ITUB20155272A1 - Intracellular antibody - Google Patents

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ITUB20155272A1 ITUB2015A005272A ITUB20155272A ITUB20155272A1 IT UB20155272 A1 ITUB20155272 A1 IT UB20155272A1 IT UB2015A005272 A ITUB2015A005272 A IT UB2015A005272A IT UB20155272 A ITUB20155272 A IT UB20155272A IT UB20155272 A1 ITUB20155272 A1 IT UB20155272A1
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Michele Chirichella
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Description

RIVENDICAZIONI
1. Metodo per determinare la capacità di un’immunoglobulina di legarsi a un target modificato a livello post-traduzionale in un ambiente intracellulare, che si ripiega e viene modificato a livello post-traduzionale come una proteina nativa a livello intracellulare, comprendente le fasi di; a) fornire un acido nucleico codificante per un’immunoglobulina intracellulare che è associata a una prima molecola; e
b) fornire un acido nucleico codificante per un target intracellulare che è associato a:
- un enzima che modifica in vivo il target o soggetto a una codifica genetica sito-specifica diretta delle modifiche post-traduzionali (PTM) nella proteina target e
- una seconda molecola,
in cui detta prima e seconda molecola sono domini separabili di una molecola reporter; e c) esprimere detta prima sequenza nucleotidica insieme a detta seconda sequenza nucleotidica in un
ambiente intracellulare,
in cui il legame di detta immunoglobulina con detto target porta all<*>interazione stabile della prima molecola e della seconda molecola, producendo in questo modo una molecola reporter rilevabile che genera un segnale, e ;d) rilevare detto segnale da detta molecola reporter ri levabile, in cui detta rilevazione di un segnale è indice di attività di legame stabile tra detta immunoglobulina e detto target nell’ambiente intracellulare; ;e) isolare quelle immunoglobuline che si legano stabilmente al target ;e facoltativamente ;f) selezionare quelle immunoglobuline che non si legano a target che non è modificato a livello post-traduzionale. ;;2. Metodo per determinare la capacità di un’immunoglobulina di legarsi a un target modificato a livello post-traduzionale in un ambiente intracellulare, che si ripiega e viene modificato a livello post-traduzionale come una proteina nativa a livello intracellulare, comprendente le fasi di: a) fornire un acido nucleico codificante per un’ìmmunoglobulina intracellulare che è associata a una prima molecola; e ;b) fornire un acido nucleico codificante per un target intracellulare che incorpora una modifica post-traduzionale che viene codificata geneticamente tramite metodi basati sul codice genetico espanso e ;- una seconda molecola, ;in cui detta prima e seconda molecola sono domini separabili di una molecola reporter; e c) esprimere detta prima sequenza nucleotidica insieme a detta seconda sequenza nucleotidica in un ;ambiente intracellulare di una cellula in grado di decodificare tale modifica post-traduzionale codificata geneticamente, ;in cui il legame di detta immunoglobulina con detto target porta all<*>interazione stabile della prima molecola e della seconda molecola, producendo in questo modo una molecola reporter ri levabile che genera un segnale, e
d) rilevare detto segnale da detta molecola reporter rilevabile, in cui detta rilevazione di un segnale è indice di attività di legame stabile tra detta immunoglobulina e detto target nell’ ambi ente intracellulare;
e) isolare quelle immunoglobuline che si legano stabilmente al target
e facoltativamente
f) selezionare quelle immunoglobuline che non si legano a un target che non è modificato a livello post-traduzionale.
3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’acido nucleico codificante per Pìmmunoglobulina viene ottenuto da una libreria codificante un repertorio di acidi nucleici codificanti immunoglobuline e/o non viene usata alcuna applicazione preventiva dell’esposizione su fago per isolare le immunoglobuline che si legano a un target.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la modifica posttraduzionale è almeno una modifica selezionata dal gruppo consistente in: aceti lazione, fosforilazione, SUMOilazione, poliubiquitinazione e monoubiquitinazione, metilazione, trimetilazione, succilinazione, S-glutationilazione, adenililazione, ammidazione, miristoilazione, palmitoilazione, prenilazione, alchilazione, tirosilazione, nitrosi lazione.
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la molecola reporter è selezionata dal gruppo consistente in un fattore di trascrizione, un enzima e una molecola bioluminescente.
6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui la molecola reporter è un enzima e il metodo viene effettuato in presenza di un substrato per l’enzima.
7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la prima molecola è il dominio di attivazione di VP 16 e la seconda molecola è il dominio legante il DNA di LexA.
8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase del rilevamento è selezionata dal gruppo consistente in: un cambiamento in una proprietà ottica e l’attivazione di un gene reporter, e/o consente il selezionamento di cellule.
9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’immunoglobulina è selezionata dal gruppo consistente in un’immunoglobulina intatta, un Fv, un scFv (frammento Fv a catena singola), un Fab, un F(ab’)2, un dominio “simil-anticorpo”, un dominio “anticorpomimetico”, un dominio anticorpale singolo (dominio VH o domini VL),
10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la libreria è una libreria di scFv di topo na<'>rve SPLINT o una libreria fagica codificante un repertorio di immunoglobuline e/o la libreria è costruita dagli acidi nucleici isolati da un organismo che è stato stimolato con un antigene.
1 1. Immunoglobulina intracellulare ottenibile mediante il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10,
12. Anticorpo intracellulare, relativi frammenti leganti l’antigene ricombinanti o sintetici comprendenti una sequenza avente una % di identità di sequenza amminoacidica almeno dell’80% con la SE Q ID NO:2, la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO: 1.
13. Anticorpo intracellulare, relativi frammenti leganti Tanti gene ricombinanti o sintetici in grado di riconoscere e legare un epitopo comprendente la SEQ ID NO:6.
14. Uso delTimmunoglobulina intracellulare secondo la rivendicazione 11, o delTimmunoglobulina intracellulare selezionata mediante il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, o del Tanti corpo intracellulare, di relativi frammenti leganti Tanti gene ricombinanti o sintetici secondo le rivendicazioni 12 o 13 per interferenza funzionale PTM-selettiva nelle cellule, per terapia genica, per immunoprecipitazione della cromatina, per saggi in vitro come ELISA, Western blot, Dot blot, accoppiamento di effettori funzionali.

Claims (14)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per determinare la capacità di un’immunoglobulina di legarsi a un target modificato a livello post-traduzionale in un ambiente intracellulare, che si ripiega e viene modificato a livello post-traduzionale come una proteina nativa a livello intracellulare, comprendente le fasi di; a) fornire un acido nucleico codificante per un’immunoglobulina intracellulare che è associata a una prima molecola; e b) fornire un acido nucleico codificante per un target intracellulare che è associato a: - un enzima che modifica in vivo il target o soggetto a una codifica genetica sito-specifica diretta delle modifiche post-traduzionali (PTM) nella proteina target e - una seconda molecola, in cui detta prima e seconda molecola sono domini separabili di una molecola reporter; e c) esprimere detta prima sequenza nucleotidica insieme a detta seconda sequenza nucleotidica in un ambiente intracellulare, in cui il legame di detta immunoglobulina con detto target porta all interazione stabile della prima molecola e della seconda molecola, producendo in questo modo una molecola reporter rilevabile che genera un segnale, e d) rilevare detto segnale da detta molecola reporter ri levabile, in cui detta rilevazione di un segnale è indice di attività di legame stabile tra detta immunoglobulina e detto target nell’ambiente intracellulare; e) isolare quelle immunoglobuline che si legano stabilmente al target e facoltativamente f) selezionare quelle immunoglobuline che non si legano a target che non è modificato a livello post-traduzionale.
  2. 2. Metodo per determinare la capacità di un’immunoglobulina di legarsi a un target modificato a livello post-traduzionale in un ambiente intracellulare, che si ripiega e viene modificato a livello post-traduzionale come una proteina nativa a livello intracellulare, comprendente le fasi di: a) fornire un acido nucleico codificante per un’ìmmunoglobulina intracellulare che è associata a una prima molecola; e b) fornire un acido nucleico codificante per un target intracellulare che incorpora una modifica post-traduzionale che viene codificata geneticamente tramite metodi basati sul codice genetico espanso e - una seconda molecola, in cui detta prima e seconda molecola sono domini separabili di una molecola reporter; e c) esprimere detta prima sequenza nucleotidica insieme a detta seconda sequenza nucleotidica in un ambiente intracellulare di una cellula in grado di decodificare tale modifica post-traduzionale codificata geneticamente, in cui il legame di detta immunoglobulina con detto target porta all<*>interazione stabile della prima molecola e della seconda molecola, producendo in questo modo una molecola reporter ri levabile che genera un segnale, e d) rilevare detto segnale da detta molecola reporter rilevabile, in cui detta rilevazione di un segnale è indice di attività di legame stabile tra detta immunoglobulina e detto target nell’ ambi ente intracellulare; e) isolare quelle immunoglobuline che si legano stabilmente al target e facoltativamente f) selezionare quelle immunoglobuline che non si legano a un target che non è modificato a livello post-traduzionale.
  3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui l’acido nucleico codificante per Pìmmunoglobulina viene ottenuto da una libreria codificante un repertorio di acidi nucleici codificanti immunoglobuline e/o non viene usata alcuna applicazione preventiva dell’esposizione su fago per isolare le immunoglobuline che si legano a un target.
  4. 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la modifica posttraduzionale è almeno una modifica selezionata dal gruppo consistente in: aceti lazione, fosforilazione, SUMOilazione, poliubiquitinazione e monoubiquitinazione, metilazione, trimetilazione, succilinazione, S-glutationilazione, adenililazione, ammidazione, miristoilazione, palmitoilazione, prenilazione, alchilazione, tirosilazione, nitrosi lazione.
  5. 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la molecola reporter è selezionata dal gruppo consistente in un fattore di trascrizione, un enzima e una molecola bioluminescente.
  6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui la molecola reporter è un enzima e il metodo viene effettuato in presenza di un substrato per l’enzima.
  7. 7. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la prima molecola è il dominio di attivazione di VP 16 e la seconda molecola è il dominio legante il DNA di LexA.
  8. 8. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la fase del rilevamento è selezionata dal gruppo consistente in: un cambiamento in una proprietà ottica e l’attivazione di un gene reporter, e/o consente il selezionamento di cellule.
  9. 9. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui l’immunoglobulina è selezionata dal gruppo consistente in un’immunoglobulina intatta, un Fv, un scFv (frammento Fv a catena singola), un Fab, un F(ab’)2, un dominio “simil-anticorpo”, un dominio “anticorpomimetico”, un dominio anticorpale singolo (dominio VH o domini VL),
  10. 10. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, in cui la libreria è una libreria di scFv di topo narve SPLINT o una libreria fagica codificante un repertorio di immunoglobuline e/o la libreria è costruita dagli acidi nucleici isolati da un organismo che è stato stimolato con un antigene.
  11. 1 1. Immunoglobulina intracellulare ottenibile mediante il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10,
  12. 12. Anticorpo intracellulare, relativi frammenti leganti l’antigene ricombinanti o sintetici comprendenti una sequenza avente una % di identità di sequenza amminoacidica almeno dell’80% con la SE Q ID NO:2, la SEQ ID NO:3 o la SEQ ID NO: 1.
  13. 13. Anticorpo intracellulare, relativi frammenti leganti Tanti gene ricombinanti o sintetici in grado di riconoscere e legare un epitopo comprendente la SEQ ID NO:6.
  14. 14. Uso delTimmunoglobulina intracellulare secondo la rivendicazione 11, o delTimmunoglobulina intracellulare selezionata mediante il metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 10, o del Tanti corpo intracellulare, di relativi frammenti leganti Tanti gene ricombinanti o sintetici secondo le rivendicazioni 12 o 13 per interferenza funzionale PTM-selettiva nelle cellule, per terapia genica, per immunoprecipitazione della cromatina, per saggi in vitro come ELISA, Western blot, Dot blot, accoppiamento di effettori funzionali.
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