DE69123156T3

DE69123156T3 - VERFAHREN ZUR ERZEUGUNG FUNKTIONELLER, EINKETTIGER Fv ANTIKOERPER-FRAGMENTE AUF BAKTERIOPHAGEN-OBERFLÄCHEN

Info

Publication number: DE69123156T3
Application number: DE69123156T
Authority: DE
Inventors: John Sawston McCAFFERTY; Anthony Richard Pope; Kevin Stuart Godmanchester JOHNSON; Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom; Andrew David Griffiths; Ronald Henry Jackson; Kaspar Philipp Holliger; James David Marks; Timothy Piers Clackson; David John Chiswell; Gregory Paul Winter; Timothy Peter Bonnert
Original assignee: Medical Research Council; Cambridge Antibody Technology Ltd
Current assignee: Medical Research Council; MedImmune Ltd
Priority date: 1990-07-10
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2011-07-11
Also published as: DE122010000026I2; JP3176917B2; EP0589877B2; US7723270B1; DE69133545T2; EP1847605A3; DE69133545D1; DE69132920D1; AU8221691A; ATE339497T1; CA2086936C; EP1847605A2; US20070148774A1; EP1754787A3; ES2322323T1; DE69132920C5; ATE145237T1; DE122010000026I1; AU664155B2; NL300423I1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Bestandteilen von spezifischen Bindungspaaren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch diese Verfahren hergestellten biologischen Bindemoleküle.
Aufgrund ihrer hohen Spezifität für ein bestimmtes Antigen, stellte das Aufkommen von monoklonalen Antikörpern (Kohler, G. and Milstein C.; 1975 Nature 256: 495) einen bedeutenden technischen Durchbruch mit wichtigen, sowohl wissenschaftlichen als auch wirtschaftlichen Konsequenzen dar.
Monoklonale Antikörper werden herkömmlicherweise hergestellt, indem eine immortalisierte Säugetierzelllinie etabliert wird, die aus einer einzelnen, Immunglobuline produzierenden Zelle, die eine Form eines biologisch funktionellen Antikörpermoleküls mit einer bestimmten Spezifität sekretiert, stammt. Da die Antikörper herstellende Säugetierzelle immortalisiert ist, sind die Eigenschaften des Antikörpers von Charge zu Charge reproduzierbar. Die Schlüsseleigenschaften monoklonaler Antikörper sind deren Spezifität für ein bestimmtes Antigen und die Reproduzierbarkeit, mit der sie hergestellt werden können.
Strukturell umfaßt der einfachste Antikörper (IgG) vier Polypeptidketten, zwei schwere (H) Ketten und zwei leichte (L) Ketten, die durch Disulfidbindungen miteinander verbunden sind (siehe 1). Die leichten Ketten existieren in zwei unterschiedlichen Formen, die kappa (κ) und lambda (λ) genannt werden. Jede Kette weist eine konstante Region (C) und eine variable Region (V) auf. Jede Kette ist in eine Reihe von Domänen aufgeteilt. Die leichten Ketten haben zwei Domänen, wobei eine der C-Region und die andere der V-Region entspricht. Die schweren Ketten weisen 4 Domänen auf, wobei eine der V-Region entspricht und drei Domänen (1, 2 und 3) sich in der C-Region befinden. Der Antikörper hat zwei Arme (jeder Arm stellt eine Fab-Region dar), wobei jeder davon eine VL- und eine VH-Region aufweist, die miteinander assoziiert sind. Es ist dieses Paar der V-Regionen (VL und VH), das sich von einem Antikörper zu einem anderen unterscheidet (aufgrund der Aminosäuresequenzvariationen), und welche gemeinsam für die Erkennung des Antigens und die Bereitstellung einer Antigenbindestelle (ABS) verantwortlich sind. Noch detaillierter ist jede V-Region aus drei Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDR) aufgebaut, die von vier Gerüst-(framework)-Regionen (FR) getrennt werden. Die CDR's sind der variabelste Teil der variablen Regionen, und sie erfüllen die entscheidende Antigenbindefunktion. Die CDR-Regionen werden aus vielen potentiellen Keimliniensequenzen über einen komplexen Vorgang erhalten, an dem Rekombination, Mutation und Selektion beteiligt sind.
Es zeigte sich, daß die Antigenbindefunktion von Fragmenten eines ganzen Antikörpers erfüllt werden kann. Beispiele für Bindefragmente sind (i) das Fab-Fragment, das aus den VL-, VH-, CL- und CH1-Domänen besteht; (ii) das Fd-Fragment, das aus den VH- und CH1-Domänen besteht; (iii) das Fv-Fragment, das aus den VL- und VH-Domänen eines einzelnen Arms eines Antikörpers besteht; (iv) das dAb-Fragment (Ward, E. S. et al., Nature 341, 544–546 (1989)), das aus einer VH-Domäne besteht; (v) isolierte CDR-Regionen; und (vi) F(ab')₂-Fragmente, ein bivalentes Fragment, das zwei Fab-Fragmente umfaßt, die durch eine Disulfidbrücke bei der Hinge-("Scharnier")-Region verbunden sind.
Obwohl die zwei Domänen des Fv-Fragments von verschiedenen Genen kodiert werden, wurde gezeigt, daß es durch rekombinante Verfahren möglich ist, einen synthetischen Linker herzustellen, der es ihnen ermöglicht, als einzelne Proteinkette hergestellt zu werden (bekannt als Einzelketten-Fv (scFv); Bird, R. E. et al., Science 242, 423–426 (1988) Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 5879–5883 (1988)). Diese scFv-Fragmente werden aus Genen von Monoklonalen zusammengestellt, die zuvor isoliert wurden. In dieser Anwendung beschreiben die Anmelder ein Verfahren, um scFv-Fragmente aus VH- und VL-Domänen zusammenzufügen, die nicht Teil eines Antikörpers sind, der zuvor isoliert wurde.
Obwohl monoklonale Antikörper, deren Fragmente und Derivate enorme Vorteile mit sich brachten, gibt es nach wie vor eine Anzahl von damit verbundenen Einschränkungen.
Erstens sind die therapeutischen Anwendungen monoklonaler Antikörper, die von menschlichen, immortalisierten Zelllinien hergestellt werden, sehr vielversprechend für die Behandlung eines weiten Bereichs von Erkrankungen (Clinical Applications of Monoclonal Antibodies. Herausgegeben von E. S. Lennox. British Medical Bulletin 1984. Veröffentlicht von Churchill Livingstone). Leider sind menschliche Zelllinien, die immortalisierte Antikörper produzieren, sehr schwierig zu erhalten und diese ergeben geringe Ausbeuten an Antikörper (etwa 1 μg/ml). Im Gegensatz dazu ergeben Nagetierzelllinien hohe Mengen an Antikörpern (etwa 100 μg/ml). Die wiederholte Verabreichung dieses fremden Nagetierproteins an Menschen kann jedoch zu schädlichen Überempfindlichkeitsreaktionen führen. Daher sind diese aus Nagetieren stammenden monoklonalen Antikörper zumeist nur eingeschränkt therapeutisch verwendbar.
Zweitens ist es ein Schlüsselaspekt beider Isolierung der monoklonalen Antikörper, wieviele verschiedene Klone der antikörperproduzierenden Zellen mit verschiedenen Spezifitäten praktisch etabliert und geerntet werden können, im Vergleich dazu, wieviele theoretisch geerntet werden müssen, um eine Zelle zu isolieren, die Antikörper mit den gewünschten Spezifitätseigenschaften produziert (Milstein, C., Royal Soc. Croonian Lecture, Proc. R. Soc. London, B. 239; 1–16, (1990)). Beispielweise glaubt man, daß die Anzahl der verschieden Spezifitäten, die zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Lymphozyten des Immunsystems der Maus exprimiert werden, etwa 10⁷ ist und dies ist nur ein kleiner Teil der potentiellen Repertoires der Spezifitäten. Während der Isolierung einer typischen antikörperproduzierenden Zelle mit der erwünschten Spezifität kann der Untersucher jedoch nur von 10³ bis 10⁴ einzelne Spezifitäten ernten. Das Problem ist beim Menschen noch größer, da dieser etwa 10¹² Lymphozytenspezifitäten aufweist und die Enschränkung besteht, daß davon lediglich 10³ oder 10⁴ geerntet werden können.
Dieses Problem wurde in einem gewissen Ausmaß bei Labortieren durch die Verwendung von Immunisierungsmodellen vermindert. Wenn man monoklonale Antikörper mit einer Spezifität gegen ein bestimmtes Epitop herstellen möchte, wird ein Tier mit einem Immunogen, das dieses Epitop exprimiert, immunisiert. Das Tier baut dann eine Immunreaktion gegen das Epitop auf und es gibt eine Vermehrung von Lymphozyten, die Spezifität gegen dieses Epitop aufweisen. Aufgrund dieser Vermehrung der Lymphozyten mit der gewünschten Spezifität wird es einfacher, diese im Ernteverfahren aufzufinden. Dieser Ansatz ist jedoch nicht in allen Fällen erfolgreich, da möglicherweise ein geeignetes Immunogen nicht zur Verfügung steht. Weiters ist, wenn man menschliche monoklonale Antikörper herstellen möchte (z.B. zur therapeutischen Verabreichung wie oben besprochen), solch ein Ansatz praktisch oder ethisch nicht durchführbar.
In den letzten Jahren wurden diese Probleme zum Teil durch die Anwendung von rekombinanten DNA-Verfahren zur Isolierung und Produktion von z.B. Antikörpern und Fragmenten von Antikörpern mit Antigenbindefähigkeit, in Bakterien wie z.B. E.coli in Angriff genommen.
Dieser einfache Ersatz von immortalisierten Zellen durch Bakterienzellen als "Fabrik" vereinfacht die Verfahren zur Herstellung großer Mengen von Bindemolekülen beträchtlich. Weiters gibt ein rekombinantes Produktionssystem Raum für die Herstellung von zurechtgeschnittenen Antikörpern und Fragmenten davon. Beispielsweise ist es möglich, chimäre Moleküle mit neuen Kombinationen von Binde- und Effektorfunktionen, "humanisierte" Antikörper (z.B. variable Regionen aus Mäusen kombiniert mit konstanten Domänen aus Menschen, oder Antikörper-CDR's aus Mäusen auf menschliche FR aufgepfropft) und neue Antigenbindemoleküle zu produzieren. Weiters weist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion-(polymerase chain reaction, PCR) -amplifikation (Saiki, R. K., et al., Science 239, 487–491 (1988) zur Isolierung von antikörperproduzierenden Sequenzen aus Zellen (z.B. Hybridome und B-Zellen) ein großes Potential zur Beschleunigung des Zeitmaßstabs, mit dem Spezifitäten isoliert werden können, auf. Amplifizierte VH- und VL-Gene werden direkt in Vektoren zur Expression in Bakterien oder Säugetierzellen kloniert (Orlandi, R., et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 3833–3837; Ward, E. S., et al., 1989, s.o.; Larrick, J. W., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1250–1255; Sastry, L. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86, 5728–5732). Von Bakterien sekretierte lösliche Antikörperfragmente werden dann auf Bindeaktivität gescreent.
Wie das Produktionssystem, das auf immortalisierten Zellen basiert, weist jedoch auch das rekombinante Produktionssystem noch den Nachteil des zuvor diskutierten Selektionsproblems auf und vertraut daher auf die Immunisierung, um den Anteil an Zellen mit der erwünschten Spezifität zu erhöhen. Weiters können einige dieser Verfahren die Screeningprobleme verschlimmern. Beispielsweise wurden große getrennte Bibliotheken der H- und L-Ketten aus immunisierten Mäusen hergestellt und vor dem Screenen nach einem statistischen Kombinationsverfahren miteinander kombiniert (Huse, W. D. et al., 19889, Science 246, 1275–1281, WO 90/14443; WO 90/14424 und WO 90/14430). Jedoch geht dabei die in jeder Zelle enthaltene Information, nämlich die ursprüngliche Paarung einer bestimmten L-Kette mit einer bestimmten H-Kette, verloren. Dies führt zum Verlust einiger der durch die Verwendung von Immunisierungstechniken bei Tieren erlangten Vorteile. Derzeit weisen nur Bibliotheken, die aus einzelnen VH-Domänen stammen (dAbs: Ward, E. S., et al., 1989, s.o.), diesen Nachteil nicht auf. Da jedoch nicht alle Antikörper-VH-Domänen Antigen binden können, müssen mehr gescreent werden. Zusätzlich verbleibt das zu lösende Problem, viele verschiedene Spezifitäten in Prokaryoten direkt zu screenen.
Somit besteht ein Bedarf an einem Screeningsystem, das eines oder mehrere der obigen oder andere Probleme vermindert oder beseitigt. Das ideale System würde das Ernten einer sehr großen Anzahl an Spezifitäten (z.B. 10⁶ und mehr), ein rasches Sortieren bei jeder Klonierungsrunde und einen raschen Transfer des für das Bindemoleküls kodierenden genetischen Materials von einer Stufe des Produktionsprozesses zur nächsten Stufe gestatten.
Die attraktivsten Kandidaten für diesem Screeningtyp wären prokaryotische Organismen (da diese schnell wachsen, einfach handzuhaben sind und da eine große Anzahl an Klonen gebildet werden kann), die an ihrer Oberfläche eine funktionelle Bindedomäne exprimieren und aufweisen, z.B. einen Antikörper, Rezeptor, Enzym usw. Im UK-Patent GB-2137631B werden Verfahren zur Co-Expression der Gene der variablen H- und L-Ketten von Immunoglobulinen in einer einzigen Wirtszelle geoffenbart. Doch das Protein wurde intrazellulär exprimiert und war unlöslich. Weiters erfor derte das Protein eine ausgedehnte Verarbeitung, um Antikörperfragmente mit Bindeaktivität zu bilden, und dies führte zu einem Material mit nur einem Bruchteil der Bindeaktivität, die für Antikörperfragmente bei dieser Konzentration erwartet wurde. Es wurde bereits gezeigt, daß Antikörperfragmente mit dem geeigneten Signalpeptid durch bakterielle Membranen sekretiert werden können (Skerra, A. und Pluckthun, A. 1988, Science 240, 1041–1043) mit einem darauffolgenden Anstieg der Bindeaktivität der Antikörperfragmente. Diese Verfahren erfordern das Screenen der einzelnen Klone auf Bindeaktivität in derselben Art wie die monoklonalen Antikörper aus Mäusen.
Es wurde jedoch nicht gezeigt, wie eine funktionelle Bindedomäne, z.B. ein Antikörper, Antikörperfragment, Rezeptor, Enzym, etc., auf der Oberfläche des Bakteriums in einer Konfiguration, die das Ernten, z.B. seiner Antigenbindefragmente, und die Selektion auf Klone mit gewünschten Eigenschaften gestattet, gehalten werden kann. Zu einem großen Teil ist dies deshalb, weil die Oberfläche des Bakteriums eine komplexe Struktur aufweist, und bei den gram-negativen Organismen gibt es eine Außenwand, was die Position weiter kompliziert. Weiters wurde nicht gezeigt, daß sich z.B. eine Antikörperdomäne korrekt faltet, wenn sie als Fusion mit einem Oberflächenprotein von Bakterien oder Bakteriophagen exprimiert wird.
Bakteriophagen sind für diesen Screeningtyp attraktive, mit Prokaryoten verwandte Organismen. Im allgemeinen weist ihre Oberfläche eine relativ einfache Struktur auf, sie können leicht in großer Zahl gezüchtet werden, sie sind der praktischen Handhabung, die bei vielen potentiellen Massenscreenprogrammen angewendet wird, leicht zugänglich, und sie tragen die genetische Information für ihre eigene Synthese innerhalb einer kleinen einfachen Verpackung. Die Schwierigkeit bestand darin, praktisch das Problem zu lösen, wie Bakteriophagen auf diese Weise verwendet werden können. Eine Genex Corporation Patentanmeldung Nr. WO 88/06630 schlug vor, daß der Bakteriophage λ ein geeignetes Vehikel für die Expression von Antikörpermolekülen ist, aber es wurde nicht gelehrt, wie diese allgemeine Idee ausgeführt werden kann. Beispielsweise zeigt die WO 80/06630 nicht, daß irgendwelche Sequenzen (a) als Fusion mit dem V-Gen exprimiert wurden; (b) auf der Oberfläche von λ exprimiert wurden; (c) so exprimiert wurden, daß das Protein biologische Aktivität beibehält. Weiters wurde nicht gezeigt, wie man nach geeigneten Fusionen screent. Da die λ-Virionen innerhalb der Zelle angeordnet werden, würde das Fusionsprotein intrazel-lulär exprimiert und daher wurde angenommen, daß es inaktiv ist. Bass et al., Dezember 1990 (nach der frühesten Priorität der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Deletion eines Teils des Gens III des filamentösen Bakteriophagen M13 und die Insertion der Kodiersequenz des menschlichen Wachstumshormons (hGH) an der N-terminalen Stelle des Gens. Das von M13 gezeigte Wachstumshormon erwies sich als funktionell. (Bass, S., et al., Proteins, Structur, Function and Genetics (1990) 8: 309–314). Zusätzlich war immer, wenn diese Fusion exprimiert wurde, eine funktionelle Kopie des Gens III vorhanden. Eine Patentanmeldung der Protein Engineering Corporation WO 90/02809 schlägt die Insertion der Kodiersequenz des Rinderpankreastrypsininhibitors (BPTI) in das Gen VIII von M13 vor. Es zeigte sich jedoch, daß dieser Vorschlag nicht funktionierte. Beispielsweise wurde nicht gezeigt, daß die BPTI-Sequenzen als Fusionen mit dem Gen III exprimiert und an der Oberfläche von M13 gezeigt werden. Weiters lehrt dieses Dokument, daß, wenn eine Fusion mit dem Gen III durchgeführt wird, es notwendig ist, eine zweite synthetische Kopie des Gens III zu verwenden, sodaß auch unverändertes Gen III-Protein vorhanden ist. Die Ausführungsformen der vorliegenden Anmeldung tun dies nicht. In Ausführungsformen, in denen der Phagemid mit dem M13K07-Gen III-Deletions-Phagen ergänzt ("rescued") wird, ist kein unverändertes Gen III vorhanden.
Die Anmeldung WO 90/02809 lehrt auch, daß Phagemide, die nicht das vollständige Genom von M13 enthalten und Ergänzung ("rescue") durch Co-Infektion mit einem Helferphagen erfordern, nicht für diese Zwecke geeignet sind, da die Co-Infektion zur Rekombination führen könnte.
In allen Ausführungsformen, bei denen die vorliegenden Anmelder Phagemide verwendet haben, haben sie einen Helferphagen verwendet und die einzigen Sequen zen, die in den Phagemiden aus filamentösen Bakteriophagen stammen, sind der Replikationsursprung und die Gen III-Sequenzen.
Die Anmeldung WO 90/02809 lehrt auch, daß deren Verfahren Information wie z.B. die Nukleotidsequenz des Startmoleküls und dessen dreidimensionale Struktur erforderte. Die Verwendung eines bereits existenten Repertoires an Bindemolekülen, um nach einem Bindebestandteil zu screenen, wie dies hierin offenbart wird, wurde nicht geoffenbart. Weiters diskutieren sie nicht die Bevorzugung der Vielfalt ihrer Bindemoleküle in natürlichen Variationsblöcken, wie z.B. CDR's von Immunglobulinen, um die Bildung von verbesserten Molekülen zu bevorzugen und unvorteilhafte Variationen zu vermeiden. Die Anmeldung WO 90/02809 schließt auch spezifisch die Anmeldung ihres Verfahrens zur Produktion von scFv-Molekülen aus.
In jedem der oben besprochenen Patente (WO 88/06630 und WO 90/02809), ist das zum Zeigen vorgeschlagene Protein eine einzelne Polypeptidkette. Es gibt keine Offenbarung eines Verfahrens, das ein dimeres Molekül durch Expression eines Monomers als Fusion mit einem Capsidprotein und das andere Protein in freier Form zeigt.
WO 91/17271, zitierbar unter Artikel 54(3) DPC und nur wie diese gemäß ihrem früher beanspruchten Prioritätsdatum berechtigt, beschreibt die Insertion eines Proteins in ein Hüllenprotein eines Bakteriophagen und die Verwendung von Affinitätsreinigungsverfahren, um Phagenpartikel auszuwählen.
Eine weitere Offenbarung, veröffentlicht im Mai 1991 (nach dem frühesten Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung) beschreibt die Insertion der Kodiersequenzen einer der zwei Kettern des Fab-Abschnitts eines Antikörpers in Gen VIII von M13 mit einer Co-Expression des anderen aus einem Plasmid.
Es wurde gezeigt, daß die zwei Ketten als funktionelles Fab-Fragment auf der Oberfläche des Phagen exprimiert wurden (Kang A. S. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88 S. 4363–4366). Es erfolgte keine Offenbarung der Insertionsstelle in Gen VIII und der Assay auf pAb-Bindeaktivität durch ELISA benützte ein Reagens, daß für die L-Kette eines Antikörpers und nicht für einen Phagen spezifisch ist. Eine weitere Offenbarung, die im März 1991 (nach dem frühesten Prioritätsdatum der vorliegenden Anmeldung) veröffentlicht wurde, beschreibt die Insertion eines Fragments des gag-Proteins des AIDS-Virus in den N-terminalen Abschnitt des Gen III des Bakteriophagen fd. Die Expression des gag-Proteins wurde durch immunologische Verfahren nachgewiesen, aber es wurde nicht gezeigt, ob das Protein in einer funktionellen Form exprimiert wurde (Tsunetsugu-Yokota Y. et al., (1991) Gene 99 S. 261–265).
Das Problem, wie Bakteriophagen auf diese Weise zu verwenden sind, ist tatsächlich schwierig. Das Protein muß in den Phagen in einer Weise insertiert werden, daß die Integrität der Phagenhülle nicht verletzt wird, und das Protein selbst sollte funktionell sein und seine biologische Aktivität bezüglich der Antigenbindung beibehalten. Somit sollte, wenn das Protein der Wahl ein Antikörper ist, dieser sich korrekt und effizient falten und zur Antigenbindung präsentiert werden. Eine Lösung des Problems für Antikörpermoleküle und -fragmente würde auch ein allgemeines Verfahren für ein beliebiges Biomolekül, das ein Bestandteil eines spezifischen Bindepaares ist, z.B. Rezeptormoleküle und Enzyme, bereitstellen.
Überraschenderweise konnten die Anmelder einen Bakteriophagen konstruieren, der an seiner Oberfläche ein großes, biologisch funktionelles Bindemolekül (z.B. Antikörperfragmente, Enzyme und Rezeptoren) exprimiert und zeigt, und der intakt und infektiös bleibt. Die Anmelder nannten die Struktur, die ein Viruspartikel und ein Bindemolekül umfaßt, eine "Packung" ("package"). Wenn das Bindemolekül ein Antikörperderivat oder -fragment oder eine Domäne ist, die homolog zu einer Immunglobulindomäne ist, nennen die Anmelder die Packung einen "Phagenantikörper" (pAb). Es sollte jedoch, außer wenn es der Zusammenhang anders verlangt, wenn der Ausdruck Phagenantikörper allgemein verwendet wird, dieser ebenfalls so interpretiert werden, daß er sich auf eine beliebige Packung, die ein Viruspartikel und ein auf der Virusoberfläche gezeigtes, biologisch funktionelles Bindemolekül umfaßt, bezieht.
pAbs haben einen Anwendungsbereich bei der Auswahl von Antikörpergenen, die für Antigenbindeaktivität kodieren. Beispielsweise können pAbs zum Klonieren und Auswählen von Hybridomen verwendet werden (Orlandi, R., et al., (1989) PNAS 86 S. 3833–3837), und beim Screenen von großen kombinatorischen Bibliotheken (wie z.B. jene in Huse, W. D. et al., 1989, Science 246, 1275–1281). Insbesondere können Selektionsrunden unter Verwendung von pAbs bei der Auswahl von Antikörpern mit hoher Affinität aus den letzteren Bibliotheken hilfreich sein. Es kann vorzuziehen sein, kleine Bibliotheken zu screenen, die aus Antigen-selektierten Zellen stammen (Casali, P., et al., (1986) Science 234 S. 476–479), um die ursprünglichen VH/VL-Paare, die die Fv-Region eines Antikörpers umfassen, auszuwählen. Die Verwendung von pAbs kann auch die Konstruktion von vollständig synthetischen Antikörpern gestatten. Weiters können Antikörper hergestellt werden, die einige synthetische Sequenzen, z.B. CDRs, und einige natürliche vorkommende Sequenzen aufweisen. Beispielsweise können V-Genrepertoires in vitro hergestellt werden, indem nicht erneut angeordnete V-Gene mit D- und J-Segmenten kombiniert werden. Bibliotheken von pAbs können dann durch die Bindung an Antigen ausgewählt werden, in vitro in den Antigen-bindenden Schleifen oder V-Domänengerüstregionen hypermutiert werden, und weiteren Selektions- und Mutageneserunden unterzogen werden.
Wie bereits besprochen, verlieren getrennte H- und L-Kettenbibliotheken die ursprüngliche Paarung zwischen den Ketten. Es ist schwierig, eine Bibliothek, die groß genug für eine besonders vorteilhafte Kombination von H- und L-Ketten ist, herzustellen und zu screenen.
Beispielsweise gibt es in einer Maus etwa 10⁷ mögliche H-Ketten und 10⁷ mögliche L-Ketten, und um etwas wie diese Anzahl an Kombinationen zu testen, müßte man eine Bibliothek mit etwa 10¹⁴ Klonen herstellen und screenen. Dazu gab es bisher keine praktische Möglichkeit.
Die vorliegende Erfindung bietet eine Anzahl an Ansätzen, die dieses Problem erleichtern.
In einem ersten Ansatz, (ein statistischer kombinatorischer Ansatz, siehe Beispiele 15 und 16) wird eine größtmögliche Bibliothek gebildet, die so viele wie möglich von den 10¹⁴ möglichen Kombinationen exprimiert. Durch die Expression der H- und L-Ketten auf der Oberfläche des Phagen, ist es jedoch in vernünftigem Ausmaß durchführbar, die gewünschte Kombination aus allen gebildeten Kombinationen durch Affinitätsverfahren auszuwählen (siehe weiter unten zur Beschreibung der Selektionsformate).
In einem zweiten Ansatz (von den Anmeldern dualer kombinatorischer Ansatz genannt) wird zur Selektion der gewünschten Kombination eine große Bibliothek aus zwei kleineren Bibliotheken gebildet. Dies erleichtert das Problem weiter. Der Ansatz beinhaltet die Bildung von: (i) einer ersten Bibliothek von etwa 10⁷ z.B. H-Ketten, die auf einem Bakteriophagen gezeigt werden (als Fusion mit dem durch Gen III kodierten Gen), die gegen z.B. Tetracyclin resistent ist; und (ii) einer zweiten Bibliothek mit etwa 10⁷ z.B. L-Ketten, in der die Kodiersequenzen für diese leichten Ketten innerhalb eines Plasmidvektors, der einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen (ein Phagemid) enthält, die gegen z.B. Ampicillin resistent ist (d.h. ein unterschiedliches Antibiotikum) und die im periplasmatischen Raum eines Wirtsbakteriums exprimiert werden. Die erste Bibliothek wird dann verwendet, um die Bakterien, die die zweite Bibliothek enthalten, zu infizieren, um 10¹⁴ Kombinationen von H- und L-Ketten auf der Oberfläche der resultierenden Phagen im bakteriellen Überstand zu liefern.
Der Vorteil dieses Ansatzes ist, daß zwei getrennte Bibliotheken mit etwa 10⁷ Elementen gebildet werden, um 10¹⁴ Kombinationen herzustellen. Die Bildung einer Bibliothek mit 10⁷ Elementen ist praktisch möglich.
Die 10¹⁴ Kombinationen werden dann einer Selektion unterzogen (siehe weiter unten zur Beschreibung der Selektionsformate) wie dies durch die vorliegende Anmeldung geoffenbart wird. Diese Selektion gibt dann eine Phagenpopulation, die eine bestimmte Kombination von H- und L-Ketten mit der gewünschten Spezifität zeigt. Die ausgewählten Phagen enthalten jedoch nur DNA, die für einen Bestandteil des Paars der H- und L-Ketten kodiert (stammt entweder aus dem Phagen oder aus dem Phagemid). Das Probeneluat, das die Population enthält, wird dann in zwei Teile geteilt. Ein erster Teil wird auf z.B. Tetracyclinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen auszuwählen, die DNA, die für an der Antigenbindung beteiligte H-Ketten kodiert, enthalten. Ein zweiter Teil wird auf z.B. Ampicillinplatten gezüchtet, um jene Bakteriophagen auszuwählen, die Phagemid-DNA, die für an der Antigenbindung beteiligte H-Ketten kodiert, enthalten. Ein Koloniensatz aus einzeln isolierten Klonen, z.B. von den Tetracyclinplatten werden dann zur Infektion von spezifischen Kolonien z.B. von den Ampicillinplatten verwendet. Dies ergibt Bakteriophagen, die spezifische Kombinationen von H- und L-Ketten exprimieren, die dann auf Antigenbindung untersucht werden können.
In einem dritten Ansatz (von den Anmeldern hierarchischer dualer Kombinationsansatz genannt) wird eine einzelne Kolonie entweder vom H- oder L-Kettenklon, die durch Züchten auf den Antibiotikaplatten ausgewählt wurde, verwendet, um eine gesamte Bibliothek von Klonen, die für die andere Kette (H oder L) kodieren, zu infizieren. Die Selektion erfolgt wie oben beschrieben. Dies bevorzugt die Isolierung der günstigsten Kombination.
In einem vierten Ansatz (von den Anmeldern hierarchischer Ansatz genannt, siehe Beispiele 17 und 18) werden beide Ketten in denselben Vektor kloniert. Eine der Ketten, von der man weiß, daß sie erwünschte Eigenschaften aufweist, wird fixiert. Eine Bibliothek der komplementären Kette wird in den selben Vektor insertiert. Geeignete Partner für die fixierte Kette werden nach der Präsentation auf der Oberfläche des Bakteriophagen ausgewählt.
In einem fünften Ansatz (siehe Beispiel 33) kann, um die Chancen ursprüngliche Paare wiederzugewinnen, die Komplexität der kombinatorischen Bibliotheken reduziert werden, indem kleine B-Populationen von B-Lymphozyten, die zur Bindung an ein gewünschtes Antigen ausgewählt wurden, verwendet werden. Die Zellen bieten z.B. mRNA oder DNA zur Herstellung von Bibliotheken von Antikörpergenen zur Präsentation auf Phagen. Dieses Verfahren kann in Kombination mit den obigen vier Ansätzen zur Selektion von Antikörperspezifitäten verwendet werden.
Phagemide wurden bereits oben erwähnt. Die Anmelder haben realisiert und gezeigt, daß Phagemide in vielen Fällen gegenüber Phagen zur Klonierung von Antikörper vorzuziehen sind, da sie einfacher zu verwenden sind, um umfassendere Bibliotheken des Immunrepertoires herzustellen. Dies ist so, weil die Phagemid-DNA etwa 100fach effizienter als Bakteriophagen-DNA bei der Transformation von Bakterien ist (siehe Beispiel 14). Die Verwendung von Phagemiden ermöglicht es auch, die Anzahl der Gen III-Bindemolekülfusionsproteine, die auf der Oberfläche des Bakteriophagen gezeigt werden, zu variieren (siehe Beispiel 12). Beispielsweise bestimmt in einem System, das eine Bakterienzelle umfaßt, die ein für ein Gen III-Fusionsprotein kodierendes Phagemid enthält, und die mit einem Helferphagen infiziert ist, die Induktion der Expression der Gen III-Fusionsproteine in unterschiedlichem Ausmaß die Anzahl der Gen III-Fusionsproteine, die nach der Superinfektion in dem zwischen der inneren und äußeren Bakterienmembran definierten Raum vorhanden sind. Dies bestimmt das Verhältnis der Gen III-Fusionsproteine zu nativem Gen III-Protein, das der zusammengesetzte Phagen zeigt.
Die Expression eines einzelnen Fusionsproteins pro Virion kann die Selektion von Antikörperspezifitäten auf Affinitätsbasis durch die Vermeidung des "Aviditäts"effektes, bei dem ein Phage, der zwei Kopien eines Antikörpers mit geringer Affinität exprimiert, die selbe offensichtliche Affinität aufweist wie ein Phage, der eine Kopie eines Antikörpers mit höherer Affinität exprimiert. In einigen Fällen ist es jedoch wichtig, alle Gen III-Moleküle, die aus der Superinfektion von Phagemid-hältigen Zelle stammen, zu zeigen, um Fusionen zu erhalten (z.B. zur Selektion von Bindemolekülen mit niedriger Affinität oder zur Verbesserung der Sensitivität bei ELISA). Ein gangbarer Weg wäre die Superinfektion mit einem Bakteriophagen, der ein defektes Gen III enthält. Die Anmelder haben daher einen Phagen entwickelt und verwendet, bei dem Gen III deletiert ist. Dies ist vollständig neu.
Die Demonstration, daß eine funktionelle Antigenbindedomäne auf der Oberfläche eines Phagen präsentiert werden kann, hat Auswirkungen auf die Konstruktion von neuen Antikörpern. Beispielsweise könnten, wenn andere Proteindomänen an der Oberfläche des Phagen präsentiert werden können, Phagenvektoren verwendet werden, um Gene durch die Bindeeigenschaften des präsentierten Proteins zu klonieren und auszuwählen. Weiters könnten Proteinvarianten, einschließlich in die Oberfläche des Proteins eingebauter Epitopbibliotheken, hergestellt werden und leicht nach Bindeaktivitäten ausgewählt werden. Andere Proteinarchitekturen könnten als "neuartige" Antikörper dienen.
Das Verfahren bietet die Möglichkeit, Antikörper nach ersten Prinzipien zu bauen, und wobei der Vorteil des strukturellen Gerüsts, in dem sich die Antigen-bindenden Schleifen falten, genützt wird. Im allgemeinen haben diese Schleifen eine begrenzte Anzahl an Konformationen, die eine Vielfalt an Bindestellen durch alternative Schleifenkombinationen und durch verschiedene Seitenketten bilden. Jüngste Erfolge bei der Modellierung von Antigenbindestellen sind für die de novo-Gestaltung vielversprechend. In jedem Fall wird eine hochauflösende Struktur des Antigens benötigt. Der Ansatz ist jedoch zur Herstellung von z.B. katalytischen Antikörpern aussichtsreich, insbesondere für kleine Substrate. Hier können Seitenketten oder Bindestellen für prostethische Gruppen eingebracht werden, nicht nur um den Übergangszustand des Substrats selektiv zu binden, sondern auch um direkt bei der Bindungsbildung und -zerstörung teilzunehmen. Die -einzige Frage ist, ob der Antikörperaufbau, der auf Bindung spezialisiert ist, der beste Ausgangspunkt zur Herstellung von Katalysatoren ist. Ursprüngliche Enzymarchitekturen, wie z.B. der Triosephosphat-Isomerase (TIM)-rumpf, könnten besser geeignet sein. Wie Antikörper haben auch TIM-Enzyme eine Gerüststruktur (einen Rumpf aus β-Faltblattstrukturen und α-Helices) und Schleifen, um Substrat zu binden. Viele Enzyme mit einer Vielfalt an katalytischen Eigenschaften basieren auf diesem Aufbau und die Schleifen könnten unabhängig von den Gerüsten zur Gestaltung neuer katalytischer und Bindeeigenschaften manipuliert werden. Das Phagenselektionssystem gemäß der vorliegenden Offenbarung kann verwendet werden, um nach Antigenbindeaktivitäten auszuwählen und die so ausgewählten CDR-Schleifen entweder auf einem Antikörpergerüst oder auf einem TIM-Rumpfgerüst verwendet werden. Schleifen, die auf einem z.B. TIM-Rumpfgerüst angeordnet sind, könnten weiter durch Mutagenese modifiziert und weiterer Selektion unterzogen werden. Somit ist es nicht erforderlich, nach Bindeaktivitäten mit hoher Affinität in einem einzelnen Schritt zu selektieren. Die Strategie des Immunsystems, bei der sich niedere Affinität zu hoher Affinität entwickelt scheint realistischer und kann unter Verwendung dieser Erfindung imitiert werden.
Obwohl innerhalb dieser Anmeldung die Anmelder die Möglichkeit diskutieren, Varianten von pAbs mit höherer Affinität zu screenen, erkennen sie, daß in einigen Anwendungen, beispielsweise Chromatographie mit niederer Affinität (Ohlson, S. et al., Anal. Biochem. 169, S. 204–208 (1988)), es wünschenswert sein kann, Varianten mit niederer Affinität zu isolieren.
Die Beispiele 16 und 17 zeigen, daß die vorliegende Erfindung einen Weg bietet, Antikörper mit niedriger Affinität herzustellen (wie dies in der primären Immunantwort oder in nicht immunisierten Tieren zu sehen ist). Dies wird möglich gemacht, indem vielfache Kopien des Antikörpers auf der Phagenoberfläche in Verbindung mit dem Gen III-Protein präsentiert werden. Somit ermöglichen pAbs die Isolierung von Genen für diese Antikörper und falls nötig die Mutation, um verbesserte Antikörper bereitzustellen.
pAbs gestatten auch die Selektion von Antikörpern mit verbesserter Stabilität. Es zeigte sich bei vielen Antikörpern, daß die Ausbeute und Stabilität verbessert werden, wenn die Antikörper bei 30°C und nicht bei 37°C exprimiert werden. Wenn pAbs bei 37°C präsentiert werden, sind nur jene zur Affinitätsselektion verfügbar, die stabil sind. Wenn Antikörper in vivo zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken verwendet werden, würde eine erhöhte Stabilität die Halbwertszeit der Antikörper im Blutkreislauf erhöhen.
Es ist oft notwendig, die Vielfalt einer Population von Genen, die kloniert wurden, um deren Proteine auf Phagen zu präsentieren oder um eine einzelne Nukleotidsequenz zu mutieren, zu erhöhen. Obwohl in vitro- oder in vivo-Mutageneseverfahren für beide Zwecke verwendet werden können, wäre die Verwendung von Mutatorstämmen ein besonders geeignetes Verfahren. Ein Mutatorstamm ist ein Stamm, der einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, daß DNA, die darin repliziert wird, bezüglich ihrer ursprünglichen DNA mutiert wird. Daher wird eine Genpopulation, wenn diese als Gen III-Fusionen in diese Stämme eingebracht wird, in ihrer Vielfalt weiter erhöht und sie kann dann, falls gewünscht, in einen nicht-Mutatorstamm zur Präsentation und Selektion transferiert werden. Beispiel 26 betrifft die Verwendung von Mutatorstämmen mit Phagenantikörpern (ein Beispiel einer in vitro-Mutagenese und Selektion von Phagenantikörpern wird in Beispiel 30 gegeben).
TERMINOLOGIE
Viel der in diesem Abschnitt diskutierten Terminologie wurde bereits, wenn dies günstig war, im Text erwähnt.
Spezifisches Bindepaar
Dies beschreibt ein Paar von Molekülen (wobei jedes Bestandteil eines spezifischen Bindepaares ist), die aus natürlich vorkommenden erhalten oder synthetisch hergestellt wurden. Eines Teil des Molekülpaars weist eine Fläche oder eine Höhlung an seiner Oberfläche auf, die sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und daher als komplementär mit dieser definiert ist, sodaß das Paar die Eigenschaft besitzt, sich spezifisch aneinander zu binden. Beispiele von Typen von spezifischen Bindepaaren sind Antigen-Antikörper, Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptor, Rezeptor-Ligand, Enzym-Substrat, IgG-Protein A.
Packung ("package")
Dies beschreibt ein sekretiertes Bakteriophagenpartikel, in dem das Partikel einen Bestandteil eines spezifischen Bindungspaares an seiner Oberfläche präsentiert. Die Packung kann ein Bakteriophage sein, der an seiner Oberfläche eine Antigenbindedomäne präsentiert. Dieser Typ einer Packung wurde Phagenantikörper (pAb) genannt.
Antikörper
Dies beschreibt entweder ein natürliches oder ein teilweise oder ganz synthetisch hergestelltes Immunglobulin. Der Ausdruck umfaßt auch ein beliebiges Protein mit einer Bindedomäne, die mit einer Immunglobulinbindedomäne homolog ist. Diese Proteine können aus natürlichen Quellen stammen, oder teilweise oder ganz synthetisch hergestellt sein. Beispiele für Antikörper sind die Immunglobulinisotypen und die Fab-, F(ab¹)₂-, scFv-, Fv-, dAb-, Fd-Fragmente.
Immunglobulinüberfamilie (immunglobulin super family)
Dies beschreibt eine Familie von Polypeptiden, deren Mitglieder zumindest eine Domäne mit einer Struktur, die mit der der variablen oder konstanten Domäne von Immunglobulinmolekülen verwandt ist, aufweisen. Die Domäne enthält zwei β-Faltblattstrukturen und üblicherweise eine konservierte Disulfidbindung (siehe A. F. Williams und A. N. Barclay 1988 Ann. Rev. Immunol. 6, 381–405).
Beispiele für die Mitglieder einer Immunglobulinüberfamilie sind CD4, aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktorrezeptor (PDGFR), intrazelluläres Adhesionsmolekül (ICAM). Außer wenn der Zusammenhang dies anders erfordert, umfaßt der Hinweis auf Immunglobuline und Immunglobulinhomologe in dieser Anmeldung Mitglieder der Immunglobulinüberfamilie und Homologe davon.
Homologe
Dieser Ausdruck bezeichnet Polypeptide mit den selben oder konservierten Resten an einer entsprechenden Position in deren Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur. Der Begriff umfaßt auch zwei oder mehr Nukleotidsequenzen, die für die homologen Polypeptide kodieren.
Ein Beispiel für homologe Peptide sind die Immunglobulinisotypen.
Funktionell
Bezüglich eines sbp-Bestandteils, der an der Oberfläche eines Bakteriophagen präsentiert wird, bedeutet dies, daß der sbp-Bestandteil in einer gefalteten Form, in der seine spezifische Bindedomäne für seinen komplementären sbp-Bestandteil die gleiche oder fast analog zu ihrer Nativkonfiguration ist, präsentiert wird, wodurch dieser ähnliche Spezifität bezüglich des komplementären sbp-Bestandteils aufweist. Diesbezüglich unterscheidet sich dieser von den Peptiden von Smith et al., s.o., die keine definierte gefaltete Konfiguration aufweisen und eine Vielzahl an Konfigurationen annehmen können, die durch die komplementären Bestandteile, mit denen sie in Kontakt gebracht werden können, bestimmt sind.
Genetisch vielfältige Population
In Verbindung mit sbp-Bestandteilen oder Polypeptidkomponenten davon, bezieht sich dies nicht nur auf die Vielfalt, die in der natürlichen Population von Zellen oder Mikroorganismen vorkommen kann, sondern auch auf die Vielfalt, die durch künstliche Mutation in vitro oder in vivo gebildet wurde.
Die Mutation in vitro kann z.B. statistische Mutagenese unter Verwendung von Oligonukleotiden mit statistischen Mutationen der Sequenz, die man variieren möchte, umfassen. Bei der in vivo-Mutagenese können z.B. Mutatorstämme von Wirtsmikroorganismen verwendet werden, um die DNA zu erhalten (siehe Beispiel 38 unten).
Domäne
Eine Domäne ist ein Teil eines Proteins, der in sich selbst gefaltet ist und unabhängig von den anderen Teilen des gleichen Proteins und unabhängig vom komplementären Bindebestandteil ist.
Gefaltete Einheit
Dies ist eine spezifische Kombination einer α-Helix- und/oder β-Faltblatt- und/oder β-Schleifenstruktur. Domänen und gefaltete Einheiten enthalten Strukturen, die Aminosäuren, welche in der Primärstruktur nicht benachbart sind, zusammenbringen.
Freie Form
Dies beschreibt den Zustand eines Polypeptids, das nicht von einer replizierbaren, genetischen Präsentations-Packung präsentiert wird.
Bedingt defekt
Dies beschreibt ein Gen, das ein bestimmtes Polypeptid unter einer Bedingungsanordnung nicht exprimiert, aber unter einer anderen doch. Ein Beispiel ist ein Gen, das eine "amber"-Mutation aufweist, die in nicht-supprimierenden bzw. supprimierenden Wirten exprimiert wird.
Alternativ dazu kann ein Gen ein Protein exprimieren, das unter einer Bedingungsanordung defekt ist, aber unter einer anderen nicht. Ein Beispiel ist ein Gen mit einer temperatursensitiven Mutation.
Unterdrückbares Translationsstopcodon
Dies beschreibt ein Codon, das die Translation von Nukleotidsequenzen stromabwärts von dem Codon unter einer Bedingungsanordnung erlaubt, aber unter einer anderen Bedingungsanordnung die Translation an diesem Codon endet. Beispiele für unterdrückbare Translationsstopcodons sind die "amber"-, "ochre"- und "opal"-Codons.
Mutatorstamm
Dies ist eine Wirtszelle, die einen genetischen Defekt aufweist, der bewirkt, daß darin replizierte DNA bezüglich ihrer ursprünglichen DNA mutiert ist. Beispiele für Mutatorstämme sind NR9046mutD5 und NR9046mutT1 (siehe Beispiel 26).
Helferphage
Dies ist ein Phage, der verwendet wird, um Zellen zu infizieren, die ein defektes Phagengenom enthalten, und der eine Beseitigung des Defekts bewirkt. Das defekte Phagengenom kann ein Phagemid oder ein Phage, in dem Gensequenzen für einige Funktionen entfernt wurden, sein. Beispiele für Helferphagen sind M13K07, M13K07 Gen III Nr. 3; und Phagen, die ein mit einem Capsidprotein fusioniertes Bindeprotein präsentieren oder dafür kodieren.
Vektor
Dies ist ein DNA-Molekül, das in einem Wirtsorganismus, in den ein Gen insertiert wurde, um ein rekombinantes DNA-Molekül zu konstruieren, repliziert werden kann.
Phagenvektor
Dies ist ein Vektor, der aus der Modifikation eines Phagengenoms stammt und einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen, aber nicht für ein Plasmid, enthält.
Phagemidvektor
Dies ist ein Vektor, der aus der Modifikation eines Plasmidgenoms stammt und einen Replikationsursprung für einen Bakteriophagen sowie den Plasmidreplikationsursprung enthält.
Sekretiert
Dies beschreibt einen Bakteriophagen oder ein Molekül, das mit einem auf einem Phagen präsentierten Bestandteil eines sbp verbunden ist, worin der sbp-Bestandteil und/oder das Molekül gefaltet wurden, und die Packung außerhalb des zellulären Cytosols zusammengesetzt wurde.
Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen
Eine Sammlung von natürlich vorkommenden Nukleotiden, z.B. DNA-Sequenzen, die für exprimierte Immunglobulingene in einem Tier kodieren. Die Sequenzen werden durch eine in vivo-Neuanordnung von z.B. V-, D-, und J-Segmenten für die H-Ketten und V- und J-Segmenten für die L-Ketten gebildet. Alternativ dazu können die Sequenzen aus einer in vitro immunisierten Zelllinie, in der die Neuanordnung als Antwort auf die Immunisierung intrazellulär erfolgte, gebildet werden.
Bibliothek
Eine Sammlung von Nukleotid-, z.B. DNA-Sequenzen, in Klonen.
Repertoire an künstlich neu angeordneten Immunglobulingenen
Eine Sammlung von Nukleotid-, z.B. DNA-Sequenzen, die gesamt oder zum Teil aus einer Quelle stammen, die eine andere ist als die der neu angeordneten Immunglobulinsequenzen aus einem Tier. Dies kann z.B. DNA-Sequenzen umfassen, die durch die Kombination von nicht neu angeordneten V-Segmenten mit D- und J-Segmenten für VH-Domänen kodieren, und DNA-Sequenzen, die durch die Kombination von V- und J-Segmenten für VL-Domänen kodieren.
Ein Teil der gesamten DNA-Sequenzen kann aus der Oligonukleotidsynthese stammen.
Sekretionsleaderpeptid
Dies ist eine Sequenz von Aminosäuren, die mit dem N-terminalen Ende eines Polypeptids verbunden ist und die die Bewegung des Polypeptids aus dem Cytosol hinaus lenkt.
Eluens bzw. Elutionsmittel
Dies ist eine Lösung, die verwendet wird, um die Verbindung zwischen zwei Molekülen aufzubrechen. Die Bindung kann eine nicht kovalente oder kovalente Bindungen) sein. Die zwei Moleküle können Bestandteile eines sbp sein.
Derivat
Dies ist eine Substanz, die von einem Polypeptid abstammt, welches von der innerhalb eines ausgewählten Partikels befindlichen DNA kodiert wird. Das Derivatpolypeptid kann sich vom kodierten Polypeptid durch die Addition, Deletion, Substitution oder Insertion von Aminosäuren oder durch die Verbindung von anderen Molekülen mit dem kodierten Polypeptid unterscheiden. Diese Änderungen können auf der Nukleotid- oder der Proteinstufe erfolgen. Z.B. kann das kodierte Polypeptid ein Fab- Fragment sein, das dann mit einem Fc-Teil aus einer anderen Quelle verbunden wird. Alternativ dazu können auch Marker wie z.B. Enzyme, Fluoreszenzgruppen usw. mit z.B. Fab-, scFv-Fragmenten verbunden werden.
Hierin wird ein Verfahren gemäß der Erfindung beansprucht, das wie folgt definiert ist:
Verfahren zur Herstellung eines Bestandteils eines spezifischen Bindungspaares (sbp), welches Verfahren umfaßt: das Exprimieren von Nukleinsäure, die für eine genetisch vielfältige Population dieses Typs von sbp-Bestandteil kodiert, in rekombinanten Wirtszellen, worin jeder sbp-Bestandteil als Fusion mit einer Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen exprimiert wird, der den sbp-Bestandteil an der Oberfläche des Bakteriophagenteilchens präsentiert, wobei dieses Teilchen die Fähigkeit zur Replikation hat, die durch darin gepackte genetische Information unter Verwendung dieser Oberflächenkomponente verliehen wird, wobei Nukleinsäure, die für den präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, innerhalb der Wirtszelle in einer Form enthalten ist, die unter Verwendung der Oberflächenkomponente in das Teilchen gepackt werden kann, wodurch das genetische Material des Teilchens, das einen sbp-Bestandteil präsentiert, für diesen präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die sbp-Bestandteile Einzelketten-Fv-Antikörpermoleküle sind, stammend von:

(i) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres,
(ii) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines nicht mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres,
(iii) einem Repertoire von künstlich neu angeordnetem/-n Immunglobulingen oder -genen, oder
(iv) einem Gemisch aus beliebigen von (i), (ii) und (iii);

Ferner werden folgende Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung beansprucht:
eine Ausführungsform, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil aus einem Phagenvektor exprimiert wird;
eine Ausführungsform, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil aus einem Phagemidvektor exprimiert wird, wobei das Verfahren die Verwendung eines Helfer-Phagen oder eines komplementierende Phagengene exprimierenden Plasmids umfaßt, um das Packen des Phagemidgenoms zu unterstützen, und die Oberflächenkomponente ein Capsidprotein dafür ist;
eine Ausführungsform, worin die Fusion mit einem Bakteriophagencapsidprotein erfolgt und das Teilchen mit der Fusion in Abwesenheit des in Wildform exprimierten Capsidproteins gebildet wird;
eine Ausführungsform, worin die Fusion mit einem Bakteriophagencapsidprotein erfolgt und ein natives derartiges Capsidprotein im Teilchen vorhanden ist, das die Fusion präsentiert;
eine Ausführungsform, worin der Wirt ein Bakterium ist und die Oberflächenkomponente ein Capsidprotein für den Bakteriophagen ist;
eine Ausführungsform, worin der Bakteriophage ein filamentöser Phage ist;
eine Ausführungsform, worin der Phage aus den Klasse-I-Phagen fd, M13 und f1 ausgewählt wird;
eine Ausführungsform, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil als Fusion mit dem Gen-III-Capsidprotein von Phage fd oder seinem Gegenstück in einem anderen filamentösen Phagen exprimiert wird;
eine Ausführungsform, worin der präsentierte sbp-Bestandteil in den N-terminalen Bereich des reifen Capsidproteins stromab eines Sekretionsleitpeptids eingefügt wird;
eine Ausführungsform, worin der Wirt E.coli ist;
eine Ausführungsform, worin die durch die Expression gebildeten Teilchen ausgewählt oder gescreent werden, um einen einzelnen präsentierten sbp-Bestandteil oder eine Mischpopulation der präsentierten sbp-Bestandteile bereitzustellen, die in ihren jeweiligen Teilchen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für den präsentierten sbp-Bestandteil kodiert;
eine Ausführungsform, worin die Teilchen durch Affinität für einen Bestandteil ausgewählt werden, der zum präsentierten sbp-Bestandteil komplementär ist;
eine Ausführungsform, worin das Verfahren das Gewinnen jeglicher an den komplementären Bestandteil gebundener Teilchen durch Waschen mit einem Eluens umfaßt;
eine Ausführungsform, worin das Eluens ein Molekül enthält, das mit den Teilchen um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert;
eine Ausführungsform, worin die Teilchen dem komplementären sbp-Bestandteil in Gegenwart eines Moleküls zugeführt werden, das mit den Teilchen um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert;
eine Ausführungsform, worin die aus einem ausgewählten oder gescreenten Teilchen stammende Nukleinsäure verwendet wird, um den sbp-Bestandteil, der präsentiert wurde, oder ein Fragment oder Derivat davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus zu exprimieren;
eine Ausführungsform, worin Nukleinsäure von einem oder mehreren Teilchen genommen und verwendet wird, um kodierende Nukleinsäure in einem weiteren Verfahren bereitzustellen, um einen einzelnen sbp-Bestandteil oder eine Mischpopulation von sbp-Bestandteilen oder dafür kodierende Nukleinsäure zu erhalten.
Ferner werden hierin rekombinante Wirtszellen gemäß der Erfindung beansprucht, die wie folgt definiert sind:
rekombinant Wirtszellen, die eine Bibliothek aus Nukleinsäurefragmenten beinhalten, die Fragmente umfaßt, die für eine genetisch vielfältige Population spezifischer Bindungspaar- (sbp-) Bestandteile kodieren, wobei jeder sbp-Bestandteil als Fusion mit einer Oberflächenkomponente eines sekretierbaren Bakteriophagen exprimiert wird, sodass die sbp-Bestandteile an der Oberfläche der Bakteriophagenteilchen präsentiert werden und das unter Verwendung der Oberflächenkomponente gepackte genetische Material der Teilchen für den zugehörigen präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die sbp-Bestandteile Einzelketten-Fv-Antikörpermoleküle sind, stammend von:

Der Phage kann fd sein oder ein Derivat von fd. Das Derivat kann gegen Tetracyclin resistent sein.
Der sbp-Bestandteil oder die Polypeptidkette davon kann in die N-terminate Region des reifen Capsidproteins stromabwärts von der Sekretionsleadersequenz insertiert sein. Die Sequenz kann nach der Aminosäure +1 des reifen Proteins insertiert sein. Die Insertionsstelle kann von von kurzen Nukleotidsequenzen flankiert sein, die den Sequenzen entsprechen, die an jedem Ende der zu insertierenden Nukleinsäure vorkommen. Wenn z.B. die Proteindomäne eine Immunglobulindomäne ist, kann die Insertionsstelle im Phagen von Nukleotidsequenzen flankiert sein, die für die ersten fünf Aminosäuren und die letzten fünf Aminosäuren der Ig-Domäne kodieren. Solche flankierende Nukleotidsequenzen sind in 4(2) B und C gezeigt, worin die die Stelle flankierenden Nukleotidsequenzen für die Aminosäuresequenzen QVQLQ und VTVSS, die an den beiden Enden der VH-Domäne auftreten, oder für QVQLQ und LEIKR, die an den beiden Enden der Fv-(VH + VL kombiniert)-Domäne auftreten, kodieren. Jede dieser Sequenzen, die die Insertionsstelle flankieren, kann eine geeignete Spaltungsstelle einschließen, wie in 4 gezeigt.
Alternativ dazu können die in 4(2) B und C gezeigten und oben beschriebenen flankierenden Nukleotidsequenzen verwendet werden, um die Insertionsstelle für eine beliebige zu insertierende Nukleinsäure zu flankieren, ob diese Nukleinsäure ein Immunglobulin kodiert oder nicht.
Wie bereits erwähnt, bietet die vorliegende Erfindung auch neuartige Selektionssysteme und Assayformate. In diesen Systemen und Formaten wird die Gensequenz, die für den scFv-Antikörper mit der erwünschten Spezifität kodiert, von einer allgemeinen Population von sekretierten Bakteriophagen mit einem Bereich an Spezifitäten durch die Tatsache der Bindung an ein spezifisches Ziel (z.B. ein Antigen oder Epitop) abgetrennt.
Partikel können durch Waschen mit einem Eluens gewonnen werden. Die Waschbedingungen können variiert werden, um Partikel mit verschiedenen Bindeaffinitäten für das Epitop zu erhalten. Alternativ dazu kann, um z.B. Partikel mit hoher Affinität zu erhalten, der komplementäre Bestandteil (z.B. ein Epitop) der Population von Partikeln (z.B. pAbs), die bereits an einen Bindebestandteil gebunden sind, präsentiert werden, wobei in diesem Fall pAbs mit höherer Affinität für das Epitop die bereits gebundenen Bindebestandteile verdrängen.
PCR-Primer und damit verbundene Reagentien zur Verwendung, wenn die sbp-Bestandteile Antikörper sind, können die folgenden Eigenschaften aufweisen:

(i) Primer mit Homologie zum 5'-Ende des sense oder anti-sense-Stranges der Sequenzen, die für Antikörperdomänen kodieren; und
(ii) Primer einschließlich der tag-Sequenzen 5' von diesen homologen Sequenzen, die Restriktionsstellen beinhalten, um eine Insertion in Vektoren zu ermöglichen; zusammen mit Sequenzen, die das Zusammensetzen der amplifizierten VH- und VL-Regionen ermöglichen, um die Expression als Fv-, scFv-, oder Fab-Fragmente zu ermöglichen.

Puffer und Enzyme werden typischerweise gemäß den hierin beschriebenen Strategien verwendet, um die Herstellung der Nukleotidsequenzen, die für die von neu angeordneten oder nicht neu angeordneten Immunglobulingenen erhaltenen Fv-, scFv- oder Fab-Fragmente kodieren, zu ermöglichen.
Die Anmelder haben die filamentösen F-spezifischen Bakteriophagen als Beispiel für den Phagentyp ausgewählt, der als Vehikel für die Präsentation von Bindemolekü len, z.B. Antikörpern und Antikörperfragmente und Derivate davon, auf deren Oberfläche dienen könnte und die darauffolgende Selektion und Manipulation erleichtern könnte.
Die F-spezifischen Phagen (z.B. f1, fd und M13) haben eine Methode zur Vermehrung entwickelt, das die Wirtszelle nicht tötet, und sie werden üblicherweise als Vehikel für rekombinante DNA verwendet (Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1980). Das einzelsträngige DNA-Genom (etwa 6,4 Kb) von fd wird durch die bakterielle Membran extrudiert, wo es Capsid-Untereinheiten absondert ("sequesters"), um reife Virionen zu bilden. Diese Virionen weisen eine Durchmesser von 6 nm und eine Länge von 1 μm auf und jedes enthält etwa 2800 Moleküle des Haupthüllenproteins, das vom viralen Gen VIII kodiert wird, und 4 Moleküle des Adsorptionsmolekül-Gen III-Proteins (g3p), wobei sich das letztere an einem Ende des Virions befindet. Diese Struktur wurde von Webster et al., 1978 in The Single Stranded DNA Phages, 557–569, Cold Spring Harbour Press erläutert. Das Gen III-Produkt ist bei der Bindung des Phagen an den bakteriellen F-Pilus beteiligt.
Obwohl diese Phagen ihre Wirte während der normalen Replikation nicht töten, kann die Unterbrechung von einigen ihrer Gene zum Zelltod führen (Kornberg, A., 1980, s.o.). Dies beschränkt zum Teil ihre Verwendung. Die Anmelder haben erkannt, daß das Gen III des Phagen fd eine attraktive Möglichkeit zur Insertion von fremden, biologisch aktiven Sequenzen ist. Es gibt jedoch auch andere ausssichtsreiche Sequenzen, einschließlich z.B. das Gen VIII und das Gen VI.
Das Protein selbst ist nur ein Nebenbestandteil der Phagenhülle und die Unterbrechung des Gens führt nicht zum Zelltod (Smith, G. 1988 Virology 167: 156–165). Weiters ist es möglich einige Fremdsequenzen (mit keiner biologischen Funktion) an verschiedenen Positionen innerhalb dieses Gens zu insertieren (Smith, G. 1985 Science 228: 1315–1317., Parmley, S. F. and Smith, G. P. Gene 73 (1988) S. 305–318). und de la Cruz, V. F., et al., 1988, J. Biol. Chem., 263: 4318–4322). Smith et al., beschrieben die Präsentation von Peptiden an der äußeren Oberfläche des Phagen, aber die Präsentation von Proteindomänen wurde von ihnen nicht beschrieben. Peptide können einen Bereich von Strukturen annehmen, die sich unterscheiden können, wenn sie sich frei in Lösung befinden gegenüber dem Fall, wenn sie an z.B. einen Antikörper gebunden sind oder wenn sie einen Teil eines Proteins bilden (Stanfield, R. I. et al., (1990), Science 248, S. 712–719). Proteine haben im allgemeinen eine wohl definierte Tertiärstruktur und erfüllen ihre biologische Funktion nur, wenn sie diese Struktur annehmen. Beispielsweise wurde die Struktur des Antikörpers D1.3 in freier Form und in an Antigen gebundener Form aufgeklärt (Bhat, T. N. et al., (1990) Nature 347, S. 483–485). Die Grundstruktur des Proteins ist in jedem Fall mit nur geringfügigen Variationen rund um die Bindungsstelle für das Antigen identisch. Andere Proteine zeigen bei der Bindung eines Liganden deutlichere Konformationsänderungen, beispielsweise die Enzyme Hexokinase und Pyruvat-Dehydrogenase während ihrem katalytischen Zyklus, aber sie behalten ihr Gesamtfaltmuster bei. Diese strukturelle Integrität weisen ganze Proteine nicht auf, aber sie wird von Proteindomänen gezeigt. Dies führt zum Konzept einer gefalteten Einheit, die Teil eines Proteins ist, oft eine Domäne, die eine wohl definierte Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur aufweist und die das selbe Gesamtfaltmuster aufweist, ob sie sich an einen Bindepartner bindet oder nicht. Die einzige Gensequenz, die Smith et al., beschrieben und die eine ausreichende Größe aufweist, um für eine Domäne zu kodieren (ein Minimum von etwa 50 Aminosäuren), war ein 335 bp-Fragment einer β-Glaktosidase, die den Nukleotiden 861–1195 in der β-Glaktosidasegensequenz entspricht (Parmley, S. + Smith, G. P. 188, s.o.). Diese würde für 112 Aminosäuren der viel größeren, 380 Aminosäuren aufweisenden Domäne kodieren. Daher wurde vor der vorliegenden Anmeldung keine im wesentlichen vollständige Domäne oder gefaltete Einheit auf Phagen präsentiert. In diesen Fällen konnten, obwohl die Infektiosität des Phagen zerstört war, die insertierten Sequenzen auf der Phagenoberfläche durch die Verwendung von z.B. Antikörpern detektiert werden.
Das durch das Gen III kodierte Protein weist mehrere Domänen auf (Pratt, D., et al., 1969 Virology 39: 42–53; Grant, R. A. et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 539–546 und Armstrong, J., et al., FEBS Lett. 135: 167–172, (1981)) einschließlich: (i) einer Signalsequenz, die das Protein zur Zellmembran lenkt und die dann abgespalten wird; (ii) einer Domäne, die das reife Protein in der bakteriellen Zellmembran (und ebenso in der Phagenhülle) verankert; und (iii) einer Domäne, die sich spezifisch an den Phagenrezeptor, den F-Pilus des Wirtsbakteriums, bindet. Kurze Sequenzen, die von Proteinmolekülen stammen, wurden an zwei Stellen innerhalb des reifen Moleküls insertiert (Smith, G., 1985, s.o., und Parmley, S. F. and Smith, G. P., 1988, s.o.), nämlich in die Region zwischen den Domänen und auch zwischen die Aminosäuren 2 und 3 am N-Terminus. Bei den Insertionsstellen am N-Terminus zeigte sich erfolgreich, daß die strukturelle Integrität des Gen III-Proteins aufrechterhalten werden konnte und daß die Peptide an der Oberfläche des Phagen präsentiert wurden. Durch die Verwendung von für die Peptide spezifischen Antisera wurde gezeigt, daß sich die Peptide, die an dieser Stelle insertiert wurden, auf der Oberfläche des Phagen befinden. Diese Autoren konnten auch, unter Verwendung dieser Eigenschaft, den Phagen reinigen. Die vom Phagen exprimierten Peptide wiesen jedoch keine eigenen, meßbaren biologischen Funktionen auf. Es ist schwierig, die biologische Funktion eines Moleküls, das in einem gegenüber seinem natürlichen Zustand völlig anderen Zusammenhang exprimiert wird, beizubehalten. Die Anforderungen an die Struktur des Moleküls sind hoch. Im Gegensatz dazu ist die Beibehaltung der Fähigkeit, von spezifischen Antisera gebunden zu werden, ein passiver Vorgang, der wesentlich weniger strenge Anforderungen an die Struktur das Moleküls stellt. Beispielsweise ist es die Regel und nicht die Ausnahme, daß polyklonale Antisera völlig denaturierte und biologisch inaktive Proteine in Western Blots erkennen (siehe z.B. Harlow, E. and Lane, D., Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1988). Daher zeigt die Insertion von Peptiden in eine Region, die ihrer Struktur ermöglicht, von Antisera mittels einer Sonde erkannt zu werden, nur, daß die Region es den Peptiden gestattet, dargestellt zu werden, aber sie zeigt nicht, daß die Region für die Insertion darzustellender großer Sequenzen, wobei strukturelle Zwänge für die Präsentation eines Moleküls mit einer biologischen oder Bindefunktion erforderlich sind, geeignet ist. Insbesondere zeigt sie nicht, daß Domänen oder gefaltete Einheiten von Proteinen von in diese Region insertierten Sequenzen präsentiert werden können.
Diese Erfahrung mit Western Blots ist eine anschauliche praktische Demonstration, die zeigt, daß das Beibehalten der Fähigkeit, durch spezifische Antisera gebunden zu werden, wesentlich weniger strenge Anforderungen an die Struktur eines Polypeptids stellt, als dies das Falten zur Beibehaltung der biologischen Aktivität tut.
Es wurden Studien durchgeführt, in denen E.coli manipuliert wurde, um das β-adrenergische Rezeptor-Protein als Fusion mit dem äußeren Membranprotein lamB zu exprimieren. Der β-adrenergische Rezeptor wurde in einer funktionellen Form exprimiert, was durch das Vorhandensein von Bindeaktivität bestimmt wurde. Wenn jedoch eine äquivalente Antikörperfusion mit lamB gemacht wurde, war die Antikörperfusion für die Wirtszelle toxisch.
Die Anmelder haben die Möglichkeit untersucht, die Genkodiersequenz für biologisch aktive Antikörperfragmente in die Gen III-Region von fd zu insertieren, um ein großes Fusionsprotein zu exprimieren. Wie aus der vorhergehenden Diskussion offensichtlich ist, stellt dieser Ansatz große Anforderungen an die Funktionalität des Fusionsproteins. Die Insertion ist groß und kodiert für Antikörperfragmente von zumindest 100–200 Aminosäuren; die vom Antikörper stammende Domäne muß sich effizient und korrekt falten, um Antigenbindung zu zeigen; und die meisten Funktionen des Gen III müssen beibehalten werden. Der Ansatz der Anmelder zur Konstruktion des Fusionsmoleküls wurde so gestaltet, daß das Risiko, diese Funktionen zu unterbrechen, minimiert wurde. In einer Ausführungsform der Erfindung war der verwendete Anfangsvektor fd-tet (Zacher, A. N., et al., 1980, Gene, 9, 127–140) eine gegenüber Tetracyclin resistente Version des fd-Bakteriophagen, die als dem infizierten E.coli-Wirt Tetracyclinresistenz verleihendes Plasmid vermehrt werden kann. Die Anmelder entschlossen sich aus mehreren Gründen, nach der Signalsequenz des fd-Gen III zu insertieren. Insbesondere entschlossen sie sich, nach der Aminosäure 1 des reifen Proteins zu insertieren, um die Umgebung für die Signalpeptida sespaltung beizubehalten. Um die Struktur und Funktion des Gen III selbst beizubehalten, wird der Großteil der ursprünglichen Aminosäuresequenz nach den insertierten Immunglobulinsequenzen synthetisiert. Die insertierten Immunglobulinsequenzen wurden so gestaltet, daß sie Reste aus der Schaltregion ("switch region"), die VH-VL mit CH1-CL verbindet, umfassen (Lesk, A., and Chothia, C., Nature 335, 188–190, 1988).
Überraschenderweise konnten die Anmelder bei der Manipulation des Gen III des Bakteriophagen fd einen Bakteriophagen konstruieren, der an seiner Oberfläche große biologisch funktionelle Antikörper-, Enzym- und Rezeptormoleküle präsentiert, wobei er intakt und infektiös bleibt. Weiters können die Phagen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität aufweisen, aus einem Hintergrund von Phagen, die diese Spezifität nicht zeigen, ausgewählt werden.
Die Sequenzen, die für eine Population von Antikörpermolekülen und für die Insertion in den Vektor zur Expression von Antikörperbindefunktionen auf der Phagenoberfläche kodieren, können aus einer Vielzahl an Quellen gewonnen werden. Beispielsweise aus immunisierten und nicht immunisierten Nagetieren oder Menschen, oder aus Organen wie z.B. Milz oder peripheren Blutlymphozyten. Die Kodiersequenzen können aus diesen Quellen mittels dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden (Orlandi, R., et al., 1989, s.o.; Larrick, J. W., et al., 1989, s.o.; Chiang, Y. L., et al., 1989, Bio Techniques 7, S. 360–366; Ward, E. S., et al., 1989, s.o.; Sastry, L., et al., 1989, s.o.) oder durch in den Beispielen 11 und 27 beschriebene neue Verbindungsstrategien. Jeder einzelne pAb in der resultierenden Bibliothek von pAbs exprimiert Antikörper oder von Antikörper abstammende Fragmente, die bezüglich ihrer Antigenbindeeigenschaften monoklonal sind.
Die von den vorliegenden Anmeldern gemachte Offenbarung ist wichtig und stellt einen bemerkenswerten Durchbruch in der Technologie, die mit der Herstellung von biologischen Bindemolekülen, ihren Fragmenten und Derivaten durch die Verwendung von rekombinanten Verfahren verbunden ist, dar.
In rekombinanten Standardverfahren zur Herstellung von Antikörpern wird ein Expressionsvektor, der die für die Antikörperketten kodierenden Sequenzen enthält, zur Transformation von E.coli verwendet. Die Antikörperpolypeptide werden exprimiert und durch die Verwendung von Standardscreeningsystemen detektiert. Wenn beim Screenen ein Antikörperpolypeptid detektiert wird, muß man zu dem speziellen, transformierten E.coli, der das gewünschte Antikörperpolypeptid exprimiert, zurückkehren. Weiters muß dann der Vektor, der die Kodiersequenz für das gewünschte Antikörperpolypeptid enthält, aus E.coli isoliert werden, damit er in weiteren Verarbeitungsschritten verwendet werden kann.
In der vorliegenden Erfindung jedoch ist das gewünschte Antikörperpolypeptid, wenn es exprimiert wird, bereits mit seiner Genkodiersequenz zusammengepackt. Dies bedeutet, daß, wenn ein Antikörperpolypeptid mit der gewünschten Spezifität ausgewählt wird, man nicht zur ursprünglichen Kultur zur Isolierung dieser Sequenz zurückkehren muß. Weiters mußte bei bisherigen Verfahren in Standardrekombinationstechniken jeder Klon, der Antikörper exprimiert, einzeln gescreent werden. Die vorliegende Anmeldung ermöglicht die Selektion von Klonen, die Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften exprimieren, und erfordert dazu nur das Screenen von Klonen aus einem angereicherten Pool.
Da das sekretierte Bakteriophagenteilchen einen Bestandteil eines spezifischen Bindepaares an der Oberfläche einer relativ einfachen replizierbaren Struktur, die auch die für diesen Bestandteil kodierende genetische Information enthält, präsentiert, können Teilchen, die sich an den komplementären Bestandteil des spezifischen Bindepaares (z.B. das Antigen) binden, sehr effizient entweder durch die Elution des komplementären Bestandteils mittels z.B. Diethylamin, hoher Salzkonzentration, usw. und das Infizieren geeigneter Bakterien oder durch das Denaturieren der Struktur und das spezifische Amplifizieren der für diesen Bestandteil kodierenden Sequenzen mittels PCR gewonnen werden. D.h. es ist nicht notwendig, zum ursprünglichen bakteriellen Klon, aus dem der pAb entstand, zurückzukehren.
Für einige Zwecke z.B. Immunfällung und einige diagnostische Tests, ist es vorteilhaft, polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente zu verwenden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht dies entweder durch die Selektion eines angereicherten Pools von pAbs mit den gewünschten Eigenschaften oder durch das Mischen von einzeln isolierten Klonen mit den gewünschten Eigenschaften. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können dann, falls erforderlich, in löslicher Form exprimiert werden. Solch eine ausgewählte polyklonale pAb-Population kann aus Phagenstämmen, Phagemid enthaltenden Bakterien oder Bakterien, die die aus der ausgewählten polyklonalen Population stammenden löslichen Fragmente exprimieren, gezüchtet werden. Somit wird ein zu einem polyklonalen Antiserum äquivalentes Reagens gebildet, das repliziert werden kann und routinemäßig ohne die Verwendung von Tieren in Kultur hergestellt werden kann.
SELEKTIONSFORMATE UND AFFINITÄTSREIFUNG
Einzelne sekretierte Bakteriophagenteilchen, die die gewünschte Spezifität z.B. für ein Antigen exprimieren, können unter Verwendung von herkömmlichen Screeningverfahren aus der komplexen Bibliothek isoliert werden (z.B. laut der Beschreibung in Harlow, E., and Lane, D., 1988, s.o.; Gherardi, E. et al., 1990. J. Immunol. Meth. 126, S. 61–68).
Die Anmelder haben auch eine Reihe von neuen Selektionsverfahren entwickelt, die nur aufgrund der einzigartigen Eigenschaften der Teilchen praktikabel sind. Die allgemeinen Grundzüge einiger Screenigvorschriften sind in 2 dargestellt.
Die Population/Bibliothek von zu screenenden pAbs kann aus immunisierten oder anderen Tieren gebildet werden; oder kann in vitro durch Mutagenisieren bereits existierender Phagenantikörper (unter Verwendung bekannter Techniken wie z.B. Oligonukleotid gerichtete Mutagenese (Sambrook, J., et al., 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Diese Population in einem oder mehreren der weiter unten mit Hinweis auf 2 beschriebenen Forma te gescreent werden, um jene einzelnen pAbs zu erhalten, deren Antigenbindeeigenschaften sich von Probe c unterscheiden.
Bindeelution
2(i) zeigt Antigen (ag), das an ein feste Oberfläche (s) gebunden ist, wobei diese feste Oberfläche (s) von einer Petrischale, von Chromatographieperlen, magnetischen Perlen und dergleichen bereitgestellt werden kann. Die Population/Bibliothek von pAbs wird dann über das ag geschickt, und jene einzelnen p, die sich daran binden, werden nach dem Waschen zurückgehalten, und gegebenenfalls mit dem Detektionssystem d nachgewiesen. Ein auf anti-fd-Antisera basierendes Detektionssystem wird weiter unten in Beispiel 4 detaillierter dargestellt. Wenn Proben der gebundenen Population p unter ansteigend schärferen Bedingungen entfernt werden, steigt die in jeder Probe vorhandene Bindeaffinität an. Verschärfte Bedingungen können z.B. durch Erhöhen der Weichzeit, oder Ändern des pH-Werts der Weichlösung, etc erhalten werden.
Konkurrenz ("competition")
Bezugnehmend auf 2(ii) kann Antigen ag an einen festen Träger s gebunden werden und bis zur Sättigung durch das ursprüngliche Bindemolekül c gebunden werden. Wenn eine Population eines mutanten pAb (oder ein Satz nicht verwandter pAbs) dem Komplex angeboten wird, werden sich nur jene binden, die eine höhere Affinität für das Antigen ag aufweisen als c. In den meisten Beispielen wird nur ein geringer Teil der Population c durch Individuen aus der Population p verdrängt. Wenn c ein herkömmliches Antikörpermolekül ist, kann das gesamte gebundene Material gewonnen werden und das gebundene p kann durch das Infizieren von geeigneten Bakterien und/oder durch die Verwendung von Standardverfahren wie z.B. PCR gewonnen werden.
Es ist eine vorteilhafte Anwendung, wenn ag ein Antikörper ist und c sein Antigen. Die gewonnene gebundene Population p ist dann ein anti-idiotypischer Antikörper, wobei diese zahlreiche Verwendungen in der Forschung und der pharmazeutischen und diagnostischen Industrie finden.
Derzeit ist es schwierig, direkt anti-idiotypische Antikörper auszuwählen. pAbs gäben die Möglichkeit, dies direkt durch das Binden von pAb-Bibliotheken (z.B. eine native Bibliothek) an B-Zellen (die Antikörper an ihrer Oberfläche exprimieren) und das Isolieren der gut gebundenen Phagen zu tun.
In einigen Fällen kann es sich als vorteilhaft erweisen, die Population p vorzuselektieren. Beispielsweise in dem anti-Idiotyp-Beispiel oben kann p an einen verwandten Antikörper adsorbiert werden, der das Antigen nicht bindet.
Wenn c jedoch ein pAb ist, dann können jeweils eines oder beide von c und p vorteilhafterweise auf einige Arten markiert werden, um gebundenes p gegenüber gebundenem c sowohl zu unterscheiden wie auch auszuwählen. Dieses Markieren kann physikalisch erfolgen z.B. durch das Vormarkieren von p mit Biotin; oder noch vorteilhafter genetisch. Beispielsweise kann c mit einer EcoB-Restriktionsstelle markiert sein, während p mit einer EcoK-Restriktionsstelle markiert sein kann (siehe Carter, P. et al., 1985, Nucl. Acid Res. 13, 4431–4443). Wenn die gebundenen p + c vom Antigen eluiert werden und zur Infektion von geeigneten Bakterien verwendet werden, gibt es eine Restriktion (und damit kein Wachstum) der Population c (d.h. Bakterien, die EcoB-Restriktion aufweisen in diesem Beispiel). Alle gewachsenen Phagen wären stark mit jenen Individuen von p mit höheren Bindeaffinitäten angereichert. Alternativ dazu kann die genetische Markierung durch das Markieren mit neuen Sequenzen, die verwendet werden können, um unter Verwendung von PCR spezifisch p aus einem Gemisch zu amplifizieren, erreicht werden.
Da die gebundenen pAbs unter Verwendung von z.B. PCR oder bakterieller Infektion amplifiziert werden können, ist es auch dann möglich, die gewünschte Spezifität zu erhalten, wenn nicht ausreichende Individuen gebunden sind, um die Detektion über herkömmliche Verfahren zu ermöglichen.
Das bevorzugte Verfahren zur Selektion eines Phagen, der ein Proteinmolekül mit der gewünschten Spezifität oder Affinität präsentiert, ist oft die Elution von einer Affinitätsmatrix mit einem Liganden (siehe z.B. Beispiel 16). Die Elution mit ansteigenden Ligandenkonzentrationen sollte Phagen, die Bindemoleküle mit ansteigender Affinität präsentieren, eluieren. Wenn sich jedoch z.B. ein pAb an sein Antigen mit hoher Affinität oder Avidität bindet (oder ein anderes Protein an seinen Bindungspartner), kann es sein, daß es nicht möglich ist, den pAb aus der Affinitätsmatrix mit einem dem Antigen verwandten Molekül zu eluieren. Alternativ dazu kann es sein, daß es kein geeignetes eluierendes Molekül gibt, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das nicht für z.B. den Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist. Einige der allgemein verwendeten, nicht spezifischen Elutionsverfahren verringern die Lebensfähigkeit des Phagen, beispielsweise nimmt die Phagenlebensfähigkeit bei pH 12 mit der Zeit ab (Rossomando, E. F. and Zinder N. D. J. Mol. Biol. 36, 387–399). Es kann Wechselwirkungen zwischen z.B. Antikörper und Affinitätsmatrizen geben, die nicht unterbrochen werden können, ohne die Phageninfektiosität vollständig zu entfernen. In diesen Fällen ist ein Verfahren zur Elution des Phagen notwendig, das sich nicht der Zerstörung der z.B. Antikörper-Antigen-Wechselwirkung bedient. Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, das die Elution gebundener pAbs unter milden Bedingungen (Reduktion einer Dithiol-Gruppe mit Dithiothreitol), die die Phagenstruktur nicht zerstören, ermöglicht.
Dieses Elutionsverfahren ist nur ein Beispiel eines Elutionsverfahrens unter milden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren wäre es, eine Nukleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, welche eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hochspezifische Protease bilden, zwischen dem fremden, insertierten Gen, in diesem Fall ein Gen für ein Antikörperfragment, und dem Rest des Gen III einzubringen. Beispiele solch hochspezifischer Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach dem Binden des Phagen an die Affinitätsmatrix und der Elution, um nichtspezifisch bindende Phagen zu entfernen, würde der bzw. die stark gebundene(n) Phage(n) durch das Waschen der Säule mit Protease unter Bedingungen, die die für die Spaltung an der Spaltungsstelle geeignet sind, entfernt werden. Dies würde das Antikörperfragment vom Phagenpartikel abspalten und den Phagen eluieren. Es ist zu erwarten, daß dieser Phage infektiös ist, da die einzige Proteasestelle die spezifisch eingebrachte sein sollte. Der stark bindende Phage könnte dann durch das Infizieren von z.B. E.coli TG1-Zellen wiedergewonnen werden.
Ein zum obigen alternatives Verfahren ist es, die Affinitätsmatrix, die die stark gebundenen pAbs zurückgehalten hat, zu nehmen und die DNA z.B. durch Kochen in SDS-Lösung zu extrahieren. Die extrahierte DNA kann dann dazu verwendet werden, direkt E.coli-Wirtszellen zu transformieren, oder alternativ dazu können die für den Antikörper kodierenden Sequenzen amplifiziert werden, beispielsweise mittels PCR mit geeigneten Primern, wie z.B. jene die hierin geoffenbart sind, und dann zur Expression als löslicher Antikörper für weitere Untersuchungen oder als pAb für weitere Selektionsrunden in einen Vektor insertiert werden.
Ein weiteres bevorzugtes Selektionsverfahren nach der Affinität wäre die Bindung an eine Affinitätsmatrix, die geringe Mengen an Liganden enthält.
Wenn man aus einer Proteinmoleküle präsentierenden Phagenpopulation nach hoher Affinität für den Liganden auswählen will, ist es eine bevorzugte Strategie, eine Phagenpopulation an eine Affinitätsmatrix, die geringe Mengen an Liganden enthält, zu binden. Es gibt um die Bindung des Liganden Konkurrenz zwischen Phagen, die Proteine mit hoher und mit niedriger Affinität präsentieren. Phagen, die Protein mit hoher Affinität präsentieren, werden vorzugsweise gebunden und Protein mit niedriger Affinität wird ausgewaschen. Das Protein mit hoher Affinität wird dann durch Elution mit dem Liganden oder durch andere Verfahren, die den Phagen von der Affinitätsmatrix eluieren (Beispiel 25 zeigt dieses Verfahren), gewonnen.
Zusammenfassend kann, zur Wiedergewinnung der gepackten DNA aus dem Affinitätsschritt, die Packung einfach eluiert werden, sie kann in Vorhandenseins eines homologen sbp-Bestandteils, der mit dieser Packung um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert, eluiert werden; diese könnte durch Kochen entfernt werden, sie könnte durch proteolytische Spaltung des Proteins entfernt werden; und andere Verfahren, z.B. das Zerstören der Bindung zwischen dem Substrat und dem komplementären sbp-Bestandteil, um die gepackte DNA und den sbp-Bestandteil freizusetzen, sind für Fachleute auf dem Gebiet offensichtlich. Jedenfalls ist es das Ziel, die DNA aus der Packung zu erhalten, sodaß diese direkt oder indirekt verwendet werden kann, um den dadurch kodierten sbp-Bestandteil zu exprimieren.
Die Effizienz dieses Selektionsverfahrens für pAbs und die Möglichkeit, große Bibliotheken herzustellen, bedeutet, daß die Immunisierungsverfahren, die entwickelt wurden, um den Anteil der gescreenten Zellen, die den Antikörper von Interesse produzieren, erhöht wird, keine absolute Notwendigkeit sind. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Isolation von Bindespezifitäten, z.B. Antigen-Bindespezifitäten, einschließlich jenen, die durch herkömmliche Verfahren schwierig oder sogar nicht zu erhalten wären, z.B. katalytische oder anti-idiotypische Antikörper. Der Verzicht auf das Tier ist im gesamten nun möglich, wenn einmal eine vollständige Bibliothek des Immunrepertoires konstruiert wurde.
Die neuartige Struktur des pAb-Moleküls kann in einer Anzahl von anderen Anwendungen verwendet werden, wobei einige Beispiele davon die folgenden sind:
Signalamplifikation
pAbs vereinen, indem sie selbst als eine neuartige molekulare Einheit funktionieren, die Fähigkeit, sich an ein spezifisches Molekül, z.B. ein Antigen, zu binden, mit der Amplifikation, wenn das Haupthüllenprotein verwendet wird, um eine andere Gruppe daran zu befestigen. Diese Gruppe kann durch immunologische, chemische und beliebige andere Mittel befestigt werden, und dann z.B. verwendet werden, um den Komplex zur Verwendung in vitro oder in vivo mit Detektionsreagentien oder zytotoxischen Molekülen zu markieren.
Physikalische Detektion
Die Größe der pAbs kann als Marker verwendet werden, insbesondere hinsichtlich physikalischer Detektionsverfahren wie z.B. Elektronenmikroskopie und/oder einige Biosensoren, z.B. Oberflächenplasmonresonanz ("surface plasmon resonance").
Diagnoseassays
Die pAbs haben auch vorteilhafte Verwendungen in Diagnoseassays, insbesondere wo eine Trennung aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften bewirkt werden kann, z.B. Zentrifugation, Filtration etc.
Damit die Erfindung besser verstanden wird, werden nun Ausführungsformen mit Hinweis auf die weiter unten beschriebenen Figuren genauer beschrieben, wobei diese Beispiele der Veranschaulichung dienen und die Erfindung in keiner Weise einschränken. Die Präsentation der Fab-Fragmente ist nicht Teil der Erfindung. Die Erwähnung solcher Fragmente in diesem Dokument dient nur dem Zweck der Veranschaulichung.
1 zeigt die Grundstruktur des einfachsten Antikörpermoleküls IgG.
2 zeigt schematisch die Selektionsverfahren, die die einzigartigen Eigenschaften der pAbs einsetzen; 2i) zeigt ein Binde-/Elutionssystem; und (2ii) zeigt ein Konkurrenzsystem (p = pAb; ag = Antigen, an das sich pAb binden soll; c = Konkurrenzpopulation z.B. Antikörper, pAb, Ligand; s = Substrat (z.B. Kunststoffperlen etc.); d = Detektionssystem.
3 zeigt den Vektor fd-tet und ein Schema zur Konstruktion von Vektoren, fdTPs/Bs (zur Insertion von VH-Kodiersequenzen) und fdTPs/Xh zur Insertion von scFv-Kodiersequenzen.
4 zeigt die Nukleotidsequenzen für die Oligonukleotide und Vektoren. Alle Sequenzen sind von 5' nach 3' aufgezeichnet und gemäß Beck et al., 1978, Nucl. Acid. Res. 5: 4495–4503 numeriert. 4.1 zeigt die zur Mutagenese (oligo's 1 und 2) und zum Sequenzieren (oligo 3) verwendeten Sequenzen. Die gezeigten Sequenzen wurden auf einem Oligonukleotidsynthesegerät von Applied Biosystems synthetisiert und sind zur einsträngigen Form von fd-tet komplementär (sie sind bezüglich Gen III in der anti-sense-Form). 4.2 zeigt die Sequenzen der verschiedenen Konstrukte rund um die Gen III-Insertionsstelle. Diese Sequenzen sind in sense-Richtung bezüglich Gen III aufgezeichnet; (A) fd-tet (und fdTδBst) (B) fdTPs/Bs und (C) fdTPs/Xh. Die Schlüsselrestriktionsstellen sind gemeinsam mit den durch die Vektoren beigetragenen Immunglobulinaminosäuren gezeigt, (der Ein-Buchstaben-Kode für Aminosäuren wird verwendet, siehe Harlow, E. und Lane, D. 1988, s.o.).
5 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für scFv im Vektor scFvD1.3 myc. Dies ergibt die Sequenz des aus Einzelketten bestehenden anti-Lysozym-Fv und die umgebenden Sequenzen in scFvD1.3 myc, wobei die N-terminale pel b-Signalpeptidsequenz und die C-terminale myc tag-Sequenz gezeigt ist (Ward, E. S., et al., 1989, s.o.). Es ist auch die Peptidsequenz gezeigt, die die VH- und VL-Regionen verbindet. Die Aminosäuresequenz ist über der Nukleotidsequenz mit dem: Ein-Buchstaben-Kode dargestellt, siehe Harlow, E. und Lane, D. 1988, s.o.).
6 zeigt die Bindung von pAbs an Lysozym und die Wirkung der Variation der Menge des Überstandes. Jeder Punkt ist der Durchschnittswert einer Doppelprobe. Lysozym wurde mit 1 mg/ml in 50 mm NaHCO₃ beschichtet.
7 zeigt die Wirkung der Variation der Beschichtungskonzentration von Lysozym oder Rinderserumalbumin (BSA) auf die Bindung von pAbs an Lysozym in graphischer Form. Jeder Punkt ist der Durchschnittswert einer Doppelprobe.
8 zeigt die Sequenz rund um die Klonierstelle in Gen III von fd-CAT2. Restriktionsenzymstellen werden dargestellt sowie die Aminosäuren, die durch von Antikör per stammende Sequenzen kodiert werden. Diese werden am 5'-Ende vom Gen III-Signalpeptid und am 3'-Ende von 3 Alaninresten (durch die NotI-Restriktionsstelle kodiert) und vom Rest des reifen Gen III-Protein flankiert. Der Pfeil zeigt die Spaltungsstelle zum Abschneiden des Signalpeptids.
9 zeigt die Bindung von pAb (1.3) an Lysozyme. Bindung von Phagen, wie mittels ELISA detektiert wurde, an (a) Hühnereiweißlysozym (HEL), (b) Puteneiweißlysozym (TEL), (c) menschliches Lysozym (HUL), (d) Rinderserumalbumin (BSA). Ein weiterer Vergleich von (e) fdTPs/Bs an HEL.
10 zeigt eine Karte von FabD1.3 in pUC19.
11 zeigt die ELISA-Ergebnisse, die einen Vergleich der Lysozymbindung durch Phagen-Fab und Phagen-scFv bieten. Vektor = fdCAT2 (Beispiel 5); fdscFv (OX) = pAbNQ11 (Beispiel 9); fdVHCH1 (D1.3) = Wachstum in normalen Zeilen (d.h. keine L-Kette, siehe Beispiel 7); fdFab (D1.3) d.h. fdVHCH1 (D1.3), gezüchtet in Zellen, die die D1.3 L-Kette enthalten; fdscFv (D1.3) = pAbD1.3.
12 zeigt die Oligonukleotidsondierung von mittels Affinität gereinigten Phagen. 10² Phagen in Verhältnis von 1 pAb (D1.3) in 4 × 10⁴ fdTPs/Bs wurden mittels Affinität gereinigt und mit einem Oligonukleotid sondiert, das spezifisch für pAb (D1.3) ist. A ist ein Filter nach einer Affinitätsreinigungsrunde (900 Kolonien gesamt) und B ist ein Filter nach zwei Runden (372 Kolonien gesamt).
13 zeigt die Sequenz des anti-Oxazolon-Antikörperfragments NQ11scFv. Die vom Linker beigesteuerte Sequenz ist in Kleinbuchstaben gezeigt. Die Sequenz für VH ist vor der Linkersequenz und die Sequenz für VL ist nach dem Linker.
14 zeigt die ELISA-Ergebnisse für die Bindung von pAbNQ11 und pAbD1.3 und Vektor fdTPs/Xh an die angegebenen Antigene.
15 zeigt die Sequenz rund um die phoA-Insertion in fd-phoAla166. Die zur Klonierung verwendeten Restriktionsstellen sind gezeigt, sowie die durch phoA kodierten Aminosäuren rund um die Insertionsstellen. Die ersten fünf Aminosäuren der reifen Fusion kommen aus dem Gen III.
16(1) zeigt die Struktur von Gen III und die native BamHI-Stelle, in die eine scFv-Kodiersequenz in Beispiel 10 insertiert wurde und 16(2) zeigt die natürlichen Peptidlinkerstellen A und B zur möglichen Insertion von scFv-Kodiersequenzen.
17 zeigt schematisch die Arbeitsvorschrift für die PCR-Assemblierung von Mäuse-VH- und VLK-Repertoires zur in Beispiel 11 beschriebenen Phagenpräsentation.
18 zeigt Beispiele der mit der Vorschrift in Beispiel 11 erhaltenen Endprodukte. Die Bahnen a und b zeigen die Produkte der Beginn-PCR unter Verwendung von Primern der schweren bzw. leichten Kette; Bahn C zeigt das vollständig assemblierte 700 bp-Produkt vor der Endspaltung mit Not1 und ApaL1; M1, M2 Marker Φ174 Hae-Spaltung bzw. 123 bp-Leiter ("ladder") (BRL Limited, P. O. Box 35, Washington Road, Paisley, Scotland).
19 zeigt die Ergebnisse eines ELISA der Lysozymbindung durch pCAT-3scFvD1.3-Phagemid im Vergleich zum pCAT-3-Vektor (beide durch M13K07 ergänzt) und zu fdCAT2scFvD1.3 wie in Beispiel 12 beschrieben. Der ELISA wurde wie in Beispiel 6 beschrieben mit Modifikationen, die in Beispiel 13 detailliert erklärt sind, durchgeführt.
20 zeigt das Spaltmuster, das zu sehen ist, wenn einzelne Klone, die statistisch aus einer Bibliothek von Einzelketten-Fv-Antikörpergenen, die aus einer immunisierten Maus stammen, ausgewählt wurden, mit BstN1 gespalten werden.
21 zeigt VH- und VK-Gensequenzen, die aus der kombinatorischen Bibliothek in Beispiel 16 und der hierarchischen Bibliothek in Beispiel 17 stammen.
22 zeigt eine Matrix von ELISA-Signalen für Klone, die aus einer statistischen kombinatorischen Bibliothek stammen. Die Bezeichnung der Klone ist wie in 21. Die Anzahl der mit jeder Kombination gefundenen Klone ist durch die Zahlen angegeben.
23 zeigt a) den Phagemid pHEN1, ein Derivat von pUC119, der in Beispiel 19 beschrieben ist; und b) die Klonierstellen im Phagemid pHEN.
24. Die Antikörperkonstrukte, die zur Präsentation auf der Oberfläche des Phagen in fd-CAT2 und pHEN1 kloniert wurden. Die Konstrukte I, II, III und IV wurden sowohl in fd-CAT2 (als ApaLI-NotI-Fragmente) als auch in PHEN1 (als SfiI-NotI-Fragmente) und in PHEN1 (als SfiI-NotI-Fragmente). Alle Konstrukte enthielten die variablen Regionen der schweren Kette (VH) und der leichten Kette (VL) des aus Mäusen stammenden anti-phOx-Antikörpers NQ10.12.5. Die konstanten Domänen waren menschliches CK und CH1 (γ 1-Isotyp).
25. Drei Arten der Präsentation von Antikörperfragmenten auf der Phagenoberfläche durch Fusion mit dem Gen III-Protein.
26. Western-Blot des Überstands, der aus pHEN1-II(+)- oder pHEN1(–)-Kulturen von E.coli HB2151 entnommen wurde, wobei dieser die Sekretion nur von PHEN1-II zeigt. Der anti-menschliche Fab detektiert sowohl H- als auch L-Ketten. Aufgrund der Befestigung von c-myc tag, ist die L-Kette, die sowohl durch anti-c-myc tag- als auch durch anti-menschliche CK-Antisera markiert bzw. hervorgehoben ist, etwas größer (berechnetes Mr 24625) als die H-Kette (berechnetes Mr 23145).
27 ist ein Graph, der die Wirkung der Lysozymverdünnung auf das Verhältnis der ELISA-Signale, die unter Einsatz von pAbD1.3 oder löslichem scFvD1.3 erhalten wurden, zeigt.
28 ist ein Graph, der die Wirkung der Lysozymverdünnung auf die ELISA-Signale, die unter Einsatz von fdTscFvD1.3 oder löslichem scFvD1.3 erhalten wurden, zeigt.
29 ist ein Graph, der positive Ergebnisse aus einem ELISA-Screen von Phagen, die scFv-Fragmente präsentieren, die aus der Zelllinie 013 stammen, welche einen gegen Östriol gerichteten Antikörper exprimiert, zeigt.
30 ist ein Graph, der positive Ergebnisse aus einem ELISA-Screen von Phagen, die scFv-Fragmente präsentieren, die aus der Zelllinie 014 stammen, welche einen gegen Östriol gerichteten Antikörper exprimiert, zeigt.
31. Vergleich der ELISA-Signale mit scFvD1.3, der in fd-CAT2 (fd) oder pCAT-3 kloniert wurde. pCAT-3scFv1.3 wurde mit M13K07 (K07) ergänzt. M13K07ΔgIIINr. 3 (gIIINr. 3) oder M13K07gIIIΔNr. 2 (g111Nr. 2). Die Phagenantikörper sind in 10fachen (10 ×), 1fachen (1 ×) oder 0,1fachen (0,1 ×) Konzentrationen relativ zur Konzentration im Überstand nach Wachstum über Nacht verglichen. Die Signale der nicht rekombinanten Vektoren fdCAT2 und pCAT-3 waren < 0,01 bei 10facher Konzentration. M13K07gIIIΔNr. 1 ergänzte ("rescued") überhaupt nicht, was sich daraus ergibt, daß es in diesem ELISA kein Signal über dem Hintergrund gibt.
32. Western-Blot von mit PEG gefällten Phagen, die in dem mit anti-g3p sondierten ELISA verwendet wurden. Freie g3p- und die g3p-scFvD1.3-Fusionsbanden sind mit Pfeilen gekennzeichnet.

Probe 1 – fdscFvD1.3
Probe 2 – pCAT3-Vektor
Probe 3 – pCAT3scFvD1.3, ergänzt mit M13K07, kein IPTG
Probe 4 – pCAT3scFvD1.3, ergänzt mit M13K07, 50 μM IPTG
Probe 5 – pCAT3scFvD1.3, ergänzt mit M13K07, 100 μM IPTG
Probe 6 – pCAT3scFvD1.3, ergänzt mit M13K07gIIIΔNr. 3 (kein IPTG)
Probe 7 – pCAT3scFvD1.3, ergänzt mit M13K07gIIIΔNr. 2 (kein IPTG)

Die Proben von Feld A enthalten pro Bahn das 8 μl-Äquivalent des Phagemidkulturüberstandes, und 80 μl des fd-Überstandes (10fach geringere Phagenausbeute als der Phagemid). Die Phagemidproben von Feld B sind die in Feld A verwendeten bei einer 5fach höheren Probenbeladung (äquivalent zu 40 μl Kulturüberstand pro Bahn), um die Fusionsbanden in den Proben, die mit ursprünglichem M13K07 ergänzt wurden, sichtbar zu machen.
33 ist ein Graph, der die fdCAT2scFvD1.3-Anreicherung zeigt, die sich aus einem Gemisch von fdCAT2scFvD1.3 und fdCAT2TPB4 durch eine Anreicherungsrunde ("round of panning") ergibt.
34 ist ein Graph, der die fdCAT2scFvD1.3-Anreicherung zeigt, die sich aus einem Gemisch von fdCAT2scFvD1.3 und fdCAT2TPB1 durch eine Anreicherungsrunde ("round of panning") ergibt.
35. Western-Blot von Phagenproteinen von fdCAT2(1) und fd-tet-SNase(2) mit anti-g3p-Antiserum. Die Banden der Molekulargewichtsmarker sind bezeichnet (kD).
36. Nuklease-Assay von löslicher SNase (3 ng) (A-1), fd-tet-SNase (4 × 10⁹ TU und 0,7 μg) (D-1) in einer 10fach-Verdünnungsreihe (1 bis 3 oder 4). Der Marker (M) ist eine HindIII-Spaltung von λ-DNA (New England Biolabs).
37 zeigt die DNA-Sequenz von scFvB18 (anti-NP).
38 zeigt eine schematische Darstellung der Schritte, die an der PCR-Assemblierung der für die menschlichen scFv-Fragmente kodierenden Nukleotidsequenzen beteiligt sind. Die Details sind in Beispiel 27 zu finden.
39. ELISA-Assay von Phagenantikörpern unter Verwendung von mit Puteneilysozym beschichteten Platten. Die zwei Klone B1 und A4, die durch Mutagenese und Selektion von pAbD1.3 erhalten wurden, sind gezeigt. Die Konzentration (x-Achse) bezieht sich auf die Konzentration der Phagen für jede Probe relativ zur Konzentration im Kulturüberstand. B1 zeigt, verglichen mit D1.3, eine Bindung an Puteneilysozym. A4 weist, verglichen mit D1.3, eine verringerte Bindung an Hühnereilysozym auf.
40. ELISA von Phagenantikörpern, die sich an HEL und TEL binden. Klon 1 ist fdCAT2scFvD1.3. Die Klone 2 bis 10 wurden aus der Bibliothek (Beispiel 31) nach Selektion erhalten. Die Hintergrundwerte, die sich aus der Bindung dieser Klone an BSA ergeben, wurden subtrahiert.
41 zeigt die DNA-Sequenz der leichten Ketten D1.3 M1F und M21, die durch Selektion aus einer hierarchischen Bibliothek in Beispiel 31 erhalten wurden.
42 zeigt einen Fv-λ-Expressionsvektor (Beispiel 33), der aus pUC119 erhalten wurde. Er enthält die neu angeordneten λ1-Keimliniengene. Die Kassetten der schweren und leichten Ketten enthalten jeweils stromaufwärts vom pel B-Leader eine Ribosomenbindestelle (Restriktionsstellen sind gezeigt als: H = HindIII; Sp = SphI; B = BamHI, E = EcoRI.
Materialien und Verfahren
Die folgenden von den Anmeldern verwendeten Vorschriften sind in Sambrook, J. et al., 1989, s.o. beschrieben: Restriktion, Spaltung, Ligation, Herstellung von kompetenten Zellen (Hanahan-Verfahren), Transformation, Analyse der Restriktionsenzymspaltprodukte auf Agarosegelen, Reinigung von DNA mittels Phenol/Chloroform, 5'-Endmarkierung von Oligonukleotiden, Filterscreening von bakteriellen Klonen, Herstellung von 2 × TY-Medium und -Platten, Herstellung von Tetracyclin-Stammlösungen, PAGE von Proteinen, Herstellung von Phosphat-gepufferter Salzlösung. Alle Enzyme wurden von New England Biolabs (CP Laboratories, PO Box 22, Bishop's Stortford, Herts., England) geliefert und, wenn dies nicht anders erwähnt ist, gemäß den Angaben der Hersteller verwendet.
Der Vektor fd-tet (Zacher, A. N. et al., 1980, s.o.) wurde von der American Type Culture Collection (ATCC Nr. 37.000) erhalten und in kompetente TG1-Zellen (Genotyp: K12δ (lac-pro), sup E, thi, hsdD5/F traD36, pro A+B+, Lac 1^q, lac δM15) transformiert.
Virale Partikel wurden hergestellt, indem TG1-Zellen, die das erwünschte Konstrukt enthalten, in 10–100 ml 2 × TY-Medium mit 15 μg/ml Tetracyclin 16–24 Stunden lang gezüchtet wurden. Der Kulturüberstand wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 Upm in einem 8 × 50 ml-Rotor, Sorval RC-5B Zentrifuge, gesammelt. Die Phagenpartikel wurden durch die Zugabe von 1/5 des Volumens an 20%igem Polyethylenglycol (PEG)/2,5 M NaCl und 1-stündiges Stehenlassen bei 4°C gefällt. Diese wurden 15 Minuten lang wie oben beschrieben zentrifugiert und die Pellets wiederum in 10 mM Tris/HCl pH 8, 1 mM EDTA in 1/100 des ursprünglichen Volumens aufgelöst. Der Bakterienrückstand und nicht aufgelöstes Material wurden durch 2-minütige Zentrifugation in einer Mikrozentrifuge entfernt. Einsträngige DNA zur Mutagenese und Sequenzierung wurde aus der konzentrierten Phagenlösung gemäß Sambrook, J. et al., 1989, s.o., hergestellt.
Liste der Beispiele
Beispiel 1 Konstruktion der Insertionspunktlinker und Konstruktion der Vektoren
Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion von zwei Derivaten des Phagenvektor fd-tet: a) fdTPs/Bs für die Insertion von VH-Kodiersequenzen; und b) fdTPs/Xh für die Insertion von scFv-Kodiersequenzen. Die Derivatvektoren weisen eine neue BstEII-Stelle zur Insertion von Sequenzen auf.
Beispiel 2 Insertion der Immunglobulin-Fv-Domäne in den Phagen
Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus einem anti-Lysozym-Antikörper D1.3 stammen, in fdTPs/Xh, um das Konstrukt fdTscFvD1.3 zu ergeben.
Beispiel 3 Insertion der Immunglobulin-VH-Domäne in den Phagen
Dieses Beispiel betrifft die Insertion von VH-Kodiersequenzen, die aus einem anti-Lysozym-Antikörper D1.3 stammen, in fdTPs/Bs, um das Konstrukt fdTVHD1.3 zu ergeben.
Beispiel 4 Analyse der Bindespezifität der Phagenantikörper
Dieses Beispiel untersucht die Bindespezifitäten der Konstrukte fdTscFvD1.3 und fdTVHD1.3.
Beispiel 5 Konstruktion von fdCAT2
Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion des Derivats fdCAT2 des Phagenvektors fdTPs/Xh. Das Derivat hat Restriktionsstellen für Enzyme, die DNA nicht häufig schneiden.
Beispiel 6 Spezifische Bindung des Phagenantikörpers (pAb) an Antigen
Dieses Beispiel zeigt die Bindung von pAbfdTscFvD1.3 an Lysozym durch ELISA.
Beispiel 7 Isolierung von spezifischen, erwünschten Phagen aus einem Gemisch von Vektorphagen.
Dieses Beispiel zeigt, wie ein Phage (z.B. fdTscFvD1.3), der ein Bindemolekül präsentiert, von Vektorphagen durch Affinitätsverfahren isoliert werden kann.
Beispiel 8 Konstruktion von pAb, die anti-Hapten-Aktivität exprimieren
Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus dem anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 stammen, in fdTPs/Xh, um das Konstrukt pAbNQ11 zu bilden. Das Beispiel zeigt die Bindung von pAbNQ11 an Oxazolon durch ELISA.
Beispiel 9 Anreicherung von pAbD1.3 aus Gemischen anderer pAbs durch Affinitätsreinigung
Dieses Beispiel zeigt, wie ein Phage (z.B. pAbD1.3), der eine Sorte von Bindemolekül präsentiert, durch Affinitätsverfahren von Phagen (z.B. pAbNQ11), die eine andere Sorte von Bindemolekülen präsentieren, isoliert werden kann.
Beispiel 10 Insertion von Bindemolekülen in alternative Stellen im Phagen
Dieses Beispiel betrifft die Insertion von scFv-Kodiersequenzen, die aus a) dem anti-Lysozym-Antikörper D1.3; und b) dem anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 stammen, in eine BamHI-Stelle von fdTPs/Xh, um die Konstrukte fdTBam1 mit einem NQ11-Insert zu ergeben.
Beispiel 11 PCR-Assemblierung der VH- und VLK-Repertoires aus Mäusen zur Phagenpräsentation
Dieses Beispiel betrifft ein System für die Präsentation aller durch eine Maus kodierten VH- und VLK-Repertoires auf Phagen. Das System beinhaltet die folgenden Schritte. 1) Herstellung von RNA aus Milz. 2) Herstellung von cDNA aus der RNA. 3) Einsatz von Primern, die für Antikörpersequenzen spezifisch sind, um mittels PCR alle VH- und VLK-cDNA-Kodiersequenzen zu amplifizieren. 4) Einsatz der PCR, um ein Linkermolekül aus verbindenden Paaren der VH- und VLK-Sequenzen zu bilden. 5) Einsatz der PCR, um kontinuierlich DNA-Moleküle, von denen jedes eine VH-Sequenz, einen Linker und eine VLK-Sequenz umfaßt, zu assemblieren. Die spezifi sche VH/VLK-Kombination wird statistisch erhalten. 6) Einsatz der PCR, um Restriktionstellen einzubringen.
Beispiel 12 Konstruktion eines Phagemids, der Gen III als Fusion mit der Kodierseguenz für ein Bindemolekül enthält
Diese Beispiel betrifft die Konstruktion von zwei Phagemiden, die auf pUC119 basieren und die das Gen III von fdCAT2 und die Gen III-Fusion fdCAT2scFvD1.3 getrennt enthalten, um pCAT2 bzw. pCAT3scFvD1.3 zu bilden.
Beispiel 13 Ergänzung ("rescue") der anti-Lysozym-Antikörperspezifität aus pCAT3-scFvD1.3 durch M13K07
Diese Beispiel betrifft die Ergänzung der Kodiersequenz für die Gen IIIscFv-Fusion von pCAT3scFvD1.3 durch das Wachstum des M13K07-Helferphagen, wobei durch ELISA gezeigt wird, daß die Phagen scFv anti-Lysozym-Aktivität präsentieren.
Beispiel 14 Transformationseffizienz der pCAT-3- und pCAT-3scFvD1.3-Phagemide
Dieses Beispiel vergleicht die Wirksamkeit der Phagemide pUC119, pCAT-3 und pCAT3scFvD1.3 und des Phagen fdCAT2 bei der Transformation von E.coli.
Beispiel 15 PCR-Assemblierung einer Einzelketten-Fv-Bibliothek aus einer immunisierten Maus
Diese Beispiel betrifft ein System für die Phagenpräsentation von scFv (umfaßt VH und VL) aus einer immunisierten Maus unter Verwendung der Grundtechniken, die in Beispiel 11 erklärt sind (cDNA-Herstellung und PCR-Assemblierung der VH- und VLK-Repertoires aus Mäusen) und die Ligation der PCR-assemblierten Sequenzen in fdCAT2, um eine Phagenbibliothek mit 10⁵ Klonen zu bilden. Die Untersuchung von 500 Klonen zeigte, daß keiner Spezifität gegen phOx zeigte.
Beispiel 16 Selektion von Antikörpern, die für 2-Phenyl-5-oxazolon spezifisch sind aus einem Repertoire einer immunisierten Maus
Dieses Beispiel zeigt, daß Phagen, die aus einer in Beispiel 15 aufgestellten Bibliothek gezüchtet wurden, einer Affinitätsselektion unter Verwendung von phOx unterzogen werden können, um jene Phagen auszuwählen, die scFv mit der gewünschten Spezifität präsentieren.
Beispiel 17 Bildung weiterer Antikörperspezifitäten durch die Assemblierung von hierarchischen Bibliotheken
Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion von hierarchischen Bibliotheken, in denen eine bestimmte VH-Sequenz mit dem gesamten VLK-Repertoire kombiniert wird und eine bestimmte VLK-Sequenz mit dem gesamten VH-Repertoire kombiniert wird und die Selektion neuer VH- und VL-Paarungen aus diesen Bibliotheken.
Beispiel 18 Selektion von Antikörpern, die auf Bakteriophagen präsentiert werden mit verschiedenen Affinitäten für 2-Phenyl-5-oxazolon unter Einsatz von Affinitätschromatoaraphie
Dieses Beispiel betrifft die Trennung von Phagen, die scFv-Fragmente mit verschiedenen Bindeaffinitäten für ein bestimmtes Antigen präsentieren, mittels Affinitätstechniken.
Beispiel 19 Konstruktion von Phagemid pHEN1 zur Expression von Antikörperfragmenten, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen nach Superinfektion exprimiert werden
Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion des Phagemid pHEN1, der aus pUC119 erhalten wurde. pHEN1 weist die in 23 gezeigten Merkmale auf.
Beispiel 20 Präsentation von Einzelketten-Fv-Fragmenten, die vom anti-Oxazolon-Antikörper NQ10.12.5 stammen, auf dem Bakteriophagen fd unter Verwendung von pHEN1 und fdCAT2.
Dieses Beispiel beschreibt die Präsentation eines scFv-Fragments mit einer Spezifität gegen phOx auf der Oberfläche eines Bakteriophagen. Zur Präsentation von scFv umfaßt der Phagemid pHEN1 die für scFv (VH und VL) kodierenden Sequenzen zur Ergänzung durch einen der Phagen VSM13 oder fdCAT2.
Beispiel 21 Induktion von löslichen scFv- und Fab-Fragmenten unter Verwendung des Phagemid pHEN1
Dieses Beispiel betrifft die Bildung von löslichen scFv- und Fab-Fragmenten aus Gen III-Fusionen mit für diese Fragmente kodierenden Sequenzen durch Expression der Klone in pHEN1 in einem E.coli-Stamm, der "amber"-Mutationen nicht unterdrückt.
Beispiel 22 Erhöhte Empfindlichkeit im ELISA von Lysozym unter Verwendung von fdTscFvD1.3 als primärer Antikörper, verglichen mit löslichem scFvD1.3.
Dieses Beispiel betrifft die Verwendung von fdTscFvD1.3 im ELISA und zeigt, daß mit dem Phagenantikörper fdTscFvD1.3 kleinere Lysozymmengen als mit dem löslichen scFvD1.3 nachgewiesen werden können.
Beispiel 23 Direkte Ergänzung und Expression von monoklonalen Mäuseantikörpern als Einzelketten-Fv-Fragmente auf der Oberfläche des Bakteriophagen fd
Diese Beispiel betrifft die Präsentation von zwei Klonen, die direkt von Zellen, die gegen Östriol gerichtete monoklonale Antikörper exprimieren, erhalten wurden, auf Phagen als funktionelle scFv-Fragmente.
Beispiel 24 Konstruktion eines Helferphagen, dem Gen III fehlt
Dieses Beispiel betrifft die Konstruktion eines Helferphagen, der von M13K07 durch Deletion von Sequenzen in Gen III erhalten wurde. Die Ergänzung von pCAT3-scFvD1.3 ist beschrieben. Der scFvD1.3 wird auf hohem Niveau als Fusion unter Verwendung des Deletionsphagen exprimiert, äquivalent zur Expression unter Verwendung von fdCAT2-scFvD1.3.
Beispiel 25 Selektion von Bakteriophagen, die gegen Lysozym gerichtete scFv-Fragmente exprimieren, aus Gemischen gemäß der Affinität unter Verwendung eines Anreicherungsverfahrens ("panning procedure")
Dieses Beispiel betrifft die Selektion von Bakteriophagen gemäß der Affinität des gegen Lysozym gerichteten scFv-Fragments, das auf deren Oberfläche exprimiert wird. Phagen mit verschiedenen Affinitäten wurden an mit Lysozym beschichtete Petrischalen gebunden und nach dem Waschen die gebundenen Phagen mittels Triethylamin eluiert. Es wurden Bedingungen gefunden, bei denen eine beträchtliche Anreicherung für einen Phagen mit einer 5fach höheren Affinität als jene des Phage, mit dem er vermischt war, erhalten werden konnte.
Beispiel 26 Bildung und Selektion von Mutanten eines anti-4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP)-Antikörpers, der auf Phagen exprimiert wird, unter Einsatz von Mutatorstämmen
Diese Beispiel betrifft das Einbringen von Mutationen in ein Gen für einen Antikörper, der in Phagen durch Züchten des Phagen in Stämmen, die statistisch die DNA aufgrund eines Defekts in der DNA-Replikation mutieren, kloniert wurde. Verschiedene Mutationen werden in den Phagen eingebracht, die vom ursprünglichen Phagen ausgewählt werden können.
Beispiel 27 Eine auf PCR basierende Technik zur Ein-Schritt-Kionierung menschlicher scFv-Konstrukte
Diese Beispiel beschreibt die Bildung von scFv-Fragment-Bibliotheken, die aus einem nicht immunisierten Menschen erhalten wurden. Es werden Beispiele der Herstellung von Bibliotheken in Phagemiden zur Phagenpräsentation der scFv-Fragmente, die aus den IgG- und IgM-Sequenzen stammen, gezeigt.
Beispiel 28 Isolierung der Bindeaktivitäten aus einer Bibliothek von scFvs aus einem nicht immunisierten Mensch
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung von Klonen für Phagenantikörper, die gegen BSA, Lyszym und Oxazolon gerichtet sind, aus der Bibliothek der scFv-Fragmente, die aus den IgM-Genen eines nicht immunisierten Menschen stammen. Die Selektion erfolgte durch Anreicherung ("panning") oder durch Affinitätschromatographie und Analyse der Bindespezifitäten durch ELISA. Die Sequenzierung der Klone zeigte, daß diese menschlichen Ursprungs sind.
Beispiel 29 Ergänzung der menschlichen IgM-Bibliothek unter Verwendung eines Helferphagen, dem das Gen 3 fehlt (Δg3)
Diese Beispiel betrifft die Isolierung von Klonen für Phagenantikörper, die spezifisch für Thyroglobulin und Oxazolon sind, aus der Bibliothek der aus den IgM-Genen eines nicht immunisierten Menschen stammenden scFv-Fragmente. In diesem Beispiel erfolgte die Ergänzung mit M13K07gIIINr. 3 (NCTC12478), einem Helferphagen, dem das Gen III fehlt. Es zeigte sich, daß für eine Phagemidbibliothek, die mit diesem Phagen ergänzt wurde, weniger Selektionrunden in Vergleich zu einer, die mit M13K07 ergänzt wurde, notwendig sind.
Beispiel 30 Änderung der Feinspezifität von auf Phagen präsentiertem scFvD1.3 durch Mutagenese und Selektion auf immobilisiertem Putenlysozym
Dieses Beispiel betrifft die in vitro-Mutagenese von pCATscFvD1.3 durch den statistischen Austausch mit Aminosäuren von Resten, von denen bekannt ist, daß sie bei der bevorzugten Erkennung von Hühnereilysozym gegenüber Puteneilysozym durch scFvD1.3 wichtig sind. Nach der Selektion nach Phagenantikörpern, die Puteneilysozym erkennen, durch Affinitätschromatographie, wurden die Klone auf ihre Spezifität mittels ELISA analysiert. Es wurden zwei Gruppen von Klonen mit gleicher Erkennung von Hühner- und Putenlysozym, eine mit erhöhtem ELISA-Signal mit dem Putenenzym und eine mit verringertem Signal für das Hühnerenzym gefunden.
Beispiel 31 Modifikation der Spezifität eines Antikörpers durch Austausch der VLK-Domäne durch eine VLK-Bibliothek, die aus einer nicht immunisierten Maus stammt
Diese Beispiel zeigt, daß der Austausch der VL-Domäne von scFvD1.3, das spezifisch für Hühnereiweißlysozym (HEL) ist, durch eine Bibliothek von VL-Domänen die Selektion der scFv-Fragmente, die sich auch an Puteneiweißlysozym binden, ermöglicht. Die scFv-Fragmente wurden aus Phagen präsentiert und die Selektion erfolgte durch Anreicherung in mit TEL beschichteten Röhrchen. Die Analyse mittels ELISA zeigte Klone mit im Vergleich zu HEL verstärkter Bindung an TEL. Jene mit der stärksten Bindung an TEL wurden sequenziert.
Beispiel 32 Selektion einer Phagenantikörperspezifität durch die Bindung an ein Antigen das an magnetischen Perlen befestigt ist Die Verwendung eines spaltbaren Reagens, um die Elution der gebunden Phagen unter milden Bedingungen zu ermöglichen.
Dieses Beispiel betrifft die Verwendung einer spaltbaren Bindung im Affinitätsselektionsverfahren um die Freisetzung von gebundenen Phagen unter milden Bedingungen zu ermöglichen. pAbNQ11 wurde aus einem Gemisch mit pAbD1.3 durch die Selektion unter Verwendung von biotinyliertem Ox-BSA, das an magnetische Perlen gebunden ist, etwa 600fach angereichert. Die Spaltung einer Bindung zwischen BSA und dem Biotin ermöglicht die Elution des Phagen.
Beispiel 33 Verwendung der Zellenselektion, um einen angereicherten Pool von Antigen-spezifischen Antikörpergenen bereitzustellen, Anwendung, um die Komplexität der Repertoires der Antikörperfragmente, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden, zu verringern
Dieses Beispiel betrifft die Verwendung der Zellselektion, um einen angereicherten Pool von Genen, die für gegen 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure gerichtete Antikörper kodieren, herzustellen und beschreibt, wie dieses Verfahren verwendet werden könnte, um die Komplexität der Antikörperrepertoires, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden, zu verringern.
Beispiel 1
Konstruktion der Insertionspunktslinker und Konstruktion der Vektoren
Der Vektor fd-tet hat zwei BstEII-Restriktionsstellen, die die Tetracyclinresistenzgene flankieren (3). Da es die Strategie zur Insertion der VH-Fragmente war, diese in eine neu innerhalb von Gen III insertierte BstEII-Stelle zu ligieren, war es vorteilhaft, die ursprünglichen BstEII-Stellen aus fd-tet zu löschen. Dies wurde erreicht, indem fd-tet mit dem Restriktionsenzymen BstEII gespalten wurde, die 5'-Überstände aufgefüllt und erneut ligiert wurde, um den Vektor fdTδBst zu bilden. Die Spaltung von fd-tet mit BstEII (0,5 Units/μl) wurde in 1 × KGB-Puffer (100 mM Kaliumglutamat, 23 mM Tris-Acetat (pH 7,5), 10 mM Magnesiumacetat, 50 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM Dithiothreitol (Sambrook, J., et al., 1989, s.o.)) mit DNA bei einer Konzentration von 25 ng/μl durchgeführt. Die 5'-Überstände wurden unter Verwendung von 2 × KGB-Puffer, jeweils 250 μM dNTP's (Pharmacia Ltd., Pharmacia House, Midsummer Bolevark, Milton Keynes, Bucks., UK.) und 0,04 Units/μl Klenow-Fragment (Amersham International, Lincoln Place, Green End, Aylesbury, Bucks., UK) aufgefüllt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur, wurde die DNA mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt.
Die Ligationen wurden bei einer DNA-Konzentration von 50 ng/μl durchgeführt. Die Ligationen wurden in kompetente TG1-Zellen transformiert und auf TY-Platten, die mit 15 μg/ml Tetracyclin versetzt waren, ausplattiert. Dies selektiert Vektoren, bei denen während des Ligationsschrittes das Gen für das Tetracyclinresistenzprotein wieder in den Vektor insertiert wurde. Die Kolonien wurden in 25 ml 2 × TY-Medium, das mit 15 μg/ml Tetracyclin versetzt war, gegeben und über Nacht bei 37°C gezüchtet.
Doppelsträngige DNA wurde unter Verwendung des Gene-Clean II Sets (Bio101 Inc., PO Box 2284, La Jolla, California, 92038–2284, USA.) aus den resultierenden Klonen und gemäß der darin beschriebenen Vorschrift zur schnellen DNA-Isolierung im kleinen Maßstab gereinigt. Die Orientierung von 5 der resultierenden Klone wurde mit dem Restriktionsenzym ClaI geprüft. Es wurde ein Klon ausgewählt, der dasselbe Restriktionsmuster durch ClaI aufwies wie fd-tet, der aber keine BstEII-Stellen hatte.
Die in vitro-Mutagenese von fdTδBst wurde benützt, um Vektoren mit geeigneten Restriktionsstellen, die das Klonieren von Antikörperfragmenten stromabwärts vom Gen III-Signalpeptid und im Rahmen mit der Gen III-Kodiersequenz erleichtern, zu bilden. Das auf Oligonukleotide gerichtete Mutagenesesystem in der Version 2 (Amersham International) wurde mit oligo 1 (4) verwendet, um fdTPs/Bs zu bilden (um das Klonieren der VH-Fragmente zu erleichtern). Die Sequenz offdTPs/Bs (4) wurde unter Einsatz des Sequenase Sets Version 2 (USB Corp., PO Box 22400, Cleveland, Ohio, 11422, USA.) mit oligo 3 (4) als Primer bestätigt.
Ein zweiter Vektor fdTPs/Xh (um das Klonieren der Einzelketten-Fv-Fragmente zu erleichtern) wurde durch das Mutagenisieren von fdTPs/Bs mit oligo 2 gemäß dem Verfahren von Venkitaraman, A. R., Nucl. Acid. Res. 17, S. 3314 gebildet. Die Sequenz von fdTPs/Xh (4) wurde unter Einsatz des Sequenase Sets Version 2 (USB Corp.) mit oligo 3 als Primer bestätigt.
Alternative Konstrukte werden dem Fachmann auf dem Gebiet natürlich offensichtlich sein. Beispielsweise M13 und/oder seine Wirtsbakterien könnte(n) so modifiziert werden, daß sein Gen III ohne das Auftreten von exzessivem Zelltod unterbrochen werden könnte; das modifizierte fd-Gen III, oder ein anderes modifiziertes Protein, könnte in ein Plasmid, das einen Einzelstrangphagenreplikationsursprung aufweist, wie z.B. pUC119, eingebaut werden, die Superinfektion mit dem modifizierten Phagen, wie z.B. K07, würde dann die Einkapselung des Phagenantikörpergenoms in eine Hülle, die zum Teil vom Helferphagen und zum Teil vom Phagenantikörper-Gen III-Konstrukt stammt, ergeben.
Die detaillierte Konstruktion eines Vektors, wie z.B. fdTPs/Bs in nur ein Weg das Ziel eines Phagenantikörpers zu erreichen. Beispielsweise können Verfahren, wie z.B. die "sticky feet"-Klonierung/Mutagenese (Clackson, T. and Winter, G. 1989, Nucl. Acids. Res., 17, S. 10163–10170) benützt werden, um die Verwendung von Restriktionsenzymspaltungen und/oder Ligationsschritten zu vermeiden.
Beispiel 2
Insertion der Immunglobulin-Fv-Domäne in den Phagen
Das Plasmid scFvD1.3 myc (zur Verfügung gestellt von G. Winter und A. Griffiths) enthält VH- und VL-Sequenzen aus dem Antikörper D1.3, die über eine Peptidlinkersequenz fusioniert sind, um eine Einzelketten-Fv-Version des Antikörper D1.3 zu bilden. Die Sequenz des scFv und die umgebenden Sequenzen in scFvD1.3 myc sind in 5 gezeigt.
Die Spaltung von scFvD1.3 myc mit PstI und XhoI (diese Restriktionsstellen sind in 5 gezeigt) schneidet ein 693 bp-Fragment, das für den Hauptteil von scFv kodiert, heraus. Die Ligation dieses Fragments in fdTPs/Xh, der mit PstI und XhoI gespalten wurde, ergab das Konstrukt fdTscFvD1.3, das für das Gen III-Signalpeptid und die erste Aminosäure, die an den vollständigen D1.3 scFv fusioniert ist, gefolgt von dem reifen Gen III-Protein ab Aminosäure 2, kodiert.
Der Vektor fdTPs/Xh wurde für die Ligation durch 2-stündige Spaltung mit PstI und XhoI, gefolgt von einer 30-minütigen Spaltung mit alkalischer Phosphatase aus Kalbsdarm (Böhringer Mannheim UK Ltd, Bell Lane, Lewes, East Sussex, BN7 1LG) mit einem Unit/μl bei 37°C. Frische alkalische Phosphatase aus Kalbsdarm wurde bis zu einer Endkonzentration von 2 Units/μl zugegeben und weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktionslösung wurde 3mal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser aufgelöst. Das Insert wurde aus scFvD1.3 myc mit den geeigneten Restriktionsenzymen (PstI und XhoI) ausgeschnitten, 2mal mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in Wasser aufgelöst. Die Ligationen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, außer daß sowohl Vektor- als auch die Insertproben jeweils eine Endkonzentration von 5 ng/μl aufwiesen. Die Bildung des richtigen Konstruktes wurde wie in Beispiel 1 beschrieben durch Sequenzieren bestätigt.
Um zu zeigen, daß Proteine mit der erwarteten Größe hergestellt wurden, wurden die Virionen durch PEG-Fällung wie oben beschrieben konzentriert. Die Proben wurden gemäß der Vorschrift in Sambrook, J. et al., s.o. vorbereitet. Äquivalente von 2 ml des Überstandes wurden auf ein 18%iges SDS-Polyacrylamidgel aufgegeben. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 15 Minuten lang in Gellaufpuffer (50 mM Tris, 380 mM Glycin, 0,1% SDS) mit 20% Methanol geweicht. Der Transfer auf Nitrocellulosefilter erfolgte in frischem 1 × Laufpuffer/20% Methanol unter Verwendung von TE70 Semi Phor, einem "halb-trocken"-Blotting-Gerät ("semi-dry blotting apparatus"; Höffer, 654 Minnesota Street, Box 77387, San Francisco, California 94107, USA.).
Nach dem Transfer, wurde der Filter durch 1-stündige Inkubation in einer 2%igen Milchpulver-Lösung (Marvel) in Phosphat-gepufferter Salzlösung blockiert. Der Nachweis der scFv- und VH-Proteinsequenzen in den Phagenantikörperfusionsproteinen erfolgte durch 1-stündiges Weichen des Filters mit einer 1/1000-Verdünnung (in 2% Milchpulver) eines polyklonalen Kaninchenantiserums gegen Affinitäts-gereinigtes, bakteriell exprimiertes scFv-Fragment (von G. Winter zur Verfügung gestellt). Nach dem Waschen mit PBS (3 × 5 Minuten-Waschungen) wurde gebundener primärer Antikörper mit 1-stündiger Verwendung eines an Meerrettichperoxidase konjugierten anti-Kaninchen-Antikörpers (Sigma, Fancy Road, Poole, Dorset, BH17 7NH, UK.) nachgewiesen. Der Filter wurde in PBS/0,1% Triton-X100 gewaschen und mit 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminbenzidintetrahydrochlorid (DAB), 0,02% Kobaltchlorid, und 0,03% Wasserstoffperoxid in PBS entwickelt.
Die Ergebnisse zeigten, daß mit den Klonen fdTVHD1.3 (aus Beispiel 3, beinhaltet für VH kodierende Sequenzen) und fdTscFvD1.3 (beinhaltet für scFv kodierende Sequenzen) ein Protein zwischen 69.000 und 92.500 Dalton durch das anti-Fv-Serum detektiert wird. Das ist die für die konstruierten Fusionsproteine erwartete Größe. Dieses Produkt wird in von fd-tet, fdTδBst oder fdTPs/Xh gewonnenen Überständen nicht beobachtet.
Beispiel 3
Insertion der Immunglobulin-VH-Domäne in den Phagen
Das VH-Fragment aus D1.3 wurde aus dem Plasmid pSW1-VHD1.3-TAG1 (Ward, E. S. et al., 1989, s.o.) gebildet. Die Spaltung dieses Plasmids mit PstI und BstEII ergibt das in 5 zwischen den Positionen 113 und 432 gezeigte Fragment. Die Klonierung dieses Fragments in die PstI- und BstEII-Stellen von fdTPs/Bs ergab das Konstrukt fdTVHD1.3, das für ein Fusionsprotein mit einer vollständigen VH-Domä ne, die zwischen die erste und dritte Aminosäure des reifen Gen III-Proteins (Aminosäure 2 wurde gelöscht) insertiert wurde, kodiert.
Die verwendeten Verfahren waren genau wie in Beispiel 2, außer daß der verwendete Vektor fdTPs/Bs war, der mit PstI und BstII gespalten wurde.
Beispiel 4
Analyse der Bindespezifität der Phagenantikörper
Die Bindung der spezifischen Phagenantikörper an das spezifische Antigen, Lysozym, wurde mit ELISA-Verfahren analysiert. Die Phagenantikörper (z.B. fdTVHD1.3 und fdTsc/FvD1.3) wurden in E.coli gezüchtet und Phagenantikörperteilchen wurden wie in Materialien und Verfahren beschrieben mit PEG gefällt. Die gebundenen Phagenantikörperteilchen wurden mittel polyklonalem Schafsserum gegen den nahe verwandten Phagen M13 nachgewiesen.
ELISA-Platten wurden durch die Beschichtung von 96-Napf-Platten (Falcon Microtest III flexible Platte. Falcon: Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, California, 93030, USA.) mit 200 μl einer Lysozymlösung (1 mg/ml, wenn nicht anders erwähnt) in 50 mM NaHCO₃ für 16–24 Stunden vorbereitet. Vor der Verwendung wurde diese Lösung entfernt, die Platte mehrere Male in PBS gespült und mit 200 μl 2% Milchpulver/PBS eine Stunde lang inkubiert. Nach mehreren Spülungen mit PBS wurden 100 μl der Testproben zugegeben und eine Stunde inkubiert. Die Platten wurden gewaschen (3 Spülungen in 0,05% Tween 20/PBS, gefolgt von 3 Spülungen in PBS alleine). Die gebundenen Phagenantikörper wurden durch die Zugabe von 200 μl pro Napf einer 1/1000-Verdünnung von polyklonalem anti-M13-Schafsserum (von G. Winter zur Verfügung gestellt, obwohl ein gleichwertiger Antikörper unter Verwendung von Standardverfahren von einem Fachmann auf dem Gebiet leicht hergestellt werden kann) in 2% Milchpulver/PBS und 1-stündige Inkubation nachge wiesen. Nachdem wie oben gewaschen wurde, wurden die Platten mit biotinyliertem anti-Schaf-Antikörper (Amersham International) 30 Minuten lang inkubiert. Die Platten wurden wie oben gewaschen und mit dem Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex (Amersham International) inkubiert. Nach einer abschließenden Waschung (wie oben) wurden 0,5 mg/ml ABTS-Substrat in Citratpuffer zugegeben (ABTS: 2'2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulphonsäure); Citratpuffer = 50 mM Zitronensäure, 50 mM Trinatriumcitrat in einem Verhältnis von 54:46. Wasserstoffperoxid wurde auf eine Endkonzentration von 0,003% zugegeben und die Platten 1 Stunde lang inkubiert. Die optische Dichte bei 405 nm wurde in einem Titersek Multiskan-Plattenlesegerät abgelesen.
6 zeigt die Wirkung der Variation der Phagenantikörpermenge. 100 μl verschiedener Verdünnungen von mit PEG gefällten Phagen wurden aufgegeben und die Menge als ursprüngliches Kulturvolumen, aus dem er gewonnen wurde, ausgedrückt. Die Signale, die sowohl vom scFv enthaltenden Phagenantikörper (fdTscFvD1.3) als auch vom VH enthaltenden Phagenantikörper (fdTVHD1.3) erhalten wurden, waren höher als jene, die vom Phagenantikörpervektor (fdTPs/Xh) erhalten wurden. Das höchste Signal/Rausch-Verhältnis tritt bei der Verwendung des Äquivalents von 1,3 ml der Kultur auf.
7 zeigt die Ergebnisse der Beschichtung der Platten mit variierenden Konzentrationen an Lysozym oder Rinderserumalbumin (BSA). Das Äquivalent von 1 ml des ursprünglichen Phagenantikörperkulturüberstandes wurde. Die Signale von den Überständen, die mit fdTscFvD1.3 erhalten wurden, waren wieder höher als jene, die mit fdTPs/Xh erhalten wurden, wenn mit Lysozym beschichtete Näpfe verwendet wurden. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Typen von Überständen, wenn die Platten mit BSA beschichtet waren. Allgemein gesagt ist der Signalwert auf den Platten proportional zur beschichteten Lysozymmenge. Diese Ergebnisse zeigen, daß die detektierte Bindung spezifisch für Lysozym als Antigen ist.
Beispiel 5
Konstruktion von fdCAT2
Es wäre nützlich, Vektoren zu konstruieren, die die Verwendung von die DNA selten schneidenden Restriktionsenzymen ermöglichen, und somit die unerwünschte Spaltung der Antikörpergeninserte innerhalb ihrer Kodiersequenz vermeiden. Insbesondere Enzyme mit einer Erkennungssequenz von 8 Basen sind in diesem Zusammenhang nützlich, beispielsweise NotI und SfiI. Chaudhary (PNAS 87, S. 1066–1070, 1990) identifizierten allgemein eine Anzahl von Restriktionsstellen, die im den variablen Genen von Antikörpern selten vorkommen. Die Anmelder haben als Beispiel, wie dieser Enzymtyp verwendet werden kann, einen Vektor gestaltet und konstruiert, der zwei dieser Stellen verwendet. Die für die Enzyme ApaLI und NotI notwendigen Stellen wurden in fdTPs/Xh eingebracht, um fdCAT2 zu bilden.
Das folgende Oligonukleotid wurde synthetisiert: 5'-ACT TTC AAC AGT TTC TGC GGC CGC CCG TTT GAT CTC GAG CTC CTG CAG TTG GAC CTG TGC ACT GTG AGA ATA GAA-3' (siehe Beschreibung der 4) und benützt, um fdTPs/Xh unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets von Amersham International, wie in Beispiel 1 beschrieben, zu mutagenisieren um fd-CAT2 zu bilden. Die Sequenz von fd-CAT2 wurde rund um die Manipulationsstelle durch DNA-Sequenzieren überprüft. Die endgültige Sequenz rund um den Insertionspunkt innerhalb von Gen III ist in 8 gezeigt.
N.B. fdCAT2 wird hierin auch durch die alternativen Begriffe fd-tet-DOG1 und fd-DOG1 bezeichnet.
Beispiel 6
Spezifische Bindung des Phagenantikörpers (pAb) an Antigen
Die Bindung von pAbD1.3 (fdTscFvD1.3 aus Beispiel 2) an Lysozym wurde mittels ELISA weiter analysiert.
Verfahren
1. Phagenwachstum
Mit Phagen transduzierte Bakterienkulturen wurden in 10–100 ml 2 × TY-Medium mit 15 μg/ml Tetracyclin hergestellt und unter Schütteln bei 37°C 16–24 Stunden lang wachsen gelassen. Der Phagenüberstand wurde durch Zentrifugation der Kultur (10 Minuten bei 10.000 Upm, 8 × 50 ml Rotor, Sorval RC-5B Zentrifuge) gewonnen. Auf dieser Stufe war der Phagentiter 1–5 × 10¹⁰/ml transduzierende Einheiten. Die Phagen wurden durch Zugabe von 1/5 des Volumens an 20% PEG in 2,5 M NaCl, 1 Stunde lang Stehenlassen bei 4°C und Zentrifugieren (siehe oben) gefällt. Die Phagenpellets wurden in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0 in 1/100 des ursprünglichen Volumens erneut suspendiert, und die Bakterienreste und aggregierten Phagen durch 2-minütiges Zentrifugieren in einer Tisch-Mikrozentrifuge entfernt.
ELISA
Die Platten wurden mit Antigen (1 mg/ml Antigen) beschichtet und wie in Beispiel 4 blockiert. 2 × 10¹⁰ Phagen transduzierende Einheiten wurden den mit Antigen beschichteten Platten in Phosphat-gepufferter Salzlösung, die 2% Magermilchpulver (MPBS) enthält, zugegeben. Die Platten wurden zwischen jedem Schritt durch 3 Spülungen mit 0,5% Tween-20 min PBS, gefolgt von 3 Spülungen mit PBS, gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden durch Inkubation mit anti-M13-Antiserum aus Schafen entwickelt und mit an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem anti-Ziegen-Serum (Sigma, Poole, Dorset, UK), das auch Schafsimmunglobuline detek tiert, und ABTS (2'2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulphonsäure)) nachgewiesen. Die Ablesungen bei 405 nm erfolgten nach einem geeigneten Zeitraum. Die Ergebnisse (9) zeigen, daß der den Antikörper aufweisende Phage dasselbe Reaktivitätsmuster aufwies wie der ursprüngliche D1.3-Antikörper (Harper, M., Lema, F., Boulot, G., and Poljak, F. J. (1987) Molec. Immunol. 24, 97–108), und sich an Hühnereiweißlysozym, aber nicht an Puteneiweißlysozym, menschliches Lysozym oder Rinderserumalbumin band. Die Spezifität des Phagen wird insbesondere durch das Fehlen der Bindung an Puteneiweißlysozym, das sich von Hühnereiweißlysozym durch nur 7 Aminosäuren unterscheidet, veranschaulicht.
Beispiel 7
Isolierung von spezifischen, erwünschten Phagen aus einem Gemisch von Vektorhagen.
Die Anmelder reinigten pAb (D1.3) (ursprünglich in Beispiel 2 als fdTscFvD1.3 bezeichnet) aus Gemischen unter Einsatz von Affinitätssäulen. pAb (D1.3) wurde mit dem Vektor fd-Phage (siehe Tabelle 1) gemischt und etwa 10¹² Phagen über eine Lysozym-Sepharose-Säule geschickt (aus mit Bromcyan aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia, Milton Keynes, Bucks, UK) gemäß den Anleitungen der Produzenten hergestellt). TG1-Zellen wurden mit geeigneten Verdünnungen der Eluate infiziert und die erhaltenen Kolonien durch den Einsatz einer Oligonukleotid-Sonde, die nur den pAb (D1.3) nachweist, analysiert, siehe Tabelle 1 und 12. Eine eintausendfache Anreicherung von pAb (D1.3) wurde mit einem einzigen Säulendurchgang beobachtet. Durch das Züchten der angereicherten Phagen und deren erneuten Durchgang durch die Säule wurden Anreicherungen bis hinauf zu einer Million beobachtet.
Die Anreicherung wurde auch unter Verwendung rein immunologischer Kriterien gezeigt. Beispielsweise wurden 10² Phagen (bei einem Verhältnis von 1 pAb (D1.3) zu 4 × 10⁶ fdTPs/Bs) zwei Affinitätsselektionsrunden unterzogen und dann 26 Kolonien genommen und über Nacht gezüchtet. Die Phagen wurden dann mittels ELISA (wie Beispiel 6) auf Lysozymbindung untersucht. Fünf Kolonien zeigten Phagen mit Lysozymbindeaktivitäten, siehe Tabelle 1, und es wurde mittel PCR-Screenen (Beispiel 13, bei Verwendung von 30 Zyklen mit 1 Minute bei 92°C, 1 Minute bei 60°C, 1 Minute bei 72°C und mit CDR3PCR1 und oligo 3 (4) als Primer) gezeigt, daß diese für scFv (D1.3) kodieren.
Somit können sehr seltene pAbs aus großen Populationen herausgefischt werden, indem Antigen zur Selektion verwendet wird und dann die Phagen gescreent werden.
In diesem Beispiel wurden die Affinitätschromatographie von pAbs und der Einsatz der Oligonukleotidsonde wie unten beschrieben durchgeführt.
Etwa 10¹² Phagenteilchen in 1 ml PBS wurden auf eine 1 ml Lysozym-Sepharose-Affinitätssäule, die in MPBS vorgewaschen wurde, aufgegeben; die Säule wurde nacheinander mit 10 ml PBS; dann 10 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 7,5; dann 10 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 8,5; dann 5 ml 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl pH 9,5 (mit Triethylamin eingestellt) gewaschen und dann mit 5 ml 10 mM Triethylamin eluiert. Das Eluat wurde mit 0,5 M Natriumphosphatpuffer pH 6,8 neutralisiert und die Phagen zur Analyse ausplattiert. Für eine zweite Affinitätschromatographierunde, wurde das erste Säuleneluat auf etwa 30.000 Kolonien pro Petrischale ausplattiert. Nach dem Wachstum über Nacht, wurden die Kolonien dann in 5 ml 2 × TY-Medium gekratzt, und ein 20 μl Aliquot in 10 ml frischem Medium verdünnt und über Nacht wachsen gelassen. Die Phagen wurden mit PEG, wie oben beschrieben, gefällt, in 1 ml MPBS erneut suspendiert und auf die Säule aufgebracht, gewaschen und wie oben eluiert.
Die synthetisierten Oligonukleotide:
40 pMol des Oligonukleotids VH1FOR (Ward, W. S., et al., (1989) Nature 341, 544–546), der für pAb (D1.3) spezifisch ist, wurde mit 100 μCi α-³²P ATP phosphoryliert, an Nitrozellulosefilter bei 67°C in 6 × Natriumcitratsalzlösungs-(SSC) (Sambrook et al., s.o.)-Puffer 30 Minuten lang hybridisiert (1 pMol/ml) und 30 Minuten lang auf Raumtemperatur abkühlen gelassen, sowie 3 × 1 Minute bei 60°C in 0,1 × SSC gewaschen.
Beispiel 8
Konstruktion von pAb, die anti-Hapten-Aktivität exprimieren
Oxazolon ist ein Hapten, das herkömmlicherweise zur Untersuchung der Details der Immunantwort verwendet wird. Der anti-Oxazolon-Antikörper NQ11 wurde bereits beschrieben (E. Gherardi, R. Pannell, C. Milstein, JI Immunol. Method 126, 61–68). Ein Plasmid, das die VH- und VL-Gene von NQ11 enthält, wurde in eine scFv-Form umgewandelt, indem das BstEII/SacI-Fragment von scFvD1.3 myc (die Nukleotide 432–499 in 5) zwischen die VH- und VL-Gene insertiert wurde, um pscFvNQ11 zu bilden, dessen Sequenz in 13 dargestellt ist. Dieser scFv wurde in die PstI/XhoI-Stelle von FdTPs/Xh kloniert (wie früher beschrieben), um pAb zu bilden. NQ11 hat eine innere PstI-Stelle und daher war es notwendig, eine vollständige Spaltung von pscFvNQ11 mit XhoI zu machen, gefolgt von einer teilweisen Spaltung mit PstI.
Die spezifische Bindung von pAbNQ11 wurde mittels ELISA bestätigt. ELISA-Platten wurden bei 37°C bei einer Proteinkonzentration von 200 μg/ml in 50 mM NaHCO₃ beschichtet. Die Platten wurden entweder mit Hühnereilysozym (HEL), Rinderserumalbumin (BSA) oder mit an Oxazolon konjugiertem (Konjugationsverfahren in Makela O., Kantinen M., Pelkonen J. L. T., Karfalainen K. (1978) J. Exp. Med. 148, 1644) BSA (OX-BSA) beschichtet. Die Vorbereitung der Phagen, die Bindung an ELISA-Platten, das Waschen und die Detektionwaren wie in Beispiel 6 beschrieben.
Die Proben wurden in Doppelversuchen untersucht und die durchschnittliche Absorption nach 10 Minuten ist in 14 dargestellt.
Dieses Ergebnis zeigt, daß der pAbNQ11 sich an das richtige Antigen bindet. 14 zeigt auch, daß pAbD1.3 und pAbNQ11 sich nur an jenes Antigen binden, gegen das der ursprüngliche Antikörper gerichtet war.
Beispiel 9
Anreicherung von pAbD1.3 aus Gemischen anderer pAbs durch Affinitätsreinigung
3 × 10¹⁰ Phagen in 10 ml PBSM in den in Tabelle 2 gezeigten Verhältnissen von pAbD1.3 zu pAbNQ11 wurden über eine 1 ml Sepharosesäule geschickt. Das Waschen, die Elution und die anderen Verfahren waren wie in Beispiel 8 beschrieben, wenn nicht anders erwähnt. Die Eluate aus den Säulen wurden zur Infektion von TG1-Zellen verwendet, die dann ausplattiert wurden. Die Kolonien wurden mit einer Sonde untersucht, die zwischen pAbD1.3 und pAbNQ11 unterscheidet. Die Sequenz dieses Oligonukleotids (D1.3CDR3A) ist: 5'-GTA GTC AAG CCT ATA ATC TCT CTC-3'. Tabelle 2 zeigt die Daten aus diesem Experiment. Eine Anreicherung von zumindest 1000fach wurde in einer Runde und einer Anreicherung von über 1 Million-fach in zwei Reinigungsrunden erreicht. Dies gleicht dem in Beispiel 7 beschriebenen Ergebnis.
Beispiel 10
Insertion von Bindemolekülen in alternative Stellen im Phagen
Die Verfügbarkeit einer alternativen Stelle zur Insertion von Bindemolekülen im Phagen würde die Möglichkeit eröffnen, leichter mehr als ein Bindemolekül, z.B. ein Antikörperfragment, in einem einzigen pAb exprimieren zu können. Dies kann verwendet werden, um einzelne oder vielfache Bindespezifitäten zu bilden. Das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bindeaktivitäten auf einem einzelnen Molekül erhöht die Nützlichkeit und Spezifität dieses Moleküls beträchtlich. Dieses kann bei der Bindung von Viren mit einer hohen Mutationsrate, wie z.B. der menschliche Immunschwäche-Virus (human immunodeficiency virus, HIV), nützlich sein. Zusätzlich kann es verwendet werden, um Antigene in unmittelbare Nähe (z.B. Arzneimitteldesign ("drug targetting") oder Zellenfusion) zu bringen oder es kann als "molekulare Klammer" ("molecular clamp") in chemischen, immunologischen und enzymatischen Verfahren wirken.
Der Vektor fd-tet und die hierin beschriebenen Derivate haben eine einzelne BamHI-Stelle in Gen III. Das wurde bereits zur Expression von Peptidfragmenten auf der Oberfläche von filamentösen Bakteriophagen verwendet (Smith GP. (1985) Science 228, S. 1315–1317 und de la Cruz et al., (1988) J. Biol. Chem. 263, S. 4318–4322). Dies bietet eine mögliche alternative Stelle zur Insertion von Antikörperfragmenten.
DNA-Fragmente, die für scFv's aus D1.3 oder NQ11 kodieren, wurden durch PCR unter Verwendung der unten gezeigten Primer hergestellt. Die Primer waren so gestaltet, daß sie ein Fragment mit BamHI-Stellen in der Nähe der beiden Enden aufweisen, um das Klonieren in die BamHI-Stelle von Gen III zu ermöglichen (siehe 16(1)). Die verwendeten Oligonukleotide stellen ebenfalls sicher, daß dem resultierenden PCR-Produkt PstI- und XhoI-Restriktionsstellen fehlen, die normalerweise verwendet werden, um die scFv's zu manipulieren (siehe 16(1)). Dies erleichtert die nachfolgende Manipulation eines zweiten Antikörperfragments in der herkömmlichen Weise am N-Terminus von Gen III. Die verwendeten Oligonukleotide waren:
Herstellung des Vektor- und PCR-Inserts
Die PCR-Reaktion wurde in einer 80 μl-Reaktion wie in Beispiel 11 beschrieben unter Verwendung von 1 ng/μl Templat und 0,25 U/μl Taq-Polymerase und einer Zyklusabfolge von: 94°C 1 Minute lang, 60°C 1 Minute lang und 70°C 2 Minuten lang über 30 Zyklen durchgeführt. Das Templat war entweder pscFvNQ11 (Beispiel 8) oder scFvD1.3 myc (Beispiel 2). Die Reaktionsprodukte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt, in Wasser gelöst und mit BamHI gemäß den Angaben des Herstellers gespalten. Die Spaltlösung wurde erneut mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt und in Wasser gelöst.
Der Vektor fdTPs/Xh wurde mit BamHI gespalten und mit Kalbsdarmphosphatase behandelt und wie in Beispiel 2 gereinigt. Die Ligationen wurden mit einer Vektorkonzentration von etwa 6 ng/μl und einer PCR-Insertkonzentration von etwa 3 ng/μl angesetzt. Diese wurden 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur vor der Transformation in kompetente Zellen und dem Ausplattieren auf TY-tet-Platten ligiert. Die resultierenden Kolonien wurden wie in Beispiel 7 beschrieben sondiert. Aus einer Anzahl von Kolonien wurde die DNA isoliert und die korrekte Ausrichtung und Insertgröße durch Restriktionsspaltung mit HindIII alleine oder in Kombination mit BamHI bestätigt. (Eine HindIII-Stelle wird durch einen der Primer beigetragen und die andere durch den Vektor).
Zwei Klone, die ein D1.3-Insert enthalten (fdTBam1 und fdTBam2) und einer der ein NQ11-Insert enthält (NQ11Bam1) wurden gezüchtet und die Phagen wie bereits früher beschrieben isoliert. ELISA's wurden wie in Beispiel 6 durchgeführt. Es wurde für keinen dieser Klone ein spezifisches Signal gefunden, das vermuten läßt, daß die natürliche BamHI-Stelle keine geeignete Stelle zur Insertion eines funktionellen Antikörpers ist (die Ergebnisse sind nicht gezeigt).
Es kann möglich sein, in alternative Stellen zu klonieren, um die Bindeaktivität beizubehalten. Die in Gen III vorhandenen Peptidwiederholungen können solch eine Stel le bieten (16 Block A und B). Dies kann durch Insertion einer BamHI-Stelle und Verwendung des oben beschriebenen PCR-Produktes erfolgen. Um dies zu erleichtern, wurde die natürliche BamHI-Stelle durch Mutagenese mit dem unten gezeigten Oligonukleotid G3mutδBam (unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham International)) entfernt:
Der unterstrichene Rest ersetzt einen A-Rest, wodurch die BamHI-Stelle entfernt wurde. Die DNA wurde aus einer Anzahl von Klonen isoliert und einige Mutanten ohne BamHI-Stellen durch Restriktionsspaltung identifiziert.
Das Oligonukleotid G3 Bamlink wurde konstruiert, um eine BamHI-Stelle an einer Anzahl von möglichen Stellen innerhalb der Peptidlinkerstellen A und B einzubringen, siehe 16(2). Die Sequenz des Linkers ist:
Seine Beziehung zu den Peptidwiederholungen in Gen III ist in 16 gezeigt.
Beispiel 11
PCR-Assemblierung der VH- und VLK-κ-Repertoires aus Mäusen zur Phagenpräsentation
Das Prinzip ist in 17 veranschaulicht. Die Details werden in den Abschnitten A bis F geboten, aber die grobe Richtlinie wird zuerst besprochen.

1. cDNA wird aus Milz-RNA aus einer geeigneten Maus hergestellt und die VH- und VLK-Repertoires einzeln amplifiziert. Getrennt werden zu VH1FOR-2 (Domäne 1) und VLK1BACK (Domäne 2) umgekehrte und komplementäre Primer verwendet, um eine existierende scFv enthaltende DNA durch PCR zu amplifizieren. (Der Ausdruck FOR bezieht sich z.B. auf einen Primer zur Amplifikation von Sequenzen auf dem sense-Strang, wodurch sich anti-sense-Kodier sequenzen ergeben. Der Ausdruck BACK bezieht sich z.B. auf einen Primer zur Amplifikation von Sequenzen auf dem anti-sense-Strang, wodurch sich sense-Kodiersequenzen ergeben.). Dies ergibt ein "Linker"-Molekül, das für den Linker mit der Aminosäuresequenz (Ein-Buchstaben-Code) (GGGGS)₃, der mit den zwei primären (VH und VLK) PCR-Produkten überlappt, kodiert.
2. Die getrennt amplifizierten VH-, VLK- und Linkersequenzen müssen jetzt in ein kontinuierliches DNA-Molekül durch die Verwendung einer "Assemblierungs"-("assembly")-PCR angeordnet werden. In der zweiten "Assemblierungs"-PCR werden die VH-, VLK- und Linkerbanden kombiniert und aufgrund des oben bezüglich Überlappungen erwähnten assembliert. Dies ergibt ein assembliertes DNA-Fragment, das die Expression der VH- und einer VLK-Domäne lenkt. Die spezifische VH/VLK-Kombination wird statistisch aus den oben erwähnten getrennten VH- und VLK-Repertoires erhalten.

Die Assemblierungs-PCR wird in zwei Stufen durchgeführt. Zuerst 7 Zyklenrunden nur mit den in der PCP vorhandenen Banden, gefolgt von weiteren 20 Runden in Gegenwart der flankierenden Primer VH1BACK (bezieht sich auf Domäne 1 von VH) und VLKFOR. Die Oligonukleotidsequenzen für diese Oligonukleotidprimer werden im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Dieses Zweistufen-Verfahren vermeidet das mögliche Problem der bevorzugten Amplifikation der ersten zu assemblierenden Kombinationen.
Zur Klonierung in das Phagensystem müssen die assemblierten Repertoires mit den geeigneten Restriktionsstellen "beendet" ("tagged") werden. Im weiter unten dargestellten Beispiel wird dies durch das Vorsehen einer ApaLI-Restriktionsstelle am VH-Ende des kontinuierlichen DNA-Moleküls und einer NotI-Stelle am VLK-Ende des Moleküls veranschaulicht. Dies wird durch eine dritte Stufe der PCR unter Verwendung von "beendeten" Primern durchgeführt. Die Nukleotidsequenzen für diese Oligonukleotidprimer werden unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" angeführt. Es gibt jedoch 4 mögliche κ- Sequenzen der leichten Kette (wohingegen eine einzige Konsensussequenz der schweren Kette verwendet werden kann). Daher werden 4 Oligonukleotidsequenzen für VLK vorgesehen.
In dieser dritten Stufe der PCR, wurden Sets von Primern, die eine neue Restriktionsstelle bilden und weitere 10 Nukleotide auf der 5'-Seite der Restriktionsstelle aufweisen, verwendet. Lange Enden bzw. Anhängsel ("tags") ergeben ein besseres Schneidergebnis, wobei Überstände mit 15–20 Nukleotiden verwendet werden können.
Vorschriften für äußerst sauberes Arbeiten müssen zu jeder Zeit während der PCR verwendet werden, um Kontamination zu vermeiden. Es müssen immer Blindvergleiche ohne DNA eingeschlossen werden, um Kontaminationen festzustellen. Die Gelboxen müssen von Purin befreit werden. Ein dafür vorgesehenes Geneclean Set (B10 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA) kann gemäß den Angaben der Hersteller verwendet werden, um DNA aus einem Agarosegel zu extrahieren. Die Perlen, Nal und die NEW-Waschung sollten in aliquoten Anteilen eingesetzt werden.
Alle Enzyme wurden von CP Laboratories, P.O. Box 22, Bishop's Stortford, Herts CM20 3DH erhalten und die von den Herstellern empfohlenen und gelieferten Puffer wurden, wenn nicht anders erwähnt, verwendet.
A. RNA-Isolierung
RNA kann durch viele den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannte Arbeitsvorschriften isoliert werden. Beispielsweise ergibt die folgende Arbeitsvorschrift (Triton X-100-Lyse, Phenol/SDS-RNase-Inaktivierung) hervorragende Ergebnisse mit Milz- und Hybridomzellen (die Zugabe von VRC (veronal ribosyl complex, Veronal-Ribosom-Komplex) als ein RNase-Hemmer ist für Milzzellen erforderlich). Guanidin/Isothiocyanat/CsCl-Arbeitsvorschriften (wobei die gesamte zelluläre RNA erhalten wird) geben ebenfalls gute Ergebnisse, sind aber zeitaufwendiger.

1. 1–5 × 107 Zellen werden durch 10-minütige Zentrifugation in einer Tischzentrifuge bei 800 g und 4°C geerntet. Diese werden erneut in 50 ml kaltem PBS-Puffer suspendiert. Die Zellen werden wieder bei 800 g und 4°C 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand verworfen.
2. Auf Eis wird 1 ml eiskalter Lysepuffer dem Pellet zugegeben und mit einer 1 ml-Gilsonpipette durch sanftes Auf- und Abpipettieren erneut suspendiert. Dies wird 1 Minute auf Eis stehen gelassen.
3. Nach der Lyse werden die Zellenreste durch Zentrifugation bei 1300 Upm fünf Minuten lang in einer Mikrozentrifuge bei 4°C in vorgekühlten Röhrchen entfernt.
4. 0,5 ml Überstand werden jeweils in zwei Eppendorfgefäße, die 60 μl 10% (Gew./Vol.) SDS und 250 μl Phenol (zuvor mit 100 mM Tris-HCl pH 8,0 äquilibriert) enthalten, überführt. Es wird 2 Minuten stark gevortext, dann fünf Minuten bei Raumtemperatur in einer Mikrozentrifuge (13.000 Upm) zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wird in ein frisches Röhrchen überführt.
5. Die obere wäßrige Phase wird erneut fünfmal mit 0,5 ml Phenol extrahiert.
6. Mit 1/10 des Volumens 3 M Natriumacetat und 2,5 Volumina Ethanol wird über Nacht bei 20°C oder 30 Minuten mit Trockeneis/Isopropanol gefällt.
7. Das RNA-Pellet wird gewaschen und in 50 μl erneut suspendiert, um die Konzentration durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm zu prüfen, und 2 μg werden auf einem Agarosegel geprüft. 40 μg RNA wurden von aus einer Maus stammenden Milzzellen erhalten.

Der Lysepuffer [10 mM Tris-HC. pH 7,4, 1 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 10 mM VRC (New England Biolabs), 0,5% (Gew./Vol.) Triton X-100] wird frisch hergestellt.
B. cDNA-Isolierung
cDNA kann durch viele den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannte Arbeitsvorschriften isoliert werden. Beispielsweise kann die folgende Arbeitsvorschrift verwendet werden:

1. Es wird das folgende Reverse-Transkriptions-Gemisch hergestellt:
NB
i.) DEPC ist Diethylpyrocarbonat, dessen Funktion die Inaktivierung aller Enzyme ist, die DNA oder RNA abbauen könnten
ii.) dNTP ist Desoxynukleotidtriphosphat
iii.) DTT ist Dithiothreitol, dessen Funktion die eines Antioxydans ist, um eine für die Emzymfunktion erforderliche reduzierende Umgebung zu schaffen.
iv.) RNasin ist ein Ribonukleaseinhibitor, der von Promega Corporation, 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wisconsin, USA, erhalten wurde
2. Es wurden 10 μg RNA auf 40 μl Endvolumen mit mit DEPC behandeltem Wasser verdünnt. Dann wurde 3 Minuten lang bei 65°C wärmebehandelt und eine Minute auf Eis gehalten (um die Sekundärstruktur zu entfernen).
3. Der RNA wurde das Reverse-Transkription-Gemisch (58 μl) sowie 4 μl klonierte Reverse Transkriptase "Super RT" (Anglian Biotech Ltc., Whitehall House, Whitehall Road, Colchester, Essex) zugegeben und bei 42°C eine Stunde lang inkubiert.
4. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Minuten gekocht, eine Minute auf Eis gekühlt und dann in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um die Zellreste als Pellet zu erhalten. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen überführt.

10 × "first strand"-Puffer ist [1,4 M KCl, 0,5 M Tris-HCl pH 8,1 bei 42°C 80 mM MgCl₂].
Die Primer annellieren an das 3'-Ende. Beispiele für Primer für leichte Ketten vom κ-Typ sind MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5FONX (unter "Primersequenzen" unten angegeben) und Beispiele für Primer für die schweren Ketten sind MIGG1, 2 (CTG GAC AGG GAT CCA GAG TTC CA) und MIGG3 (CTG GAC AGG GCT CCA TAG TTC CA), die an CH1 annelieren.
Alternativ dazu können beliebige Primer, die sich an das 3'-Ende der variablen Regionen VH, VLK, VL, oder an die konstanten Regionen CH1, CK, oder CL binden, verwendet werden.
C. Primäre PCRs.
Für jede PCR und jeden Blindvergleich, wurden die folgenden Reaktionen angesetzt (z.B. eine Reaktion für jede der vier VLK- und der vier VH-PCRs). In der Folge wurde die "Vent" DNA Polymerase, die von C.P.Laboratories Ltd. (New England Biolabs, Adresse weiter oben) verkauft wird, verwendet. Die Puffer sind die durch C.P.Laboratories bereitgestellten.
Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Für VH ist der FOR-Primer VH1FOR-2 und der BACK-Primer VH1BACK. Für VLK sind die FOR-Primer MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5FONX (für die 4 jeweiligen leichten Ketten vom κ-Typ) und der BACK-Primer ist VK1BACK. Es ist nur ein BACK-Primer für die leichte Kette vom κ-Typ erforderlich, da die Bindung an eine Nukleotidsequenz erfolgt, die den 4 leichten Ketten vom κ-Typ ähnlich ist.
Dieses Gemisch wird 5 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt. Es werden 2,5 μl cDNA-Präparat (aus B; weiter oben), und 2 Tropfen Paraffinöl (Sigma Chemicals, Poole, Dorset, UK) zugegeben. Dann wird dies auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock z.B. einen PHC-2, der von Techne Ltd., Duxford, UK, hergestellt wurde, gegeben, wobei dieser bereits auf 94°C eingestellt ist. Es wird 1 μl "Vent"-DNA-Polymerase unter das Paraffin zugegeben: Dann wird mit 25 Zyklen mit 94°C 1 Minute, 72°C 2 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60°C erfolgt 5 Minuten lang.
Dies wird auf einem 2% lmp- ("low melting point", niedrigschmelzenden/TAE(Tris-Acetat EDTA)-Gel gereinigt und die DNA in 20 μl Wasser pro ursprünglicher PCR unter Verwendung des Geneclean Sets (siehe oben) gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert.
D. Herstellung der Linker
In größerer Menge ansetzen (z.B. 10fach).
Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Der FOR-Primer ist LINKFOR und der BACK-Primer BACKFOR. Es wird mit Paraffinöl überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, siehe oben, mit 94°C gegeben. Dann wird mit 25 Zyklen mit 94°C 1 Minute, 65°C 1 Minute, 72°C 2 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60°C erfolgt 5 Minuten lang.
Dies wird auf einem 2% lmp/TAE-Gel gereinigt (unter Verwendung eines Ladefarbstoffes ohne Bromphenolblau, da ein 93 bp-Fragment erwünscht ist) und mit SPIN-X die Säule (Costar Limited, 205 Broadway, Cambridge, Ma., USA) eluiert und gefällt. Pro PCR-Reaktion wird dies in 5 μl H₂O aufgenommen.
E. Assemblierungs-PCR
Ein Viertel jedes PCR-Reaktionsprodukts (5 μl) wird für jede Assemblierung verwendet. Das Gesamtvolumen beträgt 25 μl.
Für jeder der vier VLK-Primer wird folgendes angesetzt:
Dieses Gemisch wird 5 Minuten lang mit UV-Licht bestrahlt. Dann werden jeweils 5 μl der VH- und VLK-Bande aus der primären PCR und 1,5 μl Linker, der aus den präparativen Gelen isoliert und wie oben in C und D beschrieben mittels des Geneclean Sets extrahiert wurde, zugegeben. Dies wird mit Paraffin überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, der auf 94°C vorgeheizt ist, gegeben. Es wird mit 7 Zyklen mit 94°C 2 Minuten, 72°C 4 Minuten amplifiziert. Dann wird die Temperatur wieder auf 94°C eingestellt.
Es werden jeweils 1,5 μl VH1BACK und der geeignete VLKFOR-Primer MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX oder MJK5FONX (10 pMol/μl) bei 94°C zugegeben. Der Primer sollte wie oben mit UV behandelt sein. Es wird mit 20 Zyklen mit 94°C 1,5 Minuten, 72°C 2,5 Minuten amplifiziert. Die Nachbehandlung bei 60°C erfolgt 5 Minuten lang. Dies wird auf einem 2% lmp/TAE-Gel gereinigt und die DNA in 20 μl H₂O pro Assemblierungs-PCR unter Verwendung eines Geneclean Sets (siehe oben) gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert.
F. Addition von Restriktionsstellen
Für jede Assemblierung und jeden Vergleich wird folgendes angesetzt:
Die FOR- und BACK-Primer werden weiter unten im Abschnitt mit dem Titel "Primersequenzen" gezeigt. Der FOR-Primer ist ein beliebiger aus JK1NOT10, JK2NOT10, JK4NOT10 oder JK5NOT10 (für die jeweiligen vier leichten Ketten vom κ-Typ) um eine Not1-Restriktionsstelle am VLK-Ende anzubringen. Der BACK-Primer ist HBKAPA10, um eine ApaL1-Restriktionsstelle am VH-Ende anzubringen.
Dies wird mit Paraffin überschichtet und auf einen für Zyklen geeigneten Heizblock, der auf 94°C vorgeheizt ist, gegeben. Dann werden 0,5 μl Cetus-Taq-DNA-Polymerase (Cetus/Perkin-Elmer, Beaconsfield, Bucks, UK) unter das Paraffin zugegeben. Die Amplifikation wird mit 11–15 Zyklusrunden (von der Effizienz abhängig) bei 94°C 1 Minute, 55°C 1 Minute, 72°C 2 Minuten durchgeführt. Die 5-minütige Nachbehandlung erfolgte bei 60°C.
10 × Taq-Puffer ist [0,1 M Tris-HCl pH 8,3 bei 25°C, 0,5 M KCl, 15 mM MgCl₂, 1 mg/ml Gelatine].
G. Aufarbeitung
Es wird einmal mit Chloroform/IAA (Isoamylalkohol), einmal mit Phenol, einmal mit Chloroform/IAA gereinigt und alles nachextrahiert, um minimale Verluste zu gewährleisten. Es wird mit 70% Ethanol gefällt und zweimal gewaschen. Dies wird in 70 μl H₂O gelöst.
Über Nacht wird mit NotI bei 37°C gespalten:
Die DNA (verbunden Sequenz) oben bezieht sich auf die assemblierte DNA-Sequenz, die in 5'-3'-Richtung folgendes umfaßt:
ApaL1-Restriktionsstelle
VH-Sequenz
Linker-Sequenz
VLK-Sequenz
Not1-Restriktionsstelle
Die VLK-Sequenz kann eine der vier möglichen Kettensequenzen vom κ-Typ sein.
Die Enzyme Not 1 (oben), ApaL1 (unten) und die Puffer NEB Not 1, NEB BSA laben) und der NEB Puffer 4 (unten) können von den C.P.Laboratories, New England Biolabs, s.o., erhalten werden.
Es wird erneut gefällt, und in 80 μl H₂O aufgenommen. Dazu werden 10 μl NEB Puffer 4 und 10 μl ApaL 1 gegeben.
Das Enzym ApaL 1 wird in Aliquoten über den Tag verteilt zugegeben, da es eine kurze Halbwertszeit bei 37°C hat.
Dies wird auf einem 2% lmp/TAE-Gel gereinigt und die DNA unter Verwendung eines Geneclean Sets gemäß den Angaben der Hersteller extrahiert. Wenn notwendig, wird erneut gespalten.
H. DNA-Endprodukt
Das DNA-Endprodukt es ein etwa 700 bp umfassendes Fragment mit ApaL1- und Not1-kompatiblen Enden, das aus durch einen Linker verbundenen, statistisch angeordneten Sequenzen der schweren und der leichten Kette besteht. Ein für diese Art typisches Molekül ist das in fdsdFvD1.3 inkorporierte scFvD1.3-Molekül, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Diese Moleküle können dann in geeignete, aus fd gewonnene Vektoren, z.B. fdCAT2 (Beispiel 5), unter Verwendung von Standardverfahren ligiert werden.
Primersequenzen
Primäre PCR-Oligonukleotide (die Restriktionsstellen sind unterstrichen):
Beispiel 12
Konstruktion eines Phagemids der Gen III als Fusion mit der Kodierseguenz für ein Bindemolekül enthält
Es wäre nützlich, die Transfektionseffizienz des Phagen-bindenden Molekülsystem zu verbessern und auch über die Möglichkeit, verschiedene Anzahlen und Spezifitäten der Bindemoleküle auf der Oberfläche des selben Bakteriophagen zu präsentieren, zu verfügen. Die Anmelder haben ein Verfahren entwickelt, das beide Ziele erreicht.
Der Ansatz kommt aus dem Phagemidsystem, das auf pUC119 [Vieira, J. and Messing, J. (1987) Methods Enzymol. 153:3] basiert. Kurz gesagt, wurde das Gen III aus fd-CAT2 (Beispiel 5) und die Gen III-scFv-Fusion aus fd-CAT2scFvD1.3 (Beispiel 2) stromabwärts vom lac-Promotor in getrennte Proben von pUC119 kloniert, damit das insertierte Gen III und die Gen III-Fusion durch den M13M07-Helferphagen (Vieira, J. and Messing, J., s.o.), der gemäß Sambrook et al., 1989, s.o., hergestellt wurde, ergänzt werden können. Es wäre zu erwarten, daß die Mehrheit der ergänzten Phagen ein vom pUC119-Plasmid stammendes Genom enthält, das die Bindemolekül-Gen III-Fusion enthält und verschiedene Anzahlen des Bindemoleküls auf der Oberfläche bis hinauf zum normalen Maximum von 3–5 Molekülen von Gen III auf der Oberfläche des Phagen vom Wildtyp exprimieren sollte. Das System wurde unten unter Verwendung eines Antikörpers als Bindemolekül beispielhaft ausgeführt.
Ein fdCAT2, der die Einzelketten-Fv-Form des D1.3 anti-Lysozym-Antikörpers enthält, wurde durch Spaltung von fdTscFvD1.3 (Beispiel 2) mit Pst1 und Xho1, Reinigung des das scFv-Fragment enthaltenden Fragments und Ligieren desselben in einen mit Pst1 und Xho1 gespaltenen fdCAT2 gebildet. Der geeignete Klon, mit der Bezeichnung fdCAT2scFvD1.3, wurde nach dem Ausplattieren auf 2 × TY-Tetracyclin (15 μg/ml) ausgewählt und durch Restriktionsenzym- und Sequenzanalyse bestätigt.
Gen III aus fd-CAT2 (Beispiel 5) und die Gen III-Fusion aus fd-CAT2scFvD1.3 wurde mit den unten gezeigten Primern A und B PCR-amplifiziert.
Primer A anneliert an das 5'-Ende des Gen III, das die Ribosomenbindestelle umfaßt und beinhaltet eine HindIII-Stelle. Primer B anneliert an das 3'-Ende des Gen III am C-Terminus und beinhaltet zwei UAA-Stopcodons und eine EcoRI-Stelle. 100 ng fd-CAT2 und fd-CAT2scFvD1.3 wurden als Template zur PCR-Amplifikation in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl, wie in Beispiel 7 beschrieben, verwendet, außer daß 20 Amplifikationszyklen durchgeführt wurden: 94°C 1 Minute, 50°C 1 Minute, 72°C 3 Minuten. Dies ergab die Amplifikation des erwarteten 1,2 Kb-Fragments aus fd-CAT2 und ein 1,8 Kb-Fragment aus fd-CAT2scFvD1.3.
Die PCR-Fragmente wurden mit EcoRI und HindIII gespalten, auf einem Gel gereinigt und in eine mit EcoRI und HindIII geschnittene und dephosphorylierte pUC119- DNA ligiert und unter Verwendung von Standardverfahren (Sambrook et al., s.o.) in E.coli TG1 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf SOB-Agar (Sambrook et al., 1989, s.o.), der 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, ausplattiert. Die resultierenden Klone wurden mit pCAT-3 (aus fd-CAT2 erhalten) und pCAT-3scFvD1.3 (aus fd-CAT2scFvD1.3 erhalten) bezeichnet.
Beispiel 13
Ergänzung ("rescue") der anti-Lysozym-Antikörperspezifität aus pCAT-3scFvD1.3 durch M13K07
Einzelne pCAT-3- und pCAT-3scFvD1.3-Kolonien wurden in 1,5 ml 2TY, das 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, überführt und 6 Stunden bei 30°C gezüchtet. 30 μl dieser stationären Zellen wurden zu 6 ml 2TY, das 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, in 50 ml Polypropylenröhrchen (Falcon, Becton Dickinson Labware, 1950 Williams Drive, Oxnard, Ca., USA) zugegeben und 1,5 Stunden bei 30°C in einem New Brunswick Kreisschüttler (New Brunswick Scientific Ltd., Edison House 163 Dixons Hill road, North Mimms, Hatfield, UK) bei 380 Upm gechüttelt. Die Zellen wurden durch 25-minütige Zentrifugation bei 5.000 g zu einem Pellet geformt und die Röhrchen auf Löschpapier getrocknet. Die Zellpellets wurden dann in 6 ml 2TY, das 1,25 × 10⁹ p.f.u. (Plaque forming units, Plaque-bildende Einheiten)/ml zugegebene M13K07-Bakteriophagen enthält, suspendiert. Das Gemisch wurde 5 Minuten auf Eis gelassen und dann 45 Minuten lang bei 450 Upm und 35°C wachsen gelassen. Es wurde dann ein Cocktail zugegeben, der 4 μl 100 μg/ml Ampicillin, 0,5 μl 0,1 M IPTG und 50 μl 10 mg/ml Kanamycin enthält, und die Kulturen über Nacht bei 35°C und 450 Upm wachsen gelassen.
Am darauffolgenden Tag wurden die Kulturen zentrifugiert und die Phagenpartikel wie in Beispiel 6 mit PEG gefällt. Die Phagenpellets wurden in 100 μl TE (Tris-EDTA, siehe Beispiel 6) erneut suspendiert und die Phagen auf E.coli TG1 titriert. Aliquote der infizierten Zellen wurden auf 2TY, das entweder 100 μg/ml Ampicillin zur Selek tion nach pUC119-Phagenpartikel oder 50 μg/ml Kamamycin zur Selektion nach M13K07-Helferphagen enthält, ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert und die Antibiotika-resistenten Kolonien gezählt:
Dies zeigt daß die amp^R-Phagenpartikel infektiös sind und in der "ergänzten" Phagenpopulation in einem 100fachen Überschuss gegenüber dem kan^R-M13K07-Helferphagen vorhanden sind.
Die Phagen wurden mittels ELISA wie in Beispiel 6 beschrieben auf anti-Lysozym-Aktivität untersucht, wobei die folgenden Modifikationen vorgenommen wurden:

1) Die ELISA-Platten wurden 3 Stunden lang mit 2% Marvel/PBS geblockt.
2) 50 μl Phagen, 400 μl 1 × PBS und 50 μl Marvel wurden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur durch dauerndes Umdrehen gemischt, bevor jedem Napf 150 μl zugegeben wurden.
3) Den Phagen wurde bei Raumtemperatur ein Zeitraum von zwei Stunden zur Bindung gelassen.
4) Alle Waschungen nach der Phagenbindung waren: 2 schnelle Spülungen PBS/0,5% Tween 20 3 × 2 Minuten Waschung PBS/0,5% Tween 20 2 schnelle Spülungen PBS ohne Tensid 3 × 2 Minuten Waschung PBS ohne Tensid

Das Ergebnis dieses ELISA ist in 22 gezeigt und demonstriert, daß die Antikörperspezifität tatsächlich effizient "ergänzt" werden kann.
Es scheint eine Grundregel in der bakteriellen Genetik zu sein, daß, wenn mutante Proteine und Proteine vom Wildtyp in der selben Zelle co-exprimiert werden, das Protein vom Wildtyp bevorzugt verwendet wird. Dies ist analog zur obigen Situation, worin die mutanten Proteine (d.h. Antikörperfusion) und die Gen III-Proteine vom Wildtyp (aus M13K07) in Konkurrenz um die Assemblierung als Teil des pUC119-Phagemidpartikels stehen. Man steht daher der Tatsache gegenüber, daß die Mehrheit der resultierenden pUC119-Phagemidteilchen weniger Gen III-Antikörper-Fusionsmoleküle auf ihrer Oberfläche aufweisen, als dies bei reinen Phagensystem, wie z.B. in Beispiel 2 beschrieben, der Fall ist. Solche Phagemidantikörper binden daher wahrscheinlich Antigen mit einer niedrigeren Avidität als fd-Phagenantikörper mit drei oder mehr Kopien der Antikörperfusion auf deren Oberfläche (es gibt in dem beschriebenen System, z.B. in Beispiel 2, kein Gen III vom Wildtyp), und sie bieten einen Weg zur Herstellung von Phagenteilchen mit verschiedenen Anzahlen desselben Bindemoleküls (und daher verschiedenen Aviditäten für Ligand/Antigen) oder – durch den Einsatz von Helferphagen wie z.B. M13K07, um Zellen, die zwei oder mehr Gen III-Antikörper-Fusionen exprimieren, zu "ergänzen" – mit mehreren verschiedenen Bindespezifitäten auf deren Oberfläche.
Es ist auch möglich, Helferphagen zu erhalten, die in deren Genomen für kein funktionelles Gen III kodieren (z.B. durch die Deletion der Gen III-Sequenz oder eines Abschnittes davon oder durch den Einbau einer "amber"-Mutation innerhalb des Gens). Dies defekten Phagen wachsen nur auf geeigneten Zellen (z.B. solche, die ein funktionales Gen III in trans bieten, oder ein "amber"-Suppressor-Gen enthalten), aber wenn diese verwendet werden, um Phagenantikörper zu ergänzen, bauen diese nur die vom Phagemid kodierte Gen III-Antikörperfusion in die freigesetzten Phagenteilchen ein.
Beispiel 14
Transformationseffizienz der pCAT-3- und pCAT-3scFvD1.3-Phagemide
Die DNA's der Plasmide pUC19, pCAT-3 und pCAT-3scFvD1.3 sowie die DNA des Phagen fdCAT2 wurden isoliert und zur Transformation von E.coli TG1 verwendet. Die pCAT-3- und pCAT-3scFvD1.3-Transformationen wurden auf SOB-Agar, der 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose enthält, ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Die fdCAT-2-Transformationen wurden auf 15 μg/ml enthaltendem TY-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Transformationseffizienzen sind als Kolonien pro μg eingebrachter DNA angegeben.
Wie erwartet ist die Transformation des Phagemidvektors etwa 100fach effizienter als der ursprüngliche fdCAT-2-Vektor. Weiters beeinträchtigt die Gegenwart eines scFv-Antikörperfragments die Effizienz nicht. Diese Verbesserung der Transformationseffizienz ist bei der Bildung von Phagenantikörperbibliotheken, die große Repertoires an verschiedenen Bindespezifitäten aufweisen, von praktischer Nützlichkeit.
Beispiel 15
PCR-Assemblierung einer Einzelketten-Fv-Bibliothek aus einer immunisierten Maus
Um die Nützlichkeit des Phagen zur Selektion von Antikörpern aus Repertoires zu zeigen, ist es zuerst notwendig, eine vielfältige, repräsentative Bibliothek des Anti körperrepertoires eines Tieres herstellen und dieses Repertoire auf der Oberfläche des Bakteriophagen fd präsentieren zu können.
Zytoplasmische RNA wurde wie in Beispiel 11 aus den vereinten Milzorganen von fünf Balb/c-Mäusen, die 8 Wochen nach der primären Immunisierung mit 2-Phenyl-5-oxazolon (phOX), das an Hühnerserumalbumin gekuppelt ist, aufgefrischt wurden, isoliert. Die cDNA-Herstellung und PCR-Assemblierung der κ-Repertoires der VHs und VLs aus Mäusen zur Phagenpräsentation war wie in Beispiel 11. Die so erhaltenen Moleküle wurden in fdCAT2 ligiert.
Der Vektor fdCAT2 wurde gründlich mit Not1 und ApaL1 gespalten; durch Elektroelution gereinigt (Sambrook et al., 1989, s.o.) und 1 μg (5 μg für die hierarchischen Bibliotheken, siehe Beispiel 1) an 0,5 μg der assemblierten scFv-Gene in 1 ml mit 8.000 Units T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 16°C durchgeführt. Das gereinigte Ligationsgemisch wurde in 6 Aliquoten in MC1061-Zellen (W. J. Dower, J. F. Miller & C. W. Ragsdale, Nucl. Acids Res. 16, 6127–6145, 1988) elektroporiert und auf NZY-Medium (Sambrook et al., 1989, s.o.) mit 15 μg/ml in 243 × 243 mm Platten (Nunc) ausplattiert: 90–95% der Klone enthielten scFv-Gene mittels PCR-Screening.
Rekombinante Kolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der Primer VH1BACK und MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX und MJK5FONX (siehe Beispiel 11) gescreent, gefolgt von einer Spaltung mit dem häufig schneidenden Enzym BstN1 (New England Biolabs, gemäß dem Herstellerangaben verwendet). Die Bibliothek der 2 × 10⁵ Klone schien vielfältig, wie dies durch die Vielfalt der Spaltmuster, die in 23 zu sehen sind, zu beurteilen ist, und das Sequenzieren zeigte das Vorhandensein der meisten VH-Gruppen (R. Dildrop, Immunol. Today, 5, 85–86, 1984) und VK-Untergruppen (Kabat. E. A. et al., s.o.)(keine Daten angegeben). Keiner der 568 untersuchten Klone band sich an phOx, wie durch einen ELISA wie in Beispiel 8 nachgewiesen wurde.
Somit ist die Fähigkeit, Antikörper auszuwählen, die durch die Verwendung von Phagenantikörpern (wie in Beispiel 16) geboten wird, notwendig, um leicht Antikörper mit Antigenbindeaktivität aus statistisch kombinierten VH- und VL-Domänen zu isolieren. Sehr aufwendiges Screenen wäre notwendig, um Antigenbindefragmente zu isolieren, wenn der statistische kombinatorische Ansatz von Huse et al., 1989 (s.o.) verwendet würde.
Beispiel 16
Selektion von Antikörpern, die für 2-Phenyl-5-oxazolon spezifisch sind aus einem Repertoire einer immunisierten Maus
Die in Beispiel 15 hergestellte Bibliothek wurde verwendet, um diese Fähigkeit des Phagensystems, Antikörper auf der Basis ihrer Antikörperspezifität auzuwählen, zu demonstrieren.
Keiner der 568 Klone, die aus der nicht selektierten Bibliothek untersucht wurden, band sich an phOx, wie mittels ELISA nachgewiesen wurde.
Das Screenen auf Bindung des Phagen an Hapten wurde mittels ELISA durchgeführt: 96-Napf-Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit 10 μg/ml phOx-BSA oder 10 μg/ml BSA in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) beschichtet. Die Beimpfung mit Kolonien der mit Phagen transduzierten Bakterien erfolgte in 200 μl 2 × TY mit 12,5 μg/ml Tetracyclin in 96-Napf-Platten ("cell wells", Nuclon); diese wurden 24 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln (300 Upm) wachsen gelassen. Auf dieser Stufe waren die Kulturen gesättigt und die Phagentiter reproduzierbar (10¹⁰ TU/ml). Dann wurden 50 μl Phagenüberstand, gemischt mit 50 μl PBS, das 4% Magermilchpulver enthält, den beschichteten Platten zugegeben. Weitere Details waren wie in Beispiel 8.
Die Phagenbibliothek wurde über eine phOx-Affinitätssäule geschickt (Tabelle 3A) und mit Hapten eluiert. Die Kolonien aus der in Beispiel 17 hergestellten Bibliothek wurden in 50 ml 2 × TY-Medium gekratzt und bei 37°C 30 Minuten lang geschüttelt. Die freigesetzten Phagen wurden zweimal mit Polyethylenglykol gefällt und erneut auf 10¹² TU (transduzierende Einheiten)/ml Wasser suspendiert (Titer wie in Beispiel 8 bestimmt). Zur Affinitätsselektion wurde eine 1 ml phOx-BSA-Sepharose-Säule (O. Makela, M. Kaartinen, J. L. T. Pelonen and K. Karjalainen, J. Exp. Med. 148, 1644–1660, 1978) mit 300 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), und 20 ml PBS, die 2% Magermilchpulver enthält (MPBS), gewaschen. Die Säule wurden mit 10¹² TU Phagen in 10 ml PBS beladen, mit 10 ml MPBS und abschließend mit 200 ml PBS gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit 5 ml 1 mM 4-ε-Amino-capronsäuremethylen-2-phenyl-oxazol-5-on (phOx-CAP: O. Makela et al., 1978, s.o.) eluiert. Etwa 10⁶ TU eluierte Phagen wurden mittels Infektion von 1 ml in der log-Phase befindlichem E.coli-TG1 amplifiziert und wie oben ausplattiert. Für eine weitere Selektionsrunde wurden die Kolonien in 10 ml 2 × TY-Medium gekratzt und dann wie oben verarbeitet. Man stellte fest, daß sich nach der ersten Selektionsrunde von den eluierten Klonen 13% an phOx banden, wobei die mittels ELISA nachgewiesene Bindung von schwach bis stark reichte.
Um die Klone zu sequenzieren, wurde Templat-DNA aus den Überständen von 10 ml Kulturen, die 24 Stunden gewachsen waren, isoliert und unter der Verwendung des Didesoxy-Verfahrens und eines Sequenase Sets (USB), mit dem Primer LINKFOR (siehe Beispiel 11) für die VH-Gene und dem Primer fdSEQ1 (5'-GAA TTT TCT GTA TGA GG) für die Vk-Gene sequenziert. 23 dieser Hapten-bindenden Klone wurden sequenziert und 8 verschiedene VH-Gene (A bis H) wurden in einer Vielfalt von Paarungen mit sieben verschiedenen Vk-Genen (a bis g) (21) gefunden. Die meisten Domänen, wie z.B. VH-B und Vk-d waren "promiskuiv", und konnten Hapten mit jedem dieser Partner binden.
Die Sequenzen der V-Gene waren mit jenen verwandt, die in der Sekunkärantwort auf phOx zu sehen waren, aber mit Unterschieden (21). So setzen die phOx-Hy bridome aus der sekundären Antwort somatisch mutierte Derivate der drei Typen an Vk-Genen – Vkoxl., "Vkox.-ähnliche" und Vk45.1-Gene (C. Berek, G. M. Griffiths & C. Milstein, Nature 316, 412–418 (1985)) – ein. Diese können sich mit VH-Genen aus einigen Gruppen paaren, wobei jene aus Vkox herkömmlicherweise eher mit dem VHoxl-Gen (VH-Gruppe 2. R. Dildrop, s.o.) ein Paar bilden. Vkoxl-Gene werden immer, und Vkox-ähnliche Gene oft, in Verbindung mit schweren Ketten (einschließlich Vhoxl) gefunden und enthalten einen kurzen Fünferrest CDR3, mit der Grundsequenz Asp-X-Gly-X-X, worin das zentrale Glycin zur Bildung einer Kavität für phOx notwendig ist. In der statistischen kombinatorischen Bibliothek gehören jedoch fast alle VH-Gene zu Gruppe 1, und viele der Vk-Gene waren ox-ähnlich und mit VH-Domänen mit einem Fünferrest mit der Sequenz Asp/Asn-X-Gly-X-X (21) verbunden. Vkoxl und Vhoxl wurden nur einmal gefunden (Vk-f und VH-E), und nicht miteinander kombiniert. Bei Vk-f fehlt das Trp91, das bei der phOx-Bindung beteiligt ist, und es bildete mit einem VH (VH-C) mit einem Sechserrest-CDR3 ein Paar.
Eine Matrixkombination der VH- und VK-Gene wurde bei phOx-bindenden Klonen, die aus dieser statistischen kombinatorischen Bibliothek ausgewählt wurden, identifiziert. Die Anzahl der mit jeder Kombination gefundenen Klone ist in 22 gezeigt. Es zeigte sich, daß die Bindung an phOx-BSA bei Beurteilung mittels ELISA-Signal variierte (durch Schattierung in 22 hervorgehoben). Es zeigte sich keine Bindung an BSA alleine.
Eine zweite Selektionsrunde aus der ursprünglichen statistischen kombinatorischen Bibliothek aus immunen Mäusen ergab, daß 93% der eluierten Klone phOx banden (Tabelle 3). Die meisten dieser Klone waren Vk-d-Kombinationen und banden sich beim ELISA stark an phOx (die Daten sind nicht gezeigt). Einige schwach Bindende waren zu sehen. Dies läßt vermuten, daß die Affinitätschromatographie nicht nur die Bindenden angereichert hat, sondern auch die am besten Bindenden.
Mittels Fluoreszenzquenchtitrationen wurde der Kd von VH-B/Vk-d für phOx-GABA mit 10^–8 M (siehe Beispiel 18) bestimmt, was zeigt, daß Antikörper mit Affinitäten, die repräsentativ für die Sekundärantwort sind, aus der Sekundärantwort ausgewählt werden können; nur zwei (von 11 untersuchten) sekretieren Antikörper mit einer höheren Affinität als VH-B/Vk-d (C. Berek et al., 1985, s.o.). Der Kd von VH-B/Vk-b für phOx-GABA wurde mit 10^–5 M bestimmt (Beispiel 18). Es können also Phagen, die scFv-Fragmente mit schwachen Affinitäten aufweisen, mit Antigen selektiert werden, wahrscheinlich aufgrund der Avidität mehrerer Antikörperköpfe auf den Phagen.
Dieses Beispiel zeigt, daß Antikörperspezifitäten aus Bibliotheken, die von immunisierten Mäusen gewonnen wurden, isoliert werden können. Es wird oft notwendig sein, diese Antikörper in einer löslichen Form für weitere Untersuchungen und zur Verwendung in therapeutischen und diagnostischen Anwendungen zu exprimieren. Beispiel 18 zeigt die Bestimmung der Avidität der löslichen scFv-Fragmente, die mittels Phagenantikörper selektiert wurden. Beispiel 21 zeigt, daß lösliche Fragmente ähnliche Eigenschaften aufweisen wie jene die auf Phagen präsentiert werden. Für viele Zwecke ist es notwendig, ein Antikörpermolekül zu konstruieren und zu exprimieren, das die Fc-Abschnitte der schweren Kette enthält, und vielleicht den Immunglobulin-Isotyp zu variieren. Um dies zu erreichen, ist es notwendig, die Antigenbindestellen, die mittels des Phagenselektionssystem identifiziert wurden, in einen Vektor zur Expression in Säugetierzellen zu subklonieren, wobei ähnliche Verfahren verwendet werden wie jene, die von Orlandi et al., (1989, s.o.) beschrieben wurden. Beispielsweise können die VH- und VL-Gene mittels PCR mit Primern, die geeignete Restriktionsstellen enthaften, getrennt amplifiziert und in Vektoren insertiert werden, wie z.B. in pSV-gpt HuIgG1 (L. Riechmann et al., Nature 332, 323–327, 1988), der die Expression der VH-Domäne als Teil des IgG1-Isotyps mit schwerer Kette ermöglicht, und pSV-hyg HuCK, der die Expression der an die Konstantregion der leichten Kette vom κ-Typ befestigten VL-Domäne ermöglicht. Weiters können Fusionen der VH- und VL-Domänen mit Genen, die für nicht Immunglobulinproteine kodieren, beispielsweise Enzymen, durchgeführt werden.
Beispiel 17
Bildung weiterer Antikörperspezifitäten durch die Assemblierung von hierarchischen Bibliotheken
Weitere Antikörperspezifitäten können aus der in den Beispiel 15 und 16 hergestellten und gescreenten Bibliothek unter Verwendung eines hierarchischen Ansatzes gewonnen werden.
Die Promiskuität der VH-B- und Vk-d-Domänen veranlaßte die Anmelder weitere Paarungen zu bewirken, indem diese Gene mit dem gesamten Repertoire, sowohl Vk- als auch VH-Genen, aus der gleichen immunisierten Maus assembliert wurden. Die resultierenden "hierarchischen" Bibliotheken, (VH-B × Vk-rep und VH-rep × Vk-d), mit jeweils 4 × 10⁷ Bestandteilen, wurden einer Selektionsrunde unterzogen und die Hapten-bindenden Klone isoliert (Tabelle 3). Wie mittels ELISA gezeigt wurde, waren die meisten stark bindend. Indem 24 Klone aus jeder Bibliothek sequenziert wurden, identifizierten die Anmelder vierzehn neue Partner für VH-B und dreizehn für Vk-d (21). Abgesehen von VH-B und Vk-c wurde keiner der vorherigen Partner (oder andere Klone) aus der statistischen kombinatorischen Bibliothek erneut isoliert. Wieder waren die Vk-Gene hauptsächlich ox-ähnlich und die VH-Gene hauptsächlich aus Gruppe 1 (wie in Dildrop R., s.o. definiert), aber die einzigen Beispiele von Vkoxl (Vk-h, -p, -q und -r) hatten Trp91 und die VH-CDR3-Sequenz Asp-X-Gly-X-X herrscht nun vor. Somit scheinen einige Merkmale der phOx-Hybridome stärker in der hierarchischen Bibliothek in Erscheinung zu treten. Die neuen Partner unterscheiden sich voneinander hauptsächlich durch kleine Änderungen in den CDRs, was anzeigt, daß viel von der feinen Vielfalt vom statistischen kombinatorischen Ansatz ungenützt geblieben ist. Allgemeiner gesagt, wurde gezeigt, daß ein Spektrum an verwandten Antikörpern hergestellt werden kann, indem ein Partner fixiert wird und der andere variiert wird, und dies könnte sich als unbezahlbar für die Feinabstimmung der Antikörperaffinität und -spezifität erweisen.
Daher ermöglichen Phagenantikörper wiederum, daß ein größerer Bereich von Antikörpermolekülen auf gewünschte Eigenschaften untersucht wird.
Dieses Beispiel und Beispiel 16 zeigen die Isolierung von einzelnen Antikörperspezifitäten durch die Präsentation auf der Phagenoberfläche. Für einige Zwecke kann es erwünscht sein, ein Gemisch an Antikörpern zu haben, äquivalent zu einem polyklonalen Antiserum (beispielsweise zur Immunfällung). Um ein Antikörpergemisch herzustellen, könnte man Klone vermischen und lösliche Antikörper oder Antikörperfragmente exprimieren oder alternativ dazu Klone aus einer Bibliothek selektieren, um einen hoch angereicherten Pool an Genen, die für gegen einen Liganden von Interesse gerichtete Antikörper kodieren, zu erhalten und die Antikörper aus diesen Klonen zu exprimieren.
Beispiel 18
Selektion von Antikörpern, die auf Bakteriophagen präsentiert werden, mit verschiedenen Affinitäten für 2-Phenyl-5-oxazolon unter Verwendung von Affinitätschromatoraphie
Die in Beispiel 16 gezeigten ELISA-Daten lassen vermuten, daß die Affinitätschromatographie nicht nur die Bindenden angereichert hat, sondern auch die am besten Bindenden. Um dies zu bestätigen, wurden die Bindungsaffinitäten eines stark bindenden und eines schwach bindenden Phagen bestimmt und dann gezeigt, daß sie voneinander mittels Affinitätschromatographie getrennt werden können.
Die Klone VH-B/Vk-b und VH-B/Vk-d wurden mit MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX, MJK5FONX (siehe Beispiel 11) und VH1BACK-SfiI (5'-TCG CGG CCC AGC CGG CCA TGG CC(G/C) AGG T(C/G)(A/C) A(A/G)C TGC AG(C/G) AGT C(A/T)G G), einem Primer der eine SfiI-Stelle (unterstrichen) am 5'-Ende des VH-Gens einbringt, erneut amplifiziert. VG-B/Vk-d wurde in einen Phagemid, z.B. pJM1 (von A. Griffiths und J. Marks zur Verfügung gestellt), als SfiI-NotI-Kassette, stromabwärts vom pelB-Leader zur periplasmatischen Sekretion (M. Better et al., s.o.), mit einem C-terminalen Peptidanhängsel zur Detektion (siehe Beispiel 19 und Fig.), und unter der Steuerung eines λ-P_L-Promotors (H. Shimatake & M. Rosenberg Nature 292, 128–132, 1981) kloniert. Der Phagemid sollte die folgenden Merkmale besitzen: a) einzige SfiI- und NotI-Restriktionsstellen stromabwärts von einem pelB-Leader; b) eine Sequenz, die für ein C-terminates Peptidanhängsel zur Detektion kodiert; und c) einen λ-P_L-Promotor, der die Expression steuert. 10 Liter jeden Phagemid beinhaltende Kulturflüssigkeit von E.coli N4830-1 (M. E. Gottesmann, S. Adhya & A. Das J. Mol. Biol. 140, 57–75, 1980) wurden wie in K. Nagai & H. C. Thogerson (Methods Enzymol. 153, 461–481, 1987) induziert und die Überstände mit 50%-igem Ammoniumsulfat ausgefällt. Das erneut suspendierte Präzipitat wurde gegen PBS + 0,2 mM EDTA (PBSE) dialysiert, damit eine 1,5 ml phOx-Sepharose-Säule beladen und die Säule nacheinander mit 100 ml PBS; 100 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,0; 10 ml 50 mM Citrat, pH 5,0; 10 ml 50 mM Citrat, pH 4,0; und 20 ml 50 mM Glycin, pH 3,0 gewaschen. Die scFv-Fragmente wurden mit 50 mM Glycin, pH 2,0 eluiert, mit Tris-Base neutralisiert und gegen PBSE dialysiert. VH-B/Vk-b wurde in einen auf pUC119 basierenden Phagenvektor geklont, der für mit pJM1 identische Signal- und Tag-Sequenzen kodierte, und die Expression bei 30°C in einer 10 Liter-Kultur von E.coli TG1, der den Phagemid wie in D. de Bellis & I. Schwartz (1980 Nucl. Acid Res. 18, 1311) beinhaltet, induziert. Die geringe Affinität des Klon VH-B/Vk-b machte seine Reinigung auf phOx-Sepharose unmöglich. Daher wurde nach Konzentrierung durch Ultrafiltration (Filtron, Flowgen) der Überstand (100 ml von 600 ml) auf eine 1 ml Säule mit an Protein A-Sepharose gekuppeltem (E. Harlow & D. Lane, s.o.) monoklonalen Antikörper 9E10 (Evan, G. I. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3610–3616, 1985), der das Peptidanhängsel erkennt, aufgebracht. Die Säule wurde mit 200 ml PBS und 50 ml PBS, 0,5 MNaCl gewaschen. Die scFv-Fragmente wurden mit 100 ml 0,2 M Glycin, pH 3,0, eluiert, wobei die Neutralisierung und Dialyse wie zuvor erfolgten.
Der Kd (1,0 ± 0,2 × 10^–8 M) für den Klon VH-B/Vk-d wurde durch Fluoreszenzquenchtitration mit 4-ε-Aminobuttersäuremethylen-2-phenyl-oxazol-5-on (phOx-GABA Co. Makela et al., 1978, s.o.) bestimmt. Die Anregung erfolgte bei 280 nm, die Emission wurde bei 340 nm überwacht und der K_d berechnet. Der K_d des Klons VH-B/Vk-b mit niedriger Affinität wurde mit 1,8 ± 0,3 × 10^–5 M bestimmt (nicht gezeigt). Um die durch die Absorption aufgrund der höheren Konzentrationen von phOx-GABA erforderliche Lichtmenge zu minimieren, erfolgte die Anregung bei 260 nm und die Überwachung der Emmission bei 304 nm. Zusätzlich wurden die Fluoreszenzwerte durch jene aus einer parallelen Titration des Lysozym-bindenden Fragments D1.3 dividiert. Der Wert wurde wie in H. N. Eisen Meth. Med. Res. 10, 115–121, 1964 berechnet. Ein Gemisch der Klone VH-B/Vk-b und VH-B/Vk-d, 7 × 10¹⁰ TU Phagen im Verhältnis 20 VH-B/Vk-b : 1 VH-B/Vk-d, wurde in 10 ml PBS auf die phOx-BSA-Sepharose-Säule aufgebracht und wie oben eluiert. Die eluierten Phagen wurde verwendet, um E.coli TG1 erneut zu infizieren, und die Phagen hergestellt und wie zuvor geerntet. Etwa 10¹¹ TU Phagen wurden auf eine zweite Affinitätssäule aufgebracht und der Vorgang wiederholt, um gesamt drei Säulendurchgänge zu erhalten. Verdünnungen der eluierten Phagen wurden auf jeder Stufe doppelt ausplattiert und getrennt mit für Vk-b (5'-GAG CGG GTA ACC ACT GTA CT) oder Vk-d (5'-GAA TGG TAT AGT ACT ACC CT) spezifischen Oligonukleotid-Sonden untersucht. Nach diesen zwei Runden waren im wesentlichen alle eluierten Phagen VH-B/Vk-d (Tabelle 3). Daher können Phagenantikörper auf der Basis der Antigenaffinität des präsentierten Antikörpers selektiert werden.
Beispiel 19
Konstruktion von Phagemid pHEN1 zur Expression von Antikörperfragmenten, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen nach Superinfektion exprimiert werden
Der Phagemid pHEN1 (23) ist ein Derivat von pUC119 (Vieira, J. & Messing, J. Methods Enzymol 153, S. 3–11, 1987). Die Kodierregion von g3p aus fdCAT2 wurde durch PCR, unter Verwendung der Primer G3FUFO und G3FUBA (weiter unten gezeigt) (die EcoRI- bzw. HindIII-Stellen enthalten), amplifiziert, und als HindIII-EcoRI- Fragment in pUC119 kloniert. Das HindIII-NotI-Fragment, das für die g3p-Signalsequenz kodiert, wurde durch ein pelB-Signalpeptid (Better, M. et al., Science 240, 1041–1043, 1988) mit einer internen SfiI-Stelle ersetzt, was die Klonierung von Antikörpergenen as SfiI-NotI-Fragmente ermöglicht. Ein Peptidanhängsel, c-myc, (Munro, S. & Pelham, H., Cell 46, 291–300, 1986) wurden direkt nach der NotI-Stelle durch Klonieren einer Oligonukleotid-Kassette eingebracht, und darauffolgend ein "amber"-Codon durch Stellen-gerichtete Mutagenese unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham International) eingebracht (23b).
Beispiel 20
Präsentation von Einzelketten-Fv- und Fab-Fragmenten, die vom anti-Oxazolon-Antikörper NQ10.12.5 stammen, auf dem Bakteriophagen fd unter Verwendung von pHEN1 und fdCAT2.
Ein Bereich von Konstrukten (siehe 24) wurde aus einem Klon (im wesentlichen Konstrukt II in pUC19) hergestellt, der zur Expression eines löslichen Fab-Fragments (Better et al., 199, s.o.) aus dem anti-phOx (2-Phenyl-5-oxazolon)-Antikörper NQ10.12.5 (Griffiths, G. M. et al., Nature 312, 271–275, 1984) in Bakterien konstruiert war. Im Konstrukt II stammen die V-Regionen aus NQ10.12.5 und sind an menschlichen Ck- und CH1- (γ1-Isotyp) Konstantdomänen befestigt. Die C-terminalen Cysteinreste, die normalerweise zwischen den leichten und schweren Ketten des Antikörpers eine kovalente Bindung bilden, sind aus beiden Konstantdomänen gelöscht worden. Um die Gene der schweren und leichten Ketten zusammen als Fab-Fragmente (Konstrukt II) oder als getrennte Ketten (Konstrukte III und IV) zur Phagen präsentation zu klonen, wurde DNA aus dem Konstrukt II durch PCR amplifiziert, um eine NotI-Restriktionsstelle am 3'-Ende und entweder eine ApaLI-Stelle (zum Klonieren in fdCAT2) oder eine SfiI-Stelle (zum Klonieren in pHEN1) einzubringen. Die Primer FABNOTFOK mit VH1BACKAPA (oder VH1BACKSFI15) wurden zur PCR-Amplifikation von Genen, die für Fab-Fragmente (Konstrukt II) kodieren, verwendet, die Primer FABNOTFOH mit VH1BACKAPA (oder VH1BACKSFI15) für schwere Ketten (Konstrukt III), und die Primer FABNOTFOK und MVKBAAPA (oder MVKBASFI) für leichte Ketten (Konstrukt IV).
Die Einzelketten-Fv-Version von NQ10.12.5 (Konstrukt I) weist die variablen Domänen der schweren (VH) und der leichten Kette (Vakuum) durch einen flexiblen Linker (Gly₄Ser)₃ (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 5879–5883, 1988) verbunden auf und diese wurde aus Konstrukt II durch "Spleißen durch überlappende Erweiterung" wie in Beispiel 14 konstruiert. Die assemblierten Gene wurden mit den Primern VK3F2NOT und VH1BACKAPA (oder VH1BACKSFI15) erneut amplifiziert, um Restriktionstellen zum Klonieren in fd-CAT2 (ApaLI-NotI) oder pHEN1 (SfiI-NotI) anzuhängen.
Restriktionsstellen sind unterstrichen.
Ergänzung von Phagen- und Phagemidteilchen
Die Konstrukte I–IV (27) wurden sowohl in fd-CAT2 als auch in pHEN1 eingebracht. Der Phage fd-CAT2 (und fd-CAT2-I, II, III oder IV) wurden aus dem Überstand von infiziertem E.coli TG1, nachdem diese über Nacht bei 37°C in 2 × TY-Medium mit 12,5 μg/ml Tetracyclin geschüttelt wurden, entnommen und direkt im ELISA verwendet. Der Phagemid pHEN1 (und pHEN1-I und II) in E.coli TG1 (supE) wurden über Nacht in 2 ml 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Glucose (ohne Glucose verhindert die Expression von g3p die spätere Superinfektion durch den Helferphagen) gezüchtet. 10 μl des Überstandes wurden verwendet, um 2 ml 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Glucose zu beimpfen, und diese wurden bei 37°C 1 Stunde geschüttelt. Die Zellen wurden gewaschen, und in 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin erneut suspendiert und die Phagemidteilchen durch die Zugabe von 2 μl (10⁸ pfu) VCSM13-Helferphagen (Stratagene) ergänzt. Nach einstündigem Wachstum wurden 4 μl Kanamycin (25 mg/ml) zugegeben und die Kultur über Nacht wachsen gelassen. Die Phagemidteilchen wurden mittels Fällung mit Polyethylenglycol für den ELISA 10fach konzentriert.
ELISA
Die Detektion der Phagenbindung an 2-Phenyl-5-oxazolon (phOx) wurde wie in Beispiel 9 durchgeführt. 96-Napf-Platten wurden mit 10 μg/ml phOx-BSA oder mit 10 μg/ml BSA in PBS über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet, und mit PBSS, die 2% Magermilchpulver enthält, blockiert. Phagen (Phagemid)-Überstand (50 μl), der mit 50 μl 4% Magenmilchpulver enthaltender PBS vermischt war, wurde den Näpfen zugegeben und untersucht. Um die Bindung der löslichen scFv- oder Fab-Fragmente, die aus pHEN1 ausgeschieden werden, nachzuweisen, wurde das c-myc-Peptidanhängsel, das von Munro und Pelham 1986, s.o., beschrieben wurde, unter Verwendung des monoklonalen anti-myc 9-E10 (Evan, G. I. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 3610–3616, 1985) detektiert, gefolgt von der Detektion mit an Peroxidase konjugiertem anti-Maus-Ziegenimmunglobulin. Die anderen Detais waren wie in Beispiel 9.
Die Konstrukte in fdCAT2 und pHEN1 präsentieren Antikörperfragmente auf der Oberfläche von filamentösen Phagen. Der Phagenvektor, fd-CAT2 (8) basiert auf dem Vektor fd-tet (Zacher, A. N. et al., Gen 9, 127–140, 1980) und weist Restriktionsstellen (ApaLI und NotI) zum Klonieren von Antikörpergenen (oder anderen Proteingenen) zur Expression als Fusionen mit dem N-Terminus des Phagenhüllenproteins g3p auf. Die Transkription der Antikörper-g3p-Fusionen in fd-CAT2 wird vom Gen III-Promotor gesteuert, und das Fusionsprotein aufgrund des g3p-Leaders in das Periplasma gelenkt. Es wurde durch ELISA (Tabelle 4) gezeigt, daß Fab- und scFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Präsentation in fd-CAT2 kloniert wurden, sich an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden. Es wurde angenommen, daß sich die Phagen binden, wenn die A₄₀₅ der Probe zumindest 10fach größer war als der Hintergrund im ELISA.
Der Phagemidvektor, pHEN1 (23) basiert auf pUC119 und enthält Restriktionsstellen (SfiI und NotI) zum Klonieren der Fusionsproteine. Hier wird die Transkription der Antikörper-g3p-Fusionen vom induzierbaren IacZ-Promotor gesteuert und das Fusionsprotein aufgrund des pelB-Leaders in das Periplasma gelenkt. Der Phagemid wurde mit dem VCSM13-Helferphagen in 2 × TY-Medium ohne Glucose oder IPTG ergänzt: unter diesen Bedingungen gibt es eine ausreichende Expression des Antikörper-g3p. Es wurde mittels ELISA (Tabelle 4) gezeigt, daß Fab- und scFv-Fragmente von NQ10.12.5, die zur Präsentation in pHEN1 kloniert wurden, sich an phOx-BSA (aber nicht an BSA) binden, wobei das selbe Kriterium wie oben verwendet wurde.
Beispiel 21
Induktion von löslichen scFv- und Fab-Fragmenten unter Verwendung des Phagemid pHEN1
Weitere Untersuchungen der Antikörper, die auf der Oberfläche des Phagen exprimiert wurden, würden sehr erleichtert werden, wenn es einfach ist, zur Expression in Lösung umzuschalten.
E.coli HB2151 wurde mit pHEN-Phagemid (pHEN1-I oder II) infiziert und auf YTE-Platten mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert. Kolonien wurden bei 37°C in 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Glucose bis zu einer optischen Dichte von OD₅₅₀ = 0,5–1,0 geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, einmal in 2 × TY-Medium gewaschen, in Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalaktosid (IPTG) erneut suspendiert und weiter 16 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand, der die sekretierten Ketten enthält, direkt im ELISA verwendet.
Der Phagemid pHEN1 hat gegenüber dem Phagen fd-CAT2 den Vorteil, daß der Antikörper entweder zur Phagenpräsentation (durch Wachstum in supE-Stämmen von E.coli) oder als mit einem Anhängsel markiertes lösliches Fragment (durch Wachstum in Nicht-Suppressor-Stämmen) hergestellt werden kann, da ein Peptidanhängsel (Beispiel 19) und ein "amber"-Codon zwischen den Antikörper und g3p eingebracht wurde. Die Sekretion von löslichen Fab-Fragmenten aus pHEN1-II oder von scFv-Fragmenten aus pHEN1-I wurde nach Wachstum in E.coli HB2151 und Induktion mit IPTG mittels Western-Blots nachgewiesen. Zur Detektion der ausgeschiedenen Proteine wurden 10 μl Überstand von induzierten Kulturen einer SDS-PAGE unterzogen und die Proteine durch Elektroblotten auf Immobilon-P (Millipore) übertragen. Lösliche leichte und schwere Ketten wurden mit polyklonalem anti-menschlicher Fab-Antiserum aus Ziegen und mit an Peroxidase konjugiertem anti-Ziegen-Immunglobulin aus Kaninchen (jeweils in einer Verdünnung von 1:1000) nachgewiesen. Die mit dem Anhängsel versehene VK-Domäne wurde mit 9E10-Antikörper (1:1000) und an mit an Peroxidase konjugiertem anti-Maus-Immunglobulin aus Kaninchen (für Fc spezifisch) (1:1000) (Sigma) oder mit einem mit einer Peroxidase markiertem anti-menschlicher CK-Antiserum (Dako) detektiert. 3,3'-Diaminobenzidin (DAB; Sigma) wurde als Peroxidase-Substrat verwendet (Harlow, E. et al., 1988, s.o.). Mit scFv wurden die Fragmente unter Verwendung des 9E10 anti-myc tag-Antikörpers detektiert (keine Daten gezeigt). Mit Fab wurden, wie erwartet, nur die leichten Ketten durch 9E10 (oder anti-menschlicher CK)-Antikörper nachgewiesen, während das anti-menschlicher Fab-Antiserum sowohl schwere als auch leichte Ketten detektierte. Die Bindung der löslichen scFv- und Fab-Fragmente an phOx-BSA (aber nicht an BSA) wurde ebenfalls mittels ELISA (Tabelle 4B) gezeigt. Somit können scFv- und Fab-Fragmente auf Phagen präsentiert werden oder als lösliche Fragmente aus dem selben Phagemidvektor sekretiert werden.
Beispiel 22
Erhöhte Empfindlichkeit im ELISA-Assay mit Lysozym unter Verwendung von FDTscFvD1.3 als primärer Antikörper, verglichen mit löslichem scFvD1.3.
Prinzipiell sollte die Verwendung von Phagenantikörpern die Durchführung von empfindlicheren Immunassays als mit löslichen Antikörpern ermöglichen. Phagenantikörper kombinieren die Fähigkeit ein spezifisches Antigen zu binden mit der Möglichkeit zur Amplifikation durch das Vorhandensein vielfacher (etwa 2800) Kopien des Haupthüllenproteins (g8p) auf jedem Virion. Dies würde die Befestigung einiger Antikörpermoleküle, die gegen M13 gerichtet sind, an jedem Virion, gefolgt von der Befestigung einiger Moleküle von an Peroxidase konjugiertem anti-species-Antikörper (anti-Schaf-IgG im unteren Fall), ermöglichen. Somit gibt es für jeden Phagenantikörper, der an Antigen gebunden ist, die Möglichkeit einige Peroxidasemoleküle zu befestigen, wohingegen bei der Verwendung eines löslichen Antikörpers als primärer Antikörper diese Amplifikation nicht stattfindet.
ELISA-Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur unter Verwendung von 200 μl von 10fach-Verdünnungen des Hühnereilysozyms (1000, 100, 10, 1, 0,1 und 0,01 μg/ml) in 50 mM NaHCO₃, pH 9,6 beschichtet. Der ELISA wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt, außer daß (i) die Inkubation mit anti-Lysozym-Antikörper entweder mit FDTscFvD1.3 (pAb; 10¹¹ Phagen pro Napf; 1,6 nMol) oder mit durch Affinität gereinigtem scFvD1.3 (18 μg pro Napf; 0,7 nMol) erfolgte; (ii) die Inkubation mit dem zweiten Antikörper mit einer 1/100-Verdünnung von anti-M13-Schafsserum für FDTscFvD1.3-Proben oder mit einer 1/100-Verdünnung von anti-scFvD1.3-Kaninchenserum (von S. Ward) für lösliche scFvD1.3-Proben erfolgte; (iii) an Peroxidase konjugiertes anti-Ziegen-Kaninchenimmunglobulin (Sigma; 1/5000) für FDTscFvD1.3-Proben verwendet wurde und an Peroxidase konjugiertes anti-Kaninchen-Ziegenimmunglobulin (Sigma; 1/5000) für lösliche scFvD1.3-Proben verwendet wurde. Die Absorption bei 405 nm wurde wurde nach 15 Stunden gemessen. Die Ergebnisse sind in den 30 und 31 gezeigt. In diesen Figuren sind die zum Beschichten verwendeten Lysozymkonzentrationen auf einer logarithmischen Verdünnungsskala relativ zu 1 μg/ml gezeigt (d.h. log = –3 = 1 mg/ml; log = 2 = 0,01 μg/ml).
Mit FDTscFvD1.3 wurden bei allen Lysozymkonzentrationen höhere Signale erhalten (28), aber der Unterschied war bei den größten Verdünnungen, wo die Antigenquantitäten am meisten limitierend sind (27 und 28), sehr deutlich. Dies läßt vermuten, daß die Phagenantikörper für Assays vom Sandwichtyp, wo das Einfangen von geringen Antigenmengen durch den primären Antikörper ein amplifiziertes Signal erzeugt, besonders wertvoll sein können, wenn die Phagenantikörper, die gegen ein unterschiedliches Epitop gerichtet sind, als der zweite Antigen-bindende Antikörper verwendet werden.
Beispiel 23
Direkte Ergänzung und Expression von monoklonalen Mäuseantikörpern als Einzelketten-Fv-Fragmente auf der Oberfläche des Bakteriophagen fd
Das Prinzip ist jenem in Beispiel 11 beschriebenen sehr ähnlich. Es besteht aus der PCR-Assemblierung von Einzelketten-Antikörpern aus cDNA, die aus Monoklonalen aus Mäuse hergestellt wurde. Als Beispiel wird die Ergänzung und Expression zweier solcher Antikörper aus Monoklonalen, die Antikörper gegen das Steroidhormon Östriol exprimieren, beschrieben.
A. RNA-Isolierung
RNA kann mit vielen im Fachgebiet gut bekannten Verfahren isoliert werden. In diesem Beispiel ergab die Verwendung von Triton X-100-Lyse, Phenol/SDS-RNase-Inaktivierung hervorragende Ergebnisse.

1. Die hier verwendeten monoklonalen Mäusezellen waren durch Zentrifugation geerntet worden und in Serum-freiem Medium erneut suspendiert worden. Sie wurden dann zentrifugiert und in Salzlösung erneut suspendiert und nach einem abschließenden Zentrifugationsschritt in sterilem Wasser bei 1 × 10⁷ Zellen pro ml erneut suspendiert. (Normalerweise würden die Zellen in PBS-Puffer gewaschen und abschließend erneut suspendiert werden, aber diese speziellen Zellen wurden an die Anmelder, wie beschrieben, in Wasser gefroren geliefert).
2. Zu 750 μl Zellen wurden 250 μl eiskalter 4 × Lysepuffer (40 mM Tris-HCl ph 7,4/4 mM MgCl₂/600 mM NaCl/40 mM VRC (Veronyl-Ribosyl-Komplex)/2% Triton X-100) zugegeben. Die Suspension wurde gut vermischt und auf Eis 5 Minuten stehen gelassen.
3. Die Zentrifugation erfolgte bei 4°C in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten lang bei 13.000 Upm.

Der Überstand wird dann dreimal mit Phenol, dreimal mit Phenol/Chloroform extrahiert und und schließlich wie im Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben mit Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird in 50 μl Wasser erneut suspendiert.

4. Die optische Dichte der RNA bei 260 nm wurde mit einer 2,5 μl-Probe in 1 ml Wasser gemessen. Die RNA wurde durch Elektrophorese einer 2 μg-Probe auf einem 1%-Agarosegel überprüft. RNA im Bereich von 32 μg bis 42 μg wurde durch dieses Verfahren erhalten.

B. cDNA-Herstellung
Das verwendete Verfahren ist das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene. Zwei cDNA-Herstellungen wurden durchgeführt. Diese erfolgten aus RNA, die aus den Monoklonalen, die als Zelllinien 013 und 014 bekannt sind, wobei beide Antikörper gegen das Steroidhormon Östriol exprimieren.
C. Primäre PCRs
Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene: Die VH-Region wurde mit den Primern VH1BACK und VH1FOR-2 amplifiziert. Für die κ-Region wurden vier getrennte Reaktionen unter Verwendung des Primers VK2BACK und mit MJK1FONX, MJK2FONX, MJK4FONX oder MJK5FONX durchgeführt. Die Proben (5 μl) wurden auf einem 1,5%-Agarosegel überprüft. Dabei wurde beobachtet, daß für cDNA, die aus den zwei Östriol-Monoklonalen hergestellt wurde, die Primer VK2BACK und MJK1FONX die beste Amplifikation der V-κ-Region ergaben. Die VH-Banden und die V-κ-Banden, die mit VK2BACK/MJK1FONX amplifiziert wurden, wurden auf 2%-Agarosegelen mit niedrigem Schmelzpunkt für jedes Monoklonale gereinigt. Die DNA-Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und unter Verwendung eines dafür vorgesehenen Geneclean Sets wie in Beispiel 11 gereinigt.
D. Herstellung der Linker
Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene. In diesem Fall wurde die amplifizierte Linker-DNA auf einem 2%-Agarosegel gereinigt und aus dem Gel mit einem dafür vorgesehenen "Mermaid"-Set (BIO 101, Geneclean, La Jolla, San Diego, California, USA) gemäß den Herstellerangaben gewonnen.
E. Assemblierungs-PCRs
Das verwendete Verfahren ist im wesentlichen das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene. In diesem Fall wurde das assemblierte PCR-Produkt auf einem 2%-Agarosegel gereinigt und aus dem Gel mit einem dafür vorgesehenen "Mermaid"-Set gewonnen.
F. Addition von Restriktionsstellen und Aufarbeitung
Das assemblierte Produkt wurde mit ApaLI- und NotI-Restriktionsstellen "beendet" ("tagged") bzw. an den Enden versehen. Die DNA wurde dann mit ApaLI und NotI gespalten, um adhesive Enden zum Klonieren zu bilden, und dann auf einem 2%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt und unter Verwendung eines Geneclean Sets extrahiert. Das verwendete Verfahren ist das gleiche wie das in Beispiel 11 beschriebene.
G. Klonieren in den Vektor fd-CAT2
Die Gesamtmenge von 15 μg mit CsCl gereinigter fd-CAT2-DNA wurde mit 100 Units des Restriktionsenzyms NotI (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 200 μl 1 × NEB-NotI-Puffer mit 1 × NEB-acetyliertem BSA für einen Zeitraum von 3 Stunden bei 37°C gespalten. Die Vektor-DNA wurden dann zweimal mit 15 μl Strataclean (einem im Handel erhältlichen Harz zur Entfernung von Protein) gemäß den Herstellerangaben (Stratagene, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, California, USA) behandelt. Die DNA wurde dann mit 100 Units des Restriktionsenzyms ApaLI (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 200 μl 1 × NEB-Puffer 4 über Nacht bei 37°C gespalten. Der Vektor wurde dann mit einer Chroma Spin 1000-Säule gemäß den Angaben der Hersteller (Clontech Laboratories Inc, 4030 Fabian way, Palo Alto, California, USA) gereinigt. Dieser Schritt entfernt das ApaLI/NotI-Fragment, um geschnittene Vektor-DNA für eine maximale Ligationseffizienz zu erhalten.
Die Ligationsreaktionen wurden mit 2,5–10 ng des DNA-Inserts und 10 ng Vektor in einem Gesamtvolumen von 10 μl 1× NEB-Ligasepuffer mit 1 μl NEB-Ligase (New England Biolabs) bei 16°C über Nacht (etwa 16 Stunden) durchgeführt.
H. Transformation und Wachstum
Der E.coli-Stamm TG1 wurde kompetent gemacht und mit der rekombinanten fdCAT2-DNA wie von Sambrook et al., 1989, s.o., transformiert. Die Zellen wurden auf LBtet-Platten (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 15 g Bacto-agar pro Liter mit 15 μg/μl Tetracyclin, die erst kurz vor dem Plattengießen zugegeben werden, ausplattiert und über Nacht wachsen gelassen.
10 ml LBtet-Nährlösung (LB-Medium mit 15 μg/μl Tetracyclin) wurden dann in 50 ml Röhrchen mit aus einzelnen Näpfen isolierten Kolonien beimpft. Nach dem Wachstum über Nacht bei 35°C/350 Upm in einer Tischzentrifuge. Die Überstände wurden in 15 ml Zentrifugenröhrchen übertragen und jedem 2 ml 20% PEG 8000/2,5 M NaCl zugegeben. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten wurde der rekombinante Phage durch Zentrifugation bei 9000 Upm in einem SM24-Rotor für 30 Minuten pelletiert. Der PEG-Überstand wurde verworfen. Noch verbliebenes PEG wurde mit einer Pasteurpipette nach einem kurzen (2 Minuten) Zentrifugationsschritt entfernt. Dieser letzte Schritt wurde wiederholt, um sicherzugehen, daß kein PEG verbleibt. Das Phagenpellet wurde dann in 500 μl PBS-Puffer erneut suspendiert. Dies wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei 13.000 Upm zentrifugiert, um übriggebliebene Zellen zu entfernen. Der Phagenüberstand wurde in ein frisches Röhrchen übertragen.
I. Assay auf Antikörperexpression
Die Rekombinanten des Bakteriophagen fd wurden auf die Expression eines Antikörpers gegen Östriol mittels ELISA gescreent. Dieses Verfahren ist in Beispiel 6 beschrieben. In diesem Fall sind die folgenden Änderungen wesentlich:

1. Die Mikrotiterplatten wurden über Nacht mit 40 μg/ml Östriol-6-carboxymethyloxim-BSA (Steraloids, 31 Radcliffe Road, Croydon, CRO 5QJ, England) beschichtet.
2. Der erste Antikörper war der mutmaßliche anti-Östriol-Phagenantikörper. 50 μl Phagen in einem Endvolumen von 200 μl steriler PBS mit 0,25% Gelatin wurden jedem Napf zugegeben.
3. Der zweite Antikörper war ein anti-M13-Schafsantikörper bei einer Verdünnung von 1:1000.
4. Der dritte Antikörper war an Peroxidase konjugiertes anti-Ziegen-Kaninchenimmunglobulin.

Die Rekombinanten, die funktionelle Antikörper exprimieren, wurden durch Inkubation mit dem chromogenen Substrat 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure) nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in den 32 und 33 dargestellt.
Beispiel 24
Konstruktion eines Helferphagen, dem das Gen III fehlt
Um das Potential des Phagemidkloniersystems vollständig zu verwirklichen, ist ein Helferphage, dem das Gen III fehlt, wünschenswert. Die Ergänzung von Gen III-Fusionen mit einem solchen Helferphagen würde ergeben, daß alle Phagemid-"Nachkommen" eine Gen III-Fusion auf deren Capsid aufweisen, da es keine Konkurrenz mit dem Wildtyp-Molekül gibt.
Die Steuerung der Anzahl an Fusionsmolekülen auf jedem Phagen ist besonders nützlich. Beispielsweise kann ein Helferphage, dem das Gen III fehlt, verwendet werden, um Antikörper mit geringer Affinität aus einem nativen Repertoire zu ergänzen, in dem eine hohe Avidität notwendig ist, um jene Phagen zu isolieren, die die korrekte Antikörperspezifität aufweisen. Der nicht mutierte Helferphage kann dann verwendet werden, wenn Versionen mit höherer Affinität konstruiert werden, wodurch die Aviditätskomponente verringert wird und die Selektion rein auf Basis der Affinität ermöglicht wird. Es zeigt sich, daß dies eine überraschenderweise erfolgreiche Strategie zur Isolierung und Affinitätsreifung von Antikörpern aus nativen Bibliotheken darstellt.
Die zur Konstruktion des Helferphagen gewählte Vorgehensweise war die teilweise Deletion des Gen III von M13K07 unter Verwendung der Exonuclease Bal31. Phagen, denen das Gen III fehlt, sind jedoch nicht infektiös, daher wurde ein E.coli-Stamm konstruiert, der Gen III exprimiert. M13-Gen III vom Wildtyp wurde mit den Primern gIIIFUFO und gIIIFUBA PCR-amplifiziert, genauso wie dies in Beispiel 19 beschrieben ist. Das PCR-Produkt wurde mit EcoRI und HindIII gespalten und in einen mit EcoRI und HindIII geschnittenen pUC19 (kein Phagemid, da ihm der Ursprung der SS-DNA- Replikation des filamentösen Phagen fehlt) unter der Steuerung des lac-Promotors insertiert. Das Plasmid wurde in E.coli TG1 transformiert und der resultierende Stamm mit TG1/pUC19gIII bezeichnet. Dieser Stamm stellt dem Helferphagen gIII-Protein in trans bereit.
Es gibt in M13K07 eine einzelne, einzigartige BamHI-Stelle, die sich etwa in der Mitte von gIII befindet. Doppelsträngige M13K07-DNA wurde durch alkalische Lyse und CsCl-Zentrifugation (Sambrook et al., 1989, s.o.) isoliert; 20 μg DNA wurden mit BamHI geschnitten, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, dann in 50 μl Bal31-Puffer (600 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 12 mM CaCl₂, 12 mM MgCl₂ und 1 mM EDTA) erneut suspendiert und 4 Minuten lang mit 1 Unit Bal31 (New England Biolabs) gespalten. Diese Behandlung entfernt etwa 1 Kb DNA. EGTA wurde auf 20 mM zugegeben und die Reaktionslösung mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt, bevor die Reinigung des geschnittenen Genoms auf einem Agarosegel erfolgte. Die DNA wurde mit Klenow-Enzym repariert und mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) mit sich selbst ligiert.
Aliquote der Ligationsreaktionslösung wurden in kompetente TG1/pUC19gIII-Zellen transformiert und auf SOB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin ausplattiert. Die Kolonien wurden auf das Vorhandensein einer Deletion mittels PCR mit den Primern gIIIFUBA und KSJ12 (CGGAATACCCAAAAGAACTGG) gescreent.
KSJ12 anneliert am Gen VI, das sich unmittelbar stromabwärts von gIII im Phagengenom befindet, wodurch sich gIII auf dem Helferphagen von jenem, das auf dem Plasmid resident ist, unterscheidet. Drei Klone ergaben geschnittene PCR-Produkte, die Deletionen von etwa 200, 400 und 800 bp entsprechen. Diese Klone wurden mit M13K07gIIIΔNr. 1, 2 bzw. 3 bezeichnet. Keine Klone wurden von den früheren Bal31-Zeitpunkten erhalten, was vermuten läßt, daß diese auf irgendeine Art für die Wirtszelle tödlich sind. Einige Klone wurden von späteren Zeitpunkten isoliert, aber keiner von diesen ergab ein PCR-Produkt, was anzeigt, daß die Deletionsreaktion zu weit erfolgt war.
M13K07gIIIΔNr. 1, 2 und 3 wurden kultiviert und die resultierenden Helferphagen auf ihre Fähigkeit, eine Antikörper-gIII-Fusion (scFvD1.3) zu ergänzen, mittels ELISA untersucht, genau wie dies in Beispiel 13 beschrieben wurde. Wie in 31 gezeigt ist, wurde nur ein Klon M13K07gIIIΔNr. 3 gefunden, der den Antikörper gut ergänzte; das Signal mit diesem Helferphagen war größer als jenes mit dem ursprünglichen M1307. Mit M13K07gIIIΔNr. 3 ergänzte Phagemide sollten eine viel höhere Dichte von Antikörperfusionen auf ihren Oberflächen aufweisen. Es wurde gezeigt, daß dies wirklich der Fall ist, indem der in diesem ELISA verwendete Phage durch Western-Blotten mit anti-gIII Protein-Antiserum analysiert wurde. Diese Analyse ermöglicht eine Abschätzung der Menge an gIII-Fusionsprotein gegenüber dem freien gIII-Protein, das auf den Phagen(Phagemid)-teilchen vorhanden ist.
Nur eine Minutenfraktion des gIII-Proteins auf dem mit M1307 ergänztem Material ist als intakte Fusion vorhanden (32). Die Fusionsproteinbande wird durch IPTG induziert, sie ist daher unbestreitbar die durch den Phagemid synthetisierte. Wie erwartet herrscht gIII-Protein vom Wildtyp mit einer kleineren Kopienanzahl und von einem schwächeren Promotor gesteuert vor, sogar wenn die durch den lac-Promotor gesteuerte gIII-Fusionsproteinsynthese voll induziert ist (100 μM IPTG). Dies steht im Gegensatz zu dem Muster, das durch den selben mit M13K07gIIIΔNr. 3 ergänzten Klon gebildet wurde, und zu dem Muster, das durch fdCAT2-scFvD1.3 gebildet wurde. In diesen beiden letzteren Fällen gibt es keine Konkurrenz mit dem gIII vom Wildtyp und die Fusionsproteinbande ist entsprechend stärker.
Es ist bemerkenswert, daß die Konstruktion von M13K07gIIIΔNr. 3 sehr uneffizient war: ein Klon aus 20 μg Ausgangs-DNA. Darüberhinaus ist die Ausbeute von gIII-Helferphagen aus Über-Nacht-Kulturen mit etwa 10⁶ cfu/ml extrem klein, verglichen mit etwa 10¹¹ cfu/ml für den ursprünglichen Phagen. Abgesehen davon ergänzt M13K07gIIIΔNr. 3 den Phagemid ebenso wie den ursprünglichen Phagen, wie durch die Anzahl der Phagemidpartikel, die nach dem Wachstum über Nacht hergestellt wurden, festgestellt werden kann. Dies deutet darauf hin, daß die trans-Replikation und die Verpackungsfunktionen des Helferphagen intakt sind und läßt vermuten, daß seine eigene Replikation defekt ist. Daher kann es sein, daß die Inaktivierung von gIII normalerweise toxisch für die Wirtszelle ist und daß M13K07gIIIΔNr. 3 aufgrund einer kompensierenden Mutation, die z.B. die Replikation betrifft, isoliert wurde. Der Phage fd-tet ist dahingehend ungewöhnlich, daß er Mutationen in Strukturgenen toleriert, die normalerweise für die Wirtszelle tödlich sind, da er einen Replikationsdefekt aufweist, der die Akkumulierung von toxischen Phagenprodukten verlangsamt; M13K07gIIIΔNr. 3 könnte ebenfalls einen solchen Defekt aufweisen.
M13K07gIIIΔNr. 3 wurde am 28. Juni 1991 gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 6HT, UK (Zugangsnr. NCTC 12478) hinterlegt. Er enthält eine Deletion des M13-Genoms von den Basen 1979 bis inklusive 2768 (siehe Van Wezenbeek, P. G. M. F. et al., Gene II, S. 129–148, 1980 für die DNA-Sequenz des M13-Genoms).
Beispiel 25
Selektion von Bakteriophagen, die gegen Lysozym gerichtete scFv-Fragmente exprimieren aus Gemischen gemäß der Affinität unter Verwendung eines Anreicherungsverfahrens ("panning procedure")
Zur Isolierung eines Antikörpers mit einer erwünscht hohen Affinität ist es notwendig, einen Antikörper mit einer Affinität, die nur um ein geringes Vielfaches höher ist als der Rest der Population, auswählen zu können. Dies ist insbesondere wichtig, wenn ein Antikörper mit einer nicht ausreichenden Affinität z.B. aus einem Repertoire, das aus einem immunisierten Tier stammt, isoliert wurde, und die statistische Mutagenese verwendet wird, um Derivate mit möglicherweise erhöhter Affinität herzustellen. In diesem Beispiel wurden Gemische von Phagen, die Antikörper mit verschiedenen Affinitäten, die gegen Hühnereilysozym gerichtet sind, exprimieren, einem Anreicherungsverfahren ("panning procedure") unterzogen. Es wurde gezeigt, daß Phagenantikörper die Fähigkeit verleihen, einen Antikörper mit einem K_d von 2 nM gegenüber einem mit einem K_d von 13 nM zu selektieren.
Die in diesem Beispiel verwendeten Oligonukleotide sind in der folgenden Liste angeführt:
OLIGONUKLEOTIDE
Phagen, die gegen Lysozym gerichtete scFv-Fragmente präsentieren, wurden aus in Plasmiden klonierten Fab-Fragmenten gewonnen.
Variable Regionen der schweren und leichten Kette wurden durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chaim reaction) aus Plasmiden, die "humanisierte", zur Herstellung von Fab-Fragmenten geeignete VH-CH1- und VK-CK-Inserte (von J. Foote zur Verfügung gestellt) amplifiziert. Die Dissoziationskonstante, K_d für verschiedene Kombinationen der zwei Plasmide, die als Fabs kombiniert werden, sind weiter unten gezeigt:
Primäre PCR
Die primäre PCR der variablen Regionen wurde durchgeführt, indem folgendes kombiniert wurde:
36,5 μl Wasser
5 μl PCR-Puffer (10 ×)
2 μl dNTP (5 mM)
2,5 μl Back oligo (10 pMol/μl) (VHBHD13APA oder VKBHD13)
2,5 μl Forward oligo (10 pMol/μl) (VHFHD13 oder VKFHD13NOT)
Die Reaktionslösung wird durch 5-minütige UV-Bestrahlung dekontaminiert, um fremde DNA zu zerstören, und 1 μl Plasmid-DNA zugegeben (0,1 μg/μl). Das PCR-Gemisch wurde mit 2 Tropfen Paraffinöl überschichtet und 5 Minuten lang auf einen PCR-Block mit 94°C gegeben, bevor 0,5 μl Taq-Polymerase unter das Paraffin zugegeben wurden. Die verwendeten Zyklusbedingungen waren 94°C 1 Minute, 40°C 1 Minute, 72°C 1,5 Minuten bei 17 Zyklen.
Der Linker (Gly₄-Ser)₃ wurde aus dem anti-phOx (2-Phenyloxazol-5-on)-Klon fd-CAT2-scFvNQ11 unter Verwendung der Oligos HD13BLIN und HD13FLIN3 mit 0,1 μg Plasmid-DNA amplifiziert. Die verwendeten PCR-Zyklen waren 94°C 1 Minute, 25°C 1,5 Minuten bei 17 Zyklen.
Die amplifizierte DNA wurde durch das Trennen der Proben auf einem 2%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt bei 90 mA, Ausschneiden der geeigneten Banden und Extrahieren der DNA mittels des Geneclean II Sets (BIO 101 Inc.) für VH und VK, oder durch den Einsatz von Spin-X-Filtern (Costar) für den Linker. Ein Endvolumen von 10 μl wurde verwendet, um die extrahierte DNA erneut zu suspendieren.
PCR-Assemblierung
Die Assemblierung der vier "humanisierten" Einzelketten-FvD1.3 (scFvHuD1.3)-Konstrukte erfolgte durch den Vorgang der "Assemblierung durch überlappende Erweiterung", Beispiel 11.
Es wurden folgendes kombiniert:
34,5 μl Wasser
5 μl PCR-Puffer (10 ×)
2 μl dNTP (5 mM)
2,5 μl Back oligo (10 pMol/μl) (VHBHD13APA)
2,5 μl Forward oligo (10 pMol/μl) (VKFHD13NOT)
Wiederum wird die Reaktionslösung wird durch 5-minütige UV-Bestrahlung dekontaminiert, bevor 1 μl der primären PCR-Produkte; VH-1 oder VH-2, VK-3 oder VK-4, sowie die Linker-DNA; zugegeben wird. Die Reaktionslösung wurde mit 2 Tropfen Paraffinöl überschichtet und 5 Minuten lang auf einen PCR-Block mit 94°C gegeben, bevor 0,5 μl Taq-Polymerase zugegeben wurden. Die verwendeten Zyklusbedingungen waren 94°C 1 Minute, 60°C 1,5 Minuten, 72°C 2,5 Minuten bei 20 Zyklen.
Die wäßrige Schicht unter dem Paraffin wurde einmal mit Phenol, einmal mit Phenol/Chloroform, einmal mit Ether extrahiert, mit Ethanol gefällt, und in 36 μl Wasser erneut suspendiert. Dazu wurden 5 μl 10 × Puffer für NotI, 5 μl 1 mg/ml BSA und 4 μl (40 U) NotI (New England Biolabs) gegeben. Die Restriktion wurde über Nacht bei 37°C inkubiert.
Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und in 36 μl Wasser erneut suspendiert; dazu wurden 5 μl 10 × NEB-Puffer 4,5 μl 1 mg/ml BSA und 2 μl (40 U) ApaLI (New England. Biolabs) gegeben. Dies wurde 5 Stunden lang bei 37°C inkubiert; weitere 2 μl ApaLI wurden zugegeben und die Reaktion bei 37°C über Nacht inkubiert.
Die geschnittene DNA wurde durch Gelreinigung auf einem 1,3%-Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt extrahiert, und dann mit Geneclean gehandelt, um die Insert-DNA zur Klonierung zu erhalten.
Der Vektor fdCAT2 (wie in Beispiel 15 hergestellt und mit ApaLI und NotI gespalten) und die scFv-DNA wurden wie in Beispiel 15 ligiert.
Analyse der Klone
Die Kolonien aus den Ligationen wurden zuerst mittels PCR-Screenen auf Inserts gescreent. Das PCR-Gemisch wurde in größerem Menge hergestellt, indem 14,8 μl 1 × PCR-Puffer, 1 μl dNTP (5 mM), 1 μl Back oligo (FDPCRBAK), 1 μl Forward oligo (FDPCRFOR), und 0,2 μl Taq-Polymerase pro gescreenter Kolonie kombiniert wurden. 20 μl-Aliquote dieses PCR-Gemisches wurden in eine 96-Napf-Techneplatte gegeben. Die Koloniespitze wurde mit einem Zahnstocher berührt und schnell im PCR-Gemisch gedreht und die Kolonie erhalten, indem der Zahnstocher in eine Cellwell-Platte (Nunc), die 250 μl 2 × TY Medium enthielt, gegeben wurde. Das PCR-Gemisch wird mit 1 Tropfen Paraffin überschichtet und die Platte auf einen Block mit 94°C 10 Minuten lang gegeben, bevor die Zyklen 94°C 1 Minute, 60°C 1 Minute, 72°C 2,5 Minuten durchgeführt.
Die so erhaltenen Klone wurden, wie unten dargestellt, bezeichnet. Die Affinität der scFv-Fragmente, die von den Fab-Fragmenten erhalten wurden, wurde nicht bestimmt, aber ältere Ergebnisse lassen vermuten, daß diese nahe daran liegen, jedoch nicht notwendigerweise identisch sind (R. E. Bird & B. W. Walker TIBTECH 9, 132–137, 1991).
Die Herstellung der Phagen und die ELISA waren wie in Beispiel 6 beschrieben. Es wurde gezeigt, daß die in fdCAT2 gebildeten Klone, wie erwartet, Lysozym binden.
Affinitätselektion
Selektion der Phagen, die sich mit der höchsten Affinität binden
Es wurden Mischexperimente durchgeführt, in denen der Phage fd-CAT2scFvD1.3 (Beispiel 14) entweder mit fd-CAT2TPB1, fd-CAT2TPB2 oder mit fd-CAT2TKPB4 gemischt wurde, und in einer Anreicherungsrunde verwendet wurde.
Das allgemein verwendete Verfahren zur Affinitätselektion durch Anreicherung ist das unten genau beschriebene. Jede Abweichung von dieser Arbeitsvorschrift wird am jeweiligen Punkt beschrieben. Die Anreicherungsplatten wurden zwischen den Manipulationen auf eine Schüttelplattform gestellt.
Falcon-35 mm-Gewebekulturplatten wurden über Nacht mit 1 ml Lysozym (verschiedene Konzentrationen), das in 50 mM NaHCO₃ pH 9,6 gelöst war, beschichtet und mit 2 ml 2% MPBS bei Raumtemperatur für 2 Stunden blockiert. Die Phagen wurden in 1 ml 2% MPBS vorbereitet und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Die Platten wurden 5 Minuten lang mit 2 ml der folgenden Lösungen gewaschen: 5 mal mit PBS, PBS-Tween, 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,5; 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 9,5; 500 mM NaCl, 50 mM NaHCO₃ pH 9,6; 500 mM NaCl. Die Elution der Phagen erfolgte dann durch Zugabe von 1 ml 100 mM Triethylamin und 5-minütiges Schütteln vor dem Entfernen des Eluats, das mit 100 μl 1,0 M Tris-HCl pH 7,4 neutralisiert wurde.
Die Platten wurden über Nacht mit Lysozym mit der unten angegebenen Konzentration beschichtet.
Die Kolonien aus einzelnen Anreicherungsrunde wurden entweder mit der Sonde MURDSEQ (für dfCATscFvD1.3) oder mit der Sonde HUMD13SEQ (für fdCAT2 TPB-Konstrukte) untersucht.
Nitrocellulosekreise (Schleicher & Schüll, BA 85, 0,45 μm) wurden mit Bleistift markiert, und sanft auf die Kolonien, die aus den Anreicherungsexperimenten erhalten wurden, gelegt und eine Minute liegen gelassen. Die Filter wurden dann schnell von einer Kante weggezogen und 5 Minuten lang mit der Kolonieseite nach oben auf ein Stück 3 MM-Papier (Whatman), das in Denaturierlösung geweicht war (500 mM NaOH; 1,5 M NaCl), gelegt. Sie wurden dann auf 3 MM, das in Neutralisierlösung (3,0 M NaCl; 500 mM Tris-HCl, pH 7,5) geweicht war, für 1 Minute überführt, und dann 1 Minute auf 3 MM, das in 5 × SSC; 250 mM Ammoniumacetat geweicht war. Die Filter wurden dann an der Luft getrocknet, bevor sie in einem Vakuumofen mit 80°C 30 Minuten lang getrocknet wurden.
Die Oligonukleotidsonde wurde durch Kombinieren der folgenden Lösungen hergestellt:
2 μl Oligonukleotid (1 pMol/μl)
2 μl γ-³²P-ATP (3000 Ci/mMol) (Amersham International plc)
2 μl 10 × Kinasepuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl₂; 10 mM DTT)
12 μl Wasser
2 μl Polynukleotid-Kinase (20 Units)
Dies wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Hybridisierung wurde im Techne HB-1-Hybridisierer durchgeführt. Die getrockneten Filter wurden bei 37°C in 40 ml Hybridisierungspuffer (10 ml 100 mM Natriumpyrophosphat; 180 ml 5,0 M NaCl; 20 ml 50 × Denhardt-Lösung; 90 ml 1,0 M Tris-HCl pH 7,5; 24 ml 250 mM EDTA; 50 ml 10% NP40; mit Wasser auf 1 Liter aufgefüllt 60,3 mg rATP; 200 mg Hefe-RNA (Sigma)) 15 Minuten lang vorhybridisiert und dann wurden 20 μl des kinasierten Oligonukleotids zugegeben. Die Filter wurden bei 37°C zumindest eine Stunde lang inkubiert, und dann 3mal 10 Minuten lang mit 50 ml 6 × SSC bei 37°C gewaschen (Waschung mit geringer Stringenz). Die Filter wurden luftgetrocknet, mit Saran-Umhüllung bedeckt und über Nacht einem Kodak X-AR-Film ausgesetzt.
Selektion von fd-CAT2scFvD1.3 aus fd-CAT2TPB4
33 faßt die Ergebnisse aus den Anreicherungsexperimenten mit einem Gemisch des Phagen fd-CAT2scFvD1.3 mit hoher Affinität (Kd-2 nM) und mit dem Konstrukt fd-CAT2TPB4 (Kd-52 nM) zusammen.
Bei einer Beschichtungskonzentration von 3000 μg/ml Lysozym konnte nur wenig oder keine Anreicherung erhalten werden. Es war jedoch möglich, eine Anreicherung für den scFvD1.3-Phagen zu erhalten, wenn eine niedrigere Lysozymkonzentration verwendet wurde, um die Platten zu beschichten. Der beste Anreicherungswert, der erhalten wurde, war von 1,5% fd-CAT2scFvD1.3 in Anfangsgemisch auf 33% fd-CAT2scFvD1.3 in der eluierten Fraktion, auf einer Platte, die über Nacht mit 30 μg/ml Lysozym geschichtet worden war.
Selektion von fd-CAT2scFvD1.3 aus fd-CAT2TPB1
Die Anreicherung für den scFvD1.3-Phagen mit hoher Affinität gegenüber dem fd-CAT2TPB1-Phagen (Kd-13 nM) konnte nur bei Experimenten gezeigt werden, bei denen die Platten über Nacht mit geringen Lysozymkonzentrationen geschichtet wurden, wie in 34 dargestellt ist.
Zusammenfassend wurden Einzelketten-Fv-Versionen einer Reihe von humanisierten D1.3-Antikörpern im Phagen fd konstruiert. Durch Affinitätsselektion von fd-CAT2-Phagengemischen, durch Anreicherung in kleinen Petrischalen, wurde gezeigt, daß der scFvD1.3-Phage mit hoher Affinität bevorzugt gegenüber einem Hintergrund von scFvHuD1.3-Phagen mit geringerer Affinität selektiert werden kann.
Beispiel 26
Bildung und Selektion von Mutanten eines anti-4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP)-Antikörpers, der auf Phagen exprimiert wird, unter Einsatz von Mutatorstämmen
Es ist manchmal wünschenswert, die Vielfalt eines in Phagen klonierten Genpools, z.B. ein Antikörpergenpool, zu erhöhen oder ein größere Anzahl an Varianten eine einzelnen klonierten Gens herzustellen. Es gibt viele geeignete in vitro-Mutagenese-Verfahren. Ein attraktives Verfahren, insbesondere zur Herstellung einer vielfältigeren Population einer Antikörpergenbibliothek, ist jedoch die Verwendung von Mutatorstämmen. Dies hat den Vorteil, daß eine sehr große Anzahl von Mutanten hergestellt wird, die im wesentlichen nur durch die handhabbare Anzahl der Phagen be schränkt wird. Das Phagenpräsentationssystem ermöglicht die volle Ausnützung dieser Anzahl, um verbesserte oder veränderte Klone zu isolieren.
Nukleotidsequenzen, die für ein gegen 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP) gerichtetes scFv-Antikörperfragment, scFvB18, kodieren, das wie in Beispiel 14 aus einem monoklonalen Antikörper gegen NP gewonnen wurde, wurden wie in Beispiel 11 mittels ApaLI- und NotI-Restriktionsstellen in fdCAT2 kloniert, um fdCAT1scFvB18 zu bilden, oder unter Verwendung von PstI- und NotI-Restriktionsstellen in fdDOGKan (fdCAT2, worin seine Tetracyclinresistenzgene entfernt und durch Kanamycinresistenzgene ersetzt wurden), um fdDOGKanscFvB18 zu bilden oder in den Phagemidvektor pHEN1 mit den Restriktionsstellen SfiI und NotI als Fusionsprotein mit Gen III, um pHEN1scFvB18 zu bilden.
Die folgenden Mutatorstämme (R. M. Schaaper & R. L. Dunn J. Mol. Biol. 262, 1627–16270, 1987; R. M. Schaaper Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85, 8126–8130, 1988) wurden verwendet:
Diese wurden von Dr. R. M. Schaaper zur Verfügung gestellt (Department of Health & Human Services, N1H, PO Box 12233, Research Triangle Park, N. C. 27709)
NR9046mutD5: NR9046 mutD5::Tn10
NR9046mutT1: NR9046 mutT1::Tn10
wurden gemäß Standardverfahren durch P1-Transduktion konstruiert. Die Mutatorstämme wurden mit fdCAT2scFvB18 oder fdDOGKanscFvB18 transfiziert und die Transfektanten nach ihrer Antibiotikaresistenz ausgewählt. Die Transfektanten wurden 24 Stunden lang bei 37°C wachsen gelassen, bevor die mutanten Phagen durch PEG-Fällung gewonnen wurden. Die mutanten Phagen wurden auf einer 1 ml NIP – (4-Hydroxy-3-iodo-5-nitrophenylessigsäure)-BSA-Sepharose-Affinitätssäule (die nach den Herstellerangaben hergestellt wurde), die mit 200 ml PBS vorgewaschen und mit 20 ml MPBS blockiert wurde, selektiert. Die Phagen wurden in 10 ml MPBS auf die Säule aufgebracht und nicht gebundenes Material erneut aufgegeben um eine vollständige Bindung sicherzustellen. Die Säule wurde nacheinander mit 10 ml MPBS und 500 ml PBS gewaschen. Die an die Affinitätsmatrix gebundenen Phagen wurden mit 5 Säulenvolumina 0,33 mM NIP-Cap (Beispiel 33) eluiert.
Das Phageneluat wurde 30 Minuten bis 1 Stunde mit E.coli-Mutatorstämmen in der log-Phase (2 × 10⁸ Zellen/ml) ohne Antibiotikaselektion inkubiert. Die infizierten Zellen wurden dann in 2 × TY 1:100 verdünnt und 24 Stunden lang mit Antibiotikaselektion gezüchtet (15 μg/ml Tetracyclin oder 30 μg/ml Kanamycin für fdCAT2scFvB18 bzw. fdDOGKanscFvB18). Die Phagen aus dieser Kultur wurden für eine weitere Affinitätsselektions- und Mutationsrunde verwendet.
Die Bindung der Phagenantikörper wurde mittels ELISA wie in Beispiel 8 untersucht, außer daß die ELISA-Platten mit NIP-BSA (4-Hydroxy-3-iodo-5-nitrophenylacetysl-BSA; 0,4 mg/ml) beschichtet wurden. Die Kulturüberstände wurden nach dem Wachstum in Cellwells wie in Beispiel 16 beschrieben vorbereitet und 20 μl Kulturüberstand jedem Napf zugegeben und mit MPBS auf 200 μl verdünnt.
Die Phagenproben, die im ELISA ein Signal ergaben, das mehr als das Doppelte des Hintergrunds betrug, wurden untersucht. Der ELISA erfolgte wie oben für die nicht spezifische Bindung an Lysozym, BSA oder Ox-BSA (Beispiel 9). Die Spezifität für NIP wurde weiters durch einen ELISA bestätigt, in dem Reihenverdünnungen von NIP-Cap zusammen mit Phagenantikörpern zugegeben wurden. Die Zugabe erhöhter Konzentrationen von NIP-Cap verringerte das Signal auf den Hintergrundwert.
Phagen, die im ELISA positive Signale ergaben, wurden sequenziert und 2 verschiedene Mutanten in den Phagemid pHEN1 subkloniert und in HB2151 zur löslichen Expression und in TG1 zur Phagenpräsentation transformiert (Beispiel 21).
Zur Expression der löslichen scFv-Fragmente wurden die Transformanten in E.coli HB2151 bei 37°C in einem Liter 2 × TY mit 0,2% Glucose, 0,1 mg/ml Ampicillin bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 1 gezüchtet und die Expression der löslichen scFv-Fragmente durch die Zugabe von IPTG auf 1 mM induziert. Die Kulturen wurden bei 30°C 16 Stunden lang geschüttelt.
Die löslichen scFvB18 wurden aus dem rohen bakteriellen Überstand in einer FLOWGEN-Ultrazentrifugationseinheit auf ein Volumen von 200 ml konzentriert.
Das Konzentrat wurde zweimal über eine 2 ml NIP-BSA-Sepharose-Säule geschickt, die mit 200 ml PBS vorgewaschen wurde. Die Säule wurde mit 500 ml PBS und 200 ml 0,1 M Tris pH 7,5, 0,5 m NaCl gewaschen und die Phagenantikörper mit 50 mM Citratpuffer pH 2,3 eluiert. Das Eluat wurde sofort mit 1 M Tris pH 8 neutralisiert. Das Eluat wurde mit zweimaligem Austausch gegen 1 Liter PBS, 0,2 mM EDTA dialysiert. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation bei 10.000 g entfernt und die Proteinausbeute durch Messung der Absorption des Überstands bei 280 nm bestimmt.
Nach 4 Mutations- und Selektionsrunden wurden die isolierten Klone gescreent und in einem oder zwei seltenen Beispielen wurden stark positive ELISA-Signale von Phagenantikörpern, die aus der Mutation sowohl von fdCAT2scFvB18 als auch fdDOGKanscFvB18 stammten, im ELISA erhalten. Diese Phagenantikörper, die stark positive ELISA-Signale ergaben, wurden in weiteren Runden um einen Faktor von etwa 2,5 pro Runde angereichert. Vierzig Phagenantikörper, die stark positive Signale ergaben, wurden sequenziert und sie zeigen jeweils einzelne Mutationen an sechs verschiedenen Stellen in den scFvB18-Nukleotidsequenzen, wobei sich fünf davon in der leichten Kette befinden. Mehr als 70% der Mutationen traten an den Positionen 724 und 725 auf, wobei das erste Glycin im J-Segment der leichten Kette (Gerüst 4) zu Serin (in 21 Fällen) oder Aspartat (in 3 Fällen) geändert wurde. Die Sequenz von scFvB18 ist in 37 gezeigt.
Die Nukleotidsequenzen, die für die scFv-Fragmente einer Gerüstmutante mit der obigen Glycin-zu-Serin-Mutation kodieren, sowie eine Mutante, worin Tyr in der CDR3 der leichten Kette zu Aspartat mutiert wurde, wurden durch PCR aus den Phagenantikörperklonen amplifiziert und in den Phagemid pHEN1 subkloniert (im wesentlichen wie in Beispiel 20). Damit vermeidet man mögliche Probleme mit durch die Mutatorstämme verursachten Gen III-Mutationen. Das selbe ELISA-Signalmuster war zu sehen, wenn die Mutanten nach dem Ergänzen des Phagemid mit dem Helferphagen (wie in Beispiel 20) auf Phagen präsentiert wurden, wie wenn die Mutanten untersucht wurden, wenn diese wie oben aus dem Phagengenom exprimiert wurden.
Die scFv-Fragmente aus scFvB18 und die scFv-Fragmente, die die Glycin-zu-Serin- bzw. die Tyrosin-zu-Aspartat-Mutationen enthalten, wurden bei 30°C in Lösung exprimiert (nach der Transformation in E.coli HB2151 wie in Beispiel 21). Sie zeigten keine Unterschiede in den ELISA-Signalen zwischen B18 vom Wildtyp und der Gerüstmutante. Das Signal, das vom Phagenantikörper mit der Mutation von Tyrosin zu Aspartat in CDR3 von scFv erhalten wurde, war etwa 10mal stärker. Es zeigte sich, daß die Expressionsausbeuten vergleichbar waren, wie durch Western-Blotten unter Verwendung eines Antiserums gegen g3p (wie oben beschrieben) festgestellt wurde. Affinitätsmessungen wurden mittels Fluoreszenzquenchen wie in Beispiel 18 durchgeführt. Die Affinitätsmessung von mit Affinität gereinigten scFv-Fragmenten zeigte jedoch, daß scFvB18 und die scFvB18-(Gly→Ser) und scFvB18-(Tyr→Asp) Mutanten eine vergleichbare Affinität von 20 nM für NIP-Cap aufweisen.
Ein Westernblot unter Einsatz eines anti-Gen III-Antikörpers zeigte, daß die Gerüstmutante deutlich weniger der proteolytischen Spaltung ausgesetzt war als scFvB18.
Daher ergibt die Verwendung von Mutatorstämmen einen vielfältigen Bereich von Mutanten in Phagenantikörpern, wenn diese als Wirte für Klone zur Gen III-Fusion verwendet werden. In diesem Fall zeigen einige der Klone wahrscheinlich aufgrund der erhöhten Stabilität gegenüber proteolytischem Angriff höhere ELISA-Signale. Die Mutatorstämme können daher verwendet werden, um Vielfalt in einen Klon oder eine Klonpopulation zu bringen. Diese Vielfalt sollte sollte Klone mit den erwünschten Eigenschaften, wie z.B. einer höheren Affinität oder Spezifität, ergeben. Solche Klone können dann nach der Präsentation der Proteine auf Phagen selektiert werden.
Beispiel 27
Eine auf PCR basierende Technik zur Ein-Schritt-Klonierung menschlicher scFv-Konstrukte
Die Assemblierung menschlicher scFv ist der in Beispiel 11 beschriebenen Assemblierung von scFvs aus Mäusen ähnlich. Um die PCR-Klonierung von menschlichen V-Genen zu entwickeln, war es notwendig, einen neuen Bereich der für den Menschen spezifischen Oligonukleotidprimer zu konstruieren (Tabelle 6). Die Assemblierung der menschlichen scFvs ist im wesentlichen die selbe wie die Bildung menschlicher Fabs, erfordert aber ein Set an FORWARD-Primern, die komplementär zu den J-Segmenten der VH-, VK- und Vλ-Genen sind. (Für Fabs werden FORWARD-Primern verwendet, die komplementär zur Konstantregion sind.) Die für das J-Segment spezifischen Primer wurden basieren auf den veröffentlichten JH-, JK- und Jλ-Sequenzen (Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4. Ausgabe. US-Department of Health and Human Services. 1987) konstruiert.
Zusätzlich wird ein anderer Linker für die scFvs benötigt als für Fabs, daher wurde für die menschlichen scFvs ein neues Set von Primern benötigt, um den Linker herzustellen. Primer, die komplementär zu den JH-Forward-Primern und den VK- und Vλ-Back-Primern sind, wurden synthetisiert, um die Bildung von Linker-DNA durch PCR-Amplifikation eins Plasmidtemplats, das den scFv-Linker enthält (Tabelle 6, 38), zu ermöglichen. Um eine ausreichende Amplifikation sicherzustellen, wurden die Primer in die tatsächliche Linkersequenz erweitert. Unter Verwendung dieser Primer zur Herstellung der Linker-DNA, wurden 52 getrennte PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei jeder der vier umgekehrten JH-Primer in Kombination mit jedem der 13 umgekehrten VK- und Vλ-Oligonukleotide verwendet wurde. Das Templat war etwa 1 ng pSW2scD1.3 (Ward, E. S. 19889, s.o.), das das kurze Peptid (Gly₄Ser)₃ enthält (Huston, J. S. et al., Gene, 1989, 77: 61).
Ein spezifisches Beispiel der PCR-Assemblierung einer menschlichen scFv-Bibliothek
Dieses Beispiel beschreibt die Bildung einer menschlichen Bibliothek von scFvs, die aus einem nicht immunisiertem Menschen hergestellt wurde:
500 ml Blut, die etwa 10⁸ B-Zellen enthalten, wurden von einem gesunden, freiwilligen Blutspender erhalten. Die weißen Blutkörperchen wurden auf Ficoll abgetrennt und die RNA wie in Beispiel 11 beschrieben isoliert.
20% der RNA, die das genetische Material von etwa 2 × 10⁷ B-Zellen enthalten, wurden zur cDNA-Isolierung verwendet. Die schweren Ketten, die aus IgG- oder IgM-Antikörpern stammen, wurden getrennt gehalten, indem die cDNA-Synthese entweder mit einem IgG-spezifischen Primer (HuIgG1-4CH1FOR) oder mit einem IgM-spezifischen Primer (HuIgMFOR) geprimt wurde. Aliquote der cDNA wurden verwendet, um vier getrennte scFv-Bibliotheken zu bilden (IgG-K, IgG-λ, IgM-K und IgM-λ). Die resultierenden Bibliotheken wurden auf 1,5%-Agarose gereinigt, elektroeluiert und mit Ethanol gefällt. Zum nachfolgenden Klonieren wurden die K- und λ-Bibliotheken kombiniert, wodurch sich getrennte IgG- und IgM-Bibliotheken ergaben.
Klonieren der Bibliothek:
Die gereinigten scFv-Fragmente (1–4 μg) wurden mit den Restriktionsenzymen NotI und entweder SfiI oder NcoI gespalten. Nach der Spaltung wurden die Fragmente mit Phenol/Chloroform extrahiert, und mit Ethanol gefällt. Die gespaltenen Fragmente wurden in entweder mit SfiI-NotI oder mit NcoI-NotI gespaltene, durch Agarosegelelektrophorese gereinigte pHEN1-DNA (6 μg) (siehe Beispiel 19) in einem 100 μl Ligationsgemisch mit 2.000 U T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Das Ligationsgemisch wurde durch Phenolextraktion gereinigt und mit Ethanol gefällt. Die ligierte DNA wurde in 10 μl Wasser erneut suspendiert und 2,5 μl-Proben in E.coli TG1 (50 μl) elektroporiert. Die Zellen wurden in 1 ml SOC 1 Stunde lang wachsen gelassen und dann auf 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 1% Glucose (AMP-GLU) in 243 × 243 mm-Platten (Nunc) ausplattiert. Nach dem Wachstum über Nacht wurden die Kolonien zur Lagerung bei –70°C als Stammbibliothek von den Platten in 10 ml 2 × TY gekratzt, das AMP-GLU und 15% Glycerin enthält.
Das Klonieren in mit SfiI-NotI und mit NcoI-NotI gespaltene pHEN1 ergab Bibliotheken von 10⁷ bzw. 2 × 10⁷ Klonen für die IgM-Bibliotheken und etwa 5 × 10⁷ Klonen für jede der beiden IgG-Bibliotheken.
Beispiel 28
Isolierung der Bindeaktivitäten aus einer Bibliothek von scFvs aus einem nicht immunisierten Menschen
Die Fähigkeit, Bindeaktivitäten aus Bibliotheken menschlicher Antikörper, die auf der Oberfläche von Phagen präsentiert werden, zu selektieren, könnte sich als noch wichtiger erweisen als die Isolierung von Bindeaktivitäten aus Mäusebibliotheken. Dies ist so, weil der Standardweg zur Bildung von Antikörpern über die Hybridom technik mit menschlichen Antikörpern nicht den selben Erfolg hatte wie jene bei Mäusen. Während es in einigen Fällen möglich ist, Bibliotheken aus immunisierten Menschen zu erhalten, zeigt es sich, daß es in vielen Fällen aufgrund der Toxizität oder der Nicht-Verfügbarkeit eines geeigeneten Immunogens oder aus ethischen Überlegungen nicht möglich ist, zu immunisieren. Alternativ dazu können Bindeaktivitäten aus Bibliotheken isoliert werden, die aus Individuen mit Krankheiten hergestellt wurden, in denen therapeutische Antikörper durch die Immunreaktion gebildet wurden. In vielen Fällen befinden sich die Antikörper-produzierenden Zellen jedoch in der Milz und sind nicht im im Kreislauf befindlichen Pool der peripheren Lymphozyten (das am leichtesten zugängliche Material zur Bildung einer Bibliothek) verfügbar. Zusätzlich kann es sein, daß in Krankheiten in Verbindung mit Immunsuppression keine therapeutischen Antikörper hergestellt werden.
Ein alternativer Ansatz wäre es, die Bindeaktivitäten aus einer Bibliothek die aus einem nicht immunisiertem Individuum hergestellt wurde, zu isolieren. Dieser Ansatz basiert auf Schätzungen, daß ein primäres Repertoire von 10⁷ verschiedenen Antikörpern mehr als 99% der Epitope mit einer Affinitätskonstante von 10⁵ M^–1 oder einer besseren erkennen sollte. Da es sein kann, daß dies keine Antikörper mit hoher Affinität ergibt, kann die Affinität durch die Mutation der V-Gene und/oder durch die Verwendung der isolierten VH-Domäne in einem hierarchischen Ansatz mit einer Bibliothek von leichten Ketten (oder umgekehrt) erhöht werden. In diesem Abschnitt zeigen die Anmelder die Durchführbarkeit dieses Ansatzes durch die Isolierung von spezifischen Antigenbindeaktivitäten gegen drei verschiedene Antigene aus einer Bibliothek von scFvs aus einem nicht immunisierten Menschen.
Materialien und Verfahren
Die in diesem Beispiel beschriebene Bildung der menschlichen scFv-Bibliothek, die für die Isolierung der Bindeaktivitäten verwendet wird, ist ausführlich in Beispiel 21 erklärt.
Schätzung der Vielfalt der ursprünglichen und der selektierten Bibliotheken:
Rekombinante Klone wurden vor und nach der Selektion durch PCR (Beispiel 15) mit den Primern LMB3 (der sich 5' von der pelB-Leadersequenz anordnet und identisch mit dem umgekehrten Sequenzierprimer (–40 n) von pUC19 ist) und fd-SEQ1 gescreent; dann folgte die Spaltung mit dem häufig schneidenden Enzym BstNI. Die Analyse von 48 Klonen aus jeder nicht selektierten Bibliothek zeigte, daß 90% der Klone Inserte hatten und die Bibliotheken schienen gemäß der Beurteilung durch das BstNI-Restriktionsmuster extrem vielfältig zu sein.
Ergänzung der Phagemidbibliotheken für Anreicherungsexperimente:
Um Phagemidteilchen aus der Bibliothek zu ergänzen, wurden 100 ml 2 × TY, das AMP-GLU (siehe Beispiel 27) enthält, mit 10⁹ Bakterien, die aus der Bibliothek (in Beispiel 27 hergestellt) entnommen wurden (etwa 10 μl), inokuliert und unter Schütteln bei 37°C 1,5 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen wurden abzentrifugiert (IEC-Zentrifuge, 4 K, 15 Minuten) und in 100 ml vorgewärmtem (37°C) 2 × TY-AMP-Medium erneut suspendiert, 2 × 10¹⁰ pfu VCS-M13 (Stratagene)-Teilchen zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang ohne Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden dann in 900 ml 2 × TY mit Ampicillin (100 μg/ml) und Kanamycin (25 μg/ml) (AMP-KAN) überführt und über Nacht unter Schütteln bei 37°C wachsen gelassen. Die Phagenpartikel wurden durch drei PEG-Fällungen (siehe Materialien und Verfahren) gereinigt und konzentriert und in PBS auf 10³ TU/ml (Ampicillin-resistente Klone) erneut suspendiert.
Anreicherung von phOx:BSA-Bindern durch Selektion in Röhrchen:
Zur Anreicherung wurde ein 75 × 12 mm Nunc-Immunröhrchen (Maxisorb; Cat. Nr. 4-44202) über Nacht bei Raumtemperatur mit 4 ml phOx:BSA (1 mg/ml; 14 phOx pro BSA in 50 mM NaHCO₃-Puffer pH 9,6) beschichtet. Nach drei Waschungen mit PBS wurde das Röhrchen 2 Stunden lang bei 37°C mit PBS, die 2% Marvel enthält, (2% MPBS) zum Blockieren inkubiert. Nach 3 Waschungen mit PBS wurden die Phagemidteilchen (10¹³ TU) in 4 ml 2% MPBS zugegeben, 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Drehtisch inkubiert und dann weitere 1,5 Stunden stehen gelassen. Die Röhrchen wurden dann mit 20 Waschungen mit PBS, 0,1% Tween 20 und 20 Waschungen mit PBS (jeder Waschschritt wurde durchgeführt, indem der Puffer hinein- und sofort wieder herausgeschüttet wurde) gewaschen. Die gebundenen Phagenpartikel wurden vom Röhrchen durch die Zugabe von 10 ml 100 mM Triethylamin pH 11,5 und 15-minütiges Drehen eluiert. Das eluierte Material wurde sofort durch die Zugabe von 0,5 ml 1,0 M Tris-HCl pH 7,4 neutralisiert und gevortext. Die Phagen wurden bei 4°C gelagert.
Die eluierten Phagen (in 1,5 ml) wurden verwendet, um 8 ml logarithmisch wachsende E.coli TG1-Zellen in 15 ml 2 × TY-Medium zu infizieren, und auf AMP-GLU-Platten wie oben ausplattiert, wobei sich durchschnittlich 10⁷ mit Phagen infizierte Kolonien ergaben.
Zur Selektion von phOx-Bindern wurde der Ergänzung-Röhrchenanreicherung-Ausplattieren-Zyklus 4mal wiederholt, wonach die Phagemidklone mittels ELISA auf Bindung untersucht wurden.
Anreicherung von Lysozymbindern durch Anreichern ("panning") und auf Säulen:
Eine Petrischale (35 × 10 mm Falcon 3001 Gewebekulturschale) wurde zur Anreicherung durch "panning" verwendet. Während aller Schritte wurden die Platten auf einer A600 Schüttelplatte (Raven Scientific) geschüttelt. Die Platten wurden über Nacht mit 1 ml Puteneiweißlysozym (3 mg/ml) in 50 mM NaHCO₃ (pH 9,6) beschichtet, 3mal mit 2 ml PBS gesachen und mit 2 ml 2% MPBS bei Raumtemperatur 2 Stunden lang blockiert. Nach 3 PBS-Waschungen wurden etwa 10¹² TU Phagenteilchen in 1 ml 2% MPBS zugegeben und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur schütteln gelassen. Die Platten wurden 5 Minuten lang mit 2 ml der folgenden Lösungen gewaschen: 5mal PBS, PBS-Tween (0,02% Tween-20), 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 500 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) + 500 mM NaCl, und abschließend 50 mM NaHCO₃ (pH 9,6). Die gebundenene Phagenpartikel wurden dann durch die Zugabe von 1 ml 100 mM Triethylamin pH 11,5 und 5-minütiges Schütteln eluiert, und dann mit 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert (wie oben). Alternativ dazu wurden 1 ml Puteneiweißlysozym-Sepharose-Säulen zur Affinitätsreinigung verwendet (McCafferty, J., et al., Nature 1990, 348: 552). Die Säulen wurden gründlich mit PBS gewaschen, mit 15 ml 2% MPBS blockiert, und die Phagen (10¹² TU) in 1 ml 2% MPBS aufgebracht. Nach dem Waschen mit 50 ml PBS, 10 ml PBS-Tween (PBS + 0,02% Tween 20), 5 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) + 500 mM NaCl, 5 ml Tris-HCl (pH 8,5) + 500 mM NaCl, 5 ml 50 Tris-HCl (pH 9,5) + 500 mM NaCl und abschließend 5 ml 50 mM NaHCO₃ pH 9,6. Die gebundenen Phagen wurden mit 1,5 ml 100 mM Triethylamin und mit 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert.
Zur Selektion von Puteneiweißlysozym-Bindern wurde der Ergänzung-Röhrchenanreicherung-Ausplattieren-Zyklus oder der Ergänzung-Säule-Ausplattieren-Zyklus 4mal wiederholt, wonach die Phagemidklone mittels ELISA auf Bindung untersucht wurden.
Ergänzung von einzelnen Phagemidklonen für ELISA:
Mit Klonen, die aus nach 4 Anreicherungsrunden eluierten, erneut infizierten und ausplattierten Phagenteilchen resultieren, wurden 150 μl 2 × TY-AMP-GLU in 96-Napf-Platten (Cell wells, Nunclon) beimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (250 Upm) wachsen gelassen. Ein 96-Napf-Platten-Replicator ("plunger") wurde verwendet, um mit etwa 4 μl der Über-Nacht-Kulturen auf der Anfangsplatte ("master plate") 200 μl frisches TY-AMP-GLU zu beimpfen. Nach 1 Stunde wurden 50 μl 2 × TY-AMP-GLU mit 10⁸ pfu VCS-M13 jedem Napf zugegeben, und die Platte 45 Minuten lang bei 37°C inkubiert und dann eine Stunde lang bei 37°C geschüttelt. Die Glucose wurde dann durch Abzentrifugieren der Zellen (4 K, 15 Minuten) und Belüften mittels einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernt. Die Zellen wurden in 200 μl 2 × TY-AMP-KAN (Kanamycin 50 μg/ml) erneut suspendiert und unter Schütteln bei 37°C 20 Stunden wachsen gelassen. Der nicht konzentrierte, Phagen-hältige Überstand wurde zur Analyse durch ELISA genommen.
ELISA
Die Analyse auf Bindung an phOX:BSA, BSA oder Lysozym wurde mittels ELISA (siehe Beispiel 9) durchgeführt, wobei 100 μg/ml phOX:BSA oder BSA, oder 3 mg/ml Puteneiweißlysozym zur Beschichtung verwendet wurden. Die Bestimmung der Kreuzreaktivität der isolierten Klone mit nicht verwandten Antigenen wurde ebenfalls mittels ELISA auf Platten, die mit 100 μg/ml eines nicht relevanten Antigens (Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin (KLH), Eialbumin, Chymotrypsinogen, Cytochrom c, Thyroglobulin, GAP-DH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase), oder Trypsininhibitor) beschichtet wurden, durchgeführt.
Charakterisierung von ELISA-positiven Klonen
Alle isolierten Antigen-spezifischen Klone wurden gegen ein Anzahl von nicht relevanten Antigenen wie oben beschrieben auf Kreuzreaktivität untersucht. Die Vielfalt der Klone wurde wie oben beschrieben mittels PCR-Screenen bestimmt und zumindest zwei Klone aus jedem Restriktionsmuster wurden mit dem Didesoxykettenabbruch-Verfahren sequenziert.
Ergebnisse
Isolierung und Charakterisierung von phOx:BSA-Bindern
Nach 4 Selektionsrunden wurden die für phOx:BSA ELISA-positiven Klone isoliert. Alle Klone stammten aus der IgM-Bibliothek. Von den 96 analysierten Klonen banden sich 43 Klone sowohl an phOx:BSA wie auch an BSA mit optischen Dichten im Bereich von 0,4 bis 1,3 (Hintergrund 0,125). Diese Klone werden als BSA-Binder bezeichnet. Die Bindung an BSA schien spezifisch zu sein, da keiner der 11 analysierten Klone ein Signal über dem Hintergrund ergab, wenn er in einem ELISA mit KLH, Eialbumin, Chymotrypsin, Cytochrom c, Lysozym, Thyroglobulin, GAP-DH oder Trypsininhibitor verwendet wurde. Alle Klone, die sich an BSA binden, hatten dasselbe BstNI-Restriktionsmuster und 14 Klone wurden vollständig sequenziert. Dreizehn der vierzehn Klone hatten dieselbe Sequenz, VH stammte aus einen menschlichen Gen der VH3-Familie und VL aus einem menschlichen Gen der Vλ3-Familie (Tabelle 1). Der andere BSA-Binder stammte aus einem menschlichen Gen der VH4-Familie und einem menschlichen Gen der Vk1-Familie (keine Daten gezeigt).
Es wurde ein Klon isoliert, der sich nur an phOx:BSA (OD 0,3) band, und der gebundene Phage konnte durch die Zugabe von 0,02 mM 4-ε-Aminocapronsäuremethylen-2-phenyl-oxazo-5-on (phOx-CAP) als Konkurrent ("competitor") vollständig verdrängt werden. Es wurde ebenfalls keine Bindung an die verschiedenen, nicht relevanten, oben beschriebenen Proteine über dem Hintergrund detektiert. Die Sequenz ergab ein VH aus einem menschlichen Gen der VH1-Familie und ein VL aus eine menschlichen Gen der Vλ1-Familie (Tabelle 7).
Isolierung und Charakterisierung von Lysozym-Bindern:
Nach 4 Selektionsrunden wurden für Putenlysozm 50 ELISA-positive Klone isoliert. Die Mehrheit der Klone, nämlich mehr als 95%, stammten aus der IgM-Bibliothek. Die Bindung an Lysozym schien spezifisch zu sein, da keiner der 11 analysierten Klone ein Signal über dem Hintergrund ergab, wenn er in einem ELISA mit KLH, Eialbumin, Chymotrypsin, Cytochrom c, Lysozym, Thyroglobulin, GAP-DH oder Trypsininhibitor verwendet wurde. Die Lysozym-bindenden Klone hatten 3 verschiedene BstNI-Restriktionsmuster und zumindest 2 Klone aus jedem Restriktionsmuster wurden vollständig sequenziert. Die Sequenzen zeigten das Vorhandensein von 4 einzigartigen menschlichen VH-VL-Kombinationen (Tabelle 7).
Zusammenfassung
Die Ergebnisse zeigen, daß Antigenbindeaktivitäten aus Repertoires von scFvs, die aus IgM-cDNA von menschlichen Freiwilligen, die nicht spezifisch immunisiert worden waren, isoliert werden kann.
Beispiel 29
Ergänzung der menschlichen IgM-Bibliothek unter Verwendung eines Helferphagen, dem das Gen 3 fehlt (δg3)
Dieses Beispiel beschreibt die Ergänzung von Gen 3-Fusionen aus einer menschlichen Bibliothek unter Verwendung eines Helferphagen mit einer Gen 3-Deletion.
100 μl der bakteriellen Stammlösung der IgM-Phagemidbibliothek, die wie beschrieben hergestellt wurde (Beispiel 27) und 5 × 10⁸ Bakterien enthält, wurden verwendet, um 100 ml 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose (TY/Amp/Glu) zu beimpfen. Die wurde bei 37°C 2,5 Stunden wachsen gelassen. 10 ml dieser Kultur wurden 90 ml vorgewärmtem TY/Amp/Glu zugegeben und die Infektion durch die Zugabe von 10 ml eines 200fachen Konzentrats des K07-Helferphagen, dem das Gen 3 fehlt (M13K07gIIIΔNr. 3) (Beispiel 24) und 1-stündiger Inkubation bei 37°C ohne Schütteln durchgeführt. Die Herstellung von M13K07gIIIΔNr. 3 war wie in Beispiel 24 beschrieben. Nach der 10-minütigen Zentrifugation bei 4.000 Upm wurden die Bakterien erneut in 100 ml 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin (ohne Glucose) suspendiert. Die Titration der Kultur an diesem Punkt ergab, daß es 1,9 × 10⁸ Bakterien gab, wie aufgrund ihrer Fähigkeit auf Platten zu wachsen, die sowohl Ampicillin (100 μg/ml) wie auch Kanamycin (50 μg/ml) enthaften, festgestellt wurde. Die Inkubation wurde für eine weitere Stunde unter Schütteln fortgesetzt, bevor die Bakterien in 2,5 Liter 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin, die sich in 5 2,5 Liter-Kolben befinden, überführt wurde. Diese Kultur wurde 16 Stunden inkubiert und der Überstand durch Zentrifugation gewonnen (10–15 Minuten bei 10.000 Upm in einer Sorvall RCSB-Zentrifuge bei 4°C). Die Phagenpartikel wurden durch die Zugabe von 1/5 des Volumens an 20% Polyethylenglycol, 2,5 M NaCl, dann bei 4°C 30 Minuten Stehenlassen und wie oben Zentrifugieren geerntet. Das resultierende Pellet wurde erneut in 40 ml 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4 suspendiert und die bakteriellen Zellreste durch Zentrifugation wie oben entfernt. Das Präparat der verpackten Phagemide wurde dann erneut gefällt, wie oben gesammelt und erneut in 10 ml 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA pH 7,4 suspendiert. Der Liter dieses Präparats enthielt 4,1 × 10¹³ transduzierende Einheiten/ml (Ampicillinresistenz).
Mit OX-BSA beschichtete Röhrchen wurden wie in Beispiel 30 zur Anreicherung (panning) der Phagemidbibliothek aus Beispiel 27 hergestellt. Die ergänzte Bibliothek wurde auch durch mit Rinderthyroglobulin (Sigma) beschichtete Röhrchen angereichert. Diese wurden über Nacht bei 37°C mit mit einer Konzentration von 1 mg/ml Thyroglobulin in 50 mM NaCO₃ pH 9,6 beschichtet. Die Röhrchen wurden mit PBS, die 2% Milchpulver (PBS/M) blockiert und 3 Stunden lang mit 1 ml der ergänzten Phagenbibliothek (dem Äquivalent von 250 ml Kulturüberstand), gemischt mit 3 ml PBS/M, inkubiert. Waschen, Elution, Neutralisation und Infektion waren wie in Beispiel 30.
Ergebnisse: Anreicherung (panning) mit Oxazolon-BSA
Die erste Anreicherungsrunde mit OX-BSA ergab 2,8 × 10⁶ Phagen. Eine große Bakterienplatte mit 1,4 × 10⁶ Kolonien, die aus diesem Eluat erhalten wurde, wurde in 10 ml 2 × TY, 20% Glycerin gekratzt, 10 Minuten geschüttelt und gelagert. Dies wurde auch verwendet, um eine frische Kultur zur Ergänzung mit M13K07gIIIΔNr. 3 zu beimpfen. (Bakterien und ergänzte Phagen, die aus der ersten Anreicherungsrunde mit OX-BSA stammen, werden mit OXPAN1 bezeichnet. Bakterien oder ergänzte Phagen, die aus der zweiten und dritten Anreicherungsrunde stammen, werden mit OXPAN2 bzw. OXPAN3 bezeichnet.) Die Ergänzung der Phagen mit M13K07gIIIΔNr. 3 nach jeder Anreicherungsrunde war im wesentlichen wie oben beschrieben, aber unter Verwendung von 5 ml-Volumina für die Anfangskulturen in TY/Amp/Glu, unter Einsatz von 1 ml Helferphagen und mit der Überführung in 100–500 ml 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin. Die zweite und dritte Anreicherungsrundenschritte waren wie oben für die erste beschrieben, aber mit Einsatz von 0,8–1,0 ml 100fach konzentrierter Phagen (das Äquivalent von 80–100 ml Kulturüberstand). Das Eluat aus der zweiten Anreicherungsrunde enthielt 8 × 10⁸ infektiöse Partikel und das Eluat aus der dritten Anreicherungsrunde enthielt 3,3 × 10⁹ infektiöse Partikel.
Anreicherung mit Thyroglobulin
Die erste Anreicherungsrunde mit Thyroglobulin ergab 2,52 × 10⁵ infektiöse Partikel. Die Hälfte des Eluats wurde verwendet, um 1,26 × 10⁵ bakterielle Klone auf einer großen Platte zu bilden. Diese Kolonien wurden in 10 ml 2 × TY, 20% Glycerin gekratzt, 10 Minuten geschüttelt, aliquotiert und gelagert. Diese Bakterien und daraus stammende ergänzte Phagen werden mit THYPAN1 bezeichnet, und verwendet, um eine frische Kultur zur Ergänzung mit M13K07gIIIΔNr. 3 zu beimpfen, um ein polyklonales ergänztes Phagenpräparat zu ergeben. Material, das auf ähnliche Weise aus Anreicherungen der zweiten und dritten Runde stammt, wurde mit THYPAN2 bzw. THYPAN3 bezeichnet. Die Anreicherungen mit Thyroblobulin in der zweiten und dritten Runde waren wie oben für die zweite und dritte Runde der Anreicherung mit OX-BSA beschrieben. Das Eluat aus der zweiten Anreicherungsrunde enthielt 8 × 10⁷ transduzierende Einheiten und das Eluat aus der dritten Anreicherungsrunde enthielt 6 × 10⁷ infektiöse Partikel.
ELISA-Screenen der durch Anreicherung erhaltenen Klone
40 Kolonien, die aus der dritten Anreicherungsrunde mit Thyroglobulin (THYPAN3) stammten, wurden in eine 96-Napf-Platte gegeben und über Nacht bei 37°C in TY/Amp/Glu wachsen gelassen. In ähnlicher Weise wurden 48 Kolonien aus zwei und 48 Kolonien aus drei Anreicherungsrunden mit OX-BSA gezüchtet (OX-PAN2 und OX-PAN3). Zur selben Zeit wurden polyklonale Phagen hergestellt. Am nächsten Tag wurden 5 μl aus jeder Kultur in 100 μl frisches vorgewärmtes TY/Amp/Glu überführt, 1,5 Stunden wachsen gelassen und M13K07gIIINr. 3 (2 × 10⁵ infektiöse Phagen pro Napf in 100 μl TY/Amp/Glu) zugegeben. Diese wurden eine Stunde lang ohne Schütteln bei 37°C inkubiert, mit 4.000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, erneut in 150 μl 2 × TY-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin suspendiert und eine weitere Stunde unter Schütteln inkubiert, bevor 2 ml Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin zugegeben wurden. Nachdem die Kulturen über Nacht gewachsen waren, wurden sie mit 4.000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, und die Überstände gesammelt. Die zum Screenen der THYPAN3-Klone verwendeten ELISA-Platten wurden bei 37°C über Nacht mit 200 μg/ml Thyroglobulin in 50 mM NaCO₃ pH 9,6 beschichtet. Die für OXPAN2 und OXPAN3 verwendeten Platten wurden über Nacht bei 37°C mit 200 μg/ml OX-BSA in PBS beschichtet.
120 μl des Kulturüberstandes wurden mit 5 × PBS, 10% Milchpulver gemischt und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang inkubiert. Die ELISAs wurden wie in Beispiel 13 durchgeführt.
Für Thyroglobulin waren 18 von 40 Klonen positiv (0,3–2,0 O.D. nach 30 Minuten). (Ein Phagenvergleich (Vektor pCAT3) ergab einen Wert von 0,07 O.D.). Zusätzlich waren positive Signale auch in den polyklonalen Phagenpräparaten THYPAN1 (0,314 O.D.) und THYPAN2 (0,189 O.D.) zu sehen, verglichen mit den aus der ursprünglichen, nicht angereicherten Bibliothek. stammenden Phagen (0,069 O.D.). Alle polyklonalen Phagen wurden mit PEG gefällt und in 10facher Konzentration verwendet.
Die PCR-Reaktionen und BstN1-Spaltungen wurden mit den positiven Klonen wie oben beschrieben durchgeführt und sechs verschiedene DNA-Fragmentmuster erhalten, was zeigt, daß zumindest sechs verschiedene Klone isoliert worden waren.
Bei OX-BSA waren nach zwei Anreicherungsrunden 30 von 48 Klonen im ELISA positiv und nach drei Runden 42 von 48. In einem getrennten Experiment wurde nach 30 Minuten ein positives Signal von den polyklonalen Phagenpräparaten OXPAN1 (0,988 O.D.) und OXPAN2 (1,717 O.D.) erhalten, verglichen mit den aus der ursprünglichen, nicht angereicherten Phagemidbibliothek stammenden Phagen (0,186 O.D.).
Spezifität der Klone für Thyroglobulin oder OX-BSA
Selektierte Klone (11 anti-Thyroglobulin, 5 anti-OX-BSA), wobei jeder ein unterschiedliches BstNI-Restriktionsspaltmuster darstellt, wurden auf ihre Bindung an nicht relevante Antigene untersucht. ELISA-Platten wurden mit Antigen (100 μg/ml in 50 mM NaCO₃ pH 9,6) durch Inkubation bei 37°C über Nacht beschichtet. Die Liste der Antigene besteht aus Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin, Hühnereilysozym, Rinderserumalbumin, Eialbumin, Chymotrypsinogen, Cytochrom c, GAP-DH (Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase), Trypsininhibitor, Rinderthyroglobulin und Oxazolon-BSA. Doppelproben des Phagenüberstandes (80 μl + 20 μl 5 × PBS, 10 Milchpulver) wurden jedem Antigen zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der ELISA wurde wie in Beispiel 13 durchgeführt.
Jeder der Thyroglobulin-spezifischen Klone (11 von 11) war für Thyroglobulin positiv (O.D. 0,12–0,76), zeigte aber nach 60 Minuten keine Bindung (O.D. < 0,03) an eines der nicht relevanten Antigene. In ähnlicher Weise hatten 3 der 5 OX-BSA-spezifischen Klone eine O.D. von 0,07–0,52, im Vergleich zu O.D.s < 0,02 für die nicht relevanten Antigene. Keiner der 5 Klone zeigte irgendeine Bindung an BSA alleine.
Somit können positive Klone nach nur 2 Anreicherungsrunden durch Ergänzen mit M13K07gIIIΔNr. 3 isoliert werden. Zusätzlich gibt es mit diesem Helferphagen eine größere Wahrscheinlichkeit für die Bildung von Phagenpartikel mit mehr als einem intakten Antikörpermolekül. Die erhöht möglicherweise die Avidität des Phagenantikörpers und ermöglicht die Isolierung von Klonen mit schwacher Affinität.
Beispiel 30
Änderung der Feinspezifität von auf Phagen präsentiertem scFvD1.3 durch Mutagenese und Selektion auf immobilisiertem Putenlysozym
Der D1.3-Antikörper bindet sich an Hühnereilysozym (HEL) mit einer Affinitätskonstante von 4,5 × 107 M^–1, hingegen bindet er sich an Puteneilysozym (TEL) mit einer Affinitätskonstante von < 1 × 10⁵ M^–1 (Harper et al., 1987, Molecular Immunology 24, S. 97–108, Amit et al., (1986) Science 233, S. 747–753).
Es wurde vermutet, daß der Grund dafür ist, daß der an der Position 121 von HEL vorhandene Glutaminrest (gln121) durch einen Histidinrest an der selben Stelle in TEL ersetzt ist. Somit kann die Mutagenisierung der D1.3-Antikörperreste, die mit gnl21 von HEL in Wechselwirkung stehen, die Bindung an TEL erleichtern.
Gemäß Amit et al., s.o., gibt es eine Wechselwirkung zwischen Tyrosin an der Position 32, Phenylalanin an der Position 91 und Tryptophan an der Position 92 der leichten Kette mit gln121 von HEL. Zusätzlich gibt es auch eine Wechselwirkung von Tyrosin an der Position 101 der schweren Kette. Es wird von keinem dieser Reste erwartet, daß er bei der Bestimmung der Hauptkettenkonformation der variablen Regionen des Antikörpers beteiligt ist. (Chothia and Lesk (1987), Journal of Molecular Biology 196, S. 901–917).
Mutagenese von pCAT3SCFvD1.3
Die Oligonukleotide mutL91,92 wurden hergestellt, um Phenylalanin an der Position 91 (L91) und Tryptophan an der Position 92 (L92) der leichten Kette statistisch abzuwandeln. Die Oligonukleotide mutL32 wurden hergestellt, um Tyrosin an der Position 32 der leichten Kette (L32) statistisch abzuwandeln, und die Oligonukleotide mut101 wurden hergestellt, um Tyrosin an der Position 101 der schweren Kette (H101) statistisch abzuwandeln.
mutL91,92:
mutL32:
mutH101:
(N stellt eine statistische Insertion gleicher Mengen von A, C, G oder T dar). Die in vitro-Mutagenese des Phagemidvektors pCAT3scFvD1.3 (Beispiel 12) mit dem Oligonukleotid mutL91,92 wurde unter Verwendung eines in vitro-Mutagenese Sets (Amersham) durchgeführt. Die resultierende DNA, wurde durch Elektroporation mit einem Bio-Rad-Elektroporator in TG1-Zellen transformiert. Es wurden 78.000 Klone erhalten und diese in 15 ml 2 × TY/20% Glycerin gekratzt. Dieser Pool wurde D1.3L91L92 genannt. Einsträngige DNA wurde durch Ergänzen mit M13K07 wie in Sambrook et al., 1989, s.o., hergestellt und mit dem Primer FDTSEQ1, unter Verwendung eines Sequenase-Sequenziersets (United States Biochemical Corporation) sequenziert.
Dies zeigte, daß die DNA erfolgreich mutagenisiert wurde, durch das Vorhandensein von Banden in allen vier DNA-Sequenzierbahnen an den Nukleotidpositionen, die für L91 und L92 kodieren, bestimmt wurde. Diese mutagenisierte einsträngige DNA wurde wie oben einer weiteren Mutageneserunde mit den Nukleotiden entweder mutL32 oder mutH101 unterzogen. Die Mutagenese mit mut32 ergab 72.000 Klone (der Pool wurde D1.3L32 genannt), während mutH101 102.000 Klone ergab (der Pool wurde D1.3H101 genannt). Diese Klone wurden in 2 × TY/20% Glycerin gekratzt. Einzelstrang-DNA aus jedem Pool wurde mit den Oligonukleotiden D1.3L40 bzw. LINKSEQ1 sequenziert, wie oben beschrieben, und es wurde gezeigt, daß diese korrekt statistisch abgewandelt war.
D1.3L40:
LINKSEQ1:
Herstellung von ergänzten Phagen zur Affinitätsreinigung
10–20 μl Bakterien, die aus jedem mutagenisiertem Pool stammen (von Platten abgekratzt), wurden zum Beimpfen von 5 ml TY/Amp/Glu verwendet. Alle Bakterien wurden bei 37°C wachsen gelassen. Nach 2–3 Stunden Wachstum wurde 1 ml zur Verdünnung in 5 ml vorgewärmtes TY/Amp/Glu gegeben und durch die Zugabe des in Beispiel 24 beschriebenen M13K07gIIIΔNr. 3-Präparats infiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurden die Kulturen bei 4.000 Upm 10 Minuten zentrifugiert, erneut in 2 × TY mit 100 μg/ml Ampicillin suspendiert, eine weitere Stunde inkubiert, dann in 500 ml 2 × TY mit 100 μg/ml Ampicillin und 50 μg/ml Kanamycin überführt und dies 16 Stunden wachsen gelassen. Die verbleibenden Phagenherstellungsschritte waren wie in Beispiel 29. Die Phagen wurden schließlich in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4 in 1/100 des ursprünglichen Kulturvolumens gelöst.
Affinitätsreinigung
100 ml Puteneilysozym mit einer Konzentration von 10 mg/ml in 0,1 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl pH 8,3 wurden dem selben Volumen an gequollener, mit Bromcyan aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) gemischt, kovalent gebunden und gemäß den Herstellerangaben gewaschen. Vor der Verwendung wurde diese Matrix (TEL-Sepharose) mit 100 Volumina PBS, gefolgt von 10 Volumina PBSM gewaschen. Die TEL-Sepharose wurde im gleichen Volumen PBSM erneut suspendiert, und 1 ml zu 1 ml eines 50fachen Phagenkonzentrats in PBSM gegeben und auf einer rotierenden Plattform 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die tatsächlich in diesem Schritt eingesetzten Phagen wurden hergestellt, indem gleiche Volumina der unabhängigen Präparate der drei statistisch abgewandelten Pools (D1.3L9L92, D1.3H101 und D1.3L32) vermischt wurden. Nach diesem Bindeschritt wurden die Suspensionen auf eine wegwerfbare Polypropylen-Säule (Poly-Prep-Säulen, Bio-Rad) aufgegeben und mit 200 Volumina PBS mit 0,1% Tween 20 gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden mit 1 ml 100 mM Triethylamin eluiert und mit 0,5 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert. Aus dem Eluat wurde eine Verdünnungsreihe her gestellt und zur Infektion von TG1-Zellen verwendet, die dann auf TY-Platten mit 100 μg/ml Ampicillin und 2% Glucose ausplattiert wurden. Die Platten, die etwa 106 Kolonien aufwiesen, wurden in 3 ml 2 × TY mit 20% Glycerin gekratzt und bei –70°C gelagert. 10 μl davon wurden zum Starten einer zweiten Kultivierungsrunde verwendet, die wie oben beschrieben mit M13K07gIIIΔNr. 3 ergänzt wurden (mit einem Endkulturvolumen von 100 ml). Die zweite und dritte Runde von Affinitätssäulenreinigungsschritten wurden wie oben für die erste beschrieben durchgeführt.
Analyse mittels ELISA
40 Kolonien, die aus der dritten Säulenreinigungsrunde auf TEL-Sepharose stammen, wurden in eine 96-Napf-Platte gegeben und über Nacht bei 37°C in 200 μl TY/Amp/Glu gezüchtet. Die Phagemidteilchen wurden ergänzt und für den ELISA wie in Beispiel 13 beschrieben vorbereitet. Die ELISA-Platten wurden über Nacht bei 37°C mit Hühnereilysozym (HEL) oder Puteneilysozym (TEL) mit einer Konzentration von 200 μg/ml in 50 mM NaCO₃ pH 9,6 beschichtet. Die ELISAs wurden wie in Beispiel 13 durchgeführt.
Nach 15-minütiger Inkubation in Substrat, zeigte sich, daß 13 Klone negativ waren (O.D. < 0,05 bei HEL und TEL). Bei allen positiven wurde ein Signal von 0,1–0,78 bei HEL erzielt mit Ausnahme von einem, wo das Signal bei HEL 0,078 betrug, jedoch brachte das Signal bei TEL (O.D. 0,169) diesen in die positive Gruppe. Das Vergleichsphagemidpräparat hatte ein prozentuelles Signalverhältnis TEL:HEL von 22%. Es wurde angenommen, daß die Klone eine unveränderte Bindung aufweisen, wenn das Verhältnis TEL:HEL weniger als 40% betrug. 9 Klone fielen in diese Kategorie. Es wurden 18 Proben gefunden, die eine veränderte Bindung mit einem Signalverhältnis von zwischen 40–200% aufwiesen.
Es wurden Verdünnungsreihen von 10 Klonen hergestellt, die mittels ELISA untersucht wurden. In 6 dieser Klone war das Bindungsprofil an HEL dasselbe wie im ursprünglichen Klon (pCAT2SCFvD1.3), während das Signal mit TEL verstärkt war (siehe 39, Klon B1). In den verbleibenden 4 Klonen wurde das mit TEL verstärkte Signal von einem Signalabfall mit HEL (siehe 39, Klon A4) begleitet.
Konkurrenz mit löslichem Antigen
Alle isolierten Klone behielten die Bindung an HEL in verschiedenem Ausmaß. Um zu bestimmen ob ein lösliches Antigen mit dem immobilisierten in Konkurrenz treten kann, wurde wie oben ein Parallelexperiment durchgeführt, aber vor der Inkubation mit dem Phagenpräparat wurde zur TEL-Sepharose Hühnereilysozym (1 mg/ml) zugegeben. Dieses Experiment wurde mit 3 Säulenreinigungsrunden durchgeführt und 40 Kolonien erhalten. Keiner dieser Klone band HEL oder TEL, was zeigt, daß das lösliche Antigen durch Konkurrenz erfolgreich die Bindung an das immobilisierte Antigen unterbunden hatte.
Beispiel 31
Modifikation der Spezifität eines Antikörpers durch Austausch der VLK-Domäne durch eine VLK-Bibliothek, die aus einer nicht immunisierten Maus stammt
Wenn eine Antikörperspezifität isoliert wird, ist es oft wünschenswert, einige seiner Eigenschaften zu verändern, insbesondere seine Affinität oder Spezifität. Dieses Beispiel zeigt, daß die Spezifität eines Antikörpers durch die Verwendung einer unterschiedlichen VL-Domäne, die aus einem Repertoire solcher Domänen stammt, geändert werden kann. Dieses Verfahren unter Verwendung der Präsentation auf Phagen wäre für die Verbesserung sowohl von existierenden monoklonalen Antikörpern wie auch von Antikörperspezifität, die von Phagenantikörper erhalten wurden, anwendbar. Dieses Beispiel zeigt, daß der Austausch der VL-Domäne von scFvD1.3, der spezifisch für Hühnereiweißlysozym (HEL) ist, mit einer Bibliothek von VL-Domänen die Selektion von scFv-Fragmenten, die sich auch an Puteneiweißlysozym (TEL) binden, ermöglicht. Allgemeiner gesagt zeigt dieses Beispiel, daß Antikörperspezifitäten durch den Austausch einer variablen Domäne modifiziert werden können, und gibt ein weiteres Beispiel des hierarchischen Ansatzes zur Isolierung von Antikörperspezifitäten.
Die schwere Kette von D1.3 wurde aus einem bestehenden Konstrukt (pSW1-VHD1.3, Ward et al., 1989, s.o.) mittels PCR unter Verwendung der Primer VH1BACK und VH1FOR amplifiziert, die Bibliothek der leichten Kette wurde aus der aus der Milz einer nicht immunisierten Maus erhaltenen cDNA-Bibliothek, die unter Verwendung der MJKFONX-Primer 1, 2, 4, 5 für den ersten Strang wie in Beispiel 11 synthetisiert wurde, amplifiziert. Die nachfolgende Amplifikation wurde mit denselben "forward"(vorwärts)-Primern und dem VK2BACK-Primer durchgeführt. Die PCR-Assemblierung der schweren Kette von D1.3 mit der Bibliothek der leichten Kette wurde durch den Signalketten-Fv-Linker wie in Beispiel 11 beschrieben vermittelt.
Die Klonierung der assemblierten PCR-Produkte (scFv-Sequenzen) wurden nach einem zusätzlichen PCR-Schritt ("pull-through") unter Verwendung eines BACK-Primers, der eine ApaLI-Stelle bereitstellt, und von forward-Primern, die wie in Beispiel 11 eine NotI-Stelle enthalten, durchgeführt. Mit ApaLI/NotI gespaltene PCR-Fragmente wurden in den ebenso gespaltenen Vektor fdCAT2 kloniert. Nach Elektroporation der Ligationsreaktion in MC1061-Zellen wurden 5 × 10⁵ Transformationen erhalten.
Das Screenen der Phagenbibliothek nach TEL-Bindern wurde durch Anreicherung (panning) durchgeführt. Falcon 2058-Polystyrolröhrchen wurden (16 Stunden lang) mit 2 ml TEL-PBS (3 mg/ml) beschichtet und mit 4 ml MPBS (PBS mit 2% Magermilchpulver) blockiert. Aus der Bibliothek erhaltene Phagen (5 × 10¹⁰ transduzierende Einheiten) in 2 ml MPBS (2%) wurden 2 Stunden lang in diesen Röhrchen bei Raumtemperatur inkubiert. Die Röhrchen wurden 3 × mit PBS, 1 × mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 0,5 M NaCl; 1 × mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,5) 0,5 M NaCl; 1 × mit 50 mM Tris-HCl (pH 9,5) 0,5 M NaCl gewaschen. Schließlich wurden die Phagen mit 100 mM Triethylamin eluiert. Die eluierten Phagen wurden verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren, die Zellen wurden auf 2 × TY-Platten mit 15 μg/ml Tetracyclin ausplattiert und 16 Stunden lang wachsen gelassen. Die Kolonien wurden in 25 ml 2 × TY-Medium gekratzt und die Phagen durch PEG-Fällung erhalten. Nach einer zweiten Selektionsrunde auf TEL-Binder wurden wie in Beispiel 2 beschrieben ELISAs durchgeführt.
Die Analyse von 100 Klonen aus der Bibliothek durch ELISA auf mit TEL beschichteten Platten zeigte vor der Affinitätsselektion keine Binder. Im Gegensatz dazu zeigten etwa 10% der Phagenklone nach zwei Selektionsrunden auf TEL-bindende Phagen positive ELISA-Signale. Die ELISA-Signale galten als positiv, wenn die Werte um zumindest das Zweifache höher als die des fdCAT2-Vektors ohne Insert waren. Eine genauere Analyse der Bindeeigenschaften der TEL-bindenden Phagen ist in 40 gezeigt.
Wie in 40 gezeigt, wurden einige Klone gefunden, die sich im Gegensatz zum ursprünglichen D1.3 scFv, der sich fast ausschließlich an HEL bindet, in gleichem Ausmaß an TEL und HEL binden. Keiner der Klone band sich an BSA. Diese Entdeckungen zeigen, daß die Spezifität dieser scFvs im Vergleich zu D1.3 breiter ist, da beide Lysozyme (TEL und HEL) erkannt werden, daß aber die Spezifität für Lysozym beibehalten wurde, da BSA nicht erkannt wurde. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen (durch DNA-Sequenzieren erhalten) von zwei leichten Ketten aus den Klonen MF1 und M21, die den Klonen 3 und 9 in 40 entsprechen, sind in 41 dargestellt.
Im Fall von isolierten Antikörpern kann der in dieser Untersuchung beschriebene Ansatz besonders nützlich sein, wenn die Erkennung eines weiteren Bereich verschiedener, aber eng verwandter Antigene erwünscht ist. Beispielsweise sind monoklonale Antikörper gegen virale Antigene wie die V3-Schleife des HIV1-gp 120 in den meisten Fällen aufgrund der Variabilität in diesem Teil des HIV1-env-Gens ziemlich spezifisch für ein bestimmtes Virusisolat. Die Modifikation solcher Antikörper auf die in diesem Beispiel beschriebene Weise könnte zu Antikörpern führen, die mit einem größeren Bereich von HIV-1-Isolaten kreuzreagieren, und wäre daher möglicherweise von hohem Wert für die Therapie und Diagnose.
Ein ähnlicher Ansatz könnte durchgeführt werden, bei dem die variable Region der leichten Kette mit den erwünschten Eigenschaften fixiert gehalten wird und mit einer Bibliothek von variablen Domänen der schweren Kette kombiniert wird. Einige schwere Ketten, beispielsweise VHD1.3 behalten ihre Bindeaktivität als Einzeldomänen bei. Dies könnte zu einer Strategie führen, worin VH-Domänen, wenn sie auf Phagen exprimiert werden, auf Bindeaktivität gescreent werden, und dann die bindenden Domänen mit einer Bibliothek von VL-Domänen zur Selektion von geeigneten Leichtkettenpartnern kombiniert werden.
Beispiel 32
Selektion einer Phagenantikörperspezifität durch die Bindung an ein Antigen das an magnetischen Perlen befestigt ist. Die Verwendung eines spaltbaren Reagens um die Elution der gebunden Phagen unter milden Bedingungen zu ermöglichen.
Wenn sich ein Phagenantikörper mit hoher Affinität oder Avidität an sein Antigen bindet, kann es sein, daß es nicht möglich ist, den Phagenantikörper mit einem dem Antigen verwandten Molekül von der Affinitätsmatrix zu eluieren. Alternativ dazu kann es sein, daß es kein geeignetes spezifisches Molekül zur Elution gibt, das in ausreichend hoher Konzentration hergestellt werden kann. In diesen Fällen ist es notwendig, ein Elutionsverfahren zu verwenden, das nicht für den Antigen-Antikörper-Komplex spezifisch ist. Leider zerstören einige der nicht spezifischen Elutionsverfahren die Phagenstruktur, beispielsweise nimmt die Phagenlebensfähigkeit bei pH 12 mit der Zeit ab (Rossomando, E. F. and Zinder, N. D. J. Mol. Biol. 36, 387–399, 1968). Es wurde daher ein Verfahren entwickelt, das die Elution von gebundenen Phagenantikörpern unter milden Bedingungen (Reduktion einer Dithiol-Gruppe mit Dithiothreitol), die die Phagenstruktur nicht zerstören, ermöglicht.
Das Zielantigen wurde mit einem spaltbaren Biotinylierungsreagens biotinyliert. Mit 2-Phenyl-5-oxazolon (O. Makela et al., s.o.) konjugiertes BSA wurde unter Verwendung eines Biotinylierungsreagens mit einer spaltbaren Dithiol-Gruppe (Sulfosuccin imidyl-2-(biotinamido)ethyl-1,3-dithiopropionat von Pierce) gemäß den Herstellerangaben modifiziert. Diese biotinylierte Antigen wurde an mit Streptavidin beschichtete magnetische Perlen (Dynal) gebunden und der Komplex verwendet, um Phagen zu binden. Die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Perlen wurden mit Antigen vorbeschichtet, indem 650 μg biotinyliertes OX-BSA in 1 ml PBS mit 200 μl Perlen zumindest eine Stunde lang bei Raumtemperatur vermischt wurde. Ein Vierzigstel des Komplexes (äquivalent mit 5 μl Perlen und einem Input von 17,5 μg OX-BSA) wurden zu 0,5 ml Phagen in PBSM (PBS mit 2% Magermilchpulver) mit 1,9 × 10¹⁰ Phagenteilchen gegeben, und in den in Tabelle 8 gezeigten Verhältnissen von pAbD1.3, der gegen Lysozym (Beispiel 2) gerichtet ist, zu pAbNQ11, der gegen 2-Phenyl-5-oxazolon gerichtet ist, vermischt.
Nach 1-stündiger Inkubation unter Mischen bei Raumtemperatur wurden die magnetischen Perlen unter Verwendung einer Dynal MPC-E Magnettrennvorrichtung wiedergewonnen. Sie wurden dann in PBS mit 0,5% Tween 20 (3 × 10 Minuten, 2 × 1 Stunde, 2 × 10 Minuten) gewaschen und die Phagen durch 5-minütige Inkubation in 50 μl PBS mit 10 mM Dithiothreitol eluiert. Das Eluat wurde verwendet, um TG1-Zellen zu infizieren und die resultierenden Kolonien wurden mit dem Oligonukleotid NQ11CDR3 (5'-AAACCAGGCCCCGTAATCATAGCC-3'), das aus CDR3 des NQ11-Antikörpers (dieser hybridisiert mit pAbNQ11, aber nicht mit pAbD1.3) stammte.
Eine 670fache Anreicherung von pAbNQ11 (Tabelle 8) wurde von einem Hintergrund von pAbD1.3 in einer einzigen Anreicherungsrunde unter Verwendung des Äquivalents von 17,5 μg biotinyliertem OX-BSA erreicht.
Dieser Elutionsvorgang ist nur ein Beispiel eines Elutionsvorgangs unter milden Bedingungen. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren wäre der Einbau einer Nukleotidsequenz, die für Aminosäuren kodiert, welche eine Erkennungsstelle für die Spaltung durch eine hochspezifische Protease darstellen, zwischen den fremden, insertierten Gen, in diesem Fall ein Gen für ein Antikörperfragment, und der verbleibenden Sequenz des Gen III. Beispiele für solch hochspezifische Proteasen sind Faktor X und Thrombin. Nach der Bindung des Phagen an die Affinitätsmatrix und der Elution zur Entfernung von nicht spezifisch bindenden und schwach bindenden Phagen würde der stark bindende Phage durch das Waschen der Säule mit einer Protease unter Bedingungen, die zur Spaltung der Spaltstelle geeignet sind, entfernt werden. Dies würde das Antikörperfragment vom Phagenpartikel abspalten und den Phagen eluieren. Es wäre zu erwarten, daß diese Phagen infektiös sind, da die einzige Proteasestelle die eine spezifisch eingebaute sein sollte. Die stark bindenden Phagen könnten dann durch Infektion von z.B. E.coli TG1-Zellen wiedergewonnen werden.
Beispiel 33
Verwendung der Zellenselektion, um einen angereicherten Pool von Antigenspezifischen Antikörpergenen bereitzustellen, Anwendung, um die Komplexität der Repertoires der Antikörperfragmente, die auf der Oberfläche von Bakteriophagen präsentiert werden, zu verringern
Es gibt etwa 10¹⁴ verschiedene Kombinationen der leicht und schweren Ketten, die aus der Milz einer immunisierten Maus stammen. Wenn der statistische kombinatorische Ansatz verwendet wird, um Fragmente der schweren und leichten Ketten in einen einzelnen Vektor zur Präsentatoin von scFv-, Fv- oder Fab-Fragmenten auf Phagen kloniert werden, ist es kein praktischer Vorschlag, alle 10¹⁴ Kombinationen zu präsentieren. Ein Ansatz zur Reduktion der Komplexität, der in diesem Beispiel beschrieben ist, ist es, nur Gene aus nach Antigen selektierten Zellen zu klonieren.
Das Immunsystem nützt die Bindung von Antigen durch Oberflächenimmunglobuline, um die Zellenpopulation auszuwählen, die mit der Herstellung spezifischer Antikörper reagieren. Dieser Ansatz zur Auswahl Antigen-bindender Zellen wurde untersucht, um die Anzahl der kombinatorischen Möglichkeiten zu verringern und so die Chance, die ursprüngliche Kombination von schweren und leichten Ketten zu erhalten, zu erhöhen.
Die Immunreaktion auf das Hapten 4-Hydroxy-3-nitrophenylessigsäure (NP) wurde ausführlich untersucht. Da die primäre Immunreaktion auf NP nur eine einzige leichte Kette nützt, konnten die Anmelder die Verwendung des kombinatorischen Verfahrens mit einer fixierten leichten Kette und einer Bibliothek von schweren Ketten untersuchen, um die Häufigkeiten der Gene, die für Antikörper, die sich an NIP (4-Hydroxy-3-iod-5-nitrophenylessigsäure) binden, zu untersuchen. Die Anmelder nutzten somit dieses System, um die Vorteile der Auswahl von Zellpopulationen vor der Herstellung kombinatorischer Bibliotheken zur Präsentation auf Phagen zu untersuchen.
Verfahren
2.1 Haptenkonjugate
Hühner-γ-Globulin (CGG, Sigma, Poole, UK) und Rinderserumalbumin (BSA, Böhringer-Mannheim, Deutschland) wurden mit NP-O-Succinimid oder NIP-Caproat-O-Succinimid (Cambridge Research Biochemicals, Northwich, UK) basierend auf dem Verfahren, das von Brownstone (Brownstone, A. Mitchison, N. A. and Pitt-Rivers, R. Immunology 1966, 10: 465–492) beschrieben wurde, konjugiert. Die aktivierten Verbindungen wurden in Dimethylformamid gelöst und zu Proteinen in 0,2 M NaHCO₃ zugegeben. Diese wurden unter konstantem Rühren 16 Stunden lang vermischt und dann unter mehrfachem Wechseln gegen 0,2 M NaHCO₃ dialysiert. Sie wurden schließlich gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert (PBS). Die hergestellten Konjugate waren NP₁₂CGG, NIP₁₀BSA. Das NIP₁₀BSA-Derivat wurde darauffolgend unter Verwendung eines von Amersham gelieferten Biotinylierungssets (Amersham International, Amersham, UK) biotinyliert.
2.2 Tiere und Immunisierung
Mäuse des Stammes C57BL/6 wurden durch intraperitoneale Injektion von 100 μg NP-CGG in vollständigem Freund-Adjuvans im Alter von 10 Wochen immunisiert.
2.3 Milzaufarbeitung
Sieben Tage nach der Immunisierung wurden die Milzzellen wie von Galfre und Milstein (Galfre, G., and Milstein, C., Methods Enzymol. 1981. 73: 3–46) beschrieben, aufgearbeitet. Die roten Zellen ("red cells") wurden mit Ammoniumchlorid (Boyle, W., Transplantation 1968. 6: 71) lysiert und nach der Durchführung der Zellenselektion wurden die toten Zellen nach dem Verfahren von Böhmer und Shortman (Böhmer, H., and Shortman, K., J. Immunol. Methods 1973. 1: 273) entfernt. Die Zellen wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), 1% Rinderserumalbumin, 0,01% NaN3 suspendiert; die Zellen wurden während des gesamten Zellselektionsvorgangs in diesem Medium auf 4°C gehalten.
2.4 Zelllösung
Biotinyliertes NIP-BSA wurde an mit Streptavidin gekuppelte magnetische Perlen (Dynabeads M280 Streptavidin, Dynal, Oslo, Norwegen) gekuppelt, indem 10⁸ Perlen mit 100 μg biotinyliertem Protein eine Stunde lang mit gelegentlichem Rühren inkubiert wurden und dann fünfmal gewaschen wurden um ungebundenes Antigen zu entfernen. Die gekuppelten Perlen wurden bis zur Verwendung in Medium bei 4°C aufbewahrt. Zur Selektion der Antigen-bindenden Zellen wurden die Zellen (2–4 × 10⁷/ml) zuerst 30 Minuten mit nicht gekuppelten Perlen in einem Perlen:Zellen-Verhältnis von 1:1 inkubiert. Die Perlen wurden dann getrennt, indem das Röhrchen für 3–5 Minuten in eine Magnetvorrichtung (MPC-E Dynal) gegeben wurde. Die ungebundenen Zellen wurden entfernt und dann mit an NIP-BSA gekuppelten magnetischen Perlen in einem Perlen:Zellen-Verhältnis von 0,1:1 60 Minuten lang mit gelegentlichem Rühren inkubiert. Die Perlen und die rosettenförmigen Zellen wurden wie oben beschrieben getrennt. Die Perlen wurden dann in 1 ml Medium erneut suspendiert und die Trennung wiederholt; dieser Vorgang wurde 5–7mal wiederholt, bis bei der Zählung mit einem Hämozytometer keine Zellen mehr nachgewiesen werden konnten.
Für die Ablösung ("depletion") der Zellen mit Oberflächenimmunglobulinen wurden die Zellen mit 20 mg biotinyliertem mehrwertigem anti-Maus-Immunglobulin aus Ziegen (Sigma, Poole, UK) inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit Medium gewaschen und mit einem Perlen:Zellen-Verhältnis von 30:1 zu an Streptavidin gekuppelte magnetische Perlen zugegeben. Nach 30 Minuten Inkubation wurden die Perlen und die rosettenförmigen Zellen durch 3maligen Gebrauch der Magnetvorrichtung getrennt, wobei jedesmal der Überstand genommen wurde.
2.5 DNA/cDNA-Herstellung, PCR-Amplifikation und Klonieren
DNA wurde durch ein einfaches Proteinase-K-Spaltverfahren, das insbesondere für geringe Zellzahlen günstig ist (PCR-Protocols: A Guide to Methods and Applications. Hrsg. Innis M. A., Gelfand D. H., Sninsky J. J. und Whit T. J., Academic Press), isoliert. Die RNA-Isolierung und nachfolgende cDNA-Synthese wurden wie von Gherardi et al. (Gherardi, E., Pannell, R. und Milstein, C., J. Immunol. Methods, 1990. 126: 61–68) durchgeführt. Die PCR und das Klonieren der Bibliotheken der schweren Kette wurden unter Verwendung der von Ward et al. (Ward, E. S., Güssow, D., Griffiths, A. D., Jones, P. T. and Winter, G., Nature, 1989. 341: 544–546) beschriebenen Primer und Bedingungen durchgeführt. Die verwendeten VH- und Fv-Expressionsvektoren wurden den bereits von Ward et al. beschriebenen angepasst. Sie wurden beide in pUC119 (Vieira and Messing, siehe weiter unten) subkloniert und der Fv-Expressionsvektor wurde dahingegend modifiziert, daß er eine leichte Kette der Keimlinie λ1 (von T. Simon zur Verfügung gestellt (ursprünglich von Siegfried Weiss, Basel, Immunologie-Institut, kloniert)) umfaßt. Der Vektor ist in 42 gezeigt.
2.6 Expression und ELISA
Zum Screenen wurden einzelne Kolonien in einzelne Näpfe von Mikrotiterplatten (Bibby) in 200 μl 2 × TY/100 μg/ml Ampicillin/0,1% Glucose gegeben und dann unter Rühren 5–6 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG, Sigma, Poole, UK) wurde dann auf eine Endkonzentration von 1 mM zugege ben und die Inkubation für weitere 16 Stunden bei 16°C fortgesetzt, bevor die Überstände geerntet wurden. Die Näpfe von Falcon-ELISA-Platten (Becton Dickinson, N. J., USA) wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit NIP₁₀-BSA (40 μg/ml in PBS) beschichtet und dann mit 2% Magermilchpulver in PBS 2 Stunden lang blockiert. Die bakteriellen Überstände wurden zugegeben, und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und dann wurden die Platten dreimal mit PBS blockiert. An Peroxidase konjugierte anti-Maus-λ-Kette aus Ziegen (Southern Biotechnology, Birmingham, USA) wurde zugegeben und erneut 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach sechs Waschungen mit PBS und die Entwicklung mit 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma, Poole, UK) als Peroxidasesubstrat erfolgen. Die optische Dichte bei 405 nm unter Einsatz eines Thermomax-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, Menlo Park, USA) nach 30 Minuten abgelesen. Western-Blotten erfolgte unter Verwendung des C-terminalen myc tag wie in Beispiel 21.
3.1 Vergleich von RNA/DNA und mit Antigen selektierten Zellen
Die Ergebnisse der Antigenselektion sind in Tabelle 13 gezeigt. Weniger als 1% der Zellen binden sich an mit NIP-BSA beschichtete Perlen und die nicht spezifische Bindung ist sehr gering. Die Bestimmung des Anteils der exprimierten Gene aus jeder VH-Bibliothek mittels Western-Blot zeigte, daß VH-Domänen in der vollen Länge in 95% aller Klone exprimiert wurden, wenn RNA als Ausgangsmaterial verwendet wurde, aber nur 60% (12/20) der Klone, wenn DNA (entweder selektierte Zellen oder von der ganzen Milz) als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Dieser Unterschied resultiert wahrscheinlich aus der Tatsache, daß viele neu angeordnete Pseudogene mit den Primern der Anmelder amplifiziert werden könnten und es schein so zu sein, daß es auf der Ebene der Transkription einen gewissen Selektionsgrad nach funktionellen Genen geben muß.
Eine variable Anzahl an Klonen aus jedem Bibliothekstyp wurde zur Herstellung von Fv-Fragmenten, die sich an NIP banden, gescreent. Es wurden zu Beginn Screen-ELISAs durchgeführt und die positiven genommen, um jene mit einer optischen Dichte von zumindest dem Zweifachen des Hintergrunds zu umfassen. Die anfangs Positiven wurden erneut transformiert und die Bindung doppelt überprüft; es wurde bestätigt, daß die Bindung für NIP spezifisch war und für BSA nicht. Die Häufigkeit von bestätigten, NIP-bindenden positiven Klonen ist für jedes Ausgangsmaterial in Tabelle 10 gezeigt. Die Verwendung von DNA als Ausgangsmaterial zur PCR-Amplifikation ist etwa äquivalent zum Probennehmen von Zellen, da es nur ein funktionelles, neu angeordnetes Gen der schweren Kette und zumeist ein neu angeordnetes Pseudogen pro B-Zelle gibt. Das Amplifizieren aus der RNA eines Tieres beeinflußt das Repertoire in Richtung der reagierenden Zellen, und in einem kurz davor immunisierten Tier würde man erwarten, daß dies einige Nachteile für das Antigen ergibt. Aus den Daten in Tabelle 10 geht klar hervor, wie wirkungsvoll diese Selektion- mit der Anzahl der Antigen-spezifischen Gene ist, welche um zumindest das 96fache angereichert werden, wenn RNA, die eine Woche nach der primären Immunisierung hergestellt wurde, als Ausgangsmaterial verwendet wird. Die Daten zeigen auch, daß die Selektion nach Antigen-bindenden Zellen ein alternatives wirkungsvolles Selektionsverfahren für das erforderliche genetische Ausgangsmaterial ist.
3.2 Vergleich der gesamten Milz/Milz mit abgelöstem Oberflächenimmunglobulin
Um die zelluläre Basis der durch die Verwendung von RNA als Ausgangsmaterial erreichten Selektion zu untersuchen, wurde die Milz von Oberflächenimmunglobulin-positiven Zellen unter Verwendung von biotinyliertem anti-mehrwertigen Immunglobulin und von mit Streptavidin konjugierten magnetischen Perlen. die vorherige FACS-Analyse hatte gezeigt, daß dieses Verfahren mehr als 96% der Oberflächenimmunglobulin-positiven Zellen entfernt. RNA wurde sowohl aus Fraktionen, denen das Oberflächenimmunglobulin abgelöst wurde, als auch von abgelösten Fraktionen einer Milz isoliert und aus jeder VH-Bibliotheken hergestellt. Die ELISA-Ergebnisse (Tabelle 10) zeigen die Anzahl von Positiven durch diese Ablösung sicher nicht abnimmt, was vermuten läßt, daß der Hauptteil der selektiven Wirkung der Verwendung von RNA aus Oberflächenimmunglobulin-negativen G-Zellen (wahrscheinlich Plasmazellen) kommen kann.
Schlußfolgerungen
Die Anmelder haben die Wichtigkeit der Amplifikation von spezifischer RNA, die durch Immunisierung hergestellt wurde, gezeigt, um zu ermöglichen, daß Bindeaktivität mit beliebiger, annehmbarer Häufigkeit aus einer kombinatorischen Bibliothek erhalten wird. Die Anmelder zeigten auch eine alternative Strategie, die jene des Immunsystems selbst imitiert. Die Verwendung eines einfachen Verfahrens zur Selektion nach Antigen-bindenden Zellen ergab eine vergleichbare Anreicherung und hat den zusätzlichen Vorteil, daß ein größerer Bereich von Genen eingesetzt wird. Auf den ersten Blick scheint es aufgrund der gewaltigen Vielfalt der Immunglobulingene unwahrscheinlich, daß der statistische kombinatorische Ansatz die ursprüngliche Kombination der schweren und leichten Kette ergibt. Die Anmelder zeigen hier jedoch, daß nach der Immunisierung, mit einem guten Antigen, 10% der VH-Gene aus der gesamten isolierten RNA der Milz aus den Antigen-spezifischen Zellen kommen, sodaß die wirksame Größe des Repertoires stark reduziert wird. Dies zusammen mit der Tatsache, daß Promiskuität der schweren und leichten Ketten auftritt (Beispiel 16 und 17), erklärt die Tatsache, daß das kombinatorische System Antigen-bindende Klone mit annehmbarer Frequenz ergibt. Die Daten lassen auch vermuten, daß der Hauptteil der Antigen-spezifischen RNA aus Oberflächenimmunglobulin-negativen Zellen, die sehr wahrscheinlich Plasmazellen sind, stammt.
Die Daten zeigen auch, daß dieses einfache Verfahren zur Antigenselektion bei der Reduktion der Komplexität der kombinatorischen Bibliothek nützlich sein kann. In diesem Fall wurde eine zumindest 56fache Anreicherung von Antigen-spezifischen Genen erreicht, was im Normalfall, wenn schwere und leichte Ketten nicht bekannt sind, eine Verringerung der Komplexität der kombinatorischen Bibliothek um einen Faktor von mehr als 3000 ergeben würde. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes von Antigen-selektierten Zellen (und dem Amplifizieren von DNA, um allfällige Nachteile aufgrund des Zustands der Zellen zu verringern) ist es, daß dies einen größeren Bereich von amplifizierten Antikörpergenen ergibt. Es kann sein, daß eine einfache Zellenselektion, wie z.B. jene, die die Anmelder hier beschrieben haben, in Kombination mit der Phagenselektion ideal wäre. Aus diesem Beispiel ist zu sehen, daß durch die Kombination von Zellen- und Phagenselektionsverfahren vernünftigerweise erwartet werden kann, daß man alle Kombinationen der schweren und leichten Ketten (etwa 4 × 10¹⁰) screent und somit in der Lage wäre, alle Bindekombinationen zu screenen, obwohl dies zur Zeit nicht aus der ganzen Milz (etwa 4 × 10¹⁴ Kombinationen, mit der Annahme von 50% B-Zellen) möglich wäre. Tabelle 1

Fußnoten: ^a Etwa 10¹² Phagen mit dem angegebenen Verhältnis von pAb (D1.3): FDTPs/Bs wurden auf 1 ml Lysozym-Sepharose-Säulen aufgebracht, gewaschen und eluiert. ^b TG1-Zellen wurden mit dem eluierten spezifisch bindenden Phagen infiziert und auf TY-tet-Platten ausplattiert. Nach der Inkubation bei 30–37°C über Nacht, wurden die Platten durch Hybridisierung an das ³²P-markierte Oligonukleotid VH1FOR (Ward et al., s.o.), der spezifisch für pAbD1.3 ist, analysiert. ^c Einzelne Kolonien aus den Über-Nacht-Platten wurden gezüchtet, die Phagen gereinigt und auf Lysozymbindung untersucht. ^d Die Anreicherung wurde aus den Oligonukleotidsondierungsdaten berechnet.

Tabelle 2
Bemerkungen:

1. 10¹⁰ Phagen wurden auf die Lysozymsäule wie in Tabelle 1 aufgebracht.
2. Das Ausplattieren der Zellen und das Sondieren mit Oligonukleotid erfolgte wie in Tabelle 1, außer daß das Oligonukleotid D1.3CDR3A war.

Tabelle 5
Tabelle 8

¹ 1,9 × 10¹⁰ Phagen in 0,5 ml wurde 1 Stunde mit 5 μl zuvor mit Antigen (OX-BSA)-beschichteten Streptavidinmagnetperlen
² Die Kolonien wurden mit dem Oligonukleotid NQ11CDR3 sondiert.

Tabelle 9
Tabelle 10

* Anreicherungsgrad, verglichen mit Gesamt-DNA

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Bestandteils eines spezifischen Bindungspaares (sbp), welches Verfahren umfasst: das Exprimieren von Nukleinsäure, die für eine genetisch vielfältige Population dieses Typs von sbp-Bestandteil kodiert, in rekombinanten Wirtszellen, worin jeder sbp-Bestandteil als Fusion mit einer Oberflächenkomponente eines sekretierten Bakteriophagen exprimiert wird, der den sbp-Bestandteil an der Oberfläche des Bakteriophagenteilchens präsentiert, wobei dieses Teilchen die Fähigkeit zur Replikation hat, die durch darin gepackte genetische Information unter Verwendung dieser Oberflächenkomponente verliehen wird, wobei Nukleinsäure, die für den präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, innerhalb der Wirtszelle in einer Form enthalten ist, die unter Verwendung der Oberflächenkomponente in das Teilchen gepackt werden kann, wodurch das genetische Material des Teilchens, das einen sbp-Bestandteil präsentiert, für diesen präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die sbp-Bestandteile Einzelketten-Fv-Antikörpermoleküle sind, stammend von: (i) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres, (ii) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines nicht mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres, (iii) einem Repertoire von künstlich neu angeordnetem/-n Immunglobulingen oder -genen, oder (iv) einem Gemisch aus beliebigen von (i), (ii) und (iii); und jeder sbp-Bestandteil in einer funktionellen Form präsentiert wird, die eine Bindungsdomäne für den komplementären spb-Bestandteil umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil aus einem Phagenvektor exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil aus einem Phagemidvektor exprimiert wird, wobei das Verfahren die Verwendung eines Helfer-Phagen oder eines komplementierende Phagengene exprimierenden Plasmids um fasst, um das Packen des Phagemidgenoms zu unterstützen, und die Oberflächenkomponente ein Capsidprotein dafür ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fusion mit einem Bakteriophagencapsidprotein erfolgt und das Teilchen mit der Fusion in Abwesenheit des in Wildform exprimierten Capsidproteins gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fusion mit einem Bakteriophagencapsidprotein erfolgt und ein natives derartiges Capsidprotein im Teilchen vorhanden ist, das die Fusion präsentiert.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Wirt ein Bakterium ist und die Oberflächenkomponente ein Capsidprotein für den Bakteriophagen ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der Bakteriophage ein filamentöser Phage ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der Phage aus den Klasse-I-Phagen fd, M13 und f1 ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin jeder präsentierte sbp-Bestandteil als Fusion mit dem Gen-III-Capsidprotein von Phage fd oder seinem Gegenstück in einem anderen filamentösen Phagen exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der präsentierte sbp-Bestandteil in den N-terminalen Bereich des reifen Capsidproteins stromab eines Sekretionsleitpeptids eingefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, worin der Wirt E.coli ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die durch die Expression gebildeten Teilchen ausgewählt oder gescreent werden, um einen einzelnen präsentierten sbp-Bestandteil oder eine Mischpopulation der präsentierten sbp-Bestandteile bereitzustellen, die in ihren jeweiligen Teilchen mit Nukleinsäure assoziiert sind, die für den präsentierten sbp-Bestandteil kodiert.
Verfahren nach Anspruch 12, worin die Teilchen durch Affinität für einen Bestandteil ausgewählt werden, der zum präsentierten sbp-Bestandteil komplementär ist.
Verfahren nach Anspruch 13, welches das Gewinnen jeglicher an den komplementären Bestandteil gebundener Teilchen durch Waschen mit einem Eluens umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin das Eluens ein Molekül enthält, das mit den Teilchen um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die Teilchen dem komplementären sbp-Bestandteil in Gegenwart eines Moleküls zugeführt werden, das mit den Teilchen um die Bindung an den komplementären sbp-Bestandteil konkurriert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin die aus einem ausgewählten oder gescreenten Teilchen stammende Nukleinsäure verwendet wird, um den sbp-Bestandteil, der präsentiert wurde, oder ein Fragment oder Derivat davon in einem rekombinanten Wirtsorganismus zu exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 17, worin Nukleinsäure von einem oder mehreren Teilchen genommen und verwendet wird, um kodierende Nukleinsäure in einem weiteren Verfahren bereitzustellen, um einen einzelnen sbp-Bestandteil oder eine Mischpopulation von sbp-Bestandteilen oder dafür kodierende Nukleinsäure zu erhalten.
Rekombinante Wirtszelle, die eine Bibliothek aus Nukleinsäurefragmenten beinhaltet, die Fragmente umfasst, die für eine genetisch vielfältige Population spezifischer Bindungspaar- (sbp-) Bestandteile kodieren, wobei jeder sbp-Bestandteil als Fusion mit einer Oberflächenkomponente eines sekretierbaren Bakteriophagen exprimiert wird, sodass die sbp-Bestandteile an der Oberfläche der Bakteriophagenteilchen präsentiert werden und das unter Verwendung der Oberflächenkomponente gepackte genetische Material der Teilchen für den zugehörigen präsentierten sbp-Bestandteil kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die sbp-Bestandteile Einzelketten-Fv-Antikörpermoleküle sind, stammend von: (i) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres, (ii) dem Repertoire an neu angeordneten Immunglobulingenen eines nicht mit komplementärem sbp-Bestandteil immunisierten Tieres, (iii) einem Repertoire von künstlich neu angeordnetem/-n Immunglobulingen oder -genen, oder (iv) einem Gemisch aus beliebigen von (i), (ii) und (iii); und jeder sbp-Bestandteil in einer funktionellen Form präsentiert wird, die eine Bindungsdomäne für den komplementären spb-Bestandteil umfasst.