PT1745075E - Péptidos de ligação a poli-n-acetilglucosamina (pnag/dpnag) e métodos da sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"PÉPTIDOS DE LIGAÇÃO A POLI-N-ACETILGLUCOSAMINA (PNAG/DPNAG) E MÉTODOS DA SUA UTILIZAÇÃO"

Campo da Invenção

Esta invenção refere-se de um modo geral a péptidos que se ligam a poli-N-acetilglucosamina (PNAG) e PNAG desacetilada (dPNAG) de bactérias tais como Staphylococcus e à sua utilização no diagnóstico e no tratamento de infecções bacterianas estafilocócicas e outras expressando PNAG.

Antecedentes da Invenção

Os Staphylococcus são bactérias gram-positivas que normalmente habitam e colonizam a pele e as membranas mucosas dos humanos. Se a membrana mucosa ou a pele ficar danificada durante uma cirurgia ou outro traumatisomo, os Staphylococcus pode ter acesso a tecidos internos causando o desenvolvimento da infecção. Se os Staphylococcus proliferarem localmente ou se introduzirem no sistema linfático ou no sistema sanguíneo, podem resultar complicações infecciosas graves tais como as associadas com bacteremia estafilocócica. As complicações associadas com bacteremia estafilocócica incluem choque séptico, endocardite, artrite, osteomielite, pneumonia e abscessos em vários orgãos. 1

Os Staphylococcus incluem tanto organismos positivos para a coagulase que produzem uma coagulase livre, como organismos negativos para a coagulase que não produzem esta coagulase livre. Staphylococcus aureus é a forma mais comum de Staphylococcus positivos para a coagulase. S. aureus geralmente causa a infecção numa localização local, extravascular ou intravascular, que pode em último caso resultar em bacteremia. S. aureus é também uma causa principal de osteomielite aguda e causa infecções de pneumonia estafilocócica. Adicionalmente, S. aureus é responsável por aproximadamente 1-9% dos casos de meningite bacteriana e 10-15% dos abscessos cerebrais.

Existem pelo menos vinte e uma espécies conhecidas de Staphylococcus negativos para a coagulase, incluindo S. epidermldls, S. saprophyticus, S. hominis, S. warneri, S. haemolyticus, S. saprophiticus, S. cohnli, S. xylosus, S. slmulans e S. capitis. S. epidermldis é o agente mais frequente causador de infecção associado com dispositivos de acesso intravenoso e o isolado mais frequente em bacteremias nosocomiais primárias. S. epidermldls está também associado com endocardite da válvula prostética.

Staphylococcus é também uma fonte comum de infecções bacterianas em animais. Por exemplo, a mastite estafilocócica é um problema comum em ruminantes incluindo bovinos, ovelhas e cabras. A doença é geralmente tratada com antibióticos para reduzir a infecção mas o tratamento é um processo caro e resulta ainda numa perda da produção de leite. As vacinas mais eficazes para gado identificadas até ao momento são vacinas de S. aureus intacto, vivo administradas subcutaneamente. A administração de vacinas vivas está, no entanto, associada com o risco de infecção e com reacções tóxicas. Por essa razão, muitos 2 investigadores tentaram produzir vacinas de S. aureus morto e/ou isolar polissacáridos capsulares ou componentes da parede celular que induzam a imunidade contra S. aureus. No entanto nenhuma destas tentativas, teve sucesso. 0 documento WO 00/03745 divulga uma vacina de polissacáridos para infecções estafilocócicas.

Kojima Y. et al. divulgam um anticorpo contra o polissacárido capsular/Adesão que protege coelhos contra bacteremia relacionada com cateter devida a Staphylococcus negativos para a coagulase, em J. Infectious Diseases Vol 162, n° 22, Agosto de 1990, páginas 435-441.

Lee Jean C et al. divulgam a eficácia protectora de anticorpos contra o polissacárido capsular de Staphylococcus aureus do tipo 5 num modelo modificado de endocardite em ratos, em Infection and Imunity Vol 65 n° 10, 1997, páginas 4146-4151.

Maria-Litran T et al. divulgam propriedades imunoquímicas do polissacárido superficial Poli-N-Acetilglucosamina estafilocócico em Infection and Imunity Vol 70 n° 8, Agosto de 2002, páginas 443-4440. O documento WO 2004/043407 é um documento disponível sob o Artigo 54(3) EPC e divulga métodos e produtos para tratar infecções estafilocócicas. O documento WO 2004/043405 é um documento disponível sob o Artigo 54(3) EPC e divulga uma vacina de polissacáridos para infecções estafilocócicas. 3

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se de um modo geral à identificação e à utilização de péptidos que se ligam a poli-N-acetilglucosamina (PNAG) tal como poli-N-acetilglucosamina (PNAG) estafilocócica e PNAG pouco acetilada ou desacetilada (aqui colectivamente referida como dPNAG). Estes péptidos são aqui referidos como péptidos que se ligam a PNAG/dPNAG. 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja incluída nas reivindicações é proporcionada apenas para informação. Em particular a invenção refere-se a anticorpos produzidos a partir de hibridomas depositados na ATCC a 21 de Abril de 2004, sob o N° de Acesso PTA-5931 (F598). A invenção inclui anticorpos (tais como anticorpos monoclonais humanos) e fragmentos de anticorpos. Uma característica comum da invenção aqui divulgada é a capacidade de reconhecer e se ligar especif icamente a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica. PNAG e/ou dPNAG expressas por outras estirpes bacterianas podem ser também reconhecidas e ligadas pelos péptidos da invenção. Uma característica importante de alguns anticorpos e fragmentos de anticorpos proporcionados pela invenção é a sua capacidade para intensificar a opsonização e a fagocitose (i. e., opsonofagocitose) de estirpes bacterianas, tais como espécies estafilocócicas, que expressam PNAG.

Deste modo, num aspecto, a invenção proporciona uma composição de acordo com a reivindicação 1. São partilhadas várias formas de realização entre este e outros aspectos da invenção. Estas formas de realização irão ser 4 referidas uma vez mas deverá ser entendido que estas se aplicam igualmente a todos os aspectos da invenção.

Numa forma de realização, a CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. A CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia pesada seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 15 e SEQ ID N° 21 ou esta pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia pesada derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931. A CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia leve seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 18 e SEQ ID N° 24 ou esta pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR3 da cadeia leve derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA 5931.

Numa outra forma de realização, a CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma CDR2 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. A CDR2 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 20 e SEQ ID N° 23 ou esta pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR2 derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931.

Numa outra forma de realização, a CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma CDR1 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. A CDR1 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode compreender uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 13, 5 SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 19 e SEQ ID N° 22 ou esta pode compreender uma sequência de aminoácidos de uma CDR1 derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931.

Numa forma de realização, o péptido isolado compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do qrupo consistindo de SEQ ID N° 1 ou uma sequência de aminoácidos de uma reqião variável da cadeia pesada derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931.

Numa outra forma de realização, o péptido isolado compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo na SEQ ID N° 2 ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável de uma cadeia leve derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931.

Na invenção, o péptido isolado é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolado, tal como mas não limitado a um anticorpo monoclonal intacto isolado, de um modo preferido solúvel ou um fragmento de anticorpo monoclonal isolado tal como mas não limitado a um fragmento F(ab')2f um fragmento Fd e um fragmento Fab. 0 anticorpo isolado pode ser um anticorpo produzido a partir de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931 ou um seu fragmento de anticorpo.

Numa forma de realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado intensifica a opsonofagocitose de estirpes bacterianas expressando PNAG (e. g., estafilococos tais como mas não limitados a S. aureus ou S. epidermidis) .

Numa forma de realização, o anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado compreende uma sequência de aminoácidos 6 compreendendo uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID N° 1 e uma sequência de aminoácido compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e seleccionada do grupo consistindo na SEQ ID N° 2. 0 anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolado podem compreender uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 1 e uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2. 0 anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolado podem compreender uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5931 (F598) e uma sequência de aminoácidos compreendendo a região variável da cadeia leve derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5931 (F598) ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5932 (F628) e uma sequência de aminoácidos compreendendo a região variável da cadeia leve derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5932 (F628) ou uma sequência de aminoácidos de uma região variável da cadeia pesada derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5933 (F630) e uma sequência de aminoácidos compreendendo a região variável da cadeia leve derivada de um hibridoma depositado tendo o N° de Acesso PTA-5933 (F630) .

Numa forma de realização, o péptido isolado é conjugado com uma marcação detectável. A marcação detectável pode ser uma marcação detectável in vivo ou in vitro.

Numa forma de realização, a composição compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outras formas de 7 realização, o péptido isolado tal como o anticorpo ou o fragmento de anticorpo isolado está presente numa quantidade eficaz para inibir uma infecção por uma estirpe bacteriana expressando PNAG (tal como uma infecção estafilocócica) ou numa quantidade eficaz para detectar uma estirpe bacteriana expressando PNAG (tais como os estafilococos) numa amostra ou proveniente de um indivíduo.

Numa forma de realização, o péptido isolado liga-se selectivamente a PNAG estafilocócicas. Numa outra forma de realização, o péptido isolado liga-se selectivamente a dPNAG estafilocócicas.

Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica.

Numa forma de realização, a sequência nucleotídica é seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 24. Numa outra forma de realização, a sequência nucleotídica é seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6.

Numa forma de realização, o ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico da região variável da cadeia pesada derivada de um hibridoma tendo o N° de Acesso PTA-5931, PTA-5932 ou PTA-5933. Numa outra forma de realização, o ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico da região variável da cadeia leve derivada de um hibridoma tendo o N° de Acesso PTA-5931, PTA-5932 ou PTA-5933. Em ainda outra forma de realização, o ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico da CDR da cadeia pesada derivada de um hibridoma tendo o N° de Acesso PTA-5931; PTA-5932 ou PTA-5933 ou este é uma molécula de ácido nucleico da CDR da cadeia leve derivada de um hibridoma tendo o N° de Acesso PTA-5931, PTA-5932 ou PTA-5933. São descritos vectores de expressão compreendendo as moléculas de ácido nucleico isoladas referidas acima, ligadas operativamente a um promotor e células transformadas ou transfectadas com esses vectores de expressão. É também descrita uma célula isolada produzindo um anticorpo monoclonal anti-PNAG/dPNAG estafilocócica (F598) e tendo o N° de Acesso PTA-5931, uma célula isolada produzindo um anticorpo monoclonal anti-PNAG/dPNAG estafilocócica (F628) e tendo o N° de Acesso PTA-5932 e uma célula isolada produzindo um anticorpo monoclonal anti-PNAG/dPNAG estafilocócica (F630) e tendo o N° de Acesso PTA-5933. A invenção proporciona ainda, em aspectos adicionais, o anticorpo monoclonal isolado produzido pelas células isoladas depositadas referidas acima ou seus fragmentos de anticorpo. 0 fragmento de anticorpo pode ser mas não limitado a um fragmento F(ab')2f um fragmento Fd ou um fragmento Fab. Numa forma de realização relacionada, o fragmento intensifica a opsonofagocitose de estirpes bacterianas expressando PNAG (e. g., Staphylococcus tais como mas não limitados a S. aureus ou S. epidermidis).

Num outro aspecto, a invenção proporciona um método para detectar estirpes bacterianas expressando PNAG (tais como Staphylococcus) num indivíduo ou numa amostra proveniente de um indivíduo. 0 método compreende determinar um nível de teste de ligação de um péptido isolado ou de uma sua variante 9 funcionalmente equivalente a uma amostra num indivíduo ou proveniente deste e comparar o nível de teste de ligação com um controlo, em que o péptido isolado se liga selectivamente a PNAG/dPNAG estafilocócica e compreende uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica ou a uma sua variante funcionalmente equivalente e em que um nível de ligação de teste que é superior ao controlo é indicador da presença da estirpe bacteriana (e. g., Staphylococcus) na amostra. As bactérias a serem detectadas podem ser Staphylococcus, E. coli, Yersinia pestis (γ. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis ou B. bronchiseptica. A invenção proporciona também métodos para detectar e tratar infecções de plantas por bactérias expressando PNAG tal como Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

Numa forma de realização, é medido o nível de teste da ligação in vitro.

Num outro aspecto, a invenção é útil num método para tratar um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção por uma estirpe bacteriana expressando PNAG (e. g., uma infecção estafilocócica). 0 método compreende a administração a um indivíduo com necessidade desse tratamento um péptido isolado que se liga selectivamente a PNAG/dPNAG estafilocócica e compreende uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica ou uma sua variante funcionalmente equivalente, numa quantidade eficaz para inibir a infecção. Numa outra forma de realização, o péptido isolado é conjugado com um agente citotóxico. 10

Numa forma de realização, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver uma infecção estafilocócica, tal como mas não limitada a infecção por S. aureus ou S. epidermidis. Numa outra forma de realização, o indivíduo tem ou está em risco de desenvolver um infecção por E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis ou B. bronchiseptica.

As infecções bacterianas anteriores são subjacentes a patologias tais como gastroenterite, infecções do tracto urinário, peste, tosse convulsa, infecções do fluxo sanguíneo e infecções dentárias (periodontite) . A invenção pretende tratar estas últimas patologias pelo tratamento da infecção bacteriana subjacente. A detecção e as composições para tratamento aqui proporcionadas são adequadas para indivíduos humanos e não-humanos que têm ou estão em risco de desenvolverem essas infecções. Os indivíduos não-humanos incluem animais agrícolas tais como vacas e porcos, mas não estão limitados desta forma.

Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) é outra bactéria expressando PNAG, no entanto esta é considerada um agente patogénico de plantas e não de animais. A invenção contempla a detecção e o tratamento de espécies de planta tendo essas infecções utilizando os péptidos de ligação aqui proporcionados, de um modo preferido conjugados com uma marcação detectável ou citotóxica, dependendo do método. 11

Em ainda um outro aspecto, a invenção proporciona composições úteis no tratamento de uma infecção por uma estirpe bacteriana expressando PNAG (e. g., infecção estafilocócica) compreendendo administrar a um individuo com necessidade deste um péptido de ligação a PNAG/dPNAG, que reduz a carga bacteriana num individuo em pelo menos 50% em pelo menos 4 horas após a exposição a uma bactéria que expressa PNAG numa quantidade eficaz para tratar a infecção.

Numa forma de realização, o péptido de ligação a PNAG/dPNAG é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo isolado. Numa forma de realização, a infecção é uma infecção estafilocócica. Numa forma de realização, a infecção estafilocócica é uma infecção por S. aureus ou uma infecção por S. epidermidis. Numa outra forma de realização, a infecção é uma infecção por E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis ou B. bronchiseptica. São também contempladas pela invenção infecções por Ralstonia solanacearum (R. solanacearum), embora estas afectem plantas e não animais. Numa outra forma de realização, o péptido de ligação a PNAG/dPNAG é administrado antes da exposição à bactéria, tal como mas não limitado a pelo menos 24 horas antes da exposição à bactéria.

Numa forma de realização, o péptido de ligação a PNAG/dPNAG reduz a carga bacteriana num individuo em pelo menos 60% em pelo menos 4 horas após a exposição à bactéria. Numa outra forma de realização, o péptido de ligação a PNAG/dPNAG reduz a carga bacteriana num individuo em pelo menos 50% em 2 horas após a 12 exposição à bactéria. Em ainda outra forma de realização, o péptido de ligação a PNAG/dPNAG reduz a carga bacteriana num indivíduo em pelo menos 60% em 2 horas após a exposição à bactéria. As bactérias expressando PNAG incluem mas não estão limitadas a estafilococos, E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis e B. bronchiseptica, que afectam animais e Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) que afecta plantas.

Estas e outras formas de realização da invenção irão ser aqui descritas com maior detalhe.

Breve Descrição das Figuras A FIG. 1 é um gráfico mostrando as afinidades de ligação de anticorpos monoclonais (MAb) F598, F628 e F630 (numa forma

IgG2) a PNAG nativa. É utilizado MAb contra P. aeruginosa MEP como um controlo negativo. A FIG. 2 é um gráfico mostrando as afinidades de ligação dos MAb F598, F628 e F630 (numa forma IgG2) a dPNAG. A FIG. 3 é um gráfico mostrando os resultados de um ELISA de competição utilizando PNAG e MAb F598, F628 e F630 (numa forma IgG2). A FIG. 4 é um gráfico mostrando as afinidades de ligação dos MAb F598, F628 e F630 (numa forma IgGl) a PNAG nativa. 13 A FIG. 5 é um gráfico mostrando as afinidades de ligação dos MAb F598, F628 e F630 (numa forma IgGl) a dPNAG. A FIG. 6 é um gráfico mostrando a actividade de fixação de complemento dos MAb F598, F628 e F630 tanto na forma IgGl como IgG2 em PNAG. É utilizado MAb contra P. aeruginosa MEP como um controlo negativo. A FIG. 7 é um gráfico mostrando a actividade opsonofagocitica dos MAb F598, F628 e F630 na forma IgG2 e IgGl contra a estirpe Mn8 de S. aureus. A FIG. 8A é um gráfico de barras mostrando os resultados médios comparando os niveis de estafilococos no sangue de murganhos (8 por grupo) admininstrados com um MAb IgGl humano de controlo contra alginato de P. aeruginosa ou Mab F598 especifico para PNAG/dPNAG (numa forma IgGl) e demonstrando que o MAb F598 pode proporcionar protecção passiva contra desafio com S. aureus. A FIG. 8B é um gráfico mostrando os resultados da protecção contra desafio com S. aureus em murganhos individuais, apresentando as CFU por mL do sangue após a administração de um MAb IgGl humano de controlo contra alginato de P. aeruginosa e MAb F598 especifico para PNAG/dPNAG (numa forma IgGl). A FIG. 8C é um gráfico mostrando os resultados da protecção contra o desafio com S. aureus em murganhos FVB individuais utilizando MAb F598 e Mab contra P. aeruginosa MEP de controlo. 14 A FIG. 9 é uma imunotransferência mostrando a expressão de PNAG por estirpes UTI de E. coli marcadas D-U e incluindo um isolado de E. coli pga sobre-expressante (canto superior direito). A FIG. 10 é um gráfico de barras mostrando o nivel de morte de isolados de E. coli utilizando o anti-soro policlonal produzido contra dPNAG de S. aureus.

As FIG. 11A E 11B são gráficos mostrando, respectivamente, o nivel de morte de isolados de E. coli expressando niveis de PNAG relativamente elevados (estirpe U) e intermédios (estirpe P), utilizando anti-soro policlonal produzido contra dPNAG e PNAG. A FIG. 12 é um gráfico de barras mostrando a redução em CFU de diferentes estirpes bacterianas expressando PNAG utilizando F598, F628 e F630. A FIG. 13 é um gráfico mostrando a proporção de bactérias S. aureus mortas por F598 e F628 como uma função da presença ou da ausência do gene icaB. A FIG. 14 é um gráfico mostrando a proporção de bactérias S. aureus mortas por F598 e F628 como uma função da sobre-expressão do gene icaB.

Deve ser entendido que as Figuras não são necessárias para a realização da invenção. 15

Breve Descrição da Listagem de Sequência região A SEQ ID N° 1 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia pesada do anticorpo F598. região A SEQ ID N° 2 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia leve do anticorpo F598. região A SEQ ID N° 3 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia pesada do anticorpo F628. região A SEQ ID N° 4 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 5 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N° 6 é a sequência de aminoácidos da variável da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N° 7 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo F598. região região CDR1 da A SEQ ID N° 8 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo F598. A SEQ ID N° 9 é a sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo F598. A SEQ ID N° 10 é a sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo F598. CDR2 da CDR3 da CDR1 da 16 A SEQ ID N° 11 é a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve do anticorpo F598. A SEQ ID N° 12 é a sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve do anticorpo F598. A SEQ ID N° 13 é a sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 14 é a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 15 é a sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 16 é a sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 17 é a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 18 é a sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 19 é a sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N° 20 é a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N° 21 é a sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia pesada do anticorpo F630. 17 A SEQ ID N° 22 é a sequência de aminoácidos da CDR1 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ O s Q 1—1 23 é a sequência de aminoácidos da CDR2 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N° 24 é a sequência de aminoácidos da CDR3 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N 0 25 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia pesada do anticorpo F598. A SEQ ID N 0 26 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia leve do anticorpo F598. A SEQ ID N 0 27 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N 0 2 8 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia leve da do anticorpo F628. A SEQ ID N 0 29 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N 0 3 0 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia leve da do anticorpo F630. A SEQ ID N° 31 é a sequência nucleotidica da CDR1 da cadeia pesada do anticorpo F598. A SEQ ID N° 32 é a sequência nucleotidica da CDR2 da cadeia pesada do anticorpo F598. 18 A SEQ ID N° 33 é a sequência pesada do anticorpo F598. A SEQ ID N° 34 é a sequência leve do anticorpo F598. A SEQ ID N° 35 é a sequência leve do anticorpo F598. A SEQ ID N° 36 é a sequência leve do anticorpo F598. A SEQ ID N° 37 é a sequência pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 38 é a sequência pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 39 é a sequência pesada do anticorpo F628. A SEQ ID N° 40 é a sequência leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 41 é a sequência leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 42 é a sequência leve do anticorpo F628. A SEQ ID N° 43 é a sequência pesada do anticorpo F630. nucleotidica da CDR3 da cadeia nucleotidica da CDR1 da cadeia nucleotidica da CDR2 da cadeia nucleotidica da CDR3 da cadeia nucleotidica da CDR1 da cadeia nucleotidica da CDR2 da cadeia nucleotidica da CDR3 da cadeia nucleotidica da CDR1 da cadeia nucleotidica da CDR2 da cadeia nucleotidica da CDR3 da cadeia nucleotidica da CDR1 da cadeia 19 A SEQ ID N° 44 é a sequência nucleotídica da CDR2 da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N° 45 é a sequência nucleotídica da CDR3 da cadeia pesada do anticorpo F630. A SEQ ID N° 46 é a sequência nucleotídica da CDR1 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N° 47 é a sequência nucleotídica da CDR2 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N° 48 é a sequência nucleotídica da CDR3 da cadeia leve do anticorpo F630. A SEQ ID N° 49 é a sequência nucleotídica do iniciador lambda constante. A SEQ ID N° 50 é a sequência nucleotídica do iniciador Hu lambda sig 5. A SEQ ID N° 51 é a sequência nucleotídica do iniciador da cadeia Pesada constante. A SEQ ID N° 52 é a sequência nucleotídica do iniciador VH7LDRHU. A SEQ ID N° 53 é a sequência nucleotídica do iniciador Hu lambda sig 1. A SEQ ID N° 54 é a sequência nucleotídica do iniciador VH1LDRHU. 20 A SEQ ID N° 55 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de F598 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 56 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia pesada de F598 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 57 é a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de F598 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 58 é a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de F628 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 59 é a sequência nucleotidica da região variável da cadeia pesada de F628 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 60 é a sequência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de F630 incluindo alguma sequência da região constante. A SEQ ID N° 61 é a sequência nucleotidica da região variável de cadeia leve de F630 incluindo alguma sequência da região constante. 21

Descrição Detalhada da Invenção A invenção proporciona composições úteis, inter alia, para a imunização de humanos e animais contra a infecção por estirpes bacterianas expressando poli-N-acetilglucosamina (PNAG) assim como a detecção desses agentes patogénicos. Essas estirpes bacterianas incluem mas não estão limitadas a estafilococos negativos para a coagulase e positivos para a coagulase tais como S. aureus e S. epidermis. A invenção proporciona ainda péptidos que se ligam a várias formas de PNAG expressa por algumas estirpes bacterianas. 0 âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações e qualquer informação que não esteja incluída nas reivindicações é proporcionada apenas para informação. A invenção é baseada em parte na detecção, isolamento e caracterização de vários anticorpos monoclonais humanos que se ligam a várias formas de PNAG (incluindo formas altamente acetiladas, formas pouco acetiladas e formas desacetiladas, como descrito abaixo). Estes anticorpos são produzidos por hibridomas depositados na ATCC a 21 de Abril de 2004 sob os N° de acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933 de acordo com o Tratado de Patentes de Budapeste. Os hibridomas e os anticorpos que estes produzem são designados F598, F628 e F630. Estes hibridomas são aqui referidos repetidamente. Deve ser entendido que a referência a hibridomas (ou anticorpos produzidos por hibridomas) tendo os N° de Acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933 significa os hibridomas referidos acima. Os hibridomas depositados foram produzidos a partir de células B recolhidas de um indivíduo humano em recuperação de uma infecção estafilocócica. As células B foram transformadas com o vírus Epstein-Barr e depois fundidas com a linha de células de mieloma 22 humano-murganho ΗΜΜΑ 2.5 para originar os hibridomas depositados. A PNAG existe na natureza em várias formas que diferem de acordo com o grau de substituições com acetato. As substituições com acetato podem variar entre 0-100%. Como aqui utilizado, PNAG refere-se à "PNAG nativa" correspondente à mistura de ocorrência natural de PNAG com a gama de substituições com acetato referida acima. A PNAG pouco acetilada é uma subpopulação dos polissacáridos PNAG em que menos de 50% dos grupos amino da glucosamina estão substituídos com acetato. Como aqui utilizado, o termo dPNAG abrange tanto PNAG pouco acetilada como PNAG completamente desacetilada (i. e., dPNAG refere-se a um subconjunto do polissacáridos PNAG compreendendo 0 - menos de 50% substituintes acetato). A PNAG tem a estrutura seguinte:

em que, n é um número inteiro variando entre 2 a superior ou igual a 300, R é seleccionado do grupo consistindo de -NH-CO-CH3 e -NH2. A PNAG tem uma ligação beta (β) 1-6 (i. e., é 23 compreeendida por unidades monoméricas de glucosamina ligadas em conjunto por ligações beta (β) 1-6). A PNAG pode ser um homo-polimero. Um homo-polímero é aquele em que os grupos R dos resíduos glucosamina são idênticos. 0 homo-polímero pode compreender apenas grupos R não substituídos (i. e., R=NH2) . A PNAG pode ser também um hetero-polímero com uma mistura de grupos NH2 e NH-CO-CH3 na posição R. A dPNAG tem a estrutura idêntica a PNAG, com a excepção de menos de 50% dos grupos R serem -NH-CO-CH3. A PNAG e a dPNAG podem ser de ocorrência natural e preparadas a partir de qualquer estirpe bacteriana contendo o locus ica (ou um locus homólogo tal como o locus pga), produzindo as enzimas biosintéticas codificadas por este locus e utilizando estas enzimas para sintetizar PNAG ou dPNAG. As bactérias que expressam PNAG incluem estafilococos tais como S. aureus e S. epidermidis, E. coli tais como as estirpes 0157:H7 e CFT073 de E. coli, Yersinia pestis, Yersinia entercolitica, Xanthomonas axonopodis, Pseudomonas fluorescens (cuja totalidade são espécies sequenciadas com os loci pgaABCD completos) e Actinobacillus actinomycetemcomitans (AA) , Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap), Ralstonia solanacearum (e. g., forma de megaplasmídeo), Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e Bordetella bronchiseptica (cuja totalidade contém genes pgaABC mas aparentemente não apresentam um homólogo de pgaD). O pgaD não é aparentemente necessário para a expressão de PNAG dado que espécies codificando pgaABC tais como AA e Ap (listadas acima) produzem PNAG.

As bactérias que expressam PNAG são bactérias que contêm o locus ica ou um locus homólogo tal como o locus pga. Por exemplo, os estafilococos expressando PNAG são estafilococos que contêm o locus ica. As estirpes bacterianas expressando PNAG incluem estirpes bacterianas expressando dPNAG. Por exemplo, os estafilococos expressando PNAG incluem estafilococos expressando dPNAG. Estas estirpes incluem mas não estão limitadas a S. epidermis e S. aureus, assim como outras estirpes (e. g., S. carnosus) que foram transformadas com os genes no locus ica ou locus homólogo tal como o locus pga. Em particular a PNAG pode ser preparada a partir de estirpes especificas incluindo S. epidermis RP62A (número ATCC 35984), S. epidermis RP12 (número ATCC 35983), S. epidermis M187, S. carnosus TM300 (pCN27), S. aureus RN4220 (pCN27), S. aureus MN8 mucóide, E.coli 0157:H7 e E. coli CFT073. A dPNAG pode ser também sintetizada de novo ou através da modificação de PNAG nativa. A PNAG e dPNAG podem ser preparadas de acordo com os métodos descritos em Maira-Litran et ai. Infect Immun. Agosto de 2002; 70(8):4433 e na Pedido de Patente U. S. 10/713790 apresentado em 12 de Novembro de 2003. A PNAG é também expressa por outras bactérias incluindo mas não limitadas a E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axotiopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinoniycetenicomitans), A. pleuropneumoniae, Ralstonia solanacearum (R. solanacearum),

Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis e B. brorechiseptica. Como descrito nos Exemplos, 17 de 18 isolados de E. coli de infecções do tracto urinário continham o locus pga. Destes, cerca de um terço expressava niveis relativamente elevados de PNAG, cerca de um terço expressava 25 níveis relativamente intermédios de PNAG e o restante terço expressava níveis relativamente baixos de PNAG. As análises acima foram realizadas por imunotransferência utilizando anti-soros produzidos contra PNAG de S. aureus. Isto é um indício de que pode ser utilizada PNAG de uma espécie para produzir anticorpos (e consequentemente péptidos de ligação) contra outras espécies que expressam PNAG.

Deste modo, num aspecto, a invenção proporciona péptidos de ligação e anticorpos. Os anticorpos da invenção ligam-se a PNAG/dPNAG estafilocócica e intensificam a opsonofagocitose de espécies que produzem PNAG (i. e., anticorpos monoclonais humanos opsonofagocíticos específicos para PNAG/dPNAG estafilocócica). Os anticorpos são aqui designados como anticorpos anti-PNAG/dPNAG estafilocócica. Deve ser entendido, no entanto, que esses anticorpos são capazes de se ligar a PNAG/dPNAG independentemente da sua origem. Consequentemente, os anticorpos da invenção que são definidos como ligantes de, por exemplo, PNAG/dPNAG estafilocócica e capazes de detectar e/ou aumentar a opsonofagocitose de, por exemplo, espécies estafilocócicas, são também capazes de detectar e/ou aumentar a opsonofagocitose de bactérias não-estafilocócicas expressando PNAG.

Um anticorpo anti-PNAG/dPNAG estafilocócica é um anticorpo que a) se liga tanto a PNAG como a dPNAG, b) se liga a PNAG mas não a dPNAG ou c) se liga a dPNAG mas não a PNAG. Os anticorpos preferidos ligam-se a dPNAG.

Os anticorpos F598, F628 e F630 são todos capazes de se ligarem a PNAG nativa e alguns são também capazes de ser ligarem a dPNAG. Apesar de não se pretender ser limitado por qualquer 26 mecanismo ou teoria, pensa-se que os anticorpos que reconhecem dPNAG têm maior probabilidade de se ligarem especificamente a partes da molécula da PNAG que não contêm grupos acetato e não a partes da molécula que incluem substituintes tais como as substituições com acetato. Por exemplo, os anticorpos que se ligam a dPNAG podem reconhecer e ligarem-se à estrutura base da PNAG e não aos seus substituintes acetato. Estes anticorpos são capazes de mediar a morte opsonofagocitica de bactérias expressando PNAG tais como mas não limitadas a isolados estafilocócicos ou de E. coli provenientes de indivíduos humanos infectados. Quando utilizados in vivo em modelos murinos da infecção estafilocócica, os anticorpos proporcionam protecção contra desafio estafilocócico. As condições sob as quais cada anticorpo monoclonal proporciona protecção podem variar. Estas e outras verificações são descritas com maior detalhe nos Exemplos. Não pretendendo ser limitado por qualquer teoria em particular, pensa-se que a progressão da infecção por bactérias expressando PNAG (tal como a infecção estafilocócica) é devida a uma falha na produção de uma resposta imunitária adequada que elimine o agente patogénico. Especificamente, um dos defeitos consiste numa falha na produção de anticorpos opsonofagocíticos específicos para PNAG (tais como os produzidos por estafilococos).

Os anticorpos opsonofagocíticos são anticorpos que se depositam sobre um antigénio ou sobre uma bactéria com e sem a capacidade de recrutar deposição adicional de componentes do sistema de complemento e facilitar a fagocitose do antigénio ou da bactéria por células fagocíticas tais como células apresentadoras do antigénio (e. g., macrófagos ou células 27 dendríticas) ou neutrófilos polimorfonucleares. A fagocitose pode ocorrer de uma forma mediada por Fc que envolve apenas o anticorpo ligado ao antigénio ou à bactéria. A fagocitose pode ocorrer também por ligação de receptores do complemento nos fagócitos a opsoninas do complemento nas superfícies bacterianas em que os anticorpos se depositaram. A fagocitose pode também ocorrer por uma combinação destes dois mecanismos. A capacidade para proporcionar anticorpos opsonofagocíticos ao local da infecção deve consequentemente contribuir para a erradicação da infecção mais eficazmente do que anteriormente possível.

Tanto a PNAG como a dPNAG são altamente imunogénicas in vivo e capazes de promover anticorpos que medeiam a morte opsónica e a protecção contra infecção, supõe -se que a dPNAG promova de um modo preferido anticorpos que medeiem a morte opsónica e a protecção contra infecção. 0 polissacárido dPNAG é, por isso, útil, inter alia, na produção de respostas imunitárias, incluindo respostas imunitárias dependentes do anticorpo, contra estirpes bacterianas expressando PNAG tais como mas não limitadas a estafilococos. Os anticorpos promovidos após a administração de dPNAG reconhecem a dPNAG e em formas de realização importantes reconhecem também formas altamente acetiladas da PNAG.

Deste modo, a invenção refere-se à identificação e à utilização de péptidos que se ligam a PNAG e/ou a dPNAG. Os péptidos que se ligam a PNAG e/ou a dPNAG estaf ilocócica são aqui designados como péptidos de ligação a PNAG/dPNAG. Novamente, deve ser entendido que esses péptidos de ligação são capazes de se ligarem a PNAG/dPNAG independentemente da origem. Os péptidos de ligação a PNAG/dPNAG incluem péptidos a) que se ligam tanto a PNAG como a dPNAG, b) péptidos que se ligam a PNAG 28 e não a dPNAG (aqui designados como péptidos de ligação a PNAG) e péptidos c) que se ligam a dPNAG e não a PNAG (aqui designados como péptidos de ligação a PNAG). Em formas de realização preferidas, os péptidos ligam-se pelo menos a dPNAG (abrangendo deste modo as categorias (a) e (c) referidas acima).

Os péptidos da invenção compreendem minimamente regiões que se ligam a PNAG/dPNAG (i. e., regiões de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica). Como aqui utilizada, uma região de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma região que a) se liga tanto a PNAG como a dPNAG, b) se liga a PNAG mas não dPNAG (aqui designada como uma região de ligação a PNAG) ou c) se liga a dPNAG mas não a PNAG (aqui designada como uma região de ligação a PNAG), independentemente da origem de PNAG/dPNAG. De um modo preferido, a região de ligação a PNAG/dPNAG é uma região que se liga pelo menos a dPNAG (e consequentemente abrange as categorias (a) e (c)). As regiões de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica derivam das regiões de ligação a PNAG/dPNAG dos anticorpos da invenção ou alternativamente, estas são variantes funcionalmente equivalentes dessas regiões.

Consequentemente, duas classes particularmente importantes de regiões de ligação a PNAG/dPNAG derivadas de anticorpo são regiões variáveis e CDR dos anticorpos aqui descritos ou produzidos por hibridomas depositados na ATCC a 21 de Abril de 2004 sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Os ácidos nucleicos da CDR e da região variável podem ser clonados a partir de células produtoras de anticorpo tais como aquelas em depósito como descritas nos Exemplos. 29 é uma

Um anticorpo, como é bem conhecido na técnica, montagem de cadeias polipeptídicas ligadas por pontes persulfureto. Duas cadeias de aminoácido principais, designadas como cadeia leve e cadeia pesada, constituem a totalidade dos isotipos estruturais principais do anticorpo. Tanto as cadeias pesadas como as cadeias leves são ainda divididas subregiões designadas como regiões variáveis e regiões constantes. Em alguns casos, os péptidos abrangem as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo dos anticorpos anteriores. A região variável da cadeia pesada é um péptido que varia geralmente entre 100 a 150 aminoácidos de comprimento. A região variável da cadeia leve é um péptido que varia geralmente entre 80 a 130 aminoácidos de comprimento.

Como é também bem conhecido na técnica, as CDR de um anticorpo são as porções da região variável do anticorpo que são grandemente responsáveis pela especificidade de ligação de um anticorpo a um determinado antigénio ou epitopo antigénico. As CDR interagem directamente com o epitopo do antigénio (ver, em geral, Clark, 1986; Roitt, 1991). Nas regiões variáveis tanto da cadeia pesada como da cadeia leve das imunoglobulinas IgG, existem quatro regiões estruturais (FR1 a FR4) separadas respectivamente por três regiões determinantes da complementaridade (CDR1, CDR 2 e CDR3). As regiões estruturais (FR) mantêm a estrutura terciária do paratopo, que é a porção do anticorpo que está envolvida na interacção com o antigénio ou epitopo antigénico. As CDR e em particular a CDR3 e mais particularmente a CDR3 da cadeia pesada, contribuem substancialmente para a especificidade do anticorpo. Dado que as CDR e em particular a CDR3, conferem uma grande proporção da especificidade antigénica no anticorpo, estas regiões podem ser 30 incorporadas em outros anticorpos ou péptidos para conferir especificidade antigénica idêntica a esse anticorpo ou péptido.

De um modo preferido, os péptidos de ligação a PNAG/dPNAG abrangem minimamente pelo menos uma CDR das aqui descritas ou das que podem ser derivadas dos hibridomas depositados (i. e., uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica) . Como aqui utilizado, uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma CDR aqui descrita ou é uma CDR derivada de hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. As CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica incluem a) CDR que se ligam tanto a PNAG como a dPNAG, b) CDR que se ligam a PNAG e não a dPNAG (aqui designadas como CDR de ligação a PNAG) e c) CDR que se ligam a dPNAG e não a PNAG (aqui designadas como CDR de ligação a dPNAG), independentemente da origem da PNAG/dPNAG. Estes péptidos contêm de um modo preferido pelo menos uma CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. A região de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode ser uma CDR1 de ligação a PNAG/dPNAG estaf ilocócica, uma CDR2 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica ou uma CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica, cuja totalidade é derivada dos anticorpos e cadeias variáveis de anticorpo aqui divulgadas.

Como aqui utilizado, uma "CDR1 de ligação a PNAG/dPNAG estaf ilocócica" é uma CDR1 que se liga, de um modo preferido especificamente, a PNAG/dPNAG estafilocócica e é derivada das regiões variáveis das cadeias pesadas ou das leves dos anticorpos aqui descritos ou produzidos por hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Esta pode ter uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 10, 31 SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 19 e SEQ ID N° 22. Aplicam-se definições respectivas semelhantes às CDR2 e CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica.

Uma "CDR2 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica" é uma CDR2 que se liga, de um modo preferido especif icamente, a PNAG/dPNAG estafilocócica e é derivada das regiões variáveis quer das cadeia pesadas quer das leves dos anticorpos aqui descritos ou produzida pelos hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Esta pode ter uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 20 e SEQ ID N° 23.

Uma "CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica" é uma CDR3 que se liga, de um modo preferido especif icamente, a PNAG/dPNAG estafilocócica e é derivada das regiões variáveis quer das cadeia pesadas quer das leves dos anticorpos aqui descritos ou produzida pelos hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Esta pode ter uma sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo de SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 18, SEQ ID N° 21 e SEQ ID N° 24.

Além das sequências listadas acima, a invenção pretende abranger variantes funcionalmente equivalentes destas sequências incluindo variantes de substituição conservadora na sequência quer de aminoácidos quer nucleotidica, como descrito com maior detalhe abaixo.

Os péptidos da invenção, incluindo mas não limitados aos anticorpos opsonofagociticos aqui discutidos, são úteis 32 inter alia em métodos de diagnóstico direccionados para a detecção, numa amostra num indivíduo ou proveniente deste, do antigénio PNAG/dPNAG ou de bactérias expressando PNAG (tais como mas não limitadas a bactérias estafilocócicas gue expressam PNAG). No mínimo, os péptidos úteis nestes métodos necessitam apenas de reconhecer e se ligarem a PNAG/dPNAG (tal como PNAG/dPNAG estafilocócica) independentemente destes também intensificarem a opsonização e a fagocitose. Em formas de realização importantes, os anticorpos e os seus fragmentos ligam-se a PNAG/dPNAG selectivamente. Consequentemente, estes necessitam apenas de possuir uma ou mais das CDR derivadas dos clones do anticorpo aqui descritos ou produzidos pelos hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Em formas de realização preferidas, os péptidos compreendem uma CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG e de um modo ainda mais preferido, os péptidos compreendem uma CDR3 da cadeia pesada de ligação a PNAG/dPNAG. Deve ser entendido que nem todas as CDR são necessárias para realizar a ligação a PNAG/dPNAG. No entanto, em algumas formas de realização os péptidos compreendem todas as CDR de um determinado clone de anticorpo aqui divulgado ou produzido por hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933.

Além disso, deve ser entendido que a invenção também abrange a permuta de CDR entre as regiões variáveis aqui proporcionadas. De um modo preferido, uma CDR da cadeia pesada é permutada com outra CDR da região variável da cadeia pesada e do mesmo modo, uma CDR da cadeia leve é permutada com outra CDR da região variável da cadeia leve.

As sequências de aminoácido do CDR das cadeias variáveis divulgadas na presente invenção são como se seguem: 33

Clone Cadeia CDR SEQ ID N2: Sequência F598 Hv CDRl 7 GYYWS F598 Hv CDR2 8 YIHYSRSTNSNPALKS F59 8 Hv CDR3 9 DTYYYDSGDYEDAFDI F598 Lt CDRl 10 TLSSGHSNYAIA F598 Lt CDR2 11 VNRDGSHIRGD F598 Lt CDR3 12 QTWGAGIRV F628 Hv CDRl 13 NYYWS F628 Hv CDR2 14 YiHYSGSTNSNPSLKS F628 Hv CDR3 15 DTYYESSGHWFDGLDV F628 Lt CDRl 16 TLDSEHSRYTIA F628 Lt CDR2 17 VKSDGSHSKGD F628 Lt CDR3 18 QTWGPGÍRV F630 Hv CDRl 19 NFGIS F630 Hv CDR2 20 WVSTYNGRTNYAQKFRG F630 Hv CDR3 21 DYYETSGYAYDDFAI F630 Lt CDRl 22 TLSSGHSTYAIA F630 Lt CDR2 23 VNSDGSHTKGD F630 Lt CDR3 24 QTWGPGÍRV

As sequências nucleotídicas das CDR das cadeias variáveis divulgadas na presente invenção são como se seguem:

Clone Cadeia CDR SEQ ID N2: Sequência F598 Hv CDRl 31 GGT TAC TAC TGG AGT F59 8 Hv CDR2 32 TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC CCC GCC CTC AAG AGT F59 8 Hv CDR3 33 GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT F598 Lt CDRl 34 ACT CTG AGC AGT GGC CAC AGC AAC TAC GCC ATC GCT F59 8 Lt CDR2 35 GTT AAC AGA GAT GGC AGC CAC ATC AGG GGG GAC F59 8 Lt CDR3 36 CAG ACC TGG GGC GCT GGC ATT CGA GTG 34 (continuação)

Clone Cadeia CDR SEQ ID Nfi : Sequência F628 Hv CDR1 37 AAT TAC TAC TGG AGT F628 Hv CDR2 38 TAT ATC CAT TAT AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT CCA TCC CTC AAG AGT F628 Hv CDR3 39 GAT ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC F628 Lt CDR1 40 ACT CTG GAC AGT GAA CAC AGC AGA TAC ACC ATC GCA F628 Lt CDR2 41 GTT AAG AGT GAT GGC AGT CAC AGC AAG GGG GAC F628 Lt CDR3 42 CAG ACT TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG F630 Hv CDR1 43 AAC TTT GGT ATC AGT F630 Hv CDR2 44 TGG GTC AGC ACT TAC AAT GGT CGC ACA AAT TAT GCA CAG AAG TTC CGG GGC F630 Hv CDR3 45 GAT TAC TAT GAG ACT AGT GGT TAC GCC TAT GAT GAT TTT GCG ATC F630 Lt CDRl 46 ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC TAC GCC ATC GCG F630 Lt CDR2 47 GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC F630 Lt CDR3 48 CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG Os péptidos podem também compreender uma região variável de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. Uma região variável de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica é uma região variável (de um modo preferido uma região variável de um anticorpo como descrito aqui ou como derivado de hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933) que a) se liga tanto a PNAG como a dPNAG, b) se liga a PNAG mas não a dPNAG (aqui designada como uma região variável de ligação a PNAG) ou c) se liga a dPNAG mas não a PNAG (aqui designada como uma região variável de ligação a PNAG), independentemente da origem PNAG/dPNAG. A presente invenção proporciona pelo menos seis regiões variáveis diferentes, pelo menos três das quais são regiões variáveis da cadeia pesada e pelo menos três das quais são regiões variáveis da cadeia leve. As SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 25 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região 35 variável da cadeia pesada derivada do clone de anticorpo F598. As SEQ ID N° 2 e SEQ ID N° 26 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região variável da cadeia leve derivada do clone de anticorpo F598. As SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 27 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região variável da cadeia pesada derivada do clone de anticorpo F628. As SEQ ID N° 4 e SEQ ID N° 28 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região variável da cadeia leve derivada do clone de anticorpo F628. As SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 29 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região variável da cadeia pesada derivada do clone de anticorpo F630. As SEQ ID N° 6 e SEQ ID N° 30 correspondem à sequência de aminoácidos e nucleotidica da região variável da cadeia leve derivada do clone de anticorpo F630.

Deve ser entendido que os ácidos nucleicos ou os péptidos da invenção podem ser derivados das sequências aqui proporcionadas ou dos hibridomas depositados. Estas sequências podem ser clonadas (e. g., por PCR) e inseridas num vector e/ou células para produzir péptidos correspondente a regiões variáveis de completas ou fragmentos de regiões variáveis completas e anticorpos compreendendo as regiões variáveis. É consequentemente possível produzir anticorpos ou seus fragmentos compreendendo uma combinação de regiões variáveis da cadeia leve e pesada. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode compreender a região variável da cadeia pesada do MAB F598 (ou do anticorpo produzido pelo hibridoma F598 depositado) e a região variável da cadeia leve do F630 (ou do anticorpo produzido pelo hibridoma F630 depositado) . Deve ser entendido que pode ser utilizada qualquer combinação de regiões variáveis da cadeia pesada e leve (como aqui divulgadas ou como compreendidas em anticorpos 36 produzidos por hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933) na sínt ese de um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a invenção.

Consequentemente, a invenção abrange anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são compreendidos pelas seguintes combinações de r egiões var iáve is: SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 2; SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 4; SEQ ID N° 1 e SEQ ID N° 6; SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 2; SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4; SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 6; SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 2; SEQ ID N° 5 e SEQ ID N 0 4 ; e SEQ ID Ν' 3 5 e SEQ ID N° 6.

De um modo semelhante a invenção abrange anticorpos ou fragmentos de anticorpos que são compreendidos pelas seguintes combinações de regiões variáveis: 1. região variável da cadeia pesada do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931 e região variável da cadeia leve do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931; 2. região variável da cadeia pesada do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931 e região variável da cadeia leve do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932; 3. região variável da cadeia pesada do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931 e região variável da cadeia leve do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933; 4. região variável da cadeia pesada do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932 e região variável da cadeia leve do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931; 37 5. região variável da cadeia pesada do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932 e região variável da cadeia leve do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932; 6. região variável da cadeia pesada do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932 e região variável da cadeia leve do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933; 7. região variável da cadeia pesada do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933 e região variável da cadeia leve do hibridoma F598 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5931; 8. região variável da cadeia pesada do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933 e região variável da cadeia leve do hibridoma F628 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5932; e 9. região variável da cadeia pesada do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933 e região variável da cadeia leve do hibridoma F630 tendo o N° de Acesso ATCC PTA-5933. A invenção pretende capturar anticorpos e fragmentos de anticorpos de vários isotipos. Os hibridomas depositados produzem anticorpos do isotipo IgG2. No entanto, os genes da imunoglobulina recombinada (Ig), particularmente os genes da região variável, podem ser isolados a partir dos hibridomas depositados, como descrito nos Exemplos e clonados num vector de recombinação Ig que codifica para os genes da região constante da Ig humana tanto da cadeia pesada como da leve. Foram identificados, sintetizados e isolados anticorpos do isotipo IgGl que se ligam a PNAG/dPNAG estafilocócica e deste modo 38 intensificam a opsonofagocitose de bactérias expressando PNAG (tal como os estafilococos) , utilizando esta técnica.

Os anticorpos podem ser de um isotipo IgGl, IgG2, IgG3,

IgG4, IgD, IgE, IgM, IgAl, IgA2 ou slgA. A invenção pretende capturar isotipos encontrados em espécies não-humanas assim como mas não limitados a IgY em aves e tubarões. Os vectores que codificam as regiões constantes de vários isotipos são conhecidos e anteriormente descritos. (Ver, por exemplo, Preston et al. Production and characterization of a set of mouse-human chimeric immunoglobulin G (IgG) subclass and IgA monoclonal antibodies with identical variable regions specific for P. aeruginosa serogroup 06 lipopolysaccharide. Infect Immun. Set de 1998; 66 (9) :4137-42; Coloma et al. Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction. J Immunol Methods. 31 de Julho de 1992; 152(1):89-104; Guttieri et al. Cassette vectors for conversion of Fab fragments into full-length human IgGl monoclonal antibodies by expression in stably transformed insect cells. Hybrid Hybridomics. Junho de 2003; 22(3):135-45,- McLean et al. Human and murine immunoglobulin expression vector cassettes. Mol Immunol. Out de 2000; 37 (14):837-45,- Walls et al. Vectors for the expression of PCR amplified immunoglobulin variable domains with human constant regions. Nuclelc Aclds Res. 25 de Junho de 1993; 21(12):2921-9; Norderhaug et al. Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells. J Immunol Methods. 12 de Maio de 1997; 204(1):77-87.)

Como aqui utilizado, o termo "péptido" inclui anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos funcionalmente activos 39 e/ou equivalentes e péptidos e polipéptidos funcionalmente activos e/ou equivalentes.

Os péptidos da invenção são péptidos isolados. Como aqui utilizado, o termo "péptidos isolados" significa que os péptidos estão substancialmente puros e são essencialmente isentos de outras substâncias com as quais estes podem ser encontrados na natureza ou em sistemas in vivo numa extensão prática e adequada para a sua utilização pretendida. Em particular os péptidos são suficientemente puros e suficientemente isentos de outros constituintes biológicos das suas células hospedeiras de forma a serem úteis, por exemplo, na produção de preparações farmacêuticas ou sequenciação. Dado que um péptido isolado da invenção pode ser misturado com um veiculo farmaceuticamente aceitável numa preparação farmacêutica, o péptido pode compreender apenas uma pequena percentagem em peso da preparação. 0 péptido está no entanto substancialmente puro por ter sido substancialmente separado das substâncias com as quais este pode estar associado em sistemas vivos.

Os péptidos da invenção ligam-se a PNAG e/ou a dPNAG, de um modo preferido numa forma selectiva. Como aqui utilizado, os termos "ligação selectiva" e "ligação especifica" são utilizados de um modo indiferente para se referirem à capacidade do péptido se ligar com maior afinidade a PNAG e/ou a dPNAG e aos seus fragmentos do que os compostos não derivados de PNAG. Ou seja, os péptidos que se ligam selectivamente a PNAG e/ou a dPNAG não se irão ligar a compostos não derivados de PNAG com a mesma extensão e com a mesma afinidade com que estes se ligam a PNAG e/ou a dPNAG e seus fragmentos, com excepção de antigénios de reacção cruzada ou moléculas preparadas para serem miméticas de PNAG/dPNAG tais como os miméticos peptídicos de hidratos de 40 carbono ou regiões variáveis de anticorpos anti-idiotipo que se ligam aos péptidos de ligação a PNAG/dPNAG na mesma forma que PNAG/dPNAG. Os anticorpos que se ligam selectivamente a PNAG ligam-se a PNAG com maior afinidade do que a dPNAG. Os anticorpos que se ligam a dPNAG podem também ligar-se a dPNAG com uma afinidade menor, comparável ou superior do que a PNAG. Em formas de realização preferidas, os péptidos da invenção ligam-se apenas a PNAG e/ou a dPNAG e seus fragmentos e de um modo ainda mais preferido, estes ligam-se pelo menos a dPNAG. Como aqui utilizado, um péptido de ligação que se liga selectivamente ou especificamente a PNAG/dPNAG estafilocócica pode também ligar-se a PNAG/dPNAG de outras origens e irá ligar-se com menor afinidade (se ligar) a compostos não derivados de PNAG/dPNAG. A afinidade menor pode incluir pelo menos menos 10%, menos 20%, menos 30%, menos 40%, menos 50%, menos 60%, menos 70%, menos 80%, menos 90% ou menos 95%. Deste modo, "selectivo" neste sentido refere-se à ligação a PNAG/dPNAG e não à forma derivada de Staphylococcus de PNAG/dPNAG.

Como referido anteriormente, a invenção proporciona péptidos e. g., anticorpos ou fragmentos de anticorpos, que se ligam a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica. Esses anticorpos de um modo preferido intensificam a opsonização e a fagocitose (i. e., opsonofagocitose) de bactérias expressando PNAG (tais como estafilococos expressando PNAGj e consequentemente são úteis na prevenção e na terapia de algumas formas de infecções bacterianas num indivíduo. A opsonização refere-se a um processo pelo qual a fagocitose é facilitada pela deposição de opsoninas (e. g., factores de complemento de anticorpo e/ou opsónicos tais como C4b ou C3b ou qualquer outro factor capaz de promover a opsonofagocitose) no antigénio. A fagocitose e a opsonofagocitose referem-se ao processo pelo qual as células 41 fagocíticas (e. g., macrófagos, células dendríticas e leucócitos polimorfonucleares (PMNL)) englobam o material e o encerram dentro de um vacúolo (e. g., um fagossoma) no seu citoplasma. Deste modo, os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos que opsonizam bactérias e intensificam a fagocitose são anticorpos ou fragmentos de anticorpos que reconhecem e se depositam num antigénio e realizando isto, facilitam a incorporação e a englobamento do antigénio (e a substância contendo o antigénio, e. g., bactérias estafilocócicas) por células fagocíticas. Geralmente, para intensificar a fagocitose e a opsonização, o anticorpo compreende um domínio ou uma região Fc. 0 domínio Fc é reconhecido pela células contendo o receptor de Fc (e. g., células apresentadoras do antigénio tais como macrófagos ou PMNL) . Como aqui utilizado, "intensificar a opsonofagocitose" significa aumentar a probabilidade que um substrato contendo antigénio ou antigénio sejam reconhecidos e englobados por uma célula fagocítica, através da deposição do anticorpo. Este aumento pode ser medido pela redução da carga bacteriana in vivo ou pela morte celular bacterianas in vitro utilizando os métodos in vitro descritos abaixo.

Os ensaios de opsonização são convencionais na técnica. Geralmente esses ensaios medem a quantidade de morte bacteriana na presença de um anticorpo, um antigénio (expresso na célula bacteriana alvo), complemento e células fagocíticas. É normalmente utilizado soro quer de animais quer de humanos como uma fonte de complemento e são normalmente utilizadas células polimorfonucleares provenientes de animais ou humanos como uma fonte de células fagocíticas. A célula alvo para a morte opsonofagocítica pode ser procariota (como na presente invenção) ou eucariota, dependendo do tipo de célula que expressa o antigénio. A morte celular pode ser medida por contagens de 42 células viáveis antes e após a incubação dos componentes da reacção. Alternativamente, a morte celular pode ser quantificada pela medição dos conteúdos celulares no sobrenadante da mistura de reacção (e. g., libertação de crómio radioactivo ou libertação de enzimas intracelulares tais como desidrogenase do lactato). Outros ensaios irão ser evidentes para os especialistas na técnica, tendo lido a presente descrição, que são úteis para determinar se o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica também estimula a opsonização e a fagocitose. A presente invenção proporciona, inter alia, anticorpos monoclonais humanos específicos para PNAG/dPNAG que intensificam a morte opsónica de bactérias expressando PNAG tais como mas não limitadas a estafilococos. Estes anticorpos são denominados F598, F628 e F630. Quando utilizados in vivo em humanos, os anticorpos monoclonais humanos irão ser imunogénicos com muito menor probabilidade (em comparação com anticorpos de outras espécies). Consequentemente, estes anticorpos representam novos agentes úteis na concepção de vacinas assim como em imunoterapia passiva visando estirpes bacterianas que expressam PNAG tais como mas não limitadas a estafilococos. A síntese destes anticorpos monoclonais é descrita nos Exemplos. Resumidamente, os anticorpos foram obtidos como se segue: foram recolhidas células B a partir de indivíduos em recuperação de uma infecção estafilocócica. As células B recolhidas foram transformados utilizando o vírus de Epstein-Barr e, após um período de crescimento e rastreio para a secreção do anticorpo contra PNAG/dPNAG, fundidas com o parceiro linha celular de mieloma humano-murganho imortalizada designada HMMA 2.5. Após um período inicial de crescimento das células 43 fundidas, foram isolados, cultivados e analisados separadamente clones produtores de anticorpos únicos, utilizando um ensaio de ligação (e. g., ELISA) . Foram seleccionados três hibridomas com base na capacidade do seu anticorpo segregado para se ligar a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica. Os três anticorpos foram do isotipo IgG2 e foram utilizados como uma fonte de anticorpo do isotipo IgG2. As regiões variáveis foram clonadas por PCR a partir dos hibridomas como descrito acima.

Foram clonados ácidos nucleicos da região variável para as cadeias pesadas e leves dos anticorpos, num vector de expressão de Ig humano (i. e., TCAE6) que continha as sequências codificantes da região constante da IgGl (gama 1) para a cadeia pesada e a região constante lambda para as cadeias leves. (Ver, por exemplo, Production and characterization of a set of mouse-human chimeric immunoglobulin G (IgG) subclass and IgA monoclonal antibodies with identical variable regions specific for P. aeruginosa serogroup 06 lipopolysaccharide. Infect Immun. 19 98 Sep; 66(9) :4137-42). As regiões variáveis podem ser colocadas em qualquer vector que codifica as sequências codificantes da região constante. Por exemplo, em Coloma, et al. 1992 J. Immunol. Methods 152:89-104) foram descritos vectores de expressão da região constante da cadeia pesada de Ig humana contendo os clones genómicos dos genes da região constante da cadeia pesada das IgG2, IgG3, IgG4 e IgA humanas e sem genes da região variável.

Estes vectores de expressão foram então transfectados em células (e. g. , células CHO DG44), as células foram cultivadas in vitro e a IgGl foi subsequentemente recolhidas do sobrenadante. Os anticorpos resultantes possuíam regiões variáveis humanas e regiões constantes de IgGl humana e lambda. 44

Foi avaliada a sua capacidade para se ligarem a PNAG e/ou a dPNAG e intensificarem a opsonização e a fagocitose de bactérias expressando PNAG tais como estafilococos utilizando os ensaios ligação e de morte opsonofagocitica tais como os aqui descritos. "Anticorpos isolados" como aqui utilizado refere-se a anticorpos que estão substancialmente fisicamente separados de outro material celular (e. g., separados de células que produzem os anticorpos) ou a partir de outro material que impeça a sua utilização nos métodos de diagnóstico ou terapêuticos da invenção. De um modo preferido, os anticorpos isolados estão presentes numa população homogénea de anticorpos (e. g., uma população de anticorpos monoclonais). As composições de anticorpos isolados podem no entanto serem combinadas com outros componentes tais como mas não limitados a veículos farmaceuticamente aceitáveis, adjuvantes e semelhantes. "Células produtoras de anticorpos isolados" incluindo hibridomas isolados e células recombinantes isoladas (tais como as aqui descritas), como aqui utilizado, referem-se a células produtoras de anticorpos que estão substancialmente fisicamente separadas de outras células, outro material corporal (e. g., tecido e fluido ascítico) e outro material que impeça a sua utilização na produção de, por exemplo, uma população de anticorpos isolada e de um modo preferido homogénea. Os hibridomas depositados na ATCC a 21 de Abril de 2004 sob o Tratado de Budapeste a 21 de Abril de 2004 com os N° de Acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933 são considerados como sendo exemplos de células produtoras de anticorpos isoladas e mais especificamente de hibridomas isolados. 45

Deste modo numa forma de realização, o péptido da invenção é um anticorpo monoclonal solúvel intacto isolado específico para PNAG e/ou a dPNAG estaf ilocócica. Como aqui utilizado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a uma população homogénea de imunoglobulinas que se liga especificamente a um epitopo idêntico (i. e., determinante antigénico). Numa forma de realização o péptido da invenção é, por exemplo, um anticorpo monoclonal tendo uma região variável da cadeia pesada tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5. 0 anticorpo monoclonal pode ter uma região variável da cadeia leve tendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4 ou SEQ ID N° 6. São abrangidos pela invenção os anticorpos monoclonais tendo qualquer combinação de regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. A invenção pretende abranger anticorpos para além de, por exemplo, os clones F598, F628 e F630, desde que que esses anticorpos tenham as características de ligação dos anticorpos monoclonais aqui descritos. Opcionalmente, esses anticorpos adicionais intensificam também a opsonofagocitose de estirpes bacterianas expressando PNAG tais como mas não limitadas a estafilococos expressando PNAG. Um comum especialista na técnica pode identificar facilmente anticorpos que têm as caracteristicas funcionais (e. g., ligação, atributos de opsonização e de fagocitose) desses anticorpos monoclonais utilizando os ensaios de rastreio e ligação aqui estabelecidos em detalhe.

Em outras formas de realização, o péptido é um fragmento de anticorpo. Como é bem conhecido na técnica, apenas uma pequena porção de uma molécula de anticorpo, o paratopo, está envolvida na ligação do anticorpo ao seu epitopo (ver, em geral, Clark, W. 46 R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7a Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford; e Pier GB, Lyczak JB, Wetzler LM, (eds). Immunology, Infection and Immunity (2004) Ia Ed. American Society for Microbiology Press, Washington D. C.). As regiões pFc' e Fc do anticorpo são, por exemplo, efectores da cascata de complemento e podem mediar ligação a receptores Fc em células fagociticas, mas não estão envolvidas na ligação ao antigénio. Um anticorpo em que foi quebrada enzimaticamente a região pFc' ou que foi produzido sem a região pFc', designado um fragmento F(ab')2, conserva ambos os locais de ligação ao antigénio de um anticorpo intacto. Um fragmento F(ab')2 isolado é designado como um fragmento monoclonal bivalente devido aos seus dois locais de ligação ao antigénio. De um modo semelhante, um anticorpo em que foi quebrada enzimaticamente a região Fc ou que foi produzido sem a região Fc, designado um fragmento Fab, conserva um dos locais de ligação ao antigénio da molécula de anticorpo intacta. Indo além disso, os fragmentos Fab consistem na cadeia leve do anticorpo ligada covalentemente e uma porção da cadeia pesada do anticorpo indicada Fd (região variável da cadeia pesada). Os fragmentos Fd são o determinante principal da especificidade do anticorpo (um fragmento único Fd pode associar-se com até dez cadeias leves diferentes sem alterar a especificidade do anticorpo) e os fragmentos Fd conservam a capacidade de ligação ao epitopo em isolamento.

Os termos Fab, Fc, pFc', F(ab')2 e Fv são utilizados com qualquer significado imunológico convencional [Klein, Immunology (John Wiley, Nova Iorque, NY, 1982); Clark, W. R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 47 7a Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford); e Píer GB, Lyczak JB, Wetzler LM, (eds). Immunology, Infection and Immunity (2004) Ia Ed. American Society for Microbiology Press, Washington D. C.].

Em outras formas de realização, as porções Fc dos anticorpos da invenção podem ser substituídas de modo a produzir IgM assim como anticorpos IgG humanos contendom algumas ou todas as CDR dos anticorpos monoclonais aqui descritos ou produzidos pelos hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. É de particular importância a inclusão de uma região CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica e, numa menor extensão, as outras CDR e porções das regiões estruturais dos anticorpos monoclonais aqui descritos ou produzido pelos hibridomas depositados sob os N° de acesso ATCC. PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933. Esses anticorpos humanos irão ter utilidade clinica particular uma vez que estes irão reconhecer e irão ligar-se, de um modo preferido selectivamente, a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica, mas não irão evocar uma resposta imunitária em humanos contra o próprio anticorpo. A invenção pretende também incluir variantes funcionalmente equivalentes dos péptidos de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica. Uma "variante funcionalmente equivalente" é um composto tendo a mesma função (i. e., capacidade de se ligar a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica e em algumas formas de realização para facilitar a opsonização das estirpes bacterianas expressando PNAG) que os péptidos da invenção. Uma variante funcionalmente equivalente pode ser de natureza peptídica mas não está limitada dessa forma. Por exemplo, esta pode ser um hidrato de carbono, um peptidomimético, etc. Em formas de realização importantes, a variante funcionalmente equivalente é 48 um péptido tendo a sequência de aminoácidos de uma região variável ou uma CDR com substituições conservadoras aí contidas, que é ainda capaz de ligação a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica. Um exemplo de uma variante funcionalmente equivalente à CDR3 da região variável da cadeia pesada de ligação a PNAG/dPNAG estaf ilocócica do clone F598 (i. e., SEQ ID N° 1) é um péptido tendo substituições conservadoras na SEQ ID N° 1 que se liga, de um modo preferido especif icamente, a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica e que opcionalmente intensifica a opsonização de estirpes bacterianas expressando PNAG tais como estafilococos expressando PNAG. Como aqui utilizado, "substituição conservadora" refere-se a uma substituição de aminoácidos que não altera a carga relativa ou as características de tamanho do péptido em que a substituição de aminoácido é realizada. As substituições conservadoras de aminoácidos incluem substituições realizadas entre aminoácidos com os grupos seguintes: (1) Μ, I, L, V; (2) F, Y, W; (3) K, R, H; (4) A, G; (5) S, T; (6) Q, N; e, (7) E, D.

As variantes equivalentes funcionais podem ter identidade com os péptidos explicitamente aqui referidos. Ou seja, essas variantes podem ter identidade de pelo menos 99%, identidade de pelo : menos 98%, identidade de pelo menos 97% , identidade de pelo menos 96%, identidade de pelo menos 95%, identidade de pelo menos 94%, identidade de pelo menos 93%, identidade de pelo menos 92%, identidade de pelo menos 91%, identidade de pelo menos 90%, identidade de pelo menos 85%, identidade de pelo menos 80%, identidade de pelo menos 75%, identidade de pelo menos 70%, identidade de pelo menos 65%, identidade de pelo menos 60%, identidade de pelo menos 55%, identidade de pelo menos 50%, identidade de pelo menos 45%, identidade de pelo menos 40%, identidade de pelo menos 35%, identidade de pelo 49 menos 30%, identidade de pelo menos 25%, identidade de pelo menos 20%, identidade de pelo menos 10% ou identidade de pelo menos 5% com as sequências de aminoácido aqui proporcionadas. A equivalência funcional refere-se a uma actividade equivalente (e. g. , ligação a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica ou intensificação da opsonofagocitose da bactérias expressando PNAG tais como estafilococos expressando PNAG), no entanto esta abrange também a variação no nível dessa actividade. Por exemplo, um equivalente funcional é uma variante que se liga a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica com uma afinidade menor, igual ou superior aos clones de anticorpos monoclonais aqui descritos, desde que que a variante seja ainda útil na invenção (i. e., esta ligar-se a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica e opcionalmente intensificar a opsonofagocitose de bactérias expressando PNAG tais como estafilococos expressando PNAG).

Essas substituições podem ser realizadas por vários métodos conhecidos de um comum especialista na técnica. Por exemplo, as substituições de aminoácidos podem ser realizadas por mutação dirigida por PCR, mutagénese dirigida para um local de acordo com o método de Kunkel (Kunkel, Proc. Nat. Acad Sei. U.S.A. 82:488-492, 1985) ou por síntese química de um gene codificando a CDR particular ou um péptido compreendendo as sequências de aminoácido da CDR aqui descrita. Estes e outros métodos para alterar um péptido contendo uma CDR irão ser conhecidos dos comuns especialistas na técnica e podem ser encontrados em referências que compilam esse métodos, e. g. Sambrook ou Ausubel, referidos acima. No entanto, em algumas formas de realização, devido ao tamanho das CDR, pode ser mais adequado sintetizar os péptidos variantes utilizando um sintetizador de péptidos tal como os comercialmente disponíveis. A actividade de 50 variantes funcionalmente equivalentes da CDR de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica pode ser testada pelos ensaios de ligação e em alguns casos ensaios de actividade biológica, discutidos mais detalhadamente abaixo. Como aqui utilizados, os termos "variante funcional", "variante funcionalmente equivalente" e "variante funcionalmente activa" são utilizados de um modo indiferente.

Como aqui utilizado o termo "fragmento de anticorpo funcionalmente activo" significa um fragmento de uma molécula de anticorpo incluindo uma região de ligação a PNAG ou de ligação a PNAG estafilocócica da invenção que conserva a capacidade de se ligar respectivamente a PNAG ou dPNAG estafilocócica, de um modo preferido de uma forma específica. Esses fragmentos podem ser utilizados in vitro e in vivo. Em particular, os fragmentos de anticorpos bem conhecidos funcionalmente activos incluem mas não estão limitados aos fragmentos F(ab')2, Fab, Fv e Fd de anticorpos. Estes fragmentos que não têm o fragmento Fc do anticorpo intacto, desaparecem mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação não específica a tecidos do que um anticorpo intacto (Wahl et al.r J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Como um outro exemplo, podem ser construídos anticorpos de cadeia única de acordo com os métodos descritos na Patente U.S. N° 4946778 de Ladner et al. Esses anticorpos de cadeia única incluem as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas ligadas por uma parte de ligação flexível. Foram também descritos métodos para obter um anticorpo de domínio único ("Fd") que compreende um domínio único da cadeia pesada variável isolado, (ver, por exemplo, Ala et al., Nature 341:644-646 (1989), divulgando um método de rastreio para identificar uma região variável da cadeia pesada de um anticorpo (anticorpo de domínio único VH) com afinidade suficiente para o seu epitopo 51 alvo para se ligar a este na forma isolada) . São conhecidos na técnica métodos para preparar fragmentos Fv recombinantes baseados em sequências conhecidas da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve de um anticorpo e foram descritas, e. g., Moore et al., Patente U.S. N° 4462334. Outras referências descrevendo a utilização e a produção de fragmentos de anticorpos incluem e. g., fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Iimunoassays (Elsevier, Amsterdão, 1985)), Fv fragments (Hochman et al., Biochemistry 12:1130 (1973); Sharon et al., Biochemistry 15:1591 (1976); Ehrlich et al., Patent U.S. N° 4355023) e porções de moléculas de anticorpo (Audilore-Hargreaves, Patente U. S. N°. 4470925). Deste modo, os especialista na técnica podem construir fragmentos de anticorpos a partir de várias porções de anticorpos intactos sem destruir a especificidade dos anticorpos para PNAG e/ou dPNAG estafilocócica.

Em aspectos importantes da invenção, o fragmento de anticorpo funcionalmente activo conserva também a capacidade de opsonizar e fagocitar bactérias expressando PNAG tais como estafilococos expressando PNAG. Neste último caso, o fragmento de anticorpo inclui uma região Fc assim como um domínio de ligação ao epitopo. A região Fc permite que o fragmento de anticorpo se ligue a células positivas para o receptor Fc, que subsequentemente fagocitam o epitopo ligado pela região Fab do anticorpo.

Adicionalmente podem ser facilmente sintetizados ou produzidos péptidos pequenos incluindo os contendo a região CDR3 de ligação a PNAG/dPNAG estafilocócica por meios recombinantes para produzir o péptido da invenção. Esses métodos são bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica. Os péptidos 52 podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando sintetizadores de péptidos automatizados que estão comercialmente disponíveis. Os péptidos podem ser produzidos por técnicas recombinantes incorporando o ADN expressando o péptido num vector de expressão e transformando células com o vector de expressão para produzir o péptido.

Os péptidos, incluindo anticorpos, podem ser testados para a sua capacidade para se ligarem a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica utilizando ensaios de ligação convencionais conhecidos na técnica. Como um exemplo de um ensaio adequado, pode ser imobilizada PNAG e/ou a dPNAG, tal como PNAG e/ou dPNAG estaf ilocócica, numa superfície (tal como num poço de uma placa multi-poços) e depois feita contactar com um péptido marcado. A quantidade do péptido que se liga a PNAG e/ou a dPNAG (e que deste modo se fica imobilizado na superfície) pode ser então quantificada para determinar se um péptido emm particular se liga a PNAG e/ou a dPNAG. Alternativamente, pode ser também medida a quantidade de péptido não ligado à superfície. Numa variação deste ensaio, o péptido pode ser testado para a sua capacidade para se ligar directamente a uma colónia expressando PNAG cultivada in vitro. A ligação do péptido pode ser também testada utilizando um ensaio de competição. Se o péptido a ser testado (incluindo um anticorpo) competir com os anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos aqui descritos, como mostrado por uma redução na ligação do anticorpo monoclonal ou fragmento, então é provável que o péptido e o anticorpo monoclonal se liguem ao mesmo ou pelo menos a um epitopo sobreposto. Neste sistema de ensaio, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é marcado e a PNAG e/ou a dPNAG é imobilizada na superfície sólida. Estes e outros ensaios 53 são aqui descritos mais detalhadamente. Deste modo, podem ser identificados péptidos competidores incluindo anticorpos competidores. A invenção abrange péptidos e em particular anticorpos (e seus fragmentos) que competem com o anticorpo F598, F628 ou F630 para a ligação a PNAG/dPNAG (i. e., anticorpos que reconhecem e se ligam aos mesmos epitopos que F598, F628 ou F630).

Os ensaios de ligação convencionais são bem conhecidos na técnica e vários destes são adequados na presente invenção incluindo ELISA, ensaio de competição de ligação (como descrito acima), ensaios de sanduíche, ensaios radiorreceptores utilizando péptidos marcados radioactivamente ou anticorpos marcados radioactivamente, imunoensaios, etc. A natureza do ensaio não é essencial desde que seja suficientemente sensível para detectar a ligação de um pequeno número de péptidos.

Podem ser também incluídos vários outros reagentes na mistura de ligação. Estes incluem reagentes tais como sais, tampões, proteínas neutras (e. g., albumina), detergentes, etc. que podem ser utilizados para facilitar uma ligação óptima. Esse reagente pode também reduzir interacções não-específicas ou de fundo dos componentes da reacção. Podem ser também utilizados outros reagentes que melhorem a eficiência do ensaio. A mistura dos materiais de ensaio anteriores é incubada sob condições em que o anticorpo monoclonal normalmente se liga especificamente a PNAG e/ou a dPNAG tal como a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica. Essas condições irão mimetizar de um modo preferido condições fisiológicas. A ordem da adição dos componentes, a temperatura de incubação, o tempo de incubação e outros parâmetros do ensaio podem ser facilmente determinados. Essa experimentação envolve apenas a optimização dos parâmetros de ensaio, não a composição 54 fundamental do ensaio. As temperaturas de incubação tipicamente situam-se entre 4 °C e 40 °C. Os tempos de incubação são de um modo preferido minimizados para facilitar o rastreio de elevada capacidade de processamento, rápido e tipicamente estão entre 0,1 e 10 horas. Após a incubação, é detectada a presença ou ausência de ligação especifica entre o péptido e PNAG e/ou dPNAG por qualquer método adequado disponível para o utilizador.

Tipicamente, são processadas várias misturas de ensaio em paralelo com péptidos diferentes ou diferentes concentrações de péptido para obter uma resposta diferente às várias concentrações. Uma destas concentrações serve como um controlo negativo, i. e., a concentração zero de PNAG e/ou de PNAG ou uma concentração de PNAG e/ou dPNAG abaixo dos limites de detecção do ensaio. É frequentemente utilizado um passo de separação para separar péptido ou anticorpo ligado de não ligado. O passo de separação pode ser realizado de várias formas. Adequadamente, pelo menos um dos componentes (e. g., péptido ou anticorpo) é imobilizado num substrato sólido através da ligação a PNAG e/ou a dPNAG. Os componentes não ligados podem ser facilmente separados da fracção ligada. O substrato sólido pode ser constituído por uma vasta gama de materiais e numa vasta gama de formas, e. g., colunas ou géis de poliacrilamida, agarose ou sefarose, placas de microtitulação, microesferas, partículas de resina, etc. O passo de separação inclui de um modo preferido múltiplos enxaguamentos ou lavagens. Por exemplo, quando o substrato sólido é uma placa de microtitulação, os poços podem ser lavados várias vezes com uma solução de lavagem, que inclui tipicamente os componentes da mistura de incubação que não participam em ligações específicas tais como sais, tampão, 55 detergente, proteína não-específica, etc. Em que o substrato sólido é uma esfera magnética, as esferas podem ser lavadas uma ou mais vezes com uma solução de lavagem e isoladas utilizando um magneto.

Os péptidos podem ser utilizados isoladamente ou em conjugados com outras moléculas tais como agentes de detecção ou citotóxicos na detecção e composições da invenção, como aqui descrito mais detalhadamente.

Tipicamente, um dos componentes compreende normalmente ou está ligado ou conjugado com uma marcação detectável. Uma marcação detectável é uma parte, cuja presença pode ser determinada directamente ou indirectamente. Geralmente, a detecção da marcação envolve uma emissão de energia pela marcação. A marcação pode ser detectada directamente pela sua capacidade de emitir e/ou absorver fotões ou outras partículas atómicas de um comprimento de onda particular (e. g., radioactividade, luminescência, densidade óptica ou de electrónica, etc.). Uma marcação pode ser detectada indirectamente pela sua capacidade de se ligar, recrutar e, em alguns casos, quebrar outra parte que por si pode emitir ou absorver luz de um comprimento de onda particular (e. g., marcação do epitopo tal como epitopo FLAG, marcação enzimática tais como peroxidase de rábano, etc.). Um exemplo de detecção indirecta é a utilização de uma primeira marcação enzimática que quebra um substrato em produtos visíveis. A marcação pode ser de natureza química, peptídica ou de molécula de ácido nucleico embora não esteja limitada dessa forma. Outras marcações detectáveis incluem isótopos radioactivos tais como P32 ou H3, marcadores luminescentes tais como fluorocromos, marcadores de densidade óptica ou electrónica, etc. ou marcações de epitopo 56 tais como epitopo FLAG ou epitopo AI, biotina, avidina e marcações enzimáticas tais como peroxidase de rábano, β-galactosidase, etc. A marcação pode ser ligada a um péptido durante ou após a sua síntese. Existem muitas marcações e métodos de marcação diferentes conhecidos do comum especialista na técnica. Os exemplos de tipos de marcações que podem ser utilizados na presente invenção incluem enzimas, isótopos radioactivos, compostos fluorescentes, metais coloidais, compostos quimioluminescentes e compostos bioluminescentes. Os comuns especialistas na técnica irão conhecer outras marcações adequadas dos péptidos aqui descritos ou irão ser capazes de as determinar, utilizando experimentação de rotina. Além disso, a ligação ou a conjugação destas marcações com os péptidos da invenção pode ser realizada utilizando técnicas convencionais normais para os comuns especialistas na técnica.

Uma outra técnica de marcação que pode resultar numa maior sensibilidade consiste na ligação dos péptidos a haptenos de baixo peso molecular. Estes haptenos podem ser então alterados especificamente através de uma segunda reacção. Por exemplo, é comum utilizar haptenos tal como biotina, que reage com avidina ou dinitrofenol, piridoxal ou fluoresceína, que pode reagir com anticorpos anti-hapteno específicos. A conjugação dos péptidos incluindo anticorpos ou seus fragmentos com uma marcação detectável facilita, inter alia, a utilização desses agentes em ensaios diagnósticos. Uma outra categoria de marcações detectáveis inclui marcações de diagnóstico e de visualização (geralmente designadas como marcações detectáveis in vivo) tal como por exemplo visualização de ressonância magnética (MRI): Gd (DOTA); para medicina nuclear: 201T1, o radionuclido emissor gama 99mTc; para 57 tomografia de emissão de positrões (PET): isótopos emissores de positrões, (18 ) F-ffuorodesoxiglicose ((18)FDG), (18)F-fluoreto, cobre-64, gadodiamida e isótopos radioactivos de Pb(II) tal como 203Pb; lllln.

As conjugações ou modificações aqui descritas utilizam química de rotina, em que a química não é uma parte da invenção e em que a química é bem conhecida dos especialistas na técnica da química. A utilização de grupos protectores e elementos de ligação conhecidos tais como elementos de ligação mono e hétero-bifuncionais está bem documentada na literatura e não irá ser aqui repetida.

Como aqui utilizado, "conjugado" significa duas entidades de ligadas forma estável entre si por qualquer meio físico-químico. É importante que a natureza da ligação seja tal que esta não prejudique substancialmente a eficácia de qualquer entidade. Tendo estes parâmetros em consideração, pode ser utilizada qualquer ligação covalente ou não-covalente conhecida dos comuns especialistas na técnica. Em algumas formas de realização, é preferida ligação covalente. A conjugação não-covalente inclui interacções hidrofóbicas, interacções iónicas, interacções de afinidade elevada tais como complexação biotina-avidina e biotina-estreptavidina e outras interacções de afinidade. Esses meios e métodos de ligação são bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica.

Podem ser utilizados vários métodos para detectar a marcação, dependendo da natureza da marcação e outros componentes do ensaio. Por exemplo, a marcação pode ser detectada enquanto ligada ao substrato sólido ou subsequentemente à separação do substrato sólido. As marcações 58 podem ser detectadas directamente por densidade óptica ou electrónica, emissões radioactivas, transferências de energia não-radioactivas, etc. ou detectadas indirectamente com conjugados de anticorpo, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. Os métodos para detectar as marcações são bem conhecidos na técnica.

Os anticorpos monoclonais aqui descritos podem ser também utilizados para produzir anticorpos anti-idiotipicos que podem ser utilizados para rastreio e identificação de outros anticorpos que têm a mesma especificidade de ligação que os anticorpos monoclonais da invenção. Um anticorpo anti-idiotipico é um anticorpo que reconhece determinantes únicos presentes num anticorpo monoclonal da invenção. Estes determinantes estão localizados na região hipervariável do anticorpo. Esta é esta região que se liga a um determinado epitopo e é deste modo responsável pela especificidade do anticorpo. Esses anticorpos anti-idiotípicos podem ser produzidos utilizando técnicas de hibridoma bem conhecidas (Kohler e Milstein, Nature, 256:495, 1975) . Como um exemplo, um anticorpo anti-idiotipico pode ser preparado imunizando um indivíduo com o anticorpo monoclonal. 0 indivíduo imunizado irá reconhecer e responder aos determinantes idiotípicos do anticorpo monoclonal imunizante e irá produzir um anticorpo contra estes determinantes idiotípicos. É possível identificar outros clones com o mesmo idiotipo que o anticorpo monoclonal utilizado para a imunização, pela utilização dos anticorpos anti-idiotipicos do animal imunizado, que são específicos para o anticorpo monoclonal da invenção. A identidade idiotípica entre anticorpos monoclonais de duas linhas celulares demonstra que dois anticorpos monoclonais são iguais no que respeita ao seu reconhecimento do mesmo determinante epitópico. Deste modo, é possível identificar 59 outros hibridomas expressando anticorpos monoclonais que têm a mesma especificidade epitópica, utilizando anticorpos anti-idiotipicos.

Os anticorpos anti-idiotipicos podem ser também utilizados para imunização activa (Herlyn, et al.r Science, 232:100, 1986), uma vez que é possível utilizar a tecnologia anti-idiotipo para produzir anticorpos monoclonais que mimetizam um epitopo. Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-idiotípico produzido contra um primeiro anticorpo monoclonal irá ter um domínio de ligação na região hipervariável que é a imagem do epitopo ligado pelo primeiro anticorpo monoclonal. Deste modo, o anticorpo monoclonal anti-idiotípico pode ser utilizado para imunização, uma vez que o domínio de ligação do anticorpo monoclonal anti-idiotipo actua eficazmente como um antigénio. A invenção contempla ainda anticorpos bi-específicos que incluem um primeiro domínio de ligação ao antigénio específico para PNAG/dPNAG e um segundo domínio de ligação ao antigénio específico para outra parte. O primeiro domínio de ligação ao antigénio específico para PNAG/dPNAG pode compreender qualquer dos péptidos de ligação a PNAG/dPNAG (incluindo CDR, regiões variáveis, fragmentos Fab aqui descritos ou produzidos ou derivados de hibridomas depositados tendo os N° de Acesso ATCC PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933). O segundo domínio de ligação ao antigénio pode ser específico para uma parte numa célula tal como uma célula bacteriana ou uma célula hospedeira. As células hospedeiras podem ser células do sistema imunitário ou células do tecido infectado. Os anticorpos para moléculas da superfície celular expressas por células do sistema imunitário ou provenientes de várias células do tecido hospedeiras estão geralmente comercialmente disponíveis de fontes tais como Sigma 60 ou BD Biosciences Pharmingen. Os comuns especialistas na técnica irão ser capazes de produzir esses anticorpos bi-especificos com base nestes ensinamentos e o conhecimento da técnica. Numa forma semelhante, a invenção contempla também anticorpos tri-especificos. (Ver, por exemplo, os documentos US 5945311 e 6551592 para a produção de anticorpo bi-especificos e tri-especifico).

Foram determinadas as sequências responsáveis pela especificidade dos anticorpos monoclonais da invenção. Consequentemente, os péptidos de acordo com a invenção podem ser preparados utilizando tecnologia de ADN recombinante. Existem entidades nos Estados Unidos que realizam esta função comercialmente, tais como Thomas Jefferson University e Scripps Protein and Nucleic Acids Core Sequencing Facility (La Jolla, Califórnia) . Por exemplo, pode ser preparado ADNc da região variável por reacção em cadeia da polimerase a partir de ARN de hibridoma depositado utilizando iniciadores degenerados ou não degenerados (derivados da sequência de aminoácidos). 0 ADNc pode ser subclonado para produzir quantidades suficientes de ADN em cadeia dupla para sequenciação por reacções de sequenciação ou equipamento convencional.

Com o conhecimento das sequências de ácido nucleico dos domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo monoclonal anti-PNAG/dPNAG estafilocócica, um comum especialista na técnica é capaz de produzir ácidos nucleicos que codificam este anticorpo ou que codificam os vários fragmentos de anticorpo, anticorpos humanizados ou polipéptidos descritos acima. É contemplado que esses ácidos nucleicos irão estar operativamente ligados a outros ácidos nucleicos formando um vector recombinante para clonagem ou expressão dos péptidos da 61 invenção. A presente invenção inclui qualquer vector recombinante contendo as sequências codificantes ou sua parte, para transformação procariota ou eucariota, transfecção ou terapia génica. Esses vectores podem ser preparados utilizando técnicas de biologia molecular convencionais, conhecidas dos especialistas na técnica e irão compreender sequências ADN de codificantes para a região CDR (e de um modo preferido para a região CDR3) e sequências variáveis adicionais contribuindo para a especificidade dos anticorpos ou suas partes, assim como outras sequências peptídicas não-especificas e um promotor adequado quer com uma sequência sinal de exportação ou de secreção (Whittle et al., Protein Eng. 1: 499, 1987 e Burton et al., Science 266:1024-1027, 1994) quer sem (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90:7889, 1993 e Duan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 91:5075-5079,1994). Esses vectores podem ser transformados ou transfectados em células procariotas (Huse et al., Science 246:1275, 1989, Ward et al., Nature 341:644-646, 1989; Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991 e Barbas et al., Proc. Natl. Acad Sei. (USA) 88:7978, 991) ou eucariotas (Whittle et al., 1987 e Burton et al., 1994) ou utilizados para terapia génica (Marasco et al., 1993 e Duan et al., 1994) por técnicas convencionais, conhecidas dos especialistas na técnica.

Como aqui utilizado, um "vector" pode ser qualquer de vários ácidos nucleicos em que pode ser inserida uma sequência pretendida por restrição e ligação para transporte entre ambientes diferentes genéticos ou para expressão numa célula hospedeira. Os vectores são tipicamente contituidos por ADN embora estejam também disponíveis vectores de ARN. Os vectores incluem, mas não estão limitados a, plasmideos e fagemidios. Um vector de clonagem é o que é capaz de se replicar numa célula hospedeira e que é ainda caracterizado por um ou mais locais de 62 endonuclease de restrição em que o vector pode ser cortado de uma determinada forma e em que uma sequência de ADN pretendida pode ser ligada de forma a que o novo vector recombinante conserve a sua capacidade para se replicar na célula hospedeira. No caso de plasmídeos, a replicação da sequência pretendida pode ocorrer várias vezes à medida que o plasmideo aumenta em número de cópias dentro da bactéria hospedeira ou apenas uma única vez por hospedeiro antes do hospedeiro se reproduzir por mitose. No caso dos fagos, a replicação pode ocorrer activamente durante uma fase litica ou passivamente durante uma fase lisogénica. Um vector de expressão é aquele em que pode ser inserida uma sequência de ADN pretendida por restrição e ligada de forma a que esta seja ligada operativamente a sequências reguladoras e pode ser expressa como um transcrito de ARN. Os vectores podem conter ainda uma ou mais sequências marcadoras adequadas para utilização na identificação de células que foram ou não transformadas ou transfectadas com o vector. Os marcadores incluem, por exemplo, genes codificando proteínas que aumentam ou reduzem quer a resistência quer a sensibilidade a antibióticos ou a outros compostos, genes que codificam enzimas cujas actividades são detectáveis por ensaios convencionais conhecidos na técnica (e. g., β-galactosidase ou fosfatase alcalina) e genes que afectam visivelmente o fenótipo de células, hospedeiros, colónias ou placas transformadas ou transfectadas. Os vectores preferidos são os capazes de replicação autónoma e expressão dos produtos do gene estrutural presente nos segmentos de ADN aos quais estes estão ligados operativamente.

Os vectores de expressão da presente invenção incluem sequências reguladoras ligadas operativamente a uma sequência nucleotídica codificando um dos péptidos da invenção. Como aqui 63 utilizado, o termo "sequências reguladoras" significa sequências de nucleótido que são necessárias ou conducentes à transcrição de uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido pretendido e/ou que são necessárias ou conducentes à tradução do transcrito resultante no polipéptido pretendido. As sequências reguladoras incluem, mas não estão limitadas a, sequências 5' tais como operadores, promotores e sequências de ligação ao ribossoma e sequências 3' tais como sinais de poliadenilação. Os vectores da invenção podem incluir opcionalmente sequências 5' líder ou sinal, sequências 5' ou 3' codificando produtos de fusão para auxiliar na purificação da proteína e vários marcadores que auxiliam na identificação ou na selecção de transformantes. A selecção e a concepção de um vector adequado estão dentro da capacidade e do discernimento de um comum especialista na técnica. A purificação subsequente dos péptidos pode ser realizada por qualquer de vários meios convencionais conhecidos na técnica.

Um vector preferido para o rastreio de péptidos, mas não necessariamente preferido para a produção em massa dos péptidos da invenção, é uma molécula de ADN recombinante contendo uma sequência nucleotidica que codifica e é capaz de expressar um polipéptido de fusão contendo, na direção terminal amino para carboxilo, (1) um domínio sinal de secreção procariota, (2) um polipéptido da invenção, e, opcionalmente, (3) um domínio de proteína de fusão. 0 vector inclui sequências reguladoras de ADN para a expressão do polipéptido de fusão, de um modo preferido sequências reguladoras procariota. Esses vectores podem ser construídos pelos especialistas na técnica e foram descritos por Smith et al. (Science 228:1315-1317, 1985), Clackson et al.

(Nature 352:624-628, 1991); Kang et al. (em "Methods: A

Companion to Methods in Enzymology: Vol. 2", R. A. Lerner e D.R. 64

Burton, ed. Academic Press, NY, pp 111-118,1991); Barbas et al. (Proc. Natl. Acad Sei. (USA) 88:7978-7982, 1991), Roberts et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 89:2429-2433, 1992).

Um polipéptido de fusão pode ser útil para a purificação dos péptidos da invenção. 0 domínio de fusão, por exemplo, pode incluir uma cauda poli-His que permite a purificação em colunas de Ni+ ou proteína de ligação à maltose do vector comercialmente disponível pMAL (New England BioLabs, Beverly, MA) . Um domínio de fusão actualmente preferido, mas de modo algum necessário, é uma âncora membranar de fago filamentoso. Este domínio é particularmente útil no rastreio de bibliotecas de apresentação de fagos de anticorpos monoclonais mas pode ser de menos utilidade na produção em massa de anticorpos. A âncora membranar de fago filamentoso é de um modo preferido um domínio da proteína do invólucro cpIII ou cpVIII capaz de se associar com a matriz de uma partícula de fago filamentoso, incorporando deste modo o polipéptido de fusão na superfície de fago, para permitir ligação em fase sólida a antigénios ou epitopos específicos e deste modo permitir o enriquecimento e a selecção dos anticorpos ou fragmentos específicos codificados pelo vector fagemídio. 0 sinal de secreção é um domínio de péptido líder de uma proteína que visa a membrana proteica da célula hospedeira, tal como a membrana periplásmica de bactérias gram negativas. Um sinal de secreção preferido de E. coli é um sinal de secreção pelB. Em Lei, et al. (Nature 381:543-546, 1988) são descritas as sequências de resíduo de aminoácidos previstas do domínio do sinal de secreção de duas variantes produtoras do gene pelB de Erwinia carotova. A sequência líder da proteína pelB foi anteriormente utilizada como um sinal de secreção para proteínas de fusão (Better, et al., Science 240:1041-1043, 1988; Sastry, 65 et al., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 86:5728-5732, 1989; e

Mullinax, et al., Proc. Natl. Acad Sei. (USA) 87:8095-8099, 1990). Em Oliver, Em Neidhard, F. C. (ed.), Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1:56-69 (1987), podem ser encontradas sequências de resíduos de aminoácidos para outros domínios do polipeptídicos sinal de secreção de E. coli úteis nesta invenção.

Para atingir níveis elevados da expressão génica em E. coli, é necessário utilizar não apenas promotores fortes para produzir grandes quantidades de ARNm, mas também locais de ligação ao ribossoma para assegurar que o ARNm é traduzido eficientemente. Em E. coli, o local de ligaçao ao ribossoma inclui um codão de iniciação (AUG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão de iniciação (Shine, et al., Nature 254:34, 1975). A sequência, AGGAGGU, que é designada sequência de Shine-Dalgarno (SD), é complementar à extremidade 3' do ARNr 16S de E. coli. A ligação do ribossoma ao ARNm e a sequência na extremidade 3' do ARNm pode ser afectada por vários factores: (i) grau de complementaridade entre a sequência de SD e a extremidade 3' dos ARNr 16S; (ii) o espaçamento e possivelmente a sequência de ADN que se situa entre a sequência SD e AUG (Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76:760., 1979a: Roberts, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76:5596, 1979b; Guarente, et al., Science 209:1428, 1980; e Guarente, et al., Cell 20:543, 1980). A optimização é realizada medindo o nível da expressão de genes em plasmídeos em que este espaçamento é alterado sistematicamente. A comparação entre diferentes ARNm mostra que existem sequências estatisticamente preferidas a partir das posições -20 a +13 (em que o A de AUG é a posição 0) 66 (Gold, et al., Annu. Rev. Microbiol. 35:365, 1981). As sequências líder revelaram influenciar drasticamente a tradução (Roberts, et ai., 1979a, b supra); e (iii) a sequência nucleotídica após AUG, que afecta a ligação do ribossoma (Taniguchi, et al., J. Mol. Biol., 118:533, 1978).

As sequências reguladoras 3' definem pelo menos um codão de terminação (stop) na grelha de leitura correcta e ligado operativamente ao polipéptido de fusão heterólogo.

Em formas de realização preferidas com um hospedeiro de expressão procariota, o vector utilizado inclui uma origem de replicação ou replicão procariota, i. e., uma sequência de ADN tendo a capacidade de controlar a replicação autónoma e a manutenção da molécula de ADN recombinante extra-cromossomicamente numa célula hospedeira procariota, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com esta. Essas origens da replicação são bem conhecidas na técnica. As origens de replicação preferidas são as que são eficientes no organismo hospedeiro. E. coli é uma célula hospedeira preferida. Uma origem da replicação preferida para utilização de um vector em E. coli, é ColEl encontrada em pBR322 e vários outros plasmídeos comuns. É também preferida a origem de replicação pl5A encontrada em pACYC e os seus derivados. Os replicões ColEl e pl5A têm sido extensamente utilizados em biologia molecular, estão disponíveis em vários plasmídeos e são descritos por Sambrook. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).

Além disso, as formas de realização que incluem um replicão procariota incluem também de um modo preferido um gene cuja expressão confere uma vantagem selectiva, tal como resistência a 67 um fármaco, a um hospedeiro bacteriano transformado com este. Os genes de resistência a fármacos bacterianos típicos são os que conferem resistência a ampicilina, tetraciclina, neomicina/canamicina ou cloranfenicol. Os vectores contêm também tipicamente locais de restrição adequados para a inserção de sequências de ADN traduzíveis. Os vectores característicos são os plasmídeos pUC18 e pUC 19 e vectores derivados tal como pADNcII disponível de Invitrogen (San Diego, CA).

Quando o péptido da invenção é um anticorpo incluindo tanto sequências da cadeia pesada como da cadeia leve, estas sequências podem ser codificadas em vectores distintos ou, mais adequadamente, podem ser expressas por um único vector. A cadeia pesada e leve, após tradução ou após secreção, pode formar a estrutura heterodimérica das moléculas de anticorpo naturais. Esse anticorpo heterodimérico pode ou não ser estabilizado por ligações persulfureto entre as cadeias pesadas e leves.

Um vector para a expressão de anticorpos heterodiméricos, tais como os anticorpos intactos da invenção ou os fragmentos de anticorpos F(ab')2/· Fab ou de Fv da invenção, é uma molécula de ADN recombinante adaptada para receber e expressar as primeiras e as segundas sequências de ADN traduzíveis. Ou seja, um vector de expressão de ADN para expressar um anticorpo heterodimérico proporciona um sistema para clonar (inserir) independentemente as duas sequências de ADN traduzíveis em duas cassetes distintas presentes no vector, para formar dois cistrões distintos para expressar os primeiros e segundos polipéptidos de um anticorpo heterodimérico. 0 vector de expressão de ADN para expressar dois cistrões é designado como um vector de expressão dicistrónico. 68

De um modo preferido, o vector compreende uma primeira cassete que inclui sequências de ADN reguladoras a montante e a jusante ligadas operativamente através de uma sequência de nucleótidos adaptada para ligação direccional a um ADN inserido. A sequência traduzivel a montante codifica de um modo preferido o sinal de secreção como descrito acima. A cassete inclui sequências reguladoras de ADN para expressar o primeiro polipéptido de anticorpo que é produzido quando uma sequência de ADN traduzivel inserida (ADN inserido) é inserida direccionalmente na cassete através da sequência de nucleótidos adaptada para a ligação direccional. 0 vector de expressão dicistrónico contém também uma segunda cassete para expressar o segundo polipéptido de anticorpo. A segunda cassete inclui uma segunda sequência de ADN traduzivel que de um modo preferido codifica um sinal de secreção, como descrito acima, ligada operativamente no seu terminal 3' através de uma sequência de nucleótidos adaptada para a ligação direccional a uma sequência de ADN a jusante do vector que define tipicamente pelo menos um codão de terminação na grelha de leitura da cassete. A segunda sequência de ADN traduzivel está ligada operativamente no seu terminal 5' às sequências reguladoras de ADN que formam os elementos 5'. A segunda cassete é capaz, após a inserção de uma sequência de ADN traduzivel (ADN inserido), de expressar o segundo polipéptido de fusão compreendendo um sinal de secreção com um polipéptido codificado pelo ADN inserido.

Os péptidos da presente invenção podem ser também produzidos por células eucariotas tais como as células CHO, hibridomas humanos, células B-linfoblastóides imortalizadas e semelhantes. Neste caso, é construído um vector em que as 69 sequências reguladoras eucariotas estão ligadas operativamente às sequências nucleotidicas codificando o péptido. A concepção e a selecção de um vector eucariota adequado estão dentro da capacidade e do discernimento de um comum especialista na técnica. A purificação subsequente dos péptidos pode ser realizada por qualquer de vários meios convencionais conhecidos na técnica.

Numa outra forma de realização, a presente invenção proporciona células hospedeiras, tanto procariotas como eucariotas, transformadas ou transfectadas com os vectores do presente invenção e incluindo-os consequentemente.

Como aqui utilizado no que respeita a ácidos nucleicos, o termo "isolado" significa: (i) amplificado in vitro por, por exemplo, reacção em cadeia da polimerase (PCR); (ii) produzido recombinantemente por clonagem; (iii) purificado, como por quebra e separação em gel; ou (iv) sintetizado por, por exemplo, síntese química. Um ácido nucleico isolado é aquele que é facilmente manipulável por técnicas de ADN recombinante bem conhecidas na técnica. Deste modo, uma sequência nucleotídica contida num vector em que são conhecidos os locais de restrição 5' e 3' ou para a qual foram divulgadas sequências dos iniciadores para a reacção em cadeia da polimerase (PCR) é considerado isolada mas não uma sequência de ácido nucleico existindo no seu estado nativo no seu hospedeiro natural. Um ácido nucleico isolado pode estar substancialmente purificado, mas não tem de estar. Por exemplo, um ácido nucleico que está isolado dentro de um vector de clonagem ou de expressão não está puro por este poder compreender apenas uma percentagem muito pequena do material na célula em que este reside. No entanto, esse ácido nucleico está isolado como o termo é aqui utilizado 70 porque este é facilmente manipulável por técnicas convencionais conhecidas dos comuns especialistas na técnica.

Como aqui utilizado, diz-se que uma sequência codificante e sequências reguladoras estão "ligadas operativamente" quando estas estão ligadas covalentemente de forma a colocar a expressão ou a transcrição da sequência codificante sob a influência ou o controlo das sequências reguladoras. Se for pretendido que as sequências codificantes sejam traduzidas numa proteína funcional, diz-se que duas sequências de ADN estão ligadas operativamente se a indução de um promotor nas sequências reguladoras 5' resultar na transcrição da sequência codificante e se a natureza da ligação entre as duas sequências de ADN não (1) resultar na introdução de uma mutação de alteração da grelha de leitura, (2) interferir com a capacidade da região promotora para controlar a transcrição das sequências codificantes ou (3) interferir com a capacidade do transcrito de ARN correspondente ser traduzido numa proteína. Deste modo, uma região promotora irá estar ligada operativamente a uma sequência codificante se a região promotora for capaz de realizar a transcrição dessa sequência de ADN de forma a que o transcrito resultante possa ser traduzido na proteína ou no polipéptido pretendido. A natureza precisa das sequências reguladoras necessárias para a expressão génica pode variar entre espécies ou tipos celulares, mas irá incluir em geral, de acordo com a necessidade, sequências 5' não transcritas e 5' não traduzidas envolvidas, respectivamente, com a iniciação da transcrição e da tradução, tais como uma caixa TATA, sequência de remate, sequência CAAT e semelhantes. Especialmente, essas sequências reguladoras 5'não-transcritas irão incluir uma região promotora 71 que inclui uma sequência promotora para o controlo da transcrição do gene ligado operativamente. As sequências reguladoras podem também incluir sequências intensificadoras ou sequências activadoras a montante, como pretendido. A presente divulgação refere-se também à utilização dos péptidos aqui descritos em métodos in vivo e in vitro. Os métodos são úteis para diagnosticar assim como para tratar infecções por bactérias expressando PNAG tais como infecções estafilocócicas. "Estafilococos" como aqui utilizado refere-se a quaisquer espécies bacterianas estafilocócicas expressando o antigénio PNAG. As bactérias que são classificadas como estafilococos são bem conhecidas dos especialistas na técnica e descritas na literatura de microbiologia. Estafilococos expressando PNAG incluem mas não estão limitados a Staphylococcus epidermidis (incluindo RP62A (Número ATCC 35984), RP12 (Número ATCC 35983) e M187), Staphylococcus aureus (incluindo RN4220 (pCN27) e MN8 mucóide) e estirpes tais como Staphylococcus carnosus transformado com os genes no locus ica (incluindo TM300 (pCN27)). Outras estirpes bacterianas expressando PNAG naturalmente contêm ou estão transformadas com o locus pga. Os exemplos incluem E. coli, Yersinia pestis (Y pestis), Y entercolitica, Xanthomonas axonopodis, Pseudomonas fluorescens (cuja totalidade são espécies sequenciadas com loci pgaABCD completo) e Actinohacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Ralstonia solanacearum (e. g., forma de megaplasmideo), Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis e B. hronchiseptica. Podem ser facilmente identificadas outras estirpes bacterianas expressando PNAG pelo comum especialista na técnica. Por exemplo, as bactérias que contêm o locus ica ou pga podem produzir PNAG. Um comum especialista na técnica pode facilmente 72 rastrear a expressão de ARNm ou de proteína relacionada com o locus ica ou pga desde que sejam conhecidas as sequências de ácido nucleico do locus ica e pga (descrito em Heilmann, C., 0. Schweitzer, C. Gerke, N. Vanittanakom, D. Mack and F. Gotz (1996) Molecular basis of intercellular adhesion in the biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Molec. Microbiol. 20:1083 para S. epidermidis e em Cramton SE, Gerke C, Schnell NF, Nichols WW, Gotz F. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for biofilm formation. Infect Immun. 1999 Out; 67(10):5427-33) para S. aureus; Blattner, F. R., G. Plunkett III, C. A. Bloch, N. T. Perna, V. Burland, M. Riley, J. Collado-Vides, J. D. Glasner, C. K. Rode, G. F. Mayhew, J. Gregor, N. W. Davis, Η. A. Kirkpatrick, Μ. A. Goeden, D. J. Rose, B. Mau, e Y. Shao. 1997. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277:1453-14 74. Os genes descritos por Blattner et al. foram designados ycdSRQP e renomeados pgaABCD em Wang et ai., J. Bacteríology, Maio de 2004, p. 2724-2734, Vol. 186, N° 9.) Adicionalmente a cápsula de estirpes bacterianas pode ser isolada e analisada utilizando cromatografia líquida e espectroscopia de massa.

Os métodos de detecção ou diagnóstico proporcionados pela invenção envolvem geralmente fazer contactar uma ou mais péptidos da invenção com uma amostra num indivíduo ou proveniente deste. De um modo preferido, a amostra é inicialmente recolhida a partir do indivíduo, embora sejam também perspectivados métodos de detecção in vivo. A amostra pode incluir qualquer tecido ou fluido de corporal que seja suspeito de albergar as bactérias. Por exemplo, uma infecção estafilocócica pode ocorrer em essencialmente todos os tecidos, orgãos e fluidos do corpo humano mas é mais normalmente 73 encontrada infectando a pele, ossos, articulações pulmões e sangue. Uma infecção por E. coli pode ocorrer, por exemplo, no tracto genitourinário, assim como em outros tecidos e localizações. A infecção por Y. pestis é a causa da peste bubônica na pele e peste pneumónica nos pulmões. A infecção por B. pertussis causa tosse convulsa no tracto respiratório. Essencialmente pode ser testado qualquer fluido, tecido ou orgão corporal tal como pele, osso, articulações, pulmões, mucosas tais como expectoração e sangue para a presença das bactérias.

Como aqui utilizado, o termo "tratamento" refere-se à administração de péptidos a um indivíduo com o objectivo de realizar um benefício medicamente desejável. Consequentemente, "tratamento" pretende abranger tanto métodos de tratamento "profilácticos" como "terapêuticos". Os métodos de tratamento profilácticos referem-se a tratamento administrado a um indivíduo antes do diagnóstico de uma infecção (tal como uma infecção estafilocócica). Por outras palavras, o indivíduo não apresenta sintomas de uma infecção (tal como uma infecção estafilocócica) embora o indivíduo possa estar em risco desta. Os métodos de tratamento terapêutico referem-se ao tratamento administrado a um indivíduo após o diagnóstico de uma infecção (tal como uma infecção estafilocócica) . Por outras palavras, o indivíduo foi diagnosticado como tendo uma infecção (tal como uma infecção estafilocócica) ou alternativamente, o indivíduo pode apresentar sintomas associados com essa infecção.

Os anticorpos anti-PNAG/dPNAG da invenção são úteis para induzir a imunização passiva num indivíduo para prevenir ou limitar o desenvolvimento de infecção sistémica e doença nos indivíduos em risco de exposição a agentes infecciosos. 0 método para induzir imunidade passiva a infecção por bactérias 74 expressando PNAG, tais como estafilococos tal como S. aureus, é realizado administrando uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-PNAG/dPNAG (e. g., um que cause opsonização de estafilococos tal como S. aureus) a um indivíduo. "Imunidade passiva" como aqui utilizada envolve a administração de anticorpos a um indivíduo, em que os anticorpos são produzidos num indivíduo diferente (incluindo indivíduos da mesma e de diferentes espécies), de forma a que os anticorpos se liguem à superfície das bactérias e causem a fagocitose das bactérias. 0 anticorpo anti-PNAG/dPNAG pode ser administrado a qualquer indivíduo em risco de desenvolver uma infecção por bactérias expressando PNAG (e. g., infecção estafilocócica expressando PNAG) para induzir imunidade passiva e em algumas formas de realização pode ser particularmente adequado para indivíduos incapazes de induzir a imunidade activa contra PNAG e/ou dPNAG. Um indivíduo que seja incapaz de induzir uma resposta imunitária é um indivíduo imunocomprometido (doente submetido a quimioterapia e. g., doente com SIDA, etc.) ou um indivíduo que ainda não desenvolveu um sistema imunitário (e. g. recém-nascido pré-termo).

Um "indivíduo" como aqui utilizado é um mamífero de sangue quente e inclui mas não está limitado a humanos, primatas, animais agrícolas tais como cavalos, vacas, porco, cabras, ovelhas e galinhas e animais domésticos tais como cães e gatos. Em algumas formas de realização, o indivíduo é um indivíduo não-roedor. Um indivíduo não-roedor é qualquer indivíduo como definido acima, mas excluindo especificamente roedores tais como murganhos, ratos e coelhos. Em algumas formas de realização, o indivíduo preferido é humano. Em alguns casos, o indivíduo pode ser um que tenha recebido ou vá receber uma prótese tal como uma 75 substituição da anca ou do joelho uma vez que esses dispositivos são especialmente propensos à colonização por bactérias. Como aqui referido, alguns aspectos da invenção proporcionam também detecção e tratamento de infecções em plantas. 0 anticorpo anti-PNAG/dPNAG da invenção é administrado ao indivíduo numa quantidade eficaz para induzir imunidade a bactérias expressando PNAG (e. g., Staphylococcus tais como S. aureus). Uma "quantidade eficaz para induzir imunidade a bactérias expressando PNAG" é uma quantidade do anticorpo anti-PNAG/dPNAG que seja suficiente para (i) prevenir a ocorrência de infecção por essas bactérias num indivíduo que seja exposto a essas bactérias; (ii) inibir o desenvolvimento da infecção, i. e., detenção ou redução da velocidade do seu desenvolvimento; e/ou (iii) aliviar os efeitos da infecção, i. e., redução da carga bacteriana ou erradicação completa das bactérias em indivíduos infectados. Como um exemplo, uma "quantidade eficaz para induzir imunidade a estafilococos" como aqui utilizada é uma quantidade do anticorpo anti-PNAG/dPNAG que é suficiente para (i) prevenir a ocorrência a infecção por estafilococos num indivíduo que seja exposto a estafilococos; (ii) inibir o desenvolvimento da infecção, i. e., detenção ou redução da velocidade do seu desenvolvimento; e/ou (iii) aliviar os efeitos da infecção, i. e., redução da carga bacteriana ou erradicação completa das bactérias em indivíduos infectados.

Pode-se determinar se uma quantidade do anticorpo anti-PNAG/dPNAG é "uma quantidade eficaz para induzir imunidade a infecção" utilizando um ensaio de opsonização in vitro que é preditivo do grau de opsonização de um anticorpo, utilizando processos de rotina conhecidos dos comuns especialistas na técnica. Um anticorpo que opsoniza bactérias expressando PNAG 76 tais como bactérias expressando PNAG estafilocócica é aquele que quando adicionado a uma amostra dessas bactérias causa fagocitose das bactérias. Um ensaio de opsonização pode ser um ensaio de colorimétrico, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de incorporação fluorescente ou de radiomarcação, um ensaio bactericida mediado por células ou outro ensaio que meça o potencial opsónico de um material.

Irão ser eficazes doses de anticorpo variando entre 1 ng/kg e 100 mg/kg, dependendo do modo de administração. Considera-se que a gama preferida se situa entre 500 ng e 500 pg/kg e de um modo muito preferido entre 1-100 pg/kg. A quantidade absoluta irá depender de vários factores incluindo se a administração é realizada num indivíduo de risco elevado ainda não infectado com as bactérias ou num indivíduo tendo já uma infecção, o tratamento simultâneo, o número de doses e os parâmetros do doente individual incluindo idade, condição física, tamanho e peso. Estes são factores bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica e podem ser abordados com apenas experimentação de rotina. É geralmente preferido que seja utilizada uma dose máxima, ou seja, a dose segura mais elevada de acordo com julgamento médico adequado. São também contempladas doses múltiplas dos anticorpos da invenção. Geralmente os esquemas de imunização envolvem a administração de uma dose elevada de um anticorpo seguida por doses mais baixas subsequentes do anticorpo após um período de espera de várias semanas. Podem ser também administradas doses adicionais. A calendarização da dosagem para imunização passiva pode necessitar uma administração mais frequente. Os intervalos de tempo pretendidos para a distribuição de doses múltiplas de um anticorpo PNAG/dPNAG particular podem ser determinados por um 77 comum especialista na técnica utilizado apenas experimentação de rotina.

Estão disponíveis várias vias de administração. 0 modo seleccionado particular irá depender, naturalmente, do anticorpo anti-PNAG/dPNAG particular seleccionado, da patologia particular a ser tratada e da dosagem necessária para a eficácia terapêutica. Os métodos desta invenção, de um modo geral, podem ser praticados utilizando qualquer forma de administração que seja medicamente aceitável, significando qualquer forma que produza níveis eficazes da protecção sem causar efeitos adversos clinicamente inaceitáveis. As formas de administração preferidas são as vias parentéricas. 0 termo "parentérico" inclui injecção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal e intra-esternal ou técnicas de infusão. Outra vias incluem mas não estão limitadas a oral, nasal, dérmica, sublingual e local.

Os anticorpos anti-PNAG/dPNAG da invenção podem ser distribuídos em conjunto com outros fármacos anti-bacterianos (e. g. , antibióticos) ou com outros anticorpos anti-bacterianos. A utilização de antibióticos no tratamento da infecção bacteriana é rotina. Um veículo de administração comum (e. g., comprimido, implante, solução injectável, etc.) pode conter tanto o anticorpo da invenção como o fármaco anti-bacteriano e/ou anticorpo. Alternativamente, o fármaco anti-bacteriano e/ou anticorpo podem ser doseados separadamente. 0 fármaco anti-bacteriano ou anticorpo pode ser também conjugado com o anticorpo anti-PNAG/dPNAG.

Os fármacos anti-bacterianos são bem conhecidos e incluem: penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, ciclacilina, epicilina, hetacilina, 78 pivampicilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, avlocilina, mezlocilina, piperacilina, amdinocilina, cefalexina, cephradine, cefadoxil, cefaclor, cefazolin, cefuroxima axetilo, cefamandole, cefonicida, cefoxitina, cefotaxima, ceftizoxima, cefmenoxina, ceftriaxona, moxalactama, cefotetano, cefoperazona, ceftazidma, imipenema, clavulanato, timentina, sulbactama, neomicina, eritromicina, metronidazole, cloramfenicol, clindamicina, lincomicina, vancomicina, trimetoprim-sulfametoxazole, aminoglicósidos, quinolonas, tetraciclinas e rifampina. (Ver Goodman and Gilman's, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8a Ed., 1993, McGraw Hill Inc.).

De acordo com a invenção, o péptido pode ser administrado numa composição farmacêutica. Em geral, uma composição farmacêutica compreende o péptido da invenção e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para péptidos, anticorpos monoclonais e fragmentos de anticorpos são bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica. Como aqui utilizado, um veículo farmaceuticamente aceitável significa um material não-tóxico que não interfere com a eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos, e. g. , a capacidade do péptido de se ligar a PNAG e/ou a dPNAG estafilocócica e opcionalmente intensificar a opsonização e a fagocitose.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem diluentes, enchimentos, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes e outros materiais que são bem conhecidos na técnica. Na Patente U.S. N° 5211657 são descritos veículos característicos farmaceuticamente aceitáveis para péptidos em particular. Essas preparações podem conter normalmente sal, agentes tamponantes, 79 conservantes, veículos compatíveis e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Quandos utilizados em medicina, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas podem ser adequadamente utilizados sais não farmaceuticamente aceitáveis para preparar seus sais farmaceuticamente-aceitáveis e não são excluídos do âmbito da invenção. Esses sais farmacologicamente e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados aos preparados dos ácidos seguintes: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico e semelhantes. Do mesmo modo, podem ser preparados sais farmaceuticamente aceitáveis como sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos, tais como sais de sódio, potássio ou cálcio.

Os péptidos da invenção podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semi-sólidas, líquidas ou gasosas tais como comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, unguentos, soluções, supositórios, inalantes e injecções e vias normais para administração oral, parentérica ou cirúrgica. A invenção abrange também composições farmacêuticas que são formuladas para administração local, tal como por implantes.

As composições adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, comprimidos, pastilhas, contendo cada um uma quantidade pré-determinada do agente activo. Outras composições incluem suspensões em líquidos aquosos ou em líquidos não-aquosos tal como um xarope, elixir ou uma emulsão.

Quando os compostos aqui descritos (incluindo variedades peptídicas e não-peptídicas) são utilizados terapeuticamente, em algumas formas de realização uma via de administração desejável 80 pode ser por aerossol pulmonar. As técnicas para preparar sistemas de distribuição de aerossol contendo compostos são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Geralmente, esses sistemas devem utilizar componentes que não irão prejudicar significativamente as propriedades biológicas dos péptidos (ver, por exemplo, Sciarra e Cutie, "Aerosols", em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, 1990, páginas 1694-1712). Os especialistas na técnica podem determinar facilmente os vários parâmetros e condições para produzir aerossóis sem recurso a experimentação excessiva. A invenção é útil em métodos que abrangem o passo de administrar os péptidos da invenção em conjunto com terapias convencionais para tratar a infecção bacteriana subjacente. Por exemplo, o método pode ser realizado simultaneamente com um tratamento convencional, tal como por exemplo terapia com antibiótico. Em algumas formas de realização, os péptidos da invenção podem ser administrados substancialmente simultaneamente com o tratamento convencional. Por substancialmente simultaneamente, pretende-se significar que um péptido da invenção é administrado a um indivíduo num momento suficientemente próximo da administração do tratamento convencional (e. g., antibiótico), pelo que os dois compostos podem exercer um efeito aditivo ou mesmo sinérgico. Em alguns casos, o péptido e o agente do tratamento convencional estão conjugados entre si. Em outros, os compostos estão fisicamente separados.

Os péptidos da invenção podem ser administrados directamente a um tecido. De um modo preferido, o tecido é aquele em que a infecção bacteriana existe. Alternativamente, o tecido é aquele em que é provável surgir a infecção. A 81 administração directa no tecido pode ser realizada por injecção directa. Os péptidos podem ser administrados uma vez ou alternativamente estes podem ser administrados em várias administrações. Se forem administrado múltiplas vezes, os péptidos podem ser administrados através de vias diferentes. Por exemplo, as primeiras (ou algumas primeiras) administrações podem ser realizadas directamente no tecido afectado enquanto as administrações ulteriores podem ser sistémicas.

As preparações para administração parentérica incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não-aquosas estéreis. Os exemplos de solventes não-aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem renovadores de fluido e nutrientes, renovadores de eletrólito (tais como os baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Podem estar também presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, agentes antimicrobianoss, antioxidantes, quelantes e gases inertes e semelhantes. Irão resultar doses mais baixas a partir de outras formas de administração, tal como administração intravenosa. No caso de uma resposta num indivíduo ser insuficiente nas doses iniciais aplicadas, podem ser utilizadas doses mais elevadas (ou doses eficazmente mais elevadas por uma via de distribuição diferente, mais localizada) na medida da tolerância do doente. São contempladas doses múltiplas por dia para obter níveis sistémicos adequados de compostos. 82

Em ainda outras formas de realização, o veiculo preferido é uma microparticula ou implante biocompativel que é adequado para a implantação no mamífero receptor. Os implantes bioerodíveis característicos que são úteis de acordo com este método são descritos no Pedido Internacional PCT N° PCT/US/03307 (Publicação N° WO 95/24929, intitulada "Polymeric Gene Delivery System", reivindicando prioridade sobre o pedido de patente U. S. N° de série 213668, apresentado a 15 de Março de 1994) . 0 documento PCT/US/0307 descreve uma matriz polimérica biocompativel, de um modo preferido biodegradável para conter uma macromolécula biológica. A matriz polimérica pode ser utilizada para obter libertação prolongada do agente num indivíduo. De acordo com um aspecto da presente invenção, o agente aqui descrito pode ser encapsulado ou disperso dentro da matriz polimérica biocompatível, de um modo preferido biodegradável divulgada no documento PCT/US/03307. A matriz polimérica está de um modo preferido na forma de uma microparticula tal como uma microesfera (em que o agente é disperso ao longo de uma matriz polimérica sólida) ou uma microcápsula (em que o agente é armazenado no núcleo de um invólucro polimérico). Outras formas da matriz polimérica para conter o agente incluem películas, revestimentos, géis, implantes e stents. 0 tamanho e a composição do dispositivo de matriz polimérica são seleccionados para resultar numa cinética de libertação favorável no tecido em que o dispositivo de matriz é implantado. 0 tamanho do dispositivo de matriz polimérica é ainda seleccionado de acordo com o método de distribuição que irá ser utilizado, tipicamente injecção num tecido ou administração de uma suspensão por aerossol nas áreas nasais e/ou pulmonares. A composição da matriz polimérica pode ser seleccionada para ter tanto velocidades de degradação favoráveis como também para ser constituída por um material que seja 83 bioadesivo, para aumentar adicionalmente a eficácia da transferência quando o dispositivo é administrado a uma superfície vascular, pulmonar ou outra. A composição da matriz pode ser também seleccionada para não se degradar, mas pelo contrário se libertar por difusão ao longo de um período de tempo prolongado.

Podem ser utilizadas matrizes poliméricas tanto não biodegradáveis como biodegradáveis para distribuir os agentes da invenção ao indivíduo. São preferidas matrizes biodegradáveis. Esses polímeros podem ser polímeros naturais ou sintéticos. São preferidos polímeros sintéticos. 0 polímero é seleccionado com base no período de tempo ao longo do qual é pretendidaa libertação, geralmente na ordem de algumas horas a um ano ou mais prolongado. Tipicamente, é mais desejável a libertação ao longo de um período variando entre algumas horas e três a doze meses. 0 polímero está opcionalmente na forma de um hidrogel que pode absorver até cerca de 90% do seu peso em água e além disso, é opcionalmente reticulado com iões multivalentes ou outros polímeros.

Em geral, os agentes da invenção podem ser distribuídos utilizando o implante de bioerodível através de difusão ou de um modo mais preferido, pela degradação da matriz polimérica. Os polímeros sintéticos característicos que podem ser utilizados para formar o sistema de distribuição biodegradável incluem: poliamida, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenoglicóis, óxidos de polialquileno, tereftalatos polialquileno, alcoóis polivinílicos, éteres polivinílicos, ésteres polivinílicos, halogenetos poli-vinílicos, polivinilpirrolidona, poliglicólidos, polissiloxanos, poliuretanos e seus co-polímeros, alquilcelulose, hidroxialquilceluloses, éteres de 84 celulose, ésteres de celulose, nitroceluloses, polímeros de ésteres acrílicos e metacrílicos, metilcelulose, etilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, hidroxibutilmetilcelulose, acetato de celulose, propionato de celulose, butirato de acetato de celulose, ftalato de acetato de celulose, carboxiletilcelulose, triacetato de celulose, sal de sódio de sulfato de celulose, poli(metacrilato de metilo), poli(metacrilato de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), poli(acrilato de octadecilo), polietileno, polipropileno, poli(etilenoglicol), poli(óxido de etileno), poli(etileno tereftalato), poli(alcoóis vinílicos), acetato polivinílico, policloreto de vinilo, poliestireno e polivinilpirrolidona.

Os exemplos de polímeros não-biodegradáveis incluem o acetato vinílico de etileno, ácido poli(met)acrílico, poliamidas, co-polímeros e suas misturas.

Os exemplos de polímero biodegradáveis incluem polímeros sintéticos tais como polímeros de ácido láctico e ácido glicólico, polianidridos, poli(orto)ésteres, poliuretanos, poli(ácido butico), poli(ácido valérico) e poli(lactido-cocaprolactona) e polímeros naturais tais como alginato e outros polissacáridos incluindo dextrano e celulose, colagénio, seus derivados químicos (substituições, adições de grupos químicos, por exemplo, alquilo, alquileno, hidroxilações, oxidações e outras modificações realizadas por rotina pelos especialistas na técnica), albumina e outras proteínas hidrofílicas, zeína e outras prolaminas e proteínas hidrofóbicas, co-polímeros e suas 85 misturas. Em geral, estes materiais degradam-se quer por hidrólise enzimática que por exposição a água in vivo, por erosão superficial ou do conjunto.

Os polímeros bioadesivos de interesse particular incluem hidrogéis bioerodíveis descritos por H. S. Sawhney, C. P. Pathak e J. A. Hubell em Macromolecules, 1993, 26, 581-587, cujos ensinamentos são aqui incorporados, ácidos poli-hialurónicos, caseína, gelatina, glutina, polianidridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo) e poli(acrilato de octadecilo).

Outros sistemas de distribuição podem incluir sistemas de distribuição por libertação temporizada, libertação retardada ou de libertação prolongada. Esses sistemas podem evitar administrações repetidas do péptido, aumentando a conveniência para o indivíduo e o médico. Estão disponíveis muitos tipos de sistemas de distribuição por libertação e conhecido dos comuns especialistas na técnica. Estes incluem sistemas de base polimérica tais como poli(lactido-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poli-hidroxibutírico e polianidridos. Na Patente U. S. 5075109 são descritas, por exemplo, microcápsulas dos polímeros anteriores contendo fármacos. Os sistemas de distribuição incluem também sistemas não-poliméricos que são: lípidos incluindo esteróis tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidos gordos ou gorduras neutras tais como mono di e 86 triglicéridos; sistemas de libertação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas baseados em péptido; revestimentos de cera; comprimidos prensados utilizando ligantes e excipients convencionais; implantes parcialmente fundidos; e semelhantes. Exemplos específicos incluem, mas não estão limitados a: (a) sistemas de erosão em que o agente redutor de plaquetas está contido numa forma dentro de uma matriz tais como as descritas nas Patentes U.S. N° 4452775, 4675189 e 5736152 e (b) sistemas difusionais em que um componente activo penetra a uma velocidade controlada a partir de um polímero tal como descrito nas Patentes U.S. N° 3854480, 5133974 e 5407686. Para além disso, podem ser utilizados sistemas de distribuição de equipamento à base de bombas, alguns dos quais estão adaptados para a implantação. A utilização de um implante de libertação prolongada de longo prazo pode ser particularmente adequada para o tratamento profiláctico de indivíduos em risco de desenvolver uma infecção tal como uma infecção estafilocócica. Libertação a longo prazo, como aqui utilizada, significa que o implante é construído e disposto para distribuir níveis terapêuticos do ingrediente activo durante pelo menos 30 dias e de um modo preferido 60 dias. Os implantes de libertação prolongada de longo prazo são bem conhecidos dos comuns especialistas na técnica e incluem alguns dos sistemas de libertação descritos acima.

Os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar casos específicos da prática do presente invenção e não pretendem limitar o âmbito da invenção. Como irá ser evidente para um comum especialista na técnica, a presente invenção irá encontrar aplicação em várias composições e métodos. 87

Exemplos S. aureus e S. epidermidis estão associados com uma ampla gama infecções adquiridas em hospital e na comunidade. 0 aumento da resistência aos antibióticos incentiva o desenvolvimento de novas terapias para tratar e prevenir estas infecções. A adesão das bactérias a tecidos hospedeiros ou a dispositivos prostéticos implantados é frequentemente importante para uma infecção estafilocócica com sucesso. Uma dessas moléculas de adesão expressas na superfície de estafilococos in vivo e que revelou ser um alvo para anticorpos protectores é a poli-N acetil-glucosamina (PNAG). Esta molécula de adesão é expressa e utilizada por outras bactérias tais como mas não limitadas a E. coli.

Processos Experimentais

Hibri domas:

Foi recolhido sangue de doentes após o estabelecimento de infecção por S. aureus e foram isoladas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) das amostras de sangue utilizando sedimentação Ficoll Hypaque. Foram estimuladas células B por exposição durante a noite ao vírus de Epstein-Barr (EBV) produzido pela linha celular B95.8 como descrito por Posner et al. (Posner et al. Epstein Barr vírus transformation of peripheral blood B cells secreting antibodies reactive with cell surface antigens. Autoimmunity. 1990; 8(2):149-58.) Após 24 horas, as células foram lavadas e dispersas em placas de 96 poços numa concentração de 1 x 106 PBMC/poço em 100 pL de meios de crescimento (RPMI1640 suplementado com FBS a 20%) contendo Meio Condicionado de Linfócitos a 10% (LyCM, preparado a partir de PBMC humanas estimuladas durante 48 horas com fito-hemaglutinina). Após 5 dias, foram adicionados 100 pL adicionais de meios de crescimento suplementados com LyCM a 10%. As células estimuladas com EBV foram então alimentadas semanalmente pela remoção de 100 pL de meios gastos e a adição de 100 pL de meios de crescimento suplementados com LyCM a 10%.

Quando os poços ficaram inoculados densamente (como evidenciado pelo crescimento sobre mais de 80% da superfície do fundo do poço e o aparecimento de uma alteração de pH nos meios indicadora de crescimento celular), as culturas foram rastreadas por ELISA para a produção do anticorpo específico contra PNAG/dPNAG. As células de poços individuais únicos originando uma reacção positiva para o anticorpo foram então dispersas em 48 poços de uma placa de cultura de tecido e após vários dias de crescimento os sobrenadantes foram testados para a reactividade com o antigénio PNAG/dPNAG.

As culturas que continuaram a testar positivo por ELISA foram então fundidas com a linha celular de mieloma humano-murganho HMMA 2.5 para produzir hibridomas como anteriormente descrito (Posner et ai. The construction and use of a human-mouse myeloma analogue suitable for the routine production of hybridomas secreting human monoclonal antibodies. Hybridoma. 1987 Dez; 6(6):611-25). Após a fusão, as células foram cultivadas em placas de micropoços com meio de crescimento (RPMI 1640 suplementado com FBS a 20% e hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) e ouabaína) para a selecção de células fundidas. Estas culturas foram alimentadas em intervalos semanais e rastreadas por ELISA para a produção de anticorpo. 89

Foram clonadas hibridomas numa densidade de 1 célula/poço, poços com o crescimento positivo foram rastreados por ELISA para o anticorpo especifico e os poços contendo hibridomas produzindo anticorpo positivos expandidos no interior de poços em placas de cultura de tecidos com volume crescente, depois em frascos de volume crescente para obter linhas celulares clonadas. Foram recuperados três hibridomas, designados F598, F628 e F630, produzindo anticorpos IgG2 humanos que se ligavam quer a PNAG quer a dPNAG quer a ambas.

Modificação química de PNAG:

Pfoi dissolvida PNAG purificada em NaOH 5 M a uma concentração final de 0,5 mg/mL e incubada durante 18 h a 37 °C com agitação, para remover a maioria dos substituintes N e O. A solução base forte foi depopis neutralizada com HC1 5 N, a um pH final entre 6 e 8 e dialisada contra dtbO durante 24 horas. O produto final foi obtido por liofilização da amostra. ELISA:

Foram revestidas 4 placas de microtitulação Immulon de 100 pL com a concentração óptima de ligação de cada antigénio (0,6 pg/mL para PNAG nativa e 3 pg/mL para dPNAG) em tampão de sensibilização (NaH2PC>4 0,2 M, Na2HPC>4 0,2 M, azida a 0,02%) e incubadas durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas 3 x

com PBS/tween a 0,05% e bloqueadas com 200 pL de leite magro a 5% em PBS e depois incubadas durante a noite a 4 °C. As placas foram lavadas e foram adicionados MAb purificados em várias concentrações, diluídos em leite magro a 5%/tween a 0,05% em PBS 90 (tampão de diluição). As placas foram então incubadas durante 1 h a 37 ° C e lavadas. Foram adicionados 100 pL de anticorpo secundário (molécula total anti-IgG humana conjugada com fosfatase alcalina (AP) e obtida de ICN) numa diluição 1:1000 realizada em tampão de diluição. As placas foram incubadas durante 1 h a 37 °C e lavadas. Foram adicionados 10 0 pL de Fosfato de p-Nitrofenilo a uma concentração de 1 mg/mL em tampão de substrato (800 mg de NaHCCp 1,46 g de Na2CC>3, 10 mg de MgCl, 20 mg de Na3N em 500 mL H20) e as placas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 min. As placas foram lidas a 405 nm. Foi utilizada IgG humana purificada de Sigma como um padrão para quantificar os MAb em placas sensibilizadas com IgG anti-humano.

Ensaio de deposição do complemento:

Foram preparadas placas de microtitulação como para o ensaio de ELISA. Após a incubação com MAb e lavagem, foram utilizados soros humanos normais absorvidos com três estirpes diferentes de S. aureus como uma fonte de complemento numa diluição de 1:50 em tampão de diluição. As placas foram incubadas durante 15 min a 37 °C. Após lavagem da placa, foi adicionado anticorpo C3 de cabra anti-humano numa concentração de 1:2000 e incubado durante uma hora a 37 °C. Foi adicionado um conjugado IgG-anti-cabra-AP a 1:2000 e incubado a 37 °C durante uma hora. As placas foram reveladas essencialmente como para o ensaio de ELISA, excepto apenas por uma duração de 15 min. 91

Ensaios opsonofagocíticos:

Foram descritos anteriormente ensaios de morte opsonofagocitica. (Ver Ames et al. Infection and Immunity 49:281-285, 1985 e Maira-Litran et al. Infect Immun. 70(8):4433-

4440, 2002). A estirpe alvo utilizada é a Mn8 (S. aureus) . A estirpe alvo foi cultivada até uma densidade óptica de 0,4 a um comprimento de onda de 650 nm (OD650) e diluída para 1:100 para o ensaio. Foi absorvido complemento (obtido de um coelho bébé através uma fonte comercial tal como Accurate Chemical And Scientific Corp. Westbury, Nova Iorque 11590 e utilizado numa diluição 1:15) durante 1 h com a estirpe Mn8m de S. aureus (resuspensa numa OD650 de 1,0).

Foram separadas células de polimorfonucleares (PMN) do sangue humano recolhido recentemente utilizando

Heparina/dextrano (mistura 1:1). As PMN foram utilizadas numa concentração de 5 x 106 células/mL. São utilizadas soluções com os anticorpos monoclonais em várias concentrações como fonte de anticorpo. Foram adicionados cem pL de cada componente (solução de anticorpo monoclonal, PMN, complemento, bactérias alvo) em conjunto e depois incubados durante 1,5 h a 37 °C, centrifugando. Os sobrenadantes foram recolhidos e realizadas diluições e depois foram plaqueadas aliquotas no agar triptico de soja (TSA), utilizando geralmente diluições de sobrenadante 1:100 e 1:1000. Após incubação durante a noite a 37 °C, foram contadas as colónias bacterianas e calculados os níveis de morte. 92

Clonagem de regiões variáveis do anticorpo:

Foi realizada extracção de ARN a partir de cada hibridoma em ~6 x 106 células utilizando o kit RNAeasy de Qiagen. Foi transcrito reversamente 1 pg de ARN total em ADNc utilizando um kit Qiagen Omniscript. Foi utilizado 1 pL do produto de ADNc como molde para as reacções de PCR. Cada reacção consistiu em 50 pL de mistura Invitrogen Hi fi, 100 pmoles de cada iniciador nucleotidico e 1 pL de ADNc molde. Foram realizados ~30 ciclos PCR com o seguinte protocolo: 94 °C durante 30 segundos, ciclo: 94 °C durante 30 segundos, 65 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1 min, extensão final a 72 °C durante 5 min. Os produtos de PCR foram sequenciados e pesquisados utilizando o programa BALST Ig contra sequências da linha germinal conhecidas disponíveis na base de dados NCBI.

Os iniciadores utilizados para clonar as regiões variáveis do anticorpo a partir das linhas de células de hibridoma depositadas na ATCC a 21 de Abril de 2004 sob os N° de Acesso PTA-5931, PTA-5932 e PTA-5933, são como se seguem: (5'-3' com locais de restrição sublinhados e ATG iniciais a negrito) :

Cadeia leve de F598

lambda constante: GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG (SEQ ID N° 49)

Hu lambda sig 5: AGATCTCTCACCATGGCATGGATCCCTCTCTTC (SEQ ID N° 50) 93

Cadeia pesada de F598

Cadeia pesada constante: TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC (SEQ ID N° 51) VH7LDRHU: GTCGACATGAAACATCTGTGGTTCTTC (SEQ ID N° 52) Cadeia leve de F628

lambda constante: GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG (SEQ ID N° 49)

Lambda de Hu sig 1: AGATCTCTCACCATGGCCRGCTTCCCTCTCCTC (SEQ ID N° 53)

Cadeia pesada de F628

Cadeia pesada constante: TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC (SEQ ID N° 51) VH7LDRHU: GTCGACATGAAACATCTGTGGTTCTTC (SEQ ID N° 52) Cadeia leve de F630 lambda constante: GACCGAGGGGGCAGCCTTGGGCTGACCTAGG (SEQ ID N° 49)

Lambda de Hu sig 5: AGATCTCTCACCATGGCATGGATCCCTCTCTTC (SEQ ID N° 50) 94

Cadeia pesada de F630

Cadeia pesada constante: TGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGAC (SEQ ID N° 51) VH1LDRHU: G TCGACATGGACTGG ACCTGGA (SEQ ID N° 54)

Ensaios in vivo de desafio bacteriano:

Foram administrados intravenosamente (IV) a murganhos MAb F598 que se ligam tanto a PNAG como a dPNAG ou um controlo, MAb IgGl não ligante a PNAG/dPNAG humana contra alginato ou MEP de P. aeruginosa (designado MAb F429) para induzir imunidade passiva. Após vinte e quatro horas, os murganhos foram desafiados com S. aureus (5 x 107 CFU/murganho) pela mesma via de administração que o MAb.

Os níveis de CFU no sangue 2 horas após a infecção foram utilizados como a medida da eficácia do MAB administrado para induzir imunidade passiva contra S. aureus.

Resultados

Sequências do MAB: São mostradas abaixo as sequências de aminoácido e nucleotídicas para as regiões variáveis e CDR dos MAb F598, F628 e F630. As regiões CDR estão sublinhadas e as regiões constantes estão em itálico. 95

Ia. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA E DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F598 CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG Q V Q L Q E s G P G I * \ r K Έ ► s 1 GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT E T L s L Γ < * 1 Γ i 7 J s < Ξ 1 S S I S GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG ccc CCA GGG AAG GGA CTG G Y Y W S W I R Q p : P ( 3 ] K ( 5 : L GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC E W I G Y I H Y S R S T N s N ccc .GCC CTC AAG AGT ÇGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG P A L K S R V T I S s D T s K AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG N Q L s X. R L S s V T A A D T GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT A V Y Y c A R D T Y Y Y D S G GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC D Y E D A F D I . W G Q G T M V ACC GTC TCC TCA (SEQ ID Ne 25) T V s S (SEQ ID Ne 1)

Ib. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F598 0Υ0Ι;0Ε3ΟΡ6ίνΚΡ3ΕΤ13Ι,Τ0Τν3ΰ63Ι36ΥΥΚ5ΚΙΕ0ΡΡ6ΚΟΙαΕΚΙ6ΥΙΗΥ5Κ3ΤΝ3ΝΡΑ LKSRVTISSDTSKNQLSLRLSSVTAADTAVYYCARDTYYYDSGDYEDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID N2 1) 96

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISGYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIHYSRSraSNFA LKSRVTIS S DTSKNQLSl·RLSSVTAADTAVYYCARDTYYYDSGDYEDAFDIWGQGTMVTVSS AS (SEQ ID N2 55)

Ic. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO DE VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F598 CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC CCC GCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID N2 25) CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG GAG ACC CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTT TCT GGT GGC TCC ATC AGT GGT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG CCC CCA GGG AAG GGA CTG GAG TGG ATT GGG TAT ATT CAT TAT AGT AGG AGC ACC AAC TCC AAC CCC GCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA TCA GAC ACG TCC AAG AAC CAG CTC TCC CTG AGA CTG AGC TCA GTG ACC GCT GCG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACC TAT TAC TAT GAT AGT GGT GAT TAT GAG GAT GCT TTT GAT ATT TGG GGC CAA GGG ACA ATG GTC ACC GTC TCC TCA GCT AGC (SEQ ID Nfi 56) 97

Ila. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F598 CAG CTT GTG CTG ACT CAG TCG ccc TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA Q L V L T Q S P s A s A s I. G GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGC CAC AGC AAC A s V K L T c T L S s G H S N TAC GCC ATC GCT TGG CAT CAG CAG CAG CCA GGG AAG GGC CCT CGC Y A I A W H Q Q Q P G K G P R TAC TTG ATG AAG GTT AAC AGA GAT GGC AGC CAC ATC AGG GGG GAC Y L M K V N R D G S H I R G D GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC ACC TCT GGG GCT GAG CGT G I P D R F S G s T s G A E R TAC CTC ACC ATC TCC AGT CTC CAG TCT GAA GAT GAG GCT GAC TAT Y L T I s S L Q S E D E A D Y TAC TGT CAG ACC TGG GGC GCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG Y c Q T w G A G I R V F G G G ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT (SEQ ID Ne 26) T K L T V L G (SEQ ID N2 2)

Ilb. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F598 QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSNYAIAWHQQQPGKGPRYLMKVNBDGSHIRGDGI PDRFSGSTSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGAGIRVFGGGTKLTVLG (SEQ ID N2 2) QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSNYAIAWHQQQPGKGPRYLMKVNRDGSHIRGDGI PDRFSGSTSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGAGIRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSV (SEQ ID N2 57) 98

IIc. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F598

CAG CTT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGC CAC AGC AAC TAC GCC ATC GCT TGG CAT CAG CAG CAG CCA GGG AAG GGC CCT CGC TAC TTG ATG AAG GTT AAC AGA GAT GGC AGC CAC ATC AGG GGG GAC GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC ACC TCT GGG GCT GAG CGT TAC CTC ACC ATC TCC AGT CTC CAG TCT GAA GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG ACC TGG GGC GCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT (SEQ ID N2 26)

Illa. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F628

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG QVQLQE SGPGLVKPS

GAG ACC CTG TCC CTC ACG TGC ACT GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGT ETLSLTCTVSGGSI S

AAT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG CAG TCC CCA GGG AGG GGA CTG

N Y Y W S WIRQSPGRGL

GAG TGG ATT GGG TAT ATC CAT TAT AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT

E W I G Y I H YSGSTNSN

CCA TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC ATA TCA GTT GAC ACG TCC AAG

P S L K S RVTISVDTSK

AAC CAG GTC TCC CTG AAG CTG GGC TCT GTG ACC GCT GCG GAC ACG

NQVSLKLGSVTAADT

GCC ATA TAT TAC TGT GCG AGA GAT ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT AIYYCARDTYYESSG 99

CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC HWFDGLDV W G Q G T S V ACC GTC TCC TCA (SEQ ID Na 27) T V S S (SEQ ID Ne 3)

Illb. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F628 QVQLQES G PGLVKPS ETLSLTCT VSGGSISNYYWSWIRQS PGRGLEWI G}[IHYSGSTNSNPS LKSRVTIS VDT SKNQVS LKLGS VTAADTAIYYCARDTYYESSGHWFDGLDVWGQGTSVTVS S (SEQ ID Na 3) QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYYWSWIRQSPGRGLEWIGYIHYSGSTNSNPS I,KSRVTISVDTSKNQVSLKLGSVTAADTA:i:YYCARDTYYESSGHWFDGLDVWGQGTSVTVSS ASTKGP (SEQ ID N2 58)

DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA

CCA GGA CTG GTG AAG CCT TCG GTC TCT GGT GGC TCC ATC AGT CAG TCC CCA GGG AGG GGA CTG AGT GGG AGC ACC AAC TCC AAT ATA TCA GTT GAC ACG TCC AAG TCT GTG ACC GCT GCG GAC ACG ACT TAC TAT GAA AGT AGT GGT TGG GGC CAA GGG ACC TCG GTC IIIc. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA PESADA DE F628

CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GGC GAG ACC CTG TCC CTC ACG TGC ACT AAT TAC TAC TGG AGT TGG ATC CGG GAG TGG ATT GGG TAT ATC CAT TAT CCA TCC CTC AAG AGT CGA GTC ACC AAC CAG GTC TCC CTG AAG CTG GGC GCC ATA TAT TAC TGT GCG AGA GAT CAT TGG TTC GAC GGT TTG GAC GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID Na 27) 100 CAG GTG CAG CTG CAG GAG ACC CTG TCC CTC AAT TAC TAC TGG AGT GAG TGG ATT GGG TAT CCA TCC CTC AAG AGT AAC CAG GTC TCC CTG GCC ATA TAT TAC TGT CAT TGG TTC GAC GGT ACC GTC TCC TCA GCT (SEQ ID 1 NS 59)

GAG TCG GGC CCA GGA ACG TGC ACT GTC TCT TGG ATC CGG CAG TCC ATC CAT TAT AGT GGG CGA GTC ACC ATA TCA AAG CTG GGC TCT GTG GCG AGA GAT ACT TAC TTG GAC GTC TGG GGC AGC ACC

CTG GTG AAG CCT TCG GGT GGC TCC ATC AGT CCA GGG AGG GGA CTG AGC ACC AAC TCC AAT GTT GAC ACG TCC AAG ACC GCT GCG GAC ACG TAT GAA AGT AGT GGT CAA GGG ACC TCG GTC IVa. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F628 CAG CCT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA Q P V L T Q S P s A S A s L G GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG GAC AGT GAA CAC AGC AGA A s V K L T c T L D S E H S R TAC ACC ATC GCA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG AAG GGC CCT CGG Y T I A W H Q Q Q P E K G P R TAC CTG ATG AAG GTT AAG AGT GAT GGC AGT CAC AGC AAG GGG GAC Y L M K V K S D G S H S K G D GGC ATT ACT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT GGG GCT GAG CGC G I T D R P s G s S s G A E R TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAC TAT Y L T I s s L Q s E D E A D Y TAC TGT CAG ACT TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG Y c Q T W G P G I R V F G G G ACC AAG CTG ACC GTC CTA (SEQ ID N2 28) T R L T V L (SEQ ID Ns 4) 101 IVb. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F628 ζ)Ρνΐ/Γζ)3Ρ3Α3Α316Δ3νΚΙίΤ(3Τυ)3ΕΗ3Β.ΥΤΙΑν}Η0(Χ)ΡΕΚ6ΡΕν¥ΙιΜΚνΚ3Ρ65Η5Κ6ΡΟΙ TDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEA DYYCQTWGPGIRVFGGGTKLTVL (SEQ ID Ns 4) IVc. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F628 CAG CCT GTG CTG ACT CAG TCG CCC TCT GCC TCT GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG GAC AGT GAA CAC AGC AGA TAC ACC ATC GCA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG AAG GGC CCT CGG TAC CTG ATG AAG GTT AAG AGT GAT GGC AGT CAC AGC AAG GGG GAC GGC ATT ACT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT GAG GCT GAC TAT TAC TGT CAG ACT TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA (SEQ ID N2 28) 102

Va. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F630 CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG ATG AAG AGG CCT GGG Q V Q L V Q s G A E M K R P G GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC A s V K V s c K A s G Y T F T AAC TTT GGT ATC AGT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT N F G I S w V R Q A F G Q G L GAG TGG ATA GGA TGG GTC AGC ACT TAC AAT GGT CGC ACA AAT TAT E W I G W V S T Y N G R T N Y GCA CAG AAG TTC CGG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC A Q K F R G R V T M T T D T s ACG AAC ACA GCG TAC ATG GAA CTG AGG AGC CTG GGA TCT GAC GAC T N T A Y M Ξ L R S L G s D D ACG GCC GTC TTT TAC TGT GCG AGA GAT TAC TAT GAG ACT AGT GGT T A V F Y C A R D Y Y E T S G TAC GCC TAT GAT GAT TTT GCG ATC TGG GGC CAA GGG ACA TTG GTC Y A Y D D F A I W G Q G T L V ACC GTC TCC TCA (SEQ ID N2 29) T V s S (SEQ ID N2 5)

Vb. SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F630 QVQLVOSGAEMKRPGASVKVSCKASGYTFTNFGISWVRQAPGQGLEWIGWVSTYNGRTNYAQ KFRGRVTMTT DT STNTAYMELRSLG SDDTAVFYCARDYYETSGYAYDDFAIWGQGTLVTVS S (SEQ ID Ne 5) 103

Vc. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA DE F630

CAG GTT CAG CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG ATG AAG AGG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTC TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC ACC TTT ACC AAC TTT GGT ATC AGT TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATA GGA TGG GTC AGC ACT TAC AAT GGT CGC ACA AAT TAT GCA CAG AAG TTC CGG GGC AGA GTC ACC ATG ACC ACA GAC ACA TCC ACG AAC ACA GCG TAC ATG GAA CTG AGG AGC CTG GGA TCT GAC GAC ACG GCC GTC TTT TAC TGT GCG AGA GAT TAC TAT GAG ACT AGT GGT TAC GCC TAT GAT GAT TTT GCG ATC TGG GGC CAA GGG ACA TTG GTC ACC GTC TCC TCA (SEQ ID N2 29) 104

Via. ALINHAMENTO DA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS E NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F630 CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT GCT TCC CTG GGA Q L V L T Q S P s A s A s L G GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC A S V K L T c T L S S G H S T TAC GCC ATC GCG TGG CAT CAG CAG CAG CCA CTG AGG GGT CCT CGT Y A I A W H Q Q Q P L R G P R TTC TTG ATG AAA GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC F L M K V N S D G S H T K G D GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGT TCT GGG GCT GAG CGC G I P D R F s G s S s G A E R TAC CTC TCC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAA GAT GAG TCT GAC TAT Y L s I s S L Q s E D E s D Y TAC TGT CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG Y c Q T W G P G I R V F G G G ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT (SEQ ID Na 30) T K L T V L G (SEQ ID Na 6) VIb. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F630 QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSTYAIAWHQQQPLRGPRFLMKVNSDGSHTKGDGI PDRFSGSS SGAERYLSIS SLQSEDES DYYCQTWGPGIRVFGGGTKLTVLG (SEQ ID Na 6) QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGHSTYAIAWHQQQPLRGPRFLMK^SDGSHTKCTGI PDRFSGSS SGAERYLS ISSLOSEDESDY-YCQTWGPGIRVFGGGTKLTVLGQPKAAPSU (SEQ ID Na 60) 105 VIc. SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA DA REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE F630

CAG CTT GTG GCC TCG GTC TAC GCC ATC TTC TTG ATG GGG ATC CCT TAC CTC TCC TAC TGT CAG ACC AAG CTG

CTG ACT CAA AAG CTC ACC GCG TGG CAT AAA GTC AAC GAT CGC TTC ATC TCC AGC ACG TGG GGC ACC GTC CTA

TCG CCC TCT TGC ACT CTG CAG CAG CAG AGT GAT GGC TCA GGC TCC CTC CAG TCT CCT GGC ATT GGT (SEQ ID GCC TCT GCT AGC AGT GGG CCA CTG AGG AGC CAC ACC AGT TCT GGG GAA GAT GAG CGA GTG TTC N2 30)

TCC CTG GGA CAC AGC ACC GGT CCT CGT AAG GGG GAC GCT GAG CGC TCT GAC TAT GGC GGA GGG CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT GCT TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACT CTG AGC AGT GGG CAC AGC ACC TAC GCC ATC GCG TGG CAT CAG CAG CAG CCA CTG AGG GGT CCT CGT TTC TTG ATG AAA GTC AAC AGT GAT GGC AGC CAC ACC AAG GGG GAC GGG ATC CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGT TCT GGG GCT GAG CGC TAC CTC TCC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAA GAT GAG TCT GAC TAT TAC TGT CAG ACG TGG GGC CCT GGC ATT CGA GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCT GCC CCA TCG GTC ACC TGT TCC CGC CTC (SEQ ID N2 61)

Caracterizaçao de MAb IgG2:

Os hibridomas foram denominados a partir dos seus números de fusão correspondentes: F598, F628 e F630. Os anticorpos

produzidos a partir destes hibridomas foram todos dos tipos IgG2 e lambda. Após a purificação dos anticorpos utilizando colunas de proteína G, foram utilizados ELISA para determinar diferenças na especificidade do epitopo dos MAb. Foi realizada modificação química da PNAG nativa para remover alguns substituintes. O 106 tratamento com base forte (NaOH 5 M) resulta na remoção da maior parte dos grupos N-acetilo. Como verificado na FIG. 1 todos os MAb se ligam bem à forma nativa da PNAG, embora com curvas de ligação diferentes. Quando a PNAG é tratada com NaOH 5 M para produzir dPNAG, o MAb F598 liga-se com a maior actividade (FIG. 2). Este resultado sugere que F598 tenha especificidade para os epitopos da estrutura base da PNAG e não necessite de grupos N e O-acetilados se liguem ao polímero PNAG. Os MAb F630 e F628 ligam-se fracamente a dPNAG sugerindo que a sua especificidade necessite os acetatos encontrados na forma nativa da PNAG.

Foram utilizados ELISA de competição para determinar as actividades de ligação relativa dos MAb. A FIG. 3 mostra que a actividade de ligação relativa dos MAb é: F598> F628> F630.

Criaçao e caracterização de MAb alterados para IgGl:

Os anticorpos do isotipo IgGl humanos podem fixar melhor o complemento na superfície de um antigénio do que anticorpos do isotipo IgG2. Por isso, foi realizada a clonagem das regiões variáveis do MAB e a produção do isotipo IgGl. Foram utilizados iniciadores direccionados para a região constante de IgG2 e iniciadores específicos para a extremidade 5' das regiões variáveis identificadas nos hibridomas originais (ver aqui a listagem de iniciadores sob "Clonagem de regiões variáveis do anticorpo") para obter produtos de PCR a partir de preparações ADNc produzidos a partir de ARNm isolado a partir das linhas de célula de hibridoma de IgG2 originais. Os produtos de PCR foram sequenciados e analisados para determinar os genes da linha germinal que deram mais provavelmente origem a cada anticorpo. 107

Como mostrado na Tabela 1, existem genes comuns da linha germinal que são utilizados pelos hibridomas na preparação de anticorpos direccionados contra PNAG e/ou dPNAG. Como mostrado, MAb F598, F628 e F630 utilizam os mesmos genes da linha germinal da cadeia leve e regiões D da cadeia pesada. A única diferença consiste no gene V utilizado para produzir a cadeia pesada do MAB F630 e no gene J utilizado para produzir a cadeia pesada do MAB F628; os restantes genes da linha germinal são idênticos para os MAb.

Tabela 1.

Cadeia H ou L do hibridoma Genes da Linha Germinal F598L IGLV4-69 ou V5-6 IGLJ3 ou IGLJ2 F598H IGHV4-59 IGHD3-22 IGHJ3 F628L IGLV4-69 ou V5-6 IGLJ3 ou IGLJ2 F628H IGHV4-59 IGHD3-22 IGHJ6 F630L IGLV4-69 ou V5-6 IGLJ3 ou IGLJ2 F630H IGHV 1-18 IGHD3-22 IGHJ3 0 ADN codificando as regiões variáveis completas abrangendo os segmentos V, J e D da cadeia pesada e os segmentos V e J da cadeia leve de cada um dos MAb (F598, F728 e F630) foi clonado no vector TCAE6, contendo as regiões constantes humanas da cadeia leve kappa e da cadeia pesada de IgGl. As construções iniciais mantiveram o emparelhamento original dos genes das cadeias pesada e leve obtidos a partir dos hibridomas originais. Foi transfectado ADN plasmídico contendo cada uma das construções em células CHO e os MAb IgGl resultantes foram purificados e caracterizados. Como verificado nas FIG. 4 e 5, todos os MAb IgGl têm curvas de ligação a PNAG idênticas quando 108 comparados com os MAb IgG2 originais, no entanto as construções IgGl dos MAb F628 e F630 perderam alguma da sua capacidade para se ligarem a dPNAG (e. g., comparar com as FIG. 1 e 2).

Para testar se os MAb IgGl têm maior actividade activadora do complemento funcional que do que os MAb IgG2 parentais, foram realizados ensaios de deposição do complemento. 0 ensaio de deposição de complemento é essencialmente um ensaio ELISA que mede a deposição da proteina de complemento C3 quando é adicionado soro humano à mistura de reacção. Como mostrado nso FIG. 6, todos os MAb IgGl tem melhor actividade de fixação do complemento que os MAb IgG2 parentais. A extensão do aumento na fixação de complemento depende do MAB. Para o MAB F598, que tem a actividade de ligação a PNAG e dPNAG mais elevada, verifica-se apenas um ligeiro aumento na actividade do isotipo IgGl em relação ao IgG2. Para os MAb F628 e F630, o MAb IgGl tem pelo menos o dobro da actividade de deposição do complemento que o MAb IgG2 parental.

Actividade opsonofagocítica:

Foi testada a actividade opsonofagocítica dos anticorpos monoclonais F598, F628 e F630 tanto nas formas IgG2 como IgGl (6 pg do MAB) contra a estirpe Mn8 de S. aureus. 0 anticorpo monoclonal F598 apresentou o nível mais elevado da redução (i. e., morte) em CFU quando foi utilizada a forma IgGl (FIG. 7). 109

Protecção passiva contra infecção: A administração do MAB F598 que se liga tanto a PNAG como a dPNAG a murganhos, 24 horas antes do desafio com a estirpe Mn8 de S. aureus resultou 2 horas após a infecção numa redução de 68% no número de CFU/mL de sangue em comparação com murganhos recebendo MAb contra um antigénio irrelevante, alginato de P. aeruginosa (significância de P = 0,002) (FIG. 8A) . A FIG. 8B mostra as CFU de S. aureus por mL de sangue de cada animal individual administrado com quer MAb de controlo quer MAb F598gl. A administração de 800 pg de MAb F598 por murganho FVB, 4 horas antes do desafio intraperitoneal (IP) com 5 x 108 CFU de S. aureus (estirpe Mn8) resultou em sobrevivência aumentada em comparação com murganhos administrados com um MAb de controlo (F429 específico para P. aeruginosa). A FIG. 8C mostra os resultados destas experiências. Aos cinco dias após o desafio bacteriano, todos os murganhos que receberam F598 e apenas cerca de 20% de murganhos que receberam MAb de controlo estivam vivos (8 murganhos por grupo).

Isolados de E. coli de infecção do tracto urinário:

Foram isolados dezoito isolados clínicos de E. coli de infecção do tracto urinário (UTI) e testados para a presença do locus pga por PCR e expressão de PNAG por imunotransf erência utilizando anti-soros produzidos contra PNAG de S.aureus. Os isolados clínicos foram cultivados em cultura e quando as células atingiram na fase estacionária foi extraído ADN por técnicas convencionais para utilização em PCR ou as células foram submetidas a extracção com EDTA (fervendo durante 5 minutos). Dezassete dos dezoito isolados continham genes pga 110 como determinado por PCR. Com base nos resultados de imunotransferência, destes dezassete, cerca de um terço foi caracterizado como expressando níveis de PNAG relativamente elevados, cerca de um terço foi caracterizado como expressando níveis de PNAG relativamente intermédios (ou moderados) e o terço restante foi caracterizado como expressando níveis de PNAG relativamente baixos. Além disso, a sobre-expressão do locus pga resultou na produção intensificada de PNAG. A FIG. 9 mostra os resultados desta imunotransferência. A estirpe "H" expressa níveis não detectáveis de PNAG e não tem um locus pga. A faixa do canto superior direito representa uma estirpe de E. coli sobre expressando pga. A FIG. 10 mostra o nível de morte opsónica dos isolados clínicos UTI de E. coli referidos acima utilizando um anti-soro policlonal produzido contra dPNAG de S. aureus. BW representa uma estirpe de E. coli do tipo selvagem, pga representa uma estirpe de E. coli com o locus pga eliminado e pga++ representa uma estirpe de E. coli sobre expressando pga. O nível de morte correlaciona-se aproximadamente com o nível de expressão de PNAG pelo isolado de E. coli.

As FIG. 11 A e 11B mostram o nível de morte opsónica de uma estirpe de E. coli com expressão elevada de PNAG (estirpe U) e de uma estirpe de E. coli com expressão intermédia de PNAG (estirpe P) por anti-soro policlonal produzido contra dPNAG e PNAG. Em todas as diluições de anti-soro testadas, o anti-soro anti-dPNAG foi mais eficaz na morte de qualquer estirpe do que o anti-PNAG. 111 A FIG. 12 mostra a actividade opsonofagocítica do MAB F598 contra várias estirpes estafilocócicas e uma estirpe de E. coli pelos MAB F598, F628 e F630 (6 pg/mL de MAB por ensaio).

Mutação do locus ica:

As FIG. 13 E 14 mostram os resultados de morte de estirpes de S. aureus pelos MAb F598 e F628 que têm loci ica mutantes. A estirpe 10833 de S. aureus foi eliminada do locus ica (10833Aica) depois transformada com um plasmideo contendo ica do tipo selvagem isolado de S. aureus Mn8m (pMuc, sobre-produtora de PNAG) ou com pMuc com o gene icaB eliminado (pMucãicaB), como mostrado na FIG. 13. As estirpes 10833 (tipo selvagem) e 10833 (picaB) de S. aureus são mostradas na FIG. 14. A estirpe 10833 sobre-expressa o gene icaB (picaB) a partir de um plasmideo utilizando o promotor constitutivo do locus ica de S. aureus Mn8m (sobre-produtora de PNAG). 0 gene icaB é a enzima considerada responsável pela desacetilação de PNAG . A eliminação do gene icaB afecta a morte por MAB F598 mas não por MAb F628.

Na ausência do gene icaB, a morte por MAB F598 é reduzida (FIG. 13). A sobre-expressão do gene icaB resulta na morte intensificada por MAB F598 com pouco ou nenhum efeito sobre a morte por MAB 628.

Conclusões

Os ELISA utilizando PNAG quimicamente modificados realçaram as diferenças na especificidade de três MAb totalmente humanos direccionados para a forma nativa de PNAG. O MAb F598 revelou reconhecer PNAG e dPNAG e deste modo é especifico para a 112 estrutura base da molécula. Os MAb F628 e F630 reconhecem aparentemente epitopos específicos de acetato. Os ELISA de competição revelam que as actividades de ligação relativas dos MAb colocam F598 com a actividade de ligação mais elevada seguido por F628 e depois F630. A clonagem das regiões variáveis revela que existe utilização de restrição génica para produzir anticorpos contra a PNAG e/ou dPNAG. A alteração da região constante de MAb de gama 2 para gama 1 resultou em ligação idêntica a PNAG, mas reduziu a capacidade de 2 dos 3 MAb para se ligarem a dPNAG. Finalmente a alteração da região constante para gama 1 resultou numa capacidade aumentada dos MAb para fixarem o complemento, no entanto este aumento foi mais significativo para os MAb F628 e F630 que têm uma actividade de ligação mais baixa. A avaliação da eficácia protectora do MAB F598gl mostrou que a administração deste produto a murganhos 24 horas antes do desafio IV com a estirpe Mn8 de S. aureus viva resultou numa redução de 68% dos níveis de estaf ilococos no sangue 2 horas após a infecção. A administração do MAB F598 a murganhos 4 horas antes do desafio IP com a estirpe Mn8 de S. aureus viva resultou em sobrevivência aumentada em comparação com murganhos tratados com o MAb de controlo.

Equivalentes A descrição escrita anterior deve ser considerada suficiente para permitir a um especialista na técnica realizar a invenção. Os anticorpos e os péptidos particulares aqui divulgados não devem ser interpretados como limitantes da invenção dado que estes pretendem ser apenas ilustrativos de formas de realização particulares da invenção como aqui proporcionadas. Várias modificações da invenção além das aqui 113 mostradas e descritas irão ser evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição anterior e irão ser incluídas no âmbito das reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> The Brigham and Women's Hospital, Inc. Beth Israel Deaconess Medicai Center, Inc.

<12 0> PÉPTIDOS DE LIGAÇÃO A POLI-N-ACETILGLUCOSAMINA

(PNAG/dPNAG) E MÉTODOS DA SUA UTILIZAÇÃO <130> B0801-70300WO00 <140> Não atribuído ainda <141> 2005-04-21 <150> US 60/564105 <151> 2004-04-21 <160> 61 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens 114 < 4 Ο Ο > 1

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly 1 5

Pro Gly Leu Vai Lys Pro 10

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai 20

Ser Gly Gly Ser Ile Ser 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro 35 40

Pro Gly Lys Gly Leu Glu 45

Gly Tyr Ile His Tyr Ser Arg Ser 50 55

Thr Asn Ser Asn Pro Ala 60

Ser Glu 15 Gly Tyr Trp Ile Leu Lys

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp 65 70

Thr Ser Lys Asn Gin Leu 75

Ser Leu 80

Arg Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala 85

Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr 90

Cys Ala 95

Arg Asp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser 100

Gly Asp Tyr Glu Asp Ala 105 110

Phe Asp

Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai 115 120

Thr Vai Ser Ser <210> 2 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Gin Leu Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Vai Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Asn Tyr Ala 20 25 30 115

Ile Ala Trp His Gin Gin Gin Pro Gly Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45

Lys Vai Asn Arg Asp Gly Ser His Ile Arg Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Trp Gly 85 90 95

Ala Gly Ile Arg Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110 <210> 3 <211> 124

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai Asp Thr Ser Lys Asn Gin Vai Ser Leu 65 70 75 80 116

Lys Leu Gly

Ser Vai Thr Ala Ala Asp 85

Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Arg Asp Thr Tyr Tyr Glu Ser Ser Gly His Trp Phe Asp Gly Leu Asp 100 105 110 val Trp Gly Gin Gly Thr Ser Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Gin Pro Val Leu Thr Gin Ser Pro 1 5

Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu 20

Asp Ser Glu His Ser Arg Tyr Thr 25 ' 30

Ile Ala Trp His Gin Gin Gin Pro 35 40

Glu Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 45

Lys Val Lys Ser Asp Gly Ser His 50 55

Ser Lys Gly Asp Gly Ile Thr Asp 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly 65 70

Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 75 80

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Trp Gly 85 90 95

Pro Gly Ile Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 117 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Met Lys Arg Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Trp Vai Ser Thr Tyr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe 50 55 60

Arg Gly Arg Vai Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Asp Asp Thr Ala Vai Phe Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Gly Tyr Ala Tyr Asp Asp Phe Ala 100 105 110

Ile Trp Gly Gla Gly Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser 115 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens 118 <4Ο0> 6

Gin Leu Vai Leu Thr Gin Ser 1 5

Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu 10

Ser Vai Lys Leu Thr Cys Thr 20

Leu Ser Ser Gly His Ser Thr 25 30

Ile Ala Trp His Gin Gin Gin 35

Pro Leu Arg Gly Pro Arg Phe 40 45

Lys Vai Asn Ser Asp Gly Ser 50 55

His Thr Lys Gly Asp Gly Ile 60

Gly Ala 15 Tyr Ala Leu Met Pro Asp

Ile Ser 80

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 65 70

Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Ser 75

Trp Gly 95

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu 85

Ser Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr 90

Leu Gly

Pro Gly Ile Arg Vai Phe Gly 100

Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai 105 110 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7

Gly Tyr Tyr Trp Ser 1 5

<210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens 119 <4Ο0> 8

Tyr Ile His Tyr Ser Arg Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ala Leu Lys Ser 1 5 10 15

<210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Asp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Phe Asp Ile 15 10 15

<210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 10

Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Asn Tyr Ala Ile Ala 15 10

<210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 120 <4 Ο 0> 11

Vai Asn Arg Asp Gly Ser His Ile Arg Gly Asp 15 10 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12

Gin Thr Trp Gly Ala Gly Ile Arg Vai 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 13

Asn Tyr Tyx Trp Ser 1 5

Tyr lie His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 121 <210> 15

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15

Asp Thr Tyr Tyr Glu Ser Ser Gly His Trp Phe Asp Gly Leu Asp Vai 1 5 10 15 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 16 Thr Leu Asp Ser Glu His Ser Arg Tyr Thr Ile Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Vai Lys Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp 15 10 122

<210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Gin Thr Trp Gly Pro Gly Ile Arg Vai 1 5

<210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 19

Asn Phe Gly 11e Ser 1 5

<210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20

Trp Vai Ser Thr Tyr Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Arg 15 10 15

Gly 123 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Tyr Tyr Glu Thr Ser Gly Tyr Ala Tyr Asp Asp Phe Ala 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 22 Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Thr Tyr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23

Vai Asn Ser Asp Gly Ser His Thr Lys Gly Asp 15 10 124 <210> 24

<211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24

Gin Thr Trp Gly Pr o Gly He Arg Vai

<210> 25 <211> 372 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tttctggtgg ctccatcagt ggttactact ggagttggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat attcattata gtaggagcac caactccaac 180 cccgccctca agagtcgagt caccatatca tcagacacgt ccaagaacca gctctccctg 240

O agactgagct cagtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatacctat 300 tactatgata gtggtgatta tgaggatgct tttgatattt ggggccaagg gacaatggtc 360 accgtctcct ca 372

<210> 26 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens 125 <4Ο0> 26 cagcttgtgc tgactcagtc gccctctgcc tctgcctccc tgggagcctc ggtcaagctc 60 acctgcactc tgagcagtgg ccacagcaac tacgccatcg cttggcatca gcagcagcca 120 gggaagggcc ctcgctactt gatgaaggtt aacagagatg gcagccacat caggggggac 180 gggatccctg atcgcttctc aggctccacc tctggggctg agcgttacct caccatctcc 240 agtctccagt ctgaagatga ggctgactat tactgtcaga cctggggcgc tggcattcga 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt 336

<210> 27 <211> 372 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acgtgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattactact ggagttggat ccggcagtcc 120 ccagggaggg gactggagtg gattgggtat atccattata gtgggagcac caactccaat 180 ccatccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca ggtctccctg 240 aagctgggct ctgtgaccgc tgcggacacg gccatatatt actgtgcgag agatacttac 300 tatgaaagta gtggtcattg gttcgacggt ttggacgtct ggggccaagg gacctcggtc 360 accgtctcct ca 372

<210> 28 <211> 333 <212> ADN <213> Homo sapiens 126 <400> 28 tgggagcctc ggtcaagctc catggcatca gcagcagcca gcagtcacag caagggggac agcgctacct caccatctcc cttggggccc tggcattcga gccctctgcc tctgcctccc acacagcaga tacaccatcg gatgaaggtt aagagtgatg aggctccagc tctggggctg ggctgactat tactgtcaga gctgaccgtc cta cagcctgtgc tgactcagtc acctgcactc tggacagtga gagaagggcc ctcggtacct ggcattactg atcgcttctc agcctccagt ctgaggatga gtgttcggcg gagggaccaa 60 120 180 240 300 333

<210> 29 <211> 372 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcagttgggt gcgacaggcc 120 acaatggtcg cacaaattat 180 catccacgaa cacagcgtac 240 tttactgtgc gagagattac 300 ggggccaagg gacattggtc 360 372 caggttcagc tcctgcaagg cctggacaag gcacagaagt atggaactga tatgagacta accgtctcct tggtgcagtc cttctggtta ggcttgagtg tccggggcag ggagcctggg gtggttacgc ca tggagctgag cacctttacc gataggatgg agtcaccatg atctgacgac ctatgatgat atgaagaggc aactttggta gtcagcactt accacagaca acggccgtct tttgcgatct

<210> 30 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens 127 <400> 30 ggtcaagctc €0 gcagcagcca 120 caagggggac 180 ctccatctcc 240 tggcattcga 300 336 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggt

<210> 31 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 ggttactact ggagt

<210> 32 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 tatattcatt atagtaggag caccaactcc aaccccgccc tcaagagt

<210> 33 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens 128 <400> 33 gatacctatt actatgatag tggtgattat gaggatgctt ttgatatt <210> 34 <211> 36

<212> ADN <213> Homosapiens <400> 34 actctgagca gtggccacag caactacgcc atcgct

<210> 35 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 gttaacagag aíggcagcca catcaggggg gac

<210> 36 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 cagacctggg gcgctggcat tcgagtg

<210> 37 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens 129 <4Ο0> 37 aattactact ggagt

<210> 38 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 38 tatatccatt atagtgggag caccaactcc aatccatccc tcaagagt <210> 39 <211> 48 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 39 gatacttact atgaaagtag tggtcattgg ttcgacggtt tggacgtc <210> 40 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 40 actctggaca gtgaacacag cagatacacc atcgca <210> 41 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens 130 <4Ο0> 41 gttaagagtg alggcagtca cagcaagggg gac

<210> 42 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 42 cagacttggg gccctggcat tcgagtg

<210> 43 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 43 aactítggta tcagt <210> 44 <211> 51 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 44 tgggtcagca ctíacaatgg tcgcacaaat tatgcacaga agttccgggg c <210> 45 <211> 45 <212> ADN <213> Homo sapiens 131 <4Ο0> 45 gattactatg agactagtgg ttacgcctat gatgattttg cgaíc

<210> 46 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 actctgagca gtgggcacag cacctacgcc atcgcg

<210> 47 <211> 33 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 47 glcaacagtg atggcagcca caccaagggg gac

<210> 48 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 48 cagacgtggg gcccíggcat tcgagtg

<210> 49 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial 132 <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 49 gaccgagggg gcagccttgg gctgacctag g 31

<210> 50 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 50 agatctctca ccatggcatg gatccctctc ttc 33

<210> 51 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 51 ígggcccttg gtgctagctg aggagac 27 133

<210> 52 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 52 gtcgacatga aacatctgtg gítcttc 27

<210> 53 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 53 agatctctca ccatggccrg cttcccíctc ctc 33

<210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético 134 <4Ο0> 54 gtcgacatgg actggacctg ga 22 <210> 55 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 55

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Vai Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Tyr Ile His Tyr Ser Arg Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Ser Asp Thr Ser Lys Asn Gin Leu Ser Leu 65 70 75 80

Arg Leu Ser Ser Vai Thr Ala Ala Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Gly Asp Tyr Glu Asp Ala Phe Asp 100 105 110

Ile Trp Gly Gin Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser 115 120 125 <210> 56 <211> 378 <212> ADN <213> Homo sapiens 135 <4Ο0> 56 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tttctggtgg ctccatcagt ggttactact ggagttggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattgggtat attcattata gtaggagcac caactccaac 1Θ0 cccgccctca agagtcgagt caccatatca tcagacacgt ccaagaacca gctctccctg 240 agactgagct cagtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatacctat 300 tactatgata gtggtgatta tgaggatgct tttgatattt ggggccaagg gacaatggtc 360 accgtctcct cagctagc 378

<210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57

Gin Leu Val Leu Thr Gin ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Asn Tyr Ala 20 25 30

Ile Ala Trp His Gin Gin Gin Pro Gly Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met 35 40 45

Lys Val Asn Arg Asp Gly Ser His Ile Arg Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 136

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Trp Gly 85 90 95

Ala Gly Ile Arg Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110

Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Vai 115 120 <210> 58 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58

Gin Vai Gin Leu Gin Glu Ser 1 5 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20

Gly Pro Gly Leu Vai Lys Pro Ser Glu ío IS Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Tyr 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gin 35

Ser Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 40 45

Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly 50 55

Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys 60

Ser Arg Vai Thr Ile Ser Vai 65 70

Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val Ser Leu 75 80

Lys Leu Gly Ser Vai Thr Ala

Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 90 95

Arg Asp Thr Tyr Tyr Glu Ser 100

Ser Gly His Trp Phe Asp Gly Leu Asp 105 110

Vai Trp Gly Gin Gly Thr Ser 115

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 120 125 137

Gly Pro 130

<210> 59 <211> 381 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 59 caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acgtgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattactact ggagttggat ccggcagtcc 120 ccagggaggg gactggagtg gattgggtat atccattata gtgggagcac caactccaat 180 ccatccctca agagtcgagt caccatatca gttgacacgt ccaagaacca ggtctccctg 240 aagctgggct ctgtgaccgc tgcggacacg gccatatatt actgtgcgag agatacttac 300 tatgaaagta gtggtcattg gttcgacggt ttggacgtct ggggccaagg gacctcggtc 360 accgtctcct cagctagcac c 381

<210> 60 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60

Gin Leu Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Ser Thr Tyr Ala 138

Ile Ala Trp His Gin Gin Gin Pro Leu Arg Gly Pro Arg Phe Leu Met 35 40 45

Lys Vai Asn Ser Asp Gly Ser His Thr Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Ser Ile Ser 65 70 75 80

Ser Leu Gin Ser Glu Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Gin Thr Trp Gly 85 90 95

Pro Gly Ile Arg Vai Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Vai Leu Gly 100 105 110

Ser Vai 120

Gin Pro Lys Ala Ala Pro 115

<210> 61 <211> 375 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 61 cagcttgtgc tgactcaatc gccctctgcc tctgcttccc tgggagcctc ggtcaagctc 60 acctgcactc tgagcagtgg gcacagcacc tacgccatcg cgtggcatca gcagcagcca 12 0 ctgaggggtc ctcgtttctt gatgaaagtc aacagtgatg gcagccacac caagggggac 180 gggatccctg atcgcttctc aggctccagt tctggggctg agcgctacct ctccatctcc 240 agcctccagt ctgaagatga gtctgactat tactgtcaga cgtggggccc tggcattcga 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccatcggfcc 360 acctgttccc gcctc 375

Lisboa, 5 de Junho de 2013 139

Claims (26)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição, compreendendo um anticorpo isolado ou seu fragmento que se liga selectivamente a poli-N-acetilglucosamina estafilocócica (PNAG/dPNAG), em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado compreende: (a) uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 1 e uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 2.
2. 2. Composição da reivindicação 1, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo isolado: (a) é um anticorpo monoclonal solúvel intacto; (b) é um fragmento de anticorpo isolado seleccionado do grupo consistindo de fragmento F(ab')2f fragmento Fd e fragmento Fab; (c) intensifica a opsonofagocitose das estirpes bacterianas expressando PNAG; ou (d) intensifica a opsonofagocitose de Staphylococcus expressando PNAG;
3. 3. Composição da reivindicação 1, em que (a) os Staphylococcus expressando PNAG são S. aureus ou S. epidermidis, ou 1 (b) as estirpes bacterianas expressando PNAG são E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis {X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans {A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) , Bordetella pertussis (B. pertussis) , B. parapertussis ou B. bronchiseptica expressando PNAG.
4. 4. Composição da reivindicação 1, em que o anticorpo isolado é conjugado com uma marcação detectável.
5. 5. Composição da reivindicação 1, compreendendo ainda um veiculo farmaceuticamente aceitável.
6. 6. Composição da reivindicação 5, em que o anticorpo isolado está (a) presente numa quantidade eficaz para inibir uma infecção por estirpes bacterianas expressando PNAG; (b) presente numa quantidade eficaz para inibir uma infecção estafilocócica; (c) presente numa quantidade eficaz para detectar estirpes bacterianas expressando PNAG numa amostra num indivíduo ou proveniente deste; ou (d) presente numa quantidade eficaz para detectar Staphylococcus numa amostra num indivíduo ou proveniente deste. 2
7. 7. Composição da reivindicação 1, em que o anticorpo isolado (a) se liga selectivamente a PNAG estafilocócicas, ou (b) se liga selectivamente a dPNAG estafilocócicas.
8. 8. Anticorpo isolado para utilização num método para detectar uma estirpe bacteriana expressando PNAG num indivíduo compreendendo determinar um nível de teste de ligação do anticorpo isolado ou de uma sua variante funcionalmente equivalente a uma amostra num indivíduo ou proveniente deste, e comparar o nível de teste de ligação a um controlo, em que o anticorpo isolado é o anticorpo isolado da reivindicação 1, e em que um nível de teste de ligação que é superior ao controlo é indicador da presença de uma estirpe bacteriana expressando PNAG na amostra.
9. 9. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o método é um método para detectar Staphylococcus.
10. 10. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o anticorpo isolado é conjugado com uma marcação detectável. 3
11. 11. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que é medido o nível de teste de ligação in vitro.
12. 12. Anticorpo isolado para utilização no tratamento de um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção por uma estirpe bacteriana expressando PNAG, em que o anticorpo isolado é o anticorpo isolado da reivindicação 1.
13. 13. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o método é um método para tratar um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma infecção estafilocócica compreendendo a administração a um indivíduo com necessidade desse tratamento de um anticorpo isolado de acordo com a reivindicação 1 numa quantidade eficaz para inibir uma infecção estafilocócica.
14. 14. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que o indivíduo está em risco de desenvolver (a) uma infecção estafilocócica, ou (b) uma infecção com E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens {P. fluorescens), Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) , A. pleuropneumoniae, Bordetella pertussis (B. pertussis) , B. parapertussis ou B. bronchiseptica. 4
15. 15. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a Reivindicação 12 ou 13, em que o anticorpo isolado é conjugado com um agente citotóxico.
16. 16. Anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG, que é o anticorpo isolado da reivindicação 1, para a utilização no tratamento de uma infecção de uma estirpe bacteriana expressando PNAG, em que o referido anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG é administrado a um indivíduo com necessidade deste numa quantidade eficaz para tratar a infecção e reduzir a carga bacteriana no indivíduo em pelo menos 50% dentro de 4 horas após a exposição a uma bactéria que expressa PNAG.
17. 17. Anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG para utilização de acordo com a reivindicação 16, para tratar uma infecção estafilocócica.
18. 18. Anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG para utilização de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que o anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG é administrado antes da exposição à bactéria.
19. 19. Anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG para utilização de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que o anticorpo de ligação a PNAG/dPNAG (a) reduz a carga bacteriana num indivíduo em pelo menos 60% dentro de 4 horas após a exposição à bactéria, (b) reduz a carga bacteriana num indivíduo em pelo menos 50% em 2 horas após a exposição à bactéria, ou 5 (c) reduz a carga bacteriana num indivíduo em pelo menos 60% em 2 horas após a exposição à bactéria.
20. 20. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou um anticorpo ou anticorpo de ligação para utilização de acordo com qualquer uma das de reivindicações 8, 12 ou 16, em que as estirpes bacterianas expressando PNAG são seleccionadas do grupo consistindo de E. coli, Yersinia pestis (Y. pestis), Y. entercolitica, Xanthomonas axonopodis (X. axonopodis), Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) , Actinobacillus actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans), A. pleuropneumoniae, Ralstonia solanacearum (R. solanacearum), Bordetella pertussis (B. pertussis), B. parapertussis e B. bronchiseptica.
21. 21. Anticorpo isolado para utilização de acordo com a reivindicação 9, em que os Staphylococcus são S. aureus ou S. epidermidis.
22. 22. Composição, compreendendo: uma variante funcionalmente equivalente isolada de um anticorpo ou seu fragmento que se liga selectivamente a poli-N-acetilglucosamina estafilocócica (PNAG/dPNAG) em que a variante compreende sequências de aminoácido que tendo identidade de aminoácidos de pelo menos 80% com, respectivamente, a SEQ ID N° 1 e a SEQ ID N° 2.
23. 23. Composição de acordo com a reivindicação 22, 6 em que a variante funcionalmente equivalente compreende sequências de aminoácidos tendo identidade de aminoácidos de pelo menos 80% com, respectivamente, a SEQ ID N° 9 e a SEQ ID N° 12.
24. 24. Composição da reivindicação 22, em que a variante funcionalmente equivalente compreende sequências de aminoácidos tendo identidade de aminoácidos de pelo menos 80% com, respectivamente a SEQ ID N° 7 e a SEQ ID N° 10; ou sequências de aminoácido tendo identidade de aminoácidos de pelo menos de 80% com, respectivamente, a SEQ ID N° 8 e a SEQ ID N° 11.
25. 25. Anticorpo isolado ou um seu fragmento que se liga selectivamente a poli-N-acetilglucosamina estafilocócica (PNAG/dPNAG) compreendendo: uma região da cadeia pesada compreendendo sequências da CDR1 da cadeia pesada, CDR2 da cadeia pesada e CDR3 da cadeia pesada compreendendo sequências de aminoácido, respectivamente, da SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8 e SEQ ID N° 9; e uma região da cadeia leve compreendendo a CDR1 da cadeia leve, a CDR2 da cadeia leve e sequências da CDR3 da cadeia leve compreendendo, respectivamente, as sequências de aminoácido das SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 11 e SEQ ID N° 12. 7
26. 26. Acido nucleico que codifica o anticorpo isolado ou um seu a como fragmento que se liga selectivamente poli-N-acetilglucosamina estafilocócica (PNAG/dPNAG) definido em qualquer das reivindicações anteriores. Lisboa, 5 de Junho de 2013 8