CN1221349A - 细胞疫苗、免疫治疗以及它们的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高弱免疫原性或无免疫原性细胞的免疫原性的方法,得到能够激活T细胞并继而引起有效的免疫反应的细胞性疫苗。利用本发明获得的细胞疫苗,可以用于预防和治疗某些疾病,这些疾病的发生或/和进展是由于逃避了激活T细胞引发的免疫反应而引起的。例如,这些疾病中包括所有的恶性肿瘤,先天、后天的免疫缺陷性疾病,以及由各种病原体引起的感染性疾病。

Description

细胞疫苗、免疫治疗以及它们的制备方法
相关申请
本申请要求获得受益于下列美国临时申请的优先权：申请号60/019,639，1996年6月12日备案。
本发明的技术领域
本发明提供一种增强无免疫原性或弱免疫原性的细胞的免疫原性的方法，为的是向免疫系统提供激活T淋巴细胞并引起有效的免疫反应的免疫原性信号。本发明的方法产生细胞疫苗，可以用于预防和治疗某些疾病，这些疾病的发生或/和进展是由于逃避了激活T细胞引发的免疫反应而引起的。例如，这些疾病中包括所有的恶性肿瘤，先天、后天的免疫缺陷性疾病，以及由各种病原体引起的感染性疾病。
本发明的背景技术
Hanna等(美国专利号5,484,596)描述了利用肿瘤组织作为疫苗。Honsik等(美国专利号4,844,893)描述了将抗肿瘤细胞抗原的抗体加载于IL-2-激活的白细胞上，用于杀伤靶细胞。这两篇专利均通过在此引述而全文合并于本文。
抗肿瘤免疫反应主要由T淋巴细胞所介导。的主要的组织相容性复合物(MHC)和对共刺激免疫反应的分子调节的降低，均是与以肿瘤细胞作为信号的T细胞激活的缺陷相关的(Luboldt等，Cancer Res.56:826-830,1996；L.Chen等，Cell,1:1093,1992；P.S.Linsley,J.A.Ledbetter,Ann.Rev.Immunol.,11:191,1993；G.J.Freeman等，Science,262:909,1993；C.H.June等，Immuno.Today,15:321,1994；J.T.Gerge等，Cancer Res.,53:2374,1993；Ostrand-Rosenberg,S.Curr.Opin.Immune.,6:772,1993；B.E.Elliot等，Adv.Cancer Res.,53:181,1989)。
识别结合了MHC的抗原的T细胞抗原受体(TCR)，还不是激活T细胞的充分的信号。共刺激分子，例如B7-1和B7-2分子，是存在有抗原的细胞(APCs)的表面蛋白，它们和以免疫系统为靶标的其它的细胞对T细胞的激活提供关键信号(参见L.Chen等Immunol.Rev.,145:123,1995；T.Tykocinski等，Am.J.Path.,148:1,1996)。B7分子通过T淋巴细胞表面的CD28分子所提供的信号看起来是T细胞激活的主要的共刺激方式。不过，晚些的研究显示，共刺激的机理较以往所理解的更为复杂，还有细胞因子、粘附分子的参与。(参见G.Yang等，J.Immune.,154:2794,1995；M.Kubin等，J.Exp.Med.,180:211,1994；Y.Li等，J.Exp.Med.,183:639,1996)。
已有许多方法用于提高肿瘤细胞的免疫原性(见本节所引述的众多参考文献)。大多数目前所研究的方法需要进行基因转染。具体地说，目前绝大多数方法需要体外或体内向肿瘤细胞转染例如MHC、B7等基因，或利用带有抗原的细胞(APCs)修饰肿瘤细胞(Y.J.Guo等，Science,263:518,1994；M.Tykocinski,A.J.Path.,148:1,1996；J.Young and K.Inaba,J.Exp.Med.,183:7,1996；L.Zitvogel等，J.Exp.Med.183:87,1996；C.M.Celluzzi等,J.Exp.Med.,183:283,1996)。由于对原代肿瘤细胞的转染效率低下，或由于需要使用大量的APCs，致使这些方案耗时较多且可靠性较差。
利用细胞因子体外处理肿瘤细胞，可以提高MHC分子和一些粘附分子的表达(R.Mattson et al.,1992,Biol-Reprod 46:1176；R.J.Ulevitch et al.,1991,Am.J.Pathol.139:287；F.Willems et al.,1994,Eur.J.Immune.24:1007；I.Saito et al.,1993,J.Clin.Lab.Anal.7:180；R.A.Panettieri et al.,1994,J.Immune.154:1358；M.Ikeda et al.,1994,J.Invest.Dermatol.103:791)。向肿瘤细胞内转染MHC、B7-1或B7-2基因，可以使低免疫原性的肿瘤细胞系转变为高免疫原性的肿瘤细胞系(S.E.Townsend and J.P.Allison,Science 259:368；J.P.Allison et al.,1995,Curr.Opin.Immune.7:682；G.Yang et al.,1995,J.Immune.154:2794；M.Kubin et al.,1994,J.Exp.Med.180:211)。向无免疫原性的肿瘤细胞转染B7基因，不能改变其免疫原性，但是若同时共转染另一细胞表面分子CD48的基因，则可使其具备免疫原性(Y.Lietal.,1996,J.Exp.Med.183:639)。
某些情况下，共刺激分子B7可以通过结合CTLA-4这种在T细胞表面上的对B7的第二级受体而传递负性的信号。体外实验显示，与CTLA-4的交联可以抑制T细胞的增殖。进一步的实验表明，CTLA-4基因缺失的小鼠可发生严重的T细胞过度增殖性疾病(K.Kawai et al.,1993,Science 261:609；J.P.Allison,M.K.Krummel,1995,Science 270:932；J.M.Green et al.,1994,Immunity1:501)。最近，有报道显示，在部分小鼠的肿瘤模型中，体内注射抗CTLA-4的单克隆抗体以阻断CTLA-4调控的信号，可增强依赖T细胞的抗肿瘤免疫反应(D.R.Leach et al.,1996,Science 271:1734)。这些数据提供了这样的证据，即CTLA-4对CD28共刺激信号可以是反向调控的。因此，表达B7分子的转染肿瘤细胞可以CTLA-4调控的负信号而无法产生所期望的抗肿瘤免疫反应。
除上述的利用转染B7基因而激活T细胞的方法之外，也有报道在某些场合下，利用双特异性单克隆抗体(bispecificmonoclonal antibodies,Bi-MAbs)，与预先刺激的淋巴细胞合用，以诱导T细胞的激活。例如，有一个报道为先用CD3:CD30双特异性单克隆抗体(CD30为Hodgkin’s淋巴瘤的肿瘤相关抗原)与CD30+Hodkin’s淋巴瘤细胞预先刺激外周血淋巴细胞(PBLs)，然后再以CD28:CD30 Bi-MAbs和CD3:CD30 Bi-MAbs共同处理这些淋巴细胞，可以造成共刺激作用。然而，只有CD28:CD30和CD3:CD30 Bi-MAbs的联合应用，并不能诱导人静息PBLs产生明显的针对Hodgkin’s淋巴瘤细胞系的体外杀伤活性；CD28:CD30 Bi-MAbs单独刺激亦无效(C.Renner et al.,1994,Science 264:833)。同样，只有先用CD30+细胞、CD3:CD30Bi-MAb预先刺激PBLs，然后再用上述两种Bi-MAbs共同刺激这种PBLs，才可能产生体内生长的Hodgkin’s衍生的淋巴瘤的消退；而单独使用两种Bi-MAbs中的任何一种，以及同时使用这两种Bi-MAbs但不使用预刺激的PBLs，均不能产生显著的效应(Renner et al，同上)。
本发明的概述
本发明的特征是提供了具有免疫原性的肿瘤细胞以及其它的自体免疫原性细胞，制备这些免疫原性细胞的简便的方法，利用这些具有免疫原性的细胞激活或增强针对病变细胞的免疫反应并对正常或健康细胞造成很小的影响的方法，以及避免对T淋巴细胞产生负性信号传递的方法。
本发明提供了一种提高无免疫原性或弱免疫原性细胞的免疫原性的方法，由此制备的细胞疫苗可激活T细胞，进而引发针对疾病细胞的有效的免疫反应。利用本发明制备的细胞疫苗可以用于疾病的预防和治疗。
归纳起来，本发明的方法包括的步骤是(1)处理弱或无免疫原性自体细胞(靶细胞)以在细胞内增强激活T细胞的一级信号和共刺激信号；(2)将可以结合被处理的靶细胞的一种或多种抗原以及同时又可以结合T细胞表面的一种或几种共刺激分子(例如CD28分子)的物质加在被处理的细胞上，由此使被处理的细胞具有与T细胞物理性结合和激活共刺激信号的能力。这种物质包括但不限于：针对被处理细胞表面抗原和CD28或/和其它T细胞共刺激分子的双特异性单克隆抗体(Bi-MAbs)。当自体细胞结合了(1)具有二个或二个以上的T细胞表面上的T细胞激活共刺激分子结合位点的桥联分子，或(2)二个或二个以上的每个具有一个或一个以上的T细胞表面上的T细胞激活共刺激分子结合位点的桥联分子时，则步骤(1)可被省略。
利用细胞因子或其它方法处理致病性的靶细胞，使其激活T细胞所需的一级信号和/或共刺激信号的表达提高，然后再将桥联分子与其结合，一旦这两步骤完成后，在将细胞疫苗注射给患者之前，可以将未与细胞结合的细胞因子和桥联分子等成分从免疫原性的组合物中分离出去。这一额外的步骤是为了减少细胞因子进入人体可能产生的副作用，以及减少未结合的桥联分子进入人体而可能引起的针对正常或健康细胞的不利免疫反应的危险性。
上述方法的第一个步骤是在受处理细胞内上调抗原的处理能力，以及增强T细胞激活所涉及的细胞表面分子的表达。第二个步骤是为被处理的细胞提供与T细胞表面的CD28分子或/和其它共刺激分子的物理性桥联的能力，从而获得刺激T细胞活化的最优条件。
因此，本发明的第一个方面提供了为体内含有病变靶细胞的患病哺乳动物(包括人类)使用的具有免疫原性的组合物。这种免疫原性组合物包括自体病变靶细胞，它不同于患者体内的一般的病变靶细胞，即其对病变细胞的特征性抗原的加工和提呈能力更为有效。例如，自体病变靶细胞可以表达一个或多个激活T细胞所需的一级信号(如MHC分子)和/或多个共刺激信号(如B7-1、B7-2)，而且表达水平更高(如，高出50％、优选2倍，更优选10倍以上)。如下面所述，增强T细胞激活所需的一级信号或/和共刺激信号的表达水平的方法可以有不同形式。
另外，自体病变靶细胞还结合有一个或多个桥联分子。每个桥联分子有一个或一个以上的与一种或一种以上的效应细胞表面的共刺激分子结合的位点，这些效应细胞包括但不局限于下列细胞：T细胞、NK细胞、巨噬细胞、LAK细胞、B细胞，以及其它白细胞。虽然不是必须的，但这些桥联分子最好含有一个或一个以上的与一个或一个以上的病变靶细胞表面抗原分子结合的位点，从而能够与该病变靶细胞在表面抗原处发生结合。在另一个优选的实施方案中，在具有免疫原性的组合物中的大部分(例如至少＞80％，优选＞90％，更优选＞95％)桥联分子都与病变靶细胞结合，致使该组合物中基本上不含有未与病变靶细胞结合的游离桥联分子。在更为优选的实施方案中，具有免疫原性组合物含有药理学有效剂量的结合了桥联分子的病变靶细胞。
“具有免疫原性”这一词的定义是：具有激活哺乳动物的全部或部分免疫系统的能力，尤其是指T淋巴细胞的反应。
“自体”这一词的定义是：病变靶细胞来自相同的患病哺乳动物个体，或来自具有相同的主要组织相容性复合物表型的其它个体。一个自体靶细胞可以由患病的哺乳动物体内或其它具有同样的MHC表型的个体体内，用本领域技术人员所熟知的方法获取。
“病变靶细胞”一词的定义是：在患病的哺乳动物体内，所有引起、传播、加重某种疾病的细胞以及相关的细胞。治病性靶细胞包括，但不局限于下列细胞：肿瘤细胞(包括未经修饰的肿瘤细胞和用各种方法处理的肿瘤细胞，包括原代培养的肿瘤细胞)。上述肿瘤细胞的来源包括但不局限于：肝癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、头颈部癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、脑肿瘤、骨肉瘤、胆囊癌、骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、以及胰腺癌。
病变靶细胞还可能是感染了脘病毒(prion)(其引起疯牛病的疾病)、病毒、细菌、霉菌、原生物或其它寄生虫的细胞。
病毒包括所有在Fields of Virology(Raven Press,New York,1990，第2版，在此通过引述而合并于本文)中描述和提及的种类。例如，这些病毒包括但不局限为：疱疹病毒、鼻病毒、肝炎病毒(包括A、B、C和D型)、HIV、EBV、HPV，以及HLV。
细菌包括所有在Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology(Williams and Wilkins,1994，第9版，在此通过引述而合并于本文)中所描述或提及的种类。例如包括但不局限为：革兰氏阳性、革兰氏阴性菌，Streptococci(链球菌)，pseudomonasand enterococci(假单胞菌，肠球菌)，Mycobacteriumtuberculosis(结核杆菌)，Aeromonas hydrophilia,Aeromonas caviae,Aeromonas sobria,Streptococcus uberis,Enterococcus faecium,Enterococcus faecalis,Bacillus sphaericus,Pseudomonasfluorescens,Pseudomonas putida,Serratia liquefaciens,Lactococcus lactis,Xanthomonas maltophilia,Staphylococcussimulans,Staphylococcus hominis,Streptococcus constellatus,Streptococcus anginosus,Escherichia coli(大肠杆菌),Staphylococcucaureus,Mycobacterium fortuitum,and Klebsiellapneumonia(肺炎克雷伯菌)。
T细胞激活的一级信号受体分子包括MHCⅠ类分子，MHCⅡ类分子和其它与抗原加工和/或提呈有关的分子。T细胞激活的共刺激分子包括ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,LFA-1,LFA-2,VLA-1,VCAM-1,4-1BB,B7-1,B7-2，其它细胞粘附蛋白，以及其它的通过T细胞表面蛋白来激活T细胞共刺激信号通道的细胞表面蛋白。
“桥联分子”一词的定义是：可通过其自身的可与细胞结合的位点将二个或多个细胞联系到一起的分子或物质。优选地，桥联分子可将自体病变靶细胞和效应细胞联系在一起，向该效应细胞传递信号来激活或增强其针对靶细胞的免疫反应。桥联分子具有一个或一个以上的对效应细胞上的刺激或/和共刺激分子的结合位点。这些结合位点经过设计可以激活T细胞活化的正调节子(如CD28,4-1BB)，同时避免刺激T细胞活化的负调节子(如CTLA-4)。这个结合位点也可被设计为封闭T细胞活化负调节子的(参见Leach等，Science,271:1734-1736,1996)。每个桥联分子还可以含有一个或一个以上的病变靶细胞表面抗原的结合位点。桥联分子包括但不局限于：双特异性单克隆抗体，融合蛋白，有机聚合物，化学和生物化学材料等。通过在此引述将美国专利第5,601,819号，第5,637,481号，第5,635,602号，第5,635,600号，第5,591,828号，第5,292,668号和第5,582,996号中所描述和提到的抗体合并于本文。
当桥联分子与靶细胞在体外结合时，作为桥联分子锚着位点的靶细胞抗原并不一定是靶细胞所特有的。靶细胞表面的任意分子均可作为桥联分子的结合位点。这些分子包括但不限于：蛋白质、糖蛋白、脂类、糖脂、磷酸脂、聚合脂、甾体、单糖以及多糖类(参见：Molecular Biology of the Cell,pp47-58,pp276-337,Second Ed.,published by Garland Publishing,Inc.,NY & London)。例如，转铁蛋白受体、低密度脂蛋白(LDL)受体、gp55,gp95,gp115,gp210,CD44,ICAM-1,ICAM-2，胶原和纤维粘结蛋白受体，Fc受体，以及细胞因子受体等。
效应细胞表面的共刺激分子可能是抗原、脂肪酸、脂类、甾体或糖类，只要满足能够对效应细胞杀伤靶细胞的功能具有刺激或共刺激作用的条件即包括在内。共刺激分子包括但不限于：CD1a,CD1b,CD1c,CD2,CD2R,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD9,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CDw12,CD13,CD14,CD15,CD15s,CD16a,CD16b,CDw17,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD39,CD40,CD41,CD42a,CD42b,CD42c,CD42d,CD43,CD44,CD44R,CD45,CD45RA,CD45RB,CD45RO,CD46,CD47,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD50,CD51,CD51/61复合物，CD52,CD53,CD54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD59,CDw60,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD63,CD64,CDw65,CD66a,CD66b,CD66c,CD66d,CD66e,CD67,CD68,CD69,CD70,CD71,CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78,CD79a,CD80,CD81,CD82,CD83,CDw84,CD85,CD86,CD87,CD88,CD89,CDw90,CD91,CDw92,CD93,CD94,CD95,CD96,CD97,CD98,CD99,CD99R,CD100,CDw101,CD102,CD103,CD104,CD105,CD106,CD107a,CD107b,CDw108,CDw109,CD110-CD114,CD115,CDw116,CD117,CD118*,CD119,CD120a,CD120b,CDw121a,CDw121b,CD122,CD123*,CDw124,CD125*,CD126,CDw127,CDw128,CD129,CDw130,LFA-1,LFA-2,LFA-3,VLA-1,VCAM-1,VCAM-2,4-1BB，细胞因子和化学因子受体。在优选的实施方案中，桥联分子具有T细胞表面的CD28分子或4-1BB分子的结合位点。
“药理学有效”一词的定义是，能够治愈，减轻或预防一种或一种以上的由哺乳动物体内的致病性细胞所造成的或有关的临床症状的能力。这些症状包括但不限于：细胞增殖失控，细菌感染，以及病毒感染。
为了治疗患者的需要，我们还可以分离、浓缩或纯化具有免疫原性的组合物。
针对具有免疫原性的组合物进行“分离”一词的定义是，将自体病变靶细胞从其天然来源中分离出来。使用“分离”这个术语时，表示把一种或一种以上的天然物质从其正常环境中分离出来。这样，可将病变靶细胞置于不同的细胞环境中，或将其置于不含其它细胞的溶液中。该术语并不表示病变靶细胞是唯一存在的细胞，但又确实表示该细胞是主要的存在着的细胞成分(至少较其它细胞多20-50％)，并且基本上不含有患者体内与其相关联的其它组织(纯度至少为90％以上)。在优选的实施方案中，组合物中基本上不含有效应细胞，如T细胞。在另一个优选的实施方案中，组合物中基本上不含有未与病变靶细胞结合的游离的桥联分子。在第三种优选的实施方案中，组合物基本上不含有病变靶细胞外的细胞因子。
针对具有免疫原性的组合物进行“浓缩”一词的定义是：使该组合物中，自体病变靶细胞的占所有细胞的比例明显高于患者体内患病组织中该细胞的含量(2-5倍)。浓缩的手段可以是专业人员通过减少其它细胞的含量，或提高特定的病变靶细胞的数量，或两者结合达到的。需要指出的是，“浓缩”并不是指具有免疫原性的组合物中没有其它细胞的存在，而是指通过有效的方法明显提高特定细胞的相对含量。这里，“明显”一词指提高的程度对于操作者来说是有价值的，一般表示病变靶细胞与其它细胞的比值提高至少约2倍，优选提高至少5-10倍或更高。
针对具有免疫原性的组合物进行“纯化”一词，并非指绝对的纯(如均一性制剂)，而是指病变靶细胞较其天然环境相对更纯一些。病变靶细胞可以直接来自患者体内或体外培养物中，可经过处理，也可是未经处理的。纯化的程度从一个数量级，到较好的二个数量级，甚至到更好的4-5个数量级等都是本发明所包括的。在一个优选的实施方案中，组合物基本上不含有效应细胞，如T细胞。
具有免疫原性的组合物可以含有药理学适宜的的载体、赋形剂。关于它们的配方和给药的技术，可参考Remington’sPharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)。将具有免疫原性的组合物给予患者的途径可以是系统给予，如静脉注射，也可以是皮下注射。将本发明的组合物给予患病哺乳动物时，可以根据单位剂量来给予，每单位剂量含有根据所需要达到的治疗效果而预先确定数量(例如，约为1×105至1×1010，优选为1×106至1×109，最优选为1×107至1×108)的结合了桥联分子和/或激活的自体病变靶细胞，并配以生理上可耐受水性介质作为稀释剂。
可以有多种方法增强T细胞激活一级信号和共刺激信号的表达。例如，利用细胞因子或其它可以获得所需增强的因子在体外、体内或ex vivo处理靶细胞；体外或体内向靶细胞内转染MHC基因、粘附分子基因、细胞因子基因和/或其它各种转录激活因子或增强子。细胞因子包括所有在The Cytokine Handbook(Thomson,A.,ed.,1994,Academic Press,San Diego)一书中所描述和提及的细胞因子，该书通过在此引述而合并于本文。例如，这些因子包括但不限于：IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-14,IL-15,IL-16,IL-17,干扰素(如IFN-α,β和γ)，肿瘤坏死因子(如TNF-α和β)，以及其它化学因子和淋巴因子。在优选的实施方案中，将IFN-γ和TNF-α单独或联合使用，增强在病变靶细胞中的T细胞激活一级信号和共刺激信号的表达。
当我们将细胞表面结合了桥联分子的病变靶细胞提供给患者后，它们就与效应细胞表面的共刺激分子结合。每个病变靶细胞结合的桥联分子越多，它就可以与越多的效应细胞结合。另外，每个桥联分子与共刺激分子的结合位点越多，它也同样可以与更多的效应细胞相结合。
在这方面，申请人发现，当大量的桥联分子同具有与两个或两个以上不同的T细胞共刺激分子结合位点的靶细胞结合时，即使没有经过细胞因子处理(可提高该细胞的T细胞激活一级信号、共刺激信号分子的表达)，也可制备细胞疫苗。单个桥联分子可以在病变靶细胞表面上的不同的锚定分子上。同一个桥联分子可以含有二个或二个以上的结合位点来对T细胞表面上的两个或两个以上的共刺激分子进行结合。
因此，本发明的第二个方面提供了具有免疫原性的组合物，其所含有的自体病变靶细胞结合了(a)具有二种或两种以上的结合两种或两种以上不同效应细胞的结合位点的一种桥联分子，(b)具有二种或两种以上的结合效应细胞表面上的二种或两种以上不同共刺激分子的结合位点的一种桥联分子，(c)二种或更多种桥联分子，每个桥联分子含有结合不同效应细胞的结合位点，(d)二种或更多种桥联分子，每个桥联分子分别含有结合效应细胞表面不同的共刺激分子的结合位点，(d)结合到靶细胞上的不同抗原上的两种或两种以上的桥联分子，或(e)上述各种情况的任意两种或多种的组合。
本发明的药理学有效剂量的具有免疫原性组合物在给予患病的哺乳动物之前，可使用药理学可接受的载体来进行修饰。
此外，患者服用的药理学组合物可以含有：①药理学有效剂量的可提高肿瘤细胞的一种或多种T细胞激活一级信号分子、共刺激分子表达水平的某种细胞因子；②药理学有效剂量的，同时具有肿瘤细胞表面抗原的结合位点和T细胞表面的共刺激分子的结合位点的桥联分子；以及③药理学可接受的载体。
在治疗患者时，可以是在将靶细胞提供给患者之前，用细胞因子或其它提高T细胞激活的一级信号/共刺激信号表达的方法体外处理自体靶细胞。另外，也可以是将细胞因子等物质应用于患者体内，在体内提高T细胞激活的一级信号/共刺激信号的表达。
本发明的第三个方面提供了在患病哺乳动物中产生抵抗病变细胞的细胞毒性白细胞的方法，该方法包括将一定数量的效应细胞(如白细胞)群体与上述的具有免疫原性的组合物在体外环境中接触，接触的时间要足以对具有免疫原性的组合物产生反应，然后收集该被处理的细胞群体。这样产生的细胞毒性白细胞就可以提供给患病哺乳动物来进行对疾病的治疗和预防。
本发明的方法，可以用于预防和治疗某些其发生或/和进展是由于逃避了激活T细胞引发的免疫反应而引起的疾病。例如，这些疾病包括，所有的癌症，天然和继发的免疫缺陷状态，各种病原体所引起的感染性疾病等。本发明的方法以3种不同类型的发生在人体的癌症为对象进行说明。就其性质而言，癌症细胞的免疫原性都很弱，无法引发有效的T细胞反应，因而可以在患者体内存活和增殖。如下文所述，用本发明的自体肿瘤细胞疫苗，可以刺激有效的T细胞免疫，从而预防癌症，以及治疗已经发生的癌症。
从以下的详细描述和权利要求书中可明显看出本发明的其它特色和优点。
附图的简要说明
图1：细胞因子处理的hepa1-6细胞的MHC-Ⅰ类分子、ICAM-1、ICAM-2和VCAM-1抗原的表达情况。该结果为4次可比较的实验中的代表性数据。
图2：用细胞因子处理的hepa1-6细胞和抗CD28 MAb体外诱发的对同系脾T细胞的刺激和增殖。
图3：用细胞因子处理的hepa1-6细胞和抗CD28 Mab相结合的在体外共同刺激自体脾静息T细胞所产生的CTLs的细胞毒性，用对照抗体代替抗CD28 MAb作为对照。
图4：由细胞因子处理并结合了抗CD28 Bi-MAb的hepa1-6细胞诱导的保护性免疫反应。
图5：由细胞因子处理并结合了CD28:gp55 Bi-MAb的hepa1-6细胞诱导的对肿瘤的排斥作用。
图6：体内治疗已形成的肝肿瘤。
图7：经γ-射线照射后的细胞因子处理的并结合了CD28:gp55 Bi-MAb的hepa1-6细胞的治疗效果。
本发明的详细描述
本发明提供了用以下描述的两步法制备的细胞疫苗进行个体预防疾病的免疫方法，以及对已经患有疾病的个体的治疗方法。本发明的方法可以用于任何涉及低或无免疫反应病理的疾病，其中有效的治疗或预防需要激活T细胞以启动免疫反应。本发明适用于疾病包括但不限于：所有类型的癌症、免疫缺陷性疾病(包括天然和继发的)、以及由病毒或其它各种病原体引起的感染性疾病。
本发明的方法修饰弱或无免疫原性的病变自体细胞(靶细胞)，具体方法包括：①处理靶细胞以提高其激活T细胞所需的一级信号和共刺激信号分子的表达；和②将可以结合靶细胞的一种或多种抗原以及同时又可以结合T细胞表面的一种或几种共刺激分子(例如CD28分子)的物质加在靶细胞上，由此使靶细胞具有与T细胞物理性结合和激活共刺激信号的能力。这种物质包括但不限于：针对被处理的细胞上的抗原和T细胞上的CD28和/或其它共刺激分子的双特异性单克隆抗体(Bi-MAbs)。
该方法的第一个步骤的目的是增加与T细胞激活有关的细胞表面分子的表达，如MHC分子和粘附分子，以及通过提高靶细胞内与抗原加工有关的酶的活性而上调靶细胞内的抗原加工能力。对该方法的第一步骤而言，可以使用任何能够增强靶细胞(例如，MHC和粘附分子的表达)内T细胞活化的一级信号和共刺激信号的方式。要获得增强的表达，可以采用的方式有，例如，在体外或体内用细胞因子或能引发预期增强的其它因子处理靶细胞，也可是体外或体内向靶细胞内转染MHC基因、粘附分子基因、细胞因子基因，和/或MHC，粘附分子，细胞因子基因的转录激活因子或增强子。
在本发明方法一个实施方案中，是利用细胞因子处理靶细胞来提高了在靶细胞内的T细胞激活所需的一级信号和共刺激分子的水平。如下面的实例中所述，可用细胞因子体外或ex vivo处理靶细胞。此外，还可选择用细胞因子在体内处理靶细胞，其途径如：病变局部注射、淋巴结内注射、皮下注射等；体内注射细胞因子时可配合各种符合药理学要求的载体或可控释放装置。在该方法的第一步骤中，可以使用任何能够增加靶细胞的MHC分子或粘附分子表达的任何细胞因子或它们的组合。在优选的实施方案中，如用下面的实施例更为充分描述的那样，第一步骤是干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的联合应用。优选地，用约10-100U/ml的IFN-γ和约10-100U/ml的TNF-α的细胞坏死因子来处理靶细胞；更优选用约100U/ml的IFN-γ和50U/ml的TNF-α处理靶细胞，如下文的第6.1节所述。不过，究竟该采用何种细胞因子组合，以及何种浓度，才能获得最佳的激活信号的增强效应，可能需针对不同的细胞类型具体而定，如下文第6.1节中所述。
本发明方法的第二个步骤是为被处理的细胞提供可与T细胞表面的CD28和/或其它共刺激分子进行物理性桥联的能力，并因此提供激活T细胞的最佳条件。对该第二步骤而言，凡是一方面能够与靶细胞表面的一种或几种抗原分子结合，同时另一方面又能与一种或几种T细胞表面的与其激活有关的共刺激分子结合的物质，均可被使用。这种双特异性或多特异性的桥联分子可能是诸如：Bi-MAb、蛋白或其它大分子、聚合材料等，它们的共同点是具有能够与T细胞表面的共刺激分子结合，并具有活化或引发共刺激信号活化官能团。在一个实施方案中，如在下文第6节中作为实例所描述的那样，是将Bi-Mab用作桥联分子的。
上述双特异性或多特异性的桥联物质的功能之一是针对与靶细胞表面的特异性抗原或任何靶细胞上所表达的抗原。最好的是，在体内进行桥联物质与靶细胞的结合，而且连接该桥联分子的靶细胞抗原是靶细胞所独有的。
不过，由于靶细胞与桥联分子的结合可以在体外进行，桥联分子对应的靶细胞抗原也就不一定需要是该靶细胞所独有的。相应地，在体外结合到靶细胞的桥联物质将不会与将要用修饰的细胞进行免疫的个体的细胞上的相同的抗原发生交叉反应。
在这样的桥联物质与经本方法的第一步骤处理过的细胞进行培养之后，未与细胞结合的游离桥联分子可用洗涤的方法除去，而已经结合在靶细胞表面的桥联物质则可用聚乙二醇(PEG)或其它交联剂交联在细胞表面。
这种双特异性或多特异性的桥联物质的另外一个功能是对T细胞表面的共刺激分子为特异性的，如对CD28为特异性的。因此，当用经修饰过的细胞对个体进行免疫时，所结合桥联分子上的CD28分子(或其他共刺激分子)的结合位点是自由的，因此，将与T细胞表面的CD28分子(或其他共刺激分子)相结合，从而使被修饰的细胞与T细胞实现了物理性结合。这种桥联物质介导的物理连接还将被修饰细胞表面上的其它的分子(其中的一些是经过细胞因子处理步骤而增强了的)与T细胞表面上的其它的分子相接触，提供了进一步的共刺激并进而促进了T细胞的激活。
根据本发明方法的第一步骤对靶细胞的处理是在体内还是在体外，以及患者病情、治疗的目的等因素，该方法的第二个步骤也可以相应地在体内或体外进行。如果第一步是在体内处理的话，桥联分子与靶细胞的结合也可以在体内进行。在这种情况下，临床医生可以利用各种临床常用的方法将桥联分子给予患者。第一步在体内对病变或损害的细胞进行处理后，第二步应选用哪种途径给予桥联分子方为上策，则应根据病变或损害的各种综合条件，包括病变或损害的部位而定。例如，当第一步处理的病变细胞位于淋巴结时，优选将桥联分子直接注射于淋巴结内。与此类似，例如，当第一步采用肿瘤局部注射细胞因子或基因转移载体的方法处理肿瘤细胞时，第二步给予桥联分子的方法也优选为肿瘤内注射或肿瘤周围局部注射。
在第一步是在体外进行的情况下，则向处理后的靶细胞加载桥联分子既可在体外也可在体内进行。如果桥联分子是在体内提供的，则一般应采用与给予靶细胞相同或相似的途径，同时也需考虑上述关于对体内处理的靶细胞的体内加载时讨论的影响因素。
当对体外处理的细胞进行体外加载时，则处理的并加载了的细胞(细胞疫苗)可以用在体内预防或治疗疾病，也可用该疫苗细胞在体外诱导对病变或损害具有特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。在体外对处理的细胞的加载所提供的优点是桥联分子对应的靶细胞抗原可以是任意的。
当用疫苗细胞治疗或免疫患者时，可采用各种本领域技术人员所熟知的方法将体外处理的和加载的细胞提供给患者。在一个具体的实施方案中，即如后面的实施例中更为全面描述的那样，被处理的和加载的细胞是以皮下注射给患者的。在另一个实施方案中，被处理的和加载的细胞是直接注射至病变部位的，这一种方法在某些情况下优于皮下注射的方法(例如，当需要治疗的病变部位血供不充足时，当该病变无法进行活检时，或当不使患者冒更大风险就无法破坏该病变组织时，等)。在另一个实施方案中，将疫苗细胞直接注射至淋巴结内，这种方法所需的疫苗细胞的数量较其它方法少，因此在获得的自体病变细胞数量较少时(如肿瘤无法进行手术活检，而只能以针刺方法获得极少量肿瘤细胞)为首选。而且，由于淋巴结内本身含有大量的T淋巴细胞，因此淋巴结内注射疫苗细胞的方法可以提高细胞疫苗与T细胞的相互作用。申请者的原始实验数据显示，在淋巴结内仅注射少至1×104个按照本发明方法制备的肿瘤疫苗细胞，就可以诱导有效的抗亲代肿瘤的免疫反应，治愈已形成的肿瘤。这种方法诱导的免疫反应的治疗效果大约相当于皮下注射100倍的疫苗细胞所取得的效果。
在本发明的一个具体的实施方案中，用与CD28反应的Bi-MAb作为双特异性桥联分子。如上文第二节中所述，B7即可与T细胞上的CD28相互作用，又可与CTLA-4相互作用。在某些情况下，B7与CTLA-4的相互作用会产生防止T细胞激活的负性信号。因此，当用于免疫的疫苗细胞表面涂覆的是对CD28为特异性的Bi-MAb时，则在这些细胞上的B7与CTLA-4之间的相互作用(或其它的T细胞活化下调分子)就被最小化和/或被回避。另外，对其它的共刺激T细胞表面分子(如CD2,CD48)为反应性的各种Bi-MAb也可以用于实践本发明的方法中。进而言之，如果联合应用几种对不同的T细胞共刺激分子具有特异性的Bi-MAb，会产生更强的T细胞共刺激作用。
可以采用各种本领域已知的技术制备桥联分子。如下面的实例中所述，Bi-MAb是一种有效的桥联物质。如下文中第6.2节所述及其中引述的文献中所述，可以采用各种本技术领域中常用的方法制备Bi-MAb。为获得可同时结合多种T细胞共刺激分子的桥联分子，可用化学方法将几种不同的Bi-MAb交联。
除Bi-MAb之外，其它人工合成含有的既可与(一种或多种)靶细胞的(一种或多种)抗原结合同时又可与(一种或多种)T细胞共刺激分子结合的位点的分子也均可被用于本发明方法的实践之中。例如，这些分子可以是人工设计的具有所需结合位点的蛋白质、其它大分子、聚合物等，其合成方法可能是基因工程手段、合成手段，或采用化学方法将多肽、聚合物和/或其它大分子的连接而成。这些桥联分子的结合位点部分可以是包括例如抗体Fab2片段、抗体结合位点、天然或人工配体，以及其它的可与靶细胞抗原(一种或多种)、T细胞共刺激分子(一种或多种)相互作用的各种因子等。
采用符合药理学要求的各种载体或本技术领域中已知的各种药物释放系统，可将桥联分子提供给患者。例如，当进行癌症的免疫治疗时，可以将IFN-γ、TNF-α、抗CD28的Bi-MAb结合起来配制在某种可控的释放系统中，直接注射至患者的淋巴结或肿瘤局部。
本发明的方法特别适用于癌症的治疗。本发明的这一方面的具体应用在下文的第6节中将利用具体的实例详细加以描述。各实施例中的数据表明，利用本发明的两步法可以制备具有强烈免疫原性的肿瘤细胞，该方法包括：①用干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)体外处理自体肿瘤细胞；以及②将肿瘤细胞与同时抗肿瘤细胞抗原和T细胞的CD28分子的双特异性单克隆抗体预孵育。经过上述二个步骤处理的肿瘤细胞可作为细胞疫苗，引起CTL介导的免疫反应，对肿瘤具有预防和治疗作用。
尤其须指出的是，下述各实施例中描述的研究表明，把细胞因子处理的、加载了Bi-MAb的抗CD28的肝癌细胞，作为细胞疫苗免疫小鼠，不仅可以使该动物获得对其亲代野生型肝癌细胞的保护性免疫，而且可以治愈动物已经形成的肉眼可见的肝癌。此外，下文第6.7节中的描述还表明，本发明的方法还可以引发对淋巴瘤和结肠癌的保护性免疫。
当利用本发明的细胞疫苗治疗其它癌症或其它疾病时，可能会优选不同的给予途径、或其组合。在下文的第6.4节中将简要描述，在某些肝癌模型中，先用细胞因子处理的肿瘤细胞(未结合桥联分子)免疫，再静脉给予抗CD28的Bi-MAb，也会诱导一定的抗肿瘤免疫。
如下文第6.5,6.6节所述研究的结果所示，相比之下，采用细胞因子体外处理的和体外加载Bi-MAbs的细胞，可以引发均匀的肿瘤免疫性和治愈已形成的肝癌肿瘤。在前述情况下的静脉注射后，对肿瘤组织的不充足的Bi-MAbs的分布可能是造成不同治疗效果的原因。
用细胞因子处理的、抗CD28的Bi-MAb加载了的自体细胞对个体进行免疫可以抵抗各种疾病，从而给该个体的免疫系统提供足以激活T细胞的信号并使其获得防御性免疫。类似地，用细胞因子处理的、抗CD28的Bi-MAb加载了的病变细胞或损伤细胞对个体进行处理，可以抵抗各种疾病，从而给该个体的免疫系统提供足以激活T细胞的信号并引发细胞毒性T淋巴细胞反应。在这两种情况下，也可以使用对其它的T细胞共刺激分子为特异性的Bi-MAbs来加载到被处理的细胞上，使其获得体内与T细胞的物理桥联。
除了MHC的I类、ICAM-1、ICAM-2和VCAM-1分子之外，用细胞因子进行处理可以提高肿瘤细胞对肿瘤抗原的加工，还可以引发对T细胞激活为基本的其它的细胞表面分子的表达。细胞因子处理的hepa1-6细胞同固定化的抗CD28 MAb相结合，并不能在体外刺激脾T细胞或在申请人的模型系统中引发体内的抗肿瘤免疫性。这就建议在CD28与抗CD28 MAb之间的相互作用所传递的信号本身并不足以引发T细胞的活化。
相反，当使用细胞因子处理的、体外加载了抗CD28 Bi-MAb的肿瘤细胞与T细胞上的CD28进行相互反应时，则获得了强的免疫反应，这就表明，物理性桥联功能是活化过程中的重要的组成部分。
此外，我们还发现，同样用细胞因子处理但然后转染了B7基因的hepa1-6肝癌细胞，在体外不能激活脾T细胞(见下文第6.2节)。这与近来的发现即B7可以与T细胞表面的CTLA-4分子结合产生T细胞的负调节信号的报道相吻合。同时，这也说明我们选择的使用抗CD28双特异性单克隆抗体造成抗原提呈细胞与T细胞通过CD28分子形成物理性联接的方法是更为合理的。
本发明提供了基因转染和肿瘤：APC融合制备细胞疫苗的替代方法。在本发明的一种具体实施方案中，即在下面的实施例中所述，Bi-MAb与肿瘤或其它靶细胞的结合是在体外进行的。因此，这些细胞上的抗原不必是该细胞所独有的。一般来说，任何抗原均可作为目标。只要将抗CD28的MAbs与识别任何肿瘤细胞或靶细胞上表达的抗原(包括还在被处理的个体的众多细胞如淋巴细胞上表达的抗原)连接，就可以产生各种Bi-MAb。当难以获得抗肿瘤特异性抗原的抗体时，这一方法尤其有用。
实例6.1：细胞因子体外诱导HEPA1-6细胞的粘附分子
和MHC分子的表达
Hepa1-6是在C57BL/6小鼠体内用化学方法诱导得到的肝癌(G.J.Darlington et al.,1980,J.Natl.Cancer Inst.64:809)。从这种肿瘤中得到的细胞注入同系动物皮下，可以迅速生长出肿瘤结节。Hepa1-6细胞表面缺乏MHCⅠ类分子和B7分子，而且即使转染了B7-1或B7-2分子，也不能诱导宿主产生免疫反应。
确定用细胞因子诱导hepa1-6细胞表达激活因子的最佳条件的实验是这样进行的：将2×106/ml的hepa1-6细胞悬液，加入24孔板中，每孔1ml，细胞培养液为含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺，1×非必须氨基酸，1mM丙酮酸钠的RPMI-1640培养液；同时分别在不同的孔中加入IFN-γ100U/ml、TNF-α50U/ml、或这两种浓度细胞因子的合并应用。37℃孵育48hr。对照的hepa1-6细胞只加同样的培养液而不加任何细胞因子。
收获细胞，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤，分别用下列抗小鼠单抗染色(括号内为抗体名称及来源)：MHC-Ⅰ(M1/42),MHC-Ⅱ(M5/114),CD44(KM81)(ATCC),ICAM-1(HA58),ICAM-2(3C4),和VCAM-1(51-10C9)(PharMingen,San Diego,California)；这些单抗的对照抗体是大鼠抗小鼠CD3单抗(YCD3)。为染色小鼠B7-1(CD80)和B7-2(CD86)，我们采用的是CTLA4-Ig，该分子为一种可溶性融合蛋白，含有CTLA-4分子的可变区和人IgG1的恒定区(包括铰链区、CH2和CH3区)(Y.J.Guo et al.,1994,Science 263:518；C.Caux et al.,1994,J.Exp.Med.180:1841；E.Murphy et al.,1994,J.Exp.Med.180:223；R.Seder et al.,1994,J.Exp.Med.179:299；B.Blazar et al.,1994,Blood 83:3815；K.Hathcock et al.,1993,Science 262:905；P.Linsley et al.,1991,J.Exp.Med.174:561)。
细胞分别与上述单抗或嵌合蛋白分子在冰上共孵育40分钟。其对照是大鼠抗小鼠CD3(YCD3)抗体和另一种可溶性人嵌合蛋白CD44-Ig。加入FITC标记的羊抗大鼠Ig或FITC标记的兔抗人Ig，于冰上再共孵育40分钟。然后，洗涤样品，固定细胞，在流式细胞仪(FACScan,Becton Dickinson,San Jose,California)上测定细胞相对于对照染色管的荧光染色强度。结果显示，除ICAM-1外，对照处理组(未加任何细胞因子)的细胞其它各种染色均为阴性。
Hepa1-6与干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF-α)共孵育后，表达MHC-Ⅰ、ICAM-2和VCAM-1，同时其ICAM-1的表达也明显较处理前升高(图1)。这种改变在撤除细胞因子后，可在体外维持至少3天。但是，将这种经过细胞因子处理的hepa1-6细胞(CT-hepa1-6)注射到同系小鼠体内后，仍可形成肿瘤。我们对此的解释是，由于仍没有B7分子的表达，致使处理后的细胞无法产生通过CD28分子的共刺激信号，所以无法诱导有效的免疫反应。
实例6.2：用细胞因子处理的hepa1-6细胞和抗CD28 Bi-MAb
在体外共同刺激自体脾T细胞可造成其增殖和激活
下面的实验将显示，用细胞因子处理的hepa1-6细胞和几种抗CD28及肿瘤抗原的Bi-MAb在体外共同刺激自体脾T细胞可造成其增殖，提示这种双特异性单克隆抗体可以提供CD28共刺激信号。这几种双特异性单克隆抗体分别为：CD28:gp55,CD28:gp95和CD28:gp210，它们一方面具有对T细胞上面的CD28分子为特异性的结合位点，同时分别具有对肿瘤细胞表面所表达的三种糖蛋白之一为特异性的第二结合位点。它们的制备和使用如下文所述。
为制备单抗或双特异性单抗，我们将2×107hepa1-6细胞与福氏完全佐剂(CFA)混合后免疫Wistar大鼠。此后8周内用同样的细胞混合福氏不完全佐剂(ICFA)强化免疫3次。按以往报道的方法[见J.Alan & T.Robin,in:Immunochemistry in Practice,Chapter 2(Blackwell,New York,2nd ed.1988)]，取免疫过的大鼠的脾脏，将脾细胞与大鼠YB2/0骨髓瘤细胞融合。利用免疫荧光染色法筛选出20余株分泌Ig的杂交瘤，其中3株的上清经流式细胞术分析，可染色绝大多数hepa1-6细胞。免疫沉淀实验证明，这3种抗体对应的抗原分别为55Kd,95Kd和210Kd，均为糖蛋白，表达于大多数肿瘤细胞。我们分别称这3种抗体为抗-gp55、抗-gp95和抗-gp210。抗小鼠CD28单抗的制备方法为：先用表达CD28的小鼠T细胞杂交瘤细胞系免疫Wistar大鼠；细胞融合后，用免疫荧光染色、流式细胞仪分析筛出分泌抗CD28抗体的杂交瘤，再用这些杂交瘤的上清进行免疫沉淀试验和刺激T细胞增殖、IL-2产生等试验。分泌抗小鼠CD18单抗的杂交瘤购自ATCC，该杂交瘤用于制备抗小鼠CD18:gp55 Bi-MAb。所有本实验中的抗体的纯化均是将杂交瘤注射裸鼠腹腔，再取其腹水用Protein-G亲和柱制备纯化抗体。
根据以往报道的方法，利用上述抗体制备双特异性单克隆抗体(见J.A.MacLean et al.,1993,J.Immunol.150:1619；L.K.Gilliland et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7719；C.Bodeet al.,1989,J.Biol.Chem.264:944)。
用尼龙毛柱从正常脾细胞中分离纯化T细胞；将纯化的T细胞(5×106/孔)在RPMI-1640完全培养液中，与5×105/孔的经过细胞因子处理(如前文第6.1节中所述)或未经过处理的且又经照射(5000伦琴)过的hepa1-6细胞37℃共孵育96小时，同时分别加入双特异性单克隆抗体CD28:gp55、CD28:gp95、或CD28:gp210。这些抗体的对照为：不加抗体(空白对照)、加入CD28:CD18双特异性单克隆抗体、以及同时加入抗CD28单抗和抗gp55单抗三种。另设细胞对照为：经细胞因子处理或未经细胞因子处理的，转染了B7基因，细胞表面表达高水平的B7分子的hepa1-6细胞。测定T细胞的CD3+CD8+CD25+细胞的百分比(平均值±SD)的方法是用Cy-ChromTM标记的抗CD3、PE标记的抗CD8和FITC标记的抗CD25单抗(PharMingen,SanDiego,California)同时染色细胞，再用FACScan进行三色荧光分析。
每种Bi-MAbs均在体外或体内与细胞因子处理后的hepa1-6肿瘤细胞合用，观察其刺激肿瘤特异性的CTLs的能力。分别在含有50mg/ml抗CD28 Bi-MAbs或对照抗体的条件下，将小鼠脾细胞与细胞因子处理或未经处理的hepa1-6细胞共同孵育，37℃，共9天。
图2的结果显示，这3种抗CD28 Bi-MAbs中的任何一种与细胞因子处理后的肿瘤细胞合用，均可明显的刺激脾T细胞增殖。
缺少了抗CD28 Bi-MAb或细胞因子处理过的自体肿瘤细胞这两个因素其中的任何一个，均未发现可刺激脾T细胞发生增殖。有趣的是，转染并高表达B7的hepa1-6细胞，即使用细胞因子经同样的方法处理，仍不能有效地刺激静息T细胞的增殖。上述方法诱导产生的T细胞的表型主要为CD3+CD8+CD25+。
实例6.3：细胞因子处理的Hepa1-6细胞和抗CD28 Bi-Mabs
诱导的CTLs的体外杀伤活性
用下述方法测定细胞因子处理的Hepa1-6细胞和抗CD28Bi-MAbs诱导的静息T细胞的体外杀伤活性：分别在含有CD28Bi-MAbs或对照抗体的条件下，将尼龙毛柱纯化的小鼠静息脾T细胞(5×106/well)与细胞因子处理(见前文第6.1节)并经5000伦琴照射的hepa1-6细胞(5×105/well)37℃共同孵育，共9天。对照还设有仅加入同样数量的照射的B7+的hepa1-6细胞(不加抗体)。γ-射线照射的静息脾细胞(5×106/孔)作为滋养细胞加入各孔。分别于培养第3、6天，向每孔中加入2ml含有20U重组人IL-2的RPMI-1640完全培养液。
以标准的4小时51Cr释放法测定诱导9天后的CTLs对自体、同种异体肿瘤细胞及NK敏感的YAC-1细胞系的杀伤作用。图3显示的是这三种杀伤试验在效∶靶比为1∶20时的肿瘤细胞裂解情况(平均值±SD)。该结果说明，我们诱导的CTLs具有自体特异性的肿瘤杀伤活性。
实例6.4：静脉注射抗CD28 Bi-MAb对细胞因子处理的
Hepa1-6细胞致瘤性的影响
小鼠接种细胞因子处理后的hepa1-6细胞后，分别于第1、2和第4天静脉注射100μg的抗CD28:gp55 Bi-MAb，结果动物形成肿瘤的时间推迟，并且有40％(8/20)的动物肿瘤消退。注射未经处理的亲代hepa1-6细胞+抗CD28 Bi-MAb组和注射CT-hepa1-6+对照抗体组的动物，均在接种后60天内死亡。免疫组化结果显示，注射双特异性单克隆抗体后24hr,48hr,72hr后，除肿瘤组织外，这些抗体还广泛分布于动物的肺、肝和肾脏。
实例6.5：结合了抗CD28 Bi-MAbs的细胞因子处理的
Hepa1-6细胞可诱导保护性免疫反应
将肿瘤细胞在含有IFN-γ100U/ml+TNF-α50U/ml的10％FCS的RPMI-1640培养液中，37℃,5％CO2，孵育48小时；收获细胞，用PBS(pH7.4，室温)洗涤3遍；再按第6.1节所述方法与50μg/ml的抗CD28 Bi-MAb在冰上共孵育45分钟；然后再于30％PEG(溶于RPMI-1640)中4℃孵育45分钟；PBS洗涤3遍；最后以1-2×107/ml的密度重悬于PBS中。标记其它Bi-MAbs或Mabs也与上述步骤相同，均与相应的抗体共孵育45分钟。
5组C57BL/6小鼠，每组5只，分别皮下接种不同处理的hepa1-6细胞1×106。其中的4组分别为细胞因子处理后分别结合了CD28:gp55、CD28:gp95、CD28:gp210、CD18:gp55(对照抗体)双特异性单克隆抗体的hepa1-6细胞，以及1组未经细胞因子处理但结合了CD28:gp55的双特异性单克隆抗体的hepa1-6细胞。2周后，各组动物均皮下接种2.5×106的亲代hepa1-6细胞。
细胞因子处理的hepa1-6细胞(CT-hepa1-6)预孵育(结合)了任何一种抗CD28：双特异性单克隆抗体后，均丧失了动物体内的致瘤性，而结合了对照双特异性单克隆抗体的CT-hepa1-6细胞仍有致瘤性。图4的免疫接种实验结果显示，预先接种结合了任何一种抗CD28/肿瘤抗原的Bi-MAbs的CT-hepa1-6细胞，都使动物产生针对亲代野生型肿瘤细胞的保护性免疫，所有的动物于接种后120天内仍无肿瘤生成(图4)。相反，先接种未经细胞因子处理但结合了CD28:gp55的双特异性单克隆抗体的hepa1-6细胞，或经细胞因子处理但结合了对照双特异性单克隆抗体的hepa1-6细胞，然后再接种亲代野生型肿瘤细胞，动物均生长肿瘤并在第二次接种后50天内死亡(图4)。本实验重复2次，结果一致。实例6.6：本发明的方法在肝癌中的应用：用细胞因子处理并结合了
双特异性单克隆抗体的hepa1-6细胞治愈已形成的肝癌
为确定能否用接种结合了抗CD28 Bi-MAbs的CT-hepa1-6细胞的方法治疗已经形成了的肝癌，我们进行了下面的三项实验。每项实验结果均表明，接种结合了抗CD28 Bi-MAbs的CT-hepa1-6细胞，可以治愈已经形成了的肝癌。
在第一项实验中，我们先给40只小鼠均皮下接种2×106的hepa1-6细胞，14天后，所有的动物均形成镜下可见的肿瘤；此时将动物随机分为4组，每组10只动物；第一组皮下注射2×106的结合了CD28:gp55 Bi-MAb的CT-hepa1-6；第二组皮下注射2×106的结合了CD18:gp55 Bi-MAb的CT-hepa1-6；第三组皮下注射2×106的结合了CD28:gp55 Bi-MAb的野生型hepa1-6；第四组皮下注射2×106的结合了CD18:gp55 Bi-MAb的野生型hepa1-6。结果如图5所示，第一组动物均存活超过100天，而其它三组动物均在40天内死亡。本实验经2次重复，结果一致。
在第二项实验中，共有5组小鼠，每组5只动物，均皮下注射1×106hepa1-6细胞。4周后，动物长出6-8mm(最大径)的肿瘤。分别给3组动物皮下注射1×106的结合了CD28:gp55、或CD28:gp95、或CD28:gp210 Bi-MAb的CT-hepa1-6细胞；7天后重复注射同样数量的与上一次注射同样处理的肿瘤细胞。剩余2组中，一组皮下注射1×106的与CD18:gp55预孵育的CT-hepa1-6细胞，另一组皮下注射1×106的与抗CD28单抗、抗gp55单抗(均为50μg/ml)预孵育的CT-hepa1-6细胞(CD28+gp55)。定期测量肿瘤大小。
结果如图6所示。前3组注射结合了抗CD28：肿瘤抗原双特异性单克隆抗体的CT-hepa1-6细胞的动物在40天后已测不到肿瘤结节存在。而对照的另两组，无论是以对照双特异性单克隆抗体或是以混合的单抗代替抗CD28：肿瘤抗原Bi-MAb，其肿瘤均增加原来的2倍大小，而且所有的动物都在该期间内死亡。本实验经3次重复，结果一致。
在第三项实验中，我们试以γ-射线照射的结合了Bi-MAbs的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗。三组小鼠，每组5只，分别皮下接种1×106hepa1-6细胞，2周后，第一组皮下注射1×106γ-射线照射的结合了CD28:gp55 Bi-MAb的CT-hepa1-6细胞；第二组皮下注射1×106γ-射线照射的与抗CD28单抗和抗gp55单抗预孵育的CT-hepa1-6细胞；第三组则皮下注射仅以γ-射线照射野生hepa1-6细胞。结果如图7所示，与前两项实验结果相似，只有第一组注射γ-射线照射的结合了CD28:gp55 Bi-MAb的CT-hepa1-6细胞才能对已经形成的肿瘤具有治疗作用(动物存活100天以上)，而其它二组动物均在40天内死亡。
病理检查的结果显示，先注射亲代野生型肿瘤细胞，再注射细胞因子处理并结合了抗CD28：肿瘤抗原双特异性单克隆抗体的自体肿瘤细胞，肿瘤组织局部产生明显的炎症反应，大量淋巴细胞浸润；浸润的淋巴细胞经荧光标记的大鼠抗小鼠CD3、CD8、CD25单抗的染色，结果显示其表型为CD3+CD8+CD25+，这与体外激活的实验结果相对应一致。而对照组无论是注射未经处理的肿瘤细胞，还是结合对照抗体的肿瘤细胞的动物，肿瘤组织局部均无炎症反应和淋巴细胞浸润。
为进一步研究上述诱导的免疫反应是否由CTLs所介导，我们还在免疫接种小鼠前或接种后用抗体处理去除小鼠体内的CD8+T细胞。结果发现无论是接种前还是接种后去除CD8+T细胞，均可使细胞疫苗失去诱导抗肿瘤免疫反应的能力。实例6.7：本发明的方法在其它肿瘤系统中的应用：用细胞因子处理并结合了Bi-MAbs的肿瘤细胞诱导针对淋巴瘤和结肠癌的保护性免疫
我们又在其它肿瘤模型中，验证了细胞因子处理并结合了抗CD28 Bi-MAbs的自体肿瘤细胞的免疫原性。这里的其它肿瘤模型是EL-4淋巴瘤和SMCC-1结肠癌模型。
EL-4细胞转染B7基因后，可产生免疫原性。但SMCC-1结肠癌即使转染了B7基因，也无法使其产生免疫原性。这两种肿瘤细胞均可在同种的C57BL/6小鼠皮下形成肿瘤，生长迅速(可参见Li et al.,1996,J.Exp.Med.,180:211)。这两种细胞表面均有gp55抗原表达，因此，这部分实验也使用上文提到的抗CD28:gp55 Bi-MAb。
三组小鼠，分别皮下接种1×106细胞因子处理并结合了CD28:gp55 Bi-MAb的hepa1-6细胞、EL-4细胞或SMCC-1肿瘤细胞。
2周后，将用修饰的hepa1-6细胞免疫了的那一组分为3个亚组，分别皮下接种1×106hepa1-6细胞、SMCC-1细胞或EL-4细胞。
将用细胞因子处理并结合了CD28:gp55 Bi-MAb的SMCC-1细胞免疫了的那一组分为2个亚组，一组皮下接种1×106的SMCC-1细胞，另一组两侧皮下分别接种1×106的EL-4细胞和hepa1-6细胞。
与此类似，将用细胞因子处理并结合了CD28:gp55 Bi-MAb的EL-4细胞免疫了的那一组也分为2个亚组，一组皮下接种1×106的EL-4细胞，另一组两侧皮下分别接种1×106的SMCC-1细胞和hepa1-6细胞。
上述实验结果如以下表Ⅰ所示。另一次重复实验的结果与此相同。
表Ⅰ
细胞因子处理并结合了抗CD28 Bi-MAb的肿瘤细胞
所引起的免疫反应的特异性
第一次免疫的细胞 第二次接种的细胞 生长肿瘤的小鼠数目
Bi-MAb-CT-Hepa1-6     Hepa1-6     0/10
 Bi-MAb-CT-Hepa1-6     SMCC-1     6/6
 Bi-MAb-CT-Hepa1-6     EL-4     5/5
 Bi-MAb-CT-SMCC-1     SMCC-1     0/6
 Bi-MAb-CT-SMCC-1  EL-4+Hepa1-6     6/6
 Bi-MAb-CT-EL-4     EL-4     0/6
 Bi-MAb-CT-EL-4  SMCC-1+Hepa1-6     6/6
由表Ⅰ可以看出，所有事先接种结合了抗CD28:gp55 Bi-MAb的CT-EL-4或CT-SMCC-1的动物，均可使该动物产生针对自体的亲代野生型肿瘤细胞的保护性免疫。
在上面三组实验中，所有的免疫反应都是肿瘤类型特异性的。例如，用结合了抗CD28 Bi-MAb的CT-hepa1-6细胞免疫接种，并不能抑制同种EL-4或SMCC-1细胞的体内生长(表Ⅰ)。有趣的是，虽然野生型的EL-4细胞不经细胞因子处理也表达高水平的MHC-Ⅰ类分子，但用它结合双特异性单克隆抗体后免疫动物，仍不能诱导保护性免疫。另外，取自免疫了细胞因子处理并结合了抗CD28 Bi-MAb的小鼠体内的CTLs，可以特异性地体外杀伤亲代的肿瘤细胞，而对其它类型的肿瘤细胞没有特异性杀伤。
实例6.8：以结合了多价桥联分子的肿瘤细胞诱导细胞免疫
上述数据表明，SMCC-1、EL-4或hepa1-6细胞在体外经细胞因子处理后，再与抗CD28双特异性单克隆抗体结合，可产生免疫原性。用这种修饰的肿瘤细胞诱导的抗肿瘤免疫反应既可以有预防作用，也有治疗作用。
下面的数据显示，用抗CD28 Bi-MAb和抗4-1BB Bi-MAb这两种不同的双特异性单克隆抗体结合EL-4或SMCC-1细胞，即使它们事先未经细胞因子处理，也同样可以具有免疫原性，而且诱导的免疫反应同样既具有预防功能，也具有治疗功能。
先在体外用抗CD28：抗gp55和抗4-1BB：抗gp115两种双特异性单克隆抗体(浓度均为50μg/ml)与肿瘤细胞在冰上共孵育45分钟；PEG固定，洗涤3次后，将结合有这二种Bi-MAbs的肿瘤细胞按不同的剂量注射至同种动物皮下。2周后再注射相应的亲代肿瘤细胞，观察动物生长肿瘤的情况，结果见表Ⅱ。
表Ⅱ
不同方法体外处理肿瘤细胞以提高其免疫原性，
诱导的体内抗肿瘤能力的比较
    免疫 剂量     攻击 肿瘤形成
照射过的EL-4Wt  1×106  1×106EL-4Wt  100％
照射过的CT-EL-4Wt  1×106  1×106EL-4Wt  100％
照射过的EL-4涂覆的CD28 Bi-MAb  1×106  1×106EL-4Wt  50％
照射过的CT-EL-4涂覆的CD28 Bi-MAb  1×106  1×106EL-4Wt  0％
 1×105  1×106EL-4Wt  20％
 5×104  1×106EL-4Wt  60％
照射过的EL-4Wt涂覆的抗-CD28和抗-4-1BB Bi-MAbs  1×106  1×106EL-4Wt  0％
 1×105  1×106EL-4Wt  0％
 5×104  1×106EL-4Wt  10％
在治疗性实验中，先在同种动物皮下接种2×106的亲代野生型肿瘤细胞；2至4周后，给生长肿瘤的动物注射修饰的肿瘤细胞。各组动物的生存时间见表Ⅲ。
表Ⅲ：结合了单价或多价双特异性单克隆抗体的
肿瘤细胞疫苗体内治疗作用的比较
肿瘤     疫苗 剂量 动物存活率*(％)
SMCC-1  SMCC-1Wt     1×106     0％
SMCC-1  CT-SMCC-1+CD28Bi-MAbs     1×106     100％
    5×105     30％
SMCC-1  SMCC-1+CD28&4-1BB Bi-MAbs     1×106     100％
    5×105     80％
SMCC-1 SMCC-1+CD28&4-1BB Bi-Mabs(multivalent Bi-MAbs     1×106     100％
    5×105     100％
    1×105     60％
*用肿瘤疫苗治疗后60天的生存率。
实例6.9：对感染了病毒的细胞的免疫作用
原代培养的肝细胞取自临床活检的正常肝组织，用肝细胞培养液培养。自体外周血淋巴细胞为从同一患者的外周血中分离，培养于含有5％人AB血清，5％胎牛血清和20iu/ml rh-IL-2的RPMI-1640培养液中。
采用E1B缺陷的腺病毒感染培养中的肝细胞，方法参考以往报道。用RT-PCR和组织学方法证实病毒感染。
感染了病毒的肝细胞随后分别用：(1)仅细胞因子；(2)仅BiMAbs；或(3)细胞因子+BiMAbs处理。处理后的肝细胞用5000伦琴的射线照射后，在RPMI-1640完全培养液中，与自体PBL共同孵育，方法如前所述。
用标准4小时51Cr释放法测定用修饰或未修饰的肝细胞诱导的CTLs的细胞毒性。表Ⅳ：病毒感染的肝细胞经IFN-γ和TNF-α处理并与抗CD28双特异性单克隆抗体共孵育后，体外刺激自体PBL所诱导的CTLs。
靶细胞     处理方法 效应细胞 效∶靶比 细胞毒性
肝细胞     无     PBL     1∶50     ～3％
肝细胞     细胞因子     PBL     1∶50     ～3％
肝细胞     Bi-MAbs     PBL     1∶50     ～3％
肝细胞     细胞因子     PBL     1∶50     ～3％
Ad-肝细胞     无     PBL     1∶50     ～3％
Ad-肝细胞     细胞因子     PBL     1∶50     ～5％
Ad-肝细胞     Bi-MAbs     PBL     1∶50     ～13％
Ad-肝细胞 细胞因子+Bi-MAbs     PBL     1∶50     ～20％
Ad-肝细胞 Bi-MAbs(多价*)     PBL     1∶50     ～40％
Ad-肝细胞 细胞因子+Bi-MAbs(多价*)     PBL     1∶50     ～40％
*  抗gp115:CD28双特异性单克隆抗体是用几种抗CD28单抗和抗gp115单抗化学交联，再以亲和层析柱纯化而来的。它及能够与CD28分子特异性结合，又可与gp115抗原特异性结合。
本发明并不仅仅限于本申请所列举的实例的范围，这几个实例仅为本发明的几个方面的应用，任何功能上的等同物都在本发明的范围内。显然，对于本领域的技术人员来说，对上述的实例稍事修改，就有可能有新的应用，因此这些修改也在本发明的范围之内。例如，还可参考Guo等在Nature Medicine,Vol.4:1-5,(April,1997)中的文献。
所有引述的文献，包括每一篇文献中的图、核酸序列、氨基酸序列等，均被通过在此引述而合并于为本文。所有上述文献中提到的以及其中的参考文献中所提到的化合物都通过在此引述而合并于本文。
本发明的其它具体实施方案均揭示于权利要求书中。

Claims (49)

1．一种用于体内含有病变细胞的患病哺乳动物的具有免疫原性的组合物，该组合物包括：
(a)一种可以表达比所述患病哺乳动物体内的病变细胞更高水平的一种或多种T细胞激活一级信号、共刺激信号分子的自体病变靶细胞；和
(b)一种包括一个或多个可与所述患病哺乳动物T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子，其中所述的桥联分子结合在上述的病变靶细胞上。
2．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的桥联分子进一步包括一个或多个可与所述的病变靶细胞表面的一种或多种抗原结合的位点，并且所述的桥联分子通过与该抗原的结合而结合在该病变靶细胞上。
3．根据权利要求1所述的组合物，所述的组合物是经分离的、浓缩的、或经纯化的组合物。
4．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的一种或多种T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子，选自MHC-Ⅰ类分子、ICAM-1分子、ICAM-2分子、VCAM-2分子、B7-2、和B7-2分子所组成的一组。
5．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的一种或多种T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子，是通过向所述的病变靶细胞内转染外源性核酸分子而表达的。
6．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的病变靶细胞被用一种或多种细胞因子在体外所处理，以提高对所述的一种或多种T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子的表达。
7．根据权利要求6所述的组合物，其中所述的病变靶细胞是用IFN-γ或TNF-α处理的，或经它们两者共同处理的。
8．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的桥联分子包括与T细胞表面的CD28分子或4-1BB分子结合的位点。
9．根据权利要求2所述的组合物，其中所述的抗原选自LDL受体、gp55、gp95、gp115、gp210、CD44、ICAM-1、ICAM-2、胶原和纤维粘接蛋白受体、转铁蛋白受体、Fc受体、以及各种细胞因子受体所组成的一组。
10．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的桥联分子是能和所述的一种或多种T细胞表面共刺激分子特异性结合的抗体。
11．根据权利要求2所述的组合物，其中所述的桥联分子是通过共价键与所述的病变靶细胞表面的所述懂得一种或多种抗原结合的。
12．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的病变靶细胞是肿瘤细胞。
13．根据权利要求12所述的组合物，其中所述的肿瘤细胞选自肝癌、肝细胞癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、肾癌、头颈部癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、脑肿瘤、骨肉瘤、胆囊癌、骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、以及胰腺癌细胞所组成的一组。
14．根据权利要求1所述的组合物，其中所述的病变靶细胞是被病毒感染的细胞。
15．根据权利要求14所述的组合物，其中所述的病毒选自由HIV、HAV、HBV、HCV、HDV、EBV、HPV、和HLV所组成的一组。
16．一种用于体内含有病变细胞的患病哺乳动物的具有免疫原性的组合物，该组合物包括：
(a)自体病变靶细胞；和
(b)二种或更多种桥联分子，每种桥联分子包括与T细胞表面的不同共刺激分子结合的位点，其中所述的桥联分子结合在所述病变靶细胞的表面上。
17．根据权利要求16所述的组合物，其中所述的二种或更多种桥联分子中的每一种均含有和所述病变靶细胞表面的不同抗原结合的位点。
18．一种用于含有病变细胞的患病哺乳动物的具有免疫原性的组合物，该组合物包括：
(a)自体病变靶细胞；和
(b)含有两种或更多种可与T细胞表面的二种或更多种共刺激分子结合的位点的桥联分子，其中所述的桥联分子结合在所述的病变靶细胞的表面上。
19．根据权利要求18所述的组合物，其中所述的桥联分子进一步包括一个或多个可与所述的病变靶细胞表面的一种或多种抗原结合的位点，且所述的桥联分子通过与所述的抗原分子的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
20．一种药用组合物，包括：
(a)能够提高患病哺乳动物体内的肿瘤细胞的一种或一种以上T细胞激活一级信号或共刺激信号分子的表达水平的药理学有效剂量的细胞因子；
(b)既含有可与所述的肿瘤细胞表面抗原结合的位点且又含有可与T细胞表面的共刺激分子结合的位点的药理学有效剂量的桥联分子；和
(c)药理学可接受的载体。
21．一种用于体内含有病变细胞的哺乳动物的药用组合物，包括：
(a)结合了一种或一种以上含有与患病哺乳动物T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子的药理学有效剂量的自体病变靶细胞；以及：
(b)药理学可接受的载体。
22．根据权利要求21所述的组合物，其中所述的一种或一种以上的桥联分子中的每一种都进一步包括一个或一个以上可与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，且所述的桥联分子通过与所述抗原的结合而结合在所述病变靶细胞上。
23．一种制备用于体内含有病变细胞的患病哺乳动物的具有免疫原性的组合物的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供一种自体病变靶细胞；
(b)处理上述病变靶细胞，提高其T细胞激活一级信号、共刺激信号分子表达水平；
(c)提供含有一个或一个以上的可与一种或一种以上所述患病哺乳动物的T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子；和
(d)将所述桥联分子结合在所述病变靶细胞上；
其中所述的步骤(c)和(d)可在步骤(b)之前或之后进行。
24．根据权利要求23所述的方法，其中所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上可与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，且所述的桥联分子通过与所述的抗原的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
25．根据权利要求23所述的方法，其中所述的一种或种以上的T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子选自MHC-Ⅰ类分子、ICAM-1分子、ICAM-2分子、VCAM-2分子、B7-1、和B7-2分子所组成的一组。
26．根据权利要求23所述的方法，其中所述的一种或一种以上的T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子是通过向所述的病变靶细胞内转染外源性核酸分子而表达的。
27．根据权利要求23所述的方法，其中所述的病变靶细胞是用一种或一种以上的细胞因子来进行体外处理，以提高所述的一种或一种以上的T细胞激活的一级信号、共刺激信号分子的表达。
28．根据权利要求27所述的方法，其中所述的病变靶细胞是用IFN-γ或TNF-α处理的，或用它们两者联合处理的。
29．根据权利要求23所述的方法，其中所述的桥联分子包括与T细胞表面的CD28分子或4-1BB分子结合的位点。
30．根据权利要求24所述的方法，其中所述的抗原选自由LDL受体、gp55、gp95、gp115、gp210、CD44、ICAM-1、ICAM-2、胶原和纤维粘接蛋白受体、转铁蛋白受体、Fc受体、以及各种细胞因子受体所组成的一组。
31．根据权利要求23所述的方法，其中所述的桥联分子是对所述的一种或一种以上的T细胞表面共刺激分子具有特异性结合亲和性的抗体。
32．根据权利要求24所述的方法，其中所述的桥联分子是以共价键与所述的病变靶细胞表面的所述一种或一种以上的抗原相结合的。
33．一种治愈体内含有病变细胞的患病哺乳动物，或减缓该病变细胞生长速度的方法，该方法包括向所述的患病哺乳动物提供药理学有效剂量的具有免疫原性的组合物，该组合物包括：
(a)可以表达较所述患病哺乳动物体内的病变细胞更高水平的一种或一种以上的T细胞激活一级信号、共刺激信号分子的自体病变靶细胞；和
(b)含有一个或一个以上的与所述患病哺乳动物T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子，其中所述的桥联分子结合在所述的病变靶细胞上。
34．根据权利要求33所述的方法，其中所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，并且所述的桥联分子通过与所述抗原的结合而结合在所述病变靶细胞上。
35．根据权利要求33所述的方法，其中所述的具有免疫原性的组合物是在体外制备的。
36．一种治愈体内含有病变细胞的患病哺乳动物，或减缓该病变胞生长速度的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供自体病变靶细胞；
(b)处理所述病变靶细胞，提高所述的病变靶细胞中的一种或一种以上的T细胞激活一级信号、共刺激信号分子表达水平；
(c)提供含有一个或一个以上与一种或一种以上所述患病哺乳动物的T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子；
(d)将所述桥联分子结合在所述病变靶细胞上；和
(e)收集药理学有效剂量的、结合了所述桥联分子的所述病变靶细胞，并将所收集的细胞提供给所述的患病哺乳动物；
其中所述的步骤(c)和步骤(d)可在步骤(b)之前或之后进行。
37．根据权利要求36所述的方法，其中所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，且所述的桥联分子通过与所述的抗原分子的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
38．根据权利要求36所述的方法，还进一步包括在步骤(e)之前的去除未与所述病变靶细胞结合的桥联分子的步骤。
39．一种治愈体内含有病变细胞的患病哺乳动物，或减缓该病变细胞生长速度的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供自体病变靶细胞；
(b)提供含有一个或一个以上与一种或一种以上所述患病哺乳动物的T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子；
(c)将所述桥联分子结合在所述病变靶细胞上；
(d)收集药理学有效剂量的、结合了所述桥联分子的所述病变靶细胞，并将所述的收集细胞提供给所述的患病哺乳动物；和
(e)将药理学有效剂量的一种或一种以上的细胞因子提供给所述的患病哺乳动物，以提高其体内的所述病变靶细胞的一种或一种以上T细胞激活所需的一级信号、共刺激信号分子的表达水平。
40．根据权利要求39所述的方法，其中所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，且该桥联分子通过与所述的抗原分子的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
41．根据权利要求39所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前的去除未与所述病变靶细胞结合的桥联分子的步骤。
42．一种治愈体内含有病变细胞的患病哺乳动物，或减缓该病变细胞生长速度的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供自体病变靶细胞；
(b)提供含有两个或两个以上的可与两种或两种以上不同的所述患病哺乳动物的T细胞表面的共刺激分子结合的位点的桥联分子；
(c)将所述桥联分子结合在所述病变靶细胞上；和
(d)收集药理学有效剂量的结合了所述桥联分子的所述病变靶细胞，并将它们提供给所述的患病哺乳动物。
43．根据权利要求42所述的方法，其中所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上抗原结合的位点，且所述的桥联分子通过与所述的抗原分子的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
44．根据权利要求42所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前的去除未与所述病变靶细胞结合的桥联分子的步骤。
45．一种治愈体内含有病变细胞的患病哺乳动物，或减缓该病变细胞生长速度的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供自体病变靶细胞；
(b)提供两种各自含有对所述患病哺乳动物的T细胞表面不同的共刺激分子的结合位点的桥联分子；
(c)将所述桥联分子结合在所述病变靶细胞上；和
(d)收集药理学有效剂量的结合了所述桥联分子的所述病变靶细胞，并将它们提供给所述的患病哺乳动物。
46．根据权利要求45所述的方法，其中每一种所述的桥联分子进一步包括一个或一个以上与所述的病变靶细胞表面的一种或一种以上的抗原相结合的位点，且每一个所述的桥联分子都通过与所述的抗原分子的结合而结合在所述的病变靶细胞上。
47．根据权利要求45所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前的去除未与所述病变靶细胞结合的桥联分子的步骤。
48．一种可将患病哺乳动物体内的病变靶细胞与所述的患病哺乳动物体内的效应细胞连接起来的桥联分子，该分子包括：
(a)与所述病变靶细胞表面的抗原结合的位点；和
(b)二个或二个以上的与所述效应细胞表面的两种或两种以上不同的共刺激分子结合的位点。
49．一种产生针对患病哺乳动物体内的病变靶细胞的细胞毒性白细胞的方法。该法包括下列步骤：
(a)提供选自权利要求1至19中任何一个所述的具有免疫原性的组合物；
(b)使一定群体的白血细胞与所述的具有免疫原性的组合物互相接触一段时间，这段时间要长得足以使这些白血细胞与所述的具有免疫原性的组合物发生反应；和
(c)收集所述的白血细胞群体。
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