JP3676380B2 - 細胞性ワクチンおよび免疫療法薬ならびにそれらの製造方法 - Google Patents
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Description
関連出願
本願は、1996年6月12日に出願されたアメリカ合衆国仮出願60/019,639の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、有効な免疫応答に導くＴ細胞活性化を刺激する能力を有する免疫原性シグナルを有する免疫系を提供するための、弱免疫原性細胞または非免疫原性細胞の免疫原性の増強方法を提供するものである。本発明の方法により、Ｔ細胞活性化により引き起こされる免疫応答を回避することによる発症および／または持続する疾患の予防および治療に有用な細胞性ワクチンが得られる。かかる疾患としては、例えば、全ての癌、自然および誘発性免疫不全状態、ならびに種々の病原体の感染により生じる疾患が挙げられる。
発明の背景
HannaらによるU.S.特許5,484,596には、ワクチンとして腫瘍組織を用いることが開示されている。HonsikらによるU.S.特許4,844,893には、標的細胞を殺すために腫瘍細胞上で優先的に発現される抗原に指向されるＭａｂでＩＬ−２活性化白血球を武装することが開示されている。両特許は、引用して本明細書の記載とする。
抗腫瘍免疫応答は、主として、Ｔリンパ球により媒介される。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）および免疫応答をコスティミュレートする分子の両方のダウン・レギュレーションは、腫瘍細胞によりシグナルを伝達する欠損Ｔ細胞活性化に関係している（Luboldtら, Cancer Res. 56: 826-830, 1996；L. Chenら, 1992, Cell 1: 1093；P. S. Linsley, J. A. Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol 11: 191；G. J. Freemanら, 1993, Science 262: 909；C. H. Juneら, 1994, Immune. Today 15: 321；J. T. Gergeら, 1993, Cancer Res. 53: 2374；Ostrand-Rosenberg, 1993, S. Curr. Opin. Immune. 6: 722；B. E. Elliotら, 1989, Adv. Cancer Res. 53: 181）。
ＭＨＣ結合抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識は、Ｔ細胞活性化のために充分なシグナルではない。Ｂ７−１およびＢ７−２のようなコスティミュラトリー分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および免疫応答により標的とされる他の細胞の細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルを提供する（検討のために、L. Chenら, 1995, Immunol. Rev. 145: 123；T. Tykocinskiら, 1996, Am. J. Path. 148 :1を参照）。Ｔ細胞表面分子ＣＤ２８を介するＢ７シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化のための主要なコスティミュラトリー経路であると思われる。しかしながら、最近の研究によると、コスティミュレーションは、サイトカインおよび接着分子の両方を含むより複雑な事象であることが示されている（G. Yangら, 1995, J. Immune. 154: 2794；M. Kubinら, 1994, J. Exp. Med. 180: 211；Y. Liら, 1996, J. Exp. Med. 183: 639）。
腫瘍細胞の免疫原性を増強するために多くのアプローチが用いられてきた（例えば、このセクションで引用した文献を参照）。現在、研究下にある主なアプローチは、遺伝子導入を含んでいる。これに関して、今日まで用いられてきた方法のほとんどは、ＭＨＣまたはＢ７などの遺伝子とのex vivoまたはin vivoトランスフェクション、または腫瘍細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による修飾を必要とした（Y. J. Guoら, 1994, Science 263: 518；M. Tykocinski, 1996, A. J. Path. 148: 1；J. Young and K. Inaba, 1996, J. Exp. Med. 183: 7；L. Zitvogelら, 1996, J. Exp. Med. 183: 87；C. M. Celluzziら, 1996, J. Exp. Med. 183: 283）。これらのアプローチは、一次腫瘍細胞の低いトランスフェクション能のため、および、多数のＡＰＣを必要とするために、時間がかかり、かつ、問題が多い。
腫瘍細胞のサイトカインによるin vitro処理は、ＭＨＣおよび接着分子の発現を増加させる（R. Mattssonら, 1992, Bio-Reprod 46: 1176；R. J. Ulevitchら, 1991, Am. J. Pathol. 139: 287；F. Willemsら, 1994, Eur. J. Immune. 24: 1007；I. Saitoら, 1993, J. Clin. Lab. Anal. 7: 180；R. A. Panettieriら, 1994, J. Immune. 154: 1358；M. Ikedaら, 1994, J. Invest. Dermatol. 103: 791）。腫瘍細胞のＭＨＣ、Ｂ７−１およびＢ７−２遺伝子とのトランスフェクションは、低免疫原性腫瘍細胞系を免疫原性細胞系に転換する（S. E. Townsend and J. P. Allison, Science 259: 368；J. P. Allisonら, 1995, Curr. Opin. Immune. 7: 682；G. Yangら, 1995, J. Immune. 154: 2794；M. Kubinら, 1994, J. Exp. Med. 180: 211）。非免疫原性腫瘍細胞は、Ｂ７遺伝子単独とのトランスフェクションには応答しないが、細胞表面でのＣＤ４８分子の補発現（co-expression）により応答するようになることができる（Y. Liら, 1996, J. Exp. Med. 183: 639）。
コスティミュラトリー分子Ｂ７は、いくつかの環境下で、Ｔ細胞上のＢ７に対する第の受容体であるＣＴＬＡ−４への結合を介して負のシグナルを送達することができる。架橋結合性ＣＴＬＡ−４分子は、in vitroでＴ細胞増殖を阻害することが示された。さらにまた、ＣＴＬＡ−４を欠損しているマウスは、重篤なＴ細胞増殖障害を発症する（K. Kawaiら, 1993, Science 261: 609；J. P. Allison, M. K. Krummel, 1995, Science 270: 932；J. M. Greenら, 1994, Immunity 1: 501）。最近の報告により、ＣＴＬＡ−４媒介シグナル伝達をブロックする抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の導入の結果、あるマウスモデルにおいて腫瘍のＴ細胞依存性拒絶反応が増強されたことが示された（D. R. Leachら, 1996, Science 271: 1734）。これらのデータにより、ＣＴＬＡ−４がＣＤ２８コスティミュラトリーシグナルに対してカウンター−レギュレートすることが提供される。したがって、Ｂ７分子を発現するトランスフェクトされた腫瘍細胞は、ＣＴＬＡ−４媒介の負のシグナル伝達により有効な免疫を誘起できない。
Ｂ７遺伝子トランスフェクションを用いるＴ細胞活性化に加えて、予備刺激されたリンパ球と組み合わせて二重特異性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）を用いて、ある環境下でのＴ細胞活性化を誘発した。例えば、一の研究により、コステイミュラトリーシグナルは、ＣＤ３０＋ホジキン腫瘍由来細胞の存在下、ＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂで予備刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と組み合わせたＣＤ：２８：ＣＤ３０（ＣＤ３０は、ホジキン腫瘍関連抗原である）およびＣＤ３：ＣＤ３０に対するＢｉ−ＭＡｂの組み合わせにより送達され得るが；しかしながら、ＣＤ２８：ＣＤ３０およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂの組み合わせだけでは、ホジキン腫瘍由来細胞系に対するヒトＰＢＬを休止させる有意なin vitro細胞障害性を誘発せず、ＣＤ２８：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂ単独での刺激では、有効ではなかったことを報告した（C. Rennerら, 1994, Science 264: 833）。同様に、ＣＤ２８：ＣＤ３０およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂの両方をＣＤ３０＋細胞およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂでin vitroで予備刺激されたＰＢＬと組み合わせて用いた場合にのみホジキン腫瘍由来異種移植片の退縮が観察された；予備刺激されたヒトＰＢＬを用いずにＢｉ−ＭＡｂ単独または２つのＢｉ−ＭＡｂの組み合わせで処理した異種移植片においては有意な効果は観察されなかった（Rennerら, 上掲）。
発明の概要
本発明は、免疫原性腫瘍細胞および他の免疫原性自己細胞、かかる免疫原性細胞の好都合な作製方法、正常な細胞または健康な細胞に対しては最小効果を有しつつ病的細胞に対する免疫応答を活性化または増強するためのかかる免疫原性細胞の使用方法、および負のＴ細胞シグナル伝達経路の回避方法を特徴とする。
本発明は、弱免疫原性細胞または非免疫原性細胞の免疫原性を増強し、その結果としてＴ細胞活性化を刺激することができる細胞性ワクチンが得られ、次いで、病的細胞に対する有効な免疫応答に導く方法を提供するものである。本発明の細胞性ワクチンは、疾病を予防するためのワクチンとして、および、疾患を処置するための免疫療法薬として用いることができる。
概して、本発明方法は、(１)弱免疫原性自己細胞または非免疫原性自己細胞（標的細胞）を処理して、該細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅させる段階、および、(２)処理細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子（例えば、ＣＤ２８）に結合することができる物質を処理細胞に結合させ、これにより、Ｔ細胞への物理的結合能およびコスティミュラトリーシグナル活性化能を有する処理細胞を提供する段階を含む。かかる物質としては、限定されないが、処理細胞上の抗原ならびにＴ細胞上のＣＤ２８および／または別のコスティミュラトリー分子を標的とする二重特異性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）が挙げられる。第一段階は、自己細胞が（１）Ｔ細胞の表面上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子または（２）Ｔ細胞の表面上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する２つ以上の架橋分子と結合される場合は省かれる。
標的病的細胞におけるプライマリーおよび／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルがサイトカインまたは他の手段により増幅され、架橋分子を標的病的細胞に結合させた後、標的病的細胞を患者に投与する前に、標的病的細胞に結合されないサイトカインおよび架橋分子を免疫原性組成物から除去する。この追加の段階は、サイトカインを患者に投与することに関連する副作用を最小にする。それはまた、標的病的細胞に結合されない架橋分子を患者に導入することに関連する危険性をも最小にする。該危険性は、正常な細胞または健康な細胞に対して望ましくない免疫応答を生じる事象である。
該方法の第一段階は、処理細胞内での抗原処理能力をアップ・レギュレートし、Ｔ細胞活性化に関係する細胞表面分子の発現を増幅する。第二段階は、ＣＤ２８および／または別のコスティミュラトリー分子を介してＴ細胞に物理的に架橋する手段を有する処理細胞を提供し、これによりＴ細胞活性化を刺激するための最適条件を提供する。
したがって、第１の態様では、本発明は、標的病的細胞を有する哺乳動物患者（ヒトを含む）への投与用の免疫原性組成物を特徴とするものである。該免疫原性組成物は、病的細胞に特有な抗原をより効果的に処理し提供するという点で該患者における病的細胞とは異なる自己標的病的細胞を含有する。例えば、自己標的病的細胞は、１つ以上のプライマリーＴ細胞活性化分子（例えば、ＭＨＣ）および／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）をより高いレベル（例えば、５０％高い、好ましくは、２倍高い、より好ましくは、１０倍高い）で発現する。以下に記載するように、プライマリーおよび／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現レベルを増強する別の方法がある。
さらに、自己標的病的細胞は、１つ以上の架橋分子をそれに結合していた。各架橋分子は、エフェクター細胞（限定されないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＬＡＫ細胞、Ｂ細胞および他の白血球が挙げられる）の表面上の１つ以上のコスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する。好ましくは、必要ではないが、架橋分子は、標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原に対する１つ以上の結合部位を有しており、細胞表面抗原で標的病的細胞に結合される。別の好ましい具体例では、免疫原性組成物における実質的に全ての（例えば、＞８０％、好ましくは、＞９０％、より好ましくは、＞９５％）架橋分子は、自己標的病的細胞に結合されており、その結果、該組成物は、実質的に、標的病的細胞に結合されない架橋分子を含まない。さらに好ましい具体例では、免疫原性組成物は、標的病的細胞の医薬上有効量をそれに結合された架橋分子と共に含有する。
「免疫原性」とは、哺乳動物の免疫系の全部または一部の応答、特にＴ細胞の応答を活性化する能力を意味する。
「自己」とは、標的病的細胞が哺乳動物患者由来または共通の主要組織適合表現型を有する別の患者由来であることを意味する。自己標的細胞は、当業者に知られている方法を用いて哺乳動物患者または同一のＭＨＣを共有する別の供給源から得られる。
「標的病的細胞」とは、哺乳動物患者において疾患を生じるか、伝播するか、悪化させるか、または該疾患の一因である細胞を意味する。標的病的細胞としては、限定されないが、腫瘍細胞（非修飾腫瘍細胞、種々のアプローチで修飾された腫瘍細胞および一次構造を含む）が挙げられる。腫瘍細胞の供給源としては、限定されないが、肝臓癌、肝細胞癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭部および頚部癌、肉腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍、骨肉腫、ブレード癌、骨髄腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および膵癌が挙げられる。
標的病的細胞は、プリオン（とりわけ、狂牛病の原因である）、ウイルス、細菌、真菌類、原生動物または他の寄生生物（例えば、蠕虫）に感染した細胞であってもよい。
ウイルスとしては、Fields Virology, 第２版, 1990, Raven Press, New York（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例えば、限定されないが、疱疹ウイルス、ライノウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型）、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、およびＨＬＶが挙げられる。
細菌としては、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 第９版, 1994, Williams and Wilkins（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例としては、限定されないが、グラム陽性および陰性菌、ストレプトコッカス、シュードモナスおよびエンテロコッカス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、エロモナス・ヒドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、エロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、エロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）、ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uberis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、バシラス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、セラチア・リクファシエンス（Serratia liquefaciens）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ザントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、エシュリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）が挙げられる。
プライマリーＴ細胞活性化分子としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIおよび抗原処理および／または提示に関連する他の分子が挙げられる。コスティミュラトリーＴ細胞活性化分子としては、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２、ＶＬＡ−１、ＶＣＡＭ−１，４−１ＢＢ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ならびに、Ｔ細胞表面タンパク質を介するＴ細胞コスティミュラトリー経路を活性化することができる他の細胞接着タンパク質および他の細胞表面タンパク質が挙げられる。
「架橋分子」とは、２つ以上の細胞を、その結合部位を有する細胞への結合により一緒に結合することができる分子または物質を意味する。好ましくは、架橋分子は、エフェクター細胞と一緒に自己標的病的細胞を担持することができ、エフェクター細胞にシグナルを送達して、該標的に対するエフェクター細胞の免疫応答を活性化または増強することができる。架橋分子は、エフェクター細胞上のスティミュラトリーおよび／またはコスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する。これらの結合部位は、Ｔ細胞活性化の正の調節物質（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ）を活性化するが、Ｔ細胞活性化の負の調節物質（例えば、ＣＴＬＡ−４）の刺激を回避するように設計することができる。該結合部位は、また、Ｔ細胞活性化の負の調節物質をブロックするように設計することもできる（Leachら, Science 271: 1734-1736, 1996を参照）。架橋分子は、また、標的病的細胞の表面上の抗原に対する１つ以上の結合部位をも有する。架橋分子としては、限定されないが、二重特異性モノクローナル抗体、融合タンパク質、有機高分子物質、および、化学物質および生化学物質のハイブリッドが挙げられる。U.S.特許5,601,819、5,637,481,5,635,602、5,635,600、5,591,828、5,292,668および5,582,996に開示または記載されている抗体は、引用して本明細書の記載とする。
架橋分子に対するアンカーとして供する標的細胞上の抗原は、架橋分子がin vitroで標的細胞に結合される場合に標的細胞に対して固有である必要はない。標的細胞表面上の分子を用いて架橋分子を固定することができる。該分子としては、限定されないが、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、リン脂質、脂質凝集物、ステロイド、ならびに二糖類、オリゴ糖類および多糖類などの炭水化物群が挙げられる（Garland Publishing, Inc. NY & Londonにより発行された“Molecular Biology of The Cell,”第47-58頁, 第276-337頁, 第２版を参照）。例としては、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ｇｐ５５、ｇｐ９５、ｇｐ１１５、ｇｐ２１０、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、コラーゲンおよびフィブロネクチン受容体、トランスフェリン受容体、Ｆc受容体、ならびにサイトカイン受容体が挙げられる。
エフェクター細胞の表面上のコスティミュラトリー分子は、標的細胞を破壊するこれらのエフェクター細胞の機能を刺激またはコスティミュレートすることができる、抗原、脂肪酸、脂質、ステロイドおよび糖であってよい。コスティミュラトリー分子としては、限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｒ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５１／６１複合体、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤｗ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤｗ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１１０−１１４、ＣＤ１１５、ＣＤｗ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８*、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤｗ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３*、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２５*、ＣＤ１２６、ＣＤｗ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤｗ１３０、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＶＬＡ−１、ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−２、４−１ＢＢ、サイトカインおよびケモカイン受容体が挙げられる。好ましい具体例では、架橋分子は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８または４−１ＢＢに対する結合部位を有する。
「医薬上有効な」とは、限定されないが、非制御細胞増殖、細菌感染およびウイルス感染を含む哺乳動物患者において病的細胞により生じるか、または、病的細胞に関連する１つ以上の臨床的症状を治療、軽減または予防する能力を意味する。
免疫原性組成物は、患者に投与するために単離、豊富化、または精製されてもよい。
免疫原性組成物に関する「単離される」とは、自己標的病的細胞が自然の供給源から単離されることを意味する。「単離される」なる用語の使用は、１つ以上の天然物質が通常の環境から取り出されたことを示す。したがって、標的病的細胞は、異なる細胞性環境中、または、他の細胞を含まない溶液中に置かれてよい。該用語は、標的病的細胞が存在する唯一の細胞であることを意味しないが、それが存在する優位な細胞であり（いずれの他の細胞よりも少なくとも２０−５０％多い）、患者の身体中で自然にそれに関連する別の組織を実質的に含まない（少なくとも純度約９０％）ことを示す。好ましい具体例では、該組成物は、Ｔ細胞などのエフェクター細胞を実質的に含まない。もう１つの好ましい具体例では、該組成物は、標的病的細胞に結合されない架橋分子を実質的に含まない。第３の好ましい具体例では、該組成物は、標的病的細胞の外側にサイトカインを実質的に含まない。
免疫原性組成物に関する「豊富化」とは、自己標的病的細胞が患者の身体中の病的組織におけるよりも該組成物における方が全細胞の有意に高いフラクション（２−５倍）を構成することを意味する。これは、存在する他の細胞の量の優先的な減少もしくは特異的標的病的細胞の量の優先的な増加またはこの２つの組み合わせにより生じさせられる。しかしながら、豊富化は、存在する他の細胞が全くないこと、問題の細胞の相対的な量が有用な方法で有意に増加したことを意味しないことに注意すべきである。「有意に」なる用語は、本明細書では、増加のレベルがかかる増加を行わせしめるのに有用であることを示すために用いられ、一般に、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５〜１０倍またはそれ以上の他の細胞に対する増加を意味する。
免疫原性組成物に関する「精製された」とは、絶対的な純度を必要としないが（例えば、ホモジニアス調製物）；代わりに、標的病的細胞が自然環境におけるよりも比較的純粋であることを示す。標的病的細胞は、修飾を伴うかまたは伴わずに、患者から直接または細胞培養物から得られる。少なくとも１オーダー、好ましくは、２または３オーダー、より好ましくは、４または５オーダーの精製が特に考えられる。好ましい具体例では、該組成物は、Ｔ細胞などのエフェクター細胞を実質的に含まない。
免疫原性組成物は、医薬上好適な担体または賦形剤を含有してよい。製剤化および投与のための技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)において見られる。免疫原性組成物は、全身的に、例えば静脈内注入または皮下注射により、患者に投与されてよい。本発明組成物は、各単位が希釈剤として生理学的に耐えられる水性媒体と関係して所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量（例えば、約１×１０5〜約１×１０10、好ましくは、約１×１０6〜約１×１０9、より好ましくは約１×１０7〜約１×１０8）の武装および／または活性化した自己標的病的細胞を含有する単位投薬として哺乳動物患者に投与されてもよい。
プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現は、種々の手段により、例えば、サイトカインまたは所望の増幅を誘発する能力を有する他の因子での標的細胞のin vitro、ex vivoまたはin vivo処理；ならびにＭＨＣ遺伝子、接着分子遺伝子、サイトカイン遺伝子および／またはそれらの各転写活性化剤またはエンハンサーの標的細胞へのin vitroおよびin vivoトランスファーにより増強されてもよい。サイトカインとしては、The Cytokine Handbook, Thomson, A., (編), 1994, Academic Press, San Diego（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例としては、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、β、およびγ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、およびβ）ならびに他のケモカインおよびリンホカインが挙げられる。好ましい具体例では、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを単独または組み合わせて用いて、自己標的病的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現を増強する。
架橋分子で被覆された標的病的細胞が患者に投与されると、それは、エフェクター細胞の表面上のコスティミュラトリー分子に結合するであろう。標的病的細胞が架橋分子で被覆されるのが密であるほど、より多くのエフェクター細胞を結合することができるであろう。さらに、架橋分子がコスティミュラトリー分子に対する結合部位を多く有するほど、より多くのエフェクター細胞を結合することができるであろう。
出願人は、多数の架橋分子がＴ細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する結合部位を有する標的細胞に結合される場合、細胞性ワクチンが（プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させるために）サイトイカン処理を必要とせずに製造されることを見出した。個々の架橋分子は、標的病的細胞の表面上の種々のアンカー分子に結合されてよい。個々の架橋分子は、Ｔ細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有してもよい。
したがって、第２の態様では、本発明は、(ａ)２つ以上の異なるエフェクター細胞に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子、(ｂ)エフェクター細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子、(ｃ)各々が異なるエフェクター細胞に対する結合部位を含有する２つ以上の架橋分子、（ｄ）各々がエフェクター細胞の表面上の異なるコスティミュラトリー分子に対する結合部位を含有する２つ以上の架橋分子、（ｄ）各々が標的細胞上の異なる抗原に結合される２つ以上の架橋分子、または（ｅ）上記架橋分子の２つ以上を組み合わせたものを結合した自己標的病的細胞を含有する免疫原性組成物を特徴とする。
本発明の免疫原性組成物の医薬上有効量は、哺乳動物患者への投与の前に医薬上許容される担体により補完されてよい。
別法としては、(１)腫瘍細胞における１つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させる能力を有する医薬上有効量のサイトカイン、(２)腫瘍細胞の表面上の抗原に対する結合部位およびＴ細胞の表面上のコスティミュラトリー分子に対する結合部位を含有する医薬上有効量の架橋分子、および（３）医薬上許容される担体を含有する医薬組成物を患者に投与してもよい。
患者を治療する際に、自己標的細胞は、該標的細胞を患者に投与する前に、サイトイカンまたはin vitroでプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子を増加させる他の手段で処理されてよい。別法としては、患者にサイトカンを投与して、in vivoでプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子を増加させてよい。
第３の態様では、本発明は、免疫原性組成物と反応させるのに充分な時間、in vitroでエフェクター細胞（例えば、白血球）の個体群を前記免疫原性組成物と接触させ、処理されたエフェクター細胞個体群を回収することにより哺乳動物患者における病的細胞に対する細胞傷害性白血球を生じさせる方法を特徴とする。このようにして生じた細胞傷害性白血球は、次いで、患者に投与して、疾患を治療または予防することができる。
本発明の方法は、Ｔ細胞活性化により引き起こされる免疫応答を回避することにより発症および／または持続する疾患の予防および治療に有用である。かかる疾患としては、例えば、全ての癌、自然および誘発性免疫不全状態、ならびに種々の病原体での感染により生じる疾患が挙げられる。本発明の方法は、本明細書では３つのタイプのヒト癌へのその適用を示すことにより説明される。癌細胞は、本質的には一般に弱い免疫原性を有するものであり、有効なＴ細胞応答を引き起こさず、生き残り、結果として増殖する。本明細書で示すとおり、本発明の自己腫瘍細胞ワクチンを用いて有効なＴ細胞応答を刺激することにより、癌を予防することができ、確立された癌を治療することができる。
本発明の他の特徴および長所は、以下の発明の詳細な説明から、および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１．サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞上のＭＨＣクラスＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１抗原の発現。結果は、４つの比較可能な実験からの代表的なデータである。
図２．サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞および抗−ＣＤ２８ ＭＡｂにより誘発されたin vitroでの同遺伝子型脾Ｔ細胞の刺激化および増殖。
図３．抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＭＡｂと組み合わせたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞でのナイーブ脾Ｔ細胞のin vitroプライミングにより生じたＣＴＬの細胞傷害性。
図４．抗ＣＤ−２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞での防御免疫の誘発。
図５．ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞での処理後の腫瘍拒絶反応。
図６．in vitroでの確立された肝細胞癌の治療。
図７．ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の治療有効性。
発明の詳細な説明
本発明は、疾患に対して個体を免疫化するための方法、および、本明細書に記載した二段階プロセスで製造した細胞性ワクチンを用いて確立した疾患を有する個体を治療するための方法を提供するものである。本発明の方法は、有効な治療または予防がＴ細胞の活性化を介する免疫ブーストを必要とする低免疫原性または非免疫原性応答病理を含む障害に適用可能である。かかる障害としては、限定されないが、癌の全ての形態、免疫不全障害（自然および誘発性の両方）、およびウイルスまたは他の病原因子により生じた感染性疾患が挙げられる。
本発明の方法は、(１)プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅させるために標的細胞を処理し、(２)標的細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子（すなわち、ＣＤ２８）への結合能を有する物質を該標的細胞に結合させることにより、該障害の弱免疫原性または非免疫原性自己細胞（標的細胞）を修飾することからなり、これにより、Ｔ細胞に物理的に結合する能力およびコスティミュラトリーシグナルを活性化する能力を有する標的細胞を提供する。かかる物質としては、限定されないが、処理細胞上の抗原ならびにＴ細胞上のＣＤ２８および／または他のコスティミュラトリー分子を標的とした二重特異」性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）が挙げられる。
当該方法の第１段階は、ＭＨＣおよび接着分子のようなＴ細胞活性化に関係した細胞表面分子の発現を増幅し、細胞内抗原処理に関係した酵素活性を増強することにより標的細胞内での抗原処理能をアップ・レギュレートする。当該方法の第１段階のために、標的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅することができる手段（すなわち、ＭＨＣおよび接着分子の発現）を用いてもよい。かかる増幅した発現は、例えば、サイトカインまたは所望の増幅を誘発する能力を有する他の因子でのin vitroおよびin vivo処理；ならびにＭＨＣ遺伝子、接着分子遺伝子、サイトカイン遺伝子、および／またはＭＨＣ、接着分子、およびサイトカイン遺伝子転写活性化剤またはエンハンサーの標的細胞へのin vitroおよびin vivoトランスファーにより行われてよい。
当該方法の一の具体例では、標的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルの増幅は、サイトカイン処理を用いて行われる。標的細胞は、本明細書の実施例に記載するようにex vivoまたはin vitroでサイトカインで処理されてよい。別法としては、サイトカインは、好適な医薬担体または制御放出調製物において、例えば、病変局内注射、リンパ内注射、皮下注射などによりin vivoで標的細胞に投与されてよい。ＭＨＣおよび接着分子の増幅発現を生じるいずれかのサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて、当該方法の第一段階で細胞を処理してよい。本明細書の実施例によりさらに充分に記載される好ましい具体例では、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の組み合わせは、該第一段階で用いられる。好ましくは、細胞は、約１０〜１００Ｕ ＴＮＦ−αと組み合わせた約１０〜１００Ｕ ＩＦＮ−γの濃度で、より好ましくは以下のセクション６.１に記載するように１００Ｕ ＩＦＮ−γおよび５０Ｕ ＴＮＦ−αで処理されてもよい。しかしながら処理されるべき特定細胞上の活性化シグナルの増幅に最も最適な条件および特異的サイトカインは、変化してよく、実質的には以下のセクション６.１に記載するように決定されてよい。
本発明の方法の第二段階は、ＣＤ２８および／または他のＴ細胞コスティミュラトリー分子を介するＴ細胞表面に物理的に結合する能力を有する処理細胞を提供し、これにより、Ｔ細胞活性化を刺激するための最適な条件を提供する。該第二段階のために、処理細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子への結合能を有する物質を用いてよい。かかる二重特異性または多重特異性架橋物質は、例えば、標的Ｔ細胞コスティミュラトリー分子に結合し、該コスティミュラトリーシグナルを活性化し、該コスティミュラトリーシグナルの活性化を誘発する能力を有する官能性を含有する、Ｂｉ−ＭＡｂ、タンパク質および他の巨大分子、ならびに高分子物質からなる。以下のセクション６において実施例により記載する一の具体例では、Ｂｉ−ＭＡｂを架橋物質として用いる。
二重特異性または多重特異性架橋物質の一の官能性は、標的細胞特異的抗原または標的細胞上で発現されるいずれかの抗原に向けられる。最適には、標的細胞がin vivoで架橋物質で武装されるべきである場合、該架橋物質が向けられる標的細胞抗原は、固有であるべきである。
しかしながら、架橋物質の結合は、in vitroで行われるので、標的細胞抗原は、処理細胞に固有である必要はない。したがって、in vitroで標的細胞に結合した架橋物質は、修飾細胞で免疫化されるべき個体における細胞上の同一抗原と交差反応しないであろう。
かかる架橋物質を当該方法の第一段階に従って処理した細胞と一緒にインキュベートした後、遊離の架橋物質を洗浄除去し、結合した架橋物質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の架橋剤を用いて細胞表面に架橋結合させる。二重特異性または多重特異性架橋物質の別の官能性は、ＣＤ２８などのＴ細胞活性化コスティミュレーターに特異的に向けられる。したがって、修飾細胞を用いて個体を免疫化した場合、結合した架橋物質のＣＤ２８（または他のコスティミュラトリー分子）結合部位は、空いており、Ｔ細胞表面上のＣＤ２８（または他のコスティミュラトリー分子）に結合するであろうし、このことは、修飾細胞がＴ細胞に物理的に結合するようになるであろうということを確認している。この架橋物質媒介物理的結合は、また、サイトカイン処理段階により増幅されたものもある修飾細胞の表面上の他の分子をＴ細胞の表面上の他の分子と接触させ、さらにコスティミュレーションを提供し、これにより、さらに、Ｔ細胞活性化を促進する。
当該方法の第二段階は、標的細胞がin vivoまたはin vitroのいずれで当該方法の第一段階に従って処理されたか、治療されるべき疾患または病変の環境、および治療の臨床目的に依存して、in vitroまたはin vivoで行われる。当該方法の第一段階がin vivoで行われる場合、処理細胞もまた同様に、in vivoで架橋物質で武装される。この場合、臨床医は、患者に架橋物質を投与するための種々の公知の方法を用いる。当該方法の第一段階に従ってin vivoで処理した疾患または病変特異的細胞（標的細胞）を有している患者に架橋物質を投与する最良の経路は、処理されるべき疾患または病変の臨床的特徴および／または他の特徴ならにび処理される細胞の部位に依存するであろう。例えば、リンパ節に位置する標的細胞をin vivoで処理する場合、架橋物質のリンパ節への直接投与が好ましい。同様に、例えば、腫瘍細胞をサイトカインまたは遺伝子トランスファーベクターの腫瘍内注射によりin vivoで処理する場合、架橋物質は、腫瘍中に直接または腫瘍の局所環境に投与されるべきである。
当該方法の第一段階がin vitroで行われる場合、処理細胞は、in vivoまたはin vitroで架橋物質で武装される。架橋物質がin vivoで投与される場合、in vivo処理した標的細胞のin vivo武装に関して上記で検討した同一因子を考慮して、処理細胞を投与するために用いた同一経路または類似の経路を用いるべきである。
in vitro処理細胞がin vitroで武装される場合、処理された武装細胞（細胞性ワクチン）は、疾患の治療および予防のためにin vivoで、または、病変もしくは疾患特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生のためにin vitroで用いられる。in vitroで処理細胞を武装することにより、標的細胞上のいずれかの抗原に向けられた結合を用いることができるという長所が得られる。
患者の治療または免疫化のために用いる場合、in vitro処理された武装細胞は、当業者に知られている種々の方法を用いて患者に投与される。以下の実施例でより充分に記載される特定の具体例では、in vitro処理された武装細胞は、皮下注射される。別の具体例では、処理された武装細胞は、ある環境下で（例えば、処理されるべき病変が、充分には血管化されていないか、生検に対してアクセス不可能であるか、または患者に対してさらなる危険性を生じずに粉砕され得ない場合）皮下投与よりも優れている点を提供する投与経路である直接病変内注射により投与される。さらなる具体例では、処理された武装細胞は、リンパ節への注射により投与される。この投与方法は、別の投与経路を用いる場合に典型的に必要とされるよりもわずかな処理された武装細胞を必要とするだけである。かかるリンパ内投与は、限定された自己組織のみを細針生検技術を用いて病変から得ることができる場合（すなわち、アクセス不可能な／手術不可能な癌）に好ましい。さらにまた、リンパ内投与は、細胞性ワクチンとリンパ節内に多数のＴ細胞を与えるＴ細胞との間の相互作用を増強すると思われる。出願人の最初の実験データは、本発明の方法を用いて調製した１×１０4個程度の細胞性癌ワクチン細胞の単回リンパ内注射が非経口腫瘍細胞抗原投与に対して有効な免疫応答を誘発することができ、確立された腫瘍を治療することができることを示す。この投与方法の治療的効果は、皮下投与された１００倍以上の細胞を用いて行われたものと等価であると思われる。
本発明の方法の特定の具体例では、ＣＤ２８と反応するＢｉ−ＭＡｂが二重特異性架橋物質として用いられる。上記セクション２において簡単に検討されたように、Ｂ７は、Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方と相互作用する。ある環境下で、Ｂ７−ＣＴＬＡ−４相互作用は、Ｔ細胞活性化を防止する負のシグナルを生じる。したがって、ＣＤ２８に対して特異的なＢｉ−ＭＡｂで被覆された細胞で免疫化することにより、かかる細胞上のＢ７とＣＴＬＡ−４（または他のＴ細胞活性化ダウン・レギュレート分子）との間の相互作用は、最小化および／または回避される。さらに、他のコスティミュラトリーＴ細胞表面分子（すなわち、ＣＤ２、ＣＤ４８）と反応するＢｉ−ＭＡｂもまた、本発明の方法の実施の際に用いてよい。さらにまた、より有効なコスティミュレーションは、種々のＴ細胞コスティミュレーターに対する特異性を有する多数のＢｉ−ＭＡｂを用いて行われる。
架橋物質は、よく知られている技術を用いて製造される。以下の実施例に示すように、Ｂｉ−ＭＡｂは、架橋物質として有効に用いられる。かかるＢｉ−ＭＡｂは、当該技術分野でよく知られている方法、例えば、下記セクション６.２に記載され、本明細書で引用された文献に開示されているような方法を用いて得られる。多数のＴ細胞コスティミュラトリー分子結合部位を含有するＢｉ−ＭＡｂは、多数のコスティミュラトリー活性化回路を生じる手段を提供するために化学結合により製造される。
Ｂｉ−ＭＡｂに加えて、標的細胞の抗原およびＴ細胞コスティミュラトリー分子の両方に対して特異的な官能性結合部位を含有するように処理された分子は、本発明の方法の実施の際に架橋物質として用いられる。かかる分子は、例えば、所望の結合部位を含有するように処理された、タンパク質、他の巨大分子、および高分子物質からなっていてもよく、遺伝子工学技術、合成技術を用いることにより、または、構成要素をなすポリペプチド、高分子物質、および／または他の巨大分子の化学結合により製造される。かかる架橋物質の結合部位成分は、例えば、Ｆab２抗体フラグメント、抗体結合部位、天然のもしくは処理されたリガンド、または、標的細胞抗原およびＴ細胞コスティミュラトリー分子と反応する他の因子からなる。
架橋物質は、当該技術分野でよく知られている医薬上許容される単体または種々の薬物デリバリーシステムを用いてin vivoで患者に投与される。例としては、癌免疫治療のためには、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γおよび抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの組み合わせは、リンパ節または腫瘍自体に該調製物を直接注射することにより患者に投与される制御放出調製物内に製剤化される。
本発明の方法は、癌を治療する際に特に有用である。本発明のこの態様は、下記セクション６.で示される実施例によりさらに充分に記載される。該実施例で示されるデータは、（１）γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)の組み合わせによる自己腫瘍細胞のin vitro処理、ならびに(２)腫瘍細胞上の抗原およびＴ細胞上のＣＤ２８の両方に対して特異的なＢｉ−ＭＡｂとの予備インキュベーションからなる本発明の二段階法を用いて、強い免疫原性の腫瘍細胞を得ることができることを示す。得られた修飾腫瘍細胞は、確立された腫瘍を予防することも治療することもできるＣＴＬ媒介免疫を生起する細胞性ワクチンとして作用することができる。
特に、以下の実施例に記載した研究は、サイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装肝細胞癌が非経口腫瘍細胞抗原投与に対して防御免疫を誘発し、さらにまた、マウスにおいて確立された肉眼的肝細胞癌を治療することを示す。さらに、下記セクション６.７.に記載した実験は、リンパ腫および結腸癌に対しても防御免疫を誘発することを示す。
種々の投与経路またはその組み合わせは、本発明の細胞性ワクチンを用いて種々の癌または他の疾患を治療する場合に好ましい。セクション６.４.に簡単に記載する実験により説明されるように、サイトカイン処理した（非武装）細胞による免疫化後の抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの静脈内投与により、肝細胞癌モデル系においていくつかの抗腫瘍免疫が誘発される。
比較すると、下記セクション６.５.および６.６.に記載される実験の結果により示されるように、in vitroでサイトカインで処理され、in vitroでＢｉ−ＭＡｂで武装された細胞の投与は、均一な腫瘍免疫を誘発し、確立された肝細胞癌を治療する。前者の場合に静脈内注射後の腫瘍組織へのＢｉ−ＭＡｂの不充分な局在化が治療効果の差異の原因である可能性がある。
個体は、サイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装自己細胞で種々の疾患に対して免疫化され、これにより、Ｔ細胞を活性化して防御免疫を与えるのに充分なシグナルを有する個体の免疫系を提供する。同様に、個体は、疾患または病変のサイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装自己細胞を投与することにより種々の疾患について治療され、これにより、Ｔ細胞を活性化して細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘発するのに充分なシグナルを有する個体の免疫系を提供する。両者の場合、他のＴ細胞コスティミュラトリー分子に対する特異性を有するＢｉ−ＭＡｂを用いて、in vivoでＴ細胞に物理的に結合する手段で処理細胞を武装する。
ＭＨＣクラスＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１分子に加えて、サイトカインでの処理は、腫瘍細胞による腫瘍抗原処理を増強し、Ｔ細胞活性化に必須の他の細胞表面分子の発現を誘発する。サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞と固定化抗ＣＤ２８ ＭＡｂとの組み合わせは、in vitroで脾Ｔ細胞を刺激できず、出願人のモデル系ではin vivoで抗腫瘍免疫を誘発できない。このことは、ＣＤ２８と抗ＣＤ２８ ＭＡｂとの間の相互作用により送達されたシグナルがＴ細胞活性化を誘発するのにそれ自体では充分ではないことを示唆する。
対照的に、in vitroで抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理腫瘍細胞がＴ細胞上のＣＤ２８と相互作用する場合に強い免疫原性応答が得られ、これは、物理的結合機能が活性化プロセスの重要な成分であることを示唆している。
さらに、サイトカイン処理しＢ７トランスフェクトしたｈｅｐａ １−６細胞がin vitroで脾Ｔ細胞を活性化することができなかったという観察結果（下記セクション６.２.）は、Ｂ７がＣＴＬＡ−４と相互作用として負の調節シグナルを送達するという最近の発見と一致し、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂを用いてＴ細胞活性化のためのＣＤ２８分子に特異的に抗原提示細胞を物理的に結合させるための強い理論的根拠を提供する。
本発明は、細胞性ワクチンの開発のための遺伝子導入および腫瘍：ＡＰＣエンジニアリングについて有効な選択を提供する。以下の実施例に記載した本発明の特定の具体例では、Ｂｉ−ＭＡｂの腫瘍または他の標的細胞への結合は、in vitroで生じる。したがって、かかる細胞上の抗原は、これらの細胞に固有である必要はない。実質的には、いずれの抗原も標的とされる。Ｂｉ−ＭＡｂは、処理されるべき個体の細胞の大きな個体群（すなわち、リンパ球）上でも発現する抗原を含む、抗ＣＤ２８ ＭＡｂを腫瘍または他の標的細胞上で発現された抗原を認識するＭａｂに結合させることにより生じることができる。このアプローチは、腫瘍特異的抗原に対するＭａｂが入手可能ではない場合に特に有用である。
実施例６.１
in vitroでのｈｅｐａ １−６細胞上の接着分子およびＭＨＣ分子のサイトカイン誘発発現
ｈｅｐａ １−６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて生じる化学的誘発性肝細胞癌である（G. J. Darlingtonら, 1980, J. Natl. Cancer Inst. 64: 809）。この腫瘍由来の細胞は、迅速に増殖し、同遺伝子型動物において皮下小節を形成する。ｈｅｐａ １−６細胞は、それらの細胞表面上のＭＨＣクラスＩおよびＢ７分子の両方を欠いており、Ｂ７−１またはＢ７−２分子をコードしている遺伝子でトランスフェクトした場合でさえ宿主免疫応答を誘発しない。
ｈｅｐａ １−６細胞上の活性化シグナルの増幅に最も最適な条件およびサイトカインは、以下のとおり決定された。ｈｅｐａ １−６細胞１mlを２×１０6細胞／mlの濃度で２４ウエル組織培養プレート中で平板培養し、１０％ウシ胎児血清、２mMグルタミン、１×可欠アミノ酸および１mMピルビン酸ナトリウムで補足された完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、ＩＦＮ−γ １００Ｕ、またはＴＮＦ−α ５０Ｕ、またはこれらの同一濃度でのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの組み合わせと一緒に３７℃で４８時間インキュベートした。培地単独中で行う以外は同様にインキュベートしたｈｅｐａ １−６細胞を対照として用いた。
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、マウスＭＨＣクラスＩ（Ｍ１／４２）、ＭＨＣクラスII（Ｍ５／１１４）、ＣＤ４４（ＫＭ８１）（ＡＴＣＣ）、ＩＣＡＭ−１（ＨＡ５８）、ＩＣＡＭ−２（３Ｃ４）およびＶＣＡＭ−１（５１−１０Ｃ９）（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンゲン（PharMingen））に対するラットモノクローナル抗体で染色した。マウスＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）について染色するために、本発明者は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有する可溶性融合タンパク質であるＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いた（Y. J. Guoら, 1994, Science 263: 518；C. Cauxら, 1994, J. Exp. Med. 180: 1841；E. Murphyら, 1994, J. Exp. Med. 180: 223；R. Sederら, 1994, J. Exp. Med. 179: 299；B. Blazarら, 1994, Blood 83: 3815；K. Hathcockら, 1993, Science 262: 905；P. Linsleyら, 1991, J. Exp. Med. 174: 561）。
細胞を氷上で抗体またはキメラタンパク質と一緒に４０分間インキュベートした。マウスＣＤ３（ＹＣＤ３）に対するラット抗体および可溶性ヒトＣＤ４４−Ｉｇキメラタンパク質を負の対照として用いた。細胞を３回洗浄した。ラットＩｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート・ヤギ抗体またはヒトＩｇに対するＦＩＴＣ標識ウサギ抗体を氷上でさらに４０分間添加した。次いで、試料を洗浄し、固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンホゼのベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））中で分析した。負の対照グループ（培地単独）における平均蛍光強度は、ＩＣＡＭ−１を除いてバックグラウンドレベルであった。
インターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の組み合わせと一緒にインキュベートしたｈｅｐａ １−６細胞は、ＭＨＣクラスＩ、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ−２）および血管接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の発現を示し、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の有意に増強した発現を示した(図１)。この発現パターンは、培地からサイトカインを除去した後にin vitroで３日間以上維持された。しかしながら、サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞（ＣＴ−ｈｅｐａ １−６）は、なおも、同遺伝子型動物において腫瘍を形成することができた。これは、該細胞が、Ｂ７の発現の不在によりＣＤ２８媒介コスティミュラトリーシグナルを提供するのに不充分であったためであると思われる。
実施例６.２
in vitroでのサイトカイン処理したｈｅｐａ １−６細胞および抗ＣＤ２８Ｂｉ−ＭＡｂにより誘発された同遺伝子型脾Ｔ細胞の刺激および増殖
以下の実施例は、ＣＤ２８に対するＢｉ−ＭＡｂおよび腫瘍細胞を組み合わせたサイトカイン活性化ｈｅｐａ １−６細胞が脾Ｔ細胞の増殖をin vitroで刺激することを示し、これは、かかるＢｉ−ＭＡｂがＣＤ２８コスティミュラトリーシグナルを提供することができることを示している。各々がＴ細胞上のＣＤ２８分子に対する１つの結合特異性および腫瘍細胞表面上で発現された３つの糖タンパク質のうちの１つに対する第二の結合特異性を有する３つのＢｉ−ＭＡｂ、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５、およびＣＤ２８：ｇｐ２１０を以下のとおり作製し使用した。
ＭａｂおよびＢｉ−ＭＡｂの製造のために、ウィスター（Wistar）ラットをＣＦＡ中の２×１０7ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化した。８週間にわたるＩＣＦＡ中に同細胞を有する３つのさらなるブーストの後、従前の開示（J. Alan & T. Robin, in: Immunochemistry in Practice, 第２章（Blackwell, New York, 第２版, 1988））に従って免疫化ラット由来の脾臓細胞をＹＢ２／０ラット骨髄腫と融合した。免疫蛍光染色法により２０以上のＩｇ産生性ハイブリドーマを選択した。３つの抗体は、フローサイトメトリー分析法によりｈｅｐａ １−６細胞と反応した。これらのＭａｂは、別々に、イムノプレシピテーションにより決定されるようにほとんどの腫瘍細胞上で発現した５５Ｋｄ、９５Ｋｄまたは２１０Ｋｄ糖タンパク質を認識した。Ｍａｂは、各々、抗ｇｐ５５、抗ｇｐ９５および抗ｇｐ２１０と称された。抗マウスＣＤ２８ Ｍａｂは、最初に、細胞表面上の高レベルのＣＤ２８抗原を発現しているマウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞系でウィスターラットを免疫化することにより得られた。細胞融合後、抗ＣＤ２８ ＭＡｂを産生しているハイブリドーマをＦＡＣＳｃａｎにより免疫蛍光分析法で選択した。抗ＣＤ２８ Ｍａｂは、さらに、イムノピレシピテーションならびにＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生アッセイにより特徴付けられ、確認された。ＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂを産生するために用いられた抗マウスＣＤ１８を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣから購入した。これらの実験で用いた全てのＭａｂは、ヌードマウス由来の腹水をタンパク質Ｇカラムに通すことにより精製した。
Ｂｉ−ＭＡｂは、従前の開示（J. A. MacLeanら, 1993, J. Immunol. 150: 1619；L. K. Gillilandら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7719；C. Bodeら, 1989. H. Biol. Chem. 264: 944）に従って、これらのＭａｂから産生された。
正常な脾Ｔ細胞をナイロンウールカラムにより精製した。精製したＴ細胞（５×１０６／ウエル）を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で９６時間、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５またはＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂの存在または不在下、５×１０5個の放射線照射（５０００レントゲン）サイトカイン処理（上記セクション６.１.の記載に従う）または未処理ｈｅｐａ １−６細胞と一緒に共培養した。Ｔ細胞上のＣＤ１８を腫瘍細胞上のｇｐ５５に結合するＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂおよび親ＣＤ２８＋ｇｐ５５ Ｍａｂの混合物を対照として用いた。Ｂ７遺伝子でトランスフェクトされた、細胞表面上の高レベルのＢ７分子を発現するサイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞もまた対照として用いた。Cy−ChromTM標識抗ＣＤ３、ＰＥ標識抗ＣＤ８およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ２５抗体（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンゲン）を用いてＦＡＣＳｃａｎ中での三色分析法によりＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞のパーセンテージ（平均∇ＳＤ）を決定した。
Ｂｉ−ＭＡｂの各々は、ｈｅｐａ １−６細胞のサイトカイン処理と組み合わせてその腫瘍特異性ＣＴＬを活性化する能力についてin vitroおよびin vivoの両方で試験した。マウス脾臓細胞を、各々５０mg／mlの精製した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照抗体の存在下、抗体サイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞と一緒に３７℃で９日間共培養した。
図２に示した結果は、サイトカイン処理腫瘍細胞と３つの抗ＣＤ２８ ＢｉＭＡｂのいずれか１つとの組み合わせが脾Ｔ細胞増殖を有意に刺激することを示唆している。
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたはサイトカイン処理自己腫瘍細胞のいずれかの不在下では刺激は得られなかった。おもしろいことには、Ｂ７でトランスフェクトされて高レベルのＢ７を発現しているｈｅｐａ １−６細胞は、同様の方法でサイトカインで処理した場合にin vitroでナイーブＴ細胞を刺激する際に有効ではなかった。このアプローチにより生じたリンパ球の大部分は、ＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞であった。
実施例６.３
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと組み合わせてサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞により生じたＣＴＬのin vitro細胞傷害性
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＭＡｂと組み合わせてサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞でのナイーブ脾Ｔ細胞のin vitroプライミングにより生じたＣＴＬの細胞傷害性は、以下のように確立された。ナイロンウール豊富化ナイーブＴ細胞（５×１０6／ウエル）をまず、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ、対照抗体と組み合わせた５×１０5個の放射線照射（５０００レントゲン）サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞（上記セクション６.１の記載に従う）または放射線照射Ｂ７+ｈｅｐａ １−６細胞単独と一緒に３７℃で９日間インキュベートすることによりin vitroで刺激した。γ線照射したナイーブ脾臓細胞（５×１０6）を支持細胞として培養物に添加した。刺激後３日目および６日目に、組換えヒトＩＬ−２（２０Ｕ）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地２mlを各培養ウエルに別々に添加した。
同遺伝子型の同種異系腫瘍細胞に対するＣＴＬおよびＮＫ感受性ＹＡＣ−１細胞系の細胞傷害性を、標準的な４時間51Cr放出アッセイで決定した。３つの実験の結果は、図３において、腫瘍細胞溶解の指標として１：２０ Ｅ：Ｔ比での51Cr放出のパーセンテージとして示される。これらの結果は、本明細書の記載に従って生じたＣＴＬが自己腫瘍細胞に対して特異的な細胞溶解活性を有することを示す。
実施例６.４
サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の腫瘍形成性（tumorigenicity）に対する静脈内投与した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの効果
サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞を注射した後、１日目、２日目および４日目に抗ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂを１００μgの用量で静脈内投与されたマウスは、遅延腫瘍形成を経験し、これらのマウスの４０パーセント（８／２０）は、腫瘍退縮を経験した。親ｈｅｐａ １−６細胞と抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂとの組み合わせまたはＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞と対照抗体との組み合わせを注射した動物は、腫瘍細胞の接種後６０日以内に全て腫瘍を発症し、死亡した。Ｂｉ−ＭＡｂの注射後２４時間目、４８時間目、および７２時間目の免疫組織学的実験は、Ｂｉ−ＭＡｂが腫瘍組織以外に肺、肝臓および腎臓において広範に分布していることを示した。
実施例６.５
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞でのin vitroでの防御免疫の誘発
腫瘍細胞を、まず、１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、ＩＦＮ−γ １００ＵおよびＴＮＦ−α ５０Ｕの組み合わせでin vitroで３７℃、５％ＣＯ2で４８時間処理した。次いで、細胞を２０℃でリン酸緩衝化生理食塩水pH７.４（ＰＢＳ）×３で洗浄し、上記セクション６.１.の記載に従って、氷上で４５分間５０μg／mlの濃度で抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にインキュベートした。４℃で６０分間、同量のＲＰＭＩ−１６４０中３０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中でさらにインキュベートした後、該細胞を前記に従って３回洗浄し、１−２×１０7／ml ＰＢＳの濃度に懸濁化させた。Ｂｉ−ＭＡｂまたはＭａｂで細胞を武装するために、サイトカイン処理または未処理親腫瘍細胞を各抗体で４５分間プレインキュベートした。
グループあたりＣ５７ＢＬ／６マウス５匹からなる５つのグループを、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５、ＣＤ２８：ｇｐ２１０または対照Ｂｉ−ＭＡｂ ＣＤ１８：ｇｐ５５で武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個で、または、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個で皮下免疫化した。２週間後、グループの各々におけるマウスに親ｈｅｐａ １−６細胞２.５×１０6個を皮下注射により抗原投与した。
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートされ／武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞（ＣＴ−ｈｅｐａ １−６）は、同遺伝子型マウスにおいて腫瘍を形成するそれらの能力を完全に失っているが、対照抗体と一緒にプレインキュベートされ／武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞は、それらの形成能を保持していた。免疫化実験の結果は、図４に示されている。ＣＤ２８／腫瘍抗原Ｂｉ−ＭＡｂの各々で武装されたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化されたマウスは、親腫瘍細胞での抗原投与に対する防御免疫を発症し、これらの動物の全ては、かかる抗原投与後１２０日間、腫瘍がないままであった（図４）。対照的に、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞または対照抗体ＣＤ１８：ｇｐ５５で武装されたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞のいずれかで皮下注射された全てのマウスは、親ｈｅｐａ １−６細胞での抗原投与後５０日以内に腫瘍を発症し、死亡した（図４）。この実験は、比較可能な結果を伴って２回繰り返した。
実施例６.６
本発明の方法の肝細胞癌系への適用：サイトカイン処理Ｂｉ−ＭＡｂ武装ｈｅｐａ １−６細胞での確立した肝細胞癌の治療
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞での免疫化が確立した肝細胞癌を治療することができることを確立するために、以下の３つの実験を行った。該実験の各々は、Ｂｉ−ＭＡｂ武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の治療的投与が肝細胞癌のための有効な治療法であることを示す。
第１の実験では、マウス４匹に野生型ｈｅｐａ １−６細胞２×１０6個を皮下接種した。１４日後、顕微的腫瘍の発症後、マウスを１０匹ずつ４つのグループに分けた。グループを、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂのいずれかで武装されたサイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞２×１０6個で皮下処理した。
この実験の結果は、図５に示されている。抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で処理したグループにおける全てのマウスは、１００日間以上生存した（図５）。対照的に、対照Ｂｉ−ＭＡｂ武装／サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞で処理したグループにおける全てのマウスおよびＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂまたはＣＤ１８：ｇｐ５５対照Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞で処理されたグループにおける全てのマウスは、約４０日以内に死亡した（図５）。この実験は、比較可能な結果を伴って２回繰り返した。
第２の実験では、マウス５匹ずつの５つのグループにｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個を皮下注射した。４週間後、６−８mm（最大径）の腫瘍を有しているマウスに、各々ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５またはＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞を皮下注射し、次いで、その７日後に同用量でＢｉ−ＭＡｂ武装／サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞のブーストを皮下注射した。各々５０μgの濃度でＣＤ１８：ｇｐ５５でプレインキュベートしたかまたは抗ＣＤ２８および抗ｇｐ５５親Ｍａｂの両方と混合した（ＣＤ２８＋ｇｐ５５）細胞を対照として用いた。腫瘍寸法は、定期的に測定した。
この実験の結果は、図６に示されている。ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５およびＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂで処理されたマウスにおける肝細胞癌は、約４０日以内に検出不可能な寸法に退縮した（図６）。対照的に、対照Ｂｉ−ＭＡｂまたはＭＡｂのいずれかと一緒にプレインキュベートされたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で処理されたマウスにおける肝細胞癌は、同一期間内で寸法が２倍以上になり、この期間内のこれらのマウスの全て（図６）。この実験は、比較可能な結果を伴って３回繰り返した。
第３の実験では、γ線照射したＢｉ−ＭＡｂ武装腫瘍細胞をワクチンとして用いた。マウス５匹ずつの３つのグループにｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個を皮下接種した。２週間後、マウスに、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個、またはγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞と親抗ＣＤ２８および抗ｇｐ５５ Ｍａｂの混合物との組み合わせ、または単独のγ線照射ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個のいずれかを皮下注射した。
図７に示されているこの実験結果は、前記した第２の実験で得られた結果と類似している。ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞で処置したマウスのみが生き残った(１００日間以上)。他の２つのグループの全てのマウスは、処置の４０日以内に死亡した。
実験により、まず親腫瘍細胞が注射され、次いで、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートされたサイトカイン処理自己腫瘍細胞を投与されたマウス由来の腫瘍細胞は、豊富なリンパ球浸潤を伴う著しい炎症反応を示した。in vitro刺激データによると、浸潤しているリンパ球の大多数は、ラット抗マウスＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ２５ ＭＡｂでの組織切片の免疫蛍光染色により決定すると、ＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞であった。抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装した未処理腫瘍細胞または対照Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理腫瘍細胞のいずれかを注射したマウスには、局所的免疫応答はなかった。
誘発された免疫がＣＴＬにより媒介されているかをさらに研究するために、マウスは、免疫化の前または後に抗体処理によりＣＤ８+Ｔ細胞を枯渇させられた。免疫化の前または後のＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇は、細胞性ワクチンのin vivoで抗腫瘍免疫を生起することができる能力を排除した。
実施例６.７
さらなる癌系への本発明の方法の適用：サイトカイン処理Ｂｉ−ＭＡｂ武装癌細胞を用いるリンパ腫および結腸癌に対する防御免疫の誘発
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートしたサイトカイン処理自己腫瘍細胞の免疫原性を２つのさらなる癌系、ＥＬ−４リンパ腫およびＳＭＣＣ−１結腸癌において試験した。
ＥＬ−４リンパ腫は、Ｂ７遺伝子でトランスフェクトされた場合に免疫原性になる。対照的に、ＳＭＣＣ−１結腸癌は、Ｂ７遺伝子でドランスフェクトされた後でさえ非免疫原性のままである。これらの細胞系は、共に、迅速に増殖し、同遺伝子型Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおいて皮下腫瘍を発症する（例えば、Liら, 1996, J. Exp. Med. 180: 211を参照）。これらの細胞系は、共に、それらの細胞表面上のｇｐ５５抗原を発現する。したがって、前記実施例において記載された抗ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂもまた、これらの実験で用いられた。
マウスの３つのグループを、各々、１×１０6個のサイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ｈｅｐａ １−６、ＥＬ−４またはＳＭＣＣ−１腫瘍細胞の皮下投与により免疫化した。
２週間後、修飾ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化したマウスを３つのグループに分け、各々１×１０6個のｈｅｐａ １−６細胞、ＳＭＣＣ−１細胞またはＥＬ−４細胞の皮下注射により抗原投与した。
サイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ＳＭＣＣ−１細胞で免疫化したマウスを２つのグループに分けた。１つのグループは、ＳＭＣＣ−１細胞１×１０6個の皮下接種により抗原投与した。別のグループは、ＥＬ−４細胞およびｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個の、各々、マウスの左および右の側腹部への皮下接種により抗原投与した。
同様に、サイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ＥＬ−４細胞で免疫化したマウスを２つのグループに分け、これをＥＬ−４細胞のみまたはＳＭＣＣ−１およびｈｅｐａ １−６細胞の両方のいずれかで抗原投与した。
表Ｉに示されるこの実験結果は、同一結果を伴って２回繰り返した。
全ての３つの実験グループにおける生起した免疫は、腫瘍特異性である。例えば、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞での免疫化は、in vivoでの同遺伝子型ＥＬ−４またはＳＭＣＣ−１腫瘍の増殖を阻害しなかった。おもしろいことには、サイトカインによる処理の不在下で、親ＥＬ−４細胞は、細胞表面でＭＨＣクラスＩを高レベルで発現し、しかも抗ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートされた場合でさえ、それらは、防御免疫を誘発できなかった。さらに、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたサイトカイン処理自己腫瘍細胞で免疫化したマウス由来のＣＴＬは、in vitroで、親腫瘍細胞を溶解したが、他の腫瘍細胞を溶解しなかった。
実施例６.８
多価の架橋分子で武装された腫瘍による細胞性免疫の誘発
前記データは、ＳＭＣＣ−１、ＥＬ−４およびｈｅｐａ １−６細胞がサイトカインと抗ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体との組み合わせでのin vitroでの処理の後に、より免疫原性となることを示した。修飾腫瘍細胞は、予防的および治療的である抗腫瘍特異的免疫を生起することができる。
以下のデータは、ＥＬ−４およびＳＭＣＣ−１細胞がまた、これらの細胞が２種類の二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉ−Ｍａｂ）（１つがＣＤ２８に対して特異的であり、もう１つが４−１ＢＢに対して特異的である）で再被覆された場合にサイトカイン処理なしで同遺伝子型動物において予防的および治療的抗腫瘍免疫を生起するために有効であることを示した。
該細胞を、氷上で４５分間、５０μg／mlの濃度で抗ｇｐ５５：抗ＣＤ２８および抗ｇｐ１１５：抗４−１ＢＢ ｂｉ−Ｍａｂでin vitroで被覆した。ＰＥＧで固定し、３回洗浄した後、２種類のｂｉ−Ｍａｂで被覆した腫瘍細胞を、種々の用量で同遺伝子型動物に皮下注射した。２週間後、免疫化動物に親腫瘍細胞を抗原投与し、腫瘍形成速度を観察した（表II）。
治療的実験では、同遺伝子型動物をまず親腫瘍細胞２×１０6個で皮下接種した。２〜４週間後、腫瘍を担持している動物に修飾腫瘍細胞を注射した。平均生存時間をモニターした（表III）。
実施例６.９
ウイルス感染細胞に対する細胞性免疫の発生
一次肝細胞を臨床生検研究所から入手し、肝細胞性培地中で培養した。自己末梢血リンパ球を同患者から手術の間に入手し、５％ヒトＡＢ血清および５％ウシ胎児血清、２０iu／ml ｒｈ−ＩＬ−２で補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。
肝細胞を、従前に報告されたようにＥ１Ｂ欠失アデノウイルスに感染させた。ウイルス感染は、ＲＴ−ＰＣＴおよび組織学的実験により確認した。
次いで、感染した肝細胞を（１）サイトカイン単独、（２）ＢｉＭａｂ単独、または（３）サイトカイン＋二重特異性Ｍａｂでin vitroで処理した。修飾したウイルス感染肝細胞を５０００Ｒの線量で放射線照射し、次いで、従前に報告されたように完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で自己ＰＢＬと一緒に同時培養した。
非修飾肝細胞および修飾肝細胞により生じたＣＴＬの細胞障害性を標準的な４時間51Cr放出アッセイで決定した。
本発明は、本明細書に記載の具体例により範囲を限定されず、本発明の個々の態様の単なる説明であることを示しており、機能的に等価であるものは全て本発明の範囲内である。本発明の種々の修飾は、本明細書において示され記載されたものに加えて、前記の記載から当業者に明らかになるであろうし、同様に本発明の範囲内になることを意図する。例えば、Guoら, Nature Medicine, 第4:1-5巻（1997年4月）は、実施例およびリファレンスを提供する。
引用された全ての刊行物（各刊行物に挙げられている図面、核酸配列およびアミノ酸配列を含む）は、引用により本明細書の一部とされる。上記刊行物において記載および引用された全ての化合物（前記刊行物により列挙された記述に開示および引用されているれらの化合物を含む）は、引用により本明細書の一部とされる。
本発明の他の具体例を以下の請求の範囲に記載する。
本願は、1996年6月12日に出願されたアメリカ合衆国仮出願60/019,639の優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、有効な免疫応答に導くＴ細胞活性化を刺激する能力を有する免疫原性シグナルを有する免疫系を提供するための、弱免疫原性細胞または非免疫原性細胞の免疫原性の増強方法を提供するものである。本発明の方法により、Ｔ細胞活性化により引き起こされる免疫応答を回避することによる発症および／または持続する疾患の予防および治療に有用な細胞性ワクチンが得られる。かかる疾患としては、例えば、全ての癌、自然および誘発性免疫不全状態、ならびに種々の病原体の感染により生じる疾患が挙げられる。
発明の背景
HannaらによるU.S.特許5,484,596には、ワクチンとして腫瘍組織を用いることが開示されている。HonsikらによるU.S.特許4,844,893には、標的細胞を殺すために腫瘍細胞上で優先的に発現される抗原に指向されるＭａｂでＩＬ−２活性化白血球を武装することが開示されている。両特許は、引用して本明細書の記載とする。
抗腫瘍免疫応答は、主として、Ｔリンパ球により媒介される。主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）および免疫応答をコスティミュレートする分子の両方のダウン・レギュレーションは、腫瘍細胞によりシグナルを伝達する欠損Ｔ細胞活性化に関係している（Luboldtら, Cancer Res. 56: 826-830, 1996；L. Chenら, 1992, Cell 1: 1093；P. S. Linsley, J. A. Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol 11: 191；G. J. Freemanら, 1993, Science 262: 909；C. H. Juneら, 1994, Immune. Today 15: 321；J. T. Gergeら, 1993, Cancer Res. 53: 2374；Ostrand-Rosenberg, 1993, S. Curr. Opin. Immune. 6: 722；B. E. Elliotら, 1989, Adv. Cancer Res. 53: 181）。
ＭＨＣ結合抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識は、Ｔ細胞活性化のために充分なシグナルではない。Ｂ７−１およびＢ７−２のようなコスティミュラトリー分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および免疫応答により標的とされる他の細胞の細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞活性化のための重要なシグナルを提供する（検討のために、L. Chenら, 1995, Immunol. Rev. 145: 123；T. Tykocinskiら, 1996, Am. J. Path. 148 :1を参照）。Ｔ細胞表面分子ＣＤ２８を介するＢ７シグナル伝達は、Ｔ細胞活性化のための主要なコスティミュラトリー経路であると思われる。しかしながら、最近の研究によると、コスティミュレーションは、サイトカインおよび接着分子の両方を含むより複雑な事象であることが示されている（G. Yangら, 1995, J. Immune. 154: 2794；M. Kubinら, 1994, J. Exp. Med. 180: 211；Y. Liら, 1996, J. Exp. Med. 183: 639）。
腫瘍細胞の免疫原性を増強するために多くのアプローチが用いられてきた（例えば、このセクションで引用した文献を参照）。現在、研究下にある主なアプローチは、遺伝子導入を含んでいる。これに関して、今日まで用いられてきた方法のほとんどは、ＭＨＣまたはＢ７などの遺伝子とのex vivoまたはin vivoトランスフェクション、または腫瘍細胞の抗原提示細胞（ＡＰＣ）による修飾を必要とした（Y. J. Guoら, 1994, Science 263: 518；M. Tykocinski, 1996, A. J. Path. 148: 1；J. Young and K. Inaba, 1996, J. Exp. Med. 183: 7；L. Zitvogelら, 1996, J. Exp. Med. 183: 87；C. M. Celluzziら, 1996, J. Exp. Med. 183: 283）。これらのアプローチは、一次腫瘍細胞の低いトランスフェクション能のため、および、多数のＡＰＣを必要とするために、時間がかかり、かつ、問題が多い。
腫瘍細胞のサイトカインによるin vitro処理は、ＭＨＣおよび接着分子の発現を増加させる（R. Mattssonら, 1992, Bio-Reprod 46: 1176；R. J. Ulevitchら, 1991, Am. J. Pathol. 139: 287；F. Willemsら, 1994, Eur. J. Immune. 24: 1007；I. Saitoら, 1993, J. Clin. Lab. Anal. 7: 180；R. A. Panettieriら, 1994, J. Immune. 154: 1358；M. Ikedaら, 1994, J. Invest. Dermatol. 103: 791）。腫瘍細胞のＭＨＣ、Ｂ７−１およびＢ７−２遺伝子とのトランスフェクションは、低免疫原性腫瘍細胞系を免疫原性細胞系に転換する（S. E. Townsend and J. P. Allison, Science 259: 368；J. P. Allisonら, 1995, Curr. Opin. Immune. 7: 682；G. Yangら, 1995, J. Immune. 154: 2794；M. Kubinら, 1994, J. Exp. Med. 180: 211）。非免疫原性腫瘍細胞は、Ｂ７遺伝子単独とのトランスフェクションには応答しないが、細胞表面でのＣＤ４８分子の補発現（co-expression）により応答するようになることができる（Y. Liら, 1996, J. Exp. Med. 183: 639）。
コスティミュラトリー分子Ｂ７は、いくつかの環境下で、Ｔ細胞上のＢ７に対する第の受容体であるＣＴＬＡ−４への結合を介して負のシグナルを送達することができる。架橋結合性ＣＴＬＡ−４分子は、in vitroでＴ細胞増殖を阻害することが示された。さらにまた、ＣＴＬＡ−４を欠損しているマウスは、重篤なＴ細胞増殖障害を発症する（K. Kawaiら, 1993, Science 261: 609；J. P. Allison, M. K. Krummel, 1995, Science 270: 932；J. M. Greenら, 1994, Immunity 1: 501）。最近の報告により、ＣＴＬＡ−４媒介シグナル伝達をブロックする抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の導入の結果、あるマウスモデルにおいて腫瘍のＴ細胞依存性拒絶反応が増強されたことが示された（D. R. Leachら, 1996, Science 271: 1734）。これらのデータにより、ＣＴＬＡ−４がＣＤ２８コスティミュラトリーシグナルに対してカウンター−レギュレートすることが提供される。したがって、Ｂ７分子を発現するトランスフェクトされた腫瘍細胞は、ＣＴＬＡ−４媒介の負のシグナル伝達により有効な免疫を誘起できない。
Ｂ７遺伝子トランスフェクションを用いるＴ細胞活性化に加えて、予備刺激されたリンパ球と組み合わせて二重特異性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）を用いて、ある環境下でのＴ細胞活性化を誘発した。例えば、一の研究により、コステイミュラトリーシグナルは、ＣＤ３０＋ホジキン腫瘍由来細胞の存在下、ＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂで予備刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と組み合わせたＣＤ：２８：ＣＤ３０（ＣＤ３０は、ホジキン腫瘍関連抗原である）およびＣＤ３：ＣＤ３０に対するＢｉ−ＭＡｂの組み合わせにより送達され得るが；しかしながら、ＣＤ２８：ＣＤ３０およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂの組み合わせだけでは、ホジキン腫瘍由来細胞系に対するヒトＰＢＬを休止させる有意なin vitro細胞障害性を誘発せず、ＣＤ２８：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂ単独での刺激では、有効ではなかったことを報告した（C. Rennerら, 1994, Science 264: 833）。同様に、ＣＤ２８：ＣＤ３０およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂの両方をＣＤ３０＋細胞およびＣＤ３：ＣＤ３０ Ｂｉ−ＭＡｂでin vitroで予備刺激されたＰＢＬと組み合わせて用いた場合にのみホジキン腫瘍由来異種移植片の退縮が観察された；予備刺激されたヒトＰＢＬを用いずにＢｉ−ＭＡｂ単独または２つのＢｉ−ＭＡｂの組み合わせで処理した異種移植片においては有意な効果は観察されなかった（Rennerら, 上掲）。
発明の概要
本発明は、免疫原性腫瘍細胞および他の免疫原性自己細胞、かかる免疫原性細胞の好都合な作製方法、正常な細胞または健康な細胞に対しては最小効果を有しつつ病的細胞に対する免疫応答を活性化または増強するためのかかる免疫原性細胞の使用方法、および負のＴ細胞シグナル伝達経路の回避方法を特徴とする。
本発明は、弱免疫原性細胞または非免疫原性細胞の免疫原性を増強し、その結果としてＴ細胞活性化を刺激することができる細胞性ワクチンが得られ、次いで、病的細胞に対する有効な免疫応答に導く方法を提供するものである。本発明の細胞性ワクチンは、疾病を予防するためのワクチンとして、および、疾患を処置するための免疫療法薬として用いることができる。
概して、本発明方法は、(１)弱免疫原性自己細胞または非免疫原性自己細胞（標的細胞）を処理して、該細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅させる段階、および、(２)処理細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子（例えば、ＣＤ２８）に結合することができる物質を処理細胞に結合させ、これにより、Ｔ細胞への物理的結合能およびコスティミュラトリーシグナル活性化能を有する処理細胞を提供する段階を含む。かかる物質としては、限定されないが、処理細胞上の抗原ならびにＴ細胞上のＣＤ２８および／または別のコスティミュラトリー分子を標的とする二重特異性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）が挙げられる。第一段階は、自己細胞が（１）Ｔ細胞の表面上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子または（２）Ｔ細胞の表面上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する２つ以上の架橋分子と結合される場合は省かれる。
標的病的細胞におけるプライマリーおよび／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルがサイトカインまたは他の手段により増幅され、架橋分子を標的病的細胞に結合させた後、標的病的細胞を患者に投与する前に、標的病的細胞に結合されないサイトカインおよび架橋分子を免疫原性組成物から除去する。この追加の段階は、サイトカインを患者に投与することに関連する副作用を最小にする。それはまた、標的病的細胞に結合されない架橋分子を患者に導入することに関連する危険性をも最小にする。該危険性は、正常な細胞または健康な細胞に対して望ましくない免疫応答を生じる事象である。
該方法の第一段階は、処理細胞内での抗原処理能力をアップ・レギュレートし、Ｔ細胞活性化に関係する細胞表面分子の発現を増幅する。第二段階は、ＣＤ２８および／または別のコスティミュラトリー分子を介してＴ細胞に物理的に架橋する手段を有する処理細胞を提供し、これによりＴ細胞活性化を刺激するための最適条件を提供する。
したがって、第１の態様では、本発明は、標的病的細胞を有する哺乳動物患者（ヒトを含む）への投与用の免疫原性組成物を特徴とするものである。該免疫原性組成物は、病的細胞に特有な抗原をより効果的に処理し提供するという点で該患者における病的細胞とは異なる自己標的病的細胞を含有する。例えば、自己標的病的細胞は、１つ以上のプライマリーＴ細胞活性化分子（例えば、ＭＨＣ）および／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）をより高いレベル（例えば、５０％高い、好ましくは、２倍高い、より好ましくは、１０倍高い）で発現する。以下に記載するように、プライマリーおよび／またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現レベルを増強する別の方法がある。
さらに、自己標的病的細胞は、１つ以上の架橋分子をそれに結合していた。各架橋分子は、エフェクター細胞（限定されないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、ＬＡＫ細胞、Ｂ細胞および他の白血球が挙げられる）の表面上の１つ以上のコスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する。好ましくは、必要ではないが、架橋分子は、標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原に対する１つ以上の結合部位を有しており、細胞表面抗原で標的病的細胞に結合される。別の好ましい具体例では、免疫原性組成物における実質的に全ての（例えば、＞８０％、好ましくは、＞９０％、より好ましくは、＞９５％）架橋分子は、自己標的病的細胞に結合されており、その結果、該組成物は、実質的に、標的病的細胞に結合されない架橋分子を含まない。さらに好ましい具体例では、免疫原性組成物は、標的病的細胞の医薬上有効量をそれに結合された架橋分子と共に含有する。
「免疫原性」とは、哺乳動物の免疫系の全部または一部の応答、特にＴ細胞の応答を活性化する能力を意味する。
「自己」とは、標的病的細胞が哺乳動物患者由来または共通の主要組織適合表現型を有する別の患者由来であることを意味する。自己標的細胞は、当業者に知られている方法を用いて哺乳動物患者または同一のＭＨＣを共有する別の供給源から得られる。
「標的病的細胞」とは、哺乳動物患者において疾患を生じるか、伝播するか、悪化させるか、または該疾患の一因である細胞を意味する。標的病的細胞としては、限定されないが、腫瘍細胞（非修飾腫瘍細胞、種々のアプローチで修飾された腫瘍細胞および一次構造を含む）が挙げられる。腫瘍細胞の供給源としては、限定されないが、肝臓癌、肝細胞癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭部および頚部癌、肉腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍、骨肉腫、ブレード癌、骨髄腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および膵癌が挙げられる。
標的病的細胞は、プリオン（とりわけ、狂牛病の原因である）、ウイルス、細菌、真菌類、原生動物または他の寄生生物（例えば、蠕虫）に感染した細胞であってもよい。
ウイルスとしては、Fields Virology, 第２版, 1990, Raven Press, New York（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例えば、限定されないが、疱疹ウイルス、ライノウイルス、肝炎ウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびＤ型）、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、およびＨＬＶが挙げられる。
細菌としては、Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 第９版, 1994, Williams and Wilkins（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例としては、限定されないが、グラム陽性および陰性菌、ストレプトコッカス、シュードモナスおよびエンテロコッカス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、エロモナス・ヒドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、エロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）、エロモナス・ソブリア（Aeromonas sobria）、ストレプトコッカス・ユベリス（Streptococcus uberis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、バシラス・スフェリカス（Bacillus sphaericus）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、セラチア・リクファシエンス（Serratia liquefaciens）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）、ザントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas maltophilia）、スタフィロコッカス・シミュランス（Staphylococcus simulans）、スタフィロコッカス・ホミニス（Staphylococcus hominis）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、エシュリキア・コリ（Escherichia coli）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Mycobacterium fortuitum）、およびクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）が挙げられる。
プライマリーＴ細胞活性化分子としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスIIおよび抗原処理および／または提示に関連する他の分子が挙げられる。コスティミュラトリーＴ細胞活性化分子としては、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２、ＶＬＡ−１、ＶＣＡＭ−１，４−１ＢＢ、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ならびに、Ｔ細胞表面タンパク質を介するＴ細胞コスティミュラトリー経路を活性化することができる他の細胞接着タンパク質および他の細胞表面タンパク質が挙げられる。
「架橋分子」とは、２つ以上の細胞を、その結合部位を有する細胞への結合により一緒に結合することができる分子または物質を意味する。好ましくは、架橋分子は、エフェクター細胞と一緒に自己標的病的細胞を担持することができ、エフェクター細胞にシグナルを送達して、該標的に対するエフェクター細胞の免疫応答を活性化または増強することができる。架橋分子は、エフェクター細胞上のスティミュラトリーおよび／またはコスティミュラトリー分子に対する１つ以上の結合部位を有する。これらの結合部位は、Ｔ細胞活性化の正の調節物質（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ）を活性化するが、Ｔ細胞活性化の負の調節物質（例えば、ＣＴＬＡ−４）の刺激を回避するように設計することができる。該結合部位は、また、Ｔ細胞活性化の負の調節物質をブロックするように設計することもできる（Leachら, Science 271: 1734-1736, 1996を参照）。架橋分子は、また、標的病的細胞の表面上の抗原に対する１つ以上の結合部位をも有する。架橋分子としては、限定されないが、二重特異性モノクローナル抗体、融合タンパク質、有機高分子物質、および、化学物質および生化学物質のハイブリッドが挙げられる。U.S.特許5,601,819、5,637,481,5,635,602、5,635,600、5,591,828、5,292,668および5,582,996に開示または記載されている抗体は、引用して本明細書の記載とする。
架橋分子に対するアンカーとして供する標的細胞上の抗原は、架橋分子がin vitroで標的細胞に結合される場合に標的細胞に対して固有である必要はない。標的細胞表面上の分子を用いて架橋分子を固定することができる。該分子としては、限定されないが、タンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、リン脂質、脂質凝集物、ステロイド、ならびに二糖類、オリゴ糖類および多糖類などの炭水化物群が挙げられる（Garland Publishing, Inc. NY & Londonにより発行された“Molecular Biology of The Cell,”第47-58頁, 第276-337頁, 第２版を参照）。例としては、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ｇｐ５５、ｇｐ９５、ｇｐ１１５、ｇｐ２１０、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、コラーゲンおよびフィブロネクチン受容体、トランスフェリン受容体、Ｆc受容体、ならびにサイトカイン受容体が挙げられる。
エフェクター細胞の表面上のコスティミュラトリー分子は、標的細胞を破壊するこれらのエフェクター細胞の機能を刺激またはコスティミュレートすることができる、抗原、脂肪酸、脂質、ステロイドおよび糖であってよい。コスティミュラトリー分子としては、限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ２Ｒ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４４Ｒ、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５１／６１複合体、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤｗ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤｗ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤｗ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１１０−１１４、ＣＤ１１５、ＣＤｗ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８*、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤｗ１２１ａ、ＣＤｗ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３*、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２５*、ＣＤ１２６、ＣＤｗ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤ１２９、ＣＤｗ１３０、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−２、ＬＦＡ−３、ＶＬＡ−１、ＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−２、４−１ＢＢ、サイトカインおよびケモカイン受容体が挙げられる。好ましい具体例では、架橋分子は、Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８または４−１ＢＢに対する結合部位を有する。
「医薬上有効な」とは、限定されないが、非制御細胞増殖、細菌感染およびウイルス感染を含む哺乳動物患者において病的細胞により生じるか、または、病的細胞に関連する１つ以上の臨床的症状を治療、軽減または予防する能力を意味する。
免疫原性組成物は、患者に投与するために単離、豊富化、または精製されてもよい。
免疫原性組成物に関する「単離される」とは、自己標的病的細胞が自然の供給源から単離されることを意味する。「単離される」なる用語の使用は、１つ以上の天然物質が通常の環境から取り出されたことを示す。したがって、標的病的細胞は、異なる細胞性環境中、または、他の細胞を含まない溶液中に置かれてよい。該用語は、標的病的細胞が存在する唯一の細胞であることを意味しないが、それが存在する優位な細胞であり（いずれの他の細胞よりも少なくとも２０−５０％多い）、患者の身体中で自然にそれに関連する別の組織を実質的に含まない（少なくとも純度約９０％）ことを示す。好ましい具体例では、該組成物は、Ｔ細胞などのエフェクター細胞を実質的に含まない。もう１つの好ましい具体例では、該組成物は、標的病的細胞に結合されない架橋分子を実質的に含まない。第３の好ましい具体例では、該組成物は、標的病的細胞の外側にサイトカインを実質的に含まない。
免疫原性組成物に関する「豊富化」とは、自己標的病的細胞が患者の身体中の病的組織におけるよりも該組成物における方が全細胞の有意に高いフラクション（２−５倍）を構成することを意味する。これは、存在する他の細胞の量の優先的な減少もしくは特異的標的病的細胞の量の優先的な増加またはこの２つの組み合わせにより生じさせられる。しかしながら、豊富化は、存在する他の細胞が全くないこと、問題の細胞の相対的な量が有用な方法で有意に増加したことを意味しないことに注意すべきである。「有意に」なる用語は、本明細書では、増加のレベルがかかる増加を行わせしめるのに有用であることを示すために用いられ、一般に、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５〜１０倍またはそれ以上の他の細胞に対する増加を意味する。
免疫原性組成物に関する「精製された」とは、絶対的な純度を必要としないが（例えば、ホモジニアス調製物）；代わりに、標的病的細胞が自然環境におけるよりも比較的純粋であることを示す。標的病的細胞は、修飾を伴うかまたは伴わずに、患者から直接または細胞培養物から得られる。少なくとも１オーダー、好ましくは、２または３オーダー、より好ましくは、４または５オーダーの精製が特に考えられる。好ましい具体例では、該組成物は、Ｔ細胞などのエフェクター細胞を実質的に含まない。
免疫原性組成物は、医薬上好適な担体または賦形剤を含有してよい。製剤化および投与のための技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)において見られる。免疫原性組成物は、全身的に、例えば静脈内注入または皮下注射により、患者に投与されてよい。本発明組成物は、各単位が希釈剤として生理学的に耐えられる水性媒体と関係して所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量（例えば、約１×１０5〜約１×１０10、好ましくは、約１×１０6〜約１×１０9、より好ましくは約１×１０7〜約１×１０8）の武装および／または活性化した自己標的病的細胞を含有する単位投薬として哺乳動物患者に投与されてもよい。
プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現は、種々の手段により、例えば、サイトカインまたは所望の増幅を誘発する能力を有する他の因子での標的細胞のin vitro、ex vivoまたはin vivo処理；ならびにＭＨＣ遺伝子、接着分子遺伝子、サイトカイン遺伝子および／またはそれらの各転写活性化剤またはエンハンサーの標的細胞へのin vitroおよびin vivoトランスファーにより増強されてもよい。サイトカインとしては、The Cytokine Handbook, Thomson, A., (編), 1994, Academic Press, San Diego（引用して本明細書の記載とする）に開示または引用されているものが挙げられる。例としては、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、β、およびγ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα、およびβ）ならびに他のケモカインおよびリンホカインが挙げられる。好ましい具体例では、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを単独または組み合わせて用いて、自己標的病的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現を増強する。
架橋分子で被覆された標的病的細胞が患者に投与されると、それは、エフェクター細胞の表面上のコスティミュラトリー分子に結合するであろう。標的病的細胞が架橋分子で被覆されるのが密であるほど、より多くのエフェクター細胞を結合することができるであろう。さらに、架橋分子がコスティミュラトリー分子に対する結合部位を多く有するほど、より多くのエフェクター細胞を結合することができるであろう。
出願人は、多数の架橋分子がＴ細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する結合部位を有する標的細胞に結合される場合、細胞性ワクチンが（プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させるために）サイトイカン処理を必要とせずに製造されることを見出した。個々の架橋分子は、標的病的細胞の表面上の種々のアンカー分子に結合されてよい。個々の架橋分子は、Ｔ細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有してもよい。
したがって、第２の態様では、本発明は、(ａ)２つ以上の異なるエフェクター細胞に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子、(ｂ)エフェクター細胞の表面上の２つ以上の異なるコスティミュラトリー分子に対する２つ以上の結合部位を有する架橋分子、(ｃ)各々が異なるエフェクター細胞に対する結合部位を含有する２つ以上の架橋分子、（ｄ）各々がエフェクター細胞の表面上の異なるコスティミュラトリー分子に対する結合部位を含有する２つ以上の架橋分子、（ｄ）各々が標的細胞上の異なる抗原に結合される２つ以上の架橋分子、または（ｅ）上記架橋分子の２つ以上を組み合わせたものを結合した自己標的病的細胞を含有する免疫原性組成物を特徴とする。
本発明の免疫原性組成物の医薬上有効量は、哺乳動物患者への投与の前に医薬上許容される担体により補完されてよい。
別法としては、(１)腫瘍細胞における１つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させる能力を有する医薬上有効量のサイトカイン、(２)腫瘍細胞の表面上の抗原に対する結合部位およびＴ細胞の表面上のコスティミュラトリー分子に対する結合部位を含有する医薬上有効量の架橋分子、および（３）医薬上許容される担体を含有する医薬組成物を患者に投与してもよい。
患者を治療する際に、自己標的細胞は、該標的細胞を患者に投与する前に、サイトイカンまたはin vitroでプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子を増加させる他の手段で処理されてよい。別法としては、患者にサイトカンを投与して、in vivoでプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子を増加させてよい。
第３の態様では、本発明は、免疫原性組成物と反応させるのに充分な時間、in vitroでエフェクター細胞（例えば、白血球）の個体群を前記免疫原性組成物と接触させ、処理されたエフェクター細胞個体群を回収することにより哺乳動物患者における病的細胞に対する細胞傷害性白血球を生じさせる方法を特徴とする。このようにして生じた細胞傷害性白血球は、次いで、患者に投与して、疾患を治療または予防することができる。
本発明の方法は、Ｔ細胞活性化により引き起こされる免疫応答を回避することにより発症および／または持続する疾患の予防および治療に有用である。かかる疾患としては、例えば、全ての癌、自然および誘発性免疫不全状態、ならびに種々の病原体での感染により生じる疾患が挙げられる。本発明の方法は、本明細書では３つのタイプのヒト癌へのその適用を示すことにより説明される。癌細胞は、本質的には一般に弱い免疫原性を有するものであり、有効なＴ細胞応答を引き起こさず、生き残り、結果として増殖する。本明細書で示すとおり、本発明の自己腫瘍細胞ワクチンを用いて有効なＴ細胞応答を刺激することにより、癌を予防することができ、確立された癌を治療することができる。
本発明の他の特徴および長所は、以下の発明の詳細な説明から、および請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１．サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞上のＭＨＣクラスＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１抗原の発現。結果は、４つの比較可能な実験からの代表的なデータである。
図２．サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞および抗−ＣＤ２８ ＭＡｂにより誘発されたin vitroでの同遺伝子型脾Ｔ細胞の刺激化および増殖。
図３．抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＭＡｂと組み合わせたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞でのナイーブ脾Ｔ細胞のin vitroプライミングにより生じたＣＴＬの細胞傷害性。
図４．抗ＣＤ−２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞での防御免疫の誘発。
図５．ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞での処理後の腫瘍拒絶反応。
図６．in vitroでの確立された肝細胞癌の治療。
図７．ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の治療有効性。
発明の詳細な説明
本発明は、疾患に対して個体を免疫化するための方法、および、本明細書に記載した二段階プロセスで製造した細胞性ワクチンを用いて確立した疾患を有する個体を治療するための方法を提供するものである。本発明の方法は、有効な治療または予防がＴ細胞の活性化を介する免疫ブーストを必要とする低免疫原性または非免疫原性応答病理を含む障害に適用可能である。かかる障害としては、限定されないが、癌の全ての形態、免疫不全障害（自然および誘発性の両方）、およびウイルスまたは他の病原因子により生じた感染性疾患が挙げられる。
本発明の方法は、(１)プライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅させるために標的細胞を処理し、(２)標的細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子（すなわち、ＣＤ２８）への結合能を有する物質を該標的細胞に結合させることにより、該障害の弱免疫原性または非免疫原性自己細胞（標的細胞）を修飾することからなり、これにより、Ｔ細胞に物理的に結合する能力およびコスティミュラトリーシグナルを活性化する能力を有する標的細胞を提供する。かかる物質としては、限定されないが、処理細胞上の抗原ならびにＴ細胞上のＣＤ２８および／または他のコスティミュラトリー分子を標的とした二重特異」性モノクローナル抗体（Ｂｉ−ＭＡｂ）が挙げられる。
当該方法の第１段階は、ＭＨＣおよび接着分子のようなＴ細胞活性化に関係した細胞表面分子の発現を増幅し、細胞内抗原処理に関係した酵素活性を増強することにより標的細胞内での抗原処理能をアップ・レギュレートする。当該方法の第１段階のために、標的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルを増幅することができる手段（すなわち、ＭＨＣおよび接着分子の発現）を用いてもよい。かかる増幅した発現は、例えば、サイトカインまたは所望の増幅を誘発する能力を有する他の因子でのin vitroおよびin vivo処理；ならびにＭＨＣ遺伝子、接着分子遺伝子、サイトカイン遺伝子、および／またはＭＨＣ、接着分子、およびサイトカイン遺伝子転写活性化剤またはエンハンサーの標的細胞へのin vitroおよびin vivoトランスファーにより行われてよい。
当該方法の一の具体例では、標的細胞におけるプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化シグナルの増幅は、サイトカイン処理を用いて行われる。標的細胞は、本明細書の実施例に記載するようにex vivoまたはin vitroでサイトカインで処理されてよい。別法としては、サイトカインは、好適な医薬担体または制御放出調製物において、例えば、病変局内注射、リンパ内注射、皮下注射などによりin vivoで標的細胞に投与されてよい。ＭＨＣおよび接着分子の増幅発現を生じるいずれかのサイトカインまたはサイトカインの組み合わせを用いて、当該方法の第一段階で細胞を処理してよい。本明細書の実施例によりさらに充分に記載される好ましい具体例では、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の組み合わせは、該第一段階で用いられる。好ましくは、細胞は、約１０〜１００Ｕ ＴＮＦ−αと組み合わせた約１０〜１００Ｕ ＩＦＮ−γの濃度で、より好ましくは以下のセクション６.１に記載するように１００Ｕ ＩＦＮ−γおよび５０Ｕ ＴＮＦ−αで処理されてもよい。しかしながら処理されるべき特定細胞上の活性化シグナルの増幅に最も最適な条件および特異的サイトカインは、変化してよく、実質的には以下のセクション６.１に記載するように決定されてよい。
本発明の方法の第二段階は、ＣＤ２８および／または他のＴ細胞コスティミュラトリー分子を介するＴ細胞表面に物理的に結合する能力を有する処理細胞を提供し、これにより、Ｔ細胞活性化を刺激するための最適な条件を提供する。該第二段階のために、処理細胞上の１つ以上の抗原およびＴ細胞の表面上の１つ以上のＴ細胞活性化コスティミュラトリー分子への結合能を有する物質を用いてよい。かかる二重特異性または多重特異性架橋物質は、例えば、標的Ｔ細胞コスティミュラトリー分子に結合し、該コスティミュラトリーシグナルを活性化し、該コスティミュラトリーシグナルの活性化を誘発する能力を有する官能性を含有する、Ｂｉ−ＭＡｂ、タンパク質および他の巨大分子、ならびに高分子物質からなる。以下のセクション６において実施例により記載する一の具体例では、Ｂｉ−ＭＡｂを架橋物質として用いる。
二重特異性または多重特異性架橋物質の一の官能性は、標的細胞特異的抗原または標的細胞上で発現されるいずれかの抗原に向けられる。最適には、標的細胞がin vivoで架橋物質で武装されるべきである場合、該架橋物質が向けられる標的細胞抗原は、固有であるべきである。
しかしながら、架橋物質の結合は、in vitroで行われるので、標的細胞抗原は、処理細胞に固有である必要はない。したがって、in vitroで標的細胞に結合した架橋物質は、修飾細胞で免疫化されるべき個体における細胞上の同一抗原と交差反応しないであろう。
かかる架橋物質を当該方法の第一段階に従って処理した細胞と一緒にインキュベートした後、遊離の架橋物質を洗浄除去し、結合した架橋物質をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の架橋剤を用いて細胞表面に架橋結合させる。二重特異性または多重特異性架橋物質の別の官能性は、ＣＤ２８などのＴ細胞活性化コスティミュレーターに特異的に向けられる。したがって、修飾細胞を用いて個体を免疫化した場合、結合した架橋物質のＣＤ２８（または他のコスティミュラトリー分子）結合部位は、空いており、Ｔ細胞表面上のＣＤ２８（または他のコスティミュラトリー分子）に結合するであろうし、このことは、修飾細胞がＴ細胞に物理的に結合するようになるであろうということを確認している。この架橋物質媒介物理的結合は、また、サイトカイン処理段階により増幅されたものもある修飾細胞の表面上の他の分子をＴ細胞の表面上の他の分子と接触させ、さらにコスティミュレーションを提供し、これにより、さらに、Ｔ細胞活性化を促進する。
当該方法の第二段階は、標的細胞がin vivoまたはin vitroのいずれで当該方法の第一段階に従って処理されたか、治療されるべき疾患または病変の環境、および治療の臨床目的に依存して、in vitroまたはin vivoで行われる。当該方法の第一段階がin vivoで行われる場合、処理細胞もまた同様に、in vivoで架橋物質で武装される。この場合、臨床医は、患者に架橋物質を投与するための種々の公知の方法を用いる。当該方法の第一段階に従ってin vivoで処理した疾患または病変特異的細胞（標的細胞）を有している患者に架橋物質を投与する最良の経路は、処理されるべき疾患または病変の臨床的特徴および／または他の特徴ならにび処理される細胞の部位に依存するであろう。例えば、リンパ節に位置する標的細胞をin vivoで処理する場合、架橋物質のリンパ節への直接投与が好ましい。同様に、例えば、腫瘍細胞をサイトカインまたは遺伝子トランスファーベクターの腫瘍内注射によりin vivoで処理する場合、架橋物質は、腫瘍中に直接または腫瘍の局所環境に投与されるべきである。
当該方法の第一段階がin vitroで行われる場合、処理細胞は、in vivoまたはin vitroで架橋物質で武装される。架橋物質がin vivoで投与される場合、in vivo処理した標的細胞のin vivo武装に関して上記で検討した同一因子を考慮して、処理細胞を投与するために用いた同一経路または類似の経路を用いるべきである。
in vitro処理細胞がin vitroで武装される場合、処理された武装細胞（細胞性ワクチン）は、疾患の治療および予防のためにin vivoで、または、病変もしくは疾患特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生のためにin vitroで用いられる。in vitroで処理細胞を武装することにより、標的細胞上のいずれかの抗原に向けられた結合を用いることができるという長所が得られる。
患者の治療または免疫化のために用いる場合、in vitro処理された武装細胞は、当業者に知られている種々の方法を用いて患者に投与される。以下の実施例でより充分に記載される特定の具体例では、in vitro処理された武装細胞は、皮下注射される。別の具体例では、処理された武装細胞は、ある環境下で（例えば、処理されるべき病変が、充分には血管化されていないか、生検に対してアクセス不可能であるか、または患者に対してさらなる危険性を生じずに粉砕され得ない場合）皮下投与よりも優れている点を提供する投与経路である直接病変内注射により投与される。さらなる具体例では、処理された武装細胞は、リンパ節への注射により投与される。この投与方法は、別の投与経路を用いる場合に典型的に必要とされるよりもわずかな処理された武装細胞を必要とするだけである。かかるリンパ内投与は、限定された自己組織のみを細針生検技術を用いて病変から得ることができる場合（すなわち、アクセス不可能な／手術不可能な癌）に好ましい。さらにまた、リンパ内投与は、細胞性ワクチンとリンパ節内に多数のＴ細胞を与えるＴ細胞との間の相互作用を増強すると思われる。出願人の最初の実験データは、本発明の方法を用いて調製した１×１０4個程度の細胞性癌ワクチン細胞の単回リンパ内注射が非経口腫瘍細胞抗原投与に対して有効な免疫応答を誘発することができ、確立された腫瘍を治療することができることを示す。この投与方法の治療的効果は、皮下投与された１００倍以上の細胞を用いて行われたものと等価であると思われる。
本発明の方法の特定の具体例では、ＣＤ２８と反応するＢｉ−ＭＡｂが二重特異性架橋物質として用いられる。上記セクション２において簡単に検討されたように、Ｂ７は、Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方と相互作用する。ある環境下で、Ｂ７−ＣＴＬＡ−４相互作用は、Ｔ細胞活性化を防止する負のシグナルを生じる。したがって、ＣＤ２８に対して特異的なＢｉ−ＭＡｂで被覆された細胞で免疫化することにより、かかる細胞上のＢ７とＣＴＬＡ−４（または他のＴ細胞活性化ダウン・レギュレート分子）との間の相互作用は、最小化および／または回避される。さらに、他のコスティミュラトリーＴ細胞表面分子（すなわち、ＣＤ２、ＣＤ４８）と反応するＢｉ−ＭＡｂもまた、本発明の方法の実施の際に用いてよい。さらにまた、より有効なコスティミュレーションは、種々のＴ細胞コスティミュレーターに対する特異性を有する多数のＢｉ−ＭＡｂを用いて行われる。
架橋物質は、よく知られている技術を用いて製造される。以下の実施例に示すように、Ｂｉ−ＭＡｂは、架橋物質として有効に用いられる。かかるＢｉ−ＭＡｂは、当該技術分野でよく知られている方法、例えば、下記セクション６.２に記載され、本明細書で引用された文献に開示されているような方法を用いて得られる。多数のＴ細胞コスティミュラトリー分子結合部位を含有するＢｉ−ＭＡｂは、多数のコスティミュラトリー活性化回路を生じる手段を提供するために化学結合により製造される。
Ｂｉ−ＭＡｂに加えて、標的細胞の抗原およびＴ細胞コスティミュラトリー分子の両方に対して特異的な官能性結合部位を含有するように処理された分子は、本発明の方法の実施の際に架橋物質として用いられる。かかる分子は、例えば、所望の結合部位を含有するように処理された、タンパク質、他の巨大分子、および高分子物質からなっていてもよく、遺伝子工学技術、合成技術を用いることにより、または、構成要素をなすポリペプチド、高分子物質、および／または他の巨大分子の化学結合により製造される。かかる架橋物質の結合部位成分は、例えば、Ｆab２抗体フラグメント、抗体結合部位、天然のもしくは処理されたリガンド、または、標的細胞抗原およびＴ細胞コスティミュラトリー分子と反応する他の因子からなる。
架橋物質は、当該技術分野でよく知られている医薬上許容される単体または種々の薬物デリバリーシステムを用いてin vivoで患者に投与される。例としては、癌免疫治療のためには、サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γおよび抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの組み合わせは、リンパ節または腫瘍自体に該調製物を直接注射することにより患者に投与される制御放出調製物内に製剤化される。
本発明の方法は、癌を治療する際に特に有用である。本発明のこの態様は、下記セクション６.で示される実施例によりさらに充分に記載される。該実施例で示されるデータは、（１）γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α(ＴＮＦ−α)の組み合わせによる自己腫瘍細胞のin vitro処理、ならびに(２)腫瘍細胞上の抗原およびＴ細胞上のＣＤ２８の両方に対して特異的なＢｉ−ＭＡｂとの予備インキュベーションからなる本発明の二段階法を用いて、強い免疫原性の腫瘍細胞を得ることができることを示す。得られた修飾腫瘍細胞は、確立された腫瘍を予防することも治療することもできるＣＴＬ媒介免疫を生起する細胞性ワクチンとして作用することができる。
特に、以下の実施例に記載した研究は、サイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装肝細胞癌が非経口腫瘍細胞抗原投与に対して防御免疫を誘発し、さらにまた、マウスにおいて確立された肉眼的肝細胞癌を治療することを示す。さらに、下記セクション６.７.に記載した実験は、リンパ腫および結腸癌に対しても防御免疫を誘発することを示す。
種々の投与経路またはその組み合わせは、本発明の細胞性ワクチンを用いて種々の癌または他の疾患を治療する場合に好ましい。セクション６.４.に簡単に記載する実験により説明されるように、サイトカイン処理した（非武装）細胞による免疫化後の抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの静脈内投与により、肝細胞癌モデル系においていくつかの抗腫瘍免疫が誘発される。
比較すると、下記セクション６.５.および６.６.に記載される実験の結果により示されるように、in vitroでサイトカインで処理され、in vitroでＢｉ−ＭＡｂで武装された細胞の投与は、均一な腫瘍免疫を誘発し、確立された肝細胞癌を治療する。前者の場合に静脈内注射後の腫瘍組織へのＢｉ−ＭＡｂの不充分な局在化が治療効果の差異の原因である可能性がある。
個体は、サイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装自己細胞で種々の疾患に対して免疫化され、これにより、Ｔ細胞を活性化して防御免疫を与えるのに充分なシグナルを有する個体の免疫系を提供する。同様に、個体は、疾患または病変のサイトカイン処理した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ武装自己細胞を投与することにより種々の疾患について治療され、これにより、Ｔ細胞を活性化して細胞障害性Ｔリンパ球応答を誘発するのに充分なシグナルを有する個体の免疫系を提供する。両者の場合、他のＴ細胞コスティミュラトリー分子に対する特異性を有するＢｉ−ＭＡｂを用いて、in vivoでＴ細胞に物理的に結合する手段で処理細胞を武装する。
ＭＨＣクラスＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＶＣＡＭ−１分子に加えて、サイトカインでの処理は、腫瘍細胞による腫瘍抗原処理を増強し、Ｔ細胞活性化に必須の他の細胞表面分子の発現を誘発する。サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞と固定化抗ＣＤ２８ ＭＡｂとの組み合わせは、in vitroで脾Ｔ細胞を刺激できず、出願人のモデル系ではin vivoで抗腫瘍免疫を誘発できない。このことは、ＣＤ２８と抗ＣＤ２８ ＭＡｂとの間の相互作用により送達されたシグナルがＴ細胞活性化を誘発するのにそれ自体では充分ではないことを示唆する。
対照的に、in vitroで抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理腫瘍細胞がＴ細胞上のＣＤ２８と相互作用する場合に強い免疫原性応答が得られ、これは、物理的結合機能が活性化プロセスの重要な成分であることを示唆している。
さらに、サイトカイン処理しＢ７トランスフェクトしたｈｅｐａ １−６細胞がin vitroで脾Ｔ細胞を活性化することができなかったという観察結果（下記セクション６.２.）は、Ｂ７がＣＴＬＡ−４と相互作用として負の調節シグナルを送達するという最近の発見と一致し、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂを用いてＴ細胞活性化のためのＣＤ２８分子に特異的に抗原提示細胞を物理的に結合させるための強い理論的根拠を提供する。
本発明は、細胞性ワクチンの開発のための遺伝子導入および腫瘍：ＡＰＣエンジニアリングについて有効な選択を提供する。以下の実施例に記載した本発明の特定の具体例では、Ｂｉ−ＭＡｂの腫瘍または他の標的細胞への結合は、in vitroで生じる。したがって、かかる細胞上の抗原は、これらの細胞に固有である必要はない。実質的には、いずれの抗原も標的とされる。Ｂｉ−ＭＡｂは、処理されるべき個体の細胞の大きな個体群（すなわち、リンパ球）上でも発現する抗原を含む、抗ＣＤ２８ ＭＡｂを腫瘍または他の標的細胞上で発現された抗原を認識するＭａｂに結合させることにより生じることができる。このアプローチは、腫瘍特異的抗原に対するＭａｂが入手可能ではない場合に特に有用である。
実施例６.１
in vitroでのｈｅｐａ １−６細胞上の接着分子およびＭＨＣ分子のサイトカイン誘発発現
ｈｅｐａ １−６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて生じる化学的誘発性肝細胞癌である（G. J. Darlingtonら, 1980, J. Natl. Cancer Inst. 64: 809）。この腫瘍由来の細胞は、迅速に増殖し、同遺伝子型動物において皮下小節を形成する。ｈｅｐａ １−６細胞は、それらの細胞表面上のＭＨＣクラスＩおよびＢ７分子の両方を欠いており、Ｂ７−１またはＢ７−２分子をコードしている遺伝子でトランスフェクトした場合でさえ宿主免疫応答を誘発しない。
ｈｅｐａ １−６細胞上の活性化シグナルの増幅に最も最適な条件およびサイトカインは、以下のとおり決定された。ｈｅｐａ １−６細胞１mlを２×１０6細胞／mlの濃度で２４ウエル組織培養プレート中で平板培養し、１０％ウシ胎児血清、２mMグルタミン、１×可欠アミノ酸および１mMピルビン酸ナトリウムで補足された完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、ＩＦＮ−γ １００Ｕ、またはＴＮＦ−α ５０Ｕ、またはこれらの同一濃度でのＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの組み合わせと一緒に３７℃で４８時間インキュベートした。培地単独中で行う以外は同様にインキュベートしたｈｅｐａ １−６細胞を対照として用いた。
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、マウスＭＨＣクラスＩ（Ｍ１／４２）、ＭＨＣクラスII（Ｍ５／１１４）、ＣＤ４４（ＫＭ８１）（ＡＴＣＣ）、ＩＣＡＭ−１（ＨＡ５８）、ＩＣＡＭ−２（３Ｃ４）およびＶＣＡＭ−１（５１−１０Ｃ９）（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンゲン（PharMingen））に対するラットモノクローナル抗体で染色した。マウスＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）について染色するために、本発明者は、ヒトＣＴＬＡ４タンパク質の可変ドメインおよびヒトＩｇＧ１定常領域のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含有する可溶性融合タンパク質であるＣＴＬＡ４−Ｉｇを用いた（Y. J. Guoら, 1994, Science 263: 518；C. Cauxら, 1994, J. Exp. Med. 180: 1841；E. Murphyら, 1994, J. Exp. Med. 180: 223；R. Sederら, 1994, J. Exp. Med. 179: 299；B. Blazarら, 1994, Blood 83: 3815；K. Hathcockら, 1993, Science 262: 905；P. Linsleyら, 1991, J. Exp. Med. 174: 561）。
細胞を氷上で抗体またはキメラタンパク質と一緒に４０分間インキュベートした。マウスＣＤ３（ＹＣＤ３）に対するラット抗体および可溶性ヒトＣＤ４４−Ｉｇキメラタンパク質を負の対照として用いた。細胞を３回洗浄した。ラットＩｇに対するフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート・ヤギ抗体またはヒトＩｇに対するＦＩＴＣ標識ウサギ抗体を氷上でさらに４０分間添加した。次いで、試料を洗浄し、固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（カリフォルニア州サンホゼのベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinson））中で分析した。負の対照グループ（培地単独）における平均蛍光強度は、ＩＣＡＭ−１を除いてバックグラウンドレベルであった。
インターフェロン（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）の組み合わせと一緒にインキュベートしたｈｅｐａ １−６細胞は、ＭＨＣクラスＩ、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ−２）および血管接着分子１（ＶＣＡＭ−１）の発現を示し、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の有意に増強した発現を示した(図１)。この発現パターンは、培地からサイトカインを除去した後にin vitroで３日間以上維持された。しかしながら、サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞（ＣＴ−ｈｅｐａ １−６）は、なおも、同遺伝子型動物において腫瘍を形成することができた。これは、該細胞が、Ｂ７の発現の不在によりＣＤ２８媒介コスティミュラトリーシグナルを提供するのに不充分であったためであると思われる。
実施例６.２
in vitroでのサイトカイン処理したｈｅｐａ １−６細胞および抗ＣＤ２８Ｂｉ−ＭＡｂにより誘発された同遺伝子型脾Ｔ細胞の刺激および増殖
以下の実施例は、ＣＤ２８に対するＢｉ−ＭＡｂおよび腫瘍細胞を組み合わせたサイトカイン活性化ｈｅｐａ １−６細胞が脾Ｔ細胞の増殖をin vitroで刺激することを示し、これは、かかるＢｉ−ＭＡｂがＣＤ２８コスティミュラトリーシグナルを提供することができることを示している。各々がＴ細胞上のＣＤ２８分子に対する１つの結合特異性および腫瘍細胞表面上で発現された３つの糖タンパク質のうちの１つに対する第二の結合特異性を有する３つのＢｉ−ＭＡｂ、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５、およびＣＤ２８：ｇｐ２１０を以下のとおり作製し使用した。
ＭａｂおよびＢｉ−ＭＡｂの製造のために、ウィスター（Wistar）ラットをＣＦＡ中の２×１０7ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化した。８週間にわたるＩＣＦＡ中に同細胞を有する３つのさらなるブーストの後、従前の開示（J. Alan & T. Robin, in: Immunochemistry in Practice, 第２章（Blackwell, New York, 第２版, 1988））に従って免疫化ラット由来の脾臓細胞をＹＢ２／０ラット骨髄腫と融合した。免疫蛍光染色法により２０以上のＩｇ産生性ハイブリドーマを選択した。３つの抗体は、フローサイトメトリー分析法によりｈｅｐａ １−６細胞と反応した。これらのＭａｂは、別々に、イムノプレシピテーションにより決定されるようにほとんどの腫瘍細胞上で発現した５５Ｋｄ、９５Ｋｄまたは２１０Ｋｄ糖タンパク質を認識した。Ｍａｂは、各々、抗ｇｐ５５、抗ｇｐ９５および抗ｇｐ２１０と称された。抗マウスＣＤ２８ Ｍａｂは、最初に、細胞表面上の高レベルのＣＤ２８抗原を発現しているマウスＴ細胞ハイブリドーマ細胞系でウィスターラットを免疫化することにより得られた。細胞融合後、抗ＣＤ２８ ＭＡｂを産生しているハイブリドーマをＦＡＣＳｃａｎにより免疫蛍光分析法で選択した。抗ＣＤ２８ Ｍａｂは、さらに、イムノピレシピテーションならびにＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生アッセイにより特徴付けられ、確認された。ＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂを産生するために用いられた抗マウスＣＤ１８を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣから購入した。これらの実験で用いた全てのＭａｂは、ヌードマウス由来の腹水をタンパク質Ｇカラムに通すことにより精製した。
Ｂｉ−ＭＡｂは、従前の開示（J. A. MacLeanら, 1993, J. Immunol. 150: 1619；L. K. Gillilandら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7719；C. Bodeら, 1989. H. Biol. Chem. 264: 944）に従って、これらのＭａｂから産生された。
正常な脾Ｔ細胞をナイロンウールカラムにより精製した。精製したＴ細胞（５×１０６／ウエル）を、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中、３７℃で９６時間、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５またはＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂの存在または不在下、５×１０5個の放射線照射（５０００レントゲン）サイトカイン処理（上記セクション６.１.の記載に従う）または未処理ｈｅｐａ １−６細胞と一緒に共培養した。Ｔ細胞上のＣＤ１８を腫瘍細胞上のｇｐ５５に結合するＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂおよび親ＣＤ２８＋ｇｐ５５ Ｍａｂの混合物を対照として用いた。Ｂ７遺伝子でトランスフェクトされた、細胞表面上の高レベルのＢ７分子を発現するサイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞もまた対照として用いた。Cy−ChromTM標識抗ＣＤ３、ＰＥ標識抗ＣＤ８およびＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ２５抗体（カリフォルニア州サンディエゴのファーミンゲン）を用いてＦＡＣＳｃａｎ中での三色分析法によりＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞のパーセンテージ（平均∇ＳＤ）を決定した。
Ｂｉ−ＭＡｂの各々は、ｈｅｐａ １−６細胞のサイトカイン処理と組み合わせてその腫瘍特異性ＣＴＬを活性化する能力についてin vitroおよびin vivoの両方で試験した。マウス脾臓細胞を、各々５０mg／mlの精製した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照抗体の存在下、抗体サイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞と一緒に３７℃で９日間共培養した。
図２に示した結果は、サイトカイン処理腫瘍細胞と３つの抗ＣＤ２８ ＢｉＭＡｂのいずれか１つとの組み合わせが脾Ｔ細胞増殖を有意に刺激することを示唆している。
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたはサイトカイン処理自己腫瘍細胞のいずれかの不在下では刺激は得られなかった。おもしろいことには、Ｂ７でトランスフェクトされて高レベルのＢ７を発現しているｈｅｐａ １−６細胞は、同様の方法でサイトカインで処理した場合にin vitroでナイーブＴ細胞を刺激する際に有効ではなかった。このアプローチにより生じたリンパ球の大部分は、ＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞であった。
実施例６.３
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと組み合わせてサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞により生じたＣＴＬのin vitro細胞傷害性
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＭＡｂと組み合わせてサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞でのナイーブ脾Ｔ細胞のin vitroプライミングにより生じたＣＴＬの細胞傷害性は、以下のように確立された。ナイロンウール豊富化ナイーブＴ細胞（５×１０6／ウエル）をまず、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂ、対照抗体と組み合わせた５×１０5個の放射線照射（５０００レントゲン）サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞（上記セクション６.１の記載に従う）または放射線照射Ｂ７+ｈｅｐａ １−６細胞単独と一緒に３７℃で９日間インキュベートすることによりin vitroで刺激した。γ線照射したナイーブ脾臓細胞（５×１０6）を支持細胞として培養物に添加した。刺激後３日目および６日目に、組換えヒトＩＬ−２（２０Ｕ）を含有する完全ＲＰＭＩ−１６４０培地２mlを各培養ウエルに別々に添加した。
同遺伝子型の同種異系腫瘍細胞に対するＣＴＬおよびＮＫ感受性ＹＡＣ−１細胞系の細胞傷害性を、標準的な４時間51Cr放出アッセイで決定した。３つの実験の結果は、図３において、腫瘍細胞溶解の指標として１：２０ Ｅ：Ｔ比での51Cr放出のパーセンテージとして示される。これらの結果は、本明細書の記載に従って生じたＣＴＬが自己腫瘍細胞に対して特異的な細胞溶解活性を有することを示す。
実施例６.４
サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の腫瘍形成性（tumorigenicity）に対する静脈内投与した抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂの効果
サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞を注射した後、１日目、２日目および４日目に抗ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂを１００μgの用量で静脈内投与されたマウスは、遅延腫瘍形成を経験し、これらのマウスの４０パーセント（８／２０）は、腫瘍退縮を経験した。親ｈｅｐａ １−６細胞と抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂとの組み合わせまたはＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞と対照抗体との組み合わせを注射した動物は、腫瘍細胞の接種後６０日以内に全て腫瘍を発症し、死亡した。Ｂｉ−ＭＡｂの注射後２４時間目、４８時間目、および７２時間目の免疫組織学的実験は、Ｂｉ−ＭＡｂが腫瘍組織以外に肺、肝臓および腎臓において広範に分布していることを示した。
実施例６.５
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞でのin vitroでの防御免疫の誘発
腫瘍細胞を、まず、１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ−１６４０培地中、ＩＦＮ−γ １００ＵおよびＴＮＦ−α ５０Ｕの組み合わせでin vitroで３７℃、５％ＣＯ2で４８時間処理した。次いで、細胞を２０℃でリン酸緩衝化生理食塩水pH７.４（ＰＢＳ）×３で洗浄し、上記セクション６.１.の記載に従って、氷上で４５分間５０μg／mlの濃度で抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にインキュベートした。４℃で６０分間、同量のＲＰＭＩ−１６４０中３０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中でさらにインキュベートした後、該細胞を前記に従って３回洗浄し、１−２×１０7／ml ＰＢＳの濃度に懸濁化させた。Ｂｉ−ＭＡｂまたはＭａｂで細胞を武装するために、サイトカイン処理または未処理親腫瘍細胞を各抗体で４５分間プレインキュベートした。
グループあたりＣ５７ＢＬ／６マウス５匹からなる５つのグループを、ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５、ＣＤ２８：ｇｐ２１０または対照Ｂｉ−ＭＡｂ ＣＤ１８：ｇｐ５５で武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個で、または、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個で皮下免疫化した。２週間後、グループの各々におけるマウスに親ｈｅｐａ １−６細胞２.５×１０6個を皮下注射により抗原投与した。
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートされ／武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６腫瘍細胞（ＣＴ−ｈｅｐａ １−６）は、同遺伝子型マウスにおいて腫瘍を形成するそれらの能力を完全に失っているが、対照抗体と一緒にプレインキュベートされ／武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞は、それらの形成能を保持していた。免疫化実験の結果は、図４に示されている。ＣＤ２８／腫瘍抗原Ｂｉ−ＭＡｂの各々で武装されたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化されたマウスは、親腫瘍細胞での抗原投与に対する防御免疫を発症し、これらの動物の全ては、かかる抗原投与後１２０日間、腫瘍がないままであった（図４）。対照的に、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞または対照抗体ＣＤ１８：ｇｐ５５で武装されたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞のいずれかで皮下注射された全てのマウスは、親ｈｅｐａ １−６細胞での抗原投与後５０日以内に腫瘍を発症し、死亡した（図４）。この実験は、比較可能な結果を伴って２回繰り返した。
実施例６.６
本発明の方法の肝細胞癌系への適用：サイトカイン処理Ｂｉ−ＭＡｂ武装ｈｅｐａ １−６細胞での確立した肝細胞癌の治療
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞での免疫化が確立した肝細胞癌を治療することができることを確立するために、以下の３つの実験を行った。該実験の各々は、Ｂｉ−ＭＡｂ武装したサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞の治療的投与が肝細胞癌のための有効な治療法であることを示す。
第１の実験では、マウス４匹に野生型ｈｅｐａ １−６細胞２×１０6個を皮下接種した。１４日後、顕微的腫瘍の発症後、マウスを１０匹ずつ４つのグループに分けた。グループを、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂまたは対照ＣＤ１８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂのいずれかで武装されたサイトカイン処理または未処理ｈｅｐａ １−６細胞２×１０6個で皮下処理した。
この実験の結果は、図５に示されている。抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で処理したグループにおける全てのマウスは、１００日間以上生存した（図５）。対照的に、対照Ｂｉ−ＭＡｂ武装／サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞で処理したグループにおける全てのマウスおよびＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂまたはＣＤ１８：ｇｐ５５対照Ｂｉ−ＭＡｂで武装された未処理ｈｅｐａ １−６細胞で処理されたグループにおける全てのマウスは、約４０日以内に死亡した（図５）。この実験は、比較可能な結果を伴って２回繰り返した。
第２の実験では、マウス５匹ずつの５つのグループにｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個を皮下注射した。４週間後、６−８mm（最大径）の腫瘍を有しているマウスに、各々ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５またはＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂで武装されたサイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞を皮下注射し、次いで、その７日後に同用量でＢｉ−ＭＡｂ武装／サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞のブーストを皮下注射した。各々５０μgの濃度でＣＤ１８：ｇｐ５５でプレインキュベートしたかまたは抗ＣＤ２８および抗ｇｐ５５親Ｍａｂの両方と混合した（ＣＤ２８＋ｇｐ５５）細胞を対照として用いた。腫瘍寸法は、定期的に測定した。
この実験の結果は、図６に示されている。ＣＤ２８：ｇｐ５５、ＣＤ２８：ｇｐ９５およびＣＤ２８：ｇｐ２１０ Ｂｉ−ＭＡｂで処理されたマウスにおける肝細胞癌は、約４０日以内に検出不可能な寸法に退縮した（図６）。対照的に、対照Ｂｉ−ＭＡｂまたはＭＡｂのいずれかと一緒にプレインキュベートされたＣＴ−ｈｅｐａ １−６細胞で処理されたマウスにおける肝細胞癌は、同一期間内で寸法が２倍以上になり、この期間内のこれらのマウスの全て（図６）。この実験は、比較可能な結果を伴って３回繰り返した。
第３の実験では、γ線照射したＢｉ−ＭＡｂ武装腫瘍細胞をワクチンとして用いた。マウス５匹ずつの３つのグループにｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個を皮下接種した。２週間後、マウスに、ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個、またはγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞と親抗ＣＤ２８および抗ｇｐ５５ Ｍａｂの混合物との組み合わせ、または単独のγ線照射ｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個のいずれかを皮下注射した。
図７に示されているこの実験結果は、前記した第２の実験で得られた結果と類似している。ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂで武装したγ線照射サイトカイン処理ｈｅｐａ １−６細胞で処置したマウスのみが生き残った(１００日間以上)。他の２つのグループの全てのマウスは、処置の４０日以内に死亡した。
実験により、まず親腫瘍細胞が注射され、次いで、抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートされたサイトカイン処理自己腫瘍細胞を投与されたマウス由来の腫瘍細胞は、豊富なリンパ球浸潤を伴う著しい炎症反応を示した。in vitro刺激データによると、浸潤しているリンパ球の大多数は、ラット抗マウスＣＤ３、ＣＤ８およびＣＤ２５ ＭＡｂでの組織切片の免疫蛍光染色により決定すると、ＣＤ３+ＣＤ８+ＣＤ２５+Ｔ細胞であった。抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂで武装した未処理腫瘍細胞または対照Ｂｉ−ＭＡｂで武装したサイトカイン処理腫瘍細胞のいずれかを注射したマウスには、局所的免疫応答はなかった。
誘発された免疫がＣＴＬにより媒介されているかをさらに研究するために、マウスは、免疫化の前または後に抗体処理によりＣＤ８+Ｔ細胞を枯渇させられた。免疫化の前または後のＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇は、細胞性ワクチンのin vivoで抗腫瘍免疫を生起することができる能力を排除した。
実施例６.７
さらなる癌系への本発明の方法の適用：サイトカイン処理Ｂｉ−ＭＡｂ武装癌細胞を用いるリンパ腫および結腸癌に対する防御免疫の誘発
抗ＣＤ２８ Ｂｉ−ＭＡｂと一緒にプレインキュベートしたサイトカイン処理自己腫瘍細胞の免疫原性を２つのさらなる癌系、ＥＬ−４リンパ腫およびＳＭＣＣ−１結腸癌において試験した。
ＥＬ−４リンパ腫は、Ｂ７遺伝子でトランスフェクトされた場合に免疫原性になる。対照的に、ＳＭＣＣ−１結腸癌は、Ｂ７遺伝子でドランスフェクトされた後でさえ非免疫原性のままである。これらの細胞系は、共に、迅速に増殖し、同遺伝子型Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにおいて皮下腫瘍を発症する（例えば、Liら, 1996, J. Exp. Med. 180: 211を参照）。これらの細胞系は、共に、それらの細胞表面上のｇｐ５５抗原を発現する。したがって、前記実施例において記載された抗ＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂもまた、これらの実験で用いられた。
マウスの３つのグループを、各々、１×１０6個のサイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ｈｅｐａ １−６、ＥＬ−４またはＳＭＣＣ−１腫瘍細胞の皮下投与により免疫化した。
２週間後、修飾ｈｅｐａ １−６細胞で免疫化したマウスを３つのグループに分け、各々１×１０6個のｈｅｐａ １−６細胞、ＳＭＣＣ−１細胞またはＥＬ−４細胞の皮下注射により抗原投与した。
サイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ＳＭＣＣ−１細胞で免疫化したマウスを２つのグループに分けた。１つのグループは、ＳＭＣＣ−１細胞１×１０6個の皮下接種により抗原投与した。別のグループは、ＥＬ−４細胞およびｈｅｐａ １−６細胞１×１０6個の、各々、マウスの左および右の側腹部への皮下接種により抗原投与した。
同様に、サイトカイン処理したＣＤ２８：ｇｐ５５ Ｂｉ−ＭＡｂ武装ＥＬ−４細胞で免疫化したマウスを２つのグループに分け、これをＥＬ−４細胞のみまたはＳＭＣＣ−１およびｈｅｐａ １−６細胞の両方のいずれかで抗原投与した。
表Ｉに示されるこの実験結果は、同一結果を伴って２回繰り返した。
実施例６.８
多価の架橋分子で武装された腫瘍による細胞性免疫の誘発
前記データは、ＳＭＣＣ−１、ＥＬ−４およびｈｅｐａ １−６細胞がサイトカインと抗ＣＤ２８二重特異性モノクローナル抗体との組み合わせでのin vitroでの処理の後に、より免疫原性となることを示した。修飾腫瘍細胞は、予防的および治療的である抗腫瘍特異的免疫を生起することができる。
以下のデータは、ＥＬ−４およびＳＭＣＣ−１細胞がまた、これらの細胞が２種類の二重特異性モノクローナル抗体（ｂｉ−Ｍａｂ）（１つがＣＤ２８に対して特異的であり、もう１つが４−１ＢＢに対して特異的である）で再被覆された場合にサイトカイン処理なしで同遺伝子型動物において予防的および治療的抗腫瘍免疫を生起するために有効であることを示した。
該細胞を、氷上で４５分間、５０μg／mlの濃度で抗ｇｐ５５：抗ＣＤ２８および抗ｇｐ１１５：抗４−１ＢＢ ｂｉ−Ｍａｂでin vitroで被覆した。ＰＥＧで固定し、３回洗浄した後、２種類のｂｉ−Ｍａｂで被覆した腫瘍細胞を、種々の用量で同遺伝子型動物に皮下注射した。２週間後、免疫化動物に親腫瘍細胞を抗原投与し、腫瘍形成速度を観察した（表II）。
ウイルス感染細胞に対する細胞性免疫の発生
一次肝細胞を臨床生検研究所から入手し、肝細胞性培地中で培養した。自己末梢血リンパ球を同患者から手術の間に入手し、５％ヒトＡＢ血清および５％ウシ胎児血清、２０iu／ml ｒｈ−ＩＬ−２で補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。
肝細胞を、従前に報告されたようにＥ１Ｂ欠失アデノウイルスに感染させた。ウイルス感染は、ＲＴ−ＰＣＴおよび組織学的実験により確認した。
次いで、感染した肝細胞を（１）サイトカイン単独、（２）ＢｉＭａｂ単独、または（３）サイトカイン＋二重特異性Ｍａｂでin vitroで処理した。修飾したウイルス感染肝細胞を５０００Ｒの線量で放射線照射し、次いで、従前に報告されたように完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で自己ＰＢＬと一緒に同時培養した。
非修飾肝細胞および修飾肝細胞により生じたＣＴＬの細胞障害性を標準的な４時間51Cr放出アッセイで決定した。
引用された全ての刊行物（各刊行物に挙げられている図面、核酸配列およびアミノ酸配列を含む）は、引用により本明細書の一部とされる。上記刊行物において記載および引用された全ての化合物（前記刊行物により列挙された記述に開示および引用されているれらの化合物を含む）は、引用により本明細書の一部とされる。
本発明の他の具体例を以下の請求の範囲に記載する。
Claims (27)
- 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療に有用な免疫原性組成物であって、
（ａ）該哺乳動物患者の該病的細胞におけるよりも高いレベルで１つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子を発現する単離された自己標的病的細胞；および
（ｂ）該哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位および４−１ＢＢに対する結合部位を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する、該標的病的細胞と結合する架橋分子
を含有してなる免疫原性組成物。 - 架橋分子が、さらに、標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原に対する１つ以上の抗原結合部位を含有してなり、かつ、架橋分子が該抗原で標的病的細胞に結合される請求項１記載の組成物。
- 単離されるか、豊富化されるか、または精製される請求項１記載の組成物。
- １つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子がＭＨＣクラスＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ−１、Ｂ７−１およびＢ７−２からなる群から選択される請求項１記載の組成物。
- １つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子が標的病的細胞に導入された異種核酸から発現される請求項１記載の組成物。
- １つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子の発現を増加させるために、標的病的細胞が１つ以上のサイトカインでイン・ビトロで処理される請求項１記載の組成物。
- 標的病的細胞がＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、またはその両方で処理される請求項６記載の組成物。
- 抗原がＬＤＬ受容体、ｇｐ５５、ｇｐ９５、ｇｐ１１５、ｇｐ２１０、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、コラーゲンおよびフィブロネクチン受容体、トランスフェリン受容体、Ｆc受容体、ならびにサイトカイン受容体からなる群から選択される請求項２記載の組成物。
- 架橋分子がＴ細胞の表面上のＣＤ２８および４−１ＢＢに対して特異的結合親和性を有する抗体である請求項１記載の組成物。
- 架橋分子が共有結合により標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原と結合する請求項２記載の組成物。
- 標的病的細胞が腫瘍細胞である請求項１記載の組成物。
- 腫瘍細胞が肝細胞癌、肺癌、胃癌、結腸直腸癌、腎臓癌、頭部および頚部癌、肉腫、リンパ腫、白血病、脳腫瘍、骨肉腫、ブレード癌、骨髄腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、ならびに膵癌からなる群から選択される請求項１１記載の組成物。
- 標的病的細胞がウイルスに感染している請求項１記載の組成物。
- ウイルスがＨＩＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、ＥＢＶ、ＨＰＶ、およびＨＬＶからなる群から選択される請求項１３記載の組成物。
- 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療に有用な免疫原性組成物であって、
（ａ）単離された自己標的病的細胞；
（ｂ）Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位を含む、標的病的細胞の表面と結合する、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する第一架橋分子；および
（ｃ）Ｔ細胞の表面上の４−１ＢＢに対する結合部位を含む、標的病的細胞の表面と結合する、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する第二架橋分子
を含有してなる免疫原性組成物。 - ２つの架橋分子が、各々、標的病的細胞の表面上の異なる抗原に対する結合部位を含有してなる請求項１５記載の免疫原性組成物。
- 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療に有用な免疫原性組成物であって、
（ａ）単離された自己標的病的細胞；および
（ｂ）Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位およびＴ細胞の表面上の４−１ＢＢに対する結合部位を含む、標的病的細胞の表面と結合する、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子
を含有してなる免疫原性組成物。 - 架橋分子が、さらに、標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原に対する１つ以上の抗原結合部位を含有してなり、架橋分子が該抗原で標的病的細胞と結合する請求項１７記載の組成物。
- （ａ）哺乳動物患者の腫瘍細胞において１つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させる能力を有する医薬上有効量のサイトカイン；
（ｂ）腫瘍細胞の表面上の抗原に対する結合部位ならびにＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位および４−１ＢＢに対する結合部位を含有してなる、医薬上有効量のＴ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子；および
（ｃ）医薬上許容される担体
を含有してなる医薬組成物。 - 病的細胞を有する哺乳動物患者への投与用の組成物であって、
（ａ）該哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子および該哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上の４−１ＢＢに対する結合部位を含む、Ｔ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子が結合している医薬上有効量の自己標的病的細胞；および
（ｂ）医薬上許容される担体
を含有してなる組成物。 - ２つの架橋分子が、さらに、各々、標的病的細胞の表面上の１つ以上の抗原に対する１つ以上の抗原結合部位を含有してなり、抗原で標的病的細胞と結合する請求項２０記載の組成物。
- 標的病的細胞にプライマリーＴ細胞活性化分子またはコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子をコードしている遺伝子が導入されている請求項１記載の組成物。
- 標的病的細胞にＭＨＣ遺伝子、接着分子遺伝子およびサイトカイン遺伝子からなる群から選択される遺伝子が導入されている請求項１記載の組成物。
- 哺乳動物患者由来の標的病的細胞を哺乳動物患者におけるエフェクター細胞に結合させるための架橋分子であって、
（ａ）標的病的細胞の表面上の抗原に対する第一結合部位；
（ｂ）Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８に対する第二結合部位；および
（ｃ）Ｔ細胞の表面上の４−１ＢＢに対する第三結合部位
を含む架橋分子。 - 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療用の医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）単離された自己標的病的細胞を準備する工程；
（ｂ）該標的病的細胞を処理して、標的病的細胞において１つ以上のプライマリーおよびコスティミュラトリーＴ細胞活性化分子のレベルを増加させる工程；
（ｃ）哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位および４−１ＢＢに対する結合部位を含有してなるＴ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子を準備する工程；
（ｄ）該標的病的細胞に架橋分子を結合させる工程；および
（ｅ）次いで、哺乳動物患者への投与のために架橋分子が結合している標的病的細胞の医薬上有効量を回収する工程
からなり、工程（ｃ）および（ｄ）が工程（ｂ）の前または後のいずれかで行われることを特徴とする製造方法。 - 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療用の医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）単離された自己標的病的細胞を準備する工程；
（ｂ）哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位および４−１ＢＢに対する結合部位を含有してなるＴ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子を準備する工程；
（ｃ）標的病的細胞に架橋分子を結合させる工程；および
（ｄ）次いで、哺乳動物患者への投与のために架橋分子が結合している標的病的細胞の医薬上有効量を回収する工程
からなることを特徴とする製造方法。 - 病的細胞を有する哺乳動物患者の治療用の医薬組成物の製造方法であって、
（ａ）単離された自己標的病的細胞を準備する工程；
（ｂ）該哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上のＣＤ２８に対する結合部位を有してなるＴ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子および該哺乳動物患者におけるＴ細胞の表面上の４−１ＢＢに対する結合部位を有してなるＴ細胞活性化を刺激する能力を有する架橋分子を準備する工程；
（ｃ）標的病的細胞に架橋分子を結合させる工程；および
次いで、哺乳動物患者への投与のために架橋分子が結合している標的病的細胞の医薬上有効量を回収する工程
からなることを特徴とする製造方法。
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