” 및 “헤테로사이클로알킬”은, 단독으로 또는 다른 용어와 조합하여, 다른 언급이 없으면, 각각, 치환 또는 비치환 “알킬” 및 치환 또는 비치환 “헤테로알킬”의 고리 형을 나타낸다. 추가적으로, 헤테로사이클로알킬에 있어서, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 잔여 부분에 부착된 위치를 점유할 수 있다. 사이클로알킬의 예는, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 1-사이클로헥세닐, 3-사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 등등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 헤테로사이클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라히드로티엔-2-일, 테트라히드로티엔-3-일, 1-피페라지닐, 2-피페라지닐, 등등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 고리 구조의 헤테로원자 및 탄소 원자는 선택적으로 산화될 수 있다.
용어 “할로” 또는 “할로겐”은, 단독으로 또는 다른 치환기의 부분으로서, 다른 언급이 없으면, 불소, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자를 의미한다. 추가적으로, “할로알킬”과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들면, 용어 “할로(C1-C4)알킬”은, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필, 등등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것을 의미한다.
용어 “아릴”은, 다른 언급이 없으면, 함께 융합되거나 공유 결합되어 단일 고리 또는 다중 고리(바람직하게는 1개부터 3개의 고리)가 될 수 있는 치환 또는 비치환 다중포화, 방향족, 탄화수소 치환기를 의미한다. 용어 “헤테로아릴”은, N, O, 및 S으로부터 선택된 1개부터 4개의 헤테로원자를 포함하는 아릴기(또는 고리)를 지칭하는데, 여기에서, 질소, 탄소 및 황 원자는 임의로 산화될 수 있으며, 질소 원자(들)는 임의로 사급화될 수 있다. 헤테로아릴기는 헤테로원자를 통해 분자의 잔여 부분에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴기들의 비-제한적인 예들은 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-비페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라지닐, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸리닐, 2-벤지미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹사리닐, 5-퀴녹사리닐, 3-퀴놀릴, 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기에서 기술된 아릴 및 헤테로아릴 고리계의 각각의 치환기는 하기에서 기술된 허용가능한 치환기들의 군으로부터 선택된다. “아릴” 및 “헤테로아릴”은 또한 하나 이상의 비-방향족 고리계가 융합되거나, 그렇지 않으면, 아릴 또는 헤테로아릴 시스템에 결합된 고리계를 포함한다.
요약하면, 용어 “아릴”은 다른 용어들(예, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)과 조합하여 사용될 때, 상기에서 정의된 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 다를 포함한다. 따라서, 용어 “아릴알킬”은, 탄소 원자(예, 메틸렌기)가 예를 들면, 산소 원자에 의해 대체된(예, 펜옥시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필, 등등) 알킬기들을 포함하는, 알킬기(예, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸, 등등)에 아릴기가 부착된 라디칼들을 포함하는 것을 의미한다.
상기 용어들(예, “알킬”, “헤테로알킬”, “아릴” 및 “헤테로아릴”) 각각은 지시된 라디칼의 치환 및 비치환 형태 둘 다를 포함한다. 라디칼의 각 유형의 바람직한 치환기는 하기에 제공된다.
알킬, 및 헤테로알킬 라디칼의 치환기(알킬렌, 알케닐, 헤테로알킬렌, 헤테로알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 헤테로사이클로알케닐로 흔히 지칭되는 그러한 기들을 포함함)는 일반적으로 “알킬 치환기” 및 “헤테로알킬 치환기”로 각각 지칭되고, -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -할로겐, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR-C(NR’R”R’”)=NR””, -NR-C(NR’R”)=NR’”, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN 및 -NO2 로부터 선택되는 여러 가지 기들 중 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 그 수는 0 부터 (2m’+1)의 범위를 가지는데, m’은 상기 라디칼 내에서 탄소 원자의 총 수이다. R’, R”, R”’ 및 R”” 각각은 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 예를 들어, 1-3 할로겐으로 치환된 아릴, 치환 또는 비치환 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시기, 또는 아릴알킬기를 지칭한다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들어, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재하는 각각의 R’, R”, R”’ 및 R”” 기들로서 독립적으로 선택된다. R’ 및 R”가 동일한 질소 원자에 부착되면, 이들은 질소 원자와 결합되어 5-, 6-, 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있다. 예를 들어, -NR’R”은 1-피롤리디닐 및 4-모르폴리닐을 포함하나, 이에 한정되지 않는 것으로 의미된다. 치환기에 대해 상술한 것으로부터, 통상의 기술자는 용어 “알킬”이 할로알킬(예, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, 등등)과 같은, 수소기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기를 포함하는 것으로 의미하는 것을 이해할 것이다.
알킬 라디칼에 대해 기술된 치환기와 유사하게, 아릴 치환기 및 헤테로아릴 치환기는 일반적으로 “아릴 치환기” 및 “헤테로아릴 치환기”로 각각 지칭되며, 예를 들어, 0부터 방향족 고리계 상의 개방 원자가(open valence)의 총 수까지의 범위에서, 할로겐, -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R”, -SR’, -할로겐, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)2R’, -NR-C(NR’R”)=NR’”, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R”, -NRSO2R’, -CN 및 -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시, 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 다양화되고 선택되는데; 여기에서, R’, R”, R”’ 및 R””은 바람직하게는 수소, (C1-C8)알킬 및 헤테로알킬, 비치환 아릴 및 헤테로아릴, (비치환 아릴)-(C1-C4)알킬, 및 (비치환 아릴)옥시-(C1-C4)알킬로부터 독립적으로 선택된다. 본 발명의 화합물이 하나 이상의 R기를 포함할 때, 예를 들면, 각각의 R기들은 하나 이상의 이들 기가 존재하는 각각의 R’, R”, R’” 및 R””기들로서 독립적으로 선택된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 아릴 치환기들 중 둘은 식-T-C(O)-(CRR’)q-U-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR’- 또는 단일 결합이고, q는 0부터 3까지의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -A-(CH2)r-B-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, A 및 B는 독립적으로 -CRR’, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR’- 또는 단일결합이고, r은 1부터 4까지의 정수이다. 그렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합들 중 하나는 이중결합으로 임의로 대체될 수 있다. 대안적으로 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환기들 중 둘은 식 -(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-의 치환기로 임의로 대체될 수 있는데, 여기에서, s 및 d는 독립적으로 0부터 3까지의 정수이고, X는 -O-, -NR’, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, 또는 -S(O)2NR’-이다. 치환기 R, R’, R” 및 R’”은 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환 (C1-C6) 알킬로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “디포스페이트”는 두 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 용어 “트리포스페이트”는 세 개의 포스페이트기를 포함하는 인산의 에스테르를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 갖는 특정 약물은 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00001
본 명세서에서 사용되는, 용어 “헤테로원자”는 산소(O), 질소(N), 황(S) 및 실리콘(Si)을 포함한다.
기호 “R”은 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로시클릴 기들로부터 선택되는 치환기를 나타내는 일반적인 약어이다.
본 발명의 다양한 관점은 하기의 소단락에서 좀더 자세히 기술된다.
특정 기능적 특성을 가지는 항-CD70 항체
본 발명의 항체는 항체의 특정 기능적 특징 또는 특성에 의하여 특징지어진다. 예를 들어, 상기 항체는 세포의 표면에서 발현되는 인간 CD70과 같은, 인간 CD70에 특이적으로 결합한다. 바람직하게, 본 발명의 항체는 고친화도, 예를 들어 1 x 10-7 M 이하의 KD로, 더 바람직하게는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 및 더욱더 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하의 KD로 CD70에 결합한다. CD70에 대한 상기 항체의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 분석법은 예를 들어, ELISA, 웨스텐 블랏 및 RIA를 포함하여, 당해 분야에 공지되어 있다. 적절한 분석법은 실시예들에 자세히 기재되어 있다. 또한 상기 항체의 결합 동역학(예, 결합 친화도)이 ELISA, 스캐챠드(Scatchard) 및 비아코어(Biacore) 분석법과 같은, 당해 분야에 공지된 표준 분석법에 의하여 평가될 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 항체는 신장 암종 종양 세포주, 예를 들어, 786-O, A-498, ACHN, Caki-1 또는 Caki-2 세포주에 결합할 수 있다. 또 다른 예로서, 본 발명의 항체는 B-세포 종양 세포주, 예를 들어, 다우디, HuT 78, 라지 또는 그란타-519 세포주에 결합할 수 있다.
본 발명의 항-CD70 항체는 인간 CD70에 결합하고 바람직하게는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다:
(a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD70 에 결합하고; 및
(b) 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합하며;
(c) 림프종 세포주, 예를 들어 B-세포 종양 세포주에 결합하고;
(d) CD70-발현 세포에 의하여 내재화하며;
(e) CD70-발현 세포에 대한 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 나타내고; 및
(f) 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 세포의 성장을 억제한다.
바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 두 개를 나타낸다. 더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 세 개를 나타낸다. 보다 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 네 개를 나타낸다. 보다 더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 다섯 개를 나타낸다. 더욱더 바람직하게, 상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 여섯 개 모두를 나타낸다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 5 x 10-9 M 이하의 친화도로 CD70에 결합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체가 세포독소에 접합할 때 상기 항체는 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 성장을 억제한다.
본 발명의 항체의 CD70에 대한 결합은 당해 분야에 잘 확립되어 있는 하나 이상의 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 항체가, 형질감염되어 세포 표면에서 CD70을 발현하는 CHO 세포 또는 예를 들어 786-O, A498, ACHN, Caki-1, 및/또는 Caki-2와 같은 CD70-발현 세포주(예, 세포주의 적절한 분석법 및 더 자세한 기재는 실시예 4 및 5를 참조)와 같은, 인간 CD70을 발현하는 세포주와 반응하는 유세포 분석법으로 항체를 테스트할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 결합 동역학(예, KD 값)을 포함하여, 상기 항체의 결합을 비아코어 결합 분석법으로 테스트할 수 있다. 또 다른 적절한 결합 분석법은 ELISA 분석법, 예를 들어 재조합 CD70 단백질을 이용하는 것을 포함한다(예, 적절한 분석법에 대해서는 실시예 1 참조).
바람직하게, 본 발명의 항체는 5 x 10-8 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합하거나, 3 x 10-8 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합하거나, 1 x 10-8 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합하거나, 7 x 10-9 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합하거나, 6 x 10-9 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합하거나 또는 5 x 10-9 M 이하의 KD로 CD70 단백질에 결합한다. CD70에 대한 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 표준 비아코어 분석법(standard BIACORE analysis)으로 평가될 수 있다.
CD70-발현 세포에 의한 항-CD70 항체의 내재화를 평가하는 표준 분석법은 당해 분야에 공지되어 있다(예, 실시예 7 및 21에 기재된 Hum-ZAP 및 면역형광 분석법 참조). 또한 CD27로의 CD70의 결합, 및 항-CD70 항체에 의한 상기 결합의 억제를 평가하는 표준 분석법이 당해 분야에 공지되어 있다(예, 실시예 17에 기재된 분석법 참조). 또한 CD70-발현 세포에 대항한 ADCC를 평가하는 표준 분석법이 당해 분야에 공지되어 있다(예, 실시예 9에 기재된 ADCC 분석법 참조). 또한 항-CD70 항체, 및 이의 세포독소 접합체에 의한 생체 내 종양 세포 성장의 억제를 평가하는 표준 분석법이 당해 분야에 공지되어 있다(예, 실시예 18, 19, 24-31 및 36-41에 기재된 종양 이종이식 마우스 모델 참조).
본 발명의 바람직한 항체는 인간 단일클론 항체이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 예를 들어, 키메릭 또는 인간화 단일클론 항체이다.
단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4
본 발명의 예시적인 항체는 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 분리되고 구조적으로 특징지워진 인간 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4를 포함한다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VH 아미노산 서열은 각각 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 73, 및 6에 보여진다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VL 아미노산 서열은 각각 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 11, 및 12에 보여진다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 11의 VL 아미노산 서열을 가진다). 이들 항체의 각각이 CD70에 결합할 수 있으면, VH 및 VL 서열은 “혼합되고 짝지어져서” 본 발명의 다른 항-CD70 결합 분자를 만들 수 있다. 상기 “혼합되고 짝지어진” 항체의 CD70 결합을 상기 및 실시예에 기재된 결합 분석법(예, FACS 또는 ELISAs)을 이용하여 테스트할 수 있다. 바람직하게, VH 및 VL 사슬이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 VH/VL 접합으로부터의 VH 서열은 구조적으로 유사한 VH 서열로 대체된다. 마찬가지로, 바람직하게 특정 VH/VL 접합으로부터의 VL 서열은 구조적으로 유사한 V L서열로 대체된다.
따라서, 일 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하고:
(a) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 및 73으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
(b) 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
바람직한 중쇄 및 경쇄 조합은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열번호 5 또는 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역.
다른 관점에서, 본 발명은 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4 또는 이의 조합들의 중쇄 및 경쇄 CDR1들, CDR2들 및 CDR3들을 포함하는 항체를 제공한다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VH CDR1들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 17 및 18에 보인다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 17의 VH CDR1 서열을 가진다). 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VH CDR2들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 23 및 24에 보인다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 23의 VH CDR2 서열을 가진다). 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VH CDR3들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 75, 및 30에 보인다.
2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 Vk CDR1들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 35 및 36에 보인다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 35의 Vk CDR1 서열을 가진다). 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 Vk CDR2들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 41 및 42에 보인다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 41의 Vk CDR2 서열을 가진다). 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 Vk CDR3들의 아미노산 서열들이 각각 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 47 및 48에 보인다(69A7 및 69A7Y 둘 다 서열번호 47의 Vk CDR3 서열을 가진다). 카밧 시스템(Kabat system)을 이용하여 CDR 영역이 묘사되어 있다(Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
이러한 항체 각각이 CD70에 결합할 수 있고 항원-결합 특이성이 CDR1, CDR2, 및 CDR3 영역들에 의하여 일차적으로 제공된다면, VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들과 Vk CDR1, CDR2 및 CDR3 서열들은 “혼합되고 짝지어져서”(즉, 비록 각 항체가 VH CDR1, CDR2 및 CDR3, 및 Vk CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하더라도, 상이한 항체들로부터의 CDR들이 혼합되고 짝지어질 수 있음), 본 발명의 다른 항-CD70 결합 분자를 만들 수 있다. 상기 “혼합되고 짝지어진” 항체의 CD70 결합은 상기 및 실시예에 기재된 결합 분석법(예, FACS, ELISAs, 비아코어(Biacore) 분석법)을 이용하여 테스트할 수 있다. 바람직하게, VH CDR 서열들이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 VH 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 마찬가지로, Vk CDR 서열들이 혼합되고 짝지어질 때, 특정 Vk 서열의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 바람직하게는 구조적으로 유사한 CDR 서열(들)로 대체된다. 하나 이상의 VH 및/또는 VL CDR 영역 서열들을 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4에 대하여 본 명세서에 공지된 CDR 서열들로부터의 구조적으로 유사한 서열들로 치환함으로써 신규한 VH 및 VL 서열들을 만들 수 있다는 것은 통상적으로 숙련된 기술자에게는 확실히 명백하다.
따라서, 다른 관점에서, 본 발명은 다음을 포함하는 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다:
(a) 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 75로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
여기에서, 상기 항체는 CD70, 바람직하게는 인간 CD70에 특이적으로 결합한다.
바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 29 또는 75를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
(b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
(c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
(d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
(e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
(f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3.
CDR3 도메인은, CDR1 및/또는 CDR2 도메인(들)과 독립적으로, 단독으로 동종(cognate) 항원에 대한 항체의 결합 특이성을 결정지을 수 있다는 것과 공통의 CDR3 서열에 근거하여 동일한 결합 특이성을 가지는 다중 항체들이 예상대로 발생될 수 있다는 것이 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Klimka 등, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3만을 사용한 인간화된 항-CD30 항체의 생산을 설명함); Beiboer 등, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (부모 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 사용한 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체를 설명함); Rader 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (뮤린 항-인테그린 αvβ3 항체 LM609의 중쇄 및 경쇄 가변 CDR3 도메인을 사용한 인간화된 항-인테그린 αvβ3 항체들의 패널을 설명하고 있고 여기에서 각 항체 구성원은 CDR3 도메인 외부에 있고 부모 뮤린 항체와 동일하거나 더 높은 친화도를 가지고 부모 뮤린 항체와 동일한 에피토프를 결합할 수 있는 고유의 서열을 포함함); Barbas 등, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (CDR3 도메인은 항원 결합에 가장 중대한 공헌을 한다는 것을 개시함); Barbas 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (인간 태반 DNA에 대한 세 개 Fab(SI-1, SI-40, 및 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열들을 항-파상풍 유독소(toxoid) Fab의 중쇄에 접합하고 이로써 기존의 중쇄 CDR3을 대체하는 것을 설명하고, CDR3 도메인 단독으로 결합 특이성을 부여한다는 것을 증명함); 및 Ditzel 등, J. Immunol. 157:739-749 (1996) (부모 다중특이성 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 만을 단일특이적인 IgG 파상풍 유독소-결합 Fab p313 항체의 중쇄에 전달하는 것으로도 부모 Fab의 결합 특이성을 유지하는 데 충분하다는 결과를 나타낸 이식 연구를 설명함); Berezov 등, BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001) (항-HER2 단일클론 항체의 CDR3에 근거한 펩티드 의태체를 설명함); Igarashi 등, J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995) (항-포스파티딜세린 항체의 CDR3 도메인에 해당하는 12 아미노산 합성 폴리펩티드를 설명함); Bourgeois 등, J. Virol 72:807-10 (1998) (항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항체의 중쇄 CDR3 도메인으로부터 유도된 단일 펩티드가 시험관 내에서 바이러스를 중화할 수 있다는 것을 보여줌); Levi 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993) (뮤린 항-HIV 항체의 중쇄 CDR3 도메인에 근거한 펩티드를 설명함); Polymenis와 Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994) (Z-DNA-결합 항체의 중쇄 CDR3 영역을 접합함으로써 scFv의 결합을 가능하게 함을 설명함); 및 Xu와 Davis, Immunity 13:37-45 (2000) (중쇄 CDR3에서의 다양성이 동일한 IgM 분자가 다양한 합텐(hapten)과 단백질 항원을 구별하도록 하는데 충분하다는 것을 설명함)을 참조. 또한, 단일 CDR 도메인에 의하여 정의된 특허된 항체를 설명하는, 미국 특허 번호 제6,951,646호; 제6,914,128호; 제6,090,382호; 제6,818,216호; 제6,156,313호; 제6,827,925호; 제5,833,943호; 제5,762,905호 및 제5,760,185호를 참조. 이러한 참조 문헌 각각은 전체적으로 본 명세서 상에 참조로서 통합되어 있다.
따라서, 본 발명은 인간 또는 비-인간 동물로부터 유도되는 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 상기 단일클론 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 소정의 관점 내에서, 본 발명은 마우스 또는 래트 항체와 같은, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 상기 단일클론 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 어떤 구체예 내에서, 비-인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 해당 부모 비-인간 항체와 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 해당 부모 비-인간 항체와 같은 기능적 특징을 보유하며; (c) 해당 부모 비-인간 항체와 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 비-인간 항체와 유사한 결합 친화도를 가진다.
다른 관점 내에서, 본 발명은, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체와 같은 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 상기 인간 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 관점 내에서, 본 발명은, 예를 들어, 비-인간 동물로부터 얻은 인간 항체와 같은, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단일클론 항체를 제공하는데, 여기에서 상기 제 1 인간 항체는 CD70에 특이적으로 결합할 수 있고 제 1 인간 항체로부터의 상기 CDR3 도메인은 CD70에 대한 결합 특이성이 부족한 인간 항체에서 CDR3 도메인을 대체하여 CD70에 특이적으로 결합할 수 있는 제 2 인간 항체를 생성한다. 어떤 구체예 내에서, 제 1 인간 항체로부터의 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 그러한 독창적인 항체는 (a) 해당 부모 제 1 인간 항체와 결합을 위한 경쟁을 할 수 있고; (b) 해당 부모 제 1 인간 항체와 같은 기능적 특징을 보유하며; (c) 해당 부모 제 1 인간 항체와 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 해당 부모 제 1 인간 항체와 유사한 결합 친화도를 가진다.
특정 생식계열 서열을 가지는 항체
소정 실시예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VH 3-30.3 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VH 3-33 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VH 4-61 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VH 3-23 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
다른 바람직한 구체에에서, 본 발명은 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VK L18 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VK L15 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 인간 VK A27 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부를 제공하며, 여기에서 상기 항체는:
(a) 인간 VH 3-30.3, 3-33, 4-61, 또는 3-23 유전자(상기 유전자는 각각 서열번호 61, 62, 63, 및 64에 설명된 아미노산 서열을 암호화한다)의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역을 포함하고;
(b) 인간 VK L6, L18, L15, 또는 A27 유전자(상기 유전자는 각각 서열번호 65, 66, 67, 및 68에 설명된 아미노산 서열을 암호화한다)의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역을 포함하며; 및
(c) 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
또한 상기 항체는, 인간 CD70에 대한 고친화도 결합, CD70-발현 세포에 의한 내재화, CD70-발현 세포에 대항한 ADCC를 매개하는 능력 및/또는 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 종양 성장을 억제하는 능력과 같은, 상기에 상세히 기재된 기능적 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다.
VH 3-30.3 및 VK L6의 VH 및 VK를 각각 갖는 항체의 예는 2H5이다. VH 3-30.3 및 VK L18의 VH 및 VK를 각각 갖는 항체의 예는, 10B4이다. VH 3-33 및 VK L15의 VH 및 VK를 각각 갖는 항체들의 예는 8B5 및 18E7이다. VH 4-61 및 VK L6의 VH 및 VK를 각각 갖는 항체의 예는 69A7 및 69A7Y이다. VH 3-23 및 VK A27의 VH 및 VK를 각각 갖는 항체의 예는 1F4이다.
또한 상기 항체들은 인간 CD70에 대한 고친화도 결합, CD70-발현 세포에 의한 내재화, 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합, 림프종 세포주에 결합, CD70-발현 세포에 대항한 ADCC를 매개하는 능력, 및/또는 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 종양 성장을 억제하는 능력과 같은, 상기에 상세히 기재된 기능적 특징 중 하나 이상을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 인간 항체는, 항체의 가변 영역들이 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 얻어진다면, 특정 생식계열 서열의 “생성물”인 또는 “이로부터 유도된” 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 시스템들은 인간 면역글로불린 유전자를 지니는 유전자이식 마우스를 관심의 항원으로 면역화하거나 또는 파지 상에 전시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심의 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 “생성물”인 또는 “이로부터 유도된” 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열들과 비교하고 서열에 있어서 인간 항체의 서열과 가장 가까운(즉, 최대 % 상동성) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그러한 것으로 확인될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 “생성물”인 또는 “이로부터 유도된” 인간 항체는, 예를 들어, 자연적으로 발생하는 체세포 돌연변이 또는 자리-지정 돌연변이(site-directed mutation)의 인위적 도입으로 인해 생식계열 서열과 비교하여 상이한 아미노산을 포함할 수 있다. 그러나, 선택된 인간 항체는 일반적으로는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 아미노산 서열에 있어서 적어도 90% 동일하고 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열들(예를 들어, 뮤린 생식계열 서열들)과 비교할 때, 인간이라는 것으로서의 인간 항체를 식별하는 아미노산 잔기들을 포함한다. 소정의 경우에, 인간 항체는, 아미노산 서열에 있어서, 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과, 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 일반적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 10개 아미노산 차이만을 보일 것이다. 소정의 경우에, 상기 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열과 단지 5 개 또는 심지어 4, 3, 2, 또는 1 개 아미노산 차이만을 보일 수 있다.
상동성 항체(Homologous Antibodies)
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 본 명세서에 기재된 바람직한 항체들의 아미노산 서열들과 상동성인 아미노산 서열들을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 항체들은 본 발명의 항-CD70 항체들의 소망의 기능적 특성을 보유한다.
예를 들어, 본 발명은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하며, 여기에서:
(a) 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 73으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 및 12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며; 및
(c) 상기 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 인간 CD70에 대한 고친화도 결합, CD70-발현 세포에 의한 내재화, 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합, 림프종 세포주에 결합, CD70-발현 세포에 대항한 ADCC를 매개하는 능력, 및/또는 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 종양 성장을 억제하는 능력과 같은, 상기에서 검토된 기능적 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기 항체는 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다.
다른 구체예에서, VH 및/또는 VL 아미노산 서열들은 상기 설명된 서열들과 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 상기 설명된 서열들의 VH 및 VL 영역과 높은 (즉, 80% 이상) 상동성을 가지는 VH 및 VL 영역을 갖는 항체는 서열번호 1-12 및 73을 암호화하는 핵산 분자의 돌연변이유발(예, 자리-지정 또는 PCR-매개 돌연변이유발)에 의하여 얻은 후, 본 명세서에 기재된 기능적 분석법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에서 설명된 기능)에 대하여 상기 암호화된 변경된 항체를 테스트할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 두 개의 아미노산 서열 간의 상동성 백분율은 두 서열 간의 동일성 백분율에 대응된다. 두 서열 간의 동일성 백분율은, 두 서열의 최적 정렬에 대하여 도입될 필요가 있는, 간격들의 수 및 각 간격의 길이를 고려하여, 상기 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100). 두 서열 간 서열의 비교 및 백분율 동일성의 결정은, 하기 비-제한적 실시예에 기재된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 이룰 수 있다.
두 개 아미노산 서열간의 동일성 백분율은 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있으며, PAM120 가중치 잔기 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 사용한다. 또한, 두 개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 Needleman 및 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있고, 이 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 이용가능) 내의 GAP 프로그램에 통합되어 있으며, Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스와, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 간격 가중치와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 단백질 서열들을 “조회(query) 서열”로 사용하여 공공 데이터베이스에 대하여 검색을 수행함으로써, 예를 들어, 연관 서열들을 확인할 수 있다. 상기 검색은 Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어길이= 3을 사용하여 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 항체 분자와 상동성인 아미노산 서열들을 얻을 수 있다. 비교 목적상 이격된 정렬들을 얻기 위해, Gapped BLAST를 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수들이 유용하다. www.ncbi.nlm.nih.gov 참조.
보존적 변형체(conservative modifications)를 갖는 항체
소정의 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기에서 이러한 CDR 서열들의 하나 이상은 공지의 항-CD70 항체 또는 이의 보존적 변형체에 기초한 특정 아미노산 서열들을 포함하고 상기 항체는 본 발명의 항-CD70 항체들의 소망의 기능적 특성을 보유한다. 항원 결합을 제거하지 않는 소정의 보존적 서열 변형체가 만들어질 수 있다는 것은 당해 분야에서 이해되고 있다. 예를 들어, Brummell 등. (1993) Biochem 32:1180-8(살모넬라에 특이적인 항체의 CDR3 중쇄 도메인에서 돌연변이 분석법을 설명함); de Wildt 등 (1997) Prot. Eng. 10:835-41(항-UA1 항체에서 돌연변이 연구를 설명함); Komissarov 등 (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870(HCDR3의 중앙부에서의 돌연변이가 친화도를 없애거나 감소시켰음을 보여줌); Hall 등 (1992) J. Immunol. 149:1605-12(CDR3 영역에서의 단일 아미노산 변화가 결합 활성도를 없앴음을 설명함); Kelley와 O’Connell (1993) Biochem. 32:6862-35(항원 결합에서 Tyr 잔기의 기여를 설명함); Adib-Conquy 등 (1998) Int. Immunol. 10:341-6 (결합에서 소수성의 영향을 설명함) 및 Beers 등 (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43 (HCDR3 아미노산 돌연변이체를 설명함)을 참조. 따라서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공하며, 여기에서:
(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 30, 및 75의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하며; 및
(c) 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합한다.
추가적으로 또는 대안적으로, 상기 항체는 인간 CD70에 대한 고친화도 결합, CD70-발현 세포에 의한 내재화, 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합, 림프종 세포주에 결합, CD70-발현 세포에 대항한 ADCC를 매개하는 능력, 및/또는 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 종양 세포의 종양 성장을 억제하는 능력과 같은, 상기에서 검토된 기능적 특성들 중 하나 이상을 가질 수 있다.
바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고; 상기 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36의 아미노산 서열들 및 이의 보존적 변형체로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
다양한 구체예에서, 상기 항체는 예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메릭 항체일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 “보존적 서열 변형체”는 그 아미노산 서열을 포함하는 항체의 결합 특징을 유의하게 변화 또는 변경하지 않는 아미노산 변형체를 지칭하는 것으로 의도된다. 상기 보존적 변형체는 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 자리-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발과 같이, 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 본 발명의 항체에 변형을 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 가지는 아미노산 잔기의 군들(families)은 당해 분야에 정의되어 있다. 이러한 군들은 염기성 측쇄(예, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예, 아스파르트 산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 가진 아미노산들을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군(family)으로부터 나온 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 이러한 변경된 항체는 본 명세서에 기재된 기능 분석법을 사용하여 보유된 기능(즉, 상기에서 설명된 기능들)에 대하여 테스트할 수 있다
본 발명의 항-CD70 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 CD70 단일클론 항체(즉, CD70에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 임의의 단일클론 항체와 교차-경쟁하는 능력을 가진 항체)에 의하여 인식된 인간 CD70 상에서 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참조 항체는 단일클론 항체 2H5(서열번호 1 및 7에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 10B4(서열번호 2 및 8에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 8B5(서열번호 3 및 9에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 18E7(서열번호 4 및 10에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 69A7(서열번호 5 및 11에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 69A7Y(서열번호 73 및 11에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐) 또는 단일클론 항체 1F4(서열번호 6 및 12에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐)일 수 있다.
상기 교차-경쟁하는 항체들은 표준 CD70 결합 분석법에서 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4와 교차-경쟁하는 그들의 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 표준 ELISA 분석법이 이용될 수 있는데, 여기에서, 재조합 인간 CD70 단백질은 플레이트 상에 고정되고, 항체들 중 하나가 형광적으로 표지되며, 표지 항체의 결합을 경쟁하는 비-표지 항체의 능력이 평가된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 비아코어 분석법을 항체의 교차-경쟁 능력을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들어 비아코어를 이용한 에피토프 결합 실험은 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4 항체가 CD70상의 별개의 에피토프에 결합하는 것을 증명하였다. 인간 CD70에 대한, 예를 들어, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4의 결합을 억제하는 테스트 항체의 능력은 상기 테스트 항체가 인간 CD70에 결합하는 것에 대하여 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4와 경쟁할 수 있고 그럼으로써 2H5(서열번호 1 및 7에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐 ) , 10B4(서열번호 2 및 8에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 8B5(서열번호 3 및 9에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 18E7(서열번호 4 및 10에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 69A7(서열번호 5 및 11에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 69A7Y (서열번호 73 및 11에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐), 또는 1F4 (서열번호 6 및 12에서 각각 보여주는 바와 같은 VH 및 VL 서열을 가짐)에 의하여 인식된 인간 CD70 상의 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 증명한다.
바람직한 구체예에서, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4에 의하여 인식된 인간 CD70 상에서 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단일클론 항체이다. 상기 인간 단일클론 항체는 실시예들에서 기재된 바와 같이 제조 및 분리될 수 있다.
조작되고 변형된 항체
본 발명의 항체는 본 명세서에서 개시된 하나 이상의 VH 및/또는 VL 서열들을 가지는 항체를 출발 물질로 사용하여 제조함으로써 변형된 항체를 조작할 수 있으며, 상기 변형된 항체는 상기 출발 항체와는 변경된 특성을 가질 수 있다. 하나 또는 양 쪽 가변 영역(즉, VH 및/또는 VL) 내의, 예를 들어, 하나 이상의 CDR 영역 내 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내의 하나 이상의 잔기를 변형시킴으로써 항체를 조작할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 불변 영역(들) 내의 잔기들을 변형함으로써, 항체를 조작하여, 예를 들어, 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 바꿀 수 있다.
소정의 구체예에서, CDR 접합은 항체의 가변 영역을 조작하는 데 사용될 수 있다. 항체들은 주로, 여섯 개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역(CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해서 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, CDR 내에 있는 아미노산 서열들은 CDR바깥의 서열들보다 개별적 항체들 간에 있어서 더욱 다양하다. CDR 서열들이 대부분 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 가지는 상이한 항체로부터 유도된 골격 서열들에 접합된, 특이적 자연발생 항체들로부터 나온 CDR 서열들을 포함하는 발현 벡터들을 제작함으로써 특이적 자연 발생 항체들의 특성을 의태하는 재조합 항체들을 발현하는 것이 가능하다(예, Riechmann, L. 등 (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. 등 (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 등 (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Winter의 미국 특허 번호 제5,225,539호 및 Queen 등의 미국 특허 번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
따라서, 본 발명의 다른 구체예는 각각 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18, 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24, 및 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 75 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 각각 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36, 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42, 및 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열들을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부에 관한 것이다. 따라서, 상기 항체들은 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y, 또는 1F4의 VH 및 VL CDR 서열들을 포함하나, 이러한 항체들로부터의 상이한 골격 서열들을 포함할 수 있다.
상기 골격 서열들은, 생식계열 항체 유전자 서열들을 포함하는 공공 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식계열 DNA 서열들은 Kabat, E. A., 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., 등 (1992) “The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox, J. P. L. 등 (1994) “A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836에서는 물론 “VBase” 인간 생식계열 서열 데이터베이스(www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 인터넷 상으로 이용가능)에서 발견될 수 있고, 이들 각각의 내용은 참조문헌으로 본 명세서에 명백하게 병합된다. 다른 예로서, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자들에 대한 생식계열 DNA 서열들은 진뱅크(Genbank) 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, HCo7 HuMAb 마우스에서 발견되는 하기 중쇄 생식계열 서열들은 첨부한 진뱅크(Genbank) 기탁 번호 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 3-33(NG_0010109 및 NT_024637) 및 3-7(NG_0010109 및 NT_024637)에서 입수할 수 있다. 다른 예로서, HCo12 HuMAb 마우스에서 발견되는 하기 중쇄 생식계열 서열들은 첨부한 진뱅크(Genbank) 기탁 번호 1-69(NG_0010109, NT_024637 및 BC070333), 5-51(NG_0010109 및 NT_024637), 4-34(NG_0010109 및 NT_024637), 3-30.3(CAJ556644) 및 3-23(AJ406678)에서 입수할 수 있다. 인간 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열의 또 다른 소스는 IMGT(http://imgt.cines.fr)에서 이용가능한 인간 면역글로불린 유전자의 데이터베이스이다.
항체 단백질 서열들은 축척된 단백질 서열 데이터베이스와 비교하는 데 있어서 당해 분야의 숙련자들에게는 잘 알려진, 서열 유사성 검색 방법들 중 하나인, Gapped BLAST로 불리는 방법을 사용할 수 있다(Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402). BLAST는 발견적(heuristic) 알고리즘으로, 여기에서 항체 서열 및 데이터베이스 서열 간의 통계적으로 유의한 정렬은 정렬된 단어들의 고-득점 분절 쌍 (high-scoring segment pairs, HSP)을 포함할 수 있을 것이다. 연장 또는 가지치기(trimming)에 의해서 그 득점을 향상시키지 못하는 분절 쌍(segment pair)을 히트(hit)라고 칭한다. 간략하게, VBASE 유도의 뉴클레오티드 서열들(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)은 번역되어 있고, FR1 내지 FR3 골격 영역간 및 이를 포함하는 영역은 유지되어 있다. 상기 데이터베이스 서열들은 평균 98 잔기의 길이를 가진다. 단백질의 전체 길이에 걸쳐서 정확히 들어맞는 이중 서열들은 제외된다. 저 복잡도 필터(complexity filter)를 정지시킨 것을 제외하고는 기설정된(default), 표준 변수들을 가지고 blastp 프로그램 및 BLOSUM62의 치환 매트릭스를 사용하여 단백질들에 대하여 BLAST 검색을 실시하여 5 등까지의 히트를 걸러내어, 서열 짝(match)들을 생성하였다. 상기 뉴클레오티드 서열들을 6 개 모든 프레임에서 번역하고 상기 데이터베이스 서열의 매칭 분절에서 정지 코돈이 없는 프레임이 잠재적인 히트로 고려된다. 이를, 다음, BLAST 프로그램 tblastx를 사용하여 확정하였고, 이것은 상기 항체 서열을 6 개 모든 프레임에서 번역하며 이러한 번역물을 6 개 모든 프레임에서 동적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열들과 비교한다. IMGT(http://imgt.cines.fr)로부터 이용가능한 것과 같은, 다른 인간 생식계열 서열 데이터베이스를 상기 기재한 VBASE와 유사하게 검색할 수 있다.
아이덴티티들(identities)은 서열의 전체 길이에 걸쳐서 항체 서열과 단백질 데이터베이스 간의 아미노산이 정확하게 들어맞는 것들이다. 양성적인 것들(아이덴티티들+치환 짝)은 일치하지는 않으나 아미노산 치환물은 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 가이드된다. 만약 항체 서열이 동일한 아이덴티티를 가진 두 데이터베이스 서열과 매치된다면, 가장 양성적인 것들을 가지는 히트는 매칭 서열 히트(matching sequence hit)인 것으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항체에 사용하기에 바람직한 골격 서열들은 본 발명의 선택된 항체들에 의해 사용된 골격 서열들과 구조적으로 유사한데, 예를 들어, 본 발명의 바람직한 단일클론 항체들에 의해 사용되는 VH 3-30.3 골격 서열들(서열번호 61) 및/또는 VH 3-33 골격 서열들(서열번호 62) 및/또는 VH 4-61 골격 서열들(서열번호 63) 및/또는 VH 3-23 골격 서열들(서열번호 64) 및/또는 VK L6 골격 서열들(서열번호 65) 및/또는 VK L18 골격 서열들(서열번호 66) 및/또는 VK L15 골격 서열들(서열번호 67) 및/또는 VK A27 골격 서열들(서열번호 68)과 유사하다.
VH CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 VK CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은, 골격 서열이 유도하는 생식계열 면역글로불린 유전자에서 발견되는 것과 동일한 서열을 가지는 골격 영역 상에 접합될 수 있거나, 또는 상기 CDR 서열들은 생식계열 서열들에 비하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 골격 영역 상에 접합될 수 있다. 예를 들어, 소정의 경우, 골격 영역 내의 잔기를 돌연변이시켜 항체의 항원 결합능을 유지 또는 강화시키는 것이 유익한 것으로 알려져 있다(예를 들어, Queen 등의 미국 특허 번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
다른 유형의 가변 영역 변형은 VH 및/또는 VK CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 관심의 항체의 하나 이상의 결합 특성(예, 친화도)을 향상시키는 것이다. 자리-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발을 수행하여 돌연변이(들)를 도입하고 항체 결합, 또는 다른 관심의 기능적 특성에 대한 효과는 본 명세서에 기재되고 실시예에서 제공된 바와 같이, 시험관 내 또는 생체 내 분석법으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, 보존적 변형(상기에서 검토된 바와 같이)이 도입된다. 이러한 돌연변이는 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 더욱이, 일반적으로, 하나의 CDR 영역 내에서 단지 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 잔기만이 변경된다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 항-CD70 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부를 제공한다: (a) 서열번호13, 14, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1 영역; (b) 서열번호19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2 영역; (c) 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 75 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 75 및 30에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3 영역; (d) 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR1 영역; (e) 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR2 영역; (f) 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열 또는 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48에 비하여 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 또는 다섯 개의 아미노산 치환들, 결실들 또는 첨가들을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 VK CDR3 영역.
본 발명의 조작된 항체들은, 예를 들어, 항체의 특성을 개선시키기 위하여, VH 및/또는 VK 내의 골격 잔기에 변형이 만들어진 것을 포함한다. 일반적으로 상기 골격 변형들은 항체의 면역원성을 감소시키도록 만들어진다. 예를 들어, 하나의 접근 방법은 하나 이상의 골격 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 “복귀돌연변이”시키는 것이다. 더욱 상세하게는, 체세포 돌연변이된 항체는 항체가 유도되는 생식계열 서열과는 상이한 골격 잔기를 포함할 수 있다. 상기 잔기는 항체 골격 서열들을 항체가 유도되는 생식계열 서열들과 비교함으로써 확인할 수 있다. 상기 “복귀돌연변이”된 항체는 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들어, 10B4에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #2(FR1 이내)는 이소류신이지만 상응하는 VH 3-30.3 생식계열 서열 내의 이 잔기는 발린이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 자리-지정 돌연변이유발 또는 PCR-매개 돌연변이유발(예를 들어, 10B4의 VH의 FR1의 잔기 2를 이소류신에서 발린으로 복귀돌연변이시킬 수 있다)에 의하여 체세포 돌연변이는 생식계열 서열로 “복귀돌연변이”될 수 있다.
다른 예로서, 10B4에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #30(FR1 이내)은 글리신이지만 상응하는 VH 3-30.3 생식계열 서열 내의 이 잔기는 세린이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 10B4의 VH의 FR1의 잔기 30을 글리신에서 세린으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #24(FR1 이내)는 트레오닌이지만 상응하는 VH 3-33 생식계열 서열 내의 이 잔기는 알라닌이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 8B5의 VH의 FR1의 잔기 24를 트레오닌에서 알라닌으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #77(FR3 이내)은 리신이지만 상응하는 VH 3-33 생식계열 서열 내의 이 잔기는 아스파라긴이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 8B5의 VH의 FR3의 잔기 11을 리신에서 아스파라긴으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 8B5에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #80(FR3 이내)은 세린이지만 상응하는 VH 3-33 생식계열 서열 내의 이 잔기는 티로신이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 8B5의 VH의 FR3의 잔기 14를 세린에서 티로신으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #50(FR2 이내)은 류신이지만 상응하는 VH 4-61 생식계열 서열 내의 이 잔기는 이소류신이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 69A7의 VH의 FR2의 잔기 13을 류신에서 이소류신으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #85(FR3 이내)는 아르기닌이지만 상응하는 VH 4-61 생식계열 서열 내의 이 잔기는 세린이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 69A7의 VH의 FR3의 잔기 18을 아르기닌에서 세린으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대하여, VH의 아미노산 잔기 #89(FR3 이내)는 트레오닌이지만 상응하는 VH 4-61 생식계열 서열 내의 이 잔기는 알라닌이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 69A7의 VH의 FR3의 잔기 22를 트레오닌에서 알리닌으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 10B4에 대하여, VL의 아미노산 잔기 #46(FR2 이내)은 페닐알라닌이지만 상응하는 VL L18 생식계열 서열 내의 이 잔기는 류신이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 10B4의 VL의 FR2의 잔기 12를 페닐알라닌에서 류신으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 예로서, 69A7에 대하여, VL의 아미노산 잔기 #49(FR2 이내)는 페닐알라닌이지만 상응하는 VL L6 생식계열 서열 내의 이 잔기는 티로신이다. 그것의 생식계열 배열로 골격 영역 서열을 되돌리기 위하여, 예를 들어, 69A7의 VL의 FR2의 잔기 15를 페닐알라닌에서 티로신으로 “복귀돌연변이”시킬 수 있다.
다른 유형의 골격 변형은 골격 영역 내에 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에, 하나 이상의 잔기를 돌연변이시켜 T 세포 에피토프를 제거하고 그것에 의하여 항체의 잠재적 면역원성을 감소시키는 것을 포함한다. 이러한 접근 방법은 또한 “탈면역화”로 지칭되며 Carr 등의 미국 특허 공개 번호 제20030153043호에 보다 상세히 기재되어 있다.
또한 본 발명의 조작된 항체는 아미노산 잔기에 변형을 만들어 항체에서 T-세포 에피토프의 상호작용을 변경시키는 아미노산 변형을 통해 면역성 반응을 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다(예, 미국 특허 번호 제6,835,550호; 제6,897,049호 및 제6,936249호 참조).
골격 또는 CDR 영역 내에서 만들어진 변형에 더하여 또는 대안적으로, 본 발명의 항체들을 조작하여, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포 독성과 같은 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 일반적으로 변경하기 위하여, Fc 영역 내에 변형을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 항체를 화학적으로 변형시키고(예를 들어, 하나 이상의 화학적 분체를 항체에 붙일수 있다) 또는 글리코실화를 변경하는 것으로 변형시켜 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경할 수 있다. 이러한 구체예들 각각이 하기에 더 상세히 기재되어 있다. Fc 영역에서의 잔기의 번호매김은 카밧의 EU 인덱스의 것과 같다.
한 구체예에서, CH1의 힌지 영역을 변형시켜 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 수를 변경, 예를 들어 증가시키거나 감소시킨다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 미국 특허 번호 제5,677,425호에 더 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역에서의 시스테인 잔기의 수를 변경하여, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄들의 결집을 용이하게 하거나 또는 항체의 안정성을 증가 또는 감소시킨다.
다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 영역을 돌연변이시켜 항체의 생물학적 반감기를 감소시킨다. 더욱 상세하게는, 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 부위에 도입되어 상기 항체가, 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여, 손상된 포도상구균 단백질 A(SpA) 결합을 가진다. 이러한 접근 방법은 Ward 등의 미국 특허 번호 제6,165,745호에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
다른 구체예에서, 상기 항체를 변형시켜 생물학적 반감기를 증가시킨다. 다양한 접근 방법이 가능하다. 예를 들어, Ward의 미국 특허 번호 제6,277,375호에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 하기 돌연변이를 도입할 수 있다: T252L, T254S, 및 T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, Presta 등의 미국 특허 번호 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기재된 바와 같이, 항체를 CH1 또는 CL 영역에서 변경시켜 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 두 개 루프로부터 얻은 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체의 작동자(effector) 기능(들)을 변경하도록 Fc 영역을 변경한다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 작동자 리간드에 대한 변경된 친화도를 가지지만, 부모 항체의 항원-결합 능력을 보유하게 한다. 친화도가 변경되는 상기 작동자 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근 방법은 Winter 등의 미국 특허 번호 제5,624,821호 및 제5,648,260호에 더 상세히 기재되어 있다.
다른 실시예에서, 아미노산 잔기 329, 331 및 322로부터 선택된 하나 이상의 아미노산들을 다른 아미노산 잔기로 대체하여 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소되거나 파괴된 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 가지게 한다. 이러한 접근 방법은 Idusogie 등의 미국 특허 번호 제6,194,551호에 더 상세히 기재되어 있다.
다른 실시예에서, 아미노산 위치 231 및 239 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경하여 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변경한다. 이러한 접근 방법은 Bodmer 등의 PCT 공개번호 제WO 94/29351호에 더 기재되어 있다.
또 다른 실시예에서, 하기의 위치에서 하나 이상의 아미노산들을 변형함으로써 Fc 영역을 변형시켜 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439. 이러한 접근 방법은 Presta의 PCT 공개 번호 제WO 00/42072호에 더 상세히 기재되어 있다. 더욱이, FcγR1, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 자리가 지도화되어 있고 향상된 결합을 가지는 변이체들(variants)이 기재되어 있다(Shields, R.L. 등 (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 참조). 위치 256, 290, 298, 333, 334 및 339에서의 특이적 돌연변이는 FcγRIII에 대한 결합을 향상시키는 것으로 나타났다. 추가적으로, 하기의 조합 돌연변이체는 FcγRIII 결합을 향상시키는 것으로 나타났다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A 및 S298A/E333A/K334A.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체의 C-말단은 시스테인 잔기의 도입으로 변형되며 이는 미국 가출원 일련변호 제60/957,271호에 기재되어 있고, 그 내용은 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. 상기 변형은 전장 중쇄 서열의 c-말단으로 시스테인을 포함하는 연장(cysteine-containing extension)의 도입뿐만 아니라, 전장 중쇄 서열의 C-말단에 또는 그 근처에 존재하는 아미노산 잔기의 대체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 구체예에서, 시스테인을 포함하는 연장은 서열 알라닌-알라닌-시스테인(N-말단에서 C-말단으로)을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 상기 C-말단 시스테인 변형의 존재는, 치료제 또는 마커 분자와 같은 파트너 분자의 접합체에 대한 위치를 제공한다. 특히, C-말단 시스테인 변형때문에, 반응성 티올기의 존재는 하기에 상세히 기재된 디설파이드 링커를 사용하여 파트너 분자를 접합하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법에서 파트너 분자에 대한 상기 항체의 접합은 특정 부착 위치 위로 증가된 제어를 가능하게 한다. 더욱이 C-말단에 또는 그 근처에 부착 위치를 도입함으로써, 접합은 최적화되어 항체의 기능적 특성으로 간섭을 감소시키거나 제거할 수 있고, 단순화한 분석법 및 접합체 제조의 품질관리를 가능하게 한다.
또 다른 구체예에서, 항체의 글리코실화를 변경시킨다. 예를 들어, 비글리코실화된 항체를 만들 수 있다(즉, 항체는 글리코실화를 결여함). 글리코실화를 변경하여, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 탄수화물 변형은, 예를 들어, 항체 서열 내에서 하나 이상의 글리코실화의 자리를 변경함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 골격 글리코실화 자리를 제거하도록 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환을 만들어서 그 자리에서 글리코실화를 없애버릴 수 있다. 상기 비글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 상기 접근 방법은 Co 등의 미국 특허 번호 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 글리코실화를 변경하는 추가적 접근 방법은 Hanai 등의 미국 특허 번호 제7,214,775호, Presta의 미국 특허 번호 제6,737,056호, Presta 의 미국 특허공개번호 제20070020260호, Dickey 등의 PCT 공개번호 제WO/2007/084926호, Zhu 등의 PCT 공개번호 제WO/2006/089294호, 및 Ravetch 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/055916호에 더 자세히 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 통합된다.
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 가지는 항체, 예를 들어, 감소된 양의 퓨코실 잔기를 가지는 저퓨코실화 항체, 또는 증가된 두 갈래 GlcNac 구조를 가지는 항체를 만들 수 있다. 상기 변경된 글리코실화 패턴은 항체들의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 상기 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기제(machinery)를 가진 숙주 세포에서 상기 항체를 발현시킴으로써 이루어 질 수 있다. 변경된 글리코실화 기제를 가진 세포들은 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 재조합 항체들을 발현하여 변경된 글리코실화를 가지는 항체를 생성하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포주 Ms704, Ms705, 및 Ms709는 퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8(알파 (1,6) 퓨코실트랜스퍼라제)이 결여되어 있어서, Ms704, Ms705, 및 Ms709 세포주에서 발현되는 항체들은 그들 탄수화물 상에 퓨코스가 결여되어 있다. Ms704, Ms705, 및 Ms709 FUT8-/- 세포주들은 두 개의 대체 벡터를 사용하여 CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자를 표적 파괴함으로써 만들 수 있다(Yamane 등의 미국 특허공개번호 제20040110704호 및 Yamane-Ohnuki 등 (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22 참조). 다른 예로서, Hanai 등의 EP 제1,176,195호에는 퓨코실 트랜스퍼라제를 암호화하는 FUT8 유전자가 기능적으로 파괴되어 있는 세포주가 기술되어 있고, 상기 세포주에서 발현되는 항체들은 알파 1,6 결합-관련 효소를 감소시키거나 제거함으로써 저퓨코실화를 나타내게 된다. Hanai 등은 또한 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민에 퓨코스를 첨가하는데 낮은 효소 활성을 가지는 또는 그러한 효소 활성을 가지지 않는 세포주, 예를 들어, 래트 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기재하고 있다. Presta의 PCT 공개번호 제WO 03/035835호는 변형 CHO 세포주인 Lec13 세포에 대해서 기재하고 있는데, 이 세포들은 Asn(297)-연결 탄수화물에 퓨코스를 부착하는 능력이 감소되어 있어서, 그러한 숙주 세포에서 발현된 항체들에 저퓨코실화를 야기하게 된다(또한 Shields, R.L. 등 (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 참조). Umana 등의 PCT 공개번호 제WO 99/54342호는 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII))를 발현하도록 조작된 세포주를 기재하고 있고, 이러한 조작된 세포주에서 발현된 항체들은 증가된 양갈래 GlcNac 구조를 보이고, 결과적으로 상기 항체들의 증가된 ADCC 활성을 나타낸다(Umana 등 (1999) Nat. Biotech. 17:176-180을 참조). 대안적으로, 퓨코시다제 효소를 사용하여 상기 항체의 퓨코스 잔기를 절단할 수 있다. 예를 들어, 퓨코시다제 알파-L-퓨코시다제는 항체들에서 퓨코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. 등 (1975) Biochem. 14:5516-23).
추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체를 만들 수 있는데, 변경은 항체의 시알릴화(sialyation)의 수준과 관련이 있다. 상기 변경은 Dickey 등의 PCT 공개번호 제WO/2007/084926호 및 Ravetch 등의 PCT 공개번호 제 WO/2007/055916호에 기재되어 있는데, 이 둘은 그 전체가 참고로서 본 명세서에 통합되어 있다. 예를 들어, 아스로박터 우레아파센스 시알리다제(Arthrobacter ureafacens sialidase)와 같은, 시알리다제와의 효소 반응을 이용할 수 있다. 상기 반응의 조건은 미국 특허번호 제5,831,077호에 일반적으로 기재되어 있으며, 이것은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합되어 있다. 적절한 효소의 다른 비-제한적 예들은, Schloemer 등, J. Virology, 15(4), 882-893 (1975) 및 Leibiger 등, Biochem J., 338, 529-538 (1999)에 각각 기재된 바와 같은, 뉴라미니다제(neuraminidase) 및 N-글리코시다제 F이다. 탈시알릴화된 항체를 친화성 크로마토그래피를 이용하여 더 정제할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 시알리트랜스퍼라제(sialytransferase) 효소를 이용함으로써 시알리화의 수준을 증가시키는 방법을 이용할 수 있다. 상기 반응의 조건들은 Basset 등, Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307-311 (2000)에 일반적으로 기재되어 있다.
본 발명에 의하여 고려될 수 있는 본원 항체들의 다른 변형은 페그화(pegylation)이다. 항체를 페그화시켜, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 늘릴 수 있다. 항체를 페그화시키기 위해, 항체 또는 이의 단편을, 예를 들어, PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과, 하나 이상의 PEG기들이 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서 반응시킨다. 바람직하게, 페그화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 실시된다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “폴리에틸렌 글리콜”은 다른 단백질들, 예를 들어, 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도하는 데 사용된 PEG의 임의의 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 소정의 구체예에서, 페그화될 항체는 비글리코실화된 항체이다. 단백질을 페그화시키는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 제0 154 316호 및 Ishikawa 등의 EP 제0 401 384호 참조.
항체 단편 및 항체 의태체
본 발명은 전통적인 항체에 한정되지 않고, 항체 단편 및 항체 의태체를 사용하여 실행될 수 있다. 하기에 기술된 바와 같이, 다양한 항체 단편 및 항체 의태 기술이 개발되고 있으며 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 도메인 항체, 나노바디 및 유니바디와 같이, 이러한 많은 기술들은, 통상적인 항체 구조의 단편 또는 다른 변형체를 이용하는 반면에, 통상적인 항체 결합을 의태하지만, 독특한 메커니즘들로부터 발생되고 이를 통해 기능하는 결합 구조를 사용하는, 어피바디, 디에이알핀, 안티칼린, 아비머, 및 베르사바디와 같은, 대안적 기술도 있다.
도메인 항체(dAbs)는 항체의 최소 기능적 결합 유닛으로서, 인간 항체의 중쇄(VH) 또는 경쇄(VL)의 가변 영역에 상응한다. 도메인 항체는 약 13 kDa의 분자량을 가진다. 도만티스(Domantis)는 완전 인간 VH 및 VL dAb들의 일련의 크고 높은 기능적 라이브러리(각 라이브러리당 백억개 이상의 상이한 서열)를 개발하였고, 이러한 라이브러리를 사용하여 치료적 표적에 특이적인 dAb를 선택한다. 많은 통상적인 항체들과는 달리, 도메인 항체들은 박테리아, 효모, 및 포유동물 세포 시스템에서 잘 발현된다. 도메인 항체들 및 이의 제조방법에 대한 상세 설명은 미국 특허 번호 제6,291,158호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,172,197호; 제6,696,245호; 미국 출원 일련 번호 제2004/0110941호; 유럽 특허출원 번호 제1433846호 및 유럽 특허 번호 제0368684호 및 제0616640호; 제WO05/035572호, 제WO04/101790호, 제WO04/081026호, 제WO04/058821호, 제WO04/003019호 및 제WO03/002609호에서 찾을 수 있고, 이들 각각은 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 통합되어 있다.
나노바디는 자연적으로-일어나는 중쇄 항체의 유일한 구조적 및 기능적 특성을 포함하는 항체-유도 치료 단백질이다. 이들 중쇄 항체는 단일 가변 도메인(VHH) 및 두 개의 불변 도메인(CH2 및 CH3)을 포함한다. 중요한 것은, 클론화되고 분리된 VHH 도메인은 원래 중쇄 항체의 전체 항원-결합 능을 보유하고 있는 완벽하게 안정된 폴리펩티드이다. 나노바디들은 인간 항체들의 VH 도메인과 높은 상동성을 가지며 활성의 임의의 손실 없이 더 인간화될 수 있다. 중요한 것은 나노바디가 낮은 면역원성 잠재능을 가지며, 이는 나노바디가 주된 화합물로 사용된 영장류 실험에서 확인되었다.
나노바디는 통상적인 항체들의 장점과 작은 분자 약물의 중요한 특징을 조합한다. 통상적인 항체들과 같이, 나노바디들은 높은 표적 특이성, 이들 표적에 대한 높은 친화도 및 낮은 내재적 독성을 보인다. 그러나, 작은 분자 약물과 같이, 이들은 효소를 억제하며 수용체 틈에 용이하게 접근할 수 있다. 또한, 나노바디들은 매우 안정하고, 주사 외 다른 방식으로 투여될 수 있으며(예를 들어, 제WO 04/041867호 참조, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 통합됨), 제조하기 쉽다. 나노바디의 다른 장점은 그들의 작은 크기의 결과로서, 공통적이지 않거나 숨겨진 에피토프를 인식하고, 그들의 독특한 삼차원적, 약물 포맷 유연성으로 인하여 높은 친화도 및 선택성으로 단백질 표적의 빈 공간 또는 활성 부위에 결합하며, 약물 전달의 수명, 용이성과 속도를 맞추는 것을 포함한다.
나노바디는 단일 유전자에 의해 암호화되며 거의 모든 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어, E. coli(예, 미국 특허 번호 제6,765,087호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 통합됨), 곰팡이(molds)(예를 들어, 아스파질러스 또는 트리코데마) 및 효소(예를 들어, 사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 한세눌라 또는 피키아)(예, 미국 특허 번호 제6,838,254호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에서 참조문헌으로 통합됨)에서 효과적으로 생산된다. 제조 공정은 증감될 수 있고 수 킬로그램 양의 나노바디들을 생산해왔다. 나노바디들이 통상적인 항체에 비하여, 뛰어난 안정성을 나타내므로, 이들은 긴 보관 수명, 즉시 사용되는 용액으로서 제형화될 수 있다.
나노클론 방법(예, 제WO 06/079372호 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에 참조문헌으로 통합됨)은 B-세포의 자동화된 고출력 선택에 기초하여, 원하는 표적에 대하여 나노바디를 생성하는 독점적 방법으로서, 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다.
유니바디는 또 다른 항체 단편 기술이지만, 이러한 것은 IgG4 항체들의 힌지 영역을 제거하는 것에 기초한다. 힌지 영역을 삭제하면 통상적인 IgG4 항체들의 크기에 실질적으로 절반인 분자가 생성되고, IgG4 항체들의 이가 결합 영역보다는 일가 결합 영역을 가진다. IgG4 항체들이 비활성적이고 따라서 면역계와 상호작용하지 않는데, 이는 면역 반응을 원치 않는 질병 치료에 장점일 수 있고, 이러한 장점은 유니바디에 있는 것이 또한 공지되어 있다. 예를 들어, 유니바디들은 그들이 결합된 세포를 억제하거나 휴지(silence)시키지만 살해하지는 않게 기능할 수 있다. 부가적으로, 암 세포에 결합하는 유니바디는 증식하도록 그것들을 자극하지 않는다. 더구나, 유니바디는 통상적 IgG4 항체의 크기의 반 정도이기 때문에, 더 큰 고형암에 걸쳐 잠재적으로 유리한 효능으로 더 좋은 분포를 나타낼 수 있다. 유니바디는 온전한 IgG4 항체들과 유사한 속도로 신체에서 제거되며 온전한 항체들과 유사한 항원 친화도로 결합할 수 있다. 유니바디의 더 상세한 설명은 특허출원 제WO2007/059782호를 참조할 수 있고, 이것은 전체적으로 본 명세서에 참조문헌으로 통합된다.
어피바디 분자는, 포도상구균의 단백질 A의 IgG-결합 도메인들 중 하나로부터 유도되는, 58-아미노산 잔기 단백질 도메인에 기초한 새로운 형태의 친화성 단백질을 나타낸다. 이러한 세 개 나선 묶음 도메인은 조합성 파지미드 라이브러리의 제작용 골격으로 사용될 수 있고, 그로부터 파지 디스플레이 기술을 사용하여 원하는 분자를 표적하는 어피바디 변이체를 선택할 수 있다(Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55). 어피바디 분자의 간단하고 견고한 구조는 이들의 저분자량(6 kDa)과 조합되어 이들을 다양한 적용에, 예를 들어, 검출 시약에 적절하게 하고(Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, 등, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211), 수용체 상호작용을 억제한다(Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). 어피바디 및 이의 제조 방법의 더 상세한 설명은 미국 특허 번호 제5,831,012호를 참조할 수 있고, 이것은 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로 통합되어 있다.
표지된 어피바디는 또한 이소형태의 풍부함을 결정하기 위한 이미징 어플리케이션에 유용하다.
디에이알핀(DARPin, Designed Ankyrin Repeat Proteins)은 항체 의태 DRP(Designed Repeat Protein) 기술의 한 예인데, 이는 비-항체 폴리펩티드의 결합 능력을 이용하기 위해 개발되었다. 안키린 또는 류신이 많은 반복 단백질과 같은 반복 단백질은 편재하는 결합 분자이고, 이는 항체와는 달리, 세포 내 및 세포외적으로 발생한다. 이들의 독특한 모듈식 건축구조는 반복되는 구조적 단위체(반복체)를 특징으로 하고, 이것들은 함께 쌓여져서 가변성 및 모듈식의 표적-결합 표면을 나타내는 연장된 반복 도메인을 형성한다. 이러한 모듈성에 근거하여, 고도로 다양화된 결합 특이성을 가지는 폴리펩티드들의 조합적 라이브러리들을 생성할 수 있다. 이러한 전략은 가변적인 표면 잔기 및 이들이 무작위적으로 반복 도메인으로 결집되는 것을 나타내는 자가-양립성 반복체들의 일치된 구성을 포함한다.
디에이알핀은 고효율로 박테리아성 발현 시스템에서 생산될 수 있으며, 공지된 가장 안정한 단백질에 속한다. 인간 수용체, 사이토카인, 키나아제, 인간 프로테아제, 바이러스 및 막 단백질을 포함한 광범위한 표적 단백질에 대한 매우 특이적이고 고친화도인 디에이알핀들을 선택하였다. 단단위(single-digit) 나노몰 내지 피코몰 범위의 친화도를 가지는 디에이알핀들을 얻을 수 있다.
디에이알핀은 ELISA, 샌드위치 ELISA, 유세포 분석법(FACS), 면역조직화학(IHC), 칩 응용, 친화도 정제 또는 웨스턴 블랏팅을 포함하여, 넓은 범위의 어플리케이션에 사용되어 왔다. 디에이알핀은 또한, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein, GFP)에 융합된 세포내 마커 단백질로서 세포내 분획에서 매우 활성적이라는 것이 증명되었다. 디에이알핀은 또한 pM 범위 내에 있는 IC50으로 바이러스 입장을 억제하는 데 사용되었다. 디에이알핀은 단백질-단백질 상호작용을 차단하는 데 이상적일 뿐 아니라, 효소를 억제하는 데에도 이상적이다. 프로테아제, 키나아제 및 운반자가 가장 일반적으로 알로스테릭 억제 방식으로 성공적으로 억제되었다. 종양 상에 매우 빠르고 특이적으로 농축되는 것과 매우 양호한 종양 대 혈액 비율로 인하여, 디에이알핀은 생체 내 진단 또는 치료적 접근에 매우 적절하다.
디에이알핀 및 다른 DRP 기술에 관한 추가의 정보는 미국 특허 출원 공개 번호 제2004/0132028호 및 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 02/20565호에서 발견될 수 있고, 둘 다 본 명세서에 전체적으로 참조 문헌으로서 통합된다.
안티칼린은 추가적인 항체 의태 기술이나, 이 경우, 결합 특이성은 리포칼린, 즉 인간 조직 및 체액에서 자연적으로 그리고 풍부하게 발현되는 저분자량 단백질의 군(family)으로부터 유도된다. 리포칼린은 생체 내에서 생리적 수송 및 화학적으로 민감하거나 불용성인 화합물의 저장과 관련된 일단의 기능들을 수행하기 위해 발달하였다. 리포칼린은 단백질의 하나의 말단에서 네 개 루프를 지지하는 고도로 보존된 β-배럴을 포함하는 견고하고 고유한 구조를 가진다. 이러한 루프들은 결합 포켓의 입구를 형성하고, 분자의 이러한 부분에서의 형태적 차이는 개별 리포칼린 간의 결합 특이성에서의 다변화를 설명한다.
보존된 β-시트 골격에 의해 지지되는 초가변성 루프의 전체 구조가 면역글로불린의 흔적이지만, 리포칼린은 크기에서 항체들과 상당히 상이하며, 단일 면역글로불린 도메인보다 약간 더 큰 160-180 아미노산들의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된다.
리포칼린을 클론화하고 이들의 루프를 조작하여 안티칼린을 생성한다. 구조적으로 다양한 안티칼린들의 라이브러리를 생성하였고 안티칼린 디스플레이는 결합 기능의 선택 및 스크리닝을 가능하게 하며, 용해성 단백질을 발현하고 생성하여 원핵 또는 진핵 시스템에서 더 분석할 수 있다. 연구에 따르면, 실질적으로 임의의 인간 표적 단백질에 특이적인 안티칼린을 개발할 수 있고 분리할 수 있으며, 나노몰 또는 그 이상의 범위의 결합 친화도를 얻을 수 있다는 것이 성공적으로 밝혀졌다.
또한 안티칼린은 소위 듀오칼린으로 불리는, 이중 표적화 단백질로서 형성될 수 있다. 듀오칼린은, 그의 두 개 결합 도메인의 구조적 방향과는 관계없이 표적 특이성 및 친화도를 유지하면서, 표준 제조방법으로 용이하게 제조되는 하나의 단량체성 단백질에서 두 개의 개별적인 치료적 표적을 결합한다.
단일 분자를 통하여 다중 표적들을 조정하는 것은 단일 원인 인자 이상을 포함하는 것으로 알려진 질병에 특히 유리하다. 더욱이, 듀오칼린과 같은 이중 또는 다중 결합 형식은 질병에서 세포 표면 분자를 표적화하는데 있어서, 신호 전달 경로 상에 작용 효과(agonistic effect)를 매개하는데 있어서, 또는 세포 표면 수용체들을 결합하고 클러스터링하는 것을 통해 향상된 내재화 효과를 유도하는 데 있어서 상당한 잠재능력을 가진다. 더구나, 듀오칼린의 높은 고유 안정성은 단량체성 안티칼린과 비견되며, 듀오칼린에게 유연한 배합 및 전달 능력을 제공한다.
안티칼린에 대한 추가 정보는 미국 특허 번호 제7,250,297호 및 국제 특허 출원 공개번호 제WO 99/16873호에서 발견되며, 이 둘은 본 명세서에 전체가 참조 문헌으로서 통합된다.
본 발명의 맥락에 유용한 또 다른 항체 의태 기술은 아비머이다. 아비머는 시험관 내 엑손 셔플링(exon shuffling) 및 파지 디스플레이에 의해 인간 세포외 수용체 도메인의 거대 군(family)으로부터 개발되고, 결합 및 억제 특성을 갖는 다중도메인 단백질을 생성한다. 다중 독립적 결합 도메인들을 연결하는 것은, 결합활성(avidity)을 생성하고 그 결과로 통상적인 단일-에피토프 결합 단백질에 비하여 친화도 및 특이성을 향상시킨다는 것을 보여 주었다. 잠재적 장점은 대장균(Escherichia coli) 내에서 다중표적-특이적 분자를 간단하고 효율적으로 생산하고, 열안정성 및 프로테아제에 대한 내성을 향상시킨다는 것을 포함한다. 나노몰 이하의 친화도를 가지는 아비머를 다양한 표적에 대하여 얻었다.
아비머에 대한 추가 정보는 미국 특허출원 공개번호 제2006/0286603호, 제2006/0234299호, 제2006/0223114호, 제2006/0177831호, 제2006/0008844호, 제2005/0221384호, 제2005/0164301호, 제2005/0089932호, 제2005/0053973호, 제2005/0048512호, 제2004/0175756호에서 발견되며, 이 모두는 전체적으로 본 명세서에 참조 문헌으로서 통합된다.
베르사바디(Versabodies)는 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 항체 의태 기술이다. 베르사바디는 >15% 시스테인 함량을 갖는 3-5 kDa의 작은 단백질이고, 높은 디설파이드 밀도 골격을 형성하여, 통상적인 단백질이 가지는 소수성 코어를 대체한다. 소수성 코어를 포함하는, 많은 수의 소수성 아미노산을 작은 수의 이황화물로 대체하면, 더 작고, 더 강한 친수성(덜 결집되고 비-특이적 결합)이고, 프로테아제와 열에 더 저항성이 있으며, 더 낮은 밀도의 T-세포 에피토프를 가지는 단백질을 생성하게 되는데 이는, MHC 발현에 대부분 기여하는 잔기가 소수성이기 때문이다. 이러한 네가지 특성 모두는 면역원성에 영향을 끼치는 것으로 공지되어 있고, 이들은 함께 면역원성을 크게 저하시킬 것으로 예상된다.
베르사바디 대한 영감은 거머리, 뱀, 거미, 전갈, 달팽이, 및 말미잘에 의해 생산되는 천연적 주입성 생약학물로부터 나온 것인데, 이것은 예상외로 낮은 면역원성을 보이는 것으로 공지되어 있다. 모양에 의해서 그리고 크기를 스크리닝함으로써, 선택된 천연 단백질 군으로 출발하여, 소수성, 단백질 가수분해성 항원 가공 및 에피토프 밀도를 천연적 주입성 단백질에 대하여 평균보다 훨씬 낮은 수준으로 최소화한다.
베르사바디의 구조가 주어지면, 이러한 항체 의태체는 다-가(multi-valency), 다중 특이성, 다양한 반감기 메카니즘, 조직 표적화 모듈 및 항체 Fc 영역의 부재를 포함하는 다양한 형식을 제공한다. 더구나, 베르사바디는 E. coli에서 고효율로 제조되며, 그들의 친수성 및 작은 크기 때문에, 베르사바디는 고도로 용해성이고 고농도로 제형화될 수 있다. 베르사바디는 뛰어나게 열에 안정성이고(그것들을 끓일 수도 있음) 보관 수명이 길다.
베르사바디에 대한 추가 정보는 미국 특허출원 공개번호 제2007/0191272호에서 발견되며, 그 전체가 본 명세서에서 참조 문헌으로서 통합된다.
상기에서 제공된 항체 단편 및 항체 의태 기술의 상세한 설명은 본 명세서의 맥락에서 사용될 수 있는 모든 기술의 포함 목록인 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 비제한적 방식으로, 다양한 추가 기술이 본 발명의 맥락에서 사용할 수 있는 데, Qui 등, Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)(이는 그 전체로서 본 명세서에 참조 문헌으로서 통합됨)에 개략적으로 기술된 상보적 결정 영역의 융합과 같은 대안적 폴리펩티드-기반 기술을 포함하며, 뿐만 아니라, 미국 특허번호 제5,789,157호, 제5,864,026호, 제5,712,375호, 제5,763,566호, 제6,013,443호, 제6,376,474호, 제6,613,526호, 제6,114,120호, 제6,261,774호, 및 제6,387,620호(이들 모두는 그 전체로서 본 명세서에 참조 문헌으로서 통합됨)에 기재된 RNA 앱타머 기술(RNA aptamer technologies)과 같은 핵산-기반 기술도 포함한다.
항체 물리적 성질
본 발명의 항체들은 항-CD70 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 더 특징화될 수 있다. 다양한 분석법들을 사용하여 이러한 물리적 특성에 근거하여 항체들의 상이한 부류를 검출 및/또는 분화시킬 수 있다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 항체들은 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 자리를 포함할 수 있다. 가변 영역에서 하나 이상의 글리코실화 자리가 존재하는 것은 변경된 항원 결합으로 인하여 항체의 면역원성을 높이거나 또는 항체의 pK를 변경하는 결과를 가져올 수 있다(Marshall 등 (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA 및 Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick 등 (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh 등 (1985) Nature 316:452-7; Mimura 등 (2000) Mol Immunol 37:697-706). 글리코실화는 N-X-S/T 서열을 포함하는 모티프(motifs)에서 발생한다고 공지되어 있다. 가변 영역 글리코실화는 글로코블랏(Glycoblot) 분석법을 사용하여 테스트할 수 있는데, 이는 항체를 절단하여 Fab를 생산한 후, 과요오드산 산화 및 쉬프(Schiff) 염기 형성을 측정하는 분석법을 사용하여 글리코실화를 테스트한다. 대안적으로, 가변 영역 글리코실화는 다이오넥스 광 크로마토그래피(Dionex-LC)를 사용하여 테스트할 수 있는데, 이는 Fab로부터 당류를 단당류로 절단하고 개별적인 당 함유량을 분석한다. 어떤 경우에, 가변 영역 글리코실화를 포함하지 않는 항-CD70 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여, 가변 영역에서 글리코실화 모티프를 포함하지 않는 항체들을 선택함으로써 또는 글리코실화 모티프 내에 잔기를 돌연변이시킴으로써 성취될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 아스파라긴 이성화 자리를 포함하지 않는다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는 각각 N-G 또는 D-G 서열들에서 일어날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트 산 효과는 이소아스파르트 산의 생성을 야기하는데, 이것은 주 사슬보다는 측쇄 카르복시 말단의 얽힘 구조(kinked structure)를 생성함으로써 항체의 안정성을 저하시킨다. 이소아스파르트 산의 생성은 역-상 HPLC를 사용하여 이소아스파르트 산에 대하여 테스트하는 등량분석법(iso-quant assay)을 사용하여 측정될 수 있다.
각 항체는 고유의 등전위점(pI)을 가지나, 일반적으로 항체들은 6 내지 9.5 사이의 pH 범위 안에 거한다. IgG1 항체에 대한 pI는 대표적으로 7-9.5의 pH 범위에 있고, IgG4 항체에 대한 pI는 대체로 6-8의 pH 범위에 거한다. 항체들은 이러한 범위 밖에 있는 pI를 가질 수 있다. 비록 상기 효과들이 일반적으로 알려져 있지 않더라도, 정상적인 범위 밖의 pI를 가진 항체들이 생체 내 조건 하에서 풀림(unfolding) 및 불안정성을 가질 수 있다고 생각된다. 상기 등전점을 모세관 등전위 초점 분석법(capillary isoelectric focusing assay)을 사용하여 테스트할 수 있는데, 이것은 pH 구배를 만들고 레이저 포커싱을 사용하여 정확성을 높일 수 있다(Janini 등 (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma 등 (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt 등 (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 어떤 경우에, 정상 범위에 들어가는 pI 값을 포함하는 항-CD70 항체를 가지는 것이 바람직하다. 이것은 정상 범위 내의 pI를 갖는 항체를 선택함으로써, 또는 당해 분야에서 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 하전된 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 이룰 수 있다.
각 항체는 열 안정성을 나타내는 용융점을 가질 수 있다(Krishnamurthy R 및 Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 더 높은 열적 안정성은 생체 내에서 더 큰 전체 항체 안정성을 나타낸다. 항체의 용융점은 차등 스캐닝 열량계와 같은 기술을 사용하여 측정될 수 있다(Chen 등 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando 등 (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1은 항체의 초기 풀림의 온도를 나타낸다. TM2는 항체의 완전한 풀림의 온도를 나타낸다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 TM1은 60℃ 이상, 바람직하게는 65℃ 이상, 더욱 바람직하게는 70℃ 이상이다. 대안적으로, 항체의 열적 안정성은 원편광 이색성 분석(circular dichroism)을 사용하여 측정될 수 있다(Murray 등 (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
바람직한 구체예에서, 빠르게 분해하지 않는 항체들을 선택한다. 항-CD70 항체의 단편화는, 당해 분야에 공지된, 모세관 전기영동(CE) 및 MALDI-MS를 이용하여 측정될 수 있다(Alexander AJ 및 Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
다른 바람직한 구체예에서, 최소 결집 효과를 갖는 항체들을 선택한다. 결집은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변경되거나 바람직하지 않은 약물동력학(pharmacokinetic) 특성을 개시하게 할 수 있다. 일반적으로, 25% 이하, 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 15% 이하, 더 더욱 바람직하게는 10% 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 5% 이하로 결집하는 항체가 허용된다. 결집은, 크기 배제 컬럼(size-exclusion column, SEC) 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 및 광 분산을 포함한, 당해 분야에 공지된 몇 가지 기술로 측정하여 단량체, 이량체, 삼량체 또는 다량체를 확인할 수 있다.
항체를 조작하는 방법
상기에 검토된 바와 같이, 본 명세서에서 개시된 VH 및 VK 서열들을 갖는 항-CD70 항체를 사용하여 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이에 부착된 불변 영역(들)을 변형함으로써 새로운 항-CD70 항체들을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점에서, 본 발명의 항-CD70 항체, 예컨대 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4의 구조적 특징을 이용하여, 인간 CD70에 결합하는 것과 같은, 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능적 특성을 보유하는, 구조적으로 관련된 항-CD70 항체를 만들 수 있다. 예를 들어, 상기에 검토된 바와 같이, 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4 또는 이의 돌연변이들의 하나 이상의 CDR 영역을 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDR들과 재조합적으로 조합하여, 추가의 재조합적으로 조작된 본 발명의 항-CD70 항체를 만들 수 있다. 다른 유형의 변형은 앞 부분에서 기재되었던 것들을 포함한다. 이러한 조작 방법에 사용되는 개시 물질은 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역이다. 조작된 항체를 만들기 위해, 본 명세서에서 제공된 하나 이상의 VH 및/또는 VK 서열들 또는 이의 하나 이상의 CDR 영역을 갖는 항체를 실제로 제조하는(즉, 단백질로서 발현시킴) 것은 필요치 않다. 그보다는, 그 서열(들)에 포함된 정보를 개시 물질로 사용하여 원래 서열(들)로부터 유도된 “2세대” 서열(들)을 생성시킨 후, 상기 “2세대” 서열(들)을 제조하고 단백질로서 발현시킨다.
따라서, 다른 구체예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 항-CD70 항체를 제조하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로 이루어진 군에서 선택된 CDR1 서열, 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 및 24로 이루어진 군에서 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 25, 26, 27, 28, 29, 75, 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 및 36으로 이루어진 군에서 선택된 CDR1 서열, 서열번호 37, 38, 39, 40, 41, 및 42로 이루어진 군에서 선택된 CDR2 서열, 및/또는 서열번호 43, 44, 45, 46, 47, 및 48로 이루어진 군에서 선택된 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하고;
(b) 상기 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 상기 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변경하여 적어도 하나의 변경된 항체 서열을 생성하고; 및
(c) 상기 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현하는 것.
표준 분자 생물학 기술을 사용하여 상기 변경된 항체 서열을 제조하고 발현시킬 수 있다.
바람직하게, 변경된 항체 서열(들)에 의하여 암호화된 항체는 본 명세서에서 기재된 항-CD70 항체의 기능적 특성들의 하나, 몇 개 또는 모두를 보유하는 항체이며, 상기 기능적 특성들은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
(a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD70 에 결합하고; 및
(b) 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합하며;
(c) 림프종 세포주, 예를 들어 B-세포 종양 세포주에 결합하고;
(d) CD70-발현 세포에 의하여 내재화하며;
(e) CD70-발현 세포에 대한 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 나타내고; 및
(f) 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 세포의 성장을 억제한다.
상기 변경된 항체들의 기능적 특성들은 실시예에서 설명된 바와 같이, 당해 분야에서 이용가능하고 및/또는 본 명세서에 기재된 표준 분석법(예를 들어, 유세포 분석법, 결합 분석법)을 이용하여 평가될 수 있다.
본 발명의 항체를 조작하는 방법에 관한 소정의 구체예에서, 항-CD70 항체 암호화 서열의 전체 또는 일부를 따라서 돌연변이를 무작위적으로 또는 선택적으로 도입할 수 있으며, 그 결과의 변형된 항-CD70 항체들을, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 결합 활성에 대하여 및/또는 다른 기능적 특성들에 대하여 스크리닝할 수 있다. 돌연변이 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Short의 PCT 공개번호 제WO 02/092780호는 포화 돌연변이유발법, 합성 결찰 조립법(synthetic ligation assembly) 또는 이의 조합을 사용하여 항체 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 방법을 기재한다. 대안적으로, Lazar 등의 PCT 공개번호 제WO 03/074679호는 컴퓨터화된 스크리닝 방법을 사용하여 항체들의 생리화학적 특성들을 최적화시키는 방법들을 기재한다.
본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자
본 발명의 다른 관점은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 핵산은 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태 내에 존재할 수 있다. 핵산은, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로즈 젤 전기영동 및 당해 업계에 공지된 다른 기술을 포함한 표준 기술을 사용하여, 다른 세포 성분 또는 다른 오염물, 예를 들어 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때, “분리”되거나 “실질적으로 순수하게 된” 것이다. F. Ausubel 등, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York을 참조. 본 발명의 핵산은, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있고 인트론성 서열들을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 핵산은 cDNA 분자이다.
본 발명의 핵산을 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 하이브리도마(예를 들어, 후술하는 바와 같은 인간 면역글로불린 유전자를 지닌 트랜스유전자성(transgenic) 마우스로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현되는 항체의 경우, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호하하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 얻을 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리로부터 얻은(예, 파지 디스플레이 기술을 사용함) 항체의 경우, 상기 항체를 암호화하는 핵산은 유전자 라이브러리로부터 회수할 수 있다.
본 발명의 바람직한 핵산 분자들은 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 또는 1F4 단일클론 항체들의 VH 및 VL 서열들을 암호화하는 것들이다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VH 서열들을 암호화하는 DNA 서열들은 각각 서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 74 및 54에 나타나 있다. 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7, 69A7Y 및 1F4의 VL 서열들을 암호화하는 DNA 서열들은 각각 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 59 및 60에 나타나 있다(69A7 및 69A7Y는 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 VL 서열을 암호화하는 동일한 DNA 서열을 가진다).
일단 VH 및 VL 분절을 암호화하는 DNA 단편들을 얻는다면, 이러한 DNA 단편들은 표준 재조합 DNA 기술에 의하여 더 조작하여, 예를 들어, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자로, Fab 단편 유전자로 또는 scFv 유전자로 변환시킬 수 있다. 이러한 조작에서, VL- 또는 VH-암호화 DNA 단편은 항체 불변 영역 또는 유연한 링커와 같은, 다른 단백질을 암호화하는 다른 DNA 단편과 작동적으로 연결되어 있다. 본 명세서의 맥락에서 사용되는, 용어 “작동적으로 연결된”은, 두 개 DNA 단편들이 연결되어서 그 두 개 DNA 단편들에 의해 암호화된 아미노산 서열들이 프레임 내(in-frame)에 남아있는 것을 의미하는 것으로 의도된다.
VH-암호화 DNA를 중쇄 불변 영역들(CH1, CH2, 및 CH3)을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 VH 영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 중쇄 유전자로 변환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자들의 서열은 당해 분야에 공지되어 있고(예, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들을 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 상기 중쇄 불변 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있으나, 가장 바람직하게는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우, VH-암호화 DNA를 중쇄 CH1 불변 영역만을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결할 수 있다.
VL-암호화 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 암호화하는 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써, VL 영역을 암호화하는 분리된 DNA를 전장 경쇄 유전자(Fab 경쇄 유전자는 물론)로 변환시킬 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열들은 당해 분야에 공지되어 있고(예, Kabat, E. A. 등 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이러한 영역들을 포함하는 DNA 단편들은 표준 PCR 증폭에 의하여 얻을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
scFv 유전자를 만들기 위해, VH- 및 VL-암호화 DNA 단편들을 유연한 링커를 암호화하는, 예를 들어, 아미노산 서열 (Gly4 -Ser)3을 암호화하는 다른 단편에 작동적으로 연결시켜서, VH 및 VL 서열들을 상기 유연한 링커로 연결된 VL 및 VH를 가지는, 연속적인 단일 사슬 단백질로서 발현하게 할 수 있다(예, Bird 등 (1988) Science 242:423-426; Huston 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty 등 (1990) Nature 348:552-554 참조).
본 발명의 단일클론 항체의 생산
본 발명의 단일클론 항체(mAbs)를 통상적인 단일클론 항체 방법, 예를 들어, Kohler 및 Milstein (1975) Nature 256:495의 표준 체세포 하이브리드화 기술을 포함하는 다양한 기술로 생산할 수 있다. 비록 체세포 하이브리드화 과정이 바람직하다 하더라도, 원칙적으로, 단일클론 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 방법이다. 면역화 프로토콜 및 융합용 면역화된 비장세포의 분리 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너들(예, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 공정 또한 공지되어 있다.
본 발명의 키메릭 또는 인간화 항체들을 상기 기재한 대로 제조된 비-인간 단일클론 항체의 서열에 근거하여 제조할 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린들을 암호화하는 DNA는 관심의 비-인간 하이브리도마로부터 얻을 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-뮤린(예, 인간) 면역글로불린 서열을 포함하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 항체를 생성하기 위해, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 가변 영역을 인간 불변 영역에 연결시킬 수 있다(예, Cabilly 등의 미국 특허번호 제4,816,567호 참조). 인간화 항체를 만들기 위해, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 뮤린 CDR 영역들을 인간 골격으로 삽입할 수 있다(예, Winter의 미국 특허번호 제5,225,539호 및 Queen 등의 미국 특허번호 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체들은 인간 단일클론 항체들이다. CD70에 대하여 지정된 상기 인간 단일클론 항체들은 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 부분을 지닌 트랜스유전자성(transgenic) 또는 트랜스염색체성(transchromosomic) 마우스를 사용하여 생산할 수 있다. 이러한 트랜스유전자성 및 트랜스염색체성 마우스는 각각 본 명세서에서 HuMAb 마우스 ® 및 KM 마우스 ® 로 지칭되는 마우스를 포함하고, 총칭하여 본원에서 “인간 Ig 마우스”라 지칭한다.
HuMAb 마우스 ® (Medarex사)는 내인성 μ 및 κ 사슬 좌위를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 정렬되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열들을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자 미소좌위(miniloci)를 포함한다(예, Lonberg, 등 (1994) Nature 368(6474):856-859 참조). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자들은 유형 전환(switching) 및 체세포 돌연변이를 겪게 되어 고친화도 인간 IgGκ 단일클론 항체를 생성한다(Lonberg, N. 등 (1994) 위 문헌; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. 및 Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, 및 Harding, F. 및 Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546에서 검토됨). HuMab 마우스 ® 의 제조와 사용, 및 상기 마우스에 의한 게놈 변형은 Taylor, L. 등 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. 등 (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi 등 (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. 등 (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon 등 (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. 등 (1994) International Immunology 6: 579-591; 및 Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에 더 설명되어 있는데, 이 모든 것들의 내용은 전체적으로 참조 문헌으로서 본 명세서에 특히 통합된다. Lonberg 및 Kay의 미국 특허번호 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호; Surani 등의 미국 특허번호 제5,545,807호; Lonberg 및 Kay의 PCT 공개번호 제WO 92/03918호, 제WO 93/12227호, 제WO 94/25585호, 제WO 97/13852호, 제WO 98/24884호 및 제WO 99/45962호; 및 Korman 등의 PCT 공개번호 제WO 01/14424호를 더 참조. 또한 인간 람다 경쇄 유전자를 지니는 트랜스유전자성 마우스를 Bruggemann의 PCT 공개번호 제WO 00/26373호에 기재된 것과 같이 사용할 수 있다. 예를 들어, 인간 람다 경쇄 트랜스유전자를 지니는 마우스는 인간 중쇄 트랜스유전자(예, HCo7)를 지니는 마우스, 및 또한 임의적으로 인간 카파 경쇄 트랜스유전자(예, KCo5)를 지니는 마우스와 교배시켜 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자 둘 다를 지니는 마우스를 만들 수 있다(예, 실시예 1 참조).
다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체를, 인간 중쇄 트랜스유전자 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 지닌 마우스와 같이, 트랜스유전자 및 트랜스염색체 상에 인간 면역글로불린 서열을 지닌 마우스를 사용하여 키울 수 있다. 이 마우스는 본 명세서에서 “KM 마우스®”로 지칭되며, Ishida 등의 PCT 공개번호 제WO 02/43478 호에 더 상세하게 기재되어 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스유전자성 동물 시스템은 당해 분야에서 이용가능하며 본 발명의 항-CD70 항체를 키우는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 제노마우스(Abgenix 사)로 지칭되는 대안적 트랜스유전자성 시스템을 사용할 수 있는데; 그러한 마우스는, 예를 들어, Kucherlapati 등의 미국 특허번호 제5,939,598호; 제6,075,181호; 제6,114,598호; 제6,150,584호 및 제6,162,963호에 기재되어 있다.
더구나, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 트랜스염색체성 동물 시스템은 당해 분야에서 이용가능하고 본 발명의 항-CD70 항체를 키우는데 사용될 수 있다. 예를 들어, “TC 마우스”로 지칭되는, 인간 중쇄 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스염색체 둘 다를 지닌 마우스를 사용할 수 있는데; 상기 마우스는 Tomizuka 등 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727에 기재되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스염색체를 지니는 소는 당해 분야에서 설명되어 있고(Kuroiwa 등 (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 및 PCT 출원 번호 제 WO 2002/092812호) 본 발명의 항-CD70 항체를 키우는데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법들을 사용하여 제조할 수 있다. 인간 항체들을 분리하는 상기 파지 디스플레이 방법들은 당해 분야에 확립되어 있다. 예를 들어: Ladner 등의 미국 특허번호 제5,223,409호; 제5,403,484호; 및 제5,571,698호; Dower 등의 미국 특허번호 제5,427,908호 및 제5,580,717호; McCafferty 등의 미국 특허번호 제5,969,108호 및 제6,172,197호; 및 Griffiths 등의 미국 특허번호 제5,885,793호; 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호 및 제6,593,081호 참조.
본 발명의 인간 단일클론 항체들은 또한 인간 면역 세포가 재구성되어 인간 항체 반응이 면역화시 발생될 수 있는 SCID 마우스를 사용하여 제조할 수 있다. 상기 마우스는, 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허번호 제5,476,996호 및 제5,698,767호에 설명되어 있다.
다른 구체예에서, Buechler 등의 미국 특허번호 제 6,794,132호에 기술된 바와 같이, 인간 항-CD70 항체를 인간 Ig 마우스 및 파지 디스플레이 기법의 조합을 이용하여 제조한다. 보다 명확히, 그 방법은 우선 인간 Ig 마우스(상기한 HuMab 마우스 또는 KM 마우스와 같은)를 하나 이상의 CD70 항원으로 면역화시킴으로써 상기 마우스에 항-CD70 항체 반응을 키우고, 이어서 핵산 암호화 인간 항체 사슬을 마우스의 림프 세포로부터 분리하고 이러한 핵산을 디스플레이 벡터(예, 파지)에 도입하여 디스플레이 패키지의 라이브러리를 제공하는 것을 포함한다. 따라서, 각 라이브러리 멤버는 인간 항체 사슬을 암호화하는 핵산을 포함하고 각 항체 사슬은 디스플레이 패키지로부터 나타내어진다. 그 다음 라이브러리를 CD70 단백질로 스크리닝하여 CD70에 특이적으로 결합하는 라이브러리 멤버를 분리한다. 그 후 선택된 라이브러리 멤버의 핵산 삽입물(inserts)을 표준 방법에 의하여 분리하고 배열하여 선택된 CD70 바인더의 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 결정한다. VH 영역이 CH 영역에 작동적으로 연결되고 VL 영역이 CL 영역에 작동적으로 연결될 수 있도록 가변 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 지니는 발현 벡터로 클론화하는 것과 같은, 표준 재조합 DNA 기법에 의하여 가변 영역은 전장 항체 사슬로 변환될 수 있다.
인간 Ig 마우스의 면역화
인간 Ig 마우스를 사용하여 본 발명의 인간 항체를 키울 때, Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 및 PCT 공개 번호 제WO 98/24884호 및 제WO 01/14424호에 의하여 설명된 바와 같이, 상기 마우스를 CD70-발현 세포주, CD70 항원 및/또는 재조합 CD70의 정제되거나 농축된 제조물, 또는 CD70 융합 단백질로 면역화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 마우스는 첫 주입시 6-16 주령일 것이다. 예를 들어, CD70 항원의 정제되거나 재조합 제조물(5-50 ㎍)은 복강내 및/또는 피하로 인간 Ig 마우스를 면역화시키는데 사용될 수 있다.
CD70에 결합하는 완전한 인간 단일클론 항체를 생성하는 상세 과정이 하기 실시예 1에 기술되어 있다. 다양한 항원들과의 축적된 실험에 따르면, 트랜스유전자성 마우스는, 프로인트 완전 항원보강제(complete Freund’s adjuvant) 내의 항원으로 복강내(IP)로 처음 면역화시킨 후, 프로인트 불완전 항원보강제(incomplete Freund’s adjuvant) 내의 항원으로 2 주마다 (총 6 번까지) IP 면역화시킬 때, 반응하는 것으로 나타났다. 그러나, 프로인트 이외의 다른 항원보강제도 효과적이라는 것을 또한 발견하였다(예, 리비(RIBI) 항원보강제). 덧붙여, 보강제 부재시 완전 세포가 높은 항원성이라는 것도 발견하였다. 안화후방 혈액(retroorbital bleed)에 의하여 얻은 혈장 샘플을 이용한 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐서 면역반응을 모니터할 수 있다. 혈장을 ELISA에 의하여 스크린할 수 있고(하기 기술함), 항-CD70 인간 면역글로불린의 충분한 역가를 가진 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 예를 들어, 비장을 희생 및 제거하기 3일 전에, 마우스를 항원으로 정맥내 증폭시킬 수 있다. 각 면역화에 대하여 2-3 개 융합이 수행되는 것이 필요한 것으로 예상된다. 일반적으로, 각 항원에 대하여 6 내지 24 마리 마우스를 면역화시킨다. 통상, HCo7 및 HCo12 품종(strain) 둘 다가 사용된다. HCo7 및 HCo12 마우스 품종의 생성은 각각 미국 특허번호 제5,770,429호 및 PCT 공개 제WO 01/09187호의 실시예 2에 기재되어 있다. 또한, HCo7 및 HCo12 트랜스유전자 둘 다를 두 개의 상이한 인간 중쇄 트랜스유전자(HCo7/HCo12)를 가진 단일 마우스 내로 함께 배양할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PCT 공개 제WO 02/43478호에 기재된 바와 같이, KM 마우스® 품종을 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
본 발명의 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장세포 및/또는 림프절 세포를 분리하고, 마우스 골수종 세포주와 같은 적절한 무한증식 세포주에 융합시킬 수 있다. 결과로 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체들의 생산을 위하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구들의 단일 세포 현탁액을 50% PEG를 사용하여, P3X63-Ag8.653을 분비하지 않는 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)의 수의 6분의 1에 융합시킬 수 있다. 대안적으로, 사이토펄스(CytoPulse) 대형 챔버 세포 융합 전기천공기(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie, Maryland)를 사용하여, 전기장에 기초한 전기융합 방법을 사용함으로써 면역화된 마우스의 비장 림프구의 단일세포 현탁액을 융합시킬 수 있다. 세포를 평평한 바닥 미세역가 플레이트에 약 2 x 105으로 도말한 후, 20% 태아 클론 혈정, 18% “653” 조건 배양액, 5% 오리겐(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50 mg/ml 겐타마이신, 및 1X 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(Hypoxanthine-aminopterin-thymidin, HAT)(Sigma; HAT는 융합 24 시간 후에 첨가)을 함유하는 선택 배지에 1주일 배양한다. 약 2 주일 후에는, 세포를 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양할 수 있다. 그 다음, 개별 웰을 인간 단일클론 IgM 및 IgG 항체들에 대하여 ELISA에 의하여 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14 일후에 배지를 관찰할 수 있다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 재도말하고, 다시 스크린하고 나서, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면, 단일클론 항체들을 제한 희석법으로 적어도 두 번 서브클론화할 수 있다. 그 다음 안정된 서브클론들을 시험관 내에서 배양하여 특성화용 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성할 수 있다.
인간 단일클론 항체들을 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광 계수를 사용하여 OD280에 의하여 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80℃에 보관할 수 있다.
본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
또한 본 발명의 항체들을, 예를 들어, 당해 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술 및 유전자 형질감염 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생산할 수 있다(예, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
예를 들어, 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 발현하기 위해, 일부 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA들을, 표준 분자 생물학 기술(예, PCR 증폭 또는 관심의 항체를 발현하는 하이브리도마를 사용하는 cDNA 클로닝)에 의하여 얻을 수 있고 이러한 DNA들을 발현 벡터들에 삽입하여 그 유전자를 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결할 수 있다. 이러한 맥락에서, 용어 “작동적으로 연결된”은 항체 유전자가 벡터 내로 결찰되어 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열들이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그들의 의도된 기능을 행하도록 하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열들은 사용되는 발현 숙주 세포에 사용할 수 있도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터로 삽입할 수 있거나, 더욱 일반적으로는 두 유전자들을 동일한 발현 벡터로 삽입한다. 상기 항체 유전자들을 표준 방법(예, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보 제한 자리의 결찰, 또는 제한 자리가 없으면 블런트 말단 결찰(blunt end ligation))에 의하여 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역들은, 그것들을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하고 있는 발현 벡터 내로 삽입함으로써, 임의의 항체 이소타입의 전장 항체 유전자를 생성하는데 사용될 수 있는데, 상기 벡터 내에서 VH 분절이 CH 분절(들)과 작동적으로 연결되고 벡터내에서 VK 분절이 CL 분절과 작동적으로 연결된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 상기 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 상기 항체 사슬의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 상기 항체 사슬 유전자를 벡터로 클론화하여 신호 펩티드가 인-프레임(in-frame)으로 항체 사슬 유전자의 아미노산 말단에 연결되게 할 수 있다. 상기 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 유도된 신호 펩티드)일 수 있다.
상기 항체 사슬 유전자에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 사슬 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열들을 지닌다. 용어 “조절 서열”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 조절 서열들은, 예를 들어, Goeddel(Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에 설명되어 있다. 조절 서열들의 선택을 포함하여, 발현 벡터의 구성은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 요소에 달려있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 이해될 것이다. 포유동물 숙주 세포 발현에 대한 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 계도하는 바이러스성 요소, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미언 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스 및 폴리오마 바이러스로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서(예, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter (AdMLP))를 포함한다. 대안적으로, 비바이러스성 조절 서열들, 예를 들어, 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수 있다. 또한, 조절 요소들은, SV40초기 프로모터로부터 유도된 서열들 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복체를 포함하는 SRα 프로모터 시스템과 같이, 상이한 소스로부터 얻어진 서열들로 구성될 수 있다(Takebe, Y. 등 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
항체 사슬 유전자 및 조절 서열들에 더하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예를 들어, 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예, 복제 개시점) 및 선택 마커 유전자와 같은 서열들을 지닐 수 있다. 상기 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예, Axel 등의 미국 특허번호 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 일반적으로, 선택 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포 상에, G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 저항성을 부여한다. 바람직한 선택 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭으로 dhfr- 숙주 세포에서 사용) 및 네오(neo) 유전자(G418 선택용으로)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄를 발현하기 위해, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터(들)를 표준 기술에 의하여 숙주 세포로 형질감염시킨다. 용어 “형질감염”의 다양한 유형은 외부 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포로 도입하는 데 공통적으로 사용되는 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 비록 본 발명의 항체들을 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 발현하는 것이 이론적으로 가능하다고 할지라도, 진핵 세포, 및 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 상기 진핵 세포, 및 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다, 적절히 접히고 면역적으로 활성인 항체를 더 잘 모으고 분비할 것 같기 때문이다. 항체 유전자의 원핵성 발현은 활성 항체를 높은 효율로 생산하는 것에 대하여 비효율적이라는 것이 보고되었다(Boss, M. A. 및 Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
본 발명의 재조합 항체들을 발현하기 위한 바람직한 포유동물 숙주 세포는 차이니스 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO 세포)(예를 들어, R. J. Kaufman 및 P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621 에서 설명된 바와 같이, DHFR 선택 마커와 같이 사용되는, Urlaub 및 Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 에서 설명된 dhfr- CHO 세포를 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포를 포함한다. 특히, NSO 골수종 세포와 같이 사용하기 위해, 다른 바람직한 발현 시스템은 제WO 87/04462호, 제WO 89/01036호 및 EP 제338,841호에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포로 도입될 때, 숙주 세포에서 항체가 발현하기에, 또는 더 바람직하게는 항체가 숙주세포가 성장되는 배양 배지로 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양함으로써, 상기 항체를 생산할 수 있다. 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다.
항원에 대한 항체 결합의 특성화
예를 들어, 유세포 분석에 의하여, CD70에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 항체들을 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, CD70-발현 세포를 조직 배양 플라스크에서 새롭게 수확하고 단일 세포 부유물을 준비한다. CD70-발현 세포 부유물(suspension)을 제1 항체로 직접적으로 또는 고정 후에 PBS에서 1% 파라포름알데히드로 착색시킨다. 약 백만개 세포를 0.5% BSA 및 50-200 ㎍/ml의 제1 항체를 포함하는 PBS에서 재부유시키고 30분간 얼음 위에서 배양한다. 상기 세포를 0.1% BSA, 0.01% NaN3를 포함하는 PBS로 2번 세척하고, 100㎕의 1:100 희석된 FITC-접합 염소-항-인간 IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)에서 재부유시키며 추가 30분 동안 얼음 위에서 배양한다. 세포를 다시 2번 세척하고, 0.5 ml의 세척 버퍼에서 재부유시키며 FACSCalibur 사이토미터(cytometer) 상에서 형광 염색에 대하여 분석한다(Becton-Dickinson, San Jose, CA).
대안적으로, 표준 ELISA에 의하여, CD70에 결합하는 것에 대하여 본 발명의 항체들을 테스트할 수 있다. 간단히 말하면, 미세역가 플레이트(microtiter plates)를 PBS 중의 0.25 ㎍/ml의 정제된 CD70으로 코팅하고 나서, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 차단시킨다. 항체의 희석물(예, CD70-면역화된 마우스로부터의 혈청 희석물)을 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2 시간 동안 배양한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척하고 나서, 알칼리 포스파타아제에 접합된 2차 시약(예, 인간 항체에 대하여, 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 다중클론 시약)으로 37℃에서 1 시간동안 배양한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질(1 mg/ml)로 전개시킨 다음, 405-650의 OD로 분석한다. 바람직하게, 최고의 역가를 전개한 마우스가 융합에 사용될 것이다.
또한 상술한 바와 같은 ELISA 분석법을 사용하여 CD70 면역원과의 양성 반응성을 보여주는 하이브리도마를 스크리닝할 수 있다. 높은 결합력으로 CD70에 결합하는 하이브리도마를 서브클론화하고 나아가 특성화한다. 부모 세포의 반응성을 보유하는(ELISA 분석법에 의함), 각 하이브리도마로부터의 하나의 클론을 선택하여 5-10 바이얼 세포 은행(vial cell bank)을 만들어 -140 ℃에서 저장하고 항체를 정제할 수 있다.
항-CD70 항체를 정제하기 위해, 선택된 하이브리도마를 단일클론 항체 정제용 2-리터 스피너-플라스크에서 성장시킬 수 있다. 단백질 A-세파로즈(Pharmacia, Piscataway, NJ)를 사용한 친화 크로마토그래피 전에 상청액을 여과하고 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 젤 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피로 점검하여 순도를 확실하게 할 수 있다. 완충액을 PBS로 교환할 수 있고, 농도를 1.43 흡광계수를 사용하는 OD280으로 결정할 수 있다. 상기 단일클론 항체들을 분주하고 -80 ℃에 보관할 수 있다.
선택된 항-CD70 단일클론 항체가 특이한 에피토프에 결합하고 있는지를 결정하기 위하여, 각 항체를 시판되는 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 비오티닐화할 수 있다. 비표지된 단일클론 항체와 비오티닐화된 단일클론 항체를 이용한 경쟁 연구를 상기에서 설명된 CD70 코팅-ELISA 플레이트를 이용하여 수행할 수 있다. 비오티닐화된 mAb 결합을 스트렙-아비딘-알칼리 포스파타제 탐침자(strep-avidin-alkaline phosphatase probe)로 검출할 수 있다. 대안적으로, 하기 실시예에 더 상세히 기재된 바와 같이, 경쟁 연구는 방사능표지된 항체를 이용하여 수행할 수 있고 비표지된 경쟁 항체는 스캐챠드 분석법에서 검출될 수 있다.
정제된 항체들의 이소타입을 결정하기 위해, 특정 이소타입의 항체들에 특이적인 시약을 사용하여 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 미세역가 플레이트의 웰을 1 ㎍/ml의 항-인간 면역글로불린으로 밤새 4℃에서 코팅할 수 있다. 1% BSA로 차단한 후, 주위 온도에서 1 내지 2 시간 동안 플레이트를 1 ㎍/ml 이하의 테스트 단일클론 항체들 또는 정제된 이소타입 대조군과 반응시킨다. 다음, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리 포스파타제-접합 탐침자와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전개시키고 전술한 바와 같이 분석한다.
웨스턴 블랏팅에 의하여, CD70 항원과의 반응성에 대하여 항-CD70 인간 IgG를 더 분석할 수 있다. 간단히 말하면, CD70을 준비하고, 여기에 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 실시한다. 전기영동 후, 분리된 항원들을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 10% 태아 소혈청으로 차단하며, 테스트될 단일클론 항체들로 탐침한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 타블렛으로 전개시킬 수 있다(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
또한 본 발명의 항체의 결합 특이성은 예를 들어 유세포 분석에 의하여 CD70 단백질을 발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 모니터함으로써 결정할 수 있다. 786-O, A498, ACHN, Caki-1, 및/또는 Caki-2 세포(실시예 4 및 5에 더 설명됨)와 같이, 자연적으로 CD70 단백질을 발현하는 세포 또는 세포주를 사용할 수 있거나 또는 CHO 세포주와 같은 세포주를 CD70을 암호화하는 발현 벡터로 형질감염시켜 CD70을 상기 세포의 표면 상에 발현시킬 수 있다. 형질감염된 단백질은 태그에 대한 항체를 이용한 탐지용으로서, 바람직하게는 N-말단에, myc-태그 또는 his-태그와 같은, 태그를 포함할 수 있다. CD70 단백질에 대한 본 발명의 항체의 결합은 형질감염된 세포를 항체와 함께 배양하고, 결합한 항체를 탐지함으로써 결정할 수 있다. 형질감염된 단백질 상에서 태그에 대한 항체의 결합을 양성 대조군으로서 이용할 수 있다.
이중특이적 분자
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD70 항체 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합부는, 다른 기능성 분자, 예를 들어, 다른 펩티드 또는 단백질(예, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도되거나 연결되어 적어도 두 개의 상이한 결합 자리 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 생성할 수 있다. 본 발명의 항체는 사실상 하나 이상의 다른 기능성 분자로 유도되거나 연결되어 두 개 이상의 상이한 결합 자리 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 생성하는데; 상기 다중특이적 분자들은 또한, 본 명세서에서 사용되는, 용어 “이중특이적 분자”에 의하여 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 만들기 위해, 본 발명의 항체를, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 의태체와 같은, 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결시켜(예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유적 결합 또는 기타), 이중특이적 분자를 만들어낸다.
따라서, 본 발명은 CD70에 대한 적어도 하나의 제 1 결합 특이체 및 제 2 표적 에피토프에 대한 제 2 결합 특이체를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 상기 제 2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 작동자 세포(예, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포(PMN)), 및 CD70을 발현하는 표적 세포 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자들은 CD70 발현 세포를 작동자 세포에 표적화시키고 Fc 수용체-매개 작동자 세포 활성, 예를 들어, CD70 발현 세포의 대식작용, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC), 사이토카인 분비 또는 슈퍼옥사이드 음이온의 발생을 개시한다.
이중특이적 분자가 다중특이성인 본 발명의 구체예에서, 상기 분자는 항-Fc 결합 특이체 및 항-CD70 결합 특이체에 더하여, 제 3 결합 특이체를 더 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 제 3 결합 특이체는 항-증진 인자(anti-enhancement factor, EF) 부분, 예를 들어, 세포독성 활성에 수반된 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대하여 면역 반응을 증가시키는 분자이다. 상기 “항-증진 인자 부분”은 주어진 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체에 결합하는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있고, 따라서 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 작용을 향상시키는 결과를 낳는다. 상기 “항-증진 인자 부분”은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 대안적으로, 상기 항-증진 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이체들이 결합하는 독립체와는 다른 개체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-증진 인자 부분은 세포독성 T-세포를 결합할 수 있다(예, CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 표적 세포에 대하여 면역 반응을 증진시키는 결과를 가져오는 다른 면역 세포를 통해서).
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이체로서 적어도 하나의 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하고, 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb 또는 단일 사슬 Fv를 포함한다. 상기 항체는 또한 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 이의 임의의 최소 단편일 수 있고, 예를 들어 Fv 또는 단일 사슬 구성체일 수 있으며, 이는 Ladner 등의 미국 특허번호 제4,946,778호에 기술되어 있고, 이의 내용은 참조문헌으로서 명백히 본 명세서에 통합된다.
한 구체예에서, Fcγ 수용체를 위한 결합 특이체가 단일클론 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “IgG 수용체”는 염색체 1 상에 위치한 8 개 γ-사슬 유전자들 중의 임의의 것을 지칭한다. 이러한 유전자들은 총 12 개의 트랜스멤브레인 또는 용해성 수용체 이소형태을 암호화하고 이들은 세 가지 Fcγ 수용체 군으로 나뉜다: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16). 바람직한 한 구체예에서, Fcγ 수용체는 인간 고친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자이고, 단량체성 IgG에 대하여 높은 친화도(108 - 109 M-1)를 보여준다.
소정의 바람직한 항-Fcγ 단일클론 항체들의 생산 및 특성화는 Fanger 등의 PCT 공개번호 제WO 88/00052호 및 미국 특허번호 제4,954,617호에 기술되어 있고, 이의 교시는 본 명세서에 참조문헌으로서 완전히 통합된다. 이러한 항체들은 수용체의 Fcγ의 결합 자리와 구별되는 자리에서 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 에피토프에 결합하고, 따라서, 그들의 결합은 IgG의 생리적 수준에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이성 항-FcγRI 항체들은 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32 를 생산하는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), ATCC 기탁번호 HB9469로부터 입수가능하다. 다른 구체예에서, 상기 항-Fcγ 수용체 항체는 단일클론 항체 22(H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산과 특성화는 Graziano, R. F. 등 (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002 및 PCT 공개번호 제WO 94/10332호에 기술되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 지정 HA022CL1 하에서 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁되었고 기탁번호 CRL 11177을 가진다.
다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성이 인간 IgA 수용체, 예를 들어, Fc-알파 수용체(FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되며, 이의 결합은 바람직하게는 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 “IgA 수용체”는 염색체 19 상에 위치한 하나의 α-유전자(FcαRI)의 유전자 생성물을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 유전자는 55 내지 110 kDa의 수 개의 교호적으로 스플라이스된 트랜스멤브레인 이소형태를 암호화하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립세포 상에 구조적으로 발현되나, 비-작동자(non-effector) 세포군 상에서는 아니다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대하여 중간 정도의 친화도(≒ 5 × 107 M-1)를 가지며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 사이토카인류에 노출시 증가된다(Morton, H. C. 등 (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). A3, A59, A62 및 A77로서 동정된, IgA 리간드 결합 도메인 외부의 FcαRI과 결합하는, 4 개 FcαRI-특이성 단일클론 항체가 기재되어 있다(Monteiro, R. C. 등 (1992) J. Immunol. 148:1764).
FcαRI 및 FcγRI은 본 발명의 이중특이적 분자에 사용하기에 바람직한 개시 수용체인데, 이는 그것들이 (1) 면역 작동자 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수지상 세포 상에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준(예, 세포당 5,000-100,000)으로 발현되며; (3) 세포독성 활성의 매개자이고(예, ADCC, 대식작용); (4) 그것들에 표적화된, 자체-항원을 포함한, 항원의 향상된 항원 제시를 매개하기 때문이다.
인간 단일클론 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메릭 및 인간화 단일클론 항체이다.
본 발명의 이중특이적 분자는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여, 구성적 결합 특이체, 예를 들어, 항-FcR 및 항-CD70 결합 특이체들을 접합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 분자의 각 결합 특이체는 분리적으로 생성되고 이후에 서로 접합될 수 있다. 상기 결합 특이체들이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 교차-결합 제제가 공유결합성 접합에 사용될 수 있다. 교차-결합 제제의 예는 단백질 A, 카보디이미드, N-석신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(oPDM), N-석신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 설포석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)를 포함한다(예, Karpovsky 등 (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조). 다른 방법들은 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan 등 (1985) Science 229:81-83, 및 Glennie 등 (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 설명된 것들을 포함한다. 바람직한 접합 제제는 SATA 및 설포-SMCC이고, 둘 다 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)에서 입수할 수 있다.
결합 특이체들이 항체인 경우, 이들을 두 개 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설피드릴 결합을 통해 접합할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 접합 전에, 힌지 영역은 변형되어 홀수의 설피드릴 잔기, 바람직하게는 하나를 포함한다.
대안적으로, 양 쪽 결합 특이체들은 동일 벡터에서 암호화되고, 동일한 숙주 세포에서 발현하고 결집될 수 있다. 이러한 방법은 상기 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 두 개의 결합 결정자를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 두 개의 단일 사슬 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 분자를 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,260,203호; 미국 특허 번호 제5,455,030호; 미국 특허 번호 제4,881,175호; 미국 특허 번호 제5,132,405호; 미국 특허 번호 제5,091,513호; 미국 특허 번호 제5,476,786호; 미국 특허 번호 제5,013,653호; 미국 특허 번호 제5,258,498호; 및 미국 특허 번호 제5,482,858호에 설명되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에 참조문헌으로서 명백히 통합된다.
이중특이적 분자가 그의 특이성 표적에 결합하는 것은, 예를 들어, 효소연관 면역흡착법(ELISA), 방사능면역분석(RIA), FACS 분석, 생체분석(예, 성장 억제), 또는 웨스턴 블랏 분석으로 확인될 수 있다. 이러한 분석법의 각각은 일반적으로, 관심의 복합체에 특이적인 표지 시약(예, 항체)을 사용함으로써, 특정 관심의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예컨대, 항체-FcR 복합체를 인식하고 특이적으로 결합하는 효소-연결 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 상기 복합체는 다양한 다른 면역분석법 중 임의의 것을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 방사능으로 표지되고 방사능면역분석(RIA)에서 사용될 수 있다(예를 들어, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조, 이는 본 명세서에 참조 문헌으로 통합됨). 방사능 동위원소는 γ 계수기 또는 신틸레이션 계수기(scintillation counter)와 같은 수단을 사용하여 또는 자가방사기록법(autoradiography)으로 검출될 수 있다.
링커(linkers)
본 발명은 화학적 링커를 통해 항체가 상기 파트너에 연결되는 항체-파트너 접합체를 제공한다. 어떤 구체예에서, 링커는 펩티딜 링커이고, 본 명세서에 (L4)p-F- (L1)m로 표시된다. 다른 링커는 하이드라진 및 디설파이드 링커를 포함하고, 각각, (L4)p-H- (L1)m 또는 (L4)p-J- (L1)m로 표시된다. 파트너에 부착된 링커에 부가하여, 본 발명은 또한 필수적인 임의의 분자 종에 부착하기에 적절한 분리가능한 (cleavable) 링커 가지를 제공한다. 본 발명의 링커 가지의 양상은 치료 부분(moiety)에 대한 이들의 부착을 참고로 하여 본 명세서에 예시된다. 그러나, 링커는 진단용 제제, 분석용 제제, 생분자, 표적화 제제, 검출가능한 표지 등을 포함하나 이에 한정되지 않는, 다양한 종에 부착될 수 있다는 것이 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.
항체-파트너 접합체에서 펩티딜 및 다른 링커들의 사용은 미국 가출원 일련번호 제60/295,196호; 제60/295,259호; 제60/295342호; 제60/304,908호; 제60/572,667호; 제60/661,174호; 제60/669,871호; 제60/720,499호; 제60/730,804호; 및 제60/735,657호; 및 미국 특허출원 일련번호 제10/160,972호; 제10/161,234호; 제11/134,685호; 제11/134,826호; 및 제11/398,854호 및 미국 특허번호 제6,989,452호 및 PCT 특허출원 번호 제 PCT/US2006/37793호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 참조 문헌으로서 본 명세서에 통합된다.
추가 링커들은 미국 특허 번호 제6,214,345호(Bristol-Myers Squibb), 미국 특허출원 번호 제 2003/0096743호 및 미국 특허출원 번호 제2003/0130189 호(둘 다 Seattle Genetics에 속함), de Groot 등, J. Med. Chem. 42, 5277 (1999); de Groot 등, J. Org. Chem. 43, 3093 (2000); de Groot 등, J. Med. Chem. 66, 8815, (2001); 제WO 02/083180호 (Syntarga); Carl 등, J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981); Dubowchik 등, Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998) 및 제60/891,028호(2007년 2월 21일에 출원됨)에 기술되어 있다.
한 관점에서, 본 발명은 치료적 제제 및 마커에 표적화기(targeting groups)를 부착하는데 유용한 링커에 관한 것이다. 다른 관점에서, 본 발명은 화합물에 안정성을 부여하거나, 그들의 생체내 독성을 감소시키거나, 그렇지 않으면, 그들의 약물동력학, 생물학적 이용효능 및/또는 약물역학에 유리하게 영향을 미치는 링커를 제공한다. 상기 구체예에서, 약물이 작용 자리로 전달되면, 상기 링커는 분리되어 활성 약물을 방출하는 것이 일반적으로 바람직하다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 링커는 흔적이 없어서, 일단 치료적 제제 또는 마커로부터 제거되면(예를 들어 활성화 동안에), 링커의 존재 흔적은 남지 않는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 링커들은 치료 작용 또는 마커 활성의 자리에서와 같은 표적 세포의 자리에서 또는 근처에서 분리될 수 있는 그들의 능력에 의해 특징지워진다. 상기 분리는 자연에서 효소적일 수 있다. 이 특징은 치료적 제제 또는 마커의 전신 활성을 감소시키고 독성 및 전신 부작용을 감소시키는 것에 도움을 준다. 효소적 분리의 바람직한 분리가능한 기는 펩티드 결합, 에스테르 결합, 및 디설파이드 결합을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 pH에 민감하고, pH의 변화를 통해 분리된다.
본 발명의 한 중요한 관점은 링커가 분리되는 속도를 조절하는 능력이다. 때때로 빨리 분리하는 링커가 바람직하다. 그러나 어떤 구체예에서, 더 느리게 분리하는 링커가 바람직할 수 있다. 예를 들면, 지속 방출 제형(sustained release formulation)에서 또는 빠른 방출 및 느린 방출 성분 둘 다를 가진 제형(formulation)에서 더 느리게 분리하는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 제WO 02/096910호는 하이드라진 링커를 갖는 여러 개의 특정 리간드-약물 복합체를 제공한다. 그러나, 요구되는 고리화(cyclization)의 속도에 따라 링커 조성물을 조절할 수 있는 방법은 없고 상술된 특정 화합물이 많은 약물-링커 접합체에 바람직한 것보다 더 느린 속도로 약물로부터 리간드를 분리한다. 이와 대조적으로, 본 발명의 하이드라진 링커는 매우 빠른 것에서 매우 느린 것까지의 고리화 속도 범위를 제공하고, 이에 의하여 바람직한 고리화 속도에 기초한 특정 하이드라진 링커의 선택이 가능하다.
예를 들어, 매우 빠른 고리화는 분리시 단일 5-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커로 성취될 수 있다. 세포에 세포독성 제제를 표적 전달하는 바람직한 고리화 속도는 분리시 제미널 위치(geminal position)에 2개의 메틸기를 갖는 링커로부터 얻어진 두 개의 5-멤버 고리 또는 단일 6-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커를 사용하여 성취될 수 있다. 젬-디메틸 효과(gem-dimethyl effect)는 제미널 위치에 2개의 메틸기가 없는 단일 6-멤버 고리에 비해 고리화 반응 속도를 가속하는 것으로 보여졌다. 이는 스트레인(strain)이 고리에서 느슨해짐으로 인한 것이다. 그러나, 때때로 치환기들은 그것을 빠르게 하는 대신에 반응을 느리게 할 수 있다. 흔히 지연의 이유는 입체 장애일 수 있다. 예를 들어, 젬 디메틸 치환은 제미널 탄소(geminal carbon)가 CH2일 때에 비해 훨씬 빠른 고리화 반응을 허용한다.
그러나, 어떤 구체예에서, 더 느리게 분리하는 링커가 바람직할 수 있다는 것을 주의하는 것이 중요하다. 예를 들어, 지속 방출 제형에서 또는 빠른 방출과 느린 방출 성분 둘 다를 갖는 제형에서, 더 느리게 분리하는 링커를 제공하는 것이 유용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 느린 고리화 속도는, 분리시, 젬-디메틸 치환이 없이, 단일 6-멤버 고리 또는 단일 7-멤버 고리를 생산하는 하이드라진 링커를 사용하여 성취할 수 있다.
또한 링커는 순환 중에 분해에 대항하는 치료적 제제 또는 마커를 안정화시키는 작용을 한다. 상기 안정화는 부착된 제제 또는 마커의 순환 반감기를 연장하기 때문에 이 특징은 유의한 이점을 제공한다. 또한 링커는 부착된 제제 또는 마커의 활성을 약화시켜서 접합체를 순환 중에 상대적으로 양성을 띠게하여(relatively benign), 원하는 작용 자리에서 활성화 후에, 원하는 효과, 예를 들면, 독성을 갖게 한다. 치료적 제제 접합체에 대해서, 링커의 이 특징이 제제의 치료 지표를 개선한다.
바람직하게 안정화기는 혈액 또는 비-표적 조직에 존재할 수 있는 효소에 의한 치료적 제제 또는 마커의 제거 및 대사를 제한하기 위해서 선택되며, 더 나아가 제제 또는 마커가 세포로 이동하는 것을 제한하기 위해 선택된다. 안정화기는 제제 또는 마커의 분해를 차단하는 작용을 하고, 또한 제제 또는 마커의 다른 물리학적 특징을 제공하는 작용도 할 수 있다. 안정화기는 또한 제형화된 또는 비-제형화된 형태에 저장하는 동안 제제 또는 마커의 안정성을 개선할 수 있다.
이상적으로, 37℃에서 2시간 동안 인간 혈액내에 제제 또는 마커를 저장함으로써 테스트시 안정화기가 분해로부터 제제 또는 마커를 보호한다면, 안정화기는 치료적 제제 또는 마커를 안정화시키는데 유용하며 주어진 분석 조건 하에서 인간 혈액내에 존재하는 효소에 의해 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 더욱 바람직하게는 5% 미만 및 더더욱 바람직하게는 2% 미만으로 제제 또는 마커를 분리하게 된다.
또한 본 발명은 이러한 링커들을 포함하는 접합체에 관한 것이다. 더욱 특별하게, 본 발명은 질병의 치료, 특히 암 화학요법에 사용될 수 있는 전구약물의 사용에 관한 것이다. 특히, 본 명세서에 기술된 링커들의 사용은 유사한 구조의 전구약물에 비해 혈액내에서 작용의 높은 특이성, 감소된 독성 및 개선된 안정성을 나타내는 전구약물을 제공한다.
본 명세서에 기술된 본 발명의 링커는 파트너 분자 내의 다양한 위치에 존재할 수 있다.
따라서, 상기 기(group)를 결여하는 구성체들의 속도에 비해 증진된 속도로, 생체내, 예를 들어, 혈액류에서 분리될 사슬의 부분으로서 임의의 다양한 기들을 포함할 수 있는 링커를 제공한다. 또한 치료적 제제 및 진단용 제제와 링커 가지의 접합체도 제공한다. 링커는 치료적 제제의 전구약물 유사체를 형성하고 치료적 제제 또는 진단용 제제를 표적화 제제, 검출가능한 표지, 또는 고형 지지체에 가역적으로 연결하는데 유용하다. 링커를 세포독소를 포함하는 복합체에 함입할 수 있다.
항체로의 전구약물의 부착은 세포독성 약물의 통상적인 항체 접합체보다 추가적인 안전성 이점을 줄 수 있다. 종양 세포 내 및 혈장을 포함하여 여러 가지 정상 조직에서 모두 전구약물의 활성은 에스테라제에 의해 이루어질 수 있다. 비록 마우스에서 관찰된 것보다는 덜 유사하지만, 인간에서 관련된 에스테라제 활성의 수준은 래트 및 비-인간 영장류에서 관찰되는 것과 매우 유사함이 보여졌다. 또한 전구약물의 활성은 글루쿠로니다제에 의한 분리로 이루어질 수 있다.
분리가능한 펩티드, 하이드라진, 또는 디설파이드 기에 부가하여, 하나 이상의 자기-희생 링커기 L1은 세포독소와 표적화 제제 사이에 임의로 도입된다. 또한 이러한 링커기는 스페이서기(spacer groups)로 기술될 수도 있으며, 적어도 2개의 반응성 기능기(functional groups)를 포함한다. 전형적으로, 스페이서기의 하나의 화학적 기능성기(functionality)는 치료적 제제, 예를 들면, 세포독소의 화학적 기능성기에 결합되고, 반면에 상기 스페이서기의 다른 화학적 기능성기는 표적화 제제 또는 분리가능한 링커의 화학적 기능성기에 결합하는데 사용된다. 스페이서기의 화학적 기능성기의 예는 하이드록시, 메르캅토, 카르보닐, 카르복시, 아미노, 케톤, 및 메르캅토 기들을 포함한다.
L1으로 표시되는, 자기-희생 링커는 일반적으로 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 또는 치환 또는 비치환 헤테로알킬 기이다. 한 구체예에서, 알킬 또는 아릴 기는 1개 내지 20개 사이의 탄소 원자를 포함한다. 또한 그것들은 폴리에틸렌 글리콜 부분도 포함한다.
예시적 스페이서기는, 예를 들어, 6-아미노헥사놀, 6-메르캅토헥사놀, 10-하이드록시데칸산, 글리신 및 다른 아미노산, 1,6-헥산디올, β-알라닌, 2-아미노에탄올, 시스테아민(2-아미노에탄티올), 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 3-말레이미도벤조산, 프탈리드, α-치환 프탈리드, 카르보닐기, 아민성 에스테르, 핵산, 펩티드 등을 포함한다.
스페이서기는 부가적인 분자 부분 및 화학적 기능성기를 세포독소-표적화 제제 복합체 내로 도입하게 할 수 있다. 일반적으로, 부가적인 부분 및 기능성기는 상기 복합체의 혈장 반감기 및 다른 특성들에 영향을 줄 것이다. 따라서, 스페이서기의 신중한 선택을 통하여, 혈장 반감기 범위를 갖는 세포독소 복합체를 생산할 수 있다.
약물 부분에 직접 인접하여 위치한 스페이서(들)는 또한 (L1)m으로 나타내며, 여기에서 m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 및 6으로부터 선택된 정수이다. 다중 L1 스페이서가 존재할 때, 동일한 또는 상이한 스페이서를 사용할 수 있다. L1 은 임의의 자기-희생기일 수 있다.
L4는 상기 부분을 포함하는 링커를 사용하여 접합체에 증가된 용해성 또는 감소된 응집성들을 바람직하게 부여하거나 상기 접합체의 가수분해 속도를 변경하는 링커 부분이다. L4 링커는 자기-희생이 될 필요가 없다. 한 구체예에서, L4 부분은 직쇄, 분지쇄, 또는 고리일 수 있는, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다. 치환기는, 예를 들어, 저급(C1-C6)알킬, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 또는 디알킬아미노일 수 있다. 어떤 구체예에서, L4 는 비-고리형 부분을 포함한다. 다른 구체예에서, L4 는 임의의 양 또는 음으로 하전된 아미노산 폴리머, 예를 들면, 폴리리신 또는 폴리아르게닌을 포함한다. L4는 폴리에틸렌 글리콜 부분과 같은 폴리머를 포함할 수 있다. 추가적으로, L4 링커는 예를 들면, 폴리머 성분 및 작은 화학적 부분 둘 다를 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에서, L4는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부분을 포함한다. L4의 PEG 부분은 1 내지 50개 단위의 길이일 수 있다. 바람직하게는, PEG는 1-12개의 반복 단위, 더 바람직하게는 3-12개의 반복 단위, 더욱 바람직하게는 2-6개의 반복 단위, 또는 심지어 더 바람직하게는 3-5개의 반복 단위 및 가장 바람직하게는 4개의 반복 단위를 가질 것이다. L4는 단지 PEG 부분만으로 구성되거나, 또는 부가적인 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬을 또한 포함할 수 있다. L4 부분의 일부로서 PEG를 조합하여 복합체의 수용성을 향상시키는 것이 유용하다. 추가적으로, PEG 부분은 항체에 약물이 접합하는 동안 일어날 수 있는 결집의 정도를 감소시킨다.
어떤 구체예에서, L4 는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착되는
Figure 112009042033207-PCT00002
을 포함한다. R20은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이다. 각 R25, R25’, R26, 및 R26’는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고; s 및 t는 독립적으로 1 내지 6의 정수들이다. 바람직하게, R20, R25, R25’, R26, 및 R26’는 소수성이다. 어떤 구체예에서, R 20은 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 저급 알킬)이다. 어떤 구체예에서, R25, R25’, R26, 및 R26’는 독립적으로 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 C1부터 C4까지의 알킬)이다. 어떤 구체예에서, R25, R25’, R26, 및 R26’는 모두 H이다. 어떤 구체예에서, t는 1이고 s는 1 또는 2이다.
펩티드 링커 (F)
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩티딜 링커는 하기의 일반식으로 표시될 수 있다: (L4)p-F- (L1)m, 여기에서 F는 펩티딜 부분을 포함하는 링커 부분을 나타낸다. 한 구체예에서, F 부분은 임의의 부가적인 자기-희생 링커(들), L2, 및 카르보닐기를 포함한다. 다른 구체예에서, F 부분은 아미노기 및 임의의 스페이서기(들), L3를 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 펩티딜 링커를 포함하는 접합체는 하기 식 (a)의 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00003
.
이 구체예에서, L1은 상술된 바와 같이, 자기-희생 링커이고, L4는 상술된 바와 같이, 증가된 용해성, 또는 감소된 응집성을 부여하거나 또는 가수분해율을 변경하는 부분이다. L2 는 자기-희생 링커(들)를 나타낸다. 덧붙여, m은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1은 하나 이상의 천연 아미노산, 및/또는 비천연 α-아미노산을 나타내고; c는 1 내지 20의 정수이다. 어떤 구체예에서, c는 2 내지 5의 범위에 있거나, 또는 c는 2 또는 3이다.
상기 식 (a)의 본 발명의 펩티드 링커에서, AA1은 그의 아미노 말단에서 L4에 직접 연결되거나, 또는 L4가 부재하는 경우, X4기(즉, 표적화 제제, 검출가능한 표지, 보호된 반응성 기능기 또는 비보호된 반응성 기능기)에 직접 연결된다. 어떤 구체예에서, L4가 존재하면, L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착된 카르복실 아실기를 포함하지 않는다. 따라서, 이들 구체예에서, 미국 특허 번호 제6,214,345호의 펩티딕 링커에서는 필요한, 카르복실 아실 단위가 L4 와 X4 중의 하나와 AA1 사이에 직접 있을 필요는 없다.
다른 구체예에서, 펩티딜 링커를 포함하는 접합체는 하기 식 (b)의 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00004
.
이 구체예에서, L4는 상술된 바와 같이, 바람직하게 증가된 용해성 또는 감소된 응집성을 부여하거나, 또는 가수분해율을 변경하는 부분이고; L3는 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 스페이서기이며, L3의 아민은 D의 매달린(pendant) 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3 의 카르복실은 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성하고; o 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다. AA1는 하나 이상의 천연 아미노산, 및/또는 비천연 α-아미노산을 나타내고; c는 1 내지 20의 정수이다. 이 구체예에서, L1은 없다(즉 m은 일반식에서 0임).
상기 식 (b)의 본 발명의 펩티드 링커에서, AA1은 그의 아미노 말단에서 L4에 직접 연결되거나, 또는 L4가 부재하는 경우, X4기(즉, 표적화 제제, 검출가능한 표지, 보호된 반응성 기능기 또는 비보호된 반응성 기능기)에 직접 연결된다. 어떤 구체예에서, L4가 존재하면, L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착된 카르복실 아실기를 포함하지 않는다. 따라서, 이들 구체예에서, 미국 특허 번호 제6,214,345호의 펩티딕 링커에서는 필요한, 카르복실 아실 단위가 L4 와 X4 중의 하나와 AA1 사이에 직접 있을 필요는 없다.
자기-희생 링커(self-immolative linker) L 2
자기-희생 링커 L2는 두 개의 간격이 있는 화학적 부분을 함께 공유적으로 연결시켜 정상적으로 안정한 세 부분으로 된 분자를 형성할 수 있는 2-기능성 화학적 부분으로, 효소적 분리 수단에 의해 상기 세 부분으로 된 분자로부터 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중의 하나를 방출하고; 상기 효소적 분리 후에, 상기의 간격이 있는 화학적 부분 중 다른 하나를 상기 분자의 잔여 부분으로부터 자발적으로 분리하여 방출한다. 본 발명에 따라, 자기-희생 스페이서를 그의 한쪽 끝에서 펩티드 부분에 공유적으로 연결시키고, 그의 다른 쪽 끝에서 유도체화가 약리학적 활성을 억제하는 약물 부분의 화학적 반응성 자리에 공유적으로 연결되어, 결과적으로 펩티드 부분과 약물 부분을 함께 구분하고 공유적으로 연결하여 세 부분으로된 분자를 형성하는데, 이것은 표적 효소가 없을 때는 안정되고 약리학적으로 비활성이지만, 스페이서 부분과 펩티드 부분을 공유적으로 연결하는 결합부에서 표적 효소에 의해 효소적으로 분리되어 그렇게 함으로써 세 부분으로 된 분자로부터 펩티드 부분의 방출에 영향을 미친다. 상기 효소적 분리는, 다시, 스페이서 부분의 자기-희생적 특징을 활성화하고 약물 부분에 스페이서 부분을 공유적으로 연결하는 결합부의 자발적 분리를 개시하는데, 그렇게 함으로써 약물을 약리학적으로 활성인 형태로 방출하는 데 영향을 미친다.
자기-희생 링커 L2는 임의의 자기-희생기가 될 수 있다. 바람직하게는 L2는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 치환 헤테로사이클로알킬, 치환 및 비치환 아릴, 및 치환 및 비치환 헤테로아릴이다.
특히 바람직한 자기-희생 스페이서 L2는 식 (c)에 의하여 나타낼 수 있다:
Figure 112009042033207-PCT00005
아미노벤질기의 방향족 고리는 하나 이상의 “K”기로 치환될 수 있다. “K”기는 고리 구조의 일부인 4개의 비치환 탄소 중 하나에 부착된 수소를 대체한 방향족 고리 상의 치환기이다. “K”기는 할로겐과 같은 단일 원자일 수 있고, 또는 알킬, 헤테로알킬, 아미노, 니트로, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 및 시아노와 같은 다-원자기일 수 있다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된다. 예시적인 K 치환기는 F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 및 메틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. “Ki”에서, i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 한 바람직한 구체예에서, i는 0이다.
상기에서 보여진 구조의 에테르 산소 원자는 카르보닐기에 연결된다. NR24 기능성기로부터 방향족 고리로 난 선은, 아민 기능성기가 고리를 형성하면서 -CH2-O- 기에 의해 치환되지 않는 5개의 탄소 중 임의의 것에 결합될 수 있을 나타낸다. 바람직하게, X의 NR24 기능성기는 -CH2-O- 기에 대한 파라 위치에서 방향족 고리에 공유적으로 결합되어 있다. R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 선택된 멤버이다. 특정 구체예에서, R24는 수소이다.
한 구체예에서, 본 발명은 상기 식 (a)의 펩티드 링커를 제공하는데, 여기에서 F는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00006
여기에서 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 선택된다. 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버인데, 여기에서 R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되며; i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다.
다른 구체예에서, 상기 식 (a)의 펩티드 링커는 다음 구조를 포함하는 -F-(L1)m-를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00007
여기에서 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이다.
어떤 구체예에서, 자기-희생 스페이서 L1 또는 L2는 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00008
여기에서 각 R17, R18, 및 R19는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택되고, w는 0 내지 4의 정수이다. 어떤 구체예에서, R17 및 R18은 독립적으로 H 또는 알킬(바람직하게, 비치환 C1-4 알킬)이다. 바람직하게, R17 및 R18은 메틸 또는 에틸과 같은, C1-4 알킬이다. 어떤 구체예에서, w는 0이다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 바라는 것은 아니지만, 이 특정한 자기-희생 스페이서는 상대적으로 빠르게 고리화한다는 것을 실험적으로 알아내었다.
어떤 구체예에서, L1 또는 L2는
Figure 112009042033207-PCT00009
을 포함한다.
스페이서기(spacer group) L 3
스페이서기 L3은 일차 또는 이차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 것으로 특징지워지며, L3기의 아민이 D의 매달린 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 또는 L3의 카르복실이 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성한다. L3 는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 또는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 한 바람직한 구체예에서, L3은 방향족기를 포함한다. 더욱 바람직하게, L3은 벤조산기, 아닐린기 또는 인돌기를 포함한다. -L3-NH- 스페이서로 작용할 수 있는 구조의 비-제한적인 예들은 하기의 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00010
Figure 112009042033207-PCT00011
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택되는 멤버이며, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이다.
L3을 포함하는 본 발명의 링커의 분리시, L3 부분은 약물, D에 부착된 상태로 남는다. 따라서, L3 부분은 D에 부착된 그의 존재가 D의 활성을 유의하게 변경하지 않도록 선택된다. 다른 구체예에서, 약물 D의 일 부분은 그 자체가 L3 스페이서로 기능한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 약물, D는, 약물의 일 부분이 L3 스페이서로서 기능하는 듀오카르마이신 유도체이다. 그러한 구체예의 비-제한적인 예는 NH2-(L3)-D가 다음으로 이루어진 군에서 선택된 구조를 갖는 것들을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00012
여기에서 Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이며; 각 구조상의 NH2기는 (AA1)c 와 반응하여 -(AA1)c-NH-를 형성한다.
펩티드 서열 AA 1
AA1기는 단일 아미노산 또는 아미드 결합에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산을 나타낸다. 아미노산은 천연 아미노산 및/또는 비천연 α-아미노산일 수 있다.
펩티드 서열 (AA1)c는 단일 아미노산(c=1일때) 또는 아미드 결합에 의해 함께 결합된 다수의 아미노산의 기능적 아미드화 잔기이다. 본 발명의 펩티드는 생물학 시스템에서 관심의 위치에서 효소에 의한 펩티드의 효소-촉매 분리를 위해 선택된다. 예를 들어, 표적화 제제를 사용하여 세포에 표적화되나, 그 세포에 의하여 내재화되지 않은 접합체에 대하여, 예컨대, 근처의 사멸하는 세포의 세포 내용물의 방출로 인하여 세포외 기질에 존재할 수 있는 하나 이상의 프로테아제에 의하여 분리되는 펩티드를 선택하여, 펩티드를 세포외적으로 분리한다. 펩티드 내의 아미노산의 수는 1부터 20까지의 범위에 있을 수 있으나; 더욱 바람직하게는 (AA1)c를 포함하여 1-8개의 아미노산, 1-6개의 아미노산 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산일 것이다. 특정 효소 또는 효소류에 의해서 분리되기 쉬운 펩티드 서열은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
혈청, 간, 장 등에서 효소에 의해 분리되는 많은 펩티드 서열은 당해 분야에 알려져 있다. 본 발명의 예시적인 펩티드 서열은 프로테아제에 의하여 분리되는 펩티드 서열을 포함한다. 프로테아제-민감성 서열의 사용에 대하여 나오는 논의의 초점은 설명을 명확하게 하기 위함이며 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
펩티드를 분리하는 효소가 프로테아제일 때, 링커는 일반적으로 프로테아제의 분리 인식 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 프로테아제의 분리 인식 서열은 단백질분해 분리 동안에 프로테아제에 의하여 인식되는 특정 아미노산 서열이다. 많은 프로테아제 분리 자리는 당해 분야에 공지되어 있고, 이들 및 다른 분리 자리들은 링커 부분에 포함될 수 있다. 예를 들어, Matayoshi 등, Science 247: 954 (1990); Dunn 등, Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah 등, Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber 등, Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith 등, Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); Bouvier 등, Meth. Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy 등, in Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's Disease, ed. Masters et al. pp. 190-198 (1994) 참조.
펩티드 서열 (AA1)c의 아미노산은 종양-관련 프로테아제와 같은 특정 분자에 의한 선택적인 효소적 분리에 대한 그들의 적합성을 근거로 선택된다. 사용된 아미노산은 천연 또는 비천연 아미노산일 수 있다. 그것들은 L 또는 D 배열일 수 있다. 한 구체예에서, 적어도 3개의 상이한 아미노산이 사용된다. 다른 구체예에서는, 단지 2개의 아미노산이 사용된다.
바람직한 구체예에서, 펩티드 서열 (AA1)c은 리소좀 프로테아제에 의하여 분리되는 그의 능력을 근거로 선택되는데, 이의 비-제한적인 예는 카텝신 B, C, D, H, L 및 S를 포함한다. 바람직하게, 펩티드 서열 (AA1)c은 시험관 내에서 카텝신 B에 의하여 분리될 수 있는데, 이것을 당해 분야에 공지된 시험관 내 프로테아제 분리 분석법을 이용하여 테스트할 수 있다.
다른 구체예에서, 펩티드 서열 (AA1)c은 종양 세포의 부근에서 세포외적으로 발견되는 프로테아제와 같은, 종양-관련 프로테아제에 의하여 분리될 수 있는 그의 능력을 근거로 선택되는데, 이의 비-제한적인 예는 티메트 올리고펩티다아제(thimet oligopeptidase, TOP) 및 CD10을 포함한다. TOP 또는 CD10에 의해 분리되는 펩티드의 능력을 당해 분야에 공지된 시험관 내 프로테아제 분리 분석법을 이용하여 테스트할 수 있다.
본 발명의 접합체에 사용하기에 적절한 펩티드 서열의 적절하나 비-제한적인 예는 Val-Cit, Cit-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N9-토실-Arg, Phe-N9-니트로-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu(서열번호 77), β-Ala-Leu-Ala-Leu(서열번호 78), Gly-Phe-Leu-Gly(서열번호 79), Val-Ala, Leu-Leu-Gly-Leu(서열번호 91), Leu-Asn-Ala, 및 Lys-Leu-Val를 포함한다. 바람직한 펩티드 서열은 Val-Cit 및 Val-Lys이다.
다른 구체예에서, 약물 부분에 가장 근접하게 위치한 아미노산은 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: Ala, Asn, Asp, Cit, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val. 또한 다른 구체예에서, 약물 부분에 가장 근접하게 위치한 아미노산은 다음으로 이루어진 군에서 선택된다: Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, 및 Val.
프로테아제는 암 전이에 관련되어 왔다. 프로테아제 우로키나아제의 합성의 증가는 많은 암에서 전이하는 능력의 증가와 관련되어 있었다. 우로키나아제는 세포외 공간에 편재하여 위치하는, 플라스미노겐으로부터 플라스민을 활성화하고, 그의 활성화는, 전이하는 종양 세포가 침입하는 통로가 되는 세포외 기질에서 단백질의 분해를 일으킬 수 있다. 플라스민은 또한 콜라게나제를 활성화하여, 모세관 및 림프계를 둘러싸는 기저막에서 콜라겐의 분해를 증진시키고, 그 때문에 종양 세포가 표적 조직으로 침입하게 한다(Dano 등, Adv. Cancer. Res., 44:139 (1985)). 따라서, 우로키나아제에 의해 분리되는 펩티드 서열을 링커로서 사용하는 것은 본 발명의 범위내에 있다.
본 발명은 또한 트립타제에 의한 분리에 민감한 펩티드 서열의 사용을 제공한다. 인간 마스트 세포(mast cells)는, α βI, βII, 및 βIII로 지정된, 적어도 4개의 다른 트립타제를 발현한다. 이러한 효소들은 혈액 혈장 프로테이나제 억제제에 의해서 조절되지 않으며, 단지 시험관 내에서 약간의 생리학적인 기질을 분리한다. 세린 프로테아제의 트립타제 군(family)은 마스트 세포를 수반하는 다양한 알러지 및 염증성 질병에 관련되어 있는데, 이는 이러한 질환을 갖는 환자의 생물학적 유체(biological fluids)에서 발견되는 높아진 트립타제 수준으로 인한 것이다. 그러나, 질병의 병리생리학에 있어서 트립타제의 정확한 역할은 서술될 것으로 남는다. 트립타제의 생물학적 기능 및 해당 생리학적 결과의 범위는 그들의 기질 특이성에 의하여 실질적으로 한정된다.
트립타제는 종양 전이 및 침입과 관련된 프로테아제의 치모겐(zymogen) 형태인, 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제(pro-urokinase plasminogen activator, uPA)의 우수한 활성제이다. 세포의 유출 및 이동을 위한 세포외 기질의 파괴를 초래하는, 플라스미노겐 캐스케이드의 활성화는 Pro-Arg-Phe-Lys(서열번호 80)의 P4-P1 서열에서 프로-우로키나아제 플라스미노겐 활성제의 트립타제 활성화의 작용일 수 있다(Stack 등, Journal of Biological Chemistry 269 (13): 9416-9419 (1994)). 관 투과성의 조절에 관련되어 있는 뉴로펩티드인, 혈관작용성 장 펩티드는, 또한 Thr-Arg-Leu-Ar(서열번호 81) 서열에서 일차적으로, 트립타제에 의하여 분리된다(Tam 등, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 3: 27-32 (1990)). G-단백질과 짝지어진 수용체 PAR-2는 Ser-Lys-Gly-Arg(서열번호 82) 서열에서 트립타제에 의하여 분리되고 활성화되어 섬유아세포 증식을 이끌 수 있으며, 반면에 트롬빈 활성화 수용체 PAR-1은 Pro-Asn-Asp-Lys(서열번호 83) 서열에서 트립타제에 의하여 비활성화된다(Molino 등, Journal of Biological Chemistry 272(7): 4043-4049 (1997)). 취합하면, 이 증거는 질병의 결과로서 조직 리모델링에서의 트립타제의 주요한 역할을 암시한다. 이는 여러 마스트 세포-매개 질환에서 관찰되는 의미있는 변화와 일치한다. 만성 천식 및 다른 장기성 호흡기 질병들의 한 증거는 그의 생리학적 표적의 트립타제 활성화의 결과일 수 있는 하부 조직의 섬유증 및 비대화이다. 유사하게, 일련의 보고서는 다양한 암에서 마스트 세포 밀도, 트립타제 활성 및 나쁜 예후와 관련된 혈관생성(angiogenesis)을 보여준다(Coussens 등, Genes and Development 13(11): 1382-97 (1999)); Takanami 등, Cancer 88(12): 2686-92 (2000); Toth-Jakatics 등, Human Pathology 31(8): 955-960 (2000); Ribatti 등, International Journal of Cancer 85(2): 171-5 (2000)).
특정 프로테아제가 선택된 펩티드 서열을 분리하는지를 평가하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 7-아미노-4-메틸 코우마린(7-amino-4-methyl coumarin)(AMC) 형광성 펩티드 기질의 사용은 프로테아제 특이성을 결정하는 잘 확립된 방법이다(Zimmerman, M. 등 (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51). 아닐리드 결합의 특이적 분리는 형광성 AMC 이탈기를 방출하여 개개의 기질의 분리 속도를 간단히 결정하게 한다. 더욱 최근에, AMC 펩티드 기질 라이브러리의 배열(Lee, D. 등 (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72) 및 위치-스캐닝 라이브러리(Rano, T.A. 등 (1997) Chemistry and Biology 4:149-55)를 사용하여 단일 실험에서 넓은 범위의 기질을 샘플링함으로써 프로테아제의 N-말단 특이성을 빠르게 개괄하였다. 따라서 통상의 기술자는 적당하지 않은 실험을 다시 분류하지 않고서도 펩티드 서열의 배열을 쉽게 평가하여 본 발명에서 그들의 유용성을 결정할 수 있다.
본 발명의 항체-파트너 접합체는 임의로 둘 이상의 링커를 포함할 수 있다. 이 링커들은 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 펩티딜 링커는 약물을 리간드에 연결하는 데에 사용될 수 있고 제2 펩티딜 링커는 진단용 제제를 복합체에 부착할 수 있다. 추가 링커들의 다른 이용은 분석용 제제, 생분자, 표적제제, 및 검출가능한 표지를 항체-파트너 복합체에 연결하는 것을 포함한다.
또한, 예를 들어, 본 발명의 화합물의 이량체, 삼량체, 사량체 및 고도의 동족체, 또는 이의 반응성 유사체와 같은, 종을 포함하는, 다중- 또는 다-가 종인 본 발명의 화합물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 다중- 및 다-가 종은 본 발명의 단일 종 또는 하나 이상의 종으로부터 결집될 수 있다. 예를 들면, 이량체적 구성체는 “동종-이량체적” 또는 “이종 이량체적”일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물 또는 이의 반응성 유사체가 올리고머 또는 폴리머 골격(예, 폴리리신, 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 등)에 부착되는 다중- 및 다-가 구성체는 본 발명의 범위 내에 있다. 골격은 바람직하게 다중기능적이다(즉, 본 발명의 화합물을 부착하기 위한 반응성 자리들의 배열을 가짐). 또한, 본 발명의 단일 종 또는 본 발명의 하나 이상의 종을 갖는 골격이 유도될 수 있다.
또한, 본 발명은, 유사하게 기능화되지 않은 유사 화합물에 비하여 향상된 수용성을 갖는 화합물을 제공하도록 기능화된 화합물을 포함한다. 따라서, 본 명세서에 설명된 임의의 치환기는 향상된 수용성을 갖는 유사 라디칼로 대체될 수 있다. 예를 들어, 하이드록실기를 디올로 대체하는 것, 또는 아민을 4급 아민, 하이드록시 아민 또는 유사한 보다 수용성인 부분으로 대체하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 바람직한 구체예에서, 부모 화합물의 수용성을 향상시킨 부분으로 본 명세서에 설명된 화합물의 이온 채널을 향하여 활성에 본질적이지 않은 자리에서의 치환에 의하여, 추가적인 수용성이 부여된다. 유기 화합물의 수용성을 향상시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기 방법은, 예를 들어 4급 암모늄과 같은 영구히 하전된 부분을 가지는 유기 핵, 또는 예를 들어 카르복실산, 아민과 같은 생리학적으로 관련된 pH에서 하전된 기를 기능화하는 것을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 방법은 유기 핵 하이드록실- 또는 아민-함유기, 예를 들어, 알코올, 폴리올, 폴리에테르, 등에 부가하는 것을 포함한다. 대표적인 예는 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 폴리(에틸렌글리콜) 및 폴리(프로필렌글리콜)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 화합물을 위한 적절한 기능화 화학법 및 전략은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Dunn, R.L. 등, Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991을 참조.
하이드라진 링커 (H)
두 번째 구체예에서, 본 발명의 접합체는 하이드라진 자기-희생 링커를 포함하는데, 상기 접합체는 다음의 구성을 가진다:
Figure 112009042033207-PCT00013
여기에서, D, L1, L4, 및 X4는 상기에서 정의된 바와 같고 본 명세서에서 더 기술되며, H는 다음의 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009042033207-PCT00014
여기에서 n1은 1 - 10의 정수이고; n2는 0, 1, 또는 2이고; 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이고; I는 결합(즉, 골격의 탄소와 인접한 질소 사이의 결합) 또는 다음의 구조이다:
Figure 112009042033207-PCT00015
여기에서 n3은 0 또는 1이며, 단 n3이 0일 때, n2 는 0이 아니고; n4는 1, 2, 또는 3이며, 여기에서 I가 결합일 때, n1은 3이고 n2는 1이며, D는 다음의 구조가 될 수 없다:
Figure 112009042033207-PCT00016
여기에서 R은 Me 또는 CH2- CH2-NMe2이다.
한 구체예에서, 페닐 고리 상에서의 치환은 파라 치환이다. 바람직한 구체예에서, n1은 2, 3, 또는 4이거나 또는 n1은 3이다. 바람직한 구체예에서, n2는 1이다. 바람직한 구체예에서, I는 결합(즉, 골격의 탄소와 인접한 질소 사이의 결합)이다. 한 관점에서, 하이드라진 링커, H는 분리시, 예를 들면, n3이 0이고 n4가 2일때, 6-멤버 자기 희생 링커를 형성할 수 있다. 다른 관점에서, 하이드라진 링커, H는 분리시 2개의 5-멤버 자기 희생 링커를 형성할 수 있다. 또 다른 관점에서, 분리시, H는 5멤버 자기 희생 링커를 형성하거나, H는 7-멤버 자기 희생 링커를 형성하거나, 또는 H는 5-멤버 자기 희생 링커 및 6-멤버 자기 희생 링커를 형성한다. 분리의 속도는 분리시 형성되는 고리의 크기에 의해 영향을 받는다. 따라서, 원하는 분리 속도에 따라, 분리시 형성될 적절한 크기의 고리를 선택할 수 있다.
5 멤버 하이드라진 링커
한 구체예에서, 하이드라진 링커는 5-멤버 하이드라진 링커를 포함하는데, 여기에서 H는 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00017
한 바람직한 구체예에서, n1은 2, 3, 또는 4이다. 다른 바람직한 구체예에서, n1은 3이다.
상기 구조에서, 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이다. 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1 - C6 알킬이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1 - C3 알킬, 더욱 바람직하게는 H 또는 CH3이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 R24는 메틸기이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 H이다. 각 R24는 화합물 입체 효과를 맞추고 용해성을 변경하기 위해서 선택된다.
5-멤버 하이드라진 링커는 약물을 링커로부터 분리하는 하나 이상의 고리화 반응으로 처리될 수 있으며, 예를 들어, 다음에 의하여 기술될 수 있다:
Figure 112009042033207-PCT00018
본 발명의 5 멤버 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 다음과 같다:
Figure 112009042033207-PCT00019
Cbz-보호 DMDA b는 염화 티오닐을 갖는 용액에서 2,2-디메틸-말론산 a와 반응하여 Cbz-DMDA-2,2-디메틸말론산 c를 형성한다. 화합물 c는 EDC의 존재 하에서 Boc-N-메틸 하이드라진 d와 반응하여 DMDA-2,2-디메틸말로닉-Boc-N-메틸하이드라진 e를 형성한다.
6 멤버 하이드라진 링커
다른 구체예에서, 하이드라진 링커는 6-멤버 하이드라진 링커를 포함하는데, 여기에서 H는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00020
한 바람직한 구체예에서, n1은 3이다. 상기 구조에서, 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이다. 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 C1 - C6 알킬이다. 다른 구체예에서, 각각의 R24는 독립적으로 H 또는 C1 - C3 알킬, 더욱 바람직하게는 H 또는 CH3이다. 다른 구체예에서, 적어도 하나의 R24는 메틸기이다. 다른 구체예에서, 각 R24는 H이다. 각 R24는 화합물의 입체 효과를 맞추고 용해성을 변경하기 위해서 선택된다. 한 바람직한 구체예에서, H는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00021
한 구체예에서, H는 제미널 디메틸 치환을 포함한다. 상기 구조의 한 구체예에서, 각 R24는 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 알킬이다.
6-멤버 하이드라진 링커는 링커로부터 약물을 분리하는 고리화 반응으로 처리될 수 있으며, 다음과 같이 설명된다:
Figure 112009042033207-PCT00022
본 발명의 6 멤버 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 디음과 같다:
Figure 112009042033207-PCT00023
디클로로메탄을 갖는 용액의 Cbz-보호 디메틸알라닌 a는 HOAt 및 CPI와 반응하여 Cbz-보호 디메틸알라닌 하이드라진 b를 형성한다. 하이드라진 b는 메탄올의 작용에 의하여 탈보호되어 화합물 c를 형성한다.
다른 하이드라진 링커
본 발명은 7개의 멤버를 갖는 링커를 포함하는 것으로 고려된다. 이 링커는 5 또는 6 멤버 링커와 같이 빠르게 고리화하지 않을 것 같지만, 이것은 어떤 항체-파트너 접합체에 바람직할 수 있다. 유사하게, 상기 하이드라진 링커는 2개의 6 멤버 고리, 또는 하나의 6 및 하나의 5 멤버 고리화 생성물을 갖는 하나의 하이드라진 링커를 포함할 수 있다. 6 및 7 멤버 링커 뿐만 아니라 5 및 7 멤버 링커도 또한 고려된다.
다른 하이드라진 구조, H는 다음 식을 가진다:
Figure 112009042033207-PCT00024
여기에서, q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; 및
각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이다. 이 하이드라진 구조는 또한 5-, 6-, 또는 7-멤버 고리를 형성할 수 있으며, 부가 성분을 더하여 다중 고리를 형성할 수 있다.
디설파이드 링커 (J)
또 다른 구체예에서, 링커는 효소적으로 분리가능한 디설파이드기를 포함한다. 한 구체예에서, 본 발명은 식 (d)를 따르는 구조를 갖는 세포독성 항체-파트너 화합물을 제공한다:
Figure 112009042033207-PCT00025
여기에서 D, L1, L4, 및 X4는 상기에서 정의되어 있고 본 명세서에 더 설명되어 있으며, J는 다음 구조를 가지는 기를 포함하는 디설파이드 링커이다:
Figure 112009042033207-PCT00026
여기에서, 각 R24는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 및 비치환 헤테로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이고; 각 K는 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR21R22, NR21COR22, OCONR21R22, OCOR21, 및 OR21로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 멤버이며, 여기에서, R21 및 R22는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬 및 비치환 헤테로사이클로알킬로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되고; i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이고; d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 정수이다.
디설파이드 링커의 방향족 고리는 하나 이상의 “K”기로 치환될 수 있다. “K”기는, 고리 구조의 일부인 4개의 비치환 탄소 중 하나에 부착된 수소를 대체하는 방향족 고리 상의 치환기다. “K”기는 할로겐과 같은 단일 원자일 수 있고, 또는 알킬, 헤테로알킬, 아미노, 니트로, 하이드록시, 알콕시, 할로알킬, 및 시아노와 같은 다-원자기일 수 있다. 예시적인 K 치환기는 독립적으로 F, Cl, Br, I, NO2, OH, OCH3, NHCOCH3, N(CH3)2, NHCOCF3 및 메틸을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. “Ki”에서 i는 0, 1, 2, 3, 또는 4의 정수이다. 한 특정 구체예에서, i는 0이다.
바람직한 구체예에서, 링커는 하기 식의 효소적으로 분리가능한 디설파이드기를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00027
이 구체예에서, L4, X4, p, 및 R24의 아이덴티티들(identities)은 상기에 서술된 바와 같고, d는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 특정 구체예에서, d는 1 또는 2이다.
더욱 특정한 디설파이드 링커는 하기 식에서 보인다:
Figure 112009042033207-PCT00028
이 구체예의 특정한 예는 하기와 같다:
Figure 112009042033207-PCT00029
.
바람직하게, d는 1 또는 2이다.
다른 디설파이드 링커는 하기 식에서 보인다:
Figure 112009042033207-PCT00030
이 구체예의 특정한 예는 하기와 같다:
Figure 112009042033207-PCT00031
.
바람직하게, d는 1 또는 2이다.
다양한 구체예에서, 디설파이드는 아민에 대하여 오르토(ortho)에 있다. 다른 특정 구체예에서, a는 0이다. 바람직한 구체예에서, R24는 H 및 CH3로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 디설파이드 링커를 제조하기 위한 예시적인 합성 경로는 하기와 같다:
Figure 112009042033207-PCT00032
3-메르캅토프로피온산 a의 용액을 알드리티올-2와 반응시켜 3-메틸 벤조티아졸리움 아이오다이드 b를 형성한다. 3-메틸 벤조티아졸리움 아이오다이드 c를 수산화나트륨과 반응시켜 화합물 d를 형성한다. 메탄올과 함께 화합물 d의 용액을 화합물 b와 더 반응시켜 화합물 e를 형성한다. 화합물 e를 염화아세틸 및 메탄올의 작용에 의하여 탈보호하여 화합물 f를 형성한다.
세포독소, 링커 및 항체에 치료적 제제를 접합하기 위한 다른 방법에 대한 더 많은 검토는, 또한, Gangwar 등의 PCT 공개번호 제WO 2007/059404호, 및 Saito, G. 등 (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215의 “Cytotoxic Compounds And Conjugates”; Trail, P.A. 등 (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. 및 Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. 및 Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조, 이들 각각은 그 전체가 참조문헌으로서 본 명세서에서 통합되어 있다.
파트너 분자(Partner Molecules)
본 발명은 세포독소, 약물(예, 면역억제제) 또는 방사능독소와 같은, 파트너 분자에 접합하는 항체를 특징으로 한다. 또한 상기 접합체는 본 명세서에서 “면역접합체”로도 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 “면역독소”로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성 제제는 세포에 해로운(예, 살해) 임의의 제제를 포함한다.
본 발명의 파트너 분자의 예는 택솔, 사이토칼라신 B(cytochalasin B), 그라미시딘 D(gramicidin D), 에티듐 브로마이드(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안트라신 디오네(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신 D(actinomycin D), 1-디하이드로테스토스테론(1-dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로프라노롤(propranolol), 및 퓨로마이신(puromycin) 및 이들의 유사체 또는 동족체를 포함한다. 또한, 파트너 분자의 예는, 예를 들어, 항대사물질(예, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카르바진(5-fluorouracil decarbazine)), 알킬화 제제(예, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine) (BSNU) 및 로무스틴(lomustine) (CCNU), 사이클로토스프아미드(cyclothosphamide), 부술판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신C(mitomycin C), 및 cis-디클로로디아민 플라티늄 (II)(cis-dichlorodiamine platinum, DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안트라사이클린(anthracyclines)(예, 다우노루비신(daunorubicin)(이전에는 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(예, 닥티노마이신(dactinomycin)(이전에는 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 및 안트라마이신(anthramycin, AMC)), 및 항-유사분열 제제(예, 빈크리스틴(vincristine) 및 빈블라스틴(vinblastine))을 포함한다.
본 발명의 항체에 접합할 수 있는 파트너 분자의 다른 바람직한 예는 듀오카르마이신(duocarmycins), 칼리체아미신(calicheamicins), 메이탄신(maytansines) 및 아우리스타틴(auristatins), 및 이들의 유도체를 포함한다. 칼리체아미신 항체 접합체의 예는 상업적으로 입수가능하다(Mylotarg®; American Home Products).
파트너 분자의 바람직한 예는 CC-1065 및 상기 듀오카르마이신이다. CC-1065는 Upjohn사에 의해 1981년에 스트렙토마이세스 젤렌시스(Streptomyces zelensis)로부터 처음 분리되었고(Hanka 등, J. Antibiot. 31: 1211 (1978); Martin 등, J. Antibiot. 33: 902 (1980); Martin 등, J. Antibiot. 34: 1119 (1981)), 시험관 내에서 그리고 실험용 동물에서도 우수한 항종양 및 항균 활성을 가지고 있는 것이 발견되었다(Li 등, Cancer Res. 42: 999 (1982)). CC-1065는 5'-d(A/GNTTA)-3' 및 5'-d(AAAAA)-3'의 서열 선택과 함께 마이너 그루브(minor groove) 내에서 이중-가닥 B-DNA에 결합하고(Swenson 등, Cancer Res. 42: 2821 (1982)), 분자에 존재하는 그의 CPI 좌-수 유닛(left-hand unit)에 의하여 3'-아데닌의 N3 위치를 알킬화한다(Hurley 등, Science 226: 843 (1984)). 강력하고 광범위한 항종양 활성에도 불구하고, CC-1065는 실험용 동물에서 죽음을 지연시키기 때문에 인간에 이용될 수 없다.
CC-1065 및 듀오카르마이신의 많은 유사체 및 유도체는 당해 분야에서 공지되어 있다. 많은 화합물의 구조, 합성 및 특성에 대한 연구가 검토되었다. 예를 들어, Boger 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); 및 Boger 등, Chem. Rev. 97: 787 (1997) 참조.
Kyowa Hakko Kogya 사에서의 하나의 기(group)는 많은 CC-1065 유도체를 제조하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,101,038호; 제5,641,780호; 제5,187,186호; 제5,070,092호; 제5,703,080호; 제5,070,092호; 제5,641,780호; 제5,101,038호; 및 제5,084,468호; 공개된 PCT 출원번호 제WO 96/10405호 및 공개된 유럽 특허출원 번호 제0 537 575 A1호를 참조.
또한 Upjohn 사(Pharmacia Upjohn)가 CC-1065의 유도체를 제조하는데 활발하다. 예를 들어, 미국 특허번호 제5,739,350호, 제4,978,757호, 제5,332, 837호 및 제4,912,227호를 참조.
본 발명의 특히 바람직한 관점은 하기 식 (e)에 따른 구조를 갖는 세포독성 화합물을 제공한다:
Figure 112009042033207-PCT00033
여기에서, 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택되는 멤버이다. 예시적인 고리계는 페닐 및 피롤을 포함한다.
기호 E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일결합으로부터 독립적으로 선택되거나, E 및 G는 임의로 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성한다.
기호 X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버를 나타낸다. R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬로, 및 아실로부터 선택된 멤버이다.
기호 R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로부터 선택된 멤버를 나타내는데, 여기에서 R11은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 또는 SiR12R13R14이다. 기호 R12, R13, 및 R14는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴을 나타내며, 여기에서, R12 및 R13은 이들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖고 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. 하나 이상의 R12, R13, 또는 R14는 그의 구조 안에 분리가능한 기를 포함할 수 있다.
R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 독립적으로 선택되는 멤버들인데, 여기에서 n은 1부터 20까지의 정수이며, 또는 R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 이웃한 쌍은, 그들이 부착된 탄소 원자와 함께, 결합되어 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4부터 6까지의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. 하나의 예시적인 구조는 아닐린이다.
R4, R4’, R5, R5 ’ , R11, R12, R13, R15 및 R16은 분리가능한 링커 또는 분리가능한 기질과 같이, 그들의 구조 안에 하나 이상의 분리가능한 기를 임의로 포함한다. 예시적인 분리가능한 기는 펩티드, 아미노산, 하이드라진, 디설파이드, 및 세팔로스포린 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
어떤 구체예에서, R4, R4 ’ , R5, R5 ’ , R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 약물을 본 발명의 링커 또는 효소 분리가능한 기질에, 예를 들어 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에, 또는 J에 결합하는데 사용된다.
또 다른 예시적인 구체예에서, R4, R4 ’ , R5, R5 ’ , R11, R12, R13, R15 및 R16 중 적어도 하나는 화합물을 접합하기에 적절한 반응기를 가진다. 다른 예시적인 구체예에서, R4, R4 ’ , R5, R5 ’ , R11, R12, R13, R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 알킬 및 치환 헤테로알킬로부터 선택되며, 알킬 또는 헤테로알킬 부분의 자유말단에 반응성 기능기를 가진다. R4, R4 ’, R5, R5 ’, R11, R12, R13, R15 및 R16 중 하나 이상은 다른 종, 예를 들어, 표적 제제, 검출가능한 표지, 고형 지지체, 등등에 접합될 수 있다.
R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이다. R6이 존재하면, R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성한다. R7은 CH2-X1 또는 -CH2-이다. R7이 CH2-이면, 그것은 사이클로프로판 고리의 성분이다. 기호 X1은 할로겐, 예를 들어 Cl, Br 또는 F와 같은 이탈기를 나타낸다. R6 및 R7의 조합은 화학 원자가의 규칙을 어기지 않는 방식으로 해석된다.
X1은 임의의 이탈기일 수 있다. 유용한 이탈기는 할로겐, 아지드, 설포닉 에스테르(예, 알킬설포닐, 아릴설포닐), 옥소늄 이온, 알킬 퍼클로레이트, 암모니오알칸설포네이트 에스테르, 알킬플루오로설포네이트 및 플루오르화 화합물(예, 트리플레이트, 노나플레이트, 트레실레이트) 및 기타 유사한 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이탈기로서 유용한 특정 할로겐은 F, Cl 및 Br이다. 이들 및 특정의 반응 조건에 적절한 다른 이탈기를 선택하는 것은 당해 분야의 숙련자의 능력 범위안에 있다(예를 들어, March J, Advanced Organic Chemistry, 제2판, John Wiley and Sons, 1992; Sandler SR, Karo W, Organic Functional Group Preparations, 제2판, Academic Press, Inc., 1983; 및 Wade LG, Compendium of Organic Synthetic Methods, John Wiley and Sons, 1980).
6-멤버 고리 내의 곡선은 고리가 하나 이상의 불포화도를 가질 수 있으며, 방향족일 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 하기에 설명된 것들과 같은 고리 구조 및 관련 구조는 식 (f)의 범위 내에 있다:
Figure 112009042033207-PCT00034
.
어떤 구체예에서, R4, R4’, R5, 및 R5’ 중 적어도 하나는 상기 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 결합시키고, 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00035
여기에서 v는 1부터 6까지의 정수이고; 각 R27, R27’, R28, 및 R28’은, H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택된다. 어떤 구체예에서, R27, R27’, R28, 및 R28’는 모두 H이다. 어떤 구체예에서, v는 1부터 3까지의 정수이다(바람직하게는, 1). 이 유닛은 약물로부터 아릴 치환기를 분리하는데 사용될 수 있으며, 그렇게하여 다중-약물 저항에 대한 기질인 화합물을 생성하는 것을 저지하거나 피한다.
한 구체예에서, R11은 자기-고리화하지 않으며 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결하는 부분, X5를 포함한다. 부분, X5는, 바람직하게 효소를 사용하여 분리가능하며, 분리될 때, 활성 약물을 제공한다. 예로써, R11은 하기 구조(약물의 잔여 부분에 결합하는 우측를 가짐)를 가질 수 있다:
Figure 112009042033207-PCT00036
예시적 구체예에서, 식 (e)의 고리계 A는 치환 또는 비치환 페닐 고리이다. 고리계 A는 본 명세서에 정의 부분에서 설명된 바와 같은 하나 이상의 아릴기 치환기로 치환될 수 있다. 어떤 구체예에서, 페닐 고리는 CN 또는 메톡시 부분으로 치환된다.
어떤 구체예에서, R4, R4’, R5, 및 R5’ 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결하며, R3는 SR11, NHR11 및 OR11로부터 선택된다. R11는 -SO(OH)2, -PO(OH)2, -AAn, -Si(CH3)2C(CH3)3, -C(O)OPhNH(AA)m,
Figure 112009042033207-PCT00037
,
Figure 112009042033207-PCT00038
,
Figure 112009042033207-PCT00039
,
Figure 112009042033207-PCT00040
,
Figure 112009042033207-PCT00041
,
Figure 112009042033207-PCT00042
또는 임의의 다른 당류 또는 당류의 조합,
Figure 112009042033207-PCT00043
Figure 112009042033207-PCT00044
Figure 112009042033207-PCT00045
및 이의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 10의 범위 내에 있는 정수이고, m은 1 내지 4의 범위 내에 있는 임의의 정수이며, p는 1 내지 6의 범위 내에 있는 임의의 정수이고, AA는 천연 또는 비-천연 아미노산이다. 어떤 구체예에서, AAn 또는 AAm은 펩티드 링커 (F)에 대하여 상기에 설명된 동일한 아미노산 서열로부터 선택되고, R4, R4’, R5, 또는 R5’의 링커 부분에 사용되는 아미노산 서열과 임의로 동일하다. 적어도 어떤 구체예에서, R3은 생체 내에서 분리가능하여 활성 약물 화합물을 제공한다. 적어도 어떤 구체예에서, R3은 화합물의 생체 내 용해성을 증가시킨다. 어떤 구체예에서, 활성 약물을 제공하기 위하여 혈액에서 활성 약물의 농도의 감소 속도가 R3의 분리 속도보다 실질적으로 빠르다. 이것은 활성 약물의 독성이 전구약물 형태의 것보다 실질적으로 높은 곳에서 특히 유용하다. 다른 구체예에서, 혈액에서, 활성 약물을 제공하기 위한 R3의 분리 속도는 활성 약물의 농도의 감소 속도보다 빠르다.
다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식 (g)에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112009042033207-PCT00046
.
이 구체예에서, 치환기 R3, R4, R4 ’, R5, R5 ’, R6, R7 및 X의 아이덴티티들(identities)은 실질적으로 식 (a)에서 상술한 바와 같으며, 뿐만 아니라 특정 구체예에서도 같다. 기호 Z는 O, S 및 NR23으로부터 독립적으로 선택된 멤버이다. 기호 R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버를 나타낸다. 각 R23은 독립적으로 선택된다. 기호 R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8 또는 CO2R8을 나타낸다. R8는 치환 알킬, 비치환 알킬, NR9R10, NR9NHR10 및 OR9로부터 선택된 멤버이다. R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택된다. R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬이다. R2가 치환 알킬일 때, 그것은 퍼플루오로알킬, 예를 들어, CF3이외의 것이 일반적으로 바람직하다. 한 구체예에서, R2는 치환 알킬인테, 여기에서 치환기는 할로겐이 아니다. 다른 구체예에서, R2는 비치환 알킬이다.
어떤 구체예에서, R1은 CO2CH3와 같은, 에스테르 부분이다. 어떤 구체예에서, R2는 저급 알킬기인데, 치환되거나 비치환될 수 있다. 현재 바람직한 저급 알킬기는 CH3이다. 어떤 바람직한 구체예에서, R1은 CO2CH3이고 R2는 CH3이다.
어떤 구체예에서, R4, R4’, R5, 및 R5’는 H, 할로겐, NH2, OMe, O(CH2)2N(R29)2 및 NO2로부터 독립적으로 선택된 멤버들이다. 각 R29는 독립적으로 H 또는 저급 알킬(예, 메틸)이다.
어떤 구체예에서, 이탈기 X1이 할로겐, 일킬설포닐, 아릴설포닐, 및 아지드로 이루어진 군에서 선택되는 멤버이도록 약물을 선택한다. 어떤 구체예에서, X1는 F, Cl, 또는 Br이다.
어떤 구체예에서, Z는 O 또는 NH이다. 어떤 구체예에서, X는 O이다.
또 다른 예시적 구체예에서, 본 발명은 식 (h) 또는 (i)에 따른 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
Figure 112009042033207-PCT00047
식 (e)의 듀오카르마이신 유사체의 다른 바람직한 구조는 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리인 구조이다. 고리계 A가 피롤일 때의 식 7의 구조에 대해 상술된 약물 분자 상의 바람직한 치환기는 또한 고리계 A가 비치환 또는 치환 페닐 고리일 때의 바람직한 치환기이다.
예를 들면, 바람직한 구체예에서, 약물 (D)는 구조 (j)를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00048
이 구조에서, R3, R6, R7, X는 식 (e)에 대하여 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8는 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R1’는 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2’는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
R4, R4’, R5, R5’, R11, R12, R13, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다.
약물 (D)의 다른 구체예는 구조 (k)를 포함하는데, 여기에서 R4 및 R4’는 결합되어 헤테로사이클로알킬을 형성한다:
Figure 112009042033207-PCT00049
이 구조에서, R3, R5, R5 ’, R6, R7, X는 식 (e)에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R32는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R32는, 분리가능한 링커 또는 분리가능한 기질과 같이, 그의 구조 안에 하나 이상의 분리가능한 기를 임의로 포함한다. 예시적인 분리가능한 기는 펩티드, 아미노산, 하이드라진, 디설파이드, 및 세팔로스포린 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, R4, R4’, R5, R5’, R15, 및 R16에 대하여 본 명세서에 서술된 치환기의 임의의 선택은 R32에도 적용가능하다.
R5, R5’, R11, R12, R13, R15, R16, 또는 R32의 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다. 적어도 어떤 구체예에서, R32는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 결합한다.
이 화합물의 바람직한 구체예는 하기 구조를 가진다:
Figure 112009042033207-PCT00050
R1은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, C(O)R8, 또는 CO2R8이고, 여기에서 R8는 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이고, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이며;
R1’은 H, 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 C(O)R8이고, 여기에서, R8은 NR9R10 및 OR9로부터 선택된 멤버이며, 여기에서 R9 및 R10은 H, 치환 또는 비치환 알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로알킬로부터 독립적으로 선택되는 멤버이고;
R2는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬, 또는 시아노, 또는 알콕시이고; R2’는 H, 또는 치환 또는 비치환 저급 알킬, 또는 비치환 헤테로알킬이다.
다른 구체예는 다음 식을 가진다:
Figure 112009042033207-PCT00051
이 구조에서, A, R6, R7, X, R4, R4’, R5, 및 R5’는 식 (e)에 대해 상술된 바와 같다. 더욱이, Z는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고, 여기에서, R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며;
R33은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로부터 선택되는데, 여기에서 n은 1 내지 20의 정수이다. R15 및 R16은 독립적으로 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 및 치환 또는 비치환 펩티딜을 나타내는데, 여기에서 R15 및 R16은 그들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6의 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성한다. R33은 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F, H, J, 또는 X2에 연결한다.
바람직하게, A는 치환 또는 비치환 페닐, 또는 치환 또는 비치환 피롤이다. 또한, R11에 대하여 본 명세서에 서술된 치환기의 임의의 선택은 R33에도 적용가능하다.
리간드
X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 이루어진 군에서 선택된 리간드를 나타낸다. 바람직한 리간드는 항체 및 이의 단편과 같은, 표적화 제제이다.
어떤 구체예에서, X4군은 R29, COOR29, C(O)NR29, 및 C(O)NNR29로부터 선택되는 멤버로 기술될 수 있으며, 여기에서 R29는 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 헤테로아릴로부터 선택된 멤버이다. 또 다른 예시적인 구체예에서, R29는 티올 반응성 멤버이다. 더 예시적인 구체예에서, R29는 할로아세틸 및 알킬 할라이드 유도체, 말레이미드, 아지리딘, 및 아크릴로일 유도체로부터 선택된 티올 반응성 멤버이다. 상기 티올 반응성 멤버는, 예를 들어, 항체와 같은 표적화 제제의 아미노산의 측쇄와 반응하여 표적화 제제를 링커-약물 부분에 결합시킬 수 있는 반응성 보호기로서 작용할 수 있다.
검출가능한 표지( Detectable Labels)
본 발명의 화합물 및 방법과 연관되어 사용된 특정 표지 또는 검출가능한 기는 일반적으로 그것이 본 발명의 화합물의 활성 또는 유용성에 유의하게 간섭하지 않는 한, 본 발명의 중요한 관점이 아니다. 검출가능한 기는 검출가능한 물리적 또는 화학적 특성을 갖는 임의의 물질일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 면역분석 분야에서 잘 발달되어 왔으며, 일반적으로, 상기 방법에 유용한 임의의 표지는 본 발명에 적용될 수 있다. 따라서, 표지는 분광기의, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다. 본 발명에 유용한 표지는 자성 구슬(예, DYNABEADS™), 형광 색소(예, 형광물질 이소티오시아네이트, 텍사스 레드(Texas red), 로다민, 등), 방사능표지(예, 3H, 125I, 35S, 14C, 또는 32P), 효소(예, 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타제, 및 ELISA에 일반적으로 사용되는 다른 것들), 및 콜로이드성 금 또는 착색된 유리 또는 플라스틱 구슬(예, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스, 등)과 같은 비색 표지를 포함한다.
당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 표지를 본 발명의 화합물에 직접적으로 또는 간접적으로 결합시킬 수 있다. 상술한 바와 같이, 요구되는 민감도, 화합물과의 접합의 용이성, 안정성 요구, 사용가능한 설비 및 처리 규정에 따라 표지를 선택함으로써 매우 다양한 표지를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물이 검출가능한 표지에 접합될 때, 상기 표지는 바람직하게는 방사성 동위원소, 형광성 제제, 형광성 제제 전구체, 발색단(chromophores), 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 멤버이다. 항체에 여러 기들을 접합시키는 방법은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체에 빈번히 접합되는 검출가능한 표지는 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제와 같은 효소이다.
비-방사성 표지는 흔히 간접적인 수단에 의해서 부착된다. 일반적으로, 리간드 분자(예, 비오틴)는 접합체의 성분에 공유적으로 결합된다. 다음에 상기 리간드는 고유하게 검출가능하거나, 검출가능한 효소, 형광성 화합물, 또는 화학발광성 화합물과 같은, 신호 시스템에 공유적으로 결합되는 다른 분자(예, 스트렙타비딘)에 결합된다.
또한 본 발명의 접합체의 성분은, 예를 들면, 효소 또는 형광단과의 접합에 의하여, 신호 생성 화합물에 직접적으로 접합될 수 있다. 표지로서 관심의 효소는 우선적으로 하이드롤라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글리코시다제, 또는 옥시도타제, 특히 퍼옥시다제일 것이다. 형광성 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 등등을 포함한다. 화학발광성 화합물은 루시페린, 및 2,3-디하이드로프탈라진디온, 예를 들어, 루미놀을 포함한다. 사용될 수 있는 여러 표지화 또는 신호 생성 시스템의 검토를 위하여, 미국 특허번호 제4,391,904호를 참조.
표지를 검출하는 수단은 통상의 기술자에 잘 알려져 있다. 따라서, 예를 들면, 표지가 방사성 표지일 때, 검출 수단은 자가방사기록법(autoradiography)에서와 같은 신틸레이션 계수기 또는 사진 필름을 포함한다. 표지가 형광성 표지일 때, 적절한 파장의 빛을 갖는 형광색소를 여기시키고(exciting) 그 결과의 형광을 검출함으로써 표지를 검출할 수 있다. 필름 수단에 의하여, 전하결합소자(charge coupled devices, CCDs) 또는 광증폭기 등과 같은 전자 검출기를 사용함으로써, 상기 형광을 육안으로 검출할 수 있다. 유사하게, 효소에 적절한 기질을 제공하고 그 결과의 반응 생성물을 검출함으로써, 효소 표지를 검출할 수 있다. 마지막으로, 단순한 비색 표지는 표지와 관련된 색깔을 관찰함으로써 간단히 검출할 수 있다. 따라서, 여러 딥스틱(dipstick) 분석법에서, 접합된 금은 흔히 분홍색으로 나타나고, 반면에 다양한 접합된 구슬은 구슬의 색으로 나타낸다.
형광성 표지는 취급시 주의를 거의 요구하지 않는다는 장점을 가지며, 고-처리량 가시화 기술(컴퓨터를 포함하는 통합된 시스템에서 분석용 이미지의 디지털화를 포함하는 광학적 분석)에 사용할 수 있어서 현재 바람직하다. 바람직한 표지는 하기 중 하나 이상에 의하여 전형적으로 특징지어질 수 있다: 표지화하는데 있어서 높은 감응성, 높은 안정성, 낮은 백그라운드(background), 낮은 환경 감응성 및 높은 특이성. 많은 형광성 표지는 SIGMA chemical company(Saint Louis, MO), Molecular Probes(Eugene, OR), R&D systems(Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc.(Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company(Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc.(Gaithersburg, MD), Fluka Chemica- Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), 및 Applied Biosystems(Foster City, CA), 뿐만 아니라 통상의 기술자에게 공지된 많은 다른 상업적 소스(sources)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 더욱이, 통상의 기술자들은 특정 용도에 적절한 형광단을 선택하는 방법을 알 것이며, 상업적으로 용이하게 입수할 수 없다면, 필요한 형광단을 새로 합성하거나 상업적으로 입수할 수 있는 형광성 화합물을 합성적으로 변형하여 원하는 형광성 표지에 도달할 수 있을 것이다.
작은 분자 형광단에 덧붙여, 자연적으로 발생하는 형광성 단백질 및 상기 단백질의 조작된 유사체가 본 발명에서 유용하다. 상기 단백질은, 예를 들어, 자포동물의 녹색 형광성 단백질(Ward 등, Photochem. Photobiol. 35:803-808 (1982); Levine 등, Comp. Biochem. Physiol., 72B:77-85 (1982)), 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 균주로부터의 황색 형광성 단백질(Baldwin 등, Biochemistry 29:5509-15 (1990)), 와편모충 심비오디니움(dinoflagellate Symbiodinium) sp 종으로부터의 페리디닌-클로로필(Peridinin-chlorophyll)(Morris 등, Plant Molecular Biology 24:673:77 (1994)), 시네코코커스(Synechococcus), 예를 들면, 피코에리트린(phycoerythrin) 및 피코시아닌(phycocyanin)과 같은 해양 시아노박테리아로부터의 피코빌리단백질(phycobiliproteins)(Wilbanks 등, J. Biol. Chem. 268:1226-35 (1993)), 등을 포함한다.
일반적으로, 세포독소와 표적화 제제(또는 다른 시약), 및 선택적으로는 스페이서기의 사이에 결합을 형성하기 전에, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 통상의 기술자는 하이드록시, 아미노, 및 카르복시기를 포함한, 다양한 화학적 기능성기가 다양한 표준 방법 및 조건을 사용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 세포독소 또는 표적화 제제의 하이드록실기를 포스겐 처리를 통해 활성화시켜 해당 클로로포르메이트, 또는 p-니트로페닐클로로포르메이트를 형성하고 해당 카르보네이트를 형성할 수 있다.
한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 카르복실 기능성기를 포함하는 표적화 제제를 이용한다. 예를 들면, 카르복실기를 해당 아실 할라이드 또는 활성 에스테르로의 전환에 의하여 활성화시킬 수 있다. 이 반응을 상기 March, pp. 388-89에 기술된 바와 같이 다양한 조건 하에서 실시할 수 있다. 한 예시적인 구체예에서, 아실 할라이드를 카르복실-함유기와 옥살일 클로라이드의 반응을 통하여 제조한다. 활성화된 제제를 세포독소 또는 세포독소-링커 가지 조합과 반응시켜 본 발명의 접합체를 형성한다. 카르복실-함유 표적화 제제의 사용은 단순히 예시적이고, 많은 다른 기능성 기들을 갖는 제제를 본 발명의 링커에 접합할 수 있다는 것을 통상의 기술자는 알 것이다.
반응성 기능기
기술되는 바를 명확히 하기 위하여, 계속되는 논의는 표적화 제제에 세포독소를 접합시키는 것에 초점을 맞춘다. 이 초점은 본 발명의 한 구체예를 예시하고, 이로부터 다른 것들은 통상의 기술자에 의해서 쉽게 추론될 수 있다. 한 구체예의 논의에 초점을 맞춘 것으로 본 발명이 한정되지 않는다.
본 발명의 예시적 화합물은 치환 또는 비치환 알킬 또는 헤테로알킬 사슬에 일반적으로 위치하며, 다른 종에 그것들의 용이한 부착을 허용하는, 반응성 기능기를 포함한다. 상기 반응성기의 편리한 위치는 사슬의 말단 위치이다.
본 발명을 실시하는 데 유용한 반응들의 반응성기 및 반응부류는 일반적으로 생접합 화학의 분야에 잘 알려진 것들이다. 반응성 기능기를 보호하거나 보호하지 않을 수 있으며, 상기 기의 보호된 성질을 유기 합성의 분야에 공지된 방법에 의해 변하게 할 수 있다. 반응성 세포독소 유사체에 유용한 반응들의 바람직한 부류는 비교적 온화한 조건 하에서 진행하는 것들이다. 이것들은 친핵성 치환(nucleophilic substitutions)(예, 아실 할라이드, 활성 에스테르를 갖는 아민 및 알코올의 반응), 친전자성 치환(예, 엔아민 반응) 및 탄소-탄소 및 탄소-헤테로원자 다중 결합에 첨가(예, 마이클 반응(Michael reaction), 디엘스-알더 첨가(Diels-Alder addition))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 유용한 반응들은 예를 들어, March, Advanced Organic Chemistry, 제3판, John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; 및 Feeney 등, Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982에서 논의된다.
예시적인 반응 유형은 N-하이드록시숙신이미드 에스테르, N-하이드록시벤즈트리아졸 에스테르, 산 할라이드, 아실 이미다졸, 티오에스테르, p-니트로페닐 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐 및 방향족 에스테르를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 카르복실기 및 이의 다양한 유도체들의 반응을 포함한다. 하이드록실기는 에스테르, 에테르, 알데히드, 등등으로 전환될 수 있다. 할로알킬기는, 예를 들면, 아민, 카르복실레이트 음이온, 티올 음이온, 카르바니온 또는 알콕시드 이온과의 반응에 의하여 새로운 종으로 전환된다. 디에노필(예, 말레이미드)기는 디엘스-알더 반응에 참여한다. 알데히드 또는 케톤 기는 이민, 하이드라존, 세미카르바존, 또는 옥심으로, 또는 그리그나드(Grignard) 첨가 또는 알킬리튬 첨가와 같은 메커니즘을 통하여, 전환될 수 있다. 설포닐 할라이드는 아민과 쉽게 반응하여, 예를 들면, 설폰아미드를 형성한다. 아민 또는 설프하이드릴 기는 예를 들면, 아실화, 알킬화 또는 산화될 수 있다. 알켄은, 사이클로첨가, 아실화, 마이클 첨가, 등등을 이용하여 새로운 종의 배열로 전환될 수 있다. 에폭시드는 아민 및 하이드록실 화합물과 쉽게 반응한다.
통상의 기술자는 많은 이러한 연결들을 다양한 방법으로 다양한 조건을 이용하여 생성할 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 에스테르의 제조에 대해서, 예를 들면, 상기 March, 1157 참조; 티오에스테르에 대해서, 상기 March, 362-363, 491, 720-722, 829, 941, 및 1172 참조; 카르보네이트에 대해서, 상기 March, 346-347 참조; 카르바메이트에 대해서, 상기 March, 1156-57 참조; 아미드에 대해서, 상기 March 1152 참조; 우레아 및 티오우레아에 대해서, 상기 March 1174 참조; 아세탈 및 케탈에 대해서, 상기 Greene 등 178-210 및 상기 March 1146 참조; 아실옥시알킬 유도체에 대해서, Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery, K. B. Sloan, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1992 참조; 에놀 에스테르에 대해서, 상기 March 1160 참조; N-설포닐이미데이트에 대해서, Bundgaard 등, J. Med . Chem., 31:2066 (1988) 참조; 안하이드라이드에 대해서, 상기 March 355-56, 636-37, 990-91, 및 1154 참조; N-아실아미드에 대해서, 상기 March 379 참조; N-마니쉬 염기에 대해서, 상기 March 800-02 및 828 참조; 하이드록시메틸 케톤 에스테르에 대해서, Petracek 등, Annals NY Acad. Sci., 507:353-54 (1987) 참조; 디설파이드에 대해서, 상기 March 1160 참조; 및 포스포네이트 에스테르 및 포스폰아미데이트에 대해서 참조.
반응성 기능기들은 반응에 참여하지 않거나 반응을 간섭하지 않도록 비보호되고 선택될 수 있다. 대안적으로, 보호기의 존재에 의하여 반응성 기능기가 반응에 참여하는 것을 막을 수 있다. 통상의 기술자는 특정 기능기가 반응 조건의 선택을 간섭하는 것을 막는 방법을 알 것이다. 유용한 보호기의 예에 대해서, Greene 등, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991 참조.
전형적으로, 표적화 제제는 표준 화학 기술을 사용하여 그들 각각의 화학적 기능성기들을 통해 세포독소에 공유적으로 연결된다. 임의적으로, 링커 또는 제제는 하나 이상의 스페이서기를 통하여 제제에 결합된다. 스페이서기는 조합으로 사용될 때 등가이거나 다를 수 있다.
일반적으로, 세포독소와 반응성 기능기 사이의 연결이 형성되기 전에, 그리고 임의로, 스페이서기는, 적어도 하나의 화학적 기능성기가 활성화될 것이다. 통상의 기술자는 하이드록시, 아미노 및 카르복시 기들을 포함하는, 다양한 화학적 기능성기들이 다양한 표준 방법들 및 조건들을 이용하여 활성화될 수 있다는 것을 알 것이다. 한 예시적인 구체예에서, 본 발명은 반응성 기능기로서 카르복실 기능성기를 포함한다. 카르복실기는 상기에서 기술된 바와 같이 활성화될 수 있다.
분리가능한 기질
본 발명의 분리가능한 기질은 “X2”로 나타낸다. 바람직하게, 분리가능한 기질은 효소에 의하여 분리될 수 있는 분리가능한 효소 기질이다. 바람직하게, 효소는, 직접적으로 또는 간접적으로, 치료될 종양 또는 다른 표적 세포와 우선적으로 관련이 있다. 효소는 치료될 종양 또는 다른 표적 세포에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 분리가능한 기질은 종양 또는 다른 표적 세포의 주위에 또는 안에서 발견되는 효소에 의하여 우선적으로 분리될 수 있는 펩티드일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 효소는, 종양 항원에 특이적인 항체와 같은, 종양 세포에 특이적으로 결합하는 표적화 제제에 부착될 수 있다.
상기에 기술된 약물에 결합하기 적당한 효소 분리성 기질의 예로서, PCT 특허출원 공개번호 제 WO 00/33888호, 제 WO 01/95943호, 제 WO 01/95945호, 제 WO 02/00263호, 및 제 WO 02/100353호는 약물에 분리가능한 펩티드의 부착을 공지하며, 이들 모두는 참조 문헌으로서 본 명세서에 병합된다. 펩티드는, 종양과 관련있는, 트로우아제(trouase)(티메트 올리고펩티다아제(thimet oligopeptidase)와 같은), CD10(네프릴리신), 기질 메탈로프로테아제(MMP2 또는 MMP9와 같은), 유형 II 트랜스멤브레인 세린 프로테아제(헵신, 테스티신, TMPRSS4, 또는 매트립타제/MT-SP1과 같은), 또는 카텝신과 같은, 효소에 의하여 분리될 수 있다. 이 구체예에서, 전구약물은 상술한 바와 같은 약물, 펩티드, 안정화기, 및 선택적으로 약물과 펩티드 사이의 연결기를 포함한다. 안정화기는 펩티드의 말단에 부착되어 전구약물이 종양 또는 다른 표적 세포에 도달하기 전에 분해되는 것을 막는다. 적절한 안정화기의 예들은, 숙신산, 디글리콜산, 말레산, 폴리에틸렌 글리콜, 피로글루탐산, 아세트산, 나프틸카르복실산, 테레프탈산, 및 글루타르산 유도체들과 같은, 비-아미노산; 뿐만 아니라, 비-유전자로 암호화된 아미노산, 또는 아스파르트산의 β-카르복시기 또는 글루탐산의 γ-카르복실기에서 펩티드의 N-말단에 부착되는 아스파르트산 또는 글루탐산을 포함한다.
펩티드는 전형적으로 3-12(또는 그 이상) 아미노산을 포함한다. 특정 아미노산의 선택은, 적어도 부분적으로, 펩티드를 분리하는데 사용될 효소, 뿐만 아니라, 생체 내 팹티드의 안정성에 의존할 것이다. 적절한 분리가능한 펩티드의 일 예는
Figure 112009042033207-PCT00052
AlaLeuAlaLeu(서열번호 92)이다. 이것은 안정화기와 조합하여 숙시닐-βAlaLeuAlaLeu(서열번호 92)를 형성한다. 적절한 분리가능한 펩티드의 다른 예가 상기에 언급된 참조문헌에 제공되어 있다.
예증적 예로써, 네프릴리신(neprilysin), 중성 엔도펩티다아제(neutral endopeptidase, NEP), 및 공통 급성 림프구성 백혈병 항원(common acute lymphoblastic leukemia antigen, CALLA)으로도 알려진, CD10은 유형 II 세포-표면 아연-의존성 메탈로프로테아제이다. CD10과 함께 사용되는데 적절한 분리가능한 기질은 LeuAlaLeu 및 IleAlaLeu을 포함한다. 기질이 커짐에 따라 촉매 효율성이 종종 감소된다 할지라도, CD10에 대한 다른 알려진 기질은 50개까지의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 포함한다.
다른 예증적 예는 기질 메탈로프로테아제(matrix metalloproteases, MMP)에 기초한다. 아마도 종양과 관계된 가장 특성화된 단백질 분해적 효소에서, 종양 미세환경 내에서 MMP의 활성화의 명확한 상관관계가 있다. 특히, 용해성 기질 효소 MMP2(젤라티나제 A) 및 MMP9(젤라티나제 B)는 집중적으로 연구되었고, 종양 성장을 포함하는 조직 리모델링 동안에 선택적으로 활성화되는 것으로 보여진다. MMP2 및 MMP9에 의하여 분리되도록 설계된 펩티드 서열은 덱스트란 및 메토트렉세이트의 접합체(Chau 등, Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)); PEG(polyethylene glycol)와 독소루비신의 접합체(Bae 등, Drugs Exp. Clin. Res. 29:15-23 (2004)); 및 알부민과 독소루비신의 접합체(Kratz 등, Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2001-2006 (2001))에 대하여 설계되고 테스트되었다. MMP와 함께 사용할 적절한 서열의 예는 ProValGlyLeuIleGly(서열번호 84), GlyProLeuGlyVal(서열번호 85), GlyProLeuGlyIleAlaGlyGln(서열번호 86), ProLeuGlyLeu(서열번호 87), GlyProLeuGlyMetLeuSerGln(서열번호 88), 및 GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln(서열번호 89)을 포함하나 이에 한정되지 않는다(예를 들어, Kline 등, Mol . Pharmaceut. 1:9-22 (2004) 및 Liu 등, Cancer Res. 60:6061-6067 (2000)뿐만 아니라 이전에 언급된 참조문헌을 참조). 다른 분리가능한 기질도 사용될 수 있다.
또한 다른 예는 유형 II 트랜스멤브레인 세린 프로테아제이다. 효소의 이러한 기는, 예를 들어, 헵신, 테스티신, 및 TMPRSS4를 포함한다. GlnAlaArg는 매트립타제/MT-SP1(유방 및 난소 암들에서 과대-발현됨)과 함께 유용한 하나의 기질 서열이고, LeuSerArg는 헵신(전립선 및 다른 부분의 종양 유형에서 과대-발현됨)과 함께 유용하다(예, Lee 등, J. Biol . Chem. 275:36720-36725 및 Kurachi와 Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes 제2권, 제2판 (Barrett AJ, Rawlings ND & Woessner JF, eds) pp. 1699-1702 (2004) 참조). 다른 분리가능한 기질도 사용될 수 있다.
분리가능한 기질 정렬의 다른 유형은 종양 또는 세포와 관련되는 분리가능한 기질을 분리할 수 있는 별개의 효소를 준비하는 것을 포함한다. 예를 들어, 효소는 종양-특이적 항체(또는 종양 또는 수용체 리간드와 같은 다른 표적 세포에 우선적으로 부착되는 다른 개체)에 결합될 수 있으며, 그리고 나서 효소-항체 접합체는 환자에게 제공될 수 있다. 효소-항체 접합체는 종양과 관련된 항원을 향하고 이 항원에 결합된다. 이어서, 약물-분리가능한 기질 접합체가 전구약물로서 환자에 제공된다. 약물-분리가능한 기질 접합체가 종양과 관련되는 효소와 반응할 때 상기 약물은 종양 근처에서 방출되기만 하여, 분리가능한 기질은 분리되고 약물은 유리된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,975,278호; 제 5,587,161호; 제 5,660,829호; 제 5,773,435호; 및 제 6,132,722호는 그러한 정렬을 공지하는데, 이 모든 것들은 본 명세서에 참조 문헌으로서 병합된다. 적절한 효소 및 기질의 예는 β-락타마제 및 세팔로스포린 유도체, 카르복시펩티다아제 G2 및 글루타믹 및 아스파르틱 엽산 유도체들을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 효소-항체 접합체는 관심의, 표적 세포 상에서 또는 표적 자리에서 발현되는 항원에 대한 특이성에 기초하여 선택된, 항체, 또는 항체 단편을 포함한다. 항체에 대한 논의는 본 명세서에서 상기에 주어져 있다. 적절한 세팔로스포린-분리가능한 기질의 예는 다음과 같다:
Figure 112009042033207-PCT00053
.
접합체의 예
본 발명의 링커 및 분리가능한 기질은 다양한 파트너 분자를 포함하는 접합체에 사용될 수 있다. 본 발명의 접합체의 예는 하기에 더 자세히 기술된다. 다른 지시가 없으며, 치환기들은 세포독소, 링커, 및 분리가능한 기질에 관한 부분에서 상기에 설명된 바와 같이 정의된다.
A. 링커 접합체
적절한 접합체의 한 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009042033207-PCT00054
여기에서 L1은 자기-희생 링커이고; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009042033207-PCT00055
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 하나 이상의 멤버이고; c는 1 내지 20의 정수이며; L2는 자기-희생 링커이고 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00056
여기에서 각 R17, R18, 및 R19는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택되고, w는 0 내지 4의 정수이며; o는 1이고; L4는 링커 멤버이며; p는 0 또는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 이루어진 군에서 선택된 멤버이며; D는 다음의 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00057
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E 및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 OR11인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 이루어진 군에서 선택된 멤버이고, R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되고, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고, 존재할 때 R6 및 R7은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 및 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 결합된 CH2-X1 또는 -CH2- 이고, 여기에서 X1은 이탈기인데, 여기에서 R11은 상기 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결시킨다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용되기에 적당한 화합물의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009042033207-PCT00058
접합체 유형의 다른 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009042033207-PCT00059
여기에서 L1은 자기-희생 링커이며; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009042033207-PCT00060
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 멤버이며; c는 1 내지 20의 정수이고; L2는 자기-희생 링커이며; o는 0 이거나 1이고; L4는 링커 멤버이며; p는 0 또는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 이루어진 군에서 선택된 멤버이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00061
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E 및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 이루어진 군에서 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 이루어진 군에서 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 R4 , R4 ’, R5 및 R5 ’ 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결하고, 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00062
여기에서 v는 1 내지 6까지의 정수이고; 각 R27, R27’, R28, 및 R28’은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 그리고 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 X1는 이탈기이다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용되기에 적당한 화합물의 특정한 예는 다음과 같다:
Figure 112009042033207-PCT00063
여기에서 r은 0 내지 24 범위 내에서의 정수이다.
적절한 접합체의 다른 예는 다음 식의 화합물이다:
Figure 112009042033207-PCT00064
여기에서 L1은 자기-희생 링커이고; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며; F는 다음 구조를 포함하는 링커이다:
Figure 112009042033207-PCT00065
여기에서 AA1은 천연 아미노산 및 비천연 α-아미노산으로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 멤버이며; c는 1 내지 20의 정수이고; L3은 1차 또는 2차 아민 또는 카르복실 기능기를 포함하는 스페이서기이며; 여기에서 L3이 존재하면, m은 0이고, L3의 아민이 D의 매달린 카르복실 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 L3의 카르복실이 D의 매달린 아민 기능기와 아미드 결합을 형성하거나 둘 중의 하나이고; o는 0 또는 1이고; L4는 링커 멤버인데, 여기에서 L4는 (AA1)c의 N-말단에 직접 부착되는,
Figure 112009042033207-PCT00066
을 포함하는데, 여기에서 R20은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택되는 멤버이며, 각 R25, R25’, R26, 및 R26’은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고; s 및 t는 1 내지 6으로부터 독립적으로 선택되는 정수들이며; p는 1이고; X4는 보호된 반응성 기능기, 비보호된 반응성 기능기, 검출가능한 표지, 및 표적화 제제로 이루어진 군에서 선택된 멤버이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00067
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E 및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 이루어진 군에서 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 이루어진 군에서 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R4, R4’, R5 및 R5’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이고; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하며; 그리고 R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 X1은 이탈기이고, R4 , R4’, R5, R5’, R15 또는 R16 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 F에 연결한다.
어떤 구체예에서, 약물은 상기 구조 (c) 또는 (f)를 가진다. 접합체로서 사용하기에 적절한 화합물의 한 특정 예는 다음이다:
Figure 112009042033207-PCT00068
여기에서 r은 0 내지 24의 범위 내의 정수이다.
접합체로서의 사용하기에 적절한 화합물의 다른 예는 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00069
Figure 112009042033207-PCT00070
Figure 112009042033207-PCT00071
Figure 112009042033207-PCT00072
Figure 112009042033207-PCT00073
여기에서 R은
Figure 112009042033207-PCT00074
또는
Figure 112009042033207-PCT00075
이고 r은 0 내지 24 범위에서의 정수이다.
또한 접합체는, 하기 화합물과 같이, 구조 (g)를 갖는 약물을 사용하여 형성될 수 있다:
Figure 112009042033207-PCT00076
Figure 112009042033207-PCT00077
(여기에서 r은 0 내지 24의 범위 내의 정수이다).
접합체는 하기 구조를 갖는 약물을 사용하여 또한 형성될 수 있다:
Figure 112009042033207-PCT00078
Figure 112009042033207-PCT00079
Figure 112009042033207-PCT00080
및
Figure 112009042033207-PCT00081
그러한 세포독소들의 합성, 뿐만 아니라 항체에 대한 그것들의 연결에 관한 설명은, 2007년 11월 30일에 출원된 미국 특허 출원 일련번호 제 60/991,300호에 공지되어 있다.
소정의 구체예에서, 항-CD70은 구조 N1의 링커 및 치료적 제제에 접합된다:
Figure 112009042033207-PCT00082
소정의 구체예에서, 항-CD70은 구조 N2의 링커 및 치료적 제제에 접합된다:
Figure 112009042033207-PCT00083
B. 분리가능한 링커 접합체
적절한 접합체의 예는 하기 구조를 갖는 화합물이다:
Figure 112009042033207-PCT00084
여기에서 L1은 자기-희생 스페이서이며; m은 정수 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고; X2는 분리가능한 기질이며; 그리고 D는 다음 구조를 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00085
여기에서 고리계 A는 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 기들로부터 선택된 멤버이고; E 및 G는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 헤테로원자, 단일 결합으로부터 독립적으로 선택된 멤버이거나, E 및 G는 결합되어 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 고리계를 형성하며; X는 O, S 및 NR23으로부터 선택된 멤버이고; R23은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 아실로부터 선택된 멤버이며; R3은 (=O), SR11, NHR11 및 OR11로 이루어진 군에서 선택된 멤버인데, R11은 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 헤테로알킬, 비치환 헤테로알킬, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 설포네이트, 아실, C(O)R12R13, C(O)OR12, C(O)NR12R13, P(O)(OR12)2, C(O)CHR12R13, SR12 및 SiR12R13R14로 이루어진 군에서 선택된 멤버이고, 여기에서 R12, R13, 및 R14는 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 및 치환 또는 비치환 아릴로부터 독립적으로 선택된 멤버인데, R12 및 R13은 그것들이 부착된 질소 또는 탄소 원자와 함께 임의적으로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6 멤버를 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; R6은 존재하거나 부재하는 단일 결합이고 존재할 때 R6 및 R7 은 결합되어 사이클로프로필 고리를 형성하고; R7은 상기 사이클로프로필 고리에서 R6과 함께 결합되는 CH2-X1 또는 -CH2-인데, 여기에서 X1은 이탈기이며, R4, R4 ’, R5 및 R5 ’는 H, 치환 알킬, 비치환 알킬, 치환 아릴, 비치환 아릴, 치환 헤테로아릴, 비치환 헤테로아릴, 치환 헤테로사이클로알킬, 비치환 헤테로사이클로알킬, 할로겐, NO2, NR15R16, NC(O)R15, OC(O)NR15R16, OC(O)OR15, C(O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, 및 O(CH2)nN(CH3)2로 이루어진 군에서 독립적으로 선택된 멤버들이거나, R4, R4’, R5 및 R5’의 임의의 인접쌍은, 그것들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 결합되어 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하는데, 여기에서 n은 1 내지 20까지의 정수이며; R15 및 R16은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬, 및 치환 또는 비치환 펩티딜로부터 독립적으로 선택되는데, 여기에서 R15 및 R16은 그것들이 부착되는 질소 원자와 함께, 임의로 결합되어, 선택적으로 둘 이상의 헤테로원자를 포함하는, 4 내지 6의 멤버들을 갖는 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬 고리계를 형성하며; 여기에서 R4 , R4’, R5, 및 R5’ 중 적어도 하나는 약물을 존재한다면 L1에, 또는 X2에 연결하며, 다음으로 이루어진 군에서 선택된다:
Figure 112009042033207-PCT00086
여기에서 R30, R30 ’, R31, 및 R31 ’은 H, 치환 또는 비치환 알킬, 치환 또는 비치환 헤테로알킬, 치환 또는 비치환 아릴, 치환 또는 비치환 헤테로아릴, 및 치환 또는 비치환 헤테로사이클로알킬로부터 독립적으로 선택되고; v는 1 내지 6의 정수이다.
적절한 분리가능한 링커의 예는 β-AlaLeuAlaLeu(서열번호92) 및 다음을 포함한다:
Figure 112009042033207-PCT00087
.
약제학적 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어, 본 발명의, 단일클론 항체 또는 이의 항원-결합부(들) 중 하나 또는 조합물을 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형화된 약제학적 조성물을 제공한다. 그러한 조성물들은 본 발명의 (예를 들어, 두 개 이상의 상이한) 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자의 하나 또는 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프에 결합하는 또는 상보적 활성을 가지는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 약제학적 조성물은 조합 요법, 즉 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 적어도 하나의 다른 항-암성, 항-염증 또는 면역억제 제제와 조합된 본 발명의 항-CD70 항체를 포함할 수 있다. 조합 요법에 사용될 수 있는 치료적 제제의 예들은 본 발명의 항체의 용도에 대한 부분에서 더 자세히 후술한다.
본 명세서에서 사용되는, “약제학적으로 허용가능한 담체”는 생리학적으로 양립할 수 있는, 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항박테리아성 및 항균성 제제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구적, 척추 또는 표피 투여(예, 주사 또는 주입으로)에 적합하다. 투여 경로에 의존하여, 활성 화합물, 즉, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 산의 작용 및 화합물을 비활성화시킬 수 있는 다른 자연적 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
본 발명의 약제학적 화합물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. “약제학적으로 허용가능한 염”은 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 임의의 원하지 않는 독소학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다(예, Berge, S. M. 등 (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 그러한 염의 예는 산 부가 염 및 염기 부가 염을 포함한다. 산 부가 염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등과 같은 비독성 무기산으로부터 유래된 것은 물론, 지방족 모노- 및 디카르복실 산, 페닐-치환된 알카노 산, 하이드록시 알카노 산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰 산 등과 같은 비독성 유기산으로부터 유래된 것을 포함한다. 염기 부가 염은, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등과 같은 알칼리 토금속으로부터 유래된 것은 물론 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등과 같은 비독성 유기 아민류로부터 유래된 것을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용가능한 항산화제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 항산화제의 예는: (1) 아스코르브 산, 시스테인 염산염, 소듐 비설페이트, 소듐 메타비설파이트, 소듐 설파이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코빌 팔미테이트, 부틸레이티드 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 지용성 항산화제; 및 (3) 시트르 산, 에틸렌디아민 테트라아세트 산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), 소르비톨, 타르타르 산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트화제를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있는 적절한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올류(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은) 및 이들의 적절한 혼합물, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르류를 포함한다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 살균 공정 및, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브 산 등과 같은 다양한 항박테리아 및 항진균성 제제 주입으로 확립할 수 있다. 당, 염화나트륨 등과 같은 등장제제(isotonic agents)를 조성물에 포함하는 것이 또한 바람직하다. 이에 더하여, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 포함하여 주사가능한 약제학적 제형의 흡수를 연장할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 멸균 주사용액이나 분산액의 임시 제조물용 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 그러한 배지 및 제제를 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에 이를 사용하는 것이 포함된다. 보조적인 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료적 조성물은 일반적으로 제조 및 보관 환경하에서 반드시 멸균적이고 안정적이어야 한다. 상기 조성물은 용액, 미소유화액, 리포좀, 또는 고 약물 농도에 적합한 다른 주문된 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 포함하는 용매나 분산매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입자 크기를 유지함으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장제제, 예를 들어, 당, 폴리알코올류, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어 모노스테아레이트염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시킴으로써 주사가능한 조성물의 흡수를 연장할 수 있다.
멸균된 주사가능한 용액은, 활성 화합물을 적절한 용매에 요구되는 양으로, 필요한 경우, 상기 설명된 성분 중 하나 또는 조합물과 같이 배합하고, 멸균 마이크로정제하여 제조될 수 있다. 일반적으로 분산액은 상기 활성 화합물을, 염기성 분산매 및 상기 설명된 것의 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비이클(vehicle)에 배합하여 제조된다. 멸균된 주사용 용액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조(lyophilization)이고 이는 활성 성분에 더하여 이의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 산출한다.
담체 물질과 조합하여 단일 투약 형태를 생성하는 활성 성분의 양은 처리될 대상체 및 투여의 특정 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투약 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에, 이러한 양은 활성 성분의 약 0.01 % 내지 약 99%, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 활성 성분의 약 1% 내지 약 30%가 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 있다.
투약 섭생은 최적의 원하는 반응(예, 치료 반응)을 제공하도록 조절된다. 예를 들어, 단일 볼러스(bolus)가 투여될 수 있고, 수 개 분리된 투약물이 여러 번 투여될 수 있고 또는 투여량은 치료 상태의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이, 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이함 및 투여의 일관성을 위해 비경구 조성물을 투약 단위 형태로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투약 단위 형태는, 치료될 대상체에 단일성 투약물로서 적절한 물리적으로 분리된 단위체를 지칭하고, 각 단위체는 요구되는 약제학적 담체와 결합하여 요구되는 치료 효과를 생성하는 데 계산된 활성 화합물의 소정의 양을 포함한다. 본 발명의 투약 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 고유의 특성 및 이루어지는 특정 치료효과, 및 (b) 개인에게서 민감성의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 조제하는 당해 분야에 고유한 제한에 의해 지시되고 및 직접적으로 의존한다.
항체의 투여의 경우, 투여량은 숙주 체중의, 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 더 통상적으로는 0.01 내지 25 mg/kg의 범위이다. 예를 들어, 투여량은 0.3 mg/kg 체중, 1 mg/kg 체중, 3 mg/kg 체중, 5 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중이거나 1-10 mg/kg의 범위에 있다. 필요시, 예를 들어 15 mg/kg 체중, 20 mg/kg 체중 또는 25 mg/kg 체중의 더 높은 투여량이 사용될 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 일 주에 한번, 이 주에 한번, 삼 주에 한번, 사 주에 한번, 한 달에 한 번, 세 달에 한번, 또는 삼 내지 육 개월에 한 번 투여일 수 있다. 본 발명의 항-CD70 항체에 대한 특정한 투여 섭생은 1 mg/kg 체중 또는 3 mg/kg 체중 정맥 내 투여를 포함하고, 상기 항체는 하기 투여 스케줄 중 하나를 이용한다: (i) 4 주마다 6 번 투여 후, 3 달 마다 투여; (ii) 3 주 마다; (iii) 3 mg/kg 체중 한 번 투여 후, 매 3 주 마다 1 mg/kg 체중 투여.
어떤 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가지는 본 발명의 두 개 이상의 항-CD70 단일클론 항체를 동시에 투여하며, 이 경우, 투여되는 각 항체의 투여량은 지시된 범위에 속한다. 항체는 통상적으로 여러 번 투여된다. 단일 투여 간의 간격은, 예를 들어, 주간, 월간, 삼개월 또는 연간일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 농도를 측정하여 지시되는 바에 따라, 불규칙할 수 있다. 어떤 방법에서, 투여량은 약 1-1000 ㎍/ml의 혈장 항체 농도, 및 특정의 방법에서는 약 25-300 ㎍/ml의 농도를 얻도록 조절한다.
대안적으로, 항체는 지속 방출(sustained release) 제형으로서 투여될 수 있고, 이 경우, 투여 횟수가 줄어든다. 투여량 및 횟수는 환자에서 항체의 반감기에 의존하여 변한다. 일반적으로, 인간 항체들은 가장 긴 반감기를 보이며, 인간화 항체들, 키메릭 항체들, 및 비인간 항체들이 그 뒤를 따른다. 투여량 및 투여 횟수는 치료가 예방적인지 또는 치료적인지에 따라 변할 수 있다. 예방적 적용에서는, 상대적으로 적은 투여량이 긴 시간에 걸쳐서 상대적으로 적은 횟수로 투여된다. 특정 환자는 그들 수명의 남은 기간 동안 치료를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지 및 바람직하게, 환자가 질병의 증상의 부분적으로 또는 완전한 개선을 보일 때까지 상대적으로 잦은 횟수로 상대적으로 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후, 환자는 예방적 섭생 방식으로 투여될 수 있다.
프로피락시스(prophylaxis)에서의 사용 및/또는 비정상 세포 증식과 관련된 질병의 치료에서, 약 0.001 μM 내지 20 μM의 화합물의 농도를 순회하여 투여하는 것이 바람직한데, 약 0.01 μM 내지 5 μM이 바람직하다.
본 명세서에 설명된 화합물의 구강 투여에 관한 환자 투여량은, 전형적으로 약 1 mg/일 내지 약 10,000 mg/일, 더 전형적으로 약 10 mg/일 내지 약 1,000 mg/일, 그리고 가장 전형적으로 약 50 mg/일 내지 약 500 mg/일의 범위를 가진다. 환자 체중의 견지에서 언급했듯이, 전형적인 투여량은 약 0.01 내지 약 150 mg/kg/일, 더욱 전형적으로 약 0.1 내지 약 15 mg/kg/일, 가장 전형적으로 약 1 내지 약 10 mg/kg/일의 범위를 가지며, 예를 들면 5 mg/kg/일 또는 3 mg/kg/일이다.
적어도 어떤 구체예에서, 종양 성장을 저지하거나 억제하는 환자 투여량은 1 μmol/kg/일 이하일 수 있다. 예를 들면, 환자 투여량은 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.45, 0.3, 0.2, 0.15, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04, 0.03, 0.02, 0.01, 또는 0.005 μmol/kg 이하일 수 있다(약물의 몰(mole)을 지칭). 바람직하게, 항체-약물 접합체는 적어도 5일의 기간 이상 일일 투여량으로 투여될 때 종양의 성장을 저지한다. 적어도 어떤 구체예에서, 종양은 SCID 마우스에서 인간-유형 종양이다. 예로써, SCID 마우스는 CB17.SCID 마우스(Taconic, Germantown, NY로부터 입수가능)일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 환자에 유독하지 않고서, 특정 환자, 조성물, 및 투여의 방식에 대하여 원하는 치료학적 반응을 성취하는데 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위하여 다양화할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이들의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여의 경로, 투여의 시간, 사용된 특정 화합물의 배출율, 치료의 기간, 다른 약물, 사용된 특정 조성물와 조합하여 이용된 화합물 및/또는 물질, 치료될 환자의 나이, 성별, 체중, 조건, 일상 건강 상태 및 이전의 병력, 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사한 요소들을 포함하는, 다양한 약물동력학적 요소들에 달려있다.
본 발명의 항-CD70 항체의 “치료적으로 유효한 투여량”은 바람직하게는 질병 증상의 중증도를 감소시키고, 무증상질병 기간의 빈도 및 기간을 증가시키고, 또는 질병 고통으로 인한 장애나 불능을 방지하는 결과를 가져온다. 예를 들어, CD70+ 종양의 치료의 경우, “치료적으로 유효한 투여량”은, 미치료 대상체에 비하여, 세포 성장 또는 종양 성장을 바람직하게는 적어도 약 20%, 더 바람직하게는 적어도 약 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 60%, 및 더더욱 바람직하게는 적어도 약 80%로 억제한다. 종양 성장을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예시하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다. 대안적으로, 이러한 조성물의 성질은 세포 성장을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 그러한 억제는, 숙련된 실험자에게 알려진 분석 방법으로 시험관 내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료적 유효량은 대상체에서 종양 크기를 감소시키거나, 그렇지 않다면 증상을 개선시킨다. 통상의 기술자는 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도, 및 선택된 투여의 특정 조성물이나 경로와 같은 요인에 근거하여 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 조성물을 당해 분야에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 숙련자에 의해 이해될 바와 같이, 투여의 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 의존하여 변할 것이다. 본 발명의 항체에 대한 바람직한 투여 경로는, 정맥내, 근육내, 피부내, 복강내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, 어구 “비경구 투여”는, 장 및 국소 투여 외의 투여 방식, 통상적으로는 주사에 의한 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막강내, 관절낭내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내, 피부내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하(subcuticular), 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내, 경막외(epidural) 및 흉골내(intrasternal) 주사 및 주입을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
대안적으로, 본 발명의 항체는 국소, 표피 또는 점막 투여 경로와 같은, 비경구가 아닌 경로, 예를 들어, 비강내, 경구적으로, 질내로, 직장내로, 설하내로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
활성 화합물은, 조절된 분비 제형과 같이, 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함하는, 빠른 분비에 대하여 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은, 생체분해성, 생체양립성 중합체를 사용할 수 있다. 그러한 제형을 제조하기 위한 많은 방법은 특허되어 있거나 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 참조.
치료 조성물은 당해 분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 미국 특허 번호 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호; 또는 제4,596,556호에 공지된 장치와 같이, 바늘없는 피하 주사 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 공지된 이식물 및 모듈의 예는 다음을 포함한다: 미국 특허 번호 제4,487,603호, 조절된 속도로 약물을 분배하는, 이식될 수 있는 마이크로-주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,486,194호, 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,233호, 정밀한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,447,224호, 연속적인 약물 전달용, 가변성 흐름 이식성 주입 장치를 보여줌; 미국 특허 번호 제4,439,196호, 다중-챔버 구획을 가지는 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌; 및 미국 특허 번호 제4,475,196호, 삼투압성 약물 전달 시스템을 보여줌. 이러한 특허들은 본 명세서에서 참조문헌으로서 병합된다. 많은 다른 그러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명의 인간 단일클론 항체들을 제형화하여 생체 내에서 적절히 분포하게 할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 많은 고도의 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 가로지르는 것을 확실하게 하기 위해(필요시), 상기 화합물은, 예를 들어, 리포좀 내에 제형화될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,522,811호; 제5,374,548호; 및 제5,399,331호를 참조. 리포좀은 선택적으로 특정 세포 또는 기관으로 운반되는 하나 이상의 부분(moieties)을 포함하며, 따라서 표적화 약물 전달을 향상시킬 수 있다(예, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조). 예시적 표적화 부분들은 폴레이트 또는 비오틴(예컨대, Low 등의 미국 특허 번호 제 5,416,016호 참조); 만노시드(Umezawa 등 (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman 등 (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais 등 (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성체 단백질 A 수용체(Briscoe 등 (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier 등 (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); 또한 K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273 참조)을 포함한다.
본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 항체, 특히 인간 항체, 항체 조성물, 항체-파트너 분자 접합체 조성물 및 방법은 CD70 매개 질병의 진단 및 치료를 포함한 수 많은 시험관 내 및 생체 내 진단 유용성 및 치료 유용성을 가진다. 예를 들어, 시험관 내 또는 생체 외, 또는 인간 대상체, 예컨대 생체내 로, 이러한 분자들을 배양중인 세포로 투여하여, 다양한 질환을 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 “대상체”는 인간 및 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. “비-인간 동물”은 모든 척추동물들, 예를 들어, 포유동물, 및 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류, 및 파충류와 같은 비포유동물을 포함한다. 바람직한 대상체는 CD70 활성에 의해 매개되는 질환을 갖는 인간 환자를 포함한다. 본 방법은 변종적 CD70 발현과 관련된 질환을 갖는 인간 환자를 치료하는데 특히 적당하다. CD70에 대한 항체-파트너 분자 접합체를 다른 제제와 함께 투여하면, 그 둘은 순차적으로 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 항체가 CD70에 대하여 특이적으로 결합하는 경우, 본 발명의 항체를 사용하여 세포 표면 상에서 CD70 발현을 특이적으로 검출할 수 있고, 또한, 면역친화성 정제를 통해 CD70을 정제할 수 있다.
CD70은 신장 세포 암종, 전이성 유방암, 뇌종양, 백혈병, 림프종 및 비인두암을 포함한, 다양한 인간 암에서 발현한다(Junker et al. (2005) J Urol. 173:2150-3; Sloan et al. (2004) Am J Pathol. 164:315-23; Held-Feindt and Mentlein (2002) Int J Cancer 98:352-6; Hishima 등 (2000) Am J Surg Pathol. 24:742-6; Lens 등 (1999) Br J Haematol. 106:491-503). 항-CD70 항체는 단독으로 사용하여 암 종양의 성장을 억제할 수 있다. 대안적으로, 항-CD70 항체는 하기 기재한 바와 같이, 다른 면역성 제제, 표준 암 치료 또는 다른 항체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제시킬 수 있는 바람직한 암은 일반적으로 면역요법에 반응하는 암을 포함한다. 치료를 위한 바람직한 암의 비-제한적인 예는 신장암(예, 신장 세포 암종(renal cell carcinoma)), 유방암, 뇌종양, 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia), 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia)을 포함한 만성 또는 급성 백혈병, 림프종(예, 호지킨 림프종(Hodgkin’s lymphoma) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphoma), 원발성 중추신경계 림프종(primary CNS lymphoma), T-세포 림프종(T-cell lymphoma)) 및 비인두암(nasopharangeal carcinoma)을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있는 다른 암의 예는 흑색종(예, 전이성 악성 흑색종(metastatic malignant melanoma)), 전립선암(prostate cancer), 대장암(colon cancer), 폐암(lung cancer), 골암(bone cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 피부암(skin cancer), 두경부암(cancer of the head or neck), 피부 또는 안구 악성 흑색종(cutaneous or intraocular malignant melanoma), 자궁암(uterine cancer), 난소암(ovarian cancer), 직장암(rectal cancer), 항문 부위 암(cancer of the anal region), 위암(stomach cancer), 고환암(testicular cancer), 자궁암(uterine cancer), 난관암(carcinoma of the fallopian tubes), 자궁내막암(carcinoma of the endometrium), 자궁경부암(carcinoma of the cervix), 질암(carcinoma of the vagina), 외음부암(carcinoma of the vulva), 식도암(cancer of the esophagus), 소장암(cancer of the small intestine), 내분비계암(cancer of the endocrine system), 갑상선암(cancer of the thyroid gland), 부갑상선암(cancer of the parathyroid gland), 부신암(cancer of the adrenal gland), 연조직육종(sarcoma of soft tissue), 요도암(cancer of the urethra), 음경암(cancer of the penis), 소아 고형종양(solid tumors of childhood), 방광암(cancer of the bladder), 신장암 또는 수뇨관암(cancer of the kidney or ureter), 신우암(carcinoma of the renal pelvis), 중추신경계 신생물(neoplasm of the central nervous system(CNS)), 종양 혈관생성(tumor angiogenesis), 척수축 종양(spinal axis tumor), 뇌간교세포종(brain stem glioma), 뇌하수체 선종(pituitary adenoma), 카포시육종(Kaposi's sarcoma), 유상피암(epidermoid cancer), 편평상피암(squamous cell cancer), 석면에 의하여 유도된 암, 예를 들어 중피종(mesothelioma)을 포함하여 환경적으로 유도된 암 및 상기 암의 조합을 포함한다.
또한, 다양한 종양 세포 상에서 CD70이 발현하면, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을 사용하여 종양형성 질환, 예를 들어 투명세포(clear cell) RCC와 같은 신장 세포 암종(RCC), 교모세포종(glioblastoma), 유방암, 뇌종양, 비인두암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 버킷림프종(Burkitt's lymphoma), 미분화 거대세포 림프종(anaplastic large-cell lymphomas, ALCL), 다발성 골수종(multiple myeloma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphomas), 결절성 소분할-세포 림프종(nodular small cleaved-cell lymphomas), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphomas), 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종(Lennert's lymphomas), 면역모세포성 림프종(immunoblastic lymphomas), T-세포 백혈병/림프종(T-cell leukemia/lymphomas, ATLL), 성인 T-세포 백혈병(adult T-cell leukemia, T-ALL), 중심모세포성/중심세포성 여포 림프종 암(centroblastic/centrocytic(cb/cc) follicular lymphomas cancers), B형의 미만성 거대세포 림프종(diffuse large cell lymphomas of B lineage), 혈관면역모세포성 림프절병증(angioimmunoblastic lymphadenopathy, AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 신체 체강 기반 림프종(HIV associated body cavity based lymphomas), 배아 암종(embryonal carcinomas), 비인강의 미분화 암종(undifferentiated carcinomas of the rhino-pharynx)(예, 슈민케 종양(Schmincke’s tumor)), 캐슬맨병(Castleman’s disease), 카포시육종(Kaposi’s Sarcoma), 다발성 골수종(Multiple Myeloma), 왈든스트롬 매크로글로불린혈증(Waldenstrom’s macroglobulinemia) 및 다른 B-세포 림프종을 포함하는, 예컨대 CD70을 발현하는 종양 세포의 존재에 의하여 특징지어지는 질환을 갖는 대상체를 치료할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 항-CD70 항체 또는 이의 항원-결합부의 치료적으로 유효한 양을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체 내에서 종양 세포의 성장을 억제시킬 수 있는 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 항체는 인간 항-CD70 항체(예를 들어 본 명세서에 기술된 임의의 인간 항-인간 CD70 항체와 같음)이다. 추가적으로 또는 대안적으로 상기 항체는 키메릭 또는 인간화 항-CD70 항체일 수 있다.
추가적으로, CD27과 CD70의 상호작용은 또한 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)과 같은, 세포-매개 자가면역 질병에서 역할을 하는 것으로 제안되어졌다(Nakajima 등 (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96). 이러한 효과는 TNF-알파 생성의 억제가 일부분 매개하는 것으로 생각하였다. 더구나, CD70 시그널링의 차단은 CD8+ T-세포의 CD40-매개 클론 증식을 억제하고 CD8+ 기억 T-세포의 발생을 감소시킨다(Taraban 등 (2004) J. Immunol. 173:6542-6). 그러한 것으로서, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을 사용하여 자가면역 질환, 예를 들어 실험적 자가면역 뇌척수염을 포함하여, 예컨대 CD70을 발현하는 B-세포의 존재에 의하여 특징지어지는 질환을 갖는 대상체를 치료할 수 있다. 본 발명의 항체를 사용할 수 있는 추가적인 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus, SLE), 인슐린 의존성 당뇨병(insulin dependent diabetes mellitus, IDDM), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease, IBD)(크론씨병(Crohn’s Disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 셀리악병(Celiac disease)을 포함), 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 건선(psoriasis), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA) 및 사구체신염(glomerulonephritis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 더구나 본 발명의 항체 조성물은 이식 거부를 억제하거나 예방하는데 또는 이식편대 숙주 질환(graft versus host disease, GVHD)의 치료에 사용할 수 있다.
추가적으로, CD27과 CD70의 상호작용은 또한 CD4+ T 세포 상에서 시그널링에 역할을 하는 것으로 제안되어졌다. 일부 바이러스는 CD27 경로로 신호를 보내 항체 반응을 중화시키는 것의 파괴를 야기하는 것으로 보여졌다(Matter 등 (2006) J Exp Med 203:2145-55). 그러한 것으로서, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을, 예를 들어, 인간면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 간염 (A, B, 및 C), 헤르페스바이러스, (예, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II 및 CMV, 엡스테인 바바이러스(Epstein Barr virus)), 아데노바이러스, 인플루엔자바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기세포융합바이러스, 볼거리 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 백시니아바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기열 바이러스, 유두종 바이러스, 물사마귀 바이러스(molluscum virus), 폴리오바이러스, 광견병 바이러스, JC 바이러스 및 아르보바이러스뇌염 바이러스 및 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)의 감염을 포함하여 바이러스의 감염이 있는 대상체를 치료하는데 또는 HIV 감염/AIDS의 치료에 사용할 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을 사용하여 TNF-알파 생성을 억제할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 항체(예, 인간 단일클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하여 CD70의 수준 또는 막 표면 상에 CD70을 포함하는 세포의 수준을 검출할 수 있으며, 그 다음에 상기 수준은 소정의 질병 증상과 연결될 수 있다. 대안적으로, 상기 항체를 사용하여 CD70 기능을 억제하거나 차단할 수 있으며, 그 다음 소정의 질병 증상의 예방 또는 개선과 연결될 수 있고, 그것에 의하여 질병의 매개자로서 CD70을 포함시킬 수 있다. 이것은 항체와 CD70 사이에서 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에서 실험 샘플 및 대조군 샘플을 항-CD70 항체와 접촉시킴으로써 이룰 수 있다. 항체 및 CD70 사이에서 형성된 임의의 복합체는 실험 샘플 및 대조군에서 검출되고 비교된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 항체(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 처음에 시험관 내에서 치료적 또는 진단 용도와 연관된 결합 활성에 대하여 테스트할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기재된 유세포 분석법을 사용하여 테스트할 수 있다.
본 발명의 항체(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자, 면역접합체 및 조성물)는 CD70-관련 질병의 치료 및 진단에 추가적인 유용성을 가진다. 예를 들어, 인간 단일클론 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체를 사용하여 하기 생물학적 활성의 하나 이상을 생체 내 또는 시험관 내에서 유도해 낼 수 있다: CD70을 발현하는 세포의 성장을 억제 및/또는 상기 세포를 살해하는 것; 인간 작동자 세포의 존재시 CD70을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC를 매개하는 것; 또는 CD70에 대한 CD70 리간드 결합을 억제하는 것.
특정 구체예에서, 항체(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하여 생체 내에서 다양한 CD70-관련 질병을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. CD70-관련 질병의 예는 특히, 자가면역질환, 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE), 암, 투명세포 RCC와 같은 신장 세포 암종(renal cell carcinomas, RCC), 교모세포종(glioblastoma), 유방암, 뇌종양, 비인두암, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia, ALL), 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 버킷림프종(Burkitt's lymphoma), 미분화 거대세포 림프종(anaplastic large-cell lymphomas, ALCL), 다발성 골수종(multiple myeloma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphomas), 결절성 소분할-세포 림프종(nodular small cleaved-cell lymphomas), 림프구성 림프종(lymphocytic lymphomas), 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종(Lennert's lymphomas), 면역모세포성 림프종(immunoblastic lymphomas), T-세포 백혈병/림프종(T-cell leukemia/lymphomas, ATLL), 성인 T-세포 백혈병(adult T-cell leukemia, T-ALL), 중심모세포성/중심세포성 여포 림프종 암(centroblastic/centrocytic(cb/cc) follicular lymphomas cancers), B형의 미만성 거대세포 림프종(diffuse large cell lymphomas of B lineage), 혈관면역모세포성 림프절병증(angioimmunoblastic lymphadenopathy, AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 신체 체강 기반 림프종(HIV associated body cavity based lymphomas), 배아 암종(embryonal carcinomas), 비인강의 미분화 암종(undifferentiated carcinomas of the rhino-pharynx)(예, 슈민케 종양(Schmincke’s tumor)), 캐슬맨병(Castleman’s disease), 카포시육종(Kaposi’s Sarcoma), 다발성 골수종(Multiple Myeloma), 왈든스트롬 매크로글로불린혈증(Waldenstrom’s macroglobulinemia), 및 다른 B-세포 림프종을 포함한다.
본 발명의 항체 조성물(예, 인간 단일클론 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 적절한 생체 내 및 시험관 내 투여 경로는 당해 분야에 공지되어 있고, 통상의 기술자에 의하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 조성물을 주사(예, 정맥내 또는 피하내)로 투여할 수 있다. 상기 사용되는 분자의 적절한 투여량은 대상체의 나이와 체중, 및 항체 조성물의 농도 및/또는 제형에 따라 다르다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CD70 항체는 하나 이상의 치료적 제제, 예를 들어, 세포독성 제제, 방사성독성 제제 또는 면역억제제와 공동 투여될 수 있다. 상기 항체는 상기 제제에 연결되거나(면역복합체로서) 또는 상기 제제와 별도로 투여될 수 있다. 후자의 경우(별도 투여), 상기 항체는 상기 제제 투여 전, 후 또는 동시에 투여할 수 있거나, 다른 공지된 요법, 예를 들어, 항암 요법, 예를 들어 방사능 요법과 공동투여될 수 있다. 그러한 치료적 제제들은, 특히, 항-신생물 제제, 예를 들어, 독소루비신(아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 설페이트, 카르무스틴, 클로람부실 및 사이클로포스파미드 하이드록시우레아를 포함하며, 이들은 그 자체로, 환자에 독성이거나 약독성(subtoxic)인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주에 한번씩 100 mg/ 투여량으로 정맥내 투여되며 아드리아마이신은 21일 마다 한번씩 60-75 mg/ml의 투여량으로 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-CD70 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 화학요법제와 함께 공동 투여하면, 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 내는 상이한 메커니즘을 통해 작동하는 두 개의 항암제를 제공하게 된다. 그러한 공동 투여는, 약물에 대한 저항성의 발달로 인한 문제점 또는 종양 세포가 상기 항체에 비반응적이 되도록 하는, 종양 세포의 항원성에서의 변화로 인한 문제점을 해결할 수 있다.
또한, 표적-특이적 작동자 세포(effector cell), 예를 들어, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 작동자 세포는 치료적 제제로서 사용될 수 있다. 표적화용 작동자 세포는 대식세포, 호중구 또는 단핵구와 같은 인간 백혈구일 수 있다. 다른 세포들은 호산구, 중성 살해 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 함유 세포를 포함한다. 필요시, 작동자 세포는 처리될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 작동자 세포는 생리적으로 허용가능한 용액에서 세포 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108-109 이나, 치료 목적에 따라 다르다. 일반적으로, 그 양은 표적 세포, 예를 들어, CD70을 발현하는 종양 세포에서 국소화되고 그리고 예를 들어, 대식 작용에 의해 세포 살해를 수행하기에 충분할 정도이어야 할 것이다. 또한 투여 경로도 다양화할 수 있다.
표적-특이적 작동자 세포를 이용한 요법은 표적화된 세포를 제거하는 다른 기술과 접합하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용한 항-종양 요법 및/또는 이러한 조성물로 무장한 작동자 세포를 화학요법과 접합하여 사용할 수 있다. 추가적으로, 조합 면역요법을 사용하여 두 개의 구별되는 세포독성 작동자 군이 종양 세포를 격퇴하게 할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-CD70 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합 제제와 접합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어, 세포 표면 상에 있는 수용체를 캡핑하거나 제거함으로써, 작동자 세포 상의 FcγR 또는 FcγR 수준을 조절할 수 있다. 또한 항-Fc 수용체들의 혼합물을 이 목적에 사용할 수 있다.
보체와 결합하는 IgG1, IgG2, 또는 IgG3, 또는 IgM의 부분과 같이, 보체 결합 자리를 가지는, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 또한 보체 존재 하에서 사용할 수 있다. 한 구체예에서, 표적 세포를 포함하는 일 군의 세포를 본 발명의 결합제 및 적절한 작동자 세포를 사용하여 생체외 처리하는 것은, 보체 또는 보체 함유 혈청을 첨가함으로써 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 대식 작용은 보체 단백질의 결합으로 향상될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 또한 보체에 의해 용해될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청이나 보체를 호함하는 조성물이 본 발명의 범위에 속한다. 이러한 조성물들은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자들 바로 가까이에 위치할 때 유리할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체나 혈청은 따로 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 항체 조성물(예, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체)을 포함하는 키트, 및 이의 사용에 대한 설명서가 본 발명의 범위에 속한다. 상기 키트는 하나 이상의 추가적인 시약, 예를 들어, 면역억제제, 세포독성제 또는 방사능독성제, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가적인 인간 항체(예, 상기 제 1 인간 항체와는 구별되는, CD70 항원의 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 가지는 인간 항체)를 더 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료된 환자에 다른 치료적 제제, 예를 들어, 세포독성 또는 방사능독성 제제를 추가로(본 발명의 인간 항체 투여 전에, 동시에, 또는 그 후에) 투여하여, 상기 인간 항체들의 치료 효과를 향상시키거나 증폭할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 대상체를 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 변경하는, 예를 들어, 향상시키거나 억제하는 제제로, 예를 들어, 사이토카인으로 대상체를 처리함으로써 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자로 치료 중 투여될 수 있는 바람직한 사이토카인은 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양괴사인자(TNF)를 포함한다.
또한 본 발명의 조성물(예, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 FcγR 또는 CD70을 발현하는 세포를 표적화하는데, 예를 들어, 그러한 세포를 표지하는데 사용될 수 있다. 그러한 용도를 위하여, 검출될 수 있는 분자와 상기 결합제를 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγR과 같은 Fc 수용체, 또는 CD70을 발현하는 세포를 생체 외에서 또는 시험관 내에서 국소화 시키는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사능 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자(co-factor)일 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 샘플 내에서 CD70 항원의 존재를 검출하는, 또는 CD70 항원의 양을 측정하는 방법을 제공하는데, 이는 상기 항체 또는 이의 결합부와 CD70 사이에 복합체를 형성하도록 허용하는 조건 하에서, 샘플 및 대조군 샘플을, CD70에 특이적으로 결합하는 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합부에, 접촉시키는 것을 포함한다. 그 다음, 복합체의 형성을 검출하는데, 여기에서, 샘플과 대조군 샘플 사이의 복합체 형성 차이는 샘플에서의 CD70 항원 존재를 나타낸다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 면역접합체를 사용하여 화합물(예, 치료적 제제, 표지, 세포독소, 방사능독소, 면역억제제, 등)을 상기 항체에 연결시킴으로써, CD70 세포 표면 수용체를 가지는 세포로 상기 화합물을 표적화할 수 있다. 예를 들면, 항-CD70 항체를 미국 특허 번호 제 6,281,354호 및 제 6,548,530호, 미국 일련번호 제60/991,300호, 미국 특허공개 번호 제20030050331호, 제 20030064984호, 제 20030073852호, 및 제 20040087497호에 기술된 또는 제 WO 03/022806호로 공개된 임의의 세포독소 화합물에 접합시킬 수 있으며, 이들은 본 명세서에 전체가 참고문헌으로서 통합되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CD70을 발현하는 세포를 생체 외에서 또는 생체 내에서 국소화 시키는 방법을 제공한다(예를 들어, 방사능 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자와 같은, 검출가능한 표지를 사용하여). 대안적으로, 상기 면역접합체를 사용하여, 세포독소 또는 방사능독소를 CD70에 표적화함으로써 CD70 세포 표면 수용체를 갖는 세포를 살해할 수 있다.
도 1A는 2H5 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 49) 및 아미노산 서열(서열번호 1)을 보여준다. CDR1(서열번호 13), CDR2(서열번호 19) 및 CDR3(서열번호 25) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도(germline derivations)가 나타나있다.
도 1B는 2H5 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 55) 및 아미노산 서열(서열번호 7)을 보여준다. CDR1(서열번호 31), CDR2(서열번호 37) 및 CDR3(서열번호 43) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 2A는 10B4 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 50) 및 아미노산 서열(서열번호 2)을 보여준다. CDR1(서열번호 14), CDR2(서열번호 20) 및 CDR3(서열번호 26) 영역들이 묘사되어 있고, V, D, 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 2B는 10B4 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 56) 및 아미노산 서열(서열번호 8)을 보여준다. CDR1(서열번호 32), CDR2(서열번호 38) 및 CDR3(서열번호 44) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 3A는 8B5 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 51) 및 아미노산 서열(서열번호 3)을 보여준다. CDR1(서열번호 15), CDR2(서열번호 21) 및 CDR3(서열번호 27) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식 계열 유도가 나타나있다.
도 3B는 8B5 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 57) 및 아미노산 서열(서열번호 9)을 보여준다. CDR1(서열번호 33), CDR2(서열번호 39) 및 CDR3(서열번호 45) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 4A는 18E7 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 52) 및 아미노산 서열(서열번호 4)을 보여준다. CDR1(서열번호 16), CDR2(서열번호 22) 및 CDR3(서열번호 28) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 4B는 18E7 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 58) 및 아미노산 서열(서열번호 10)을 보여준다. CDR1(서열번호 34), CDR2(서열번호 40) 및 CDR3(서열번호 46) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 5A는 69A7 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 53) 및 아미노산 서열(서열번호 5)을 보여준다. CDR1(서열번호 17), CDR2(서열번호 23) 및 CDR3(서열번호 29) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 5B는 69A7 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 59) 및 아미노산 서열(서열번호 11)을 보여준다. CDR1(서열번호 35), CDR2(서열번호 41) 및 CDR3(서열번호 47) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계 열 유도가 나타나있다.
도 6A는 1F4 인간 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 54) 및 아미노산 서열(서열번호 6)을 보여준다. CDR1(서열번호 18), CDR2(서열번호 24) 및 CDR3(서열번호 30) 영역들이 묘사되어 있고, V, D 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 6B는 1F4 인간 단일클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(서열번호 60) 및 아미노산 서열(서열번호 12)을 보여준다. CDR1(서열번호 36), CDR2(서열번호 42) 및 CDR3(서열번호 48) 영역들이 묘사되어 있고, V 및 J 생식계열 유도가 나타나있다.
도 7은 2H5 및 10B4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 VH 3-30.3 아미노산 서열(서열번호 61)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 8은 8B5 및 18E7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 VH 3-33 아미노산 서열(서열번호 62)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 9는 69A7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 VH 4-61 아미노산 서열(서열번호 63)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 10은 1F4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 VH 3-23 아미노산 서열(서열번호 64)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 11은 2H5의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 Vk L6 아미 노산 서열(서열번호 65)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 12는 10B4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 Vk L18 아미노산 서열(서열번호 66)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 13은 8B5 및 18E7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 Vk L15 아미노산 서열(서열번호 67)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 14는 69A7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 Vk L6 아미노산 서열(서열번호 65)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 15는 1F4의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 인간 생식계열 Vk A27 아미노산 서열(서열번호 68)과 정렬시킨 것을 보여준다.
도 16은 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 CD70에 특이적으로 결합하는 것을 증명하는 ELISA 실험 결과를 보여준다.
도 17은 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5가 신장 암종 세포주에 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 18A 및 B는 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 신장 세포 암종(renal cell carcinoma, RCC) 세포주에 농도 의존성 방식으로 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다. (A) 786-O RCC 세포주 (B) A498 RCC 세포주.
도 18C는 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 신장 암종 세포주 786-O에 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 18D는 인간 CD70에 대한 HuMAb 69A7 항체가 신장 세포 암종(RCC) 세포주 786-O에 농도 의존성 방식으로 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 19는 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5가 인간 림프종 세포주에 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 20A 및 B는 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5가 인간 림프종 세포주에 농도 의존성 방식으로 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다. (A) 라지 림프종 세포주 (B) 그란타-519 림프종 세포주.
도 20C는 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 라지 림프종 세포주에 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 20D는 HuMAbs 2H5 및 69A7이 유사한 결합 에피토프를 공유하는 것을 증명하는 경쟁 유세포 분석법의 결과를 보여준다.
도 20E는 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 다우디 림프종 세포주 및 786-O 신장 암종 세포주에 결합하는 것을 증명하는 유세포 분석 실험의 결과를 보여준다.
도 21은 인간 CD70에 대한 인간 단일클론 항체가 CD70+ 세포 내로 내재화할 수 있음을 증명하는 Hum-Zap 내재화 실험의 결과를 보여준다.
도 22A-C는 세포독소-접합 인간 단일클론 항-CD70 항체가 신장 세포 암종(RCC) 세포주를 살해함을 증명하는 세포 증식 분석법의 결과를 보여준다. (A) Caki-2 RCCs (B) 786-O RCCs (C) ACHN RCCs.
도 23A-D는 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 백혈병 및 림프종 세포주를 ADCC 의존성 방식으로 살해함을 증명하는 ADCC 분석법의 결과를 보여준다. (A) ARH-77 백혈병 세포주 (B) HuT 78 림프종 세포주 (C) 라지 림프종 세포주 및 (D) CD70을 발현하지 않는 L-540 세포주.
도 24는 세포독소-접합 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 림프종 세포주를 살해함을 증명하는 세포 증식 분석법의 결과를 보여준다.
도 25A-B는 세포독소-접합 인간 단일클론 항-CD70 항체가 라지 세포에 대하여 세포독성을 나타냄을 증명하는 세포 증식 분석법의 결과를 보여준다. (A) 3시간 세척 및 (B) 연속적인 세척.
도 26A-B는 세포독소-접합 항-CD70 항체 2H5를 이용한 치료가 생체 내에서 신장 세포 암종(RCC) 종양에 직접적인 억제 효과를 나타냄을 증명하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 보여준다. (A) A-498 RCC 종양 (B) ACHN RCC 종양.
도 27A-F는 비푸코실화 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포에서 증가된 세포 독성을 ADCC 의존성 방식으로 가짐을 증명하는 ADCC 분석법의 결과를 보여준다. (A) ARH-77 세포; (B) MEC-1 세포; (C) 항-CD16 항체로 처리한 MEC-1 세포; (D) SU-DHL-6 세포; (E) IM-9 세포; (F) HuT 78 세포.
도 28은 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포를 ADCC 농도-의존성 방식으로 살해함을 증명하는 ADCC 분석법의 결과를 보여준다.
도 29는 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 백혈병 세포를 ADCC 의존성 방식으로 살해하지만, 세포독성은 CD16에 의존함을 증명하는 항체 의존성 세포 독 성(ADCC) 분석법의 결과를 보여준다.
도 30은 인간 단일클론 항-CD70 항체가 인간 활성화 T 세포를 살해하고 그 효과는 항-CD16 항체의 첨가와는 반대임을 증명하는 ACDD 분석법의 결과를 보여준다.
도 31은 일부 인간 단일클론 항-CD70 항체가 CD27에 대한 CD70의 결합을 차단하고 다른 인간 단일클론 항-CD70 항체는 CD27에 대한 CD70의 결합을 차단하지 않음을 증명하는 차단 분석법의 결과를 보여준다.
도 32A-B는 네이키드 항-CD70 항체 2H5를 이용한 치료가 생체 내에서 림프종 종양에 직접적인 억제 효과를 나타냄을 증명하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 보여준다. (A) 라지 종양; (B) ARH-77 종양.
도 33A-C는 세포독소-접합 항-CD70 항체 2H5를 이용한 치료가 생체 내에서 림프종 종양에 직접적인 억제 효과를 나타냄을 증명하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 보여준다. (A) ARH-77 종양; (B) 그란타 519 종양; (C) 라지 종양.
도 34는 항-CD70 항체 69A7이 붉은털원숭이(monkey rhesus) CD70+ B 림프종 세포주에서 발현된 CD70과 교차-경쟁함을 보여주는 연구의 결과를 보여준다.
도 35는 인간 항-CD70 항체가 공지된 마우스 항-인간 CD70 항체의 결합을 차단함을 증명하는 차단 분석법의 결과를 보여준다.
도 36A 및 B는 항-CD70 항체 또는 상기 항체의 비푸코실화 형태 중 하나로 치료한 결과를 보여준다. (A) 항-CD70 항체는 CD70 공동-자극된(co-stimulated) 세포 증식을 용량 의존성 방식으로 억제한다. (B) 항-CD70 항체는 CD70 공동-자극된 IFN-γ 분비를 용량 의존성 방식으로 억제한다.
도 37A-C는 펩티드 자극된 세포에서 항-CD70 항체 또는 상기 항체의 비푸코실화 형태 중 하나로 치료한 결과를 보여준다. (A) 항-CD70 항체는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 증식을 억제한다. (B) 관찰된 전체 세포 생존력(viability)의 유의한 감소는 없었다. (C) 관찰된 전체 CD8+ 세포 수의 유의한 감소는 없었다.
도 38은 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 증식에서 항-CD70 항체의 효과가 항-CD16 항체의 첨가에 의하여 차단됨을 보여준다.
도 39A-B는 세포독소-접합 항-CD70 항체 2H5를 이용한 치료가 생체 내에서 신장 암종 종양에 직접적인 억제 효과를 나타냄을 증명하는 생체 내 마우스 종양 모델 연구의 결과를 보여준다. (A) 786-O 종양; (B) Caki-1 종양.
도 40은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 NOD-SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 면역접합체 항-CD70-N1 및 항-CD70-N2의 생체 내 효능을 보여준다.
도 41은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 면역접합체 항-CD70-N2의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 42는 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 면역접합체 항-CD70-N2의 다양한 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 43은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 면역접합체 항-CD70-N2의 다양한 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 44는 라지 세포 림프종 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 면역접합체 항-CD70-N2의 생체 내 효능을 보여준다.
도 45는 BALB/c 마우스에서 면역접합체 항-CD70-N2의 생체 내 안전성을 보여준다.
도 46A-D는 개에서 약물이 없는 것과 비교하여 면역접합체 항-CD70-N2의 생체 내 안정성을 보여준다.
도 47은 ADCC 분석법의 결과를 보여준다. hIgG1nf Neg Ctrl = 인간 IgG1 NF 음성 대조군 Ab. hIgG1 Neg Ctrl = 인간 IgG1 음성 대조군 Ab. mIgG1 Neg Ctrl = 마우스 IgG1 음성 대조군 Ab (A) 활성화 B 세포에 결합하는 2H5의 FACS 분석법. (B) 활성화 인간 B 세포에서 2H5 NF 및 2H5의 ADCC 분석. (C) 항-CD16 Ab를 첨가한 ADCC 분석법.
도 48은 자극된 인간 PBMC 배양에 자연적으로 존재하는 작동자 세포에 의하여 ADCC를 통해 Ag 활성화된, CD70+ 인간 T 세포의 용해를 매개하는 항-CD70 항체의 능력을 묘사한다.
도 49는 CD70+ 인간 암 세포주 786-0 세포를 천연적으로 발현하는 것에 대하여 항-CD70 항체의 결합 특징을 묘사한다.
도 50은 CD70+ 림프종 세포주 ARH77 상에서 ADCC를 매개하는 푸코실화 및 비푸코실화 항-CD70 항체의 능력을 묘사한다.
도 51은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 52는 A498 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 53은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 54는 라지 세포 림프종 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 55는 다우디 세포 림프종 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 56은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 래트 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 E의 생체 내 효능을 보여준다.
도 57은 BALB/c 마우스에서 항-CD70-세포독소 E의 생체 내 안전성을 보여준다.
도 58은 개에서 항-CD70-세포독소 E의 생체 내 안전성을 보여준다.
도 59는 원숭이에서 항-CD70-세포독소 E의 생체 내 안전성을 보여준다.
도 60은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 F의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 61은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 F의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 62는 라지 세포 림프종 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 F의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 63은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 G의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 64는 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 G의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 65는 A498 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 H의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 66은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 H의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 67은 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 I의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 68은 Caki-1 신장 세포 암종 이종이식 래트 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 I의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 69는 786-O 신장 세포 암종 이종이식 SCID 마우스 모델에서 종양 형성에 대항한 항-CD70-세포독소 J의 1회 복용량의 생체 내 효능을 보여준다.
도 70은 CD70 자극화된 인간 T 세포 증식의 항-CD70 항체 2H5 기능적 차단을 보여준다.
도 71은 세포독소 B의 구조이다.
도 72는 세포독소 C의 구조이다.
도 73은 세포독소 D의 구조이다.
도 74는 세포독소 E의 구조이다.
도 75는 세포독소 F의 구조이다.
도 76은 세포독소 G의 구조이다.
도 77은 세포독소 H의 구조이다.
도 78은 세포독소 I의 구조이다.
도 79는 세포독소 J의 구조이다.
본 발명은 하기 실시예들에 의해 더 자세히 설명될 것이고, 이는 본 발명을 더 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서 전체에서 인용된 모든 도면 및 모든 참조물, 진뱅크 서열, 특허 및 공개된 특허 출원서의 내용은 참조문헌으로서 본 명세서에 명백히 병합된다.
실시예 1 . CD 70에 대항하여 인간 단일클론 항체의 생성
항원
면역화 프로토콜은 이중 myc-His 태그와 융합된 재조합 인간 CD70을 항원으로서 사용하였다. 대안적으로, 신장 암종 세포주 786-O(ATCC 기탁번호 CRL-1932)를 사용하고 신장 암종 세포주 A-498(ATCC 기탁번호 HTB-44)로 부스팅한(boosted) 온전한 세포 면역화를 일부 면역화에서 사용하였다.
트랜스유전자성 HuMAb 마우스 ® 및 KM 마우스 ®
CD70에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 각각 인간 항체 유전자를 발현하는 HuMab 트랜스유전자성 마우스의 HCo7, HCo12 및 HCo17 품종(strain) 및 트랜스유전 자성 트랜스염색체성 마우스의 KM 품종(strain)을 사용하여 제조하였다. 이 마우스 품종에서, 내인성 마우스 카파 경쇄 유전자를 Chen 등 (1993) EMBO J. 12:811-820에 기술된 바와 같이 동형접합적으로(homozygously) 분쇄시켰으며, 내인성 마우스 중쇄 유전자를 PCT 공개 제 WO 01/09187호의 실시예 1에 기술된 바와 같이 동형접합적으로 분쇄시켰다. 또한 이러한 마우스 품종은 Fishwild 등 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851에 기술된 바와 같이, 인간 카파 경쇄 트랜스유전자 KCo5 및 PCT 공개 제WO 01/09187호의 실시예 2에 기술된 바와 같이 인간 중쇄 트랜스유전자 HCo7, HCo12 또는 HCo17을 지닌다. 상기 KM 마우스® 품종은 PCT 공개 제WO 02/43478호에 기술된 바와 같이, SC20 트랜스염색체를 포함한다.
HuMab 및 KM 면역화:
CD70에 대한 완전 인간 단일클론 항체를 생성하기 위하여, HuMAb 마우스® 및 KM 마우스®의 마우스를 항원으로서 재조합 인간 CD70 또는 세포 표면 상에 CD70을 발현하는 온전한 세포로 면역화시켰다. HuMAb 마우스에 대한 일반적인 면역화 체계는 Lonberg, N. 등 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. 등 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 및 PCT 공개 제WO 98/24884호에 기술되어 있다. 마우스는 항원의 첫 주입시 6-16 주령이었다. 5-10x106 세포를 사용하여 복강내(IP)로, 피하(Sc)로 또는 발바닥 주입(footpad injection)을 통하여 HuMab 마우스를 면역화시켰다.
트랜스유전자성 마우스를 완전 프로인트 보조제(Freund’s adjuvant) 또는 리비 보조제(Ribi adjuvant) 내의 항원으로 2 회 IP 면역화시켰고, 이어서 불완전 프로인트 보조제 또는 리비 보조제 중의 항원으로 3-21일 IP 면역화시켰다(총 11 회까지의 면역화). 면역 반응을 안와후 출혈(retroorbital bleeds)에 의하여 모니터하였다. 혈장을 ELISA 및 FACS(하기에서 기술됨)로 스크리닝하였으며, 충분한 역가의 항-CD70 인간 면역글로불린을 갖는 마우스를 융합을 위하여 사용하였다. 마우스를 희생시켜 비장을 제거하기 3일 전에 항원으로 정맥내로 부스팅하였다. 일반적으로 각 항원에 대한 10-35 융합을 실시하였다. 수개 다스(dozen)의 마우스를 각 항원에 대하여 면역화시켰다.
항-CD70 항체를 생산하는 HuMAb 마우스 ® 또는 KM 마우스 ® 의 선택:
CD70에 결합하는 항체를 생산하는 HuMAb 마우스® 또는 KM 마우스®를 선택하기 위하여, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 재조합 인간 CD70을 발현하는 세포주에 결합하지만, CD70을 발현하지 않는 대조구 세포주에는 결합하지 않는 것에 대하여 유세포 분석기로 스크리닝하였다. 그에 더하여, 상기 혈청을 786-O 또는 A-498 세포에 결합하는 것에 대하여 유세포 분석기로 스크리닝하였다. 간략하게, 1:20 희석물에서 CD70-발현 CHO 세포, 786-O 세포 또는 A498 세포를 항-CD70 항체와 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하 였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 또한 CHO 세포를 발현하는 CD70에 결합하지만 부모 CHO 세포를 발현하는 비-CD70에는 결합하지 않는 항체를 Fishwild, D. 등 (1996)에 의하여 기술된 바와 같이, ELISA에 의해서 CD70에 결합하는 것에 대하여 테스트하였다. 간략하게, 미세역가 플레이트를 PBS 중 1-2 ㎍/ml 의 형질감염된 CHO 세포에서 얻은 정제된 재조합 CD70 융합 단백질로 코팅하고, 100 ㎕/웰을 4℃에서 밤새 배양한 다음에, PBS/Tween(0.05%) 중 5% 닭 혈청의 200 ㎕/웰로 차단하였다. CD70-면역화 마우스로부터 얻은 혈청의 희석물을 각 웰에 첨가하고 주변 온도에서 1-2 시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 다음 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase, HRP)에 접합된 염소-항-인간 IgG 다중클론 항체와 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척한 후에, 플레이트를 ABTS 기질(Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml)로 전개시키고, OD 415-495에서 분광광도계로 분석하였다. 최고 역가의 항-CD70 항체를 전개했던 마우스를 융합을 위해서 사용하였다. 융합을 하기 기술하는 바와 같이 실시하였으며 하이브리도마 상청액을 ELISA로 항-CD70 활성에 대하여 테스트하였다.
CD70에 대한 인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성:
HuMAb 마우스® 및/또는 KM 마우스®로부터 분리된 마우스 비장세포를, 표준 프로토콜에 기반하는 PEG 또는 사이토펄스(Cyto Pulse) 거대 챔버 세포 융합 전기 천공기(Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD)를 사용하는 전기장 기반 전기융합을 사용하여, 마우스 골수종 세포주에 융합시켰다. 그리고나서 그 결과의 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산을 위하여 스크리닝하였다. 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50% PEG(Sigma)와 함께 SP2/0 비분비성 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)의 수의 1/4에 융합시켰다. 세포를 편평바닥 미세역가 플레이트(flat bottom microtiter plate)에서 약 1x105/웰로 도말하고, 이어서 L-글루타민 및 소듐 피루베이트를 포함하고 10% 소 태아 혈청(Hyclone, Logan, UT), 18% P388DI 조건배지, 5% 오리겐 하이브리도마 클로닝 인자(BioVeris, Gaithersburg, VA), 4 mM L-글루타민, 5mM HEPES, 0.055 mM β-메르캅토에탄올, 50 units/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신 및 1X 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘(Hypoxanthine-aminopterin-thymidine, HAT) 배지(Sigma; HAT는 융합 후 24 시간에 첨가)를 더 포함한 DMEM 고농도 글루코스 배지에서 1주일 배양하였다. 1주일 후, 세포를 HAT가 HT로 치환된 배지에서 배양하였다. 그 다음, 개별 웰을 인간 항-CD70 단일클론 IgG 항체들에 대하여 FACS 또는 ELISA(상기 기술함)로 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14 일 후에 배지를 모니터하였다. 항체-분비 하이브리도마를 재도말하고, 다시 스크리닝하고 나서, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면, 항-CD70 단일클론 항체들을 제한 희석법으로 적어도 두 번 서브클론화였다. 그 다음 안정된 서브클론들을 시험관 내에서 배양하여 특성화용 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 생성할 수 있다.
하이브리도마 클론 2H5, 10B4, 8B5, 18E7 및 69A7을 추가 분석을 위하여 선택하였다.
실시예 2 . 인간 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7 및 1F4의 구조적 특성화
2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7 및 1F4 단일클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 cDNA 서열을 표준 PCR 기술을 이용하여 각각 2H5, 10B4, 8B5, 18E7, 69A7 및 1F4 하이브리도마로부터 수득하였으며 표준 DNA 서열화 기술을 이용하여 서열화하였다.
2H5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 1A 및 서열번호 49 및 1에 각각 나타나 있다.
2H5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 1B 및 서열번호 55 및 7에 각각 나타나 있다.
2H5 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 2H5 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터의 VH 분절, 미확인된 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 3-30.3 서열에 대한 2H5 VH 서열의 정렬이 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 2H5 VH 서열을 추가 분석하여 도 1A 및 7, 및 서열번호 13, 19 및 25에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역 을 묘사하였다.
2H5 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 2H5 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터의 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK L6 서열에 대한 2H5 VL 서열의 정렬이 도 11에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 2H5 VL 서열을 추가 분석하여 도 1B 및 11, 및 서열번호 31, 37, 및 43에서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
10B4의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 2A 및 서열번호 50 및 2에 각각 나타나 있다.
10B4의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 2B 및 서열번호 56 및 8에 각각 나타나 있다.
10B4 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 10B4 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-30.3으로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 4-11로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 3-30.3 서열에 대한 10B4 VH 서열의 정렬이 도 7에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 10B4 VH 서열을 추가 분석하여 도 2A 및 7, 및 서열번호 14, 20, 및 26에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
10B4 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 10B4 경쇄가 인간 생식계열 VK L18로부터의 VL 분절 및 인간 생식계 열 JK 3으로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK L18 서열에 대한 10B4 VL 서열의 정렬이 도 12에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 10B4 VL 서열을 추가 분석하여 도 2B 및 12, 및 서열번호 32, 38, 및 44에서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
8B5의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 3A 및 서열번호 51 및 3에 각각 나타나 있다.
8B5의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 3B 및 서열번호 57 및 9에 각각 나타나 있다.
8B5 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 8B5 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-33으로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 3-33 서열에 대한 8B5 VH 서열의 정렬이 도 8에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 8B5 VH 서열을 추가 분석하여 도 3A 및 8, 및 서열번호 15, 21, 및 27에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
8B5 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 8B5 경쇄가 인간 생식계열 VK L15로부터의 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK L15 서열에 대한 8B5 VL 서열의 정렬이 도 13에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 8B5 VL 서열을 추가 분석하여 도 3B 및 13, 및 서열번호 33, 39, 및 45에 서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
18E7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 4A 및 서열번호 52 및 4에 각각 나타나 있다.
18E7의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 4B 및 서열번호 58 및 10에 각각 나타나 있다.
18E7 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 18E7 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-33으로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 3-10으로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 3-33 서열에 대한 18E7 VH 서열의 정렬이 도 8에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 18E7 VH 서열을 추가 분석하여 도 4A 및 8, 및 서열번호 16, 22, 및 28에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
18E7 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 18E7 경쇄가 인간 생식계열 VK L15로부터의 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK L15 서열에 대한 18E7 VL 서열의 정렬이 도 13에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 18E7 VL 서열을 추가 분석하여 도 4B 및 13, 및 서열번호 34, 40, 및 46에서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
69A7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 5A 및 서열 번호 53 및 5에 각각 나타나 있다.
69A7의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 5B 및 서열번호 59 및 11에 각각 나타나 있다.
69A7 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 69A7 중쇄가 인간 생식계열 VH 4-61로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 4-23으로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 4-61 서열에 대한 69A7 VH 서열의 정렬이 도 9에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 69A7 VH 서열을 추가 분석하여 도 5A 및 9, 및 서열번호 17, 23, 및 29에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
69A7 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 69A7 경쇄가 인간 생식계열 VK L6으로부터의 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 4로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK L6 서열에 대한 69A7 VL 서열의 정렬이 도 14에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 69A7 VL 서열을 추가 분석하여 도 5B 및 14, 및 서열번호 35, 41, 및 47에서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
1F4의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 5A 및 서열번호 54 및 6에 각각 나타나 있다.
1F4의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열들이 도 5B 및 서열 번호 60 및 12에 각각 나타나 있다.
1F4 중쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 중쇄 서열과 비교하여 1F4 중쇄가 인간 생식계열 VH 3-23으로부터의 VH 분절, 인간 생식계열 4-4로부터의 D 분절 및 인간 생식계열 JH 4b로부터의 JH 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VH 3-23 서열에 대한 1F4 VH 서열의 정렬이 도 10에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 1F4 VH 서열을 추가 분석하여 도 5A 및 10, 및 서열번호 18, 24, 및 30에서 각각 나타낸 바와 같이 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
1F4 경쇄 면역글로불린 서열을 공지의 인간 생식계열 면역글로불린 경쇄 서열과 비교하여 1F4 경쇄가 인간 생식계열 VK A27로부터의 VL 분절 및 인간 생식계열 JK 2로부터의 JK 분절을 이용한다는 것을 입증하였다. 생식계열 VK A27 서열에 대한 1F4 VL 서열의 정렬이 도 15에 나타나 있다. CDR 영역 결정의 카밧 시스템을 이용하여 1F4 VL 서열을 추가 분석하여 도 5B 및 15, 및 서열번호 36, 42, 및 48에서 각각 나타낸 바와 같이 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역을 묘사하였다.
실시예 3 . 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합 특이성의 특성화
면역정제된 CD70에 결합시 항-CD70 항체의 비교를 표준 ELISA에 의하여 실시하여 CD70에 대한 결합의 특이성을 시험하였다.
재조합 myc-태그 CD70을 플레이트 상에 밤새 코팅하였고, 그 다음 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5, 및 18E7에 대항한 결합에 대하여 테스트하였 다. 표준 ELISA 과정을 실시하였다. 항-CD70 인간 단일클론 항체를 1 ㎍/ml의 농도로 첨가하였고 1:2 계열 희석으로 하향 적정하였다. 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG(Fc 또는 카파 사슬-특이적) 다중클론 항체를 제 2 항체로서 사용하였다. 그 결과는 도 16에 나타내었다. 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5, 10B4, 8B5 및 18E7은 CD70에 고특이성으로 결합하였다.
실시예 4 . 신장 암 암종 세포주의 표면 상에 발현된 CD70에 결합하는 항-CD70 항체의 특성화
항-CD70 항체를 세포 표면 상에 CD70을 발현하는 신장 세포 암종 세포에 결합하는 것에 대하여 유세포 분석기로 테스트하였다.
신장 세포 암종 세포주 A-498(ATCC 기탁번호 HTB-44), 786-O(ATCC 기탁번호 CRL-1932), ACHN(ATCC 기탁번호 CRL-1611), Caki-1(ATCC 기탁번호 HTB-46) 및 Caki-2(ATCC 기탁번호 HTB-47)를 항체 결합에 대하여 각각 테스트하였다. HuMAb 2H5 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 1 ㎍/ml의 농도에서 2H5와 1x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 17에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 2H5는 신장 암종 세포주 A-498, 786-O, ACHN, Caki-1 및 Caki-2에 결합하 였다.
신장 세포 암종 세포주 786-O 및 A-498을 HuMAb 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7의 결합에 대하여 다른 농도에서 테스트하였다. 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 50 ㎍/ml의 개시 농도에서 항체와 5x105 세포를 배양하고 연속적으로 1:3 희석으로 항체를 희석함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 18A(786-O) 및 도 18B(A-498)에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 신장 암종 세포주 786-O 및 A-498에 농도 의존성 방식으로 결합하였다. 항-CD70 단일클론 항체에 대한 EC50 값은 786-O 세포주에 대하여 1.844 nM 내지 6.669 nM, A-498 세포주에 대하여 3.984 nM 내지 11.84 nM의 범위에 있었다.
HuMAb 2H5 및 69A7 항-CD70 인간 단일클론 항체의 신장 세포 암종 세포주 786-O에 대한 결합을 10 ㎍/ml의 농도에서 2H5 또는 69A7와 2x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 18C에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체들 둘 다 신장 암종 세 포주 786-O에 결합하였다.
신장 세포 암종 세포주 786-O을 HuMAb 항-CD70 인간 단일클론 항체 69A7의 결합에 대하여 다른 농도에서 테스트하였다. 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 10 ㎍/ml의 개시 농도에서 항체와 5x105 세포를 배양하고 연속적으로 1:3 희석으로 항체를 희석함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 18D에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 69A7은 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 신장 암종 세포주 786-O에 농도 의존성 방식으로 결합하였다. 786-O 세포에 결합하는 항-CD70 단일클론 항체 69A7에 대한 EC50 값은 6.927 nM이었다.
이들 데이터는 항-CD70 HuMAbs가 신장 세포 암종 세포주에 결합한다는 것을 증명한다.
실시예 5 . 림프종 세포주의 표면 상에 발현된 CD70에 결합하는 항-CD70 항체의 특성화
항-CD70 항체를 세포 표면 상에 CD70을 발현하는 림프종 세포에 결합하는 것에 대하여 유세포 분석기로 테스트하였다.
림프종 세포주 다우디(ATCC 기탁번호 CCL-213), HuT 78(ATCC 기탁번호 TIB- 161) 및 라지(ATCC 기탁번호 CCL-86)를 항체 결합에 대하여 각각 테스트하였다. HuMAb 2H5 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 1 ㎍/ml의 농도에서 2H5와 1x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 주르카트(Jurkat) 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 19에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 2H5는 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 림프종 세포주 다우디, HuT 78 및 라지에 결합하였다.
림프종 세포주 라지 및 그란타 519(DSMZ 기탁번호 342)를 HuMAb 항-CD70 인간 단일클론 항체 2H5의 결합에 대하여 다양한 농도에서 테스트하였다. 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 50 ㎍/ml의 개시 농도에서 항체와 5x105 세포를 배양하고 연속적으로 1:3 희석으로 항체를 희석함으로써 평가하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 세척하였고 결합을 PE-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 20A(라지) 및 20B(그란타 519)에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 2H5는 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 림프종 세포주 라지 및 그란타 519에 농도 의존성 방식으로 결합하였다. 항-CD70 항체에 대한 EC50 값은 라 지 세포에 대하여 1.332 nM이고 그란타 519 세포에 대하여 1.330 nM이었다.
HuMAbs 2H5 및 69A7 항-CD70 인간 단일클론 항체의 라지 림프종 세포주에 대한 결합을 10 ㎍/ml의 농도에서 HuMAb와 2x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 이소타입 대조군 항체 및 제 2 항체를 단독으로 음성 대조군으로서 사용하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 20C에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체들 둘 다 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 라지 림프종 세포주에 결합하였다.
경쟁 FACS 분석법을 실시하여 2H5에 대항한 69A7의 결합 특이성을 설명하였다. 라지 세포는 10 ㎍/ml의 농도에서 네이키드 69A7, 2H5, 이소타입 대조군 항체와 함께 또는 항체없이 배양하였다. 세척한 후, 세포를 10 ㎍/ml의 농도에서 FITC-접합 69A7와 배양하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 20D에 나타내었다. 2H5 및 69A7 둘 다 유사한 결합 에피토프를 공유하는 것으로 나타나, 항-CD70 항체 69A7 및 2H5 둘 다 FITC-표지 69A7의 결합을 차단하였다.
다우디 림프종 세포주 및 786-O 신장 암종 세포를 항체 결합에 대하여 더 테스트하였다. HuMAb 69A7 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 1 ㎍/ml의 농도에서 69A7와 2x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하였고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 주르카트(Jurkat) 세포주를 음성 대조군으로서 사용하였다. 유세포 분석법은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 20E에 나타내었다. 항-CD70 단일클론 항체 69A7은 염색의 평균 형광 강도(mean fluorescent intensity, MFI)로 측정된 바와 같이, 다우디 림프종 세포주 및 786-O 신장 암종 세포주에 결합하였다.
이들 데이터는 항-CD70 HuMAbs가 림프종 세포주에 결합한다는 것을 증명한다.
실시예 6 . 항-CD70 단일클론 항체의 결합 친화도의 스캐챠드(Scatchard) 분석
2H5, 8B5, 10B4 및 18E7 단일클론 항체의 결합 친화도를 스캐챠드 분석을 이용하여 CD70 형질감염된 CHO 세포주에 대한 결합 친화도에 대하여 테스트하였다.
CHO 세포를 표준 기술을 사용하여 전장 CD70으로 형질감염시키고, 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 함유한 RPMI 내에서 성장시켰다. 세포를 트립신화하였고, Tris 기반 결합 버퍼(24mM Tris pH 7.2, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)에서 한번 세척하였으며, 상기 세포를 결합 버퍼 내에서 2x106 세포/ml로 조정하였다. 밀리포어 플레이트(Millipore plate)(MAFB NOB)를 물 중 1% 탈지 분유로 코팅하고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 상 기 플레이트를 0.2ml의 결합 버퍼로 세 번 세척하였다. 50 마이크로리터의 버퍼를 단독으로 최대 결합 웰(전체 결합)에 첨가하였다. 25 마이크로리터의 버퍼를 단독으로 대조군 웰(비-특이적 결합)에 첨가하였다. 다양한 농도의 125I-항-CD70 항체를 25㎕의 양으로 모든 웰에 첨가하였다. 100 배 과량으로 다양한 농도의 비표지 항체를 대조군 웰에 25㎕의 양으로 첨가하였고 결합 버퍼 내의 CD70 형질감염된 CHO 세포(2 X 106 세포/ml) 25㎕를 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 4℃ 진탕기 상에서 2 시간 동안 200 RPM에서 배양하였다. 배양의 완료 시에 밀리포어 플레이트를 0.2 ml의 냉 세척 버퍼(24mM Tris pH 7.2, 500mM NaCl, 2.7mN KCl, 2mM 글루코스, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 0.1% BSA)로 세 번 세척하였다. 필터를 제거하고 감마 계수기로 계수하였다. 평형 결합(equilibrium binding)의 평가를 프리즘 소프트웨어(Prism software)(San Diego, CA)로 단일 부위 결합 파라미터를 사용하여 실시하였다.
상기의 스캐챠드 결합 분석(scatchard binding assay)을 이용하여, CD70 형질감염된 CHO 세포에 대한 항체의 KD는 대략 2H5에 대하여 2.1nM, 8B5에 대하여 5.1nM, 10B4에 대하여 1.6nM, 18E7에 대하여 1.5nM이었다.
실시예 7 . 항-CD70 단일클론 항체의 내재화
Hum-Zap 내재화 분석법을 이용하여, CD70-발현 신장 암종 세포 내로 내재화하는 능력에 대하여 항-CD70 HuMAbs를 테스트하였다. Hum-Zap은 세포독소 사포린에 접합된 인간 IgG에 대한 친화성을 갖는 제 2 항체의 결합을 통하여 제 1 인간 항체의 내재화에 대하여 테스트한다.
CD70-발현 신장 암종 암 세포주 786-O를 밤새 100 ㎕ 웰 내에 1.25x104 세포/웰로 접종하였다. 항-CD70 HuMAb 항체 2H5, 8B5, 10B4 또는 18E7을 30 nM의 개시 농도로 웰에 첨가하였고, 1:3 계열 희석으로 하향 적정하였다. CD70에 비특이적인 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. Hum-Zap(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25)을 11 nM의 농도로 첨가하였고, 플레이트를 72 시간 동안 배양하였다. 이 후, 플레이트를 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 24 시간 동안 펄스하고(pulse), 수확하여 탑 카운트 신틸레이션 계수기(Top Count Scintillation Counter)(Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독하였다. 그 결과는 도 21에 나타내었다. 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 CD70-발현 786-O 신장 암종 암 세포에서 3H-티미딘 혼입의 항체 농도 의존성 감소를 보여주었다. 항-CD70 항체 2H5에 대한 EC50 값은 0.9 nM이었다. 이 데이터는 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7이 신장 암종 암 세포주 내로 내재화한다는 것을 증명한다.
실시예 8 . 신장 세포 암종 세포주 상에서 세포독소-접합 항-CD70 항체의 세포 살해의 평가
이 실시예에서, 세포 증식 분석법(cell proliferation assay)으로 CD70+ 신 장 세포 암종 세포주를 살해하는 능력에 대하여 세포독소 D(도 73)에 접합된 항-CD70 단일클론 항체를 테스트하였다. 세포독소 D는 에스테라제 활성을 필요로 하는 전구약물이다.
항-CD70 HuMAb 항체 2H5, 8B5, 10B4 또는 18E7을 펩티딜, 하이드라존 또는 디설파이드 링커와 같은 링커를 통하여, 세포독소 D에 접합하였다. 3시간 동안 100㎕ 웰에 CD70-발현 신장 암종 암 세포주 ACHN 및 Caki-2를 2.5x104 세포/웰로 접종하였고 CD70-발현 신장 암종 암 세포주 786-O을 1.25x104 세포/웰로 접종하였다. 항-CD70 항체-세포독소 접합체를 30 nM의 개시 농도로 웰에 첨가하였고, 1:3 계열 희석으로 하향 적정하였다. CD70에 비특이적인 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 69 시간 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 1.0 μCi의 3H-티미딘으로 24 시간 동안 펄스하고, 수확하여 탑 카운트 신틸레이션 계수기(Top Count Scintillation Counter)(Packard Instruments, Meriden, CT)에서 판독하였다. 그 결과는 도 22A(Caki-2), 22B(786-O) 및 22C(ACHN)에 나타내었다. 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7은 CD70-발현 Caki-2, 786-O 및 ACHN 신장 암종 암 세포에서 3H-티미딘 혼입의 항체-세포독소 농도 의존성 감소를 나타내었다. 항-CD70 항체에 대한 EC50 값은 CAKI-2세포에서 6 nM 내지 76 nM, 786-O 세포에 대하여 1.6 nM 내지 3.9 nM, ACHN 세포에 대하여 9 nM 내지 108 nM 범위에 있었다. 이 데이터는 항-CD70 항체 2H5, 8B5, 10B4 및 18E7이 세포독소에 접합될 때 신장 암종 암 세포에 대하여 세포독성이라는 것을 증명한다.
실시예 9 : 항-CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 항-CD70 단일클론 항체를 형광 세포독성 분석에서 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 통하여 작동자 세포(effector cells)의 존재 하에서 CD70+ 세포주를 살해하는 능력에 대해서 테스트하였다.
인간 작동자 세포를 하기와 같이 전혈로부터 제조하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포를 헤파린처리된 전혈로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리에 의하여 정제하였다. 세포를 10% FBS 및 200 U/ml의 인간 IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지 내에 재현탁하였고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하여 배양 배지 내에서 네 번 세척하였고, 2 x 107 세포/ml로 재현탁하였다. 표적 CD70+ 세포를 1 x 106 표적세포/mL 당 2.5 ㎕의 BATDA로 BATDA 시약(Perkin Elmer, Wellesley, MA)과 함께 37℃에서 20 분 동안 배양하였다. 표적 세포를 4 회 세척하고, 스핀 다운시키며, 1x105 세포/ml 의 최종 부피로 하였다.
CD70+ 세포주 ARH-77(인간 B 림프모세포성 백혈병; ATCC 기탁번호 CRL-1621), HuT 78(인간 피부 림프구 림프종; ATCC 기탁번호 TIB-161), 라지(인간 B 림프구 버킷림프종; ATCC 기탁번호 CCL-86) 및 음성 대조군 세포주 L540(인간 호지킨 림프종; DSMZ 기탁번호 ACC 72)을 하기와 같이 델피아(Delfia) 형광 방출 분석을 사용하여 인간 항-CD70 단일클론 항체에 대한 항체 특이적 ADCC에 대해서 테스트하 였다. 각각의 표적 세포주(100 ㎕의 표지된 표적 세포)를 작동자 세포 50 ㎕ 및 항체 50 ㎕와 함께 배양하였다. 1:50의 표적 대 작동자 비를 실험 전체에 걸쳐서 사용하였다. 모든 연구에서, 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 2000 rpm 펄스 스핀 및 37℃에서의 1 시간 배양 후에, 상청액을 수집하고, 다시 빠르게 회전시키며, 20 ㎕의 의 상청액을 편평 바닥 플레이트로 옮기고, 여기에 180 ㎕의 Eu 용액(Perkin Elmer, Wellesley, MA)을 첨가하고 RubyStar 판독기(BMG Labtech)에서 판독하였다. % 용해율을 하기와 같이 계산하였다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기에서 자발적 방출은 표적 세포만을 포함한 웰로부터의 형광이고, 최대 방출은 표적 세포를 포함한 웰로부터의 형광이며, 2% 트리톤-X(Triton-X)로 처리하였다. ARH-77, HuT 78, 라지 및 L-540 세포주에 대한 세포의 세포독성 % 용해율은 도 23A-D에 각각 나타나 있다. CD70+를 발현하는 세포주 ARH-77, HuT 78 및 라지 각각은 항체가 HuMAb 항-CD70 항체 2H5 및 18E7와 세포독성을 매개하지만, 반면 음성 대조군 세포주 L-540은 항-CD70 항체의 존재시 뚜렷한 세포 독성을 가지지 않는다는 것을 나타내었다. 이 데이터는 HuMAb 항-CD70 항체가 CD70+를 발현하는 세포에 대하여 특이적 세포독성 나타낸다는 것을 증명한다.
실시예 10 . 인간 림프종 세포주 상에서 세포독소-접합 항-CD70 항체의 세포 살해의 평가
이 실시예에서, 세포 증식 분석법(cell proliferation assay)으로 CD70+ 인 간 림프종 세포주를 살해하는 능력에 대하여 세포독소 C(도 72)에 접합된 항-CD70 단일클론 항체 2H5를 테스트하였다. 세포독소 C는 에스테라제 활성을 필요로 하는 전구약물이다.
항-CD70 HuMAb 항체 2H5를 펩티딜, 하이드라존 또는 디설파이드 링커와 같은 링커를 통하여, 세포독소 C에 접합하였다. 본 발명의 항체에 접합할 수 있는 세포독소 화합물의 예들은 2005년 9월 26일자로 출원된 미국 일련변호 제60/720,499호와 동시에 제출된 출원 및 2006년 9월 26일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO 07/038658호에 기재되어 있으며, 이들 내용은 전체적으로 본 명세서 상에 참조로서 통합되어 있다. 3시간 동안 100㎕ 웰에 CD70-발현 인간 림프종 암 세포주 다우디, HuT 78, 그란타 519 및 라지를 105 세포/웰로 접종하였다. 항-CD70 항체-세포독소 접합체를 30 nM의 개시 농도로 웰에 첨가하였고, 1:2 계열 희석으로 하향 적정하였다. 또한 HuMAb 항체 2H5-세포독소 접합체를 세포 표면 상에 CD70을 발현하지 않는 음성 대조군 세포주인, 주르카트(Jurkat) 세포주 상에서 테스트하였다. 플레이트를 72 시간 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 배양 종료 전에 0.5 μCi의 3H-티미딘으로 8 시간 동안 펄스하고, 수확하여 탑 카운트 신틸레이션 계수기(Top Count Scintillation Counter)(Packard Instruments)에서 판독하였다. 도 24는 다우디, HuT 78, 그란타 519 및 주르카드 세포 상에서 2H5-접합체의 영향을 나타내었다. 항-CD70 항체 2H5는 CD70-발현 다우디, HuT 78 및 그란타 519 B-세포 림프종 암 세포에서 3H-티미딘 혼입의 항체-세포독소 농도 의존성 감소를 나타내었지만, 주르카트 세포에서는 그렇지 않았다.
별개의 분석에서, 3시간 동안 100㎕ 웰에 CD70-발현 인간 림프종 암 세포주 라지를 104 세포/웰로 접종하였다. 항-CD70 항체-세포독소 접합체를 30 nM의 개시 농도로 웰에 첨가하였고, 1:3 계열 희석으로 하향 적정하였다. 세포독소-접합체 이소타입 대조군 항체를 대조군으로서 사용하였다. 플레이트를 3시간 동안 세척 또는 연속적으로 세척하면서 72 시간 동안 배양하였다. 그 다음 플레이트를 배양 종료 전에 0.5 μCi의 3H-티미딘으로 8 시간 동안 펄스하고, 수확하여 탑 카운트 신틸레이션 계수기(Top Count Scintillation Counter)(Packard Instruments)에서 판독하였다. 도 25A 및 25B는 각각 3 시간 동안 세척하면서 또는 연속적으로 세척한 라지 세포 상에서의 3H-티미딘 혼입의 항체-세포독소 농도 의존성 감소를 나타내었다.
이 데이터는 세포독소에 접합된 항-CD70 항체가 인간 림프종 암 세포에 대하여 특이적인 세포독성을 나타낸다는 것을 증명한다.
실시예 11 . 네이키드 및 세포독소-접합 항-CD70 항체를 이용한 생체 내 종양 이종이식 모델(xenograft model)의 치료
신장 세포 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
A-498(ATCC 기탁번호 HTB-44) 및 ACHN (ATCC 기탁번호 CRL-1611) 세포를 표준 실험실 공정을 이용하여 시험관 내에서 확장시켰다. 6-8 주령의 수컷 Ncr 무흉 선 누드 마우스(athymic nude mice)(Taconic, Hudson, NY)에 마우스당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel) (1:1) 중 7.5 x106 ACHN 또는 A-498 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스의 체중을 재고, 이식 후에 매주 2 회 전자 캘리퍼를 이용하여 삼차원적으로 종양에 대해서 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이로 계산하였다. 평균 270 mm3의 ACHN 종양 또는 평균 110 mm3의 A498 종양을 갖는 마우스를 치료 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 제0일에 PBS 비이클, 세포독소-접합 이소타입 대조군 항체 또는 세포독소-접합 항-CD70 HuMAb 2H5를 복강내로 투여하였다. 본 발명의 항체와 접합될 수 있는 세포독소 화합물의 예는 미국 가출원 일련번호 제60/720,499호 및 2006년 9월 26일에 출원된 PCT 공개번호 제WO 07/038658호에 기술되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. A-498 샘플 그룹에서 마우스는 세 가지 다른 세포독소 화합물(세포독소 A(N1), 세포독소 B(도 71), 및 세포독소 C(도 72))로 테스트하였다. 투여 후 60일 동안 종양 성장에 대하여 마우스를 모니터하였다. 종양이 종양 종말점(2000 mm3)에 이를 때 마우스를 안락사시켰다.
그 결과는 도 26A(A-498 종양) 및 26B(ACHN 종양)에 나타내었다. 세포독소와 접합된 항-CD70 항체 2H5는 종양 종말점 부피(2000 mm3)에 도달하는 평균 시간을 연장시켰으며, 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체-세포독소 접합체로 치료하는 것은 종양 성장에 대한 직접적인 생체 내 억제 효과를 가진다.
실시예 12 . 2H5와의 면역조직화학
면역조직화학으로 CD70을 인식하는 항-CD70 HuMAb 2H5의 능력을 투명세포 신장 세포 암종(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC), 림프종 및 교모세포종 환자로부터 임상 생체검사를 이용하여 시험하였다.
면역조직화학에 대하여, 5 ㎛ 동결 절편(frozen section)을 사용하였다(Ardais Inc, USA). 30분 건조한 후, 절편을 아세톤으로 고정시키고(실온에서 10분 동안) 5분 동안 공기-건조시켰다. 슬라이드를 PBS에서 헹구었고 그 다음 PBS 에서 20분 동안 10% 정상 염소 혈청과 예비-배양하였으며 이어서 PBS에서 10 ㎍/ml fitc화된 2H5를 10% 정상 염소 혈청과 30분 동안 실온에서 배양하였다. 그 다음, 슬라이드를 PBS로 세 번 세척하였고 마우스 항-FITC(10㎍/ml DAKO)와 실온에서 30분 동안 배양하였다. 슬라이드를 다시 PBS로 세척하였고 염소 항-마우스 HRP 접합체(DAKO)와 30분 동안 실온에서 배양하였다. 슬라이드를 다시 PBS로 3회 세척하였다. 다이아미노벤지딘(Sigma)을 기질로서 사용하였고, 그 결과 갈색으로 염색되었다. 증류수로 세척한 후에, 슬라이드를 헤마톡실린으로 1분 동안 대비염색(counter-stain)하였다. 이어서, 슬라이드를 흐르는 증류수에서 10초 동안 세척하였고 글리세르겔(glycergel)(DAKO)에서 고정시켰다. 임상 생체검사 면역조직화학적 염색은 비-호지킨 림프종, 형질세포종(plasmacytoma), ccRcc 및 교모세포종(glioblastoma) 절편에서 양성 염색을 나타내었다. 각각의 경우에 있어서 오직 악성 세포만 양성이었고, 인접한 정상 조직은 염색되지 않았다.
실시예 13 . 탈푸코실화(defucosylated) HuMAb의 생산
감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 항체는 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이 실시예에서, 푸코실 잔기가 결여된 2H5 HuMAb를 생산하였다.
푸코실트랜스퍼라제 유전자인 FUT 8을 결여한, CHO 세포주 Ms704-PF(Biowa, Inc., Princeton, NJ)를 항체 2H5의 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터로 전기천공시켰다. 약물-저항성 클론을 6 mM L-글루타민 및 500 ㎍/ml G418(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 갖는 세포외(Ex-Cell) 325-PF CHO 배지(JRH Biosciences, Lenexa, KS) 내에서 성장시킴으로써 선택하였다. 클론을 표준 ELISA 분석법에 의하여 IgG 발현을 위하여 스크리닝하였다. 두 개의 별개의 클론인 B8A6 및 B8C11가 생산되었고, 이들은 세포당 1일에 1.0 내지 3.8 피코그램 범위의 속도로 생산된다.
실시예 14 . 탈푸코실화 항-CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 탈푸코실화 및 비-탈푸코실화 항-CD70 단일클론 항체를 형광 세포독성 분석에서 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 통하여 작동자 세포(effector cells)의 존재 하에서 CD70+ 세포를 살해하는 능력에 대해서 테스트하였다.
인간 항-CD70 단일클론 항체 2H5를 상기한 바와 같이 탈푸코실화시켰다. 인간 작동자 세포를 하기와 같이 전혈로부터 제조하였다. 인간 말초 혈액 단핵 세포를 헤파린처리된 전혈로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리에 의하여 정제하였다. 세포를 10% FBS(배양 배지) 및 200 U/ml의 인간 IL-2를 포함하는 RPMI1640 배지 내에 재현탁하였고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하여 배양 배지 내에서 한번 세척하였고, 2 x 107 세포/ml로 재현탁하였다. 표적 CD70+ 세포를 2.5 mM 프로베네시드(probenecid)(분석 매질)로 보충된 배양 배지 내에서 1 x 106 표적세포/mL 당 2.5 ㎕의 BATDA로 BATDA 시약(Perkin Elmer, Wellesley, MA)과 함께 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 표적 세포를 PBS 중에서 20 mM HEPES 및 2.5 mM 프로베네시드로 4 회 세척하고, 스핀 다운시키고, 분석 매질 내에서 1x105 세포/ml 의 최종 부피로 조정하였다.
CD70+ 세포주 ARH-77(인간 B 림프모세포성 백혈병; ATCC 기탁번호 CRL-1621), MEC-1(인간 만성 B 세포 백혈병; DSMZ 기탁번호 ACC 497), SU-DHL-6(인간 B 세포 림프종, DSMZ 기탁번호 Acc572), IM-9(인간 B 림프모세포; ATCC 기탁번호 CCL-159) 및 HuT 78(인간 피부 림프구 림프종; ATCC 기탁번호 TIB-161)을 하기와 같이 델피아(Delfia) 형광 방출 분석을 사용하여 탈푸코실화 및 비-탈푸코실화 인간 항-CD70 단일클론 항체 2H5에 대한 항체 특이적 ADCC에 대해서 테스트하였다. 표적 세포주 ARH77(100 ㎕의 표지된 표적 세포)을 작동자 세포 50 ㎕ 및 2H5 또는 탈푸코실화 2H5 항체 50 ㎕와 함께 배양하였다. 1:50의 표적 대 작동자 비를 실험 전체에 걸쳐서 사용하였다. 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 2100 rpm 펄스 스핀 및 37℃에서의 1 시간 배양 후에, 상청액을 수집하고, 다시 빠르게 회전시키며, 20 ㎕의 의 상청액을 편평 바닥 플레이트로 옮기고, 여기에 180 ㎕의 Eu 용액(Perkin Elmer, Wellesley, MA)을 첨가하고 융합 알파 TRF 플 레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 판독하였다. % 용해율을 하기와 같이 계산하였다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기에서 자발적 방출은 표적 세포만을 포함한 웰로부터의 형광이고, 최대 방출은 표적 세포를 포함한 웰로부터의 형광이며, 3% 라이졸(Lysol)로 처리하였다. ARH-77 세포주에 대한 세포의 세포독성 % 특이적 용해율은 도 27A-F에 나타나 있다. CD70+를 발현하는 세포주 ARH-77, MEC-1, SU-DHL-6, IM-9 및 HuT 78은 HuMAb 항-CD70 항체 2H5와 함께 항체 매개성 세포독성 및 항-CD70 항체 2H5의 탈푸코실화 형태와 연관된 특이적 용해의 증가된 백분율을 나타내었다. 또한, 항-CD16 항체는 MEC-1 세포주에서 ADCC 효과를 차단함을 나타내었다. 이 데이터는 탈푸코실화 HuMAb 항-CD70 항체가 CD70+를 발현하는 세포에 대하여 증가된 특이적 세포독성을 나타낸다는 것을 증명한다.
실시예 15 . 51 Cr-방출 분석을 이용한 항-CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 항-CD70 단일클론 항체를 51Cr-방출 분석에서 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 통하여 작동자 세포(effector cells)의 존재 하에서 CD70+ 라지 B 림프구 세포를 살해하는 능력에 대해서 테스트하였다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(작동자 세포)를 헤파린처리된 전혈로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리에 의하여 정제하였다. 세포를 10% FBS 및 200 U/ml의 인간 IL-2를 포함하는 RPMI1640 배지 내에 2x106/mL으로 재현탁하였고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 세포를 수거하여 배양 배지 내에서 한 번 세척하였고, 2x107 세포/ml로 재현탁하였다. 2백만개의 표적 라지 세포(인간 B 림프구 버킷림프종; ATCC 기탁번호 CCL-86)를 총 부피 1 ml에서 200 μCi 51Cr과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 표적 세포를 한 번 세척하였고, 1ml의 배지 내에 재현탁하였으며, 37℃에서 추가 30분 동안 배양하였다. 최종 배양 후에, 표적 세포를 한 번 세척하였고, 1x105 세포/ml 의 최종 부피로 조정하였다. 최종 ADCC 분석을 위하여, 100 ㎕의 표지된 라지 세포를 작동자 세포 50 ㎕ 및 항체 50 ㎕와 함께 배양하였다. 1:100의 표적 대 작동자 비를 실험 전체에 걸쳐서 사용하였다. 모든 연구에서, 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 일부 연구에서, 분석 플레이트에 PBMC를 첨가하기 전에 항-인간 CD16 항체 또는 무관계한 마우스 IgG1 항체의 20 ㎍/mL를 포함하거나 항체를 포함하지 않는 튜브로 PBMC 배양을 균등하게 분리하였다. 27℃에서 15분 배양한 후에, 혈액 세포를 세척하지 않고 상기한 바와 같이 사용하였다. 37℃에서 4시간 배양한 후에, 상청액을 수집하고, 코브라 II 오토-감마 계수기(Cobra II auto-gamma Counter)(Packard Instruments)에서 240-400 keV의 판독창으로 계수하였다. 프리즘 소프트웨어(Prism software)(San Diego, CA)를 이용하여 분당 계수는 항체 농도의 함수로 그려졌고 데이터는 비선형회귀, S자형 용량 반응(가변 기울기)으로 분석되었다. 퍼센트 용해율을 하기 방정식으로 결정하였다: % 용해율 = (샘플 CPM- 항체가 없는 CPM)/트리톤X CPM-항체가 없는 CPM) X 100. 라지 세포주에 대하여 세포의 세포독성 % 특이적 용해율에 대한 항체 적정 곡선은 도 28에 나타나 있다. 이 데이터는 항-CD70 항체가 라지 세포주에 대하여 ADCC 효과를 나타낸다는 것을 증명한다. 라지 세포에 대한 항-CD70 항체의 EC50 값은 36 nM이었다. 항-CD16 항체의 존재시 라지 세포 상에서 세포독성의 그래프는 도 29에 나타나 있다. 이 데이터는 라지 세포 상에서 항-CD70 항체의 ADCC 효과는 CD16에 의존한다는 것을 증명한다.
실시예 16 . 활성화 T 세포 상에서 항-CD70 항체의 ADCC 활성의 평가
이 실시예에서, 탈푸코실화 및 비-탈푸코실화 항-CD70 단일클론 항체를 형광 세포독성 분석에서 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 통하여 작동자 세포(effector cells)의 존재 하에서 활성화 T 세포를 살해하는 능력에 대해서 테스트하였다.
인간 항-CD70 단일클론 항체 2H5를 상기한 바와 같이 탈푸코실화시켰다. 인간 작동자 세포를 상기와 같이 제조하였다. 인간 비장 T 세포는 항-CD3 코팅된 자성 구슬로 양성 선택하였다(순도 >90%). 세포를 Iscove’s 배지 + 10% 열 불활성화 FCS에서 6일 동안 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 구슬 및 25ng/ml IL-2로 자극하였다. 세포를 수집하였고 프로피디움 요오드화물 혼입으로 생존력에 대하여 분석하였고(60% 생존가능) ADCC 분석에 포함하기 전에 살아있는 세포를 외부로부터 차단하고(gated) CD70 발현에 대하여 분석하였다(살아있는 세포 상에서 ~65% CD70+).
활성화 T 세포를 하기와 같이 델피아(Delfia) 형광 방출 분석을 사용하여 탈푸코실화 및 비탈푸코실화 인간 항-CD70 단일클론 항체 2H5에 대한 항체 특이적 ADCC에 대해서 테스트하였다. 표적 활성화 T 세포(100 ㎕의 표지된 표적 세포)를 작동자 세포 50 ㎕ 및 2H5 또는 탈푸코실화 2H5 항체 50 ㎕와 함께 배양하였다. 1:50의 표적 대 작동자 비를 실험 전체에 걸쳐서 사용하였다. 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 2100 rpm 펄스 스핀 및 37℃에서의 1 시간 배양 후에, 상청액을 수집하고, 다시 빠르게 회전시키고, 20 ㎕의 의 상청액을 편평 바닥 플레이트로 옮기고, 여기에 180 ㎕의 Eu 용액(Perkin Elmer, Wellesley, MA)을 첨가하고 융합 알파 TRF 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 판독하였다. % 용해율을 하기와 같이 계산하였다: (샘플 방출 - 자발적 방출 * 100) / (최대 방출 - 자발적 방출), 여기에서 자발적 방출은 표적 세포만을 포함한 웰로부터의 형광이고, 최대 방출은 표적 세포를 포함한 웰로부터의 형광이며, 3% 라이졸(Lysol)로 처리하였다. 활성화 T 세포에 대한 세포의 세포독성 % 특이적 용해율은 도 30에 나타나 있다. 활성화 T 세포는 HuMAb 항-CD70 항체 2H5와 함께 항체 매개성 세포독성 및 항-CD70 항체 2H5의 탈푸코실화 형태와 연관된 특이적 용해의 증가된 백분율을 나타내었다. 항-CD70 항체의 탈푸코실화 및 비-탈푸코실화 형태 모두에서 항체 매개성 세포독성을 항-CD16 항체의 첨가로 차단하였다. 대조군 IgG는 세포독성에 대하여 효과를 나타내지 않았다. 이 데이터는 탈푸코실화 HuMAb 항-CD70 항체는 활성화 T 세포에 대하여 증가된 특이적 세포독성을 나타낸다는 것을 증명한다.
실시예 17 . 수용체-리간드 CD70-CD27 결합에 대한 차단 분석
이 실시예에서, 차단 분석을 이용하여 항-CD70 단일클론 항체를 리간드 CD27과 CD70의 상호작용을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다.
웰을 4℃에서 2 ㎍/ml 항-IgG 항체(Fc-sp.)의 100 ㎕/웰로 밤새 코팅하였다. 웰을 200 ㎕/웰 1% BSA/PBS로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 각 웰에 0.16 ㎍/ml CD27-Fc-his의 100 ㎕/웰을 1시간 동안 37℃에서 흔들면서 첨가하였다. 각 웰을 200 ㎕/웰 PBS/Tween 20(0.05 % (v:v))으로 5회 세척하였다. 항-CD70 항체를 10% NHS + 1% BSA/PBS에서 희석하였고 0.05 ㎍/ml CD70-myc-his과 혼합하였으며, 실온에서 1시간 동안 배양하였고 200 ㎕/웰 PBS/Tween 20(0.05 % (v:v))으로 5회 세척하였다. CD70/CD27 상호작용을 차단하는 공지된 항체를 양성 대조군으로서 사용하였고 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. CD70 및 항-CD70 항체의 혼합물을 항-Fc 항체로 차단하였고 100 ㎕/웰 CD70-myc-his + 항체를 CD27-Fc-his를 포함하는 웰에 첨가하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 혼합물에 100 ㎕/웰의 항-myc-HRP(10% NHS + 1% BSA/PBS에서 1:1000으로 희석됨)를 첨가하였고 37℃에서 1시간 동안 흔들면서 배양하였다. 100 ㎕ TMB 기질을 첨가함으로써 신호를 검출하였고, RT에서 5-10분 동안 배양한 다음, 75 ㎕ 0.25 M H2SO4를 첨가하였으며, 그 결과를 A450nm에서 판독하였다. 그 결과는 도 31에 나타내었다. 이 데이터는 2H5, 8B5, 및 18E7을 포함한, 일부 항-CD70 항체는 CD27에 대한 CD70의 결합을 차단하지만, 다른 항체는 CD70과 CD27 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 증명한다.
실시예 18 . 네이키드 항-CD70 항체를 이용한 생체 내 종양 이종이식 모델의 치료
림프종 종양으로 이식된 마우스를 네이키드 항-CD70 항체로 생체 내에서 치 료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
ARH-77(인간 B 림프모세포성 백혈병; ATCC 기탁번호 CRL-1621) 및 라지(인간 B 림프구 버킷림프종; ATCC 기탁번호 CCL-86) 세포를 표준 실험실 공정을 이용하여 시험관 내에서 확장시켰다. 6-8 주령의 수컷 Ncr 무흉선 누드 마우스(athymic nude mice)(Taconic, Hudson, NY)에 마우스당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel) (1:1) 중 5 x106 ARH-77 또는 라지 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스의 체중을 재고, 이식 후에 매주 2 회 전자 캘리퍼를 이용하여 삼차원적으로 종양에 대해서 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이/2로 계산하였다. 평균 80 mm3의 ARH-77 종양 또는 평균 170 mm3의 라지 종양을 갖는 마우스를 치료 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 제0일에 PBS 비이클, 이소타입 대조군 항체 또는 네이키드 항-CD70 HuMAb 2H5를 복강내로 투여하였다. 종양이 종양 종말점(2000 mm3)에 이를 때 마우스를 안락사시켰다. 그 결과는 도 32A(라지 종양) 및 32B(ARH-77 종양)에 나타내었다. 네이키드 항-CD70 항체 2H5는 종양 종말점 부피(2000 mm3)에 도달하는 평균 시간을 연장시켰으며, 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체로 치료하는 것은 종양 성장에 대한 직접적인 생체 내 억제 효과를 가진다.
실시예 19 . 세포독소-접합 항-CD70 항체를 이용한 생체 내 림프종 종양 이종이식 모델의 치료
림프종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
ARH-77(인간 B 림프모세포성 백혈병; ATCC 기탁번호 CRL-1621), 그란타 519(DSMZ 기탁번호 342) 및 라지(인간 B 림프구 버킷림프종; ATCC 기탁번호 CCL-86) 세포를 표준 실험실 공정을 이용하여 시험관 내에서 확장시켰다. 6-8 주령의 수컷 Ncr 무흉선 누드 마우스(athymic nude mice)(Taconic, Hudson, NY)에 마우스당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel) (1:1) 중 5 x106 ARH-77, 10 x106 그란타 519 또는 5 x106 라지 세포를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스의 체중을 재고, 이식 후에 매주 2 회 전자 캘리퍼를 이용하여 삼차원적으로 종양에 대해서 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이/2로 계산하였다. 평균 80 mm3(ARH-77), 220 mm3(그란타 519), 또는 170 mm3(라지)의 종양을 갖는 마우스를 치료 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 제0일에 PBS 비이클, 세포독소-접합 이소타입 대조군 항체 또는 세포독소-접합 항-CD70 HuMAb 2H5를 복강내로 투여하였다. 이 실험에서 사용한 접합체는 N1에서 링커의 분리에 의하여 방출된 독소가 없었다. 본 발명의 항체에 접합할 수 있는 세포독소 화합물의 예들은 2005년 9월 26일자로 출원된 미국 가출원 일련변호 제60/720,499호, 2006년 9월 26일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO 07/038658호에 기재되어 있으며, 이들 내용은 본 명세서 상에 참조로서 통합되어 있다. 종양이 종양 종말점(2000 mm3)에 이를 때 마우스를 안락사시켰다. 그 결과 는 도 33A(ARH-77), 33B(그란타 519) 및 33C (라지 종양)에 나타내었다. 세포독소에 접합된 항-CD70 항체 2H5는 종양 종말점 부피(2000 mm3)에 도달하는 평균 시간을 연장시켰으며, 종양 성장 진행을 늦추었다. 따라서, 항-CD70 항체-세포독소 접합체로 치료하는 것은 림프종 종양 성장에 대한 직접적인 생체 내 억제 효과를 가진다.
실시예 20 . 붉은털원숭이(rhesus) B 림프종 세포와 항-CD70 항체의 교차-반응성
또한 FACS 분석을 사용하여 붉은털원숭이(monkey rhesus) CD70+ B 림프종 세포주, LCL8664(ATCC#: CRL-1805)와 교차반응하는 항-CD70 항체 69A7의 능력을 평가하였다. HuMAb 69A7 항-CD70 인간 단일클론 항체의 결합을 1 ㎍/ml의 농도에서 69A7와 함께 1x105 세포를 배양함으로써 평가하였다. 세포를 세척하고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 34에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70 항체 69A7는 원숭이 CD70+ B 림프종 세포와 교차-반응한다는 것을 증명한다.
실시예 21 . 786-O 신장 암종 세포에 결합시 항-CD70 항체의 내재화
면역-형광 염색을 이용하여 세포에 결합시 HuMab 항-CD70 항체 69A7 및 2H5의 내재화를 테스트하기 위하여 786-O 인간 신장 암 세포주를 사용하였다. 786-O 세포(96-웰 플레이트에서 웰당 100㎕당 1x104 세포)를 0.25% 트립신/EDTA으로 처리 함으로써 조직 배양 플라스크에서 수확한 다음, FACS 버퍼(PBS + 5% FBS, 배지)에서 각각의 5㎍/ml HuMab 항-CD70 항체로 30분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 인간 IgG1 이소타입 대조군을 음성 대조군으로서 사용하였다. 배지로 2회 세척한 후에, 세포를 배지(웰당 100㎕)에 재현탁하였고 그 다음 PE와 접합된 염소 항-인간 제 2 항체(Jackson ImmunoResearch Lab)와 함께 1:100 희석물에서 30분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 세포를 0분 또는 다양한 시간동안 37℃에서 배양하고 형광현미경(Nikon) 하에서 형태 및 면역형광 강도에 대하여 즉시 이미지화하였다. 형광을 HuMab 항-CD70 항체로 염색한 세포에서는 관찰하였으나, 대조군 항체에서는 관찰하지 못했다. 또한 상기 분석에서 FITC-직접 결합된 HuMab 항-CD70 항체로 유사한 결과를 얻었다. 그 결과는 0분에 항-CD70 HuMabs 둘 다와 세포 표면 막 상에서 형광이 나타냄을 보여주었다. 30분 배양한 후에, 막 형광 강도가 유의하게 감소한 반면, 내부 형광은 증가하였다. 120분 시점에, 막 형광은 분명하지 않았지만, 대신 세포내 구획에 존재하는 것으로 나타났다. 그 데이터는 CD70-발현 내인성 종양 세포에 결합시 HuMab 항-CD70 항체는 특이적으로 내재화될 수 있다는 것을 증명한다.
실시예 22 . HuMAb 항-CD70는 공지된 마우스 항-CD70 항체의 결합을 차단한다
이 실험에서, HuMAb 항-CD70 항체 69A7를 CD70+ 신장 암종 786-O 세포에 대한 공지된 마우스 항-CD70 항체의 결합을 차단하는 능력에 대하여 테스트하였다. 786-O 세포를 마우스 항-CD70 항체 BU-69(Ancell, Bayport, MN) 1 ㎍/ml 및 HuMAb 69A7 1, 5 또는 10 ㎍/ml과 함께 20분 동안 얼음 위에서 배양하였다. IgG1 및 IgG2 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 두 번 세척하고 결합을 FITC-표지 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. 유세포 분석은 FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 사용하여 실시하였다. 그 결과는 도 35에 나타내었다. 항-CD70 HuMAb 69A7은 마우스 항-CD70 항체의 결합을 농도 의존성 방식으로 차단한다.
실시예 23. HuMAb 항-CD70은 염증 반응을 억제한다
이 실험에서, HuMAb 항-CD70 항체 2H5를 면역 반응의 억제에 대하여 테스트하였다. 마우스 CD32로 안정적으로 형질감염된 CHO-S 세포(CHO-S/mCD32 세포)를 전장 인간 CD70 구성체(CHO-S/mCD32/CD70 세포)로 일시적으로 형질감염시켰다. 표면 발현을 2A5 및 PE 접합된 항-인간 IgG 제 2 Ab를 사용하여 유세포 분석기로 확인하였다(데이터는 나타내지 않음). RosetteSep® 인간 T 세포 농축 키트(Enrichment Kit)(Cat# 15061; StemCell Technologies Inc)로 정제된 인간 말초 혈액 CD3+ T 세포를 1 x 106/웰로 96 웰 플레이트의 3중 웰(triplicate well) 내에서 1 x 105 CHO-S/mCD32 또는 CHO-S/mCD32/CD70 세포/웰, 1 ㎍/ml 항-hCD3(클론 OKT3; BD Bioscience) 및 HuMAb 2H5 또는 비-푸코실화 2H5(2H5 NF)의 계열 희석물로 시험관 내에서 자극하였다. 3일 후 상청액 분취액을 수집하고 인터페론-감마(INF-γ) 분비를 양에 관한 ELISA 키트(BD Biosciences)로 측정하였다. 플레이트를 1μCi/ml 3H- 티미딘으로 펄스하고, 8시간 동안 배양하였으며, 세포를 수확하고 3H-티미딘 혼입을 Trilux® 1450 마이크로베타 계수기(Trilux® 1450 Microbeta Counter)(Wallac, Inc.)에서 판독하였다. IgG1 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 그 결과는 도 36A-B에 나타내었다. 2H5 및 2H5 NF 둘 다 용량 의존성 방식으로 CD70 공동-자극된 증식을 완전히 억제하였다(도 36A). 또한 데이터는 2H5가 항-CD3+ CHO-S/mCD32 매개된 증식에 효과를 나타내지 않으므로 2H5 억제가 CD70 공동자극에 대하여 특이적이다는 것을 나타낸다. 마찬가지로 2H5 및 2H5 NF 둘 다 용량 의존성 방식으로 CD70 공동-자극된 INF-γ 분비를 억제하였다(도 36B). 또한 데이터는 2H5가 항-CD3+ CHO-S/mCD32 매개된 INF-γ 분비에 효과를 나타내지 않으므로 2H5 억제가 CD70 공동자극에 대하여 특이적이다는 것을 나타낸다. 공동으로 데이터는 2H5 및 2H5 NF가 기능적으로 CD70 인간 T 세포 공동자극을 차단한다는 것을 나타낸다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 특이적 T 세포 반응에 대하여 예비-스크리닝한 인간 MHC 클래스 I 반수체(haplotype) B*3501+ 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)(Astarte, Inc)를 CMV 펩티드 IPSINVHHY(서열번호 90)(ProImmune, Oxford, UK)에 결합하는 B*3501 25 ng/ml 및 HuMAb 2H5의 계열 희석물의 존재 하에서 11일 동안 배양하였다. 배양물을 CD8+ T 세포에 대하여는 PE 접합된 항-CD8 염색(클론 RPA-T8, BD Biosciences)에 의하여, 펩티드 특이적 CD8+ T 세포에 대하여는 APC 표지 펩티드-MHC 클래스 I 펜타머 올리고머(pentameric oligomer) 염색(F114-4B; ProImmune) 및 생존력에 대하여는 프로피디움 요오드화물 염색의 결핍에 의하여 유세포 분석기로 분석하였다. 이소타입 대조군 항체를 음성 대조군으로서 사용하였다. 그 결과는 도 37A-C에 나타내었다. 2H5는 부분적으로 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 연장을 억제하였고 2H5 NF 및 양성 대조군 항-MHC 클래스 I Ab(클론 W6/32; BD Bioscience)는 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 연장을 완전히 억제하였다(도 37A). 전체 세포 생존력의 유의한 감소는 관찰되지 않았다(도 37B). 전체 CD8+ 세포 수의 유의한 감소는 관찰되지 않았다(도 37C). 공동으로 데이터는 2H5 및 2H5 NF 효과가 펩티드 자극된 CD8+ T 세포에 대하여 특이적이다는 것을 나타낸다. 데이터는 동일한 공여체로 실시한 하나의 추가적인 실험을 대표하는 것이다.
사이토메갈로바이러스(CMV) 특이적 T 세포 반응에 대하여 예비-스크리닝한 인간 MHC 클래스 I 반수체 B*3501+ PBMC(Astarte, Inc)를 항-인간 CD16 (FcRγIII) 기능성 차단 Ab(클론 3G8; BD Biosciences)의 계열 희석물의 존재시 또는 부재시 CMV 펩티드 IPSINVHHY(ProImmune)(서열번호 90)에 결합하는 B*3501 25 ng/ml 및 HuMAb 2H5의 20 ㎍s/ml의 존재 하에서 11일 동안 배양하였고 그 다음 상기한 바와 같이 펩티드 특이적 CD8+ 세포 수에 대하여 유세포 분석기로 분석하였다. 그 결과는 도 38에 나타내었다. 항-CD16에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 연장의 2H5 및 2H5 NF 매개된 억제의 용량 의존성 역전(reversal)은 2H5 및 2H5 NF 억제가 CD16+ 작동자 세포와 2H5 및 2H5 NF의 상호작용을 통해 매개된다는 것을 보여준다. 2H5와 비교하여 2H5 NF 매개된 억제를 반대로 하기 위하여 약 1000-배 더 많은 3G8을 필 요로 하였다. 3G8 농도와 관계없이 음성 이소타입 대조군에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 연장의 억제는 없었고 기능성 차단 양성 대조군 W6/32에 의한 펩티드 특이적 CD8+ T 세포 연장의 억제에 대하여 3G8의 영향은 거의 없었다.
실시예 24 . 세포독소-접합 항-CD70 항체를 이용한 생체 내 신장 암종 종양 이종이식 모델의 치료
신장 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다. 이 실시예에서, 항-CD70 항체 2H5는 N2에 접합하였다. N2는 에스테라제 활성을 필요로 하는 전구약물이다.
786-O(ATCC 기탁번호 CRL-1932) 및 Caki-1 (ATCC 기탁번호 HTB-46) 세포를 표준 실험실 공정을 이용하여 시험관 내에서 확장시켰다. 6-8 주령의 수컷 CB17.SCID 마우스(Taconic, Hudson, NY)에 마우스당 0.2 ml의 PBS/마트리겔(Matrigel) (1:1) 중 786-O 또는 Caki-1 세포 2.5백만개를 오른쪽 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스의 체중을 재고, 이식 후에 매주 2 회 전자 캘리퍼를 이용하여 삼차원적으로 종양에 대해서 측정하였다. 종양 부피는 높이×폭×길이로 계산하였다. 평균 200 mm3의 종양을 갖는 마우스를 치료 그룹으로 무작위 분류하였다. 마우스에게 제0일에 PBS 비이클, 세포독소-접합 이소타입 대조군 항체 또는 세포독소-접합 항-CD70 HuMAb 2H5를 복강내로 투여하였다. 본 발명의 항체와 접합될 수 있는 세포독소 화합물의 예는 2005년 9월 26일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 제60/720,499호 및 2006년 9월 26일자로 출원된 PCT 공개번호 제WO 07/038658호에 기술되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 통합되어 있다. 종양이 종양 부피 종말점(2000 mm3)에 이를 때 마우스를 안락사시켰다. 그 결과는 도 39A(786-O), 및 도 39B(Caki-1)에 나타내었다. N2와 접합된 항-CD70 항체 2H5는 종양 종말점 부피(2000 mm3)에 도달하는 평균 시간을 연장시켰으며, 종양 성장 진행을 늦추었다. 치료된 동물에서 체중 변화는 10% 이하이었다.
따라서, 항-CD70 항체-세포독소 접합체로 치료하는 것은 림프종 종양 성장에 대한 직접적인 생체 내 억제 효과를 가진다.
실시예 25 . 항-CD70 면역접합체를 이용한 생체 내 신장 세포 암종 이종이식 모델의 치료
신장 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
티올화 항-CD70 2H5 항체에 연결된 복합체 N1 또는 N2의 면역접합체를 전술한 바와 같이 제조하였다(예, 미국 특허 출원공개 제2006/0024317호; 및 PCT 출원 제PCT/US2006/37793호 참조). NOD-SCID 마우스를 2.5 x 106 786-O 세포로 피하 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 80 mm3인 것으로 측정(정밀한 캘리퍼 사용)될 때까지 종양 형성을 모니터하였다. 8마리의 종양을 가지는 마우스의 그룹을 다음 중 하나의 단일 용량으로 치료하였다: (a) 비이클 대조군, (b) 면역접합체 항-CD70-N1, 또는 (c) 면역접합체 항-CD70-N2. 면역접합체 항-CD70-N1 및 항-CD70-N2을 각각 N1 당량의 0.3　μmol/kg 및 N2 당량의 0.1　μmol/kg의 양으로 마우스에 복강내로(i.p.) 투여하였다. 항-CD70-N1 그룹은 제 1 투여 후 21일에 동일한 용량으로 제 2 치료를 받았다. 종양 성장을 62일의 실험 과정동안 정밀한 캘리퍼로 측정함으로써 모니터하였다.
도 40에서 명백한 바와 같이, 비이클 대조군으로만 치료할 때 상당한 종양 성장을 가지는 마우스와 비교하여 면역접합체 항-CD70-N1 또는 항-CD70-N2로 단일 용량 치료하면 15일 이내에 종양이 없는 마우스로 되었다(그리고 62일까지 종양이 없는 상태로 남았다).
실시예 26 . 면역접합체 항- CD70 - N2 를 이용한 생체 내 신장 세포 암종 이종이식 모델의 치료
신장 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
티올화 항-CD70 2H5 항체에 연결된 복합체 N2의 면역접합체를 실시예 25에서 기재한 바와 같이 제조하였다. SCID 마우스를 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔 중 2.5 x 106 786-O 세포로 피하 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 105 mm3인 것으로 측정(정밀한 캘리퍼 사용)될 때까지 종양 형성을 모니터하였다. 8마리의 종양을 가지는 마우스의 그룹을 다음 중 하나의 단일 용량으로 치료하였다: (a) 비이클 대조군, (b) 이소타입 대조군, (c) 항-CD70 항체 2H5 단독, 또는 (d) 면역접합체 항-CD70-N2. 면역접합체 항-CD70-N2 및 이소타입 대조군-N2(IgG-N2)를 N2 당량의 0.1　μmol/kg의 양으로 마우스에 복강내로(i.p.) 투여하였다. 항-CD70 항체를 10 mg/kg으로 투여하였다(즉, 면역접합체 CD70-N2에 대하여 사용된 N2 당량과 동등한 단백질 양). 종양 성장을 62일의 실험 과정동안 정밀한 캘리퍼로 측정함으로써 모니터하였다.
도 41에서 명백한 바와 같이, 대조군으로만 또는 항-CD70 항체 단독으로 치료할 때 상당한 종양 성장을 가지는 마우스와 비교하여 면역접합체 항-CD70-N2로 단일의, 낮은 용량 치료하면 10일 이내에 종양이 최소한으로 검출가능한 마우스로 되었다(그리고 62일까지 그 상태로 남았다).
실시예 27 . 면역접합체 항- CD70 - N2 에 대한 생체 내 신장 세포 암종 이종이식의 용량 반응
신장 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
티올화 항-CD70 2H5 항체에 연결된 복합체 N2의 면역접합체를 실시예 25에서 기재한 바와 같이 제조하였다. SCID 마우스를 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트 리겔 중 2.5 x 106 786-O 세포로 피하 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 280 mm3인 것으로 측정(정밀한 캘리퍼 사용)될 때까지 종양 형성을 모니터하였다. 8마리의 종양을 가지는 마우스의 그룹을 (a) 비이클 대조군 또는 (b) 면역접합체 항-CD70-N2로 치료하였다. 면역접합체 항-CD70-N2를 하기의 용량 중 하나로 복강내로(i.p.) 투여하였다: N2 당량의 0.03 μmol/kg, 0.01　μmol/kg, 또는 0.005　μmol/kg. 종양 성장을 실험 과정동안 정밀한 캘리퍼로 측정함으로써 모니터하였다.
도 42에서 명백한 바와 같이, 면역접합체 항-CD70-N2의 대단히 낮은 용량으로 종양 부피가 감소되었고, 종양 부피 감소는 용량-의존성 방식으로 일어났다.
실시예 28 . 다른 신장 세포 암종 이종이식 모델 상에서 생체 내 면역접합체 항-CD70-N2의 유효성
신장 암종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
티올화 항-CD70 2H5 항체에 연결된 복합체 N2의 면역접합체를 실시예 25에서 기재한 바와 같이 제조하였다. SCID 마우스를 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔 중 2.5 x 106 Caki-1 세포로 피하 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 105 mm3인 것으로 측정(정밀한 캘리퍼 사용)될 때까지 종양 형성을 모니터하였다. 8마리의 종양을 가지는 마우스의 그룹을 다음 중 하나의 단일 용량으로 치료하였다: (a) 비이클 대조군, (b) 이소타입 대조군, (c) 항-CD70 항체 2H5 단독, 또는 (d) 면역접합 체 항-CD70-N2. 면역접합체 항-CD70-N2 및 이소타입 대조군-N2를 N2 당량의 0.3　μmol/kg의 양으로 마우스에 복강내로(i.p.) 투여하였다. 항-CD70 항체를 11.5 mg/kg으로 투여하였다(즉, 면역접합체 CD70-N2에 대하여 사용된 N2 당량과 동등한 단백질 양). 종양 성장을 62일의 실험 과정동안 정밀한 캘리퍼로 측정함으로써 모니터하였다.
도 43에서 명백한 바와 같이, 대조군으로만 또는 항-CD70 항체 단독으로 치료할 때 상당한 종양 성장을 가지는 마우스와 비교하여 면역접합체 항-CD70-N2로 단일 용량 치료하면 약 40일까지 동안은 종양이 최소한으로 검출가능한 마우스로 되었다. 따라서, 항-CD70 면역접합체는 다중 신장 암 모델에 대하여 효과적이다.
실시예 29 . 림프종 모델에서 생체 내 면역접합체 항- CD70 - N2 의 유효성
림프종 종양으로 이식된 마우스를 세포독소-접합 항-CD70 항체로 생체 내에서 치료하여 종양 성장에 대한 항체의 생체 내 효과를 검사하였다.
티올화 항-CD70 2H5 항체에 연결된 복합체 N2의 면역접합체를 실시예 25에서 기재한 바와 같이 제조하였다. SCID 마우스를 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔 중 1.0 x 107 라지 세포로 피하 이식하였다. 평균 종양 부피가 약 50 mm3인 것으로 측정(정밀한 캘리퍼 사용)될 때까지 종양 형성을 모니터하였다. 8마리의 종양을 가지는 마우스의 그룹을 다음 중 하나의 단일 용량으로 치료하였다: (a) 비이클 대조군, (b) 이소타입 대조군, 또는 (c) 면역접합체 항-CD70-N2. 면역접합체 항 -CD70-N2를 N2 당량의 0.3　μmol/kg의 양으로 마우스에 복강내로(i.p.) 투여하였다. 종양 성장을 60일의 실험 과정동안 정밀한 캘리퍼로 측정함으로써 모니터하였다.
도 44에서 명백한 바와 같이, 대조군으로만 또는 항-CD70 항체 단독으로 치료할 때 상당한 종양 성장을 가지는 마우스와 비교하여 면역접합체 항-CD70-N2로 단일 용량 치료하면 약 40일까지 동안은 종양이 최소한으로 검출가능한 마우스로 되었다. 따라서, 항-CD70 면역접합체는 또한 림프종에 대하여 효과적이다.
실시예 30 . 면역접합체 항- CD70 - N2 의 안전성 연구
BALB/c 마우스를 하기 중 하나의 용량으로 복강내로(i.p.) 면역접합체 항-CD70-N2를 이용하여 치료하였다: N2 당량의 0.1 μmol/kg, 0.3　μmol/kg, 0.6　μmol/kg, 또는 0.9　μmol/kg. 처음 12일 동안 매일, 그 후에는 투여 후 60일까지 정기적으로 마우스의 체중을 측정하였다. 체중 감소량이 처음 체중의 20%를 초과할 때 마우스를 안락사시켰다. 도 45에 선으로 나타낸 데이터는 각 그룹에 대한 평균 체중이다.
도 45에서 명백한 바와 같이, N2 당량의 0.9　μmol/kg 이하의 양으로 투여하였을 때 항-CD70-N2 면역접합체는 매우 내성이 있고 안전하였다. 따라서, 면역접합체 항-CD70-N2는 유효성을 보이는 용량(N2 당량의 약0.005-0.3　μmol/kg의 범위)이 우수한 안전 프로파일을 가질 것이다.
실시예 31 . 면역접합체 항-CD70-N2의 심도있는 안전성 연구
면역접합체 항-CD70-N2의 심도있는 안전성 연구를 수컷 비글(beagle)에서 실시하였다. 면역접합체를 약물 단독과 비교하였다. N2 당량의 0.18 μmol/kg으로 및 N2 약물 단독(N2 구조에서 링커가 없음)의 0.15 μmol/kg으로 면역접합체 항-CD70-N2를 두 마리의 비글개 각각에 정맥내로 투여하였다. 투여 후 4시간 동안 개를 매시간 모니터하였고, 임상 관찰을 28일 동안 매일 2번씩 실시하였다. 투여 후 8일까지는 매일, 그 후에는 매주 체중을 측정하였다. 전투여(predose) 단계 동안 두 번 및 투여 후 제3, 7, 14 및 28일에 표준 혈액학, 응고 및 임상 화학을 실시하였다. 그 결과는 도 46A-D에 나타내었다. 독성의 임상 신호 때문에 투여 후 제8일에 약물이 없는 그룹에서 한 마리 개를 안락사시켰다. 도 46A-D에 나타낸 바와 같이, 치료된 개는 항-CD70-N2 면역접합체에 매우 내성이 있었다.
실시예 32 . 활성화 인간 B 세포의 항-CD70 항체 매개된 ADCC
이 연구에서, 인간 B 세포 상에서 ADCC 효과를 매개하는 능력에 대하여 HuMAb 항-CD70 항체 및 비푸코실화 형태를 테스트하였다. 동결한 인간 비장 세포를 해동하고 B 세포를 자성 구슬(magnetic bead)로 음성적으로 정제하였다. 정제된 B 세포를 NEAA, 소듐 피루베이트, β-ME 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI + 10% FBS 중에서 2 x 106/ml로 배양하였다. B 세포를 LPS 10 ㎍/ml 및 항-CD40 5 ㎍/ml으로 3일 동안 활성화시켰다. 세포를 수확하여 세척하고 분취액을 비 오틴 접합 비푸코실화 2H5(2H5 NF-bio) + 스트렙타비딘-APC로 염색하였다. 인간 말초 혈액 단핵 작동자 세포를 헤파린처리된 전혈로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리에 의하여 정제하였고 50 U/ml IL-2의 존재 하에서 밤새 배양하였다. 활성화 B 세포를 1 x 106 세포 당 Na2 51CrO4(Perkin Elmer, Wellesley, MA) 100 μCi로 1시간 동안 표지하였다. 2H5 및 2H5 NF(비-푸코실화)의 계열 희석물의 존재 하에서 1:100의 비율로 작동자 세포를 표지된 표적 세포에 첨가하였다. 추가로, 20 ㎍/ml 뮤린 항-CD16 항체 3G8 또는 마우스 이소타입 대조군 항체의 존재 하에서 테스트 물품을 10 ㎍/ml으로 분석하였다. 4시간 동안 37℃에서 배양 후에, 세포를 원심분리하고 상청액을 코브라 II 오토-감마 계수기(Cobra II auto-gamma Counter)(Perkin Elmer)에서 240-400 KeV의 판독창으로 판독하였다. 퍼센트 특이적 용해율을 다음과 같이 계산하였다: (실험 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) x 100, 여기에서 (i) 작동자 세포가 없고 자발적 방출에 대한 항체 대조군이 없는 표적 세포 및 (ii) 최대 방출에 대하여 3% 라이졸 세제 대조군의 존재 하에서 표적 및 작동자 세포. 항체 농도에 대한 퍼센트 특이적 용해율을 선으로 그렸고 데이터는 GraphPad PrismTM 3.0 소프트웨어(San Diego, CA)를 이용하여 비선형 회귀, S자형 용량 반응(가변 기울기)으로 분석하였다.
데이터는 도 47에 나타내었다. 2H5 NF는 활성화 B 세포의 ~ 60%에 결합한다. 2H5 NF 및 2H5 둘 다 활성화 인간 B 세포의 용해를 유도하였으나, 2H5 NF는 2H5보다 대략 10배 더 강력하고 더 효능이 있었다. Ab의 항-CD16 역전은 Ab 매개된 용해 의 작용의 메카니즘은 NK 세포 매개된 ADCC이었다는 것을 확인한다. 따라서, 2H5 및 2H5 NF 둘 다 인간 활성화 B 세포의 ADCC를 매개한다.
실시예 33 . 시험관 내 CMV Ag 자극화된 인간 CD4+ T 세포 연장의 항-CD70 항체 억제
이 연구는 자극화된 인간 PBMC 배양에 자연적으로 존재하는 작동자 세포에 의하여 ADCC를 통해서 Ag 활성화, CD70+ 인간 T 세포(자가면역 및 면역 질병에서 염증 과정에 중요한 공헌자인 세포)의 용해를 매개하는 항-CD70 항체의 능력을 증명한다.
CMV 양성 예비-스크리닝된 제공자를 24-웰 배양 플레이트 상에서 10% 열-불활성화 FCS로 보충된 AIM-V 배지에서 1 x 106 세포/ml로 배양하였고 비오티닐화 2H5, 2H5 NF 또는 hIgG1nf 대조군 Abs의 2 ㎍/ml의 존재 하에서 5.0 ㎍/ml의 CMV 용해물로 자극하였다. 세포를 제9일에 수확하였고 각 배양에서 생존 가능한 세포/ml의 수를 혈구 계산기 및 트립판 블루 배제를 이용하여 분취액을 계수함으로써 결정하였다. 세포를 염색 버퍼에서 세척하고 5% 인간 혈청으로 차단하였다. 비오티닐화 2H5, 2H5 NF, 또는 hIgG1nf를 최종 농도 20 ㎍/ml으로 세포의 동일한 부피에 첨가하였다. 세포를 30분 동안 배양하였으며, 세척하고 항-CD4-FITC 및 PE-접합 스트렙타비딘으로 염색하였다. 세포를 다시 30분 동안 배양하였으며, 2번 세척한 다음 BD Cytofix/Cytoperm 키트를 이용하여 고정화시키고 투과성을 올렸다. 세포를 펌/세척(perm/wash) 버퍼로 2번 세척하고 항-INFγ-APC(BD 클론 B27)으로 세포내 염색하였다. 세포를 30분 동안 배양하였으며, 세척하고 염색 버퍼 내에서 재현탁하였다. 세포를 CD70 표면에 대하여 유세포 분석기로 분석하였고 살아있는 CD4+ 세포 상에서 제어함으로써 세포내 발현을 분석하였다. 각 조건에서 CD4+/CD70+ 및 CD4+/INFγ+ 세포/ml의 수는 CD4 게이트 내에서 퍼센트 CD70+ 또는 INFγ+ 세포에 전체 CD4+ 세포의 퍼센트 곱하기 생존 가능한 세포/ml의 전체 수를 곱함으로써 계산하였다((%CD70+ 또는 INFγ+) x (%CD4+) x (전체 생존 가능한 세포/ml)).
데이터는 도 48에 나타내었다. 2 ㎍/ml에서 2H5 및 2H5 NF는 제 9 일에 각각 CMV 활성화 CD70+/CD4+ 세포의 67% 및 97%를 격감시켰다. 두 가지 항체 모두 효과적이었지만, 정상 인간 혈액에 존재하는 CD16+ 작동자 세포에 의하여 Ag 활성화 CD4+/CD70+ T 세포의 ADCC를 매개하는 것에 대하여 2H5 NF가 2H5보다 더 강력하였다.
실시예 34 . CD70+ 신장 암종 세포주 786-0에 결합하는 인간 CD70 항체 1F4, 1F4 NF 및 2H5 NF의 상대적인 결합 특성
이 연구는 CD70+ 인간 암 세포주 786-0 세포를 본래 발현하는 것에 대한 항-CD70 항체의 결합 특성을 조사하였다. 인간 신장 세포 선암 세포주 786-0를 집합으로 성장시키고, 트립신으로 수확하며, 염색 버퍼에서 세척하고 최종 농도 30, 10, 3, 1, 0.4, 0.1, 0.04 및 0.01 ug/ml으로 1F4, 1F4 NF, 2H5 NF, hIgG1-NF 또는 hIgG4와 같이 배양하였다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양하였고, 염색 버퍼에 서 2번 세척하였으며 염소 F(ab)’2-항-인간-IgG(Fc)-PE 접합체로 30분 동안 염색하였다. 세포를 세척하고 유세포 분석기에 의한 분석을 위하여 염색버퍼에 재현탁하였다.
데이터는 도 49에 나타내었다. 2H5 NF는 1F4 및 1F4 NF보다 더 낮은 농도에서 결합한다. 2H5 NF는 1F4 및 1F4 NF보다 본래 세포 표면 발현되는 CD70에 대한 더 우수한 결합 친화도를 가진다. 1F4 및 1F4 NF는 NF 이소타입 때문에 특이적 결합 특성의 아무런 영향을 보이지 않는, 786-0 세포주에 동등하게 잘 결합한다.
실시예 35 . CD70+ 림프종 세포주 ARH77 상에서 ADCC를 매개하는 1F4 및 1F4 NF의 상대적인 능력
이 연구에서, 푸코실화 및 비-푸코실화(nf) 항-CD70 항체를 CD70+ 림프종 세포주 ARH77 상에서 ADCC를 매개하는 상대적인 능력에 대하여 테스트하였다. 인간 말초 혈액 단핵 작동자 세포를 헤파린처리된 전혈로부터 표준 피콜-파크(Ficoll-paque) 분리에 의하여 정제하고 50 U/ml IL-2의 존재 하에서 밤새 배양하였다. ARH77 세포를 1 x 106 세포 당 Na2 51CrO4(Perkin Elmer, Wellesley, MA) 100 μCi로 1시간 동안 표지하였다. 2H5 및 2H5nf의 계열 희석물의 존재 하에서 1:100의 비율로 작동자 세포를 표지된 표적 세포에 첨가하였다. 추가로, 테스트 물품을 5 ㎍/ml로 분석하였다. 4시간 동안 37℃에서 배양한 후에, 세포를 원심분리하고 상청액을 코브라 II 오토-감마 계수기(Cobra II auto-gamma Counter)(Perkin Elmer)에서 240-400 KeV의 판독창으로 판독하였다. 퍼센트 특이적 용해율을 다음과 같이 계산하였다: (실험 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출) x 100, 여기에서 (i) 작동자 세포가 없고 자발적 방출에 대한 항체 대조군이 없는 표적 세포 및 (ii) 최대 방출에 대하여 3% 라이졸 세제 대조군의 존재 하에서 표적 및 작동자 세포.
데이터는 도 50에 나타내었다. 1F4 및 1F4 NF 모두 CD70+ ARH77 세포 상에서 ADCC를 매개하고, 1F4 NF는 1F4보다 ADCC의 더 강력한 매개자이다.
실시예 36 . 항- CD70 -세포독소 E에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
다른 종양 세포에 대한 표적화 치료로서 항-CD70-세포독소 E 접합체의 광범위한 유용성을 증명하기 위하여, SCID 마우스에서 세 가지 신장 세포 암 이종이식 모델 및 두 가지 림프종 모델을 사용하여 생체 내에서 항-CD70-세포독소 E 접합체의 효능을 테스트하였다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 항-CD70-세포독소 E로 지칭되고, 이것은 세포독소 E(도 74)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성되며, 2006년 12월 28일자로 출원된 미국 출원 일련번호 제60/882,461호에 보다 상세히 기술되어 있고, 이 전체 내용은 참고로서 본 명세서에 명확하게 통합된다. 세포독소 E는 전구약물 형태이고, 활성을 위하여 항체로부터 방출을 필요로 할 뿐만 아니라 활성 부분을 방출하는 4’ 카바메이트 기의 분리도 필요로 한다.
786-O 세포 이종이식물 상에서 항-CD70-세포독소 E의 활성을 증명하기 위하 여 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM 중 2.5백만 786-O 세포를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 110 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.005, 0.03 또는 0.1μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 항-CD70 항체 단독(0.03 및 0.1μmol/kg으로 항-CD70-세포독소 E에 대하여 사용된 것과 동일한 양으로), 또는 0.03 및 0.1μmol/kg의 양으로 세포독소 E에 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 61일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 51에 나타내었다. 면역억제된(immunocompomised) 이 특정한 마우스 이종이식 모델 및 언급한 용량에서, 네이키드 CD70 항체로 치료하는 것은 종양 부피에 대한 효과를 보이지 않았다(즉, 종양 성장을 억제하지 않았다). 이소타입 대조군 또한 종양의 성장에 대하여 거의 효과를 가지지 않았다. 반대로, 항-CD70-세포독소 E 접합체는 명확하게 용량-의존성 항-종양 효능을 보였다. 특정 접합체의 치료적 효과는 오히려 0.03μmol/kg에서 최대인 것으로 나타난다.
그 다음 항-CD70-세포독소 E의 활성은 A498 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. A498 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 110 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세 포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 대략 60일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 52에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 E 접합체가 이 모델에서 신장암의 치료에 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
그 다음 항-CD70-세포독소 E 접합체의 활성은 Caki-1 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명되었다. Caki-1 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 2.5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 150 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 또한 별도의 그룹을 사용하여 14일씩 나누어 0.1μmol/kg으로 항-CD70-세포독소 E 접합체의 두 가지 용량으로 투여함으로써 반복 용량 치료의 효과를 연구하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 62일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 53에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 E 접합체가 caki-1 종양을 가지는 마우스에서 신장암의 치료에 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
림프종의 모델에서 항-CD70-세포독소 E의 활성을 증명하기 위하여, 치료 연구를 피하에 라지 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 실행하였다. 라지 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 1천만)를 SCID 마우스로 피하 이식 하였고, 종양이 평균 크기가 250 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 또는 0.1 및 0.3μmol/kg 체중의 양으로 세포독소 E에 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 대략 60일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 54에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 E 접합체가 또한 이 모델에서 림프종의 치료에 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
제 2의 림프종 모델은 다우디 이종이식물을 사용하여 실시하였다. 다우디 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 1천만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 70 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 항-CD70 항체 단독, 또는 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 이소타입 대조군 항체 세포독소 E 접합체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 대략 60일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 55에 나타내었다. 면역억제된(immunocompomised) 이 특정한 마우스 이종이식 모델 및 언급한 용량에서, 네이키드 CD70 항체로 치료하는 것은 종양 부피에 대한 효과를 보이지 않았다(즉, 종양 성장을 억제하지 않았다). 반대로, 항-CD70-세포독소 E 접합체는 이 모델에서 림프 종에 대하여 효능이 있고, 치료는 용량-의존성이다.
효능이 다양한 종에서 관찰될 수 있음을 증명하기 위하여, 누드 래트에서 이종이식 모델을 테스트하였다. 이 모델에서 전신에 γ선을 조사한 누드 래트에 Caki-1 세포(0.2 ml RPMI-1640/래트 중 1천만)를 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 100 mm3에 이를 때, 래트의 그룹을 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 E를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 대안적으로 래트가 제8, 15 및 22일에 0.3μmol/kg 체중의 3 용량을 받는 것으로 복합-용량 치료를 실시하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 항-CD70 항체 단독, 또는 0.3μmol/kg 체중으로 이소타입 대조군 항체 세포독소 E 접합체와 함께 단일 용량으로 또는 동일한 복합-용량 섭생으로 주입하였다. 래트의 종양 부피(LW2/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였다. 그 결과는 도 56에 나타내었다. 면역억제된(immunocompomised) 이 특정한 마우스 이종이식 모델 및 언급한 용량에서, 네이키드 CD70 항체로 치료하는 것은 종양 부피에 대한 효과를 보이지 않았다(즉, 종양 성장을 억제하지 않았다). 반대로, 항-CD70-세포독소 E 접합체는 현저한 항-종양 효과를 보였다. 동물의 체중에 대하여 유의한 영향없이, 효능이 복합-용량 치료로 증가되었다. 이소타입 대조군 접합체는 반복 투여 섭생을 함께 하더라도 종양 성장에 대하여 거의 영향을 나타내지 않음을 나타내었다.
항-CD70 접합체의 안전성을 3가지 다른 동물 종에서 테스트하였다. 5마리의 정상 balb/c 마우스의 그룹을 0.1, 0.3, 0.6 및 0.9μmol/kg 체중의 용량으로 항- CD70-세포독소 E를 복강내로(ip) 투여하였고 비이클 단독으로 주입한 동물과 비교하여 동물의 체중을 60일 동안 모니터하였다. 연구 과정 동안 대조군 동물은 체중이 10-20% 늘었다. 항-CD70-세포독소 E를 복용한 마우스는 접합체가 일반적으로 더 적은 용량에서 체중에 대하여 거의 영향을 미치지 않는 매우 내성이 있는 것을 나타내었다. 분명한 독성에서 용량-의존성 증가가 있었으며, 고용량은 회복 전에 동물의 체중에서 일시적인 감소의 원인이 되었다. 그럼에도 불구하고 접합체는 이종이식 모델에서 효능에 필요한 용량을 초과한 용량에서 매우 내성이 있었다. 그 결과는 도 57에 나타내었다.
또한 독성을 개 및 원숭이에서 테스트하였다. 3마리 개의 그룹은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.6μmol/kg 체중으로 투여하였고, 2마리 원숭이의 그룹은 0.2, 0.4, 0.6 및 0.8μmol/kg 체중으로 투여하였다. 전체 백혈구 총수 및 혈소판 총수가 항-CD70 항체-세포독소 E 접합체에 대한 독성의 특히 민감한 지표라고 믿어지는 만큼 각 연구에서 전체 백혈구 총수 및 혈소판 총수에 특히 유의하였다. 개에서는 용량이 0.6μmol/kg 체중에 도달할 때까지 세포 총수에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이 용량에서 혈소판 총수가 일시적으로 떨어지고, 백혈구 총수 또한 감소하였다. 원숭이에서는, 어떤 용량에서도 이들 파라미터에서 거의 변화가 관찰되지 않았다. 두 가지 연구 모두 동물에서 항-CD70 접합체의 유독한 용량이 이종이식 모델에서의 유효한 용량보다 유의하게 높다는 것을 뒷받침한다. 그 결과는 도 58(개에 대한 결과) 및 59(원숭이에 대한 결과)에 나타내었다.
실시예 37 . 항-CD70-세포독소 F에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
이 실시예에서, 항-CD70-세포독소 F의 효능을 신장암의 두 가지 이종이식 모델 및 림프종의 한 가지 모델에서 증명한다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 CD70-세포독소 F로 지칭되고, 이것은 세포독소 F(도 75)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성된다. 세포독소 F는 에스테라제 활성을 필요로 하는 전구약물이다.
786-O 세포 이종이식물 상에서 항-CD70-세포독소 F의 활성을 증명하기 위하여, 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM 중 2.5 백만 786-O 세포를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 110 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.005, 0.03 또는 0.1μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 F를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 또는 0.03 및 0.1μmol/kg의 용량으로 세포독소 F와 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 62일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 60에 나타내었다. 면역억제된(immunocompomised) 이 특정한 마우스 이종이식 모델 및 언급한 용량에서, 네이키드 CD70 항체로 치료하는 것은 종양 부피에 대한 효과를 보이지 않았다(즉, 종양 성장을 억제하지 않았다). 이 실험에서 이소타입 대조군 접합체 또한 종양의 성장에 대하여 거의 효과를 가지지 않았으나, 반면 항-CD70-세포독소 F로 치료한 마우스는 명확하게 용량-의존성 항-종양 효능을 보였다. 특정 접합체의 치료적 효과는 오히려 0.03μmol/kg에서 최대인 것으로 나타났다.
그 다음 항-CD70-세포독소 F의 활성은 Caki-1 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. Caki-1 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 2.5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 120 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 F를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 62일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 61에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 F 접합체가 caki-1 종양을 가지는 마우스에서 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
림프종의 모델에서 항-CD70-세포독소 F의 활성을 증명하기 위하여, 치료 연구를 피하에 라지 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 실행하였다. 라지 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 1천만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 250 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 F를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 또는 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 세포독소 F에 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 대략 60일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 62에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 F 접합체가 또한 림프종에 대하여 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
실시예 38 . 항-CD70-세포독소 G에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
이 예에서, 항-CD70-세포독소 G의 효능을 신장암의 두 가지 이종이식 모델에서 증명한다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 CD70-세포독소 G로 지칭되고, 이것은 세포독소 G(도 76)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성된다. 세포독소 G는 에스테라제 활성을 필요로 하는 전구약물이다.
786-O 세포 이종이식물 상에서 항-CD70-세포독소 G의 활성을 증명하기 위하여, 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM 중 2.5 백만 786-O 세포를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 110 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.005, 0.03 또는 0.1μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 G를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 또는 0.03 및 0.1μmol/kg의 용량으로 세포독소 G와 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 61일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 63에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70 항체 단독 또는 이소타입 대조군 접합체가 이 실험에서 종양의 성장에 거의 효과를 가지지 않지만, 반면 명확하게 마우스를 치료한 항-CD70-세포독소 G는 용량-의존성 항-종양 효능을 보인다는 것을 나타낸다.
그 다음 항-CD70-세포독소 G의 활성은 Caki-1 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. Caki-1 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 2.5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 120 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 G를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 61일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 64에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 G 접합체가 caki-1 종양을 가지는 마우스에서 신장암에 대하여 효능이 있으며, 치료는 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
실시예 39 . 항-CD70-세포독소 H에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
이 실시예에서, 항-CD70-세포독소 H의 효능을 신장암의 두 가지 이종이식 모델에서 증명한다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 CD70-세포독소 H로 지칭되고, 이것은 세포독소 H(도 77)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성된다.
항-CD70-세포독소 H의 활성은 A498 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. A498 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 110 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.1μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 H를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 대략 60일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 65에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 H 접합체가 신장암에 대하여 효능이 있다는 것을 나타낸다.
Caki-1 세포 이종이식물 상에서 항-CD70-세포독소 H의 활성을 증명하기 위하여, 마우스당 0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM 중 2.5 백만 Caki-1 세포를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 130 mm3에 이를 때, 8마리 마우스의 그룹을 0.03, 0.1 또는 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 H를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 또는 0.1 및 0.3μmol/kg의 용량으로 세포독소 H와 연결된 이소타입 대조군 항체와 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였고, 이를 투여 후 61일 동안 계속하였다. 그 결과는 도 66에 나타내었다. 면역억제된(immunocompomised) 이 특정한 마우스 이종이식 모델 및 언급한 용량에서, 네이키드 CD70 항체로 치료하는 것은 종양 부피에 대한 효과를 보이지 않았다(즉, 종양 성장을 억제하지 않았다). 이 실험에서 이소타입 대조군 접합체 또한 종양의 성장에 대하여 거의 효과를 가지지 않았다. 반대로, 항-CD70-세포독소 H 접합체는 명확하게 용량-의존성 항종양 효능을 나타낸다.
실시예 40 . 항-CD70-세포독소 I에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
이 예에서, 항-CD70-세포독소 I의 효능을 신장암의 두 가지 이종이식 모델, SCID 마우스에서 786-O 세포, 및 누드 래트에서 Caki-1세포에서 증명하였다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 CD70-세포독소 I로 지칭되고, 이것은 세포독소 I(도 78)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성된다.
항-CD70-세포독소 I의 활성은 786-O 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. 786-O 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 2.5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 170 mm3에 이를 때, 6마리 마우스의 그룹을 0.005μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 I를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였다. 그 결과는 도 67에 나타내었다. 이들 결과는 항-CD70-세포독소 I 접합체가 낮은 용량에서 조차도, 신장암에 대하여 효능이 있다는 것을 나타낸다.
효능이 다양한 종에서 관찰될 수 있음을 증명하기 위하여, 누드 래트에서 이종이식 모델을 테스트하였다. 이 모델에서 누드 래트에 Caki-1 세포(0.2 ml RPMI-1640/래트 중 1천만)를 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 100 mm3에 이를 때, 래트의 그룹을 0.3μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 I를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독, 항-CD70 항체 단독, 또는 0.3μmol/kg 체중으로 이소타입 대조군 항체 세포독소 I 접합체와 함께 단일 용량으로 주입하였다. 래트의 종양 부피(LW2/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였다. 그 결과는 도 68에 나타내었다. 그 결과는 CD70 항체 단독은 종양 성장에 대하여 효과를 거의 가지지 않고, 이소타입 대조군 접합체는 종양 성장에 대하여 전혀 효과를 보이지 않음을 나타낸다. 그러나, 항-CD70-세포독소 I 접합체는 현저한 항-종양 효과를 나타낸다. 종양 퇴화를 성취하였다. 따라서, 항-CD70-세포독소 I 접합체는 다양한 종에서 항-종양 효과를 나타낸다.
실시예 41 . 항-CD70-세포독소 J에 의한 생체 내에서의 종양 성장 억제
이 실시예에서, 항-CD70-세포독소 J의 효능을 신장암의 이종이식 모델, SCID 마우스에서 786-O 세포에서 증명하였다. CD70 항체 2H5의 세포독소 접합체는 본 명세서에서 CD70-세포독소 J로 지칭되고, 이것은 세포독소 J(도 79)에 연결된 재조합 2H5 항-CD70 항체로 구성된다. 세포독소 J는 활성을 위하여 글루쿠로니다제에 의한 분리를 필요로 하는 전구약물이다.
항-CD70-세포독소 J의 활성은 786-O 종양 이종이식물을 가지는 SCID 마우스에서 증명하였다. 786-O 세포(0.1 ml PBS 및 0.1 ml 마트리겔TM/마우스 중 2.5백만)를 SCID 마우스로 피하 이식하였고, 종양이 평균 크기가 170 mm3에 이를 때, 6마리 마우스의 그룹을 0.03μmol/kg 체중으로 단일 용량의 항-CD70-세포독소 J를 복강내(ip) 주입으로 치료하였다. 추가로, 대조군 그룹을 비이클 단독과 함께 주입하였 다. 마우스의 종양 부피(LWH/2) 및 체중을 연구 과정내내 기록하였다. 그 결과는 도 69에 나타내었다. 그 결과는 항-CD70-세포독소 J 접합체가 이 모델에서 신장암에 대하여 효능이 있다는 것을 나타낸다.
실시예 42 . 항-CD70 항체에 의한 CD70 공동자극된 T 세포 증식의 기능적 차단
이 실시예는 항-CD70 항체 1F4 IgG1, 1F4 IgG4, 2H5, 2H5 F(ab’)2 및 2H5 Fab에 의한 CD70 공동자극된 T 세포 증식의 기능적 차단의 분석 및 특징을 기술한다.
인간 CD3+ T 세포를 MACS CD3 미세구슬(Microbead)을 이용하여 저온보존된 PBMC에서 분리하였고 그 다음 마우스 CD32 및 인간 CD70 둘 다로 안정하게 형질감염된 미토마이신 C 처리된 CHO 세포의 존재 하에서 RPMI-1640 완전 배지 + 10% 열 불활성화 FCS에서 2 x 106 세포/ml로 배양하였다. 세포를 1 ㎍/ml 항-CD3(클론 OKT3)으로 3일 동안 자극하였으며, 1 μCi/웰의 3H-티미딘을 6시간 동안 첨가하고 세포를 수확하였다. 증식을 신틸레이션 계수로 혼입된 CPM으로 측정하였다.
데이터는 1F4 및 2H5 항체가 인간 항-CD3 자극된 T-세포에 의하여 CD70-매개된 CD27이 신호하는 유도된 증식을 용량 의존성 방식으로 차단할 수 있다는 것을 나타낸다. 데이터는 또한 2H5에 의한 기능적 차단이 차단 활성에 영향을 미치기 위하여 비전형적으로 IgG1 Fc 영역 매개된 세포 표면 CD70 다중화(multimerization) 를 필요로 하는 반면, 1F4는 일반적으로 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 도 70을 참고. 2H5로 결합되는 에피토프의 드문 특성을 2H5 F(ab’)2의 감소된 기능적 차단 효능 및 2H5 IgG1에 관한 2H5 Fab의 기능적 차단 활성의 완전한 결핍으로 증명한다. 반대로, 기능적 차단 활성을 가지는 Abs로 일반적으로 관찰된 것과 같이, 1F4 IgG1에 관한 1F4 IgG4의 동등한 기능적 차단 활성은 1F4로 결합되는 에피토프가 차단 활성을 영향을 미치기 위하여 일반적으로 IgG1 Fc 영역 매개된 CD70 다중화를 필요로 하지 않는다는 것을 증명한다.
따라서, 이 데이터는 CD70-매개된 인간 T-세포 활성화의 기능적 차단에 관해서 드물면서 가능하게는 독특한 특성을 가지는 에피토프에 2H5가 결합한다는 것을 나타낸다. 추가로, 2H5로 결합되는 에피토프는 또한 2H5 IgG1 또는 2H5 NF 매개된 ADCC, 내재화, 친화도 등의 특성 및 효능에 유리하게 기여할 수 있다.
CD70 기능이 질병 진행에 역할을 한다는 점에서, 인간 항-CD3 자극된 T-세포에 의하여 CD70-매개된 CD27이 신호하는 유도된 증식을 차단할 수 있는 항체 1F4 및 2H5의 능력은 임의의 면역 징후의 치료에 대하여 적절하다.
서열 식별자의 목록
서열번호 서열 서열번호 서열
1 VH a.a. 2H5 31 VK CDR1 a.a. 2H5
2 VH a.a. 10B4 32 VK CDR1 a.a. 10B4
3 VH a.a. 8B5 33 VK CDR1 a.a. 8B5
4 VH a.a. 18E7 34 VK CDR1 a.a. 18E7
5 VH a.a. 69A7 35 VK CDR1 a.a. 69A7 및 69A7Y
6 VH a.a. 1F4 36 VK CDR1 a.a. 1F4
7 VK a.a. 2H5 37 VK CDR2 a.a. 2H5
8 VK a.a. 10B4 38 VK CDR2 a.a. 10B4
9 VK a.a. 8B5 39 VK CDR2 a.a. 8B5
10 VK a.a. 18E7 40 VK CDR2 a.a. 18E7
11 VK a.a. 69A7 및 69A7Y 41 VK CDR2 a.a. 69A7 및 69A7Y
12 VK a.a. 1F4 42 VK CDR2 a.a. 1F4
13 VH CDR1 a.a. 2H5 43 VK CDR3 a.a. 2H5
14 VH CDR1 a.a. 10B4 44 VK CDR3 a.a. 10B4
15 VH CDR1 a.a. 8B5 45 VK CDR3 a.a. 8B5
16 VH CDR1 a.a. 18E7 46 VK CDR3 a.a. 18E7
17 VH CDR1 a.a. 69A7 및 69A7Y 47 VK CDR3 a.a. 69A7 및 69A7Y
18 VH CDR1 a.a. 1F4 48 VK CDR3 a.a. 1F4
19 VH CDR2 a.a. 2H5 49 VH n.t. 2H5
20 VH CDR2 a.a. 10B4 50 VH n.t. 10B4
21 VH CDR2 a.a. 8B5 51 VH n.t. 8B5
22 VH CDR2 a.a. 18E7 52 VH n.t. 18E7
23 VH CDR2 a.a. 69A7 및 69A7Y 53 VH n.t. 69A7
24 VH CDR2 a.a. 1F4 54 VH n.t. 1F4
25 VH CDR3 a.a. 2H5 55 VK n.t. 2H5
26 VH CDR3 a.a. 10B4 56 VK n.t. 10B4
27 VH CDR3 a.a. 8B5 57 VK n.t. 8B5
28 VH CDR3 a.a. 18E7 58 VK n.t. 18E7
29 VH CDR3 a.a. 69A7 59 VK n.t. 69A7 및 69A7Y
30 VH CDR3 a.a. 1F4 60 VK n.t. 1F4
61 VH 3-30.3 생식계열 a.a. 69 JH 4b 생식계열 a.a.
62 VH 3-33 생식계열 a.a. 70 JK 4 생식계열 a.a.
63 VH 4-61 생식계열 a.a. 71 JK 3 생식계열 a.a.
64 VH 3-23 생식계열 a.a. 72 JK 2 생식계열 a.a.
65 VK L6 생식계열 a.a. 73 VH a.a. 69A7Y
66 VK L18 생식계열 a.a. 74 VH n.t. 69A7Y
67 VK L15 생식계열 a.a. 75 VH CDR3 a.a. 69A7Y
68 VK A27 생식계열 a.a. 76 인간 CD70 (P32970)
77 펩티드 링커
78 펩티드 링커
79 펩티드 링커
80 펩티드 링커
81 펩티드 링커
82 펩티드 링커
83 펩티드 링커
84 펩티드 링커
85 펩티드 링커
86 펩티드 링커
87 펩티드 링커
88 펩티드 링커
89 펩티드 링커
90 사이토메갈로바이러스 펩티드
91 펩티드 링커
92 펩티드 링커
SEQUENCE LISTING <110> Medarex, Inc. Coccia, Marco A. Terrett, Jon King, David J. Pan, Chin Cardarelli, Josephine Yamanaka, Mark Henning, Karla Ann <120> HUMAN ANTIBODIES THAT BIND CD70 AND USES THEREOF <130> 077375.0533 <150> US 60/870,091 <151> 2006-12-14 <150> US 60/915,314 <151> 2007-05-01 <150> US 60/991,702 <151> 2007-11-30 <160> 92 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Ile Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Pro Tyr Ser Asn Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Ile Met Val Arg Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30 Tyr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Cys Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Asp Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Asp Tyr Ser Asn Tyr Leu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Asn Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly 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attacagtgg gagcaccaac 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgaggtctgt gaccactgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg 300 gatggggact acggtggtaa ctgttttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 54 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc atctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgata gtggtggtcg cacatacttc 180 gcagactccg tgaggggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtct 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaggtcgac 300 tacagtaact acctattctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 <210> 55 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtaccaact ggccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 56 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagctc ctaagttctt gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa a 321 <210> 57 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgctcac tttcggcgga 300 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Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 67 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95 <210> 68 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 70 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 73 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Asp 20 25 30 Tyr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 74 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtgattatt actactggag ctggatccgg 120 cagcccccag ggaagggact ggagtggctt gggtatatct attacagtgg gagcaccaac 180 tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgaggtctgt gaccactgcg gacacggccg tgtattactg tgcgagaggg 300 gatggggact acggtggtaa ctattttgac tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gly Asp Gly Asp Tyr Gly Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly 1 5 10 15 Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile 20 25 30 Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His 50 55 60 Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala 65 70 75 80 Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu 85 90 95 Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu 100 105 110 Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu 115 120 125 Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro 145 150 155 160 Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu 165 170 175 Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg 180 185 190 Pro <210> 77 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 77 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 78 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 79 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 79 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 80 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 80 Pro Arg Phe Lys 1 <210> 81 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 81 Thr Arg Leu Arg 1 <210> 82 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 82 Ser Lys Gly Arg 1 <210> 83 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 83 Pro Asn Asp Lys 1 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 84 Pro Val Gly Leu Ile Gly 1 5 <210> 85 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 85 Gly Pro Leu Gly Val 1 5 <210> 86 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 86 Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln 1 5 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 87 Pro Leu Gly Leu 1 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 88 Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln 1 5 <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 89 Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln 1 5 <210> 90 <211> 9 <212> PRT <213> Cytomegalovirus <400> 90 Ile Pro Ser Ile Asn Val His His Tyr 1 5 <210> 91 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 91 Leu Leu Gly Leu 1 <210> 92 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Peptide linker <400> 92 Ala Leu Ala Leu 1

Claims (63)

  1. 분리된 인간 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서,
    상기 항체는 인간 CD70에 결합하고 하기 특성 중 적어도 하나를 나타내며:
    (a) 1x10-7 M 이하의 KD로 인간 CD70 에 결합함; 및
    (b) 신장 세포 암종 종양 세포주에 결합함;
    (c) 림프종 세포주에 결합함;
    (d) CD70-발현 세포에 의하여 내재화됨;
    (e) CD70-발현 세포에 대한 항체 의존성 세포 독성(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)을 나타냄; 및
    (f) 세포독소에 접합할 때 생체 내에서 CD70-발현 세포의 성장을 억제함,
    상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 두 개를 나타내는 항체-파트너 분자 접합체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 세 개를 나타내는 항체-파트너 분자 접합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 네 개를 나타내는 항체-파트너 분자 접합체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 중 적어도 다섯 개를 나타내는 항체-파트너 분자 접합체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 특성 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f) 여섯 개 모두를 나타내는 항체-파트너 분자 접합체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 5.5 x 10-9 M 이하의 친화도로 인간 CD70에 결합하는 항체-파트너 분자 접합체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 3 x 10-9 M 이하의 친화도로 인간 CD70에 결합하는 항체-파트너 분자 접합체.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 항체는 2 x 10-9 M 이하의 친화도로 인간 CD70에 결합하는 항체-파트너 분자 접합체.
  10. 참조 항체에 의하여 인식된 인간 CD70상의 에피토프에 결합하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서,
    상기 참조 항체는 다음을 포함하며:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역,
    상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  16. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  17. 제 10항에 있어서,
    상기 참조 항체가 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  18. 인간 VH 3-30.3 유전자, 인간 VH 3-33 유전자, 인간 VH 4-61 유전자, 또는 인간 VH 3-23 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도되는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합하고, 상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  19. 인간 VK L6 유전자, 인간 VK L18 유전자, 인간 VK L15, 인간 VK L6 유전자, 또는 인간 VK A27 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서, 상기 항체는 CD70에 특이적으로 결합하고, 상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  20. 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체 파트너 분자 접합체로서, 다음을 포함하며:
    (a) 인간 VH 3-33 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L15 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역;
    (b) 인간 VH 3-30.3 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역; 여기에서 상기 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합함;
    (c) 인간 VH 3-30.3 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L18 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역; 여기에서 상기 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합함;
    (d) 인간 VH 4-61 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK L6 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역; 여기에서 상기 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합함; 또는
    (e) 인간 VH 3-23 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 중쇄 가변 영역 및 인간 VK A27 유전자의 생성물인 또는 상기 유전자로부터 유도된 경쇄 가변 영역; 여기에서 상기 항체는 인간 CD70에 특이적으로 결합함,
    상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 19를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 25를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 31을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 37을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 43을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 20을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 26을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 32를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 38을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 44를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 15를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 21을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 27을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 33을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 39를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 45를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  24. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 16을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 22를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 28을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 34를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 40을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 46을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 29를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 17을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 23을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 75를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 35를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 41을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 47을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 항체는
    (a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  28. 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서, 다음을 포함하며:
    (a) 서열번호 1-6, 및 73으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7-12로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 항체는 인간 CD70 단백질에 특이적으로 결합하고,
    상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  29. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  30. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  31. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  32. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  33. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  34. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  35. 제 28항에 있어서,
    (a) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    을 포함하는 항체-파트너 분자 접합체.
  36. 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부 및 파트너 분자를 포함하는 항체-파트너 분자 접합체로서, 다음을 포함하는 항체에 의하여 인식된 인간 CD70 단백질 상의 에피토프에 결합하며:
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (g) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    상기 파트너 분자는 치료적 제제인 항체-파트너 분자 접합체.
  37. 제 1항의 항체-파트너 분자 접합체, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  38. 제 1항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 세포독소인 항체-파트너 분자 접합체.
  39. 제 38항의 항체-파트너 분자 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  40. 제 1항에 있어서,
    상기 치료적 제제는 방사성 동위원소인 항체-파트너 분자 접합체.
  41. 제 40항의 항체-파트너 분자 접합체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  42. CD70-발현 종양 세포의 성장을 억제하기 위하여 CD70-발현 종양 세포를 제 1항의 항체-파트너 분자 접합체와 접촉시키는 것을 포함하는 CD70-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 CD70-발현 종양 세포는 신장 종양 세포 또는 림프종 세포인 방법.
  44. 제 42항에 있어서,
    상기 CD70-발현 종양 세포는 신장 세포 암종 또는 림프종으로 이루어진 군에서 선택된 암 유래인 방법.
  45. 대상체 내에서 암을 치료하기 위하여 대상체에 제 1항의 항체-파트너 분자를 투여하는 것을 포함하는 대상체 내에서 암을 치료하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    상기 암은 신장 세포 암종 또는 림프종인 방법.
  47. 제 45항에 있어서,
    상기 암은 신장 세포 암종(RCC), 투명세포 RCC, 교모세포종, 비-호지킨 림 프종(NHL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 버킷림프종, 미분화 거대세포 림프종(ALCL), 다발성 골수종, 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할-세포 림프종, 림프구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역모세포성 림프종, T-세포 백혈병/림프종(ATLL), 성인 T-세포 백혈병(T-ALL), 중심모세포성/중심세포성(cb/cc) 여포 림프종 암, B형의 미만성 거대세포 림프종, 혈관면역모세포성 림프절병증(AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 신체 체강 기반 림프종, 배아 암종, 비인강의 미분화 암종, 슈민케 종양, 캐슬맨병, 카포시육종, 다발성 골수종, 왈든스트롬 매크로글로불린혈증 및 B-세포 림프종으로이루어진 군에서 선택된 방법.
  48. 대상체 내에서 자가면역 질병을 치료 또는 예방하기 위하여 대상체에 제 1항의 항체-파트너 분자를 투여하는 것을 포함하는 대상체 내에서 자가면역 질병을 치료 또는 예방하는 방법.
  49. 대상체 내에서 염증을 치료 또는 예방하기 위하여 대상체에 제 1항의 항체-파트너 분자를 투여하는 것을 포함하는 대상체 내에서 염증을 치료 또는 예방하는 방법.
  50. 대상체 내에서 바이러스 감염을 치료하기 위하여 대상체에 제 1항의 항체-파트너 분자를 투여하는 것을 포함하는 대상체 내에서 바이러스 감염을 치료하는 방 법.
  51. 청구항 1에 있어서,
    상기 파트너 분자는 화학적 링커에 의하여 항체에 접합되는 항체-파트너 분자 접합체.
  52. 제 51항에 있어서,
    상기 화학적 링커는 펩티딜 링커, 하이드라진 링커, 및 디설파이드 링커로 이루어진 군에서 선택된 항체-파트너 분자 접합체.
  53. 제 1항에 있어서,
    상기 신장 세포 암종 종양 세포주는 786-O, A-498, ACHN, Caki-1 및 Caki-2 세포주로 이루어진 군에서 선택된 항체-파트너 분자 접합체.
  54. 제 1항에 있어서,
    상기 림프종 세포주는 B-세포 종양 세포주인 항체-파트너 분자 접합체.
  55. 제 54항에 있어서,
    상기 B-세포 종양 세포주는 다우디, HuT 78, 라지 및 그란타 519 세포주로 이루어진 군에서 선택된 항체-파트너 분자 접합체.
  56. 제 1항에 있어서,
    상기 항체, 또는 이의 항원 결합부는 비푸코실화되는 항체-파트너 분자 접합체.
  57. 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부.
  58. 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체에 의하여 인식된 인간 CD70 단백질 상의 에피토프에 결합하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원 결합부.
  59. (a) 서열번호 18을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
    (b) 서열번호 24를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
    (c) 서열번호 30을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
    (d) 서열번호 36을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
    (e) 서열번호 42를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및
    (f) 서열번호 48을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;
    을 포함하는, 분리된 단일클론 항체, 또는 이의 항원-결합부.
  60. 제 57항에 있어서,
    상기 항체, 또는 이의 항원-결합부는 비푸코실화되는 항체.
  61. 제 57항의 항체, 또는 이의 항원-결합부를 암호화하는 분리된 핵산 분자.
  62. 제 61항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  63. 제 62항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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