BR112019024291A2 - utilização de cd39 e de cd103 para a identificação de células t tumorais humanas reativas para o tratamento do câncer - Google Patents

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Ryan Montler
Thomas Duhen
Rebekka Duhen
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Providence Health & Services-Oregon
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Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor. Estes métodos incluem a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. A presente invenção também refere-se a métodos para o isolamento de um ácido nucleico codificando um receptor de linfócitos T (TCR) que se liga especificamente a um antígeno de célula tumoral. Estes métodos incluem o isolamento de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ a partir de uma amostra de um indivíduo portador de um tumor expressando o antígeno de célula tumoral, e clonagem de uma molécula de ácido nucleico codificando um TCR dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para expansão dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. Em modalidades adicionais, a presente invenção refere-se a métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um inibidor de ponto de controle. Os métodos incluem a detecção da presença de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica de um indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "UTILIZAÇÃO DE CD39 E DE CD103 PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
CÉLULAS T TUMORAIS HUMANAS REATIVAS PARA O TRATAMENTO DO CÂNCER". REFERÊNCIA CRUZADA COM REQUERIMENTOS RELACIONADOS
[001] Este requerimento reivindica o benefício do Requerimento de Patente Provisória dos Estados Unidos No. 62/517.612, registrado em 9 de junho de 2017, o qual é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
CAMPO
[002] A presente invenção refere-se ao campo do câncer, especificamente ao uso de transferência adotiva de células, tais como linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, e ao uso de receptores de linfócitos T (TCRs), tais como de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, para o tratamento de tumores, e relacionados com métodos para avaliação do tratamento, tal como por medição dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+.
ANTECEDENTES
[003] O sistema imune desempenha um papel importante no reconhecimento e na destruição das células tumorais e novas abordagens terapêuticas têm focalizado o reforço e/ou a restauração de sua função nos pacientes cancerosos. Uma resposta imune eficaz envolve a ação concertada de vários tipos de celulares diferentes, entre os quais os linfócitos T CD8 são atores chave que podem especificamente reconhecer e destruir células cancerosas por meio da liberação de moléculas citotóxicas e de citocinas (Klebanoff CA et al., 211:214-24, Immunol. Rev., 2006). Linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor reconhecem antígenos associados a tumores (TAA's), os quais podem compreender auto-antígenos que são superexpressos em lesões neoplasticas, bem como antígenos específicos do tumor (TSA's)
ou neoantígenos, os quais surgem em consequência de mutações específicas do tumor (Finn OJ, Cancer Immunol Res, 2017). De acordo com o presente paradigma, linfócitos T CD8 específicos do tumor são primed em linfonodos de drenagem do tumor e em seguida migram através do sangue para o tumor para exercer sua função efetora. Um estudo anterior mostrou que os linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor representam uma população heterogênea de células que consiste em linfócitos T específicos do tumor bem como linfócitos T espectadores sem nenhuma especificidade tumoral. Os últimos são recrutados para o sítio tumoral pela inflamação associada com a progressão do tumor (proliferação, angiogênese e metástase). No entanto, ainda existe a necessidade de métodos imunoterapêuticos, em que a eficácia/eficiência da transferência adotiva seja aumentada.
SUMÁRIO
[004] Foram avaliados o fenótipo e a função de linfócitos T CD8 linfócitos T CD8 DP reativos ao tumor, e foi determinado que a co- expressão de CD103 e CD39 identificou uma população de linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor especificamente induzidos no microambiente do tumor. Estas células, as quais são cronicamente estimuladas dentro do tumor, foram altamente enriquecidas para reatividade tumoral e tinham a capacidade de destruir células tumorais autólogas. Uma maior frequência de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em tumores humanos correlacionada com uma maior sobrevida geral. Foi determinado que a presença de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ pode indicar que um método terapêutico é eficaz para o tratamento de um tumor. Além disso, linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser transferidos adotivamente para dentro de um indivíduo de modo a tratar um tumor.
[005] São descritos métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor, incluindo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, deste modo tratando o indivíduo com o tumor. Em algumas modalidades, o método inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da proteína de morte celular programada (PD)-l, um antagonista do ligante da proteína de morte celular programada (PD-L)-l, um antagonista da Proteína Associada ao Linfócito T Citotóxico-4 (CTLA-4), um antagonista de Atenuadores de Linfócitos B e T (BTLA), antagonista de domínio contendo Mucina e Imunoglobulina de Célula T-3 (TIM-3), um antagonista do Gene 3 de Ativação de Linfócitos (LAG3), ou um agonista de 4-IBB ao indivíduo.
[006] Em algumas modalidades, são descritos métodos para o isolamento de uma sequência de ácidos nucleicos codificando um receptor de linfócitos T (TCR) que se liga especificamente a um antígeno de célula tumoral. Estes métodos incluem o isolamento de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ de um indivíduo portador de um tumor expressando o antígeno de célula tumoral, e clonagem da sequência de ácidos nucleicos codificando uma molécula de TCR dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, deste modo isolando uma sequência de ácidos nucleicos codificando o TCR específico para o tumor.
[007] Em modalidades adicionais, são descritos métodos para expansão dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. Estes métodos incluem cultura dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em um meio de cultura de tecido compreendendo glutamina, soro, e antibióticos; estimulação dos linfócitos T isolados com uma quantidade eficaz de células alimentadoras irradiadas alogênicas e uma citocina; e cultura dos linfócitos T estimulados em um meio de cultura de tecido e uma quantidade eficaz da citocina.
[008] Em ainda outras modalidades, são descritos métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um terapêutico contra o câncer, tal como um inibidor de ponto de controle, um modificador da resposta biológica (por exemplo, citocinas e quimiocinas), uma vacina contra o câncer, quimioterapia e/ou radiação. Também são descritos métodos para determinar se um indivíduo vai responder a um procedimento cirúrgico. Os métodos incluem a detecção da presença de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a presença dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica indica que o terapêutico contra o câncer ou o procedimento cirúrgico vai ser eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. Em alguns exemplos não limitantes, os métodos também podem incluir a administração do terapêutico contra o câncer ao indivíduo, ou a realização do procedimento cirúrgico.
[009] Em modalidades adicionais, são descritos métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um terapêutico contra o câncer. Os métodos incluem a administração ao indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo. Um aumento no número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo.
[0010] Em mais modalidades, são descritos métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor. Os métodos incluem a administração a um indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo. Um aumento na quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. Uma segunda dose do terapêutico contra o câncer é administrada ao indivíduo, em que a primeira dose é a mesma que a segunda dose, ou em que a segunda dose é menor do que a primeira dose.
[0011] Em outras modalidades, são descritos métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor. Os métodos incluem a administração ao indivíduo de uma primeira dose de um terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo. Uma diminuição ou nenhuma alteração na quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer não é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. Uma segunda dose do terapêutico contra o câncer é administrada ao indivíduo em que a segunda dose é maior do que a primeira dose, ou em que a segunda dose é a mesma que a primeira dose.
[0012] O precedente e outros objetos, características, e vantagens da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, a qual prossegue com referência às figuras anexadas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0013] FIGS. 1A a 1F. Linfócitos T CD8 CD103+ que se inflitram no tumor coexpressam a ectonucleotidase CD39. (A) Estratégia de gating representativa para a análise por citometria de fluxo de linfócitos T infiltrantes em um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC). Os números nos gráficos indicam a percentagem de células nos respectivos gates. (B) Análise viSNE de linfócitos infiltrantes no tumor (TIL) gated sobre linfócitos T CD8 CD103+ conforme mostrado em (A). O gate identifica linfócitos T CD8 CD103+ com a maior expressão de CD39. O gate é aplicado a todos os gráficos mostrado níveis de expressão de PD-1, CD69 e CD127. (C) Análise por citometria de fluxo de TIL CD8 isolados de pacientes com HNSCC, melanoma, câncer de ovário e de CRLM. Os números em cada quadrante indicam a percentagem de células positivas para CD39 e/ou CD103 sobre linfócitos T CD3+ CD8+. (D) Sumário da frequência de TIL CD8 CD39+ CD103+ (DP) entre pacientes com malignidades sólidas diferentes. São mostrados 40 pacientes com HNSCC, 2 pacientes com câncer de pulmão, 6 pacientes com melanoma, 2 pacientes com câncer de ovário, 3 pacientes com câncer retal, 3 pacientes com câncer de cólon e 6 pacientes com CRLM. O círculo vermelho salienta um paciente com câncer de cólon com síndrome de Lynch, levando a instabilidade microsatélite (MSI). (E) Análise por citometria de fluxo da percentagem de linfócitos T CD8 DP no sangue periférico, linfonodos (LN) normais, tumor primário e LN metastáticos de um paciente com HNSCC. Os números em cada quadrante indicam a percentagem de células positivas para CD39 e/ou CD103 sobre linfócitos T CD3+ CD8+. Os dados são representativos de 40 pacientes com HNSCC analisados (somente 9 pacientes para LN normais e LN metastáticos). As percentagens estão resumidas em (F).
[0014] FIGS. 2A a 2D. O perfil de expressão genética de TIL CD8+ CD39+ CD103+ descreve um perfil reminiscente de linfócitos TRM . (A) Análise de componentes principais (PCA) da expressão genética de TIL CD8 DN, SP e DP ordenados isolados a partir de 3 pacientes com HNSCC e 2 com câncer de ovário. A análise foi realizada sobre genes expressos diferencialmente entre TIL CD8 duplo positivo (DP) e duplo negativo (DN) (n=372). (B) Aglomeração não supervisionada de amostras usando os 372 genes expressos diferencialmente entre TIL CD8 DP e DN. A cor cinza escuro indica genes regulados negativamente, cinza claro indica genes regulados positivamente. (C) Gráfico de barras representando a modificação múltipla (log2) dos genes mais regulados positivamente e dos genes mais regulados negativamente em subgrupos DP vs DN. Cinza claro identifica genes com uma assinatura de ativação crônica; cinza escuro indica genes associados com o fenótipo TRM. (D) Expressão dos principais genes difcerencialmente expressos em cada um dos 5 pacientes analisados. A linha superior mostra genes associados com o fenótipo TRM, a linha inferior indica genes de assinatura de ativação crônica. Cada símbolo representa um dos pacientes, os quais são conectados com linhas.
[0015] FIGS. 3A a 3E. Propriedades fenotípicas e funcionais de TIL CD8 DP, SP e DN. (A) Análise fenotípica ex vivo da expressão de proteínas superficiais CD69, CCR7, CD127 e CD28, delineando um fenótipo TRM, sobre TIL CD8 (parte de cima). Sumário da frequência dos marcadores mencionados acima entre vários pacientes com câncer (n=6 a 13, parte de baixo). *p<0,05; ***p<0,001; ****p<0,0001 (ANOVA). (B) Análise fenotípica ex vivo da expressão de de proteínas superficiais e intracelulares PD-1, CTLA-4, TIM-3, 4-1BB e Ki-67, delineando um fenótipo ativado/cronicamente estimulado, sobre TIL CD8 (top). Sumário da frequência dos marcadores mencionados acima entre vários pacientes com câncer (n=5 a 17, parte de baixo). ***p<0,001; ****p<0,0001 (ANOVA). (C) Análise por citometria de fluxo representativa de IFN-γ, e produção de TNF-a por subgrupos de TIL CD8 estimulados por 4 horas com PMA/Ionomicina. Os números em cada quadrante indicam a percentagem de células positivas para IFN-γ e/ou TNF-a sobre linfócitos T CD3+ CD8+. (D) Frequência de IFN-γ, TNF-a, células duplo positivas IFN-γ/TNF-a por subgrupos de TIL CD8. Os dados são de 6 pacientes com HNSCC. (E) Análise por citometria de fluxo representativa da produção de granzima B por TIL CD8 (à esquerda) e sumário de 6 diferentes pacientes com HNSCC (à direita).
*p<0,05; **p<0,01 (ANOVA).
[0016] FIG. 4. A expressão de CD39 e CD103 sobre linfócitos T CD8 necessita de estimulação sustentada em um meio rico em TGF-β. Cinética da expressão de CD39, CD103 e PD-1 sobre linfócitos T CD8 naive classificados do sangue periférico. As células foram estimuladas com contas revestidas com CD3/CD28 em uma proporção de conta: linfóticos T de 1:2 na presença ou ausência de TGF-β (2 ng/ml) e a expressão de CD39, CD103 e PD-1 foi analisada por citometria de fluxo nos pontos do tempo indicados. Os dados são representativos de 4 experimentos independentes.
[0017] FIGS. 5A a 5D. Os TIL CD8 DP são altamente clonais e partilham pouca sobreposição com quaisquer outros subgrupos de linfócitos T CD8. (A) Diversidade do repertório de TCR dentro dos linfócitos T CD8 de memória do sangue, TIL CD8 DN, SP e DP. As frequências do clonótipo mais frequente, o 2o. ao 5o. mais frequentes, o 6º. ao 30o. mais frequentes, e o resto dos clonótipos são mostrados para pacientes com HNSCC HPV+ e HPV- e para um paciente com câncer de ovário. (B) Os 500 clonótipos de TIL CD8 mais frequentes são plotados com base em sua frequência em subgrupos de TIL CD8 DN, SP e DP. Cada ponto representa um clonótipo de TCR distinto. Pontos sobre o eixo indicam os clonótipos detectados dentro de um único repertório. (C) A mesma análise que em (B) comparando a frequência dos 500 clonótipos principais nos linfócitos T CD8 de memória no sangue e LN normais com a frequência dos 500 clonótipos principais nos subgrupos de TIL CD8 DN e DP. (D) Sobreposição de sequência de TCR analisada usando o índice de Morisita-Horn entre os TIL CD8 DP, e os linfócitos T CD8 de memória sanguíneos, os TIL CD8 DN e os TIL CD8 SP. Uma sobreposição de sequência de TCR de 1 indica 100% de similaridade entre duas populações.
[0018] FIGS. 6A a 6F. TIL CD8 DP reconhecem e destróem células tumorais autólogas e sua frequência se correlaciona com aumento da sobrevida total. (A) TIL CD8 expandidos foram testados para reatividade tumoral, cultivando os mesmos por 20 horas com números crescentes de células tumorais autólogas, e o reconhecimento foi avaliado medindo a frequência da expressão de 4- IBB (símbolos preenchidos) e a secreção de IFN-γ (símbolos abertos). São mostrados os resultados para três pacientes com câncer. (B) A reatividade de TIL CD8 DP foi confirmada por cultura com células tumorais autólogas com ou sem MHC-I, células tumorais alogênicas, e anti-CD3 ligado à placa. A regulação positiva d e4-IBB depois de 20 horas é mostrada para três pacientes com câncer. (C) A destruição das células tumorais foi medida pela avaliação da quantidade de eventos caspase 3/7+/cavidade monitorados a cada hora durante um período de 20 horas. (D) Imagens representativas para TIL CD8 DN e DP tomadas no início (T=0) e ao final da cocultura (T=20 horas). (E) Sobrevida total sobre uma coorte de 62 pacientes com HNSCC com base na frequência de TIL CD8 DP entre TIL CD8 total no momento da cirurgia. (F) Análise similar realizada sobre uma coorte de 30 pacientes com HNSCC HPV-negativos.
[0019] FIGS. 7A a 7C. TIL CD8 DP são enriquecidos em células reativas tumorais e o repertório de TCR do tumor primário se sobrepõe com repertório de TCR de LN metastáticos dentro do mesmo indivíduo. (A) e (B) TIL CD8 DP foram classificados e expandidos in vitro. Depois da expansão, TIL CD8 DP foram cocultivados com células tumorais autólogas por 24 horas. Ao final da cultura, as células foram classificadas com base em sua expressão de 4-1BB e CD25. O repertório de TCR de TIL CD8 DP antes da cocultura foi comparado com o repertório de TCR de TIL CD8 DP 4-1BB+ CD25+ (tumor- reativos). Os 15 principais clonótipos no TIL CD8 DP antes da co-
cultura estão presentes com suas respectivas frequências antes e depois de cocultura com células tumorais. São indicados os resultados de dois pacientes com câncer. (C) Os 500 clonótipos de TIL CD8 DP mais frequentes são plotados com base em sua frequência no tumor primário e nos LN metastáticos. São indicados os resultados de dois pacientes com HNSCC. As SEQ ID NOs: 1 a 15 são mostradas na FIG. 7A, em ordem da parte superior (SEQ ID NO: 1) para a parte inferior (SEQ ID NO: 15). As SEQ ID NOs: 16 a 30 são mostradas na FIG. 7B, em ordem da parte superior (SEQ ID NO: 16) para a parte inferior (SEQ ID NO: 30).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0020] A sequências de ãcidos nucleicos e de aminoácidos listadas na listagem de sequências anexada são mostradas usando abreviações de letras de rotina para bases de nucleotídeos, e código de três letras para aminoácidos, conforme definido na 37 C.F.R. 1.822. Somente é mostrada uma cadeia de cada sequência de ácidos nucleicos, mas a cadeia complementar é entendida como incluída por qualquer referência à cadeia apresentada. A Listagem de Sequências é submetida como um arquivo de texto ASCII [Sequence_Listing, 4 de maio de 2018, 7.113 bytes], o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente. Na listagem de sequências anexada:
[0021] As SEQ ID NOs: 1 a 30 são as sequências de nucleotídeos de exemplos de regiões de CDR3 de TCRB.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0022] Existe a necessidade de melhorar a eficácia da-e imunoterapia e de transferência adotiva de linfócitos T para os pacientes com câncer, e a necessidade de caracterizar linfócitos T CD8 envolvidos na resposta anti-tumoral, de modo a usar uma sub- população particular para métodos de diagnóstico. Linfócitos T CD39+
CD8+ incluem linfócitos T CD39+ CD103+ CD8+ e linfócitos T CD39+ CD103- CD8+. É descrito aqui, neste requerimento de patente, que foram determinados o fenótipo e a função linfócitos T CD8 linfócitos T CD8 DP reativos ao tumor, e foi documentado que a co-expressão de CD103 e CD39 identificou uma única população de linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor especificamente induzidos no microambiente tumoral. Estas células, as quais são cronicamente estimuladas dentro de um tumor, são altamente enriquecidas para reatividade tumoral e têm a capacidade de destruir células tumorais autólogas. Uma maior frequência de linfócitos T CD8 CD103+ CD39+ em tumores humanos correlacionada com uma maior sobrevida geral, indicando que a avaliação destas células em amostras biológicas proporciona métodos para determinar a eficácia do tratamento, e para avaliar se um indivíduo portador de um tumor vai responder ao tratamento. Termos
[0023] A menos que mencionado de modo diverso, os termos técnicos são usados de acordo com o uso conventional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado pela Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado pela VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0024] De modo a facilitar a revisão das várias modalidades da presente invenção, são proporcionadas as seguintes explanações de termos específicos:
[0025] 4-1BB: Uma proteína transmembrana, também referida como CD137 e TNFRSF9, que é uma proteína da superfamília de receptores dos fatores de necrose tumoral (TNFRS). A expressão de
4-1BB geralmente é dependente de ativação e está presente em um amplo subgrupo de células imunes incluindo células ativadas NK e NKT, linfócitos T regulatórios, linfócitos T ativados CD4 e CD8, células dendríticas (DC), mastócitos estimulados, células mielóides de diferenciação, monócitos, neutrófilos, e eosinófilos (Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215). A expressão de 4- IBB também tem sido demonstrada sobre a vasculatura tumoral (Broil, 2001, Amer. J. Clin. Pathol. 115(4):543-549; Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539- 554) e em sítios de endotélio inflamado ou aterosclerótico (Drenkard, 2007 FASEB J. 21: 456-463; Olofsson, 2008, Circulation 1 17: 1292- 1301). O ligante que estimula 4- IBB, isto é, Ligante de 4-1BB (4- 1BBL), é expresso sobre células de apresentação ao antígeno (APCs) ativadas, células progenitoras mielóides, e células tronco hematopoiéticas. A 4-IBB humana é uma proteína de 255 aminoácidos (Vide GENBANK Acesso Nos. NM-001561 e NP-001552, incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência conforme disponível em 1º. de junho de 2017). Anticorpos agonistas de 4-1BB são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 8.337.850, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0026] Nível de alteração: Modificação, quer por aumento ou diminuição, do número de células de um tipo celular específico, ou do nível de produção ou expressão de uma sequência de ácidos nucleicos ou uma sequência de aminoácidos (por exemplo um polipeptídeo, um siRNA, um miRNA, um mRNA, um gene), em comparação com um nível de controle.
[0027] Antisense, Sentido, e Antígeno: DNA tem duas cadeias antiparalelas, uma cadeia 5'→ 3', referida como a cadeia positiva, e uma cadeia 3'→ 5', referida como a cadeia negativa. Como a polimerase de RNA adiciona ácidos nucleicos em uma direção de 5'→
3', a cadeia negativa do DNA serve como o modelo para o RNA durante transcrição. Deste modo, um transcripto de RNA vai ter uma sequência complementar à cadeia negativa, e idêntica à cadeia positiva (exceto que U é substituída por T).
[0028] Moléculas antisense são moléculas que são especificamente hibridizáveis ou especificamente complementares ou a RNA ou à cadeia positiva de DNA. Moléculas de sentido são moléculas que são especificamente hibridizáveis ou especificamente complementares à cadeia negativa de DNA. Moléculas de antígeno são ou moléculas antisense ou de sentido direcionadas para um alvo de DNA. Um RNA antisense (asRNA) é uma molécula de RNA complementar a uma molécula de ácido nucléico de sentido (codificante).
[0029] Anticorpo: Um ligante polipeptídico compreendendo no mínimo uma região variável de cadeia leve ou de cadeia pesada de imunoglobulina a qual reconhece e se liga a (tais como especificamente reconhece e se liga especificamente a) um epítope de um antígeno, tal como um polipeptídeo PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 ou 4-IBB, ou um fragmento do mesmo. As moléculas de imunoglobulina são compostas de uma cadeia pesada e uma cadeia leve, cada uma das quais tem uma região variável, denominada a região pesada variável (VH) e a região leve variável (VL). Juntas, a região VH e a região VL são responsáveis pela ligação do antígeno reconhecido pelo anticorpo.
[0030] Anticorpos incluem imunoglobulinas intactas e as variantes e porções de anticorpos de conhecimento geral na arte, tais como anticorpos de domínio único (por exemplo, anticorpos de domínio VH), fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)'2, proteínas Fv de cadeia única ("scFv"), e proteínas Fv estabilizadas com dissulfeto ("dsFv"). Uma proteína scFv é uma proteína de fusão na qual uma região variável de cadeia leve de uma imunoglobulina e uma região variável de cadeia pesada de uma imunoglobulina são ligadas por um encadeador, ao passo que em dsFvs, as cadeias foram mutadas para introduzir uma ligação de dissulfeto de modo a estabilizar a associação das cadeias. O termo também inclui formas produzidas por engenharia genética, tais como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos murinos humanizados), anticorpos heteroconjugados (tais como, anticorpos bi-específicos). Vide também, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.
[0031] Tipicamente, uma imunoglobulina que ocorre naturalmente tem cadeias pesadas (H) e cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lâmbda (λ) e kappa (k). Existem cinco classes principais de cadeia pesada (ou isótipos) as quais determinam a atividade funcional de uma molécula de anticorpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.
[0032] Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável, (as regiões também são conhecidas como "domínios"). Em combinação, as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve especificamente se ligam ao antígeno. Regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve contêm uma região de "estrutura" interrompida por três regiões hipervariáveis, também denominadas "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs." A extensão da região de estrutura e CDRs foi definida de acordo com Kabat et al. (vide, Kabat ,et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991) e o banco de dados ImMunoGeneTics (IMGT) (vide, Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001; e imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?_ livret=0&Option=humanIg). O banco de dados Kabat é mantido online (ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). As sequências das regiões de estrutura de cadeias leves ou pesadas diferentes são relativamente conservadas dentro de uma espécie, tais como seres humanos. A região de estrutura de um anticorpo, que é as regiões de estrutura combinadas das cadeias leves e pesadas constituintes, serve para posicionasr e alinhar as CDRs no espaço tridimensional.
[0033] As CDRs são essencialmente responsáveis por ligação a um epítope de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são tipicamente referidas como CDR1, CDR2, e CDR3, numeradas seqüencialmente iniciando a partir do término amino, e também são tipicamente identificadas pela cadeia na qual a CDR em particular está localizada. Portanto, uma CDR3 de VH (ou H-CDR3) está localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo no qual é encontrado, ao passo que uma CDR1 de VL (ou L-CDR1) é a CDR1 do domínio variável da cadeia leve do anticorpo no qual é encontrado. Um anticorpo que se liga a PD-1, PD-L1, ou PD-L2, por exemplo, vai ter uma região de VH específica e uma sequência de região de VL específica, e, portanto, sequências de CDR específicas. Anticorpos com diferentes especificidades (isto é, diferentes sítios de combinação para diferentes antígenos) têm diferentes CDRs. Embora sejam as CDRs que variam de anticorpo para anticorpo, somente um número limitado de posições de aminoácidos dentro das CDRs est ao diretamente envolvidas em ligação ao antígeno. Estas posições dentro das CDRs são denominadas resíduos determinantes de especificidade (SDRs).
[0034] Referências a "VH" ou "VH" referem-se à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo a de um Fv, de um scFv, de um dsFv ou de um Fab. Referências a "VL" ou "VL" referem- se à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo a de um Fv, de um scFv, de um dsFv ou de um Fab.
[0035] Um "anticorpo monoclonal" é um anticorpo produzido por um único clone de linfócitos B ou por uma célula na qual os genes de cadeia leve e/ou pesada de um único anticorpo tenham sido transfectados. Anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos dos peritos na arte, por exemplo, produzindo células formadoras de anticorpos híbridos a partir de uma fusção de células de mieloma com células esplênicas imunes. Anticorpos monoclonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.
[0036] Um "anticorpo quimérico" tem resíduos da estrutura de uma espécie, tal como humana, e CDRs (as quais geralmente conferem ligação ao antígeno) de outra espécie, tal como um anticorpo murino que se liga especificamente a um polipeptídeo PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 ou 4-1BB.
[0037] Um anticorpo "humano" (também denominadas anticorpo "totalmente humano") é um anticorpo que inclui regiões de estrutura humana e todas as CDRs de uma imunoglobulina humana. Em um exemplo, a estrutura e as CDRs são da mesma sequência de aminoácidos de cadeias pesada e/ou leve humanas originárias. No entanto, estruturas de um anticorpo humano podem ser manipuladas para incluir CDRs de um anticorpo humano diferente. Uma imunoglobulina "humanizada" é uma imunoglobulina incluindo uma região de estrutura humana e uma ou mais CDRs de uma imunoglobulina não-humana (por exemplo uma imunoglobulina de camundongo, rato, ou sintética). A imunoglobulina não humana que proporciona as CDRs é denominada uma "doadora," e a imunoglobulina humana que proporciona a estrutura é denominada uma "aceitadora." Em uma modalidade, todas as CDRs são da imunoglobulina doadora em uma imunoglobulina humanizada. Regiões constantes não precisam estar presentes, mas se estiverem, devem ser substancialmente idênticas a regiões constantes de imunoglobulina humana, isto é, no mínimo cerca de 85 a 90%, tal como cerca de 95% ou mias idênticas. Portanto, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas a partes correspondenets de sequências de imunoglobulina humana naturais. Um "anticorpo humanizado" é um anticorpo compreendendo uma imunoglobulina de cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de cadeia pesada humanizada. Um anticorpo humanizado se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo do doador que proporciona as CDRs. A estrutura aceitadora de uma imunoglobulina humanizada ou anticorpo humanizado pode ter um número limitado de substituições por aminoácidos tomados da estrutura do doador. Anticorpos humanizados ou outros anticorpos monoclonais podem ter substituições de aminoácidos conservadoras adicionais, as quais substancialmente não têm efeito sobre ligação ao antígeno ou outras funções das imunoglobulinas. Imunoglobulinas humanizadas podem ser construídas por meio de engenharia genética (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 5.585.089).
[0038] Antígeno: Um composto, uma composição, ou uma substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de linfócitos T em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas em um animal. Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular específica, incluindo os induzidos por imunogênios heterólogos. O termo "antígeno" inclui todos os epítopes antigênicos relacionados. "Epítope" ou "determinante antigênico" refere-se a um sítio sobre um antígeno ao qual respondem linfócitos B e/ou T. Em uma modalidade, linfócitos T respondem ao epítope, quando o epítope é apresentado em conjunto com uma molécula de MHC. Epítopes podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos juxtapostos por dobramento terciário de uma proteína. Epítopes formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos sobre exposição a solventes desnaturantes considerando que epitopes formados por dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítope tipicamente inclui no mínimo 3, e mais geralmente, no mínimo 5, cerca de 9, ou cerca de 8 a 10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação da conformação espacial de epítopes incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional.
[0039] Célula de apresentação ao antígeno (APC): Uma célula que pode apresentar antígeno ligado a moléculas de MHC classe I ou classe II a linfócitos T. APCs incluem, mas não estão limitadas a, monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos B, linfócitos T e células de Langerhans. Um linfócito T que pode apresentar antígeno a outros linfócitos T (incluindo CD4+ e/ou CD8+ linfócitos T) é linfócito T de apresentação ao antígeno (T-APC).
[0040] Atenuador de linfócitos B e T (BTLA): Uma proteína também conhecida como CD272. A expressão de BTLA é induzida durante a ativação de linfócitos T, e BTLA permanece expressa sobre células Th1. BTLA interage com um homólogo de B7, B7H4, e tem um papel na inibição de linfócitos T através de interação com receptores da família de necrose tumoral. BTLA é um ligante para a superfamília dos fatores de necrose tumoral (receptor), membro 14 (TNFRSF14), também conhecido como mediador da entrada do herpes vírus (HVEM). Complexos BTLA-HVEM regulam negativamente respostas imunes de linfóticos T. Uma sequência de aminoácidos BTLA específica e não limitante, e uma sequência de mRNA codificando BTLA, é proporcionada no GENBANK® Acesso No. NM_001085357, 1o. de setembro de 2016, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Antagonistas de BTLA incluem agentes que reduzem a expressão ou a atividade de BTLA ou inibem a função de inibição de linfócitos T de BTLA, por exemplo, por ligação especificamente a BTLA e inibindo a ligação de BTLA a receptores do fator de necrose tumoral. Exemplos de compostos incluem anticorpos (tais como um anticorpo anti-BTLA), moléculas de RNAi, moléculas antisense, e proteínas dominantes negativas.
[0041] Ligação ou ligação estável (oligonucleotídeo): Um oligonucleotídeo se liga ou se liga de modo estável a um ácido nucleico alvo se uma quantidade suficiente do oligonucleotídeo formar pares de bases ou for hibridizado a seu ácido nucleico alvo, de modo a permitir a detecção daquela ligação. A ligação pode ser detectada ou por propriedades físicas ou por propriedades funcionais do complexo de alvo:oligonucleotídeo. A ligação entre um alvo e um oligonucleotídeo pode ser detectada por qualquer procedimento de conhecimento de um perito na arte, incluindo tanto testes de ligação funcionais quanto físicos. Por exemplo, a ligação pode ser detectada funcionalmente determinando se a ligação tem um efeito observável depois de um processo biossintético tal como a expressão de um gene, replicação de DNA, transcrição, translação e similares.
[0042] Métodos físicos de detecção da ligação de cadeias complementares de DNA ou RNA são de conhecimento geral na arte, e incluem os métodos referidos como procedimentos de testes de DNase I ou pegada química, mudança de gel e clivagem por afinidade, Northern blotting, dot blotting e detecção da absorção de luz. Por exemplo, um método que é amplamente usado, porque é simples e confiável, envolve observar uma modificação na absorção de luz de uma solução contendo um oligonucleotídeo (ou um análogo) e um ácido nucleico alvo em 220 a 300 nm à medida que a temperatura é lentamente aumentada. Se o oligonucleotídeo ou análogo se tiver ligado a seu alvo, há um súbito aumento na absorção em uma temperatura característica à medida que o oligonucleotídeo (ou análogo) e o alvo se disassociam um do outro, ou derretem.
[0043] A ligação entre um oligômero e seu ácido nucleico alvo é frequentemente caracterizada pela temperatura (Tm) na qual 50% do oligômero é fundido de seu alvo. Uma maior (Tm) significa um complexo mais forte ou mais estável em relação a um complexo com uma menor (Tm).
[0044] Afinidade de ligação: Afinidade de um anticorpo para um antígeno. Em uma modalidade, a afinidade é calculada por uma modificação do método de Scatchard descrito por Frankel ,et al., Mol. Immunol, 16: 101-106, 1979. Em outra modalidade, a afinidade de ligação é medida por uma taxa de dissociação de antígeno/anticorpo. Em outra modalidade, uma alta afinidade de ligação é medida por um radioimunoensaio de competição. Em outra modalidade, a afinidade de ligação é medida por ELISA. Um anticorpo que "se liga especificamente a" um antígeno (tal como um polipeptídeo PD-1, PD- L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 ou 4-1BB) é um anticorpo que se liga ao antígeno com alta afinidade e não se liga de maneira significativa aoutros antígenos não relacionados.
[0045] Terapêutico contra o câncer: Qualquer agente de utilidade para o tratamento do câncer em um indivíduo. Terapêuticos contra o câncer incluem um inibidor de ponto de controle, modificador da resposta biológica (por exemplo, citocinas e quimiocinas), uma vacina contra o câncer, quimioterapia e/ou radiação.
[0046] Agentes quimioterápicos: Qualquer agente químico com utilidade terapêutica no tratamento de doenças caracterizadas por crescimento celular anormal. As doenças referidas incluem tumores, neoplasmas, e câncer bem como doenças caracterizadas por crescimento hiperplásico tal como psoríase. Em uma modalidade, um agente quimioterápico é um composto radioativo. Um perito na arte pode prontamente identificar um agente quimioterápico de utilidade (vide, por exemplo, Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry ,et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., © 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer, L., Berkery, R. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby- Year Book, 1995; Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). Quimioterapia de combinação é a administração de mais de um agente para tratar câncer. Um exemplo é a administração de um anticorpo que se liga a um polipeptídeo PD-1, PD-L1, ou CTLA-4 usado em combinação com células, um composto radioativo, ou um composto químico.
[0047] CD39 (ENTPDl): Uma proteína de membrana integral com dois domínios transmembrana e um grande região extracelular (Maliszewski et al., 1994). Foi primeiro identificada como um marcador de ativação sobre linfócitos humanos e como a ecto-ADPase vascular (Kaczmarek E et al. (1996) Biol Chem). O termo "CD39" denota a proteína CD39 também denominada como ectonucleosideo trifosfato difosfohidrolase-1 (ENTPDl). In vivo CD39 é expresso sobre linfócitos T regulatórios (células Treg), linfócitos B e várias células imunes inatas. Tem um papel chave na supressão imune através de hidrólise de adenosina trifosfato (ATP) e adenosina difosfato (ADP) em adenosina monofosfato (AMP), que é em seguida processado em adenosina por CD73, uma ecto-5' -nucleotidase. Adenosina é um potente imunorregulador que, através de ligação a receptores A2A sobre linfócitos T, reforça a acumulação de cAMP intracelular, deste modo prevenindo a ativação de linfócitos T (Deaglio S et al., JEM, 2007). A expressão de ambos, CD39 e CD73 é aumentada em várias malignidades sólidas humanas (Antonioli Luca et al., Trends Mol Med,
2013). A regulação positiva de ambas as enzimas é favorecida dentro de ambientes hipóxicos, e sua ação concertada sequencial pode ter um papel em imunoescape tumoral (Eltzschig HK et al., Blood 2009; Ghiringhelli F et al., J Biomed Biotech, 2012). Uma sequência de aminoácidos de CD39 específica e não-limitante, e uma sequência de mRNA codificando CD39, é proporcionada no GENBANK® Acesso No. NM_00 S 776, 1º. de maio de 2017, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0048] CD103: Conhecida como a integrina alfa E (ITGAE), CD103 se liga a integrina beta 7 (β7-ITGB7) para formar a molécula integrina heterodimérica αΕβ7. O principal ligante para Εβ7 é E-caderina, uma molécula de adesão encontrada sobre células epiteliais. É importante para os linfócitos T retornarem para os sítios intestinais e a retenção de células de memória residentes no tecido (TRM) em tecidos. In vivo, CD103 é expressa sobre um subgrupo de células dendríticas no intestino e uma população de linfócitos T presente sobre trecidos periféricos caracterizados como células de memória residentes no tecido (TRM) (Schenkel JM et al., Immunity, 2014; Mueller SN et al., Nat Rev Immunol, 2015). CD103 também é expressa sobre um subgrupo de linfócitos T CD8 em câncer de ovário seroso de alto grau, câncer de pulmão, carcinoma celular urotelial da bexiga e carcinoma endometrial (Webb JR et al., Clin Cancer Res, 2014; Webb JR et al., Cancer Immunol Res, 2015; Komdeur FL et al., Oncotarget, 2016; Djenidi F et al., J Immunol, 2015; Wang B et al., J Urol, 2015; Workel HH et al., EJC, 2015). Nestas malignidades, linfócitos T CD8 CD103+ são preferencialmente localizados dentro do tumor, portanto favorecendo uma interação direta com as células tumorais. Linfócitos T CD8 CD103+ expressam altos níveis de PD-1, uma molécula superficial de ativação/exaustão, a qual depois de interação com seu ligante PD-L1 resulta em inibição da proliferação de linfócitos T,
sobrevida e funções efetoras (Webb JR et al., Cancer Immunol Res, 2015). Uma sequência de aminoácidos CD103 específica e não - limitante, e uma sequência de mRNA codificando CD103, é proporcionada no GENBANK® Acesso No. NM-002208, 20 de maio de 2017, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0049] Variantes conservadoras: Substituições de aminoácidos "conservadoras" são as substituições que não afetam substancialmente ou diminuem a afinidade de uma proteína, tal como um anticorpo. Por exemplo, um anticorpo humano que se liga especificamente a PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3 CTLA-4 ou 4-lBB, podem incluor no máximo cerca de 1, no máximo cerca de 2, no máximo cerca de 5, e no máximo cerca de 10, ou no máximo cerca de 15 substituições conservadoras e especificamente se ligam ao polipeptídeo PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4 ou 4-IBB. O termo variação conservadora também inclui o uso de um aminoácido substituído ao invés de um aminoácido parental não substituído, contanto que o anticorpo se ligue especificamente ao polipeptídeo PD- 1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4 ou 4-lBB. Substituições não conservadoras são as substituições que reduzem uma atividade ou ligação a um polipeptídeo PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4, ou 4-IBB.
[0050] Tabelas de substituições de aminoácidos conservadoras proporcionando aminoácidos funcionalmente similares são de conhecimento geral de um perito na arte. Os seis grupos seguintes são exemplos de aminoácidos que são considerados como sendo substituições conservadoras uns para os outros: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).
[0051] Contato: Colocação em associação física direta; inclui tanto em forma sólida quanto líquida.
[0052] Nível de controle (parâmetro imune): Um nível basal de um parâmetro imune. Em algumas modalidades, o nível de controle é o nível de um componente do sistema imune, tal como um tipo específico de células, na ausência de um agente terapêutico. Um nível de controle pode ser medido em uma amostra de um indivíduo que não tenha sido tratado com um agente de interesse, ou uma amostra de um indivíduo que tenha sido tratado com um agente de controle. O nível de controle também pode ser um valor padrão, tal como um valor determinado a partir de uma média de um grande número de amostras ao longo do tempo. O nível de controle também pode ser medido em uma amostra de um indivíduo tratado com a dose específica de um agente terapêutico, em que aquela dose não é administrada ao indivíduo no momento que o indivíduo está atualmente sob avaliação. O controle pode ser do indivíduo que está em avaliação, ou pode ser de um indivíduo diferente.
[0053] Proteína Associada a Linfócitos T Citotóxicos - 4 (CTLA-4): Uma proteína também conhecida como CD152. CTLA-4 é um membro da superfamília das imunoglobulinas. CTLA-4 é um receptor de proteína que funciona como um ponto de controle imune, e portanto regula negativamente as respostas imunes. CTLA-4 é expressa constitutivamente em linfócitos T regulatórios (Tregs) e é regulada positivamente em linfócitos T convencionais depois de ativação. CLTA4 se liga a CD80 ou CD86 sobre a superfície de células de apresentação ao antígeno, e é um inibidor de linfócitos T. Exemplos específicos e não limitanets de uma proteína CTLA-4 e um mRNA codificando CTLA-4 são descritos, por exemplo, no GENBANK® Acesso No. NM_001037631, 7 de outubro de 2016, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Antagonistas de CTLA-4 incluem agentes que reduzem a expressão ou a atividade de CTLA-4 ou inibem a função de inibição de linfócitos T de CTLA-4, por exemplo, se ligando especificamente a CTLA-4 e inibindo a ligação de CTLA-4 a CD80 ou CD86 sobre a superfície de células de apresentação ao antígeno. Exemplos de compostos incluem anticorpos (tais como um anticorpo anti-CTLA-4), moléculas de RNAi, moléculas antisense, e proteínas dominantes negativas.
[0054] Detectar ou detecção (célula ou biomolécula): Refere-se a determinar quantitativamente ou qualitativamente a presença de uma biomolécula ou de um tipo celular específico, tal como um linfócito T CD8+ CD39+ CD103+, em investigação. Por exemplo, determinar quantitativamente ou qualitativamente a presença de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra de um indivíduo. De modo geral, a detecção de uma molécula biológica, tal como uma proteína, um ácido nucleico, ou a detecção de um tipo celular específico ou proliferação celular, requer realizar um ensaio biológico e não simples observação. Por exemplo, testes que utilizam anticorpos ou sondas de ácido nucleico (os quais podem ser ambos marcados), ou podem ser usados par adetectar proteínas ou células, respectivamente. Diagnosticar ou diagnóstico da eficácia do tratamento, tal como com um inibidor de ponto de controle, envolve a detecção de uma modificação significativa em uma célula ou biomolécula, tal como linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+.
[0055] DNA (ácido desoxirribonucleico): DNA é um polímero de cadeia longa o qual compreende o material genético da maioria dos organismos vivos (alguns vírus têm genes compreendendo ácido ribonucleico (RNA)). As unidades de repetição em polímeros de DNA têm quatro nucleotídeos diferentes, cada um dos quais compreende uma das quatro bases, adenina, guanina, citosina e timina, ligada a um açúcar desoxirribose ao qual um grupo de fosfato é anexado. Tripletos de nucleotídeos (referidos como códons) codificam para cada aminoácido em um polipeptídeo, ou para um sinal de parada. O termo códon também é usado para as sequências correspondentes (e complementares) de três nucleotídeos no mRNA no qual a sequência de DNA é transcrita.
[0056] A menos que especificado de modo diverso, qualquer referência a uma molécula de DNA se destina a incluir o complemento reverso daquela molécula de DNA. Exceto onde seja requerido cadeia única pelo texto aqui, neste requerimento de patente, as moléculas de DNA, embora escritas para representar somente uma cadeia única, englobam ambas as cadeias de uma molécula de DNA de cadeia dupla.
[0057] Diagnóstico: Identificação da presença ou natureza de uma condição patológica, tal como, mas não limitada a, um tumor. Os métodos de diagnóstico diferem em sua sensibilidade e especificidade. A "sensibilidade" de um ensaio de diagnóstico é a percentagem de indivíduos doentes que têm resultado positivo (percentagem de positivos verdadeiros). A "especificidade" de um ensaio de diagnóstico é um menos a taxa de falso positivo, onde a taxa de falso positivo é definida como a proporção das pessoas sem a doença que têm resultado positivo no teste. Embora em um método de diagnóstico particular não se possa proporcionar um diagnóstico definitivo de uma condição, é suficiente se o método proporcionar uma indicação positiva que ajude no diagnóstico. "Prognóstico" é a probabilidade de desenvolvimento (por exemplo, gravidade) de uma condição patológica, tal como um tumor ou uma metástase.
[0058] Codificar: Diz-se que um polinucleotídeo codifica um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos de conhecimento geral dos peritos na arte, puder ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para e/ou o polipeptídeo ou um fragmento do mesmo. A cadeia anti-sentido é o complemento de um ácido nucléico similar, e a sequência codificante pode ser deduzida a partir da mesma.
[0059] Células alimentadoras: Uma camada de células tal como sobre o fundo de uma placa de cultura. As células alimentadoras podem liberar nutrientes, fatores de crescimento e/ou citocinas para dentro do meio de cultura e proporcionar um substrato ao qual outras células, tais como os linfócitos T, podem interagir. As células podem ser irradiadas. Em uma modalidade, células alimentadoras são células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas.
[0060] Inibidor de Ponto de Controle Imune: Um tipo de agente, que bloqueia vias biológicas em células específicas de tipos de sistema imune, tais como, mas não limitadas a, linfócitos T, e algumas células cancerosas. Estes inibidores inibem os linfócitos T de destruir as células cancerosas. Quando um inibidor de ponto de controle é bloqueado, é reduzida uma "inibição" sobre o sistema imune e os linfócitos T se tornam ativados contra as células cancerosas. Exemplos de proteínas de ponto de controle encontradas sobre os linfócitos T ou as células cancerosas incluem PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3.
[0061] Resposta Imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como um linfócito B, um linfócito T, ou um monócito, para um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno particular (uma "resposta específica para o antígeno"). Em uma modalidade, uma resposta imune é uma resposta de linfócitos T, tal como uma resposta de CD4+ ou uma resposta de CD8+. Em outra modalidade, a resposta é uma resposta de linfócitos B, e resulta na produção de anticorpos específicos.
[0062] "Irresponsividade" com respeito a células imunes inclui refratividade das células imunes a estimulação, tal como estimulação através de um receptor de ativação ou uma citocina. Pode ocorrer irresponsividade, por exemplo, devido a exposição a imunossupressores ou exposição a altas doses de antígeno. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "anergia" ou "tolerância" inclui refratividade a estimulação mediada por receptor de ativação. A refratividade referida é geralmente específica contra o antígeno e persiste depois de ter cessado a exposição ao antígeno tolerizante. Por exemplo, anergia em linfócitos T (em oposição a irresponsividade) é caracterizada por falta de produção de citocinas (tais como IL-2). Ocorre anergia de linfócitos T quando os linfócitos T são expostos a antígeno e recebem um primeiro sinal (um sinal mediado por CD3 ou receptor de linfócitos T) na ausência de um segundo sinal (um sinal co-estimulador). Sob estas condições, a re- exposição das células ao mesmo antígeno (mesmo se ocorrer exposição na presença de uma molécula co-estimuladora) resulta em insucesso para produzir citocinas e, portanto, insucesso para proliferar. No entanto, linfócitos T anérgicos podem montar respostas a antígenos não relacionados e podem proliferar caso cultivados com citocinas (tais como IL-2). Por exemplo, também pode ser observada anergia de linfócitos T pela falta de produção de IL-2 por linfócitos T conforme medido por ELISA ou por um ensaio de proliferação usando uma linhagetm celular indicadora. De forma alternativa, pode ser usado um constructo de gene reporter. Por exemplo, linfócitos T anérgicos não têm êxito em iniciar a transcrição de gene IL-2 induzida por um promotor heterólogo sob o controle do reforçador do gene IL-2 5' ou por um multímero da sequência de API que pode ser encontrada dentro do reforçador (Kang et al. Science 257: 1134, 1992). Linfócitos
T específicos contra o antígeno anérgicos podem ter uma redução de no mínimo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mesmo 100% na atividade citotóxica em relação a um linfócito T específico contra o antígeno de controle correspondente.
[0063] Inibir ou tratar uma doença: Inibir uma doença, tal como crescimento tumoral, refere-se a inibir o pleno desenvolvimento de uma doença ou reduzir os efeitos fisiológicos do processo de doença. Em vários exemplos, inibir ou tratar uma doença refere-se a reduzir os sintomas de um tumor ou de uma infecção com um patógeno. Por exemplo, o tratamento do câncer pode prevenir o desenvolvimento de síndrome paraneoplásica em uma pessoa que se saiba que tem um câncer, ou reduzir um sinal ou sintoma do tumor. Em outra modalidade, o tratamento de uma infecção pode ser referir a inibir o desenvolvimento ou reduzir um sintoma da infecção. "Tratamento" refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica relacionada com a doença. Vacinação terapêutica refere-se a administração de um agente a um indivíduo já infectado com um patógeno. O indivíduo pode ser assintomático, de modo que o tratamento previne o desenvolvimento de um sintoma.
[0064] Isolado: Um componente biológico "isolado", tal como um ácido nucleico, uma proteína (incluindo anticorpos) ou uma célula, que tenha sido substancialmente separado ou purificado de outros componentes biológicos no ambiente (tais como outras células) no qual o componente ocorre naturalmente, isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extra-cromossômicos, proteínas e organelas. Ácidos nucleicos e proteínas que tenham sido "isolados" incluem ácidos nucleicos e proteínas purificacos por métodos de purificação de rotina. O termo também engloba ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira bem como ácidos nucleicos sintetizados quimicamente.
[0065] Linfócito: Um tipo de leucócito que está envolvido nas defesas imunes do corpo. Existem dois tipos principais de linfócitos: linfócitos B e linfócitos T.
[0066] Gene 3 de ativação de linfócitos (LAG3): Uma proteína a qual em seres humanos é codificada pelo gene LAG3, também denominada CD223. LAG-3 é uma molécula da superfície celular com efeitos biológicos diversos sobre a função dos linfócitos T, e é um receptor de ponto de controle imune. LAG3 regula negativamente a proliferação celular, a ativação, e a homeostasia de linfócitos T, e feoi reportado que tem um papel na função supressiva de Treg. Um exemplo de aminoácido e mRNA codificando LAG3 humana é proporcionado no GENBANK® Acesso No. NM_002286.5, 9 de abril de 2017, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0067] Mamífero: Este termo inclui tanto mamíferos humanos quanto não humanos. De modo similar, o termo "sujeito" inclui tanto sujeitos humanos quanto veterinários.
[0068] Intensidade de Fluorescência Média (citometria de fluxo): Citometria de fluxo diz respeito à medição da intensidade da luz de uma célula ou partícula, quer seja luz laser dispersa ou fluorescência emitida por um fluorocromo. A luz é detectada por um tubo fotomultiplicador (PMT), o qual converte a mesma através de um amplificador para uma voltagem que é proporcional à intensidade da fluorescência original e à voltagem sobre o tubo fotomultiplicador. Estas voltagens, as quais são uma distribuição contínua, são convertidas para uma distribuição discreta por um conversor Analógico para Digital (ADC), o qual coloca cada sinal dentro de um canal específico dependendo do nível de fluorescência. Quanto maior a resolução do conversor analógico para digital, mais próximo isto reflete a distribuição contínua.
[0069] Dados citométricos de fluxo podem ser apresentados usando ou uma escala linear ou uma escala logarítmica. O uso de uma escala logarítmica é indicado na maioria das situações biológicas onde as distribuições são deslocadas para a direita. Neste caso o efeito é normalizar a distribuição-diz-se ser Log Normal e os dados serem transformados em log. Sinais lineares vêm através de um amplificador linear, mas a transformação logarítmica pode ser obtida ou por um amplificador logarítmico ou pelo uso de tabelas do tipo Look Up Tables (LUT). A maioria dos conversoreres analógico para digital nos citômetros analíticos são de 10 bit, istó e, dividem dados em 2l0 ou 1024 canais, embora exista uma tendência crescente para usar ADCs de 12 ou 14 bit para proporcionar maior resolução de dados.
[0070] Dados de um único canal de dados (dispersão ou fluorescência) são apresentados como um histograma no qual o eixo x é dividido em 1024 canais (para um ADC de 10 bit). Se os dados estiverem em uma escala linear, o número do canal e o valor linear para aquele canal serão facilmente obtidos. Em uma escala logarítmica, o eixo x ainda é dividido em 1024 canais, mas é apresentado como uma escala da década de 5 log (em geral são usadas décadas de 5 log).
[0071] Para quantificar dados citométricos de fluxo, são utilizadas as medidas da distribuição de uma população. De modo geral, as medidas da tendência central são a média e a mediana. A média é a 'média' e pode ser ou aritmética ou geométrica. A média aritmética é calculada como Sigma(x)/n, e a média geométrica como n raiz (a1 x a2 x a3....an). Em geral, com dados amplificados logarítmicos, a média geométrica é usada levando em cona a a ponderação da distribuição de dados, e a média aritmética é usada para dados lineares ou dados apresentados sobre uma escala linear. A mediana é o valor central,
isto é, o quinquagésimo percentil, onde metade dos valores estão acima e metade abaixo. Uma célula com "alta" expressão e "baixa" expressão pode ser determinada relativamente dependendo da fluorescência da população inteira; estes parâmetros são prontamente visualizados sobre gráficos de dados citométricos de fluxo.
[0072] Meio (cultura de tecido ou cultura celular): Um conjunto sintético de condições de cultura com os nutrientes necessários para suportar o crescimento (proliferação/expansão celular) de uma população específica de células. Os meios geralmente incluem uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e um tampão para manter o pH. Em uma modalidade, o meio de crescimento contém um meio mínimo essencial, tal como RPMI, suplementado com vários nutrientes para reforçar o crescimento celular. Além disso, o meio mínimo essencial pode ser suplementado com aditivos tais como soro humano, de vitelo ou bovino fetal.
[0073] Neoplasia, malignidade, câncer ou tumor: Um neoplasma é um crescimento anormal de tecido ou células que resulta de divisão celular excessiva. O crescimento neoplásico pode produzir um tumor. Um "câncer" ou "tumor" é um neoplasma que sofreu anaplasia característica com perda de diferenciação, aumento da taxa de crescimento, invasão do tecido circundante, e é capaz de metastizar. A quantidade d eum tumor em um indivíduo é a "carga tumoral" a qual pode ser medida como o número, o volume, ou o peso do tumor. Um tumor que não sofre metástase é referido como "benigno." Um tumor que invade o tecido circundante e/ou pode metastizar é referido como "maligno." Câncer metastático é um câncer em um ou mais sítios no corpo diferentes do sítio de origem do câncer original (primário) a partir do qual o câncer metastático é derivado.
[0074] Exemplos de tumores hematologicos incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia linfocítica aguda,
leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogênica aguda e leucemia mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (tais como leucemia mielocítica crônica (granulocítica), leucemia mielogênica crônica, e leucemia linfocítica crônica), policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin (formas indolente e de alto grau), mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células cabeludas e mielodisplasia.
[0075] Exemplos de tumores sólidos, tais como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do colon, malignidade linfóide, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de pulmãos, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma espinocelular, carcinoma basocelular, adenocarcinoma, carcinoma de glândulas sudoríparas, carcinoma de tiróide medular, carcinoma de tiróide papilar, feocromocitomas, carcinoma de glândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma, tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, e tumores do sistema nervoso central (tais como um glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofariogioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma).
[0076] Em vários exemplos, um tumor é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga,
câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal.
[0077] Parenteral: Administrada for a do intestino, por exemplo, não através do trato alimentar. De modo geral, formulações parenterais são as formulações que vão ser administradas através de qualquer modo possível, com a exceção de ingestão. Este termo refere-se especialmente a injeções, quer administradas por via intravenosa, por via intratecal, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via intraarticular, ou por via subcutânea, e várias aplicações superficiais incluindo aplicação intranasal, intradérmica, e tópica, por exemplo.
[0078] Agente farmacêutico: Um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico ou profilático desejado quando adequadamente administrado a um indivíduo ou a uma célula.
[0079] Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os veículos farmaceuticamente aceitáveis de utilidade são convencionais. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975, descreve composições e formulações adequadas para liberação farmacêutica dos anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[0080] Em geral, a natureza do veículo vai depender do modo de administração em particular sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis, tais como água, salina fisiológica, soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similares como um veículo. Para composições sólidas (tais como formas de pós, pílulas, comprimidos, ou cápsulas), veículos sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, ou estearato de magnésio. Além de veículos biologicamente neutros, as composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, preservantes, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.
[0081] Polinucleotídeo: O termo polinucleotídeo ou sequência de ácidos nucleicos refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeo no mínimo 10 bases de comprimento. Um polinucleotídeo recombinante inclui um polinucleotídeo que não é imediatamente contíguo com ambas as sequências codificantes com as quais é imediatamente contíguo (uma sobre a extremidade 5' e uma sobre a extremidade 3') no genoma que ocorre naturalmente do organismo a partir do qual é derivado. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante o qual é incorporado em um vetor; em um vírus ou plasmídeo que se replica autonomamente; ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou o qual existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA) independente de outras sequências. Os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos, ou formas modificadas de qualquer nucleotídeo. O termo inclui formas de DNA de cadeia única e de cadeia dupla.
[0082] Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, independente do comprimento ou de modificação pós-translacional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). Um polipeptídeo pode ter entre 3 e 30 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, um polipeptídeo tem a partir de cerca de 7 a cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Em ainda outra modalidade, um polipeptídeo tem a partir de cerca de 8 a cerca de 10 aminoácidos de comprimento. Em ainda outra modalidade, um peptídeo tem cerca de 9 aminoácidos de comprimento. Com respeito a polipeptídeos, "compreende" indica que a sequência de aminoácidos adicional ou outras moléculas pode ser incluída na molécula, "consiste essencialmente em" indica que sequências de aminoácidos adicionais não são incluídas na molécula, mas que outros agentes (tais como marcadores ou compostos químicos) podem ser incluídos, e "consiste em" indica que sequências de aminoácidos adicionais e agentes adicionais não são incluídos na molécula.
[0083] Prevenir, tratar ou melhorar uma doença: "Prevenir" uma doença refere-se à inibição do pleno desenvolvimento de uma doença, tal como um tumor. "Tratar" refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica depois de ter começado a se desenvolver, tal como uma redução na carga tumoral ou uma diminuição no número ou tamanho de metástases. "Melhorar" refere-se à redução no número ou na gravidade dos sinais ou sintomas de uma doença, tal como câncer.
[0084] Proteína da Morte Celular Programada (PD)-l: Moléculas de PD-1 são membros da superfamília genética das imunoglobulinas. A PD-1 humana tem uma região extracelular contendo um domínio da superfamília de imunoglobulinas, um domínio transmembrana, e uma região intracelular incluindo um motivo inibidor à base de tirosina imunorreceptora (ITIM) ((Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992; Shinohara et al., Genomics 23:704, 1994; Patente U.S. No. 5.698.520, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Estas características também definem uma maior família de moléculas, denominada os receptores imunoinibitórios, a qual também inclui gp49B, PIR-B, e os receptores inibitórios killer (KIRs) (Vivier e Daeron (1997) Immunol. Today 18:286). Sem ser limitado pela teoria, acredita-se que o motivo ITIM fosforilado com tirosil destes receptores interage com o domínio SI 12 contendo fosfatase, o qual leva a sinais inibitórios. Um subgrupo destes receptores imuno-
inibitórios se ligam a moléculas de complexo de histocompatibilidade maior (MHC), tais como os KIRs, e proteína 4 associada a linfócitos T citotóxicos (CTLA-4) se liga a B7-1 e B7-2. Em seres humanos, PD-1 é um receptor transmembrana do tipo I de 50 a 55 kDa que foi originalmente identificado em uma linhagem de linfócitos T submetida a apoptose induzida por ativação. PD-1 é expressa sobre linfócitos T, linfócitos B, e macrófagos. Os ligantes para PD-1 são os membros da família B7 PD-ligante 1 (PD-L1, também conhecido como B7-H1) e PD-L2 (também conhecido como B7-DC).
[0085] In vivo, PD-1 é expressa sobre linfócitos T, linfócitos B, e monócitos ativados. Dados experimentais implicam as interações de PD-1 com seus ligantes em regulação negativa de respostas imunes centrais e periféricas. Em particular, a proliferação em linfócitos T selvagens, mas não em linfócitos T deficientes de PD-1 é inibida na presença de PD-L1. Além disso, camundongos deficientes de PD-1 apresentam um fenótipo autoimune. Um exemplo de sequência de aminoácidos de PD-1 humana é estipulado em Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992; Shinohara et al. Genomics 23:704,1994; Pat. U.S. No.
5.698.520):
[0086] O engate de PD-1 (por exemplo, por reticulação ou por agregação), leva à transmissão de um sinal inibitório em uma célula imune, resultando em uma redução das respostas imunes concomitantes com um aumento em anergia de células imunes. PD-1 se liga a dois ligantes, PD-L1 e PD-L2, ambos os quais são polipeptídeos ligantes de PD-1 humana, que são membros da família de polipeptídeos B7.
[0087] Antagonistas de PD-1 incluem agentes que reduzem a expressão ou atividade de um ligante de PD 1 (PD-L1) ou um ligante de PD 2 (PD-L2) ou reduz as interações entre PD-1 e PD-L1, ou PD- L2. Exemplos de compostos incluem anticorpos (tais como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, e um anticorpo anti-PD- L2), moléculas de RNAi (tais como moléculas de RNAi anti-PD-1, RNAi anti-PD-L1, e um RNAi anti-PD-L2), moléculas antisense (tais como um RNA antisense anti-PD-1, um RNA antisense anti-PD-L1, e um RNA antisense anti-PD-L2), proteínas dominantes negativas (tais como uma proteína PD-1 dominante negativa, uma proteína PD-L1 dominante negativa, e uma proteína PD-L2 dominante negativa), vide, por exemplo, a Publicação PCT de Patente Internacional No. 2008/083174, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0088] Proliferação: A divisão de uma célula para produzir progênie, a qual pode ser medida em uma série de modos conhecidos na arte. Isto inclui, mas não está limitado a, testes que contam o número total de células, testes que contam o número de células de um tipo celular específico, testes de Ki-67, incorporação de timidina, e testes de bromodeoxiuridina.
[0089] Purificado: O termo purificado não requer pureza absoluta; ao contrário, é pretendido como um termo relativo. Portanto, por exemplo, uma preparação de peptídeo purificado é uma preparação na qual o peptídeo ou a proteína é mais enriquecido/a do que o peptídeo ou a proteína é em seu ambiente natural dentro de uma célula. Em uma modalidade, uma preparação é purificada de tal modo que a proteína ou peptídeo representa no mínimo 50% do teor de peptídeo ou proteína total da preparação. Substancial purificação denota purificação de outras proteínas ou componentes celulares. Uma proteína substancialmente purificada é no mínimo 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% pura. Portanto, em um exemplo específico e não limitante, uma proteína substancialmente purificada é 90% livre de outras proteínas ou componentes celulares.
[0090] Amostra (Amostra biológica): Inclui amostras biológicas contendo fluidos, tecidos, células, e subcomponentes das mesmas, tais como DNA, RNA, e proteínas. Por exemplo, amostras comuns incluem biópsia tumoral, medula óssea, baço, linfonodo, sangue, por exemplo, sangue periférico (mas também podem incluir qualquer outra fonte a partir da qual podem ser isolados linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, incluindo: biópsia de tecido, amostras cirúrgicas, aspirados de agulha fina, material de autópsia, e similares).
[0091] Agente de ligação específica: Um agente que se liga substancialmente somente a um alvo definido. Em uma modalidade, o agente de ligação específica é um anticorpo monoclonal ou policlonal que se liga especificamente a um polipeptídeo PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 ou 4-lBB.
[0092] O termo "se liga especificamente a" refere-se, com respeito a um antígeno tal como polipeptídeo PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 ou 4-lBB à associação preferencial de um anticorpo ou outro ligante, no todo ou em parte, com uma célula ou tecido portando aquele antígeno e não a células ou tecidos carecendo daquele antígeno. Logicamente, é reconhecido que pode ocorrer um certo grau de interação inespecífica entre uma molécula e uma célula ou tecido não alvo. Não obstante, ligação específica pode ser diferenciada como mediada através de reconhecimento específico do antígeno. Embora anticorpos seletivamente reativos se liguem a antígeno, podem fazer isso com baixa afinidade. Ligação específica resultar em uma associação muito mais forte entre o anticorpo (ou outro ligante) e células portando o antígeno do que entre o anticorpo (ou outro ligante) e células carecendo do antígeno. Ligação específica tipicamente resulta em aumento de mais de 2 vezes, tal como mais de 5 vezes, mais de 10 vezes, ou mais de 100 vezes na quantidade de anticorpo ligado ou outro ligante (por unidade de tempo) a uma célula ou tecido portando o polipeptídeo em comparação com uma célula ou tecido carecendo do polipeptídeo. Ligação específica a uma proteína sob condições similares requer um anticorpo que seja selecionada por sua especificidade para uma proteína particular. Uma variedade de formatos de imunoensaio são apropriadas para selecionar anticorpos ou outros ligantess especificamente imunorreativos com uma proteína particular. Por exemplo, imunoensaios ELISA de fase sólida são usados rotineiramente para selecionar anticorpos monoclonais especificamente imunorreativos com uma proteína. Vide Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), para uma descrição de formatos de imunoensaios e condições que podem ser usados para determinar imunorreatividade específica.
[0093] Indivíduo: Organismos vertebrados multi-celulares vivos, uma categoria que inclui tanto indivíduos humanos quanto veterinários, incluindo mamíferos humanos e não-humanos.
[0094] Linfócito T: Um leucócito crucial para a resposta imune. Os linfócitos T incluem, mas não estão limitados a, linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ . Um linfócito T CD4+ é uma célula imune que carrega um marcador sobre sua superfície conhecido como "aglomerado de diferenciação 4" (CD4). Estas células, também conhecidas como linfócitos T helper, ajudam a orquestrar a resposta imune, incluindo respostas de anticorpos bem como respostas de linfócitos T killer. Os linfócitos T CD8+ carregam o marcador do "aglomerado de diferenciação 8" (CD8). Em uma modalidade, um linfócito T CD8+ é um linfócito T citotóxico. Em outra modalidade, uma célula CD8+ é um linfócito T supressor. Um linfócito T é "ativado" quando pode responder a um antígeno de interesse específico apresentado sobre uma célula de apresentação ao antígeno.
[0095] Imunoglobulina de linfócitos T e domínio contendo mucina -3 (TIM-3): Uma proteína que em seres humanos é codificada pelo gene HAVCR2. TIM3 é um ponto de controle imune que é uma proteína da superfície celular Th1-específica que regula a ativação de macrófagos e reforça a gravidade da encefalomielite autoimune experimental em camundongos. A via Tim-3 pode interagir com a via PD-1 nos linfócitos T CD8+ exauridos no câncer. Um exemplo de sequência de proteína e mRNA para TIM-3 humano é proporcionado no GENBANK® Acesso No. NM_032782.4, 30 de abril de 2017, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[0096] Quantidade terapeuticamente eficaz: Uma quantidade de uma substância específica suficiente para obter um efeito desejado em um indivíduo que esteja sendo tratado. Por exemplo, esta pode ser a quantidade necessária para inibir ou suprimir o crescimento de um tumor. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade necessária para eliminar, reduzir o tamanho, ou prevenir metástase de um tumor. Quando administrada a um indivíduo, geralmente vai ser usada uma dosagem que vai obter concentrações em teciduos alvo (por exemplo, em tumores) que foi demonstrado que atingem um efeito desejado in vitro.
[0097] A menos que explicado de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um perito na arte à qual a presente invenção pertence. Os termos no singular "um," "uma," e "o", "a" incluem referentes no plural a menos que o contexto claramente indique de modo diverso. De modo similar, a palavra "ou" se destina a incluir "e" a menos que o contexto claramente indique de modo diverso. Consequentemente "compreendendo A ou B" significa incluindo A, ou B, ou A, e B. É ainda entendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácidos, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucleicos ou polipeptídeos são aproximados, e são proporcionados para descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados na prática ou experimentação da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, requerimentos de patente, patentes, e outras referências mencionadas aqui, neste requerimento de patente, são incorporados por meio de referência em sua totalidade. Todos os números de Accesso no GENBANK® são aqui, a este requerimento de patente, incorporados por meio de referência à medida que aparecem no banco de dados em 1º. de junho
2017. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo explanações de termos, vai controlar. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos somente e não se destinam a ser limitante. Métodos de Tratamento: Imunoterapia Adotiva
[0098] São descritos métodos aqui, neste requerimento de patente, para o tratamento de um indivíduo de interesse, tal como um indivíduo portador de um tumor. Os métodos incluem a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. São descritos métodos aqui, neste requerimento de patente, para aumentar a resposta imune, tal como reforçando o sistema imune em um indivíduo. A administração dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ purificados, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, vai aumentar a capacidade de um indivíduo para provocar uma resposta imune, tal como a um tumor. Portanto, por purificação e produção de uma população de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ purificados selecionados de um indivíduo ex vivo e introdução de uma quantidade terapêutica destas células, a resposta imune do indivíduo receptor é reforçada. Agentes adicionais também podem ser administados ao indivíduo, conforme discutido abaixo. O indivíduo pode ser um indivíduo humano ou um indivíduo veterinário.
[0099] Em um exemplo, o método inclui o isolamento do doador de uma população de células do doador incluindo linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ (tais como células mononucleares do sangue periférico ou linfócitos T de uma biópsia tumoral), e opcionalmente expansão das células. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ é administrada ao receptor, deste modo produzindo uma resposta imune para o tumor no receptor. Os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ referidos podem destruir células contendo o antígeno associado ao tumor ou auxiliar outras células imunes. Em algumas modalidades, podem ser administrados terapêuticos adicionais contra o câncer, tais como agentes quimioterápicos.
[00100] Em várias modalidades o método também inclui a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4-1BB ao indivíduo. A administração de um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4-IBB é descrita em detalhes abaixo. A administração de uma quantidade terapêutica de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4- IBB pode ser usada profilaticamente para prevenir a recidiva do tumor no receptor, ou para tratar uma recidiva do tumor.
[00101] De modo geral, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ são autólogos. No entanto, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ também podem reagir com MHCs correspondentes de doadores alogênicos. De modo geral, os linfócitos T são positivos para expressão de CD3, CD8, CD39, e CD103. Por exemplo, classificação celular ativada por fluorescência (FACS) pode ser usada para identificar (e ordenar, caso desejado) populações de células que são positivas para CD3, CD8, CD39 e CD103 por uso de anticorpos anti-CD3, anti-CD8, anti-CD39 e anti-CD103 coloridos diferentemente. Em resumo, uma população de células, tais como células mononucleares do sangue periférico ou linfócitos T de uma biópsia tumoral são incubados na presença de anticorpos anti-CD103, anti-CD8, anti-CD39 e opcionalmente anti-CD3 (cada um tendo um fluoróforo diferente anexado), por um tempo suficiente para o anticorpo se ligar às células. Depois da remoção de anticorpo não ligado, as células são analisadas por FACS usando métodos de rotina. Em exemplos específicos, a população de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ resultante é no mínimo 30% pura em relação à população total de células positivas CD8+, tal como no mínimo cerca de 50% pura, no mínimo cerca de 60% pura, no mínimo cerca de 70% pura, no mínimo cerca de 80% pura, no mínimo cerca de 90% pura, no mínimo cerca de 95% pura, ou no mínimo cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98% ou cerca de 99% pura em relação à população total de células CD8 positivas. Portanto, somente é administrado um número limitado de células heterólogas. As células podem ser processadas por mais de uma rodada de classificação celular. Populações de linfócitos T podem ser testadas para mycoplasma, esterilidade, endotoxina e qualidade controlada para função e pureza antes de criopreservação ou antes de infusão para dentro do receptor.
[00102] Em uma modalidade, anticorpos marcados especificamente direcionados para um ou mais marcadores da superfície celular são usados para identificar, quantificar, e/ou isolar linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ e populações destas células que expressam marcadores adicionais. Os anticorpos podem ser conjugados a outros compostos incluindo, mas não limitados a, enzimas, contas magnéticas, contas magnéticas coloidais, haptenos, fluorocromos, compostos metálicos, compostos radioativos ou fármacos. As enzimas que podem ser conjugadas aos anticorpos incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina, peroxidase, urease e β-galactosidase. Os fluorocromos que podem ser conjugados aos anticorpos incluem, mas não estão limitados a, isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de tetrametilrodamina, ficoeritrina, aloficocianinas e Texas Red. Para fluorocromos adicionais que podem ser conjugados aos anticorpos vide Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, publicado pela Molecular Probes, 9th Edition (2002). Os compostos metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos incluem, mas não estão limitados a, ferritina, ouro coloidal, e, particularmente, contas superparamagnéticas coloidais. Os haptenos que podem ser conjugados aos anticorpos incluem, mas não estão limitados a, biotina, digoxigenina, oxazalona, e nitrofenol. Os compostos radioativos que podem ser conjugados ou incorporados nos anticorpos são conhecidos na arte, e incluem, mas não estão limitados a, technetium 99 (99Tc), 125I, e aminoácidos compreendendo quaisquer radionuclídeos, incluindo, mas não limitados a, 14C, 3H e 35S.
[00103] Em alguns exemplos, linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ são isolados contactando as células de uma amostra biológica, tal como uma amostra de sangue periférico ou uma amostra tumoral, com um anticorpo adequadamente marcado. No entanto, outras técnicas de eficácia diferente podem ser empregadas para purificar e isolar populações desejadas de células. As técnicas de separação empregadas vão maximizar a retenção de viabilidade da fração das células a serem coletadas. A técnica em particular empregada, logicamente, vai depender da eficiência de separação, da citotoxicidade do método, da facilidade e da velocidade de separação, e de qual equipamento e/ou conhecimento técnico é requerido.
[00104] Os dados gerados por citômetros de fluxo podem ser plotados em uma única dimensão, para produzir um histograma, ou em gráficos de pontos bidimensionais ou mesmo em três dimensões. As regiões sobre estes gráficos podem ser separadas sequencialmente, com base na intensidade da fluorescência, criando uma série de extrações de subgrupos, denominadas "gates." Protocolos de gating específicos são conhecidos na arte. Os gráficos são geralmente feitos em escalas logarítmicas. Como os espectros de emissão de diferentes corantes fluorescentes se sobrepõem, os sinais nos detectores são compensados eletronicamente e computacionalmente. Dados acumulados usando o citômetro de fluxo podem ser analisados usando software tal como FLOWJO® ou BD FACSDiva®. A análise é feita mais frequentemente em um computador separado. Os princípios de gating, os quais permitem a identificação de células que expressam altos níveis ou baixos níveis de uma proteína de interesse, são de conhecimento geral na arte. Tutoriais para aprender a estabelecer gates são proporcionados, por exemplo, no website da FLOWJO®. De modo geral, um perito na arte pode usar prontamente qualquer máquina FACS e programas de computação para análise de dados de modo a estabelecer gates para separar células que expressam um marcador em particular. Como um exemplo, um perito na arte pode prontamente identificar células em que a expressão de CD8 está ausente (CD8-), a expressão de CD8 está presente (CD8+).
[00105] Procedimentos de separação adicionais podem incluir separação magnética, usando contas magnéticas revestidas com anticorpos, cromatografia por afinidade, agentes citotóxicos, quer unidos a um anticorpo monoclonal ou usados em conjunto com complemento, e "panning," o qual utiliza um anticorpo monoclonal anexado a uma matriz sólida, ou outra técnica conveniente. Aanticorpos anexados a contas magnéticas e outras matrizes sólidas, tais como contas de agarose, contas de poliestireno, membranas de fibra oca e placas de Petri de plástico, possibilitam a separação direta. As células que são ligadas pelo anticorpo podem ser removidas da suspensão celular simplesmente separando fisicamente o suporte sólido da suspensão celular. As condições exatas e a duração da incubação das células com os anticorpos ligados à fase sólida vão depender de vários fatores específicos para o sistema. No entanto, a seleção de condições apropriadas é de conhecimento geral na arte.
[00106] Células não ligadas podem ser em seguida elutriadas ou retiradas por lavagem com tampão fisiológico depois de ter sido permito tempo suficiente para as células expressando um marcador de interesse (tal como, mas não limitado a, CD8, CD39, CD103, e opcionalmente CD3, se ligarem aos anticorpos ligados a fase sólida. As células ligadas são em seguida separadas da fase sólida por qualquer método apropriado, dependendo essencialmente da natureza da fase sólida e do anticorpo empregado, e quantificadas usando métodos de conhecimento geral na arte. Em um exemplo específico e não limitante, células ligadas separadas da fase sólida são quantificadas por FACS (vide acima).
[00107] Anticorpos podem ser conjugados a biotina, os quais podem ser então removidos com avidina ou estreptavidina ligada a um suporte, ou fluorocromos, os quais podem ser usados com FACS para possibilitar separação e quantificação celular, conforme é de conhecimento na arte.
[00108] Em outra modalidade, pode ser usado um procedimento de aferese empregando um instrumento de aferese automatizado (tal como o separador de células sanguíneas CS-3000, Baxter Health Care,
Deerfield, IL, ou máquina equivalente) para coletas células de um indivíduo. Em um exemplo específico e não limitante, anticorpos marcados especificamente direcionados para um ou mais marcadores da superfície celular são usados para identificar e quantificar os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ tais como as células descritas aqui, neste requerimento de patente.
[00109] Em algumas modalidades, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ são expandidos in vitro antes de administração ao indivíduo. Métodos de expansão são descritos abaixo.
[00110] A presente invenção também proporciona composições terapêuticas que incluem os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ enriquecidos (tal como purificados) e opcionalmente um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4-IBB. As composições são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, tais como, mas não limitado a, tratamento de um indivíduo portador de um tumor. Em exemplos particulares, uma população de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ é colocada em uma forma de dose terapêutica para administração a um indivíduo que necessite dos mesmos. O antagonista de PD-1, o antagonista de PD-L1, o antagonista de CTLA- 4, o antagonista de BTLA, o antagonista de TIM-3, o antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4-IBB também está presente em uma forma de dose terapêutica para administração a um indivíduo que necessite de tratamento.
[00111] Uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ é administrada ao indivíduo. Exemplos específicos e não limitantes de uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ incluem linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ purificados administrados em uma dose de cerca de 1
X 105 células por quilograma do indivíduo a cerca de 1 X 109 células por quilograma do indivíduo, tal como a partir de cerca de 1 X 106 células por quilograma a cerca de 1 X 108 células por quilograma, tal como a partir de cerca de 5 X 106 células por quilograma a cerca de 75 X 106 células por quilograma, tal como a cerca de 25 X 106 células por quilograma, ou a cerca de 50 X 106 células por quilograma.
[00112] Linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ purificados podem ser administrados em doses únicas ou múltiplas conforme determinado por um médico. Por exemplo, as células pode ser administradas em intervalos de aproximadamente um dia, dois dias, três dias, quatro dias, cinco dias, seis dias, uma semana, duas semanas ou mensalmente dependendo da resposta desejada e da resposta obtida. Em alguns exemplos, assim que é obtida a resposta desejada, não são mais administrados linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. No entanto, se o receptor apresentar um ou mais sintomas associados com o tumor, pode ser administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ naquele momento.
[00113] A administração pode ser local ou sistêmica. Em algumas modalidades, as células são administradas por via intravenosa depois do indivíduo ser tratado com quimioterapia. Em outras modalidades, também são administradas citocinas ao indivíduo, tais como IL-2 e/ou IL-15, para suportar a proliferação das células administradas.
[00114] Os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ purificados descritos aqui, neste requerimento de patente, pode ser administrado com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como salina. O antagonista de PD-1, o antagonista de PD-L1, o antagonista de CTLA-4, o antagonista de BTLA, o antagonista de TIM-3, o antagonista de LAG3 e/ou um agonista de 4-IBB também pode ser formulado em um veículo farmaceuticamente aceitável, conforme descrito abaixo. Estes podem ser formulados em uma única composição, ou em duas composições separadas. Em alguns exemplos, outros agentes terapêuticos são administrados com os linfócitos T. Outros agentes terapêuticos podem ser administrados antes, durante, ou depois da administração dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, dependendo do efeito desejado. Exemplos de agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, agentes anti-microbianos, imunoestimulantes tais como interferon-alfa, agentes quimioterápicos ou vacinas peptídicas usadas para estimular linfócitos T in vitro. Em um exemplo particular, composições contendo linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ também incluem o um ou mais agentes terapêuticos. O uso de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ pode reduzir o volume tumoral, metástase tumor, recidiva tumoral.
[00115] De modo geral, os métodos incluem selecionar um indivíduo tendo um tumor, tal como um tumor benigno ou maligno, e a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de (1) linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ e (2) opcionalmente um antagonista de inibidor de ponto de controle, tal como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3, ou um antagonista de CTLA-4, ou um agonista de 4-IBB. O antagonista de PD-1, o antagonista de PD-L1, o antagonista de BTLA, o antagonista de TIM-3, o antagonista de LAG3 ou o antagonista de CTLA-4, ou o agonista de 4-IBB, em alguns exemplos não limitantes, pode ser um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) que se liga especificamente a PD-1, PD-L1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG3, BTLA, CTLA-4, ou 4-1BB, respectivamente. Os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ são de utilidade para tratamento do tumor, tal como para redução do volume do tumor, redução ou prevenção de metástase, prevenção da conversão de um tumor benigno para um tumor maligno e/ou prevenção ou inibição da recidiva do tumor. A administração pode ser local ou sistêmica. Mètodos de administração adequados são de conhecimento de um médico.
[00116] Em algumas modalidades, uma vantagem dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, é que a combinação de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com inibidores de ponto de controle, tais como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um antagonista de CTLA-4, ou um agonista de 4-IBB, possibilita a dosagem reduzida de agentes ativos para terapia do câncer, ao mesmo tempo que reduzindo quaisquer efeitos colaterais indesejados correspondentes (tais como citotoxicidade) da terapia. Em modalidades adicionais, outra vantagem dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, é que a combinação de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com inibidores de ponto de controle, tais como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um antagonista de CTLA-4, ou com um agonista de 4-IBB, para tratamento do tumor, para como para redução do volume tumoral, redução ou prevenção de metástase, prevenção da conversão de um tumor benigno para um tumor maligno e/ou prevenção ou inibição da recidiva do tumor. Em modalidades adicionais, a combinação de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com inibidores de ponto de controle, tais como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3, um antagonista de LAG3 e/ou um antagonista de CTLA-4, ou um agonista de 4-IBB, possibilita o aumento da sobrevida.
[00117] Agentes adicionais também podem ser administados ao indivíduo de interesse, tal como, mas não limitado a, terapêuticos contra o câncer. Também podem ser administados tratamentos adicionais ao indivíduo, tais como, mas não limitados a, ressecção cirúrgica do tumor.
[00118] O indivíduo pode ser selecionado para tratamento. Por exemplo, um ensaio de diagnóstico (tal como um ensaio imunohistoquímico (IHC) pode ser realizado sobre o tumor (ou uma amostra sobre o tumor) para identificar o indivíduo como um indivíduo provável de responder ao método de tratamento descrito. Métodos de seleção são descritos abaixo.
[00119] Em modalidades adicionais, o indivíduo é selecionado para tratamento se o tumor testar positivo para expressão de PD-L1 ou PD- L2 por um ensaio IHC. Exemplos de testes para a detecção de um tumor que testa positivo para expressão de PD-L1 são proporcionados em Topalian et al. 2012. Safety, activity, and immune correlates of anti- PD-1 antibody in cancer. N. Engl. J. Med. 366:2443-2454; Wolchok et al. 2013. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N. Engl. J. Med. 369: 122-133; Herbst et al. 2014. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515:563-567; Garon et al. 2015. Pembrolizumab for treatment of non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 372:2018-2028; e Reck et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1 -positive non- small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 375:1823-1833, cada um dos quais é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente.
[00120] O tumor pode ser benigno ou maligno. O tumor pode ser qualquer tumor de interesse, incluindo, mas não limitado a, um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal. O câncer de pulmão pode ser carcinoma do pulmão de células pequenas ou não células pequenas. O câncer de fígado pode ser um carcinoma hepático. O câncer de mama pode ser câncer de mama triplo negativo. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor de cabeça e pescoço, tal como tumores da cavidade nasal, dos seios paranasais, da nasofaringe, da cavidade oral, da orofaringe, da laringe, da hipofaringe, das glândulas salivaress e paragangliomas.
Exemplos adicionais são tumores de pele, tumores cerebrais, carcinomas cervicais, carcinomas testiculares, tumores do trato gastrointestinal, tumores do sistema genitourinário, tumores do sistema ginecológico, tumores do sistema endócrino, um sarcoma de ossos e tecidos moles, um mesotelioma, um melanoma, um neoplasma do sistema nervoso central, ou uma leucemia.
Em outras modalidades, o tumor é um tumor do pulmão, tal como um câncer de pulmão de células não pequenas ou um câncer de pulmão de células pequenas.
Em modalidades adicionais, o tumor pode ser um tumor do trato gastrointestinal, tal como câncer do esôfago, do estômago, do pâncreas, do fígado, das árvores biliares, do intestino delgado, do cólon, do retuo e da região anal.
Em ainda outras modalidades, o tumor pode ser um tumor do sistema genitourinário, tal como câncer do rim, de uretra, de bexiga, de próstata, de uretra, do pênis e dos testículos.
Em algumas modalidades, o tumor é um tumor ginecológico, tal como câncer do colo uterino, da vagina, da vulva, do corpo uterino, doenças trofoblásticas gestacionais, de ovário, das trompas de falópio, peritoneal, ou de mama.
Em outras modalidades, o tumor é um tumor do sistema endócrino, tal como um tumor de tiróide, um tumor de paratiróide, um tumor do córtex adrenal, um tumor endócrino pancreático, um tumor carcinoide e síndrome carcinoide.
O tumor pode ser um sarcoma dos ossos e de tecidos moles, um mesotelioma, um câncer da pele, um melanoma, compreendendo melanomas cutâneos e melanomas intraoculares, um neoplasma do sistema nervoso central, um câncer da infância, compreendendo retinoblastoma, tumor de Wilm, neurofibromatoses, neuroblastoma, a família de tumores de sarcoma de Ewing, rabdomiossarcoma.
O tumor pode ser um linfoma, compreendendo linfomas não-Hodgkin, linfomas cutâneos de linfócitos T, linfoma do sistema nervoso central primário, e doença de Hodgkin. O tumor pode ser um leucemia, tal como leucemia aguda, leucemia mielóide e leucemia linfocítica. O tumor pode ser neoplasmas de células plasmáticas, um câncer de sítio primário desconhecido, um carcinomastosis peritoneal, um sarcoma de Kaposi, linfomas associadas à AIDS, linfoma do sistema nervoso central primário associado à AIDS, doença de Hodgkin associada à AIDS e cânceres anogenitais associados à AIDS, um câncer metastático para o fígado, câncer metastático para o osso, efusões pleural e pericardial malignas e ascite maligna.
[00121] Em algumas modalidades, o tratamento do tumor é iniciado depois do diagnóstico do tumor, ou depois da iniciação de uma condição precursora (tal como displasia ou desenvolvimento de um tumor benigno). O tratamento pode ser iniciado nos estágios iniciais do câncer, por exemplo, pode ser iniciado antes de um indivíduo manifestar sintomas de uma condição, tal como durante um diagnóstico do estágio I ou no momento em que é diagnosticada displasia ou em que é diagnosticada uma condição proliferativa in situ. No entanto, o tratamento pode ser iniciado durante qualquer estágio da doença, tal como, mas não limitado aos cânceres do estágio I, do estágio II, do estágio III e do estágio IV. Em alguns exemplos, o tratamento é administrado a estes sujeitos com um tumor benigno que pode se converter em um tumor maligno ou mesmo metastático.
[00122] Tratamento antes do desenvolvimento da condição, tal como tratamento depois de detecção de displasia ou de uma condição precursora inicial (benigna), é referido aqui, neste requerimento de patente, como tratamento de um indivíduo que esteja "em risco" de desenvolver a condição. Em algumas modalidades, a administração de uma composição pode ser realizada durante ou depois da ocorrência das condições descritas aqui, neste requerimento de patente. As composições podem ser administradas a um indivíduo em risco de desenvolver o tumor
[00123] A presença de um tumor pode ser determinada por métodos conhecidos na arte, e tipicamente inclui avaliação citológica e morfológica. O tumor pode ser um tumor estabelecido. As células podem ser in vivo ou ex vivo, incluindo células obtidas a partir de uma biópsia.
[00124] Tratamento iniciado depois do desenvolvimento de uma condição, tal como um câncer maligno, pode resultar em diminuição da gravidade dos sintomas de uma das condições, ou remoção completamente dos sintomas, ou redução de metástase, do volume tumoral ou do número de tumores. Em alguns exemplos, o tumor se torna indetectável depois do tratamento.
[00125] Em um aspecto da presente invenção, a formação de tumores, tais como metástase, é retardada, evitada ou diminuída. Em outro aspecto, o tamanho do tumor primário é diminuído. Em um aspecto adicional, um sintoma do tumor é diminuído. Em ainda outro aspecto, o volume tumoral é diminuído. Em ainda outro aspecto, a recidiva do tumor é retardada ou evitada, tal como por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 2, 22, 23, ou 24 meses, ou por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 anos.
[00126] Em algumas modalidades, pode ser medida a resposta imune, pode ser medido o volume tumoral, pode ser medido o número de lesões metastáticas, e/ou pode ser medido um sintoma de um tumor. Uma dose terapeuticamente eficaz pode aumentar a resposta imune, diminuir o volume tumoral, diminuir o número e/ou o tamanho das metástases, e/ou diminuir um ou mais sintomas do tumor.
[00127] Embora os métodos e as composições descritos tipicamente venham a ser usados para tratar sujeitos humanos,
também podem ser usados para tratar doenças similares ou idênticas em outros vertebrados, tais como outros primatas, cães, gatos, cavalos, e vacas. Um formato de administração adequado pode ser melhor determinado por um médico para cada indivíduo individualmente. Vários veículos farmaceuticamente aceitáveis e a formulação dos mesmos são descritos em tratados de formulação de rotina, por exemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. Vide também Wang, Y. J. e Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42: 2S, 1988. A forma de dosagem da composição farmacêutica vai ser determinada pelo modo de administração escolhido.
[00128] Linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados localmente ou sistemicamente, por qualquer via. Por exemplo, linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados por via intratumoral, por via intraperitoneal, por via intravenosa. Em um exemplo não limitante, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados por via intravenosa. Um antagonista de PD-1, de PD-L1, de PD-L2, de BTLA, de TIM-3, de LAG3, ou de CTLA-4 (ou um agonista de 4-1BB) também pode ser administrado por qualquer via, incluindo administração parenteral, por exemplo, injeção ou infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, ou intraarticular, ou por administração sublingual, oral, tópica, intranasal, ou transmucosal, ou por inalação pulmonar. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ e/ou o antagonista de PD-1, de PD-L1, de PD-L2, de BTLA, de TIM-3, de LAG3, ou de CTLA-4 são administrados a um tecido em que o tumor é localizado, ou diretamente dentro do tumor (intratumoral). Quando é proporcionada uma composição parenteral, por exemplo, para injeção ou infusão, agentes ativos geralmente são suspensos em um veículo aquoso, por exemplo, em uma solução tampão isotônica em um pH de cerca de 3,0 a cerca de 8,0, de modo preferencial em um pH de cerca de 3,5 a cerca de 7,4, 3,5 a 6,0, ou 3,5 a cerca de 5,0. Tampões úteis incluem tampões de citrato de sódio-ácido cítrico e de fosfato de sódio- ácido fosfórico, e de acetato de sódio-ácido acético. Pode ser usada uma forma de preparação de repositório ou de liberação lenta de "depósito" de modo que quantidades terapeuticamente eficazes da preparação sejam liberadas na corrente sanguínea durante muitas horas ou dias depois de injeção ou liberação transdérmica.
[00129] Em determinadas modalidades, o antagonista de PD-1, de PD-L1, de PD-L2, de BTLA, de TIM-3, de LAG3, ou de CTLA-4 (tal como, mas não limitado a, um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno), ou o agonista de 4-1BB pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente. Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o agente adicional, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
[00130] Em algumas modalidades, o antagonista de PD-1 ou de PD-L1 (tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a PD-1 ou PD-L1) pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente.
Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o antagonista de PD-1 ou de PD-L1, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
Em determinadas modalidades, o antagonista de CTLA-4 (tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CTLA-4) pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente.
Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o antagonista de CTLA-4, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
Em modalidades adicionais, o antagonista de BTLA (tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a BTLA) pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente.
Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o antagonista de BTLA, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
Em modalidades adicionais, o antagonista de LAG3 ou TIM-3 (tal como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a LAG3 ou TIM-3) pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente.
Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o antagonista de LAG3 ou TIM-3, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
Em ainda outras modalidades, o agonista de 4-1BB (tais como um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a 4-1BB) pode ser administrado em uma dose na faixa de a partir de cerca de 0,01 a 10 mg/kg, 0,01 a 5 mg/kg, 0,01 a 1 mg/kg, 0,01 a 0,1 mg/kg, 1 a 10 mg/kg, 1 a 5 mg/kg, 1 a 3 mg/kg, 0,5 a 1,0 mg/kg, 0,05 a 0,5 mg/kg, de acordo com um esquema de dosagem de administração incluindo sem limitação diariamente, 2 ou 3 vezes por semana, semanalmente, a cada 2 semanas, a cada 3 semanas, mensalmente, etc., ou outra dose e esquema de dosagem considerado apropriado pelo médico assistente. Como parte da terapia de combinação, os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser administrados ao indivíduo antes, depois, ou concomitante com o agonista de 4-IBB, contanto que o esquema de administração proporcione algumas concentrações fisiológicas suficientes dos agentes para proporcionar um benefício terapêutico.
[00131] Podem ser utilizadas composições de liberação sustentada. Exemplos adequados de composições de liberação sustentada incluem materiais poliméricos adequados (tais como, por exemplo, matrizes poliméricas semi-permeáveis sob a forma de artigos modelados, por exemplo, filmes, ou mirocápsulas), materialis hidrofóbicos adequados (tais como, por exemplo, uma emulsão em um óleo aceitávle) ou resinas de permuta iônica, e derivados parcamente solúveis (tais como, por exemplo, um sal parcamente solúvel). Formulações de liberação sustentada podem ser administradas por via oral, por via retal, por via parenteral, por via intracistemal, por via intravaginal, por via intraperitoneal, topicamente (como por pós, pomadas, géis, gotas ou emplastro transdérmico), por via bucal, ou como um spray oral ou nasal, dependendo da localização do tumor.
[00132] Os veículos e excipientes farmaceuticamente aceitáveis úteis nos métodos descritos são convencionais. Por exemplo, as formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que são veículos de fluidos frarmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tais como água, salina fisiológica, outras soluções salinas balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similares. Excipientes que podem ser incluídos são, por exemplo, proteínas, tais como albumina sérica humana ou preparações de plasma. Caso desejado, a composição farmacêutica a ser administrada também pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, tais como agentes umectantes ou emulsificantes, preservantes, e agentes de tamponamento de pH e similares, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano. Os métodos atuais de preparação das formas de dosagem referidas são conhecidos, ou serão evidentes, para os peritos na arte.
[00133] Também são proporcionados kits. Llinfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ e/ou o antagonista de PD-1, de PD-L1, de PD-L2, de LAG3, de TIM-3, de BTLA, ou de CTLA-4 podem ser formulados em forma de unidade de dosagem, adequada para administração individual de dosagens precisas. A quantidade de um ou mais compostos ativos administrados vai ser dependente do indivíduo que estiver sendo tratado, da gravidade da doença, e da maneira de administração, e é melhor deixada para o critério do médico assistente. Dentro destes limites, a formulação a ser administrada vai conter uma quantidade do um ou mais componentes ativos em quantidades eficazes para obter o efeito desejado no indivíduo que estiver sendo tratado. São previstos múltiplos tratamentos, tal como durante intervalos de tempo definidos, tais como diariamente, bi-semanalmente, semanalmente, bi-mensalmente ou mensalmente, de tal modo a que seja realizada administração crônica.
[00134] Podem ser administrados agentes adicionais, tais como uma citocina, uma quimiocina, ou um agente quimioterápico. Estes podem ser incluídos nas composições farmacêuticas descritas. Pode ser administrada uma citocina, tal como interleucina-2 (IL-2), fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos (GM-CSF), ou interferon, tal como interferon (IFN) β. Em um exemplo, para a prevenção e o tratamento do câncer, pode ser administrado tratamento cirúrgico ao indivíduo. Em um exemplo, esta administração é sequencial. Em outros exemplos, esta administração é simultânea.
[00135] Exemplos de agentes quimioterápicos são agentes alquilantes, antimetabólitos, produtos naturais, ou hormônios e seus antagonistas.
Exemplos de agentes alquilantes incluem mostardas de nitrogênio (tais como mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, mostarda de uracila ou clorambucila), sulfonatos de alaquila (tais como bussulfano), nitrosouréias (tais como carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, ou dacarbazina). Exemplos de antimetabólitos incluem análogos do ácido fólico (tais como metotrexato), análogos de pirimidina (tais como 5-FU ou citarabina), e análogos de purina, tais como mercaptopurina ou tioguanina.
Exemplos de produtos naturais incluem vinca alcaloides (tais como vinblastina, vincristina, ou vindesina), epipodofilotoxinas (tais como etoposídeo ou teniposídeo), antibióticos (tais como dactinomicina, daunorubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina, ou mitocicina C), e enzimas (tais como L- asparaginase). Exemplos de agentes diversos incluem complexos de coordenação de platina (tais como cis-diamina-dicloroplatina II também conhecida como cisplatina), uréias substituídas (tais como hidroxiuréia), derivados de metil hidrazina (tais como procarbazina), e adrenocrotical suppressants (tais como mitotane e aminoglutetimida). Exemplos de hormônios e antagonistas incluem adrenocorticosteróides (tais como prednisona), progestinas (tais como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona, e acetato de magestrol), estrogênios (tais como dietilestilbestrol e etinil estradiol), antiestrogênios (tais como tamoxifeno), e androgênios (tais como proprionato de testerona e fluoximesterona). Exemplos dos fármacos quimioterápicos mais comumente usados incluem Adriamicina, Alkeran, Ara-C, BiCNU, Bussulfano, CCNU, Carboplatina, Cisplatina, Citoxano, Daunorrubicina, DTIC, 5-FU, Fludarabina, Hydrea, Idarubicina, Ifosfamida, Metotrexato, Mitramicina, Mitomicina, Mitoxantrona, Mostarda de Nitrogênio, Taxol (ou outros taxanos, tais como docetaxel), Velban, Vincristina, VP-16, enquanto alguns fármacos mais novos incluem Gemcitabina (Gemzar), Herceptina, Irinotecano (Camptosar, CPT-11), Leustatina, Navelbina, Rituxan STI- 571, Taxotere, Topotecano (Hycamtin), Xeloda (Capecitabina), Zevelin e calcitriol. Exemplos não limitante de imunomoduladores que podem ser usados incluem AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimina (Upjohn), gama interferon (Genentech), GM-CSF (fator estimulador de colônias de macrófagos granulócitos; Genetics Institute), IL-2 (Cetus ou Hoffman-LaRoche), globulina imune humana (Cutter Biological), IMREG (da Imreg of New Orleans, La.), SK&F 106528, e TNF (fator de necrose tumoral; Genentech). Em algumas modalidades, é administrado sorafenib ao indivíduo.
[00136] Agente quimioterápico adicional pode ser um anticorpo. Anticorpos podem ser proporcionados em forma liofilizada e reidratados com água estéril antes da administração, embora também sejam proporcionados em soluções estéreis de concentração conhecida. A solução de anticorpos é em seguida adicionada a uma bolsa de infusão contendo 0,9% de cloreto de sódio, Farmacopéia dos Estados Unidos, e tipicamente administrada em uma dosagem de a partir de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. Experiência considerável está disponível na arte na administração de fármacos de anticorpos, os quais têm sido comercializados nos Estados Unidos desde a aprovação de RITUXAN® em 1997. O anticorpo especificamente pode se ligar a proteína de morte programada (PD)-l ou ligante de proteína de morte programada (PD-L1) (vide abaixo). Anticorpos podem ser administrados por infusão lenta, ao invés de um bolo ou impulso intravenoso. Em um exemplo, uma maior carga de dose é administrada, com doses de manutenção subsequentes sendo administraas em um menor nível. Por exemplo, uma carga de dose inicial de 4 mg/kg pode ser infundida durante um período de alguns 90 minutos, seguida por doses de manutenção semanalmente por 4 a 8 semanas de 2 mg/kg infundidas durante um período de 30 minutos se a dose anterior tiver sido bem tolerada.
[00137] Os regimes de tratamento também incluem combinação com cirurgia, quimioterapia, radiação, ou outros agentes imunoablativos tais como CAMPATH, anticorpos anti-CD3 ou outras terapias de anticorpos, citoxina, fludarabina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micofenólico, esteróides, FR901228, citocinas, e irradiação, vacina de peptídeos, tais como a descrita em Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem uma antraciclina (por exemplo, doxorrubicina (por exemplo, doxorrubicina lipossômica)), um vinca alcaloide (por exemplo, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina), um agente alquilante (por exemplo, ciclofosfamida, decarbazina, melfalano, ifosfamida, temozolomida), um anticorpo contra células imunes (por exemplo, alentuzumab, gentuzumab, rituximab, tositumomab), um antimetabólito (incluindo, por exemplo, antagonistas do ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores da adenosina desaminase (por exemplo, fludarabina)), um inibidor do mTOR, um agonista de proteína relacionada com TNFR induzida por glicocorticóide de TNFR (GITR), um inibidor do proteassoma (por exemplo, aclacinomicina A, gliotoxina ou bortezomib), um imunomodulador tal como talidomida ou um derivado da talidomida (por exemplo, lenalidomida).
[00138] Agentes quimioterápicos gerais considerados para uso em terapias de combinação incluem anastrozol (ARIMIDEX®), bicalutamida (CASODEX®), sulfato de bleomicina (BLENOXANE®), bussulfan (MYLERAN®), injeção de bussulfan (BUSULFEX®), capecitabina (XELODA®), N4-pentoxicarbonil-5-deóxi-5-fluorocitidina, carboplatina (PARAPLATIN®), carmustina (BICNU®), clorambucila (LEUKERAN®), cisplatina (PLATINOL®), cladribina (LEUSTATIN®),
ciclofosfamida (CYTOXAN® ou NEOSAR®), citarabina, citosina arabinosídeo (CYTOSAR-U®), injeção de lipossoma de citarabina (DEPOCYT®), dacarbazina (DTIC-DOME®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), cloridreto de daunorubicina (CERUBIDINE®), injeção de lipossoma de citrato de daunorubicina (DAUNOXOME®), dexametasona, docetaxel (TAXOTERE®), cloridreto de doxorubicina (ADRIAMYCIN®, RUBEX®), etoposídeo (VEPESID®), fosfato de fludarabina (FLUDARA®), 5-fluorouracila (ADRUCIL®, EFUDEX®), flutamida (EULEXIN®), tezacitibina, Gencitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiuréia (HYDREA®), Idarubicina (IDAMYCIN®), ifosfamida (IFEX®), irinotecano (CAMPTOSAR®), L-asparaginase (ELSPAR®), cálcio leucovorin, melfalan (ALKERAN®), 6-mercaptopurina (PURINETHOL®), metotrexato (FOLEX®), mitoxantrona (NOVANTRONE®), milotarg, paclitaxel (TAXOL®), phoenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 com implante de carmustina (GLIADEL®), citrato de tamoxifeno (NOLVADEX®), teniposídeo (VUMON®), 6-tioguanina, thiotepa, tirapazamina (TIRAZONE®), cloridrteto de topotecano para injeção (HYCAMPTIN®), vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), e vinorelbina (NAVELBINE®). Exemplos de agentes alquilantes incluem, sem limitação, mostardas de nitrogênio, derivados de etilenimina, sulfonatos de alquila, nitrosouréias e triazenos): mostarda de uracila (AMINOURACIL MUSTARD®, CHLORETHAMINACIL®, DEMETHYLDOPAN®, DESMETHYLDOPAN®, HAEMANTHAMINE®, NORDOPAN®, URACIL NITROGEN MUSTARD®, URACILLOST®, URACILMOSTAZA®, URAMUSTIN®, URAMUSTINE®), clormetina (MUSTARGEN®), ciclofosfamida (CYTOXAN®, NEOSAR®, CLAFEN®, ENDOXAN®, PROCYTOX®, REVIMMUNE™), ifosfamida (MITOXANA®), melfalano (ALKERAN®), Chlorambucil (LEUKERAN®),
pipobroman (AMEDEL®, VERCYTE®), trietilenomelamina (HEMEL®, HEXYLEN®, HEXASTAT®), trietilenotiofosforamina, Temozolomide (TEMODAR®), thiotepa (THIOPLEX®), bussulfano (BUSILVEX®, MYLERAN®), carmustina (BiCNU®), lomustina (CEENU®), estreptozocina (ZANOSAR®), e Dacarbazina (DTIC-DOME®). Exemplos adicionais de agentes alquilantes incluem, sem limitação, Oxaliplatina (ELOXATIN®); Temozolomida (TEMODAR® e TEMODAL®); Dactinomicina (também conhecida como actinomicina-D, COSMEGEN®); Melfalano (também conhecido como L-PAM, L- sarcolisina, e mostarda de fenilalanina, ALKERAN®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HEXYLEN®); Carmustina (BICNU®); Bendamustina (TREANDA®); Bussulfano (BUSULFEX® e MYLERAN®); Carboplatina (PARAPLATIN®); Lomustina (também conhecida como CCNU, CEENU®); Cisplatina (também conhecida como CDDP, PLATINOL® e PLATINOL®-AQ); Clorambucila (LEUKERAN®); Ciclofosfamida (CYTOXAN® e NEOSAR®); Dacarbazina (também conhecida como DTIC, DIC e carboxamida de imidazol, DTIC-DOME®); Altretamina (também conhecida como hexametilmelamina (HMM), HEXYLEN®); Ifosfamida (IFEX®); Prednumustina; Procarbazina (MATULANE®); Mecloretamina (também conhecida como mostarda de nitrogênio, mustina e cloridreto de mecloroetamina, MUSTARGEN®); Estreptozocina (ZANOSAR®); Thiotepa (também conhecida como tiofosfoamida, TESPA e TSPA, THIOPLEX®); Ciclofosfamida (ENDOXAN®, CYTOXAN®, NEOSAR®, PROCYTOX®, REVIMMUNE®); e Bendamustina HCl (TREANDA®). Exemplos de inibidores de mTOR incluem, por exemplo, tensirolimo; ridaforolimo (conhecido formalmente como deferolimo, (1R,2R,4S)-4- [(2R)- 2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)- 1,18-dihidróxi-19,30-dimetóxi-15,17,21,23,29,35-hexametil-
2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4- azatriciclo[30.3.1.04,9]hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2- metoxiciclohexila dimetilfosfinato, também conhecido como AP23573 e MK8669, e descrito na Publicação de Patente Internacional PCT No.
WO 03/064383); everolimo (AFINITOR® ou RAD001); rapamicina (AY22989, SIROLIMUS®); simapimod (CAS164301-51-3); ensirolimo, (5-{2,4-Bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2- metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-Amino-8-[trans-4-(2- hidroxietóxi)ciclohexil]-6-(6-metóxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3- d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); e N2-[1,4- dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4- il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-α-aspartilL-serina-, sal interno (SF1126, CAS 936487-67-1), e XL765. Exemplos de imunomoduladores incluem, por exemplo, afutuzumab (disponível na ROCHE®); pegfilgrastim (NEULASTA®); lenalidomida (CC-5013, REVLIMID®); talidomida (THALOMID®), actimid (CC4047); e IRX-2 (mistura de citocinas humanas incluindo interleucina 1, interleucina 2, e interferon γ, CAS 951209-71-5, disponível na IRX Therapeutics). Exemplos de antraciclinas incluem, por exemplo, doxorrubicina (Adriamicin® e RUBEX®); bleomicina (LENOXANE®); daunorubicina (cloridreto de daunorubicina, daunomicina, e cloridreto de rubidomicina, CERUBIDINE®); daunorubicina lipossômica (lipossoma de citrato de daunorubicina, DAUNOXOME®); mitoxantrona (DHAD, NOVANTRONE®); epirubicina (ELLENCE™); idarubicina (IDAMYCIN®, IDAMYCIN PFS®); mitomicina C (MUTAMYCIN®); geldanamicina; herbimicina; ravidomicina; e desacetilravidomicina.
Exemplos de vinca alcalóides incluem, por exemplo, tartarato de vinorelbina (NAVELBINE®), Vincristina (ONCOVIN®), e Vindesina (ELDISINE®)); vinblastina (também conhecida como sulfato de vinblastina, vincaleucoblastina e VLB, ALKABAN-AQ® e VELBAN®); e vinorelbina (NAVELBINE®). Exemplos de inibidores de proteossoma incluem bortezomib (VELCADE®); carfilzomib (PX-171-007, (S)-4- Metil-N—((S)-1-(((S)-4-metil-1-((R)-2-metiloxiran-2-il)-1-oxopentan-2- il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)-2-((S)-2-(2-morfolinoacetamido)-4- fenilbutanamido)-pentanamida); marizomib (NPI-0052); citrato de ixazomib (MLN-9708); delanzomib (CEP-18770); e O-Metil-N-[(2-metil- 5-tiazolil)carbonil]-L-seril-O-metil-N-[(1S)-2-[(2R)-2-metil-2-oxiranil]-2- oxo-1-(fenilmetil)etil]-L-serinamida (ONX-0912). Exemplos de agonistas de GITR incluem, por exemplo, proteínas de fusão de GITR e anticorpos anti-GITR (por exemplo, anticorpos anti-GITR bivalentes) tais como, por exemplo, uma proteína de fusão de GITR descrita na Patente U.S.
No. 6.111.090, na Patente Européia No.: 090505B1, na Patente U.S.
No. 8.586.023, na Publicação PCT de Patente Internacional Nos.
WO 2010/003118 e 2011/090754, ou um anticorpo anti-GITR descrto, por exemplo, na Patente U.S.
No. 7.025.962, na Patente Européia No. 1947183B1, na Patente U.S.
No. 7.812.135, na Patente U.S.
No. 8.388.967, na Patente U.S.
No. 8.591.886, na Patente Européia No.
EP 1866339, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2011/028683, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2013/039954, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO2005/007190, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2007/133822, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO2005/055808, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 1999/40196, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2001/03720, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 1999/20758, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO2006/083289, na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2005/115451, na Patente U.S.
No. 7,618,632, e na Publicação PCT de Patente Internacional No.
WO 2011/051726. Método de Expansão de linfócitos T CD39+ CD103+ CD8+
[00139] Linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ podem ser expandidos in vitro. Em algumas modalidades, linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ isolados de um indivíduo podem ser cultivados em meio de cultura de tecido compreendendo glutamina, soro, e antibióticos para formar culturas primárias. As células são geralmente semeadas em um vaso de cultura apropriado. Um vaso de cultura usado para cultura da(s) célula(s) pode incluir, mas não é particularmente limitado a: frasco, frasco para cultura de tecido, placa, placa de petri, placa para cultura de tecido, multi placa, micro placa, placa micro-cavidade, multi placa, placa multi-cavidade, micro slide, slide de câmara, tubo, bandeja, Câmaras CELLSTACK®, bolsa de cultura, e garrafa de rolo, contanto que seja capaz de cultivar os linfócitos T na mesma. As células podem ser cultivadas em um volume de no mínimo ou cerca de 0,2, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, ou qualquer faixa derivável do mesmo, dependendo das necessidades da cultura. Em algumas modalidades, o vaso de cultura pode ser uma placa de cultura de tecido, por exemplo, uma placa de 6 cavidades, de 24 cavidades, ou de 96 cavidades. Em outras modalidades, o vaso de cultura pode ser um biorreator, o qual pode se referir a qualquer dispositivo ou sistema ex vivo que suporta um ambiente biologicamente ativo tal que as células podem ser propagadas. O biorreator pode ter um volume de no mínimo ou cerca de 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 litros, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 metros cúbicos, ou qualquer faixa derivável do mesmo, pode ser cultivado com os nutrientes necessários para suportar o crescimento da população de células.
[00140] De modo geral, as células são cultivadas em meio de crescimento incluindo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e um tampão para manter o pH. O meio também pode conter ácidos graxos ou lipídeos, aminoácidos (tais como aminoácidos não- essenciais), vitamina(s), fatores de crescimento, citocinas, substâncias antioxidantes, ácido pirúvico, agentes de tamponamento, e sais inorgânicos. Um exemplo de meio de crescimento contém um meio mínimo essencial, tal como meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) ou meio ESSENTIAL 8™ (E8™), suplementado com vários nutrientes, tais como aminoácidos não-essenciais e vitaminas, para reforçar o crescimento de linfócitos T. Exemplos de meio mínimo essencial incluem, mas não estão limitados a, meio Minimal Essential Medium Eagle (MEM) Alpha, meio Dulbecco's modified Eagle (DMEM), meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, meio 199, e meio F12. Opcionalmente, antibióticos podem ser adicionados a um meio, tal como, mas não limitado a, penicilina, estreptomicina, ou tetraciclina. Glutamina também pode ser adicionada a um meio de cultura de tecido. Aditivos tais como antibióticos e aminoácidos são conhecidos na arte.
[00141] Além disso, o meio mínimo essencial pode ser suplementado com aditivos adicionais tais como soro humano, fetal de vitelo ou bovino. Soro pode ser incluído, por exemplo, em uma concentração de 10 a 15% (volume/volume), tal como a cerca de 5%, cerca de 6%, cerca de 7%, cerca de 8%, cerca de 9%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, ou cerca de 15% de soro. O soro pode ser soro de feto de vitelo. Em outras modalidades, o soro é soro humano, tal como soro AB humano.
[00142] De forma alternativa, o meio pode ser livre de soro. Em outros casos, o meio de crescimento pode conter uma reposição de soro. Exemplos de reposições de soro são conhecidos na arte. Por exemplo, a reposição de soro KNOCKOUT™ é descrita, por exemplo, no Requerimento de Patente U.S. No. 2002/0076747, o qual é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Alternativas para soro podem incluir materiais os quais contêm adequadamente albumina (tal como albumina rica em lipídeos, substitutos de albumina tais como albumina recombinante, amido vegetal, dextranos e hidrolisados de proteína), transferrina (ou outros transportadores de ferro), ácidos graxos, insulina, precursores de colágeno, elementos traço, 2-mercaptoetanol, 3'-tiolglicerol, ou equivalentes dos mesmos. As alternativas para soro podem ser preparadas pelo método descrito na Publicação de Patente Internacional No. WO 98/30679, por exemplo.
[00143] Uma cultura pode ser "xeno-Free (XF)" o que refere-se a um meio ou uma condição de cultura, a qual é essencialmente livre de componentes derivados de animais heterogêneos. Para cultura de células humanas, quaisquer proteínas de um animal não-humano, tal como um camundongo, seriam componentes xeno. Portanto, em algumas modalidades, as condições descritas são xeno-free. Portanto, para cultura de células humanas, uma cultura incluindo soro AB humano pode ser "xeno free."
[00144] Outras condições de cultura podem ser adequadamente definida. Por exemplo, a temperatura de cultura pode ser cerca de 30 a 40°C, por exemplo, no mínimo ou cerca de 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39°C, mas particularmente não limitada a estas. Em uma modalidade, as células são cultivadas a 37°C. A concentração de CO2 pode ser cerca de 1 a 10%, por exemplo, cerca de 2% a 5%, ou qualquer intervalo derivável no mesmo. Em um exemplo não limitante, é utilizada uma concentração de CO 2 de cerca de 5%.
[00145] As culturas primárias são estimuladas com uma quantidade eficaz de células alimentadoras irradiadas alogênicas e uma citocina, tal como interleucina (IL)-15 ou IL-2, para formar linfócitos T estimulados. As células alimentadoras podem ser, por exemplo, células mononucleares do sangue periférico alogênicas irradiadas.
Células alimentadoras, incluindo células alimentadoras humanas, podem ser irradiadas, tal como com 4000 rad de irradiação gama.
[00146] Em alguma modalidade, as células também são estimuladas com um estimulador de linfócitos T policlonal, tal como fitohemaglutinina. Em alguns exemplos não limitantes, é utilizada uma concentração de 1 μg/ml a 2 μg/ml. Em modalidades adicionais, são utilizadas tanto uma citocina, tal como IL-15 e/ou IL-2, quanto PHA.
[00147] Em algumas modalidades, é usada uma proporção tal que são estimulados cerca de 1.000 a cerca de 2.000 linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com cerca de 100.000 a cerca de 300.000 células alimentadoras alogênicas, tais como PBMC alogênicas irradiadas. Em outras modalidades, é usada uma proporção tal que são estimulados cerca de 1.000 a cerca de 2.000 linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com cerca de 200.000 células alimentadoras alogênicas.
[00148] Uma citocina, tal como IL-2 ou IL-15 pode ser incluída na cultura. Em algumas modalidades, IL-15 pode ser usada em uma concentração de cerca de 5 ng/ml a cerca de 15 ng/ml de IL-15. Em algumas modalidades, IL-15 é incluída na cultura em uma concentração de cerca de 7 ng/ml a cerca de 12 ng/ml, tal como em uma concentração de cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, ou cerca de 12 ng/ml. Em um exemplo não limitante, IL- 15 é incluída em uma concentração de cerca de 10 ng/ml.
[00149] As culturas de linfócitos T CD39+ CD103+ CD8+ estimulados são em seguida reabastecidsd com meio de cultura de tecido fresco e a citocina, tal como IL-15 e/ou IL-2, do começo ao fim da expansão in vitro. IL-15 pode ser incluída neste meio de cultura de tecido em uma concentração de cerca de 5 ng/ml a cerca de 50 ng/ml de IL-15, tal como cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml de IL-15. Em algumas modalidades, IL-15 é incluída na cultura em uma concentração de cerca de 7 ng/ml a cerca de 12 ng/ml, tal como em uma concentração de cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, ou cerca de 12 ng/ml. Em um exemplo não limitante, IL- 15 é incluída em uma concentração de cerca de 10 ng/ml. Em outros exemplos, IL-15 é incluída em uma concentração de cerca de 20, cerca de 30, cerca de 40, ou cerca de 50 ng/ml.
[00150] A cultura celular pode ser mantida por qualquer período. Em algumas modalidades, depois de 15 a 30 dias em cultura, os linfócitos T CD39+ CD103+ CD8+ expandidos são colhidos. Métodos de Isolamento e Utilização de um Ácido Nucleico Codificando Receptores de Linfócitos T
[00151] São proporcionados métodos para o isolamento de ácido nucleico codificando receptores de linfócitos T (TCRs) que se ligam especificamente a antígenos de células tumorais. Estes métodos incluem o isolamento de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, a partir de uma amostra de um indivíduo portador de um tumor expressando o antígeno de célula tumoral. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor sólido, tal como um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal. O indivíduo pode ser um indivíduo humano ou um indivíduo veterinário. A amostra pode ser qualquer amostra do indivíduo, incluindo, mas não limitada a, uma amostra de sangue periférico ou uma biópsia tumoral. Métodos para o isolamento de linfócitos T CD8+CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, são descritos acima.
[00152] Em algumas modalidades, os métodos incluem expansão dos linfócitos T CD8+ CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Métodos de expansão para os linfócitos T CD8+ CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, in vitro também são descritos acima. Em outras modalidades, são utilizados linfócitos T CD8+ CD39+ primários, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em que as células não são expandidas in vitro.
[00153] Os métodos ainda incluem clonagem de uma molécula de ácido nucleico codificando um TCR dos linfócitos T CD8+ CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Métodos para clonagem de TCRs são conhecidos na arte, vide, por exemplo, a Patente U.S. No.
8.697.854, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. TCR's são membros da superfamília das imunoglobulinas e geralmente consistem em e subunidades a- e β-. Estas possuem um domínio variável (V) de imunoglobulina (Ig) de N- terminal, um domínio constante (C) de Ig, uma região transmembrana/abrangendo a membrana celular, e uma cauda citoplasmática curta na extremidade de C-terminal. Os domínios variáveis tanto da cadeia a quanto da cadeia β do TCR têm três regiões hiperváveis ou determinantes de complementaridade (CDRs), considerando que a região variável da cadeia β tem uma área adicional de hipervariabilidade (HV4) que normalmente não entra em contato com antígeno e portanto não é considerada uma CDR.
[00154] CDR3 é a CDR primária que reconhece antigenó processado, embora também tenha sido mostrado que CDR1 da cadeia alfa interage com a parte N-terminal de um peptídeo antigênico. CDR1 da cadeia β também interage com a parte C-terminal do peptídeo. Imagina-se que CDR2 reconhece o MHC. Nâo se imagina que a CDR4 da cadeia β participe no reconhecimento de antígeno, mas foi demonstrado que interage com superantígenos. O domínio constante do domínio de TCR consiste em sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma ligações de dissulfeto, as quais formam uma ligação entre as duas cadeias. A afinidade dos TCR's para um antígeno específico os torna de utilidade terapeuticamente. Por exemplo, os tumores podem ser tratados de maneira eficaz por uso de imunoterapia adotiva com linfócitos T expressando um TCR específico. Métodos para clonagem de TCRs, e para uso de imunoterapia adotiva usando células transfectadas com TCRs, são descritos na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2006/031221, na Patente U.S. No. 5,906,936; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO97/32603; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2007/065957, e na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2008/039818. Métodos de produzir moléculas de ácido nucleico codificando TCR e linfócitos T (ou linfócitos NK) incluindo os receptores referidos são descritos, por exemplo, em Brentjens ,et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan ,et al., 2010, Molecular Therapy, publicado online em 23 de fevereiro de 2010, às páginas 1-9; Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 - 2271; Faik et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp et al., N Engl J Med., 368: 1509-1518, 2013; Han ,et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; PCT Pub. WO2012/079000, WO2013/126726; e U.S. Pub. 2012/0213783, cada um dos quais é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade).
[00155] Em algumas modalidades, sequências de RNA de célula única são usadas para os receptores de linfócitos T ou pair-seq (Adaptive). Em um exemplo não limitante, linfócitos T purificados são isolados para células únicas usando um instrumento fluidigm ou 10x genomics. Em seguida DNA de linfócitos T é amplificado e sequenciado. Os linfócitos T não precisam ser primed ou ter antígeno apresentado para este processo.
[00156] São conhecidos exemplos adicionais de técnicas de clonagem e sequenciamento apropriadas, e instruções suficientes para orientar pessoas com perícia através de muitos exercícios de clonagem (vide, por exemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 4th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012) e Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, através do suplemento 104, 2013). Informação dos produtos dos fabricantes de reagentes biológicos e de equipamento experimental também proporcionam informação útil. Os fabricantes referidos incluem a SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça), Invitrogen (Carlsbad, CA), e Applied Biosystems (Foster City, CA), bem como muitas outras fontes comerciais conhecidas por um especialista.
[00157] Sequências de ácidos nucléicos codificando o TCR podem ser preparadas por qualquer método adequado. Assim que a sequência inteira é clonada e mostrada, também pode ser preparada por síntese química direta por métodos tais como o método do fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; o método do fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; o método da dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22:1859-1862, 1981; o método do triéster de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859- 1862, 1981, por exemplo, usando um sintetizador automatizado conforme descrito, por exemplo, em Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; e, o método de suporte sólido da Patente U.S. No. 4.458.066. Síntese química produz um oligonucleotídeo de cadeia única. Isto pode ser convertido em DNA de cadeia dupla por hibridização com uma sequência complementar ou por polimerização com uma polimerase de DNA usando a cadeia única como um modelo.
[00158] Ácidos nucleicos também podem ser preparados por métodos de amplificação. Métodos de amplificação incluem reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), o sistema de amplificação à base de transcrição (TAS), o sistema de replicação de sequência auto-sustentado (3SR). Uma ampla variedade de métodos de clonagem, células hospedeiras, e metodologias de amplificação in vitro são de conhecimento geral dos peritos na arte. Podem ser feitas modificações para um ácido nucleico codificando um polipeptídeo descrito aqui, neste requerimento de patente, sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, a expressão, ou a incorporação da molécula de direcionamento para uma proteína de fusão. As modificações referidas são de conhecimento geral dos peritos na arte e incluem, por exemplo, codons de terminação, uma metionina adicionada ao término amino para proporcionar um sítio de iniciação, aminoácidos adicionais colocados sobre um ou outro término para criar sítios de restrição localizados convenientemente, ou aminoácidos adicionais (tais como poli His) para auxiliar em etapas de purificação.
[00159] A molécula de ácido nucleico codificando o TCR pode ser encadeada operacionalmente a um promotor heterólogo. A molécula de ácido nucleico codificando o TCR pode ser incluída em um vetor (tal como um vetor lentiviral ou um vetor retroviral gama) para expressão em uma célula hospedeira. Exemplos de células são células de mamífero, e incluem um linfócito T, tal como um linfócito T citotóxico (CTL) e uma célula NK. Em exemplos não limitantes específicos, a célula é um linfócito T, tal como um linfócito T CD3+ T cell. O um linfócito T CD3+ pode ser um linfócito T CD4+ ou um linfócito T CD8+.
[00160] As moléculas de ácido nucleico também podem ser expressas em uma célula produzida de modo recombinante tal como bactérias, células de plantas, levedura, inseto e de mamífero. O TCR pode ser expresso como uma proteína de fusão. Métodos de expressão e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos e ainda descritos aqui, neste requerimento de patente, (vide, por exemplo, A1-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011). Os peritos na arte estão bem informados sobre os numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de proteínas incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, leveduras, e várias células eucarióticas superiores tais como as linhagens celulares COS, CHO, HeLa e de mieloma. O termo "célula hospedeira" também inclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. É entendido que toda a progênie não pode ser idêntica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante a replicação. Métodos de transferência estável, significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na arte. Conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, modalidades específicas da presente invenção incluem linfócitos T, tais como linfócitos T humanos e células NK humanas, as quais expressam o TCR. Estes linfócitos T podem ser linfócitos T CD3+, tais como linfócitos T CD4+ ou CD8+ .
[00161] A expressão de ácidos nucleicos codificando o TCR para um promotor (o qual é ou constitutivo ou indutível), seguida por incorporação em um cassete de expressão. O promotor pode ser qualquer promotor de interesse, incluindo um promotor de citomegalovírus e um promotor de vírus linfotrófico de linfócitos T humanos (HTLV)-l. Opcionalmente, um reforçador, tal como um reforçador de citomegalovírus, é incluído no constructo. Os cassetes podem ser adequados para replicação e integração quer em procariotas ou eucariotas. Cassetes de expressão típicos contêm sequências específicas úteis para regulação da expressão do DNA codificando a proteína. Por exemplo, os cassetes de expressão podem incluir promotores apropriados, reforçadores, terminadores de transcrição e de translação, sequências de iniciação, um codon de iniciação (isto é, ATG) em frente a um gene codificando proteína, sinal de emenda para íntrons, sequências para a manutenção do frame de leitura correto daquele gene para permitir a adequada translação de mRNA, e codons de parada. O vetor pode codificar um marcador selecionável, tal como um marcador codificando resistência a fármaco (por exemplo, resistência a ampicilina ou tetraciclina).
[00162] De modo a obter alto nível de expressão de um gene clonado, é desejável construir cassetes de expressão os quais contenham, no mínimo, um forte promotor para direcionar a transcrição, um sítio de ligação ao ribossoma para iniciação translacional (sequências de ligação ribossômica interna), e um terminador de transcrição/translação. Para células eucarióticas, as sequências de controle podem incluir um promotor e/ou um reforçador derivado de, por exemplo, um gene de imunoglobulina, HTLV, SV40 ou citomegalovírus, e uma sequência de poliadenilação, e podem ainda incluir sequências doadoras e/ou aceitadoras de emenda (por exemplo, sequências doadoras e aceitadoras de emenda de CMV e/ou HTLV).
[00163] Quando o hospedeiro é um eucariota, podem ser usados os referidos métodos de transfecção de DNA como coprecipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais, tais como microinjeção, eletroporação, inserção de um plasmídeo encerrado em lipossomas, ou vetores de vírus. Células transformadas pelos cassetes podem ser selecionadas por resistência a antibióticos conferidos por genes contidos nos cassetes, tais como os genes amp, gpt, neo e hyg.
[00164] Células eucarióticas também podem ser cotransformadas com sequências de nucleotídeos codificando o TCR, e uma segunda molécula de DNA estranho codificando um fenótipo selecionável, tal como o gene da timidina quinase do herpes simples. Outro método é usar um vetor viral eucariótico, tal como o vírus símio 40 (SV40), um lentivírus ou o vírus do papiloma bovino, para infectar de modo transitório ou transformar células eucarióticas e expressar a proteína (vide, por exemplo, Viral Expression Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011). Um perito na arte pode prontamente usar alguns sistemas de expressão tais como plasmídeos e vetores de utilidade na produção de proteínas em células incluindo células eucarióticas superiores tais como as linhagens de células COS, CHO, HeLa e de mieloma.
[00165] Em algumas modalidades, um vetor viral é utilizado para expressão do TCR. Os vetores virais incluem, mas não estão limitados a vírus símio 40, adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), vetores lentivirais, e retrovírus, tais como retrovírus gama. Os vetores retrovirais proporcionam um método altamente eficiente para transferência genética em células eucarióticas. Além disso, ocorre integração retroviral em um modo controlado e resulta na integração estável de uma ou de umas poucas cópias da nova informação genética por célula. Sem ser limitado pela teoria, os vetores lentivirais têm a vantagem em relação a vetores derivados de onco-retrovírus tais como os vírus da leucemia murina em que podem transduzir células não-proliferativas, tais como hepatócitos. Também têm a vantagem adicional de baixa imunogenicidade. O uso de vetores lentivirais para expressar um TCR é conhecido na arte, e e descrito, por exemplo, no Requerimento de Patente U.S. No. 2014/0050708, o qual é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Pode ser usado um transposon.
[00166] Em algumas modalidades, células hospedeiras são produzidas para introdução no indivíduo de interesse. A célula hospedeira pode ser um linfócito do sangue periférico (PBL) ou uma célula mononuclear do sangue periférico (PBMC), um linfócito T purificado, ou uma célula NK purificada. O linfócito T pode ser qualquer linfócito T, tal como um linfócito T cultivado, por exemplo, um linfócito T primário, ou um linfócito T de uma linhagem de linfócitos T cultivados, por exemplo, Jurkat, SupTl, etc., ou um linfócito T obtido de um mamífero (tal como um paciente humano ao qual o linfócito T-TCR vai ser posteriormente administrado). Caso obtido de um indivíduo mamífero, tal como um indivíduo humano, o linfócito T pode ser obtido a partir de numerosas fontes, incluindo, porém sem limitação, o sangue, a medula óssea, os linfonodos, o timo, ou outros tecidos ou fluidos. Os linfócitos T também podem ser enriquecidos ou purificados. O linfócito T pode ser qualquer tipo de linfócito T e pode ser de qualquer estágio de desenvolvimento, incluindo, porém sem limitação, células CD3+, linfócitos T duplo positivos CD4+/CD8+, linfócitos T helper CD4+, por exemplo, linfócitos Th1 e Th2, linfócitos T CD8+ (por exemplo, linfócitos T citotóxicos), células que se infiltram no tumora, linfócitos T de memória, linfócitos T naive, e similares. O linfócito T pode ser um linfócito T CD3+, tal como um linfócito T CD8+ ou um linfócito T CD4+ . Em modalidades alternativas, a célula pode ser uma célula NK, tal como uma célula NK obtida do mesmo indivíduo ao qual a célula TCR- NK vai ser administrada posteriormente. Em algumas modalidades, as células são humanas. Em outras modalidades, as células são de um indivíduo veterinário.
[00167] Também é proporcionada uma população de células compreendendo no mínimo uma célula hospedeira descrita aqui, neste requerimento de patente. A população de células pode ser uma população heterogênea compreendendo a célula hospedeira compreendendo qualquer um dos vetores de expressão recombinante codificando o TCR, além de no mínimo uma outra célula, por exemplo, uma célula hospedeira (por exemplo, um linfócito T), a qual não compreende qualquer vetor de expressão recombinante, ou uma célula diferente de um linfócito T, por exemplo, um linfócito B, um macrófago, um neutrófilo, um eritrócito, etc. De forma alternativa, a população de células pode ser uma população substancialmente homogênea, na qual a população compreende essencialmente células hospedeiras (por exemplo, consistindo essencialmente em) compreendendo o vetor de expressão recombinante codificando o TCR. A população também pode ser uma população de células clonais, na qual todas as células da população são clones de uma única célula hospedeira compreendendo um vetor de expressão recombinante, tal que todas as células da população compreendem o vetor de expressão recombinante. Em uma modalidade da invenção, a população de células é uma população clonal compreendendo células hospedeiras compreendendo um vetor de expressão recombinante conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Os linfócitos T podem ser linfócitos T CD3+, tais como linfócitos T CD8+ ou alguns linfócitos T CD4+ . As células também podem ser células NK.
[00168] As células podem ser autólogas para um receptor. O receptor pode ter um tumor, ou estar em risco de ter um tumor. O receptor pode ter sido submetido a um tratamento anterior para um tumor. O tumor pode ser um tumor sólido, tal como tumor sólido é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal. Em algumas modalidades, células NK ou linfócitos T autólogos são isolados de um indivíduo, tal como um indivíduo humano, e o TCR isolado é introduzido dentro destas células. Estas células transformadas são em seguida re-
introduzidas no indivíduo. Neste cenário, o doador e o receptor são o mesmo indivíduo. O indivíduo pode ser um ser humano. Em algumas modalidades, é administrada um indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T e/ou células NK expressando o TCR clonado. Em modalidades particulares (vide o Requerimento de Patente Publicado U.S. No. US20140271635 A1, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência), antes de expansão e modificação genética, uma fonte de linfócitos T é obtida de um indivíduo.
[00169] Em algumas modalidades, as células T e/ou células NK são autólogas. Em outras modalidades, as células T e/ou células NK são alogênicas. As células T e/ou células NK são em seguida introduzidas no indivíduo, conforme descrito acima. Em uma modalidade, as células expressam de modo transitório o vetor por 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dias depois de transdução. Em um exemplo não limitante, o vetor é transduzido no linfócito T por eletroporação.
[00170] O termo "sujeito" se destina a incluir organismos vivos nos quais pode ser provocada uma resposta imune (por exemplo, mamíferos). Exemplos de subjeitos incluem seres humanos, cães, gatos, camundongos, ratos, porcos (e outros subjeitos veterinários) e primatas não-humanos. Os linfócitos T podem ser obtidos a partir de uma série de fontes, incluindo células mononucleares do sangue periférico, medula óssea, tecido dos linfonodos, sangue do cordão umbilical, tecido do timo, tecido de um sítio de infecção, ascite, efusão pleural, tecido do baço, e tumores. Em outras modalidades, pode ser usado qualquer número de linhagens de linfócitos T disponíveis na arte. Em algumas modalidades, os subjeitos podem ser submetidos a leucaferese, em que os leuócitos são coletados, enriquecidos, ou depletados ex vivo para selecionar e/ou isolar as células de interesse, por exemplo, linfócitos T e ou células NK. Estes isolados celulares podem ser expandidos por métodos conhecidos na arte e tratados de tal modo que seja introduzido um constructo de TCR, deste modo criando uma célula autóloga que expressa o TCR clonado. Em um aspecto, células expressando TCR são geradas usando vetor viral, tal como, mas não limitado a, vetores virais lentivirais. Em alguns exemplos não limitantes, linfócitos T e/ou células NK podem ser obtidos a partir de uma únidade de sangue coletado de um indivíduo usando qualquer número de técnicas de conhecimento do perito na arte, tal como separação por FICOLL™, ou as células podem ser obtidas por aferese. O produto da aferese tipicamente contém linfócitos, incluindo linfócitos T, monócitos, granulócitos, linfócitos B, células NK, ottros nucleados leucócitos, eritrócitos, e plaquetas.
[00171] As células coletadas por aferese podem ser lavadas para remover a fração de plasma e para colocar as células em um apropriado ou meio tampão para as etapas de processamento subsequentes. Em alguns exemplos não limitantes, as células são lavadas com salina tamponada com fosfato (PBS). Em alguns exemplos alternativos, a solução de lavagem carece de cálcio e pode carecer de magnésio ou pode carecer de muitos, se não de todos os cátions divalentes. As etapas de ativação iniciais na ausência de cálcio podem levar a ativação ampliada. A etapa de lavagem pode ser realizada por métodos conhecidos na arte, tal como por uso de uma centrífuga de passagem ("flow-through") semi-automatizada (por exemplo, o processador celular Cobe 2991, o Baxter CYTOMATE®, ou o HAEMONETICS CELL SAVER 5®) de acordo com as instruções do fabricante. Depois de lavagem, as células podem ser ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis, tais como uma solução salina com ou sem tampão. De forma alternativa, os componentes indesejáveis da amostra de aferese podem ser removidos e as células ressuspensas diretamente em meio de cultura.
[00172] Em algumas modalidades, os linfócitos T são isolados dos linfócitos do sangue periférico por seleção negativa. Uma subpopulação específica de linfócitos T, tais como linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+, CD28+ CD45RA+, e CD45RO+, linfócitos T naive e/ou de memória, pode ser ainda isolada por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, os linfócitos T podem ser isolados por incubação contas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28, tais como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, ou CD3/IL-2, por um período de tempo suficiente para seleção positiva dos linfócitos T desejados, vide, por exemplo, o Requerimento de Patente Publicado U.S. No. US20140271635 A1. Em um exemplo não limitante o período de tempo é de cerca de 24 a cerca de 72 horas e todos os valores inteiros intermediários. Em exemplos não limitantes adicionais, o período de tempo é de no mínimo 24 horas, 36, 48 horas ou mais. Tempos de incubação mais longos podem ser usados para isolar linfócitos T em qualquer situação onde haja poucos linfócitos T em comparação com outros tipos de células, tal como em isolamento a partir de indivíduos com compromentimento imune. Também podem ser usadas múltiplas rodadas de seleção.
[00173] O enriquecimento de uma população de linfócitos T por seleção negativa pode ser realizado com uma combinação de anticorpos direcionados para marcadores da superfície únicos para as células negativamente selecionadas. Um método é classificação celular e/ou seleção através de imunoaderência magnética negativa ou citometria de fluxo que usa um cocquetel de anticorpos monoclonais direcionados para marcadores da superfície celular presentes sobre as células negativamente selecionadas. Por exemplo, de modo a enriquecer para células CD4+ por seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais tipicamente inclui anticorpos para CD8a, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD36, CD56, CD132, TCR γ/δ, e CD235a
(Glycophorin A). De modo a enriquecer para células CD8+ por seleção negativa, o coquetel de anticorpos monoclonais contém anticorpos para CD4, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123, TCR γ/δ, e CD235a. Pode ser selecionada uma população de linfócitos T que expresse uma ou mais citocinas. Métodos para triagem para expressão celular são descritos na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2013/126712.
[00174] Para isolamento de uma população desejada de células por seleção positiva ou negativa, a concentração de células e superfície (por exemplo, partícultas tais como contas) pode ser variada para assegurar máximo contato das células e contas. Em algumas modalidades, é usada uma concentração de 1 milhão de células/ml. Em modalidades adicionais, é usado mais de 100 milhões de células/ml. Em outras modalidades, é usada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 milhões de células/ml. Sem ser limitado pela teoria, o uso de altas concentrações pode resultar em aumento da produção celular, ativação celular, e expansão celular. Também podem ser usadas menores concentrações de células. Sem ser limitado pela teoria, diluindo significativamente a mistura de linfócitos T e superfície (por exemplo, partículas tais como contas), são minimizadas interações entre as partículas e células. Isto seleciona para células que expressam altas quantidades de antígenos desejados a serem ligados às partículas. Em algumas modalidades, a concentração de células usada é de 5x106/ml. Em outras modalidades, a concentração usada pode ser de cerca de 1×105/ml a 1×106/ml, e qualquer valor inteiro no meio.
[00175] As células podem ser incubadas em um rotator por durações de tempo variáveis em velocidades variáveis ou a 2 a 10°C. ou em temperatura ambiente. Os linfócitos T para estimulação também podem ser congelados depois de uma etapa de lavagem. Sem ser limitado pela teoria, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente proporciona um produto mais uniforme removendo granulócitos e em alguma extensão monócitos na população celular. Depois da etapa de lavagem que remove plasma e plaquetas, as células podem ser suspensas em uma solução de congelamento. Apesar de muitas soluções de congelamento e parâmetros de congelamento serem conhecidos na arte e virem a ser úteis neste contexto, um método envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de Albumina Sérica Humana, ou meio de cultura contendo 10% de Dextrano 40 e 5% de Dextrose, 20% de Albumina Sérica Humana e 7,5% de DMSO, ou 31,25% de Plasmalyte-A, 31,25% de Dextrose 5%, 0,45% de NaCl, 10% de Dextrano 40 e 5% de Dextrose, 20% de Albumina Sérica Humana, e 7,5% de DMSO ou outro meio de congelamento celular adequado contendo por exemplo, Hespan e PlasmaLyte A, em seguida as células são congeladas a -80° C. em uma taxa de 1° por minuto e armazenados na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. Outros métodos de congelamento controlado podem ser usados, bem como congelamento não controlado imediatamente a -20° C ou em nitrogênio líquido, vide a Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. US-2014-0271635 A1.
[00176] Amostras de sangue ou produto da aferese pdoem ser coletados de um indivíduo em um período de tempo antes de quando podem ser necessárias as células expandidas, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. Deste modo, a fonte das células a serem expandidas pode ser coletada a qualquer momento necessário, e células desejadas, tais como linfócitos T, isoladas e congeladas para uso posterior em terapia de linfócitos T para qualquer série de doenças ou condições que viriam a se beneficiar da terapia de linfócitos T, tais como as descritas aqui, neste requerimento de patente. Em um aspecto, uma amostra de sangue ou uma aferese é tomada de um indivíduo saudável de modo geral. Em determinados aspectos, uma amostra de sangue ou uma aferese é tomada de um indivíduo saudável de modo geral, o qual esteja em risco de desenvolver uma doença, tal como um tumor, mas o qual ainda não tenha desenvolvido uma doença, e as células de interesse são isoladas e congeladas para uso posterior. Em determinados aspectos, os linfócitos T podem ser expandidos, congelados, e usados em um momento posterior. Em determinados aspectos, as amostras são coletadas de um paciente logo depois do diagnóstico de uma doença em particular, tal como um tumor, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, mas antes de qualquer tratamento. Em um aspecto adicional, as células são isoladas de uma amostra de sangue ou de uma aferese de um indivíduo antes de qualquer número de modalidades de tratamento relevantes. Em determinados aspectos, células criopreservadas são degeladas e lavadas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e deixadas em repouso por uma hora em temperatura ambiente antes do uso. Amostras de sangue ou produto da aferese podem ser coletados de um indivíduo quando necessário, e não congelados. Em algumas modalidades, linfócitos T portadores de tumor autólogo são isolados dos indivíduos para subsequentes transfecção e infusão.
[00177] Os linfócitos T podem ser ativados e expandidos geralmente usando métodos conforme descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 6.352.694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358;
6.887.466; 6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7.172.869; 7.232.566;
7.175.843; 5.883.223; 6.905.874; 6.797.514; 6.867.041; e na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 20060121005. Os linfócitos T podem ser expandidos por contato com uma superfície tendo anexado à mesma um agente que estimula um sinal associado ao complexo CD3/TCR e um Iigante que estimula uma molécula co- estimulatória sobre a superfície dos linfócitos T. Os linfócitos T também podem ser expandidos usando PHA ou PBMCs em volume podem ser transfectadas com CD3/28 ou CD3/IL2. Em alguns exemplos não limitantes, populações de linfócitos T podem ser estimuladas conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, tal como por contato com um anticorpo anti-CD3, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado sobre uma superfície, ou por contato com um ativador da proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Para co-estimulação de uma molécula acessória sobre a superfície dos linfócitos T, é usado um Iigante que se liga à molécula acessória. Por exemplo, uma população de linfócitos T pode ser posta em contato com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28, sob condições apropriadas para estimular a proliferação dos linfócitos T. De modo a estimular a proliferação de ou linfócitos T CD4+ ou linfócitos T CD8+, um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28. Exemplos de um anticorpo anti-CD28 incluem 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, França) podem ser usados assim como outros métodos conhecidos comumente na arte (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al. . Immunol. Meth. 227(1. -2):53-63, 1999). Outros métodos incluem o uso de PBMCs alogênicas, irradiadas, junto com fitohemaglutinina para estimular a proliferação de linfócitos T.
[00178] Assim que um TCR é isolado, podem ser usados vários testes para avaliar a atividade da molécula, tais como, mas não limitados a, a capacidade de expandir linfócitos T depois de estimulação de antígeno, sustentar a expansão de linfócitos T na ausência de reestimulação, e atividades anti-cancerígenas em modelos in vitro e animais apropriados, em algumas modalidades, a regulação positiva de marcadores de ativação, tais como, mas não limitado a, 1-lBB é avaliada, tal como por citometria de fluxo.
[00179] O método inclui a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células da composição farmacêutica, tais como linfócitos T e/ou células NK, que expressam o TCR clonado. Sujeitos que necessitem do mesmo, tais como um indivíduo portador de um tumor, podem ser submetidos subsequentemente a tratamento de rotina com quimioterapia ou cirurgia (para o câncer) ou agentes anti-virais (para uma infecção pelo HIV). A administração das células hospedeiras expressando o TCR heterólogo pode resultar em tratamento do tumor, tal como diminuição do volume tumoral, diminuição de metástase, ou diminuição de um sinal ou sintoma do tumor.
[00180] As composições farmacêuticas podem incluir uma célula hospedeira expressando TCR, por exemplo, uma pluralidade de células hospedeiras expressando TCR, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, em combinação com um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis. As células hospedeiras expressando TCR podem ser linfócitos T, tais como linfócitos T CD3+, tais como linfócitos T CD4+ e/ou CD8+, e/ou células NK. As composições referidas podem incluir tampões tais como salina tamponada neutra, salina tamponada com fosfato e similares; carboidratos tais como glicose, manose, sacarose ou dextranos, manitol; proteínas; polipeptídeos ou aminoácidos tais ocmo glicina; antioxidantes; agentes quelantes tais como EDTA ou glutationa; adjuvantes (por exemplo, hidróxido de alumínio); e preservantes.
[00181] Com respeito às células, pode ser usada uma variedade de veículos aquosos, por exemplo, salina tamponada e similares, para introduzir as células. Estas soluções são estéreis e geralmente livres de matéria indesejável. Estas composições podem ser esterilizadas por técnicas de esterilização convencionais e de conhecimento geral. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme requerido para condições fisiológicas aproximadas tais como agentes de ajuste de pH e de tamponamento, agentes de ajuste da toxicidade e similares, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio e similares. A concentração nestas formulações pode variar amplamente, e vai ser selecionada essencialmente com base nos volumes dos fluidos, nas viscosidades, no peso corporal e similares, de acordo com o modo de administração em particular selecionado e as necessidades do indivíduo.
[00182] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é substancialmente livre de, por exemplo não há níveis detectáveis de um contaminante, tal como endotoxina, micoplasma, lentivírus competente para replicação (RCL), p24, ácido nucleico VSV-G, gag do HIV, contas revestidas anti-CD8/anti-CD39/anti-CD103 residuais, anticorpos de camundongo, soro humano reunido, albumina sérica bovina, soro bovino, componentes do meio de cultura, célula de embalagem de vetor ou componentes de plasmídeos, uma bactéria e um fungo.
[00183] A quantidade precisa da composição a ser administrada pode ser determinada por um médico levando em conta diferenças individuais em idade, peso, tamanho do tumor, extensão de metástase, e condição do paciente (sujeito). Geralmente pode ser declarado que uma composição farmacêutica compreendendo os linfócitos T (e/ou células NK) descritos aqui, neste requerimento de patente, pode ser administrada em uma dosagem de 104 a 109 células/kg de peso corporal, tal como 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluindo todos os valores inteiros dentro destas faixas. Exemplos de doses são 106 células/kg a cerca de 1 X 108 células/kg, tal como a partir de cerca de 5 X 106 células/kg a cerca de 7,5 X 107 células/kg, tal como a cerca de 2,5 X 107 células/kg, ou a cerca de 5,0 X 107 células/kg.
[00184] Uma composição pode ser administrada uma vez ou múltiplas vezes, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 vezes nestas dosagens. A composição pode ser administrada por uso de técnicas de infusão que são conhecidas comumente em imunoterapia (vide, por exemplo, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). As composições podem ser administradas diariamente, semanalmente, bimensalmente ou mensalmente. Em alguns exemplos não limitantes, a composição é formulada para administração intravenosa e é administrada múltiplas vezes. A quantidade e a frequência de administração vai ser determinada por fatores tais como a condição do indivíduo, e o tipo e a gravidade da doença do indivíduo, embora dosagens apropriadas possam ser determinadas por estudos clínicos.
[00185] Em uma modalidade, o TCR é introduzido dentro das células, tais como linfócitos T ou células NK, e o indivíduo recebe uma administração inicial de células, e uma ou mais administrações subsequentes das células, em que a uma ou mais administrações subsequentes são administradas menos de 15 dias, por exemplo, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 dias depois da administração anterior. Em uma modalidade, mais de uma administração das células é proporcionada ao indivíduo (por exemplo, um ser humano) por semana, por exemplo, são administradas 2, 3, ou 4 administrações das células expressando TCR por semana. Em uma modalidade, o indivíduo recebe mais de uma administração dos linfócitos T por semana (por exemplo, 2, 3 ou 4 administrações por semana) (também referido como um ciclo), seguido por uma semana sem nenhuma administração, e em seguida uma ou mais administrações adicionais das células expressando TCR (por exemplo, mais de uma administração das células por semana) são administradas ao indivíduo. Em outra modalidade, o indivíduo (por exemplo, o indivíduo humano) recebe mais de um ciclo de células expressando TCR, e o tempo entre cada ciclo é menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, ou 3 dias. Em uma modalidade, as células expressando TCR são administradas a cada dois dias para 3 administrações por semana. Em outra modalidade, as células expressando TCR são administradas por no mínimo duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais semanas. A dosagem dos tratamentos acima a ser administrada a um paciente vai variar com a precisa natureza da condição que estiver sendo tratada e o receptor do tratamento. O escalonamento das dosagens para administração humana pode ser realizado de acordo com práticas aceitas na arte.
[00186] Em algumas modalidades, linfócitos T modificados com TCR são capazes de replicar in vivo resultando em persistência de longo termo que pode levar a controle tumoral sustentada. Em vários aspectos, os linfócitos T administrados ao indivíduo, ou a progênie destas células, persistem no indivíduo por no mínimo quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove meses, dez meses, onze meses, doze meses, treze meses, quatorze meses, quinze meses, dezeseis meses, dezessete meses, dezoito meses, dezenove meses, vinte meses, vinte e um meses, vinte e dois meses, vinte e três meses, ou por anos depois da administração dos linfócitos T ao indivíduo. Em outras modalidades, as células e sua progênie estão presentes por menos de seis meses, cinco meses, quatro meses, três meses, dois meses, ou um mês, por exemplo, três semanas, duas semanas, uma semana, depois da administração dos linfócitos T ao indivíduo.
[00187] A administração das composições ao indivíduo pode ser realizada em qualquer maneira conveniente, incluindo por injeção,
transfusão, implantação ou transplantação. As composições descritas podem ser administradas a um paciente por via trans arterial, por via subcutânea, por via intradérmica, por via intratumoral, por via intranodal, por via intramedular, por via intramuscular, por injeção intravenosa (i.v.), ou por via intraperitoneal. Em algumas modalidades, as composições são administradas a um paciente por injeção intradérmica ou subcutânea. Em outras modalidades, as composições da presente invenção são administradas por injeção i.v.. As composições também podem ser injetadas diretamente dentro de um tumor ou de um linfonodo.
[00188] Em uma modalidade, composições contendo populações de células isoladas também podem conter um ou mais agentes farmacêuticos adicionais, tais como um ou mais agentes anti- microbianos (por exemplo, antibióticos, agentes anti-virais e agentes anti-fúngicos), agentes anti-tumorais (por exemplo, fluorouracila, metotrexato, paclitaxel, fludarabina, etoposídeo, doxorrubicina, ou vincristina), agentes de depleção (por exemplo, fludarabina, etoposiíeo, doxorrubicina, ou vincristina), ou agentes antiinflamatórios não- esteroidais, tais como ácido acetilsalicílico, ibuprofeno ou sódio naproxeno), citocinas (por exemplo, interleucina-2), ou uma vacina. Muitos agentes quimioterápicos são presentemente conhecidos na arte. Em uma modalidade, o agente quimioterápico é selecionado entre o grupo que consiste em inibidores mitóticos, agentes alquilantes, anti-metabólitos, antibióticos intercalantes, inibidores do fator de crescimento, inibidores do ciclo celular, enzimas, inibidores da topoisomerase, agentes anti-sobrevida, modificadores da resposta biológica, anti-hormônios, por exemplo, anti-androgênios, e agentes anti-angiogênese.
[00189] Para o tratamento de malignidade, o método também pode incluir a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um terapêutico adicional contra o câncer (incluindo agentes quimioterápicos e radiação) ou cirurgia.
[00190] As células expressando o TCR podem ser administradas em conjunto com cirurgia, radiação, quimioterapia, ou imunoterapia. Agentes quimioterápicos adequados são descritos acima. Células expressando o TCR também podem ser administadas com um Antagonista de PD-1, de CTLA-4, de TIM-3, de LAG3, de BTLA e/ou um Agonista de 4-IBB, conforme descrito em detalhes abaixo. Métodos de Detecção e Tratamento
[00191] É descrito aqui, neste requerimento de patente, que a administração de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, são de utilidade em diagnóstico e tratamento. Nestas modalidades, linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, são medidos em uma amostra biológica de um indivíduo. Em algumas modalidades, a amostra é uma amostra de sangue periférico ou uma biópsia tumoral. O indivíduo pode ser qualquer indivíduo, tal como um indivíduo humano ou um indivíduo veterinário. Em modalidades adicionais, o indivíduo tem um tumor, é suspeito de ter um tumor, ou está em risco de ter um tumor. O tumor pode ser um tumor sólido. Em alguns exemplos não limitantes, o tumor sólido é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal.
[00192] Em algumas modalidades, são descritos métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um terapêutico contra o câncer, os quais incluem, mas não estão limitados a, modificadores da resposta biológica (tais como citocinas e quimiocinas), vacinas contra o câncer, agentes quimioterápicos, agentes imunoterápicos, e radiação. Em algumas modalidades, o terapêutico contra o câncer pode ser um inibidor de ponto de controle, um agonista de 4-IBB e/ou radiação. O terapêutico contra o câncer pode ser um produto químico. Os métodos também podem ser usados para detectar se um indivíduo vai responder à cirurgia.
[00193] Estes métodos incluem a detecção da presença de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD39+ CD103+ CD8, em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a presença dos linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD39+ CD103+ CD8, na amostra biológica indica que o terapêutico contra o câncer, tal como, mas não limitado a, um inibidor de ponto de controle, um agonista de 4-IBB, e/ou radiação, vai ser eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. O método também pode indicar que o indivíduo vai respondert a um procedimento cirúrgico, tal como ressecção. O método também pode incluir administração do terapêutico contra o câncer ao indivíduo, ou realização do procedimento cirúrgico. Em alguns exemplos não limitantes, o terapêutico contra o câncer é um inibidor de ponto de controle, o qual pode ser, sem limitação, um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3 ou um antagonista de LAG3. Antagonistas adequados são descritos em detalhes abaixo. Agonistas de 4-IBB adequados também são descritos abaixo.
[00194] Em outras modalidades, são descritos métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um regime terapêutico, tal como incluindo um terapêutico contra o câncer. O terapêutico contra o câncer pode ser um agente quimioterápico ou radiação. O terapêutico contra o câncer pode ser um inibidor de ponto de controle, tal como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD- L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3 ou um antagonista de LAG3, ou pode ser um agonista de 4-IBB. Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração a um indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra biológica de um indivíduo. Um aumento na quantidade de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo.
[00195] Em modalidades adicionais, são descritos métodos para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um terapêutico contra o câncer. O terapêutico contra o câncer pode ser um agente quimioterápico ou radiação. O terapêutico contra o câncer pode ser um inibidor de ponto de controle, tal como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3 ou um antagonista de LAG3, ou pode ser um agonista de 4-IBB. Estes métodos incluem a administração a um indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra biológica de um indivíduo, em que um aumento na quantidade de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. Em modalidades adicionais, os métodos ainda incluem a administração de uma segunda dose do terapêutico contra o câncer ao indivíduo, em que a primeira dose é a mesma que a segunda dose, ou em que a segunda dose é menor do que a primeira dose.
[00196] Em ainda outras modalidades, são descritos métodos para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor. Estes métodos incluem a administração a um indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o câncer, e a determinação do número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra biológica de um indivíduo. Uma diminuição ou nenhuma alteração na quantidade de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o câncer não é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo. Uma segunda dose do terapêutico contra o câncer é administrada ao indivíduo, em que a segunda dose é maior do que a primeira dose, ou em que a segunda dose é a mesma que a primeira dose.
[00197] Em algumas modalidades, o indivíduo tem um tumor, ou está em risco de desenvolver um tumor, conforme discutido acima. Estes sujeitos podem ser identificados por métodos de rotina adequados, por uma pessoa com conhecimento na arte, tal como um médico. Os métodos descritos incluem selecionar um indivíduo de interesse, e administrar o terapêutico contra o câncer de interesse, incluindo, mas não limitado a um inibidor de ponto de controle, tal como um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3 ou um antagonista de LAG3. Também pode ser administrado ao indivíduo um agonista de 4-IBB. O método pode detectar sujeitos que vão responder a um procedimento cirúrgico.
[00198] Em modalidades adicionais, é administrada ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um terapêutico contra o câncer, tal como, mas não limitado a, um inibidor de ponto de controle, por exemplo um antagonista de PD-1, um antagonista de PD-L1, um antagonista de CTLA-4, um antagonista de BTLA, um antagonista de TIM-3 ou um antagonista de LAG3. Em modalidades adicionais, pode ser administrado ao indivíduo um agonista de 4-IBB. A administração dos linfócitos T CD39+ CD8+ purificados, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, e um inibidor de ponto de controle ou um agonista de 4-lBB, conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, vai aumentar a capacidade de um indivíduo para superar condições patológicas, tais como um tumor. As células e o inibidor de ponto de controle podem ser incluídos em uma única composição farmacêutica ou em composições farmacêuticas separadas. Portanto, por purifição e geração de uma população de linfócitos T CD39+ CD8+ purificados, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, de um indivíduo ex vivo e introdução de uma quantidade terapêutica destas células, é reforçada a resposta imune do indivíduo receptor. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de ponto de controle ou um agonista de 4-IBB também reforça a resposta imune do receptor. Portanto, os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, para determinar se um agente quimioterápico ou radiação é eficaz podem ser usados em combinação com qualquer um dos métodos terapêuticos (e em qualquer um dos sujeitos) descritos acima.
[00199] Os métodos também podem ser usados para avaliar a dose de um terapêutico contra o câncer que é terapeuticamente eficaz para um indivíduo. Por exemplo, os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser usados para determinar se a dose administrada a um indivíduo de interesse pode ser reduzida e ainda ser eficaz. Os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, também podem ser usados para determinar se a dose administrada a um indivíduo é baixa demais, e portanto deve ser aumentada para ser terapeuticamente eficaz.
[00200] Qualquer um dos métodos descritos pode incluir a medição de outros tipos celulares, tais como linfócitos B e/ou T. Os métodos descritos também podem incluir a medição da expressão de marcadores tais como PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3 ou LAG3. A expressão de CD8, CD39 e/ou CD103 é avaliada.
[00201] Em algumas modalidades, são medidos os linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Um aumento no número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, da amostra biológica em comparação com um controle indica que a dose do terapêutico contra o câncer é de utilidade no tratamento do indivíduo, e em que uma ausência de uma alteração significativa no número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em comparação com o controle indica que a dose do terapêutico contra o câncer não é de utilidade para tratar o indivíduo. O controle pode ser um valor padrão previamente determinado, ou a quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra do indivíduo antes da administração do terapêutico contra o câncer, ou a quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra do indivíduo, quando é administrada uma substância de controle ao indivíduo.
[00202] De modo geral, a medição do número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, inclui a obtenção de uma amostra que inclui linfócitos T de um indivíduo, e a determinação da presença ou do número de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, na amostra. Em alguns exemplos, a amostra é uma amostra de biópsia, uma amostra de sangue, ou uma amostra de células mononucleares do sangue periférico. Os métodos incluem imunohistoquímica e/ou citometria de fluxo.
[00203] Os métodos podem incluir métodos de imunohistoquímica,
tais como sobre uma amostra biológica de um indivíduo. A amostra pode ser uma amostra de tumor. Em algumas modalidades, um anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno), tal como um anticorpo que se liga a CD8, CD39 ou CD103 é marcado diretamente com um marcador detectável. Em outra modalidade, o anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno) que se liga a CD8, CD39 ou CD103 (o primeiro anticorpo) é não marcado e um segundo anticorpo ou outra molécula que pode se ligar ao anticorpo que se liga ao primeiro anticorpo é utilizado. Conforme é de conhecimento geral de um perito na arte, é escolhido um segundo anticorpo que é capaz de se ligar especificamente à específica espécie e classe do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o primeiro anticorpo for uma IgG humana, então o anticorpo secundário pode ser uma IgG anti-humana. Outras moléculas que podem se ligar a anticorpos incluem, sem limitação, Proteína A e Proteína G, ambas as quais estão disponíveis comercialmente.
[00204] Marcadores adequados para o anticorpo ou anticorpo secundário são descritos acima, e incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, agentes magnéticos e materiais radioativos. Exemplos não-limitantes de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase. Exemplos não- limitantes de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina. Exemplos não-limitantes de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, dansil cloreto ou ficoeritrina. Um exemplo não-limitante de material luminescente é luminol; um exemplo não-limitante de um agente magnético é gadolínio, e exemplos não-limitantes de marcadores radioativos incluem 125I, 1311, 35S ou 3H.
[00205] As células também podem ser quantificadas usando citometria de fluxo. Em modalidades adicionais, a amostra pode ser purificada, por exemplo para separar linfócitos T, tais como linfócitos T CD8 ou linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Em algumas modalidades, os métodos incluem a medição da quantidade de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Em alguns exemplos, a quantidade de linfócitos T CD39+ CD8+, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, em uma amostra biológica é comparada com um controle. Controles adequados são mencionados acima.
[00206] Em alguns exemplos, são produzidas suspensões celulares de uma amostra tumoral. Em um exemplo não limitante, sob condições estéreis, os tumores são cortados em pedaços pequenos e digeridos em RPMI-1640 com hialuronidase, colagenase, DNase bem como albumina sérica humana. As células podem ser digeridas, por exemplo, por 1 hora em temperatura ambiente sob agitação com uma barra de agitação magnética. As suspensões celulares são filtradas através de um filtro celular. Linfócitos infiltrantes no tumor podem ser enriquecidos por centrifugação com uma solução de gradiente de densidade.
[00207] Métodos para isolamento, detecção, e/ou quantificação de linfócitos T são conhecidos na arte, e protocolos exemplares são proporcionados aqui, neste requerimento de patente. Tambémsão conhecidos na arte métodos para medir a proliferação de linfócitos T. Estes métodos geralmente envolvem o uso de técnicas moleculares e/ou bioquímicas e não simples observação visual. É utilizada análise de células, em alguns exemplos, análise de células ativada por fluorescência (FACS). FACS pode ser usada para classificar (isolar) células tais como linfócitos T tingindo as células com um anticorpo adequadamente marcado. Em uma modalidade, podem ser usados vários anticorpos (tais como anticorpos que se ligam a CD8, CD39 e
CD103) e classificação por FACS para produzir populações de linfócitos T CD39+ CD8+ substancialmente purificados, tais como linfócitos T CD8 CD39+ CD103+. Pode ser empregada qualquer técnica de FACS, vide, por exemplo, métodos de FACS descritos na Patente U.S. No. 5.061.620.
[00208] No entanto, outras técnicas de eficácia diferente podedm ser empregadas para purificar e isolar populações desejadas de células. As técnicas de separação empregadas vão maximizar a retenção de viabilidade da fração das células a serem coletadas. A técnica em particular empregada, logicamente, vai depender da eficiência de separação, da citotoxicidade do método, da facilidade e da velocidade de separação, e de qual equipamento e/ou conhecimento técnico é requerido.
[00209] Procedimentos de separação incluem separação magnética, usando contas magnéticas revestidas com anticorpos, agentes citotóxicos, quer unidos a um anticorpo monoclonal ou usados em conjunto com complemento, e "panning," o qual utiliza um anticorpo monoclonal anexado a uma matriz sólida, ou outra técnica conveniente. Aanticorpos anexados a contas magnéticas e outras matrizes sólidas, tais como contas de agarose, contas de poliestireno, membranas de fibra oca e placas de Petri de plástico, possibilitam a separação direta. As células que são ligadas pelo anticorpo podem ser removidas da suspensão celular simplesmente separando fisicamente o suporte sólido da suspensão celular. As condições exatas e a duração da incubação das células com os anticorpos ligados à fase sólida vão depender de vários fatores específicos para o sistema empregado. No entanto, a seleção de condições apropriadas está bem dentro do conhecimento na arte.
[00210] As células não ligadas podem ser então elutriadas ou lavadas com tampão fisiológico depois de tempo suficiente ter sido permitido para as células expressando um marcador de interesse (por exemplo, CD39 ou CD103) se ligarem aos anticorpos ligados a fase sólida. As células ligadas são em seguida separadas da fase sólida por qualquer método apropriado, dependendo essencialmente da natureza da fase sólida e do anticorpo empregado.
[00211] Anticorpos podem ser conjugados a biotina, os quais podem ser então removidos com avidina ou estreptavidina ligada a um suporte, ou fluorocromos, os quais podem ser usados, com FACS, para permitir separação celular.
[00212] Por exemplo, células expressando CD8 ou CD3 são inicialmente separadas de outras células pela expressão na superfície celular de CD8 ou CD3. Em seguida a pureza das células CD8+ ou células CD3+ isoladas é checada, tal como com um citômetro de fluxo BD LSRFORTESSA® (Becton Dickinson, San Jose, CA), caso isto seja desejado. Em uma modalidade, são realizadas etapas de purificação adicionais, tais como classificação FACS da população de células. Em um exemplo, esta classificação pode ser realizada para detectar a expressão de CD39, CD103, e CD8.
[00213] Os métodos também podem incluir a medição da proliferação de células. Métodos para analisar a proliferação de células, tais como a avaliação da proliferação são conhecidos na arte. Por exemplo, podem ser utilizadas abordagens de diluição de corante de membrana as quais incluem marcação química ex vivo de células de interesse com corantes fluorescentes. Pode ser utilizada marcação com análogos de nucleosídeos tritiados (comumente 3H-timidina desoxirribonucleosídeo, 3H-TdR) ou bromodesoxiuridina (BrdU). Análise FACS está disponível para a medição da incorporação de BrdU. Também podem ser usados marcadores substitutos de proliferação tais como proteínas associadas ao ciclo celular e ao teor de DNA.
[00214] Em um exemplo, pode ser utilizada a medição de Ki67 ou PCNA. Antígeno Ki67 é a proteína nuclear relacionada com o ciclo celular prototípico que é expressa por células proliferantes em todas as fases do ciclo celular ativo (fase Gl, S, G2 e M). Está ausente em células em repouso (GO). Anticorpos Ki67 são úteis no estabelecimento de proliferação. Anticorpos Ki67 podem ser usados para quantificar células proliferantes entre e células em repouso (índice Ki67). Ki67 é rotineiramente usado como um marcador da cicloagem e da proliferação celulares; anticorpos para Ki67 estão disponíveis comercialmente, tais como ABCAM®, e estão disponíveis métodos para usar estes anticorpos em análises imunohistoquímica e FACS.
[00215] Outros métodos podem ser usados para detectar as células que estão no ciclo celular ativo no momento da amostragem. A proliferação de linfócitos, tais como linfócitos T CD39+ CD8+, por exemplo Linfócitos T CD8 CD39+ CD103+, também pode ser medida por uso de métodos que utilizam isótopos estáveis para marcar o DNA em amostras biológicas incluindo células. DNA é marcado uniformemente e altamente através da via de síntese de novo. Os marcadores de isótopos estáveis usados, por exemplo, 2H-glicose ou água pesada (2H2O ou H218O), são não tóxicos para os animais e para os seres humanos, e são considerados seguros de modo geral pela agência americana FDA (Food and Drug Administration) (vide a Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2009/0155179). A medição da incorporação de marcadores de isótopos estáveis em DNA de linfócitos compreende as seguintes etapas: (i) extração do DNA ou sua liberação da cromatina sem isolamento adicional, hidrólise do DNA para desoxirribonucleotídeos, (ii) liberação seletiva de desoxirribose a partir de desoxirribonucleotídeos de purina, (iii) derivatização de desoxirribose de purine para um derivado volátil (por exemplo,
tetraacetato de pentano, derivado de pentafluorobenzil tetraacetil, ou outro derivado adequado) adequado para análise por cromatografia gasosa/espectrometria de massa (GC/MS), (iv) análise por GC/MS do referido derivado, (v) análise do padrão de abundância do isotopômero de massa do referido derivado, e (vi) cálculo do referido padrão de um valor de enriquecimento em excesso que é uma medida da incorporação de isótopos estáveis. Modalidades específicas de cada um destes métodos foram ensinadas (vide a Pat. U.S. No. 5.910.40). Antagonistas de PD-1, de CTLA-4, de TIMS, de LAG3, de BTLA e Agonistas de 4-1BB
[00216] Inibidores de check-point, tais como antagonistas de PD-1, antagonistas de PD-L1, antagonistas de CTLA-4, antagonistas de LAG3, antagonistas de TIM-3 e/ou antagonistas de BTLA são de utilidade no método descrito aqui, neste requerimento de patente, por exemplo em combinação com linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+. Agonistas de 4-1BB também são de utilidade no método descrito aqui, neste requerimento de patente. O antagonista de PD-1, o antagonista de PD-L1, o antagonista de CTLA-4, o antagonista de LAG3, o antagonista de TIM-3, o antagonista de BTLA, e/ou o agonista de 4- 1BB pode ser um composto químico ou biológico. O agente pode ser um anticorpo, incluindo mas não limitado a um anticorpo quimérico, humanizado, ou humano. Antagonistas e agonistas adequados também incluem fragmentos de ligação ao antígeno destes anticorpos (vide acima para uma descrição de fragmentos de ligação ao antígeno). O antagonista pode ser, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico inibidor ou uma molécula pequena, tal como uma molécula com menos de 900 daltons ou menos de 800 daltons.
[00217] Um antagonista de PD-1 pode ser qualquer composto químico ou molécula biológica que bloqueie a ligação de PD-L1 ou PD- L2 expressa sobre uma célula a PD-1 humana expressa sobre uma célula imune (linfócito T, linfócito B ou linfócito NKT). Nomes alternativos ou sinônimos para PD-1 e seus ligantes incluem: PDCD1, PD1, CD279 e SLEB2 para PD-1; PDCD1L1, PD-L1, B7H1, B7-4, CD274 e B7-H para PD-L1; e PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc e CD273 para PD-L2. Exemplos de sequências de aminoácidos de PD-1 humanas podem ser encontrados em NCBI Acesso No.: NP_005009. Exemplos de sequências de aminoácidos de PD-L1 e PD-L2 humanas podem ser encontrados em NCBI Acesso No.: NP_054862 e NP 079515, respectivamente, 28 de abril de 2017, incorporados por meio de referência. In vivo, PD-1 é expresso sobre linfócitos T, linfócitos B, e monócitos ativados. Em seres humanos, PD-1 é um receptor transmembrana do tipo I de 50 a 55 kDa que foi identificado originalmente em uma linhagem de linfócitos T sofrendo apoptose induzida por ativação. PD-1 é expresso sobre linfócitos T, linfócitos B, e macrófagos. Os ligantes para PD-1 são os membros da família B7 PD-ligante 1 (PD-L1, também conhecido como B7-H1) e PD-L2 (também conhecido como B7-DC). Pode ser usado um inibidor de PD- L1 ou de PD-L2 nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00218] Dados experimentais implicam as interações de PD-1 com seus ligantess na regulação negativa de respostas imunes centrais e periféricas. Em particular, a proliferação em linfócitos T selvagens, mas não em linfócitos T deficientes de PD-1 é inibida na presença de PD-L1. (Vide, por exemplo, Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992; Shinohara et al. Genomics 23:704,1994; Pat. U.S. No. 5.698.520, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência).
[00219] Sequências de aminoácidos de PD-1 adicionais são descritas na Patente U.S. No. 6.808.710 e na Publicação do Requerimento de Patente U.S. Nos. 2004/0137577, 2003/0232323,
2003/0166531, 2003/0064380, 2003/0044768, 2003/0039653, 2002/0164600, 2002/0160000, 2002/0110836, 2002/0107363, e 2002/0106730, as quais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[00220] PD-1 é um membro da família de moléculas CD28/CTLA-4 com base em sua capacidade de se ligar a PD-L1. In vivo, como CTLA-4, PD-1 é rapidamente induzida sobre a superfície de linfócitos T em responsta a anti-CD3 (Agata et al. Int. Immunol. 8:765, 1996). A exaustão de linfócitos T é concomitante com uma indução na expressão de PD-1, vide a Publicação PCT de Patente Internacional No. 2008/083174, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. A citotoxicidade de linfócitos T pode ser aumentada pondo em contato um linfócito T com um agente que reduz a expressão ou atividade de PD-1. Um agente que reduz a expressão ou atividade de PD-1 pode ser usado para aumentar uma resposta imune, tal como para um tumor. Sem ser limitado pela teoria, a redução da expressão ou atividade de PD-1 resulta em um aumento na atividade de linfócitos T citotóxicos, aumentando a resposta imune específica.
[00221] Membros da família de PD-1 se ligam a um ou mais receptores, tais como PD-L1 e PD-L2 sobre células de apresentação ao antígeno. Um exemplo de sequência de aminoácidos para PD-L1 é proporcionado como GENBANK® Acesso No. AAG18508, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, conforme disponível em 4 de outubro de 2000. Um exemplo de sequência de aminoácidos precursora de PD-L2 é proporcionado como GENBANK® Acesso No. AAK15370, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, conforme disponível em 8 de abril de 2002. Um exemplo de sequência de aminoácidos precursora de PD-L2 variante é proporcionado como
GENBANK® Acesso No. Q9BQ51, o qual é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, conforme disponível em 12 de dezembro de 2006.
[00222] Antagonistas de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, incluem agentes que reduzem a expressão ou atividade de um ligante 1 de PD (PD-L1) ou de um ligante 2 de PD (PD-L2) ou reduzem a interação entre PD-1 e PD-L1 ou a interação entre PD-1 e PD-L2; estes são antagonistas de PD. Exemplos de compostos incluem anticorpos (tais como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, e um anticorpo anti-PD-L2), moléculas de RNAi (tais como moléculas de RNAi anti-PD-1, RNAi anti-PD-L1, e um RNAi anti-PD-L2), moléculas antisense (tais como um RNA antisense anti- PD-1, um RNA antisense anti-PD-L1, e um RNA antisense anti-PD-L2), proteínas dominantes negativas (tais como uma proteína PD-1 dominante negativa, uma proteína PD-L1 dominante negativa, e uma proteína PD-L2 dominante negativa), e inibidores de molécula pequena. Quaisquer destes antagonistas de PD-1 são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00223] Outros anticorpos são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, (tais como um anticorpo anti- CTLA-4, e um anticorpo anti-LAG3, um anticorpo anti-TIM-3 ou um anticorpo anti-BTLA), moléculas de RNAi (tais como moléculas de RNAi anti-CTLA-4, RNAi anti-LAG3, RNAi anti-TIM-3 e um RNAi anti- BTLA), moléculas antisense (tais como um RNA antisense anti-CTLA- 4, um RNA antisense anti-LAG3, um RNA antisense anti-TIM-3 e um RNA antisense anti-BTLA). Proteínas dominantes negativas também de utilidade são uma proteína CTLA-4 dominante negativa, uma proteína LAG3 dominante negativa, uma proteína LAG- 3 dominante negativa e uma proteína BTLA dominante negativa). Quaisquer destes antagonistas são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Além disso, agonistas de 4-IBB, tais como anticorpos que se ligam a 4-1BB e Aptâmeros de RNA, são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Uma proteína dominante negativa ou inibitória de receptor de TGF-β também é de utilidade.
[00224] Um antagonista é um agente tendo a capacidade de reduzir a expressão ou a atividade do alvo em uma célula. Em algumas modalidades, a expressão ou atividade de PD-1, de PD-L1, de PD-L2, de LAG3, de TIM-3, de CTLA-4 ou de BTLA é reduzida por no mínimo cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% comparada com a referida expressão ou atividade em um controle. Exemplos de reduções na atividade são no mínimo cerca de 50%, no mínimo cerca de 60%, no mínimo cerca de 70%, no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, ou uma completa ausência de atividade detectável. Em um exemplo, o controle é uma célula que não tenha sido tratada com o antagonista de PD-1. Em outro exemplo, o controle é um valor padrão, ou uma célula contactada com um agente, tal como um veículo, conhecido por não afetar a atividade. A expressão ou atividade pode ser determinada por qualquer método de rotina na arte. Em um exemplo não limitante, um antagonista de PD-1 inibe ou reduz a ligação de PD-1 a PD-L1, a PD- L2, ou a ambos. Em um exemplo não limitante, um antagonista de PD- L1 reduz a ligação de PD-L1 ou PD-1.
[00225] Um agonista é um agente tendo a capacidade de aumentar expressão ou a atividade do alvo em uma célula. Em algumas modalidades, a expressão ou atividade de 4-IBB é aumentada por no mínimo cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% comparada com a referida expressão ou atividade em um controle. Exemplos de aumentos na atividade são no mínimo cerca de 50%, no mínimo cerca de 60%, no mínimo cerca de 70%, no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, ou uma completa ausência de atividade detectável. Em um exemplo, o controle é uma célula que não tenha sido tratada com o agonista de 4- IBB. Em outro exemplo, o controle é um valor padrão, ou uma célula contactada com um agente, tal como um veículo, conhecido por não afetar a atividade. A expressão ou atividade pode ser determinada por qualquer método de rotina na arte. Em um exemplo não limitante, o agonista de 4-IBB estimula ou aumenta a ligação. A. Anticorpos
[00226] Em algumas modalidades, o antagonista é um anticorpo. São descritos exemplos de sequência de aminoácidos de anticorpos que se ligam a PD-1, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. No. 2006/0210567, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Anticorpos que se ligam a PD-1 também são descritos na Publicação de Patente U.S. No. 2006/0034826, a qual também é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Anticorpos que se ligam a PD-1 também são descritos na Patente U.S. No. 7,488,802, Patente U.S. No.
7.521.051, na Patente U.S. No. 8.008.449, Patente U.S. No. 8.354.509, na Patente U.S. No. 8.168.757, e na U.S. Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2004/004771, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2004/072286, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2004/056875, e no Requerimento de Patente Publicado US No. 2011/0271358. O anticorpo pode ser KEYTRUDA® (pembrolizumab). O anticorpo pode ser um anticorpo anti-PD-1 tal como Nivolumab (ONO-4538/BMS-936558) ou OPDIVO® da Ono Pharmaceuticals. Antagonistas de ligação a PD-L1 incluem YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 e MEDI 4736, vide o Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2017/0044256. Exemplos de anticorpos monoclonais que se ligam especificamente a
PD-L1 humano, e são úteis nos métodos e composições descritos, são descritos na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2013/019906, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2010/077634 A1 e na Patente U.S. No. 8.383.796. Os anticorpos contra PD-1 inibidores de ponto de controle (por exemplo, Nivolumab, pidilizumab, e Pembrolizumab) ou PD-L1 (por exemplo, Durvalumab, Atezolizumab, e Avelumab) são de utilidade em qualquer um dos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Anticorpos que se ligam a PD-1, PD-L2 e PD-1 também são descritos na Patente No. 8.552.154. Em vários exemplos, o anticorpo se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 com uma constante de afinidade de no mínimo 107 M-1, tal como no mínimo 108 M-1 no mínimo 5 X 108 M-1 ou no mínimo 109 M-1. Qualquer um destes anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno, são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00227] Exemplos de anticorpos que se ligam especificamente a CTLA-4 são descritos na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2001/014424, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2004/035607, na Publicação de Patente U.S. No. 2005/0201994, na Patente Européia No. EP1141028, e na Patente Européia No. EP 1212422 Bl. Anticorpos anti CTLA-4 adicionais são descritos na Patente U.S. No. 5.811.097, na Patente U.S. No 5.855.887, na Patente U.S. No 6.051.227, na Patente U.S. No 6.984.720, na Patente U.S. No.
6.682.736, Patente U.S. No. 6.207.156, na Patente U.S. No. 5.977.318, Patente U.S. No. 6.682.736, na Patente U.S. No. 7.109.003, Patente U.S. No. 7.132.281, na Patente U.S. No. 7.452.535, e Patente U.S. No.
7.605.238; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 01/14424, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 00/37504, na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 98/42752, no Requerimento de Patente Publicado U.S. No.
2000/037504, no Requerimento de Patente U.S. Publicado No. 2002/0039581, e no Requerimento de Patente U.S. Publicado No. 2002/086014. Anticorpos que se ligam especificamente a CTLA-4 também são descritos em Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998); Camacho et al., J. Clin. Oncol., 22(145): Abstract No. 2505 (2004) (anticorpo CP-675206); Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998). Em algumas modalidades o antagonista de CTLA-4 é Ipilmumab (também conhecido como MDX-010 e MDX- 101 e YERVOY®), vide a Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2001/014424, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Estes anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno, são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00228] Em modalidades adicionais, um antagonista de BTLA é utilizado nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Anticorpos que se ligam especificamente a BTLA são descritos, por exemplo, no Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2016/0222114, no Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2015/0147344, e no Requerimento de Patente U.S. Publicado No. 2012/0288500, todos incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Agentes biológicos que modulam a atividade de BTLA, especificamente usando complexos cis de mediador de entrada de Herpes vírus (HVEM) são descritos no Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2014/0220051 e no Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2010/0104559, ambos incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Em ainda outras modalidades, o anticorpo se liga especificamente a TIM-3, tal como TSR-022. Em modalidades adicionais, o anticorpo se liga especificamente a LAG3, tal como BMS- 986016, GSK2831781, ou os anticorpos descritos na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO2015042246 A1, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Vide também o ensaio clínico número NCT01968109 para "Safety Study of Anti-LAG-3 With and Without Anti-PD-1 in the Treatment of Solid Tumors" disponível na Internet em clinicaltrials.gov e incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente. Estes anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno, são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00229] Um anticorpo contra agonista de 4-1BB também é de utilidade. Anticorpos adequados são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No. 8,337,850 e na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 2015179236 A1, ambas incorporadas por meio de referência aqui, a este requerimento de patente. Anticorpos de utilidade em qualquer um dos métodos descritos incluem urelumab (BMS-663513) e PF- 05082566 (Pfizer).
[00230] Os anticorpos de utilidade nos métodos descritos incluem anticorpos monoclonais, anticorpos humanizados, anticorpos desimunizados (tal como para reduzir uma resposta humana-anti- camundongo), anticorpos quiméricos, e proteínas de fusão de imunoglobulina (Ig). Fragmentos de ligação ao antígeno destes anticorpos também são de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Anticorpos policlonais podem ser preparados por um perito na arte, tal como por imunização de um indivíduo adequado (tal como um indivíduo veterinário) com um imunogênio. O título de anticorpos no indivíduo imunizado pode ser monitorado ao longo do tempo por técnicas de rotina, tal como com um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) usando antígeno imobilizado. Em um exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 (ou combinações dos mesmos) pode ser isolado a partir do mamífero (tal como a partir do soro) e ainda purificado por técnicas conhecidas por um especialista na arte. Por exemplo, anticorpos podem ser purificados usando cromatografia de proteína A para isolar anticorpos IgG.
[00231] Células produtoras de anticorpos podem ser obtidas do indivíduo e usadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas de rotina (vide Kohler and Milstein Nature 256:495 49, 1995; Brown et al., J. Immunol. 127:539 46, 1981; Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96, 1985; Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36; Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses. Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Kozbor et al. Immunol. Today 4:72, 1983; Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402; Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927 31, 1976). Em um exemplo, uma linhagem celular imortal (tipicamente um mieloma) é fundida a linfócitos (tipicamente esplenócitros) de um mamífero imunizado com PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG3, BTLA ou CTLA-4 e os sobrenadantes da cultura das células de hibridoma resultantes são triados para identificar um hibridoma produto de um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao polipeptídeo de interesse.
[00232] Em uma modalidade, para produzir um hibridoma, uma linhagem celular imortal (tal como uma linhagem celular de mieloma) é derivada da mesma espécie de mamífero que os linfócitos. Por exemplo, hibridomas murinos podem ser produzidos fundindo linfócitos de um camundongo imunizado com um peptídeo CTLA-4, BTLA, TIM- 3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-1BB com uma linhagem celular de camundongo imortalizada. Em um exemplo, é utilizada uma linhagem celular de mieloma de camundongo que é sensível a meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina ("meio HAT"). Pode ser usado qualquer uma de uma série de linhagens celulares de mieloma como um parceiro de fusão de acordo com técnicas de rotina,
incluindo, por exemplo, as linhagens de mieloma P3-NSl/l-Ag4-l, P3- x63-Ag8.653 ou Sp2/0-Agl4, as quais estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. Células de mieloma de camundongo sensíveis a HAT podem ser fundidas a esplenócitos de camundongo usando polietileno glicol ("PEG"). Células de hibridoma resultantes da fusão são em seguida selecionadas usando meio HAT, o qual destrói células de mieloma não fundidas (e fundidas improdutivamente). Células de hibridoma produtoras de um anticorpo monoclonal de interesse podem ser detectadas, por exemplo, por triagem dos sobrenadantes da cultura de hibridoma para a produção de anticorpos que se ligam a uma molécula de PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG3, BTLA, CTLA-4, PD-L2 ou 4-1BB, tal como por uso de um ensaio imunológico (tal como um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio (RIA).
[00233] Como uma alternativa para a preparação de hibridomas secretores de anticorpos monoclonais, um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4-1BB pode ser identificado e isolado por triagem de uma biblioteca de imunoglobulinas combinatoriais recombinantes (tal como uma biblioteca de display de fagos de anticorpos) com CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4-IBB para isolar membros da biblioteca de imunoglobulinas que se ligam especificamente ao polipeptídeo. Kits para produção e triagem de bibliotecas de display de fagos estão disponíveis comercialmente (tais como, mas não limitado a, Pharmacia e Stratagene). Exemplos de métodos e reagentes particularmente adequados para uso na produção e triagem de biblioteca de display de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, na Pat. U.S. No. 5,223,409; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 90/02809; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 91/17271; na Publicação PCT de Patente
Internacional No. WO 92/18619; na Publicação PCT de Patente Internacional WO 92/20791; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 92/15679; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 92/01047; na Publicação PCT de Patente Internacional WO 93/01288; na Publicação PCT de Patente Internacional No. WO 92/09690; em Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978 7982, 1991; e em Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19:4133 4137, 1991.
[00234] Em um exemplo, é determinada a sequência das regiões determinantes de especificidade de cada CDR. Resíduos que estão fora da SDR (sítios de contato não ligante) são substituídos. Por exemplo, em qualquer uma das sequências de CDR como na tabela acima, no máximo um, dois ou três aminoácidos podem ser substituídos. A produção de anticorpos quiméricos, os quais incluem uma região de estrutura de um anticorpo e as CDRs de um anticorpo diferente, é de conhecimento geral na arte. Por exemplo, anticorpos humanizados podem ser produzidos rotineiramente. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser uma imunoglobulina humanizada tendo regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de um anticorpo monoclonal do doador que se liga a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-1BB e imunoglobulina e estruturas de região variável de cadeias pesada e leve de estruturas de cadeias pesada e leve de imunoglobulina aceitadora humana. Anticorpos monoclonais humanizados podem ser produzidos transferindo regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do doador de cadeias variáveis pesada e leve da imunoglobulina do camundongo doador (tal como um anticorpo específico contra CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4- IBB) para um domínio variável humano, e em seguida substituindo resíduos humanos nas regiões de estrutura quando requerido para conservar a afinidade. O uso de componentes de anticorpos derivados de anticorpos monoclonais humanizados previne problemas potenciais associados com a imunogenicidade das regiões constantes do anticorpo do doador. Técnicas para a produção de anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, por Jones et al., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech.12:437, 1992; e Singer et al., J. Immunol.150:2844, 1993. O anticorpo pode ser de qualquer isótipo, mas, em várias modalidades, o anticorpo é uma IgG, incluindo mas não limitada a, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4.Em algumas modalidades, a imunoglobulina humanizada se liga especificamente ao antígeno de interesse (por exemplo, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-1BB) com uma constante de afinidade de no mínimo 107 M-1, tal como no mínimo 108 M-1 no mínimo 5 X 108 M-1 ou no mínimo 109-M-1.
[00235] Em uma modalidade, a sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada pode ser no mínimo cerca de 65% idêntica à sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina do doador. Portanto, a sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada pode ser no mínimo cerca de 75%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 99% ou no mínimo cerca de 95%, idêntica à sequência da estrutura de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina do doador. Regiões de estrutura humana, e mutações que podem ser feitas em regiões de estrutura de anticorpos humanizados, são conhecidas na arte (vide, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.585.089, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência).
[00236] Anticorpos, tais como anticorpos monoclonais murinos, anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados, incluem moléculas de comprimento total bem como fragmentos das mesmas, tais como Fab, F(ab')2, e Fv os quais incluem uma região variável de cadeia pesada e de cadeia leve e são capazes de se ligar a determinantes epitópicos específicos. Estes fragmentos de anticorpos conservam alguma capacidade de se ligar seletivamente com seu antígeno ou receptor. Estes fragmentos incluem:
[00237] (1) Fab, o fragmento o qual contém um fragmento de ligação ao antígeno monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão de anticorpo inteiro com a enzima papaína para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada;
[00238] (2) Fab', o fragmento de uma molécula de anticorpo pode ser obtido por tratamento do anticorpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para produzir uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; são obtidos dois fragmentos Fab' por molécula de anticorpo;
[00239] (3) (Fab')2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido por tratamento do anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab' mantidos juntos por duas ligações de dissulfeto;
[00240] (4) Fv, um fragmento produzido por engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como duas cadeias; e
[00241] (5) Anticorpo de cadeia única (tais como scFv), definido como uma molécula produzida por engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligadas por um encadeador polipeptídico adequado como uma molécula de cadeia única fundida geneticamente.
[00242] Métodos de produzir estes fragmentos de ligação ao antígeno são conhecidos na arte (vide por exemplo, Harlow and Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988). Em vários exemplos, a região variável inclui a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressas como polipeptídeos individuais. Anticorpos de Fv têm tipicamente cerca de 25 kDa e contêm um sítio de ligação ao antígeno completo com três CDRs por cada cadeia pesada e cada cadeia leve. Para produzir estes anticorpos, o VH e o VL podem ser expressos a partir de dois constructos de ácido nucleico individuais em uma célula hospedeira. Se o VH e o VL forem expressos de maneira não contígua, as cadeias do anticorpo de Fv são tipicamente mantidas juntas por interações não covalentes. No entanto, estas cadeias tendem a se dissociar depois de diluição, portanto foram desenvolvidos métodos para reticular as cadeias através de glutaraldeído, dissulfetos intermoleculares, ou um encadeador peptídico. Portanto, em um exemplo, o Fv pode ser um Fv estabilizado com dissulfeto (dsFv), em que a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são quimicamente encadeadas por ligações de dissulfeto.
[00243] Em um exemplo adicional, os fragmentos Fv compreendem cadeias VH e VL conectadas por um encadeador peptídico. Estas proteínas de ligação ao antígeno de cadeia única (scFv) são preparadas construindo um gene estrutural compreendendo sequências de DNA codificando os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido dentro de um vetor de expressão, o qual é subsequentemente introduzido dentro de uma célula hospedeira tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia de polipeptídeo com um peptídeo encadeador ligando os dois domínios V. Métodos para a produção de scFvs são conhecidos na arte (vide Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 97, 1991; Bird et al., Science 242:423, 1988; Patente U.S. No. 4.946.778;
Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993; e Sandhu, supra).
[00244] Fragmentos de anticorpos podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E. coli de DNA codificando o fragmento. Fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão por pepsina ou papaína de anticorpos por métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para proporcionar um fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado usando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo de bloqueio para os grupos de sulfidrila resultantes de clivagem das ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. De forma alternativa, uma clivagem enzimática usando pepsina produz dois fragmentos Fab' monovalentes e um fragmento Fc diretamente (vide a Patente U.S. No. 4.036.945 e a Patente U.S. No. 4.331.647, e referências contidas nas mesmas; Nisonhoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422, Academic Press, 1967; e Coligan et al. às seções
2.8.1-2.8.10 e 2.10.1-2.10.4).
[00245] Também podem ser usados outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como separação de cadeias pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadeias leve-pesada, clivagem posterior de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas, ou genéticas, contanto que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.
[00246] Um perito vai reconhecer que podem ser produzidas variantes conservadoras dos anticorpos. As variantes conservadoras referidas empregadas em fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos dsFv ou em fragmentos scFv, vão reter resíduos de aminoácidos necessários para os corretos dobramento e estabilização entre as regiões de VH e as de VL, e vão reter as características de carga dos resíduos de modo a preservar o baixo pi e a baixa toxicidade das moléculas. Podem ser feitas substituições de aminoácidos (tais como no máximo uma, no máximo duas, no máximo três, no máximo quatro, ou no máximo cinco substituições de aminoácidos) nas regiões de VH e nas de VL para aumentar a produção. Portanto, um perito na arte pode prontamente rever a sequência de aminoácidos de um anticorpo de interesse, localizar um ou mais dos aminoácidos na breve tabela acima, identificar uma substituição conservadora, e produzir a variante conservadora usando técnicas moleculares de conhecimento geral.
[00247] Moléculas efetoras, tais como porções terapêuticas, de diagnóstico, ou de detecção podem ser ligadas a um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD- L2, ou 4-1BB usando qualquer número de meios conhecidos dos peritos na arte. Podem ser usados meios de anexação tanto covalentes quanto não covalentes. O procedimento para anexação a uma molécula efetora a um anticorpo varia de acordo com a estrutura química do efetor. Polipeptídeos tipicamente contêm uma variedade de grupos funcionais; tais como grupos de ácido carboxílico (COOH), amina livre (-NH2) ou sulfidrila (-SH), os quais estão disponíveis para reação com um grupo funcional adequado sobre um anticorpo para resultar na ligação da molécula efetora. De forma alternativa, o anticorpo é derivatizado para expor ou anexar grupos funcionais reativos adicionais. A derivatização pode envolver a anexação de qualquer um de um número de moléculas encadeadoras tais como as disponíveis na Pierce Chemical Company, Rockford, IL. O encadeador pode ser qualquer molécula usada para unir o anticorpo à molécula efetora. O encadeador é capaz de formar ligações covalentes tanto para o anticorpo quanto para a molécula efetora. Encadeadores adequados são de conhecimento geral dos peritos na arte e incluem, mas não estão limitados a, encadeadores de carbono de cadeia reta ou ramificada, encadeadores de carbono heterocíclicos, ou encadeadores peptídicos. Onde o anticorpo e a molécula efetora são polipeptídeos, os encadeadores podem ser unidos aos aminoácidos constituintes através de seus grupos laterais (tal como através de uma ligação de dissulfeto a cisteína) ou aos grupos alfa carbono amino e carboxila dos aminoácidos terminais.
[00248] Sequências de ácidos nucléicos codificando os anticorpos podem ser preparadas por qualquer método adequado incluindo, por exemplo, clonagem de sequências apropriadas ou por síntese química direta por métodos tais como o método do fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; o método do fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979; o método da dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859-1862, 1981; o método do triêster de fosforamidita de fase sólida descrito por Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859- 1862, 1981, por exemplo, usando um sintetizador automatizado conforme descrito, por exemplo, em Needham-VanDevanter et al., Nucl. Acids Res. 12:6159- 6168, 1984; e, o método do suporte sólido da Patente U.S. No.
4.458.066. Síntese química produz um oligonucleotídeo de cadeia única. Este pode ser convertido em DNA de cadeia dupla por hibridização com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma DNA polimerase usando a cadeia única como um modelo. Um perito na arte vai reconhecer que, apesar de geralmente síntese química de DNA ser limitada a sequências de cerca de 100 bases, sequências mais longas podem ser obtidas pela ligação de sequências mais curtas.
[00249] Exemplos de ácidos nucleicos codificando sequências codificando um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA,
TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-lBB podem ser preparados por técnicas de clonagem. Exemplos de técnicas de clonagem e de sequenciamento apropriadas, e instruções suficientes para orientar os especialistas através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Sambrook et al., supra, Berger and Kimmel (eds.), supra, e Ausubel, supra. Informações sobre os produtos de fabricantes de reagentes biológicos e de equipamento experimental também proporcionam informações úteis. Os fabricantes referidos incluem a SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suíça), Invitrogen (San Diego, CA), e Applied Biosystems (Foster City, CA), bem como muitas outras fontes comerciais conhecidas por um especialista.
[00250] Ácidos nucleicos também podem ser preparados por métodos de amplificação. Métodos de amplificação incluem reação em cadeia da polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), o sistema de amplificação à base de transcrição (TAS), o sistema de replicação de sequência auto-sustentado (3SR). Uma ampla variedade de métodos de clonagem, células hospedeiras, e metodologias de amplificação in vitro são de conhecimento geral dos peritos na arte.
[00251] Em um exemplo, um anticorpo de utilidade é preparado inserindo o cDNA o qual codifica uma região variável de um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD- L1, PD-L2, ou 4-lBB dentro de um vetor o qual compreende o cDNA codificando uma molécula efetora (EM). A inserção é feita de modo que a região variável e a EM são lidas em frame de modo que é produzido um polipeptídeo contínuo. Portanto, o polipeptídeo codificado contém uma região de Fv funcional e uma região de EM funcional. Em uma modalidade, cDNA codificando um marcador detectável (tal como uma enzima) é ligado a um scFv de modo que o marcador é localizado no término carboxila do scFv. Em outro exemplo, um marcador detectável é localizado no término amino do scFv. Em um exemplo adicional, cDNA codificando um marcador detectável é ligado a uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD- L2, ou 4-lBB de modo que o marcador está localizado no término carboxila da região variável de cadeia pesada. A região variável de cadeia pesada pode ser subsequentemente ligada a uma região variável de cadeia leve do anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-lBB usando ligações de dissulfeto. Em ainda um outro exemplo, cDNA codificando um marcador é ligado a uma região variável de cadeia leve de um anticorpo que se liga a CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4- IBB, de modo que o marcador está localizado no término carboxila da região variável de cadeia leve. A região variável de cadeia leve pode ser subsequentemente ligada a uma região variável de cadeia pesada do anticorpo que especificamente liga CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-1BB usando ligações de dissulfeto.
[00252] Assim que os ácidos nucleicos codificando o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo são isolados e clonados, a proteína pode ser expressa em uma célula manipulada de maneira recombinante tal como bactérias, células vegetais, levedura, de inseto e de mamífero. Assim que uma ou mais sequências de DNA codificando o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem ser expressas in vitro por transferência de DNA para uma célula hospedeira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira do indivíduo. É entendido que toda a progênie pode não ser idêntica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorram durante a replicação. Métodos de transferência estável, significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na arte.
[00253] Sequências de nucleotídeos codificando o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem ser ligados operacionalmente a sequências de controle de expressão. Uma sequência de controle de expressão ligada operacionalmente a uma sequência codificante é ligada de tal modo que a expressão da sequência codificante é realizada sob condições compatíveis com as sequências de controle de expressão. As sequências de controle de expressão incluem, mas não estão limitadas a adequados promotores, reforçadores, terminadores de transcrição, um códon de partida (isto é, ATG) na frente de um gene codificando proteína, sinal de emenda para íntrons, manutenção do frame de leitura correto daquele gene para permitir a adequada translação de mRNA, e códons de parada.
[00254] As sequências de nucleotídeos codificando o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem ser inseridas em um vetor de expressão incluindo, mas não limitado a, um plasmídeo, um vírus ou outro veículo que possa ser manipulado para permitir a inserção ou incorporação de sequências e podem ser expressas ou em procariotas ou em eucariotas. Os hospedeiros podem incluir organismos microbianos, de leveduras, de insetos e de mamíferos. Métodos de expressão de sequências de DNA tendo sequências eucarióticas ou virais em procariotas são de conhecimento geral na arte. Vetores biologicamente funcionais virais e de DNA de plasmídeo capazes de de expressão e replicação em um hospedeiro são de conhecimento geral na arte.
[00255] A transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinante pode ser realizada por técnicas convencionais conforme é de conhecimento geral dos peritos na arte. Onde o hospedeiro é procariótico, tal como E. coli, células competentes as quais são capazes de captação de DNA podem ser preparadas a partir de células colhidas deopis da fase de crescimento exponencial e em seguida tratadas pelo método do CaCl 2 usando procedimentos de conhecimento geral na arte. De forma alternativa, pode ser usado MgCl2 ou RbCl. Também pode ser realizada transformação depois de formar um protoplasto da célula hospedeira, caso desejado, ou por eletroporação.
[00256] Quando o hospedeiro é um eucariota, os métodos de transfecção de DNA referidos são coprecipitados de fosfato de cálcio, podem ser usados procedimentos mecânicos convencionais, tais como microinjeção, eletroporação, inserção de plasmídeo encerrado em lipossomas, ou vetores de vírus. Células eucarióticas também podem ser cotransformadas com sequências de nucleotídeos codificando o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo e uma segunda molécula de DNA estranho codificando um fenótipo selecionável, tal como o gene da timidina quinase do herpes simples. Outro método é usar um vetor viral eucariótico, tal como o vírus símio 40 (SV40) ou o vírus do papiloma bovino, para infectar ou transformar transitoriamente células eucarióticas e expressar a proteína (vide por exemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Um perito na arte pode prontamente usar sistemas de expressão, tais como plasmídeos e vetores de utilidade na produção de proteínas em células, incluindo células eucarióticas superiores tais como as linhagens de células COS, CHO, HeLa e de mieloma.
[00257] O isolamento e a purificação de polipeptídeo expresso de maneira recombinante podem ser realizados por meios convencionais, incluindo cromatografia do preparativo e separações imunológicas. Uma vez expressos, os anticorpos recombinantes podem ser purificados de acordo com procedimentos de rotina da arte, incluindo precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, e similares (vide, de modo geral, R. Scopes, Protein Purification, Springer- Verlag, N.Y., 1982). Composições substancialmente puras de no mínimo cerca de 90 a 95% de homogeneidade são descritas aqui, neste requerimento de patente, e 98 a 99% de homogeneidade ou mais pode ser usado para fins farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou até a homogeneidade conforme desejado, se forem para serem usados terapeuticamente, os polipeptídeos devem ser substancialmente livres de endotoxinas.
[00258] Métodos para expressão de anticorpos de cadeia única e/ou redobragem para uma forma ativa apropriada, incluindo anticorpos de cadeia única, de bactérias tais como E. coli têm sido descritos e são de conhecimento geral e são aplicáveis aos anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente. Vide, Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse et al., Science 246: 1275, 1989 e Ward et al., Nature 341 :544, 1989, todos incorporados por meio de referência aqui, a este requerimento de patente.
[00259] Frequentemente, proteínas heterólogass funcionais de E. coli ou outras bactérias são isoladas a partir de corpos de inclusão e necessitam de solubilização usando fortes desnaturantes, e subsequente redobragem. Durante a etapa de solubilização, conforme é de conhecimento geral na arte, um agente redutor deve estar presente para separar as ligações de dissulfeto. Um exemplo de tampão com um agente redutor é: 0,1 M de Tris pH 8, 6 M de guanidina, 2 mM de EDTA, 0,3 M de DTE (ditioeritritol). Pode ocorrer a reoxidação das ligações de dissulfeto na presença de reagentes de tiol de baixo peso molecular em forma reduzida e oxidada, conforme descrito em Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, e especialmente conforme descrito por Buchner et al., supra.
[00260] Tipicamente é realizada renaturação por diluição (por exemplo, 100 vezes) da proteína desnaturada e reduzida em tampão de redobragem. Um exemplo de tampão é 0,1 M de Tris, pH 8,0, 0,5 M de L-arginina, 8 mM de glutationa oxidada (GSSG), e 2 mM de EDTA.
[00261] Como uma modificação para o protocolo de purificação de anticorpos de duas cadeias, as regiões de cadeias pesada e leve são separadamente solubilizadas e reduzidas e em seguida combinadas na solução de redobragem. Uma produção exemplar é obtida quando estas duas proteínas são misturadas em uma proporção molar tal que não é excedido um excesso molar de 5 vezes de uma proteína em relação à outra. É desejável adicionar um excesso de glutationa oxidada ou de outros compostos oxidantes de baixo peso molecular à solução de redobragem depois do embaralhamento redox ser completado.
[00262] Além de métodos recombinantes, os anticorpos e fragmentos funcionais dos mesmos que são descritos aqui, neste requerimento de patente, também podem ser construídos no todo ou em parte usando síntese de peptídeos de rotina. Síntese de fase sólida dos polipeptídeos de menos de cerca de 50 aminoácidos de comprimento pode ser realizada anexando o aminoácido do terminal carbóxi da sequência a um suporte insolúvel seguido por adição sequencial dos aminoácidos remanescentes na sequência. Técnicas de síntese de fase sólida são descritas por Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in
Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156, 1963, e Stewart et al., Solid Phase Peptides Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, 111., 1984. Proteínas de maior comprimento podem ser sintetizadas por condensação dos términos amino e carboxila de fragmentos mais curtos. Métodos de formação de ligações peptídicas por ativação de uma extremidade de terminal carboxila (tais como pelo uso do reagente de acoplamento N,N'-diciclohexilcarbodimida) são de conhecimento geral na arte. B. Ácidos Nucleicos Inibitórios
[00263] Ácidos nucleicos inibitórios que diminuem a expressão e/ou atividade de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 também podem ser usados nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Uma modalidade é um RNA inibidor pequeno (siRNA) para interferência ou inibição da expressão de um gene alvo. Sequências de ácidos nucléicos codificando PD-1, PD-L1 e PD-L2 são descritas em GENBANK® Acesso Nos. NM_005018, AF344424, NP_079515, e NP_054862, todos incorporados por meio de referência conforme disponível em 28 de abril de 2017.
[00264] De modo geral, siRNAs são gerados pela clivagem de moléculas de RNA de cadeia dupla relativamente longas por enzimas Dicer ou DCL (Zamore, Science, 296: 1265-1269, 2002; Bernstein et al., Nature, 409:363-366, 2001). Em animais e plantas, os siRNAs são montados em RISC e guiam a atividade ribonucleolítica específica da sequência de RISC, deste modo resultando na clivagem de mRNAs ou de outras moléculas alvo de RNA no citoplasma. No núcleo, os siRNAs também guiam metilação de DNA e histona associada com heterocromatina, resultando em silenciamento transcricional de genes individuais ou de grandes domínios de cromatina. siRNAs de PD-1 estão disponíveis comercialmente, tal como na Santa Cruz Biotechnology, Inc.
[00265] A presente invenção proporciona RNA adequados para interferência ou inibição da expressão de um gene alvo, cujo RNA inclui RNA de cadeia dupla de cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos contendo um ressalto 3' e/ou 5' de 0 a 5 nucleotídeos sobre cada cadeia. A sequência do RNA é substancialmente idêntica a uma porção de um mRNA ou transcripto de um gene alvo, tal como CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2, para o qual se deseja a interferência ou inibição da expressão. Para os fins da presente invenção, uma sequência do RNA "substancialmente idêntica" a uma porção específica do mRNA ou do transcripto do gene alvo para o qual se deseja a interferência ou inibição da expressão difere por não mais de cerca de 30 por cento, e em algumas modalidades não mais de cerca de 10 por cento, da porção específica do mRNA ou do transcripto do gene alvo. Em modalidades particulares, a sequência do RNA é exatamente idêntica a uma porção específica do mRNA ou do transcripto do gene alvo.
[00266] Portanto, os siRNAs descritos aqui, neste requerimento de patente, incluem RNA de cadeia dupla de cerca de 15 a cerca de 40 nucleotídeos de comprimento e um resslato 3' ou 5' tendo um comprimento de 0 a 5 nucleotídeos sobre cada cadeia, em que a sequência do RNA de cadeia dupla é substancialmente idêntica a (vide acima) uma porção de um mRNA ou transcripto de um ácido nucleico codificando CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Em exemplos particulares, o RNA de cadeia dupla contém cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos, por exemplo 20, 21, ou 22 nucleotídeos substancialmente idênticos a um ácido nucleico codificando CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Em exemplos adicionais, o RNA de cadeia dupla contém cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos 100% idênticos a um ácido nucleico codificando CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Deve ser notado que neste contexto "cerca de" refere-se a quantidades inteiras somente. Em um exemplo, "cerca de" 20 nucleotídeos refere-se a um nucleotídeo de 19 a 21 nucleotídeos de comprimento.
[00267] Com relação ao ressalto sobre o RNA de cadeia dupla, o comprimento do ressalto é independente entre as duas cadeias, em que o comprimento de um ressalto não é dependente do comprimento do ressalto sobre outra cadeia. Em exemplos específicos, o comprimento do ressalto 3' ou 5' é de 0 nucleotídeo sobre no mínimo uma cadeia, e em alguns casos é 0 nucleotídeo sobre ambas as cadeias (portanto, um dsRNA cego). Em outros exemplos, o comprimento do ressalto 3' ou 5' é de 1 nucleotídeo a 5 nucleotídeos sobre no mínimo uma cadeia. Mais particularmente, em alguns exemplos o comprimento do ressalto 3' ou 5' é de 2 nucleotídeos sobre no mínimo uma cadeia, ou 2 nucleotídeos sobre ambas as cadeias. Em exemplos particulares, a molécula de dsRNA tem ressaltos 3' de 2 nucleotídeos sobre ambas as cadeias.
[00268] Portanto, em uma modalidade de RNA proporcionado em particular, o RNA de cadeia dupla contém 20, 21, ou 22 nucleotídeos, e o comprimento do ressalto 3' é 2 nucleotídeos sobre ambas as cadeias. Em modalidades dos RNAs proporcionados aqui, neste requerimento de patente, o RNA de cadeia dupla contém cerca de 40 a 60% de adenina + uracila (AU) e cerca de 60 a 40% de guanina + citosina (GC). Mais particularmente, em exemplos específicos, o RNA de cadeia dupla contém cerca de 50% de AU e cerca de 50% de GC.
[00269] Também são descritos aqui, neste requerimento de patente, RNAs que incluem ainda no mínimo um ribonucleotídeo modificado, por exemplo, na cadeia de sentido do RNA de cadeia dupla. Em exemplos particulares, o ribonucleotídeo modificado está no ressalto 3' de no mínimo uma cadeia, ou mais particularmente no ressalto 3' da cadeia de sentido. É particularmente contemplado que exemplos de ribonucleotídeos modificados incluem ribonucleotídeos que incluem um marcador detectável (por exemplo, um fluoróforo, tal como rodamina ou FITC), um análogo nucleotídico de tiofosfato, um desoxinucleotídeo (considerado modificado porque a molécula de base é ácido ribonucleico), uma 2'-fluorouracila, uma 2'-aminouracila, uma 2'-aminocitidina, uma 4-tiouracila, uma 5-bromouracila, uma 5- iodouracila, uma 5-(3-aminoalil)-uracila, uma inosina, ou um análogo de 2'0-Me-nucleotídeo.
[00270] Moléculas antisense e de ribozima para CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 também são de utilidade no método descrito aqui, neste requerimento de patente. Ácidos nucleicos antisense são moléculas de DNA ou de RNA que são complementares a no mínimo uma porção de uma molécula de mRNA específica (Weintraub, Scientific American 262:40, 1990). Na célula, os ácidos nucleicos antisense hibridizam ao mRNA correspondente, formando uma molécula de cadeia dupla. Os ácidos nucleicos antisense interferem com a translação do mRNA, uma vez que a célula não vai traduzir um mRNA que tenha cadeia dupla. São preferenciais oligômeros antisense de cerca de 15 nucleotídeos, uma vez que são facilmente sintetizados e têm menos probabilidade de causar problemas do que moléculas maiores quando introduzidos dentro da célula alvo produzindo CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. O uso de métodos antisense para inibir a translação de genes in vitro é de conhecimento geral na arte (vide, por exemplo, Marcus- Sakura, Anal. Biochem. 172:289, 1988).
[00271] Um oligonucleotídeo antisense pode ter, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos de comprimento. Um ácido nucleico antisense pode ser construído usando síntese química e reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na arte. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico antisense pode ser sintetizada quimicamente usando nucleotídeos que ocorrem naturalmente ou nucleotídeos modificados variadamente projetados para aumentar a estabilidade biológica da moléculas ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre os ácidos nucleicos antisense e de sentido, tais como derivados de fosforotioato e podem ser usados nucleotídeos substituídos com acridina. Exemplos de nucleotídeos modificados os quais podem ser usados para gerar o ácido nucleico antisense incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5- clorouracila, 5-iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracila, diidrouracila, beta-D-galactosilqueosina, inosina, entre outros.
[00272] O uso de um oligonucleotídeo para transcrição de estol (stall) é conhecido como a estratégia triplex uma vez que o bloomer se enrola em torno de DNA duplo helicoidal, formando uma hélice de três cadeias. Portanto, estes compostos triplex podem ser projetados para reconhecer um único sítio sobre um gene escolhido (Maher, ,et al., Antisense Res. and Dev. 1(3):227, 1991; Helene, C, Anticancer Drug Design 6(6):569), 1991. Este tipo de oligonucleotídeo inibidor também é de utilidade nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[00273] Ribozimas, as quais são moléculas de RNA que possuem a capacidade de clivar especificamente outro RNA de cadeia única em uma maneira análoga a endonucleases de restrição de DNA, também são de utilidade. Através da modificação de sequências de nucleotídeos as quais codificam estes RNAs, é possível produzir moléculas que reconhecem sequências de nucleotídeos específicas em uma molécula de RNA e clivar a mesma (Cech, /. Amer. Med. Assn. 260:3030, 1988). Uma importante vantagem desta abordagem é que, como são sequência- específicas, somente são inativados mRNAs com sequências particulares.
[00274] Existem dois tipos básicos de ribozimas, a saber, do tipo tetrahymena, (Hasselhoff, Nature 334:585, 1988) e do tipo "cabeça de martelo". Ribozimas do tipo tetrahymena reconhecem sequências as quais têm quatro bases de comprimento, ao passo que ribozimas do tipo "cabeça de martelo" reconhecem sequências de bases de 11 a 18 bases de comprimento. Quanto mais longa a seqüência de reconhecimento, maior a probabilidade de que a sequência venha a ocorrer exclusivamente na espécie de mRNA alvo. Consequentemente, ribozimas do tipo cabeça de martelo são preferenciais às ribozimas do tipo tetrahymena para a inativação de uma espécie de mRNA específica e sequências de reconhecimento de 18 bases são preferenciais a sequências de reconhecimento mais curtas.
[00275] São conhecidos vários sistemas de liberação e podem ser usados para administrar os siRNAs e outras moléculas de ácido nucleico inibitórias como produtos terapêuticos. Os sistemas referidos incluem, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, nanopartículas, células recombinantes capazes de expressar a uma ou mais moléculas terapêuticas (vide, por exemplo, Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429, 1987), construção de um ácido nucleico terapêutico como parte de um vetor retroviral ou de outto vetor, e similar. C. Moléculas Pequenas
[00276] Antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2, e agonista de 4-1BB, incluem moléculas que são identificadas a partir de grandes bibliotecas tanto de extratos de produtos naturais quanto sintéticos (ou semi-sintéticos) ou de bibliotecas químicas de acordo com métodos conhecidos na arte. Os métodos de triagem que detectam diminuições na atividade de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 (tal como por detecção de morte celular para PD-1, PD-L1 e PD-L2) são úteis para a identificação de compostos de uma variedade de fontes para atividade. Os métodos de triagem que detectam aumentos na atividade de 4-IBB também são de utilidade para a identificação de compostos das fontes referidas. As triagens iniciais podem ser realizadas usando uma biblioteca diversa de compostos, uma variedade de outros compostos e bibliotecas de compostos. Portanto, podem ser identificadas moléculas que se ligam a moléculas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 que inibem a expressão de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 e moléculas que inibem a atividade de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Também podem ser identificadas moléculas que aumentam a expressão e/ou atividade de 4-IBB. Estas moléculas pequenas podem ser identificadas a partir de bibliotecas combinatoriais, de bibliotecas de produtos naturais, ou de outras bibliotecas de moléculas pequenas. Além disso, antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD- L1, e PD-L2, e agonistas de 4-IBB, podem ser identificados como compostos a partir de fontes comerciais, bem como análogos disponíveis comercialmente de inibidores identificados. Em algumas modalidades, a molécula pequena tem menos de 900 daltons, ou menos de 800 daltons.
[00277] A fonte precisa de compostos ou extratos de teste não é crucial para a identificação de antagonistas. Por conseguinte, antagonistas podem ser identificados a partir de virtualmente qualquer número de compostos ou extratos químicos. Exemplos de similares extratos ou compostos que podem ser antagonistas incluem, mas não estão limitados a, extratos à base de plantas, fúngicos, procarióticos ou de animais, caldos de fermentação, e compostos sintéticos, bem como modificação de compostos existentes. Também estão disponíveis numerosos métodos para produção aleatória ou síntese direcionada (por exemplo, semi-síntese ou síntese total) de qualquer número de compostos químicos, incluindo, mas não limitados a, compostos à base de sacarídeos, lipídeos, peptídeos, e ácidos nucléicos. Bibliotecas de compostos sintéticos estão disponíveis comercialmente na Brandon Associates (Merrimack, N.H.) e na Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Agonistas e antagonistas podem ser identificadas entre bibliotecas de compostos sintéticos que estão disponíveis comercialmente a partir de uma série de empresas incluindo Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), Comgenex (Princeton, N. J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.), e Microsource (New Milford, Conn.). Antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, e PD-L2, ou agonistas de 4-1BB, podem ser identificados entre uma rara biblioteca química, tal como a biblioteca que está disponível na Aldrich (Milwaukee, Wis.). Antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, e PD-L2, ou agonistas de 4-1BB, podem ser identificados em bibliotecas de compostos naturais sob a forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais, e animais estão disponíveis comercialmente a partir de uma série de fontes, incluindo Biotics (Sussex, Reino Unido), Xenova (Slough, Reino Unido), Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, Fla.), e PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Bibliotecas e compostos naturais e produzidos sinteticamente são prontamente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais.
[00278] Compostos úteis podem ser encontrados dentro de numerosas classes químicas, embora tipicamente sejam compostos orgânicos, incluindo compostos orgânicos pequenos. Compostos orgânicos pequenos têm um peso molecular de mais de 50 porém menos de cerca de 2.500 daltons, tal como menos de cerca de 750 ou menos de cerca de 350 daltons podem ser utilizados nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Classes de exemplo incluem heterociclos, peptídeos, sacarídeos, esteróides, e similares. Os compostos podem ser modificaddos para reforçar a eficácia, a estabilidade, a compatibilidade farmacêutica, e similares. Em várias modalidades, compostos de utilidade têm uma Kd para CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 de menos de 1 nM, menos de 10 nm, menos de 1 μΜ, menos de 10 μΜ, ou menos de 1 mM. D. Peptídeos Variantes
[00279] Também pode ser utilizada uma imunoadesina que se especificamente liga a CTLA-4 humano, a BTLA humano, a TIM-3 humano, a LAG3 humano, a PD-1 humano, a PD-L1 humano, ou a PD-L2 humano. Uma imunoadesina é uma proteína de fusão contendo a porção extracelular ou uma porção de ligação de uma proteína fundida a uma região constante tal como uma região de Fc de uma molécula de imunoglobulina. Exemplos de moléculas de imunoadesão que se ligam especificamente a PD-1 são descritos na Publicação PCT de Patente Internacional Nos. WO2010/027827 e WO2011/066342, ambas incorporadas por meio de referência. Estas moléculas de imunoadesão incluem AMP-224 (também conhecida como B7-DCIg), a qual é uma proteína de fusão PD-L2-FC. Antagonistas de PD-1 adicionais que são proteínas de fusão são descritos, por exemplo, no Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2014/0227262, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.
[00280] Em uma modalidade, um antagonista de LAG3 de utilidade nos métodos descritos é IMP321, um LAG3 solúvel, o qual tem sido usado para ativar as células dendríticas. Em outra modalidade, um antagonista de TIM-3 de utilidade nos métodos descritos é CA-327 (Curis).
[00281] Um antagonista de CTLA-4 pode ser uma proteína dominante negativa ou algumas imunoadesinas, vide, por exemplo Requerimento de Patente Publicado U.S. No. 2016/0264643, incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Antagonistas anti-CTLA-4 adicionais incluem qualquer inibidor, incluindo mas não limitado a uma molécula pequena, que pode inibir a capacidade de CTLA-4 para se ligar a seu ligante cognato, romper a capacidade de B7 para CTLA-4, romper a capacidade de CD80 para se ligar a CTLA-4, romper a capacidade de CD86 para se ligar a CTLA-4.
[00282] Em uma modalidade, variantes de uma proteína CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 as quais funcionam como um antagonista podem ser identificadas por triagem de bibliotecas combinatoriais de mutantes, tais como mutantes de ponto ou mutantes de truncação, de uma proteína CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 para identificar proteínas com atividade antagonista. Em um exemplo, o antagonista é uma proteína solúvel.
[00283] Em modalidades adicionais, variantes de 4-IBB que funcionam como um agonista podem ser identificadas por triagem de bibliotecas combinatoriais de mutantes de 4-lBB, tal como mutação de ponto ou mutantes de truncação, para identificar uma proteína com atividade agonista. O agonista pode ser uma proteína solúvel.
[00284] Portanto, pode ser gerada uma biblioteca de variantes de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-lBB por mutagênese combinatorial no nível do ácido nucleico e é codificada por uma biblioteca genética variegada. Uma biblioteca de variantes de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4-1BB pode ser produzida, por exemplo, ligando enzimaticamente uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos dentro de sequências genéticas de tal modo que uma série degenerada de sequências potenciais seja expressível como polipeptídeos individuais, ou de forma alternativa,
como uma série de proteínas de fusão maiores (tais como para display de fago) contendo a série de sequências de interesse.
[00285] Exitem uma variedade de métodos, os quais podem ser usados para produzir bibliotecas de variantes potenciais de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD- 1, PD-L1, PD-L2 ou 4-IBB a partir de uma sequência de oligonucleotídeos degenerada. Pode ser realizada a síntese química de uma sequência genética degenerada em um sintetizador de DNA automático, e o gene sintético em seguida é ligado em um vetor de expressão apropriado. O uso de o conjunto degenerado de genes possibilita a provisão, em uma mistura, de todas as sequências codificando o conjunto desejado de sequências de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4-1BB potenciais. Métodos para a síntese de oligonucleotídeos degenerados são conhecidos na arte (vide, por exemplo, Narang, et al., Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura et al. Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura et al. Science 198:1056, 1984).
[00286] Além disso, bibliotecas de fragmentos de uma sequência codificante de proteína CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou 4- IBB podem ser usadas para gerar uma população de fragmentos para triagem e seleção subsequente de variantes de um antagonista especificado (ou agonista, no caso de 4-1BB). Em uma modalidade, uma biblioteca de fragmentos de sequências codificantes pode ser gerada tratando um fragmento de PCR de cadeia dupla de uma sequência codificante de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD- L1, PD-L2, ou 4-1BB com uma nuclease sob condições em que ocorre nicking (N.T.: entalhe) somente cerca de uma vez por molécula, desnaturando o DNA de cadeia dupla, renaturando o DNA para formar DNA de cadeia dupla o qual pode incluir pares de sentido/antisense de diferentes produtos entalhados (nicked), removendo porções de cadeia única de duplexes reformados por tratamento com S 1 nuclease, e ligando a biblioteca de fragmentos resultantes em um vetor de expressão. Por este método, pode ser derivada uma biblioteca de expressão a qual codifica N-terminal, C-terminal e fragmentos internos de vários tamanhos de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, ou 4-1BB.
[00287] Várias técnicas são conhecidas na arte para a triagem de produtos genéticos de bibliotecas combinatoriais produzidas por mutações de ponto ou truncação, e para a triagem de bibliotecas de cDNA para produtos genéticos tendo uma propriedade selecionada. As técnicas referidas são adaptáveis para rápida triagem das bibliotecas genéticas geradas pela mutagênese combinatorial de proteínas. As técnicas mais amplamente usadas, as quais são suscetíveis a análise de alta produtividade, para a triagem de grandes bibliotecas genéticas tipicamente incluem clonagem da biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, transformando células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante, e expressando os genes combinatoriais sob condições nas quais a detecção de uma atividade desejada facilita o isolamento do vetor codificando o gene cujo produto foi detectado. Pode ser usada mutagênese de conjunto recursiva (REM) em combinação com os testes de triagem para identificar antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2, ou um agonista de 4-lBB (Arkin e Youvan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811 7815, 1992; Delagrave et al., Protein Eng. 6(3):327 331, 1993).
[00288] Em uma modalidade, ensaios celulares podem ser explorados para analisar uma biblioteca de variantes de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Por exemplo, alguns vetores da biblioteca de expressão podem ser transfectados em uma linhagem celular, a qual sintetiza e secreta habitualmente CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. As células transfectadas são em seguida cultivadas de tal modo que CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1,
PD-L1, ou PD-L2 e uma variante de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD- 1, PD-L1, ou PD-L2 (respectivamente) particular são secretados. O efeito da expressão do mutante sobre a atividade nas células ou nos sobrenadantes pode ser detectado, tal como por qualquer um de um ensaio funcional. DNA de plasmídeo pode ser em seguida recuperado das células em que a atividade endógena é inibida, e os clones individuais ainda caracterizados.
[00289] Peptidomiméticos também podem ser usados como antagonistas de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2. Análogos peptídicos são comumente usados na indústria farmacêutica como fármacos não-peptídicos com propriedades análogas às do peptídeo de modelo. Estes tipos de compostos não-peptídicos e são geralmente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computadorizada. Miméticos peptídicos que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. De modo geral, peptidomiméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo de paradigma (por exemplo, polipeptídeo que tenha uma atividade biológica de PD-1), mas tem uma ou mais ligações peptídicas opcionalmente substituídas por algumas ligações --CH2NH--, --CH2S--, --CH2--CH2--, --CH.=.CH-- (cis e trans), --COCH2--, -- CH(OH)CH2--, e --CH2SO--. Estas ligações peptídicas podem ser substituídas por métodos conhecidos na arte (vide, por exemplo, Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463 468, 1980; Hudson et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177 185, 1979; Spatola, Life Sci. 38:1243 1249, 1986; Holladay, et al. Tetrahedron Lett. 24:4401 4404, 1983). Peptidomiméticos podem ser adquiridos econômicos, ser estáveis, e podem ter aumento da have-life ou da absorção. A marcação de peptidomiméticos geralmente envolve anexação covalente de um ou mais marcadores, diretamente ou através de um espaçador (tal como por um grupo de amida), a uma ou mais posições não interferentes sobre o peptidomimético que sejam previstas por dados quantitativos de estrutura-atividade e/ou modelagem molecular. As posições não interferentes referidas geralmente são posições que não formam contatos diretos com a uma ou mais macromoléculas às quais o peptidomimético se liga para produzir o efeito terapêutico. A derivação de peptidomiméticos não deve interferir substancialmente com a atividade biológica ou farmacológica desejada do peptidomimético.
[00290] Também pode ser usada uma proteína dominante negativa ou um ácido nucleico codificando uma proteína dominante negativa que interfere com a atividade biológica de CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, ou PD-L2 nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. Uma proteína dominante negativa é qualquer molécula de aminoácido tendo uma sequência que tenha no mínimo 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mesmo 99% de identidade de sequência para no mínimo 10, 20, 35, 50, 100, ou mais de 150 aminoácidos da proteína selvagem à qual corresponde a proteína dominante negativa. Por exemplo, uma PD-L1 dominante negativa tem mutação de tal modo que liga PD-1 mais firmemente do que PD-1 nativa (selvagem), mas não ativa qualquer sinalização celular através de PD-1.
[00291] A proteína dominante negativa pode ser administrada como um vetor de expressão. O vetor de expressão pode ser um vetor não- viral ou um vetor viral (por exemplo, retrovírus, vírus adeno-associado recombinante, ou um vetor adenoviral recombinante). De forma alternativa, a proteína dominante negativa pode ser administrada diretamente como uma proteína recombinante sistemicamente ou à área infectada usando, por exemplo, técnicas de microinjeção.
[00292] Antagonistas de polipeptídeos podem ser produzidos em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas por expressão de polinucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos, freqüentemente como parte de um polipeptídeo maior (uma proteína de fusão, tal como com ras ou uma enzima). De forma alternativa, os peptídeos referidos podem ser sintetizados por métodos químicos. Métodos para expressão de proteínas heterólogas em hospedeiros recombinantes, síntese química de polipeptídeos, e tradução in vitro são de conhecimento geral na arte (vide Maniatis el al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Kaiser et al., Science 243: 187, 1989; Merrifield, Science 232:342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57:957, 1988).
[00293] Peptídeos podem ser produzidos, tal como por síntese química direta, e usados como antagonistas.
[00294] Peptídeos podem ser produzidos como peptídeos modificados, com porções não peptídicas anexadas por ligação covalente ao término amino e/ou ao término carbóxi. Em determinadas modalidades preferenciais, ou o término carbóxi ou o término amino, ou ambos, são modificados quimicamente. As modificações mais comuns dos grupos de terminal amino e carboxila são acetilação e amidação, respectivamente. Modificações de terminal amino tais como acilação (por exemplo, acetilação) ou alquilação (por exemplo, metilação) e modificações de terminal carbóxi, tais como amidação, bem como outras modificações de terminal, incluindo ciclização, podem ser incorporadas em várias modalidades. Algumas modificações de terminal amino e/ou de terminal carbóxi e/ou extensões peptídicas à seqüência de núcleo podem proporcionar vantajosas propriedades físicas, químicas, bioquímicas, e farmacológicas, tais como: aumento da estabilidade, aumento da potência e/ou eficácia, resistência a proteases séricas, propriedades farmacocinéticas desejáveis, e outras.
[00295] A invenção é ilustrada pelos exemplos não limitantes que se seguem.
EXEMPLOS Exemplo 1 Materiais e Métodos
[00296] Amostras de sangue de doadores saudáveis e amostra de sangue e tecido de pacientes: Amostras de sangue periférico, de linfonodos não envolvidos, de linfonodos metastáticos e de tumores foram obtidas de indivíduos com HNSCC, melanoma, câncer de colon, câncer retal, câncer de pulmão, metástase hepática colorretal e câncer de ovário. Todos os sujeitos assinaram o consentimento informado por escrito aprovado pelo Comitê de Revisão Institucional do instituto (Institutional Review Board, Providence Portland Medical Center, IRB).
[00297] No momento da coleta das amostras, os pacientes não estavam sendo submetidos a terapia. Previamente, tinham sido submetidos a uma ampla gama de terapias, incluindo quimioterapia, radioterapia, cirurgia e imunoterapia, ou nenhuma das acima.
[00298] Células mononucleares do sangue periférico foram purificadas a partir do sangue total sobre gradiente Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) e criopreservadas antes da análise.
[00299] As amostras tumorais foram preparadas como se segue: Em resumo, sob condições estéreis, os tumores foram cortados em pedaços pequenos e digeridos em meio RPMI-1640 suplementado com Hialuronidase a 0,5 mg/ml, Colagenase a 1 mg/ml (ambas da Sigma-Aldrich), DNase a 30 U/ml (Roche) bem como albumina sérica humana (MP Biomedicals) em uma concentração final de 1,5%. As células foram digeridas por 1 hora em temperatura ambiente sob agitação com uma barra de agitação magnética. As suspensões celulares foram filtradas através de um filtro de 70μm. Os linfócitos infiltrantes no tumor foram enriquecidos conforme descrito acima por centrifugação de densidade Ficoll-Paque PLUS. As suspensões de células únicas tumorais foram criopreservadas até análise posterior.
[00300] Anticorpos e citometria de fluxo: Anticorpos marcados com fluorescente foram adquiridos dos seguintes fabricantes:
[00301] Biolegend: CD3 (UCHT1), CD4 (OKT-4 ou RPA-T4), CD8 (RPA-T8), CD25 (BC96), CD38 (HIT2), CD45RA (HIlOO), CD69 (FN50), HLA-DR (L243), CTLA-4 (BNI3), 4-lBB (4B4-1), CCR7 (G043H7), Granzyme B (GB11), IFN-g (4S.B3), TNF-a (Mabl l)
[00302] BD Bioscience: CD27 (M-T271), CD127 (HIL-7R-M21), PD- 1 (EH12), Ki-67 (B56),
[00303] eBioscience: CD28 (CD28.2), CD39 (eBioAl), CD103 (Ber- ACT8 e B-Ly7), FOXP3 (PCH101), ICOS (ISA-3)
[00304] R&D: TIM-3 (344823)
[00305] Um corante de células vivas/mortas fixável foi usado para distinguir células viáveis (Biolegend). Foi realizada coloração da superfície celular em tampão FACS (PBS, suplementado com 1% de FBS e 0,01% de NaN3). Foi realizada coloração intracelular usando o kit Fix/Perm da eBioscience de acordo com as instruções do fabricante. De modo a analisar a produção de citocinas pelas células mononucleares do sangue periférico e TIL ex vivo, as células foram estimuladas por 5 horas com PMA (0,2 μΜ) e lonomicina (1 μg/ml), com BFA (10 μg/ml) presente pelas últimas duas horas e meia (2 ½ horas). Foi realizada coloração de citocinas intracelulares usando o kit CytoFix/CytoPerm da BD Bioscience de acordo com as instruções do fabricante. As células coradas foram adquiridas em um LSRII e citômetro de fluxo Fortessa, ou no FACS Ariall (todos da BD), para classificação celular. Os dados foram analisados com o software Flow Jo (Treestar).
[00306] Classificação celular e expansão de linfócitos T: PBMC e
TIL criopreservados foram degelados e enriquecidos para linfócitos T usando o kit de enriquecimento de linfócitos T da Stemcell. Para enriquecimento de TIL, contas Epcam (StemCell) foram adicionadas ao coquetel. As frações enriquecidas foram em seguida marcadas e as populações de interesse foram purificadas depois de classificação celular até 99% de pureza em um FACS Ariall (BD).
[00307] Para análise de sequenciamento de TCR, péletes celulares foram congelados até processamento posterior.
[00308] Para expansão de TIL DN CD8+, SP CD8+ e DP CD8+ bem como CD8 naive e de memória de PBMC, linfócitos T foram classificados e cultivados em meio RPMI-1640 completo, suplementado com 2 mM de glutamina, 1% (vol/vol) de aminoácidos não essenciais, 1% (vol/vol) de piruvato de sódio, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 ug/ml) e 10% de soro fetal bovino (Hyclone). Os linfócitos T (a partir de 2000 a 5000 células/cavidade) foram estimulados policlonalmente com 1 μg/ml de PHA (Sigma) na presença de células alimentadoras alogênicas irradiadas (4000 rad) (2x105 células/cavidade) e 10 ng/ml de rh IL-15 (Biolegend) em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades (Corning/Costar). Depois de 1 semana, assim que se formaram aglomerados de linfócitos T, as células foram divididas em uma placa adicional de 96 células em meio completo com IL-15, o que foi repetido novamente depois de 2 dias, resultando em 4 replicatas idênticas. As quatro replicatas foram em seguida reunidas em uma cavidade de uma placa de 24 cavidades no dia 12. As linhagens de linfócitos T foram mantidas até a análise.
[00309] Aquisição de dados de microarray: Amostras para micro matriz foram processadas em uma maneira similar a análise de fluxo. A digestão do tumor foi completada em um tubo cônico de 50 ml com uma barra de agitação magnética em temperatura ambiente por 1 hora com Colagenase a 1 mg/ml (Sigma, C-5138), hialuronidase a 0,5 mg/ml (Sigma, H-6254) em RPMI (Life Technologies, 11875-093) com 0,3% de albumina humana (MP Biomedicals 823051) e 30 u/ml de DNASE (Roche 04536282001). Depois de digestão, as amostras foram filtradas através de um filtro de 70 μm. Em seguida as amostras foram diluídas a 1:2 com meio RPMI e dispostas em camadas sobre Ficoll (GE, 17-1440-02) para enriquecer para linfócitos através de uma etapa de centrifugação. As células enriquecidas foram coradas para CD3, CD8, CD103, CD39 e classificadas usando um classificador celular BD FACSAria. As células classificadas foram lisadas e o RNA foi purificado usando o kit Direct-zol RNA miniprep (zymo research), em seguida o RNA foi transcrito reverso para cDNA e amplificado. O cDNA amplificado foi hibridizado sobre um chip genético Affymetrix Prime-View.
[00310] Análise de dados de microarray: Arquivos de CHP, produzidos pelo software Affymetrix GeneChip Command Console (AGCC) v. 3.1.1 e Affymetrix Expression Console v. 1.1 da matriz de expressão genética Affymetrix Primeview foram carregados usando o software BRB Array Tools, Versão 4.5.1 (disponível na internet, brb_nci.nih.gov/BRB-ArrayTools/), e anotados com seu tipo de amostra (isto é, DN, SP, DP). O módulo de controle de qualidade Affymetrix Quality Control foi rodado para determinar que os resultados da expressão estavam dentro das especificações (aplica o módulo BioConductor R: affy/affyQCReport). A expressão diferencial entre tipos de amostras foi determinada usando o módulo Class Comparison/Between Groups of Arrays BRBarray, usando um ajuste de limiar de significância de teste univariado (reporta quadrado mínimo e testes de Kolmogorov-Smirnov classificados pelo p-valor do teste univariado). O módulo Graphics/Visualization of Samples foi em seguida usado para produzir uma análise multidimensional (Multi- Dimensional Analysis) dos 3 grupos usando genes selecionados
(aplica o módulo BRBarray R: MDS.R).
[00311] Ativação de linfócitos T In vitro: Subgrupos de linfócitos T CD8 naive foram isolados por enriquecimento de linfócitos T CD8 magnético (Stemcell), marcados com anticorpos contra CD4, CD8, CD45RA e CCR7 e classificados. 1x105 linfócitos T naive foram cultivados com Dynabeads anti-CD3/CD28 (Life Technologies) em uma proporção de contas: linfócitos T de 1:2 na presença ou ausência de 2 ng/ml de rh TGFb-1 (R&D). Depois de 24 horas, as contas foram removidas por captura magnética para metade do experimento. A expressão de marcadores de ativação e de diferenciação foi avaliada nos dias 1, 2, 3, 4, 7 e 9.
[00312] Sequenciamento de TCR profundo de gene TCR VB e análise da clonalidade: Sequenciamento profundo das regiões variáveis V-J ou V-D-J de genes TCRb foi realizado sobre DNA genômico de populações de linfócitos T classificadas. DNA foi extraído de subgrupos de linfócitos T CD8 circulantes e residentes no tumor variando de 1x104-1x105 células (Kit DNeasy Blood and Tissue, Qiagen). As regiões de CDR3 de TCR foram seqüenciadas e mapeadas (ImmunoSEQ, Adaptive Biotech). A cobertura por amostra foi >10x. Somente dados de redisposições produtivas foram extraídos da plataforma do ImmunoSEQ Analyzer para análise posterior. A clonalidade dos diferentes subgrupos de linfócitos T foi avaliada por comparação de sequências de nucleotídeos dos 500 clones mais abundantes em cada subgrupo.
[00313] De modo a comparar a sobreposição de TCR Vβ (ou similaridade) de duas populações dadas, foi utilizado o índice de sobreposição de Morisita. O índice de similaridade de Morisita-Horn contabiliza ambos, o número de clonótipos comuns e a distribuição de tamanhos dos clonótipos, e é mais sensível aos tamanhos dos clonótipos dos clonótipos dominantes (ref. Venturi et al., J Immunologi
Meth, 2008).
[00314] Avaliação do reconhecimento de células alvo: Regulação positiva de 4-1BB e de CD25 e secreção de IFN-γ: A regulação positiva de 4-IBB e de CD25 bem como a liberação de IFN-γ foram usadas como medidas para avaliar o reconhecimento de células tumorais por linfócitos T CD8 autólogos expandidos. O experimento de cocultura foi realizado 17 a 20 dias depois do início da expansão. No dia anterior, os linfócitos T expandidos foram contados e privados de nutrientes de um dia para o outro em meio sem IL-15 para regular negativamente a expressão remanescente de 4-IBB e de CD25. Os linfócitos T CD8 expandidos (1x105) foram em seguida cultivados ou isolados ou com células tumorais (autólogas e alogênicas, proporção de linfócitos T:células alvo=10: 1). Em algumas condições, as células tumorais foram pré-incubadas com 30 ug/ml de anticorpo de bloqueio anti-MHC classe I (BD Bioscience, clone W6/32) por 3 horas antes de adicionar os linfócitos T. Como controle positivo, placas Nunc Maxisorp foram revestidas com anticorpo anti-CD3 (OKT3) e foram adicionados linfócitos T. Todas as condições foram laminadas em triplicata. Depois de 24 horas, os sobrenadantes foram colhidos e analisados por análise citométrica de matriz de contas (CBA). As células foram reunidas para cada condição e marcadas com um corante de viabilidade, seguido por coloração da superfície celular de CD39, CD103, CD25 e 4-IBB. As células foram analisadas por citometria de fluxo. Para a CBA, foi segtuido o protocolo do fabricante. Em particular, foram analisados IFN- γ e TNF-a.
[00315] Teste de destruição de células alvo vivas: Testes de destruição de células alvo mediada por linfócitos T foram realizados no Incucyte Zoom System alojado dentro de uma incubadora de células a 37°C/5% de CO2, com base no protocolo do fabricante (Essen Bioscience). De modo a avaliar a destruição por linfócitos T de células tumorais autólogas, 5000 a 10000 células tumorais (linhagens de células tumorais autólogas e alogênicas) foram semeadas em triplicata dentro de uma placa de fundo liso de 96 cavidades para atingir 10% de confluência. Subgrupos de linfócitos T autólogos expandidos foram contados e privados de nutrientes o.n. sem IL-15 exógena. Em seguida 1x105 linfócitos T forma cultivados com e sem células tumorais autólogas e alogênicas (proporção de linfócitos T:célulass tumorais=10:1). Em algumas condições, foi adicionado anticorpo anti- MHC classe I (BD Bioscience, clone W6/32). Em todas as condições, substrato NucView 488 Caspase 3/7 (Essen Bioscience) foi adicionado para monitorar a Caspase 3/7 ativa. As placas foram incubadas por 24 horas a 37 °C e foram capturadas quatro imagens de três replicatas experimentais a cada hora usando uma lente objetiva de 10X para visualizar a destruição de linfócitos T e a atividade de caspase 3/7 (fluorescência verde). O tempo de aquisição do canal verde foi de 400 ms. Para contraste de fase, foi obtida segmentação celular aplicando uma máscara de modo a excluir os menores linfócitos T. Foi aplicado um filtro de área para excluir objetos abaixo de 1000 µm2. Foi subtraído o ruído de fundo verde com o método Top-Hat de correção de não uniformidade do fundo com um raio de 20 μm e um limiar de 2 unidades corrigidas em verde. O sinal da fluorescência foi quantificado depois de aplicar a máscara ao experimento. A quantidade de destruição/apoptose de linfócitos T foi calculada pelo software Zoom proporcionado (Essen Bioscience).
[00316] Análise Estatística: Testes estatísticos foram realizados usando o software Prism (GraphPad, San Diego CA). A significância foi determinada por análise ANOVA one-way com correção de Tukey, conforme observado nas legendas das figuras. Exemplo 2 Resultados
[00317] A identificação de linfócitos T CD8 reativos com tumores é chave para avaliar o nível e a qualidade da resposta anti-tumoral em pacientes com câncer e para entender o modo de ação de novas estratégias de tratamento do câncer tais como imunoterapia.
Recentemente, linfócitos T CD8 reativos com tumores humanos foram identificados pela co-expressão de CD 103 e PD-1 em câncer de ovário seroso de alto grau (HGSC) e em câncer de pulmão de células não pequenas (NCLC). De modo a definir ainda suas propriedades e função, os linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor (TIL) foram classificados a partir de dois tumores de ovário humanos em subgrupos CD103 positivo e negativo e foi determinado seu perfil de expressão genética por microarray.
Para esta análise, foi enfocada atenção sobre moléculas da superfície celular expressas diferencialmente que podem ser facilmente detectadas por citometria de fluxo.
Uma das maiores diferenças observadas na comparação de matriz genética que cumpriu os critérios foi ENTPD1, um gene que codifica para CD39 e é encontrado sobre a superfície celular (Tabela 1). De modo a confirmar o resultado da matriz genética e a obter um melhor entendimento da diversidade dos linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor, linfócitos T CD8 isolados de um paciente com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (HNSCC) foram corados e gated sobre a população CD103+. Foram examinados CD39 e marcadores adicionais da superfície celular associados com ativação/exaustão bem como o estado de desenvolvimento.
A complexidade da análise simultânea de todos os marcadores de citometria de fluxo exigiu um método denominado t-SNE (incorporação estocástica de vizinhos distribuídos em t), amplamente usado para dados de citometria de massa.
De maneira interessante, alta expressão de CD39 sobre linfócitos T CD8 CD103+ se sobrepõs com altos níveis de expressão de PD-1 e CD69. De modo inverso, os linfócitos T CD8 CD103+ expressaram baixos níveis do IL-7R (CD 127) (Fig. 1A e IB), sugerindo um fenótipo de linfócitos T mais similar a efetores. Além do mais, a expressão combinada de CD103 e CD39 sobre linfócitos T CD8 resultou na identificação de três populações de células distintas, as quais incluem as CD103-CD39- (CD8 duplo negativo (DN)), CD103+ CD39- (CD8 único positivo (SP)) e CD103+ CD39+ (CD8 duplo positivo (DP)). Os linfócitos T CD8 DP foram detectados em freqüências relativamente elevadas em várias malignidades sólidas humanas incluindo HNSCC, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário e câncer retal (Fig. 1C), embora melanoma tenha tido a maior frequência destas células. Em contraste, os linfócitos T CD8 DP estavam presentes em frequências bastante baixas em um subgrupo de pacientes com HNSCC bem como na maioria dos pacientes com câncer de colon e metástase hepática colorretal (CRLM) (Fig. 1C e ID). De maneira surpreendente, TIL de um paciente com câncer de colon continham uma frequência muito elevada de linfócitos T CD8 DP. Este paciente foi diagnosticado com síndrome de Lynch, um distúrbio hereditário raro causado por mutações em genes de reparo de incompatibilidade levando a uma maior taxa de mutações. De maneira interessante, tumores com uma maior frequência de mutações têm uma maior probabilidade de ter grandes número de neoantígenos e os pacientes têm um melhor resultado para imunoterapia de bloqueio de ponto de controle conforme ilustrado por prolongada sobrevida livre de progressão (Le DT, N Engl J Med 2015; Snyder A, N Engl J Med 2014; Van Allen EM, Science 2015; Rizvi NA, Science 2015).
[00318] Em seguida foi examinado se os linfócitos T CD8 DP foram encontrados somente em sítios onde as células tumorais estavam presentes. De modo a abordar isto, foram analisados vários pacientes com HNSCC onde foi obtido acesso ao tumor primário, aos linfonodos metastáticos (LN), aos linfonodos não envolvidos e ao sangue periférico. Na Fig 1E são mostrados os resultados de um paciente representativo, onde a co-expressão de CD39 e CD103 por linfócitos T CD8 foi especificamente encontrada no tumor primário e nos linfonodos metastáticos, mas estava ausente ou presente em frequência muito baixa sobre linfócitos T CD8 no sangue periférico e nos linfonodos não envolvidos. De maneira importante, este perfil de expressão foi confirmado na maioria dos pacientes com HNSCC que foram analisados (Fig. 1F). Portanto, os resultados mostram que a expressão de CD39 sobre os linfócitos T CD8 CD103+ identifica uma população de linfócitos T CD8 especificamente induzida dentro do microambiente tumoral.
[00319] Para melhor entender a biologia dos linfócitos T CD8 DN, SP e DP, as três populações celulares foram classificadas diretamente ex vivo e seus perfis de expressão genética global foram determinados por microarray. Para esta análise, linfócitos T foram isolados de três HNSCC e de dois tumores de ovário. Uma comparação entre linfócitos T CD8 DP e DN identificou 372 genes expressos diferencialmente entre estas fuás populações celulares. Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis) e aglomeração hierárquica não supervisionada realizada sobre esta lista de genes selecionados descreveu que os linfócitos T CD8 DP e DN tinham perfis de mRNA distintos, ao passo que os linfócitos T CD8 SP apresentaram uma assinatura genética intermediária (Fig. 2A e B). Análise de Componentes Principais (Principal Component Analysis) e aglomeração hierárquica não supervisionada realizada sobre esta série de genes selecionados descreveu que o perfil de expressão genética foi específico do tipo celular e não foi segregado por paciente (Fig. 2A, 2B). Ao comparar transcriptos dos linfócitos T CD8 DP em relação aos linfócitos T CD8 DN, alguns dos maiores aumentos foram associados com um fenótipo ativado/esgotado tal como MKI67, TNFRSF9, CTLA-4, HAVCR2, e GZMB. Em contraste, os genes mais regulados negativamente nos linfócitos T CD8 DP em relação aos linfócitos T CD8 DN estavam envolvidos em padrões de recirculação de linfócitos T, tais como KLF2, CCR7, SELL, S1PR1, KLF2. Este perfil de expressão genética é reminiscente de uma assinatura de memória residente T (Fig. 2C). De maneira importante, o perfil de expressão para os mRNAs associados com ativação e recirculação foi consistente através de todos os cinco tumores (Fig. 2D). Portanto, os linfócitos T CD8 DP apresentam uma assinatura de expressão genética de células sofrendo estimulação e ativação acionadas por antígenos no tumor, a qual também pode resultar na perda de recirculação fora do tecido tumoral.
[00320] De modo a avaliar ainda as propriedades específicas dos linfócitos T CD8 que se inflitram no tumor, a expressão de marcadores de ativação e de diferenciação foi analisada no nível de proteínas por citometria de fluxo. Os linfócitos T CD8 DP expressaram maiores níveis de CD69 em comparação com linfócitos T CD8 SP ou DN (Fig. 3A). CD69 é uma molécula de ativação que é regulada positivamente depois de estimulação de linfócitos T e antagoniza o egresso dos tecidos mediado pelo receptor 1 de esfingosina 1-fosfato (S1PR1) (Mackay 2015; Skon 2013). Os linfócitos T CD8 DP também apresentaram menoes níeis de CCR7, IL7R (CD127) e CD28, indicativo de um fenótipo de memória efetora (ref). De maneira interessante, muito embora os linfócitos T CD8 DN e SP tenham expressado PD-1, os linfócitos T CD8 DP expressaram níveis significativamente maiores desta proteína (Fig. 3B). Além disso, CTLA- 4, e TIM-3 foram quase exclusivamente expressos dentro da população de linfócitos T CD8 DP. Consequentemente os linfócitos T CD8 DP apresentaram um fenótipo de memória efetora altamente ativada especialmente em comparação com os linfócitos T CD8 DN e SP. Além disso, a frequência aumentada de 4-1BB e Ki-67 dentro da população de linfócitos T CD8 DP sugeriu que estas células foram recentemente ativadas e proliferaram dentro do tumor, o que é indicativo de reconhecimento de antígeno cognato recente.
[00321] A função efetora dos linfócitos T CD8 DN, SP e DP foi avaliada diretamente ex vivo analisando sua produção de citocinas no nível celular único. Os linfócitos T CD8 DP tiveram uma menor frequência de células capazes de produzir IFN-γ e ou TNF-a em comparação com os linfócitos T CD8 DN e SP e foram obtidos resultados similares em seis pacientes com HNSCC (Fig. 3C, 3D). Em contraste, os linfócitos T CD8 DP tiveram um potencial citotóxico aumentado, conforme demonstrado por uma frequência significativamente maior de células positivas para granzima B (Fig. 3E).
[00322] Dado que os linfócitos T CD8 DP somente foram encontrados em locais onde as células tumorais estavam presentes, foram identificados os fatores responsáveis por este fenótipo em particular para melhor entender o desenvolvimento destas células. Foi estabelecido que o TGF-β dirige a expressão de CD 103 sobre os linfócitos T. O TGF-β é produzido dentro do microambiente tumoral e tem um papel importante na progressão do câncer através da indução da transição epitelial-mesenquimal levando ao aumento da motilidade e da invasão. Foi encontrada expressão de CD39 sobre linfócitos T CD8 cronicamente estimulados/esgotados em um modelo em camundongo de infecção crônica pelo LCMV bem como em pacientes com infecções crônicas por HCV e por HIV (Gupta PK, PLOS Pathogen 2015), corroborando um papel para estimulação de TCR sustentada em sua expressão. Portanto, foi analisada a cinética da regulação positiva de CD103 e de CD39 sobre linfócitos T CD8 naive depois da ocupação de TCR na presença ou ausência de TGF-β (Fig.
4 e dados suplementares). De modo a abordar a função da estimulação de TCR sustentada na expressão de CD39, os linfócitos T foram estimulados continuamente com contas de CD3/CD28 por 9 dias ou as contas foram removidas 24h depois da iniciação da cultura. Foi detectada expressão de CD39 dentro de 3 dias de cultura e sua expressão aumentou até o dia 9. CD103 foi regulado positivamente quando os linfócitos T foram estimulados na presença de TGF-β com mais de 80% de células positivas depois de 7 dias. Foi vista regulação positiva ótima de CD103 e CD39 somente depois de estimulação de TCR sustentada. De maneira importante, a falta de regulação positiva de CD39 na ausência de estimulação de TCR sustentada não foi devida a limitada ativação de linfócitos T uma vez que a expressão de outros marcadores de ativação, tais como PD-1, foi rapidamente induzida sobre as células (Fig. 4). Ao contrário da expressão de CD103, TGF-β não teve nenhum efeito sobre a expressão de CD39 no sistema de cultura in vitro. Portanto, a estimulação de TCR sustentada e TGF-β são os fatores necessários requeridos para promover a expressão de CD103 e CD39 sobre linfócitos T CD8. Portanto parece que os linfócitos T CD8 DP adquirem seu fenótipo depois de exposição repetida a seu antígeno cognato levando a sinalização de TCR crônica dentro do tumor em um ambiente rico em TGF- β.
[00323] Estes dados sugeriram que os linfócitos T CD8 DP reconhecem seus antígenos cognatos dentro do sítio tumoral. Se isto estiver correto, levaria à expansão seletiva de clonótipos de TCR dominantes, resultando em aumento da clonalidade em comparação com as outras populações de linfócitos T CD8. De modo a abordar isto, os clonótipos de TCR foram avaliados dentro das populações de linfócitos T CD8 DN, SP e DP bem como de linfócitos T CD8 de memória totais de sangue pareados e LN não envolvidos por sequenciamento da região CDR3 altamente variável dos genes TCRB.
Os linfócitos T CD8 DP foram mais oligoclonais em comparação com qualquer outra população de linfócitos T CD8 analisada (Fig. 5A). Os 30 clonótipos mais frequentes em cada paciente foram responsáveis por 56%, 61% e 66% da população de linfócitos T CD8 DP-porém somente 26% e 23% e 38% dos linfócitos T CD8 DN e menos de 20% dos linfócitos T CD8 periféricos de memória-em um tumor de HNSCC HPV+, um tumor de HNSCC HPV-, e um tumor de ovário, respectivamente.
Os 30 clonótipos de linfócitos T CD8 DP mais expandidos foram bem menos frequentes na população de linfócitos T CD8 DN, e representaram menos de 0,06% do repertório de linfócitos T CD8 DN para estes três pacientes.
De maneira interessante, houve muito poucos clonótipos de TCR partilhados entre os linfócitos T CD8 DP e os outros subgrupos linfócitos T CD8 infiltrantes no tumor (Fig. 5B). Em contraste, foi partilhado um maior número dos clonótipos de TCR entre os linfócitos T CD8 DN e os linfócitos T CD8 SP.
Conforme previsto pela assinatura da memória residente (Fig. 2D), A maior parte dos clonótipos de TCR presentes nos linfócitos T CD8 DN também foram partilhados com os linfócitos T CD8 de memória dentro dos LN não envolvidos com o tumor bem como com os linfócitos T CD8 de memória no sangue periférico (R2= 0,7710 e 0,2022, respectivamente), sugerindo que os linfócitos T CD8 DN foram capazes de recircular, potencialmente sensibilizando o ambiente tumoral sem em última análise reconhecer seu antígeno cognato (Fig. 5C). Em comparação, muito poucos clonótipos presentes dentro dos linfócitos T CD8 DP foram detectados nos LN não envolvidos ou no sangue periférico.
O cálcuo do índice de Morisita, um íncide de similaridade baseado na abundância que determina a sobreposição entre duas populações ainda corroborou nossos resultados e apresentou consistência desta descoberta através de amostras de 5 pacientes (Fig. 5D). Coletivamente, estes resultados sugerem que os linfócitos T CD8 DP encontram seu antígeno cognato dentro do sítio tumoral, o que resulta em sua ativação e expansão local de clones de linfócitos T e específicos para o tumor.
[00324] Se isto estiver correto, então os TIL CD8 DP vão ser enriquecidos para reatividade tumoral. Consequentemente foram geradas linhagens de células tumorais autólogas a partir de quatro tumores de melanoma e dois tumores de HNSCC e foi determinado se os TIL CD8 DP foram enriquecidos para reatividade e destruição tumorais. Os linfócitos T CD8 foram classificados diretamente a partir de digestões tumorais com base na expressão de CD103 e na expressão de CD39 e as três populações de linfócitos T CD8 foram expandidas in vitro. Depois da expansão, os TIL CD8 DN, SP e DP foram triados para reatividade contra linhagens de células tumorais autólogas conforme avaliado por regulação positiva de 4-IBB bem como secreção de IFN-γ. Em todos os seis pacientes testados foi visto que os linfócitos T CD8 DP foram altamente enriquecidos para reatividade tumoral em comparação com os TIL CD8 DN e SP (Fig 6A). O enriquecimento em TIL CD8 reativos ao tumor entre linfócitos T CD8 DP foi ilustrado por até 87% dos linfócitos T reativos na maior proporção de células tumorais para linfócitos T para o paciente 1. O reconhecimento de tumor autólogo foi específico e restrito a MHC classe I uma vez que não foi detectada nenhuma reatividade no subgrupo de TIL DP depois de bloqueio de MHC classe I ou quando as células foram cultivadas com uma linhagem de células tumorais alogênicas (Fig. 6B). De modo a abordar se os linfócitos T CD8 DP reativos ao tumor foram capazes de destruir células tumorais autólogas, os subgrupos de linfócitos T expandidos foram co- cultivados com células tumorais autólogas e monitorados para destruição específica do tumor usando o sistema de análise de células vivas Incucyte. Este sistema possibilita a visualização de apoptose dependente de caspase 3/7 por microscopia a 37°C em tempo real. De acordo com regulação positiva de 4-IBB, somente os linfócitos T CD8 DP destruíram células tumorais autólogas conforme ilustrado pelo número crescente de eventos caspase 3/7+ (Fig. 6C, 6D). Esta destruição foi dependente de MHC-classe I uma vez que o anticorpo MHC-classe I W6/32 bloqueou este efeito. Em contraste, houve pouca a nenhuma destruição de células tumorais autólogas observada pelos linfócitos T CD8 DN.
[00325] Finalmente, a relação entre a frequência de TIL CD8 DP e a sobrevida dos pacientes foi avaliada em amostras cirúrgicas. Esta análise foi focalizada sobre uma pequena coorte de pacientes com HNSCC (n=62). Depois de cirurgia, a frequência de linfócitos T CD8 DP entre o total de TIL CD8 foi determinada dentro de tumores primários por citometria de fluxo e os pacientes em seguida receberam tratamento(s) padrão de atendimento. Os pacientes foram segregados com base na frequência de linfócitos T CD8 DP, com um grupo elevado e um grupo baixo relativo à frequência média de linfócitos T CD8 DP para esta coorte. Usando esta estratégia, foi visto que os pacientes cujos tumores tinham uma maior percentagem de TIL CD8 DP no momento da cirurgia se correlacionaram com aumento da sobrevida total (OS) (Fig. 6E), os quais apresentaram maior significância no subgrupo HPV-negativo (Fig. 6F). Coletivamente, foi demonstrado que a coexpressão de CD103 e CD39 enriquece fortemente para TIL CD8 reativos ao tumor e sua frequência se correlacionou com um aumento na sobrevida total em pacientes com HNSCC.
[00326] Com base nestes resultados, foi abordado se os clonótipos de TCR presentes em altas frequências em TIL CD8 DP foram na verdade específicas do tumor. TIL CD8 DP foram cocultivados com células tumorais autólogas por 20 hóras, seguido por ordenação dos 4-
1BB+ linfócitos T CD8 CD25+. A maioria dos clonótipos presentes em alta frequência ex- vivo foram encontrados dentro da fração 4- 1BB+CD25+ de TIL CD8 DP quando estes linfócitos T foram co- cultivados com linhagens tumorais autólogas, demonstrando que foram reativos ao tumor (Fig. 7A. 7B). Os dados implicam que a utilização de TCRs da população de CD8 DP, vai ser terapêutica em uma situação de transferência adotiva. Digno de nota, foi observada uma forte sobreposição do repertório de TCR de TIL CD8 DP entre o tumor primário e LN metastáticos dentro do mesmo paciente, em duas amostras de HNSCC diferentes (Fig. 7C). Este resultado é significativo uma vez que sugere que o mesmo TCR de TIL CD8 DP pode ser isolado a partir de ou um LN metastático ou de um tumor primário e usado para terapia de TCR.
[00327] Em vista das muitas modalidades possíveis às quais podem ser aplicados os princípios da invenção descrita, deve ser reconhecido que as modalidades ilustradas são somente exemplos preferenciais da invenção e não devem ser tomadas como limitantes do âmbito da invenção. Ao invés, o âmbito da invenção é definido pelas reivindicações que se seguem. Portanto, reivindicamos como nossa invenção tudo o que esteja dentro do âmbito e do espírito destas reivindicações.

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de isolamento de um ácido nucleico codificando um receptor de linfócitos T (TCR) que se liga especificamente a um antígeno de célula tumoral, caracterizado pelo fato de que compreende: isolamento de linfócitos T CD39+ CD103+ CD8+ a partir de uma amostra de um indivíduo portador de um tumor expressando o antígeno de célula tumoral, e clonagem de uma molécula de ácido nucleico codificando um TCR dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, deste modo isolando a molécula de ácido nucleico codificando o TCR.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tumor é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é sangue periférico ou uma biópsia tumoral.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, aindacaracterizado pelo fato de que compreende ainda expansão dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ in vitro antes de clonagem do receptor de linfócitos T.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
6. Molécula de ácido nucleico caracterizada pelo fato de que codifica um TCR produzido pelo método de acordo com a reivindicação 1.
7. TCR caracterizado pelo fato de ser codificado por uma molécula de ácido nucleico codificando um TCR produzido pelo método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5.
8. Linfócito T hospedeiro isolado caracterizado pelo fato de ser transfectado com a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6.
9. Linfócito T hospedeiro de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o TCR é autólogo ao indivíduo.
10. Linfócito T hospedeiro isolado de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o TCR é alogênico ao indivíduo.
11. Método de tratamento de um indivíduo portador de um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, deste modo tratando o indivíduo com o tumor.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, aindacaracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista da proteína de morte celular programada (PD)-l, um antagonista do ligante da proteína de morte celular programada (PD- L1), um antagonista da Proteína Associada ao Linfócito T Citotóxico-4 (CTLA-4), um antagonista de Atenuadores de Linfócitos B e T (BTLA), antagonista de domínio contendo Mucina e Imunoglobulina de Célula T-3 (TIM-3), um antagonista do Gene 3 de Ativação de Linfócitos (LAG3), ou um agonista de 4-IBB ao indivíduo.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a) o antagonista de PD-1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD-1, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; b) o antagonista de PD-L1 é um anticorpo que se liga especificamente a PD-L1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; c) o antagonista de CTLA-4 é um anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; d) o antagonista de BTLA é um anticorpo que se liga especificamente a BTLA ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e) o antagonista de TIM-3 é um anticorpo que se liga especificamente a TIM-3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; e) o antagonista de LAG3 é um anticorpo que se liga especificamente a LAG3 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo que se liga especificamente a PD-1, o anticorpo que se liga especificamente a PD-L1, o anticorpo que se liga especificamente a CTLA-4, o anticorpo que se liga especificamente a BTLA, o anticorpo que se liga especificamente a TIM-3 ou o anticorpo que se liga especificamente a LAG3, é um anticorpo monoclonal humano ou um anticorpo monoclonal humanizado.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o antagonista de PD-1, o antagonista de PD-L1, o antagonista de CTLA-4, o antagonista de BTLA, o antagonista de TIM-3, ou o antagonista de LAG3, é um RNA inibidor pequeno, um RNA antisense, uma ribozima uma molécula pequena ou uma proteína dominante negativa.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor sólido.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizado pelo fato de que os linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ são autólogos.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 17, aindacaracterizado pelo fato de que compreende ainda a ressecção do tumor no indivíduo.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
21. Método de expansão de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+, caracterizado pelo fato de que compreende: cultura dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em um meio de cultura de tecido compreendendo glutamina, soro, e antibióticos para formar culturas primárias; estimulação das culturas primárias com uma quantidade eficaz de células alimentadoras irradiadas alogênicas e interleucina (IL)-15 para formar linfócitos T estimulados; e cultura dos linfócitos T estimulados em um meio de cultura de tecido e uma quantidade eficaz de IL-15; deste modo expansão dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende estimulação das culturas primárias em cerca de 5 ng/ml a cerca de 50 ng/ml de IL-15, e/ou cultura do aglomerado de linfócitos T em cerca de 5 ng/ml a cerca de 50 ng/ml de IL-15.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende estimulação das culturas primárias em cerca de 10 ng/ml de IL-15, e/ou cultura do aglomerado de linfócitos T em cerca de 10 ng/ml de IL-15.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a estimulação das culturas primárias com uma quantidade eficaz de células alimentadoras irradiadas alogênicas compreende a estimulação de cerca de 1.000 a cerca de 2.000 linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ com cerca de 100.000 a cerca de 300.000 células alimentadoras alogênicas.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de estimulação de cerca de 1.000 a cerca de
2.000 células CD39+ CD103+ CD8+ com cerca de 200.000 células alimentadoras alogênicas
26. Método de determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um inibidor de ponto de controle ou radiação, caracterizado pelo fato de que compreende: detecção da presença de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo, em que a presença dos linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica indica que o inibidor de ponto de controle ou radiação vai ser eficaz para tratamento do tumor no indivíduo.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, aindacaracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração do inibidor de ponto de controle ou radiação ao indivíduo.
28. Método para determinar se um indivíduo portador de um tumor vai responder a um terapêutico contra o agente cancerígeno, caracterizado pelo fato de que compreende: administração ao indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o agente cancerígeno, e determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo,
em que um aumento no número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o agente cancerígeno é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo.
29. Método para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende: administração a um indivíduo de uma primeira dose do terapêutico contra o agente cancerígeno, e determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo, em que um aumento na quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o agente cancerígeno é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo, e administração de uma segunda dose do terapêutico contra o agente cancerígeno, em que a primeira dose é a mesma que a segunda dose, ou em que a segunda dose é menor do que a primeira dose.
30. Método para o tratamento de um indivíduo portador de um tumor, caracterizado pelo fato de que compreende: administração ao indivíduo de uma primeira dose de um terapêutico contra o agente cancerígeno, e determinação do número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica do indivíduo, em que uma diminuição ou nenhuma alteração na quantidade de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ na amostra biológica em comparação com um controle indica que a primeira dose do terapêutico contra o agente cancerígeno não é eficaz para tratamento do tumor no indivíduo, e administração de uma segunda dose do terapêutico contra o câncer, em que a segunda dose é maior do que a primeira dose, ou em que a segunda dose é a mesma que a primeira dose.
31. Método de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o controle é o número de linfócitos T CD8+ CD39+ CD103+ em uma amostra biológica obtida do indivíduo antes de tratamento com o terapêutico contra o agente cancerígeno, ou em que o controle é um valor padrão.
32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo fato de que o terapêutico contra o agente cancerígeno é um inibidor de ponto de controle.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que o terapêutico contra o agente cancerígeno é um agente quimioterápico.
34. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 33, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ponto de controle é um antagonista da proteína de morte celular programada (PD)-l, um antagonista do ligante da proteína de morte celular programada (PD- L)-l, um antagonista da Proteína Associada ao Linfócito T Citotóxico -4 (CTLA-4), um antagonista de Atenuadores de Linfócitos B e T (BTLA), antagonista de domínio contendo Mucina e Imunoglobulina de Célula T-3 (TIM-3), um antagonista do Gene 3 de Ativação de Linfócitos (LAG3), ou um agonista de 4-IBB ao indivíduo.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 34, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue periférico ou uma biópsia tumoral.
36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 35, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 36, caracterizado pelo fato de que o tumor é um tumor sólido.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o tumor sólido é um carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, melanoma, câncer de ovário, carcinoma de células renais, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer de fígado, câncer de próstata, câncer de mama, glioblastoma ou câncer retal.
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