JP2023507083A - モノクローナル抗体融合物 - Google Patents

Abstract

任意の抗体又はその断片を含み、作動可能に連結され、目的の標識との融合物として発現される抗体融合物。これを含むプラスミド、ベクター、宿主細胞、方法、及びキットが提供される。抗体融合物は、診断及び試薬設定において有用である。

Description

関連出願の相互参照
[0001] 本出願は、参照により本明細書に援用される、２０１９年１２月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９５０，３９７号の利益を主張する。

技術分野
[0002] 本開示は、一般に、抗体及び抗体診断の分野に関し、特に、目的の試薬との抗体融合に関する。

背景
[0003] 現在の抗体産生及び試験技術は、目的の抗体の発現を含み、抗体が適切な折り畳み、グリコシル化などを有することを確実にする。抗体発現に続いて、抗体は精製及び加工されなければならず、しばしば、ある量の抗体の損失を生じる。診断及び他の使用のために、抗体はしばしば、目的のタンパク質（例えば、タグ又は標識）又は固体支持体（例えば、マイクロビーズ、ニトロセルロース、又はポリスチレンなどのプラスチック）に結合され、それによって、しばしば過酷な結合条件に抗体を曝露する。これは、抗体標識製品に対して負の影響を有し得る。上記の欠点を予防又は回避しながら、標識抗体融合物を産生することが、当技術分野において必要とされている。

[0004] 本開示はこれらの技術の欠点を克服し、収率の増加、製造の容易さ、及び製造コストの低減をもたらす抗体融合物を提供する。抗体は、目的のタンパク質試薬、及び抗体に融合されたタグと共に組換え発現される。従って、検出試薬は、発現後に「結合」される必要はなく、抗体の損失を伴う精製後の加工の必要性、又はＭＡｂを過酷な結合条件に曝露する必要性を排除する。

概要
[0005] 一態様において、イムノアッセイのための組換えモノクローナル抗体（Ｍａｂ）であって、その各々が、組換え的に発現され、目的の抗体に融合された融合タンパク質試薬を有する、組換えモノクローナル抗体（Ｍａｂ）が記載される。抗体は、任意の目的の抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、目的の抗体は、例えば、抗プロカルシトニン（ＰＣＴ）Ｍａｂ、ＴＳＨＲ特異的Ｍ２２ Ｍａｂ、Ｌｙｍｅ Ｍａｂ、Ｆｌｕ ＡＮＰ／ＢＮＰ及びＲＳＶ ＡＮＰ Ｍａｂ及びその他を含み得る。発現され、目的の抗体に融合され得るタンパク質試薬は、例えば、酵素、蛍光タンパク質、共有結合様結合試薬、リンカー試薬などを含み得る。融合抗体は、改善された機能性及び低下された生産コストを提供する。これは、検出試薬を結合させるために追加のステップ又は労力が必要とされず、従って精製後処理の必要性が排除されるように、抗体に融合されたタグを有するタンパク質試薬を組換え発現させることによって達成される。これは、抗体の通常の喪失を回避し、またＭＡｂを過酷な結合条件に曝露する必要性を回避する。

[0006] 一実施形態において、１つ以上の融合タグと結合（例えば、それと共に発現）される、高い親和性及び特異性を有するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）融合物が記載される。これらの融合物は、例えば、ポイントオブケア（ＰＯＣ）迅速イムノアッセイ及びインビトロ診断（ＩＶＤ）試験のためのＥＬＩＳＡなどの診断アッセイにおける試薬として使用され得る。免疫蛍光に基づくラテラルフローイムノアッセイは、一実施形態では、本明細書に記載される抗体融合物の１つ以上を含む。

[0007] 本開示はさらに、核酸に関する。核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、又は部分的に精製された形態若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当技術分野で周知のその他を含む標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製される場合、「単離される」か、又は「実質的に純粋にされる」。本開示の核酸組成物は、ｃＤＮＡ、ゲノム又はそれらの混合物のいずれかから、しばしば天然配列（改変された制限部位などを除く）にあるが、標準的な技術に従って突然変異されて遺伝子配列を提供し得る。コード配列については、これらの突然変異は、所望に応じてアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ及び本明細書に記載される他のこのような配列に実質的に相同であるか又は由来するＤＮＡ配列が意図される。

[0008] さらに別の態様では、抗体融合物を産生する方法が提供され、この方法は、（ａ）目的の抗体又はその断片の核酸配列を取得することと、（ｂ）抗体又はその断片の核酸を目的の標識の核酸配列に作動可能に連結することと、（ｃ）目的の標識を有する抗体又はその断片を抗体融合物として宿主細胞内で発現させることと、（ｄ）抗体融合物を単離することを含む。目的の抗体は、任意の抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、目的の抗体は、抗ＰＣＴ抗体、抗甲状腺ＴＲＡｂ、抗ライムＶｌｓＥ／Ｃ６、抗ＯｓｐＣ／１０及び抗ＤｂｐＡ抗体からなる群から選択され得る。多様な感染性疾患因子に結合できるもの、毒物学及び／又はアレルギーパネル、アレルギーパネルにおいて有用なもの、並びにホルモン（例えば、ｈＣＧなど）に対する抗体などのさらなる抗体は、本方法の範囲内であることが理解されるであろう。目的の標識は、ルシフェラーゼを含む発光標識、及び／又はＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、若しくはＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）のうちの少なくとも１つを含む蛍光標識；及び／又はホスファターゼ標識及び／又はアビジン／ビオチン若しくはPromega（登録商標）Corp.Madison WI）によって販売されているHaloTag（登録商標）システムなどのタグであり得る。

[0009] ルシフェラーゼは、ＮＬｕｃ（NanoLuc）、ＲＬｕｃ（RetinaLuc）、及びＦＬｕｃ（FireflyLuc）のうちの少なくとも１つであり得ることが理解されるであろう。

[0010] 一実施形態において、ホスファターゼ標識は、ＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）を含む。

[0011] 別の実施形態では、蛍光標識は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を含む。

[0012] 別の実施形態では、目的の抗体は、抗ＰＣＴ抗体又はその断片を含み、目的の標識は、NanoLucを含む。

[0013] さらに別の実施形態では、目的の抗体は、抗ＰＣＴ抗体又はその断片を含み、目的の標識は、ＳＥＡＰを含む。

[0014] さらに別の実施形態では、目的の抗体は、抗甲状腺ＴＲＡｂ又はその断片を含み、目的の標識は、NLucを含む。

[0015] さらに別の実施形態では、目的の抗体は、Ｌｙｍｅ ＶｌｓＥ／Ｃ６抗体、ＯｓｐＣ／１０抗体、又はＤｂｐＡ抗体、又はそれらの断片を含む。

[0016] さらに別の実施形態では、目的の抗体は、Ｍ２２（ＴＳＨＲ特異的）抗体又はその断片を含み、目的の標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質を含む。

[0017] 別の実施形態では、目的の抗体は、Ｍ２２（ＴＳＨＲ特異的）抗体又はその断片を含み、目的の標識は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む蛍光タンパク質を含む。

[0018] さらに別の実施形態では、目的の抗体は、Ｍ２２＿ＮＬｕｃ又はその断片を含み、前記抗体は、ＲＰＥ－抗ヒトＩｇＧ又はその断片を含む第２の抗体と対になっている。

[0019] さらに別の態様では、任意の抗体又はその断片と、（ａ）ルシフェラーゼ、（ｂ）蛍光タンパク質、及び（ｃ）ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）からなる群から選択される目的の標識とを含む抗体融合物が提供される。いくつかの実施形態では、目的の抗体は、抗ＰＣＴ抗体、抗甲状腺ＴＲＡｂ、抗ライムＶｌｓＥ／Ｃ６、抗ＯｓｐＣ／１０及び抗ＤｂｐＡ抗体からなる群から選択される、

[0020] 一実施形態において、目的の抗体は、融合タンパク質、例えば、アビジン又はアビジンの形態又はHaloTag（登録商標）タンパク質で標識され、一方、ＭＡｂが結合される支持体は、ビオチン又は小さいHaloTagリンカーで標識されている。一旦ＭＡｂが接触すると、共有結合又は新しい共有結合が形成され、ＭＡｂが標識試薬に曝露されることなくしっかりと結合されることを確実にする。

[0021] 蛍光タンパク質は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）のうちの少なくとも１つであり得る。

[0022] ルシフェラーゼは、ＮＬｕｃ（NanoLuc）、ＲＬｕｃ（RetinaLuc）、及びＦＬｕｃ（FireflyLuc）のうちの少なくとも１つであり得ることが理解されるであろう。

[0023] さらに別の態様では、ヒト対象における目的の疾患又は障害を診断及び／又は検出するための方法が提供される。この方法は、（ａ）抗体融合物を含むイムノアッセイを提供することであって、融合物は標識を含む、提供することと、（ｂ）イムノアッセイを対象由来のサンプルと接触させることと；（ｃ）抗体融合物がサンプル中の標的に結合するかどうかを検出して、前記疾患又は障害の存在又は非存在を決定することを含む。

[0024] 標識は、ＳＥＡＰ、及び／又は発光標識及び／又は蛍光標識であり得ることが理解されるであろう。発光又は蛍光標識は、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）からなる群から選択することができる。

[0025] 一実施形態において、検出するステップは、ラテラルフロー検出をさらに含むことができる。

[0026] 別の実施形態では、方法は、診断試験システムをさらに含むことができ、診断試験システムは、蛍光標識抗体を用いたラテラルフローイムノアッセイを含む。

[0027] 診断試験システムは、機器及びユーザ履歴データを記録及び表示するための手段をさらに含み得ることが理解されるであろう。

[0028] さらに別の態様では、本明細書に記載される抗体融合物をコードする核酸配列を含むプラスミドが提供される。

[0029] 別の態様では、これらのプラスミドを含むベクターが提供される。

[0030] さらに別の態様では、これらのベクターを含む宿主細胞が提供される。

[0031] さらに別の態様では、本明細書に記載される抗体融合物を含むキットが提供される。

[0032] 他の実施形態では、核酸は、別の核酸配列に作動可能に連結している（例えば、２つの核酸は、互いに機能的関係にある）。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関連して、作動可能に連結されるとは、連結されたＤＮＡ配列が連続し、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を連続的に且つリーディングフレーム内で連結することを意味する。スイッチ配列の場合、作動可能に連結されるとは、配列がスイッチ組換えをもたらすことができることを示す。

詳細な説明
[0033] 本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、従って、変化し得ることが理解されるであろう。本開示の多くの様々な実施形態が、以下に詳細に記載される。これらの実施形態は、多くの異なる形態をとることができ、本明細書に明示的に記載された実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的且つ完全であり、本開示の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであり、限定することを意図するものではないことも理解するべきである。

[0034] 本明細書に参照される全ての特許、出願、公開された出願及び他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。

[0035] 本開示の核酸配列（その断片（例えば、上記に提供されるような、様々なＣＤＲ領域及び／又はＦＲ領域をコードする）を含む）は、日常的な実験室技術及び試薬を使用して、別の核酸、例えば空のベクターと作動可能に連結して配置され得る。

[0036] 本開示の核酸分子は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｐＲＮＡ若しくは任意の他の形態、又はＤＮＡ（クローニングによって得られ又は合成的に産生されるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定されない）の形態、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖、又は一本鎖、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１つの鎖の任意の部分は、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、又はアンチセンス鎖としても呼ばれる非コード鎖であってもよい。さらに、抗体をコードする核酸を含む本開示の核酸分子は、それ自体で抗体断片のアミノ酸配列をコードするもの；抗体全体又はその一部のコード配列；抗体、断片又は部分のコード配列、及び追加の配列、例えば前述した追加のコード配列を伴う又は伴わない少なくとも１つのシグナルリーダー又は融合ペプチドのコード配列、例えば少なくとも１つのイントロンと、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（例えば、ｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）を含む転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割を果たす転写された非翻訳配列などの非コード５’及び３’配列を含むがこれらに限定されない追加の非コード配列；追加のアミノ酸、例えば追加の機能性を提供するものをコードする追加のコード配列を含むことができるが、これらに限定されない。従って、抗体をコードする配列は、マーカー配列、例えば、抗体断片又は部分を含む融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列に融合され得る。

[0037] 本開示は、抗体をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供するか、又は様々な抗体ＨＣ若しくはＬＣ遺伝子又はその部分を含むプラスミドを得るために使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一タイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別のタイプは、ウイルスベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。本開示はまた、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、及び当技術分野で周知の組換え技術による少なくとも１つの抗体の産生に関する。

[0038] 抗体又はその抗体断片の発現のために、一部又は全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現カセット又はベクターに挿入され得る。抗体をコードするカセットは、構築物として組み立てることができる。構築物は、当技術分野で公知の方法を用いて調製され得る。構築物は、より大きなプラスミドの一部として調製することができる。このような調製は、効率的な様式で、正確な構築物のクローニング及び選択を可能にする。構築物は、残りのプラスミド配列から容易に単離され得るように、プラスミド又は他のベクター上の便利な制限部位の間に位置し得る。本明細書に記載される抗体の軽鎖及び重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＩセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製するために使用され得る。追加的又は代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコード化することができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結するように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（例えば、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。

[0039] 原核又は真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現は、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を集合及び分泌する可能性が高いため、最も好ましい。

[0040] 一般に、哺乳動物発現ベクターは、（１）調節エレメント（通常、ウイルスプロモーター又はエンハンサー配列の形態であり、広い宿主及び組織範囲によって特徴付けられる）；（２）「ポリリンカー」配列（プラスミドベクター内の抗体コード配列を含むＤＮＡ断片の挿入を容易にする）；及び（３）ｍＲＮＡ転写物のイントロンスプライシング及びポリアデニル化に関与する配列を含む。プロモーター－ポリリンカー－ポリアデニル化部位のこの連続領域は、一般に転写単位と呼ばれる。ベクターはまた、（４）選択マーカー遺伝子（例えば、β－ラクタマーゼ遺伝子）（しばしば抗生物質（例えば、アンピシリン）に対する耐性を与え、大腸菌（E.coli）における初期の陽性形質転換体の選択を可能にする）；及び（５）細菌宿主及び哺乳動物宿主の両方におけるベクターの複製を促進する配列を含む可能性があるであろう。

[0041] 代替的に、抗体配列をコードする核酸は、染色体に組み込まれた遺伝子を含む安定な細胞株において発現され得る。ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ネオマイシン、又はハイグロマイシンなどの選択マーカーを用いた同時トランスフェクションは、コードされた抗体を大量に発現するトランスフェクトされた細胞の同定及び単離を可能にする。

[0042] 適切な誘導性非融合大腸菌（E.coli）発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ及びｐＥＴ １１ｄが挙げられる。酵母サッカロマイセス・セレビシエ（S.cerevisiae）における発現のためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８、ｐＹＥＳ２、及びｐＰｉｃＺ（Invitrogen Corp、San Diego、CA、USA）が挙げられる。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９又はＨｉ５細胞）におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターの例としては、ｐＯＥＴ、ｐＴｒｉＥｘ、ｐＩＥｘ、ｐＢＡＣ、ｐＢａｃＰＡＫ、並びにベクターのＢＤ ｐＶＬ及びｐＡｃファミリー（Expression Systems LLC、Davis、CA、USA）が挙げられる。

[0043] さらに別の実施形態では、本開示の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Seed et al., Nature, 329:840, 1987）及びｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman et al., EMBO J., 6:187-195, 1987）が挙げられる。好ましくは、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型、例えばリンパ腫細胞（例えば、マウス骨髄腫細胞））において優先的に、核酸の発現を指向し得る。特定の細胞型において、組織特異的調節エレメントは、核酸を発現するために使用される。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。

[0044] 本開示はさらに、アンチセンス配向で発現ベクターにクローニングされたＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で、調節配列に機能的に連結されている。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、又は弱毒化ウイルスの形態であり得、ここで、アンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。Weintraub et al., Reviews-Trends in Genetics, 1, 1986）を参照されたい。

[0045] いくつかの実施形態において、本開示の結合剤（抗体など）をコードする核酸は、異種遺伝子の安定な発現のために頻繁に使用されているＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ２１、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０）、マウスＬｔｋ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞などの哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。本開示の抗体を産生する代替的な方法では、動物の細胞の１つ以上、好ましくは本質的に全てである非ヒト動物は、ヒト介入によって導入された異種核酸、抗体をコードする導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、細胞の前駆体に導入することによって、直接的又は間接的に、例えばマイクロインジェクション又は組換えウイルスの感染による意図的な遺伝子操作によって、細胞に導入することができる。非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、これに限定されないが、米国特許第５，８２７，６９０号；第５，８４９，９９２号；第４，８７３，３１６号；第５，８４９，９９２号；第５，９９４，６１６号；第５，５６５，３６２号；及び第５，３０４，４８９号を参照されたい。このような方法は、トランスジェニック哺乳動物を作製するために、哺乳動物の生殖系列にＤＮＡ構築物を導入することを含み得る。体細胞を用いてトランスジェニック動物を生成する方法は、米国特許第６，１４７，２７６号；Baguisi et al. Nature Biotech., 17, 456-461, 1999; Campbell et al., Nature, 380, 64-66, 1996; Cibelli et al., Science, 280, 1256-8, 1998; Kato et al., Science, 282, 2095-2098, 1998; Schnieke et al., Science, 278, 2130-2133, 1997; Wakayama et al., Nature, 394, 369-374, 1998に記載されている。

[0046] 抗体は、カゼインなどの乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターを含む、乳腺上皮細胞において優先的に活性化されるプロモーターを用いて、動物の乳腺において産生され得る。Clark et al., Bio Technology, 7: 487-492, 1989; Gordon et al. Bio Technology, 5: 1183-1187, 1987を参照されたい）。本開示の結合剤（例えば、抗体）は、トランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば、タバコ、トウモロコシ、及びウキクサ）を提供するために、核酸をコードする少なくとも１つの抗体を使用してさらに産生され得る。Cramer et al., Curr. Top. Microbol. Immun., 240:95-118, 1999を参照されたい。

[0047] 本開示の核酸はまた、公知の方法（例えば、米国特許第５，９４２，６０９号；第６，５２１，４２７号、第６，５８６，２１１号、及び第６，６７０，１２７号）による直接化学合成によって調製され得る。

[0048] 一旦調製されたら、抗体融合物は、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、プロテインＡカラムを用いる親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどを含むがこれらに限定されない周知の方法によって組換え細胞培養物から回収及び精製され得る。本開示の抗体は、天然に精製された産物、化学合成手順の産物、及び真核生物宿主（例えば、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において使用される宿主に応じて、本開示の抗体は、グリコシル化され又はグリコシル化されない場合があり、グリコシル化されることが好ましい。

[0049] 機能、例えば結合に重要な本開示の抗体中のアミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野で公知の方法によって同定することができる（例えば、Ausubel, Current Protocols (2002), Chapters 8, 15（前出）; Cunningham et al., Science 244:1081-1085, 1989）。Cunninghamのアプローチでは、分子のどの残基にも単一のアラニン突然変異が導入される。次いで、得られた突然変異体分子を、生物学的活性、例えば結合活性について試験する。抗体結合に重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴又は光親和性標識などの構造分析によって同定され得る（Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899-904, 1992及びde Vos et al., Science 255:306-312, 1992）。

抗体融合物の産生
[0050] 本開示の抗体融合物は、場合により、多様な技術によって産生され得る。抗体自体は、場合により、本明細書に記載されるように、ハイブリドーマ技術、又は例えば、ヒト抗体のレパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類など）の免疫化によって産生され得る。

[0051] ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を生殖系列構成で有するトランスジェニックマウスの使用は、正常なヒト免疫系が寛容であるヒト自己抗原を含む多様な標的に対する高親和性完全ヒトモノクローナル抗体の単離を提供する（Lonberg et al., Nature, 368, 856-9, 1994; Green et al., Nature Genet., 7, 13-21, 1994; Green et al., Exp. Med., 188:483-95, 1988; Lonberg et al., Int. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995; Bruggemann et al., Eur. J. Immunol., 21, 1323-1326, 1991; Fishwild et al., Nat. Biotechnol., 14:845-851, 1996; Mendez et al., Nat. Genet., 15:146-156, 1997; Green et al., J. Immunol. Methods 231:11-23, 1999; Yang et al., Cancer Res. 59:1236-1243, 1999; Brueggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997；及び米国特許第５，５６９，８２５号；第６，３００，１２９号；第６，７１３，６１０号；第７，０４１，８７０号を参照されたい）。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊又は欠失させて、内因性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を排除することができる。さらに、Codexis、Inc（Redwood City、CA、USA）及びCreative Biolabs、Inc（Shirley、NY、USA）などの会社は、上記のような技術を使用して、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに従事し得る。

[0052] 免疫原性抗原の調製、及びモノクローナル抗体産生は、組換え方法などの任意の適切な技術を用いて行うことができる。免疫原性抗原は、精製形態又は合成形態の形態で動物に投与することができる。少なくとも２つの形態が実施例に記載されている。

[0053] 抗原による免疫化は、場合により、完全フロイントアジュバントのようなアジュバントの添加を伴うことができる。免疫応答は、眼窩後出血によって得られる血漿サンプルを用いて、免疫化プロトコルの経過を通じてモニターすることができる。血漿は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ得（以下に記載されるように）、十分な力価の免疫グロブリンを有する動物、例えばウサギ又はマウスが、融合のために使用され得る。動物は、屠殺及び脾臓の除去の３日前に抗原で静脈内ブーストすることができる。いくつかの実施形態では、複数（例えば、２、３、４以上）の抗原融合を行うことができる。いくつかの動物を、各抗原について免疫化し得る。

[0054] モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、免疫動物から脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合させることができる。得られたハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。

[0055] 免疫グロブリン鎖を産生することができない適切な不死細胞株は、融合パートナー、例えば骨髄腫細胞株、例えばＳｐ２／０及び誘導体細胞株、ＮＳ１及び誘導体、特に、ＧＳ－ＮＳＯ、ＡＥ－１、Ｌ．５、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｕ９３７、ＭＬＡ １４４、ＡＣＴ ＩＶ、ＭＯＬＴ４、ＤＡ－１、ＪＵＲＫＡＴ、ＷＥＨＩ、Ｋ－５６２、ＣＯＳ、ＲＡＪＩ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＨＬ－６０、ＭＬＡ １４４、ＮＡＭＡＩＷＡ、ＮＥＵＲＯ ２Ａ、ＣＨＯ、ＰｅｒＣ．６、ＹＢ２／ＯなどのようなＮＳＯ操作されたＮＳＯ株、又はヘテロ骨髄腫、それらの融合産物、又はそれらに由来する任意の細胞若しくは融合細胞、又は当該技術分野で公知の任意の他の適切な細胞株として選択される（Birch et al., Biologics 22:127-133, 1994）。融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞は、選択的培養条件又は他の適切な公知の方法を用いて単離され得、限界希釈又は細胞選別、又は他の公知の方法によってクローニングされ得る。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって検出され、操作のために選択され得る。

[0056] 必要な特異性の抗体を産生又は単離する他の適切な方法が使用され得、これには、当技術分野で公知であり、及び／又は本明細書に記載されるように、ペプチド又はタンパク質ライブラリー（例えば、非限定的に、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなど、例えば、Cambridge antibody Technologies、Cambridgeshire、UK;Morphosys（登録商標）、Martinsreid、Germany;Biovation、Aberdeen、Scotland、UK;BioInvent、Lund、Sweden;Dyax Corp.、Enzon、Affymax/Biosite;Xoma、Berkeley、CA、USAから入手可能なディスプレイライブラリーから組換え抗体を選択する方法、例えば米国特許第５，８８５，７９３号；第５，９６９，１０８号；第５，９９４，５１９号；第６，０１７，７３２号；第６，２４８，５１６号を参照されたい；又は、ヒト抗体のレパートリーを産生できる確率的に産生されたペプチド又はタンパク質（米国特許第５，７２３，３２３号；第５，７６３，１９２号；第５，８１４，４７６号；第５，８１７，４８３号；第５，８２４，５１４号；第５，９７６，８６２号）が含まれるが、これらに限定されない。このような技術には、リボソームディスプレイ（Hanes et al., PNAS USA, 94:4937-4942, 1997); Hanes et al., PNAS USA, 95:14130-1413, 1998）；単細胞抗体産生技術（例えば、選択リンパ球抗体方法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号；Wen et al., J. Immunol., 17:887-892, 1987; Babcook et al., PNAS USA, 93:7843-7848, 1996）；ゲルマイクロ液滴及びフローサイトメトリー（Powell et al., Biotechnol., 8:333-337, 1990; One Cell Systems, Cambridge, MA, USA; Gray et al., J. Imm. Meth., 182:155-163, 1995; Kenny et al., Bio Technol., 13:787-790, 1995）；Ｂ細胞選択（Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports, 19:125-134, 1994; Jonak et al., Progress Biotech., Vol. 5, In vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier, Amsterdam, Netherlands, 1988）が含まれるが、これらに限定されない。

[0057] また、上記又は以下の段落に提供されるような抗体又はその抗原結合断片を含むキット、及び、例えば、疾患、障害、感染症、又は状態の診断において、このキットを使用するための説明書も含まれる。

[0058] 類似のタンパク質又は断片への特異的結合についての抗体のスクリーニングはまた、ペプチドディスプレイライブラリーを使用して都合よく達成され得る。この方法は、所望の機能又は構造を有する個々のメンバーについてのペプチドの大きなコレクションのスクリーニングを含む。ペプチドディスプレイライブラリーを使用する抗体スクリーニングは、当技術分野で周知である。表示されるペプチド配列は、３～５０００以上のアミノ酸長、しばしば５～１００アミノ酸長、しばしば約８～２５アミノ酸長であり得る。ペプチドディスプレイライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットは、Invitrogen（Carlsbad、CA、USA）、及びCambridge Antibody Technologies（Cambridgeshire、UK）などの供給者から市販されている。米国特許第５，８８５，７９３号を参照されたい。また、Ｅｎｚｏｎ特許（米国特許第４，７０４，６９２号；第４，９３９，６６６号；第４，９４６，７７８号；第５，２６０，２０３号；第５，４５５，０３０号；第５，５１８，８８９号；第５，５３４，６２１号；第５，６５６，７３０号；第５，７６３，７３３号；第５，７６７，２６０号；及び第５，８５６，４５６号）；Ｄｙａｘ特許（米国特許第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５７１，６９８号；及び第５，８３７，５００号）；Ａｆｆｙｍａｘ特許（米国特許第５，４２７，９０８号；第５，５８０，７１７号）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ特許（米国特許第５，７５０，３７３号）；及びＸｏｍａ特許（米国特許第５，６１８，９２０号；第５，５９５，８９８号；第５，５７６，１９５号；第５，６９８，４３５号；及び第５，６９３，４９３号；第５，６９８，４１７号）を参照されたい。

抗体断片
[0059] 抗体断片は、無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導され得る（例えば、Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods, 24:107-117, 1992;及びBrennan et al., Science, 229:81, 1985を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片は、全て、哺乳動物宿主細胞又は大腸菌（E.coli）において発現され得、それらから分泌され得、従って、これらの断片の大量の容易な産生を可能にする。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリーから単離され得る。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は大腸菌（E.coli）から直接回収され得、化学的に結合されて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成し得る（Carter et al., BioTechnology 10:163-167, 1992）。

[0060] 好ましくは抗体断片の組換え産生は、単鎖発現ポリヌクレオチドを用いて行われる。この発現ポリヌクレオチドは、（１）単鎖抗体をコードするように作動可能に連結されたＶＨドメイン、スペーサーペプチド、及びＶＬドメインからなる単鎖抗体カセット、（２）単鎖抗体をコードするｍＲＮＡを形成する単鎖抗体カセットのインビトロ転写を確実にするように作動可能に連結されたインビトロ転写に適したプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなど）、並びに（３）インビトロ転写反応において機能するのに適した転写終結配列を含む。場合により、発現ポリヌクレオチドはまた、複製起点及び／又は選択マーカーを含み得る。適切な発現ポリヌクレオチドの例は、ｐＬＭ１６６である。クローニングのためのＶＨ及びＶＬ配列を得るために、Ｖ遺伝子ファミリー特異的プライマー又はＶ遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって産生されたＶＨ及びＶＬ配列のライブラリーが使用され（Nicholls et al., J. Immunol. Meth., 165: 81, 1993；国際公開第１９９３／１２２２７号）、又は利用可能な配列情報に基づいて当技術分野で公知の標準的な方法に従って設計され得る。典型的には、マウス又はヒトのＶＨ及びＶＬ配列が単離される。次いで、ＶＨ及びＶＬ配列は、通常、介在スペーサー配列（例えば、インフレーム柔軟性ペプチドスペーサーをコードする）と連結され、単鎖抗体をコードするカセットを形成する。典型的には、複数のＶＨ及びＶＬ配列を含むライブラリーが使用され（時には、複数のスペーサーペプチド種も表される）、ここで、ライブラリーは、特にＣＤＲ残基、時には、フレームワーク残基における配列多様性を増加させるために突然変異されたＶＨ及びＶＬ配列の１つ以上を用いて構築される。Ｖ領域配列は、免疫グロブリン発現細胞のためのｃＤＮＡ又はＰＣＲ増幅産物として都合よくクローニングすることができる。例えば、ヒトハイブリドーマ若しくはリンパ腫由来の細胞、又は細胞表面若しくは分泌免疫グロブリンのいずれかを合成する他の細胞株を、ポリＡ＋ＲＮＡの単離のために使用し得る。次いで、このＲＮＡを、酵素逆転写酵素を使用するオリゴｄＴプライミングｃＤＮＡの合成のために使用する（Goodspeed et al., Gene, 76: 1, 1989; Dunn et al., J. Biol. Chem., 264: 13057, 1989を参照されたい）。Ｖ領域ｃＤＮＡ又はＰＣＲ産物が単離されたら、それはベクターにクローニングされて単鎖抗体カセットを形成する。

[0061] いくつかの実施形態において、本開示の抗体又はその抗原結合断片は、当技術分野で公知の従来の方法を用いて、インビトロ（例えば、無細胞）合成によって調製され得る。様々な合成装置、例えば、Applied Biosystems、Inc.、Foster City、CA、USAによる自動合成装置が利用可能である。合成装置を使用することによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然アミノ酸で置換され得る。特定の配列及び調製方法は、利便性、経済性、必要な純度などによって決定されるであろう。

[0062] いくつかの実施形態において、本開示の操作された抗体分子は、ペプチド配列、例えば、抗体又はその断片の細胞外環境、原形質膜（外膜、膜貫通、又は内膜）、又は細胞内の特殊な区画、例えば、エンドソーム、リソソーム、ＥＲ、ゴルジ装置、液胞、封入体、核小体、ミトコンドリア、葉緑体、ペリプラズムなどへの輸送を導くＮ末端シグナル配列を含み得る。

[0063] 一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、他の方法では抗体タンパク質を産生しない大腸菌（E.coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現に関する総説には、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, 256-262, 1993及びPlueckthun et al., Immunol. Revs., 130:151-188, 1992が含まれる。

[0064] ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅の公知の方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び関連する増幅プロセスが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＣＲ及び他のインビトロ増幅法はまた、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするために、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するためのプローブとして使用するための核酸を作製するために、核酸配列決定のために、又は他の目的のために有用であり得る。インビトロ増幅法を通して当業者を導くのに十分な技術の例は、米国特許第４，６８３，２０２号に見出される。ゲノムＰＣＲ増幅のための市販のキットは、当技術分野で公知である。例えば、Advantage-GC Genomic PCR Kit（Clontech）を参照されたい。さらに、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Boehringer Mannheim）は、長いＰＣＲ産物の収率を改善するために使用され得る。

[0065] ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせなどの本開示の単離された核酸組成物は、当業者に公知の任意の数のクローニング方法論を使用して、生物学的供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件下で本開示のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定するために使用される。ＲＮＡの単離、並びにｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である。

[0066] いくつかの実施形態では、突然変異は、飽和突然変異誘発又は組換えなどによって、抗体コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた修飾抗体を結合活性についてスクリーニングすることができる。

[0067] 抗体の定常領域の付加、除去又は修飾は、治療的に投与される抗体のバイオアベイラビリティ、分布及び半減期において特に重要な役割を果たすことが知られている。抗体のＦｃ又は定常領域によってコードされる抗体クラス及びサブクラスは、存在する場合、重要な追加の特性を付与する。従って、再構成された、再設計された、又は別様に改変された定常ドメインを有する抗体は、本開示の抗体組成物によって包含される。

[0068] 本開示はさらに、少なくとも１つの抗体融合物及び担体を含む組成物に関する。好ましくは、組成物は、少なくとも１つの抗体融合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。組成物は、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどであるがこれらに限定されない任意の適切な補助剤のうちの少なくとも１つをさらに含むことができる。薬学的に許容される補助剤が好ましい。このような滅菌溶液の非限定的な例及び調製方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Gennaro et al., Ed., 18^thEdition, Mack Publishing Co., Easton, PA, USA (1990)であるがこれに限定されない。抗体、断片又は変異体組成物の投与モード、溶解性及び／又は安定性に適した薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知なように又は本明細書に記載されるように、日常的に選択され得る。

[0069] 本開示はさらに、抗体融合物及び緩衝成分、並びに場合により安定剤又は保存剤を含む安定な製剤、並びに研究、診断及び／又は医学的使用に適した多用途製剤に関する。抗体組成物は、緩衝剤又はｐＨ調整剤を含み得；典型的には、緩衝剤は有機酸又は塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、又はフタル酸の塩などの有機酸塩；ＴＲＩＳ、塩酸トロメタミン、又はリン酸緩衝剤が挙げられる。本発明の組成物に使用するのに好ましい緩衝剤は、アミノ酸又はクエン酸塩などの有機酸塩である。緩衝能においても機能し得る代表的なアミノ酸／抗体成分としては、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リジン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが挙げられる。１つの好ましいアミノ酸は、グリシンである。製剤は、約ｐＨ４～約ｐＨ１０などの広い範囲のｐＨを包含することができ、好ましい範囲は、約ｐＨ５～約ｐＨ９、最も好ましい範囲は、約６．０～約８．０である。好ましくは、本開示の製剤は、約６．８～約７．８のｐＨを有する。

[0070] 本開示の実施形態は、前述の抗体又は抗原組成物を含む表面をさらに提供し、ここで、抗体又は抗原は、パートナーへの結合を可能にするように配向される。好ましくは、表面は、固体支持体の表面である。多数の様々な固体支持体が当業者に公知であり、ニトロセルロース、反応トレイのウェルの壁、マルチウェルプレート、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、膜、及び微粒子（ラテックス粒子など）を含むがこれらに限定されない。ニトロセルロース、ナイロン及び他の微孔性構造は、水和状態のゲル構造を有する材料と同様に有用である。有用な固体支持体のさらなる例としては、天然ポリマー炭水化物及びそれらの合成的に修飾、架橋又は置換された誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換及び架橋グアーガム、セルロースエステル（特に硝酸及びカルボン酸を伴う）、混合セルロースエステル、及びセルロースエーテル；窒素を含む天然ポリマー、例えばタンパク質及び誘導体（架橋又は修飾ゼラチンを含む）；天然炭化水素ポリマー、例えばラテックス及びゴム；適切な多孔質構造、例えばビニルポリマーなどを用いて調製され得る合成ポリマーが挙げられる。

[0071] 好ましくは、支持体は、アレイプレートのウェル、例えば、タンパク質アレイ又は抗体アレイのようなマイクロアレイである。このようなアレイを構築するための方法は、当技術分野で公知である。

[0072] 本開示の方法及びキットに使用することができる多くの固体支持体が存在する。使用され得る周知の材料としては、チューブ、ビーズ、膜の形態のガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン、アガロース、デキストラン、アクリルアミド、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、及び他の材料、並びにこのような材料で形成され又は被覆されたマイクロタイタープレートなどが挙げられる。本開示の単離及び精製された組換えポリペプチド及び／又は抗体は、アミド、エステル若しくはジスルフィド結合を介した共有結合などの技術によって、又は吸着によって、固体支持体に共有結合又は物理的に結合することができる。この結合又は固定化は、例えば、固体支持体と抗体（例えば、Ｆｃドメインを介した）又は抗原のエピトープとの間のアミド、エステル又はジスルフィド結合を介した共有結合を使用することによって達成され得る。活性リンカー、例えばアビジン及び／又はビオチン、又はHaloTag（登録商標）（これは、融合タンパク質及び小タグ（ビオチンとサイズが類似する非タンパク質分子を含むもまた、本発明に従って使用され得る。抗原／抗体がＧＳＴに融合される場合、融合ポリペプチドは、好ましくはその表面上にグルタチオンを提示する固体支持体とポリペプチドのＧＳＴ部分との間のジスルフィド結合を介して固体支持体上に整列されるように固定化される。固体支持体として使用するために現在好ましいのは、NUNC、Costar、又はGreinerなどの様々な商業的供給者から得ることができる、ポリスチロールから作製されたマイクロタイタープレートである。

[0073] 抗原を検出及び／又は定量化する方法が固体支持体上で行われる場合、通常、固体支持体は、単離及び精製された組換え抗体又はその抗原結合断片で被覆される。被覆は、ＰＢＳ緩衝液又はカーボネート緩衝液などの当業者に公知の被覆緩衝液を使用することによって行うことができる。このような被覆緩衝液並及び既に被覆された固体支持体は、本開示のキットに対する試薬として含まれ得る。本開示の上記の方法を行うための好ましいモードでは、本開示のキット中に試薬として同様に含まれ得る特定の「ブロッカー」を使用することが重要である。「ブロッカー」は、抗原性ペプチドに特異的に結合するもの以外の非特異的タンパク質、プロテアーゼ、又は抗体が固体支持体上の抗原若しくは抗体、又は放射標識されたインジケーター抗原若しくは抗体を架橋又は破壊せず、偽陽性又は偽陰性の結果を生じることを確実にするために添加される。使用できる通常のブロッカーは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であり、これが好ましい。ブロッカーは、ＰＢＳ緩衝液のような緩衝液中に添加することができる。固体支持体が使用される場合、ブロッカーは、通常、固体支持体を被覆した後に添加される。

[0074] 本開示はさらに、本開示の免疫原を含む組成物又はキットに関する。この組成物は、免疫原に加えて、塩；可溶化剤；界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ－２０などの非イオン性界面活性剤など；プロテアーゼ阻害剤；グリセロールなどのうちの１つ以上を含み得る。

[0075] 免疫原を含む組成物は、ペプチドの所望の使用に従って選択される緩衝液を含むことができ、意図される使用に適切な他の物質も含むことができる。当業者は、適切な緩衝液を容易に選択することができ、その広範な種類が公知である。

[0076] いくつかの実施形態では、免疫原を含む組成物は、診断組成物である。本開示による診断組成物は、例えば、組成物の少なくとも１つのペプチドが（対照として）本開示の抗体と反応する、通常のイムノアッセイにおいて使用することができる。上記のように、本開示は、診断組成物のみならず、特に、組成物が抗原性物質として使用されるイムノアッセイ方法も包含する。不均一アッセイのために、免疫原は、固体支持体に連結され得る。アッセイの形態とは無関係に、マーカー（例えば、蛍光又は発光分子）に直接又はリンカーを介して連結された少なくとも１つの免疫原から構成されるトレーサー複合体が使用され得る。このような試薬は、ＳＰＲアッセイにおいて特に有用である。

[0077] 例示的なリンカーとしては、例えば、単一又はオリゴマーグリシン（例えば、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧなど）、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（例えば、ｎは、１～約２０の整数である）；グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１）及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２）を含み、ｎは、１～１０の整数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又はそれ以上；好ましくは１、２、又は３）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野で公知の他の可撓性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン－セリンポリマーは、これらのアミノ酸の両方が比較的構造化されておらず、従って、成分間の中性のつなぎ鎖として役立ち得るので、興味深い。グリシンポリマーは、いくつかの実施形態において使用される。例示的な可撓性リンカーとしては、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ（配列番号３）、ＧＧＧＧＧ（配列番号４）、ＧＧＳ、ＧＧＳＧ（配列番号５）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６）、ＧＳＧＳＧ（配列番号７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号８）、ＧＧＧＳＧ（配列番号９）、ＧＳＳＳＧ（配列番号１０）などが挙げられるが、これらに限定されない。

[0078] 本開示はさらに、１つ以上の免疫原又はそれを含む組成物を、組成物を処方及び／又は使用するための説明書（例えば、抗体を産生するための説明書）と共に含む、キット又は他の製品に関する。キット又は他の製品は、容器、注射器、バイアル、表面、又は診断試験（例えば、インビトロ又はエクスビボ）を行うのに有用な任意の他の物品、デバイス又は備品を含み得る。インビボで診断試験を行うこともある。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器（例えば、予め充填された注射器）、アンプル、カートリッジ、リザーバ、ポンプ、又はリオジェクト（lyo-ject）が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの多様な材料から形成することができる。

[0079] ポリペプチドの製造のための組成物及び／又はキットは、全細胞及び担体（例えば、緩衝液）を含み得る。本開示の実施形態は、前述の組成物及び／又はキットを含むシステム、例えば、診断システム又は免疫アフェレーシスシステムをさらに提供する。

[0080] 本開示はさらに、本開示のペプチドグリカン免疫原のペプチド成分をコードする核酸（前記核酸を含むベクターを含む）、並びにこのような核酸及び／又はベクターを含む細胞を含む。

[0081] 本開示は、とりわけ、疾患又は障害の診断である抗原の検出に関する。本開示は、このような疾患を診断するための特異的且つ感度の高いアッセイを提供し、それによって、患者の臨床評価の明確性を提供する。

[0082] 本開示の一態様は、疾患又は障害の原因物質に対する抗体を有することが疑われる対象における疾患又は障害を検出及び／又は診断するための方法である。診断方法は、疾患若しくは障害の臨床症状を示す、又は疾患若しくは障害を有する疑いがある対象を診断するのに有用である。本開示の別の態様では、本開示の１つ以上の抗体融合物を使用して所望の抗原を検出することを含む、対象における疾患又は障害を検出するための方法が提供される。

[0083] 好ましくは、本開示は、対象の体液を目的の抗原の存在について測定することを含む、対象における疾患又は障害を診断するための方法を提供し、対照（例えば、既知の罹患していない対象）における対応する抗体レベルと比較した、対象における抗原の上昇した抗原レベルは、原因物質による感染を示し、及び／又は対象が疾患若しくは障害を有することを示す。

[0084] この方法の一実施形態は、診断される対象（疾患又は障害を有することが疑われる対象由来の生物学的流体（例えば、尿、血清、全血又はＣＳＦ）のサンプルを、本開示の抗体融合物を含む診断試薬と接触させる（インキュベートする、反応させる）ことを含む。感染に対する抗体応答の存在下で、抗原－抗体複合体が形成される。続いて、反応混合物を分析して、この抗原－抗体複合体の存在又は非存在を決定する。例えば、ＥＬＩＳＡ、マイクロアレイ分析、Luminexビーズベースのアッセイ、又はラテラルフロー法のような、多様な従来のアッセイ形式が、検出のために使用され得る。上昇した量の抗体－ペプチド複合体の存在は、対象が病原体に曝露され、感染されたことを示す。本開示の任意の検出アッセイにおいて、陽性応答は、健康な対照の群の平均値よりも１．５、２、３、４又はそれ以上の値、例えば５標準偏差大きいとして定義される。最初のスクリーニングの目的のために、陽性応答は、対照（例えば、健康な対象）と比較した、診断試薬の平均結合における統計的に有意な差異として定義される。統計的有意性は、通常の統計的検定を用いて決定することができる。

[0085] 本開示の一実施形態は、（１）免疫原又はそれに対する抗体を含む可能性がある体液又は組織のサンプルを採取することと；（２）サンプルを、特定の抗体－抗原複合体の形成に有効な条件下で、本開示の抗体又は本開示のペプチドと接触させること、例えば、サンプルと本開示の抗体とを反応させ又はインキュベートすること（又はサンプルと免疫原とを反応させ又はインキュベートすること）と；（３）接触させた（反応させた）サンプルを、抗体－抗原複合体の存在についてアッセイすること（例えば、抗体－ペプチド複合体の量を決定すること）を含む、診断イムノアッセイ方法である。

[0086] ペプチド及び抗体が特異的に反応するようにそれらを反応させるための条件は、当業者に周知である。例えば、Current Protocols in Immunology, Coligan et al, Eds., John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (2003)又は本明細書の実施例を参照されたい。

[0087] サンプルは、好ましくは入手が容易であり、静脈血液サンプル由来、又はさらには指の刺し傷由来の血清又は血漿であり得る。他の身体部分の組織又は他の体液、例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液（口腔液）、喀痰、痰、鼻汁、粘液、涙、トリク分泌液（tric secretion）などは、抗原（又はそれに対する抗体）を含むことが知られており、サンプルの供給源として使用することができる。

[0088] 分析物及びプローブが適切な培地中で反応することが可能になったら、アッセイを行って、抗体－ペプチド反応の存在又は非存在を決定する。当業者に明らかであろう多くのタイプの適切なアッセイの中には、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降及び凝集アッセイがある。

[0089] 特異的抗体の検出のために抗原を使用するイムノアッセイのためのプロトコルは、当技術分野で周知である。例えば、従来のサンドイッチアッセイを使用することができ、又は従来の競合アッセイ形式を使用することができる。いくつかの適切なタイプのアッセイの議論については、Current Protocols in Immunology（前出）を参照されたい）。好ましいアッセイにおいて、本発明の抗体は、抗原（例えば、又はその変異体）を含むか、又は含むと考えられるサンプルを加える前又は後のいずれかに、共有結合又は非共有結合によって固体又は半固体の表面又は担体に固定化される。

[0090] 特異的結合アッセイ、特にイムノアッセイを実施するための装置は、公知であり、発明方法における使用に容易に適合させることができる。一般に、固相アッセイは、試薬の分離がより速く、より単純であるため、沈殿、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、又は磁気などの分離ステップを必要とする不均一アッセイ法よりも実施が容易である。固相アッセイデバイスには、マイクロタイタープレート、フロースルーアッセイデバイス、ディップスティック及びイムノキャピラリー又はイムノクロマトグラフィーイムノアッセイデバイスが含まれる。

[0091] 本発明の実施形態では、固体又は半固体表面又は担体は、マイクロタイターウェル中の床又は壁；フィルター表面又は膜（例えば、ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）膜、例えばImmobilon膜）；中空繊維；ビーズ化クロマトグラフィー媒体（例えば、アガロース又はポリアクリルアミドゲル）；磁気ビーズ；繊維性セルロースマトリックス；ＨＰＬＣマトリックス；ＦＰＬＣマトリックス；結合したペプチドを有する分子が液相に溶解又は分散した場合にフィルターによって保持され得るような大きさの分子を有する物質；ミセルを形成することができるか、又はミセルを同伴することなく液相を変化若しくは交換させることができるミセルの形成に関与する物質；水溶性ポリマー；又は任意の他の適切な担体、支持体又は表面である。

[0092] 本開示の実施形態では、検出手順は、色の変化について抗体－ペプチド複合体を視覚的に検査すること、又は物理化学的変化について抗体－ペプチド複合体を検査することを含む。物理化学的変化は、酸化反応又は他の化学反応によって起こり得る。これらは、目視、分光光度計などを用いて検出することができる。

[0093] 本方法の一実施形態において、プローブは、ニトロセルロース紙上に電気ブロット又はドットブロットされる。続いて、生物学的流体（例えば、血清又は血漿）をブロットしたプローブとインキュベートし、生物学的流体中の分析物をプローブに結合させる。次いで、結合した複合体を、例えば、標準的な免疫酵素法によって検出することができる。本方法の別の実施形態では、ラテックス又はポリスチレンビーズをプローブに結合させ、生物学的流体をビーズ／プローブ結合体とインキュベートし、それによって反応混合物を形成する。次いで、反応混合物を分析して、分析物の存在を決定する。

[0094] 血液産物又は他の生理学的若しくは生物学的流体のスクリーニングのための１つのアッセイは、ＥＬＩＳＡである。典型的には、ＥＬＩＳＡにおいて、本開示のプローブは、マイクロタイターウェルの表面に直接又は捕捉マトリックスを介して吸着される。次いで、表面上の残留非特異的タンパク質結合部位を、ＢＳＡ、熱不活化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、又はＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉乳の緩衝溶液）などの適切な薬剤でブロックする。次いで、このウェルを、病原性分析物を含むことが疑われる生物学的サンプルと共にインキュベートする。サンプルは、ニートで適用することができ、又はより頻繁には、通常は、少量（０．１～５．０重量％）のタンパク質（例えば、ＢＳＡ、ＮＧＳ、又はＢＬＯＴＴＯ）を含む緩衝溶液中で希釈することができる。特異的結合を生じさせるのに十分な長さの時間インキュベートした後、ウェルを洗浄して未結合分析物を除去し、次いで、標準的な手順によって酵素又は他の標識に結合され、ブロッキング緩衝液に溶解されている最適濃度の適切な抗免疫グロブリン抗体（例えば、ヒト対象については、イヌ、マウス、ウシなどの別の動物由来の抗ヒト免疫グロブリン（ｃｔＨｕＩｇ））とインキュベートする。標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどを含む多様な酵素から選択することができる。特異的結合が再び起こるのに十分な時間を与え、次いで、ウェルを再び洗浄して、未結合の結合体を除去し、酵素のための適切な基質を添加する。色を発色させ、ウェルの内容物の光学密度を視覚的又は機器的に測定する（適切な波長で測定する）。

[0095] 別の有用なアッセイ形式は、ラテラルフロー形式である。ヒト若しくは動物の抗体又はｓｔａｐｈ Ａ若しくはＧタンパク質抗体に対する抗体を、シグナル発生剤又はレポーター（すなわち、コロイド金）で標識し、これを乾燥させ、ガラス繊維パッド（サンプル適用パッド）上に置く。診断プローブを、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜（例えば、IMMOBILON膜（Millipore））又はニトロセルロース膜などの膜上に固定化する。サンプル（血液、血清など）の溶液がサンプル適用パッドに適用される場合、これはコロイド金標識レポーターを溶解し、これはサンプル中の全ての分析物に結合する。この混合物を、毛管作用によって次の膜（診断プローブを含むＰＶＤＦ又はニトロセルロース）に輸送する。サンプル中に分析物が存在する場合、それらは膜上にストライプ化されたプローブに結合し、シグナルを生成する。コロイド金標識抗体に特異的な追加の抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧなど）を使用して、対照シグナルを生成することができる。

図面の簡単な説明
[0096]Nanoluc（登録商標）ルシフェラーゼ標識システムの概略図を示す。 [0097]Ｎｉ－ＮＴＡカラムを用いた精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を用いたＭ２２＿ＮＬｕｃ＿ＨｉｓＴａｇ抗体タンパク質試験を示す。 [0098]基質としてフリマジンを用いたＭ２２＿ＮＬｕｃ酵素滴定及び発光活性を示す。 [0099]３０分アッセイにおけるＭ２２＿ＮＬｕｃ滴定曲線を用いたＬ１－１０ベースのＥＬＩＳＡアッセイ結果を示す。 [0100]Ｍ２２＿ＮＬｕｃ滴定ターブ（turve）を有するＳＡマイクロプレート上のＬ１－１０ベースのＥＬＩＳＡアッセイ結果を示す。 [0101]ＳＡビーズに対するＬ１－１０ベースのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す（Ｍ２２＿ＮＬｕｃ滴定曲線）。 [0102]抗ＭＢＰ又は抗ＳｔｒｅｐＭａｂ）ＲＡＭ被覆ＥＬＩＳＡを用いたＬ１－１０に対するＭ２２＿ＮＬｕｃ抗体用量応答を示す。 [0103]捕捉としてａ－ＭＢＰを使用するＬ１－１０ベースのＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す（Ｍ２２＿ＮＬｕｃ滴定曲線）。 [0104]１２０ｎｇ／ｍｌ及び４０ｎｇ／ｍｌでのＭ２２＿ＬｕｃによるＭ２２用量応答を示す。結果をＲＬＵで示す。 [0105]３０ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌでのＭ２２＿ＬｕｃによるＭ２２用量応答を示す。結果をＲＬＵで示す。 [0106]Ｎｉ－ＮＴＡカラムによる精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。タンパク質特性評価の結果は、Ｌ１－１０融合タンパク質が予想通りに、還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの両方で９２ｋＤａとして精製されたことを示した。精製されたタンパク質は、ＨＰＬＣにおいても１つの主要な優勢ピークを示した。 [0107]Ｌ１１０＿ＮＬｕｃ酵素滴定－発光活性を示す。 [0108]Ｍ２２ベースのＥＬＩＳＡアッセイ－Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ滴定曲線を示す。 [0109]Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ １ステップＥＬＩＳＡアッセイ－Ｍ２２用量応答曲線を示す。 [0110]Ｌ１－１０＿Ｎｌｕｃ（２００ｎｇ／ｍｌ）ＥＬＩＳＡにおけるＭ２２用量応答を示す。 [0111]Ｌ１－１０＿Ｎｌｕｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）ＥＬＩＳＡにおけるＭ２２用量応答を示す。 [0112]Ｍ２２重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のアミノ酸配列、Ｇ３Ｓリンカーのアミノ酸配列、並びにＧＦＰタンパク質及びＨｉｓタグのアミノ酸配列を示す。 [0113]Ｍ２２－ＧＦＰ＿Ｆａｂ融合物を使用するＴＳＨＲの細胞表面蛍光検出のために使用されるスキーマの概略図である。 [0114]Ｎｉ－ＮＴＡカラムを用いた精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によるＭ２２－ＧＦＰ Ｆａｂタンパク質発現及び精製結果を示す。 [0115]Ｍ２２＋二次ｍａｂの結果（細胞当たりの蛍光として測定）のヒストグラム、及びＭ２２抗体の用量応答曲線を示す。 [0116]細胞当たりで測定したＭ２２－ＧＦＰ融合蛍光強度を示す。 [0117]抗Ｆｌｕ Ａ抗体がHalo Tag（Promega）タンパク質タグに融合され、リガンドに結合されたユウロピウムビーズに結合される、本技術の抗体融合の概略図を示す。 本技術の抗体融合物を用いて行われるラテラルフローイムノアッセイを示す。

定義
[0118] 本明細書で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、複数のそのようなタンパク質を含み、「製剤」への言及は、当業者に公知の１つ以上の製剤及びその等価物への言及などを含む。

[0119] ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の、文脈が明らかにそうではないことを指示しない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた、具体的に開示されることが理解される。記載された範囲内の任意の記載された値又は介在値と、その記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値との間のより小さい各範囲は、本開示によって包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、その範囲に含まれるか又は除外されてもよく、いずれかの限界がより小さい範囲に含まれる、いずれの限界もより小さい範囲に含まれない、又は両方の限界がより小さい範囲に含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の特に除外された限界を条件として、本開示によって包含される。記載された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、それらに含まれる限界の一方又は両方を除外する範囲もまた、本開示の範囲内である。

[0120] 単語「約」は、本明細書の文脈がそうではないことを示すか、又はそのような解釈と矛盾しない限り、その値の＋又は－１０％の範囲、例えば、「約５」は４．５～５．５、「約１００」は９０～１００などを意味する。例えば、「約４９、約５０、約５５などの数値の一覧において、「約５０」は、前と後の値の間の間隔の半分未満、例えば、４９．５を超えて５２．５未満に及ぶ範囲を意味する。さらに、「約「値」未満」又は「約「値」を超える」という表現は、用語「約」の定義を考慮して理解されるべきである。

[0121] 「結合剤」は、本明細書に記載される抗体の結合断片である。例えば、結合剤は、全長抗体（例えば、無傷の可変及び定常（Ｆｃ）領域又は抗体結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）_２、ＦＶ又はｄＡｂ）であり得る。これらの抗体又はその断片は、ウサギ、げっ歯類、ヒトなどであり得る。結合剤は、ＣＷＰＳに結合するウサギ、ラクダ科動物又はヒト単一ＶＨ又はＶＬドメインなどの単一ドメイン抗体であり得る。本発明による結合剤は、本明細書に記載されるＣＤＲの１つ以上を含むタンパク質、ポリペプチドなどをさらに含むことができることが理解されるであろう。

[0122] 本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される用途のために機能するのに十分であることを意味する。従って、用語「実質的に」は、当業者によって予想されるような、絶対的又は完全な状態、寸法、測定値、結果などからのわずかな、重要でない変動であるが、全体的な性能にあまり影響を及ぼさない変動を可能にする。数値又はパラメータ又は数値として表すことができる特性に関連して使用される場合、「実質的に」は、１０％以内、又は５％以内、例えば２％以内を意味する。

[0123] 本明細書で使用される場合、用語「複数」は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上であり得る。

[0124] 本明細書で使用される場合、「単離された」は、それが天然に存在する野生若しくは天然の配列から分離された、又はその配列が天然に存在するものとは異なる環境下にある、核酸配列又はポリペプチド配列を意味する。

[0125] 「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、及び「ペプチド」は、長さ又は翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために互換的に使用される。この定義に含まれるのは、Ｄ－及びＬ－アミノ酸、並びにＤ－及びＬ－アミノ酸の混合物である。

[0126] 用語「配列同一性」は、配列アラインメントプログラムを用いて整列された、２つ以上の整列された配列における核酸又はアミノ酸配列同一性を意味する。２つの配列間の同一性を決定するために使用され得る例示的なコンピュータプログラムには、（ncbi.nlm.gov/BLAST/）にてインターネット上で公に利用可能であるＢＬＡＳＴプログラムの組、例えばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰ、及びＴＢＬＡＳＴＮが挙げられるが、これらに限定されない。Altschul,S.F.et al.,1990及びAltschul,S.F.et al.,1997も参照されたい。

[0127] 「配列同一性のパーセンテージ」及び「パーセンテージ相同性」は、本明細書において、ポリヌクレオチド及びポリペプチド間の比較を指すために互換的に使用され、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適な整列のために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定して一致した位置の数を提供し、この一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを提供することによって計算され得る。代替的に、パーセンテージは、同一の核酸塩基若しくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列において存在する位置の数を決定し、又は核酸塩基又はアミノ酸残基がギャップと共に整列されて一致した位置の数を提供し、この一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを提供することによって計算され得る。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解する。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（GCG Wisconsin Software PackageにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols、Greene Publishing Associates、Inc.とJohn Wiley & Sons、Inc.(1995 Supplement)(Ausubel)との間の合弁）によって行うことができる。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、各々Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410及びAltschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationウェブサイトを通じて公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)を参照されたい）。

[0128] 上記のアルゴリズム及びプログラムの全ては、配列アラインメント及び％配列同一性の決定に適しているが、本明細書の開示の目的のために、％配列同一性の決定は、典型的には、提供されるデフォルトパラメーターを使用して、GCG Wisconsin Softwareパッケージ（Accelrys、Madison Wis.）中のＢＥＳＴＦＩＴ又はＧＡＰプログラムを使用して行われる。

[0129] 「％配列同一性」、「パーセント同一性」又は「パーセント同一」という表現は、配列アラインメントプログラムを使用して整列された場合の、２つ以上の整列された配列間の核酸又はアミノ酸配列同一性のレベルを指す。例えば、７０％相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された７０％配列同一性と同じものを意味し、従って、所与の配列の相同体は、所与の配列の長さにわたって７０％を超える配列同一性を有する。配列同一性の例示的なレベルには、所与の配列に対する７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％以上の配列同一性が含まれるが、これらに限定されない。

[0130] 本明細書で使用される場合、用語「合成」は、人工化学合成又は生合成（例えば、遺伝子工学に基づく産生）によって製造された分子、例えばポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。好ましくは、この用語は、上記の方法の１つによって、又は当技術分野で公知の他の適切な方法によって構築された、天然に存在しない分子に関する。

[0131] 「関連する」とは、疾患、状態又は表現型の発生又は発現との一致を意味する。関連は、その改変が多様な疾患及び状態の基礎を提供し得るハウスキーピング機能を担う遺伝子、特定の疾患、状態又は表現型に関与する経路の一部である遺伝子、並びに疾患、状態又は表現型の発現に間接的に寄与する遺伝子に起因するが、これらに限定されない。

[0132] 本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、タンパク質原性アミノ酸である２２個のアミノ酸と非タンパク質原性アミノ酸を含む。用語「タンパク質原性アミノ酸」は、生化学の分野において、翻訳中に真核生物及び／又は原核生物のタンパク質に援用される２２個のアミノ酸、例えば、（ａ）ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；（ｂ）イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｌ）；（ｃ）ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；（ｄ）リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；（ｅ）メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；（ｆ）フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；（ｇ）トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；（ｈ）トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；（ｉ）バリン（Ｖａｌ；Ｖ）；（ｊ）アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）；（ｋ）システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；（ｌ）グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；（ｍ）グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；（ｎ）プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；（ｏ）セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；（ｐ）チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；（ｑ）アラニン（Ａｌａ；Ａ）；（ｒ）アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；（ｓ）アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；（ｔ）グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；（ｕ）セレノシステイン（Ｓｅｃ；Ｕ）；（ｖ）ピロリジン（Ｐｙｌ；Ｏ）を指すために使用される。用語「非タンパク質原性アミノ酸」は、生化学の分野において、タンパク質原性アミノ酸ではない、天然に存在する及び天然に存在しないアミノ酸、例えば（１）シトルリン（Ｃｉｔ）；（２）シスチン；（３）ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）；（４）オルニチン（Ｏｒｎ）；（５）テアニン；（６）ホモシステイン（Ｈｅｙ）；（７）チロキシン（Ｔｈｘ）；及びベタインなどのアミノ酸誘導体；カルニチン；カルノシンクレアチン；ヒドロキシトリプトファン；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）；Ｎ－アセチルシステイン；Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ－ｅ）；タウリン；チラミン、Ｄ－アラニン（Ｄ－Ａｌａ）などのＤ－アミノ酸；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；４－ヒドロキシプロリン（ＨＹＰ）；３，４－デヒドロ－Ｌ－プロリン（ＤＨＰ）；アミノヘプタン酸（ＡＨＰ）；（２Ｒ，５Ｓ）－５－フェニルピロリジン－２－カルボン酸（２ＰＰ）；Ｌ－ａ－メチルセリン（ＭＳ）；Ｎ－メチルバリン（ＭＶ）；６－アミノヘキサン酸（６－ＡＨＰ）；及び７－アミノヘプタン酸（７－ＡＨＰ）を指すために使用される。アミノ酸残基の略語は、IUPAC-IUB Biochem. Nom., J. Biol. Chem. 241: 527, 1966に記載されている標準的なポリペプチド命名法に従って使用される。

[0133] 本明細書で使用される場合、「アミノ酸残基」は、ポリペプチドに組み込まれた個々のアミノ酸単位を意味する。アミノ酸残基は、一般に、「Ｌ」異性体形態であることが好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能的特性（例えば、抗体結合）がポリペプチドによって保持される限り、任意のＬ－アミノ酸残基に置換することができる。全てのアミノ酸残基配列は、本明細書において、その左及び右の配向がアミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向である式によって表されることに留意するべきである。さらに、アミノ酸残基配列の始め又は終わりのダッシュは、１つ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合を示すことに留意するべきである。

[0134] 本明細書で使用される「ドメイン」は、三次構造を有するタンパク質の一部である。ドメインは、ポリペプチドの短い可撓性領域によって、完全タンパク質中の他のドメインに連結され得る。代替的に、ドメインは、機能部分を表してもよい。例えば、免疫グロブリン分子は重鎖及び軽鎖を含み、各鎖は、類似するが同一ではない一連のアミノ酸配列を含む。これらの反復の各々は、タンパク質ドメインとして知られる、タンパク質構造の個別のコンパクトに折り畳まれた領域に対応する。軽鎖は、２つのこのような免疫グロブリンドメインからなり、一方、ＩｇＧ抗体の重鎖は、４つを含む。さらに、重鎖及び軽鎖の両方のアミノ末端配列は、異なる抗体間で大きく異なり、残りのドメインは、同じアイソタイプの免疫グロブリン鎖間で一定である。重鎖及び軽鎖のアミノ末端可変ドメイン（Ｖ）（各々ＶＨ及びＶＬ）は、特異的抗原に結合する能力をそれに付与し、一方、重鎖及び軽鎖の定常ドメイン（Ｃドメイン）（各々ＣＨ及びＣＬ）は、Ｃ領域を構成する。複数の重鎖Ｃドメインは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３などと番号付けされる。

[0135] 「保存的」アミノ酸置換は、本明細書で使用される場合、一般に、典型的にはペプチドの構造を変化させるがペプチドの生物学的活性は実質的に保持される、１つのアミノ酸残基の、認識されたグループ内からの別のアミノ酸残基での置換を指す。保存的に置換されたアミノ酸は、多様な周知の方法、例えばブロック置換マトリックス（ＢＬＯＳＵＭ）、例えばＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて同定され得る。ＢＬＯＳＵＭは、タンパク質の配列アラインメントに使用される置換マトリックスであり、アラインメントスコアは、進化的に異なるタンパク質配列間の関係をマッピングするために使用される。それらは、局所的アラインメントに基づいている。例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスは、参照により組み込まれるworld-wide-web URL NCBI.NLM.NIH.GOV/class/fieldguide/BLOSUM62.txtに見出すことができる。例示的なアミノ酸置換は、表１に見出すことができる。

[0136] 本明細書で使用される場合、アミノ配列又はヌクレオチド配列に関して、「実質的に同一」は、候補配列が所与の比較ウインドウ（例えば、２５０アミノ酸）にわたって、参照配列に対して少なくとも７０％の配列同一性であることを意味する。従って、実質的に類似の配列には、例えば、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれ以上、例えば９９．５％の配列同一性を有するものが含まれる。互いに同一である２つの配列も実質的に類似である。比較ウィンドウ又は比較配列の長さは、一般に、少なくとも候補の抗体結合断片の長さであろう。配列同一性は、参照配列に基づいて計算され、配列分析のためのアルゴリズムは、当技術分野で公知である。従って、２つのアミノ酸配列のパーセント配列同一性を決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、他のポリペプチドとの最適な整列のために、ギャップが１つのポリペプチドの配列に導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。１つの配列中の位置が他の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント配列同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント配列同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つのポリペプチド配列間のパーセント配列同一性は、Vector NTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen Corp、Carlsbad、CA）を使用して決定することができる。２つのポリペプチドのパーセント同一性を決定するために、１０のギャップオープニングペナルティー及び０．１のギャップ伸長ペナルティーを使用する。他の全てのパラメータは、デフォルトで設定されている。

[0137] 本明細書で使用される場合、用語「誘導体」は、個々のアミノ酸、抗原性ペプチド又は抗体（又はその抗原結合断片）の塩、アミド、エステル、エノールエーテル、エノールエステル、アセタール、ケタール、酸、塩基、溶媒和物、水和物、多形体又はプロドラッグを含む。誘導体は、そのような誘導体化のための公知の方法を用いて、当業者によって容易に調製され得る。本明細書に記載される方法での使用に適した誘導体は、実質的な毒性効果なしに動物又はヒトに投与することができ、生物学的に活性であるか、又はプロドラッグであるかのいずれかである。誘導体は、溶媒付加形態、例えば溶媒和物又はアルコラートを含む。誘導体は、アミノ酸及び／又は異性体（例えば互変異性体又は立体異性体）のアミド又はエステルをさらに含む。

[0138] 本明細書で使用される場合、「アミノ酸アナログ」は、アミノ酸に構造的又は化学的に類似する化合物である。多くの適切なアミノ酸アナログが当技術分野で公知であり、代表的な例としては、例えば、ｐ－アセチルフェニルアラニン、ｍ－アセチルフェニルアラニン、Ｏ－アリルチロシン、フェニルセレノシステイン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジドフェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－メチルチロシン、ｐ－アミノフェニルアラニン、ｐ－シアノフェニルアラニン、ｍ－シアノフェニルアラニン、ｐ－フルオロフェニルアラニン、ｐ－ヨードフェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－ニトロフェニルアラニン、Ｌ－ＤＯＰＡ、３－アミノチロシン、３－ヨードドチロシン、ｐ－イソプロピルフェニルアラニン、３－（２－ナフチル）アラニン、ビフェニルアラニン、ホモグルタミン、Ｄ－チロシン、ｐ－ヒドロキシフェニル乳酸、２－アミノカプリル酸、ビピリジルアラニン、ＨＱ－アラニン、ｐ－ベンゾイルフェニルアラニン、ｏ－ニトロベンジルシステイン、ｏ－ニトロベンジルセリン、４，５－ジメトキシ－２－ニトロベンジルセリン、ｏ－ニトロベンジルリジン、ｏ－ニトロベンジルチロシン、２－ニトロフェニルアラニン、ダンシルアラニン、ｐ－カルボキシメチルフェニルアラニン、３－ニトロチロシン、スルホチロシン、アセチルリジン、メチルヒスチジン、２－アミノノナン酸、２－アミノデカン酸、ピロリジン、Ｃｂｚ－リジン、Ｂｏｃ－リジン、アリルオキシカルボニリジン、アルギノコハク酸、シトルリン、システインスルフィン酸、３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、３－モノヨードチロシン、３，５－ジヨードチロシン、３，５，５－トリヨードチロニン、及び３，３’，５，５’－テトラヨードチロニンが挙げられる。この用語は、修飾された又は異常なアミノ酸、例えばＤ－アミノ酸、ヒドロキシリジン、４－ヒドロキシプロリン、Ｎ－Ｃｂｚ保護アミノ酸、２，４－ジアミノ酪酸、ホモアルギニン、ノルロイシン、Ｎ－メチルアミノ酪酸、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、－フェニルプロリン、ｔｅｒｔ－ロイシン、４－アミノシクロヘキシルアラニン、Ｎ－メチル－ノルロイシン、３，４－デヒドロプロリン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノグリシン、Ｎ－メチルアミノグリシン、４－アミノピペリジン－４－カルボン酸、６－アミノカプロン酸、トランス－４－（アミノメチル）－シクロヘキサンカルボン酸、２－、３－、及び４－（アミノメチル）－安息香酸、１－アミノシクロペンタンカルボン酸、１－アミノシクロプロパンカルボン酸、及び２－ベンジル－５－アミノペンタン酸；官能化アミノ酸、例えばアルキン官能化、アジド官能化、ケトン官能化、アミノオキシ官能化アミノ酸などを含む。Liu et al., Ann. Rev. Biochem. 79:413, 2010; Kim et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 17:412, 2013を参照されたい。

[0139] 本明細書で使用される場合、用語「ペプトイド」は、１つ以上のＮ置換グリシン残基を含むポリペプチドを指す。Ｎ置換アミノ酸残基は、α炭素からではなく、Ｎからの標準アミノ酸側鎖ペンダントを有する。ペプトイドの代表的な例は、例えば、米国特許第６，０７５，１２１号及び第６，８８７，８４５号に提供されている。

[0140] 本明細書で使用される場合、用語「ペプチドグリカン」は、ペプチドによって架橋されたロープ様線状多糖鎖から構成される剛性メッシュを指す。

[0141] 用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、本明細書では、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含むように使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、この用語には、三本鎖、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡのほか、三本鎖、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。この用語はまた、例えばメチル化及び／又はキャッピングによる修飾、並びにポリヌクレオチドの未修飾形態を含む。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、プリン又はピリミジン塩基のＮ－又はＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、及び他の非ヌクレオチド主鎖、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））及びポリモルホリノポリマー（Anti-Virals,Inc.、Corvallis、OR、USAからNEUGENEとして市販されている）、並びに、ポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含むことを条件として、他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。用語「ポリヌクレオチド」と「核酸分子」との間に長さの違いは意図されていない。

[0142] 本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」は、結合された場合に、核酸ＲＮＡ及びＤＮＡの個々の構造単位を構成する分子を指す。ヌクレオチドは、核酸塩基（窒素塩基）、５炭素糖（リボース又は２－デオキシリボースのいずれか）、及び１つのリン酸基から構成される。本明細書で使用される「核酸」は、ヌクレオチドモノマーから作製されるポリマー高分子である。ＤＮＡでは、プリン塩基は、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンは、チミン（Ｔ）とシトシン（Ｃ）である。ＲＮＡは、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）を用いる。

[0143] 本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態であり得、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸は、プロモーター又は他の調節配列を含み得る。オリゴヌクレオチドは、合成手段によって調製することができる。核酸は、ＤＮＡのセグメント、又は多型部位の任意の１つにわたるか又は隣接するそれらの相補体を含む。セグメントは、５～１０００の連続する塩基であり得、５、２０、５０、１００、２００、３００、５００、７００又は１０００ヌクレオチドの下限から５００、１０００、２０００、５０００又は１００００ヌクレオチドの上限までの範囲であり得る（ここで、上限は下限よりも大きい）。５～２０、５０～１００、５０～２００、１００～２００、１２０～３００、１５０～３００、１００～５００、２００～５００、又は２００～１０００塩基の核酸が一般的である。二本鎖核酸の１つの鎖の配列への言及は、相補的配列を定義し、文脈から別様に明らかである場合を除いて、核酸の１つの鎖への言及はまた、その相補体を言及する。相補性は、任意の様式（例えば、ＤＮＡ＝ＤＮＡ；ＤＮＡ＝ＲＮＡ；ＲＮＡ＝ＤＮＡ；ＲＮＡ＝ＲＮＡ）で生じ得、各場合において、「＝」は相補性を示す。相補性は、同一の又は異なる分子の２つの鎖又は一本鎖の間で生じ得る。

[0144] 本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃～４２℃で約５０％のホルムアミド中で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、約３０℃～３５℃で約３５％～２５％のホルムアミド中で、低下したストリンジェンシー条件下で起こり得る。特に、ハイブリダイゼーションは、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．３％ ＳＤＳ、及び２００μｇ／ｍｌの剪断及び変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃の高ストリンジェンシー条件下で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、上記のように低下したストリンジェンシー条件下で起こり得るが、３５℃の低下した温度で３５％のホルムアミド中で起こり得る。特定のレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、目的の核酸のプリン対ピリミジン比を計算し、温度を調整することによって、さらに狭めることができる。上記の範囲及び条件の変更は、当技術分野で周知である。

[0145] 用語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、ＰＣＲ増幅において又はハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る、少なくとも約６ヌクレオチド～６０ヌクレオチド、好ましくは約１５～３０ヌクレオチド、最も好ましくは約２０～２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。

[0146] 本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、機能的に関連する核酸配列を指す。プロモーターがコードされたポリペプチドの転写を制御する場合、プロモーターはコード配列と作動可能に連結される。作動可能に連結された核酸配列は、連続的であり得、リーディングフレームにおいて、特定のエレメント、例えばリプレッサー遺伝子は、連続的に連結され得ないが、なお、ポリペプチド産物の発現を制御するオペレーター配列に結合し得る。

[0147] 本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、核酸配列を標的細胞に導入し得る分子（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、微粒子担体、及びリポソーム）を指す。典型的には、「ベクター構築物」は、目的の核酸の発現を指示することができ、核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を意味する。従って、この用語は、クローニング、発現、及びウイルスベクターを含む。

[0148] 本明細書で使用される場合、用語「レポーター」は、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、及び他の組織化学アッセイ）、蛍光、及び発光系を含むがこれらに限定されない、任意の検出系において検出可能な分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はポリペプチド配列を指す。例示的なレポーターとしては、例えば、β－グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、大腸菌（E.coli）β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ハロバクテリウム（Halobacterium）β－ガラクトシダーゼ、アカパンカビ（Neuropsora）チロシナーゼ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、エクオリン（クラゲ生物発光）、ホタルルシフェラーゼ（ＥＣ １．１３．１２．７）形態のフォチヌス・ピラリス（Photinus pyralis）、ウミシイタケ、レニラ・レニフォルミス（Renilla reniformis）由来のレニラ属（Renilla）ルシフェラーゼ（ＥＣ １．１３．１２．５）、及びフォトバクテリウム・フィシェリ（Photobacterium fischeri）由来の細菌ルシフェラーゼ（ＥＣ １．１４．１４．３）が挙げられる。好ましくは、レポーターは、ルシフェリン－ルシフェラーゼ系を含む。本明細書で使用される場合、用語「ルシフェリン－ルシフェラーゼ系」は、得られる発光が検出され得るような条件下で、基質（すなわち、例えば、ｃＡＭＰ）の存在下でルシフェリン及びルシフェラーゼの接触を可能にする任意のプロセス又は方法を指す。このような系は、トランスフェクトされた宿主細胞内に含まれてもよく、又は内容物が一緒に混合され得る別個のキット容器中に提供されてもよい。「レポーター」は、用語「標識」及び「検出可能な標識」を含み、これらは、本明細書で使用される場合、本明細書に記載される部分、例えばペプチド、タンパク質又は抗体に結合される場合、既知の検出方法、例えば分光法、光化学法、電気化学発光法、及び電気泳動法を用いてこのような部分を検出可能にする任意の部分を指す。

[0149] 本開示における使用に適した様々な標識は、化学的手段又は物理的手段のいずれかを介してシグナルを生成する標識を含み、ここで、シグナルは、視覚的手段又は機器的手段によって検出可能である。例示的な標識には、フルオロフォア及び放射性同位体が含まれるが、これらに限定されない。このような標識は、適切な検出器、例えば蛍光光度計による標識化合物の直接検出を可能にする。このような標識は、酵素及び基質、発色原、触媒、蛍光化合物、化学発光化合物、及び放射性標識を含むことができる。典型的には、視覚的に検出可能な標識が使用され、それによって、サンプル中の分析物の量の機器（例えば、分光光度計）読み出しを提供する。標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、Ｂ－ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼなどの酵素が含まれる。適切な基質としては、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び１，２ジオキセタンが挙げられる。検出の方法は、使用される標識に依存し、当業者に明らかであろう。注目されるように、適切な直接標識の例は、放射性標識、フルオロフォア、発色団、キレート剤、粒子、化学発光剤などを含む。

[0150] このような実施形態では、標識は、直接標識、すなわち、それ自体が検出可能であるか、若しくは検出可能なシグナルを生成する標識であってもよく、又は間接標識、すなわち、別の化合物の存在下で検出可能であるか、若しくは検出可能なシグナルを生成する標識であってもよい。「標識された第２の抗体」は、検出可能な標識に結合された抗体を指す。標識は、抗体が流体サンプル中の分析物の存在に関連する検出可能なシグナルを生成することを可能にする。

[0151] 適当な放射性標識としては、例として、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^１３１Ｉ及び^１８６Ｒｅが挙げられるがこれらに限定されない。

[0152] 本明細書で使用される場合、「コンセンサス」アミノ酸は、この方法によって得られるコンセンサスポリペプチド中の所定の位置を占めるように選択されるアミノ酸である。上記のようにコンセンサスアミノ酸を選択するように構成されたシステムは、コンピュータプログラム、又は１つ以上のコンピュータプログラムと「手動」分析及び計算との組み合わせであり得る。アミノ酸配列のグループ（そこからコンセンサス配列が調製される）内に存在するアミノ酸配列のセットは、上記で行われた進化的類似性解析に基づいて、グループの他方のメンバーよりも互いにより類似するそのような配列のセットを意味する。そのようなグループの例は、グループ内のセットが特定のポリペプチド、例えば、抗原領域のメンバーである種である。

[0153] 本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、結合、例えばペプチド結合（又はアミド結合））を介して、親ペプチドにおいて天然に結合されないアミノ酸配列に結合された、ペプチド又はその機能的断片を指す。例示的な融合ポリペプチドは、本開示の抗体（又はその抗原結合断片）と酵素（例えば、アルカリホスファターゼ；ＡＰ）との融合物を含む。

[0154] 本開示に関連するように、生物学的流体は、糞便、生検標本、皮膚、爪、及び毛髪を含む固体又は半固体サンプル、又は尿、唾液、喀痰、粘液、血液、血漿又は血清などの血液成分、羊水、精液、膣分泌物、涙、脊髄液、洗浄液、及び他の体液などの液体サンプルであり得る。サンプルには、例えば、頸部、尿道、鼻孔、及び咽喉からのスワブ標本が含まれる。このようなサンプルのいずれも、生きている、死んだ、又は死んでいる動物又は植物由来であり得る。動物には、ヒトなどの哺乳動物が含まれる。

[0155] 「尿」は、尿道を通して排泄されるか、又は患者からカテーテルから収集される液体排泄物を指す。

[0156] 「抗体」は、１つ又は複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、又はその断片を指す。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、これらは次に、各々免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。典型的には、抗体は、別の分子の特定の空間及び極性構成に特異的に結合し、それによってそれらに相補的であると規定される、その表面上又は空洞内の領域を有する免疫グロブリンである。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル（ｍＡｂ又はｍｏＡｂと略される）であり得る。抗体は、完全免疫グロブリン又はその断片を含み得る。その断片は、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＦ（ａｂ’）２を含み得る。Ｆａｂ’など。抗体はまた、組換え方法によって作製されたキメラ抗体又はその断片を含み得る。「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡアイソタイプのもの、並びに任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はその単鎖を含む、全抗体を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶＨと略される）及び重鎖定常領域から構成される。ＩｇＧ重鎖定常領域は、４つのドメインから構成される。ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。

[0157] 本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗原結合に関与する抗体の超可変領域アミノ酸残基を指す。抗体のヒトＩｇＧサブタイプの超可変領域又はＣＤＲは、典型的には、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（前出）によって記載されるような、軽鎖可変ドメイン中の残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）由来のアミノ酸残基、並びに重鎖可変ドメイン中の３１～３５（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）及び９５～１０２（Ｈ３）由来のアミノ酸残基、及び／又はChothia et al. (J. Mol. Biol. 196: 901-17, 1987)によって記載されるような重鎖可変ドメイン中の超可変ループ由来の残基を含む。フレームワーク又はＦＲ残基は、超可変領域以外の可変ドメイン残基であり、超可変領域を囲む。

[0158] 各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配列される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

[0159] 本明細書で使用される場合、用語「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、ヒト抗体の重鎖の可変領域（Ｖ_ＨＨ）を含む単鎖抗体のタイプを指す。ＳｄＡｂは、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体断片である。それらは、例えば、ヒト由来の重鎖抗体に由来し、軽鎖を有さない２つの抗体重鎖のみからなる。わずか１２～１５ｋＤａの分子量であり、ｓｄＡｂはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えば、２つの重タンパク質鎖及び２つの軽鎖を有するＩｇＧ抗体（１５０～１６０ｋＤａ）よりもはるかに小さい。ＳｄＡｂは、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られる天然に存在する免疫グロブリンの改変バージョンであり得る。このような免疫グロブリンは、米国特許第８，２９３，２３３号及び第９，３７１，３７１号；並びに米国特許出願公開第２０１１－００５２５６５号に開示されている。明確にするために、軽鎖を天然に欠く重鎖抗体に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶ_Ｈと区別するためにＶ_ＨＨ又はｓｄＡｂとして本明細書で公知である。

[0160] 本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループからなり、通常、特定の三次元構造特性、及び特定の電荷特性を有する。コンホメーション及び非コンホメーションエピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。用語「天然コンホメーションエピトープ」又は「天然タンパク質エピトープ」は、本明細書で互換的に使用され、抗原の線状配列の異なる部分からのアミノ酸が３次元空間において近接して集まる場合に生じる、抗原のコンホメーション折り畳み生じるタンパク質エピトープを含む。このようなコンホメーションエピトープは、原形質膜の細胞外側に分布している。

[0161] 「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される。しかしながら、エピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合する単離された抗体は、他の関連する抗原に対して交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせは、明確に規定された組成で組み合わされる。

[0162] 「免疫学的結合」は、本明細書で使用される場合、一般に、抗体又はその断片と、抗体が特異的である１型インターフェロン又は受容体との間に生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_Ｄ）の点から表すことができ、より小さいＫ_Ｄは、より大きい親和性を表す。選択された抗体の免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。従って、「オン速度定数」（Ｋ_ｏｎ）及び「オフ速度定数」（Ｋ_ｏｆｆ）の両方は、濃度並びに会合及び解離の実際の速度の算出によって決定され得る。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比率は、親和性に関連しない全てのパラメータのキャンセルを可能にし、従って、分離定数Ｋｄと等しい。一般に、Davies et al., Annual Rev. Biochem. 59:439-473 (1990)を参照されたい。

[0163] 「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、所定の抗原に対する抗体結合を指す。典型的には、抗体は、解離定数（Ｋ_Ｄ）１０^－７Ｍ以下で結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するＫ_Ｄよりも少なくとも２倍低いＫ_Ｄで、所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という表現は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。

[0164] ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」とは、１０^－８Ｍ以下、より好ましくは１０^－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１０^－１０Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプについて変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０^－７Ｍ以下、より好ましくは１０^－８Ｍ以下のＫ_Ｄを有する抗体を指す。

[0165] 本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。化合物に対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製され得る。これらには、Kohler & Milstein, 1975, Nature 256:495-497及び／又はKaprowski、米国特許第４，３７６，１１０号によって最初に記載されたハイブリドーマ技術；Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72及び／又はCote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030によって記載されたヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術；Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96によって記載されたＥＢＶ－ハイブリドーマ技術が含まれるが、これらに限定されない。代替的に、単鎖抗体の産生について記載される技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）を、化合物特異的単鎖抗体を産生するように適合させてもよい。

[0166] 本明細書で使用される場合、用語「ハイブリドーマ」は、２つの細胞型を一緒に融合することによって産生される細胞を指す。一般に使用されるハイブリドーマには、免疫動物由来の抗体分泌Ｂ細胞と、インビトロで無期限の増殖が可能な悪性骨髄腫細胞株との融合によって作製されるハイブリドーマが含まれる。これらの細胞をクローニングし、モノクローナル抗体を調製するために使用する。

[0167] 特異的結合部位の欠失を含む抗体断片は、公知の技術によって生成され得る。例えば、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生され得るＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されない。代替的に、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して（Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281）、目的のペプチドに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な同定を可能にすることができる。

[0168] 本明細書で使用される場合、用語「組換え抗体」は、組換え手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離された抗体、例えば（ａ）動物又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体（以下にさらに記載される）、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマからから単離された抗体、（ｃ）組換え、コンビナトリアルヒト又は他の種の抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段によって調製され、発現され、作製され、又は単離された抗体を指す。

[0169] 所望のペプチドに特異的な抗体又は抗体断片は、例えば、アガロースに結合され得、抗体－アガロース複合体は、ペプチドを精製するためのイムノクロマトグラフィーにおいて使用される。Scopes, 1984, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag New York, Inc., N.Y., Livingstone, 1974, Methods In Enzymology: Immunoaffinity Chromatography of Proteins 34:723-731を参照されたい。

[0170] 本明細書で使用される場合、用語「二重特異性分子」は、任意の薬剤、例えば、２つの異なる結合特異性を有する、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、この分子は、（ａ）細胞表面抗原、及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し得るか、又はそれらと相互作用し得る。用語「多重特異性分子」又は「ヘテロ特異性分子」は、２つより多い異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図される。例えば、分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合するか、又はそれらと相互作用し得る。従って、本開示は、二重特異性、三重特異性、四重特異性、及び他の多重特異性分子を含み、これらは、例えばＧＡＣなどの細胞表面抗原、及びＭタンパク質などの他の標的に向けられる。

[0171] 本明細書で使用される場合、用語「二価」抗体は、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作製する抗体を指す（例えば、Holliger et al., PNAS USA, 90, 6444-8, 1993; Poljak et al., Structure, 2, 1121-23, 1994を参照されたい）。「多価」抗体は、全てが同じ特異性であってもよく、又は複数の特異性を有する可能性がある２つ以上の結合ドメインを含む。

[0172] 本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」は、異なるドメイン（通常、可変ドメイン）を１つの種から、残りを別の種から保持する抗体（例えば、マウス－ヒトキメラ）である。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用される場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するか、又はそれと密接に一致する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって、又はヒト重鎖のＶ、Ｄ、及びＪセグメントの組換え中などのインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。従って、本明細書で使用される場合、用語「ヒト抗体」は、タンパク質の実質的に全ての部分（例えば、ＣＤＲ、フレームワーク、Ｃ_Ｌ、Ｃ_Ｈドメイン（例えば、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３）、ヒンジ、（Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ））がヒト生殖系列抗体遺伝子によってコードされるものと実質的に類似している抗体を指す。ヒト抗体は、それらのアミノ酸配列類似性に基づいてグループに分類されている（Nikoloudis et al., Peer J., 2, e456, 2014; Adolf-Bryfogle et al., Nucleic Acids Res., 43, D432-8, 2015）。従って、配列類似性検索を用いて、類似の線状配列を有する抗体を鋳型として選択して、ヒト又はヒト化抗体を選択又は作製することができる。キメラ抗体の産生のための技術は、Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454；Boss、米国特許第４，８１６，３９７号；Cabilly、米国特許第４，８１６，５６７号にさらに記載されている。

[0173] 本明細書で使用される場合、ヒト化抗体（再形成又はＣＤＲ移植とも呼ばれる）を作製するための「ヒト化」は、異種供給源（一般にげっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を減少させるため、及び親和性又はエフェクター機能（ＡＤＣＣ、補体活性化、Ｃ１ｑ結合）を改善するための確立された技術を含む。遺伝子操作されたＭＡｂは、ファージ表示されたランダム化配列を使用する分子生物学の技術を用いて、又はデノボで合成することにより生成することができる。例えば、非ヒト種由来のＣＤＲ領域を組み込んで抗体をヒト化するために、この設計は、ＣＤＲの残基における保存的アミノ酸置換、及び非ヒトＭＡｂ由来の残基のヒトフレームワーク領域への逆置換（逆突然変異）などの変異を含み得る。位置は、配列比較法、コンセンサス配列分析、又は可変領域の３Ｄ構造の構造解析によって識別又は同定することができる。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を示し、表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらの表示の精査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このようにして、ＦＲ（フレームワーク）残基は、コンセンサス配列及びインポート配列から選択及び組み合わされ得、その結果、所望の抗体特性、例えば標的抗原に対する増加した親和性が達成される。抗体構造についての既知のパラメータのデータセットが増加することにつれて、これらの技術の精巧さ及び精緻化も増加する。ヒト化に対する別のアプローチは、げっ歯類配列の表面残基のみをヒトｍＡｂｓ中に見出される最も一般的な残基で修飾することであり、「リサーフェシング（resurfacing）」又は「ベニアリング（veneering）」と呼ばれている。既知のヒトＩｇ配列は、例えば、ＩＧＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE Publishing, 1992に開示されている。本開示の抗体のヒト化又は操作は、任意の公知の発明、例えば、非限定的に、Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987), Carter et al., PNAS USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)、米国特許第５，７２３，３２３号；第５，９７６，８６２号；第５，８２４，５１４号；第５，８１７，４８３号；第５，８１４，４７６号；第５，７６３，１９２号；第５，７２３，３２３号；第５，７６６，８８６号；第５，７１４，３５２号；第６，２０４，０２３号；第６，１８０，３７０号；第５，６９３，７６２号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，２２５，５３９号；第４，８１６，５６７号；国際公開第１９９９００６８３；号及び国際公開第１９９４０１８２１９号に記載されるものを使用して実施され得る。

[0174] 本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生物学的に又は別様に望ましくない分子又は物質を意味し、すなわち、その分子又は物質は、毒性などの望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、対象に投与することができる。

[0175] 本明細書で使用される場合、用語「担体」は、緩衝液、アジュバント、分散剤、希釈剤などを示す。例えば、本開示のペプチド又は化合物は、公知の技術に従って、薬学的担体中での投与のために処方され得る。例えば、Remington, The Science & Practice of Pharmacy (9^thEd., 1995)を参照されたい。本開示による医薬製剤の製造において、ペプチド又は化合物（その生理学的に許容される塩を含む）は、典型的には、とりわけ、許容される担体と混合される。担体は、固体又は液体、又はその両方であることができ、好ましくはペプチド又は化合物と共に単位用量製剤として、例えば、約０．０１又は０．５重量％～約９５重量％又は９９重量％、特に約１重量％～約５０重量％、及び特に約２重量％～約２０重量％のペプチド又は化合物を含み得る錠剤として処方される。１つ以上のペプチド又は化合物を、本開示の製剤に組み込むことができ、これは薬学の周知の技術のいずれかによって調製することができる。

[0176] 本明細書で使用される場合、用語「培養物」は、１つ以上の微生物又は細胞を含むことが疑われる任意のサンプル又は標本を指す。「純粋培養物」は、細胞又は生物が特定の種又は属のみである培養物である。これは、微生物又は細胞の２つ以上の属又は種が存在する「混合培養物」とは対照的である。

[0177] 「検出する」及び「検出」は、それらの標準的な意味を有し、選択されたタンパク質又はタンパク質活性の検出、測定及び／又は特性評価を包含することが意図される。例えば、酵素活性は、タンパク質の阻害剤、アクチベーター、及びモジュレーターの検出、スクリーニング、又は特性評価の過程で「検出」され得る。

[0178] 用語「参照レベル」は、対象から、別の対象から以前に得ることができる参照レベルを指すか、又は目的の病原体に感染していない複数の正常対象に由来する数値を指すことができる。適切な参照レベルは、当業者に公知の技術に従って測定及び選択され得る。

[0179] 本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療すること」、又は「の治療」は、例えば、疾患、障害、又は状態の少なくとも１つの臨床症状の完全な又は部分的な緩和、軽減、又は減少を介した、状態の重症度の減少、又はその少なくとも部分的な改善若しくは修正を指す。

[0180] 本明細書で使用される場合、用語「投与すること」は、治療を必要とする対象に、本開示の化合物若しくはペプチドなどの組成物、又はペプチド若しくは化合物を含む医薬組成物を与えるか、又は提供するものとして最も広い意味で使用される。例えば、薬学的意味において、「投与する」は、例えば、ペプチド又は抗体を、例えば、静脈内、経口、局所、口腔内（例えば、舌下）、膣内、非経口（例えば、皮下；骨格筋、心筋、横隔膜筋及び平滑筋を含む筋肉内；皮内；静脈内；又は腹腔内）、局所（すなわち、皮膚及び粘膜表面の両方）、鼻腔内、経皮、関節内、髄腔内、吸入、門脈内送達、器官注入（例えば、眼又は血など）、又はエクスビボ（例えば、免疫アフェレーシスを介した）で受容される様式で配置することによって、治療として適用することを意味する。

[0181] 本明細書で使用される場合、「接触させること」は、活性成分を含む組成物が試験管、フラスコ、組織培養物、チップ、アレイ、プレート、マイクロプレート、キャピラリーなどの中の標的、例えば細胞標的を含むサンプルに導入され、抗原（例えば、ＧＡＣ）又は試験化合物（例えば、ＮＡＧ）の標的（例えば、抗体）への結合を可能にするのに十分な温度及び時間でインキュベートされること、又はその逆を意味する。インビボの状況において、「接触させること」は、診断又は治療分子が疾患の診断又は治療のために患者又は対象に導入され、分子は、インビボ又はエクスビボで、患者の標的組織、例えば血液組織と接触することが可能であることを意味する。

[0182] 本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、対象に幾分かの改善又は利益を提供する量を指す。別の言い方をすれば、「治療有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状の幾分かの緩和、軽減、又は減少を提供する量である。治療分子、例えば抗体の治療有効量を決定するための方法は、以下に記載される。

[0183] 本明細書で使用される場合、用語「阻害する」は、量、レベル、密度、代謝回転、会合、解離、活性、シグナル伝達、又は障害の病因因子に関連する任意の他の特徴の減少を指す。

[0184] 本明細書で使用される場合、用語「対象」は、個体を意味する。一態様では、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。一態様では、対象は、非ヒト霊長類であり得る。非ヒト霊長類には、数例を挙げると、マーモセット、サル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザルが含まれる。用語「対象」はまた、ネコ、イヌなどの飼い慣らされた動物、家畜（例えば、ラマ、ウマ、ウシ）、野生動物（例えば、シカ、エルク、ムースなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモットなど）及び鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなど）を含む。対象はまた、魚類、両生類、及びは虫類を含むことができるが、これらに限定されない。対象はさらに、ダニ、シラミ、及びノミなどの無脊椎動物を含むことができる。好ましくは、対象は、ヒト対象である。より好ましくは、対象は、ヒト患者である。

[0185] 本明細書で使用される場合、用語「検出すること」は、サンプル中の１つ以上のパラメータの測定によってサンプルに関連する値又は値のセットを決定するプロセスを指し、試験サンプルを参照サンプルと比較することをさらに含むことができる。本開示によれば、対象における疾患又は障害の検出は、対象の生物学的サンプル、例えば尿、唾液、喀痰、痰、鼻汁、粘液、涙、血液、又は血清中の１つ以上の抗原の同定、アッセイ、測定及び／又は定量化を含み得る。

[0186] 本明細書で使用される場合、用語「診断」は、対象が抗原又は病原体によって特徴付けられる疾患又は状態を含むがこれらに限定されない所与の疾患又は状態に罹患している可能性があるかどうかについての決定がなされ得る方法を指す。当業者は、しばしば、１つ以上の診断指標に基づいて診断を行い、その存在、非不在、量、又は量の変化は、疾患又は状態の存在、重症度又は非存在を示す。他の診断指標は、患者の病歴、身体症状などを含むことができる。本開示の診断方法は、単独で、又は他の診断方法と組み合わせて使用されて、所与の特徴を示す患者において経過又は転帰がより起こりやすいかどうかを決定し得る。

[0187] 本明細書で使用される場合、用語「細胞」は、用語「生物学的細胞」と互換的に使用される。生物学的細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞など、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞など、組織（例えば、筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織など）から解離した細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージなど）、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株由来の細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類などに由来し得る。

[0188] 本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、例えば、物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特徴付け及び／又は同定されるべき細胞及び／又は他の分子実体を含む、目的の対象から得られるか又は該対象に由来する組成物を指す。

[0189] 本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」は、対象の身体から得られる物質である。選択される特定の「生物学的サンプル」は、患者が有することが疑われる障害、従って、どの生物学的サンプルが分析物を含む可能性が最も高いかに基づいて変化する。組織サンプルの供給源は、血液又は任意の血液成分；体液；新鮮な、凍結及び／又は保存された器官又は組織サンプル又は生検又は吸引物からの固体組織；並びに対象又は血漿の妊娠又は発達の任意の時点からの細胞であり得る。サンプルとしては、初代若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、眼液、リンパ液、滑液、濾胞液、精液、羊水、乳、全血、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、喀痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、並びにホモジナイズされた組織、腫瘍組織、及び細胞抽出物などの組織抽出物が挙げられるが、これらに限定されない。サンプルはさらに、例えば、試薬による処理、可溶化、若しくは特定の成分、例えばタンパク質若しくは核酸について濃縮されることによって、それらの調達後に操作された生物学的サンプル、又は、切片化目的のために半固体若しくは固体マトリックス中に包埋された生物学的サンプル（例えば、組織学的サンプル中の組織又は細胞の薄片）を含む。好ましくは、サンプルは、例えば唾液、喀痰、痰、鼻汁、粘液、胸水、気管支肺胞洗浄液、血液などを含む肺臓器から得られる。

[0190] 本明細書で使用される用語「感受性」又は「素因」は、感染症、疾患又は障害を発症するリスクのある対象を記載する。これらの用語は、特定の遺伝子型及び／又はハプロタイプを有する対象が、そのような遺伝子型及び／又はハプロタイプを有さない対象よりも高い、特定の疾患又は障害を発症する可能性を有することを意味するように使用され得る。

[0191] 「緩和する」は、症状の緩解、寛解若しくは減少、又は患者の身体的若しくは精神的な幸福の改善のような任意の客観的又は主観的なパラメータを含む、病理又は状態の治療における成功の任意の指標を指す。症状の緩和は、身体診察及び／又は精神医学的評価の結果を含む客観的又は主観的パラメータに基づくことができる。

[0192] 「発色団」は、吸収特性を有する、すなわち、多様なフォトニック源のいずれかによる照射時に励起することができる部分を指す。発色団は、蛍光又は非蛍光であり得、とりわけ、染料、フルオロフォア、発光、化学発光、及び電気化学発光分子を含む。

[0193] 適切な間接標識の例には、基質と反応又は相互作用して検出可能なシグナルを生成することができる酵素（ＥＬＩＳＡ及びＥＭＩＴイムノアッセイで使用されるものなど）、標識部分に結合することができるリガンドなどが含まれる。間接標識として有用な適切な酵素としては、限定ではなく例として、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ及びウレアーゼが挙げられる。ＥＬＩＳＡ及びＥＭＩＴイムノアッセイにおけるこれらの酵素の使用は、Engvall, 1980, Methods Enzym. 70: 419-439及び米国特許第４，８５７，４５３号に詳細に記載されている。

[0194] 「基材」、「支持体」、「固体支持体」、「固体担体」、又は「樹脂」は、互換的な用語であり、任意の固相材料を指す。基材はまた、「固相」、「表面」、及び／又は「膜」などの用語を包含する。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、及びポリアクリルアミドなどの有機ポリマー、並びにそれらのコポリマー及びグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機、例えばガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ又は金属、例えば金又は白金であってもよい。「固体支持体」は、膜（例えば、ニトロセルロース）、マイクロタイタープレート（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン）、ディップスティック、試験管、及びガラス又はプラスチックビーズを含む。基材の構成は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜又は表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、又は非平面であり得る。固体支持体は、多孔質又は非多孔質であり得、膨潤又は非膨潤特性を有することができる。固体支持体は、ウェル、窪み、又は他の容器、器、特徴、若しくは位置の形態で構成され得る。複数の支持体は、試薬のロボット送達のために、又は検出方法及び／又は器具によってアドレス可能な、様々な位置でアレイ上に構成され得る。生体分子を固定化するための方法は、当技術分野で周知であり、抗体は、共有結合的に、又は非共有結合的に結合され得る。一実施形態では、固体支持体は、ビオチン化抗体が非共有結合的に結合しているストレプトアビジン被覆プレートである。

[0195] 統計学及び診断試験において、感度及び特異度は、二項分類試験の性能の統計的尺度である。感度（「リコール率」とも呼ばれる）は、陽性として正しく識別された実際の陽性の割合（例えば、状態を有すると正しく識別された病人のパーセンテージ）を測定する。特異度は、正しく識別された陰性の割合（例えば、状態を有していないと正しく識別された健康な人々のパーセンテージ）を測定する。これらの２つの尺度は、Ｉ型及びＩＩ型エラーの概念に密接に関連している。理論的な最適予測は、１００％の感度（すなわち、病気のグループからの全ての人々を病気として予測する）及び１００％の特異度（すなわち、健康なグループから誰も病気として予測しない）を達成することを目的とするが、理論的には、いずれの予測子もベイズ誤り率として知られる最小誤り限界を有する。

[0196] 「特異度」は、診断試験が陰性結果を同定する能力に関する。

[0197] 試験が高い特異度を有する場合、試験による陽性結果は、試験が試験している疾患の存在の可能性が高い。

[0198] 「感度」は、診断試験が陽性結果を同定する能力に関する。

[0199] 試験が高い感度を有する場合、陰性結果は、疾患の非存在を示唆するであろう。例えば、１００％の感度は、試験が全ての実際の陽性を認識する、すなわち、全ての病人が病気であると認識されることを意味する。従って、高特異度の試験とは対照的に、高感度の試験における陰性結果は、疾患を除外するために用いられる。

[0200] いずれの試験についても、通常、測定値の間にトレードオフが存在する。例えば、安全に対する潜在的な脅威について試験する空港のセキュリティ設定では、航空機及び搭乗者に脅威をもたらす物体を見逃すことのリスクを低減するために（高感度）、スキャナがベルトバックル及びキーのような低リスクアイテムをトリガするように設定され得る（低特異度）。このトレードオフは、受信機動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用してグラフで表すことができる。

[0201] いくつかの実施形態では、ＲＯＣは、要約統計量を生成するために使用される。いくつかの一般的なバージョンは、無識別線に対して９０度の線でのＲＯＣ曲線の切片（YoudenのＪ統計とも呼ばれる）；ＲＯＣ曲線と無識別線との間の面積；ＲＯＣ曲線下の面積、又は「ＡＵＣ」（「曲線下面積」）、又はＡ’（「ａ－プライム」と発音）；ｄ’（「ｄ－プライム」と発音」）；雑音単独条件下での系における活性の分布の平均と、信号単独条件下でのその分布との間の距離を、これらの分布の両方が同じ標準偏差で正規であるという仮定の下で、それらの標準偏差で割ったものである。これらの仮定の下で、ＲＯＣの形状は、ｄ’のみに依存することが証明され得る。

[0202] 試験の「陽性適中率（ＰＰＶ）」、又は「精度率」は、正しく診断された陽性試験結果を有する対象の割合を記述するために使用される要約統計量である。これは、陽性試験が試験される基礎状態を反映する確率を反映するので、診断方法の性能の尺度である。しかしながら、その値は、関心のある結果の有病率に依存し、これは特定の標的集団については不明であり得る。

[0203] ＰＰＶは、ベイズの定理を用いて導出することができる。ＰＰＶは、以下のように定義される：
ＰＰＶ＝真陽性の数＝真陽性の数
真陽性の数＋偽陽性の数 陽性呼び出しの数
ここで、「真陽性」とは、試験が陽性予測を行い、対象がゴールドスタンダード下で陽性結果を有する事象であり、「偽陽性」とは、試験が陽性予測を行い、対象がゴールドスタンダード下で陽性結果を有する事象である。

[0204] 「陰性適中率（ＮＰＶ）」は、正しく診断された陰性試験結果を有する対象の割合として定義される。高ＮＰＶは、試験が陰性結果を提供する場合、結果が陽性であった筈であることは稀であることを意味する。医学的試験のよく知られた状況では、高ＮＰＶは、病人を健康であると誤って分類することは稀であるという意味である。このことは、健康な人を病気であると誤って分類する試験の傾向について何も述べていないことに注意されたい。

[0205] ＮＰＶはまた、以下のように定義される：
ＮＰＶ＝真陰性の数＝真陰性の数 真陰性の数＋偽陰性の数 陰性呼び出しの数
ここで、「真陰性」とは、試験が陰性予測を行い、対象がゴールドスタンダード下で陰性結果を有する事象であり、「偽陰性」とは、試験が陰性予測を行い、対象がゴールドスタンダード下で陽性結果を有する事象である。有病率、感度、及び特異度が分かれば、陽性及び陰性適中率（ＰＰＶ及びＮＰＶ）は、以下のようにいずれの有病率についても算出できる：

[0206] 疾患の有病率が非常に低い場合、感度及び特異度の両方が高くても、陽性適中率は１に近くならないであろう。従って、一般集団のスクリーニングでは、陽性試験結果を有する多くの人々が偽陽性となることは避けられない。

[0207] 異常が稀であるほど、陰性試験が異常を示さないことを確実にすることができ、陽性結果が実際に異常を示すことを確実にすることができない。有病率は、試験が実施される前に、対象が疾患を有する確率（疾患の事前確率として知られる）として解釈することができる。陽性的中率及び陰性的中率は、試験で陽性及び陰性である対象についての同じ確率の修正推定値であり、事後確率として知られている。事前確率と事後確率の差は、試験の有用性を評価する一つの方法である。

[0208] どの試験結果についても、患者が目的の状態を実際に有した場合にその結果を得る確率と、患者が健康であった場合、対応する確率とを比較することができる。これらの確率の比は、尤度比と呼ばれ、感度／（１－特異度）として計算される。（Altman D G, Bland J M (1994). “Diagnostic tests 2: Predictive values”. BMJ 309 (6947): 102）。

[0209] 「除外基準」、「除外」、又は「ＲＯ」は、疾患又は状態の医学的鑑別診断において使用される用語であり、特定の基準が排除又は包含の臨床的意思決定プロセスにおいて評価される。基準を考慮して、対象が疾患を有するための全ての又は有意な数の基準を満たしていないと決定された場合、対象は「除外」される。

検出及び／又は診断の方法
[0210] 従って、本開示の一態様では、ヒト対象における疾患又は障害を診断及び／又は検出するための方法が提供される。本方法は、本明細書に記載される融合抗体又は結合剤を含むイムノアッセイを提供すること、及びイムノアッセイを対象由来のサンプルと接触させることを含む。

[0211] 別の態様では、ヒト対象における疾患又は障害を除外するための方法が提供され、この方法では、体液のサンプルを対象から取得し；サンプルを本発明による融合抗体と接触させて、抗体融合物がサンプル中の抗原又は標的の存在を検出するかどうかを決定し；存在が検出されないヒト対象について、疾患又は障害は除外される。

[0212] いくつかの実施形態では、サンプリングされる体液は、尿である。いくつかの実施形態では、サンプリングされる体液は、尿である。いくつかの実施形態では、サンプリングされる体液は、血液である。いくつかの実施形態では、サンプリングされる体液は、喀痰である。

キット
[0213] 固体、半固体、又は液体の生物学的サンプル中に存在する物質を検出するためのキットも提供される。キットは、生物学的サンプルを取得し、それらをサンプル緩衝液と接触させるための、サンプルをサンプル緩衝液と混合するための、装置上に標識を配置するための、及び関連する試験データを記録するための、装置を出荷するための、などの説明書を含み得る。キットは、アッセイの結果を読み取り、解釈するための説明書を含み得る。キットは、試験結果を標本サンプルと比較するために使用され得る参照サンプルをさらに含み得る。

[0214] この抗体は、高感度アッセイ検出のために、NanoGlo（登録商標）、NanoLuc（登録商標）、ＳＥＡＰ及びＧＦＰなどの遺伝的に融合されたタグを用いて潜在的に操作され得ることが理解されるであろう。発光又は蛍光タグ検出技術は、最大感度、高強度シグナル、低バックグラウンド、広いダイナミックレンジ、迅速なシグナル産生、及び次世代イムノアッセイ開発のためのアッセイ形式適合性を提供する。

[0215] 本発明の抗体融合物は、商標名Nano-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムで販売されているシステムでの使用に適している。このシステムは、NanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼの存在下でグロー型シグナルを生成する簡単な単一添加試薬を提供し；半減期が一般に使用される組織培養培地中で約１２０分である。試薬は、Nano-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質及びNano-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液を混合することによって調製される。この試薬は、NanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼを発現している細胞又はルシフェラーゼが分泌される際に培養培地上で直接使用することを可能にする一体型溶解緩衝液を含む。Nano-Glo（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬は、NanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼを検出するための専用製品である。

[0216] 別の実施形態では、抗体は、診断に使用するためのキット及び／又はイムノアッセイの一部を形成する。一実施形態において、イムノアッセイは、機器によって視覚的又は光学的に読み取ることができる検出可能なシグナルを提供する。検出可能なシグナルは、一実施形態では、抗体に結合したユウロピウム粒子などの検出粒子によって提供されるような蛍光シグナルである。

実施例
[0217] 本明細書に記載される構造、材料、組成物、及び方法は、本開示の代表的な例であることが意図され、本開示の範囲は、例の範囲によって限定されないことが理解されるであろう。当業者は、本開示が、開示された構造、材料、組成物、及び方法の変形で実施されてもよく、そのような変形は、開示の範囲内であると見なされることを認識するであろう。

実施例１
高感度生物発光イムノアッセイ検出システム
[0218] Nanoluc（登録商標）ルシフェラーゼ及びＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）は、抗体－抗原検出システムについて広い線形検出範囲検出（１．０Ｅ１０ ＲＬＵまで）を有する非常に明るい標識を提供する。各々は、生物発光検出によく適しており、比色アッセイ又は蛍光アッセイよりも優れると共に、改善された感度で非常に優れた安定性を提供する。ＰＣＴ Ｆａｂは、高感度アッセイ検出開発のために、遺伝的に融合されたタグで操作された。適切なアッセイシステムの例には：
（Ａ）融合Nanoluc（登録商標）ルシフェラーゼと共に組換え発現されたＰＣＴ ＭＡｂを使用するＰＣＴ抗体ベースのイムノアッセイ。Nanolucは、適切な基質を用いて極めて高い代謝回転率を可能にする、小さい高度に活性な操作されたルシフェラーゼタンパク質である。操作されたＰＣＴ Ｆａｂ＿Ｎｌｕｃ融合物は、安定なシグナルを有する広い線形範囲（１．０Ｅ１０ ＲＬＵまで）を示した。６０分間の基質インキュベーション後、有意なシグナル減少は観察されなかった。０．２ｐｇ／ｍｌのＦａｂ＿Ｎｌｕｃ濃度で、＞５０のシグナル／ノイズ比が観察された
（Ｂ）操作されたＳＥＡＰを用いたＰＣＴ抗体ベースのイムノアッセイ。５０ｋＤａの融合タグ酵素であるＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）は、市販されている多様な基質を用いて検出することができる。操作されたＰＣＴ Ｆａｂ＿ＳＥＡＰは、安定なシグナルを有する広い線形範囲の酵素活性（１．０Ｅ１０ ＲＬＵまで）を示し、３０分間の基質インキュベーション後に有意なシグナル減少は観察されなかった。０．１ｐｇ／ｍｌのＦａｂ＿ＳＥＡＰ濃度で、＞６５のシグナル／ノイズ比が観察された。
（Ｃ）組換え発現Ｍ２２＿Ｎｌｕｃ融合タンパク質を用いた甲状腺ＴＲＡｂベースのイムノアッセイ。ビーズベースの形式及びＥＬＩＳＡ形式を用いた初期の研究は、安定なシグナルを有する広い線形範囲の発光活性（１．０Ｅ９ ＲＬＵまで）を示し、３０分間の基質インキュベーション後に有意なシグナル減少は観察されなかった。５ｐｇ／ｍｌで、Ｍ２２＿Ｎｌｕｃ試薬は、シグナル／ノイズ比＞３０が観察されることを示した。
（Ｄ）ライムＶｌｓＥ／Ｃ６、ＯｓｐＣ／１０及びＤｂｐＡ抗体ベースのアッセイ。ここで、各ＭＡｂは、融合タグと共に組換え発現される。

[0219] 蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術及び遺伝的にコードされたＦＲＥＴバイオセンサータンパク質。ＦＲＥＴ技術及び遺伝的にコードされたＦＲＥＴバイオセンサータンパク質は、商業的なイムノアッセイ開発のための強力なツールを提供する。蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ又はＲＦＰ）は、特にＦＰが遺伝的にコード化可能であり、適合性があるため、ＦＲＥＴバイオセンサーにおけるドナー／アクセプターフルオロフォアとして最も一般的に使用される。ＦＲＥＴ対を測定する方法は、イムノアッセイのために十分に開発されている。

[0220] Ｍ２２（ＴＳＨＲ特異的）抗体を、蛍光タンパク質、すなわち緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））と共に、Ｆａｂ重鎖の末端に組換え発現させた。Ｍ２２＿Ｆａｂ＿ＧＦＰは、検出のためのＥＬＩＳＡベースのアッセイシステムで良好に機能した。これは、ラテラルフロー又はＥＬＩＳＡ及びフロースルーアッセイのような洗浄ステップを伴うアッセイにおいて有用である。また、結合を必要とせずにフローサイトメトリーアッセイに適用することもできる。

[0221] 抗体は、ＧＦＰ若しくはＲＦＰなどの蛍光タンパク質と共に組換え発現され得るか、又はＲＰＥ（Ｒ－フィコエリトリン）で標識され得ることが認識されるであろう。

[0222] 別個の組換え抗原又は抗体（同じアッセイの一部）上で、別個の蛍光タンパク質又はフルオロフォアを、第１の抗原／抗体の蛍光タンパク質の発光波長と一致する励起波長を有する融合タグを通して発現させることができる。得られたアッセイシステムは、次いで、均一アッセイシステム（すなわち、ＢＲＥＴ又はＦＲＥＴベースの）を支持する。例えば、ＴＳＨＲ特異的モノクローナル抗体Ｍ２２を、感受性標識／検出器に融合させ、イムノアッセイ開発のための融合タンパク質として組換え的に生成した。

[0223] 均一な形式で予備研究を行った。例えば、Ｍ２２＿Ｎｌｕｃは、（基質の存在下で）４６０ｎｍで発光し、ＲＰＥ－抗ヒトＩｇＧは、４８０ｎｍで励起及び５７５ｎｍで発光を示した。これら２つが混合されて結合が起こると、近接が、発光としての５７５ｎｍでの読み取りによって測定することができる、蛍光エネルギー移動をもたらした。

[0224] PromegaからのNanoBIT（登録商標）などの酵素断片相補アッセイも本発明に適用することができる。ここで、抗体及び抗原は「ベイト」及び「プレイ」として機能し、各々、「レポーター」として作用する第３のタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の断片に組換え的又は共有結合的に連結される。ベイトタンパク質とプレイタンパク質との間の相互作用は、レポータータンパク質の断片を近接させて、その酵素活性が測定できる機能性レポータータンパク質をそれらが形成することを可能する。ルシフェラーゼ由来のナノBIT（登録商標）（Large BIT（登録商標）は１５６ａａタンパク質であり、Small BIT（登録商標）は１１ａａペプチドである）は、本発明に従って容易に使用することができる。最初に、組換え抗体は、抗体重鎖又はＦａｂ重鎖若しくは軽鎖の末端に融合された非機能性発光タンパク質部分と共に発現される。次に、非機能性発光タンパク質の第２の断片が、発光タンパク質の第２の断片が第１の発光タンパク質部分に結合することができるように、第２の抗原又は抗体に連結される。これは、相補的な機能性タンパク質を生じる。この結合は、例えば、第１の抗体が、第２の抗体が結合する抗原に結合して、発光タンパク質の２つの部分を互いに近接させ、従って結合が起こることを可能にする場合に起こる。これにより、基質と反応してシグナル生成をもたらす活性酵素が得られる。

実施例２
甲状腺イムノアッセイのための生物発光分析物検出システム
[0225] 検出方法は、抗原／抗体結合事象の検出の精度が改善された、増強された感度を提供するために実施された。この努力は、２つの部分に分けられた：最初に、抗原／抗体発現システムを探索及び調査し、次いで、評価のために分析物検出システムを同定する。この評価は、Promega（登録商標）Corp.によって主に開発及び製造された異なるルシフェラーゼベースの検出システム、例えば、ホタルルシフェラーゼ（Bright-Glo（登録商標））を同定した。PromegaによるGloSensor（登録商標）は、改良された細胞内サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）均一検出システムであるホタルルシフェラーゼの融合及び環状配列に基づいて開発及び商業化された。さらに、PromegaによるNanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼ（Nluc）システムが適切である。England et al., NanoLuc: a small luciferase is brightening up the field of bioluminescence. Bioconjug. Chem. 27, 1175-1187 (2016)；及びBoute et al., NanoLuc（登録商標）luciferase - a multifunctional tool for high throughput antibody screeningを参照されたい。Front Pharmacol. 2016;7:27を参照されたい。この小さい（１９ｋＤａ）、高度に安定なＡＴＰ非依存性の生物発光タンパク質は、アッセイ開発のための強固な超高感度検出システムとなった。このシステムは、汎用性があり、細胞、固相ＥＬＩＳＡ、並びに酵素のバイオエンジニアリング及び／又はＢＲＥＴベースのスクリーニングアッセイの使用を伴うホモジニアスアッセイを可能にする。Nluc（登録商標）タンパク質ルシフェラーゼは、改善されたポイントオブケア（ＰＯＣ）試験を提供する。

[0226] NanoLucルシフェラーゼ特性の有益な特性には、小さいサイズ（１９ｋＤａ）、熱安定性、広いｐＨ範囲にわたる活性、モノマー構造、哺乳動物細胞におけるＰＴＭ検出なし、ジスルフィド結合の形成なし、細胞における均一な分布、高輝度及び広い線形ダイナミックレンジが含まれる。さらに、NanoLucは、ＡＴＰ非依存性グロー型シグナルであり、半減期＞２時間で、ランプオン（ramp-on）速度なしで安定なシグナルを提供する。図１は、Nanoluc（登録商標）ルシフェラーゼシステムの概要を示す。

実施例３
[0227] ＴＳＨＲの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸２０～２７５を含むＴＳＨＲの合成断片の融合タンパク質を、本明細書ではＬ１～１０と呼ぶ。Ｌ１－１０融合タンパク質は、ＢＩＡＣＯＲＥスクリーニングアッセイにおいて、甲状腺刺激抗体（Ｍ２２、米国特許第８，１１０，６６４号に開示；参照により本明細書に援用される配列）及び甲状腺遮断抗体（Ｋ１－７０、米国特許第９，０７３，９９２号に開示、参照により本明細書に援用される配列）に特異的に結合する（データは示さず）。所望の抗原の同定と、Ｌ１－１０（ＴＳＨ受容体、ＴＨＳＲ）及び抗ＴＳＨＲ抗体（ＴＲＡｂ）試薬の開発の後、ＥＬＩＳＡベースの甲状腺イムノアッセイを開発した。生物発光技術を探索するために、Ｌ１－１０／ＴＲＡｂ Ｍ２２アッセイシステムを用いて初期探索研究を行った。２つの組換え融合構築物、各々、Ｍ２２＿ＮＬＵＣ抗体及びＬ１－１０＿ＮＬＵＣ抗原を設計し、哺乳動物発現のためにＮＬＵＣタグで操作した。その後のタンパク質配列を、構築のために以下に列挙する。タンパク質を、各々、ＮＩ－ＮＴＡ及びＳＴＲＥＰＴＡＣＴＩＮ技術（ＡＴＵＭで）によって親和性精製し、酵素及び機能試験のために供給した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによってタンパク質の特性評価を行った。

[0228] Ｌ１－１０融合タンパク質は、以下の構造を有する：
ψ－β－γ_１－ε－γ_２－π－ＰＥＰ－φ （式Ｉ）
式中、
ψは、シグナルペプチドであるか、又は存在しない；
βは、結合分子であるか、又は存在しない；
γ_１及びγ_２は、各々、互いに独立して、リンカー又は存在しない；
εは、発現エンハンサーであるか、又は存在しない；
πは、存在するか又は存在しない切断可能な部位である；
ＰＥＰは、複数のαＴＳＨＲ ＥＣＤロイシンリッチ領域（ＬＲＲ）を含むポリペプチドである、
φは、検出可能な標識であるか、又は存在しない。

[0229] ：この研究では、Ｌ１－１０は、以下から構成された
（ｉ）シグナルペプチド（ψ）ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１１）；
（ｉｉ）結合分子（β）ＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１２）；
（ｉｉｉ）リンカー１（γ_１）ＧＧＧ（配列番号：１３）；
（ｉｖ）以下の配列を有するマルトース結合タンパク質の発現エンハンサー（ε）

；
（ｖ）リンカー２（γ_２）は、ポリペプチドＧＧＧＳ（配列番号１３）を含む；
（ｖｉ）ポリペプチドＥＮＬＹＦＱ（配列番号１５）の切断可能部位（π）；及び
（ｖｉｉ）ｈＴＳＨＲのａａ２０～２７５に対応するポリペプチドのＰＥＰ配列：

[0230] Ｍ２２＿ＮＬｕｃ＿ＨｉｓＴａｇ抗体タンパク質アミノ酸配列は、以下の通りである：
＞ｍＡＢ ＮＬｕｃ－Ｈｉｓ＿ｖＨ－ＩｇＧ１

＞ｍＡＢ ＮＬｕｃ－Ｈｉｓ＿ＶＬ－ラムダ３

[0231] システム性能をＥＬＩＳＡ／マイクロプレートアッセイ形式で評価し、融合タンパク質のルシフェラーゼ酵素活性を測定した。

酵素発光滴定
[0232] 精製したＮｌｕｃ融合Ｍ２２抗体又はＬ１－１０抗原を、ＰＢＳ－ＢＳＡ ０．１％溶液中で連続的に希釈した。各希釈液５０マイクロリットルを９６ウェル白色マイクロプレートに分配した。次いで、ＰＢＳ中で２００倍希釈した５０μＬのフリマジンを各ウェルに添加した。短いインキュベーション時間（＜３分）後、発光をPerkin-Elmer VictorX 2030 Luminescence Reader（PE Victor 2030 Workstationソフトウェアを使用）で読み取った。

[0233] ＥＬＩＳＡアッセイ手順。表２は、本発明によるアッセイ開発において使用されたＥＬＩＳＡ試薬を示す。

[0234] Microlite 2 Whiteプレートを使用する）プレート被覆を以下のように行った。希釈プレート被覆タンパク質をＰＢＳ緩衝液中で調製した。５０μｌ又は１００μｌ／ウェルの１０μｇ／ｍＬ抗原又は抗体を被覆緩衝液に添加した。プレートを密封し、４℃で一晩インキュベートした。振盪は行わなかった。次いで、プレートをＰＢＳＴ ４Ｘ、２５０μｌ／ウェルで洗浄し、特に示さない限り５秒浸漬した。次いで、２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液でブロックし、プレートを密封し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴ ４Ｘで洗浄した。

[0235] インキュベーションステップは、以下の通りであった。適切な希釈標準を、対照及びサンプルと共に、別個の非粘着性プレート中のアッセイ希釈液中で調製した。５０μｌ又は１００μｌの各抗体又は抗原（示された濃度）をプレートウェルにピペットで移した。プレートを密封し、室温で６０分間インキュベートした（特に示さない限り）。プレートをＰＢＳＴ ４ｘで洗浄した。５０μｌ／ウェルのFurimazine基質をピペットで移し、室温で３分間インキュベートした。プレートをPerkin-Elmer Victor X（登録商標）2030 Luminescence Reader（PE Victor 2030 Workstationソフトウェアを使用）で読み取った。

[0236] タンパク質特性評価結果は、抗体融合タンパク質が還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で７０ｋＤａ（重鎖）及び３０ｋＤａ（軽鎖）として精製され、非還元ゲル（２２０ｋＤａバンド）上でより高い分子バンドが観察されることを実証した。精製されたタンパク質は、ＨＰＬＣ上で１つの主要な優勢ピークを示した（保持時間５．３、ヒトＩｇＧ分子量に対応）。結果を図２に示す。

実施例４
[0237] Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、広い線形範囲の酵素発光活性（１．０Ｅ８ ＲＬＵまで）を示した。１～１０ｐｇ／ｍＬの濃度でも良好なシグナル／ノイズ比が観察された。５、１０及び１５分間の基質インキュベーション後、減少したＲＬＵシグナルは観察されなかった。

[0238] Ｌ１－１０抗原をマイクロプレート上に一晩直接被覆した。連続希釈Ｍ２２＿ＮＬｕｃを各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。対照ウェルを、５μｇ／ｍＬ Ｍ２２（非標識）の存在下でＭ２２＿Ｌｕｃと共にインキュベートした。

[0239] Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、３０分アッセイで用量応答抗原結合活性を示した（アッセイ時間は、有意に短縮された）。非標識Ｍ２２は、被覆Ｌ１－１０へのＭ２２＿Ｌｕｃ結合に対する特異的阻害を示した。しかしながら、感度は非常に低く、Ｌ１－１０抗原の直接被覆が抗原結合活性の不活性化を引き起こし、それによって感度の損失を引き起こすという以前の研究と一致した。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。

実施例５
[0240] ストレプトアビジンを、Ｌ１－１０捕捉のためのさらなるステップとして被覆した。連続希釈Ｍ２２＿ＮＬｕｃを各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。上清（Ｓｕｐｔｅ）及び結合シグナル（Ｂｏｕｎｄ）の両方を、基質発達後に測定した。Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、ＳＡ被覆プレート上で用量応答を示した。しかしながら、感度は、上清（Ｓｕｐｔｅ）として各ウェルに添加された全シグナルと比較して、非常に不良であるように思われた。これは、ＳＡとＬ１－１０上のＳｔｒｅｐタグとの間の結合親和性が低いためであり、それによって感度の損失を引き起こした。この結果を、図４に示す。

実施例６
[0241] ストレプトアビジン磁気ビーズを、Ｌ１－１０捕獲のためのさらなるステップとして使用した。１：１０希釈したストレプトアビジン磁気ビーズをＬ１－１０と共にインキュベートし、１時間回転させた。遠心分離（３０００ｒｐｍで３分間）により３回洗浄した。連続希釈Ｍ２２＿ＮＬｕｃを各チューブに添加し、１時間インキュベートした。上清（Ｓｕｐｔｅ）及び結合シグナル（Ｂｏｕｎｄ）の両方を、基質発達後に測定した。Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、ＳＡビーズアッセイで用量応答を示した。上記のように、感度は、上清（Ｓｕｐｔｅ）として各ウェルに添加された全シグナルと比較して不十分に見える。これは、ＳＡビーズとＬ１－１０上のＳｔｒｅｐタグとの間の結合親和性が低いためであり、それによって感度の損失を引き起こした。これらの結果を図５に示す。

実施例７
[0242] この研究は、検出試薬としてのNanoLucの使用と、Ｌ１－１０アッセイの開発に焦点を当てた。マウスモノクローナルＳｔｒｅｐＭＡｂ（ＩＢＡ＃２－１５１７－００１）及び抗ＭＢＰ（ＮＥＢ＃Ｅ８０３２）の間接捕捉として被覆されたウサギ抗マウス（ＲＡＭ、ＧＥ＃２９－２１５２－８１）を使用して、間接サンドイッチアッセイを試験した。マウスモノクローナル抗体は、Ｌ１－１０のアンカーとして役立った。連続希釈Ｍ２２＿ＮＬｕｃを各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、広範囲のＲＬＵシグナルにわたって良好な感度を示した。＜１００ｎｇ／ｍＬのＭ２２＿ＮＬｕｃ濃度でも広範囲のＳ／Ｎが観察された。これは、ＲＡＭがマウスモノクローナル（抗ＭＢＰ又はＳｔｒｅｐＭＡｂ）ウェルに結合し、Ｌ１－１０抗原を捕捉し、必要な感度のためにＭ２２－ＮＬｕｃによって検出されることを実証した。結果を図６に示す。

実施例８
Ｌ１－１０／抗ＭＢＰ被覆ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭ２２＿ＮＬｕｃ抗体用量応答
[0243] 標準的なサンドイッチアッセイを試験した。抗ＭＢＰモノクローナル抗体を、Ｌ１－１０抗原の直接捕捉として被覆した。連続希釈Ｍ２２＿ＮＬｕｃを各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。Ｍ２２＿ＮＬｕｃは、広範囲のＲＬＵシグナルにわたって良好な感度を示した。１００ｎｇ／ｍＬをはるかに下回るＭ２２＿ＮＬｕｃ濃度でも、広範囲のＳ／Ｎが観察された。これは、マウス抗ＭＢＰモノクローナルがＬ１－１０抗原に十分に結合し、Ｍ２２－ＮＬｕｃによって高い感度で検出されることを実証した。結果を図７に示す。

実施例９
[0244] Ｌ１－１０／抗ＭＢＰベースのＥＬＩＳＡアッセイでのＭ２２＿ＮＬｕｃとのＭ２２競合（用量応答）の滴定。固定Ｍ２２＿ＮＬｕｃ濃度（１２０ｎｇ／ｍＬから開始）で、非標識Ｍ２２を用量応答滴定に使用した。Ｍ２２は、このアッセイ形式でＭ２２＿ＮＬｕｃとの競合を示した。Ｍ２２＿ＮＬｕｃ １２０又は４０ｎｇ／ｍＬを用いて、Ｍ２２のＩＣ５０を、各々３．８ＩＵ／Ｌ及び２．１ＩＵ／Ｌ（注：１０ｎｇ／ｍＬ＝１ｍＩＵ／ｍＬ又は１ＩＵ／Ｌ）と決定した。アッセイシステムで使用されるＭ２２＿ＮＬｕｃが少なくなると、感度が検出のためにより良好になる。これは、次の実験において３０又は１０ｎｇ／ｍＬのＭ２２＿ＮＬｕｃを使用する場合に当てはまった。これは、Cheng-Prusoff式Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（［Ｌ］／Ｋｄ）によるデータ分析と一致し、式中、（Ｌ）は、リガンド（この場合、Ｍ２２－ＮＬｕｃ）の濃度である。システムで使用される［Ｌ］が小さいほど、ＩＣ５０値は低くなる。抗体又は抗原の最小濃度を使用して、より良好な感度に達することができる。
［Ａｇ］被覆＋［Ａｂ－Ｌｕｃ］⇔Ｋｄ ［Ａｇ］［Ａｂ－Ｌｕｃ］
［Ａｇ］被覆＋［Ａｂ］⇔Ｋｉ ［Ａｇ］［Ａｂ］
結果を図８に示す。

実施例１０
[0245] Ｌ１－１０／抗ＭＢＰベースのＥＬＩＳＡアッセイでのＭ２２＿ＮＬｕｃとのＭ２２競合（用量応答）の滴定。固定Ｍ２２＿ＮＬｕｃ濃度（３０又は１０ｎｇ／ｍＬ）で、非標識Ｍ２２を用量応答競合滴定に使用した。３０又は１０ｎｇ／ｍＬのＭ２２＿ＮＬｕｃを用いて、Ｍ２２（非標識）のＩＣ５０を、各々１．５ＩＵ／Ｌ及び１．０ＩＵ／Ｌと決定した。従って、より少ないＭ２２＿ＮＬｕｃ（１２０ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬへ）を使用した場合、Ｍ２２のＩＣ_５０は、３．８倍減少した（３８ｎｇ／ｍＬから１０ｎｇ／ｍＬへ）。抗ＭＢＰ／Ｌ１－１０捕捉プレートを４℃で５日間保存し、同じ活性が観察された。結果を図９に示す。

実施例１１
[0246] ＭＢＰ＿Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ抗原タンパク質試験を行った。図１０は、Ｎｉ－ＮＴＡカラムによる精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示す。

実施例１２
[0247] Furimazine基質を用いたＬ１－１０＿ＮＬｕｃ酵素滴定。Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃは、広い線形範囲の酵素発光活性（１．０Ｅ８ ＲＬＵまで）を示した。１～１０ｐｇ／ｍＬ濃度でも良好なシグナル／ノイズ比が観察された。基質を３分間インキュベートした後、一貫したＲＬＵシグナルが観察された。結果を図１１に示す。

実施例１３
[0248] Ｍ２２被覆ＥＬＩＳＡアッセイでのＬ１－１０＿ＮＬｕｃ滴定。Ｍ２２をマイクロプレート上に一晩直接被覆した。連続希釈Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃを各ウェルに添加し、５０分間インキュベートした。対照ウェルを、５０μｇ／ｍＬ Ｍ２２（非標識）の存在下でＬ１－１０＿Ｌｕｃと共にインキュベートした。Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃは、広範囲のＲＬＵシグナル（７．０Ｅ６ ＲＬＵまで）にわたって良好な感度を示した。１００ｎｇ／ｍＬをはるかに下回るＬ１－１０＿ＮＬｕｃ濃度でも、広範囲のＳ／Ｎが観察された。従って、感度は、より少ないＬ１－１０＿ＮＬｕｃを使用するように最適化された場合に、大きくなる。これは、１つの単一ステップＬ１－１０＿ＮＬｕｃアッセイが実行可能であり、特異的用量応答結合活性が例外的に広い線形範囲で観察されることを実証した。結果を図１２に示す。

実施例１４
[0249] Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ／Ｍ２２ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭ２２用量応答曲線。Ｍ２２をマイクロプレート上に被覆した。固定濃度のＬ１－１０＿ＮＬｕｃ（連続希釈Ｍ２２を含む）を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。固定Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ濃度（１μｇ／ｍＬから開始）で、非標識Ｍ２２は、このアッセイにおいてＬ１－１０＿ＮＬｕｃとの良好な競合を示した。Ｍ２２は、広範囲のＲＬＵシグナルにわたって良好な感度を示した。Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ １μｇ／ｍＬを用いて、Ｍ２２のＩＣ５０を３０ｎｇ／ｍＬ（３ＩＵ／Ｌ）と決定した。結果を図１３に示す。

実施例１５
[0250] Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ／Ｍ２２ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおけるＭ２２用量応答曲線。Ｍ２２抗体をマイクロプレート上に被覆した。固定濃度のＬ１－１０＿ＮＬｕｃ（連続希釈Ｍ２２を含む）を各ウェルに添加し、１時間インキュベートした。固定Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ濃度（０．２μｇ／ｍＬ又は０．１μｇ／ｍＬ）で、非標識Ｍ２２は、このアッセイにおいてＬ１－１０＿ＮＬｕｃとの良好な競合を示した。Ｍ２２は、広範囲のＲＬＵシグナルにわたって良好な感度を示した。Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃの０．２μｇ／ｍＬ又は、０．１μｇ／ｍＬを用いて、Ｍ２２のＩＣ５０を、各々１２ｎｇ／ｍＬ（１．２ＩＵ／Ｌ）及び８ｎｇ／ｍＬ（０．８ＩＵ／Ｌ）と決定した。より少ないＬ１－１０＿ＮＬｕｃ（１０００ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ）を使用した場合、Ｍ２２のＩＣ５０は、３．５倍（３０ｎｇ／ｍＬから８ｎｇ／ｍＬ）低下した。結果を図１４Ａ及び１４Ｂに示す。

[0251] Ｍ２２＿ＮＬｕｃ抗体タンパク質については、小タンパク質ＮＬｕｃを化学量論比で組換え抗体と遺伝的に融合させたので、これは、アッセイ開発のための直接的な標識試薬を提供した。このプロセスは、化学標識結合プロセスと比較して、抗体の不活性化なしに最大活性をもたらした。ＮＬｕｃ活性の広い発光線形ダイナミックレンジは、感度を高めたＬ１－１０アッセイを可能にした。本明細書のＨＲＰ結合体アプローチによって測定されたＭ２２用量応答曲線と比較して、少なくとも３倍の感度が観察された。Ｍ２２＿ＮＬｕｃ融合物によって検出される、プレート上の抗ＭＢＰによって捕捉されたＬ１－１０を有するこのサンドイッチ形式は、潜在的に１時間未満のアッセイにおいて、１つの単純なステップの定量的ＥＬＩＳＡを可能にした（Ｌ１－１０捕捉プレートを乾燥させ、安定に保存することができるので）。

[0252] Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ抗原タンパク質については、小タンパク質ＮＬｕｃを化学量論比で組換え抗原と遺伝的に融合させたので、これは、アッセイ開発のための直接的な標識試薬を提供した。このプロセスは、化学標識結合プロセスと比較して、抗原の不活性化なしに最大活性をもたらした。操作Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃを用いた直接イムノアッセイは、１時間未満のアッセイで、最適化された感度で、１つの単一ステップ定量的甲状腺ＥＬＩＳＡを可能にした。優れた広い線形ダイナミックレンジは、感度を高めたＬ１－１０アッセイを可能にした。低濃度のＬ１－１０＿ＮＬｕｃで測定したＭ２２用量応答曲線と比較して、少なくとも３倍の感度が観察された。従って、ＢＲＥＴなどのNanoLucベースの技術プラットフォームの潜在的応用は、操作Ｌ１－１０＿ＮＬｕｃ及びＭ２２＿Ｎｌｕｃに加えて、さらなる高感度且つ定量的なＰＯＣアッセイ開発のために使用することができる。

実施例１６
Ｍ２２＿ＧＦＰ＿Ｆａｂによる細胞表面上のＴＳＨＲの蛍光検出
[0253] ＣＨＯ細胞を、ＴＳＨＲ、５×１０^６細胞／ｍＬ、１００μＬの体積で操作した。条件当たりの細胞数は５×１０^５であった。対照は、反応緩衝液中０．９５～３０．４μｇ／ｍＬのＭ２２ Ｆａｂを用いて設計し、氷上に１時間置いた。次いで、これらを、反応緩衝液中、４２．５μｇ／ｍＬ（すなわち、一次抗体に対して５０％過剰）の濃度で、マウス抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体－Alexa Fluor 488と共にインキュベートし、氷上に１時間置いた。Ｍ２２ Ｆａｂ－ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を用いた試験を以下のように行った。

[0254] 反応緩衝液中０．９～４５．５μｇ／ｍＬの濃度のＭ２２ Ｆａｂ－ＧＦＰを取得し、氷上に１時間置いた。二次抗体は必要とされなかった。Ｍ２２ Ｆａｂ－ＧＦＰ融合物を、３００×ｇでの遠心分離で、各５分間、３回洗浄した。フローサイトメトリーを、Apogee Flow Systemsサイトメーター及びＦＩＴＣ／Alexa Fluor 488蛍光についてゲートした一重項細胞で行った。シグナルを記録し、用量応答曲線をプロットした。実験の概略図を図１６に示す。これらの実験の結果を図１７～１９に示す。

[0255] 図１７は、Ｎｉ－ＮＴＡカラムによる精製タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によるＭ２２Ｆａｂ＿ＧＦＰタンパク質発現及び精製を示す。図１８において、陰性対照（一次Ａｂ又は二次Ａｂ単独）は、非特異的結合バックグラウンドとして最小のシグナルを生じたことが分かる。緑色蛍光強度を有するＭ２２の増加が、細胞当たりに観察された。蛍光強度は、５×１０^６／ｍＬの細胞で約Ｍ２２～３０μｇ／ｍＬにピークを示した。Ｍ２２は、二次抗体を細胞表面上のＴＳＨＲ数の検出に使用した場合、有効な用量応答を示した。陰性対照は、非特異的結合バックグラウンドとして最小のシグナルを生成した。増加したＭ２２－ＧＦＰは、細胞当たりの測定された緑色蛍光強度をもたらした。蛍光強度は、５×１０^６／ｍＬの細胞で約Ｍ２２－ＧＦＰ～２０μｇ／ｍＬで定常に達した。これらの結果を図１９に示す。図から分かるように、Ｍ２２－ＧＦＰは、細胞表面上のＴＳＨＲ数を検出するために、Ｍ２２と二次抗体との組み合わせと同等に有効であった。従って、二次抗体は必要でないことが見出された。この結果は、標識の変動の減少、並びに細胞及び抗体の損失の減少が細胞当たりの受容体のより正確な測定をもたらすことを実証する。

実施例１７
抗体融合物のラテラルフロー検出
[0256] 本技術の抗体融合物を、ラテラルフローイムノアッセイでの性能について分析した。試験した抗体融合物は、Halo Tag（Promega）タンパク質タグに融合し、リガンドに結合したユウロピウムビーズに結合した抗Ｆｌｕ Ａ抗体であった（図２０Ａ）。Halo Tag－リガンド相互作用は、Halo Tag融合抗Ｆｌｕ Ａ抗体とリガンド結合ユウロピウムビーズとの結合の基礎である。次いで、表３に示すように、この抗体融合結合体をニトロセルロース上にスポットし（チャネル５及び６）、非修飾Ｆｌｕ Ａ抗体を陽性対照としてニトロセルロース上にスポットし（チャネル１）、抗体を有さないリガンドをニトロセルロースストリップの陰性対照としてスポットした（チャネル２～４）。

[0257] 各チャネルは、約８０～９０ｎＬのスポッティング溶液を含むユニークな捕捉試薬（表３による）でスポットされた。次いで、スポットされたニトロセルロースカードを、乾燥貯蔵前に５分間強制空気オーブン中で乾燥させた。

[0258] 次に、ニトロセルロースストリップに添加する前に、Ｆｌｕ Ａ抗原を、Ｆｌｕ Ａ対照Ａｂ（対照ビーズ）又はＦｌｕ Ａ融合Ａｂ（抗体融合ビーズ）に結合させた試験ビーズと予備混合した。抗原濃度を、１００ｎｇ／ｍＬ及び０ｎｇ／ｍＬの２つのレベルで試験した。次いで、ビーズと予備混合したサンプル１００ｕＬをストリップに添加し、画像化前に１０分間流した

[0259] ラテラルフローイムノアッセイによる結果は、対照ビーズ及び抗体融合ビーズの両方について、チャネル１、５、及び６において蛍光シグナルが検出されたことを示す（図２０Ｂ）。この結果は、チャネル１（対照Ｆｌｕ Ａ抗体）、５（０．９ｍｇ／ｍＬ Ｆｌｕ Ａ抗体融合物）、及び６（０．６ｍｇ／ｍＬ Ｆｌｕ Ａ抗体融合物）にスポットされた捕捉抗体に試験抗体が効果的に結合したことを示す。蛍光シグナルは、陰性対照リガンドチャネル２、３、及び４には存在しなかった。捕捉抗体の非存在下でのリガンドスポットは、陽性シグナルを生成しなかったので、これらのチャネルにおけるシグナルの非存在は、捕捉抗体の特異性を示す。これらの結果は、Ｆｌｕ Ａ／Halo Tag融合物を含む抗体融合タンパク質がラテラルフローイムノアッセイにおいて適切に機能することを示す。これは、さらに、ラテラルフロー形式における、本明細書に記載される抗体融合物の有用性を実証する。

Claims (27)

1. 抗体融合物の製造方法であって：
   ａ．目的の抗体又はその断片の核酸配列を取得することと；
   ｂ．前記目的の抗体、又はその断片の核酸を、目的の標識の核酸配列に作動可能に連結することと；
   ｃ．前記目的の標識を有する前記抗体又はその断片を抗体融合物として宿主細胞内で発現させることと；
   ｄ．前記抗体融合物を単離することと；を含み、
   ここで、前記目的の標識は、ルシフェラーゼを含む発光標識、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）のうちの少なくとも１つを含む蛍光標識、及びホスファターゼ標識からなる群から選択される、方法。
2. 前記目的の抗体が、抗ＰＣＴ抗体、抗甲状腺ＴＲＡｂ、抗ライムＶｌｓｅ／Ｃ６、抗ＯｓｐＣ／１０、抗ＤｂｐＡ抗体、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ルシフェラーゼが、ＮＬｕｃ（NanoLuc）、ＲＬｕｃ（RetinaLuc）、及びＦＬｕｃ（FireflyLuc）のうちの少なくとも１つである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ホスファターゼ標識がＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記蛍光標識が、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記目的の抗体が抗ＰＣＴ抗体又はその断片を含み、前記目的の標識がNanoLucを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記目的の抗体が抗ＰＣＴ抗体又はその断片を含み、前記目的の標識がＳＥＡＰを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記目的の抗体が抗甲状腺ＴＲＡｂ又はその断片を含み、前記目的の標識がＮＬｕｃを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記目的の抗体が、Ｌｙｍｅ ＶｌｓｅＥ／Ｃ６抗体、ＯｓｐＣ／１０抗体、又はＤｂｐＡ抗体、又はそれらの断片を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記目的の抗体がＭ２２（ＴＳＨＲ特異的）抗体又はその断片を含み、前記目的の標識が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記目的の抗体がＭ２２（ＴＳＨＲ特異的）抗体又はその断片を含み、前記目的の標識が赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む蛍光タンパク質を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記目的の抗体がＭ２２＿ＮＬｕｃ又はその断片を含み、前記抗体がＲＰＥ－抗ヒトＩｇＧ又はその断片を含む第２の抗体と対になっている、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
13. 抗体又はその断片、及び以下からなる群から選択される目的の標識を含む、抗体融合物：
    ａ．ルシフェラーゼ；
    ｂ．蛍光タンパク質；及び
    ｃ．ＳＥＡＰ（分泌胚性アルカリホスファターゼ）。
14. 前記抗体が、抗ＰＣＴ抗体、抗甲状腺ＴＲＡｂ、抗ライムＶｌｓｅ／Ｃ６、抗ＯｓｐＣ／１０、抗ＤｂｐＡ抗体、及びそれらの断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体融合物。
15. 前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）のうちの少なくとも１つである、請求項１３又は１４に記載の抗体融合物。
16. 前記ルシフェラーゼが、ＮＬｕｃ（NanoLuc）、ＲＬｕｃ（RetinaLuc）、及びＦＬｕｃ（FireflyLuc）のうちの少なくとも１つである、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の抗体融合物。
17. ヒト対象における目的の疾患又は障害を診断及び／又は検出するための方法であって：
    ａ．請求項１３に記載の抗体融合物を含むイムノアッセイを提供することと；
    ｂ．前記イムノアッセイを対象由来のサンプルと接触させることと；
    ｃ．前記抗体融合物が前記サンプル中の標的に結合するかどうかを検出して、前記疾患又は障害の存在又は非存在を決定することと；
    を含む、方法。
18. 前記標識がＳＥＡＰである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記標識が発光標識又は蛍光標識である、請求項１７又は１８に記載の方法。
20. 前記発光標識又は蛍光標識が、ルシフェラーゼ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、又はＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 前記検出するステップが、ラテラルフロー検出をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
22. 診断試験システムをさらに含み、前記診断試験システムが、蛍光標識抗体を用いたラテラルフローイムノアッセイを含む、請求項１７又は２１に記載の方法。
23. 前記診断試験システムが、機器及びユーザ履歴データを記録及び表示するための手段をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１３に記載の抗体融合物をコードする核酸配列を含むプラスミド。
25. 請求項２４に記載のプラスミドを含むベクター。
26. 請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
27. 請求項１３に記載の抗体融合物を含むキット。

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