KR20130019026A

KR20130019026A - 항-락톤 또는 락톤 유도된 시그널 분자 항체를 이용한 감염성 세균 질환의 치료 방법

Info

Publication number: KR20130019026A
Application number: KR1020137002610A
Authority: KR
Inventors: 케이스 알랜 찰톤; 앤드류 저스틴 래드클리프 폴터
Original assignee: 햅토젠 리미티드
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2003-08-13
Publication date: 2013-02-25
Also published as: KR101115240B1; JP2006508910A; KR20050065528A; EP2260868A2; DK1528935T3; US20060165704A1; WO2004014423A1; EP2260868A3; ATE550036T1; EP1528935A1; US20130045208A1; CA2495725C; JP4630663B2; EP1528935B1; AU2003251053A1; CN1681531A; US20100303831A1; US8168397B2; AU2003251053B2; HK1077207A1

Abstract

본 발명은 세균 세포 시그널링 분자의 세포외 농도를 조정함으로써 감염성 세균의 독성을 제어하기 위한 방법에 관한 것이다. 세포 시그널링 분자의 유도체를 적합한 캐리어 단백질에 접합시키고, 이를 사용하여, 본래의 시그널 분자(들)를 인식하는 고 친화성 수용체를 분리한다. 시그널링 분자와 결합함으로써, 수용체는 시그널 분자의 세포외 농도를, 특정의 기회 병원체를 독성 형태로 적응시키게 하는 한계 수준 이하로 감소 및 유지시키고, 독성 유기체를 비-독성 상태로 변환시킬 수 있다. 이들 수용체는 감염에 걸리기 쉬운 개개인의 치료, 기존의 감염 환자의 치료, 질병 모니터링 및 관리, 및 감염 숙주가 동물 또는 식물인 경우의 관련 적용 분야에 적용한다.

Description

항-락톤 또는 락톤 유도된 시그널 분자 항체를 이용한 감염성 세균 질환의 치료 방법{Methods for the treatment of an infectious bacterial disease with an anti-lactone or lactone derived signal molecules antibody}

본 발명은 환자에게서 세균성 감염증을 제어 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 방법은 전부는 아니지만 대부분의 그람 음성 및 그람 양성 세균성 감염증에 적용될 수 있다. 본 발명은 바람직한 양태에서, 세균 세포 대 세포 전염 과정에 관여하는 시그널링 분자에 대한 친화성과 특이성을 지닌 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 수용체 분자에 기초한 치료법을 제공해준다. 이러한 분자에 결합함으로써, 수용체는 세균의 존재 여부를 진단하거나 환자의 질병 상태를 평가하는데 사용될 수 있고, 기회 병원체(opportunistic pathogen) 및 기타 병원체의 독성 상태를 유도시키는데 관여하는 분자 농도를 제어하기 위해 추가로 사용될 수 있다.

오늘날 병원에서 치료받고 있는 환자의 사망률과 질병율의 주요 원인들 중의 하나가 병원내 감염(hospital acquired infection) 때문이다. 이러한 감염에 대한 감수성은 환자에게 면역억제 치료 섭생을 허용하게 만든 일차적인 질병에 따른 결과일 수 있거나, 또는 심한 피부 손상, 예를 들면, 화상을 가져다 주는 상해에 따른 것일 수 있다. 가장 흔히 발병하는 원인균이 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)이다. 이는 사람의 기회 병원체의 전형이다. 상기 세균은 기능 저하되지 않은 조직(uncompromised tissue)은 거의 감염시키지 않지만, 조직 방어 체계가 몇몇 방식으로 기능 저하된 경우에는 거의 모든 조직을 감염시킬 수 있다. 비교적 소수의 종이 원인이 되긴 하지만, 이는 사람 건강에 치명적인 위협이 되므로, 감염성 세균의 대표적인 예로서 후술되지만, 이것으로써 본 발명의 범위 또는 정도가 제한되지 않는다.

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)는 특히 심한 화상 환자, 및 면역억제된 AIDS 환자와 암 환자에 있어, 요도 감염증, 호흡기 감염증, 피부염, 연질 조직 감염증, 균혈증(bacteraemia) 및 각종 전신 감염증을 유발시키는 기회 병원체이다. 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)에 의해 야기된 호흡기 감염증은 기능 저하된 하부 기도 또는 기능 저하된 전신 방어 기전을 나타내는 개개인에게서만 발병한다. 만성 폐질환과 울혈성 심부전증 환자에게서 원발성 폐렴이 발병한다. 균혈성 폐렴은 화학요법이 진행중인 호중구 감소성 암 환자에게서 통상 발병한다. 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)의 뮤코이드 균주에 의한 낭포성 섬유증(cystic fibrosis) 환자의 하부 기도 전이증식이 흔히 발병하고, 전혀 불가능한 것은 아니지만 이를 치료하기가 어렵다. 이는 주로 면역 기능 저하 환자에게서 균혈증을 유발시킨다. 소인 상태로는 혈액학적 악성 종양, AIDS 관련 면역결핍증, 호중구 감소증(neutropenia), 진성 당뇨병, 및 심한 화상이 있다. 대부분의 슈도모나스 균혈증은 병원과 요양소에서 얻어지는데, 병원에서 얻어지는 모든 그람 음성 균혈증의 약 25%를 차지한다.

상기 세균은 이의 외부 막 LPS에 의해 제공된 투과성 장벽으로 인해 본래 많은 항생제에 대한 내성을 지니고 있는 것으로 악명이 높기 때문에, 특히 위험하고 무서운 병원체이다. 또한, 상기 세균은 표면을 바이오필름 형태로 전이증식시키는 경향이 있기 때문에, 치료학적 농도의 항생제가 세포 내로 침투하지 못하게 한다. 상기 세균 본래의 서식지가 바실루스(bacillus), 악티노마이세테스(actinomycetes) 및 곰팡이(moulds)와 연합해서 살아가는 토양이기 때문에, 이들 천연의 각종 항생제에 대한 내성이 발생하였다. 더욱이, 슈도모나스 종은 항생제 내성 플라스미드, 내성 인자(R-인자) 및 내성 전이 인자(RTFs)를 보유하고 있고, 세균성 형질도입 및 접합 프로세스를 통하여 이들 유전자를 전이시킬 수 있다. 플루오로퀴놀론, 젠타마이신 및 이미페넴을 포함한 소수의 항생제만이 슈도모나스에 대해 유효하며, 심지어 이들 항생제조차도 모든 균주에 대해 유효한 것은 아니다. 젠타마이신과 카르베니실린의 조합물이 급성 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염증 환자에게 유효한 것으로 보고되었다. 항생제를 이용하여 슈도모나스 감염증을 치료하는 것이 쓸데없다는 사실은 낭포성 섬유증 환자에게서 가장 극적으로 예시되는데, 이들 환자의 거의 대부분이 결국에는 치료할 수 없을 정도의 내성을 지닌 균주에 감염되었다. 항생제 내성 때문에, 임상 분리물에 대한 감수성 시험이 의무적이다.

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)는 토양과 물로부터 통상 분리할 수 있을 뿐만 아니라 식물과 동물의 표면으로부터도 분리할 수 있다. 전 세계적으로 이들 서식지가 발견되기 때문에, 이는 다소 "전세계적인(cosmopolitan)" 세균이다. 이는 종종 사람의 정상적인 세균총(flora)의 일부로서 존재하기도 하지만, 병원 밖의 건강한 개개인에게 전이증식하여 유행될 확률은 비교적 낮다(해부 장소에 따라서 0 내지 24%로 평가됨). 병원 내에서는, 음식물, 개수대, 탭(tap), 걸레(mop), 호흡 장비 수술 기기에 전이증식하는 것으로 공지되어 있다. 전이증식이 통상적으로 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)에 의한 감염을 전제로 하긴 하지만, 이러한 병원체는 어느 환경에서도 도처에 존재하기 때문에, 이의 정확한 공급원과 전염 양상이 명확하지 않을 때가 종종 있다. 임상적 상황에서 감염된 것으로 의심가는 집중 치료 환자들 중의 50%가 감염원을 확인할 수가 없다. 현재, 전세계적으로 1,400명의 집중 치료 병동(ICU) 환자가 매일 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염으로 인해 사망하는데, 이는 가장 높은 사망 원인이다.

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)는 주로 병원내 병원체이다. CDC에 따르면, 미국 병원 내에서 전반적인 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염증 발병률은 평균 약 0.4%(1000개 가검물 중의 4개)이며, 모든 병원내 감염증의 10.1%를 차지하는 4번째로 가장 흔하게 분리되는 병원내 병원체이다. 전세계적으로, 병원내 폐렴 증례(case)의 16%, 후천성 요도 감염증의 12%, 외과적 창상 감염증의 8% 및 혈류 감염증의 10%에 책임이 있다. 면역 기능 저하 환자, 예를 들면, 호중구 감소성 암 환자와 골수 이식 환자가 기회성 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염증에 걸리기 쉬워서(감수성), 사망률이 30%에 도달하는 것으로 보고되었다. 이는 또한, 환기장치-연관된 폐렴의 38% 및 AIDS 환자 사망의 50%에 책임이 있다. 화상 증례에서는 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염증이 최근 수년간 감소하였는데, 이는 개선된 치료법과 식이 변화 때문이다. 그러나, 사망률은 모든 사망자의 60%를 차지할 정도로 여전히 높은데, 이는 화상 환자의 이차 감염 때문이다.

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)의 다양성에 대한 한 가지 이유는 이것이 엘라스타제, LasA 프로테아제, 알칼리성 프로테아제, 람노리피드, 유형 IV 필루스-매개된 연축(twitching) 운동성, 피요베르딘(pyoverdin)[참조: Williams et al., 1996, Stintzi et al., 1998, Glessner et al., 1999], 피요시아닌(pyocyanin)[참조: Brint & Ohman, 1995, Reimmann et al., 1997], 및 세포독성 렉틴 PA-1 및 PA-II[참조: Winzer et al., 2000]을 포함한, 일련의 다양한 독성 결정인자를 생산한다는 것이다. 이들 독성 결정인자의 상당 수가 균체 밀도 감지 기구(quorum sensing)을 통하여 세포 밀도-의존적 방식으로 유전자 수준에서 조절되는 것으로 현재 공지되어 있다. 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)는 적어도 2개의 균체 밀도 감지 기구 시스템, 즉 LuxRI 상동체 LasRI[참조: Gambello & Iglewski, 1991] 및 RhlRI(VsmRI)[참조: Latifi et al., 1995]로 각각 구성된 las 및 rhl(vsm) 시스템을 보유하고 있다(도 2). LasI는 3-옥소-C12-HSL의 합성을 지시하는 반면[참조: Passador et al., 1993, Pearson et al., 1994], RhlI는 C4-HSL의 합성을 지시한다[참조: Winson et al., 1995]. The las 및 rhl 시스템은 특정 계층에 존재하는 것으로 여겨지는데, 여기서 las 시스템은 RhlR 전반에 걸쳐 전사적 제어를 발휘한다[참조: Williams et al., 1996, Pesci et al., 1997]. 전사 활성인자 LasR는 3-옥소-C12-HSL과 연계해서, 독성 결정인자 엘라스타제, LasA 프로테아제, 알칼리성 프로테아제 및 외독소 A[참조: Gambello & Iglewski, 1991, Toder et al., 1991, Gambello et al., 1993, Pearson et al., 1994] 뿐만 아니라 lasI를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 기능을 한다. 엘라스타제는 콜라겐, IgG 및 IgA 항체를 절단하고, 보상하며, 폐 점막 상으로의 세균 유착을 촉진시킬 수 있다. 이는 알칼리성 프로테아제와 조합하여, 감마 인터페론(INF) 및 종양 괴사 인자(TNF)의 불활성화를 유발시키기도 한다. LasI는 3-옥소-C12-HSL의 합성을 지시하는데, 이는 LasR과 함께, lasI 프로모터와 결합하여 양성 피드백 시스템을 창출한다. RhlR 전사 활성인자는 이의 동종 AHL(C4-HSL)와 함께, rhlAB(람노리피드), lasB, aprA, RpoS, 시아니드, 피요시아닌 및 렉틴 PA-1 및 PA-II의 발현을 조절한다[참조: Ochsner et al., 1994, Brint & Ohman, 1995, Latifi et al., 1995, Pearson et al., 1995, Winson et al., 1995, Latifi et al., 1996, Winzer et al., 2000]. 이들은 LasR/3-옥소-C12-HSL이 rhlR을 조절하는 계층적 방식으로 존재하여[참조: Latifi et al., 1996, Pesci et al., 1997], 결과적으로 양 시스템이 상기 독성 결정인자 모두를 조절할 필요가 있다.

슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염증을 치료 또는 예방하기 위한 치료법을 개발하고자 하는 수 많은 상이한 접근법이 적극적으로 수행되고 있다. 몇 가지는 광범위한 감염에 대한 것이지만, 다른 것은 특이적 유형의 슈도모나스 감염에 대한 것이다. 전통적인 접근 방식으로는 미국 특허 제6,309,651호에 기재된 바와 같은 백신을 개발하는 것이고, 기대되는 새로운 항생 약물(SLIT)은 일반적으로는 그람 음성 세균에 대항하여 유효할 것이지만, 일차적으로 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)에 대항하여 작용하도록 고안되어 에어로솔 흡입 투여되는 것이다. 연구 중에 추가로 관찰된 사항은 최적 이하의 성장 억제 농도로 투여된 항생제 에리트로마이신이 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 적혈구응집소, 헤모리신, 프로테아제 및 호모세린 락톤(HSL)의 생성을 동시에 억제시키고, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 지속 감염을 치료하는데 적용할 수 있다는 것이다. 양친매성 펩티드를 함유하는 크림 제형이 화상 또는 기타 심한 피부 상처의 감염증을 예방하는데 적당한 수단으로서 또한 조사되고 있다. 미국 특허 제6,309,651호에는 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)의 PcrV 독성 단백질에 대항한 항체가 감염으로부터의 보호를 제공해줄 수 있다는 것이 교시되어 있다.

병원성(pathogenicity)을 통제하기 위한 수단으로서 호모세린 락톤 수준을 조정하는 것에 관한 관심이 일부 있다. 특정의 조류(algae)가 몇몇 지상 식물의 경우와 마찬가지로, 아실-호모세린 락톤(AHL)의 경쟁적 억제제, 예를 들면, 푸라논[참조: Manefield, 1999]을 생성하는 것으로 입증되었다. 이들 화합물은 AHL 시그널 분자를 이의 수용체 단백질로부터 전위시켜, AHL 생물검정에서 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다[참조: Tepletski et al., 2000]. HSL 농도를 감소시키기 위해 이용되는 기타 방법으로는 HSL의 분해를 촉매하는 자가-유도인자 불활성화 효소(AiiA)를 생성시키는 것이다.

현재 개발중인 치료법과 관련해서 잠재된 수 많은 문제점과 한계가 있다. 백신이 효과적인 치료법이 될 것인지에 관해서는 아직까지 입증된 바 없다. 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)는 숙주 항체에 의한 옵소닌 작용(opsonisation)으로부터 효과적으로 보호해주는 광범위한 뮤코이드 캡슐을 생산하는데, 이는 항-슈도모나스 항체의 혈청 역가치가 높은 지속 감염증 환자에게서 입증되었다. 미국 특허 제6,309,651호에 기재된 바와 같이, 백신 및 항-PcrV 항체와 같은 치료법 적용에 있어서의 한계점은 이들 접근법 자체가 슈도모나스 감염으로만 제한되고, 기타 세균에 대해서는 효능이 없을 수도 있다는 것이다. 자가-유도인자 모의체(mimic)의 사용은 수용체 결합 부위를 놓고 HSL에 대항하여 효과적으로 경쟁하는데 대부분의 농도가 요구되고, 부작용이 일어날 수 있다는 점 때문에 제한된다. 슈도모나스 및 기타 세균에 의해 방출된 HSL이 사람 생리학에 대해 직접적인 수 많은 효과를 지닌다는 사실은 널리 공지되어 있다. 이러한 효과로는 WO 01/26650에 기재된 바와 같은 히스타민 방출 억제가 있다. WO 01/74801에는 HSL이 림프구 증식을 억제할 수 있고, 단구 및 대식 세포에 의한 TNF-α의 분비를 하향 조절할 수 있기 때문에, 총체적인 면역억제제로서 작용한다고 기재되어 있다. 따라서, 경쟁적 HSL 모의체의 사용을 포함한 치료법은 환자의 면역계를 하향 조절할 수 있다는 위험이 있다. 이는 대체로 바람직하지 못한데, 특히 면역 기능 저하 환자에게 바람직하지 못하다. 상기 세균(및 기타 세균)의 항생제에 대한 내성 발생 능력이 뛰어나다는 측면에서 보면, 항생제의 사용은 기껏해야 단기간 치료 전략으로 여겨질 수 있다.

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)의 발병 기전이 명백하게도 다인자성(multifactoral)이란 사실은 수 많은 독성 인자와, 이러한 세균과 연관된 넓은 스펙트럼의 질환에 의해 분명히 나타난다. 조직 침입과 전염에 요구되는 많은 세포외 독성 인자가, 호모세린 락톤계 시그널 분자와 특이적 전사 활성인자 단백질이 관여하는 세포-대-세포 시그널링 시스템에 의해 제어된다. 이들 조절 시스템으로 인해, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)가 협조 세포(co-ordinated cell) 밀도 의존적 방식으로 독성 형태에 적응할 수 있게 되고, 숙주 방어 기전을 극복할 수 있게 된다. 이러한 세포 시그널링으로의 간섭과, 이와 연관된 독성 인자의 생성이 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)에 의해 야기된 질병과 사망을 감소시키는데 있어 전도 유망한 치료 접근법이다. 이러한 치료 접근법의 중요성은 유사한 세포-대 세포 시그널링 시스템을 활용하는 것으로 밝혀진 세균성 병원체의 수가 증가함으로써 특히 두드러진다.

숙주-병원체 상호작용의 분자 기준을 연구하기 위해서는, 사람에게서의 병원성과 관련된 자극과 기전을 복제할 수 있는 적합한 모델 시스템(비-사람)을 입수하는 것이 요망된다. 많은 질병의 경우에는, 해당 병원체가 본질적으로, 1개 또는 수 개의 밀접하게 관련된 종 또는 그룹, 예를 들면, HIV와 연관된다. 기타 유기체는 종, 속 및 심지어 계(kingdom) 장벽을 넘어 광범위한 숙주에게서 질병을 유발시킬 수 있다. 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)가 이러한 병원체 중의 하나이고, 이는 각종의 식물, 곤충 및 동물 종을 감염시킬 수 있다.

최근 수 년간, 사람과 마우스에게서 질병을 유발시킬 수 있는 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주는 선충류 연충 캐르노합티디스 엘레간스(Caernohabtidis elegans)를 사멸시킬 수도 있다는 사실이 입증되었다[참조: Tan et al., 1999a, Tan et al., 1999b, Tan et al., 2000]. 보다 중요하게는, 씨. 엘레간스(C. elegans)에 대한 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)의 병원성이, 사람에게서의 발병 기전을 제어하는 동일한 세포 밀도-의존적 균체 밀도 감지 기구 시스템에 의해 조절된다는 것이다. 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)와 씨. 엘레간스(C. elegans) 둘 다의 게놈 서열 분석이 최근에 완료됨에 따라, 세균성 질병 기전 연구에 이상적인 상기 관계가 이루어졌다. 씨. 엘레간스(C. elegans) 단백질의 36%가 사람에게서 상동체를 가지고 있고[참조: Darby et al., 1999], 씨. 엘레간스(C. elegans)가 실험실 내에서 용이하게 성장할 수 있다는 사실은, 이를 사람의 숙주 방어와 발병 기전에 대한 모델로서 광범위하게 사용할 수 있게 하였다[참조: Kurz and Ewbank, 2000].

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)가 씨. 엘레간스(C. elegans)의 사멸을 매개한다는 각종 상이한 기전이 확인되었다. 문헌[참조: Tan et al., 1999a; 1999b, and Mahajan-Miklos et al., 1999]에는 마우스와 식물을 감염시키기도 하는 임상 분리물(균주 PA14)의 사용이 기재되어 있다. 상기 세균의 성장 조건을 변화시켜 씨. 엘레간스(C. elegans)에 후속 적용하면, 신속한 사멸(수 시간 이내) 또는 느린 사멸(3 내지 4일 이내)이 이루어질 수 있다. 신속한 사멸 기전은 Rhl 균체 밀도 감지 기구 시스템에만 의존적이다. 더욱이, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)를 적당한 수준으로 성장시킨 세포-무함유 배지의 사용, 또는 열 사멸된 추출물의 사용은 동등하게 효과적인데, 이는 확산 가능한 피요시아닌 독소에 의해 사망하기 때문이다. 이와는 달리, 느린 사멸 기전은 Las와 Rhl 시스템 모두에 좌우되어, 선충류 내장을 상당히 감염시킨다. 사망은 세균이 숙주 내로 침윤됨으로써 비롯된 것으로 추정하기 때문에, 본 검정이 동물 감염에 있어 가장 유용한 선충류 모델을 제공한다. 제3의 사멸 기전이 보고되었다[참조: Darby et al., (1990)]. 이 문헌에서는 뇌-심장 주입 배지에서 성장시킨 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주 PA01(공지된 사람 병원체)를 사용하면, 씨. 엘레간스(C. elegans)가 신속히 마비되어 사멸된다고 언급되어 있다. 앞서 언급된 느린 사멸의 경우처럼, 마비는 Las와 Rhl 시스템 둘 다에 의존적이다.

부작용을 유발시키지 않는 방법에 의해, 병원성에 관여하는 HSL 및 기타 세균 세포 시그널링 분자의 농도를 조정하는데 유효한 수단을 개발할 필요성이 있으며, 예견 가능한 미래에는 병원성 세균을 피할 수가 없다.

본 발명의 목적은 세균에 의해 분비된 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자에 대한 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 세균성 감염의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체를 세균에 감염된 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상의 세균성 감염을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 세균에 의해 분비된 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자를 이용하여 본래의 사람 파이지 디스플레이 라이브러리로부터 항균성 모노클로널 항체를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 세균 세포 시그널링 분자의 세포외 농도를 조절함으로써, 사람, 동물 및 식물 병원성 세균의 독성을 제어하는 방법을 제공한다. 기타 치료법이 특정한 병원체 또는 병원체 그룹, 또는 특정 국면의 세균 독성에 한정되는 반면, 본 발명은 일반적인(총체적인) 세균 독성에 역점을 두고 있다.

본 발명의 제1 국면에 따르면, 세균에 의해 분비된 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자에 대한 항체가 제공된다.

본 발명에 따르는 항체는 폴리클로널 항체 또는 모노클로널 항체일 수 있다. 폴리클로널 항체는 항원을 동물에게 주사하는 경우, 적합한 동물 숙주(예: 마우스, 랫트, 기니아 피그, 래빗, 양, 치킨, 고우트 또는 몽키)에서의 이들의 생성을 자극함으로써 생성될 수 있다. 필요한 경우, 아쥬반트(adjuvant)를 항원과 함께 투여할 수 있다. 이어서, 항원에 대한 이들 항체의 결합을 통하여 또는 다음에 추가로 기재되는 바와 같이 항체를 정제할 수 있다. 모노클로널 항체는 하이브리도마로부터 생성시킬 수 있다. 이들은 불멸의 세포주를 형성하기 위해 목적하는 항체를 생성시키는 B-림프구와 골수종 세포를 융합시킴으로써 형성시킬 수 있다. 이는 널리 공지된 Kohler & Milstein 기술[참조: Nature 256 52-55 (1975)]이다.

특정한 단백질과 결합하는 모노클로널 및 폴리클로널 항체를 생성하는 기술은 현재 당해 분야에서 잘 개발되었다. 이들 기술은 표준 면역학 교재, 예를 들면, 문헌[참조: Roitt et al, Immunology second edition(1989), Churchill Livingstone, London]에 논의되어 있다.

완전한 항체 이외에도, 본 발명에는 항원과 결합할 수 있는 이의 유도체가 포함된다. 따라서, 본 발명에는 항체 단편 및 합성 작제물이 포함된다. 항체 단편 및 합성 작제물의 예가 문헌[참조: Dougall et al in Tibtech 12 372-379 (September 1994)]에 제공된다. 항체 단편에는, 예를 들면, Fab, F(ab')₂ 및 Fv 단편이 포함된다[상기 Roitt et al 참조]. Fv 단편을 변형시켜 단일 쇄 Fv(scFv) 분자로서 공지된 합성 작제물을 생성할 수 있다. 이에는 분자 안정성에 기여하는 V_H 및 V_L 영역을 공유적으로 연결하는 펩티드 링커가 포함된다. 따라서, 본 발명은 단일 쇄 항체 또는 scAb로 또한 확대된다.

기타 합성 작제물로는 CDR 펩티드가 있다. 이들은 항원 결합 결정기를 포함하는 합성 펩티드이다. 펩티드 유사체를 사용할 수도 있다. 이들 분자는 통상적으로, CDR 루프 구조를 모방하고 항원-상호작용성 측쇄를 포함하는 입체 구조적으로 제한된 유기 환이다. 합성 작제물에는 또한, 키메라 분자가 포함된다. 따라서, 예를 들면, 사람 적응화(humanised)(또는 영장류 적응화) 항체 또는 이의 유도체가 본 발명의 범위 내에 속한다. 사람 적응화 항체의 예는 사람 골격 영역을 갖지만, 설치류 초가변 영역을 갖는 항체이다. 합성 작제물에는 또한, 분자에게 항원 결합성 이외에도 몇 가지 바람직한 특성을 제공해주는, 공유적으로 연결된 잔기를 포함하는 분자가 포함된다. 예를 들어, 이러한 잔기는 표지물(예; 탐지 가능한 표지물, 예를 들면, 형광 또는 방사성 표지물) 또는 약제학적 활성제일 수 있다.

항균성 시그널 분자 항체를 생성하기 위해, 표적 분자 또는 적합한 유도체를 2개의 상이한 캐리어 분자(단백질)에 접합시키는 것이 바람직하긴 하지만, 단일 접합된 종을 사용할 수도 있다. 세균성 시그널 분자는 일반적으로, 너무 작아서 생체내 면역 반응을 자극하지 못하거나, 또는 항체 라이브러리로부터 고 친화성 항체를 선별하기 위한 항원 공급원으로서 직접적으로 사용하지 못한다. 세포 시그널링 분자("항원"으로서 후술됨)에 특이적인 항체의 선별은 특이적 결합 쌍(sbp)의 제1 구성원 레퍼토리(라이브러리), 예를 들면, 필라멘트상 박테리오파아지 표면 상에 표시된 항체 라이브러리를 사용하는 바람직한 양태에서 수행한다. 수용체 라이브러리로부터 특이적 수용체를 선별할 수 있게 해주는 어떠한 기타 시스템도 본 발명의 방법에 적용할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 항원 접합체로 면역시킨 동물로부터 발생된 항체 분비성 하이브리도마 세포주 패널로부터, 시그널 분자-특이적 클론을 선별할 수 있다. 일반적인 예시 목적을 위해, 파아지 입자 상에 표시된 항체 결합 부위 라이브러리의 특정 예가 사용될 것이다.

단백질, 펩티드 또는 모든 천연 또는 합성 화합물 또는 물질일 수 있는 적합한 캐리어 분자에 커플링된 항원을 포함하는 접합체(본원에서 '접합체-1'로서 후술됨)를 적합한 고형 지지체, 예를 들면, '면역관(immunotube)' 또는 미세역가 판 상으로 고정화시키고, 피복되지 않은 표면을 비-특이적 차단제, 예를 들면, 분유(dried milk powder)로 차단시킨다. 적합한 접합체 분자에는 단백질, 예를 들면, 소의 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소의 티로글로불린(TG), 오브알부민(OVa), 또는 비-단백질, 예를 들면, 바이오틴이 포함될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 접합체 분자 선별에 대한 유일한 제한 사항은 이를 몇 가지 방식으로 고정화시킬 수 있다는 것과, 면역 반응을 유발시키기에 충분할 정도로 면역시켜야 한다는 것이다.

특이적 결합 쌍(sbp's)의 제1 구성원의 라이브러리('라이브러리')를 상기 고정화된 접합체에 적용하고, 접합체-1을 인식하는 sbp 구성원이 결합되기에 충분한 시간 동안 항온 배양한다. 접합체를 인식하지 않는 파아지는 엄격한 세척에 의해 제거한다. 결합된 채로 유지되는 파아지는, 예를 들어, 트리에틸아민 또는 기타 적합한 시약을 사용하여 완충 용액 내로 용출시켜 중성 pH로 복귀시킨다. 이어서, 회수한 파아지 입자를 적합한 숙주 유기체, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) 세균에 감염시키고 배양하여, 선별된 각 구성원의 수를 증폭시킴으로써 제2의 '증균' 라이브러리를 생성시킨다. 이어서, 이와 같이 증균된 라이브러리를 사용하여 상기 과정을 반복하여, 제2의 캐리어 단백질과 접합된 항원(접합체-2)을 인식하는 파아지-항체('파아지')에 대해 선별한다.

필요한 횟수 만큼 더 수행하는데, 이러한 선별 과정은 자유 형태의 항원을 인식하는 sbp 구성원 선별을 선호하도록 변경시킨다. 초기에는 접합체-1을 사용하고, 각각의 후속 주기 동안은 접합체-2(이용 가능한 경우)로 대체하면서, 전술된 바와 같은 항원 접합체에 대항한 파아지를 선별한다. 결합된 파아지는 이를, 결합된 형태의 항원에 대한 친화성이 더 높은 sbp 구성원이 상기 고정화된 접합체로부터 해리되기에 충분한 시간 동안, 자유 항원 또는 작은 가용성의 선별 가능한 잔기(예: 바이오틴)와 접합된 항원의 용액과 함께 항온 배양함으로써 용출시킨다. 자유 항원으로 용출시킨 파아지는 증폭 및 재선별을 위해 이. 콜라이 세포로 감염시키고, 고정화된 항원에 결합된 채로 있는 파아지는 버린다. 또 다른 한편, 덜 바람직하긴 하지만, 접합체와 결합하는 모든 항체를 예를 들어, 낮은 pH로 용출시킬 수 있다.

각 선별 주기로부터의 개개의(모노클로널) 파아지 클론을 대상으로 하여, 목적하는 결합 특징에 대해 스크리닝한다. 이는 요구 사항에 따라서 당업자에게 친숙한, SPR(표면 플라스몬 공명) 및 ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정)과 같은 기술을 포함한 각종 방법에 의해 수행할 수 있다. 선별 기준에는 접합 유도체의 존재 하에서 자유 가용성 형태의 항원과 우선적으로 결합하는 능력이 포함될 것이다.

본 발명의 바람직한 양태에서는, 항체가 본래의 사람 항체 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 발생될 것이다[참조: McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990; and WO 92/01047]. 따라서, 상기 항체는 진단용 또는 투석용 시약으로서 사용하는 것 이외에도 환자에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 진단 검정에서는, 상기 항체를 사용하여 환자에게서 HSL의 존재 여부와 이의 농도를 결정함으로써 환자의 감염 상태를 예측할 수 있다. 기타 양태에서는, HSL과 적합한 캐리어 분자의 하나 이상의 접합체로 예비-면역시킨 동물로부터 라이브러리를 작제할 수 있다. 추가의 대안은 상기 언급된 바와 같이 면역시킨 동물로부터 하이브리도마 세포주를 생성시키는 것이다. 후자 2가지 경우에서는, 예를 들어, 숙주 동물-사람 키메라 항체를 창출시키거나 또는 적합한 항체 골격 스캐폴드(scaffold) 상으로의 CDR 이식에 의해 "사람 적응화"시킴으로써, 상기 생성된 항체의 면역원성을 저하시키는 단계를 취하는 것이 바람직하다. 적용 가능한 기타 방법에는 상기 항체 내의 잠재적 T-세포 에피토프를 동정하는 방법과, 이들을 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이 유발에 의해 후속 제거하는 방법(탈-면역화 과정)이 포함될 것이다. 추가의 양태에서는, 상기 항체가 상이한 부류의 사람 면역글로불린(IgG, IgA 등)으로부터의 불변 영역을 포함하도록 공학적으로 처리할 수 있고, 이러한 항체를 동물 세포에서 완전한 항체 분자로서 생성시킬 수 있다. 특히, 이러한 접근법은 항체를 치료학적으로 사용해야 하는 경우에 요망된다.

본 발명의 경우, 항체는 모노클로널 또는 폴리클로널일 수 있다. 항체는 사람 또는 사람 적응화 항체일 수 있거나, 또는 기타 종으로부터의 투석/진단용 항체일 수 있다. Fab, F(ab')₂, Fv 또는 scFv와 같은 항체 단편 또는 유도체를 사용할 수도 있고, 예를 들어, 문헌[참조: Huston et al., Int. Rev. Immunol. 10: 195-217,1993]에 기재된 바와 같은 단일 쇄 항체, 도메인 항체(dAb), 예를 들면, 단일 도메인 항체, 또는 항체-유사 단일 도메인 항원-결합성 수용체일 수도 있다. 항체, 항체 단편 및 면역글로불린-유사 분자 이외에도, 세포-시그널링 분자의 결합을 억제함으로써 세균성 감염을 예방 또는 조정하는데 있어 항체의 결합 활성을 모방하도록 한 펩티드-유사체 또는 비-펩티드 유사체를 고안할 수 있다.

적합한 항체를 제조한 후, 통상적으로 이용 가능한 여러 기술들 중의 하나에 의해 분리 또는 정제할 수 있다[참조: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)]. 일반적으로, 적합한 기술로는 펩티드 또는 단백질 친화성 칼럼, HPLC 또는 RP-HPLC, 단백질 A 또는 단백질 G 칼럼 상에서의 정제, 또는 이들 기술의 조합이 있다. 재조합 항체는 표준 기술에 따라서 제조할 수 있고, ELISA, ABC, 도트-블롯 검정 등을 포함한, 일반적으로 이용 가능한 과정을 사용하여 특이성에 대해 검정할 수 있다.

락톤 시그널 분자는 호모세린 분자, 또는 펩티드 티오락톤 분자일 수 있다.

호모세린 락톤 분자는 다음 화학식 1 내지 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화학식을 가질 수 있다:

상기 식에서, n은 0 내지 12이다.

화학식 1의 화합물은 아실-호모세린 락톤 분자로서 기재될 수 있다. 화학식 2의 화합물은 3-옥소-호모세린 락톤으로서 기재될 수 있다. 화학식 3의 화합물은 3-하이드록시-호모세린 락톤으로서 기재될 수 있다.

화학식 1에 대한 바람직한 호모세린 락톤 분자는 N-부타노일-L-호모세린 락톤(BHL)(여기서, n은 0이다), N-도데카노일-L-호모세린 락톤(dDHL)(여기서, n은 8이다) 및 n-테트라데카노일-L-호모세린 락톤(tDHL)(여기서, n은 10이다)이다. 화학식 2에 대한 바람직한 호모세린 락톤 분자는 N-(-3-옥소헥사노일)-L-호모세린 락톤(OHHL)(여기서, n은 2이다) 및 N-(-3-옥소도데카노일)-L-호모세린 락톤(OdDHL)(여기서, n은 8이다)이다. 화학식 3에 대한 바람직한 호모세린 락톤 분자는 N-(-3-하이드록시부타노일)-L-호모세린 락톤(HBHL)(여기서, n은 0이다)이다.

일반적으로, 세균성 HSL은 2가지 부류로 추가로 나눌 수 있다: i) 장쇄 분자(10 내지 12개 탄소) 및 ii) 단쇄 분자(4 내지 8개 탄소). 슈도모나스 종에서는 이들 상이한 크기 부류가 상이한 R 분자와 결합하여 상이한 유전자가 작동 개시하도록 한다. 장쇄 분자는 LAS로서 공지된 R 상동체 유전자 생성물과 결합하고, 단쇄 분자는 RHL 단백질 상동체와 결합한다.

펩티드 티오락톤은 다음과 같은 화학식 4를 가질 수 있다:

상기 식에서, X는 모든 아미노산이고, n은 1 내지 10이다.

상기 및 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 아미노산 잔사는 통상의 IUPAC 단문자 명명법에 의해 명칭된다. 단문자 명칭은 다음과 같은 아미노산 잔사의 전통적인 3 문자 명칭과 상관있을 수 있다:

A=Ala G=Gly M=Met S=Ser

C=Cys H=His N=Asn T=Thr

D=Asp I=Ile P=Pro V=Val

E=Glu K=Lys Q=Gln W=Trp

F=Phe L=Leu R=Arg Y=Tyr.

바람직한 펩티드 티오락톤 분자는 다음 구조를 가질 수 있다:

각종의 작은 시그널 분자를 사용하여 세포들 간을 전염시키는 세균 종의 수가 증가하는 것으로 밝혀졌다. 그람 음성 세균은 N-아실 호모세린 락톤을 우선적으로 사용한다(표 1). 후자는 공통의 호모세린 락톤 환 구조를 공유하고 있고 측쇄 길이와 구조 면에서 다양한 화합물 그룹이다. 이러한 그룹 내에는 3가지 부류, 즉 아실-호모세린 락톤, 3-옥소-호모세린 락톤 및 3-하이드록시-호모세린 락톤이 있다. 단일 종이 생성되어 한 가지 이상 부류의 구성원에 반응할 수 있다.

락톤-유도된 시그널 분자는 푸라노실 보레이트 디에스테르, 예를 들면, 자가-유도인자-2 또는 AI-2, 프로-AI-2 또는 프로-AI-2-반응성 합텐일 수 있다(도 1b). 비브리오 하르베이(Vibrio harveyi) 및 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)와 같은 많은 그람 음성 및 그람 양성 유기체는 호모세린 락톤과 동일한 S-아데노실메티오닌 공급원으로부터 유도되는 제2의 시그널 분자인 AI-2를 생산하여 수용체 LuxP와 결합된다(도 1b). AI-2는 광범위한 종에 의해 생성 및 인식되어 이러한 종에서 독성을 유도시키는 만능 세균성 시그널 분자인 것으로 여겨진다.

자가 유도인자-2(AI-2):

AI-2는 2,3-디하이드록시-4-메틸-3,4-보레이트 디에스테르로서 기재될 수 있다.

락톤-유도된 시그널 분자는 4,5-디하이드록시-2,3-펜탄디온(DPD)의 유도체일 수 있는데, 이는 본래 폐환되어 프로-AI-2를 형성하며, 이는 자연적으로 붕산과 반응하여 AI-2를 형성한다(도 1b). 프로-AI-2는 2,4-디하이드록시-4-메틸-푸란-3-온으로서 기재될 수 있다. 프로-AI-2는 도 1b에 제시된 바와 같이, 헵타노산 잔기를 가하기 위해 4-메틸 위치에서 유도체화하여 프로-AI-2 반응성 합텐을 형성시킬 수 있다. 기타 유도체에는 기타 직쇄 또는 측쇄의 포화 또는 불포화 C₁-C₁₀ 카복실산 잔기, 예를 들면, 메타노산, 에타노산, 프로파노산, 펜타노산, 헥사노산, 헵타노산, 옥타노산, 노나노산 또는 데카노산이 포함될 수 있다.

프로-AI-2:

프로-AI-2 반응성 합텐:

스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 같은 그람 양성 세균은 짧은 펩티드를 이용한다(도 1c)[참조: Mayville et al., 1999]. 세포는 국소 세포 밀도를 결정하기 위한 수단으로서 상기 분자를 이용하므로, 낮은 세포 밀도 조건 하에서는 시그널 분자의 농도가 상응하게 낮다. 높은 세포 밀도에서는 국소 시그널 분자 농도가 높다. 이러한 농도가 한계 수준에 도달하게 되면, 이는 숙주 내에서의 질병 상태 개시와 독성에 관여한 유전자의 전사를 유도시킨다.

스타필로코쿠스 종에 의해 사용된 티오락톤 유도체화 펩티드 시그널 분자는 부가의 생물학적 기능을 지닌다. 이들은 국소 집단 밀도에 관한 정보를 상기 세균에 제공할 뿐만 아니라 상이한 아-그룹에 속하는 기타 에스. 아우레우스(S. aureus) 내의 독성을 억제시키는 작용을 한다[참조: Lyon et al., 2000]. 이러한 이중-기능성은 기타 아-그룹에서의 독성을 억제시키는 티오락톤 C-말단을 지닌, 해당 펩티드의 상이한 구조적 요소들 간을 분리시킨다. 변형되지 않은 N-말단은, 또한 요구되기도 하는 C-말단과 연계해서만이 시그널을 합성한 아-그룹에서의 독성 유전자 발현을 상향 조절하기 위해 시그널로서 작용한다. 티오락톤 연쇄를 수반한 C-말단의 5개 아미노산을 포함하는 절단된 펩티드의 존재로 인해, 기타 3가지 아-그룹을 억제시킬 뿐만 아니라 이를 생산하는 균주를 억제시킬 수 있다. 따라서, 이로써, 시그널 펩티드의 N-말단을 인식하고, 노출된 채로 둠으로써 C-말단을 효과적으로 표시하는 항체가 모든 에스. 아우레우스(S. aureus) 균주의 독성을 효과적으로 억제시킬 것이다. 따라서, 본 발명의 항체는 상기 언급된 바와 같은 티오락톤 분자에 의해 제시된 에피토프 또는 이의 구조적 요소, 예를 들면, 펩티드 서열 또는 티오락톤 잔기에 대항하여 생성될 수 있다.

본 발명의 특정의 바람직한 양태에서는, 항체가 scAb, 특히 XLl-Blue G3H5, G3B12, G3G2 및/또는 G3H3으로서 명명된 이. 콜라이 클론으로부터 수득되는 scAb이다. 이들 클론은 부다페스트 조약 하에 2003년 3월 18일자로 NCIMB(Aberdeen, UK)에 다음 수탁 번호로 기탁되었다: G3H5는 수탁 번호 NCIMB-41167로서 기탁되었고, G3B12는 수탁 번호 NCIMB-41168로서 기탁되었으며, G3G2는 수탁 번호 NCIMB-41169로서 기탁되었고 G3H3은 수탁 번호 NCIMB-41170로서 기탁되었다. 상기 균주는 공기 중에서 37℃의 표준 조건 하에, 적당한 성장 배지, 예를 들면, 100㎍/ml 앰피실린이 보충되고, 임의로 12.5㎍/ml 테트라사이클린, 및/또는 1% 글루코스가 보충된 LB 배지에서 배양할 수 있다.

세균성 시그널링 분자는 연구 대상의 모든 유기체에서 발견된다. 이는 모든 종에 적용 가능한, 도처에 널린 시스템인 것으로 여겨진다. 주요 차이는 모든 그람 음성(그람-) 세균은 호모세린 락톤계 분자를 이용하고, 그람 양성(그람+) 세균은 (변형된) 작은 펩티드를 이용한다는 것이다. 비브리오 하르베이(Vibrio harveyi) 및 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)와 같은 많은 그람 음성 및 그람 양성 유기체(Jones, M.B. and Blaser, M.J.)는 호모세린 락톤과 마찬가지로, S-아데노실메티오닌으로부터 유도되는 작은 붕소-함유 유기 분자 AI-2(자가 유도인자-2)를 사용하기도 한다. 이러한 분야에서의 선행 연구는, 인식하긴 하지만 기능하지 않는, 즉 전혀 병원성 전환되지 않는 것으로 시그널 분자를 모의하는데 집중되었거나 또는 다양한 수용체 시스템을 차단시키는 것에 집중되었다. 이들 방법의 단점은 주로, 이러한 모의 또는 차단에 대한 내성이 발생할 수 있고, '실제의(real)' 시그널 분자가 여전히 존재하여, 결합을 놓고 서로 경쟁할 것이라는 점이다. 또한, 일부 세균성 시그널링 분자, 예를 들면, 호모세린 락톤은 당연히 독성 인자이기 때문에, 숙주(즉, 환자)의 면역 억제를 직접적으로 유발시킬 수 있다. 본 발명의 본질은 실제적 시그널 분자를 표적으로 하므로, 이를 모든 세균 세포-대-세포 시그널링 시스템(그람 음성 및 그람 양성)에 적용할 수 있다. 이러한 접근법은 세균이 자신이 공격하는 대상을 인식하지 못하고, 이들이 단독으로 존재하는 것으로 간단히 탐지해 버린다는 점에서, 본 분야에서의 기존의 모든 노력에 비해 중요하고도 결정적인 이점을 지니고 있다. 내성에 대한 어떠한 선택적인 압박도 없을 것이다.

본 발명의 제2 국면에 따르면, 본 발명의 제1 국면에서 규정된 바와 같은 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.

이러한 조성물은 약제학 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들면, 활성 성분을 멸균 조건 하에 담체(들), 희석제(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 적당한 어떠한 경로로든 투여할 수 있도록 적응시키는데, 예를 들면, 경구(볼 또는 설파 투여 포함), 직장, 비내, 국소(볼, 설하 또는 경피 투여 포함), 질 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 또는 피내 투여 포함) 경로가 있다. 이러한 조성물은 약제학 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들면, 활성 성분을 멸균 조건 하에 담체(들) 또는 부형제(들)와 혼합함으로써 제조할 수 있다.

경구 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 별개의 단위, 예를 들면, 캅셀제 또는 정제로서; 산제 또는 과립제로서; 용제, 시럽 또는 현탁제로서(수성 또는 비-수성 액상물 중; 식용 발포제 또는 휩(whip)으로서; 또는 에멀션으로서) 제시될 수 있다.

정제 또는 경질 젤라틴 캅셀제에 적합한 부형제로는 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염이 있다.

연질 젤라틴 캅셀제에 사용하기 적합한 부형제로는 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형물 또는 액상 폴리올 등이 있다.

용제 및 시럽제를 제조하기 위해 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들어, 물, 폴리올 및 당이 있다. 현탁제를 제조하기 위해, 오일(예: 식물성 오일)을 사용하여 수중유 또는 유중수 현탁제를 제공할 수 있다.

경피 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 친밀하게 접촉될 수 있도록 하기 위한 별개의 패치로서 제시될 수 있다. 예를 들어, 활성 성분은 문헌[참조: Pharmaceutical Research, 3(6), page 318 (1986)]에 일반적으로 기재되어 있는 바와 같이 이온영동(iontophoresis)에 의해 패치로부터 전달될 수 있다.

국소 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 연고, 크림, 현탁제, 로션, 산제, 용제, 페이스트, 젤, 분무제, 에어로솔 또는 오일로서 제형화할 수 있다. 눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들면, 입 및 피부 감염의 경우에는, 상기 조성물을 국소 연고 또는 크림으로서 투여하는 것이 바람직하다. 연고로 제형화하는 경우에는, 활성 물질을 파라핀계 또는 수-혼화성 연고 기제와 함께 이용할 수 있다. 또 다른 한편, 활성 성분을 수중유 크림 기제 또는 유중수 크림 기제와 함께 크림으로 제형화할 수 있다. 눈에 국소 투여하도록 적응시킨 약제학적 조성물에는 활성 성분을 적합한 담체, 특히 수성 용매에 용해 또는 현탁시킨 점안약이 포함된다. 국소 구강 투여하도록 적응시킨 약제학적 조성물에는 로젠지(lozenge), 향정 및 구강 세척제가 포함된다.

직장 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 좌제 또는 관장제로서 제시될 수 있다.

담체가 고형물인 비내 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물에는 코로 들이쉬는 방식으로 투여되는, 즉 코 앞까지 분말 수용 용기로부터 비도(nasal passage)를 통하여 신속하게 흡입되는, 입자 크기가 예를 들어 20 내지 500 마이크론인 조악한(굵은) 산제가 포함된다. 담체가 액상물인, 예를 들어, 비내 분무제 또는 비내 점적제로서 투여하기에 적합한 조성물에는 활성 성분의 수성 또는 오일 용제가 포함된다.

흡입 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물에는 각종 유형의 계량 가압 에어로솔, 연무기 또는 흡입기를 통하여 발생될 수 있는 미립자 분제 또는 미스트(mist)가 포함된다.

질내 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물은 페사리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 발포제 또는 분무용 제형으로서 제시될 수 있다.

비경구 투여용으로 적응시킨 약제학적 조성물에는 산화방지제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 용질(이는 해당 제형이 의도한 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성이 되도록 한다)을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제가 포함된다. 주사용 용제에 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어, 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 방부제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 취기제, 염(본 발명의 물질은 그 자체가 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 제공될 수 있다), 완충제, 피복제 또는 산화방지제를 함유할 수 있다. 이들은 본 발명의 물질 이외의 치료학적 활성제를 함유할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 치료하고자 하는 질병 또는 장애, 치료하고자 하는 개개인의 연령과 상태 등에 따라서 광범위하게 다양할 수 있고, 담당의는 궁극적으로 적당한 투여량을 결정하여 사용할 수 있을 것이다.

이러한 조성물은 인체 또는 수의용으로 제형화할 수 있다. 본 출원은 달리 언급되지 않는 한, 사람 뿐만 아니라 동물에게도 동등하게 적용되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 제3 국면에 따르면, 특정 대상체에게 본 발명의 제1 국면의 항체를 투여하는 것을 포함하여, 이러한 대상체에게서 세균성 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

질병 상태를 유발시키는 것으로 밝혀진 세균의 예가 표 1에 나타나 있다. 따라서, 이러한 본 발명의 국면의 방법은 특정 대상체에서 표 1에 나타낸 바와 같은 세균 균주에 의한 감염을 치료하는 방법으로 확대된다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, 대상체에게서 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 치료학적 물질은 사람 또는 비-사람 동물의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료는 예방적일 수 있거나 또는 기존의 질환에 관한 것일 수 있다.

항체는 보통 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하게 될 멸균성 약제학적 조성물의 일부로서 통상 공급될 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 (환자에게 투여하고자 하는 투여 방법에 따라서) 적합한 어떠한 형태일 수 있다.

이는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 일반적으로 밀봉된 용기 내에 제공될 것이며 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트 일부는 통상적으로(반드시 그런 것은 아니다) 사용에 관한 지시 사항을 포함한다. 이는 다수의 단위 투여 형태를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 단기간 또는 장기간의 급성 또는 만성 질환/질병에 적용할 수 있고, 식물과 동물(사람 포함)의 대부분 또는 모든 세균 병원체에 대해 유효하다. 본 발명은 또한, 병원성 세균에 노출될 위험이 있거나 노출된 개개인에게서의 질병 개시를 방지하기 위한 예방적 처치로서 사용할 수 있다. 본 발명은 또한, 많은 감염으로부터 비롯되는 면역계의 하향 조절을 제한하거나 방지하는 잠재력을 지니고, 이는 특히 암, 낭포성 섬유증, AIDS 및 기타 면역 억제성 질환 환자에 관계된다. 추가로, 본 발명의 방법은 세균 세포 자체를 일차적 목표로 하는 것이 아니라, 특히 세균 세포 시그널링 분자에 관한 것이기 때문에, 언급된 치료에 대한 내성을 발생시키는 세균 집단에 대해 선택적인 압박을 가할 필요가 없을 것이다.

본 발명의 항체는 세균성 감염을 조정 및 저하시키기 위해, 감염된 환자에게 투여할 수 있다. 이에는 낭포성 섬유증 환자가 자신의 수명을 연장 위해 항체를 에어로솔로 흡입하는 것이 포함될 수 있다.

또 다른 양태에서는, 본 발명의 항체를 면역 억제된 환자에게 투여하여 면역-적격성을 증가시킨다.

또 다른 양태에서는, 면역원성 단백질에 대한 세포 시그널링 분자의 접합체를 개개인 또는 환자에게 투여하여, 중화 항체의 생성을 가져다 주는 시그널링 분자에 대항한 면역 반응을 자극할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 항체를 면역-진단용 시약으로서 사용하여, 예를 들어, 환자의 혈류 또는 흉수(pleural fluid)에 잠재적 병원체가 존재하고/하거나 병원성 상태인지를 탐지한다.

또 다른 양태에서는, 항체를 면역-포획용 시약으로서 사용하여, 환자 혈액으로부터 세균 세포 시그널링 분자를 투석 형태로 선택적으로 제거한다.

또 다른 양태에서는, 감염성 미생물의 병원성과 독성을 조정할 목적으로 환자 혈액으로부터 세균 세포-세포 시그널링 분자를 제거하기 위해, 대체 방법을 적용할 수 있다. 이는 상기 시그널 분자와 결합하는 천연 수용체에 근거한 기타 천연 수용체 또는 분자에 의해 달성될 수 있다. 또 다른 한편, 비-천연 수용체, 예를 들면, 분자상 각인된 중합체(MIP)를 적용할 수도 있다. 이러한 부류의 수용체는 저 분자량 바이오-분자, 예를 들면, 약물[참조: Hart et al., 2000] 및 스테로이드[참조: Whitcombe et al., 1995; Ramstrom et al., 1996; Rachkov et al., 2000]과 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 이미 밝혀졌다. 추가의 대안에서는, 신장 투석과 마찬가지로 환자 혈액으로부터 모든 저 분자량 분자를 비-특이적으로 제거함으로써 투석을 달성할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 상기 수용체가 촉매적 또는 효소적 활성을 지닐 수 있고, 세포 시그널링 분자를, 더 이상 표적 유기체에 의해 인식되지 않거나 더 이상 병원성 전환되지 않는 형태로 전환시킬 수 있다.

또 다른 양태에서는, 항체를 한 가지 이상의 상기 적용에서 서로 조합하여 사용하거나 또는 다른 치료제, 예를 들면, 항생제와 조합하여 사용하여, 부가의 증강된 치료 섭생, 질병 모니터링 및 치료 관리를 제공한다.

본 발명의 항체(또는 등가물)은 세균성 감염을 치료하기 위해 투여하거나, 또는 감염 위험이 높은 대상체에 대한 예방적 조치로서 사용될 수 있다. 이미 감염된 경우에는, 본 발명의 항체를 단독으로, 또는 항균성 항체, 항생제 또는 기타 항미생물 치료와 조합하여 투여할 수 있다. 항-HSL 항체를 기타 치료법과 연계해서 투여함으로써, 치료제를 보다 단기간 또는 저 용량으로 사용할 수 있기 때문에, 내성 발생 위험이 줄어들고 환자 응락도가 향상된다.

본 발명의 제4 국면에 따르면, 의약에 사용하기 위한, 제1 국면에서 규정된 바와 같은 항체가 제공된다.

본 발명의 제5 국면에 따르면, 세균성 감염 치료용 약제를 제조하는데 있어서의, 제1 국면에서 규정된 바와 같은 항체의 용도가 제공된다.

본 발명의 제6 국면에 따르면, 세균성 락톤 시그널 분자를 캐리어 분자에 접합시키는 단계; 및 이와 같이 형성된 접합체를 사용하여, 특이적 결합 분자 집단으로부터 상기 접합체와 특이적으로 결합하는 특이적 결합 분자를 동정하는 단계를 포함하는, 항균성의 특이적 결합 분자를 알아보기 위해, 특이적 결합 분자 집단을 스크리닝하는 방법이 제공된다.

따라서, 이러한 방법은 예를 들어, 세균성 감염을 치료하는데 있어서 항균제로서 사용할 수 있는 특이적 결합 분자를 동정하기 위한 수단이다. 이러한 특이적 결합 분자는 항체 또는 이의 단편, 예를 들면, 모노클로널 항체 또는 폴리클로널 항체이다. 적합하게는 상기 캐리어 분자가 상기 언급된 바와 같은 단백질이다. 특이적 결합 분자 집단은 파아지 디스플레이 라이브러리일 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 동정된 특이적 결합 분자는 상기 언급된 바와 같은 치료 방법 또는 의약에 사용할 수 있다. 특이적 결합 분자는 세균성 감염 치료용 약제를 제조하는데 추가로 사용될 수 있다.

따라서, 상기 방법은 세균성 락톤 시그널 분자를 특이적 결합 분자 집단의 스크리닝에 사용하여, 이러한 세균성 락톤 시그널 분자와 특이적으로 결합하는 특이적 결합 분자를 동정하는데 까지로 그 적용 범위가 확대된다.

본 발명의 제7 국면에 따르면, 특정 대상체로부터의 샘플 중의 세균성 락톤 시그널 분자를 분리하는 단계; 이러한 세균성 락톤 시그널 분자를 사용하여, 항균성의 특이적 결합 분자를 알아보기 위해 특이적 결합 분자 집단을 스크리닝함으로써, 상기 시그널 분자와 특이적으로 결합하는 특이적 결합 분자를 동정하는 단계; 및 이와 같이 동정된 특이적 결합 분자를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 대상체에서의 세균성 감염을 치료하는 방법이 제공된다.

이러한 방법을 사용함으로써, 해당 시그널링 분자가 샘플 중에 존재하는 것으로 밝혀진 감염성 세균 유기체에 대항한 특이적 결합 분자를 동정할 수 있다. 이러한 샘플로는 혈액, 타액, 조직, 뇌척수액, 눈물, 정액, 뇨, 대변, 고름, 피부 또는 점액 분비물일 수 있다. 혈액 샘플은 전혈, 또는 분할혈(fractionated blood), 예를 들면, 혈장일 수 있다. 조직 샘플은 이미 감염되었거나 감염될 가능성이 있는 조직 또는 기관의 생검일 수 있다. 샘플은 상처 또는 손상 부위로부터 취하거나 감염 또는 잠재적 감염 부위로부터 취할 수 있다. 폐, 또는 위 또는 장기 내용물로부터의 유체 샘플을 사용할 수도 있다.

본 발명의 제2 국면 및 후속 국면에 대한 바람직한 특징들은 제1 국면에 필요한 변경을 가한 것이다.

식물 및 동물 숙주에 있어서의 관련 적용을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점들은 당업자가 본 발명의 명세서와 청구의 범위를 고찰해보면 명백해질 것이다.

본원에 기재된 조성물 및 방법이 감염으로부터 비롯된 질병 또는 질환을 억제, 조정, 치료 또는 진단하는데 있어서 광범위한 유기체에 걸쳐 적용할 수 있다는 사실이 당업자에게는 명백할 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 참조로 하여 기재되긴 하지만, 당업자는 이를 기타 종에게도 적용할 수 있다.

본 발명은 세균 세포 시그널링 분자의 세포외 농도를 조정함으로써 감염성 세균의 독성을 제어하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 세포 시그널링 분자의 유도체를 적합한 캐리어 단백질에 접합시키고, 이를 사용하여, 본래의 시그널 분자(들)를 인식하는 고 친화성 수용체를 분리한다. 시그널링 분자와 결합함으로써, 수용체는 시그널 분자의 세포외 농도를, 특정의 기회 병원체를 독성 형태로 적응시키게 하는 한계 수준 이하로 감소 및 유지시키고, 독성 유기체를 비-독성 상태로 변환시킬 수 있다.

도 1a에는 3가지 대표적 부류의 호모세린 락톤 세균 세포 시그널링 분자의 화학적 구조가 도시되어 있다. 이들은 위치 C3에서의 치환에 있어 상이하고, 아실 측쇄의 길이(전형적으로 n=0 내지 n=10이다)가 각 부류 마다 다양하다. 또한, 아실 쇄 내에 시스-결합이 존재할 수도 있다. 도 1b에는 i) AI-2의 즉시 전구체인 프로-AI-2, ii) 붕소 함유 활성 AI-2 분자 및 iii) 접합체를 만들기 위해 사용된 반응성 프로-AI-2 합텐의 구조가 도시되어 있고; 도 1c에는 i) 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 그룹 I, ii) 에스. 아우레우스(S. aureus) 그룹 II, iii) 에스. 아우레우스(S. aureus) 그룹 III, 및 iv) 에스. 아우레우스(S. aureus) 그룹 IV에 의해 사용된 티오락톤 펩티드 시그널링 분자의 예가 도시되어 있다.
도 2에는 균체 밀도 또는 세포 밀도 의존적 감지 기구의 유전적 조절이 예시되어 있다. 세포 시그널링 기전은 다음 2가지 성분으로 이루어진다: 1) I 유전자(lasI 및 rhlI) 상동체는 성장 내내 증가 량의 세균 세포 시그널링 분자(HSLs)를 합성한다(이로써 균체 밀도를 탐지한다); 2) 궁극적으로 일련의 특정한 유전자(오페론) 상에서 작동(전환)될 수 있는 동종 R 단백질 상동체(lasR 및 rhlR에 의해 암호화됨)에 대한 시그널링 분자의 농도-의존적 결합으로 인해, 세균이 밀도 의존적 표현형별 전환(예: 독성, 유주)에 협조할 수 있다.
도 3에는 플라스미드 pSB1075를 사용하는 생물 발광성 리포터 유전자 검정의 주요 원리가 예시되어 있다. 광 배출량의 감소는 세균 세포 시그널링의 성공적인 차단을 지시해준다.
도 4는 불활성 컬럼 매트릭스 상에 고정화된 HSL-특이적 및 무관한 단일 쇄 항체가 면역-친화성 포획에 의해 용액으로부터 HLS를 제거할 수 있는 능력을 비교 도시한 것이다. 칼럼 용출액을 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri)의 이. 콜라이 대용물(JM107-pSB401)에 적용하였고, 이러한 용출액 중의 잔류성 HSL의 효과는 세균성 배양물을 형광시키기 위한 후속 자극으로부터 결정하였는데, 이는 RLU에 의해 측정하였다. ScAbs G3B12 및 G3G2는 HSL-특이적이고, 항-VZV는 바이러스성 단백질에 대해 특이적이며, 항-파라쿼트(anti-Paraquat) 및 항-아트라진(anti-Atrazine)은 분자량이 HSL 분자와 유사한 제초제에 대해 특이적이고, 레진 대조군은 고정화된 scAb를 전혀 함유하지 않았다. 데이터는 2가지 별개 검정으로부터의 3회 반복 샘플 평균치를 나타낸다. 표준 오차가 지시되어 있다.
도 5는 생물 발광 배출량으로써 측정된 바와 같은, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)의 이. 콜라이 대용물(JM109-pSB1075)의 dDHL-매개된 자극에 대한 특이적 및 무관한 단일 쇄 항체의 억제 효과를 도시한 것이다. HSL-특이적 scAb G3H5(●), 비-특이적 대조군 scAb(▼)(병원성 세균 표면 단백질에 대해 특이적임), 및 scAb의 부재 하(○)에서의 데이터가 제시되어 있다. 데이터 점은 반복 검정으로부터의 3회 반복 샘플 평균치를 나타낸다.
도 6은 생물 발광 배출량으로써 측정된 바와 같은, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa)의 이. 콜라이 대용물(JM109-pSB1075)의 tDHL-매개된 자극에 대한 특이적 및 무관한 단일 쇄 항체의 억제 효과를 도시한 것이다. 3가지 HSL-특이적 scAb: G3H3(●), G3G2(■) 및 G3B12(□), 무관한 항-V scAb(○)(병원성 세균 표면 단백질에 대해 특이적임), 및 scAb의 부재 하(▽)에서의 데이터가 제시되어 있다. 데이터 점은 반복 검정으로부터의 3회 반복 샘플 평균치를 나타낸다.
도 7은 (a) 60분 후 및 (b) 150분 후 생물 발광 배출량으로써 측정된 바와 같은, 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) Rrhl 시스템(단쇄 HSL 반응성)의 이. 콜라이 대용물(JM109-pSB406)의 BHL-매개된 자극에 대한 특이적 및 무관한(비-특이적) 단일 쇄 항체의 억제 효과를 도시한 것이다. G3H5, G3B12 및 G3H3 항체, 비-특이적 대조군 항체(병원성 세균 표면 단백질에 대해 특이적임), 및 항체 부재 하(PBS 완충액 만을 함유함)에서의 데이터가 제시되어 있다. 데이터 점은 반복 검정으로부터의 3회 반복 샘플 평균치를 나타낸다.
도 8은 (a) 세균성 병원체 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주 PA14 및 (b) 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주 PA01에 의한 감염으로부터 선충류를 보호해주는 G3H5 및 G3B12 항체의 능력을 입증해주는 느린 사멸 선충류 검정을 도시한 것이다.
도 9는 자유 펩티드 'YSTGGAGSGG' 또는 자유 티오락톤 펩티드 Agr-DI(도 1c 참조)의 존재하 또는 부재하의 BSA-펩티드 접합체, 또는 BSA 대조군에 대한 항-펩티드 scAb YST-1 결합에 대한 경쟁적 ELISA 데이터를 도시한 것이다.
표의 간단한 설명
표 1에는 특정 범위의 유기체에 대한 각종 세균성 표현형이, 이들을 조절하는 균체 밀도 탐지 기구 시스템의 조절 요소 및 세포 시그널링 분자와 함께 열거되어 있다.
표 2에는 경쟁적 억제 ELISA에 의해 결정된 바와 같이, dDHL-BSA와 경쟁하는데 있어서 자유 항원(dDHL-COOH) 및 2개 AHL 동족체(tDHA 및 OHHL)에 대한 항-AHL scAbs의 민감도(IC₅₀)가 요약되어 있다.
표 3은 BIAcore 2000 기구를 사용한 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 고정화된 dDHL-BSA 접합체에 대한 2개의 항-AHL scAbs의 결합 역학을 비교한 것이다. 결합 상수(ka), 해리 상수(kd) 및 친화 상수(KA,KD)가 제시된다.
표 4에는 각종 HSLs에 대한, 연쇄-셔플링(chain-shuffling)으로부터 유도된 항-HSL 클론의 민감도(IC₅₀)가 요약되어 있다. 각각의 새로운 클론 아래에 표기된 괄호( ) 안의 것은 해당물을 유도시킨 클론의 명칭이다. 신규한 클론의 항원에 대한 민감도가 출발 클론에 비해 증가한 정도를, 적용 가능한 경우에 괄호( )에 제시하였다. 경쟁적 ELISA에 의해 결정된 바와 같이, 제시된 데이터는 dDHL-TG 접합체와 경쟁하는 자유 HSLs에 대한 결합을 비교한 것이다.
표 5에는 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)에 의한 독성 인자 엘라스타제의 발현을 저하시키는데 있어서의 항-HSL scAbs의 효과가 제시되어 있다. 데이터는 콜로니 부위에 대한 클리어런스 영역(clearance zone) 비를 나타낸 것인데,이는 PBS 대조군(100%)과 비교한 비율(%)로서 표현된다.
[표 1]

[표 2]

[표 3]

[표 4]

[표 5]

본 발명은 다음에 상세된 비-제한적 실시예와 도면을 참조로 하여 추가로 기재될 것이다.

실시예 1

본원에 기재된 실시예는 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 관한 것이다. 이들은 단지 예로서 제시된 것이며, 본 발명의 범위가 이러한 예로 제한되는 것이 아니라, 독성 또는 병원성과 관련된 유전자의 발현을 직접 또는 간접적으로 조절하는 모든 세균 세포-대-세포 시그널링 분자를 포함하고, 또한 세균 세포에 대한 기타 시그널 분자-유도된 표현형별 변화(예를 들어, 생물 발광성이 있지만, 이에 제한되지 않는다)를 포함한다.

'링커'로서 작용하는 12개 탄소 아실 쇄를 갖고 카복실산 그룹에서 종결된 HSL의 유도체(dDHL-COOH로 명명됨)를 합성하였다(도 1 참조). 이를 카복실산 그룹을 통하여, 캐리어 단백질 소 혈청 알부빈(BSA) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 접합시켜 dDHL-BSA 및 dDHL-KLH를 생성시켰다. 간략하게 언급하면, 4℃에서, 50mg BSA 또는 KLH를 1.67ml 물에 용해시키고, 이에 pH 8.5의 2mM KH₂PO₄ 3.3ml를 가하였다. 이에, 1.05ml의 무수 디메틸포름아미드(DMF)를 교반시키면서 적가하였다. 10 밀리그램의 dDHL-COOH의 활성화 N-하이드록시석신이미드 에스테르를 100㎕ 무수 DMF에 용해시키고, 4℃ 하에 캐리어 단백질 용액에 다시 서서히 가하였다. 이 반응 혼합물을 잘 교반시키고, 4℃에서 24시간 동안 정치시켜 두었다. 이어서, 접합된 물질을 4 x 1 리터 물에 대해 투석시키고, MALDITOF 질량 분광법에 의해 접합을 확인하였다.

용어 '링커'는 합텐(항원)이 (바람직하게는) 면역원성 캐리어 분자에 부착될 수 있도록 해줌으로써 합텐이 상기 캐리어 표면으로부터 떨어진 곳에 표시되도록 하기 위해 사용되는 모든 화학 그룹을 지칭한다.

본 발명의 또 다른 목적에서는, 기타 캐리어 분자, 예를 들면, 자기 비드 또는 바이오틴, 및 기타 링커 및 접합 전략을 이용할 수 있다. 이어서, 2가지 접합 형태의 dDHL를 사용하여 항체 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하였다. 간략하게 언급하면, 이러한 라이브러리를 대상으로 하여, 바이오-패닝 총 3회전 스크리닝하였다. 각 회마다, dDHL-접합체를 고체 지지체 상에 고정화시키고, 이러한 접합체를 인식하는 파아지-항체가 결합하기에 충분한 시간 동안 파아지-항체 라이브러리와 함께 항온 배양하였다. 결합되지 않은 파아지는 PBS(인산염 완충 식염수) 및 PBS-트윈으로 엄격하게 세척함으로써 제거하고, 결합된 나머지 파아지는 낮은 pH에서 항온 배양함으로써 용출시켰다(1회전). 이어서, 이와 같이 용출된 파아지를 이. 콜라이 세균에 감염시키고 당업자에게 잘 알려진 방법으로 증폭시켰다. 이로써 증폭된 증균 클론의 라이브러리를 다음 패닝 주기(회전)에 사용하였다. 캐리어 단백질을 인식하는 것으로 선별된 클론의 수를 감소시키기 위해, 고정화된 접합체(dDHL-BSA 또는 dDHL-KLH)를 계속되는 선별 주기에 교대로 사용하였다. 특이적 HSL을 인식하는 클론을 선호하는 경향으로 선별하기 위해, 오히려 낮은 pH 하에서도 2회전 및 3회전 동안 파아지-항체를 경쟁적으로 용출시키는 것으로 선택된 HSL(dDHL-COOH)을 사용하였다. 3회전으로부터의 개개의 파아지 클론을 ELISA에 의해 스크리닝하였는데: 각각의 dDHA-접합체와 결합하는 능력과 캐리어 단백질 단독과 결합하는 능력을 알아보기 위해, 각 클론을 대상으로 하여 초기에 검정하였다. 접합체에 대한 결합이 용액 중의 자유 dDHL-COOH의 존재에 의해 억제될 수 있었는지를 확인해 보기 위해, 양 접합체와는 결합할 수는 있지만 어느 한 캐리어 단백질과도 결합할 수 없는 클론을 대상으로 하여 추가의 검정을 수행하였다. 자유 dDHL-COOH과 결합하는 것으로 밝혀진 파아지 클론으로부터의 항체 가변 영역 유전자를 가용성 발현 벡터(pIMS 147) 내로 아클로닝시키면, 이는 가요성 펩티드 링커에 의해 연결된 가변 중쇄 및 경쇄 도메인과, 사람 항체로부터의 카파 불변 도메인을 포함하는 가용성 단일 쇄 항체 단편(scAb)로서 생성되었다. 자유 HSL에 대한 가용성 scAb의 결합의 정량화는 경쟁적 억제 ELISA에 의해 결정되었다. 선별된 각 scAb의 일정한 농도(1 마이크로그램/ml dDHL-BSA를 기준함)를 함유하는 샘플을 특정 농도 범위의 자유 dDHL-COOH(또는 dDHL-접합체)와 함께 1시간 동안 항온 배양한 다음, dDHL-BSA로 피복된 ELISA 판에 적용하였다. 1시간 동안 항온 배양한 후, 결합되지 않은 scAb를 세척 제거하고, 고정화된 접합체에 결합된 채로 잔존하는 모든 scAb를 효소-표지된 항-사람 카파 항체로 탐지하였다. dDHL-BSA에 대한 scAb(자유 항원을 수반하지 않음)의 결합을 50% 정도 감소시키는 자유 항원의 농도(IC₅₀)로부터, 자유 dDHL-COOH에 대한 scAb의 민감도와, 기타 HSL(tDHL 및 OHHL)과의 교차 반응성을 결정하였다(표 2).

dDHL-BSA에 대한 항-HSL scAb 결합에 대한 결합 역학은 BIAcore 2000(BIAcore, Sweden)을 사용하여 결정하였다. CM5 칩을 0.2M EDC [1-3-(3-디메틸-아미노프로필)카보디이미드-HCl]/0.05M NHS(N-하이드록시-석신이미드)로 활성화시키고, dDHL-BSA 또는 BSA 단독을, 각각 pH 3.5 또는 4.5 하의 10nM Na-아세테이트 중의 상기 칩에 커플링시켰다. 일련의 10가지 농도의 scAb(100 내지 1000nM)을 대상으로 하여, 20 마이크로리터/분의 유속으로 HBS 완충액 중에서 2회 검정하였다. 20 마이크로리터 100mM NaOH를 사용하여 샘플 사이에 칩을 재생시켰다. BIAevaluation 3 소프트웨어 패키지를 사용하여, 역학을 결정하였다(표 3).

6x 히스티딘 태그를 통하여 scAb를 칼럼 내의 닉켈-세파로즈 비드에 고정화시킨 다음, 이러한 칼럼 내로 OHHL 용액을 통과시킴으로서, OHHL과 결합하는 scAb G3B12의 능력을 추가로 검정하였다. scAb에 의해 결합되고 칼럼 내에 잔존하는 모든 OHHL를 후속 용출시켰다. 유통되는(즉, 결합되지 않은) 칼럼 내의 OHHL 농도와, 결합되어 나중에 용출되는 칼럼 내의 OHHL 농도를 결정하였다.

플라스미드 pSB401을 함유하는 이. 콜라이 균주 JM107[비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri) 반응 대용물] 및 플라스미드 pSB406 및 pSB406을 함유하는 JM109[슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 반응 대용물]을 사용하여, HSL과 결합하는 scAb의 능력과 AHL에 대한 세균의 반응을 조정하는 능력을 결정하였다. 리포터 플라스미드는 HSL 반응 조절인자 유전자 luxR(pSB401), lasR(pSB1075, 장쇄 HSLs에 반응성임) 또는 rhlR(pSB406, 단쇄 HSLs에 반응성임), 및 luxI 프로모터 영역을 함유하는데, 이는 외인성 HSL과 함께, 포토르하브두스 루미네센스(Photorhabdus luminescens)로부터의 luxCDABE 유전자 융합물(발광 구조 유전자)의 발현을 활성화시킨다. 적당한 성장 조건 하에서 이들 세포는 세포외 HSL의 존재에 반응하여 광 방출하도록 유도시키는데, 이와 같이 방출된 빛의 세기는 HSL의 농도에 비례한다.

라이브러리로부터 선별된 클론으로부터의 가용성 scAb는 공개된 프로토콜[참조: Strachan et al., 1998]을 이용하여 발현하였다. 고정화된 금속 친화 크로마토그래피 정제(IMAC) 동안, scAb는 닉켈-세파로즈 칼럼으로부터 용출되지 않았다. 무관한 항원에 대한 특이성을 지닌 일련의 부가 scAb를 또한 발현시키고, 이를 닉켈-세파로즈 칼럼 상으로 고정화시켜 대조군으로서 작용하게 하였다. 500 마이크로리터의 10nM OHHL를 각 칼럼에 적용하고, 4℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 칼럼을 15초 동안 40g으로 원심분리시키고, 유통된 것을 수집하였다. 결합된 모든 OHHL를 250 마이크로리터의 1M NaCl로 용출시켰다. 본래의 유통물을 앞서와 같이 다시 적용하고 항온 배양한 다음, 유통물을 수집하고 결합된 HSL을 1M NaCl로 용출시켰다.

HSL 용액 샘플을 고정화된 scAb 칼럼 내로 통과시키기에 앞서 및 통과시킨 후에, 이. 콜라이 JM107 pSB401 배양물에 적용하고, 방출된 빛을 광도계로 측정하였다. 어떠한 scAb도 고정화시킨 바 없은 칼럼과, 무관한 항원에 대한 특이성을 지닌 scAb를 포함한 3개의 부가 칼럼을 사용하여, 적당한 대조 실험을 수행하였다. 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지에서 18시간 동안 37℃ 하에 진탕시키면서 세포를 성장시켰다. 1 밀리리터의 상기 배양물을 100ml LB 테트라사이클린 배지에 접종한 다음, OD 600nm 0.2가 달성될 때까지 이를 37℃ 하에 성장시켰다. 100 마이크로리터의 상기 배양물을 96-웰 블랙 생물-검정용 판의 중복 웰에 적용하고, 등 용적의 HSL 용액을 가하였다. HSL 용액은 10nM OHHL(양성 대조군), 닉켈-세파로즈 칼럼 내로 통과된 milli-Q 수(레진 대조군), 또는 상기 언급된 바와 같은 고정화 scAb를 함유하는 칼럼 상으로 10nM OHHL를 통과시킴으로써 수집된 유통물이다. 판을 진탕시키면서 2시간 동안 37℃ 하에 항온 배양하고, Anthos LUCY1 광도계를 1초 동안 사용하여 발광을 판독하였다(도 4).

이. 콜라이 균주 JM109-pSB1075를 사용한 3.0시간에 걸친 HSL-유도성 발광 리포터 생물 검정을 이용하여, 장쇄 HSL에 대한 세균 반응을 저하시키는 scAb의 능력을 평가하였다. 상기 균주는 JM107-pSB401에 대해 기재된 바와 본질적으로 같은데, 차이점으로는 플라스미드 pSB1075가 비브리오 피쉐리(Vibrio fischeri)의 luxR 대신 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)의 lasR를 포함한다는 것이다. JM109-pSB1075의 단일 콜로니를 항생제 함유 LB 육즙 10ml에 접종하고, 37℃에서 밤새 항온 배양하였다. 200 마이크로리터의 밤새 배양물을 10ml의 신선한 배지에 접종하고, 진탕시키면서 37℃ 하에 항온 배양하여 OD 600nm 0.2가 되도록 하였다. HSL을 상기 배양물(20nM 최종 농도의 dDHL-COOH 또는 50nM 최종 농도의 tDHL)에 가하고, 100 마이크로리터의 배양물을 블랙 96 웰 판의 삼중 웰에 가하였다. LB 배지를 음성 대조군에 부가하였다. 50 마이크로리터의 PBS 또는 50 마이크로리터의 scAb를 2mg/ml으로 각 웰에 가하고, 상기 판을 37℃에서 3시간 더 진탕시키면서 항온 배양한 후, 시간에 따른 발광을 30분 간격으로 측정하고 세포 시그널링에 대한 scAb의 효과를 결정하였다(도 5 및 6). 데이터는 구조적으로 상이한 호모세린 락톤 시그널 분자와 교차 반응하는 항-HSL 항체의 능력과, 세포외 HSL에 대한 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 대용물의 반응을 저하 또는 제거하는 항-HSL 항체의 능력을 입증해준다.

단쇄 HSL에 대한 세균 반응을 저하시키는 scAb의 능력은 상기 언급된 바와 유사한 방식으로 평가하였다. 생물 발광성 리포터 시스템은 리포터 플라스미드 pSB406(rhlR 반응 요소 조절인자를 포함함)를 수반하는 이. 콜라이 균주 JM109를 사용하였다. 시그널 분자 BHL(도 1에서 아실-HSL로서 제시되지만, 단 4개의 측쇄를 포함한다)를 상기 이. 콜라이 배양물에 가하여 최종 농도가 50nM이 되도록 하고(등가 용적의 LB 배지를 음성 대조군 배양물에 가하였다), 100㎕ 배양물을 상기 검정용 판의 삼중 웰에 가하였다. 이어서, 100nM의 50㎕ scAb 또는 50㎕ PBS를 가하고, 판을 앞서 언급된 바와 같이 항온 배양하였다. 60분 및 150분 후에 발광 측정치를 취하였다(도 7).

실시예 2

병원성 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)로부터 동물을 보호해주는 항-HSL scAb의 능력을 평가하기 위해, 선충류 씨. 엘레간스(C. elegans)를 사용한 '느린-사멸' 검정을 이용하였다. 이 검정은 동물 장기 내에서의 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 감염 정착에 따른 상기 연충(worm)의 사멸에 기초한 것이다.

슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주 PA14를 1일째에 5ml LB 육즙에 감염시키고 37℃에서 밤새 항온 배양하였다. 2일째에는 밤새 배양물 1%를 100nM 육즙 하에 100㎕ scAb를 수반한 5ml의 신선한 LB에 접종하고, 이를 37℃에서 항온 배양하여 OD 600nm 0.4가 되도록 하였다. 10 마이크로리터의 세균성 배양물을 120nM 하의 50㎕ scAb와 함께, NG 증균된 펩톤 한천 판(선충류 성장 배지) 중앙에 스폿팅하고, 판을 37℃ 하에 밤새 항온 배양하였다. 3일째 오후에는, 50㎕ scAb(120nM)을 상기 판 위에 더 스폿팅하고, 지속적으로 밤새 항온 배양하였다. 4일째 오전에는, 상기 판을 실온(약 20℃)으로 옮기고, 추가의 50㎕ scAb를 가하였다. 5일째 오전에는, 50㎕ scAb를 앞서와 같이 가하고, 20-5- 다자란 연충을 세균성 잔디 위에 직접 부가하였다(0시간). 26, 50 및 76시간째에 scAb를 보충 부가하였다. 그 다음 3일간에 걸쳐 죽은 연충의 수를 일정 간격으로 결정하였다(도 8a). 미세한 와이어 피크로 건들렸을 때 전혀 반응이 없고 움직이지 않으면 연충은 죽은 것으로 간주하였다.

대조용 판에 대해서는, PBS 또는 무관한 scAb(관련되지 않은 표적 항원에 대해 특이적임)를 사용하거나 또는 연충을 이. 콜라이 균주 OP50 상에서 성장시켰다.

슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주 PA01을 사용하여 제2 검정을 또한 수행하였다[참조: Darby et al., 1999]. 이 균주는 '마비성 사멸'(독소 생성)에 주로 사용되고 있는데, 이는 PA14 보다는 덜 유효하긴 하지만, 본 실시예에서와 같은 느린 사멸 감염 연구에 적합하기도 하다.

본 검정은 상기 언급된 바와 같이 수행되었지만, 다음과 같은 약간의 변형을 수반한다. scAb 전체 부가물은 100nM 농도이다. 3일째에, 50㎕ scAb를 아침과 오후에 판에 스폿팅하였다. 두 번째 부가 후, 상기 판을 실온으로 옮기고 밤새 항온 배양하였다. 연충과 scAb를 4일째에(0시간)에 적용하고, 30시간 및 60시간째에 단지 2개의 scAb 보충 부가물을 만들었다(도 8b).

실시예 3

슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)는 전이증식 후 광범위한 조직 손상을 유발시킬 수 있는 몇 가지 세포외 생성물을 생성시킨다. 이들 중의 한 가지인 엘라스타제는 급성 감염 동안 슈도모나스 애루지노사(Ps. aeruginosa)의 최대 독성에 필수적이다. 엘라스타제의 생성은 lasI/R 균체 밀도 탐지 기구 케스케이드의 제어 하에 있다. 따라서, 엘라스타제 생성의 탐지가 세균 집단의 독성 능력에 대한 지표로서 사용될 수 있다.

10⁵ CFU/ml(낮은 OD) 또는 10⁸ CFU/ml(높은 OD)의 4 마이크로리터의 슈도모나스 애루지노사(Ps . aeruginosa) 균주 PA14를 1% 엘라스틴, 0.5% 래브 렘코(lab lemco) 분말, 1% 펩톤, 0.5% 염화나트륨 및 1.5% 한천을 함유하는 한천 판 상으로 접종하고, 37℃에서 5일 동안 항온 배양하였다. 낮은 OD로의 성장이 병원성 전환을 방해하는 반면, 높은 OD로의 성장은 병원성 전환을 고무시킨다. 5 마이크로리터의 scAb(200nM)을 세균과 함께 상기 판에 가하고, 본 검정 내내 24시간 간격으로 동일한 용적을 부가 적용하였다.

세균성 콜로니와 이를 둘러 싸고 있는 청정 영역(이는 엘라스타제에 의한 엘라스틴의 용해를 지시한다)의 직경을 매일 측정하고, 상기 콜로니의 엘라스틴 용해 활성을 청정 영역 부위 대 세균성 콜로니 부위의 비로서 결정하였다. 1회 시도당 3 내지 4회 반복 실험을 다시 한번 더 수행하고, 이. 콜라이 XL1-Blue를 음성 대조군으로 사용하였다(표 5).

실시예 4

항원에 대한 친화성이 더 높은 항-HSL 항체를 분리하고 특정의 HSL 변이체에 대한 특이성을 지시하기 위해, 친화 돌연변이를 클론 G3B12 상에서 수행하였다. 파아지미드 DNA를 G3B12 세균성 클론으로부터 분리하고, 45개 염기쌍 가요성 링커 영역의 마지막 30개 염기를 포함하는 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머 LINKER-REV(5'-GGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTAGTGC-3'), 및 파아지 마이너 코트 단백질 유전자 gIII에 대해 특이적인 3' 프라이머 gIII-FOR(5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3')를 사용하는 PCR에 의해, 가변 경쇄 유전자를 증폭시켰다. 정확한 크기(대략 380bp)의 생성물을 1% 아가로즈 겔에서 전기영동시키고, 절개한 다음 정제하였다. 유사한 방식으로, 본래의 클론을 분리시킨 사람 본래의 전체 라이브러리를 함유하는 파아지미드 DNA를 제조하였다. pelB 리더 서열에 대해 특이적인 5' 프라이머 AH1-REV(5'-AAATACCTATTGCCTACGGC-3'), 및 링커 영역의 처음 30개 염기를 암호화하는 3' 프라이머 LINKER-FOR(5'-AGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACC-3')를 사용하여 가변 중쇄 유전자의 완전한 레퍼토리를 증폭시켰다. 정확한 크기(약 400bp)의 생성물을 상기와 같이 정제하였다. 1차 PCR 생성물 둘 다에 공통적인 링커 영역 중앙의 상보적 15개 염기를 사용하여 PCR을 연결함으로써, VH 유전자 레퍼토리를 모노클로널 VL 유전자와 결합하였다. 4주기 후 프라이머 AH1-REV 및 gIII-FOR를 PCR 연결 반응에 부가함으로써 새로운 라이브러리를 증폭시키고, 25주기를 더 수행하였다. 이와 같이 증폭시킨 DNA를 제한 효소 NcoI 및 NotI로 분해시키고, 유사하게 분해되고 정제된 파아지미드 벡터에 연결하였다. 연결되고 재정제된 DNA를 전기천공에 의해 이. 콜라이 균주 TG1 세포 내로 최종적으로 형질전환시킨 다음, 통상적인 방식으로 도말하였다.

파아지 항체를 앞서와 바와 같이 헬퍼(helper) 파아지로 구제하고, 이를 dDHL-BSA 접합체로 피복된 면역관에 적용하여 결합되도록 하였다. 결합되지 않은 파아지는 따라내고, 약한/비-특이적 결합물은 PBST 및 PBS를 이용한 다중 세척 단계에 의해 제거하였다. 이어서, 접합체 특이적 파아지를 낮은 pH 트리에틸아민으로 용출시킨 다음 중화시켰다. 이들을 신선한 log-파아지 TG1 세포에 감염시키고, 구제한 다음, 다음 선별 주기(pans) 동안 다시 증폭시켰다. 연속되는 선별 주기 동안, 고정화된 접합체를 dDHL-BSA 및 dDHL-TG로 교대시켰다. 제3 회전 패닝 동안, 셔플링된 라이브러리로부터의 결합된 파아지를, 자유 dDHL 또는 BHL(부티릴호모세린 락톤)를 사용하여 이중 pans로부터 용출시켰다.

패닝 3회전 후, 목적하는 결합 특징을 알아보기 위해 모노클로널 파아지-항체를 스크리닝하였다. 3회전으로부터의 개개의 파아지 클론을 ELISA에 의해 스크리닝하였다. 각각의 dDHL-BSA 및 KLH 접합체와 결합하는 능력과 캐리어 단백질 단독과 결합하는 능력을 알아보기 위해, 각 클론을 대상으로 하여 초기에 검정하였다. 접합체에 대한 결합이 용액 중의 자유 dDHL 또는 HSL의 존재에 의해 억제될 수 있었는지를 확인해 보기 위해, 양 접합체와는 결합할 수 있지만 어느 한 캐리어 단백질과도 결합할 수 없는 클론을 대상으로 추가의 검정을 수행하였다. 자유 BHL/dDHL과 결합하는 것으로 밝혀진 파아지 클론으로부터의 항체 가변 영역 유전자를 가용성 발현 벡터(pIMS 147) 내로 아클로닝시키면, 이는 가요성 펩티드 링커에 의해 연결된 가변 중쇄 및 경쇄 도메인과, 사람 항체로부터의 카파 불변 도메인을 포함하는 가용성 단일 쇄 항체 단편(scAb)으로서 생성되었다. 자유 HSL에 대한 가용성 scAb의 결합의 정량화는 경쟁적 억제 ELISA에 의해 결정되었다. 선별된 각 scAb의 일정한 농도(1 마이크로그램/ml dDHL-BSA를 기준함)를 함유하는 샘플을 특정 농도 범위의 자유 HSL과 함께 1시간 동안 항온 배양한 다음, tDHL-TG로 피복된 ELISA 판에 적용하였다. 1시간 동안 항온 배양한 후, 결합되지 않은 scAb를 세척 제거하고, 고정화된 접합체에 결합된 채로 잔존하는 모든 scAb를 효소-표지된 항-사람 카파 항체로 탐지하였다. dDHL-TG에 대한 scAb(자유 항원을 수반하지 않음)의 결합을 50% 정도 감소시키는 자유 항원의 농도(IC₅₀)로부터, 자유 HSL에 대한 scAb의 민감도와, 기타 HSL과의 교차 반응성을 결정하였다(표 4).

실시예 5

2개의 통상적인 펩티드인 YST-1(YSTGGAGSGG) 및 YST-2 YSTASGGASS를, 인접기(penultimate) C-말단 리신 측쇄(YSTAGGSGAK^S)의 바이오티닐화^(^은 바이오티닐화 부위를 의미한다)를 이용하여 제3 변형물인 YST-3과 함께 합성하였다. 제4 티오락톤 펩티드 YSTC*DFIM*(Agr-D1)을 또한 합성하였는데, 여기서 *는 티오락톤 환에 의해 연결된 잔사를 의미한다(도 1c 참조). 통상적인 접합 화학 기술에 의해 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC)를 사용하여 C-말단을 통하여, YST-1 중의 몇몇을 BSA에 접합시키고, YST-2를 소의 티로글로불린(TG)에 접합시켰다.

사람 본래의 항체 라이브러리를, 본질적으로 앞서 기재된 바와 같이 교체되는 고정화 YST-1 및 YST-2 접합체에 대항하여 4회전 동안 패닝하였다. 파아지-항체를 1시간 동안 결합시킨 후, 결합되지 않은 파아지를 따라내어 제거하고, 약하게 결합된 파아지는 PBST로 세척한 다음 PBS로 광범위하게 세척함으로써 제거하였다. 결합된 파아지를 트리에틸아민으로 용출시키고 중화시킨 다음, log 상 이. 콜라이 TG1 세포에 감염시켰다. 헬퍼 파아지로 구제함으로써 증균 파아지를 증폭시킨 다음, 정제하고, 다음 선별 주기에 즉시 사용하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 침전에 의해 농축시켰다. 3회전 및 4회전에서 YST-1/2-접합체에 결합된 파아지를 세척한 후, 파아지를 YST-3 용액으로 용출시켰다. 바이오티닐화 펩티드와 결합하는 파아지를 스트렙타비딘 피복된 상자성 비드로써 포획하고 자석을 이용하여 고정화시켰다. 추가의 세척 단계 후, 결합된 파아지를 TG1 세포에 직접 가하고 전술된 바와 같이 감염시켰다.

선별 4회전을 수행한 후, YST-1 및 YST-2 접합체에 대한 결합과 BSA 및 TG 캐리어 단백질 단독에 대한 결합을 알아보기 위해, 모노클로널 파아지-항체를 대상으로 하여 ELISA 스크리닝하였다. 양 접합체와만 결합된 클론의 scFv 유전자를 pIMS-147 scAb 가용성 발현 벡터 내로 아클로닝시키고, 이. 콜라이 XL1-Blue 세포 내로 형질전환시켰다. 이들 세포를 발현시키고, 가용성 scAb를 세균성 주변 세포질 공간으로부터 추출한 다음, 닉켈 친화 크로마토그래피함으로써 정제하였다. 이어서, 고정화된 펩티드 접합체와 경쟁하여, 자유(비-접합된) 펩티드와 결합하는 것과 티오락톤-펩티드 자가 유도인자 Agr-D1과 결합하는 것을 알아보기 위해, 정제된 scAb를 대상으로 하여 ELISA에 의해 추가로 검정하였다. 접합체 단독에 대한 결합과 비교한, 펩티드 존재 하에서의 시그널 감소는 scAb가 모든 펩티드에 공통인 YST-에피토프를 인식하고 있다는 것을 지시해준다(도 9).

실시예 6

AI-2 표적에 대항한 항체를 생성하기 위해, 자유 AI-2 분자와 접합체 형태 둘 다를 획득하였다. AI-2를 순수한 형태로 분리시키는 것은 가능하지 않는 것으로 여겨진다. 본래, AI-2는 프로-AI-2(도 1b)와 붕산과의 (자발적) 반응에 의해 형성된다. 시험관 내에서, 프로-AI-2가 또한 붕산과 반응하여 활성 AI-2를 생성할 것이지만, 이는 접합 및 항체 선별에 적합하지 못하다. 프로-AI-2의 유도체를 합성함으로써, 메틸 그룹을 링커(예: 아실 쇄)에 의해 말단 반응성 그룹, 예를 들면, 카복실산으로 대체시킨다. 특정 캐리어에 대한 가교 결합 또는 화학적 접합에 적합한 말단 반응성 그룹을 포함하고, 캐리어 표면에 청정하게 표시되는 코어 프로-AI-2 잔기를 생성시킨다면, 어떠한 구조도 링커로서 사용될 수 있다. 반응성 프로-AI-2는 '발명의 요약' 섹션에서 기재된 바와 같이, 바람직하게는 2개의 상이한 캐리어에 접합된다.

잠재적 수용체의 라이브러리(예: 파아지 상에 표시된 항체 라이브러리)를 붕산(바람직하게는 >10μM, pH 6.0-8.0)의 존재 하에 고정화 접합체에 적용하여 고정화 AI-2 접합체를 생성시킨다. 파아지-항체('파아지')를 결합시키고, 접합체를 인식하지 않는 것은 세척하여 제거한다. 결합된 파아지는 높은 또는 낮은 pH, 예를 들면, 트리에틸아민을 사용하거나, 자유 AI-2와의 경쟁적 결합에 의해, 또는 바이오티닐화 AI-2와의 경쟁적 결합에 의해 용출시킨 다음, 자기 스트렙타비딘 비드를 사용하여 제거할 수 있다. 극도의 pH 용출을 제외한 바이오-패닝의 모든 단계 동안, AI-2의 정확한 구조 유지를 위해서는 붕산염이 존재해야 한다. 용출된 파아지는 숙주 세균(이. 콜라이)에 재감염시키야 하고, 파아지-입자 생성 조건 하에 세포를 성장시킴으로써 증폭시키며, 다음 주기 동안 정제하였다. 바람직하게는 고정화 접합체를 교체시키는 것을 제외하고는, 1회전에 대해 기재된 바와 같이 후속 선별 주기를 수행한다.

충분한 횟수의 선별 주기가 완료되면, AI-2에 대한 결합물을 알아보기 위해 개개의(모노클로널) 클론을 대상으로 검정할 수 있다. 선별을 최소한 3회전 실시하는 것이 필요할 것으로 추정되지만, AI-2 결합성 클론을 단지 1회전 후에 분리할 수 있거나, 또는 3회전을 초과하여 수행하는 것이 필요할 수도 있다. 얼마 만큼의 많은 주기 횟수가 요구되는 지를 결정해주는 것으로 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여, 각 주기 후 폴리클로널 파아지 ELISA를 수행할 수 있다. 모노클로널 파아지-항체가 앞서 실시예에 기재된 바와 같이 생성되어야 하고, 이를 대상으로 하여, 선별에 사용된 각각의 접합체에 대한 결합과 각각의 비-접합된 캐리어에 대한 결합을 알아보기 위해 검정하였다. 이용 가능한 경우, 제3 또는 제4의 접합체(들)를 부가적으로 사용할 수 있다. 추정상의 양성 클론은, 붕산염의 존재 하에서는 이용 가능한 모든 접합체와 결합하지만, 캐리어 분자 단독과는 결합하지 않고, 바람직하게는 붕산염의 부재 하에서는 접합체와도 결합하지 않는 것으로서 동정될 것이다.

프로-AI-2와 붕산염과의 반응으로 한 가지 이상의 종이 생성될 수 있는 것이 가능하기 때문에, 항체가 특히 정확한 AI-2 구조를 인식하고 있다는 것을 입증하는 것이 바람직할 것이다. 이는 자유 프로-AI-2와 붕산염의 존재 하에서 접합체에 대한 결합을 검정함으로써 결정할 수 있었다. 증가 농도의 자유 프로-AI-2와의 결합 저하는 경쟁적 억제를 지시해준다. 따라서, 이러한 항체는 세포외 AI-2와 결합하여 이를 세포에 이용 가능하지 못하도록 함으로써, AI-2 반응성 세균의 반응을 조정할 수 있을 것으로 예상된다.

적합한 생체내 모델은 AI-2에 반응하여 발광하는 세균인, 생물 발광성 비브리오 하르베이(Vibrio harveyi)에서 발견할 수 있다. LuxS^-인 브이. 하르베이(V. harveyi) 균주는 DPD(프로-AI-2의 전구체)를 합성할 수 없기 때문에, AI-2를 생성할 수 없다. 그러나, 이들은, 붕산염과 함께 프로-AI-2의 형태로 또는 LuxS⁺ 브이. 하르베이(V. harveyi)로부터 수득된 붕산염-함유 세포-무함유 배양 배지로서 외적으로 부가된 AI-2에 반응하여 (증가된 광 배출량)으로써 반응할 수 있다. 붕산염 만을 LuxS^- 세포 또는 LuxP^- 세포(천연 AI-2 수용체가 결여됨)에 부가하면, 어떠한 광 방출(발광)도 이루어지지 않는다. 따라서, 잠재적 항-AI-2 항체('수용체')는 상기 언급된 결합 기준을 충족시키는 것으로 동정될 수 있고, 또한 LuxS^- 세포에 부가될 때 발광 저하로써 결정된 바와 같이 습윤성 브이. 하르베이(V. harveyi) 배양 배지로부터 AI-2를 고갈시킬 수 있거나, 또는 LuxS^- 세포에 부가될 때 발광을 중지/방지/저하시킬 수 있다.

인용된 참조문헌

미국 특허 문헌

제6,309,651호(2001년 10월; Frank et al.)

기타 특허 문헌

*WO 01/26650 (2001년 4월; University of Nottingham)

WO 01/74801 (2001년 10월; University of Nottingham)

WO 92/01047 (2001년 10월; Bonnert et al.)

기타 참조문헌

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NCIMB41170

20030318

<110> Haptogen Ltd <120> Methods for the treatment of an infectious bacterial disease with an anti-lactone or lactone derived signal molecules antibody <130> IPA9501-45-DIV2 <150> GB 0218951.2 <151> 2002-08-13 <150> GB 0306783.2 <151> 2003-03-24 <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> SITE <222> (4)..(8) <223> Thiolactone ring <400> 1 Tyr Ser Thr Cys Asp Phe Ile Met 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> SITE <222> (5)..(9) <223> Thiolactone ring <400> 2 Gly Val Asn Ala Cys Ser Ser Leu Phe 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> SITE <222> (4)..(8) <223> Thiolactone ring <400> 3 Tyr Ile Asn Cys Asp Phe Leu Leu 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <220> <221> SITE <222> (4)..(8) <223> Thiolactone ring <400> 4 Tyr Ser Thr Cys Tyr Phe Ile Met 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional peptide YST-1 <400> 5 Tyr Ser Thr Gly Gly Ala Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcggaggtg gctctggcgg tagtgc 26 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gaattttctg tatgagg 17 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaatacctat tgcctacggc 20 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agagccacct ccgcctgaac cgcctccacc 30 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conventional peptide YST-2 <400> 10 Tyr Ser Thr Ala Ser Gly Gly Ala Ser Ser 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide YST-3 <400> 11 Tyr Ser Thr Ala Gly Gly Ser Gly Ala Lys Ser 1 5 10

Claims

하기 단계를 포함하는, 본래의 (naive) 사람 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 세균성 시그널 분자에 특이적인 항균성 모노클로널 항체를 스크리닝하는 방법:
세균성 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자를 제1 캐리어 분자에 접합시키는 단계;
제1 캐리어 분자에 접합된 상기 세균성 시그널 분자에 대해 본래의 사람 파아지 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하여 상기 접합체를 인식하는 파아지 입자를 선별하고 이를 증폭시켜 증균 라이브러리를 형성하는 단계;
제1 캐리어 분자와는 다른 제2 캐리어 분자에 접합된 세균성 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자에 대해 상기 증균 라이브러리를 스크리닝하는 단계;
세균성 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자의 자유 가용성 형태와 배양함으로써 제2 캐리어 분자에 접합된 세균성 시그널 분자에 결합한 파아지 입자를 경쟁적으로 용출하는 단계; 및
용출된 파아지 입자로부터 상기 제1 캐리어 분자와 세균성 시그널 분자의 접합체의 존재 하에서 세균성 락톤 또는 락톤-유도된 시그널 분자의 자유 가용성 형태에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체를 스크리닝하는 단계.
제1항에 있어서, 락톤 시그널 분자가 호모세린 분자 또는 펩티드 티오락톤 분자인 것인 방법.
제2항에 있어서, 호모세린 락톤 분자가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 화학식을 갖는 것인 방법:
화학식 1

화학식 2

화학식 3

상기 식에서, n은 0 내지 12이다.
제3항에 있어서, 화학식 1의 호모세린 락톤 분자가 N-부타노일-L-호모세린 락톤(BHL)(여기서, n은 0이다), N-도데카노일-L-호모세린 락톤(dDHL)(여기서, n은 8이다) 및 n-테트라데카노일-L-호모세린 락톤(tDHL)(여기서, n은 10이다)인 것인 방법.
제3항에 있어서, 화학식 2의 호모세린 락톤 분자가 N-(-3-옥소헥사노일)-L-호모세린 락톤(OHHL)(여기서, n은 2이다) 및 N-(-3-옥소도데카노일)-L-호모세린 락톤(OdDHL)(여기서, n은 8이다)인 것인 방법.
제3항에 있어서, 화학식 3의 호모세린 락톤 분자가 N-(-3-하이드록시부타노일)-L-호모세린 락톤(HBHL)(여기서, n은 0이다)인 것인 방법.
제2항에 있어서, 펩티드 티오락톤이 하기와 같은 화학식 4를 갖는 것인 방법:

상기 식에서, X는 임의의 아미노산이고 n은 1 내지 10이다.
제7항에 있어서, 펩티드 티오락톤 분자가 하기 구조를 갖는 것인 방법:

또는

또는

또는
제1항에 있어서, 락톤-유도된 시그널 분자가 푸라노실 보레이트 다이에스테르인 것인 방법.
제9항에 있어서, 푸라노실 보레이트 다이에스테르가 하기 구조를 갖는 자가 유도인자-2(AI-2)인 것인 방법:
제23항에 있어서, 락톤-유도된 시그널 분자가 하기 구조를 갖는 Pro-AI-2 또는 이의 포화 또는 불포화 C₁-C₁₀ 카복실산 유도체인 것인 방법:
제1항에 있어서, 항체가 단일 쇄 항체(scAb)인 것인 방법.
제1항에 있어서, 항체가 항체 단편인 것인 방법.
제13항에 있어서, 항체 단편이 단일 쇄 가변 단편 또는 단일 도메인 단편인 것인 방법.
제1항에 있어서, 캐리어 분자가 단백질 또는 비-단백질인 것인 방법.
제15항에 있어서, 캐리어 분자가 소 혈청 알부민(BSA), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소의 티로글로불린(TG), 오브알부민(OVa) 및 바이오틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.