CN101001874B - 聚-n-乙酰葡萄糖胺(pnag/dpnag)结合肽及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异结合乙酰化、部分乙酰化和/或完全去乙酰化形式的聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)(如葡萄球菌PNAG)的肽，尤其是人单克隆抗体。本发明还提供了将这些肽用于诊断、预防及治疗表达PNAG的细菌(例如但不仅限于葡萄球菌和大肠杆菌)感染的方法。本发明的某些抗体增强了调理吞噬性杀菌作用及对表达PNAG细菌(例如但不仅限于葡萄球菌和大肠杆菌)的体内防护。本发明还提供了这些肽的组合物(包括药物组合物)，以及这些肽的功能等效变体。

Description

聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG/DPNAG)结合肽及其应用方法

政府支持

该项工作部分由国立卫生院基金号AI46706资助。因此，美国政府对本发明具有一定权利。

相关申请

本申请要求于2004年4月21日递交的美国临时申请系列60/564,105的优先权，其完整内容在此处引用作为参考。

技术领域

本发明主要涉及结合于细菌(如葡萄球菌(Staphylococcus))聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)和去乙酰PNAG(dPNAG)的肽，及其在诊断和治疗葡萄球菌和其他表达PNAG的细菌感染中的用途。

背景技术

葡萄球菌为革兰氏阳性细菌，通常栖居和定居于人体的皮肤和粘膜。如果皮肤或粘膜在手术或其他创伤中受到损伤，葡萄球菌就能够进入内部组织而导致感染发生。如果葡萄球菌在局部增殖或进入淋巴或血液系统，则可能会产生严重的感染性并发症，如葡萄球菌菌血症相关的并发症。葡萄球菌菌血症相关的并发症包括败血症性休克、心内膜炎、关节炎、骨髓炎、肺炎及多器官脓肿。

葡萄球菌中包括产生游离凝固酶的凝固酶阳性生物，以及不产生该游离凝固酶的凝固酶阴性生物。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是最为常见的凝固酶阳性的葡萄球菌。一般而言，金黄色葡萄球菌引起血管外或血管内的局部感染，两者最终都可能造成菌血症。金黄色葡萄球菌也是急性骨髓炎的主因，还可导致葡萄球菌肺炎感染。此外，约1-9％的细菌性脑膜炎和10-15％脑脓肿病例可归因于金黄色葡萄球菌。

至少已知21种凝固酶阴性葡萄球菌，包括表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)、人葡萄球菌(S.hominis)、华纳葡萄球菌(S.warneri)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、腐生葡萄球菌(S.saprophiticus)、孔氏葡萄球菌(S.cohnii)、木糖葡萄球菌(S.xylosus)、模仿葡萄球菌(S.simulans)和头葡萄球菌(S.capitis)。表皮葡萄球菌是经静脉装置相关的最常见的导致感染的病原体，也是原发性医源性菌血症中最常分离到的病原体。表皮葡萄球菌也与人工瓣膜感染性心内膜炎有关。

葡萄球菌也是动物中细菌感染的常见病原。例如，葡萄球菌乳腺炎是包括牛、绵羊和山羊在内的反刍动物中常见的问题。一般利用抗生素治疗该病以减轻感染，但治疗费用昂贵且仍然会造成乳产量的损失。迄今为止对家畜而言明确的最有效疫苗，是皮下施用的活的完整金黄色葡萄球菌疫苗。然而施用活疫苗伴随着感染的风险和毒性反应。为此，很多研究者已经尝试生产灭活的金黄色葡萄球菌疫苗，和/或分离能诱发对金黄色葡萄球菌免疫性的荚膜脂多糖或细胞壁成分。然而，这些尝试中无一成功。

发明概述

本发明主要涉及鉴定和应用结合聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)如葡萄球菌聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)和乙酰化不足或去乙酰化PNAG(此处总称为dPNAG)的肽。此处用结合PNAG/dPNAG的肽表示这些肽。此类肽的实例包括具有抗体互补决定区(CDR)或可变区的氨基酸序列的肽，所述抗体为此处所述的抗体，或来自2004年4月21日保藏入美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏号为PTA-5931(F598)、PTA-5932(F628)和PTA-5933(F630)的杂交瘤产生的抗体。这些肽包括但不仅限于多肽、单克隆抗体(如人单克隆抗体)及抗体片段。此处公开的肽的共同特征在于它们能够特异识别并结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG。本发明的肽也可能会识别并结合其他细菌菌株表达的PNAG和/或dPNAG。本发明中某些抗体及抗体片段的重要特征在于它们能够增强对表达PNAG的菌种(如葡萄球菌物种)的调理和吞噬作用(即调理吞噬作用)。

因此，本发明一方面提供了含有分离的选择性结合葡萄球菌聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG/dPNAG)的肽的组合物，其中包括结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR或其功能等效变体的氨基酸序列。

本发明的该方面与其他方面共享多个实施方案。仅一次引用这些实施方案，但应当认识到它们同样适用于本发明的所有方面。

在一个实施方案中，结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR为结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3。该结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3可含有选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：21的重链CDR3中的氨基酸序列，或者也可含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的重链CDR3中的氨基酸序列。该结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3可含有选自SEQ ID NO：12、SEQID NO：18和SEQ ID NO：24的轻链CDR3中的氨基酸序列，或者也可含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的轻链CDR3中的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR为结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2。该结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2可含有选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQID NO：17、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的CDR2中的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR为结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR1。该结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR1可含有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQID NO：16、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的CDR1中的氨基酸序列。

在一个实施方案中，分离的肽含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的重链可变区中的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，分离的肽含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的轻链可变区中的氨基酸序列。

在一个实施方案中，分离的肽为分离的抗体或抗体片段，例如但不仅限于分离的完整(优选可溶性的)单克隆抗体或分离的单克隆抗体片段，例如但不仅限于F(ab′)₂片段、Fd片段以及Fab片段。分离的抗体可以为ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤所产生的抗体或其抗体片段。

在一个实施方案中，分离的抗体或抗体片段增强了对表达PNAG的细菌菌株(如葡萄球菌，例如但不仅限于金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的调理吞噬作用。

在一个实施方案中，分离的抗体或抗体片段中含有具有重链可变区且选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列，以及具有轻链可变区且选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在另一个实施方案中，分离的抗体或抗体片段中含有来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的重链可变区中的氨基酸序列，以及来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的保藏杂交瘤的轻链可变区中的氨基酸序列。

分离的抗体或抗体片段中可含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQID NO：2的氨基酸序列，或SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列，或SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

分离的抗体或抗体片段中可含有来自ATCC保藏号PTA-5931(F598)的保藏杂交瘤的重链可变区中的氨基酸序列以及具有来自ATCC保藏号PTA-5931(F598)的保藏杂交瘤的轻链可变区的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5932(F628)的保藏杂交瘤的重链可变区中的氨基酸序列以及具有来自ATCC保藏号PTA-5932(F628)的保藏杂交瘤的轻链可变区的氨基酸序列，或含有来自ATCC保藏号PTA-5933(F630)的保藏杂交瘤的重链可变区中的氨基酸序列以及具有来自ATCC保藏号PTA-5933(F630)的保藏杂交瘤的轻链可变区的氨基酸序列。

在一个实施方案中，分离的肽缀合于可检测的标记。该可检测标记可为体内或体外可检测标记。

在一个实施方案中，该组合物还包含可药用载体。在其他实施方案中，分离的肽(如分离抗体或抗体片段)的量为抑制表达PNAG的细菌菌株引发感染(如葡萄球菌感染)的有效量，或为检测受试者体内或体外样品中表达PNAG的细菌菌株(例如葡萄球菌)的有效量。

在一个实施方案中，分离的肽选择性结合葡萄球菌PNAG。在另一个实施方案中，分离的肽选择性结合葡萄球菌dPNAG。

本发明的另一个方面提供了分离的含有编码结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR的核苷酸序列的核酸分子。

在一个实施方案中，核苷酸序列选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：24。在另一个实施方案中，核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

在一个实施方案中，核酸为来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤的重链可变区的核酸分子。在另一个实施方案中，核酸为来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤的轻链可变区的核酸分子。在另一个实施方案中，核酸为来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤的重链CDR的核酸分子，或者为来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤的轻链CDR的核酸分子。

本发明的其他方面还提供了含有与启动子有效连接的前述分离核酸分子的表达载体，以及由此类表达载体转化或转染的细胞。

本发明的其他方面提供了分离的产生抗葡萄球菌PNAG/dPNAG单克隆抗体(F598)的细胞，其ATCC保藏号为PTA-5931；分离的产生抗葡萄球菌PNAG/dPNAG单克隆抗体(F628)的细胞，其ATCC保藏号为PTA-5932；以及分离的产生抗葡萄球菌PNAG/dPNAG单克隆抗体(F630)的细胞，其ATCC保藏号为PTA-5933。此外，本发明还提供分离的由前述保藏的分离细胞产生的单克隆抗体或其抗体片段。抗体片段可为但不仅限于F(ab′)₂片段、Fd片段或Fab片段。在相关实施方案中，该片段增强了对表达PNAG的细菌菌株(如葡萄球菌，例如但不仅限于金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌)的调理吞噬作用。

本发明的另一个方面提供了检测受试者体内或受试者样品中表达PNAG的细菌菌株(如葡萄球菌)的方法。该方法包括测定分离的肽或其功能等效变体结合受试者体内或体外样品的测试水平，并将该结合测试水平与对照进行比较，其中分离的肽选择性结合葡萄球菌PNAG/dPNAG，且含有结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR或其功能等效变体。且其中若结合测试水平大于对照，则提示样品中存在细菌菌株(例如葡萄球菌)。待测细菌可为葡萄球菌、大肠杆菌(E.coli)、鼠疫杆菌(Yersiniapestis(Y.pestis))、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.entercolitica)、柑橘溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis(X.axonopodis))、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens(P.fluorescens))、伴放线放线杆菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans(A.actinomycetemcomitans))、胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis(B.pertussis))、副百日咳博德特氏菌(B.para pertussis)或支气管腐败杆菌(B.bronchiseptica)。本发明也提供了检测和治疗由表达PNAG的细菌所致的植物感染的方法，所述细菌如茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum(R.solanacearum))。

在一个实施方案中，体外测量结合测试水平。

本发明的另一方面提供了治疗患有表达PNAG的细菌菌株引发感染(如葡萄球菌感染)或具有该发病风险的病人的方法。所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用可抑制感染的分离的选择性结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的肽的有效量，所述肽中含有结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR或其功能等效变体。在另一个实施方案中，分离的肽缀合于细胞毒性剂。

在一个实施方案中，受试者患有葡萄球菌感染或具有其发病风险，例如但不仅限于金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染。在另一个实施方案中，受试者患有大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌感染或具有相应的发病风险。

前述细菌感染为胃肠炎、泌尿道感染、鼠疫、百日咳、血源性感染及牙科感染(牙周炎)等症状的成因。本发明旨在通过治疗根本的细菌感染来治疗这些后面的症状。此处所提供的检测和治疗方法适用于患有或有发生此类感染风险的人或非人受试者。非人受试者中包括农业动物如牛和猪，但并不仅限于此。

茄科雷尔氏菌是另一类表达PNAG的细菌，然而这是一种植物病原体而并非动物病原体。本发明涉及利用此处提供的肽检测和治疗有此类感染的植物物种，根据所用方法该肽优选缀合于可检测的或细胞毒标记。

本发明的另一方法提供了治疗表达PNAG的细菌菌株引发感染(如葡萄球菌感染)的方法，包括对需要此类治疗的受试者施用可治疗感染的有效剂量的结合PNAG/dPNAG的肽，所述肽可在暴露于表达PNAG的细菌至少4小时后降低受试者中至少50％的细菌载量。

在一个实施方案中，结合PNAG/dPNAG的肽为分离的抗体或抗体片段。在一个实施方案中，感染为葡萄球菌感染。在一个实施方案中，葡萄球菌感染为金黄色葡萄球菌感染或表皮葡萄球菌感染。在另一个实施方案中，感染为大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌感染。本发明中也包括茄科雷尔氏菌感染，尽管该感染累及植物而并非动物。在另一个实施方案中，在暴露于细菌前施用结合PNAG/dPNAG的肽，例如但不仅限于至少于暴露细菌前24小时施用。

在一个实施方案中，结合PNAG/dPNAG的肽在暴露于细菌至少4小时后降低受试者中至少60％的细菌载量。在另一个实施方案中，结合PNAG/dPNAG的肽在暴露于细菌至少2小时后降低受试者中至少50％的细菌载量。在另一个实施方案中，结合PNAG/dPNAG的肽在暴露于细菌至少2小时后降低受试者中至少60％的细菌载量。表达PNAG的细菌包括但不仅限于感染动物的葡萄球菌、大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管腐败杆菌，以及感染植物的茄科雷尔氏菌。

本发明的这些及其他实施方案将于此处详细描述。

附图简述

图1显示了单克隆抗体(MAb)F598、F628和F630(IgG2形式)对天然PNAG的结合亲和力。MAb对绿脓杆菌(P.aeruginosa)MEP的亲和力用作阴性对照。

图2显示了MAb F598、F628和F630(IgG2形式)对dPNAG的结合亲和力。

图3显示了利用PNAG和MAb F598、F628及F630(IgG2形式)进行竞争性ELISA的结果。

图4显示了MAb F598、F628和F630(IgG1形式)对天然PNAG的结合亲和力。

图5显示了MAb F598、F628和F630(IgG1形式)对dPNAG的结合亲和力。

图6显示了MAb F598、F628和F630的IgG1和IgG2形式对PNAG的补体固定活性。MAb对绿脓杆菌MEP的亲和力用作阴性对照。

图7显示了MAb F598、F628和F630的IgG1和IgG2形式对金黄色葡萄球菌菌株Mn8的调理吞噬活性。

图8A为显示比较小鼠(每组8只)血液中的葡萄球菌水平的平均结果的柱形图，所述小鼠接受对照人抗绿脓杆菌海藻酸盐IgG1 MAb，或对PNAG/dPNAG(IgG1形式)有特异性的MAb F598，证实MAb F598能够提供对金黄色葡萄球菌攻击的被动保护。

图8B显示了对个体小鼠中金黄色葡萄球菌攻击的保护结果，其中报告了施用对照人抗绿脓杆菌海藻酸盐IgG1 MAb以及对PNAG/dPNAG(IgG1形式)有特异性的MAb F598后每毫升血液中的CFU。

图8C显示了利用MAb F598和对照抗绿脓杆菌MEP MAb，对个体FVB小鼠中金黄色葡萄球菌攻击的保护结果。

图9为显示大肠杆菌UTI菌株(标记D-U)中PNAG表达并包括大肠杆菌pga过表达分离物(顶端右手边)的免疫印迹。

图10为柱图，显示了利用针对金黄色葡萄球菌dPNAG产生的多克隆抗血清杀灭大肠杆菌分离物的水平。

图11A和11B显示了利用针对dPNAG和PNAG产生的多克隆抗血清杀灭大肠杆菌分离物的水平，所述分离物分别表达相对高水平(菌株U)和中等水平(菌株P)的PNAG。

图12为柱图，显示了利用F598、F628和F630后不同表达PNAG细菌菌株CFU的减少。

图13显示了由F598和F628杀灭的金黄色葡萄球菌的比例作为icaB基因存在与否的函数。

图14显示了作为由F598和F628杀灭的金黄色葡萄球菌的比例icaB基因过表达的函数。

应当认识到这些附图并非实现本发明所必需。

序列表简述

SEQ ID NO：1为抗体F598重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2为抗体F598轻链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3为抗体F628重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4为抗体F628轻链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为抗体F630重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6为抗体F630轻链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7为抗体F598重链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8为抗体F598重链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9为抗体F598重链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10为抗体F598轻链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11为抗体F598轻链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12为抗体F598轻链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13为抗体F628重链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14为抗体F628重链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15为抗体F628重链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16为抗体F628轻链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17为抗体F628轻链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18为抗体F628轻链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19为抗体F630重链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20为抗体F630重链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21为抗体F630重链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22为抗体F630轻链CDR1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23为抗体F630轻链CDR2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24为抗体F630轻链CDR3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：25为抗体F598重链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：26为抗体F598轻链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27为抗体F628重链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：28为抗体F628轻链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：29为抗体F630重链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30为抗体F630轻链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31为抗体F598重链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：32为抗体F598重链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：33为抗体F598重链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34为抗体F598轻链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：35为抗体F598轻链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：36为抗体F598轻链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：37为抗体F628重链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：38为抗体F628重链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：39为抗体F628重链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：40为抗体F628轻链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：41为抗体F628轻链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42为抗体F628轻链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：43为抗体F630重链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：44为抗体F630重链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：45为抗体F630重链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：46为抗体F630轻链CDR1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：47为抗体F630轻链CDR2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：48为抗体F630轻链CDR3的核苷酸序列。

SEQ ID NO：49为引物λ恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：50为引物Huλsig 5的核苷酸序列。

SEQ ID NO：51为引物重链恒定区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：52为引物VH7LDRHU的核苷酸序列。

SEQ ID NO：53为引物Huλsig 1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：54为引物VH1LDRHU的核苷酸序列。

SEQ ID NO：55为包括某些恒定区序列的F598重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：56为包括某些恒定区序列的F598重链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：57为包括某些恒定区序列的F598轻链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：58为包括某些恒定区序列的F628重链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：59为包括某些恒定区序列的F628重链可变区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：60为包括某些恒定区序列的F630轻链可变区的氨基酸序列。

SEQ ID NO：61为包括某些恒定区序列的F630轻链可变区的核苷酸序列。

发明详述

本发明提供了本身可用于免疫人和动物以不受表达聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)的细菌菌株感染的组合物和方法，以及可用于检测此类病原体的组合物和方法。此类细菌菌株包括但不仅限于凝固酶阴性和凝固酶阳性的葡萄球菌，如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。本发明还提供了可结合某些细菌菌株表达的多种形式PNAG的肽。

本发明部分基于发现、分离若干人单克隆抗体及其表征，所述单克隆抗体结合多种形式的PNAG(如下所述，包括高度乙酰化形式、乙酰化不足形式和去乙酰化形式)。这些抗体是由根据布达佩斯专利条约于2004年4月21日以ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933保藏入ATCC的杂交瘤所产生的。这些杂交瘤及其所产生的抗体记为F598、F628和F630。此处将会反复提到杂交瘤。应当理解当提及到ATCC保藏号为PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤(或杂交瘤所产生的抗体)时，指的是前述杂交瘤。该保藏杂交瘤是由从葡萄球菌感染康复的人类受试者中收集的B细胞产生的。用Epstein-Barr病毒转化这些B细胞，并将这些细胞随后与人-小鼠骨髓瘤细胞系HMMA 2.5融合以产生保藏杂交瘤。

PNAG以醋酸基置换程度不等的多种形式天然存在。醋酸基置换范围可为0-100％。此处所用的PNAG是指具有前述范围醋酸基置换的天然PNAG混合物的“天然PNAG”。乙酰化不足的PNAG为PNAG多糖的一个亚群，其中被醋酸基置换的葡萄糖胺氨基低于50％。此处所用的术语dPNAG包括乙酰化不足的PNAG，也包括完全去乙酰化PNAG(即dPNAG是指含有0-小于50％醋酸置换的PNAG多糖亚型)。

PNAG结构如下：

其中，n为2至大于等于300间的整数，R选自-NH-CO-CH₃和-NH₂。PNAG具有β1-6键(即，由通过β1-6键所连接的葡萄糖胺单体组成)。

PNAG可为同聚体。同聚体中葡萄糖胺残基中的R基团相同。同聚体中可仅含有未置换R基团(即R＝NH₂)。PNAG也可为异聚体，其R位点为-NH₂和-NH-CO-CH₃基团的混合物。dPNAG与PNAG具有相同的结构，只是其中少于50％的R基团为-NH-CO-CH₃。

PNAG和dPNAG可天然存在，制备自任何携带ica基因座(或同源基因座，如pga基因座)的细菌菌株，所述菌株产生由该基因座编码的生物合成的酶，并利用这些酶合成PNAG或dPNAG。表达PNAG的细菌包括葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌)、大肠杆菌(如大肠杆菌菌株0157:H7和CFT073)、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌(以上均为具有完整pgaABCD基因座的已测序物种)，以及伴放线放线杆菌(AA)、胸膜肺炎放线杆菌(Ap)、茄科雷尔氏菌(例如巨质粒形式)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管腐败杆菌(上述所有均含有pgaABC基因但似乎缺少pgaD同源物)。pgaD似乎并非表达PNAG所必需，因为编码pgaABC的物种如AA和Ap(如上列举)产生PNAG。

表达PNAG的细菌为具有ica基因座或同源基因座(如pga基因座)的细菌。例如，表达PNAG的葡萄球菌为带有ica基因座的葡萄球菌。表达PNAG的细菌菌株中包括表达dPNAG的细菌菌株。例如表达PNAG的葡萄球菌包括表达dPNAG的葡萄球菌。这些菌株包括但不仅限于表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌，以及被ica基因座或同源基因座如pga基因座的基因转化的其他菌株(如肉葡萄球菌)。具体而言，可以从包括表皮葡萄球菌RP62A(ATCC保藏号35984)、表皮葡萄球菌RP12(ATCC保藏号35983)、表皮葡萄球菌M187、肉葡萄球菌TM300(pCN27)、金黄色葡萄球菌RN4220(pCN27)，金黄色葡萄球菌MN8粘液型(mucoid)、大肠杆菌0157:H7以及大肠杆菌CFT073在内的具体菌株制备PNAG。也可从头合成或通过修饰天然PNAG得到dPNAG。可根据Maira-Litran等人.Infect Immun.2002 Aug；70(8)：4433，以及递交于2003年11月12日的美国专利申请10/713,790中所述的方法，制备PNAG和dPNAG。

其他细菌也表达PNAG，包括但不仅限于大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、茄科雷尔氏菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管腐败杆菌。如实施例中所述，18个泌尿道感染大肠杆菌分离物中有17个携带了pga基因座。其中，约三分之一表达相对高水平的PNAG，约三分之一表达相对中等水平的PNAG，而剩下的三分之一表达相对低水平的PNAG。上述分析是利用针对金黄色葡萄球菌PNAG产生的抗血清、通过免疫印迹而进行的。这证明一个物种的PNAG可用于产生对其他表达PNAG物种的抗体(以及相应结合肽)。

因此，本发明一方面提供了结合肽和抗体。本发明的抗体结合葡萄球菌PNAG/dPNAG，并增强对产生PNAG物种的调理吞噬作用(即对葡萄球菌PNAG/dPNAG具有特异性的调理吞噬性人单克隆抗体)。此处将这些抗体称为抗葡萄球菌PNAG/dPNAG抗体。然而，应当认识到此类抗体能够结合任何来源的PNAG/dPNAG。因此，本发明的抗体虽然定义为结合如葡萄球菌PNAG/dPNAG并能检测和/或增强对如葡萄球菌物种的调理吞噬能力，也能够检测和/或增强对非葡萄球菌的表达PNAG细菌的调理吞噬能力。

抗葡萄球菌PNAG/dPNAG抗体为，a)结合PNAG和dPNAG的抗体、b)结合PNAG但不结合dPNAG的抗体，或c)结合dPNAG但不结合PNAG的抗体。优选的抗体结合dPNAG。

抗体F598、F628和F630都能结合天然PNAG，其中一些也能结合dPNAG。虽然不刻意归于任何机制或理论，识别dPNAG的抗体更有可能特异性结合PNAG分子中不含醋酸基团的部分，而不是分子中含有置换(如醋酸置换)的部分。例如，结合dPNAG的抗体可识别并结合PNAG的主链而并非其醋酸置换基。这些抗体能够介导对表达PNAG的细菌(例如但不仅限于感染的人受试者中得到的葡萄球菌或大肠杆菌分离物)的调理吞噬性杀灭。当体内应用于葡萄球菌感染的鼠模型时，这些抗体能提供对葡萄球菌攻击的保护作用。每种单克隆抗体提供保护的条件可能有所不同。这些以及其他发现将于实施例中详细描述。

虽然并非刻意归于任何特定理论，据认为表达PNAG的细菌感染(如葡萄球菌感染)的进展是由于未能产生足够的能消除病原体的免疫应答。具体而言，缺陷之一在于不能产生对PNAG(如葡萄球菌产生者)特异的调理吞噬性抗体。

调理吞噬性抗体为可将自身沉积于抗原或细菌上的抗体，它们具有或不具有募集补体系统成分额外沉积的能力，能够促进如抗原提呈细胞(例如巨噬细胞或树突状细胞)或多形核中性粒细胞等吞噬细胞对抗原或细菌的吞噬作用。吞噬作用可以通过Fc介导的方式进行，其中仅涉及结合抗原或细菌的抗体。通过巨噬细胞上补体受体与已沉积抗体的细菌表面补体调理素结合，也可进行吞噬作用。吞噬作用也可以这两种机制的组合方式进行。因此，能够向感染部位提供调理吞噬性抗体有助于比过去更有效地清除感染。

PNAG和dPNAG在体内均具有强免疫原性，能激发出介导调理性杀灭并保护免受感染的抗体，有假说认为dPNAG优选激发出介导调理性杀灭并保护免受感染的抗体。因此，dPNAG多糖本身可用于产生对表达PNAG的细菌菌株(例如但不仅限于葡萄球菌)的免疫应答，包括抗体依赖性免疫应答。施用dPNAG后激发的抗体识别dPNAG，在重要实施方案中也识别高度乙酰化的PNAG。

因此，本发明涉及鉴定结合PNAG和/或dPNAG的肽及其用途。此处将结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的肽称为结合PNAG/dPNAG的肽。同样，应当认识到这些结合肽能结合任何来源的PNAG/dPNAG。结合PNAG/dPNAG的肽包括a)结合PNAG和dPNAG的肽，b)结合PNAG但不结合dPNAG的肽(此处称为PNAG结合肽)，或c)结合dPNAG但不结合PNAG的肽(此处称为dPNAG结合肽)。在优选的实施方案中，肽至少结合dPNAG(因此包括前述类别(a)和(c))。

本发明的肽最少包括结合PNAG/dPNAG的区域(即葡萄球菌PNAG/dPNAG结合区)。此处所用的葡萄球菌PNAG/dPNAG结合区为：a)结合PNAG和dPNAG的区域、b)结合PNAG但不结合dPNAG的区域(此处称为PNAG结合区)，或c)结合dPNAG但不结合PNAG的区域(此处称为dPNAG结合区)，而不论PNAG/dPNAG的来源。优选的PNAG/dPNAG结合区为至少结合dPNAG的区域(因此包括类别(a)和(c))。葡萄球菌PNAG/dPNAG结合区来源于本发明中抗体的PNAG/dPNAG结合区，或者它们也可以为此类区域的功能等效变体。

因此，两类特别重要的抗体来源的PNAG/dPNAG结合区为此处描述抗体的可变区和CDR，或由2004年4月21日保藏于ATCC中ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生的抗体的可变区和CDR。可以如实施例中所述，从如保藏的那些抗体产生细胞中克隆CDR及可变区的核酸。

正如本领域公知，抗体为通过二硫键连接的一组多肽链。被称为轻链和重链的两条主要氨基酸链，组成了所有的抗体主要结构同种型。重链和轻链都可进一步分为亚区，称为可变区和恒定区。在某些情况下，肽中含有前述抗体的重链和轻链可变区。重链可变区为长度一般为100至150个氨基酸的肽。轻链可变区为长度一般为80至130个氨基酸的肽。

如本领域公知，抗体的CDR为抗体可变区中负责抗体对特定抗原或抗原表位结合特异性的主要部分。CDR直接与抗原的表位相互作用(主要见Clark，1986；Roitt，1991)。在IgG免疫球蛋白的重链和轻链可变区内存在4个构架区(FR1至FR4)，分别通过3个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)分开。构架区(FR)保留了互补位的三级结构，互补位这是涉及与抗原或抗原表位相互作用的抗体部分。CDR(特别是CDR3，更特别是重链CDR3)对抗体特异性举足轻重。由于CDR(特别是CDR3)赋予抗体大部分抗原特异性，可以将这些区域引入其他抗体或肽中以给予相应抗体或肽相同的抗原特异性。

优选的结合PNAG/dPNAG的肽最少包括至少一个此处所述或来自保藏杂交瘤的CDR(即结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR)。此处所用的结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR，为此处所述的CDR，或来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤的CDR。结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR包括：a)结合PNAG和dPNAG的CDR、b)结合PNAG但不结合dPNAG的CDR(此处称为PNAG结合CDR)，或c)结合dPNAG但不结合PNAG的CDR(此处称为dPNAG结合CDR)，而不论PNAG/dPNAG的来源。这些肽优选含有至少一个结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR。

葡萄球菌PNAG/dPNAG结合区可以为结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR1、结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2，或结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3，均来自此处公开的抗体和抗体可变链。

此处所用的“结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR1”为结合(优选特异性结合)葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR1，且来自此处所述抗体或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生抗体的重链或轻链可变区。它可具有选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：22的氨基酸序列。类似的相应定义适用于结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2和CDR3。

“结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2”为结合(优选特异性结合)葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR2，且来自此处所述抗体或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生抗体的重链或轻链可变区。它可具有选自SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

“结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3”为结合(优选特异性结合)葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3，且来自此处所述抗体或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生抗体的重链或轻链可变区。它可具有选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

除了上文所列的序列，本发明还包括这些序列的功能等效变体，包括如下详述的氨基酸或核苷酸序列的保守性置换变体。

本发明的肽(包括但不仅限于此处讨论的调理吞噬抗体)本身可用于诊断方法，所述诊断方法目的在于从受试者或体外样品中检测PNAG/dPNAG抗原或表达PNAG的细菌(例如但不仅限于表达PNAG的金黄色葡萄球菌)。在最起码的情况下，用于这些方法的肽仅需识别并结合PNAG/dPNAG(例如葡萄球菌PNAG/dPNAG)，而不论它们是否也增强调理和吞噬作用。在重要实施方案中，抗体及其片段选择性结合PNAG/dPNAG。因此，它们只需具有来自此处所述抗体克隆或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的杂交瘤产生抗体克隆的一个或多个CDR。在优选实施方案中，肽中含有结合PNAG/dPNAG的CDR3，甚至更优选肽中含有结合PNAG/dPNAG的重链CDR3。应当认识到为了影响对PNAG/dPNAG的结合并不需要所有的CDR。然而，某些实施方案中的肽含有来自此处所述的某一抗体克隆或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生的某一抗体克隆的所有CDR。

此外，应当理解本发明也包括此处提供的可变区之间CDR的交换。优选一条重链CDR与另一条重链可变区CDR进行交换，与之类似，一条轻链CDR与另一条轻链可变区CDR进行交换。

本发明公开的可变链CDR的氨基酸序列如下：

克隆    链    CDR     SEQ   序列

                      ID NO：

F598    Hv    CDR1    7     GYYWS

F598    Hv    CDR2    8     YIHYSRSTNSNPALKS

F598    Hv    CDR3    9     DTYYYDSGDYEDAFDI

F598    Lt    CDR1    10    TLSSGHSNYAIA

F598    Lt    CDR2    11    VNRDGSHIRGD

F598    Lt    CDR3    12    QTWGAGIRV

F628    Hv    CDR1    13    NYYWS

F628    Hv    CDR2    14    YIHYSGSTNSNPSLKS

F628    Hv    CDR3    15    DTYYESSGHWFDGLDV

F628    Lt    CDR1    16    TLDSEHSRYTIA

F628    Lt    CDR2    17    VKSDGSHSKGD

F628    Lt    CDR3    18    QTWGPGIRV

F630    Hv    CDR1    19    NFGIS

F630    Hv    CDR2    20    WVSTYNGRTNYAQKFRG

F630    Hv    CDR3    21    DYYETSGYAYDDFAI

F630    Lt    CDR1    22        TLSSGHSTYAIA

F630    Lt    CDR2    23        VNSDGSHTKGD

F630    Lt    CDR3    24        QTWGPGIRV

本发明公开的可变链中CDR的核苷酸序列如下：

克隆    链    CDR     SEQ       序列

                      ID NO：

F598    Hv    CDR1    31        GGT TAC TAC TGG

                            AGT

F598    Hv    CDR2    32        TAT ATT CAT TAT

                            AGT AGG AGC ACC AAC

                            TCC AAC CCC GCC CTC

                            AAG AGT

F598    Hv    CDR3    33        GAT ACC TAT TAC

                            TAT GAT AGT GGT GAT

                            TAT GAG GAT GCT TTT

                            GAT ATT

F598    Lt    CDR1    34        ACT CTG AGC AGT

                            GGC CAC AGC AAC TAC

                            GCC ATC GCT

F598    Lt    CDR2    35        GTT AAC AGA GAT

                            GGC AGC CAC ATC AGG

                            GGG GAC

F598    Lt    CDR3    36        CAG ACC TGG GGC

                            GCT GGC ATT CGA GTG

F628    Hv    CDR1    37    AAT TAC TAC TGG

                        AGT

F628    Hv    CDR2    38    TAT ATC CAT TAT

                        AGT GGG AGC ACC AAC

                        TCC AAT CCA TCC CTC

                        AAG AGT

F628    Hv    CDR3    39    GAT ACT TAC TAT

                        GAA AGT AGT GGT CAT

                        TGG TTC GAC GGT TTG

                        GAC GTC

F628    Lt    CDR1    40    ACT CTG GAC AGT

                        GAA CAC AGC AGA TAC

                        ACC ATC GCA

F628    Lt    CDR2    41    GTT AAG AGT GAT

                        GGC AGT CAC AGC AAG

                        GGG GAC

F628    Lt    CDR3    42    CAG ACT TGG GGC

                        CCT GGC ATT CGA GTG

F630    Hv    CDR1    43    AAC TTT GGT ATC

                        AGT

F630    Hv    CDR2    44    TGG GTC AGC ACT

                        TAC AAT GGT CGC ACA

                        AAT TAT GCA CAG AAG

                        TTC CGG GGC

F630    Hv    CDR3    45    GAT TAC TAT GAG

                        ACT AGT GGT TAC GCC

                        TAT GAT GAT TTT GCG

                        ATC

F630    Lt    CDR1    46    ACT CTG AGC AGT

                        GGG CAC AGC ACC TAC

                        GCC ATC GCG

F630    Lt    CDR2    47    GTC AAC AGT GAT

                        GGC AGC CAC ACC AAG

                        GGG GAC

F630    Lt    CDR3    48    CAG ACG TGG GGC

                        CCT GGC ATT CGA GTG

肽中可能还含有结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的可变区。结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的可变区(优选如此处所述的抗体可变区或来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生抗体的可变区)是：a)结合PNAG和dPNAG的可变区、b)结合PNAG但不结合dPNAG的可变区(此处称为PNAG结合可变区)，或c)结合dPNAG但不结合PNAG的可变区(此处称为dPNAG结合可变区)，而不论PNAG/dPNAG的来源。

本发明提供了至少6个不同的可变区，其中至少3个为重链可变区，而至少3个为轻链可变区。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：25为来自抗体克隆F598重链可变区的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：26为来自抗体克隆F598轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：27为来自抗体克隆F628重链可变区的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：28为来自抗体克隆F628轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：29为来自抗体克隆F630重链可变区的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO：6和SEQID NO：30为来自抗体克隆F630轻链可变区的氨基酸和核苷酸序列。

应当认识到本发明的核酸或肽可来自此处提供的序列，或来自保藏杂交瘤。可以克隆这些序列(例如通过PCR)并将其引入载体和/或细胞中，从而产生对应于全长可变区或全长可变区片段的肽，以及含有该可变区的抗体。因此有可能产生含有重链和轻链可变区组合的抗体或其片段。例如，本发明的抗体可含有来自MAb F598的重链可变区(或来自保藏的F598杂交瘤产生的抗体)以及F630的轻链可变区(或来自保藏的F630杂交瘤产生的抗体)。应当认识到，任何重链和轻链可变区(如此处公开的或如ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的杂交瘤产生抗体中所含的)的组合可用于合成本发明的抗体或抗体片段。

因此，本发明包括由下列可变区组合组成的抗体或抗体片段：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQID NO：4；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4；以及SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

与之相似，本发明包括由下列可变区组合组成的抗体或抗体片段：

1.ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的轻链可变区；

2.ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的轻链可变区；

3.ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的轻链可变区；

4.ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的轻链可变区；

5.ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的轻链可变区；

6.ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的轻链可变区；

7.ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤F598的轻链可变区；

8.ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤F628的轻链可变区；以及

9.ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的重链可变区，以及ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤F630的轻链可变区。

本发明旨在包括多种同种型的抗体及抗体片段。保藏杂交瘤产生IgG2同种型抗体。然而如实施例中所述，可从保藏杂交瘤中分离出重组免疫球蛋白(Ig)基因，特别是可变区基因，并将其克隆至编码人Ig重链和轻链恒定区基因的Ig重组载体中。利用这一技术，已经鉴定、合成并分离了结合葡萄球菌PNAG/dPNAG进而增强对表达PNAG细菌(如葡萄球菌)的调理吞噬作用的IgG1同种型抗体。

抗体可为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgE、IgM、IgA1、IgA2或sIgA同种型。本发明也旨在包括存在于非人物种中的同种型，例如但不仅限于鸟类和鲨鱼中的IgY。已知并描述了编码多种同种型恒定区的载体(见如Preston等人，Production and characterization of a set ofmouse-human chimeric immunoglobulin G(IgG)subclass and IgAmonoclonal antibodies with identical variable regions specific for P.aeruginosa serogroup 06 lipopolysaccharide.Infect Immun.1998Sep；66(9)：4137-42；Coloma等人，Novel vectors for the expression of antibodymolecules using variable regions generated by polymerase chain reaction.J Immunol Methods.1992Jul 31；152(1)：89-104；Guttieri等人，Cassettevectors for conversion of Fab fragments into full-length human IgG1monoclonal antibodies by expression in stably transformed insect cells.Hybrid Hybridomics.2003Jun；22(3)：135-45；McLean等人，Human andmurine immunoglobulin expression vector cassettes.Mol Immunol.2000Oct；37(14)：837-45；Walls等人，Vectors for the expression ofPCR-amplified immunoglobulin variable domains with human constantregions.Nucleic Acids Res.1993Jun 25；21(12)：2921-9；Norderhaug等人，Versatile vectors for transient and stable expression of recombinantantibody molecules in mammalian cells.J Immunol Methods.1997May12；204(1)：77-87)。

此处所用的术语“肽”包括单克隆抗体、功能活性的和/或等效的抗体片段、以及功能活性的和/或等效的肽或多肽。

本发明的肽为分离的肽。此处所用的术语“分离的肽”是指该肽基本纯净，且基本上不含有其在天然或体内系统中伴存的其它物质，其纯净程度对该肽的用途而言是切实可行且适用的。具体而言，肽的纯度及不含其宿主细胞的其它生物成分的程度，足以用于如生产药物制品或测序。由于本发明中分离的肽可能在药物制品中与可药用载体混合，该肽可能只占制品重量很小的百分比。然而该肽为基本纯净，因为已经基本分离掉了其在活体系统中伴存的物质。

本发明的肽结合PNAG和/或dPNAG，优选以选择性方式结合。此处所用的术语“选择性结合”和“特异性结合”可以互换使用，均指相对于非PNAG衍生化合物，肽能够以更强亲和力结合PNAG和/或dPNAG及其片段。也即，选择性结合PNAG和/或dPNAG的肽不会以其与PNAG和/或dPNAG及其片段结合的相同程度和相同亲和力结合非PNAG衍生化合物，除非交叉反应性抗原或分子为PNAG/dPNAG模拟物，例如以PNAG/dPNAG的相同方式结合与PNAG/dPNAG结合的肽的糖肽模拟物或抗独特型抗体可变区的模拟物。选择性结合PNAG的抗体与PNAG结合的亲和力大于与dPNAG结合的亲和力。结合dPNAG的抗体也可以比结合PNAG更小、相当或更大的亲和力结合dPNAG。在优选的实施方案中，本发明的肽仅结合PNAG和/或dPNAG及其片段，而甚至更优选它们至少结合dPNAG。此处所用的选择性或特异性结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的结合肽，也可结合其它来源的PNAG/dPNAG，而以更小的亲和力(如果有)结合非PNAG/dPNAG来源的化合物。更小的亲和力可包括至少降低10％、降低20％、降低30％、降低40％、降低50％、降低60％、降低70％、降低80％、降低90％、或降低95％。因此，此处的“选择性”是针对结合PNAG/dPNAG，而并非指结合葡萄球菌来源的PNAG/dPNAG形式。

如前文所述，本发明提供结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的肽，如抗体或抗体片段。此类抗体优选增强对表达PNAG的细菌(如表达PNAG的葡萄球菌)的调理和吞噬作用(即调理吞噬作用)，因此可用于预防和治疗受试者某些形式的细菌感染。调理是通过调理素(例如，抗体和/或调理性补体因子，如C4b或C3b或能促进调理吞噬作用的任何其他因子)在抗原上的沉积辅助吞噬作用的过程。吞噬作用和调理吞噬作用是吞噬细胞(如巨噬细胞、树突细胞和多形核白细胞(PMNL))吞入物质并将其封闭在其胞质内液泡(如吞噬体)中的过程。因此，调理细菌并增强吞噬功能的抗体或抗体片段可以识别抗原并沉积于其上，进而辅助吞噬细胞摄取和吞噬抗原(以及携带抗原的物质，例如葡萄球菌)。一般而言，为增强吞噬和调理作用，抗体中含有Fc结构域或区域。该Fc结构域由带有Fc受体的细胞(例如抗原呈递细胞，如巨噬细胞或PMNL)识别。此处所用的“增强调理吞噬作用”是指提高抗原或带有抗原底物通过抗体沉积被吞噬细胞识别和吞噬的可能性。通过体内细菌载量的降低或利用下述体外方法体外杀灭细菌细胞来测量这一增强。

本领域有调理作用的标准测定法。一般而言，此类测定测量存在抗体、抗原(表达于靶定细菌细胞)、补体及吞噬细胞时的杀菌量。通常使用动物或人血清作为补体来源，而动物或人多形核细胞通常用作吞噬细胞来源。调理吞噬性杀灭的靶细胞可为原核细胞(如本发明中)或真核细胞，取决于何种细胞类型表达该抗原。通过反应成分孵育前后计数存活细胞可以测量细胞杀灭。也可以通过测量反应混合物上清液中细胞内含物(例如放射性铬的释放或细胞内酶如乳酸脱氢酶的释放)来定量细胞杀灭。阅读本说明书后，其他可用于确定结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的抗体或抗体片段是否也刺激调理和吞噬作用的测定法对于本领域技术人员来说显而易见。

本发明本身提供增强调理性杀灭PNAG表达细菌(例如但不仅限于葡萄球菌)的PNAG/dPNAG特异性人单克隆抗体。这些抗体被命名为F598、F628和F630。当用于人体内时，人单克隆抗体的免疫原性大为降低(相对于另一物种的抗体而言)。因此，这些抗体代表了可用于疫苗设计以及针对表达PNAG细菌菌株(例如但不仅限于葡萄球菌)的被动免疫治疗的新物质。

实施例中描述了这些单克隆抗体的合成。简言之，如下获取抗体：从葡萄球菌感染恢复的个体中收集B细胞。利用Epstein-Barr病毒转化收集的B细胞，在生长一段时间并筛查对PNAG/dPNAG抗体的分泌后，将其与人-小鼠永生骨髓瘤细胞系配偶体(命名为HMMA 2.5)融合。融合细胞初步生长一段时间后，分离、培育单个产生抗体的克隆，并利用结合测定法(例如ELISA)分别分析之。基于其分泌抗体与葡萄球菌PNAG和/或dPNAG结合的能力，选择了3个杂交瘤。所有这3种抗体均为IgG2同种型，用作IgG2同种型抗体的来源。如上述通过PCR从杂交瘤中克隆可变区。

将抗体重链和轻链可变区的核酸克隆入含有IgG1(γ1)重链恒定区编码序列和λ轻链恒定区的人Ig表达载体(即TCAE6)中(见如Preston等人，Production and ch aracterization of a set of mouse-hum an chimericimmunoglobulin G(IgG)subclass and IgA monoclonal antibodies withidentical variable regions specific for P.aeruginosa serogroup O6lipopolysaccharide.Infect Immun.1998Sep；66(9)：4137-42)。可将可变区置于任何编码恒定区编码序列的载体中。例如，含有人IgG2、IgG3、IgG4基因组克隆和IgA重链恒定区基因，且缺乏可变区基因的人Ig重链恒定区表达载体描述于Coloma等人，1992J.Immunol.Methods 152：89-104中。

然后用这些表达载体转染细胞(如CHO DG44细胞)，细胞体外生长，随后从上清液中收获IgG1。所产生的抗体具有人可变区以及人IgG1和λ恒定区。利用如此处所述的结合和调理吞噬性杀灭测定，评价它们结合PNAG和/或dPNAG并增强对表达PNAG的细菌(如葡萄球菌)的调理和吞噬的能力。

此处所用的“分离的抗体”是指基本与其他细胞材料(例如分离自产生这些抗体的细胞)或与阻碍其在本发明诊断或治疗方法中用途的其他物质物理性分离的抗体。优选该分离的抗体以同质的抗体群(如单克隆抗体群)存在。然而，分离的抗体组合物可与其他成分组合，例如但不仅限于可药用载体、佐剂等。

此处所用的包括分离的杂交瘤和分离的重组细胞(如此处所述者)在内的“分离的产生抗体的细胞”，是指基本与其他细胞、其他机体材料(如腹水组织和液体)以及其他阻碍其在生产如分离的、优选为同质抗体群中用途的材料物理性分离的产生抗体的细胞。根据布达佩斯条约于2004年4月21日以ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933保藏入ATCC的杂交瘤，为分离的抗体产生细胞的实例，更具体而言为分离的杂交瘤的实例。

因此在一个实施方案中，本发明的肽为对葡萄球菌PNAG和/或dPNAG有特异性的分离的完整可溶性单克隆抗体。此处所用的术语“单克隆抗体”是指特异结合同一表位(如抗原决定簇)的同质免疫球蛋白群体。例如在一个实施方案中，本发明的肽为具有如下重链可变区的单克隆抗体，所述可变区中含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的氨基酸序列。该单克隆抗体可具有如下轻链可变区，所述可变区中含有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。本发明中包括具有任何轻链和重链可变区组合的单克隆抗体。

本发明旨在包括除了如克隆F598、F628和F630以外的抗体，只要这些抗体具有此处所述单克隆抗体的结合特征。任选地，这些额外的抗体也增强对表达PNAG的细菌菌株(例如但不仅限于表达PNAG的葡萄球菌)的调理吞噬作用。本领域普通技术人员能够利用此处详细描述的筛查和结合测定，容易地鉴定具有这些单克隆抗体功能特征(例如结合、调理和吞噬特性)的抗体。

在其他实施方案中，肽为抗体片段。正如本领域公知，抗体分子中仅有一小部分(即互补位)涉及抗体与其表位的结合(主要见如Clark，W.R.(1986)《The Experimental Foundations of Modern Immunology》Wiley &Sons，Inc.，New York；Roitt，I.(1991)《Essential Immunology》，第7版，Blackwell Scientific Publications，Oxford；以及Pier GB，Lyczak JB，Wetzler LM，(编辑)《Immunology，Infection and Immunity》(2004)第1版，American Society for Microbiology Press，Washington D.C.)。例如，抗体的pFc′和Fc区为补体级联反应的效应器，并介导与吞噬细胞Fc受体的结合，但不涉及抗原结合。pFc′区域被酶裂解的抗体或产生时就不具有pFc′区域的抗体，记作F(ab′)₂，保留了完整抗体的两个抗原结合位点。分离的F(ab′)₂为二价单克隆片段，因为其具有两个抗原结合位点。与之类似，Fc区域被酶裂解的抗体或产生时就不具有Fc区域的抗体，记作Fab片段，保留了完整抗体分子中抗原结合位点之一。更进一步，Fab片段由共价连接的抗体轻链和一部分标记为Fd的抗体重链(重链可变区)组成。Fd片段为抗体特异性的主要决定因素(单个Fd片段可与多达10个不同的轻链组合而不改变其抗体特异性)，且Fd片段在分离时保留了表位结合能力。

术语Fab、Fc、pFc′、F(ab′)₂和Fv的以任一标准免疫学意义使用[Klein，《Immunology》(John Wiley，New York，NY，1982)；Clark，W.R.(1986)《The Experimental Foundations of Modern Immunology》(Wiley& Sons，Inc.，New York)；Roitt，I.(1991)《Essential Immunology》，第7版，(Blackwell Scientific Publications，Oxford)；以及Pier GB，Lyczak JB，Wetzler LM，(编辑).《Immunology，Infection and Immunity》(2004)第1版，American Society for Microbiology Press，Washington D.C.]。

在其他实施方案中，可以替换本发明抗体的Fc部分以便产生IgM以及人IgG抗体，所述抗体具有一些或所有此处所述的单克隆抗体或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生单克隆抗体的CDR。尤其重要的是具有结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3区域，其次是具有此处所述的单克隆抗体或ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤产生单克隆抗体的其他CDR和构架区部分。此类人抗体具有特定的临床用途，因为它们能识别并结合(优选选择性结合)葡萄球菌PNAG和/或dPNAG，但不会激发人体针对抗体本身的免疫应答。

本发明还旨在包括结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的肽的功能等效变体。“功能等效变体”为具有与本发明中肽相同功能(即结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的能力，以及在某些实施方案中促进对表达PNAG细菌菌株的调理作用的能力)的化合物。功能等效变体的本质可能为肽，但不仅限于此。例如它可以为糖类、肽模拟物等。在重要的实施方案中，功能等效变体为具有可变区或CDR氨基酸序列的肽，其中含有保守性置换但仍能结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG。来自克隆F598重链可变区的结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3(即SEQ ID NO：1)的功能等效变体的实例是在SEQ ID NO：1中具有保守性置换、结合(优选特异性结合)葡萄球菌PNAG和/或dPNAG、并任选增强对表达PNAG细菌菌株如表达PNAG的葡萄球菌的调理作用的肽。此处所用的“保守性置换”，是指不改变进行氨基酸置换的肽中相对电荷或大小特征的氨基酸置换。氨基酸的保守性置换包括在下组氨基酸中各组内进行的置换：(1)M、I、L、V；(2)F、Y、W；(3)K、R、H；(4)A、G；(5)S、T；(6)Q、N；以及(7)E、D。

功能等效变体可与此处明确引用的肽具有同一性。即此类变体与此处提供的氨基酸序列之间可能具有99％的同一性，至少98％的同一性，至少97％的同一性，至少96％的同一性，至少95％的同一性，至少94％的同一性，至少93％的同一性，至少92％的同一性，至少91％的同一性，至少90％的同一性，至少85％的同一性，至少80％的同一性，至少75％的同一性，至少70％的同一性，至少65％的同一性，至少60％的同一性，至少55％的同一性，至少50％的同一性，至少45％的同一性，至少40％的同一性，至少35％的同一性，至少30％的同一性，至少25％的同一性，至少20％的同一性，至少10％的同一性，或至少5％的同一性。

功能等效是指等效的活性(例如与葡萄球菌PNAG和/或dPNAG结合，或促进对表达PNAG细菌菌株如表达PNAG的葡萄球菌的调理吞噬作用)，然而，此类活性的水平也有差异。例如，只要该变体仍可用于本发明(即其结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG，并任选增强对表达PNAG细菌菌株如表达PNAG的葡萄球菌的调理吞噬作用)，功能等效变体与葡萄球菌PNAG和/或dPNAG结合的亲和力可以小于、等于或大于此处所述的单克隆抗体克隆。

可以通过本领域普通技术人员已知的多种方法完成此类置换。例如根据Kunkel的方法(Kunkel，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82：488-492，1985)进行PCR定向突变、定点诱变；或通过化学合成编码此处所述的特定CDR或含有该CDR氨基酸序列的肽的基因，进行氨基酸置换。这些以及其他改变含CDR的肽的方法为本领域普通技术人员公知，且可见于汇编此类方法的参考文献中，如上文提及的Sambrook或Ausubel。然而在某些实施方案中，由于CDR的大小因素，利用如那些可购得的肽合成仪合成变体肽可能更方便。可以通过结合测定测试结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR的功能等效变体的活性，在某些情况下也可通过以下详述的生物活性测定进行测试。此处所用的术语“功能性变体”、“功能等效变体”以及“功能活性变体”可互换使用。

此处所用的术语“功能活性抗体片段”是指，抗体分子中包括本发明中葡萄球菌PNAG或dPNAG结合区域的片断，所述区域分别保留了结合(优选以特异方式结合)葡萄球菌PNAG或dPNAG的能力。此类片段可用于体外和体内。具体而言，公知的功能活性抗体片段包括但不仅限于抗体的F(ab′)₂、Fab、Fv和Fd片段。这些片段缺乏完整抗体的Fc片段，能更快地从循环中清除，因此相比完整抗体可能具有更低的非特异性组织结合(Wahl等人，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。又例如，可以根据Ladner等人美国专利No.4,946,778中所述的方法构建单链抗体。此类单链抗体中含有通过可变接头部分连接的轻链和重链可变区。也已经报道了获得含有分离的可变重链单结构域的单结构域抗体(“Fd”)的方法(见如Ward等人，Nature 341：644-646(1989)，公开了用于鉴定抗体重链可变区(VH单结构域抗体)的筛查方法，该重链可变区对其靶表位的亲和力足以使其在分离形式下与之结合)。基于已知抗体重链和轻链可变区序列生产重组Fv片段的方法为本领域公知，且已描述于如Moore等人，美国专利No.4,462,334中。描述抗体片段的用途和产生的其他参考文献包括如：Fab片段(Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985))、Fv片段(Hochman等人，Biochemistry 12：1130(1973)；Sharon等人，Biochemistry 15：1591(1976)；Ehrlich等人，美国专利No.4,355,023)以及抗体分子部分(Audilore-Hargreaves，美国专利No.4,470,925)。因此，本领域技术人员可从完整抗体的多个部分构建抗体片段，而不破坏该抗体对葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的特异性。

本发明的重要方面在于，功能活性抗体片段也保留了调理和吞噬表达PNAG的细菌(如表达PNAG的葡萄球菌)的能力。在后一种情况下，抗体片段包括Fc区域以及表位结合结构域。Fc区域使抗体片段能结合Fc受体阳性细胞，该细胞随后可吞噬由抗体Fab区域结合的表位。

通过重组可以很容易地合成或产生额外的小肽，包括那些含有结合葡萄球菌PNAG/dPNAG的CDR3区域的肽，从而产生本发明的肽。此类方法为本领域普通技术人员所公知。例如，可利用可购得的自动化肽合成仪合成肽。也可通过重组技术产生肽，即将表达该肽的DNA引入表达载体，再用该表达载体转化细胞以产生肽。

利用本领域已知的标准结合测定法，可以测试肽(包括抗体)结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的能力。在合适的测定实例中，可将PNAG和/或dPNAG(如葡萄球菌PNAG和/或dPNAG)固定于表面(例如多孔平板的孔内)，然后接触标记的肽。然后可以定量结合PNAG和/或dPNAG(从而使其自身固定于平面上)的肽量，以确定是否有特定的肽结合PNAG和/或dPNAG。或者也可测量未结合表面的肽量。在该测定法的变化形似中，可以测试肽直接结合体外生长的PNAG表达克隆的能力。

可以利用竞争性测定法测试肽的结合。若待测肽(包括抗体)与此处所述的单克隆抗体或抗体片段竞争，即表现为单克隆抗体或片段的结合降低，则该肽有可能与单克隆抗体结合相同或至少是有重叠的表位。在该测定系统中，标记抗体或抗体片段，并将PNAG和/或dPNAG固定在固相表面上。此处将更加详细地描述这些以及其他测定法。借此可以鉴定竞争性肽包括竞争性抗体。本发明包括与抗体F598、F628或F630竞争结合PNAG/dPNAG的肽，特别是抗体(及其片段)(即识别并结合与F598、F628或F630相同表位的抗体)。

标准的结合测定法为本领域所公知，其中有一些适用于本发明，包括ELISA、竞争性结合测定法(如上所述)、夹层测定法、利用放射性标记的肽或放射性标记的抗体的放射性受体测定法、免疫测定法等。测定法的本质并不重要，只要它的灵敏度足以检测少量肽的结合。

结合混合物中也可含有多种其他试剂。这些试剂可用于促进最佳结合，包括如盐、缓冲液、中性蛋白质(如白蛋白)、去污剂等。此类试剂也可以减少反应成分间的非特异或背景相互作用。也可使用其他能够改善测定效力的试剂。在单克隆抗体可正常特异性结合PNAG和/或dPNAG(如葡萄球菌PNAG和/或dPNAG)的条件下，孵育前述测定材料的混合物。优选该条件模拟生理条件。容易确定添加成分的顺序、孵育温度、孵育时间以及其他该测定的参数。该实验仅涉及测定参数的最佳化，并非测定的基本组成。一般而言，孵育温度在4℃至40℃之间。优选最小化孵育时间以促进迅速、高通量的筛查，一般为0.1至10小时。孵育后，通过操作者可用的任何方便方法检测是否存在肽与PNAG和/或dPNAG间的特异性结合。

一般而言，平行测定不同肽或不同肽浓度的多种测定混合物，以得到多种浓度下的不同反应。使用以下浓度之一作为阴性对照，即PNAG和/或dPNAG浓度为零或PNAG和/或dPNAG浓度在测定检测限度以下。

通常使用分离步骤将结合的肽或抗体与未结合的肽或抗体分离。可以通过多种方法完成这一分离步骤。方便起见，通过结合PNAG和/或dPNAG将至少一种成分(如肽或抗体)固定在固相底物上。可以容易地将未结合的成分与结合级分分离。所述固相底物可由很多种材料制成，也可具多种形状，例如聚丙烯酰胺柱或凝胶、琼脂糖或琼脂糖凝胶、微量滴定板、微珠、树脂颗粒等。分离步骤中优选包括多次漂洗或洗涤。例如当固相底物为微量滴定板时，可用洗涤溶液将孔洗涤数次，所述洗涤溶液一般包括孵育混合物中不参加特异性结合的那些成分，如盐、缓冲液、去污剂、非特异性蛋白质等。当固相底物为磁珠时，可将磁珠用洗涤溶液洗涤一次或多次并通过磁场分离。

在本发明的检测和治疗方法中，可以如此处详述单独使用肽或与其他分子如检测或细胞毒性剂缀合使用。

一般而言，成份之一中通常含有或耦联或缀合于可检测的标记。可检测标记为能直接或间接确定其存在的部分。一般而言，标记的检测涉及标记中能量的发射。通过其发射和/或吸收具有特定波长(例如放射性、荧光、光度或电子密度等)的光子或其他原子颗粒的能力，可以直接检测该标记。通过其结合、募集以及某些情况下裂解另一部分的能力可以间接检测标记(例如表位标记如FLAG表位、酶标记如辣根过氧物酶等)，其中所述部分自身可以发射或吸收特定波长的光。间接检测的实例如使用可将底物裂解为可视产物的第一酶标记。该标记的本质可为化学物质、肽或核酸分子，但并不限于此。其他可检测标记包括放射性同位素如P³²或H³、荧光标记物，如荧光染料，光或电子密度标记物等，或为表位标记如FLAG表位或HA表位、生物素、抗生物素蛋白，以及酶标记物如辣根过氧物酶、β-半乳糖苷酶等。可在合成过程中或合成后将标记结合于肽。有多种不同的标记物和标记方法为本领域普通技术人员已知。可用于本发明的标记种类的实例包括酶、放射性同位素、荧光化合物、胶体金属、化学发光化合物以及生物发光化合物。本领域普通技术人员知晓其他适用于此处所述肽的标记，或者能通过常规实验确定这些标记。此外，可以利用本领域技术人员的常规标准技术实施这些标记与本发明肽之间的偶联或缀合。

灵敏度更大的另一种标记技术是将肽偶联于低分子量半抗原。然后可通过二次反应特异性地改变这些半抗原。例如常使用的半抗原如可与抗生物素蛋白反应的生物素，或可与特定抗半抗原抗体反应的二硝基酚、吡哆醛或荧光素。

其中，将肽(包括抗体或其部分)缀合于可检测标记有助于这些物质在诊断性测定中的用途。另一类型的可检测标记包括诊断和影像标记(一般称为体内可检测标记)，例如核磁共振成像(MRI)的Gd(DOTA)；核医学的²⁰¹Tl、发射γ射线的放射性核素⁹⁹mTc；正电子成像术(PET)中发射正电子的同位素，(18)F-氟代脱氧葡萄糖((18)FDG)、(18)F-氟化物、铜-64、钆双胺以及Pb(II)的放射性同位素如²⁰³Pb；111In。

此处所述的缀合或修饰应用常规化学，该化学并非本发明的一部分且为化学领域的技术人员所公知。保护性基团和已知接头如单及异双功能接头的应用完善记载于文献中，此处不再重复。

此处所用的“缀合的”是指两个实体间通过任何物理化学手段彼此稳定连接。对该连接的性质而言，至关重要的是其不会对任一个部分的效力造成太大损害。考虑到这些参数，可以使用本领域普通技术人员已知的任何共价的或非共价的连接。在某些实施方案中优选共价连接。非共价连接包括疏水相互作用、离子相互作用、高亲合力相互作用如生物素-抗生物素蛋白和生物素-链霉亲和素复合物以及其他亲和力相互作用。这些手段和方法为本领域普通技术人员公知。

根据标记和其他测定成分的性质，可以使用多种方法检测标记。例如，可当标记结合于固相底物时或从固相底物上分离后检测标记。通过光或电子密度、放射性发射、非放射性能量转移等可直接检测标记，或利用抗体缀合物、链霉亲和素-生物素缀合物等间接检测之。检测标记的方法为本领域所公知。

此处所述的单克隆抗体也可用于生产抗独特型抗体，后者可用于筛查和鉴定与本发明单克隆抗体结合特异性相同的其他抗体。抗独特型抗体识别本发明单克隆抗体中的独特决定簇。这些决定簇位于抗体的高度可变区。正是这一区域结合特定表位，从而负责抗体的特异性。可以利用公知的杂交瘤技术生产此类抗独特型抗体(Kohler和Milstein，Nature，256：495，1975)。例如，通过用单克隆抗体免疫受试者可制备抗独特型抗体。该免疫的受试者能识别免疫所用单克隆抗体的独特型决定簇并对其产生应答，且产生针对这些独特型决定簇的抗体。利用免疫动物中对本发明单克隆抗体具有特异性的抗独特型抗体，可以鉴定与用于免疫的单克隆抗体具有相同独特型的其他克隆。两个细胞系的单克隆抗体独特型相同，证明这两个单克隆抗体在识别同一表位决定簇上是相同的。因此，使用抗独特型抗体能够鉴定表达具有相同表位特异性单克隆抗体的其他杂交瘤。本发明包括所有前述的抗体类型。

抗独特型抗体也可用于主动免疫(Herlyn等人，Science，232：100，1986)，因为可以利用该抗独特型技术产生模拟表位的单克隆抗体。例如，针对第一单克隆抗体产生的抗独特型单克隆抗体，在其高度可变区内具有为第一单克隆抗体结合表位的映像的结合结构域。因此，该抗独特型抗体可用于主动免疫，因为其结合结构域可有效用作抗原。

本发明还包括双特异性抗体，其中包括特异于PNAG/dPNAG的第一抗原结合结构域，以及特异于另一部分的第二抗原结合结构域。特异于PNAG/dPNAG的第一抗原结合结构域可包括任何结合PNAG/dPNAG的肽(包括此处所述或产生的或来自ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932和PTA-5933的保藏杂交瘤的CDR、可变区、Fab片)。第二抗原结合结构域可对细胞如细菌细胞或宿主细胞上的一个部分具有特异性。宿主细胞可为免疫系统细胞或来自感染组织的细胞。免疫系统细胞表达的或来自多种宿主组织细胞的细胞表面分子的抗体一般均可从如Sigma或BDBiosciences Pharmingen等来源购得。本领域普通技术人员根据此处的教导以及本领域的知识，能够生产出此类双特异性抗体。与之相似，本发明也包括三特异性抗体。(双特异性及三特异性抗体的生成见如US5,945,311和6,551,592)。

已经确定了负责本发明单克隆抗体特异性的序列。因此，可用重组DNA技术制备本发明的肽。在美国有机构商业化实施该功能，如ThomasJefferson University以及Scripps Protein and Nucleic Acids CoreSequencing Facility(La Jolla，California)。例如，可以通过聚合酶链式反应，利用可降解或不可降解引物(来自氨基酸序列)从保藏杂交瘤RNA制备cDNA可变区。可亚克隆cDNA以产生足量的双链DNA，通过常规测序反应或装置测序。

已知抗葡萄球菌PNAG/dPNAG单克隆抗体重链和轻链的核酸序列，本领域常规技术人员能够生产编码该抗体或编码上述多种抗体片段、人源化抗体或多肽的核酸。设想将此类核酸与其它核酸有效连接，以形成用于克隆或表达本发明肽的重组载体。本发明包括任何含有该编码序列或其部分的重组载体，不管其是用于原核或真核转化、转染还是基因治疗。可利用本领域技术人员已知的常规分子生物学技术制备该类载体，其中包括CDR区域(优选CDR3区域)和提供抗体特异性的其它可变序列或其部分的DNA编码序列，还包括其他非特异肽序列以及具有(Whittle等人，Protein Eng.1：499，1987和Burton等人，Science 266：1024-1027，1994)或不具有(Marasco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：7889，1993和Duan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)91：5075-5079，1994)用于输出或分泌的信号序列的合适启动子。可通过本领域技术人员已知的常规技术，将此类载体转化或转染入原核(Huse等人，Science 246：1275，1989，Ward等人，Nature 341：644-646，1989；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581，1991以及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：7978，991)或真核(Whittle等人，1987以及Burton等人，1994)细胞，或用于基因治疗(Marasco等人，1993和Duan等人，1994)。

此处所用的“载体”可为多种核酸中的任一种，所述核酸中通过限制性切割和连接插入了目的序列，以在不同遗传环境中转运或在宿主细胞中表达。载体一般由DNA组成，但也有RNA载体。载体包括但不仅限于质粒和噬粒。克隆载体能够在宿主细胞中复制，且其特征在于具有一个或多个核酸内切酶限制性位点，在这些位点上载体可以确定的方式被切割并连接入所需的DNA序列，从而使新的重组载体保留了在宿主细胞中复制的能力。当使用质粒时，所需序列的复制可能由于宿主细菌中质粒拷贝数的增加而多次发生；或者只在有丝分裂之前每一宿主中进行一次复制。使用噬菌体时，复制可主动发生于溶菌期或被动发生于溶源期。表达载体为可通过限制性切割和连接插入所需DNA序列的载体，从而使之有效连接于调节序列并可表达为RNA转录物。载体中还可含有一个或多个细胞标记序列，所述序列适用于鉴定已经或尚未被所述载体转化或转染的细胞。标记包括如，能够增强或降低对抗生素或其他化合物耐受性或敏感性的蛋白质的编码基因、通过本领域已知标准测定法可检测其活性的酶(如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的编码基因，以及对转化或转染细胞、宿主、克隆或菌斑的表型具有可视影响的基因。优选的载体为能够自主复制并表达与之有效连接的DNA片段呈现的结构基因产物的载体。

本发明的表达载体包括有效连接于编码本发明肽之一的核苷酸序列的调节序列。此处所用的术语“调节序列”，是指对编码所需多肽的核苷酸序列转录必需或有益的核苷酸序列，或对所产生转录物翻译为所需多肽必需或有益的核苷酸序列。调节序列包括但不仅限于5’序列如操纵子、启动子及核糖体结合序列，以及3’序列如多腺苷酸化信号。本发明的载体中可任选包括5’前导或信号序列、编码融合产物以辅助蛋白质纯化的5’或3’序列，以及多种有助于鉴定或选择转化株的标记。选择和设计合适载体处于本领域普通技术人员的能力和判断范围内。可以通过本领域已知的多种标准方法完成随后的肽纯化。

优选用于筛查肽(但对于大量生产本发明肽并不一定优选)的载体为含有编码并能表达融合多肽的核苷酸序列的重组DNA分子，所述多肽中从氨基端至羧基端含有(1)原核分泌信号结构域，(2)本发明的多肽，以及任选的(3)融合蛋白质结构域。载体包括用于表达融合多肽的DNA调节序列，优选原核调节序列。此类载体可由本领域技术人员构建，且已由Smith等人(Science 228：1315-1317，1985)、Clackson等人(Nature 352：624-628，1991)；Kang等人(《Methods：A Companion to Methods in Enzymology》：卷2，R.A.Lemer和D.R.Burton编辑.Academic Press，NY，111-118页，1991)；Barbas等人(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：7978-7982，1991)、Roberts等人(Proc.Natl.Acad Sci.(USA)89：2429-2433，1992)描述。

融合多肽可用于纯化本发明的肽。该融合结构域可例如包括使能在Ni+柱上纯化的聚组氨酸末端，或可购买的载体pMAL(New EnglandBioLabs，Beverly，MA)的麦芽糖结合蛋白质。目前优选但并非必需的融合结构域为丝状噬菌体膜锚。该结构域特别有助于筛查噬菌体的单克隆抗体展示文库，但在抗体的大量生产中可能用处较小。丝状噬菌体膜锚优选为能结合丝状噬菌体颗粒基质从而将融合多肽整合到噬菌体表面的cpIII或cpVIII外壳蛋白结构域，由此使多肽能固相结合于特异性抗原或表位，并允许富集和选择由噬体载体编码的特异性抗体或片段。

分泌信号为靶向宿主细胞蛋白质膜(例如革兰氏阴性细菌的周质膜)的蛋白质前导肽结构域。优选用于大肠杆菌的分泌信号为pelB分泌信号。来自两个Erwinia carotova pelB基因产生变体的分泌信号结构域的预测氨基酸残基序列如Lei等人(Nature 381：543-546，1988)所述。pelB蛋白质的前导序列曾用作融合蛋白质的分泌信号(Better等人，Science 240：1041-1043，1988；Sastry等人，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)86：5728-5732，1989；以及Mullinax等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：8095-8099，1990)。可用于本发明的其他大肠杆菌分泌信号多肽结构域的氨基酸残基序列，可见于Oliver，In Neidhard，F.C.(编辑)，《Escherichia coli andSalmonella Typhimurium》，American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1：56-69(1987)。

为实现大肠杆菌中高水平的基因表达，不但有必要使用强启动子以产生大量mRNA，也必须使用强核糖体结合位点以确保mRNA的有效翻译。大肠杆菌中的核糖体结合位点包括起始密码子(AUG)以及位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长为3-9个核苷酸的序列(Shine等人，Nature254：34，1975)。序列AGGAGGU又称为Shine-Dalgamo(SD)序列，与大肠杆菌16S rRNA的3’端互补。核糖体与mRNA以及mRNA3’端序列的结合受到若干因素的影响：(i)SD序列与16S rRNA 3’末端的互补性程度；(ii)SD序列与AUG之间的间距及可能的DNA序列(Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：760.，1979a：Roberts等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76：5596，1979b；Guarente等人，Science 209：1428，1980；以及Guarente等人，Cell 20：543，1980)。通过测量系统改变间距的质粒中基因的表达水平达到最优化。对不同mRNA的比较显示，位点-20至+13(其中AUG的A为位点0)上存在统计学优选的序列(Gold等人，Annu.Rev.Microbiol.35：365，1981)。已显示前导序列能够显著影响翻译(Roberts等人，1979a，b前文)；和(iii)AUG后面影响核糖体结合的核苷酸序列(Taniguchi等人，J.Mol.Biol.，118：533，1978)。

3’调节序列定义了至少与异源融合多肽框内有效连接的终止(停止)密码子。

在有关原核表达宿主的优选实施方案中，使用的载体包括原核来源的复制起点或复制子，即能在原核宿主细胞(例如以之转化的细菌宿主细胞)染色体外直接自主复制和维持重组DNA分子的DNA序列。此类复制起点为本领域所公知。优选复制起点为在宿主生物中有效的复制起点。优选宿主细胞为大肠杆菌。在大肠杆菌中应用载体时，优选的复制起点为见于pBR322及其他多种常用质粒的ColEl。同样优选的为见于pACYC及其衍生物的p15A复制起点。ColE和p15A复制子已广泛用于分子生物学，可获自多种质粒，其描述见Sambrook等人，《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。

此外，包括原核复制子的那些实施方案中优选也含有表达后可赋予所转化细菌宿主以选择优势(如药物抗性)的基因。一般细菌药物抗性基因为赋予对氨苄青霉素、四环素、新霉素/卡那霉素或氯霉素抗性的基因。载体中一般也含有方便的限制性位点以引入可翻译的DNA序列。载体实例为质粒pUC18和pUC19，以及衍生载体，如获自Invitrogen(San Diego，CA)的pcDNAII。

若本发明的肽为同时包括重链和轻链序列的抗体，这些序列可以由分离的载体编码，或更方便地由单个载体表达。在翻译或分泌后，重链和轻链可形成天然抗体分子的异二聚体结构。此类异二聚化抗体可能通过重链和轻链间的二硫键稳定化，也可能没有。

表达异二聚化抗体(如本发明的完整抗体或本发明抗体的F(ab′)₂、Fab或Fv片段)的载体，为改造来接受和表达第一和第二可翻译DNA序列的重组DNA分子。即，表达异二聚化抗体的DNA表达载体提供了将两个可翻译DNA序列独立克隆入(引入)载体中两个分离表达盒的系统，从而形成表达异二聚化抗体的第一和第二多肽的两个分离的顺反子。用于表达两个顺反子的DNA表达载体被称作双顺反子表达载体。

优选该载体含有包括上游和下游DNA调节序列的第一表达盒，所述调节序列经由改造来用于定向连接的核苷酸序列与插入DNA有效连接。上游可翻译序列优选编码上述分泌信号。表达盒中包括表达第一抗体多肽的DNA调节序列，其中第一抗体多肽由插入的可翻译DNA序列(插入DNA)借助改造来用于定向连接的核苷酸序列定向插入表达盒产生。

双顺反子表达载体中也含有用于表达第二抗体的第二表达盒。该第二表达盒中含有优选编码上述分泌信号的第二可翻译DNA序列，该DNA序列的3’端通过改造来用于定向连接的核苷酸序列与一般定义表达盒阅读框架中至少一个终止密码子的载体下游DNA序列有效连接。第二可翻译DNA序列于其5’端与DNA调节序列有效连接以形成5’元件。第二表达盒在引入可翻译DNA序列(引入DNA)后，能够表达含有分泌信号及由引入DNA编码多肽的第二融合多肽。

本发明的肽也可由真核细胞如CHO细胞、人杂交瘤、永生化B淋巴母细胞等产生。在这种情况下，构建含真核调节序列与编码肽的核苷酸序列有效连接的载体。设计和选择合适的真核载体为本领域普通技术人员能力及判断力所能及。可以通过本领域已知的一系列标准方法进行随后的肽纯化。

在另一个实施方案中，本发明提供由本发明载体转化或转染、因而含有该载体的原核及真核宿主细胞。

此处所用的有关核酸的术语“分离的”是指：(i)通过如聚合酶链式反应(PCR)体内扩增的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)通过如裂解和凝胶分离纯化的；或(iv)通过如化学合成合成的。分离的核酸为可用本领域公知的重组DNA技术处理的核酸。因此，含于载体中、其5’和3’限制性位点已知或其聚合酶链式反应(PCR)引物序列已公开的核苷酸序列为分离的，而在天然宿主中以天然状态存在的核酸序列则并非分离的。分离的核酸可为基本纯化的，但并非必需。例如从克隆或表达载体中分离的核酸并不纯净，因为其中可能含有仅极少百分比的其所在细胞的物质。然而，这种核酸却是分离的，因为此处用该术语表明其可用本领域普通技术人员已知的标准技术处理。

此处所用的编码序列与调节序列的“有效连接”是指，它们间的共价连接方式可使编码序列的表达或转录处于调节序列的影响或控制下。如果需要编码序列被翻译成功能蛋白质，则当诱导5’调节序列启动子能引发编码序列的转录，且这两个DNA序列间连接的形式不会(1)导致引入移码突变，(2)干扰启动子区域指导编码序列转录的能力，或(3)干扰相应的RNA转录物翻译为蛋白质的能力，则两个DNA序列为有效连接。因此，如果启动子区域能够影响DNA序列的转录从而使产生的转录物可被翻译为所需的蛋白质或多肽，则该启动子区域有效连接于该编码序列。

基因表达所需的调节序列的精确本质可能随物种或细胞种类的不同而不同，但一般必须包括，分别涉及转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。特别地，该5’非转录调节序列可包括启动子区域，包括用于转录控制有效连接基因的启动子序列。必要时调节序列中也可含有增强子序列或上游激活子序列。

本发明也旨在包括此处所述肽的体内或体外用途。本发明的方法可用于诊断和治疗由表达PNAG的细菌引发的感染，如葡萄球菌感染。此处所用的“葡萄球菌”是指所有表达PNAG抗原的葡萄球菌物种。被归类于葡萄球菌的细菌为本领域技术人员所公知，并描述于微生物学文献中。表达PNAG的葡萄球菌包括但不仅限于表皮葡萄球菌(包括RP62A(ATCC保藏号35984)、RP12(ATCC保藏号35983)和M187)、金黄色葡萄球菌(包括RN4220(pCN27)和MN8粘液型)，以及经ica基因座中的基因转化的菌株，如肉葡萄球菌(包括TM300(pCN27))。其它表达PNAG的细菌菌株天然携带或经转化具有pga基因座。其实例包括大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌(以上均为具有完整pgaABCD基因座的已测序物种)，以及伴放线放线杆菌(AA)、胸膜肺炎放线杆菌(Ap)、茄科雷尔氏菌(例如巨质粒形式)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支气管腐败杆菌。其他表达PNAG的细菌菌株可由本领域普通技术人员很容易鉴定。例如，携带ica或pga基因座的细菌能产生PNAG。由于已知ica或pga基因座的核酸序列(表皮葡萄球菌，述于Heilmann，C.，O.Schweitzer，C.Gerke，N.Vanittanakom，D.Mack和F.Gotz(1996)Molecular basis of intercellularadhesion in the biofilm-forming Staphylococcusepidermidis.Molec.Microbiol.20：1083；金黄色葡萄球菌，见Cramton SE，Gerke C，SchnellNF，Nichols WW，Gotz F.The intercellular adhesion(ica)locus is presentin Staphylococcusaureus and is required for biofilm formation.InfectImmun.1999Oct；67(10)：5427-33)；Blattner，F.R.，G.Plunkett III，C.A.Bloch，N.T.Perna，V.Burland，M.Riley，J.Collado-Vides，J.D.Glasner，C.K.Rode，G.F.Mayhew，J.Gregor，N.W.Davis，H.A.Kirkpatrick，M.A.Goeden，D.J.Rose，B.Mau，and Y.Shao.1997.The complete genomesequence of Escherichia coli K-12.Science 277：1453-1474。由Blattner等人报告的基因被命名为ycdSRQP，在Wang等人，J.Bacteriology，May2004，2724-2734页，卷186，No.9.中又被命名为pgaABCD)，本领域普通技术人员可容易地筛查mRNA的表达或有关ica或pga基因座的蛋白质。此外可以利用液相色谱和质谱分离并分析细菌菌株的荚膜。

本发明提供的检测或诊断方法一般包括将本发明的一种或多种肽与受试者样品体内或体外接触。虽然也设计了体内检测方法，但优选先从受试者中收集样品。样品可包括任何怀疑含有细菌的机体组织或体液。例如，葡萄球菌感染可发生于几乎人体所有的组织、器官及体液中，但最常见于感染皮肤、骨、关节、肺脏和血液。大肠杆菌感染可发生于如生殖泌泌尿道，以及其它组织和部位。鼠疫杆菌感染为皮肤腹股沟淋巴结鼠疫以及肺内肺鼠疫的病因。百日咳博德特氏菌感染会引起呼吸道的百日咳。基本上可以测试任何体液、组织或器官(如皮肤、骨、关节、肺脏)、粘膜(如膈)及血液中的细菌存在。

此处所用的术语“治疗”是指对受试者施用肽以达到医学所需的益处。因此，“治疗”包括“预防性”和“治疗性”治疗方法。预防性治疗方法是指在诊断感染(如葡萄球菌感染)前对受试者施用治疗。换言之，尽管受试者可能具有感染的风险，但并不表现出感染(如葡萄球菌感染)症状。治疗性治疗方法是指在诊断感染(如葡萄球菌感染)后对受试者施用的治疗。换言之，受试者已经被诊断患有感染(如葡萄球菌感染)，或受试者可能表现出此类感染相关的症状。

本发明的抗PNAG/dPNAG抗体可用于诱导受试者的被动免疫，以预防那些具有暴露于传染剂风险的受试者中发生全身性感染和疾病，或限制其进展。通过对受试者施用有效剂量的抗PNAG/dPNAG抗体(如可引发对葡萄球菌如金黄色葡萄球菌的调理作用的抗体)，可诱导出对表达PNAG细菌如葡萄球菌(如金黄色葡萄球菌)感染的被动免疫。此处所用的“被动免疫”包括对受试者施用抗体，所述抗体接触细菌的表面并导致细菌被吞噬，其中该抗体产生于不同的受试者中(包括相同或不同物种的受试者)。

可向任何有发生表达PNAG的细菌感染(如表达PNAG的葡萄球菌感染)风险的受试者施用抗PNAG/dPNAG抗体，以诱导被动免疫；在某些实施方案中特别适用于不能诱导对PNAG和/或dPNAG的自动免疫的受试者。不能产生免疫应答的受试者为免疫无应答受试者(如接受化疗的病人、AIDS病人等)或尚未发展出免疫系统的受试者(如早产儿)。

此处所用的“受试者”为恒温哺乳动物，包括但不仅限于人、灵长类、农业动物(如马、牛、猪、山羊、绵羊和鸡)，以及家养动物，如狗和猫。某些实施方案中，受试者为非啮齿类受试者。非啮齿类受试者为上述任一种受试者，但特别不包括啮齿类，如小鼠、大鼠和兔。在某些实施方案中，优选的受试者为人。某些情况下，受试者已经或将要接受假体如髋关节或膝关节置换，因为此类装置尤其容易定居细菌。正如此处所述，本发明的某些方面也提供了对植物感染的检测和治疗。

以能诱导对表达PNAG的细菌(如葡萄球菌例如金黄色葡萄球菌)免疫力的有效量向受试者施用本发明的抗PNAG/dPNAG抗体。“能诱导对表达PNAG的细菌免疫力的有效量”，是指抗PNAG/dPNAG抗体的剂量足以(i)预防暴露于此类细菌的受试者中发生此类细菌感染；(ii)抑制感染的进展，即阻遏或减缓其进展；和/或(iii)减轻感染的影响，即减少感染受试者中的细菌载量或完全清除该细菌。例如，此处所用的“能诱导对葡萄球菌免疫力的有效量”是指抗PNAG/dPNAG抗体的量足以(i)预防暴露于葡萄球菌的受试者中发生葡萄球菌感染；(ii)抑制感染的进展，即阻遏或减缓其进展；和/或(iii)减轻感染的影响，即减少感染受试者中的细菌载量或完全清除该细菌。

利用本发明普通技术人员已知的常规方法、通过能预测抗体调理性水平的体外调理测定法，能确定某一剂量的抗PNAG/dPNAG抗体是否为“能诱导对感染免疫力的有效量”。当把调理表达PNAG的细菌(如表达PNAG的葡萄球菌)的抗体加入此类细菌样品中时，能引起对该细菌的吞噬。调理性测定法可为比色法、化学发光测定法、荧光或放射性标记摄取测定法、细胞介导的杀菌测定法或测量物质的调理能力的其他测定法。

根据施用方式的不同，有效抗体量为1ng/kg至100mg/kg。优选范围为500ng至500μg/kg，最有效为1-100μg/kg。绝对量取决于一系列因素，包括是对尚未被细菌感染的高风险受试者用药还是对已经感染的受试者用药、同时采用的治疗、剂量数以及病人受试者参数(包括年龄、身体状况、身高和体重)。这些因素为本领域普通技术人员所公知，且通过常规试验就能完成。一般而言优选使用最大剂量，即根据慎重医学判断的最高安全剂量。

本发明也包括多重剂量的抗体。一般而言，免疫计划包括使用高剂量抗体后，经过若干星期的等待期使用随后的低剂量抗体。也可使用更多剂量。被动免疫的剂量表可能需要更为频繁的施药。本领域的普通技术人员仅利用常规试验就能确定递送多此剂量的特定PNAG/dPNAG抗体的时间间隔。

可以使用多种施用途径。所选的具体方式显然取决于选择的具体抗PNAG/dPNAG抗体、治疗的具体情况以及治疗效力所需的剂量。一般而言，可以利用任何可用于医疗的施用方式实施本发明的方法，也即能产生有效水平保护而不会引起临床有害的不良作用的任何方式。优选的施用方式为肠胃外途径。术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内和胸骨内注射或输注技术。其他途径包括但不仅限于经口、经鼻、经皮、舌下以及局部施用。

本发明的抗PNAG/dPNAG抗体可与其他抗细菌药物(如抗生素)或其它抗细菌抗体联合使用。抗生素在治疗细菌感染中的用途是常规的。常用的施用剂型(如片剂、植入物、可注射溶液等)中可同时含有本发明的抗体以及抗细菌药物和/或抗体。或者也可分别剂量抗细菌药物和/或抗体。抗细菌药物或抗体也可缀合于抗PNAG/dPNAG抗体。

抗细菌药物为公知，包括：青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林、巴氨西林、氨环烷西林、依匹西林(epicillin)、海他西林(hetacillin)、匹氨西林(pivampicillin)、甲氧西林、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、邻氯青霉素、双氯西林、氟氯西林(flucloxacillin)、羧苄西林、替卡西林(ticarcillin)、avlocillin、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)、美西林(amdinocillin)、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛(cefaclor)、头孢唑林(cefazolin)、头孢呋新酯、头孢孟多(cefamandole)、头孢尼西(cefonicid)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢甲肟、头孢曲松、拉氧头孢(moxalactam)、头孢替坦(cefotetan)、头孢哌酮、头孢他啶、亚胺培南(imipenem)、克拉维酸盐、特美汀(timentin)、舒巴坦、新霉素、红霉素、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、林可霉素、万古霉素、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲基异恶唑、氨基糖甙类、喹诺酮类、四环素和利福平(见Goodman和Gilman′s，Pharmacological Basics of Therapeutics，第8版，1993，McGraw HillInc.)。

根据本发明的方法，可于药物组合物中施用肽。一般而言，药物组合物含有本发明的肽及可药用载体。用于肽、单克隆抗体及抗体片段的可药用载体为本领域普通技术人员所公知。此处所用的可药用载体是指不会干扰活性成分生物活性(如肽结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的能力，以及任选增强调理和吞噬的能力)的无毒物质。

可药用载体包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂及其他本领域公知的材料。肽的可药用载体的具体实例描述于美国专利No.5,211,657。此类制品常规含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体以及任选其他治疗剂。当用于药物中时盐必须为可药用，但不可药用盐可以便利地用于制备其可药用盐，因此不排除在本发明范围外。此类药理允许且可药用盐包括但不仅限于从以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、顺丁烯二酸(马来酸)、醋酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐也可制备为碱性金属或碱土盐，如钠、钾或钙盐。

本发明的肽可成型为固体、半固体、液体或气体形式的剂型，如片剂、胶囊、粉剂、颗粒、膏剂、溶液、储存剂、吸入剂和注射剂，以及经口、肠胃外或手术施用的常用方式。本发明还包括为局部施用配制的药物组合物，如通过植入物。

适于经口施用的组合物可为独立单位，如胶囊、片剂、锭剂，各含有预定剂量的活性剂。其他组合物包括水性液体或非水性液体的悬浮剂如糖浆、酏剂或乳剂。

当此处所述的化合物(包括肽和非肽变体)用于治疗时，在某些实施方案中理想的施用途径可能为经肺气雾剂。制备含有化合物的气雾剂递送系统的技术为本领域技术人员公知。一般而言，此类系统应当使用不会显著损害肽生物学性质的成分(见如Sciarra和Cutie，“Aerosols”，《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第18版(1990)中，1694-1712页；引入作为参考)。本领域技术人员能熟练确定生产气雾剂的多种参数及条件而不需诉诸过度的试验。

本发明的方法也包括将本发明的肽与常规疗法联合使用治疗潜在的细菌感染的步骤。例如，可将本发明的方法与常规疗法同时实施，例如抗生素疗法。在某些实施方案中，肽可以与常规疗法基本同时施用。“基本同时”是指本发明的肽施用于受试者与施用常规疗法(如抗生素)之间在时间上足够接近，其中这两种化合物可能会产生累积甚至是协同作用。在某些情况下，肽与常规治疗剂彼此缀合。在另一些情况下，这些化合物为物理性分离。

本发明的肽可直接施用于组织。优选该组织为细菌感染存在的组织。或者该组织为感染可能起源于其中的组织。可通过直接注射实现直接的组织施用。肽可以施用一次，也可多次施用。如果多次施用，可以从不同途径施用肽。例如，第一次(或前几次)可直接施用于受累组织，而此后的施用可为全身性施用。

肠胃外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)，以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮剂，包括盐水和缓冲液。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖液、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液或固体油。经静脉载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格葡萄糖的电解质补充剂)等。也可含有防腐剂及其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。可利用其他施用形式如经静脉施用实现较低剂量。当应用初始剂量受试者应答不足时，可以在病人耐受性允许的范围内使用更高剂量(或通过不同的更为局部化递送途径的有效更高剂量)。可考虑每日多次剂量以达到合适的化合物全身水平。

在其他实施方案中，优选的载体为适于植入哺乳动物接受者体内的生物相容性微粒或植入物。可用于本方法的可生物蚀解的植入物实例述于PCT国际申请No.PCT/US/03307(公开号WO 95/24929，题为“聚合物基因递送系统”，要求于1994年3月15日递交的美国专利申请系列no.213,668的优先权)。PCT/US/0307描述了含有生物大分子的具生物相容性、优选可生物降解的聚合基质。该聚合基质可用于实现物质在受试者内的持续释放。根据本发明的一个方面，此处所述的物质可包被于或分散于PCT/US/03307中公开的具生物相容性、优选可生物降解的聚合基质中。聚合基质优选为微粒形式，如微球(其中物质分散于固体聚合基质中)或微胶囊(其中物质贮存于聚合壳的核内)。用于包含活性物质的聚合基质的其他形式包括薄膜、包衣、凝胶、植入物和支架(stent)。选择聚合基质装置的大小和组成，以实现基质装置植入的组织中令人满意的释放动力学。聚合基质大小的选择还要依据欲使用的递送方法，一般为注射入组织或通过气雾剂向鼻和/或肺区内施用悬浮液。可选择聚合基质的组成以使其降解速率满意，同时又由生物粘附性材料构成，从而当装置施用于血管、肺或其他表面时能进一步提高转运的有效性。也可选择基质成分并非降解而是通过扩散在延长时间段内释放。

生物不可降解和可降解聚合基质都可用于将本发明的物质递送至受试者。优选可生物降解的基质。此类基质可为天然或合成聚合物。优选合成聚合物。根据释放所需的时间长度选择聚合物，所需时间一般为数小时到数年或者更长。一般而言，最期望达到的释放期为数小时至3到12个月。聚合物任选为在水中可吸收多达约其质量的90％的水凝胶形式，水凝胶，此外任选聚合物与多价离子或其他聚合物交联。

一般而言，可利用可生物侵蚀的植入物，通过扩散方式或更优选通过聚合基质的降解递送本发明的活性物质。可用于形成可生物降解的递送系统的合成聚合物实例包括：聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烃、聚亚烷基二醇、聚烯化氧、聚对苯二甲酸亚苯基酯、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚乙烯卤化物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸、聚硅氧烷、聚氨酯及其共聚物；烷基纤维素、羟烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、丙烯酸及甲基丙烯酸酯聚合物、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、醋酸纤维素、醋酸-丙酸纤维素、醋酸-丁酸纤维素、纤维醋法酯、羧乙基纤维素、三乙酸纤维素、硫酸纤维素钠盐、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二烷基酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯吡咯烷酮。

生物不可降解聚合物包括聚醋酸乙烯、聚(甲基)丙烯酸、聚酰胺、共聚物及其混合物。

可生物降解的聚合物实例包括，合成聚合物如乳酸聚合物和羟乙酸聚合物、聚酐、聚(原)酸酯、聚丁酸、聚正戊酸以及聚乳酸己内酯共聚物；天然聚合物如海藻酸盐及其他多糖，包括葡萄糖和纤维素、胶原、其化学衍生物(取代、添加化学基团如烷基和烯基、羟基化、氧化以及其他本领域技术人员常规使用的修饰)；白蛋白及其他亲水蛋白质；锌及其他醇溶谷蛋白和疏水蛋白质、共聚物及其混合物。一般而言，这些材料可通过表面或大量侵蚀，经酶水解或体内暴露于水而降解。

受到特别关注的生物粘附聚合物包括，可生物侵蚀的水凝胶(述于H.S.Sawhney，C.P.Pathak和J.A.Hubell的Macromolecules，1993，26，581-587中，此处引用其教导)、聚透明质酸、酪蛋白、明胶、明胶蛋白、聚酐、聚丙烯酸、海藻盐、壳聚糖、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸十二烷基酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八烷基酯。

其他递送系统包括即时释放、延迟释放或缓释递送系统。此类系统可避免肽的重复施用，从而使受试者和医生都更为方便。可以使用多种类型的递送系统，并为本领域普通技术人员所知。它们包括基于聚合物的系统如聚(乳酸-乙交酯)、共聚草酸盐、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于如美国专利号5,075,109中。递送系统也包括非聚合系统，如脂质，包括固醇(如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸)或中性脂肪如单、双及三甘油酯；水凝胶递送系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包被；利用常规连接剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中血小板降低物质含于如美国专利No.4,452,775、4,675,189和5,736,152所述的基质形式中；以及(b)扩散系统，其中活性成分以控制的速率从如美国专利No.3,854,480、5,133,974和5,407,686种所述的聚合物中渗透出来。此外还可使用基于泵的硬件递送系统，其中有一些经过改造可用于植入。

长期缓释植入物的使用可能特别适合于对具有发生感染(如葡萄球菌感染)风险的受试者进行预防性治疗。此处所用的“长期释放”，是指构建和排列植入物使其递送治疗水平的活性成分可达至少30天，优选60天。长期缓释植入物为本领域普通技术人员所公知，且包括上述的某些释放系统。

提供以下实施例以说明本发明实施的具体实例，但并不在于限制本发明的范围。对于本领域普通技术人员显而易见的是，本发明可以多种组合物和方法应用。

实施例

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌与多种医院和社区获得性感染相关。抗生素耐药性的产生促使发展新的疗法来治疗和预防这些感染。细菌与宿主细胞或植入人工装置间的粘附对于葡萄球菌实现感染通常很重要。体内表达于葡萄球菌表面的此类粘附分子之一，亦为保护性抗体的作用靶，是聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)。其他细菌也表达并使用该粘附分子，例如但不仅限于大肠杆菌。

试验方法

杂交瘤：

发生金黄色葡萄球菌感染后，从病人中收集血样，并利用FicollHypaque沉淀法从中分离出外周血单核细胞(PBMC)。在Posner等人所述(Posner等人，Epstein Barr virus transformation of peripheral blood Bcells secreting antibodies reactive with cell surface antigens.Autoimmunity.1990；8(2)：149-58.)的B95.8细胞系产生的Epstein-Barr病毒(EBV)中暴露过夜，以刺激B细胞。24小时后，洗涤细胞并将其以1×10⁶PBMC/孔的浓度分散于96孔平板中，其中含有含10％淋巴细胞条件培养基(LyCM，制备自用植物凝集素刺激48小时的人PBMC)的100μl生长培养基(添加20％FBS的RPMI1640)中。5天后，另加入100μl添加10％LyCM的生长培养基。然后每周除去100μl消耗培养基并加入100μl添加10％LyCM的生长培养基，喂养EBV刺激的细胞。

当密集接种孔后(孔表面超过80％的底部有生长，且培养基出现提示细胞生长的pH改变可证实之)，利用ELISA筛查培养物中是否产生PNAG/dPNAG特异性抗体。然后将对抗体有阳性反应的单个孔中的细胞分散至组织培养平板的48孔中，生长数日后测试上清液对PNAG/dPNAG抗原的反应性。

然后，如前述(Posner等人.The construction and use of ahuman-mouse myeloma analogue suitable for the routine production ofhybridomas secreting human monoclonal antibodies.Hybridoma.1987Dec；6(6)：611-25)将ELISA测试仍为阳性的培养物与人-小鼠骨髓瘤细胞系HMMA 2.5融合，以生产杂交瘤。融合后，于微孔平板的生长培养基(添加20％FBS、次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)和哇巴因(oubain)的RPMI1640)内培养细胞，以选择融合细胞。隔周喂养这些培养物，并用ELISA筛查抗体的产生。

以每孔1个细胞的密度克隆杂交瘤，用ELISA筛查阳性生长孔中的特异性抗体，并将含有抗体产生阳性杂交瘤的孔依次扩展至容积递增的组织培养平板孔中、随后容积递增的烧瓶中，以获得克隆细胞系。回收了3种杂交瘤，它们被命名为F598、F628和F630，可产生结合PNAG、dPNAG或同时结合两者的人IgG₂抗体。

PNAG的化学修饰：

为了除去大部分N-和O-取代基，将纯化PNAG溶解于5M NaOH中使终浓度为0.5mg/ml，并在37℃下振荡孵育18小时。然后用5N HCl中和该强碱溶液，使最终pH为6至8，并用dH₂O透析24小时。冷冻干燥样品得到终产物。

ELISA：

用100μl敏化缓冲液中的最佳结合浓度(天然PNAG 0.6μg/ml，而dPNAG 3μg/ml)的各种抗原(0.2M NaH₂PO₄，0.2M Na₂HPO₄，0.02％叠氮)包被Immulon4微滴定板，并在4℃下孵育过夜。用PBS/0.05％tween洗涤平板3次，并用200μl含5％脱脂乳的PBS封闭，然后在4℃下孵育过夜。随后洗涤平板并加入在含5％脱脂乳/0.05％tween的PBS(稀释缓冲液)中稀释的不同浓度的纯化MAb。于37℃下孵育平板1小时并洗涤。加入100μl用稀释缓冲液1∶1000稀释的第二抗体(缀合于碱性磷酸酶(AP)的抗人IgG全分子，且获自ICN)。于37℃下孵育平板1小时并洗涤。加入100μl含1mg/ml对硝基苯磷酸盐的底物缓冲液(500ml H₂O中含800mg NaHCO₃、1.46g Na₂CO₃、10mg MgCl、20mg Na3N)，并将平板于室温下孵育30分钟。于405nm处读板。以Sigma的纯化人IgG为标准，定量平板上的用抗人IgG敏化的MAb。

补体沉积测定：

如ELISA测定中制备微滴定板。与MAb孵育并洗涤后，使用以稀释缓冲液1∶50稀释的3种不同金黄色葡萄球菌菌株吸收的正常人血清作为补体来源。于37℃下孵育平板15分钟。洗涤平板后，加入浓度为1∶2000的山羊抗人C3抗体，并于37℃下孵育1小时。加入1∶2000抗山羊IgG-AP缀合物，并于37℃下孵育1小时。基本如ELISA测定中显色平板，只是时间仅为15分钟。

调理吞噬测定：

上文已经描述了调理吞噬性杀菌测定(见Ames等人.Infection andImmunity 49：281-285，1985，以及Maira-Litran等人.Infect Immun.70(8)：4433-4440，2002.)。使用的靶菌株为Mn8(金黄色葡萄球菌)。使靶菌株生长至波长650nm(OD650)处的光密度为0.4，并将之稀释至1∶100进行测定。使金黄色葡萄球菌Mn8m菌株吸收补体(通过商业途径如Accurate Chemical And Scientific Corp.Westbury，New York 11590得自幼兔，并使用1∶15的稀释浓度)1小时(重悬浮至OD 650为1.0)。利用肝素/葡萄糖(1∶1混合)从新取人血液中分离多形核细胞(PMN)。使用的PMN浓度为5×10⁶细胞/ml。含不同浓度单克隆抗体的溶液用作抗体来源。同时加入每一成分各100μl(单克隆抗体溶液、PMN、补体、目标细菌)，然后于37℃下旋转孵育1.5小时。取上清液并稀释之，然后将其等份铺板于胰酶大豆琼脂(TSA)上，一般使用1∶100以及1∶1000稀释的上清液。于37℃下孵育过夜后，计数细菌克隆并计算杀菌水平。

抗体可变区的克隆：

利用Qiagen的RNAeasy试剂盒在约6×10⁶细胞中提取RNA。利用Qiagen Omniscript试剂盒将1μg总RNA逆转录为cDNA。以1μl cDNA产物作为模板进行PCR反应。每一反应是由50μl Invitrogen Hi fi混合物、各种核苷酸引物各100pmol以及1μl cDNA模板组成。按以下程序进行约30轮PCR循环：94℃下30秒，循环：94℃下30秒、65℃下30秒、72℃下1分钟，最终延伸72℃下5分钟。测序PCR产物并利用Ig BLAST程序在NCBI数据库中可得的已知生殖系序列中进行搜索。

用于克隆于2004年4月21日保藏入ATCC、ATCC保藏号为PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤所产生的抗体可变区的引物如下：(5’-3’，其中限制性位点用下划线表示，起始ATG为黑体)：

F598轻链

λ恒定区：GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG(SEQ IDNO：49)

Huλsig 5：AGATCTCTCACCATGGCATGGATCCCTCTCTTC(SEQ ID NO：50)

F598重链

重链恒定区：TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC(SEQ ID NO：51)

VH7LDRHU：GTCGACATGAAACATCTGTGGTTCTTC(SEQ ID NO：52)

F628轻链

λ恒定区：GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG(SEQ ID NO：49)

Huλsig 1：AGATCTCTCACCATGGCCRGCTTCCCTCTCCTC(SEQ ID NO：53)

F628重链

重链恒定区：TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC(SEQ ID NO：51)

VH7LDRHU：GTCGACATGAAACATCTGTGGTTCTTC(SEQ ID NO：52)

F630轻链

λ恒定区：GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG(SEQ ID NO：49)

Huλsig 5：AGATCTCTCACCATGGCATGGATCCCTCTCTTC(SEQ ID NO：50)

F630重链

重链恒定区：TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC(SEQ ID NO：51)

VH1LDRHU：GTCGACATGGACTGGACCTGGA(SEQ ID NO：54)

体内细菌攻击测定：

经静脉(IV)向小鼠施用同时结合PNAG和dPNAG的MAb F598，或作为对照的非结合PNAG/dPNAG的人抗绿脓杆菌海藻酸盐IgG1 MAb或MEP(记作MAb F429)，诱导被动免疫。24小时后，通过施用MAb相同的途径用金黄色葡萄球菌(5×10⁷CFU/小鼠)攻击小鼠。

利用注射后2小时血液中CFU水平，衡量施用MAb诱导对金黄色葡萄球菌被动免疫的效果。

结果

MAb序列：

以下显示了MAb F598、F628和F630可变区及CDR的氨基酸和核苷酸序列。CDR区域为下划线表示，恒定区为斜体。

Ia.F598重链可变区核苷酸及氨基酸序列排列

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

Q   V   Q   L   Q   E    S  G   P   G   L   V   K   P   S

GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT

E   T   L   S   L   T   C   T   V   S   G   G   S   I   S

GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG

G   Y   Y   W   S   W   I   R   Q   P   P   G   K   G   L

GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC

E   W   I   G   Y   I   H   Y   S   R   S   T   N   S   N

CCC GCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG

P   A   L   K   S   R   V   T   I   S   S   D   T   S   K

AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG

N   Q   L   S   L   R   L   S   S   V   T   A   A   D   T

GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT

A   V   Y   Y   C   A   R   D   T   Y   Y   Y   D   S   G

GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC

D   Y   E   D   A   F   D   I   W   G   Q   G   T   M   V

ACC GTC TCC TCA   (SEQ ID NO：25)

T   V   S   S     (SEQ ID NO：1)

Ib.F598重链可变区氨基酸序列

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIHYSRSTNSNPA

LKSRVTISSDTSKNQLSLRLSSVTAADTAVYYCARDTYYYDSGDYEDAFDIWGQGTMVTVSS

(SEQ ID NO：1)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIHYSRSTNSNPA

LKSRVTISSDTSKNQLSLRLSSVTAADTAVYYCARDTYYYDSGDYEDAFDIWGQGTMVTVSS

AS  (SEQ ID NO：55)

Ic.F598重链可变区核苷酸序列

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT

GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG

GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC

CCC GCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG

AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG

GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT

GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC

ACC GTC TCC TCA

(SEQ ID NO：25)

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT

GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG

GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC

CCC GCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG

AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG

GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT

GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC

ACC GTC TCC TCA GCT AGC

(SEQ ID NO：56)

IIa.F598轻链可变区氨基酸及核苷酸序列排列

CAG CTT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA

Q   L   V   L   T   Q   S   P   S   A   S   A   S   L   G

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGC CAC AGC AAC

A   S   V   K   L   T   C   T   L   S   S   G   H   S   N

TAC GCC ATC GCT TGG CAT CAG CAG CAG CCA GGG AAG GGC CCT CGC

Y   A   I   A   W   H   Q   Q   Q   P   G   K   G   P   R

TAC TTG ATG AAG GTT AAC AGA GAT GGC AGC CAC ATC AGG GGG GAC

Y   L   M   K   V   N   R   D   G   S   H   I   R   G   D

GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC ACC TCT GGG GCT GAG CGT

G   I   P   D   R   F   S   G   S   T   S   G   A   E   R

TAC CTC ACC ATC TCC AGT CTC CAG TCT GAA GAT GAG GCT GAC TAT

Y   L   T   I   S   S   L   Q   S   E   D   E   A   D   Y

TAC TGT CAG ACC TGG GGC GCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

Y   C   Q   T   W   G   A   G   I   R   V   F   G   G   G

ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT    (SEQ ID NO：26)

T   K   L   T   V   L   G  (SEQ ID NO：2)

IIb.F598轻链可变区氨基酸序列

QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSNYAIAWHQQQPGKGPRYLMKVNRDGSHIRGDGI

PDRFSGSTSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGAGIRVFGGGTKLTVLG

(SEQ ID NO：2)

QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSNYAIAWHQQQPGKGPRYLMKVNRDGSHIRGDGI

PDRFSGSTSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGAGIRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSV

(SEQ ID NO：57)

IIC.F598轻链可变区核苷酸序列

CAG CTT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGC CAC AGC AAC

TAC GCC ATC GCT TGG CAT CAG CAG CAG CCA GGG AAG GGC CCT CGC

TAC TTG ATG AAG GTT AAC AGA GAT GGC AGC CAC ATC AGG GGG GAC

GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC ACC TCT GGG GCT GAG CGT

TAC CTC ACC ATC TCC AGT CTC CAG TCT GAA GAT GAG GCT GAC TAT

TAC TGT CAG ACC TGG GGC GCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT

(SEQ ID NO：26)

IIIa.F628重链可变区氨基酸及核苷酸序列排列

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

Q   V   Q   L   Q   E   S   G   P   G   L   V   K   P   S

GAG ACC CTG TCC CTC ACG TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGT

E   T   L   S   L   T   C   T   V   S   G   G   S   I   S

AAT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG TCC CCA GGG AGG GGA CTG

N   Y   Y   W   S   W   I   R   Q   S   P   G   R   G   L

GAG TGG ATT GGG TAT ATC CAT TAT AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT

E   W   I   G   Y   I   H   Y   S   G   S   T   N   S   N

CCA TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTT GAC ACG TCC AAG

P   S   L   K   S   R   V   T   I   S   V   D   T   S   K

AAC CAG GTC TCC CTG AAG CTG GGC TCT GTG ACC GCT GCG GAC ACG

N   Q   V   S   L   K   L   G   S   V   T   A   A   D   T

GCC ATA TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT

A   I   Y   Y   C   A   R   D   T   Y   Y   E   S   S   G

CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC

H   W   F   D   G   L   D   V   W   G   Q   G   T   S   V

ACC GTC TCC TCA  (SEQ ID NO：27)

T   V   S   S    (SEQ ID NO：3)

IIIb.F628重链可变区氨基酸序列

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQSPGRGLEWIGYIHYSGSTNSNPS

LKSRVTISVDTSKNQVSLKLGSVTAADTAIYYCARDTYYESSGHWFDGLDVWGQGTSVTVSS

(SEQ ID NO：3)

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQSPGRGLEWIGYIHYSGSTNSNPS

LKSRVTISVDTSKNQVSLKLGSVTAADTAIYYCARDTYYESSGHWFDGLDVWGQGTSVTVSS

ASTKGP  (SEQ ID NO：58)

IIIc.F628重链可变区核苷酸序列

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

GAG ACC CTG TCC CTC ACG TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGT

AAT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG TCC CCA GGG AGG GGA CTG

GAG TGG ATT GGG TAT ATC CAT TAT AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT

CCA TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTT GAC ACG TCC AAG

AAC CAG GTC TCC CTG AAG CTG GGC TCT GTG ACC GCT GCG GAC ACG

GCC ATA TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT

CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC

ACC GTC TCC TCA

(SEQ ID NO：27)

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG

GAG ACC CTG TCC CTC ACG TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGT

AAT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG TCC CCA GGG AGG GGA CTG

GAG TGG ATT GGG TAT ATC CAT TAT AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT

CCA TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTT GAC ACG TCC AAG

AAC CAG GTC TCC CTG AAG CTG GGC TCT GTG ACC GCT GCG GAC ACG

GCC ATA TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT

CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC

ACC GTC TCC TCA GCT AGC ACC

(SEQ ID NO：59)

IVa.F628轻链可变区氨基酸及核苷酸序列排列

CAG CCT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA

Q   P   V   L   T   Q   S   P   S   A   S   A   S   L   G

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG GAC AGT GAA CAC AGC AGA

A   S   V   K   L   T   C   T   L   D   S   E   H   S   R

TAC ACC ATC GCA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG AAG GGC CCT CGG

Y   T   I   A   W   H   Q   Q   Q   P   E   K   G   P   R

TAC CTG ATG AAG GTT AAG AGT GAT GGC AGT CAC AGC AAG GGG GAC

Y   L   M   K   V   K   S   D   G   S   H   S   K   G   D

GGC ATT ACT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT GGG GCT GAG CGC

G   I   T   D   R   F   S   G   S   S   S   G   A   E   R

TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAC TAT

Y   L   T   I   S   S   L   Q   S   E   D   E   A   D   Y

TAC TGT CAG ACT TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

Y   C   Q   T   W   G   P   G   I   R   V   F   G   G   G

ACC AAG CTG ACC GTC CTA   (SEQ ID NO：28)

T   K   L   T   V   L     (SEQ ID NO：4)

IVb.F628轻链可变区氨基酸序列

QPVLTQSPSASASLGASVKLTCTLDSEHSRYTIAWHQQQPEKGPRYLMKVKSDGSHSKGDGI

TDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGPGIRVFGGGTKLTVL

(SEQ ID NO：4)

IVc.F628轻链可变区核苷酸序列

CAG CCT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG GAC AGT GAA CAC AGC AGA

TAC ACC ATC GCA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG AAG GGC CCT CGG

TAC CTG ATG AAG GTT AAG AGT GAT GGC AGT CAC AGC AAG GGG GAC

GGC ATT ACT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT GGG GCT GAG CGC

TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAC TAT

TAC TGT CAG ACT TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

ACC AAG CTG ACC GTC CTA  (SEQ ID NO：28)

Va.F630重链可变区氨基酸及核苷酸序列排列

CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG ATG AAG AGG CCT GGG

Q   V   Q   L   V   Q   S   G   A   E   M   K   R   P   G

GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC

A   S   V   K   V   S   C   K   A   S   G   Y   T   F   T

AAC TTT GGT ATC AGT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT

N   F   G   I   S   W   V   R   Q   A   P   G   Q   G   L

GAG TGG ATA GGA TGG GTC AGC ACT TAC AAT GGT CGC ACA AAT TAT

E   W   I   G   W   V   S   T   Y   N   G   R   T   N   Y

GCA CAG AAG TTC CGG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC

A   Q   K   F   R   G   R   V   T   M   T   T   D   T   S

ACG AAC ACA GCG TAC ATG GAA CTG AGG AGC CTG GGA TCT GAC GAC

T   N   T   A   Y   M   E   L   R   S   L   G   S   D   D

ACG GCC GTC TTT TAC TGT GCG AGA GAT TAC TAT GAG ACT AGT GGT

T   A   V   F   Y   C   A   R   D   Y   Y   E   T   S   G

TAC GCC TAT GAT GAT TTT GCG ATC TGG GGC CAA GGG ACA TTG GTC

Y   A   Y   D   D   F   A   I   W   G   Q   G   T   L   V

ACC GTC TCC TCA    (SEQ ID NO：29)

T   V   S   S      (SEQ ID NO：5)

Vb.F630重链可变区氨基酸序列

QVQLVQSGAEMKRPGASVKVSCKASGYTFTNFGISWVRQAPGQGLEWIGWVSTYNGRTNYAQ

KFRGRVTMTTDTSTNTAYMELRSLGSDDTAVFYCARDYYETSGYAYDDFAIWGQGTLVTVSS

(SEQ ID NO：5)

Vc.F630重链可变区核苷酸序列

CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG ATG AAG AGG CCT GGG

GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC

AAC TTT GGT ATC AGT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT

GAG TGG ATA GGA TGG GTC AGC ACT TAC AAT GGT CGC ACA AAT TAT

GCA CAG AAG TTC CGG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC

ACG AAC ACA GCG TAC ATG GAA CTG AGG AGC CTG GGA TCT GAC GAC

ACG GCC GTC TTT TAC TGT GCG AGA GAT TAC TAT GAG ACT AGT GGT

TAC GCC TAT GAT GAT TTT GCG ATC TGG GGC CAA GGG ACA TTG GTC

ACC GTC TCC TCA

(SEQ ID NO：29)

VIa.F630轻链可变区氨基酸及核苷酸序列排列

CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT GCT TCC CTG GGA

Q   L   V   L   T   Q   S   P   S   A   S   A   S   L   G

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC

A   S   V   K   L   T   C   T   L   S   S   G   H   S   T

TAC GCC ATC GCG TGG CAT CAG CAG CAG CCA CTG AGG GGT CCT CGT

Y   A   I   A   W   H   Q   Q   Q   P   L   R   G   P   R

TTC TTG ATG AAA GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC

F   L   M   K   V   N   S   D   G   S   H   T   K   G   D

GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGT TCT GGG GCT GAG CGC

G   I   P   D   R   F   S   G   S   S   S   G   A   E   R

TAC CTC TCC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAA GAT GAG TCT GAC TAT

Y   L   S   I   S   S   L   Q   S   E   D   E   S   D   Y

TAC TGT CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

Y   C   Q   T   W   G   P   G   I   R   V   F   G   G   G

ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT    (SEQ ID NO：30)

T   K   L   T   V   L   G      (SEQ ID NO：6)

VIb.F630轻链可变区氨基酸序列

QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSTYAIAWHQQQPLRGPRFLMKVNSDGSHTKGDGI

PDRFSGSSSGAERYLSISSLQSEDESDYYCQTWGPGIRVFGGGTKLTVLG

(SEQ ID NO：6)

QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSTYAIAWHQQQPLRGPRFLMKVNSDGSHTKGDGI

PDRFSGSSSGAERYLSISSLQSEDESDYYCQTWGPGIRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSV

(SEQ ID NO：60)

VIc.F630轻链可变区核苷酸序列

CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT GCT TCC CTG GGA

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC

TAC GCC ATC GCG TGG CAT CAG CAG CAG CCA CTG AGG GGT CCT CGT

TTC TTG ATG AAA GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC

GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGT TCT GGG GCT GAG CGC

TAC CTC TCC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAA GAT GAG TCT GAC TAT

TAC TGT CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT  (SEQ ID NO：30)

CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT GCT TCC CTG GGA

GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC

TAC GCC ATC GCG TGG CAT CAG CAG CAG CCA CTG AGG GGT CCT CGT

TTC TTG ATG AAA GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC

GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGT TCT GGG GCT GAG CGC

TAC CTC TCC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAA GAT GAG TCT GAC TAT

TAC TGT CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG

ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCT GCC CCA TCG GTC

ACC TGT TCC CGC CTC  (SEQ ID NO：61)

IgG2 MAb的表征：

根据其各自相应融合数命名杂交瘤：F598、F628及F630。由这些杂交瘤产生的抗体均为IgG2和λ型。利用蛋白质G柱纯化抗体后，通过ELISA确定这些MAb表位特异性的不同。对天然PNAG进行化学修饰以除去某些取代基。强碱(5M NaOH)处理可除去大部分N-乙酰基团。如图1所示，虽然结合曲线不同，所有抗体与天然形式的PNAG均结合良好。当用5M NaOH处理PNAG以产生dPNAG时，F598 MAb结合活性最高(图2)。这一结果提示F598对PNAG的主链表位具有特异性，且并不需要N-和O-乙酰化基团以结合PNAG聚合物。MAb F630以及F628与dPNAG结合不多，提示其特异性需要天然形式PNAG含有的乙酸基。

利用竞争性ELISA确定MAb的相对结合活性。图3显示了这些MAb的相对结合活性为：F598＞F628＞F630。

IgG1转换型MAb的制备和表征：

人IgG1同种型抗体相对于IgG2同种型，能更好地将补体固定在抗原表面上。因此，克隆MAb的可变区并产生IgG1同种型。利用针对IgG2恒定区的引物以及对原始杂交瘤中鉴定的可变区5’端具有特异性的引物(见此处“抗体可变区的克隆”中列举的引物)，获取原始IgG2杂交瘤细胞系中分离的mRNA制备的cDNA的PCR产物。测序并分析PCR产物，确定最有可能产生每种抗体的生殖细胞基因。表1为杂交瘤常用于产生针对PNAG和/或dPNAG抗体的生殖细胞基因。如该表所示，MAb F598、F628和F630使用相同的轻链生殖细胞基因和重链D区。唯一的区别在于，V基因用于产生MAb F630重链，而J基因用于产生MAbF628的重链；MAb的其余生殖细胞基因相同。

表1.

将编码整个可变区的DNA克隆入TCAE6载体，其编码的可变区包括每一MAb中(F598、F728和F630)的重链V、J和D节段以及轻链V和J节段，所述载体中含有κ轻链和IgG1重链人恒定区。初始的构建体保留了来自原始杂交瘤的重链和轻链基因的原始配对。将含有各个构建体的质粒DNA转染入CHO细胞，纯化并表征产生的IgG1 MAb。如图4及图5所示，所有的IgG1 MAb具有与初始IgG2 MAb相同的PNAG结合曲线，然而F628和F630 MAb的IgG1构建体丧失了一部分结合dPNAG的能力(如图1和2的比较)。

为测试IgG1 MAb是否比亲本IgG2 MAb具有更大的功能性补体活化活性，实施补体沉积测定。补体测定就其本质而言为一种ELISA测定，测量将人血清加入反应混合物时补体蛋白C3的沉积。如图6所示，所有IgG1 MAb的补体固定活性均优于其亲本IgG2。补体固定活性提高的程度则取决于MAb类型。对MAb F598而言，其对PNAG和dPNAG的结合活性最强，其IgG1的活性比IgG2同种型仅有轻微增加。对于MAb F628和F630而言，IgG1 MAb的补体沉积活性相比于亲本IgG2 MAb至少倍增。

调理吞噬性活性：

测试单克隆抗体F598、F628和F630的IgG1和IgG2形式(6μg MAb)对金黄色葡萄球菌菌株Mn8的调理吞噬性活性。使用单克隆抗体F598IgG1形式时，CFU的减少(即杀灭)水平最高(图7)。

对感染的被动保护：

在用金黄色葡萄球菌菌株Mn8攻击前24小时，向小鼠施用同时结合PNAG和dPNAG的MAb F598，结果与接受非相关抗原绿脓杆菌藻酸盐MAb的小鼠相比，感染后2小时每ml血中CFU的数目减少了68％(P＝0.002的显著性水平)(图8A)。图8B显示了接受对照MAb或MAb F598gl的每一动物个体中，每ml血液中的金黄色葡萄球菌CFU。在用5×10⁸CFU金黄色葡萄球菌(Mn8菌株)腹膜内(IP)攻击前4小时，对每只FVB小鼠施用800μg MAb F598，结果相对于施用对照MAb(特异于绿脓杆菌的F429)的小鼠而言存活率增加。图8C显示了这些试验的结果。细菌攻击后5天，所有接受F598的小鼠以及仅约20％接受对照MAb的小鼠仍然存活(每组8只小鼠)。

大肠杆菌泌尿道感染分离物：

分离18个大肠杆菌泌尿道感染(UTI)分离物，通过PCR测试pga基因座的存在，并利用抗金黄色葡萄球菌PNAG的抗血清、通过免疫印迹测试其中的PNAG表达。将临床分离物种植于培养基中，通过标准技术提取DNA以用于PCR，或在细胞稳定期时对细胞进行EDTA抽提(煮沸5分钟)。经PCR证实，18个分离物中有17个具有pga基因。根据免疫印迹结果，这17个中约三分之一表征为表达相对高水平的PNAG，约三分之一表征为表达相对中等水平(或适量)的PNAG，约三分之一表征为表达相对低水平的PNAG。此外，pga基因座的过度表达增强了PNAG的产生。图9显示了该免疫印迹的结果。菌株“H”表达PNAG的水平不可检测，且不具有pga基因座。右上方的狭线代表了大肠杆菌中过度表达pga的菌株。

图10显示了利用针对金黄色葡萄球菌dPNAG的多克隆抗血清，对前述大肠杆菌临床UTI分离物的调理性杀灭水平。BW代表野生型大肠杆菌菌株，pga^-代表删除pga基因座的大肠杆菌菌株，而pga⁺⁺代表pga过度表达的大肠杆菌菌株。杀菌水平与大肠杆菌分离物中的PNAG表达水平大致相关。

图11A和11B显示了利用针对dPNAG和PNAG的多克隆抗血清，对PNAG高表达大肠杆菌菌株(菌株U)和PNAG中等表达大肠杆菌菌株(菌株P)的调理性杀灭水平。在所有测试的抗血清稀释水平中，抗dPNAG血清比抗PNAG血清更有效地杀灭任一菌株。

图12显示了MAb F598对多种葡萄球菌菌株的调理吞噬活性，以及MAb F598、F628和F630对大肠杆菌菌株的调理吞噬活性(每次测定为6μg/ml MAb)。

Ica基因座的突变

图13和14显示了MAb F598和F628对具有突变ica基因座的金黄色葡萄球菌的杀灭结果。缺失金黄色葡萄球菌菌株10833中的ica基因座(10833Δica)，然后用携带分离自金黄色葡萄球菌Mn8m的野生型ica的质粒(pMuc，PNAG过产生者)或删除icaB基因的pMuc(pMucΔicaB)转化该菌株，如图13所示。金黄色葡萄球菌菌株10833(野生型)以及10833(picaB)见于图14。菌株10833(picaB)利用金黄色葡萄球菌Mn8m(PNAG过度产生者)ica基因座的组成型启动子，过度表达来自质粒的icaB基因。icaB基因为负责PNAG去乙酰化的酶。icaB基因的删除会影响MAbF598的杀菌但不会影响MAb F628。不存在icaB基因时，MAb F598的杀菌降低(图13)。icaB基因的过度表达增强了MAb F598的杀菌作用，但对MAb 628杀菌影响甚微或没有影响。

结论

利用化学修饰的PNAG的ELISA突出了针对PNAG天然形式的3种完整人MAb特异性的差异。MAb F598能识别PNAG和dPNAG，因此对于分子的主链具有特异性。MAb F628和F630似乎识别醋酸基特异性表位。竞争性ELISA提示，这些MAb的相对结合活性中，F598结合活性最强，其次为F628，最后为F630。可变区克隆显示，对于产生抗PNAG和/或dPNAG抗体存在基因限制性使用(gene restriction usage)。将MAb恒定区从γ2改为γ1，导致对PNAG的结合相同，但却降低了3种MAb中2种结合dPNAG的能力。最后，将恒定区改为γ1，增强了MAb固定补体的能力，然而这一增强在结合活性低的MAb F628和F630中最为显著。对MAb F598g1保护作用的评价显示，在IV活金黄色葡萄球菌菌株Mn8攻击前24小时，将该产物施用于小鼠，使注射2小时后血中葡萄球菌水平下降了68％。在IP活金黄色葡萄球菌菌株Mn8攻击前4小时，将该产物施用于小鼠，存活率相比于对照MAb处理小鼠提高。

等效物

前述说明足以使本领域技术人员实施本发明。此处公开的具体抗体和肽并不在于限制本发明，而仅用于此处说明本发明的具体实施方案。因此，任何功能等效于此处描述之物的肽、抗体以及抗体片段均在所附权利要求书的精神和范围内。实际上对于本领域技术人员而言，除了此处描述之物以外，根据前文描述多种对本发明的修饰显而易见，且都位于所附权利要求的范围内。

在本申请中引用的所有参考文献、专利以及专利出版物均在此处完整引用作为参考。

Claims (81)

1.组合物，其包括分离的肽，所述分离的肽为分离的抗体或其功能活性抗体片段，其中所述分离的抗体为：

(a)由具有ATCC保藏号PTA-5931的杂交瘤产生的抗体F598，或包含抗体F598的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的分离抗体；或

(b)由具有ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤产生的抗体F628，或包含抗体F628的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的分离抗体；或

(c)由具有ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤产生的抗体F630，或包含抗体F630的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列的分离抗体，

其中，所述抗体的功能活性抗体片段包含抗体的重链CDR1、CDR2和CDR3以及轻链CDR1、CDR2和CDR3。

2.权利要求1的组合物，其中F598抗体包含SEQ ID NO：7、8和9所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：10、11和12所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

3.权利要求1的组合物，其中F628抗体包含SEQ ID NO：13、14和15所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：16、17、和18所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

4.权利要求1的组合物，其中F630抗体包含SEQ ID NO：19、20和21所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：22、23和24所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

5.权利要求1的组合物，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

6.权利要求1的组合物，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

7.权利要求1的组合物，其中分离的抗体为完整的可溶性单克隆抗体。

8.权利要求1的组合物，其中功能活性抗体片段为选自F(ab′)₂片段、Fd片段以及Fab片段的分离抗体片段。

9.权利要求1的组合物，其中所述组合物增强对表达PNAG的细菌菌株的调理吞噬作用，其中PNAG是聚-N-乙酰葡萄糖胺。

10.权利要求1的组合物，其中所述组合物增强对表达PNAG的葡萄球菌的调理吞噬作用。

11.权利要求10的组合物，其中表达PNAG的葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

12.权利要求9的组合物，其中表达PNAG的细菌菌株为表达PNAG的大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、茄科雷尔氏菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

13.权利要求1的组合物，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

14.权利要求1的组合物，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

15.权利要求1的组合物，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

16.权利要求1的组合物，其中分离的肽缀合于可检测的标记。

17.权利要求16的组合物，其中可检测的标记为体内可检测标记。

18.权利要求1的组合物，其还包含可药用载体。

19.权利要求18的组合物，其中分离的肽的量为抑制表达PNAG的细菌菌株引发感染的有效量。

20.权利要求19的组合物，其中表达PNAG的细菌菌株选自大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、茄科雷尔氏菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

21.权利要求18的组合物，其中分离的肽的量为抑制葡萄球菌感染的有效量。

22.权利要求18的组合物，其中分离的肽的量为检测受试者体内或体外样品中表达PNAG的细菌菌株的有效剂量。

23.权利要求22的组合物，其中表达PNAG的细菌菌株选自大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、茄科雷尔氏菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

24.权利要求18的组合物，其中分离的肽的量为检测受试者体内或体外样品中葡萄球菌的有效剂量。

25.权利要求24的组合物，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

26.权利要求1的组合物，其中分离的肽选择性结合葡萄球菌PNAG。

27.权利要求1的组合物，其中分离的肽选择性结合葡萄球菌dPNAG，其中dPNAG是乙酰化不足或去乙酰化PNAG。

28.在权利要求1-8和13-15之任一项的组合物中定义的分离的肽用于制备组合物的用途，所述组合物用于检测受试者中表达PNAG的细菌菌株，其中分离的肽选择性结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG。

29.权利要求28的用途，其中所述分离的肽是：

-由具有ATCC保藏号PTA-5391的杂交瘤产生的抗体F598、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤产生的抗体F628、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号的PTA-5933的杂交瘤产生的抗体F630、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

30.权利要求28的用途，其中表达PNAG的细菌菌株选自大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

31.权利要求28的用途，其中，通过确定该分离的肽与受试者中或来自受试者的样品的结合测试水平，并将该结合测试水平与对照比较，使用所述分离的肽检测受试者中葡萄球菌的存在，其中高于对照结合水平的结合测试水平指示了样品中存在葡萄球菌。

32.权利要求31的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

33.权利要求30或31的用途，其中分离的肽缀合于可检测的标记。

34.权利要求33的用途，其中可检测标记为体内可检测标记。

35.权利要求30或31的用途，其中结合测试水平在体外测量得到。

36.分离的肽用于制备药物的用途，其中所述分离的肽为分离的抗体或其功能活性抗体片段，且所述分离的肽为在权利要求1-8和13-15之任一项的组合物中定义的分离的肽，所述药物用于治疗患有表达PNAG细菌菌株引发感染或有该发病风险的受试者，其中，所述肽的量有效抑制感染。

37.权利要求36的用途，其中所述分离的肽是：

-由具有ATCC保藏号PTA-5391的杂交瘤产生的抗体F598、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤产生的抗体F628、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤产生的抗体F630、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

38.权利要求36的用途，其中表达PNAG的细菌菌株选自大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

39.权利要求36的用途，所述药物用于治疗患有葡萄球菌感染或有该发病风险受试者，其中所述分离的肽选择性结合葡萄球菌PNAG和/或dPNAG，并且所述肽的量有效抑制葡萄球菌感染。

40.权利要求36或39的用途，其中所述分离的肽是F598抗体，其中该F598抗体包含SEQ ID NO：7、8、和9所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：10、11和12所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

41.权利要求36或39的用途，其中所述分离的肽是F628抗体，其中该F628抗体包含SEQ ID NO：13、14和15所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：16、17和18所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

42.权利要求36或39的用途，其中所述分离的肽是F630抗体，其中该F630抗体包含SEQ ID NO：19、20和21所示的重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列、以及SEQ ID NO：22、23和24所示的轻链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列。

43.权利要求36或39的用途，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5的氨基酸序列。

44.权利要求36或39的用途，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

45.权利要求36的用途，其中分离的抗体为完整的可溶性单克隆抗体。

46.权利要求36的用途，其中抗体片段为选自F(ab′)₂片段、Fd片段以及Fab片段的分离的抗体片段。

47.权利要求36的用途，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

48.权利要求36的用途，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：3的氨基酸序列和SEQ ID NO：4的氨基酸序列。

49.权利要求36的用途，其中分离的抗体或其功能活性抗体片段含有SEQ ID NO：5的氨基酸序列和SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

50.权利要求36或39的用途，其中的受试者有发生葡萄球菌感染的风险。

51.权利要求50的用途，其中葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

52.权利要求36或38的用途，其中的受试者有发生大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌感染的风险。

53.权利要求36或39的用途，其中分离的肽缀合于细胞毒性剂。

54.编码抗体或其功能活性抗体片段的分离的核酸分子，包含：

(i)编码含有分别由SEQ ID NO：31、32和33编码的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链区和含有分别由SEQ ID NO：34、35和36编码的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链区的核苷酸序列；

(ii)编码含有分别由SEQ ID NO：37、38和39编码的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链区和含有分别由SEQ ID NO：40、41和42编码的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链区的核苷酸序列；或

(iii)编码含有分别由SEQ ID NO：43、44和45编码的重链CDR1、CDR2和CDR3的重链区和含有分别由SEQ ID NO：46、47和48编码的轻链CDR1、CDR2和CDR3的轻链区的核苷酸序列。

55.权利要求54的分离核酸分子，其中所述核酸分子编码由具有ATCC保藏号PTA-5931、PTA-5932或PTA-5933的杂交瘤产生的抗体。

56.分离的核酸分子，其编码在权利要求1(a)中定义的抗体或其功能活性抗体片段，其包含SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所述的核苷酸序列。

57.分离的核酸分子，其编码在权利要求1(b)中定义的抗体或其功能活性抗体片段，其包含SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示的核苷酸序列。

58.分离的核酸分子，其编码在权利要求1(c)中定义的抗体或其功能活性抗体片段，其包含SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的核苷酸序列。

59.表达载体，其含有与启动子有效连接的权利要求54-58中任一项的分离的核酸分子。

60.由权利要求59的表达载体转化或转染的宿主细胞。

61.产生抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体的分离的细胞，其具有ATCC保藏号PTA-5931。

62.产生抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体的分离的细胞，其具有ATCC保藏号PTA-5932。

63.产生抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体的分离的细胞，其具有ATCC保藏号PTA-5933。

64.由权利要求61的细胞产生的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

65.由权利要求62的细胞产生的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

66.由权利要求63的细胞产生的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

67.权利要求64、65或66中任一项的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的单克隆抗体或其功能活性抗体片段，其中所述抗体或功能活性抗体片段增强对表达PNAG的细菌菌株的调理吞噬作用。

68.权利要求64、65或66中任一项的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的单克隆抗体或其功能活性抗体片段，其中所述抗体或功能活性抗体片段增强对表达PNAG的葡萄球菌的调理吞噬作用。

69.权利要求68的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG的单克隆抗体或其功能活性抗体片段，其中表达PNAG的葡萄球菌为金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。

70.权利要求67的分离的抗葡萄球菌PNAG和/或dPNAG单克隆抗体或其功能活性抗体片段，其中表达PNAG的细菌为大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

71.PNAG和/或dPNAG结合肽用于制备药物的用途，其中所述肽是PNAG和/或dPNAG结合的抗体或其功能活性抗体片段，且所述肽为在权利要求1-8和13-15之任一项的组合物中定义的肽，所述药物用于治疗表达PNAG的细菌菌株引发的感染，其中所述肽以有效治疗感染的量使在暴露于表达PNAG的细菌后受试者中的细菌载量在4小时内降低至少50％。

72.权利要求71的用途，其中所述肽是：

-由具有ATCC保藏号PTA-5391的杂交瘤产生的抗体F598、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号PTA-5932的杂交瘤产生的抗体F628、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段；或

-由具有ATCC保藏号PTA-5933的杂交瘤产生的抗体F630、或其包含重链可变区和轻链可变区的功能活性抗体片段。

73.权利要求71的用途，其中表达PNAG的细菌菌株为大肠杆菌、鼠疫杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、柑橘溃疡病菌、荧光假单胞菌、伴放线放线杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌或支气管腐败杆菌。

74.权利要求71的用途，其中所述药物用于治疗葡萄球菌感染，其中所述肽以有效治疗感染的量使在暴露于葡萄球菌细菌后受试者中的细菌载量在4小时内降低至少50％。

75.权利要求74的用途，其中葡萄球菌感染为金黄色葡萄球菌感染。

76.权利要求71或74的用途，其中结合PNAG和/或dPNAG的肽施用于受试者暴露细菌前。

77.权利要求76的用途，其中所述肽于受试者暴露细菌前至少4小时施用。

78.权利要求76的用途，其中所述肽于受试者暴露细菌前至少24小时施用。

79.权利要求71或74的用途，其中结合PNAG和/或dPNAG的肽使在暴露于细菌后受试者中的细菌载量在4小时内降低至少60％。

80.权利要求71或74的用途，其中结合PNAG和/或dPNAG的肽使在暴露于细菌后受试者中的细菌载量在2小时内降低至少50％。

81.权利要求71或74的用途，其中结合PNAG和/或dPNAG的肽使在暴露于细菌后受试者中的细菌载量在2小时内降低至少60％。

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