CN1681531A - 用抗内酯或内酯衍生的信号分子的抗体治疗感染性细菌疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过调节细胞外细菌细胞信号分子的浓度控制感染性细菌毒力的方法。使细胞信号分子的衍生物缀合适宜的载体蛋白，并且用于分离识别天然信号分子的高亲和性受体。通过结合信号分子，这些受体将信号分子的细胞外浓度减少并维持在阈值水平以下，并且可以将毒性生物体转化为无毒生物体，其中所述阈值水平将导致一些机会病原体采用毒性形式。这些受体可以应用于治疗对感染具有易感性的个体、已经感染的患者，及用于疾病监测和处理、和所感染的宿主是动物或植物的相关应用中。

Description

用抗内酯或内酯衍生的信号分子的抗体 治疗感染性细菌疾病的方法

技术领域

本发明涉及用于控制和治疗患者中细菌感染的方法。本发明的方法可以应用于即使不是所有也是大多数的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌感染。本发明提供了治疗应用，所述治疗应用在优选的实施方式中以对信号分子有亲和性和特异性的免疫球蛋白或免疫球蛋白样受体分子为基础，其中所述信号分子参与细菌细胞与细胞的通讯过程。通过结合这种信号分子，该受体可以用于诊断细菌的存在或用于评估患者的疾病状态，并且还可以用于控制参与诱导机会病原体和其它病原体中的毒性状态的分子的浓度。

背景技术

今天，在医院中接受治疗的患者中死亡率和发病率的主要原因之一是医源性感染。对这种感染的易感性可以起因于患者最初的不良健康状况、免疫抑制治疗方案或者是引起严重皮肤损害的损伤，诸如烧伤。造成最高比例的病例的细菌是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。它是人类机会病原体的典型。在组织防御受到一定损伤时，几乎任何组织都会受到该细菌感染，但是该细菌几乎从不感染未受损的组织。尽管占有相对小数量的物种，它对人类健康仍造成严重威胁，此后用其作为感染性细菌的代表性例子，但是并不以任何方式限制本发明的范围或程度。

铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)是引起尿路感染、呼吸系统感染、皮炎、软组织感染、菌血症和各种系统感染的机会病原体，特别是在严重烧伤的受害者中和免疫受抑的癌症和AIDS患者中更是如此。铜绿假单胞菌引起的呼吸道感染几乎仅发生在具有受损的下呼吸道或系统防御机制的个体中。原发性肺炎发生在具有慢性肺病和充血性心力衰竭的患者中。菌血症肺炎通常发生在接受化疗的中性粒细胞减少的癌症患者中。粘液样铜绿假单胞菌菌株在囊性纤维化病患者下呼吸道的建群是常见的，并且即使不是不可能治疗的，也是难于治疗的。该细菌主要在免疫受损患者中引起菌血症。素因性条件包括血液病学恶性肿瘤、与AIDS相关的免疫缺陷、中性粒细胞减少症、糖尿病和严重烧伤。大多数假单胞菌属(Pseudomonas)菌血症是在医院和护理院获得的，它占所有医源性革兰氏阴性菌血症的约25％。

由于该细菌外膜LPS提供的渗透性屏障，所以该细菌以其天然抗许多抗生素的抗性而出名，因此是特别危险和可怕的病原体。并且，它倾向于以生物膜形式在表面建群，这使得细胞不会受到治疗浓度的抗生素的损害。此外，因为其天然栖息地是土壤，与芽胞杆菌、放线菌和霉菌共同生活，所以它已经发展了对这些菌株的各种天然抗生素的抗性。而且，假单胞菌可以维持抗生素抗性质粒，抗性因子(R因子)和抗性转移因子(RTF)，并且能够通过细菌的转导和接合过程转移这些基因。只有少数抗生素有效地抗假单胞菌，包括氟喹诺酮，庆大霉素和亚胺培南，并且即使这些抗生素也不能有效地抗所有株系。在患有急性铜绿假单胞菌感染的患者中，据报道，庆大霉素和羧苄青霉素的联合是有效的。在囊性纤维化患者中最明显地示例了用抗生素治疗假单胞菌感染的无效性，实际上所有囊性纤维化患者最终都会受具有强烈抗性以致无法治疗的菌株感染。因为抗生素抗性，临床分离菌的易感性检测就成为强制性的。

通常可以从土壤和水及植物和动物表面分离铜绿假单胞菌。在世界上，无论在什么地方，都发现了该细菌的栖息地，所以它确实是“世界性”细菌。有时它作为人类正常菌群的部分存在，但在医院外边在健康个体中建群的盛行程度相对地低(根据解剖学位置，估计范围在0-24％)。在医院中，已知它定居在食物、水槽、水龙头、拖把和呼吸器及手术器械上。尽管铜绿假单胞菌的建群通常发生在感染以前，但是由于其在环境中普遍存在，此病原体传播的确切来源和模式常常不清楚。在临床基础上怀疑受到感染的重症监护患者中，多达50％的患者没有可确定的感染来源。目前在重症监护室(ICU’s)中，每天铜绿假单胞菌引起世界上1400例死亡，使它成为头号杀手。

铜绿假单胞菌主要是医院病原体。根据CDC，在美国医院中，铜绿假单胞菌感染的总体发生率平均约是0.4％(出院患者中的4‰)，并且该细菌是第四种最常分离的医院病原体，占所有医院获得性感染的10.1％。全球，它与16％医院肺炎病例，12％获得性尿路感染，8％手术创伤感染和10％血流感染有关。免疫受损患者诸如中性粒细胞减少的癌症和骨髓移植患者易受机会铜绿假单胞菌感染，据报道引起30％的死亡。此外，它也与38％呼吸器相关肺炎和AIDS患者中的50％死亡有关。在烧伤病例中，最近由于改进的治疗和饮食变化，铜绿假单胞菌感染已经下降。然而，死亡率仍保持很高，占由于烧伤患者二次感染所致的所有死亡的60％。

铜绿假单胞菌多样性的一个原因是它产生多种多样的毒力决定因子(virulence determinant)，包括弹性蛋白酶、LasA蛋白酶、碱性蛋白酶、鼠李糖脂、类型IV菌毛介导的颤动、绿脓菌荧光素(Williams等，1996，Stintzi等，1998，Glessner等，1999)，绿脓菌素(Brint & Ohman，1995，Reimmann等，1997)和细胞毒性凝集素PA-I和PA-II(Winzer等，2000)。现在已知这些毒力决定因子中许多通过群体感应(quorum sensing)，以依赖于细胞密度的方式在遗传水平上受到调节。铜绿假单胞菌具有至少两种群体感应系统，即las和rhl(vsm)系统，这两个系统分别由LuxRI同系物LasRI(Gambello & Iglewski，1991)和RhlRI(VsmRI)(Latifi等，1995)组成(图2)。LasI指导3-氧代-C12-HSL的合成(Passador等，1993，Pearson等，1994)，而RhII指导C4-HSL的合成(Winson等，1995)。据认为las和rhl系统存在等级，其中las系统对RhlR发挥转录控制作用(Williams等，1996，Pesci等，1997)。转录激活物LasR与3-氧代-C12-HSL联合起作用以调节基因表达，其中所述基因编码毒力决定因子弹性蛋白酶、LasA蛋白酶、碱性蛋白酶和外毒素A(Gambello & Iglewski，1991，Toder等，1991，Gambello等，1993，Pearson等，1994)及lasI。弹性蛋白酶能切割胶原蛋白、IgG和IgA抗体、补体，并且有利于细菌粘附到肺粘膜上。与碱性蛋白酶联合，它也引起γ干扰素(INF)和肿瘤坏死因子(TNF)的失活。LasI指导3-氧代-C12-HSL的合成，3-氧代-C12-HSL与LasR一起结合lasI启动子，产生正反馈系统。RhlR转录激活物与其关联AHL(C4-HSL)一起调节rhlAB(鼠李糖脂)、lasB、aprA、RpoS、氰化物，绿脓菌素和凝集素PA-I和PA-II的表达(Ochsner等，1994，Brint & Ohman，1995，Latifi等，1995，Pearson等，1995，Winson等，1995，Latifi等，1996，Winzer等，2000)。由于这些以等级形式存在，其中通过LasR/3-氧代-C12-HSL调节rhlR(Latifi等，1996，Pesci等，1997)，故需要这两个系统用于所有上述毒力决定因子的调节。

正在积极地寻求大量不同的方法来开发用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染的治疗法。一些方法倾向于广泛的范围，而其它方法定向于特定类型的假单胞菌感染。遵循传统途径的方法包括诸如美国专利6,309,651中所述的疫苗开发，并且一种有希望的新抗生素药物(SLIT)可以一般性地有效抗革兰氏阴性细菌，但是其主要设计用于抗铜绿假单胞菌，并且通过气雾剂吸入法施用。调查研究下的另一观察结果是以次最佳生长抑制浓度给药的抗生素红霉素可以同时抑制铜绿假单胞菌血细胞凝集素、溶血素、蛋白酶和高丝氨酸内酯(HSL)的产生，并且可能可以应用于持续的铜绿假单胞菌感染的治疗。此外，正在检测含有两亲性肽的乳膏制剂是否可作为预防烧伤感染或其它严重皮肤创伤感染的可能方法。美国专利6,309,651也教导了抗铜绿假单胞菌PcrV毒力蛋白的抗体可以提供抗感染保护。

对于将高丝氨酸内酯水平的调节做为控制致病性的手段，也有些兴趣。已经证明一些藻类以及陆生植物产生酰基-高丝氨酸内酯(AHL’s)的竞争性抑制剂，诸如，呋喃酮类化合物(Manefield，1999)。这些化合物从AHL信号分子的受体蛋白中置换AHL信号分子，并且可以在AHL生物测定试验中作为激动剂或拮抗剂(Tepletski等，2000)。用于降低HSL浓度的其它方法包括催化HSL降解的自诱导物(auto-inducer)失活酶(AiiA’s)的研究开发。

存在与目前研究开发的治疗法有关的大量潜在的问题和限制。至今还没有证明是否疫苗将是有效的治疗方法。正如由具有高血清效价的抗假单胞菌抗体的持续感染患者所揭示的，铜绿假单胞菌可以产生能有效地保护细菌免受宿主抗体调理作用的大量粘液样夹膜。如美国专利6,309,651中所述，应用诸如疫苗和抗PcrV抗体等治疗方法的一个局限性在于这些方法本身限于假单胞菌感染，并且将不能有效抗其它细菌。自诱导物模拟物的应用受限于有效地与HSL竞争受体结合位点所需的浓度和产生副作用的可能性。已知假单胞菌和其它细菌释放的HSL对人体生理学具有多种直接影响。这些影响包括如WO 01/26650中所述的抑制组胺释放。WO01/74801描述了HSL也能抑制淋巴细胞增殖和下调单核细胞和巨噬细胞的TNF-α分泌，由此充当一般的免疫抑制剂。因此，涉及竞争性HSL模拟物应用的治疗存在可能引起患者免疫系统下调的危险。而一般不希望这种危险存在，特别在免疫受损患者中更是如此。而鉴于该细菌(和其它细菌)具有形成抗生素抗性的显著能力，抗生素的应用至多可以看作短期策略。

清楚地，铜绿假单胞菌的致病机理是多因素的，与该细菌相关的广谱疾病和大量毒力因子即突出了这一点。但组织入侵和传播所需的许多细胞外毒力因子受细胞间信号系统的控制，该细胞间信号系统涉及基于高丝氨酸内酯的信号分子和特异性转录激活物蛋白。这些调节系统允许铜绿假单胞菌以协调的依赖于细胞密度的方式适应于毒性形式并克服宿主的防御机制。干扰这种细胞信号和相关的毒力因子产生是减少铜绿假单胞菌引起的疾病和死亡的有希望的治疗方法。随着发现越来越多数量的细菌病原体利用相似的细胞间信号传导系统，这种方法的重要性是显著的。

为了研究宿主-病原体相互作用的分子基础，期望具有(非人类的)可用的适宜模型系统，其中可以复制与人类中致病性相关的刺激作用和机理。在许多疾病情况下，所涉及的病原体本质上与一种或几种近亲物种或群体有关，例如HIV。但其它生物体可以在广泛宿主中(跨种、属、甚至界的限制)引起疾病。铜绿假单胞菌即是这样一种病原体，其能感染各种植物、昆虫和动物物种。

最近几年，已经证明能在人类和小鼠中引起疾病的铜绿假单胞菌株系也能杀死线虫蠕虫秀丽隐杆线虫(Caernohabtidis elegans)(Tan等，1999a，Tan等，1999b，Tan等，2000)。更重要的是，铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的致病性也受在人体中控制致病性的相同细胞密度依赖性群体感应系统的调节。最近完成了铜绿假单胞菌和秀丽隐杆线虫基因组测序，这使得这种关系对于细菌疾病机理的研究是理想的。36％秀丽隐杆线虫蛋白质在人类中存在同系物的事实(Darby等，1999)以及可以在实验室中容易地培养秀丽隐杆线虫的情况已经导致其被广泛用作人类中病理和宿主防御的模型(Kurz和Ewbank，2000)。

对于铜绿假单胞菌介导的秀丽隐杆线虫死亡，已经鉴定到多种不同的机制。Tan等，1999a；1999b和Mahajan-Miklos等，1999描述了也感染小鼠和植物的临床分离菌(株系PA14)的用途。通过改变该细菌的生长条件，随后应用到秀丽隐杆线虫时可以引起快速杀死(几小时内)或慢速杀死(3到4天内)。快速杀死机制只依赖于Rhl群体感应系统。而且，应用已经适当地生长过铜绿假单胞菌的无细胞培养基，或者加热灭活的提取物也同样有效，因为线虫的死亡是通过扩散性绿脓菌素毒素引起的。相反，慢速杀死机制依赖于Las和Rhl两个系统，并且引起线虫消化道的明显感染。因为死亡可能是细菌浸润宿主的结果，该试验为动物中的感染提供了最有用的线虫模型。Darby等，(1999)还描述了第三种杀死机理。这里，应用在脑心浸液培养基中生长的铜绿假单胞菌株系PA01(已知的人类病原体)可以引起秀丽隐杆线虫快速麻痹和死亡。如同前述的慢速杀死，该麻痹也依赖于Las和Rhl两个系统。

需要研发调节致病性中所涉及的HSL和其它细菌细胞信号分子浓度的有效手段，该手段所采用的调节方法没有不利的副作用，并且在可预测的将来也不可能被致病细菌逃避。

发明概述

本发明提供了通过调节细胞外细菌细胞信号分子的浓度，控制人类、动物和植物致病细菌毒力的方法。尽管其它的治疗方法限于特定的病原体或病原体群，或者限于细菌毒力的特定方面，但是本发明致力于一般的细菌毒力。

根据本发明的第一方面，本发明提供了抗细菌分泌的内酯或内酯衍生的信号分子的抗体。

本发明的抗体可以是多克隆抗体或者单克隆抗体。多克隆抗体可以通过将抗原注射到适宜的动物宿主(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、绵羊、鸡、山羊或猴子)中刺激宿主中多克隆抗体的产生而形成。如果必要，佐剂可以与抗原一起给药。然后，可以利用抗体与抗原的结合或如下所述方法纯化抗体。单克隆抗体可以从杂交瘤产生。通过融合骨髓瘤细胞和产生期望抗体的B淋巴细胞形成无限增殖细胞系，可以产生杂交瘤。这是熟知的Kohler & Milstein技术(Nature 256 52-55(1975))。

现在，本领域已经很好地开发了制备结合特定蛋白质的单克隆和多克隆抗体的技术。在标准免疫学教科书中，例如在Roitt等，Immunology第二版(1989)，Churchill Livingstone，London中有相关讨论。

除了完整抗体，本发明还包括能结合抗原的抗体衍生物。因此，本发明包括抗体片段和合成构建体。Dougall等，在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出了抗体片段和合成构建体的例子。抗体片段包括，例如Fab，F(ab′)₂和Fv片段(参见Roitt等[上引文])。可以修饰Fv片段以产生称为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这包括共价连接V_H和V_L区域的肽接头，该肽接头有助于该分子的稳定性。因此，本发明也延及单链抗体或scAb。

其它合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成肽。也可以使用肽模拟物。这些分子通常是构象限定的有机环，该有机环模拟CDR环结构，并且包含可与抗原相互作用的侧链。合成构建体也包括嵌合分子。因此，例如，人源化(或灵长类化)抗体或其衍生物也在本发明范围内。人源化抗体的例子是具有人类构架区，但是啮齿类动物高变区的抗体。合成构建体也包括包含共价连接的部分的分子，该部分除了抗原结合特性外，还提供给该分子一些期望的特性。例如，该部分可以是标记物(例如，可检测的标记，诸如荧光或放射性标记)或者是药物学上的活性剂。

为了产生抗细菌信号分子的抗体，优选将靶分子，或适合的衍生物缀合到两种不同的载体分子(蛋白质)上，但也可以使用一种缀合分子。一般地，细菌信号分子太小而不能刺激体内免疫应答或者直接用做抗原来源用于从抗体库筛选高亲和力的抗体。在优选的实施方式中，利用特异性结合对(sbp)的第一成员的集合(文库)，例如在丝状噬菌体表面展示的抗体文库，进行细胞信号分子(此后称为“抗原”)特异性抗体的筛选。允许从受体文库筛选特异性受体的任何其它系统也可以应用于本发明的方法。在可替代的实施方式中，可以从产生自用抗原缀合物免疫的动物的一组抗体分泌性杂交瘤细胞系，选择信号分子特异性克隆。为了一般示例的目的，将使用噬菌体颗粒上展示的抗体结合位点文库为例子。

将包含与适宜载体分子偶联的抗原的缀合物(此后称为“缀合物1”)固定到适合的固相支持体，诸如“免疫试管(immunotube)”或微量滴定板上，并且用非特异性封闭剂诸如干奶粉封闭未包被的表面，其中所述载体分子可以是蛋白质、肽或任何天然或合成的化合物或物质。适合的缀合物分子可以包括，但不限于蛋白质诸如牛血清白蛋白(BSA)，匙孔戚血蓝蛋白(KLH)，牛甲状腺球蛋白(TG)，卵白蛋白(Ova)，或者非蛋白质诸如生物素。选择缀合物分子时仅有的限制是它可以以一定的方式固定，并且就免疫而言其足够大以致可以激发免疫应答。

将特异性结合对(sbp)的第一成员的文库(“文库”)应用于固定的缀合物，并且温育足够的时间使得识别缀合物1的sbp成员可以发生结合。通过严格洗涤移除不识别缀合物的噬菌体。用例如，三乙胺或其它适合的试剂将保持结合的噬菌体洗脱到缓冲液中以恢复中性pH。然后，用回收的噬菌体颗粒感染适合的宿主生物体，例如大肠杆菌(E.coli)细菌，并且培养它们以扩增每个选定成员的数量，并且由此产生第二“富集”文库。然后，利用富集文库重复该方法以筛选识别缀合第二载体蛋白质的抗原(缀合物2)的噬菌体抗体(“噬菌体”)。

根据需要进行另外的循环，改变筛选方法以有利于选择识别游离抗原的sbp成员。对于每个随后的循环，首先利用缀合物1，并交替使用缀合物2(如果可获得的话)，如前所述筛选抗抗原缀合物的噬菌体。通过与游离抗原溶液或者缀合了小的可溶性标记部分(例如生物素)的抗原溶液温育足够长时间，使对结合形式的抗原具有较高亲和力的sbp成员从固定化的缀合物上解离下来，从而洗脱结合的噬菌体。用游离抗原洗脱的噬菌体感染大肠杆菌细胞以进行扩增和再次筛选，同时弃掉与固定化抗原保持结合的噬菌体。做为可替代的方案，但不是太优选的方案，可以例如，利用低pH洗脱结合缀合物的所有抗体。

从每轮筛选选择具有期望结合特征的各单个(单克隆)噬菌体克隆。可以根据需要，通过本领域普通技术人员熟悉的各种方法进行这种筛选，所述方法包括技术诸如SPR(表面等离子体共振)和ELISA(酶联免疫吸附测定法)。筛选标准将包括在缀合衍生物存在的情况下，优先结合游离可溶形式抗原的能力。

在本发明优选的实施方式中，从幼稚(naive)人抗体噬菌体展示文库(McCafferty等，Nature 348：552-554，1990；和如WO 92/01047中所述)产生抗体。因此，抗体还可以用于向患者给药以用做诊断或透析试剂。在诊断试验中，抗体可以用于检测患者中HSL的存在和浓度，从而预测患者的感染状况。在其它实施方式中，可以从预先用一种或多种由HSL和适宜的载体分子构成的缀合物免疫的动物构建文库。进一步可替代的方案是从上述免疫的动物产生杂交瘤细胞系。在后两种情况下，优选地，采取措施，例如通过产生宿主动物-人嵌合抗体，或者通过将CDR移植到适宜的抗体构架支架上进行“人源化”，以减少所得抗体的免疫原性。可用的其它方法将包括抗体内潜在T细胞表位的鉴定，和例如通过定点诱变随后将这些表位移除(去免疫)。在进一步实施方式中，抗体可以被改造以包含不同类人免疫球蛋白(IgG，IgA等)的恒定区，并且在动物细胞中做为完整抗体分子产生。特别地，在治疗使用这些抗体时这些方法是期望的。

对于本发明，抗体可以是单克隆或多克隆的。抗体可以是人类的或人源化的，或者对于透析/诊断应用而言抗体可以来源于其它物种。可以使用抗体片段或衍生物，诸如Fab，F(ab′).sup.2(也写做F(ab′)₂)，Fv或scFv，也可以使用单链抗体(scAb)诸如Huston等.(Int.Rev.Immunol.10：195-217，1993)所述的那些，结构域抗体(dAbs)，例如单结构域抗体，或抗体样单结构域抗原结合受体。除了抗体外，可以设计抗体片段和免疫球蛋白样分子、肽模拟物(peptidomimetics)或非肽模拟物以模拟抗体的结合活性，从而通过抑制细胞信号分子的结合来预防或调节细菌感染。

制备适合的抗体后，可以通过几种常用的技术之一(例如，在Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow和Lane编辑.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988)中所述)分离或纯化它。一般地，适合的技术包括肽或蛋白质亲和柱子，HPLC或RP-HPLC，蛋白质A或蛋白质G柱子上的纯化或这些技术的联合。根据标准方法，可以制备重组抗体，并且利用一般可用的方法包括ELISA，ABC，点印迹测定法等可以检测其特异性。

内酯信号分子可以是高丝氨酸分子或者肽硫代内酯分子。

高丝氨酸内酯分子可以具有选自下面的通式：

式I

式II

式III

其中n＝0到12。

通式I的化合物可以描述为酰基-高丝氨酸内酯分子。通式II的化合物可以描述为3-氧代-高丝氨酸内酯。通式III的化合物可以描述为3-羟基-高丝氨酸内酯。

优选的通式I高丝氨酸内酯分子是N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯(BHL)，其中n＝0，N-十二烷酰-L-高丝氨酸内酯(dDHL)，其中n＝8和正十四烷酰-L-高丝氨酸内酯(tDHL)，其中n＝10。优选的通式II高丝氨酸内酯分子是N-(-3-氧代己酰基)-L-高丝氨酸内酯(OHHL)，其中n＝2和N-(-3-氧代十二烷酰基)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)，其中n＝8。优选的通式III高丝氨酸内酯分子是N-(-3-羟基丁酰基)-L-高丝氨酸内酯(HBHL)，其中n＝0。

一般地，细菌HSL可以进一步被分成两类：i)长链分子(10-12个碳)和ii)短链分子(4-8个碳)。在假单胞菌属种中，这些不同大小类别的分子结合不同的R分子，并且引起不同基因打开。长链分子结合称为LAS的R同系物基因产物，短链分子结合RHL蛋白质同系物。

肽硫代内酯可以有下面的通式(IV)：

其中X是任何氨基酸，n＝1到10。

在上文和整个申请文件中，用通常的IUPAC单字母命名法命名氨基酸残基。单字母名称可以与氨基酸残基的经典三字母名称相关联，见如下：

A＝Ala    G＝Gly    M＝Met    S＝Ser

C＝Cys    H＝His    N＝Asn    T＝Thr

D＝Asp    I＝Ile    P＝Pro    V＝Val

E＝Glu    K＝Lys    Q＝Gln    W＝Trp

F＝Phe    L＝Leu    R＝Arg    Y＝Tyr

优选的肽硫代内酯分子可以具有下面的结构：

越来越多的细菌物种正在被发现利用各种小信号分子实现细胞间通讯。革兰氏阴性细菌主要利用N-酰基高丝氨酸内酯(表1)。后者是一组化合物，它们共有共同的高丝氨酸内酯环结构，但在侧链的长度和结构方面不同(图1a)。该组中分成3类，即，酰基-高丝氨酸内酯，3-氧代-高丝氨酸内酯和3-羟基-高丝氨酸内酯。单一物种可以产生和应答一类以上的高丝氨酸内酯成员。

内酯衍生的信号分子可以是呋喃糖基硼酸二酯，例如自诱导物-2或AI-2，Pro-AI-2或Pro-AI-2-活性半抗原(图1b)。许多革兰氏阴性和革兰氏阳性生物体诸如哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)产生第二信号分子，AI-2，其和高丝氨酸内酯相同也来源于S-腺苷甲硫氨酸，并且结合受体LuxP(图1b)。据认为可能AI-2是一种通用细菌信号分子，其被多种物种产生和识别并在其中诱导毒力。

自诱导物2(AI-2)

AI-2可以描述为2，3-二羟基-4-甲基-3，4-硼酸二酯。

内酯衍生的信号分子也可以是能天然环化形成Pro-AI-2的4，5-二羟基-2，3-戊二酮(DPD)的衍生物，其中Pro-AI-2可以与硼酸天然反应以形成AI-2(图1b)。Pro-AI-2可以描述为2，4-二羟基-4-甲基-呋喃-酮。如图1b所示，可以在4甲基位置衍生Pro-AI-2，添加庚酸部分形成Pro-AI-2活性半抗原。其它衍生物也可以包含其它直链或支链，饱和或不饱和C₁-C₁₀羧酸部分，诸如甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸或癸酸。

Pro-AI-2

Pro-AI-2活性半抗原

革兰氏阳性细菌诸如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)利用短肽(图1c)(Mayville等，1999)。细胞利用此分子做为确定局部细胞密度的方法，这样在低细胞密度情况下，信号分子浓度相应地低。在高细胞密度情况下，局部信号分子浓度高。当该浓度达到阈值水平时，它诱导毒力所涉及的基因的转录和宿主中病状的发作。

葡萄球菌属种所用的硫代内酯衍生的肽信号分子具有另外的生物学功能。它们不仅提供给细菌关于细菌的局部群体密度的信息，而且它们也起到抑制属于不同亚组的其它金黄色葡萄球菌(s.aureus)中的毒力的作用(Lyon等，2000)。这种双功能性在肽的不同结构元件之间分开，其中硫代内酯C末端抑制其它亚组中的毒力。未修饰的N末端做为信号在合成它的亚组中正调节毒力基因的表达，但是仅在与C末端(这也是需要的)联合的情况下才可。当存在包含具有硫代连接的C末端5个氨基酸的截短肽时，不仅抑制其它3个亚组，也抑制产生它的株系。由此表明，识别信号肽N末端但通过让C-末端暴露而有效地展示C末端的抗体将有效地抑制所有金黄色葡萄球菌(S.aureus)株系中的毒力。因此，可以通过抗上述硫代内酯分子或其结构元件(例如肽序列或硫代内酯部分)所呈递的表位来形成本发明的抗体。

在本发明一些优选的实施方式中，抗体是scAb，特别是获自命名为XL1-Blue G3H5，G3B12，G3G2和/或G3H3的大肠杆菌克隆的scAb。根据布达佩斯条约，所述克隆已经在2003年3月18日保藏在NCIMB(国立工业和海洋微生物保藏有限公司)，Aberdeen，UK，具有下面的保藏号：G3H5保藏号是NCIMB-41167，G3B12保藏号是NCIMB-41168，G3G2保藏号是NCIMB-41169和G3H3保藏号是NCIMB-41170。可以在空气中，在37℃标准条件下，在适合的生长培养基诸如补加有100μg/ml氨苄青霉素及可选地补加有12.5μg/ml四环素和/或1％葡萄糖的LB培养基中培养所述株系。

正在从进行信号分子寻找时涉及的每个生物体中发现细菌信号分子。它看起来是一个普遍的系统，可以应用于每种物种。主要差异是所有革兰氏阴性(革兰氏-ve)细菌利用基于高丝氨酸内酯的分子，革兰氏阳性(革兰氏+ve)细菌利用(修饰的)小肽。许多革兰氏阴性和阳性生物体诸如哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus aithracis)(Jones，M.B.和Blaser，M.J.)也利用小的含硼有机分子AI-2(自诱导物-2)，该分子类似高丝氨酸内酯也来源于S-腺苷甲硫氨酸。该领域中以前的研究关注于用能被识别但是没有作用(即非致病性开关)的分子模拟信号分子，或者关注于阻断各种受体系统。这些方法的缺点主要是可以发展出对该模拟或阻断的抗性，并且“真正的”信号分子仍旧存在并将竞争结合受体。此外，一些细菌信号分子，例如高丝氨酸内酯本身是毒力因子，并且可以直接引起宿主(即，患者)的免疫抑制。本发明的本质是靶向实际的信号分子，并且这可以应用于所有细菌的细胞间信号系统(革兰氏阴性和革兰氏阳性)。该方法与该领域中所有以前的尝试相比具有一个关键的重要优点，即，细菌将不会意识到它们正在受到攻击，它们仅会检测到它们是单独存在的。由此不会有任何抗性选择压力。

根据本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明第一方面中所述的抗体。

可以通过制药领域已知的任何方法，例如通过在无菌条件下混合活性组分和载体、稀释剂或赋形剂制备这种组合物。

药物组合物可以经调整而适应于通过任何适合途径给药，例如通过口服(包括口腔或舌下服用)，直肠，鼻，局部(包括口腔，舌下服用或经皮)途径，阴道或胃肠外途径(包括皮下、肌内、静脉内或皮内)。可以通过制药领域已知的任何方法，例如通过在无菌条件下混合活性组分和载体或赋形剂制备这种组合物。

适于口服给药的药物组合物可以采取的形式有离散单元诸如胶囊或片；粉末或颗粒；溶液、浆或悬浮液(在水或非水液体中；或者作为可食用的泡沫或搅拌物(whips)；或者作为乳剂)。

用于片剂或硬明胶胶囊的适合赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。

与软明胶胶囊一起使用的适合赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。

为了制备溶液和浆，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。为了制备悬浮液，可以使用油(例如植物油)以提供油包水或水包油悬浮液。

适于经皮给药的药物组合物可以为离散贴剂，其可以保持与受体表皮紧密地长期接触。例如，可以一般地如Pharmaceutical Research，3(6)，318页(1986)中所述，通过离子电渗疗法从贴剂递送活性组分。

适于局部给药的药物组合物可以制备成软膏、霜、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油。对于眼睛或其它外部组织，例如嘴和皮肤的感染，优选地该组合物以局部用软膏或霜形式施用。当制备成软膏时，活性组分可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。做为可替代的方案，活性组分可以用水包油型霜剂基质或油包水型基质配制成霜。适于眼睛局部给药的药物组合物包括滴眼剂，其中活性组分溶解或悬浮在适合载体中，特别是水性溶剂中。适于口中局部给药的药物组合物包括糖锭、锭剂、漱口剂。

适于直肠给药的药物组合物可以为栓剂或灌肠剂。

适于鼻给药的具有固体载体的药物组合物包括具有例如20到500微米范围的颗粒大小的粗粉末，其以鼻使劲吸气的方式给药，即，通过鼻通道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。其中载体是液体并以鼻喷雾剂或滴鼻剂形式给药的药物组合物包括活性组分的水性或油性溶液。

适于通过吸入法给药的药物组合物包括细粒粉尘或喷雾，其可以通过各种类型的计量给药加压气雾剂、雾化器或吹入器产生。

适于阴道给药的药物组合物可以为阴道栓剂、卫生棉条、霜、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。

适于非肠道给药的药物组合物包括水性和非水性的无菌注射溶液，该溶液可以含有使制剂与预期受体的血液基本等渗的溶质、抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂；和水性和非水性无菌悬浮液，该悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂。可以用于注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干的)条件下贮藏，只需在临使用前添加例如注射用水之类的无菌液体载体。可以从无菌粉末、颗粒和片剂制备即用配制的注射溶液和悬浮液。

药物组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、增味剂、盐(本发明物质本身即可以以药物学可接受盐的形式提供)、缓冲液、包衣剂或抗氧化剂。除了本发明的物质外，它们也可以含有其它治疗活性剂。

根据待治疗的疾病或障碍，待治疗个体的年龄和状况等，可以在宽范围内改变本发明药物组合物的剂量，并且医师将最终确定适合的使用剂量。

这种组合物可以制成人药或兽药。除了本发明上下文明确地表示外，本申请应该解释为等同地应用于人类及动物。

根据本发明的第三方面，本发明提供了在受治疗者中治疗细菌感染的方法，该方法包括向受治疗者给药本发明第一方面的抗体。

在表1中示出了发现可以引起病状的细菌的例子。因此，本发明这方面的方法延及在受治疗者中治疗由表1中所示细菌株系引起的感染。在本发明优选的实施方式中，提供了在受治疗者中治疗铜绿假单胞菌感染的方法。

可以在人类或非人类动物中使用本发明的治疗物质。该治疗可以是预防性的，或者可以针对已存在的病状进行。

抗体通常将做为无菌药物组合物的一部分应用，正常地，该组合物将包含药物学可接受的载体。该药物组合物可以是任何适合的形式(这取决于将它给予患者的期望方式)。

可以以单位剂量形式提供，通常地在密封容器中提供并且可以做为药盒的一部分提供。这种成套药盒通常(尽管不是必需的)包括使用说明书。它可以包括多个所述单位剂量形式。

本发明的方法可以应用于短期或长期、急性或慢性病症/疾病，并且有效地抗大多数或所有植物、动物(包括人类)的细菌病原体。本发明也可以用做预防性疗法，在有危险的或暴露于致病细菌的个体中预防疾病发生。本发明也具有限制或预防由许多感染引起的免疫系统下调的潜力，这对于患有癌症、囊性纤维化、AIDS和其它免疫抑制病症的患者尤其有意义。而且，因为本发明方法特别地定向于细菌细胞信号分子，而非主要定向于细菌细胞本身，所以不会给细菌群体造成选择性压力以形成对所述治疗的抗性。

可以给感染的患者施用抗体以调节和减少细菌感染。这可以包括由囊性纤维化患者吸入气雾剂形式的抗体以增加预期寿命。

在另一个实施方式中，将抗体施用给免疫抑制的患者以增加免疫活性。

在另一个实施方式中，可以向个体或患者给药免疫原性蛋白质与细胞信号分子的缀合物以刺激抗信号分子的免疫应答，引起中和抗体产生。

在另一个实施方式中，抗体用做免疫诊断试剂，检测例如患者血流或胸膜液中潜在病原体的存在和/或致病状态。

在另一个实施方式中，抗体用做免疫捕获试剂以透析形式从患者血液选择性地移除细菌细胞信号分子。

在另一个实施方式中，可替代的方法可以应用于从患者血液移除细菌细胞间信号分子，以调节感染性微生物的致病性和毒力。用结合所述信号分子的其它天然受体和基于天然受体的分子可以达到该目的。做为可替代的方案，可以应用非天然受体诸如分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymer，MIP)。已经证明这类受体能特异性地结合小分子量生物分子诸如药物(Hart等，2000)和类固醇(Whitcombe等，1995；Ramstrom等，1996；Rachkov等，2000)。在另一可选方案中，可以通过从患者血液非特异性地移除所有小分子量分子实现透析，就如肾透析一样。

在另一个实施方式中，受体可以具有催化或酶促活性，并且能将细胞信号分子转化成靶生物体不再识别的形式，或者不再引起致病性转换的形式。

在另一个实施方式中，联合上述一种或多种应用，或者联合其它疗法，例如抗生素，使用抗体以提供增加和增强的疗法，疾病监测和治疗方案。

可以给药本发明抗体(或等同物)以治疗细菌感染，或者本发明抗体(或等同物)可以用做高危感染者的预防性措施。在已经存在感染的情况下，可以单独或者联合抗菌抗体或抗生素或其它抗微生物疗法施用抗体。抗HSL抗体联合其它疗法可以允许使用较短疗程或较低剂量进行治疗，由此降低出现抗性的风险并且提高患者的顺应性。

根据本发明的第四方面，本发明提供了第一方面所述抗体在药物中的用途。

根据本发明的第五方面，本发明提供了第一方面中所述抗体在制备用于细菌感染治疗的药物中的用途。

根据本发明的第六方面，本发明提供了从特异性结合分子群筛选抗菌特异性结合分子的方法，该方法包括将细菌内酯信号分子缀合到载体分子上，并且利用这样形成的缀合物从特异性结合分子群鉴定特异性地结合缀合物的特异性结合分子。

因此，这种方法是用于鉴定特异性结合分子的手段，其中，例如，在细菌感染治疗中，该特异性结合分子可以用做抗细菌剂。特异性结合分子是抗体或其片段，例如单克隆抗体或多克隆抗体。适宜地，载体分子是上述蛋白质。特异性结合分子群可以是噬菌体展示文库。

通过本发明方法鉴定的特异性结合分子可以用在上述药物或治疗方法中。特异性结合分子还可以用于制备细菌感染治疗的药物。

因此，这种方法延及应用细菌内酯信号分子筛选特异性结合分子群，以鉴定特异性地结合所述细菌内酯信号分子的特异性结合分子。

根据本发明的第七方面，本发明提供了在受治疗者中治疗细菌感染的方法，该方法包括在来自所述受治疗者的样品中分离细菌内酯信号分子，和利用所述细菌内酯信号分子筛选特异性结合分子群中的抗细菌特异性结合分子，从而鉴定特异性地结合信号分子的特异性结合分子，和给需要的患者施用这样鉴定的特异性结合分子。

这种方法允许鉴定定向抗感染性细菌生物体的特异性结合分子，其中所述细菌生物体的信号分子被发现存在于样品中。样品可以是血液、唾液、组织、脑脊髓液、眼泪、精液、尿液、粪便、脓、皮肤或粘膜分泌物。血液样品可以是全血，或者是分级的血液，例如血浆。组织样品可以是任何感染或潜在感染的组织或器官的活检物。样品也可以取自发生损伤或感染或潜在感染的伤口或位点。也可以使用来源于肺或胃或肠的内容物的液体样品。

本发明第二和随后方面的优选特征与第一方面的优选特征除了一些必要的变更外是相同的。

本发明的其它目的、特征和优点，包括但不限于在植物和动物宿主中的相关应用，在本领域技术人员阅读本发明说明书和权利要求书后，将是显而易见的。

本领域普通技术人员将明了，这里公开的组合物和方法可以应用在广泛生物体中以抑制、调节、治疗或诊断由感染引起的疾病或病状。本发明的组合物和方法参考铜绿假单胞菌进行描述，但是将这里的各种目的应用到其它物种是本领域普通技术人员之能力所及的范围。

现在，通过参考下面详细的非限制性实施例和附图，将进一步描述本发明。

附图说明

表1列出了一系列生物体的各种细菌表型，以及调节它们的群体感应系统的调节元件和细胞信号分子。

表2总结了通过竞争性抑制ELISA所测定的、在与dDHL-BSA竞争的情况下、抗AHL scAb对游离抗原(dDHL-COOH)和两种AHL类似物(tDHL和OHHL)的敏感性(IC₅₀)。

表3比较了利用BIAcore 2000仪器通过表面等离子体共振所测定到的、两种抗AHL scAb结合固定化的dDHL-BSA缀合物的动力学。给出了缔合常数(ka)，解离常数(kd)和亲和常数(KA，KD)。

表4总结了抗HSL克隆对各种HSL的的敏感性(IC₅₀)，其中该抗HSL克隆来源于链改组。每个新克隆下面的括号( )中的内容是该新克隆所来源的克隆的名称。如果可应用的话，新克隆比起始克隆增加的抗原敏感程度在括号( )中给出。数据比较了通过竞争性ELISA所测定的、在与dDHL-TG缀合物竞争的情况下和游离HSL的结合。

表5显示抗HSL scAb降低铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)毒力因子弹性蛋白酶表达的作用。数据表示澄清区和菌落面积的比率，表示为与PBS对照比较的百分数(100％)。

图1(a)显示3类代表性高丝氨酸内酯细菌细胞信号分子的化学结构。这些化学结构的不同在于位置C3的取代，而且在每一类中酰基侧链长度均可变(通常是n＝0到n＝10)。此外，在酰基链中可以存在顺式键。图1(b)显示i)AI-2直接前体Pro-AI-2的结构；ii)含硼的活性AI-2分子的结构和iii)用于制备缀合物的反应性Pro-AI-2半抗原的结构；和图1(c)显示i)I组金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，ii)II组金黄色葡萄球菌(S.aureus)，iii)III组金黄色葡萄球菌(S.aureus)和iv)IV组金黄色葡萄球菌(S.aureus)所用的硫代内酯肽信号分子的例子。

图2说明群体或细胞密度依赖性感应的遗传调节。细胞信号机制由两种组分组成：1)在生长的整个过程中，I基因(lasI和rhlI)同系物合成增加数量的细菌细胞信号分子(HSL)(因此是群体感应)，和2)信号分子与(lasR和rhlR编码的)关联R蛋白质同系物依赖于浓度的结合，接着这可以打开一系列特定基因(操纵子)，允许细菌协调密度依赖型的表型转换(例如毒性，游动(swarming))。

图3说明利用质粒pSB1075的生物发光报道基因测定法的原理。光输出的减少表明细菌细胞信号被成功阻断。

图4比较了通过免疫亲和捕获，固定在惰性柱基质上的HSL特异性单链抗体和无关单链抗体从溶液中移除HSL的能力。柱洗脱物应用于费氏弧菌(Vibrio fischeri)的大肠杆菌替代物(JM107-pSB401)，并通过随后刺激细菌培养物发荧光并用RLU测定该荧光，以确定洗脱物中残留HSL的影响。ScAbs G3B12和G3G2是HSL特异性的，抗VZV对病毒蛋白特异，抗百草枯(Paraquat)和抗莠去净(Atrazine)对具有与HSL分子相似分子量的除草剂特异，并且树脂对照不含有固定的ScAb。数据表示来源于两次单独测定的3个重复样品的平均值。标出了标准误差。

图5表示通过生物发光输出量所测定的，特异性单链抗体和无关单链抗体对dDHL在铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)的大肠杆菌替代物(JM109-pSB1075)上介导的刺激作用的抑制效应。给出了HSL特异性scAb G3H5的数据(●)，非特异性对照scAb的数据()(对致病菌表面蛋白特异)，和没有scAb时的数据(○)。数据点表示来源于重复测定的3个重复样品的平均值。

图6表示通过生物发光输出量所测定的，特异性单链抗体和无关单链抗体对tDHL在铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)的大肠杆菌替代物(JM109-pSB1075)上介导的刺激作用的抑制效应。给出了3种HSL特异性scAb，即，G3H3(●)，G3G2(■)和G3B12(□)的数据，给出了无关抗VscAb的数据(○)(对致病菌表面蛋白特异)，和没有scAb存在时的数据()。数据点表示来源于重复测定的3个重复样品的平均值。

图7表示在(a)60分钟和(b)150分钟后通过生物发光输出量所测定的，特异性和无关(非特异性)单链抗体对于BHL在铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)Rrhl系统(短链HSL应答性)的大肠杆菌替代物(JM109-pSB406)上介导的刺激作用的抑制效应。数据表示G3H5，G3B12和G3H3抗体、非特异性对照抗体(对致病菌表面蛋白质特异)和没有抗体(仅是PBS缓冲液)时的数据。数据点表示来源于重复测定的3个重复样品的平均值。

图8表示慢速杀死线虫的试验，证明G3H5和G3B12抗体能够保护线虫免受(a)细菌病原体铜绿假单胞菌株系PA14和(b)铜绿假单胞菌株系PA01的感染。

图9表示在游离肽“YSTGGAGSGG”或游离硫代内酯肽Agr-D1(参见图1c)存在或不存在的情况下，抗肽scAb YST-1结合BSA对照或BSA-肽缀合物的竞争ELISA数据。

具体实施方式

实施例1

这里所述实施例涉及费氏弧菌(Vibrio fischeri)和铜绿假单胞菌。

给出的这些实施例仅仅是例子，本发明范围不应限于这些实施例，而是包括直接或间接调节参与毒力或致病性的基因的表达的所有细菌细胞间信号分子，并且也包括其它信号分子诱导的细菌细胞表型的改变，诸如但不限于生物发光。

合成HSL衍生物(命名为dDHL-COOH)，其具有做为“接头”的12个碳酰基链，并且终止于羧基(参见图1)。通过羧基，这种衍生物缀合到载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和匙孔戚血蓝蛋白(KLH)上产生dDHL-BSA和dDHL-KLH。简而言之，在1.67ml水中溶解50mg BSA或KLH，向其中添加3.3ml pH 8.5的2mM KH₂PO₄，所有这些都在4℃进行。为此，搅拌下，逐滴地添加1.05ml干燥的二甲基甲酰胺(DMF)。将10mgdDHL-COOH的活性N-琥珀酰亚胺酯溶解在100μl干燥DMF中，并且，在4℃，再次慢慢地添加至载体蛋白溶液中。充分地搅拌反应混合物，并且在4℃置放24小时。然后用4×1升水透析缀合的物质，通过MALDITOF质谱法证实该缀合。

术语“接头”指任何这样的化学基团，其允许半抗原(抗原)附着到(优选地)免疫原性载体分子上，以致半抗原可以离开载体表面进行展示。

在本发明的备选目的中，可以使用其它载体分子诸如磁珠或生物素和其它接头和缀合策略。然后，两种缀合形式的dDHL用于筛选抗体噬菌体展示文库。简而言之，文库通过总共3轮生物淘选进行筛选。在每轮中，dDHL缀合物固定到固相支持体上，并且与噬菌体-抗体文库温育足够长时间，使识别缀合物的噬菌体-抗体发生结合。通过用PBS(磷酸盐缓冲液)和PBS-Tween严格洗涤移除未结合的噬菌体，通过在低pH温育来洗脱保持结合的噬菌体(第一轮)。然后，用洗脱的噬菌体感染大肠杆菌，并且通过本领域熟悉的方法扩增。然后，所得到的富集克隆的扩增文库用于随后的淘选循环。为了减少选出的识别载体蛋白质的克隆数量，在相继的筛选循环中更替固定化的缀合物(dDHL-BSA或dDHL-KLH)。为了有利于筛选识别特异性HSL的克隆，在第2和3轮期间，不使用低pH，而是使用选定的HSL(dDHL-COOH)竞争地洗脱噬菌体-抗体。通过ELISA筛选来自于第3轮的每个噬菌体克隆：最初检测每个克隆结合每种dDHL-缀合物及单独的载体蛋白的能力。进一步分析能结合两种缀合物但是不能结合载体蛋白的那些克隆，以鉴定与缀合物的结合可以受溶液中游离dDHL-COOH抑制的那些克隆。从发现结合游离dDHL-COOH的这些噬菌体克隆获得抗体可变区基因，并亚克隆到可溶性表达载体(pIMS 147)中，并且以可溶性单链抗体片段(scAb)形式产生，其中该片段包含通过柔性肽接头连接的可变重链和轻链结构域和来源于人抗体的κ恒定结构域。通过竞争性抑制ELISA定量检测可溶性scAb与游离HSL的结合。含有恒定浓度的每种选定scAb的样品(相对于1μg/ml dDHL-BSA)与一个浓度范围的游离dDHL-COOH(或dDHL-缀合物)温育1小时，然后应用到用dDHL-BSA包被的ELISA板上。温育1小时后，洗掉未结合的scAb，并且用酶标记的抗人κ抗体检测与固定的缀合物保持结合的任何scAb。从游离抗原浓度检测scAb对游离dDHL-COOH的敏感性和与其它HSL(tDHL和OHHL)的交叉反应性，其中所述游离抗原浓度使scAb(无游离抗原)与dDHL-BSA的结合减少50％(IC₅₀)(表2)。

利用BIAcore 2000(BIAcore，Sweden)检测抗HSLscAb结合dDHL-BSA的结合动力学。用0.2M EDC[1-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳化二亚胺-HCl]/0.05M NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)活化CM5芯片，并且在10nM醋酸钠中，分别在pH 3.5或4.5，使dDHL-BSA或单独BSA偶联芯片。以20μl/分钟的流速，在HBS缓冲液中，重复2次地测定一系列10个浓度的scAb(100到1000nM)。在样品间，用20μl 100mM NAOH再生芯片。利用BIAevaluation 3软件包测定动力学(表3)。

通过6x组氨酸标签，将scAb固定到柱子中的镍-琼脂糖凝胶珠上，使OHHL溶液流过柱子，进一步估测scAb G3B12结合OHHL的能力。随后洗脱与scAb结合并保留在柱子上的任何OHHL。检测柱子直流物中(即，未结合的)OHHL的浓度及结合并后来洗脱的OHHL的浓度。

利用含有质粒pSB401的大肠杆菌株系JM107(费氏弧菌的应答替代物)和含有质粒pSB406及pSB406的JM109(铜绿假单胞菌的应答替代物)检测scAb结合HSL和调节细菌对AHL的应答的能力。这些报道质粒含有HSL效应调节基因luxR(pSB401)、lasR(pSB1075，应答长链HSL)或rhlR(pSB406，应答短链HSL)和luxI启动子区，它们与外源HSL一起激活来源于Photorhabdus luminescens的luxCDABE基因融合物表达(发光结构基因)。在适合的培养条件下，可以诱导这些细胞响应细胞外HSL的存在而发光，所发射的光强度与HSL浓度成比例。

利用公开的方法(Strachan等，1998)表达选自文库的克隆的可溶scAb。在固定化金属亲和层析纯化(IMAC)期间，不从镍琼脂糖凝胶柱子洗脱scAb。此外，也表达一系列对不相关抗原具有特异性的另外scAb，并将其固定到镍琼脂糖凝胶柱上做为对照。500μl 10nM OHHL应用于每个柱子，并且在4℃，温育1小时。以40g离心柱子15秒，并且收集流通物。用250μl1M NaCl洗脱任何结合的OHHL。重新上样最初的流通物并如前所述进行温育，之后收集流通物和用1M NaCl洗脱结合的HSL。

在通过固定化scAb柱子前和后，将HSL溶液样品应用于大肠杆菌JM107 pSB401培养物，并且用发光计测定所发射的光。利用无scAb固定的柱子和包含对无关抗原具有特异性的scAb的另3个柱子进行适当的对照试验。在37℃，在含有四环素的LB培养基中振荡培养细胞18小时。将1ml培养物接种到100ml LB四环素培养基中，并且在37℃培养到OD600nm达到0.2。100μl培养物加至96孔黑色生物测定板的重复孔中，并且添加同样体积的HSL溶液。HSL溶液是10nM OHHL(阳性对照)、流过镍琼脂糖凝胶柱子的milli-Q水(树脂对照)或者10nM OHHL通过上述含有固定化scAb的柱子后的流通物。在37℃振荡温育该板2小时，并且利用Anthos LUCY1发光计读取1秒的发光读数(图4)。

利用大肠杆菌株系JM109-pSB1075，在3小时期间，用HSL诱导型发光报道生物测定法估测scAb减少细菌对长链HSL应答的能力。该株系基本如所描述的JM107-pSB401，不同之处在于质粒pSB1075包含铜绿假单胞菌lasR而不是费氏弧菌luxR。将单菌落JM109-pSB1075接种到含有抗生素的10ml LB肉汤中，并且在37℃过夜温育。200μl过夜培养物接种到10ml新鲜培养基中，并且在37℃振荡温育至0.2OD600nm。向培养基添加HSL(以20nM终浓度添加dDHL-COOH或以50nM终浓度添加tDHL)，并且将100μl培养物添加到黑色96孔板的3个相同孔中。向阴性对照添加LB培养基。向每个孔添加50μl PBS或2mg/ml 50μl scAb，并且在37℃进一步振荡温育该板3小时，此后，以30分钟间隔测定发光，确定scAb对细胞信号传导的影响(图5和6)。数据证明抗HSL抗体能够与结构不同的高丝氨酸内酯信号分子交叉反应并减少或消除铜绿假单胞菌替代物对细胞外HSL的应答。

用上述相似的方法估测了scAb减少细菌对短链HSL应答的能力。生物发光报道系统使用具有报道质粒pSB406的大肠杆菌株系JM109，其包含rhlR效应元件调节物。向大肠杆菌培养物添加信号分子BHL(图1中酰基-HSL，但是有4个碳的侧链)达到50nM终浓度(向阴性对照培养物添加同样体积的LB培养基)，并且将100μl培养物添加到测定板的3个相同孔中。然后添加50μl scAb(100nM)或50μl PBS，并且如前述温育该板。60分钟和150分钟后进行发光测定(图7)。

实施例2

为了估测抗HSL scAb向动物提供抗致病性铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)保护的能力，使用基于线虫秀丽隐杆线虫的“慢速杀死”测定试验。该试验以在动物肠道中建立铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)感染后杀死蠕虫为基础。

在第1天，用铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)株系PA14感染5ml LB肉汤，并且在37℃温育过夜。第2天，将1％过夜培养物接种到含有100μlscAb(100nM)的5ml新鲜LB肉汤中，并且在37℃温育到0.4OD 600nm。10μl细菌培养物和120nM 50μl scAb一起点到富NG的蛋白胨琼脂板(线虫生长培养基)中央，并且在37℃温育该板过夜。第3天(下午)，另外50μl scAb(120nM)点到该板上，并且继续过夜温育。第4天(上午)，将板转移到室温(约20℃)，并且再次添加50μl scAb。第5天(上午)，和以前一样添加50μl scAb，并且直接将20-5成年蠕虫添加到细菌菌苔上(时间＝0小时)。在时间＝26，50和76小时，补加scAb。在随后3天间隔检测死亡蠕虫数量(图8a)。当对细金属签接触无反应并且无运动时，认为蠕虫死亡。

对于对照板，使用PBS或无关scAb(对无关靶抗原有特异性)，或者在大肠杆菌株系OP50上培养蠕虫。

也利用铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)株系PA01(Darby等，1999)进行第二次试验。该株系主要用于“麻痹杀死”(毒素产生)，但是它也适于本实施例中慢速杀死感染研究，尽管没有PA14有效。

进行下面一些修改后如上所述进行该试验。测定中scAb一直以100nM浓度添加。第3天上午和下午，将50μl scAb点到板上。第二次添加后，将板转移到室温并且过夜温育。在第4天(时间＝0小时)使用蠕虫和scAb，并且只在t＝30和60小时补充添加scAb(图8b)。

实施例3

铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)产生几种细胞外产物，建群后，这些产物可以引起广泛的组织损伤。这些产物之一弹性蛋白酶是急性感染期间铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)的最大毒力所必需的。弹性蛋白酶在lasI/R群体感应级联控制下产生。因此，通过检测弹性蛋白酶产生可以指示细菌群体的毒力能力。

4μl铜绿假单胞菌(Ps.aeruginosa)株系PA14以10⁵ CFU/ml(低OD)或10⁸ CFU/ml(高OD)接种到含有1％弹性蛋白、0.5％实验室用lemco粉末、1％胨、0.5％NaCl和1.5％琼脂的琼脂板上，并且在37℃温育5天。生长到低OD不鼓励致病性转换，而生长到高OD促进致病性转换。向该板添加50μl scAb(200nM)和细菌，并且在测定中，每隔24小时进行另外相同体积的应用。

每天测定细菌菌落直径和周围澄清区(表明弹性蛋白酶裂解弹性蛋白)，并以澄清区面积和细菌菌落面积的比率确定菌落的弹性蛋白水解活性。而且，每个试验进行3-4次重复，并且大肠杆菌XL1-Blue用做阴性对照(表5)。

实施例4

为了分离对抗原具有更高亲和性的抗HSL抗体和为了使抗体的特异性定向于特定的HSL变异体，对克隆G3B12进行亲和力成熟。从G3B12细菌克隆分离噬菌粒DNA，并且利用含有45个碱基对柔性接头区中最后30个碱基的5’寡核苷酸引物

LINKER-REV(5′-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGC-3′)和对噬菌体小外壳蛋白基因gIII特异的3’引物

gIII-FOR(5′-GAATTTTCTGTATGAGG-3′)，通过PCR扩增可变轻链基因。在1％琼脂糖凝胶中电泳正确大小(约380bp)的产物，切出并纯化。在相似的方法中，制备含有整个人幼稚文库的噬菌粒DNA，其中原始克隆是从该文库分离的。利用对pelB前导序列特异的5’引物AH1-REV(5′-AAATACCTATTGCCTACGGC-3′)和编码接头区最初30个碱基的3’引物LINKER-FOR(5′-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3′)扩增所有可变重链基因。如上所述，纯化正确大小的产物(约400bp)。然后，利用与接头区中央(其是两种主要PCR产物所共有的)互补的15个碱基，通过连接PCR，使VH基因库与单克隆VL基因组合。4轮循环后，通过向连接PCR反应添加引物AH1-REV和gIII-FOR，并进行另外25轮循环，扩增此新文库。用限制酶NcoI和NotI消化扩增的DNA，并且连接到相似消化和纯化的噬菌粒载体中。最后，通过电穿孔将连接的和再次纯化的DNA转化到大肠杆菌株系TG1细胞中，并且用常规方法涂平板。

如前所述，用辅助噬菌体拯救噬菌体抗体，并且加至用dDHL-BSA缀合物包被的免疫试管中，并且允许结合。倒掉未结合的噬菌体，并且通过用PBST和PBS实施多次洗涤步骤移除弱/非特异性结合者。然后，用低pH三乙胺洗脱缀合物特异性的噬菌体，并且中和。将这些噬菌体感染到新鲜对数期的TG1细胞中，拯救，并且再次扩增用于以后筛选(淘选)循环。对于这些相继淘选，固定化的缀合物在dDHL-BSA和dDHL-TG之间交替。在第3轮淘选期间，用游离dDHL或BHL(丁酰高丝氨酸内酯)从重复2次的淘选中洗脱来源于改组文库的结合噬菌体。

第3轮淘选后，筛选具有期望的结合特性的单克隆噬菌体抗体。通过ELISA筛选来自第3轮的每个噬菌体克隆：最初检测每个克隆结合dDHL-BSA和KLH缀合物和单独的载体蛋白的能力。进一步分析能结合两种缀合物但是不能结合载体蛋白的那些克隆，以鉴定与缀合物结合可以受溶液中游离dDHL或HSL抑制的那些克隆。从发现结合游离BHL/dDHL的这些噬菌体克隆获得抗体可变区基因，亚克隆到可溶表达载体(pIMS 147)中，并且以可溶性单链抗体片段(scAb)形式产生，该片段包含通过柔性肽接头连接的可变重链和轻链结构域和来源于人抗体的κ恒定结构域。通过竞争性抑制ELISA定量可溶scAb与游离HSL的结合。含有恒定浓度的每种选定scAb的样品(相对于1μg/ml dDHL-TG)与一个浓度范围的游离HSL温育1小时，然后应用到用tDHL-TG包被的ELISA板。温育1小时后，洗掉未结合的scAb，并且用酶标记的抗人κ抗体检测与固定化缀合物保持结合的任何scAb。从游离抗原浓度确定scAb对游离HSL的敏感性和与其它HSL的交叉反应性，其中该游离抗原浓度使scAb(无游离抗原)与dDHL-TG的结合减少50％(IC₅₀)(表4)。

实施例5

合成两种常规肽，YST-1(YSTGGAGSGG)和YST-2 YSTASGGASS，及第三种形式YST-3——其在倒数第二位C末端赖氨酸侧链上被生物素酰化^(^表示生物素酰化位点)(YSTAGGSGAK^S)。也合成第四种硫代内酯肽YSTC*DFIM*(Agr-D1)，其中*表示硫代内酯环所连接的残基(参见图1c)。通过常规缀合化学，利用l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，通过C末端，一些YST-1缀合BSA，YST-2缀合牛甲状腺球蛋白(TG)。

基本如前述，交替利用固定的YST-1和YST-2缀合物对人幼稚抗体文库进行4轮淘选。结合噬菌体-抗体1小时后，倒掉未结合的噬菌体，通过用PBST，接着用PBS大量洗涤移除弱结合的噬菌体。用三乙胺洗脱结合的噬菌体，并且中和，然后感染对数期大肠杆菌TG1细胞。通过用辅助噬菌体拯救，扩增富集的噬菌体，然后用聚乙二醇沉淀法纯化和浓缩，准备用于下一轮的筛选。在第3和4轮中洗涤结合YST-1/2缀合物的噬菌体后，用YST-3溶液洗脱噬菌体。通过链霉抗生物素蛋白包被的顺磁性珠子捕获结合生物素酰肽的这些噬菌体，并用磁铁固定。进一步洗涤后，如前所述，将结合的噬菌体直接添加到TG1细胞中，并且允许感染。

4轮选择循环后，通过ELISA针对与YST-1和YST-2缀合物，及与单独BSA和TG载体蛋白质的结合，筛选单克隆噬菌体-抗体。只结合两种缀合物的那些克隆的scFv基因被亚克隆到pIMS-147scAb可溶性表达载体中，并且转化到大肠杆菌XL1-Blue细胞中。表达这些细胞，从细菌周质间隙提取可溶scAb，并且通过镍亲和层析纯化该可溶scAb。然后，通过ELISA，在与固定的肽缀合物竞争的情况下，进一步分析纯化的scAb与游离(非缀合的)肽及与硫代内酯肽自诱导物Agr-D1的结合。与结合单独缀合物比较，在肽存在情况下的信号减少表明scAb识别所有肽共有的YST表位(图9)。

实施例6

为了产生抗AI-2靶的抗体，需要游离AI-2分子和缀合形式。分离纯化形式AI-2(被认为)是不可能的。实际上，AI-2通过Pro-AI-2(图(1b))与硼酸的(自发)反应形成。体外，Pro-AI-2也将与硼酸反应以产生活性AI-2，但是这不适于缀合和抗体筛选。可以合成Pro-AI-2衍生物，其中用具有末端活性基团，例如羧酸的接头，例如酰基链置换甲基。包含适于与载体化学缀合或交联的末端活性基团并且可以导致核心Pro-AI-2部分离开载体表面进行展示的任何结构都可以用做接头。如在“发明概述”部分中所述，优选地，活性Pro-AI-2与两种不同的载体缀合。

为了产生固定化的AI-2缀合物，在硼酸存在的情况下(优选地＞10μM，pH 6.0-8.0)，将潜在的受体文库(例如，噬菌体上展示的抗体文库)应用于固定化的缀合物。允许噬菌体-抗体(“噬菌体”)结合，并且通过洗涤移除不识别缀合物的噬菌体抗体。可以用高或低pH，例如三乙胺，或者通过与游离AI-2竞争性结合，或者通过与例如生物素酰化的AI-2竞争性结合随后用磁性链霉抗生物素蛋白珠子移除，可以洗脱结合的噬菌体。在除了极端pH洗脱外的所有生物淘选阶段，硼酸盐应该存在以确保保持AI-2的正确结构。洗脱的噬菌体应该再次感染宿主细菌(大肠杆菌)，通过在产生噬菌体颗粒的条件下培养细胞进行扩增并纯化用于下一轮循环。除了优选地轮流更替固定的缀合物，如第1轮所述进行随后的筛选循环。

当完成足够循环次数的筛选后，可以测定每个(单克隆)克隆寻找与AI-2的结合者。尽管仅1个循环后就可能分离AI-2结合克隆，但是可能仍需要至少3轮筛选，或者可能进行3轮以上循环是必要的。可以通过本领域技术人员已知的方法，在每轮循环后进行多克隆噬菌体-ELISA以确定需要多少个循环。如前面实施例所述，应该产生单克隆噬菌体抗体，并且测定其与用于筛选的每种缀合物和相应的未缀合载体的结合。如果可以获得，还可以使用第3或第4缀合物。推定的阳性克隆将被确定为这样的克隆，即，其在硼酸盐存在的情况下可以结合所有可获得的缀合物，但是不与单独的载体分子结合，并且优选地在没有硼酸盐的情况下，不与缀合物结合。

由于Pro-AI-2与硼酸盐反应可能产生一种以上的产物，故优选证明抗体特异地识别正确的AI-2结构。这可以通过在游离Pro-AI-2和硼酸盐存在的情况下测定与缀合物的结合来确定。随着游离Pro-AI-2浓度递增而出现的结合减少表明竞争性抑制。因此，预期这种抗体能通过结合细胞外AI-2并使它不能为细胞所用来调节AI-2应答性细菌的应答。

可以在生物发光哈氏弧菌(Vibrio harveyi)中发现适合的体内模型，该弧菌是应答AI-2进行生物发光的细菌。LuxS-哈氏弧菌(V.harveyi)株系不能合成DPD(Pro-AI-2的前体)，因此也不能产生AI-2。然而，它们能通过(增加的光输出)响应外源添加的AI-2而应答，该外源AI-2可以是Pro-AI-2和硼酸盐一起的形式，或者是获自LuxS⁺哈氏弧菌的含有硼酸盐的无细胞培养基。向LuxS^-细胞或向LuxP^-细胞(缺乏天然AI-2受体)添加单独硼酸盐不产生任何光发射。因此，潜在的抗AI-2抗体(“受体”)可以被确定为这样的抗体，即它们符合前述结合标准，并且如通过减少的光发射所测定的，当向LuxS^-细胞添加时，能从野生型哈氏弧菌(V.harveyi)培养基耗尽AI-2，或者当向LuxS⁺细胞添加时，淬火/阻止/减少光发射。

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Claims (35)

1、抗细菌分泌的内酯或内酯衍生的信号分子的抗体。

2、如权利要求1所述的抗体，其中内酯信号分子是高丝氨酸分子或肽硫代内酯分子。

3、如权利要求2所述的抗体，其中高丝氨酸内酯分子具有选自下面的通式：

式I

式II

式III

其中n＝0到12。

4、如权利要求3所述的抗体，其中通式I的高丝氨酸内酯分子是N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯(BHL)，其中n＝0；N-十二烷酰基-L-高丝氨酸内酯(dDHL)，其中n＝8；和正十四烷酰基-L-高丝氨酸内酯(tDHL)，其中n＝10。

5、如权利要求3所述的抗体，其中通式II的高丝氨酸内酯分子是N-(3-氧代己酰基)-L-高丝氨酸内酯(OHHL)，其中n＝2；和N-(3-氧代十二烷酰基)-L-高丝氨酸内酯(OdDHL)，其中n＝8。

6、如权利要求3所述的抗体，其中通式III的高丝氨酸内酯分子是N-(3-羟基丁酰基)-L-高丝氨酸内酯(HBHL)，其中n＝0。

7、如权利要求2所述的抗体，其中肽硫代内酯有下面的通式(IV)：

其中X是任何氨基酸，n＝1到10。

8、如权利要求7所述的抗体，其中肽硫代内酯分子是：

或

或

或

9、如权利要求1所述的抗体，其中内酯衍生的信号分子是呋喃糖基硼酸二酯。

10、如权利要求9所述的抗体，其中呋喃糖基硼酸二酯是自诱导物-2(AI-2)

11、如权利要求1所述的抗体，其中内酯衍生的信号分子是Pro-AI-2或其C₁-C₁₀饱和或不饱和羧酸衍生物

12、如权利要求1至11之任一所述的抗体，其是多克隆抗体。

13、如权利要求1至11之任一所述的抗体，其是单克隆抗体。

14、如权利要求1至11之任一所述的抗体，其是单链抗体(scAb)。

15、如权利要求1至11之任一所述的抗体，其是抗体片段。

16、如权利要求15所述的抗体，其中该抗体片段是单链可变片段(scFv)。

17、如权利要求15所述的抗体，其中该抗体片段是单结构域片段。

18、药物组合物，其包含权利要求1至17任一所述的抗体。

19、在受治疗者中治疗细菌感染的方法，该方法包括施用权利要求1至17任一所述的抗体。

20、成套药盒，其包含以单位剂量形式提供的权利要求1至17任一所述的抗体。

21、权利要求1至17任一所述的抗体，其用于药物中。

22、权利要求1至17任一所述的抗体在制备用于细菌感染治疗的药物中的用途。

23、从特异性结合分子群筛选抗细菌特异性结合分子的方法，该方法包括使细菌内酯或内酯衍生的信号分子与载体分子缀合，利用这样形成的缀合物从特异性结合分子群中鉴定特异性结合缀合物的特异性结合分子。

24、如权利要求23所述的方法，其中特异性结合分子是抗体或其片段。

25、如权利要求24所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。

26、如权利要求24所述的方法，其中抗体是多克隆抗体。

27、如权利要求23至26任一所述的方法，其中载体分子是蛋白质。

28、如权利要求23至27任一所述的方法，其中细菌内酯信号分子是高丝氨酸分子或肽硫代内酯分子。

29、如权利要求23至27任一所述的方法，其中内酯衍生的信号分子是呋喃糖基硼酸二酯，诸如AI-2或Pro-AI-2，或其C₁-C₁₀饱和或不饱和的羧酸衍生物。

30、如权利要求23至29任一所述的方法，其中特异性结合分子群是噬菌体展示文库。

31、通过权利要求23至30任一所述的方法鉴定的特异性结合分子，其用在药物中。

32、通过权利要求23至30任一所述的方法鉴定的特异性结合分子在制备用于细菌感染治疗的药物中的用途。

33、细菌内酯或内酯衍生的信号分子的用途，用于筛选特异性结合分子群以鉴定特异性地结合所述细菌内酯信号分子的特异性结合分子。

34、在受治疗者中治疗细菌感染的方法，该方法包括在来自所述受治疗者的样品中分离细菌内酯或内酯衍生的信号分子，利用所述细菌内酯信号分子从特异性结合分子群筛选抗细菌特异性结合分子以鉴定特异性结合此信号分子的特异性结合分子，和向需要的患者给药这样鉴定的特异性结合分子。

35、如权利要求34所述的方法，其中样品是血液、唾液、组织、脑脊髓液、泪液、精液、尿液、粪便、脓、皮肤或粘膜分泌物样品。

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