CN110719799A - Cd39和cd103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性t细胞中的应用 - Google Patents

Cd39和cd103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性t细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法。这些方法包括对受试者施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+T细胞。还公开了分离编码特异性结合肿瘤细胞抗原的T细胞受体(TCR)的核酸的方法。这些方法包括从来自患有表达肿瘤细胞抗原的肿瘤的受试者的样品分离CD8+CD39+CD103+T细胞，和从CD8+CD39+CD103+T细胞克隆编码TCR的核酸分子。此外，公开了扩增CD8+CD39+CD103+T细胞的方法。在另外的实施方式中，公开了确定患有肿瘤的患者是否响应于检查点抑制剂的方法。该方法包括检测来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的存在。

Description

CD39和CD103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性T细胞中的 应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月9日提交的美国临时申请号62/517,612的权益，其通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及癌症领域，尤其涉及细胞(例如CD8+CD39+CD103+ T细胞)的过继转移用于治疗肿瘤的用途和T细胞受体(TCR)(例如来自CD8+CD39+CD103+ T细胞)用于治疗肿瘤的用途，并且涉及评估治疗的方法，例如通过测量CD8+CD39+CD103+ T细胞。
背景技术
免疫系统在识别和杀死肿瘤细胞中起主要作用，新的治疗方法关注于增强和/或恢复其在癌症患者中的功能。有效的免疫反应涉及几种不同细胞类型的协同作用，其中CD8T细胞是关键角色，其可以通过释放细胞毒性分子和细胞因子来特异性识别和杀死癌细胞(Klebanoff CA et al.,211:214-24,Immunol.ReV.,2006)。肿瘤浸润CD8 T细胞识别肿瘤相关抗原(TAA's)，所述肿瘤相关抗原可能包含在肿瘤病变中过表达的自身抗原以及肿瘤特异性抗原(TSA's)或新抗原，其因肿瘤特异性突变而出现(Finn OJ,Cancer ImmunolRes,2017)。根据当前的范例，肿瘤特异性CD8 T细胞在肿瘤引流淋巴结中引发，然后通过血液迁移至肿瘤以发挥其效应子功能。先前的研究表明，肿瘤浸润CD8 T细胞代表了异质细胞群，其包含肿瘤特异性T细胞以及非肿瘤特异性的旁观者T细胞。后者因与肿瘤进展(增殖、血管新生和转移)相关的炎症被募集到肿瘤部位。然而，仍然需要其中过继转移的功效/效率增加的免疫治疗方法。
发明内容
评价了肿瘤反应性CD8 T细胞的表型和功能，并确定了CD103和CD39的共表达鉴定了在肿瘤微环境中特异性诱导的肿瘤浸润CD8 T细胞群。在肿瘤内被长期刺激的这些细胞因肿瘤反应性而被高度富集，并具有杀死自体肿瘤细胞的能力。人肿瘤中较高频率的CD8+CD39+CD103+ T细胞与更高的总体生存率相关。已经确定CD8+CD39+CD103+ T细胞的存在可以表明治疗方法对治疗肿瘤有效。另外，可以将CD8+CD39+CD103+ T细胞过继转移至受试者中以治疗肿瘤。
公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法，包括向受试者施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞，从而治疗患有肿瘤的受试者。在一些实施方式中，方法包括对受试者施用治疗有效量的程序性死亡(PD)-1拮抗剂、程序性死亡配体(PD-L1)拮抗剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)拮抗剂、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)拮抗剂、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域-3(TIM-3)拮抗剂、淋巴细胞激活基因3(LAG3)拮抗剂或4-1BB激动剂。
在一些实施方式中，公开了分离编码特异性结合肿瘤细胞抗原的T细胞受体(TCR)的核酸序列的方法。这些方法包括从患有表达肿瘤细胞抗原的肿瘤的受试者中分离CD8+CD39+CD103+ T细胞，并从CD8+CD39+CD103+ T细胞克隆编码TCR分子的核酸序列，由此分离编码对肿瘤有特异性的TCR的核酸序列。
在另外的实施方式中，公开了扩增CD8+CD39+CD103+ T细胞的方法。这些方法包括在包含谷氨酰胺、血清和抗生素的组织培养基中培养CD8+CD39+CD103+ T细胞；用有效量的同种异体经辐射的饲养细胞和细胞因子刺激分离的T细胞；和在组织培养基和有效量的细胞因子中培养刺激的T细胞。
在其他实施方式中，公开了确定患有肿瘤的受试者是否响应于癌症治疗剂(例如检查点抑制剂、生物反应调节剂(例如，细胞因子和趋化因子)、癌症疫苗、化学疗法和/或放射疗法)的方法。还公开了确定受试者是否响应于外科手术的方法。该方法包括检测来自受试者的生物学样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的存在，其中生物学样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的存在表明癌症治疗或外科手术对于治疗受试者的肿瘤将是有效的。在一些非限制性实例中，所述方法还可以包括向受试者施用癌症治疗剂，或进行外科手术。
在进一步的实施方式中，公开了确定患有肿瘤的受试者是否响应于癌症治疗剂的方法。该方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的数量。与对照相比，生物学样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的数量增加表明，癌症治疗剂的第一剂量对治疗受试者的肿瘤有效。
在更多的实施方式中，公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的数量。与对照相比，生物学样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的量增加表明第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤有效。将第二剂量的癌症治疗剂施用于受试者，其中第一剂量与第二剂量相同，或者其中第二剂量低于第一剂量。
在其他实施方式中，公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的数量。与对照相比，生物学样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的量减少或没有改变，表明第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤无效。向受试者施用第二剂量的癌症治疗剂，其中第二剂量高于第一剂量，或者其中第二剂量与第一剂量相同。
通过以下参考附图进行的详细描述，本发明的前述和其他目的、特征和优点将变得更加明显。
附图简述
图1A-1F.肿瘤浸润CD103+CD8 T细胞共表达胞外核苷酸酶CD39。(A)浸润头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的T细胞的流式细胞仪分析的代表性设门策略(gating strategy)。图中的数字表示各个门中的百分比细胞。(B)如(A)所示的对CD103+CD8 T细胞设门的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的ViSNE分析。该门鉴定出具有最高CD39表达的CD103+CD8 T细胞。将该门应用于显示PD-1、CD69和CD127表达水平的所有绘图。(C)从HNSCC、黑素瘤、卵巢癌和CRLM癌症患者中分离出的CD8 TIL的流式细胞仪分析。每个象限中的数字表示CD3+CD8+T细胞上CD39和/或CD103阳性的细胞百分比。(D)不同实体恶性肿瘤患者中CD39+CD103+(DP)CD8 TIL的频率总结。显示的是40位HNSCC患者，2位肺癌患者，6位黑素瘤患者，2位卵巢癌患者，3位直肠癌患者，3位结肠癌患者，和6位CRLM患者。红色圆圈突出显示了一位患有Lynch综合征的结肠患者，导致微卫星不稳定性(MSI)。(E)一位HNSCC患者的外周血、正常LN、原发肿瘤和转移性LN中DP CD8 T细胞百分比的流式细胞仪分析。每个象限中的数字表示CD3+CD8+ T细胞上CD39和/或CD103阳性的细胞百分比。数据代表了所分析的40位HNSCC患者(正常LN和MetLN仅为9位患者)。百分比汇总在(F)中。
图2A-2D.CD8+CD39+CD103+ TIL的基因表达谱揭示了让人联想到TRM细胞的特征。(A)从3例HNSCC和2例卵巢癌患者中分离出的分选的DN、SP和DP CD8 TIL的基因表达的主要成分分析(PCA)。对双阳性(DP)和双阴性(DN)CD8 TIL(n＝372)之间差异表达的基因进行了分析。(B)使用DP和DN CD8 TIL之间的372个差异表达的基因对样品进行无监督的聚类(unsupervised clustering)。深灰色表示下调的基因，浅灰色表示上调的基因。(C)瀑布图代表DP与DN亚群中上调程度最高的基因和下调程度最高的基因的倍数变化(log2)。浅灰色识别具有慢性激活特征的基因。深灰色表示与TRM表型相关的基因。(D)在所分析的5位患者的每一位中，最大差异表达的基因的表达。上排显示与TRM表型相关的基因，下排显示慢性激活特征基因。每个符号代表一位病人，用线连接。
图3A-3E.DP、SP和DN CD8 TIL的表型和功能特性。(A)表面蛋白CD69、CCR7、CD127和CD28的表达的离体表型分析，描绘了在CD8 TIL上的TRM表型(上)。几位癌症患者中上述标记物的频率汇总(n＝6-13，下)。*p<0.05；***p<0.001；****p<0.0001(方差分析)。(B)表面和胞内蛋白PD-1、CTLA-4、TIM-3、4-1BB和Ki-67的表达的离体表型分析，描绘了在CD8 TIL上激活/长期刺激的表型(上)。几位癌症患者中上述标记物的频率汇总(n＝5-17，下图)。***p<0.001；****p<0.0001(方差分析)。(C)用PMA/伊诺霉素刺激4小时的CD8 TIL亚群的IFN-α和TNF-α生产的代表性流式细胞仪分析。每个象限中的数字表示CD3+CD8+ T细胞上IFN-γ和/或TNF-β阳性的细胞百分比。(D)通过CD8 TIL亚群的IFN-γ、TNF-α、IFN-γ/TNF-β双阳性细胞的频率。数据来自6位HNSCC患者。(E)CD8 TIL的颗粒酶B生产的代表性流式细胞仪分析(左)和6位不同的HNSCC患者的总结(右)。*p<0.05；**p<0.01(方差分析)。
图4.CD39和CD103在CD8 T细胞上的表达需要在富含TGF-β的环境中持续刺激。从外周血中分选的初始(naive)CD8 T细胞上CD39、CD103和PD-1表达的动力学。在存在或不存在TGF-β(2ng/ml)的情况下，用包被CD3/CD28的珠子以1:2的珠:T细胞比刺激细胞，并在指示的时间点通过流式细胞仪分析CD39、CD103和PD-1的表达。数据代表4个独立实验。
图5A-5D.DP CD8 TIL是高度克隆的，并且与任何其他CD8 T细胞亚群几乎没有重叠。(A)血液记忆CD8 T细胞、DN CD8 TIL、SP CD8 TIL和DP CD8 TIL中TCRβ库的多样性。HPV+和HPV-HNSCC患者以及一位卵巢癌患者显示了最常见的克隆型频率、第二到第五常见的频率、第六到第三十常见的频率以及其余的克隆型。(B)根据DN、SP和DP CD8 TIL亚群中的频率绘制500个最常见的CD8 TIL克隆型。每个点代表一个独特的TCR克隆型。轴上的点表示在单个库中检测到的克隆型。(C)与(B)中相同的分析，比较血液和正常LN中记忆CD8 T细胞中前500个克隆型的频率与DN和DP CD8 TIL亚组中前500种克隆型的频率。(D)使用DP CD8TIL与血液记忆CD8 T细胞、DN CD8 TIL和SP CD8 TIL之间的Morisita-Horn指数分析TCRβ序列重叠。TCRβ序列重叠为1表示两个群体之间100％相似。
图6A-6F.DP CD8 TIL识别并杀死自体肿瘤细胞，其频率与总体存活率提高相关。(A)通过与数量增加的自体肿瘤细胞一起培养20小时来测试扩增的CD8 TIL的肿瘤反应性，并通过测量4-1BB表达的频率(实心符号)和IFN-γ分泌(空心符号)来评估识别性。显示了三位癌症患者的结果。(B)通过用具有或不具有MHC-1阻断抗体的自体肿瘤细胞、同种异体肿瘤细胞和板结合的抗CD3培养来证实DP CD8 TIL的反应性。对于三位癌症患者，20小时后显示4-1BB上调。(C)通过评估在20小时的时间内每小时监测的胱天蛋白酶3/7+事件/孔的量来测量肿瘤细胞杀灭。(D)在共培养开始(T＝0)和结束(T＝20hrs)时拍摄的DN和DP CD8TIL的代表性图像。(E)基于手术时总CD8 TIL中DP CD8 TIL频率的62位HNSCC患者群的总生存期。(F)对30位HPV阴性的HNSCC患者进行了类似的分析。
图7A-7C.DP CD8 TIL富集于肿瘤反应性细胞，并且原发性肿瘤TCR库与同一个体内转移性LN TCR库重叠。(A)和(B)对DP CD8 TIL进行分选并在体外扩增。扩增后，将DP CD8TIL与自体肿瘤细胞共培养24小时。培养结束时，基于4-1BB和CD25的表达对细胞进行分选。将共培养之前DP CD8 TIL的TCR库与4-1BB+CD25+DP CD8 TIL的TCR库(肿瘤反应性)进行比较。与肿瘤细胞共培养之前和之后，DP CD8 TIL的前15个克隆型以其各自的频率存在。显示了两名癌症患者的结果。(C)基于500种最常见的DP CD8 TIL克隆型在原发性肿瘤和转移性LN中的频率对它们进行绘制。显示了两位HNSCC患者的结果。在图7A中按照从上(SEQ IDNO:1)到下(SEQ ID NO:15)的顺序显示了SEQ ID NO:1-15。在图7B中按照从上(SEQ ID NO:16)到下(SEQ ID NO:30)的顺序显示了SEQ ID NO:16-30。
序列表
使用如37C.F.R.1.822中所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写以及氨基酸的三字母代码显示所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链，但应理解当提到所展示的链时，其互补链也包括在内。序列表以ASCII文本文件提交[Sequence_Listing，2018年5月4日，7,113字节]，其通过引用并入本文。在所附序列表中：SEQ ID NO:1-30是示例性TCRB CDR3区的核苷酸序列。
发明详细
需要提高针对癌症患者的免疫疗法和过继性T细胞转移的功效，并且需要表征参与抗肿瘤反应的CD8 T细胞，以便将特定的亚群用于诊断方法。CD39+CD8+ T细胞包括CD39+CD103+CD8+ T细胞和CD39+CD103-CD8+ T细胞。本文公开了确定了肿瘤反应性CD8 T细胞的表型和功能，并且记录了CD103和CD39的共表达鉴定了在肿瘤微环境中被特异性诱导的肿瘤浸润CD8 T细胞的独特群体。这些在肿瘤内被长期刺激的细胞因肿瘤反应性被高度富集，并具有杀死自体肿瘤细胞的能力。人类肿瘤中较高频率的CD103+CD39+CD8 T细胞与更高的总体存活率相关，这表明对生物学样品中这些细胞的评估提供了确定治疗功效的方法以及评估患有肿瘤的受试者是否响应于治疗的方法。
术语
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可参见：Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford UniVersity Press,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiVe DeskReference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
为了便于审阅本公开的多个实施方式，对特定术语提供了以下解释：
4-1BB：一种跨膜蛋白，也称为CD137和TNFRSF9，其是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRS)的蛋白。4-1BB的表达通常是激活依赖性的，并存在于广泛的免疫细胞亚群中，包括激活的NK和NKT细胞、调节性T细胞、激活的CD4和CD8 T细胞、树突状细胞(DC)、刺激的肥大细胞、分化髓样细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(Wang,2009,ImmunologicalReViews 229:192-215)。还已经在肿瘤脉管系统(vasculature)上(Broll,2001,Amer.J.Clin.Pathol.115(4):543-549；Seaman,2007,Cancer Cell 11:539-554)和在发炎或动脉粥样硬化的内皮处(Drenkard,2007FASEB J.21:456-463；Olofsson,2008,Circulation 117:1292-1301)证实了4-1BB的表达。刺激4-1BB的配体，即4-1BB配体(4-1BBL)，在激活的抗原呈递细胞(APC)、骨髓祖细胞和造血干细胞上表达。人4-1BB是255个氨基酸的蛋白质(请参见GENBANK登录号NM—001561和NP—001552，其以引用的方式并入本文，于2017年6月1日可获得)。4-1BB的激动剂抗体公开于例如美国专利8,337,850中，其通过引用并入本文。
改变水平：与对照水平相比，改变(通过增加或减少)特定细胞类型的细胞数或者核酸序列或氨基酸序列(例如多肽、siRNA、miRNA，基因)的产生水平或表达水平。
反义、有义和反基因：DNA具有两条反向平行链，即5'→3'链(称为正链)和3'→5'链(称为负链)。由于RNA聚合酶以5'→3'方向添加核酸，因此DNA的负链在转录过程中充当RNA的模板。因此，RNA转录物将具有与负链互补且与正链相同的序列(除了U取代T)。
反义分子是与RNA或DNA的正链特异性杂交或特异性互补的分子。有义分子是与DNA的负链特异性杂交或特异性互补的分子。反基因分子是针对DNA靶标的反义或有义分子。反义RNA(asRNA)是与有义(编码)核酸分子互补的RNA分子。
抗体：包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，其识别并结合(例如特异性识别并特异性结合)抗原(例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3或4-1BB多肽)或其片段的表位。免疫球蛋白分子由重链和轻链组成，每个重链和轻链均具有可变区，称为重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区。VH区和VL区共同负责结合抗体识别的抗原。
抗体包括本领域众所周知的完整的免疫球蛋白以及抗体的变体和部分，例如单结构域抗体(例如VH结构域抗体)、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区由接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，这些链已被突变以引入二硫键来稳定链的结合。该术语还包括基因工程形式，例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异源缀合抗体(例如双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog and Handbook,1994-1995(Pierce ChemicalCo.,Rockford,IL)；Kuby,J.,Immunology,3rd Ed.,W.H.Freeman&Co.,New York,1997。
通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互连的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型，lambda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。
每条重链和轻链均包含恒定区和可变区(这些区也称为“结构域”)。重链可变区和轻链可变区一起特异性结合抗原。轻链和重链可变区包含被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)中断的“框架”区。框架区和CDR的范围已根据Kabat等人(参见，Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health andHuman Services,1991)和ImMunoGeneTics数据库(IMGT)(参见Lefranc,Nucleic AcidsRes 29:207-9,2001；and imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？_livret＝0&Option＝humanIg)进行定义。Kabat数据库在线维护(ncbi.nlm.nih.goV/igblast/)。不同轻链或重链的框架区的序列在物种(例如人类)中相对保守。抗体的构架区，即构成的轻链和重链的组合构架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。
CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，从N端开始依次编号，并且通常还由特定CDR所在的链来鉴定。因此，VH CDR3(或H-CDR3)位于发现其的抗体重链的可变域中，而VL CDR1(或L-CDR1)是发现其的抗体轻链的可变域中的CDR1。例如，结合PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体将具有特定的VH区和VL区序列，从而具有特定的CDR序列。具有不同特异性的抗体(即不同抗原的不同结合位点)具有不同的CDR。尽管不同抗体的CDR不同，但CDR中仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
提及“VH”或“VH”时是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。提及VL”或“VL”时是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab的可变区。
“单克隆抗体”是由B淋巴细胞的单个克隆或由已向其中转染了单个抗体的轻链和/或重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员已知的方法产生，例如通过由骨髓瘤细胞与免疫脾细胞的融合制备杂交抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
“嵌合抗体”具有来自一个物种(例如人)的框架残基，以及来自另一个物种的CDR(通常赋予抗原结合)，例如与PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3或4-1BB多肽特异性结合的鼠抗体。
“人”抗体(也称为“全人”抗体)是包括人框架区和来自人免疫球蛋白的所有CDR的抗体。在一个实例中，框架和CDR来自相同来源的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而，来自一种人抗体的框架可以被工程化以包含来自不同人抗体的CDR。“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。在一个实施方式中，所有CDR都来自人源化免疫球蛋白中的供体免疫球蛋白。恒定区的存在不是必须的，但是如果存在，则它们必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％，例如约95％或更高的同一性。因此，除可能的CDR外，人源化免疫球蛋白的所有部分与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可以有有限数量的来自供体框架的氨基酸取代。人源化或其他单克隆抗体可具有其他保守氨基酸取代，其对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响。可以通过基因工程构建人源化免疫球蛋白(参见，例如，美国专利号5,585,089)。
抗原：可以刺激动物体内的抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定的体液或细胞免疫产物反应，包括由异源免疫原诱导的那些。术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其有响应的位点。在一个实施方式中，当表位与MHC分子结合呈递时，T细胞对表位有响应。表位可由因蛋白质的三级折叠而并列的连续氨基酸或不连续的氨基酸形成。当暴露于变性溶剂后，由连续氨基酸形成的表位通常会保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后丢失。表位通常包含具有独特空间构象的至少3个，更通常至少5个，约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。
抗原呈递细胞(APC)：可以将与MHC I类或II类分子结合的抗原呈递给T细胞的细胞。
APC包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞和朗格汉斯细胞。可以将抗原呈递给其他T细胞(包括CD4+和/或CD8+ T细胞)的T细胞是抗原呈递T细胞(T-APC)。
B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)：一种蛋白质，也称为CD272。在T细胞激活的过程中诱导BTLA表达，而BTLA仍在Th1细胞上表达。BTLA与B7同源物B7H4相互作用，并通过与肿瘤坏死家族受体的相互作用在T细胞抑制中发挥作用。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，所述TNFRSF14也称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物负向调节T细胞免疫反应。特异性的非限制性BTLA氨基酸序列和编码BTLA的mRNA序列在
Figure BDA0002308681980000061
登录号NM_001085357(2016年9月1日)中提供，其通过引用并入本文。BTLA拮抗剂包括例如通过特异性结合BTLA并抑制BTLA与肿瘤坏死因子受体的结合来降低BTLA的表达或活性或抑制BTLA的T细胞抑制功能的试剂。示例性化合物包括抗体(例如抗-BTLA抗体)、RNAi分子、反义分子和显性阴性蛋白。
结合或稳定结合(寡核苷酸)：如果足够量的寡核苷酸形成碱基对或与其靶核酸杂交，则寡核苷酸可以与靶核酸结合或稳定结合，从而允许检测该结合。可以通过靶标：寡核苷酸复合物的物理或功能性质来检测结合。靶标和寡核苷酸之间的结合可以通过本领域技术人员已知的任何方法来检测，包括功能和物理结合测定。例如，可以通过确定结合是否对生物合成过程例如基因表达、DNA复制、转录、翻译等具有可观察到的作用来在功能上检测结合。
检测DNA或RNA的互补链结合的物理方法是本领域众所周知的，并且包括诸如DNA酶I或化学足迹法，凝胶移位和亲和力裂解测定，Northern印迹，点印迹和光吸收检测程序的方法。例如，由于其简单可靠而被广泛使用的一种方法涉及观察含有寡核苷酸(或类似物)和靶核酸的溶液随着温度缓慢增加在220至300nm处的光吸收的变化。如果寡核苷酸或类似物已与其靶标结合，则当寡核苷酸(或类似物)与靶标彼此分离或解链时，在特征温度下会存在吸收的突然增加。
寡聚物及其靶核酸之间的结合通常特征在于50％的寡聚物与其靶解链的温度(Tm)。相对于具有较低(Tm)的复合物，较高的(Tm)表示更强或更稳定的复合物。
结合亲和力：抗体对抗原的亲和力。在一个实施方式中，通过Frankel et al.,Mol.Immunol.,16:101-106,1979描述的Scatchard方法的改进来计算亲和力。在另一个实施方式中，通过抗原/抗体的解离速率测量结合亲和力。在另一个实施方式中，通过竞争性放射免疫测定法测量高结合亲和力。在另一个实施方式中，通过ELISA测量结合亲和力。“特异性结合”抗原(例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3或4-1BB多肽)的抗体是以高亲和力结合抗原并且不会显著结合其他无关抗原的抗体。
癌症治疗剂：用于治疗受试者癌症的任何试剂。癌症治疗剂包括检查点抑制剂、生物反应调节剂(例如细胞因子和趋化因子)、癌症疫苗、化学疗法和/或放射疗法。
化学治疗剂：在特征为异常细胞生长的疾病的治疗中具有治疗有用性的任何化学药剂。此类疾病包括肿瘤、赘生物和癌症以及特征在于增生性生长的疾病，例如银屑病。在一个实施方式中，化学治疗剂是放射性化合物。本领域技术人员可以容易地确定所使用的化学治疗剂(例如，参见，Slapak and Kufe,Principles of Cancer Therapy,Chapter86in Harrison's Principles of Internal Medicine,14th edition；Perry et al.,Chemotherapy,Ch.17in Abeloff,Clinical Oncology 2nd ed.,
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2000ChurchillLivingstone,Inc；Baltzer,L.,Berkery,R.(eds.):Oncology Pocket Guide toChemotherapy,2nd ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1995；Fischer,D.S.,Knobf,M.F.,Durivage,H.J.(eds):The Cancer Chemotherapy Handbook,4th ed.St.Louis,Mosby-Year Book,1993)。联合化疗是施用一种以上的药物以治疗癌症。一个实例是联合施用结合PD-1、PD-L1或CTLA-4多肽的抗体和细胞、放射性化合物或化学化合物。
CD39(ENTPD1)：具有两个跨膜结构域和大胞外域的完整膜蛋白(Maliszewski etal,1994)。其最初被鉴定为人淋巴细胞上的激活标记和血管的胞膜外-ADP酶(Kaczmarek Eet al.(1996)Biol Chem)。术语“CD39”表示CD39蛋白，也称为外核苷三磷酸二磷酸水解酶1(ENTPD1)。在体内，CD39在调节性T细胞(Treg细胞)、B细胞和若干先天免疫细胞上表达。其通过如下方式在免疫抑制中起关键作用：三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)水解为单磷酸腺苷(AMP)，该单磷酸腺苷随后通过CD73(一种胞外5'核苷酸酶)加工成腺苷。腺苷是一种有效的免疫调节剂，其通过与T细胞上的A2A受体结合而增强胞内cAMP的积累，从而阻止T细胞激活(Deaglio S et al,JEM,2007)。CD39和CD73的表达在几种人类实体恶性肿瘤中均为增加的(Antonioli Luca et al.,Trends Mol Med,2013)。在低氧环境中，这两种酶的上调是有利的，它们的顺序协同作用可能在肿瘤的免疫逃逸中起作用(Eltzschig HK et al.,Blood 2009；Ghiringhelli F et al.,J Biomed Biotech,2012)。特定的非限制性CD39氨基酸序列和编码CD39的mRNA序列在
Figure BDA0002308681980000073
登录号NM_001776(2017年5月1日)中提供，其通过引用并入本文。
CD103：被称为整合素αE(ITGAE)的CD103结合整合素β7(β7–ITGB7)以形成异二聚体整合素分子αEβ7。αEβ7的主要配体是E-钙粘蛋白，一种在上皮细胞上发现的粘附分子。这对于T细胞归巢到肠道部位以及在组织中保留组织驻留记忆(TRM)细胞而言是重要的。在体内，CD103在肠道中的树突状细胞亚群和存在于特征为组织驻留记忆(TRM)细胞的外周组织中的T细胞群中表达(Schenkel JM et al.,Immunity,2014；Mueller SN et al.,Nat RevImmunol,2015)。CD103还可以在高度浆液性卵巢癌、肺癌、膀胱尿路上皮细胞癌和子宫内膜癌的CD8 T细胞亚群中表达(Webb JR et al.,Clin Cancer Res,2014；Webb JR et al.,Cancer Immunol Res,2015；Komdeur FL et al.,Oncotarget,2016；Djenidi F et al.,JImmunol,2015；Wang B et al.,J Urol,2015；Workel HH et al,EJC,2015)。在那些恶性肿瘤中，CD103+CD8 T细胞优先位于肿瘤内，因此有利于与肿瘤细胞的直接相互作用。CD103+CD8 T细胞表达高水平的PD-1(一种激活/耗尽表面分子(an activation/exhaustionsurface molecule))，与其配体PD-L1相互作用后会抑制T细胞的增殖、存活和效应子功能(Webb JR et al.,Cancer Immunol Res,2015)。特定的非限制性CD103氨基酸序列和编码CD103的mRNA序列在
Figure BDA0002308681980000072
登录号NM_002208(2017年5月20日)中提供，其通过引用并入本文。
保守变体：“保守”氨基酸取代是基本上不影响或降低蛋白质如抗体的亲和力的那些取代。例如，特异性结合PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG3、CTLA-4或4-1BB的人抗体可以包括至多约1个、至多约2个、至多约5个和至多约10个或至多约15个保守取代，并特异性结合PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG3、CTLA-4或4-1BB多肽。术语保守变异(conservativevariation)还包括使用取代的氨基酸来代替未取代的亲本氨基酸，条件是抗体特异性结合PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG3、CTLA-4或4-1BB多肽。非保守取代是降低活性或与PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG3、CTLA-4或4-1BB多肽结合的那些。
提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员众所周知的。以下六组是被认为是彼此保守替代的氨基酸实例：
1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；
2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和
6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
接触：以直接物理相关联的方式放置，包括固体和液体形式。
对照水平(免疫参数)：免疫参数的基线水平。在一些实施方式中，对照物水平是在不存在治疗剂的情况下免疫系统的组分(例如特定类型的细胞)的水平。可在来自未用目标试剂治疗的受试者的样品或来自用对照物试剂治疗的受试者的样品中测量对照水平。对照水平也可以是标准值，例如根据一段时间内大量样本的平均值确定的值。也可以在来自用特定剂量的治疗剂治疗的受试者的样品中测量对照水平，其中在该受试者当前正在评估时不对该受试者施用该剂量。对照可以来自正在评估的受试者，也可以来自不同受试者。
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)：也称为CD152的蛋白质。CTLA-4是免疫球蛋白超家族的成员。CTLA-4是一种可充当免疫检查点由此下调免疫反应的蛋白质受体。CTLA-4在调节性T细胞(Tregs)中组成性表达，并在激活后在常规T细胞中上调。CLTA4结合抗原呈递细胞表面的CD80或CD86，并且是T细胞的抑制剂。CTLA-4蛋白和编码CTLA-4的mRNA的具体非限制性实例公开于，例如，登录号NM_001037631(2016年10月7日)，其通过引用并入本文。CTLA-4拮抗剂包括降低CTLA-4的表达或活性或抑制CTLA-4的T细胞抑制功能的药物，例如，通过与CTLA-4特异性结合并抑制CTLA-4与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86的结合来实现。示例性的化合物包括抗体(例如抗CTLA-4抗体)、RNAi分子、反义分子和显性阴性蛋白。
检测(Detecting或detection)(细胞或生物分子)：是指定量或定性地确定所研究的生物分子或特定细胞类型(例如CD8+CD39+CD103+ T细胞)的存在。例如，定量或定性地确定来自受试者的样品中CD8+CD39+CD103+ T细胞的存在。通常，检测诸如蛋白质、核酸之类的生物分子或检测特定细胞类型或细胞增殖，需要进行生物学测定而不是简单的观察。例如，利用抗体或核酸探针(均可以被标记)或分别用于检测蛋白质或细胞的测定法。治疗(例如使用检查点抑制剂的治疗)功效的诊断(diagnosing或diagnoisis)涉及检测诸如CD8+CD39+CD103+ T细胞之类的细胞或生物分子的显著变化。
DNA(脱氧核糖核酸)：DNA是构成大多数活生物体的遗传物质的长链聚合物(某些病毒具有包含核糖核酸(RNA)的基因)。DNA聚合物中的重复单元是四种不同的核苷酸，每个核苷酸都包含与脱氧核糖相结合的以下四种碱基之一：腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶，所述脱氧核糖与磷酸基连接。核苷酸的三联体(称为密码子)编码多肽中的每个氨基酸或终止信号。术语密码子也用于mRNA中三个核苷酸的对应(和互补)序列，在所述mRNA中转录DNA序列。
除非另有说明，否则对DNA分子的任何引用均应包括该DNA分子的反向补体。除了本文本要求单链的地方以外，尽管DNA分子被书写为仅描绘单链，但其包含双链DNA分子的两条链。
诊断：鉴定病理状况(例如但不限于肿瘤)的存在或性质。诊断方法的敏感性和特异性不同。诊断测定的“敏感性”是指测试为阳性的患病个体的百分比(真实阳性的百分比)。诊断测定的“特异性”为1减去假阳性率，其中假阳性率定义为测试为阳性的无疾病的比例。尽管特定的诊断方法可能无法提供对疾病的明确诊断，但只要该方法提供有助于诊断的阳性指示就足够了。“预后”是病理状况(例如肿瘤或转移)发展的可能性(例如，严重性)。
编码：如果多核苷酸在其天然状态或通过本领域技术人员熟知的方法操纵时可以被转录和/或翻译以产生针对多肽或其片段的mRNA和/或多肽或其片段，则称这种多核苷酸编码所述多肽。反义链是这种核酸的补体，并且可以从其推导编码序列。
饲养细胞：诸如在培养皿底部的一层细胞。饲养细胞可以将营养物、生长因子和/或细胞因子释放到培养基中，并提供可与其他细胞(例如T细胞)相互作用的底物。可对细胞进行辐照。在一个实施方式中，饲养细胞是经辐照的同种异体外周血单核细胞。
免疫检查点抑制剂：一种能阻止特定类型的免疫系统细胞(例如但不限于T细胞和某些癌细胞)中生物途径的试剂类型。这些抑制剂抑制T细胞杀死癌细胞。当检查点抑制剂被阻断时，免疫系统的“抑制作用”减少，且T细胞被激活以对抗癌细胞。在T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3。
免疫反应：免疫系统细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)对刺激的反应。在一个实施方式中，反应对特定抗原是特异性的(“抗原特异性反应”)。在一个实施方式中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方式中，反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。
关于免疫细胞的“无反应”包括免疫细胞对刺激(例如通过激活受体或细胞因子的刺激)的无活性(refractivity)。例如，由于暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量的抗原，会发生无反应。如本文所用的，术语“无效能(anergy)”或“耐受”包括对激活受体介导的刺激的无活性。这种无活性通常是抗原特异性的，并且在耐受抗原暴露停止后仍然存在。例如，T细胞中的无效能(与无反应相对)的特征是缺乏细胞因子(例如IL-2)的产生。当T细胞暴露于抗原并在没有第二信号(共刺激信号)的情况下接收第一信号(T细胞受体或CD3介导的信号)时会发生T细胞无效能。在这些条件下，细胞再次暴露于相同的抗原(即使在存在共刺激分子的情况下发生暴露)也会导致无法产生细胞因子，从而导致无法增殖。然而，无效能的T细胞可以引起对无关抗原的反应，并且如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，则可以增殖。例如，当通过ELISA或通过使用指示细胞系的增殖测定来测量时，还可通过T淋巴细胞不产生IL-2来观察到T细胞无效能。或者，可以使用报告基因构建体。例如，无效能的T细胞无法启动IL-2基因转录，所述IL-2基因转录通过在5'IL-2基因增强子控制下的异源启动子诱导或通过可在增强子内发现的AP1序列的多聚体诱导(Kang et al.Science 257:1134,1992)。相对于对应的对照抗原特异性T细胞，无效能的抗原特异性T细胞的细胞毒活性可降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
抑制或治疗疾病：抑制疾病，例如肿瘤生长，是指抑制疾病的全面发展或减轻疾病过程的生理影响。在若干实例中，抑制或治疗疾病是指减轻肿瘤或病原体感染的症状。例如，癌症治疗可以防止已知患有癌症的人的副肿瘤综合征的发展，或者减轻肿瘤的体征或症状。在另一个实施方式中，感染的治疗可以指抑制感染的发展或减轻其症状。“治疗”是指改善疾病或与疾病有关的病理状况的体征或症状的治疗性干预。治疗性疫苗接种是指向已被病原体感染的受试者施用药剂。受试者可以是无症状的，因此该治疗可以防止症状的发展。
分离的：“分离的”生物成分(例如核酸、蛋白质(包括抗体)或细胞)已与该成分天然存在的环境(例如其他细胞)中的其他生物成分(即，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本分离或纯化。已被“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸。
淋巴细胞：一种参与机体免疫防御的白细胞类型。淋巴细胞主要有两种：B细胞和T细胞。
淋巴细胞激活基因3(LAG3)：一种在人中由LAG3基因编码的蛋白质，也称为CD223。LAG-3是对T细胞功能具有多种生物学作用的细胞表面分子，并且是免疫检查点受体。LAG3负调节T细胞的细胞增殖、激活和稳态(homeostasis)，并被报道为在Treg抑制功能中起作用。编码人LAG3的示例性氨基酸和mRNA在登录号NM_002286.5(2017年4月9日)中提供，其通过引用并入本文。
哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽医学受试者。
平均荧光强度(流式细胞仪)：流式细胞仪涉及细胞或颗粒的光强度的测量，无论其是散射激光还是荧光染料发出的荧光。光通过光电倍增管(PMT)来检测，所述光电倍增管通过放大器将其转换为与原始荧光强度和PMT上的电压成比例的电压。将连续分布的这些电压通过模数转换器(Analog to Digital converter,ADC)转换为离散分布，其根据荧光水平将每个信号置于特定的通道中。ADC的分辨率越高，则越接近地反映连续分布。
流式细胞仪数据可以使用线性或对数标度(linear or logarithmic scale)显示。在大多数生物学情况(其中分布右偏)下使用对数标度来表示。在这种情况下，其作用是标准化分布–这被称为Log Normal，并且数据已经过对数转换。线性信号通过线性放大器，但是对数转换可以通过对数放大器或使用查找表(LUT)来实现。分析型细胞仪中的大多数ADC是10位的，即它们将数据划分为2e10或1024个通道，尽管使用12位或14位ADC来提供更高的数据分辨率的趋势正在增长。
来自单个数据通道(散射或荧光)的数据显示为直方图，其中x轴分为1024个通道(对于10位ADC)。如果数据为线性标度，则将轻松获得该通道的通道号和线性值。在对数标度上，x轴仍被划分为1024个通道，但显示为5个对数十进位标度(log decade scale)(通常使用5个对数十进位(log decade))。
为了量化流式细胞仪数据，利用了群体分布的量度(measure)。通常，集中趋势(central tendency)的量度是均值和中位数。平均值是“平均数”，并且可以是算术或几何的。算术平均值计算为Sigma(x)/n，并且几何平均值计算为n root(a1 x a2 x a3....an)。通常，对数倍增数据使用几何平均值，因为它考虑了数据分布的权重，算术平均值用于线性数据或以线性标度显示的数据。中位数是中心值，即第50个百分位数，其中一半的值在上方，一半在下方。可以根据整个群体的荧光相对确定“高”表达和“低”表达的细胞。这些参数很容易在流式细胞仪数据图上显示。
培养基(组织培养或细胞培养)：具有支持特定细胞群生长(细胞增殖/扩增)所必需的营养物的培养条件的综合集合(synthetic set)。培养基通常包括碳源、氮源和保持pH的缓冲液。在一个实施方式中，生长培养基包含最小必需培养基(例如RPMI)，并补充有多种营养物以增强细胞生长。另外，最小必需培养基可以补充有诸如人、小牛或胎牛血清之类的添加物。
赘生物、恶性肿瘤、癌症或肿瘤：赘生物是因过度细胞分裂导致的组织或细胞异常生长。赘生物生长可产生肿瘤。“癌”或“肿瘤”是具有如下特征的赘生物：其已经历了特征性间变(anaplasia)，伴有分化丧失、生长速度增加、周围组织侵袭，并且能够转移。个体中肿瘤的量就是“肿瘤负担(tumor burden)”，其可以用肿瘤的数量、体积或重量来衡量。不转移的肿瘤被称为“良性的”。侵袭周围组织和/或能转移的肿瘤被称为“恶性的”。转移癌是指除转移癌来源的初始(原发)癌的来源部位之外的一个或多个部位的癌。
血液肿瘤的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病，急性粒细胞白血病(acute myelocytic leukemia)，急性髓系白血病(acute myelogenousleukemia)，以及粒细胞性、早粒细胞性、粒细胞性、单核细胞性和红血球性白血病)、慢性白血病(例如慢性粒细胞(粒细胞性)白血病、慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特罗姆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
实体瘤(如肉瘤和癌)的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤(myxosarcoma)、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆斯肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌和中枢神经系统肿瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、声学神经瘤、少突胶质细胞瘤、血管瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
在若干实例中，肿瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、成胶质细胞瘤或直肠癌。
肠胃外：在肠道外施用，例如，不通过消化道。通常，肠胃外制剂是通过摄食以外的任何可能方式施用的那些。该术语尤指注射剂(无论是静脉内、鞘内、肌内、腹膜内、关节内或皮下施用)以及各种表面施用，包括例如鼻内、皮内和局部施用。
药物剂：当适当地施用于受试者或细胞时能够诱导期望的治疗或预防效果的化学化合物或组合物。
可药用载体：使用的可药用载体是常规的。Remington’s PharmaceuticalSciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,15th Edition,1975描述了适用于药物递送本文公开的抗体的组合物和制剂。
通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含注射流体，所述注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体(例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等)作为载体。对于固体组合物(例如粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
多核苷酸：术语多核苷酸或核酸序列是指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合形式。重组多核苷酸包括多核苷酸，该多核苷酸与在其来源生物体的天然基因组中与其直接相邻的两个编码序列(一个在5’端，一个在3’端)不直接相邻。因此，该术语包括，例如，重组DNA，所述重组DNA被整合到载体中；到自主复制的质粒或病毒中；或到原核生物或真核生物的基因组DNA中，或作为独立于其他序列的单独分子(例如cDNA)存在。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
多肽：任何氨基酸链，无论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。多肽的长度可以是3至30个氨基酸。在一个实施方式中，多肽的长度为约7至约25个氨基酸。在另一个实施方式中，多肽的长度为约8至约10个氨基酸。在另一个实施方式中，肽的长度为约9个氨基酸。关于多肽，“包括/包含(comprises)”表示该分子中可以包含其他氨基酸序列或其他分子，“基本上由...组成”表示该分子中不包含其他氨基酸序列，但是可包含其他试剂(例如标记或化合物)，和“由...组成”表示分子中不包含其他氨基酸序列和其他试剂。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病(例如肿瘤)的全面发展。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其迹象或症状的治疗性干预，例如减轻肿瘤负荷或减少转移灶的尺寸和数量。“改善”是指疾病例如癌症的迹象或症状的数量或严重程度的降低。
程序性细胞死亡蛋白(PD)-1：PD-1分子是免疫球蛋白基因超家族的成员。人PD-1具有包含免疫球蛋白超家族结构域的胞外区、跨膜结构域和包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的胞内区((Ishida et al.,EMBO J.11:3887,1992；Shinohara et al.,Genomics 23:704,1994；美国专利号5,698,520，其以引用的方式并入本文)。这些特征还定义了更大的分子家族，称为免疫抑制受体，其还包括gp49B、PIR-B和杀伤抑制受体(KIR)(Vivier and Daeron(1997)Immunol.Today 18:286)。不受理论的束缚，相信这些受体的酪氨酰磷酸化ITIM基序与含S112结构域的磷酸酶相互作用，这导致抑制信号。这些免疫抑制受体的一个子集与主要组织相容性复合体(MHC)分子(例如KIR)相结合，并且细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)与B7-1和B7-2结合。在人中，PD-1是一种50-55kDa的I型跨膜受体，其最初在经历激活诱导的细胞凋亡的T细胞系中被鉴定。PD-1在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-1的配体是B7家族成员PD-配体1(PD-L1，也称为B7-H1)和PD-L2(也称为B7-DC)。
在体内，PD-1在激活的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。实验数据暗示PD-1及其配体的相互作用下调中枢和外周免疫反应。特别地，在PD-L1的存在下，抑制了野生型T细胞中的增殖而不是PD-1缺陷型T细胞中的增殖。此外，PD-1缺陷型小鼠表现出自体免疫表型。人PD-1的示例性氨基酸序列如Ishida et al.,EMBO J.11:3887,1992；Shinohara etal.Genomics23:704,1994；U.S.Pat.No.5,698,520)中所示：
PD-1的参与(例如通过交联或通过聚集)导致免疫细胞中抑制信号的传递，导致免疫反应减少，伴随着免疫细胞无效能增加。PD-1结合两个配体PD-L1和PD-L2，这两种都是人PD-1配体多肽，它们是多肽B7家族的成员。
PD-1拮抗剂包括降低PD配体1(PD-L1)或PD配体2(PD-L2)的表达或活性或减少PD-1与PD-L1或PD-L2之间相互作用的药物。示例性化合物包括抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体)，RNAi分子(例如抗PD-1RNAi分子、抗PD-L1 RNAi和抗PD-L2RNAi)、反义分子(例如抗PD-1反义RNA、抗PD-L1反义RNA和抗PD-L2反义RNA)、显性阴性蛋白(例如显性阴性PD-1蛋白、显性阴性PD-L1蛋白和显性阴性PD-L2蛋白)，参见，例如，PCT公开号2008/083174，其通过引用并入本文。
增殖：细胞分裂产生后代，其可以通过本领域已知的多种方法测量。这包括但不限于对细胞总数进行计数的测定，对特定细胞类型的细胞数量进行计数的测定，Ki-67测定，胸腺嘧啶掺入(thymidine incorporation)和溴脱氧尿苷测定。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对的纯度。相反，它旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的肽制品是其中肽或蛋白质比该肽或蛋白质在细胞内的天然环境中更富集的制剂。在一个实施方式中，制品被纯化为使得蛋白质或肽占制品的总肽或蛋白质含量的至少50％。基本纯化是指从其他蛋白质或细胞成分中纯化。基本上纯化的蛋白质的纯度至少为60％、70％、80％、90％、95％或98％。因此，在一个特定的非限制性实例中，基本上纯化的蛋白质为90％，并且不含其他蛋白质或细胞组分。
样品(生物样品)：包括含有液体、组织、细胞及其子成分(例如DNA、RNA和蛋白质)的生物样品。例如，常见样本包括肿瘤活检、骨髓、脾脏、淋巴结、血液，例如外周血(但也可以包括可从中分离出CD8+CD39+CD103+ T细胞的任何其他来源，包括：组织活检、外科手术样品、细针抽吸物、尸检材料等)。
特异性结合剂：基本上仅结合确定的靶标的试剂。在一个实施方式中，特异性结合剂是特异性结合PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3或4-1BB多肽的单克隆或多克隆抗体。
当关于抗原(例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3或4-1BB多肽)时，术语“特异性结合”是指抗体或其他配体整体或部分地与带有携带该抗原的细胞或组织优先结合而非与缺乏该抗原的细胞或组织优先结合。当然，已经认识到在分子与非靶细胞或组织之间可能发生一定程度的非特异性相互作用。然而，可以通过抗原的特异性识别来区分特异性结合。尽管选择性反应抗体结合抗原，但它们可能以低亲和力结合。特异性结合导致抗体(或其他配体)与带有抗原的细胞之间的结合比抗体(或其他配体)与缺乏抗原的细胞之间的结合强得多。与缺乏该多肽的细胞或组织相比，特异性结合通常导致与携带该多肽的细胞或组织结合的抗体或其他配体的量(每单位时间)增加大于2倍，例如大于5倍，大于10倍，或大于100倍。在这种条件下与蛋白质的特异性结合需要选择针对特定蛋白质具有特异性的抗体。多种免疫测定形式适用于选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体或其他配体。例如，常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的单克隆抗体。参见Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPublications,New York(1988)，其描述了可用于确定特定免疫反应性的免疫测定形式和条件。
受试者：活的多细胞脊椎动物，包括人和兽医学受试者，包括人和非人哺乳动物。
T细胞：对免疫反应至关重要的白细胞。T细胞包括但不限于CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。CD4+ T淋巴细胞是一种免疫细胞，其表面带有称为“分化簇4”(CD4)的标记物。这些细胞也称为辅助T细胞，有助于协调免疫反应，包括抗体反应和杀伤性T细胞反应。CD8+ T细胞带有“分化簇8”(CD8)标记物。在一个实施方式中，CD8+ T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在另一个实施方式中，CD8+细胞是抑制性T细胞。当T细胞可以响应于抗原呈递细胞上呈递的特定目标抗原时，它被“激活”。
T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin-domaincontaining-3,TIM-3)：在人类中由HAVCR2基因编码的蛋白质。TIM3是一种免疫检查点，其是一种Th1特异性细胞表面蛋白，其可调节小鼠中巨噬细胞激活并增强实验性自体免疫脑脊髓炎的严重性。Tim-3途径可与癌症中耗竭的CD8+ T细胞中的PD-1途径相互作用。人TIM-3的示例性mRNA和蛋白质序列在
Figure BDA0002308681980000131
登录号NM_032782.4(2017年4月30日)中提供，其通过引用并入本文。
治疗有效量：足以在所治疗的受试者中获得所需效果的特定物质的量。例如，这可以是抑制或压制肿瘤生长所需的量。在一个实施方式中，治疗有效量是消除肿瘤、减小肿瘤的尺寸或防止肿瘤转移所需的量。当施用于受试者时，通常将使用实现目标组织浓度(例如，在肿瘤中)的剂量，所述目标组织浓度已被证实实现了所需的体外作用。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一个”和“该”包括复数。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。因此，“包含A或B”是指包括A或B或A和B。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值是近似值，仅供说明。尽管类似于或等同于本文描述的那些的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。所有
Figure BDA0002308681980000132
登记号均通过引用并入本文，如同其于2017年6月1日出现在数据库中。在有冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并非旨在限制。
治疗方法：过继免疫疗法
本文公开了治疗目标受试者(例如患有肿瘤的受试者)的方法。所述方法包括施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞。本文公开了增加免疫反应，例如增强受试者的免疫系统的方法。如本文所公开的，纯化的CD8+CD39+CD103+ T细胞的施用将增加受试者引起免疫反应(例如针对肿瘤的免疫反应)的能力。因此，通过离体纯化并产生来自受试者的经纯化的选定CD8+CD39+CD103+ T细胞群，并引入治疗量的这些细胞，增强了受体受试者的免疫反应。如下所述，还可以向受试者施用其他试剂。受试者可以是人或兽医受试者。
在一个实例中，所述方法包括从供者中分离出包含CD8+CD39+CD103+ T细胞的供体细胞群(例如来自肿瘤活检的外周血单核细胞或T细胞)，并任选地扩增细胞。向受者施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞，从而在受者中对肿瘤产生免疫反应。此类CD8+CD39+CD103+ T细胞可杀死含有肿瘤相关抗原的细胞或辅助其他免疫细胞。在一些实施方式中，可以施用另外的癌症治疗剂，例如化学治疗剂。
在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用治疗有效量的PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂。以下详细描述PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂的施用。施用治疗量的CD8+CD39+CD103+ T细胞和治疗有效量的PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂可预防性地用于预防受者中肿瘤复发或治疗肿瘤复发。
通常，CD8+CD39+CD103+ T细胞是自体同源的。但是，CD8+CD39+CD103+ T细胞也可以与来自同种异体供体的匹配MHC反应。通常，T细胞对于CD3、CD8、CD39和CD103的表达是阳性的。例如，通过使用不同着色的抗CD3、抗CD8、抗CD39和抗CD103抗体，可以使用荧光激活细胞分选(FACS)来识别(并在需要时分选)对CD3、CD8、CD39和CD103呈阳性的细胞群。简言之，将诸如来自肿瘤活检的外周血单核细胞或T细胞的细胞群在抗CD103、抗CD8、抗CD39和任选的抗CD3抗体(均具有连接的不同荧光团)的存在下温育足以使抗体结合到细胞的时间。除去未结合的抗体后，使用常规方法通过FACS分析细胞。在特定实例中，相对于总CD8+阳性细胞群，所得的CD8+CD39+CD103+ T细胞群为至少30％纯，例如，相对于总CD8+阳性细胞群，为至少约50％纯，至少约60％纯，至少约70％纯，至少约80％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，或至少约96％纯，约97％纯，约98％纯，或约99％纯。因此，仅施用有限数量的异源细胞。可以对细胞进行一轮以上的细胞分选。可以在冷冻保存之前或在输注给受者之前检测T细胞群的支原体、无菌性、内毒素，并对其功能和纯度进行质量控制。
在一个实施方式中，特异性针对一种或多种细胞表面标志物的标记抗体用于鉴定、定量和/或分离CD8+CD39+CD103+ T细胞和表达其他标志物的这些细胞群。抗体可以与其他化合物缀合，所述其他化合物包括但不限于酶、磁珠、胶体磁珠、半抗原、荧光染料、金属化合物、放射性化合物或药物。可以与抗体缀合的酶包括但不限于碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶和β-半乳糖苷酶。可以与抗体缀合的荧光染料包括但不限于异硫氰酸荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明、藻红蛋白、别藻蓝蛋白和德克萨斯红。有关可以与抗体偶联的其他荧光染料，请参见Haugland,R.P.,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchProducts,published by Molecular Probes,9th Edition(2002)。可以与抗体缀合的金属化合物包括但不限于铁蛋白、胶体金，尤其是胶体超顺磁珠。可以与抗体缀合的半抗原包括但不限于生物素、洋地黄毒苷、奥沙酮和硝基苯酚。可以缀合或整合到抗体中的放射性化合物是本领域已知的，包括但不限于锝99(99Tc)、125I和包含任何放射性核素(包括但不限于14C、3H和35S)的氨基酸。
在一些实例中，通过使来自生物学样品(例如外周血样品或肿瘤样品)的细胞与适当标记的抗体接触来分离CD8+CD39+CD103+ T细胞。但是，可以采用其他功效不同的技术来纯化和分离所需的细胞群。使用的分离技术应最大程度地保留要收集的细胞级分的活力。当然，所采用的具体技术将取决于分离的效率、该方法的细胞毒性、分离的容易程度和速度以及所需的设备和/或技术技能。
流式细胞仪产生的数据可以一维绘制以生成直方图，也可以二维点图绘制，甚至三维绘制。通过创建一系列称为“门(gate)”的子集提取，可以基于荧光强度顺序分隔这些图上的区域。具体的设门方法(gating protocols)是本领域已知的。该图通常以对数标度绘制。因为不同的荧光染料的发射光谱重叠，所以检测器上的信号会通过电子方式和计算方式得到补偿。可以使用诸如或BD之类的软件来分析使用流式细胞仪积累的数据。分析通常是在单独的计算机上进行的。允许鉴定表达高或低水平的目标蛋白的细胞的设门原理是本领域众所周知的。例如，提供了用于学习如何建立门的教程以及网站。通常，本领域技术人员可以容易地使用任何FACS机器和计算机程序进行数据分析，以建立门来分离表达特定标记物的细胞。例如，本领域技术人员可以容易地鉴定其中不存在CD8表达(CD8-)的细胞、存在CD8表达(CD8+)的细胞。
其他分离程序可能包括磁分离，使用抗体包被的磁珠，亲和色谱，细胞毒性剂(可接合到单克隆抗体上或与补体联合使用)，以及“淘选”(panning)，其利用与固体基质相连的单克隆抗体，或另一种方便的技术。附着于磁珠和其他固体基质(如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜和塑料培养皿)的抗体可以直接分离。可以通过简单地将固体支持物与细胞悬浮液物理分离来从细胞悬浮液中去除与抗体结合的细胞。细胞与固相连接抗体一起温育的确切条件和持续时间将取决于该系统特有的几个因素。然而，适当条件的选择在本领域中是众所周知的。
然后，在足以允许表达目标标记物(例如但不限于CD8、CD39、CD103和任选地CD3)的细胞与固相连接的抗体结合的时间之后，可以用生理缓冲液洗脱或洗去未结合的细胞。然后通过任何合适的方法将结合的细胞与固相分离，这主要取决于固相和所用抗体的性质，并使用本领域熟知的方法进行定量。在一个特定的非限制性实例中，从固相中分离的结合细胞通过FACS定量(见上文)。
抗体可以与生物素缀合，然后可以用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉亲和素将其去除，或可以与荧光染料缀合，其可以与FACS结合使用来进行细胞分离和定量，，如本领域已知的那样。
在另一个实施方式中，采用自动血液分离(apheresis)仪(例如CS-3000血细胞分离器，Baxter Health Care，Deerfield，IL，或等效机器)的血液分离程序可用于收集受试者的细胞。在一个具体的非限制性实例中，特异性针对一种或多种细胞表面标志物的标记抗体用于鉴定和定量CD8+CD39+CD103+ T细胞，例如本文公开的细胞。
在一些实施方式中，在施用给受试者之前，在体外扩增CD8+CD39+CD103+ T细胞。扩增方法在下面公开。
本公开还提供了治疗组合物，其包括富集的(例如纯化的)CD8+CD39+CD103+ T细胞和任选地PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂。该组合物可用于本文公开的方法，例如但不限于治疗患有肿瘤的受试者。在特定实例中，将CD8+CD39+CD103+ T细胞群置于治疗剂型中，用于施用给需要它们的受试者。PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂也以治疗剂型存在，用于施用给需要治疗的受试者。
将治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞施用于受试者。治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞的具体的非限制性实例包括以如下剂量施用的纯化的CD8+CD39+CD103+ T细胞：每千克受试者约1×105细胞至每千克受试者约1×109细胞，例如每千克约1×106细胞至每千克约1×108细胞，例如每千克约5×106细胞至每千克约75×106细胞，例如每千克约25×106细胞，或每千克约50×106个细胞。
纯化的CD8+CD39+CD103+ T细胞可以按临床医生确定的单次或多次剂量施用。例如，取决于期望的反应和获得的反应，可以大约一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周或每月的间隔施用细胞。在一些实例中，一旦获得期望的反应，就不再施用其他CD8+CD39+CD103+ T细胞。但是，如果受者表现出一种或多种与肿瘤有关的症状，则可以在那时施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+ T细胞。
施用可以是局部或全身的。在一些实施方式中，在用化学疗法治疗受试者后静脉内施用细胞。在其他实施方式中，还向受试者施用细胞因子，例如IL-2和/或IL-15，以支持所施用细胞的增殖。
本文公开的纯化的CD8+CD39+CD103+ T细胞可以与可药用载体例如盐水一起施用。如下所述，PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或4-1BB激动剂也可以配制在可药用载体中。这些可以配制成单一组合物，或者配制成两种单独的组合物。在一些实例中，其他治疗剂与T细胞一起施用。取决于期望的效果，可以在施用CD8+CD39+CD103+ T细胞之前、期间或之后施用其他治疗剂。示例性治疗剂包括但不限于抗微生物剂、免疫刺激剂(如干扰素-α)、化学治疗剂或用于体外刺激T细胞的肽疫苗。在一个特定的实例中，含有CD8+CD39+CD103+ T细胞的组合物还包括一种或多种治疗剂。使用CD8+CD39+CD103+ T细胞可减少肿瘤体积、肿瘤转移、肿瘤复发。
通常，所述方法包括选择患有肿瘤(例如良性或恶性肿瘤)的受试者，并向该受试者施用治疗有效量的(1)CD8+CD39+CD103+ T细胞和(2)任选地检查点抑制剂拮抗剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂或CTLA-4拮抗剂或4-1BB激动剂。在一些非限制性实例中，PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂或CTLA-4拮抗剂或4-1BB激动剂可以是分别特异性结合PD-1、PD-L1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG3、BTLA、CTLA-4或4-1BB的抗体(或其抗原结合片段)。CD8+CD39+CD103+ T细胞用于治疗肿瘤，例如用于减少肿瘤体积，减少或预防转移，防止良性肿瘤转化为恶性肿瘤，和/或预防或抑制肿瘤的复发。施用可以是局部或全身的。合适的施用方法是临床医生已知的。
在一些实施方式中，本文提供的方法的优点是CD8+CD39+CD103+ T细胞与检查点抑制剂(如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或CTLA-4拮抗剂或4-1BB激动剂)的组合可减少用于癌症治疗的活性剂的剂量，同时还可减少治疗的任何相应的不期望的副作用(例如细胞毒性)。在另外的实施方式中，本文提供的方法的另一个优点是CD8+CD39+CD103+ T细胞与检查点抑制剂(例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或CTLA-4拮抗剂或与4-1BB激动剂)的组合用于治疗肿瘤，例如减少肿瘤体积，减少或预防转移，防止良性肿瘤转变为恶性肿瘤，和/或预防或抑制肿瘤复发。在另外的实施方式中，CD8+CD39+CD103+ T细胞与检查点抑制剂(例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂、LAG3拮抗剂和/或CTLA-4拮抗剂或4-1BB激动剂)的组合可提高生存率。
还可以将其他试剂施用给目标受试者，例如但不限于癌症治疗剂。还可以对受试者进行其他治疗，例如但不限于肿瘤的手术切除。
可以选择受试者进行治疗。例如，可以对肿瘤(或肿瘤上的样品)进行诊断测定(例如免疫组化(IHC)测定)，以将受试者鉴定为可能响应于所公开的治疗方法的受试者。下面公开了选择方法。
在进一步的实施方式中，如果通过IHC测定法测试肿瘤的PD-L1或PD-L2表达为阳性，则选择该受试者进行治疗。在以下文献中提供了用于检测测试为PD-L1表达阳性的肿瘤的示例性测定法：Topalian et al.2012.Safety,activity,and immune correlates ofanti-PD-1antibody in cancer.N.Engl.J.Med.366:2443–2454；Wolchok etal.2013.Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.N.Engl.J.Med.369:122–133；Herbst et al.2014.Predictive correlates of response to the anti-PD-L1antibody MPDL3280A in cancer patients.Nature.515:563–567；Garon etal.2015.Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lungcancer.N.Engl.J.Med.372:2018–2028；and Reck et al.Pembrolizumab versuschemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer.N.Engl.J.Med.375:1823–1833，在此通过引用将其各自内容并入本文。
肿瘤可以是良性或恶性的。肿瘤可以是任何目标肿瘤，包括但不限于头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。肺癌可以是小细胞肺癌或非小细胞肺癌。肝癌可以是肝肿瘤。乳腺癌可以是三阴性乳腺癌。在一些实施方式中，肿瘤是头颈部肿瘤，例如鼻腔、鼻旁窦、鼻咽、口腔、口咽、喉、下咽、唾液腺和神经节旁肿瘤。另外的实例是皮肤肿瘤、脑肿瘤、子宫颈癌、睾丸癌、胃肠道肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、妇科系统肿瘤、内分泌系统肿瘤、软组织和骨肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、肿瘤中枢神经系统或白血病。在其他实施方式中，肿瘤是肺癌，例如非小细胞肺癌或小细胞肺癌。在进一步的实施方式中，肿瘤可以是胃肠道肿瘤，例如食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆道癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌和肛门癌。在其他实施方式中，肿瘤可以是泌尿生殖系统的肿瘤，例如肾癌、尿道癌、膀胱癌、前列腺癌、尿道癌、阴茎癌和睾丸癌。在一些实施方式中，肿瘤是妇科肿瘤，例如子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、子宫体癌、妊娠滋养细胞疾病、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌或乳腺癌。在其他实施方式中，肿瘤是内分泌系统肿瘤，例如甲状腺肿瘤、甲状旁腺肿瘤、肾上腺皮质肿瘤、胰腺内分泌肿瘤、类癌和类癌综合征。肿瘤可以是软组织和骨骼的肉瘤、间皮瘤、皮肤癌、黑素瘤(包括皮肤黑素瘤和眼内黑素瘤)、中枢神经系统肿瘤、儿童期癌症，包括视网膜母细胞瘤、威尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)、神经纤维瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤家族、横纹肌肉瘤。肿瘤可以是淋巴瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤和霍奇金病。肿瘤可以是白血病，例如急性白血病、慢性粒细胞性白血病和淋巴细胞性白血病。肿瘤可以是浆细胞肿瘤、原发部位未知的癌症、腹膜癌、卡波西氏肉瘤、艾滋病相关的淋巴瘤、艾滋病相关的原发中枢神经系统淋巴瘤、艾滋病相关的霍奇金氏病和艾滋病相关的肛门生殖器癌、肝转移癌、骨转移癌、恶性胸膜和心包积液以及恶性腹水。
在一些实施方式中，肿瘤的治疗在诊断出肿瘤之后或在前体病症(例如发育异常或良性肿瘤发展)开始之后开始。可以在癌症的早期阶段开始治疗，例如，可以在受试者表现出病症的症状之前开始治疗，例如在I期诊断期间或诊断为发育异常或诊断为原位增生性疾病时。但是，可以在疾病的任何阶段开始治疗，例如但不限于I、II、III、和IV期癌症。在一些实例中，对患有能转化为恶性或者甚至转移性肿瘤的良性肿瘤的这些受试者施用治疗。
在病症发展之前的治疗，例如在检测到发育异常或早期(良性)前体病症时的治疗，在本文中被称为对处于患该病症的“风险中”的受试者的治疗。在一些实施方式中，可以在本文所述的病症发生期间或之后进行组合物的施用。可以将组合物施用于有发生肿瘤风险的受试者。
肿瘤的存在可以通过本领域已知的方法来确定，并且通常包括细胞学和形态学评估。肿瘤可以是已确立的肿瘤。细胞可以是体内或离体的，包括从活检获得的细胞。
在诸如恶性癌症的病症发展之后开始的治疗可导致降低所述病症之一的症状的严重性，或完全消除症状，或减少转移、肿瘤体积或肿瘤数目。在一些实例中，在治疗后无法检测到肿瘤。
在本公开的一个方面，延迟、防止或减少肿瘤的形成(诸如转移)。在另一个方面，原发肿瘤的大小减小。在另一个方面，肿瘤的症状减轻。在另一个方面，肿瘤体积减小。在另一个方面，延迟或防止了肿瘤的复发，例如长达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2、22、23或24个月或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。
在一些实施方式中，可以测量免疫反应，可以测量肿瘤体积，可以测量转移性病变的数目，和/或可以测量肿瘤的症状。治疗有效剂量可以增加免疫反应，减少肿瘤体积，减少转移的数量和/或大小，和/或减少肿瘤的一种或多种症状。
尽管所公开的方法和组合物通常将用于治疗人类受试者，但是它们也可以用于治疗其他脊椎动物(例如其他灵长类动物、狗、猫、马和牛)的相似或相同的疾病。合适的施用方式最好由医生针对每个受试者分别确定。各种可药用载体及其制剂描述在标准制剂专著(standard formulation treatises)中，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences byE.W.Martin。还参见Wang,Y.J.and Hanson,M.A.,Journal of Parenteral Science andTechnology,Technical Report No.10,Supp.42:2S,1988。药物组合物的剂型将通过所选择的施用方式来确定。
CD8+CD39+CD103+ T细胞可通过任何途径局部或全身施用。例如，可以在肿瘤内、腹膜内、静脉内施用CD8+CD39+CD103+ T细胞。在一个非限制性实例中，CD8+CD39+CD103+T细胞可以静脉内施用。PD-1、PD-L1、PD-L2、BTLA、TIM-3、LAG3或CTLA-4拮抗剂(或4-1BB激动剂)也可以通过任何途径施用，包括肠胃外施用，例如静脉内施用、腹膜内、肌肉内、腹膜内、胸骨内或关节内注射或输注，或通过舌下、口服、局部、鼻内或经粘膜施用，或通过肺吸入。在一些实施方式中，将CD8+CD39+CD103+ T细胞和/或PD-1、PD-L1、PD-L2、BTLA、TIM-3、LAG3或CTLA-4拮抗剂施用至肿瘤所在的组织中，或直接施用至肿瘤中(瘤内)。当提供肠胃外组合物时，例如用于注射或输注，通常将活性剂悬浮在水性载体中，例如在pH为约3.0至约8.0，优选在pH为约3.5至约7.4、3.5至6.0或3.5至5.0的等渗缓冲溶液中。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液和磷酸钠-磷酸缓冲液，以及乙酸钠-乙酸缓冲剂。可以使用储库(repository)或“贮库(depot)”缓释制剂的形式，以便在透皮注射或递送后的许多小时或许多天内将治疗有效量的制剂递送到血液中。
在某些实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天、每周2或3次、每周、每2周、每3周，每月等)，PD-1、PD-L1、PD-L2、BTLA、TIM-3、LAG3或CTLA-4拮抗剂(例如，但不限于抗体或抗原结合片段)或4-1BB激动剂可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在其他药剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学药剂浓度以提供治疗益处。
在一些实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天，每周2或3次，每周，每2周，每3周，每月等)，PD-1或PD-L1拮抗剂(例如特异性结合PD-1或PD-L1的抗体或抗原结合片段)可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或者根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在PD-1或PD-L1拮抗剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学浓度的药剂以提供治疗益处。在某些实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天，每周2或3次，每周，每2周，每3周，每月等)，CTLA-4拮抗剂(例如特异性结合CTLA-4的抗体或抗原结合片段)可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在CTLA-4拮抗剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学浓度的药剂以提供治疗益处。在进一步的实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天，每周2或3次，每周，每2周，每3周，每月等)，BTLA拮抗剂(例如特异性结合BTLA的抗体或抗原结合片段)可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在BTLA拮抗剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学浓度的药剂以提供治疗益处。在另外的实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天，每周2或3次，每周，每2周，每3周，每月等)，LAG3或TIM-3拮抗剂(例如特异性结合LAG3或TIM-3的抗体或抗原结合片段)可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在LAG3或TIM-3拮抗剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学浓度的药剂以提供治疗益处。在其他实施方式中，根据施用的给药方案(包括但不限于每天，每周2或3次，每周，每2周，每3周，每月等)，4-1BB激动剂(例如特异性结合4-1BB的抗体或抗原结合片段)可以以如下范围内的剂量施用：约0.01-10mg/kg、0.01-5mg/kg、0.01-1mg/kg、0.01-0.1mg/kg、1-10mg/kg、1-5mg/kg、1-3mg/kg、0.5-1.0mg/kg、0.05-0.5mg/kg，或根据治疗医师认为合适的其他剂量和给药方案施用。作为联合疗法的一部分，可在4-1BB激动剂之前、之后或同时将CD8+CD39+CD103+ T细胞施用给受试者，只要施用方案提供足够的生理学浓度的药剂以提供治疗益处。
可以使用缓释组合物。缓释组合物的合适实例包括合适的聚合物材料(例如呈成形制品形式(例如薄膜或微胶囊)的半渗透聚合物基质)，合适的疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂，以及难溶衍生物(例如难溶盐)。缓释制剂可以口服、经直肠、肠胃外、池内(intracistemally)、阴道内、腹膜内、局部(如粉末剂、软膏、凝胶、滴剂或透皮贴剂)、经颊或口服或经鼻喷雾剂施用，具体取决于肿瘤位置。
在公开的方法中有用的可药用载体和赋形剂是常规的。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，所述可注射流体为可药用和生理学可接受的流体媒介物，诸如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。可包含的赋形剂是，例如，蛋白质，例如人血清白蛋白或血浆制品。如果需要，待施用的药物组合物还可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。制备这种剂型的实际方法是本领域技术人员已知的或显而易见的。
还提供了试剂盒。可将CD8+CD39+CD103+ T细胞和/或PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM-3、BTLA或CTLA-4拮抗剂配制为适合于单独施用精确剂量的单位剂型。所施用的活性化合物的量将取决于所治疗的受试者、患病的严重程度和施用方式，并且最好由处方医生决定。在这些范围内，待施用的制剂将包含一定量的一种或多种活性成分，以在所治疗的受试者中有效实现期望效果的量。设想了多种治疗，例如在规定的时间间隔内，例如每天，每半周(biweekly)，每周，每半月(bimonthly)或每月，以实现慢性施用。
可以施用其他试剂，例如细胞因子、趋化因子或化学治疗剂。这些可被包含在所公开的药物组合物中。可以施用细胞因子(例如白介素-2(IL-2))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或干扰素，例如干扰素(IFN)β。在一个实例中，为预防和治疗癌症，可以对受试者进行手术治疗。在一个实例中，施用是顺序的。在其他实例中，施用是同时的。
化疗剂的实例是烷基化剂、抗代谢物、天然产物或激素及其拮抗剂。烷基化剂的实例包括氮芥(例如双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、尿嘧啶芥或苯丁酸氮芥)、烷基磺酸盐(例如白消安)、亚硝基脲(例如卡马汀、洛莫司汀、苏木汀、链脲菌素或达卡巴嗪)。抗代谢物的实例包括叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘧啶类似物(例如5-FU或阿糖胞苷)和嘌呤类似物(例如巯基嘌呤或硫鸟嘌呤)。天然产物的实例包括长春花碱生物碱(如长春碱、长春新碱或长春地辛)、表鬼臼毒素(如依托泊苷或替尼泊苷)、抗生素(如放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普霉素或丝裂霉素C)和酶(例如L-天冬酰胺酶)。其它药剂的实例包括铂配位络合物(例如顺式二胺-二氯铂II，也称顺铂)、取代尿素(例如羟基脲)、甲基肼衍生物(例如卡巴嗪)和肾上腺皮质激素抑制剂(例如米托坦和氨基谷氨酰胺)。激素和拮抗剂的实例包括肾上腺皮质类固醇(如泼尼松)、孕激素(如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和乙酸孕甾酮)、雌激素(如己烯雌酚(diethylstilbestrol)和炔雌醇(ethinylestradiol))、抗雌激素(如他莫昔芬)和雄激素(诸如丙酸睾丸酮和氟甲睾酮)。最常用的化疗药物的实例包括阿霉素、Alkeran、Ara-C、BiCNU、Busulfan、CCNU、Carboplatinum、Cisplatinum、Cytoxan、Daunorubicin、DTIC、5-FU、氟达拉滨、Hydrea、伊达比星、异环磷酰胺(Ifosfamide)、甲氨蝶呤、米曲霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥末、紫杉醇(或其他紫杉烷类化合物，如多西紫杉醇)、Velban、长春新碱、VP-16)，而其他一些较新的药物包括吉西他滨(Gemzar)、赫赛汀、伊立替康(Camptosar、CPT-11)、Leustatin、NaVelbine、Rituxan STI-571、Taxotere、Topotecan(Hycamtin)、希罗达(卡培他滨)、ZeVelin和骨化三醇。可以使用的免疫调节剂的非限制性实例包括AS-101(Wyeth-Ayerst Labs.)、溴嘧啶(Upjohn)、γ干扰素(Genentech)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；Genetics Institute)、IL-2(Cetus or Hoffman-LaRoch)、人免疫球蛋白(Cutter Biological)、IMREG(来自Imreg ofNew Orleans,La.)、SK&F 106528和TNF(肿瘤坏死因子；Genentech)。在一些实施方式中、向受试者施用索拉非尼。
另外的化学治疗剂可以是抗体。抗体可以冻干形式提供，并在施用前用无菌水再水化，尽管它们也以已知浓度的无菌溶液提供。然后将抗体溶液添加到装有0.9％氯化钠的输液袋(USP)中，并且通常以0.5至15mg/kg体重的剂量施用。自1997年
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获批以来，抗体药物的施用在本领域中已有相当丰富的经验。抗体可以特异性结合程序性死亡(PD)-1或程序性死亡配体(PD-L1)(见下文)。抗体可以通过缓慢输注来施用，而不是通过静脉推注或推注施用。在一个实例中，施用较高的加载剂量，随后以较低的水平施用维持剂量。例如，可以在大约90分钟的时间内注入4mg/kg的初始加载剂量，如果之前的剂量耐受良好，则可以在4-8周内每周进行在30分钟内注入2mg/kg的维持剂量。
治疗方案还包括与以下的组合：手术、化疗、辐照或其他免疫消除剂，例如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐照。肽疫苗，例如在Izumoto et al.2008JNeurosurg108:963-971中所述的那些。示例性的化学治疗剂包括蒽环类(例如阿霉素(例如脂质体阿霉素))。长春花生物碱(例如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)、烷基化剂(例如环磷酰胺、去卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、免疫细胞抗体(例如阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、托西单抗)、抗代谢物(包括，例如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))、mTOR抑制剂、TNFR糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)激动剂、蛋白酶体抑制剂，例如阿克拉霉素A、葡毒素或硼替佐米)、免疫调节剂(如沙利度胺或沙利度胺衍生物(例如来那度胺)。
被认为可用于组合疗法的一般化疗剂包括阿那曲唑
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比卡鲁胺
Figure BDA0002308681980000202
硫酸博来霉素
Figure BDA0002308681980000203
白消安白消安注射液卡培他滨
Figure BDA0002308681980000206
N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0002308681980000207
卡莫司汀
Figure BDA0002308681980000208
苯丁酸氮芥顺铂
Figure BDA00023086819800002010
克拉屈滨
Figure BDA00023086819800002011
环磷酰胺阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷
Figure BDA00023086819800002013
阿糖胞苷脂质体注射剂
Figure BDA00023086819800002014
达卡巴嗪
Figure BDA00023086819800002015
放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00023086819800002016
柔红霉素柠檬酸脂质体注射剂地塞米松、、多西紫杉醇
Figure BDA00023086819800002018
多柔比星盐酸盐
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依托泊苷
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磷酸氟达拉滨
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5-氟尿嘧啶
Figure BDA00023086819800002022
氟他胺
Figure BDA00023086819800002023
替扎西他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲(HYDREA(R))、依达比星
Figure BDA00023086819800002024
异环磷酰胺
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伊立替康
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L-天冬酰胺酶
Figure BDA00023086819800002027
亚叶酸钙、美法仑
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6-巯基嘌呤
Figure BDA00023086819800002029
甲氨蝶呤
Figure BDA00023086819800002030
米托蒽醌
Figure BDA00023086819800002031
麦罗塔、紫杉醇phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁、带有卡莫司汀植入物的聚苯并生20
Figure BDA00023086819800002033
柠檬酸他莫昔芬
Figure BDA00023086819800002034
替尼泊苷
Figure BDA00023086819800002035
6-硫鸟嘌呤、硫替太巴、替拉帕明
Figure BDA00023086819800002036
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00023086819800002037
长春碱(Vinblastine))、长春新碱
Figure BDA00023086819800002038
和长春瑞滨
Figure BDA00023086819800002039
示例性的烷基化剂包括但不限于氮芥、亚乙基亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯)：尿嘧啶芥
Figure BDA00023086819800002041
URACIL NITROGEN
Figure BDA0002308681980000211
Figure BDA0002308681980000212
氮芥(chlormethine)
Figure BDA0002308681980000213
环磷酰胺
Figure BDA0002308681980000214
REVIMMUNETM)、异环磷酰胺
Figure BDA0002308681980000216
美法仑(ALKERAN))、苯丁酸氮芥
Figure BDA0002308681980000217
pibrobroman
Figure BDA0002308681980000218
三胺嗪(triethylenemelamine)
Figure BDA0002308681980000219
Figure BDA00023086819800002110
三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺
Figure BDA00023086819800002111
硫代特帕(Thiotepa)
Figure BDA00023086819800002112
白消安卡莫司汀洛莫司汀链佐星
Figure BDA00023086819800002116
和达卡巴嗪(DTIC-
Figure BDA00023086819800002117
另外的示例性烷基化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA00023086819800002118
替莫唑胺(
Figure BDA00023086819800002119
和
Figure BDA00023086819800002120
)；放线菌素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA00023086819800002121
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA00023086819800002122
)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、
Figure BDA00023086819800002123
)；卡莫斯汀
Figure BDA00023086819800002124
苯达莫司汀
Figure BDA00023086819800002125
白消安(
Figure BDA00023086819800002126
和
Figure BDA00023086819800002127
)；卡铂
Figure BDA00023086819800002128
洛莫斯汀(也称为CCNU，
Figure BDA00023086819800002129
)；顺铂(也称为CDDP、和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(
Figure BDA00023086819800002133
和
Figure BDA00023086819800002134
)；达卡巴嗪(也称为DTIC，DIC和咪唑甲酰胺，
Figure BDA00023086819800002135
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00023086819800002136
)；异环磷酰胺泼尼丁星；丙咔嗪
Figure BDA00023086819800002138
双氯乙基甲胺(也称为氮芥，莫司汀(mustine)和双氯乙基甲胺盐酸盐，
Figure BDA00023086819800002139
)；链霉素硫代特帕(也称为硫代磷酰胺，TESPA和TSPA，
Figure BDA00023086819800002141
)；环磷酰胺
Figure BDA00023086819800002142
和盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00023086819800002143
mTOR抑制剂的实例包括，例如西罗莫司；ridaforolimus(以前称为deferolimus，(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并在PCT公开号WO03/064383中进行了描述)；依维莫司(
Figure BDA00023086819800002144
或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，
Figure BDA00023086819800002145
)；simapimod(CAS164301-51-3)；emsirolimus，(5-{2,4-二[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-(基)甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰-L-α-天冬氨酰-L-丝氨酸-，内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)和XL765。示例性的免疫调节剂包括例如阿托珠单抗(Afutuzumab)(可得自)；培非格司亭(pegfilgrastim)
Figure BDA00023086819800002147
来那度胺(lenalidomide)(CC-5013，
Figure BDA00023086819800002148
)；沙利度胺(thalidomide)
Figure BDA00023086819800002149
actimid(CC4047)；和IRX-2(包括白介素1、白介素2和干扰素γ的人细胞因子的混合物，CAS951209-71-5，可从IRX Therapeutics获得)。示例性蒽环类药物包括例如阿霉素(和)；博来霉素
Figure BDA00023086819800002152
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸柔比霉素(rubidomycin hydrochloride)，)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure BDA00023086819800002154
)；米托蒽醌(DHAD，
Figure BDA00023086819800002155
)；表柔比星(ELLENCETM)；伊达比星(
Figure BDA00023086819800002156
IDAMYCIN
Figure BDA00023086819800002157
)；丝裂霉素C
Figure BDA00023086819800002158
格尔德霉素；除莠霉素(herbimycin)；雷维霉素(ravidomycin)；和去乙酰雷维霉素(desacetylravidomycin)。长春花生物碱的实例包括，例如酒石酸长春瑞滨
Figure BDA00023086819800002159
长春新碱
Figure BDA00023086819800002160
和长春地辛
Figure BDA00023086819800002161
)；长春碱(又称硫酸长春碱，长春花碱和VLB，
Figure BDA00023086819800002162
和
Figure BDA00023086819800002163
)；和长春瑞滨
Figure BDA00023086819800002164
示例性的蛋白体抑制剂包括硼替佐米
Figure BDA00023086819800002165
卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基])-1-氧戊烷-2-基)氨基)-1-氧-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；马里佐米(NPI-0052)；柠檬酸依沙米布(MLN-9708)；地兰佐米(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。示例性的GITR激动剂包括例如GITR融合蛋白和抗GITR抗体(例如二价抗GITR抗体)，例如在以下文献中描述的GITR融合蛋白：美国专利号6,111,090，欧洲专利号090505B1，美国专利号8,586,023，PCT公开号WO 2010/003118和2011/090754，或者例如在以下文献中描述的抗-GITR抗体：美国专利号7,025,962，欧洲专利号1947183B1，美国专利号7,812,135，美国专利号8,388,967，美国专利号8,591,886，欧洲专利号EP 1866339，PCT公开号WO 2011/028683，PCT公开号WO 2013/039954，PCT公开号WO2005/007190，PCT公开号WO 2007/133822，PCT公开号WO2005/055808，PCT公开号WO1999/40196，PCT公开号WO 2001/03720，PCT公开号WO 1999/20758，PCT公开号WO2006/083289，PCT公开号WO 2005/115451，美国专利号7,618,632和PCT公开号WO 2011/051726。
扩增CD39+CD103+CD8+ T细胞的方法
CD8+CD39+CD103+ T细胞可以在体外扩增。在一些实施方式中，可以将从受试者分离的CD8+CD39+CD103+ T细胞在包含谷氨酰胺、血清和抗生素的组织培养基中培养以形成原代培养物。通常将细胞接种在合适的培养容器中。用于培养细胞的培养容器可以包括但不特别限于：烧瓶、组织培养烧瓶、培养皿、有盖培养皿、组织培养皿、多皿、微板、微孔板、多板、多孔板、显微镜玻片(micro slide)、小室玻片、试管、托盘、
Figure BDA0002308681980000221
腔室、培养袋和滚瓶，只要能够在其中培养T细胞即可。取决于培养的需要，可以以至少或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml或其中可衍生的任何范围内的体积来培养细胞。在一些实施方式中，培养容器可以是组织培养板，例如6孔、24孔或96孔板。在其他实施方式中，培养容器可以是生物反应器，所述生物反应器可指任何支持生物活性环境以使细胞能够繁殖的离体装置或系统。生物反应器可以以具有至少或大约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升、1、2、4、6、8、10、15立方米或其中可衍生的任何范围内的体积，可与支持细胞群生长所必需的营养物一起培养。
通常，将细胞在包括碳源、氮源和维持pH的缓冲液的生长培养基中培养。培养基还可以包含脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。一种示例性的生长培养基包含最小必需培养基，例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium,DMEM)或ESSENTIAL 8TM(E8TM)培养基，其补充了各种营养物(例如非必需氨基酸和维生素)以增强T细胞生长。最小必需培养基的实例包括但不限于，最小必需培养基伊格尔(Minimal Essential MediumEagle,MEM)α培养基，达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)，洛斯维公园纪念研究所(RoswellPark Memorial Institute,RPMI)-1640培养基、199培养基和F12培养基。任选地，可以将抗生素添加到培养基中，例如但不限于青霉素、链霉素或四环素。谷氨酰胺也可以添加到组织培养基中。诸如抗生素和氨基酸之类的添加剂是本领域已知的。
此外，最小必需培养基可以补充其他添加剂，例如人、胎牛或牛血清。例如可包含如下浓度的血清：10-15％(体积/体积)，例如约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、11％、约12％、约13％、约14％或约15％的血清。血清可以是胎牛血清。在其他实施方式中，血清是人血清，例如人AB血清。
或者，培养基可以是无血清的。在其他情况下，生长培养基可能包含血清替代物。示例性的血清替代物是本领域已知的。例如，在例如美国专利申请号2002/0076747中公开了KNOCKOUTTM血清替代品，其通过引用并入本文。血清的替代品可以包括这样的材料，其适当地包含白蛋白的物质(例如富含脂质的白蛋白、白蛋白代替物(例如重组白蛋白)、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、痕量元素、2-巯基乙醇、3'-巯基甘油或类似物。血清的替代品可以通过例如国际公开号WO 98/30679中公开的方法制备。
培养物可以是“不含异种(XF)”的，这是指基本上不含来源于异种动物的成分的培养基或培养条件。为了培养人细胞，非人动物(例如小鼠)的任何蛋白质都是异种成分。因此，在一些实施方式中，所公开的条件是无异种的。因此，为了培养人细胞，包含人AB血清的培养物可以是“不含异种”的。
可以适当地定义其他培养条件。例如，培养温度可以为约30至40℃，例如至少或约31、32、33、34、35、36、37、38、39℃，但并非具体限制于此。在一个实施方式中，细胞在37℃培养。CO2浓度可以为约1至10％，例如约2％至5％，或其中可衍生的任何范围。在一个非限制性实例中，使用约5％的CO2浓度。
用有效量的同种异体的经辐射的饲养细胞和细胞因子(如白介素(IL)-15或IL-2)刺激原代培养物，形成刺激的T细胞。饲养细胞可以是例如同种异体的经辐射的外周血单核细胞。可以例如用4000rad的γ辐射来辐射饲养细胞，包括人饲养细胞。
在一些实施方式中，还用多克隆T细胞刺激物(如植物血凝素)刺激细胞。在一些非限制性实例中，使用1μg/ml至2μg/ml浓度。在进一步的实施方式中，同时利用细胞因子(如IL-15和/或IL-2)和PHA。
在一些实施方式中，使用这样的比例，使得约1,000至约2,000CD8+CD39+CD103+ T细胞被约100,000至约300,000同种异体饲养细胞(例如经辐射的同种PBMC)刺激。在其他实施方式中，使用这样的比率，使得约1,000至约2,000CD8+CD39+CD103+ T细胞被约200,000同种异体饲养细胞刺激。
培养物中可包含细胞因子，例如IL-2或IL-15。在一些实施方式中，可使用约5ng/ml至约15ng/ml浓度的IL-15。在一些实施方式中，在培养物中可包含约7ng/ml至约12ng/ml浓度的IL-15，例如约7、约8、约9、约10、约11或约12ng/ml的浓度。在一个非限制性实例中，包含约10ng/ml浓度的IL-15。
然后在整个体外扩增过程中，用新鲜的组织培养基和细胞因子(例如IL-15和/或IL-2)补充经刺激的CD39+CD103+CD8+ T细胞培养物。在该组织培养基中可包含约5ng/ml至约50ng/ml的IL-15，例如约10ng/ml至约50ng/ml浓度的IL-15。在一些实施方式中，在培养物中包含约7ng/ml至约12ng/ml浓度的IL-15，例如约7、约8、约9、约10、约11或约12ng/ml浓度的IL-15。在一个非限制性实例中，包含约10ng/ml浓度的IL-15。在其他实例中，包含约20、约30、约40或约50ng/ml浓度的IL-15。
细胞培养可以维持任何时间。在一些实施方式中，在培养15至30天后，收获扩增的CD39+CD103+CD8+ T细胞。
分离和使用编码T细胞受体的核酸的方法
提供了分离编码特异性结合肿瘤细胞抗原的T细胞受体(TCR)的核酸的方法。这些方法包括从受试者的样品中分离CD39+CD8+ T细胞，例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞，所述受试者患有表达肿瘤细胞抗原的肿瘤。在一些实施方式中，肿瘤是实体瘤，例如头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。受试者可以是人受试者或兽医学受试者。样品可以是来自受试者的任何样品，包括但不限于外周血样品或肿瘤活检。上文公开了分离CD8+CD39+ T细胞(例如CD39+CD103+ CD8 T细胞)的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括扩增CD8+CD39+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8T细胞)。上文还公开了体外扩增CD8+CD39+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的方法。在其他实施方式中，利用了原代CD8+CD39+ T细胞，例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞，其中所述细胞不在体外扩增。
所述方法进一步包括从CD8+CD39+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)克隆编码TCR的核酸分子。克隆TCR的方法是本领域已知的，参见例如美国专利号8,697,854，其通过引用并入本文。TCR是免疫球蛋白超家族的成员，通常由α-亚单元和β-亚单元组成。它们具有一个N末端免疫球蛋白(Ig)可变(V)结构域、一个Ig恒定(C)结构域、跨膜/跨细胞膜区和C末端的短胞质尾区。TCRα链和β链的可变结构域均具有三个高变或互补决定区(CDR)，而β链的可变区具有一个额外的高变区(HV4)，该区域通常不与抗原接触，因此不被视为CDR。
CDR3是识别加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N端部分相互作用。β链的CDR1也与肽的C端部分相互作用。CDR2被认为可以识别MHC。不认为β链的CDR4参与抗原识别，但已证明其与超抗原相互作用。TCR结构域的恒定结构域由短连接序列组成，其中半胱氨酸残基形成二硫键，所述二硫键形成两条链之间的连接。TCR对特定抗原的亲和力使其可用于治疗。例如，通过用表达特定TCR的T细胞的过继免疫疗法可以有效地治疗肿瘤。克隆TCR的方法和使用以TCR转染的细胞的过继免疫疗法的使用方法公开于PCT公开号WO 2006/031221、美国专利号5,906,936、PCT公开号WO97/32603；PCT公开号WO2007/065957和PCT公开号WO2008/039818。产生编码TCR的核酸分子的方法和包含此类受体的T细胞(或NK细胞)公开于，例如Brentjens et al.,2010,Molecular Therapy,18:4,666-668；Morgan et al.,2010,Molecular Therapy,published online February 23,2010,pages1-9；Till et al.,2008,Blood,1 12:2261-2271；Park et al.,TrendsBiotechnol.,29:550-557,2011；Grupp et al.,N Engl J Med.,368:1509-1518,2013；Hanet al.,J.Hematol Oncol.,6:47,2013；PCT公开WO2012/079000、WO2013/126726；和美国公开2012/0213783，其各自通过引用将其全部内容并入本文。
在一些实施方式中，单细胞RNA序列用于T细胞受体或成对序列(pair-seq)(适应的(Adaptive))。在一个非限制性实例中，使用fluidigm或10x基因组学仪器将纯化的T细胞分离成单细胞。然后扩增T细胞DNA并测序。T细胞无需诱发或具有为此过程而呈递的抗原。
适当的克隆和测序技术的其他实例，以及足以指导技术人员进行许多克隆练习的说明是已知的(例如，参见Sambrook et al.(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed,Cold Spring Harbor,New York,2012)和Ausubel et al.(In Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,through supplement 104,2013)。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供了有用的信息。这样的制造商包括：theSIGMA Chemical Company(Saint Louis,MO),R&D Systems(Minneapolis,MN),PharmaciaAmersham(Piscataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Chem GenesCorp.,Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),Glen Research,Inc.,GIBCO BRLLife Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen(Carlsbad,CA)和AppliedBiosystems(Foster City,CA)，以及技术人员已知的许多其他商业来源。
可以通过任何合适的方法来制备编码TCR的核酸序列。一旦整个序列被克隆并已知，也可以通过例如以下的方法直接化学合成：Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979所述的磷酸三酯法；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979所述的磷酸二酯法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981所述的二乙基亚磷酰胺法；如Beaucage&Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981所述的固相亚磷酰胺三酯法，例如，使用例如在Needham-VanDevanter et al.,Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984中所述的自动合成仪；和美国专利号4,458,066的固相载体法。化学合成产生单链寡核苷酸。通过与互补序列杂交或通过与使用单链作为模板的DNA聚合酶聚合，可以将其转化为双链DNA。
核酸也可以通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自持序列复制系统(3SR)。多种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法是技术人员公知的。在不降低生物学活性的情况下，可以对编码本文所述多肽的核酸进行修饰。可以进行一些修饰以促进靶向分子的克隆、表达或整合到融合蛋白中。这样的修饰是本领域技术人员公知的，并且包括例如终止密码子、添加到氨基末端以提供起始位点的甲硫氨酸、位于任一末端上以产生方便定位的限制性位点的其他氨基酸或者有助于纯化步骤的其他氨基酸(例如聚组氨酸)。
编码TCR的核酸分子可以可操作地连接至异源启动子。编码TCR的核酸分子可被包含在用于在宿主细胞中表达的载体(例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体)中。示例性细胞是哺乳动物细胞，并且包括T细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和NK细胞。在特定的非限制性实例中，细胞是T细胞，例如CD3+ T细胞。CD3+ T细胞可以是CD4+或CD8+ T细胞。
核酸分子也可以在重组工程细胞(例如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞)中表达。TCR可以表达为融合蛋白。表达和纯化抗体和抗原结合片段的方法是已知的并且在本文中进一步描述(参见，例如，Al-Rubeai(ed),Antibody Expression and Production,Springer Press,2011)。本领域技术人员熟知可用于表达蛋白质的众多表达系统，包括大肠杆菌、其他细菌宿主、酵母和各种高级真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。术语“宿主细胞”还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。稳定转移的方法是指外源DNA连续保持在宿主中，这是本领域已知的。如本文所公开的，本公开的具体实施方式包括表达TCR的T细胞，例如人T细胞和人NK细胞。这些T细胞可以是CD3+ T细胞，例如CD4+或CD8+ T细胞。
将编码TCR的核酸至启动子(组成型或诱导型)的表达，然后整合到表达盒中。启动子可以是任何目标启动子，包括巨细胞病毒启动子和人T细胞淋巴细胞营养病毒启动子(HTLV)-1。任选地，构建体中包括增强子，例如巨细胞病毒增强子。表达盒可以适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达盒包含可用于调节编码蛋白质的DNA表达的特定序列。例如，表达盒可包括合适的启动子、增强子、转录和翻译终止子、起始序列、在蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子剪接信号、用于维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的适当翻译的序列、以及终止密码子。载体可以编码选择性标记物，例如编码耐药性(例如，氨苄青霉素或四环素耐药性)的标记物。
为了获得克隆基因的高水平表达，期望构建这样的表达盒，其至少包含指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点(内部核糖体结合序列)、和转录/翻译终止子。对于真核细胞，控制序列可以包括衍生自例如免疫球蛋白基因、HTLV、SV40或巨细胞病毒的启动子和/或增强子，和聚腺苷酸化序列，并且还可以包括剪接供体和/或受体序列(例如CMV和/或HTLV剪接受体和供体序列)。
当宿主是真核生物时，可以使用这样的DNA转染方法，例如磷酸钙共沉淀，常规的机械方法(例如显微注射)，电穿孔，插入封装在脂质体中的质粒，或病毒载体。可以通过对盒中包含的基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予对抗生素的耐药性来选择由该盒转化的细胞。
真核细胞也可以用编码TCR的多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外源DNA分子(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)、慢病毒或牛乳头瘤病毒，以瞬时感染或转化真核细胞并表达该蛋白(参见，例如Viral Expression Vectors,Springer press,Muzyczka ed.,2011)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统，例如用于在细胞中产生蛋白质的质粒和载体，所述细胞包括高等真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。
在一些实施方式中，病毒载体用于表达TCR。病毒载体包括但不限于猿猴病毒40、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒载体和逆转录病毒，例如γ逆转录病毒。逆转录病毒载体为基因转移到真核细胞中提供了高效的方法。而且，逆转录病毒整合以受控方式发生，并导致每细胞稳定整合一个或几个拷贝的新遗传信息。不受理论的束缚，慢病毒载体比衍生自癌逆转录病毒(如鼠白血病病毒)的载体具有优势，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。使用慢病毒载体表达TCR是本领域已知的，并且公开于例如美国申请号2014/0050708中，其通过引用并入本文。可以使用转座子(transposon)。
在一些实施方式中，产生宿主细胞以引入到目标受试者中。宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)、纯化的T细胞或纯化的NK细胞。T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupTl等，或得自哺乳动物(例如稍后将向其施用TCR-T细胞的人患者)的T细胞。如果从哺乳动物受试者(例如人受试者)获得，则T细胞可以从许多来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或体液。T细胞也可以被富集或纯化。T细胞可以是任何类型的T细胞，并且可以处于任何发育阶段，包括但不限于CD3+细胞、CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+ T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、初始T细胞等。T细胞可以是CD3+ T细胞，例如CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。在可替代的实施方式中，细胞可以是NK细胞，例如得自随后将施用TCR-NK细胞的同一受试者的NK细胞。在一些实施方式中，细胞是人类细胞。在其他实施方式中，细胞来自兽医学受试者。
还提供了包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是异源群，其包括包含编码TCR的任何重组表达载体的宿主细胞和至少一种其他细胞(例如不含任何重组表达载体的宿主细胞(例如，T细胞)，或非T细胞的细胞，例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞等)。或者，细胞群可以是基本上同源的群，其中该群主要包括宿主细胞，所述宿主细胞包含编码TCR的重组表达载体(例如，基本上由其组成)。该群也可以是细胞的克隆群，其中该群的所有细胞是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，从而该群的所有细胞都包含重组表达载体。在本发明的一个实施方式中，细胞群是包含宿主细胞的克隆群，所述宿主细胞包含本文所述的重组表达载体。T细胞可以是CD3+ T细胞，例如CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。细胞也可以是NK细胞。
细胞可与受者自体同源。受者可患有肿瘤，或有患肿瘤的风险。受者可能已经接受了肿瘤的预先治疗。肿瘤可以是实体瘤，例如实体瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。在一些实施方式中，从受试者(例如人受试者)中分离自体T细胞或NK细胞，并将分离的TCR引入这些细胞中。然后将这些转化的细胞重新引入到受试者中。在这种情况下，供者和受者是同一受试者。受试者可以是人。在一些实施方式中，向受试者施用治疗有效量的表达克隆的TCR的T细胞和/或NK细胞。在特定实施方式中(参见美国公开申请号US20140271635A1，其通过引用并入本文)，从受试者获得T细胞来源，随后进行扩增和遗传修饰。
在一些实施方式中，T细胞和/或NK细胞是自体同源的。在其他实施方式中，T细胞和/或NK细胞是同种异体的。如上所述，然后将T细胞和/或NK细胞引入到受试者中。在一个实施方式中，细胞在转导后4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天瞬时表达载体。在一个非限制性实例中，通过电穿孔将载体转导到T细胞中。
术语“受试者”旨在包括在其中可以引起免疫反应的活生物体(例如，哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、猪(和其他兽医学受试者)和非人灵长类动物。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在其他实施方式中，可以使用本领域可获得的任何T细胞系。在一些实施方式中，受试者可以经历白细胞分离术(leukapheresis)，其中白细胞离体收集、富集或耗尽，以选择和/或分离目标细胞，例如T细胞和/或NK细胞。这些细胞分离物可以通过本领域已知的方法扩增并处理，从而引入TCR构建体，从而产生表达克隆的TCR的自体细胞。一个方面，使用病毒载体(例如但不限于慢病毒病毒载体)产生表达TCR的细胞。在一些非限制性实例中，使用本领域技术人员已知的多种技术(例如FICOLLTM分离)可以从自受试者收集的单位血液中获得T细胞和/或NK细胞，或者可以通过血液分离获得细胞。血液分离产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。
可以洗涤通过血液分离收集的细胞以除去血浆级分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，以用于后续的处理步骤。在一些非限制性实例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实例中，洗涤溶液不含钙，并且可能不含镁，或者可能不含许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在没有钙存在下的初始激活步骤会导致放大激活。洗涤步骤可以通过本领域已知的方法来完成，例如通过根据制造商的说明使用半自动化的“流过式(flow-through)”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter
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或HAEMONETICSCELL SAVER
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)。洗涤后，可以将细胞重悬于各种生物相容的缓冲液中，例如含或不含缓冲剂的盐水溶液。或者，可以去除血液分离样品中不希望的成分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在一些实施方式中，通过阴性选择从外周血淋巴细胞分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD4+、CD8+、CD28+CD45RA+和CD45RO+ T细胞、初始和/或记忆T细胞。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如
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M-450CD3/CD28 T或CD3/IL-2)一起温育足以阳性选择出所需的T细胞的时间来分离T细胞，参见例如美国公开申请号US20140271635A1。在非限制性实例中，时间段为约24小时至约72小时以及其间的所有整数值。在另外的非限制性示例中，时间段是至少24小时、36、48小时或更长。在与其他细胞类型相比T细胞很少的任何情况下，例如从免疫受损的个体中分离，可以使用更长的温育时间来分离T细胞。也可以使用多轮选择。
通过阴性选择富集T细胞群可以使用抗体组合来完成，所述抗体针对阴性选择的细胞特有的表面标记物。一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD8a、CD14、CD15、CD16、CD19、CD36、CD56、CD132、TCRγ/δ和CD235a(糖蛋白A)的抗体。为了通过阴性选择富集CD8+细胞，单克隆抗体混合物包含针对CD4、CD15、CD16、CD19、CD34、CD36、CD56、CD123、TCRγ/δ和CD235a的抗体。可以选择表达一种或多种细胞因子的T细胞群。筛选细胞表达的方法在PCT公开号WO 2013/126712中公开。
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如，颗粒如珠子)的浓度以确保细胞和珠子的最大接触。在一些实施方式中，使用1×106细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用大于100×106细胞/ml。在其他实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45、50、65、70、75、80、85、90、95或100×106细胞/ml的细胞浓度。不受理论的束缚，使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞激活和细胞扩增。也可以使用较低浓度的细胞。不受理论的束缚，显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠子)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择这样的细胞，其表达大量所需抗原从而被结合至颗粒上。在一些实施方式中，所用细胞的浓度为5×106/ml。在其他实施方式中，所使用的浓度可以为约1×105/ml至1×106/ml以及介于两者之间的任何整数值。
可以将细胞在旋转器上于2-10℃或室温下以不同速度温育不同的时间长度。用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和某种程度上的单核细胞而提供了更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的并且在本文中将是有用的，但是一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或使用培养基，所述培养基包含10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％PlasmaLyte-A、31.25％的5％葡萄糖、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或使用包含例如Hespan和PlasmaLyte A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的蒸汽相中。可以使用其他受控冷冻方法以及在-20℃或在液氮中立即进行非受控冷冻的方法，参见美国公开号US-2014-0271635A1。
可以在可能需要如本文所述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或血液分离产品。这样，可以在任何必要的时间点收集待扩增细胞的来源，并将所需的细胞(例如T细胞)分离并冷冻，以供随后用于T细胞疗法中，所述T细胞疗法用于将受益于T细胞疗法的任何疾病或病症，例如本文所述的那些。一个方面，从总体健康的受试者中采集血液样品或血液分离物。在某些方面，从具有发展为疾病(如肿瘤)的风险但尚未发展成疾病的总体健康的受试者中采集血液样品或血液分离物，并分离目标细胞并冷冻用于以后使用。在某些方面，可以将T细胞扩增、冷冻并在以后的时间使用。在某些方面，如本文所述，在诊断出特定疾病例如肿瘤之后不久但在进行任何治疗之前从患者收集样品。在另一个方面，在任何相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或血液分离物中分离细胞。在某些方面，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用前在室温下静置一小时。需要时可以从受试者收集血液样品或血液分离产品，而不冷冻。在一些实施方式中，从个体分离自体同源的携带肿瘤的T细胞，用于随后的转染和输注。
通常可以使用例如在以下文献中描述的方法来激活和扩增T细胞：美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005。T细胞可以通过与连接有试剂和配体的表面接触而扩增，所述试剂刺激CD3/TCR复合物相关信号，所述配体刺激T细胞表面上的共刺激分子。也可以使用PHA扩增T细胞，或者可以用CD3/28或CD3/IL2转染大量PBMC。在一些非限制性实例中，可如本文所述刺激T细胞群，例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓虫素(bryostatin))接触。为了共同刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besancon,France)，并且可以使用本领域中其他通常已知的方法(Berg et al.,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen etal.,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland et al.,J.Immunol.Meth.227(1-2):53-63,1999)。其他方法包括将同种异体的经辐射的PBMC与植物血凝素一起使用，以刺激T细胞增殖。
分离TCR后，可以使用各种测定法评估分子的活性，例如但不限于抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有重新刺激的情况下维持T细胞扩增，以及在适当的体外和动物模型中的抗癌活性。在一些实施方式中，例如通过流式细胞术来评估激活标记物(例如但不限于1-1BB)的上调。
所述方法包括向受试者施用治疗有效量的表达克隆的TCR的药物组合物细胞，例如T细胞和/或NK细胞。有需要的受试者，例如患有肿瘤的受试者，随后可以接受化疗或外科手术(用于癌症)或抗病毒剂(用于HIV感染)的标准治疗。施用表达异源TCR的宿主细胞可导致治疗肿瘤，例如减少肿瘤体积、减少转移或减少肿瘤的体征或症状。
药物组合物可包含表达TCR的宿主细胞(例如本文所述的多种表达TCR的宿主细胞)与一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合。表达TCR的宿主细胞可以是T细胞，例如CD3+ T细胞，例如CD4+和/或CD8+ T细胞，和/或NK细胞。这样的组合物可以包括缓冲液，例如中性缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。
关于细胞，可以使用多种水性载体(例如缓冲盐水等)来引入细胞。这些溶液是无菌的，并且通常不含不想要的物质。这些组合物可以通过常规的公知灭菌技术灭菌。所述组合物可包含近似生理条件所需的可药用辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的浓度可以在很大范围内变化，并且将主要根据所选择的特定施用方式和受试者的需要，根据液体体积、粘度、体重等选择。
在一个实施方式中，药物组合物基本上不含例如可检测水平的污染物，例如内毒素、支原体、可复制慢病毒(replication competent lentivirus,RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗CD8/抗CD39/抗CD103包被的珠、小鼠抗体、合并的(pooled)人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基成分、载体包装细胞或质粒成分、细菌和真菌。
可以由医师考虑年龄、体重、肿瘤大小、转移程度和患者(受试者)状况的个体差异来确定要施用的组合物的精确量。通常可以指出，包含本文所述的T细胞(和/或NK细胞)的药物组合物可以以104至109细胞/kg体重的剂量施用，例如105至106细胞/kg体重，包括这些范围内的所有整数值。示例性剂量为106细胞/kg至约1×108细胞/kg，例如约5×106细胞/kg至约7.5×107细胞/kg，例如约2.5×107细胞/kg或约5.0×107细胞/kg。
可以以这些剂量一次或多次施用组合物，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用组合物(参见，例如，Rosenberg et al.,NewEng.J.of Med.319:1676,1988)。所述组合物可以每天、每周、每半个月或每月施用。在一些非限制性实例中，将组合物配制成用于静脉内施用并且多次施用。施用的数量和频率将取决于受试者的状况、受试者疾病的类型和严重性等因素，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
在一个实施方式中，将TCR引入细胞(例如T细胞或NK细胞)中，并且受试者接受细胞的初始施用以及细胞的一次或多次后续施用，其中所述一次或多次后续施用在先前使用之后的不到15天(例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天)施用。在一个实施方式中，每周向受试者(例如，人)提供多于一次的细胞施用，例如，每周施用2、3或4次表达TCR的细胞。在一个实施方式中，受试者每周接受多于一次的T细胞施用(例如，每周2、3或4次施用)(也称为一个周期)，随后一周不施用，然后再对受试者施用表达TCR的细胞一次或多次(例如，每周多于一次的细胞施用)。在另一个实施方式中，受试者(例如人受试者)接受多于一个周期的表达TCR的细胞，并且每个周期之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方式中，每隔一天施用表达TCR的细胞一次，每周3次。在另一个实施方式中，施用表达TCR的细胞至少2、3、4、5、6、7、8或更多周。待施用于患者的上述治疗的剂量将随所治疗疾病的确切性质和治疗受者而变化。可以根据本领域公认的实践来按比例调整用于人施用的剂量。
在一些实施方式中，TCR修饰的T细胞能够在体内复制，导致长期持续性，这可以导致持续的肿瘤控制。在多个方面，在将T细胞施用给受试者之后，施用给受试者的T细胞或这些细胞的后代在受试者中持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月或数年。在其他实施方式中，在将T细胞施用给受试者之后，细胞及其后代存在少于六个月、五个月、四个月、三个月、两个月或一个月，例如三周、两周、一周。
主题组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过注射、输液、植入或移植。所公开的组合物可以通过经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、静脉内(i.v.)注射或腹膜内给患者施用。在一些实施方式中、通过皮内或皮下注射将组合物施用于患者。在其他实施方式中，通过静脉内注射施用本发明的组合物。也可以将组合物直接注射到肿瘤或淋巴结中。
在一个实施方式中，包含分离的细胞群的组合物还可包含一种或多种其他药物，例如一种或多种抗微生物剂(例如，抗生素、抗病毒剂和抗真菌剂)、抗肿瘤剂(例如氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、紫杉醇、氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱)、消耗剂(例如氟达拉滨、依托泊苷、阿霉素或长春新碱)或非甾体抗炎剂(如乙酰水杨酸、布洛芬或萘普生钠)、细胞因子(例如白介素2)或疫苗。目前许多化学治疗剂是本领域已知的。在一个实施方式中，化学治疗剂选自由有丝分裂抑制剂、烷基化剂、抗代谢物、嵌入抗生素(intercalatingantibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物反应修饰剂、抗-激素(例如抗雄激素)和抗血管生成剂组成的组。
对于恶性肿瘤的治疗，所述方法还可以包括向受试者施用治疗有效量的其他癌症治疗剂(包括化学治疗剂和放疗)或手术。
表达TCR的细胞可以与外科手术、放疗、化疗或免疫疗法联合施用。上文公开了合适的化学治疗剂。表达TCR的细胞也可以与PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、BTLA拮抗剂和/或4-1BB激动剂一起施用，如下文详细公开的。
检测和治疗方法
本文公开了CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的施用可用于诊断和治疗。在这些实施方式中，测量来自受试者的生物样品中的CD39+CD8+ T细胞，例如CD39+CD103+ CD8 T细胞。在一些实施方式中，样品是外周血样品或肿瘤活检。受试者可以是任何受试者，例如人或兽医学受试者。在进一步的实施方式中，所述受试者患有肿瘤、被怀疑患有肿瘤或处于罹患肿瘤的风险中。肿瘤可以是实体瘤。在一些非限制性实例中，实体瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。
在一些实施方式中，公开了确定患有肿瘤的受试者是否响应于癌症治疗剂的方法，所述癌症治疗剂包括但不限于生物反应调节剂(例如细胞因子和趋化因子)、癌症疫苗、化学治疗剂、免疫治疗剂和辐射。在一些实施方式中，癌症治疗剂可以是检查点抑制剂、4-1BB激动剂和/或辐射。癌症治疗剂可以是化学药品。该方法还可用于检测受试者是否将响应于手术。
这些方法包括检测来自受试者的生物样品中的CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+CD103+ CD8 T细胞)的存在，其中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)在生物样品(其中)中的存在指示所述癌症治疗例如但不限于检查点抑制剂、4-1BB激动剂和/或辐射对治疗受试者的肿瘤将是有效的。所述方法还可以指示受试者将响应于外科手术例如切除术。所述方法还可以包括对受试者施用癌症治疗剂，或进行外科手术。在一些非限制性实例中，癌症治疗剂是检查点抑制剂，其可以是但不限于PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂。合适的拮抗剂在下面详细公开。合适的4-1BB激动剂也在下面公开。
在其他实施方式中，公开了确定患有肿瘤的受试者是否响应于治疗方案(例如包括癌症治疗剂)的方法。癌症治疗剂可以是化学治疗剂或辐射。癌症治疗剂可以是检查点抑制剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂，或者可以是4-1BB激动剂。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量。与对照相比，生物学样品中CD39+CD8+ T细胞(如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的量增加表明的第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤是有效的。
在进一步的实施方式中，公开了确定患有肿瘤的受试者是否将响应于癌症治疗剂的方法。癌症治疗剂可以是化学治疗剂或辐射。癌症治疗剂可以是检查点抑制剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂，或者可以是4-1BB激动剂。这些方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD39+CD8+ T细胞(如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量，其中与对照相比，生物学样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的量增加表明第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤是有效的。在另外的实施方式中，所述方法进一步包括向受试者施用第二剂量的癌症治疗剂，其中第一剂量与第二剂量相同，或者其中第二剂量低于第一剂量。
在其他实施方式中，公开了治疗患有肿瘤的受试者的方法。这些方法包括向受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，并确定来自受试者的生物样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量。与对照相比，生物学样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+CD103+ CD8 T细胞)的量减少或没有变化表明第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤是无效的。将第二剂量的癌症治疗剂施用于受试者，其中第二剂量高于第一剂量，或者其中第二剂量与第一剂量相同。
在一些实施方式中，受试者患有肿瘤，或有发展成肿瘤的风险，如上所述。这些受试者可以通过本领域技术人员(例如医师)适合的标准方法来鉴定。所公开的方法包括选择目标受试者，以及施用目标癌症治疗剂，包括但不限于检查点抑制剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂。还可以给受试者施用4-1BB激动剂。该方法可以检测将响应于外科手术的受试者。
在另外的实施方式中，向受试者施用治疗有效量的CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+CD103+ CD8 T细胞)和治疗有效量的癌症治疗剂，例如但不限于检查点抑制剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂。在另外的实施方式中，可以向受试者施用4-1BB激动剂。如本文所公开的，纯化的CD39+CD8+T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)以及检查点抑制剂或4-1BB激动剂的施用将增加受试者克服病理状况(例如肿瘤)的能力。细胞和检查点抑制剂可包含在单一药物组合物中或分开的药物组合物中。因此，通过离体纯化和产生来自受试者的CD39+CD8+ T细胞群(例如CD39+ CD103+CD8 T细胞)并引入治疗量的这些细胞，增强了受体受试者的免疫反应。施用治疗有效量的检查点抑制剂或4-1BB激动剂也增强了受者的免疫反应。因此，本文公开的用于确定化学治疗剂或辐射是否有效的方法可以与上述任何治疗方法(和在任何受试者中)组合使用。
所述方法还可用于评估对受试者治疗有效的癌症治疗剂的剂量。例如，本文公开的方法可以用于确定施用于目标受试者的剂量是否可以降低并且仍然有效。本文公开的方法还可以用于确定施用于受试者的剂量是否太低，因此必须增加剂量以具有治疗效果。
任何公开的方法可以包括测量其他细胞类型，例如B和/或T细胞。所公开的方法还可包括测量标志物例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、BTLA、TIM-3或LAG3的表达。评价CD8、CD39和/或CD103的表达。
在一些实施方式中，测量CD39+CD8+ T细胞，例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞。与对照相比，来自生物样品的CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数目增加表明癌症治疗剂的剂量可用于治疗受试者，并且其中与对照相比，不存在CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)数量的显著变化表明该癌症治疗剂的剂量不适用于治疗受试者。对照可以是先前确定的标准值，或者是来自施用癌症治疗剂之前的受试者的样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量，或者是当对受试者施用对照物质时，CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量。
通常，测量CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量包括获取包含来自受试者的T细胞的样品，并确定样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的存在或数量。在一些实例中，样品是活检样品、血液样品或外周血单核细胞样品。所述方法包括免疫组化法和/或流式细胞术。
所述方法可以包括免疫组化方法，例如在来自受试者的生物样品上。样品可以是肿瘤样品。在一些实施方式中，抗体(或抗原结合片段)，例如结合CD8、CD39或CD103的抗体，直接用可检测的标记物标记。在另一个实施方式中，结合CD8、CD39或CD103的抗体(或抗原结合片段)(第一抗体)是未标记的，并且使用了第二抗体或可以结合与第一抗体结合的抗体的其他分子。如本领域技术人员所公知的，选择能够特异性结合特定种类和类别的第一抗体的第二抗体。例如，如果第一抗体是人IgG，则第二抗体可以是抗人IgG。可以与抗体结合的其他分子包括但不限于蛋白A和蛋白G，两者均可商购。
抗体或二抗的合适标记如上所述，并且包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、磁性剂和放射性材料。合适的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶。合适的辅基复合物的非限制性实例包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。合适的荧光材料的非限制性实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白(phycoerythrin)。非限制性的示例发光材料是鲁米诺；非限制性的示例磁性剂是钆，并且非限制性的示例放射性标记包括125I、131I、35S或3H。
细胞也可以使用流式细胞术定量。在另外的实施方式中，例如，可以纯化样品以分离T细胞，例如CD8 T细胞或CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)。在一些实施方式中，所述方法包括测量CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量。在一些实例中，将生物样品中CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)的数量与对照进行比较。合适的对照已在上面指出。
在一些实例中，细胞悬液是从肿瘤样品产生的。在一个非限制性实例中，在无菌条件下，将肿瘤切成小块，并在RPMI-1640中用透明质酸酶、胶原蛋白酶、DNA酶以及人血清白蛋白进行消化。细胞可以例如在磁力搅拌棒的搅拌下于室温消化1小时。细胞悬浮液通过细胞过滤器过滤。可以通过用密度梯度溶液离心来富集肿瘤浸润淋巴细胞。
分离、检测和/或定量T细胞的方法是本领域已知的，并且本文提供了示例性方案。测量T细胞增殖的方法也是本领域已知的。这些方法通常涉及分子和/或生化技术的使用，而不是简单的视觉观察。在一些实例中，利用荧光激活细胞分析(FACS)的细胞。通过用适当标记的抗体对细胞进行染色，FACS可用于分选(分离)T细胞等细胞。在一个实施方式中，几种抗体(例如结合CD8、CD39和CD103的抗体)和FACS分选可以用于产生基本上纯化的CD39+CD8+ T细胞(例如CD39+ CD103+ CD8 T细胞)群。可以采用任何FACS技术，例如，参见美国专利号5,061,620中公开的FACS方法。
但是，可以采用其他功效不同的技术来纯化和分离所需的细胞群。使用的分离技术应最大程度地保留要收集的细胞级分的活力。当然，所采用的具体技术将取决于分离的效率、方法的细胞毒性、分离的容易程度和速度以及所需的设备和/或技术技能。
分离方法包括使用抗体包被的磁珠、连接至单克隆抗体或与补体结合使用的细胞毒性剂的磁分离，以及利用与固体基质连接的单克隆抗体的“淘选”，或另一种方便的技术。附着于磁珠和其他固体基质(如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜和塑料培养皿)的抗体可以直接分离。可以通过简单地将固体支持物与细胞悬浮液物理分离从抗体悬浮液中去除与抗体结合的细胞。细胞与固相连接的抗体一起温育的确切条件和持续时间将取决于对所用系统特有的几个因素。然而，适当条件的选择在本领域技术范围内。
然后，在足以允许表达目标标记物(例如CD39或CD103)的细胞结合到与固相连接的抗体的时间后，可以用生理缓冲液洗脱或洗掉未结合的细胞。然后主要根据固相的性质和所用抗体，通过任何适当的方法将结合的细胞与固相分离。
抗体可以与生物素缀合，然后可以用与支持物结合的抗生物素蛋白或链霉亲和素除去，或可以与荧光染料缀合，其可与FACS结合使用)，以实现细胞分离。
例如，表达CD8或CD3的细胞最初通过CD8或CD3的细胞表面表达而与其他细胞分离。如果需要的话，然后使用例如BD
Figure BDA0002308681980000321
流式细胞仪(Becton Dickinson,SanJose,CA)检查分离的CD8+细胞或CD3+细胞的纯度。在一个实施方式中，进行进一步的纯化步骤，例如FACS分选细胞群。在一个实例中，可以进行这种分选以检测CD39、CD103和CD8的表达。
该方法还可以包括测量细胞增殖。用于分析细胞增殖(例如评估增殖)的方法是本领域已知的。例如，可以使用膜染料稀释方法，其包括用荧光染料对目标细胞进行离体化学标记。可以使用以氚化核苷类似物(通常为3H-胸苷脱氧核糖核苷，3H-TdR)或溴脱氧尿苷(BrdU)进行标记。FACS分析可用于测量BrdU掺入。也可以使用增殖的替代标志物，例如DNA含量和与细胞周期相关的蛋白质。
在一个实例中，可以利用Ki67或PCNA的测量。Ki67抗原是与原型细胞周期相关的核蛋白，其通过在活跃细胞周期的所有阶段(G1，S，G2和M阶段)增殖细胞来表达。在静止(G0)细胞中不存在。Ki67抗体可用于建立增殖。Ki67抗体可用于定量静息细胞之间的增殖细胞(Ki67指数)。Ki67通常用作细胞周期和增殖的标志物。Ki67的抗体可商购获得，例如可从获得，并且可获得在免疫组化和FACS分析中使用这些抗体的方法。
可以使用其他方法来检测采样时处于活跃细胞周期中的那些细胞。也可以通过使用利用稳定同位素标记包含细胞的生物样品中的DNA的方法来测量淋巴细胞(例如CD39+CD8+ T细胞，例如CD39+CD103+CD8 T细胞)的增殖。通过从头合成途径对DNA进行一致且高度标记。使用的稳定同位素标记，例如2H-葡萄糖或重水(2H2O或H2 18O)，对动物和人无毒，并且通常被美国食品和药物管理局(FDA)认为是安全的(请参阅美国专利申请公开号2009/0155179)。掺入到淋巴细胞DNA的稳定同位素标记的测量包括以下步骤：(i)提取DNA或从染色质中释放DNA而无需进一步分离，将DNA水解成脱氧核糖核苷酸，(ii)从嘌呤脱氧核糖核苷酸中选择性释放脱氧核糖，(iii)将嘌呤脱氧核糖衍生为适合通过气相色谱/质谱(GC/MS)分析的挥发性衍生物(例如戊烷四乙酸酯、五氟苄基四乙酰基衍生物或其他合适的衍生物)，(iv)对衍生物进行GC/MS分析，(v)分析所述衍生物的质量同位素丰度模式，和(Vi)从所述模式计算过量富集值，所述过量富集值是稳定同位素掺入的量度。已经教导了这些方法中的每一种的具体实施方式(参见美国专利号5,910,40)。
PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG3、BTLA拮抗剂和4-1BB激动剂
检查点抑制剂，例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂和/或BTLA拮抗剂可用于本文公开的方法，例如与CD8+CD39+CD103+ T细胞组合。4-1BB激动剂也可用于本文公开的方法中。PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、TIM-3拮抗剂、BTLA拮抗剂和/或4-1BB激动剂可以是化学或生物化合物。所述试剂可以是抗体，包括但不限于嵌合、人源化或人抗体。合适的拮抗剂和激动剂还包括这些抗体的抗原结合片段(参见上文对抗原结合片段的描述)。拮抗剂可以是例如抑制剂核酸分子或小分子，例如小于900道尔顿或小于800道尔顿的分子。
PD-1拮抗剂可以是任何化学物质或生物分子，它们可以阻断细胞上表达的PD-L1或PD-L2与免疫细胞(T细胞、B细胞或NKT细胞)上表达的人PD-1的结合。PD-1及其配体的别名或同义词包括：对于PD1，有PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；对于PD-L1，有PDCD1L1、PD-L1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；对于PD-L2，有PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。示例性的人PD-1氨基酸序列可以在NCBI登录号：NP_005009中找到。示例性的人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可分别在NCBI登录号：NP_054862和NP_079515(2017年4月28日)中找到，其以引用方式并入。在体内，PD-1在激活的T细胞、B细胞和单核细胞上表达。在人中，PD-1是50-55kDa的I型跨膜受体，其最初是在经历激活诱导的细胞凋亡的T细胞系中被鉴定。PD-1在T细胞、B细胞和巨噬细胞上表达。PD-1的配体是B7家族成员PD-配体1(PD-L1，也称为B7-H1)和PD-L2(也称为B7-DC)。PD-L1或PD-L2抑制剂可用于本文公开的方法中。
实验数据暗示PD-1与其配体的相互作用下调了中枢和外周免疫反应。特别地，在PD-L1的存在下，野生型T细胞中的增殖而非PD-1缺陷型T细胞中的增殖被抑制。(参见，例如，Ishida et al.,EMBO J.11:3887,1992；Shinohara et al.Genomics 23:704,1994；U.S.Pat.No.5,698,520，通过引用并入本文)。
其他PD-1氨基酸序列公开于美国专利号6,808,710和美国专利申请公开号2004/0137577、2003/0232323、2003/0166531、2003/0064380、2003/0044768、2003/0039653、2002/0164600、2002/0160000、2002/0110836、2002/0107363和2002/0106730，其通过引用并入本文。
PD-1是基于与PD-L1结合的能力的分子的CD28/CTLA-4家族的成员。像CTLA-4一样，PD-1在体内因响应于抗CD-3而在T细胞表面被迅速诱导(Agata et al.Int.Immunol.8:765,1996)。T细胞耗竭伴随PD-1表达的诱导，参见PCT公开号2008/083174，其通过引用并入本文。通过使T细胞与降低PD-1表达或活性的试剂接触，可以增加T细胞的细胞毒性。降低PD-1表达或活性的试剂可用于增加免疫反应，例如对肿瘤的免疫反应。不受理论的束缚，PD-1表达或活性的降低导致细胞毒性的T细胞活性的增加，从而增加了特异性免疫反应。
PD-1家族成员与一种或多种受体结合，例如抗原呈递细胞上的PD-L1和PD-L2。PD-L1的示例性氨基酸序列以登录号AAG18508提供，其以引用方式并入本文，自2000年10月4日起可获得。PD-L2前体的氨基酸序列以登录号AAK15370提供，其以引用方式并入本文，自2002年4月8日起可获得。示例性变体PD-L2前体的氨基酸序列以登录号Q9BQ51提供，其以引用方式并入本文，自2006年12月12日起可获得。
在本文公开的方法中使用的拮抗剂包括降低PD配体1(PD-L1)或PD配体2(PD-L2)的表达或活性的试剂或降低PD-1与PD-L1之间的相互作用或PD-1与PD-L2之间的相互作用的试剂。PD-1和PD-L2之间的相互作用；这些是PD拮抗剂。示例性化合物包括抗体(例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和抗PD-L2抗体)、RNAi分子(例如抗PD-1RNAi分子、抗PD-L1RNAi和抗PD-L2 RNAi)、反义分子(例如抗PD-1反义RNA、抗PD-L1反义RNA和抗PD-L2反义RNA)、显性阴性蛋白(例如显性阴性PD-1蛋白、显性阴性PD-L1蛋白和显性阴性PD-L2蛋白)和小分子抑制剂。这些PD-1拮抗剂中的任何一种都可用于本文公开的方法。
其他抗体可用于本文公开的方法(例如，抗CTLA-4抗体和抗LAG3抗体、抗-TIM-3抗体或抗BTLA抗体)、RNAi分子(例如抗CTLA-4RNAi分子、抗LAG3 RNAi、抗TIM-3RNAi和抗BTLARNAi)、反义分子(例如抗CTLA-4反义RNA、抗LAG3反义RNA、抗TIM-3反义RNA和反BTLA反义RNA)。还可以使用的显性阴性蛋白是显性阴性CTLA-4蛋白、显性阴性LAG3蛋白、显性阴性LAG-3蛋白和显性阴性BTLA蛋白。这些拮抗剂中的任何一种都可用于本文公开的方法中。另外，在本文公开的方法中使用了4-1BB激动剂，例如结合4-1BB和RNA适体的抗体。TGF-β受体抑制性或显性阴性蛋白也是有用的。
拮抗剂是具有降低细胞中靶标的表达或活性的能力的试剂。在一些实施方式中，与对照中的此类表达或活性相比，PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM-3、CTLA-4或BTLA的表达或活性降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。活性的示例性降低为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或完全不存在可检测的活性。在一个实例中，对照是尚未用PD-1拮抗剂处理的细胞。在另一个实例中，对照是标准值，或者是与已知不影响活性的试剂例如载体接触的细胞。表达或活性可以通过本领域中的任何标准方法来确定。在一个非限制性实例中，PD-1拮抗剂抑制或减少PD-1与PD-L1、PD-L2或两者的结合。在一个非限制性实例中，PD-L1拮抗剂降低了PD-L1或PD-1的结合。
激动剂是具有增加细胞中靶标的表达或活性的能力的试剂。在一些实施方式中，与对照中的此类表达或活性相比，4-1BB的表达或活性增加了至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。活性的示例性增加为至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或完全不存在可检测的活性。在一个实例中，对照是未经4-1BB激动剂处理的细胞。在另一个实例中，对照是标准值，或者是与已知不影响活性的试剂例如载体接触的细胞。表达或活性可以通过本领域中的任何标准方法来确定。在一个非限制性实例中，4-1BB激动剂刺激或增加结合。
A.抗体
在一些实施方式中，拮抗剂是抗体。结合PD-1的抗体的示例性氨基酸序列公开于例如美国专利公开号2006/0210567中，其通过引用并入本文。结合PD-1的抗体也公开在美国专利公开号2006/0034826中，其也通过引用并入本文。结合PD-1的抗体还公开于美国专利号7,488,802、美国专利号7,521,051、美国专利号8,008,449、美国专利号8,354,509、美国专利号8,168,757和美国PCT公开号WO2004/004771、PCT公开号WO2004/072286、PCT公开号WO2004/056875和美国公开专利申请号2011/0271358中。抗体可以是
Figure BDA0002308681980000351
(派姆单抗(pembrolizumab))。抗体可以是抗PD-1抗体，例如来自Ono Pharmaceuticals的纳武单抗(Nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558)或
Figure BDA0002308681980000352
PD-L1结合拮抗剂包括YW243.55.S70、MPDL3280A、MDX-1105和MEDI 4736，请参见美国公开专利申请号2017/0044256。特异性结合人PD-L1并且可用于所公开的方法和组合物中的单克隆抗体的实例公开于PCT公开号WO2013/019906、PCT公开号WO2010/077634A1和美国专利号8,383,796中。针对PD-1(例如纳武单抗、pidilizumab和Pembrolizumab)或PD-L1(例如DurValumab、Atezolizumab和AVelumab)的检查点抑制剂抗体可用于本文公开的任何方法。结合PD-1、PD-L2和PD-1的抗体也公开在专利号8,552,154中。在几个实例中，特异性结合CTLA-4、BTLA、PD-1、PD-L1或PD-L2的抗体具有至少107M-1的亲和常数，例如至少108M-1，至少5×108M-1或至少109M-1。这些抗体和抗原结合片段中的任何一种都可用于本文公开的方法。
特异性结合CTLA-4的示例性抗体公开于PCT公开号WO 2001/014424、PCT公开号WO2004/035607、美国公开号2005/0201994、欧洲专利号EP1141028和欧洲专利号EP1212422B1。其他CTLA-4抗体公开于美国专利号5,811,097、美国专利号5,855,887、美国专利号6,051,227、美国专利号6,984,720、美国专利号6,682,736、美国专利号6,207,156、美国专利号5,977,318、美国专利号6,682,736、美国专利号7,109,003、美国专利号7,132,281、美国专利号7,452,535和美国专利号7,605,238；PCT公开号WO 01/14424、PCT公开号WO00/37504、PCT公开号WO 98/42752、美国公开专利申请号2000/037504、美国公开申请号2002/0039581和美国公开申请号2002/086014。特异性结合CTLA-4的抗体也公开于Hurwitzet al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho et al.,J.Clin.Oncol.,22(145):Abstract No.2505(2004)(抗体CP-675206)；Mokyr et al.,Cancer Res.,58:5301-5304(1998)。在一些实施方式中，CTLA-4拮抗剂是伊匹单抗(Ipilmumab)(也称为MDX-010和MDX-101和
Figure BDA0002308681980000353
)，参见PCT公开号WO 2001/014424，其通过引用并入本文。这些抗体和抗原结合片段可用于本文公开的方法。
在进一步的实施方式中，在本文公开的方法中使用了BTLA拮抗剂。特异性结合BTLA的抗体公开于例如，美国公开专利申请号2016/0222114、美国公开专利申请号2015/0147344和美国公开专利申请号2012/0288500，其全部通过引用并入本文。在美国公开专利申请号2014/0220051和美国公开专利申请号2010/0104559中公开了调节BTLA活性的生物剂，特别是使用疱疹病毒进入介体(Herpesvirus entry mediator,HVEM)顺式复合物，两者均通过引用并入本文。在其他实施方式中，抗体特异性结合TIM-3，例如TSR-022。在进一步的实施方式中，抗体特异性结合LAG3，例如BMS-986016、GSK2831781，或在PCT公开号WO2015042246 A1中公开的抗体，其通过引用并入本文。关于“Safety Study of Anti-LAG-3With and Without Anti-PD-1in the Treatment of Solid Tumors”，另请参见临床试验编号NCT01968109，其可在互联网上的clinicaltrials.gov获得，并通过引用并入本文。这些抗体和抗原结合片段可用于本文公开的方法。
4-1BB激动剂抗体也是有用的。合适的抗体公开于例如美国专利号8,337,850和PCT公开号WO 2015179236 A1中，两者均通过引用并入本文。在任何公开的方法中使用的抗体包括urelumab(BMS-663513)和PF-05082566(Pfizer)。
在所公开的方法中使用的抗体包括单克隆抗体、人源化抗体、去免疫化抗体(例如以减少人抗小鼠反应)、嵌合抗体和免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。这些抗体的抗原结合片段也可用于本文公开的方法。多克隆抗体可以通过本领域技术人员来制备，例如通过用免疫原免疫合适的受试者(例如兽医学受试者)。可以通过标准技术监测免疫受试者随时间的抗体滴度，例如使用固定化抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)。在一个实例中，可以从哺乳动物(例如从血清)分离特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2(或其组合)的抗体，并通过本领域技术人员已知的技术进一步纯化。例如，可以使用蛋白A色谱法纯化抗体以分离IgG抗体。
可以从受试者获得产生抗体的细胞，并通过标准技术将其用于制备单克隆抗体(参见Kohler and Milstein Nature 256:495 49,1995；Brown et al.,J.Immunol.127:539 46,1981；Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77 96,1985；Gefter,M.L.et al.(1977)Somatic Cell Genet.3:231 36；Kenneth,R.H.in Monoclonal Antibodies:A New Dimension In BiologicalAnalyses.Plenum Publishing Corp.,New York,N.Y.(1980)；Kozbor etal.Immunol.Today 4:72,1983；Lerner,E.A.(1981)Yale J.Biol.Med.54:387 402；Yeh etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.76:2927 31,1976)。在一个实例中，将永生细胞系(典型地为骨髓瘤)与来自用PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、LAG3、BTLA或CTLA-4免疫的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合。筛选所得杂交瘤细胞的培养物上清液，以鉴定产生特异性结合目标多肽的单克隆抗体的杂交瘤。
在一个实施方式中，为了产生杂交瘤，永生细胞系(例如骨髓瘤细胞系)来源于与淋巴细胞相同的哺乳动物物种。例如，鼠类杂交瘤可以通过将永生化小鼠细胞系与来自用CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB肽免疫的小鼠的淋巴细胞融合来制备。在一个实例中，利用了对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感的小鼠骨髓瘤细胞系。根据标准技术，许多骨髓瘤细胞系均可以用作融合伴侣(fusionpartner)，包括例如P3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系，其可得自American Type Culture Collection(ATCC),Rockville,Md。HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞可以使用聚乙二醇(“PEG”)与小鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基选择融合产生的杂交瘤细胞，其可杀死未融合的(和非生产性融合的)骨髓瘤细胞。可以通过如下方式检测产生目标单克隆抗体的杂交瘤：例如通过筛选用于生产结合PD-1、PD-L1、TIM-3、LAG3、BTLA、CTLA-4、PD-L2或4-1BB分子的抗体的杂交瘤培养上清液，例如通过使用免疫测定(例如酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA))。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的替代方法，可以通过以下方式鉴定并分离与CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB特异性结合的单克隆抗体：用CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)以分离特异性结合多肽的免疫球蛋白文库成员。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如但不限于Pharmacia和Stratagene)。特别适合用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于，例如，美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 90/02809；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO92/09690；Barbas et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978 7982,1991；Hoogenboom etal.,Nucleic Acids Res.19:4133 4137,1991。
在一个实例中，确定每个CDR的特异性决定区的序列。SDR以外的残基(非配体接触位点)被取代。例如，在上表中的任何CDR序列中，至多可以取代一个、两个或三个氨基酸。嵌合抗体的产生在本领域中是公知的，所述嵌合抗体包括来自一种抗体的框架区和来自不同抗体的CDR。例如，可以常规产生人源化抗体。抗体或抗体片段可以是人源化免疫球蛋白，其具有来自结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的供体单克隆抗体的互补决定区(CDR)和来自人受者免疫球蛋白重链和轻链框架的免疫球蛋白重链和轻链可变区框架。人源化单克隆抗体可以通过将来自供体小鼠免疫球蛋白(例如CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB特异性抗体)的重链和轻链可变链的供体互补决定区(CDR)转移到人可变结构域中，然后在需要保留亲和力时在框架区中取代人残基来产生。使用源自人源化单克隆抗体的抗体组分消除了与供体抗体的恒定区的免疫原性相关的潜在问题。产生人源化单克隆抗体的技术描述于，例如Jones et al.,Nature 321:522,1986；Riechmann et al.,Nature 332:323,1988；Verhoeyen et al.,Science 239:1534,1988；Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285,1992；Sandhu,Crit.Rev.Biotech.12:437,1992；和Singer et al.,J.Immunol.150:2844,1993。抗体可以是任何同种型，但是在几个实施方式中，抗体是IgG，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方式中，人源化免疫球蛋白特异性结合目标抗原(例如，CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB)，其亲和常数为至少107M-1，例如至少108M-1，至少5×108M-1或至少109M-1。
在一个实施方式中，人源化免疫球蛋白重链可变区框架的序列可以与供体免疫球蛋白重链可变区框架的序列具有至少约65％的同一性。因此，人源化免疫球蛋白重链可变区框架的序列可以与供体免疫球蛋白重链可变区框架的序列具有至少约75％、至少约85％、至少约99％或至少约95％的同一性。人框架区和可在人源化抗体框架区中产生的突变是本领域已知的(参见，例如，美国专利5,585,089，其通过引用并入本文)。
抗体，例如鼠类单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，包括全长分子及其片段，例如Fab、F(ab')2和Fv，其包括重链和轻链可变区，并且能够结合特异性表位决定簇。这些抗体片段保留了一些与其抗原或受体选择性结合的能力。这些片段包括：
(1)Fab，包含抗体分子的单价抗原结合片段的片段，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体以产生完整的轻链和重链的一部分来产生。
(2)Fab'，抗体分子的片段可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后还原，得到完整的轻链和重链的一部分来获得；每个抗体分子获得两个Fab'片段；
(3)(Fab')2，可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体而无需随后还原而获得的抗体片段；F(ab')2是通过两个二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体；
(4)Fv，一种基因工程片段，其包含表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；和
(5)单链抗体(例如scFv)，其定义为包含通过合适的多肽接头连接的轻链可变区、重链可变区的基因工程分子，其是遗传上融合的单链分子。
制备这些抗原结合片段的方法是本领域已知的(参见，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1988)。在几个实例中，可变区包括表达为单个多肽的轻链可变区和重链可变区。Fv抗体通常约为25kDa，并包含一个完整的抗原结合位点，每个重链和每个轻链具有三个CDR。为了产生这些抗体，可以从宿主细胞中的两个单独的核酸构建体表达VH和VL。如果VH和VL非连续表达，则Fv抗体的链通常通过非共价相互作用保持在一起。然而，这些链在稀释时趋于解离，因此已经开发了通过戊二醛、分子间二硫键或肽接头使链交联的方法。因此，在一个实例中，Fv可以是二硫键稳定的Fv(dsFv)，其中重链可变区和轻链可变区通过二硫键化学连接。
在另一个实例中，Fv片段包含通过肽接头连接的VH和VL链。通过构建结构基因来制备这些单链抗原结合蛋白(scFv)，所述结构基因包含编码通过寡核苷酸连接的VH和VL结构域的DNA序列。将结构基因插入表达载体，随后将其引入宿主细胞，例如大肠杆菌。重组宿主细胞合成具有桥接两个V结构域的接头肽的单个多肽链。产生scFv的方法是本领域已知的(参见Whitlow et al.,Methods:a Companion to Methods in Enzymology,Vol.2,page97,1991；Bird et al.,Science 242:423,1988；U.S.Patent No.4,946,778；Pack et al.,Bio/Technology 11:1271,1993；和Sandhu，同上)。
抗体片段可以通过抗体的蛋白水解或通过在大肠杆菌中表达编码该片段的DNA来制备。可以通过常规方法通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗体来获得抗体片段。例如，抗体片段可以通过用胃蛋白酶酶促切割抗体来产生，以提供表示为F(ab')2的5S片段。该片段可以使用硫醇还原剂和任选地二硫键的断裂产生的巯基的封闭基团进一步断裂，以产生3.5S Fab'单价片段。或者，使用胃蛋白酶的酶促切割直接产生两个单价Fab'片段和一个Fc片段(参见美国专利号4,036,945和美国专利号4,331,647，以及其中包含的参考文献；Nisonhoff et al.,Arch.Biochem.Biophys.89:230,1960；Porter,Biochem.J.73:119,1959；Edelman et al.,Methods in Enzymology,Vol.1,page 422,Academic Press,1967；和Coligan et al.，at sections 2.8.1-2.8.10and 2.10.1-2.10.4)。
也可使用裂解抗体的其他方法，例如分离重链以形成单价轻-重链片段，进一步裂解片段或其他酶促、化学或遗传技术，只要这些片段与完整抗体所识别的抗原结合即可。
本领域技术人员将认识到，可以产生抗体的保守变体。抗体片段(例如dsFv片段或scFv片段)中使用的此类保守变体将保留在VH和VL区之间正确折叠和稳定所必需的氨基酸残基，并保留这些残基的电荷特征以保持分子的低pI和低毒性。可以在VH和VL区中进行氨基酸取代(例如至多1个、至多2个、至多3个、至多4个或至多5个氨基酸取代)以提高产量。因此，本领域技术人员可以容易地查看目标抗体的氨基酸序列，在上面的简表中定位一个或多个氨基酸，鉴定保守取代，并使用公知的分子技术产生保守变体。
可以使用本领域技术人员已知的多种方法将效应分子(例如治疗性、诊断性或检测性部分)连接到特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体。共价和非共价连接方式均可使用。将效应分子连接至抗体的方法根据效应子的化学结构而变化。多肽通常包含各种官能团；例如羧酸(COOH)，游离胺(-NH2)或巯基(-SH)基团，它们可用于与抗体上的合适官能团反应以导致效应分子结合。或者，将抗体衍生化以暴露或连接其他反应性官能团。衍生化可能涉及许多接头分子(例如可得自Pierce ChemicalCompany,Rockford,IL的那些)的连接。接头可以是用于将抗体连接至效应分子的任何分子。接头能够与抗体和效应分子均形成共价键。合适的连接基团是本领域技术人员公知的，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当抗体和效应分子是多肽时，接头可以通过它们的侧基(例如通过与半胱氨酸的二硫键)与组成的氨基酸连接或与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。
可以通过任何合适的方法来制备编码抗体的核酸序列，包括，例如克隆合适的序列，或者通过例如以下的方法直接化学合成：Narang et al.,Meth.Enzymol.68:90-99,1979所述的磷酸三酯法；Brown et al.,Meth.Enzymol.68:109-151,1979所述的磷酸二酯法；Beaucage et al.,Tetra.Lett.22:1859-1862,1981所述的二乙基亚磷酰胺法；如Beaucage&Caruthers,Tetra.Letts.22(20):1859-1862,1981所述的固相亚磷酰胺三酯法，例如，使用如例如Needham-VanDevanter et al.,Nucl.Acids Res.12:6159-6168,1984所述的自动合成仪；和美国专利号4,458,066的固体载体法。化学合成产生单链寡核苷酸。可以通过与互补序列杂交或通过与使用单链作为模板的DNA聚合酶聚合将其转化为双链DNA。技术人员会认识到，尽管DNA的化学合成通常限于约100个碱基的序列，但可以通过连接较短的序列来获得较长的序列。
可以通过克隆技术来制备编码与CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB特异性结合的抗体的序列的示例性核酸。合适的克隆和测序技术的实例，以及足以指导技术人员进行许多克隆练习的说明，可在Sambrook等人(同上)，Berger和Kimmel(编)(同上)和Ausubel(同上)中找到。来自生物试剂和实验设备制造商的产品信息也提供了有用的信息。此类制造商包括the SIGMA Chemical Company(Saint Louis,MO),R&D Systems(Minneapolis,MN),Pharmacia Amersham(Piscataway,NJ),CLONTECH Laboratories,Inc.(Palo Alto,CA),Chem Genes Corp.,Aldrich Chemical Company(Milwaukee,WI),GlenResearch,Inc.,GIBCO BRL Life Technologies,Inc.(Gaithersburg,MD),FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG,Buchs,Switzerland),Invitrogen(San Diego,CA),and Applied Biosystems(Foster City,CA)，以及其中技术人员已知的许多其他商业资源。
核酸也可以通过扩增方法来制备。扩增方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自持序列复制系统(3SR)。多种克隆方法、宿主细胞和体外扩增方法是技术人员公知的。
在一个实例中，通过将编码来自特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体的可变区的cDNA插入包含编码效应分子(EM)的cDNA的载体中来制备使用的抗体。进行插入，使得可变区和EM被读入框中，从而产生连续的多肽。因此，编码的多肽包含功能性Fv区和功能性EM区。在一个实施方式中，将编码可检测标记物(例如酶)的cDNA连接至scFv，以使标记物位于scFv的羧基末端。在另一个实例中，可检测的标记物位于scFv的氨基末端。在另一个实例中，将编码可检测标记的cDNA与特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体的重链可变区连接，以使标记物位于重链可变区的羧基末端。随后可以使用二硫键将重链可变区连接至特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体的轻链可变区。在又一个实例中，将编码标志物的cDNA与结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体的轻链可变区连接，以使标记物位于轻链可变区的羧基末端。随后可使用二硫键将轻链可变区与特异性结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的抗体的重链可变区连接。
一旦分离并克隆了编码抗体或其功能片段的核酸，就可以在重组工程化的细胞如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞中表达蛋白质。可以通过将DNA转移到合适的宿主细胞中在体外表达编码抗体或其功能片段的一种或多种DNA序列。细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能会发生突变。稳定转移的方法是指外源DNA连续保持在宿主中，这是本领域已知的。
编码抗体或其功能片段的多核苷酸序列可以与表达控制序列可操作地连接。连接与编码序列可操作连接的表达控制序列，使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。表达控制序列包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(即ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因正确阅读框以允许mRNA的适当翻译以及终止密码子。
可以将编码抗体或其功能片段的多核苷酸序列插入表达载体中，该表达载体包括但不限于质粒、病毒或其他可以被操纵以允许序列的插入或掺入并且可以在原核生物或真核生物中表达的载体。宿主可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物生物。在原核生物中表达具有真核或病毒序列的DNA序列的方法是本领域公知的。能够在宿主中表达和复制的生物功能病毒和质粒DNA载体是本领域已知的。
用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域技术人员公知的常规技术进行。在宿主是原核生物的情况下，例如大肠杆菌，可以从指数生长期后收获的细胞中制备能够吸收DNA的感受态细胞，然后使用本领域公知的步骤通过CaCl2方法进行处理。或者，可以使用MgCl2或RbCl。如果需要，也可以在形成宿主细胞的原生质体后进行转化，或通过电穿孔进行转化。
当宿主是真核生物时，可以使用这样的DNA转染方法，例如磷酸钙共沉淀、常规的机械方法(例如显微注射)、电穿孔、插入封装在脂质体中的质粒或者病毒载体。真核细胞也可以用编码抗体或其功能片段的多核苷酸序列和编码可选择表型的第二外源DNA分子(例如单纯疱疹胸苷激酶基因)共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞并表达该蛋白(例如，参见EukaryoticViral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman ed.,1982)。本领域技术人员可以容易地使用表达系统，例如用于在细胞中产生蛋白质的质粒和载体，所述细胞包括高级真核细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。
重组表达的多肽的分离和纯化可以通过常规方法进行，包括制备色谱和免疫分离。一旦表达，就可以根据本领域的标准程序纯化重组抗体，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(通常参见R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.,1982)。本文公开了均一性(homogeneity)为至少约90至95％的基本上纯的组合物，并且为药学的目的可使用98至99％或更高的均一性。一旦被部分纯化或达到所需的均一性，如果要用于治疗性目的，则多肽应基本不含内毒素。
已经描述了从例如大肠杆菌的细菌表达单链抗体和/或重折叠成合适的活性形式(包括单链抗体)的方法，这些方法是公知的，并且适用于本文公开的抗体。参见，Buchneret al.,Anal.Biochem.205:263-270,1992；Pluckthun,Biotechnology 9:545,1991；Huseet al.,Science 246:1275,1989和Ward et al.,Nature 341:544,1989，均通过引用并入本文。
通常，从包涵体中分离出来自大肠杆菌或其他细菌的功能性异源蛋白，并需要使用强变性剂进行增溶，然后进行重折叠。如本领域所公知的，在增溶步骤中，必须存在还原剂以打开二硫键。示例性的有还原剂的缓冲剂是：0.1M Tris pH 8，6M胍，2mM EDTA，0.3MDTE(二硫赤藓糖醇)。如Saxena et al.,Biochemistry 9:5015-5021,1970)中所述的，其通过引用并入本文，尤其是如Buchner(同上)所述的，在还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂的存在下，可以发生二硫键的再氧化。
复性通常通过将变性和还原的蛋白质在重折叠缓冲液中稀释(例如100倍)来完成。示例性的缓冲剂是0.1M Tris，pH 8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
作为对双链抗体纯化方案的改进，重链和轻链区分别溶解并还原，然后合并在重折叠溶液中。当以使一种蛋白质相对于另一种蛋白质不超过5倍摩尔过量的摩尔比混合这两种蛋白质时，获得示例性的产率。理想的是在氧化还原改组完成之后向重折叠溶液中添加过量的氧化的谷胱甘肽或其他低分子量氧化化合物。
除重组方法外，本文公开的抗体及其功能片段也可以使用标准肽合成来全部或部分构建。长度小于约50个氨基酸的多肽的固相合成可以通过将序列的C末端氨基酸连接到不溶性支持物上，然后依次添加序列中剩余的氨基酸来完成。固相合成技术描述于Barany&Merrifield,The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.Vol.2:Special Methods inPeptide Synthesis,Part A.pp.3-284；Merrifield et al.,J.Am.Chem.Soc.85:2149-2156,1963和Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,PierceChem.Co.,Rockford,Ill.,1984。长度更大的蛋白质可以通过较短片段的氨基和羧基末端的缩合来合成。通过羧基末端的激活形成肽键的方法(例如通过使用偶联剂N,N'-二环己基碳二亚胺)是本领域公知的。
B.抑制性核酸
降低CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的表达和/或活性的抑制性核酸也可以用于本文公开的方法中。一个实施方式是用于干扰或抑制靶基因表达的小抑制性RNA(siRNA)。编码PD-1、PD-L1和PD-L2的核酸序列公开于
Figure BDA0002308681980000401
登记号NM_005018、AF344424、NP_079515和NP_054862，均通过引用并入，自2017年4月28日起可获得。
通常，通过Dicer或DCL酶切割相对长的双链RNA分子来产生siRNA(Zamore,Science,296:1265-1269,2002；Bernstein et al.,Nature,409:363-366,2001)。在动植物中，将siRNA组装到RISC中并指导RISC的序列特异性核糖核酸分解活性，从而导致在细胞质中mRNA或其他RNA靶分子的切割。在细胞核中，siRNA还指导异染色质相关的组蛋白和DNA甲基化，从而导致单个基因或大染色质结构域的转录沉默。PD-1siRNA可商购自例如SantaCruz Biotechnology,Inc。
本公开提供了适合于干扰或抑制靶基因表达的RNA，该RNA包括约15至约40个核苷酸的双链RNA，每条链上含有0至5个核苷酸的3'和/或5'突出端。RNA的序列与期望干扰或抑制其表达的目标基因(例如CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2)的mRNA或转录本的一部分基本相同。为了本公开的目的，与期望干扰或抑制其表达的靶基因的mRNA或转录本的特定部分“基本相同”的RNA序列与靶基因的mRNA或转录本的特定部分相差不超过约30％，并且在一些实施方式中相差不超过约10％。在特定的实施方式中，RNA的序列与靶基因的mRNA或转录本的特定部分完全相同。
因此，本文公开的siRNA包括长度为约15至约40个核苷酸的双链RNA和每条链上具有0至5个核苷酸的长度的3'或5'突出端，其中该双链RNA的序列基本上是与编码CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的核酸的mRNA或转录本的一部分相同(见上文)。在特定实例中，双链RNA包含与编码CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的核酸基本相同的约19至约25个核苷酸，例如20、21或22个核苷酸。在另外的实例中，双链RNA含有与编码CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的核酸100％相同的约19至约25个核苷酸。在此上下文中，“约”不应仅指整数。在一个实例中，“约”20个核苷酸是指长度为19至21个核苷酸的核苷酸。
关于双链RNA上的突出端，突出端的长度在两条链之间是独立的，因为一个突出端的长度不取决于另一条链上突出端的长度。在特定的实例中，3'或5'突出端的长度在至少一条链上为0-核苷酸，并且在某些情况下，在两条链上为0-核苷酸(因此为钝端dsRNA)。在其他实例中，3'或5'突出端的长度在至少一条链上为1-核苷酸至5-核苷酸。更具体地，在一些实例中，3'或5'突出端的长度是至少一条链上的2-核苷酸，或两条链上的2-核苷酸。在特定的实例中，dsRNA分子在两条链上均具有2-核苷酸的3'突出端。
因此，在一个特定提供的RNA实施方式中，双链RNA包含20、21或22个核苷酸，并且3'突出端的长度在两条链上均为2-核苷酸。在本文提供的RNA的实施方式中，双链RNA包含约40-60％的腺嘌呤+尿嘧啶(AU)和约60-40％的鸟嘌呤+胞嘧啶(GC)。更特别地，在特定的实例中，双链RNA包含约50％AU和约50％GC。
本文还描述了例如在双链RNA的有义链中还包含至少一种修饰的核糖核苷酸的RNA。在特定实例中，修饰的核糖核苷酸在至少一条链的3'突出端，或更特别地在有义链的3'突出端。特别考虑的是，修饰的核糖核苷酸的实例包括核糖核苷酸，其包括可检测的标记(例如，荧光团，如罗丹明或FITC)、硫代磷酸核苷酸类似物、脱氧核苷酸(由于碱基分子是核糖核酸而被考虑为修饰的)、2'-氟尿嘧啶、2'-氨基尿嘧啶、2'-氨基胞嘧啶核苷、4-硫尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-(3-氨基烯丙基)-尿嘧啶、肌苷或2'O-Me-核苷酸类似物。
用于CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的反义和核酶分子也可用于本文公开的方法中。反义核酸是与特定mRNA分子的至少一部分互补的DNA或RNA分子(Weintraub,Scientific American 262:40,1990)。在细胞中，反义核酸与相应的mRNA杂交，形成双链分子。反义核酸会干扰mRNA的翻译，因为细胞不翻译双链的mRNA。优选约15个核苷酸的反义寡聚物，因为它们容易合成并且当被引入产生CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的靶细胞中时，与大分子相比不太可能引起问题。使用反义方法抑制基因的体外翻译是本领域公知的(参见，例如Marcus-Sakura,Anal.Biochem.172:289,1988)。
反义寡核苷酸的长度可以是例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸。可以使用本领域已知的方法，通过化学合成和酶促连接反应来构建反义核酸。例如，可以使用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来化学合成反义核酸分子，所述修饰的核苷酸被设计成增加分子的生物学稳定性或增加在反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷等。
使用寡核苷酸来阻止转录是公知的三链体策略，因为bloomer缠绕在双螺旋DNA周围，形成了三链螺旋。因此，可以将这些三链体化合物设计为识别所选基因上的独特位点(Maher,et al.,Antisense Res.and Dev.1(3):227,1991；Helene,C.,Anticancer DrugDesign 6(6):569),1991)。这种类型的抑制性寡核苷酸也可用于本文公开的方法中。
也可以使用核酶，其是具有以类似于DNA限制性核酸内切酶的方式特异性切割其他单链RNA的能力的RNA分子。通过修饰编码这些RNA的核苷酸序列，可以对识别RNA分子中特定核苷酸序列的分子进行工程改造并将其切割(Cech,J.Amer.Med.Assn.260:3030,1988)。该方法的主要优点是，由于它们是序列特异性的，因此只有具有特定序列的mRNA失活。
有两种基本类型的核酶，即四膜虫型(tetrahymena-type)(Hasselhoff,Nature334:585,1988)和“锤头(hammerhead)”型。四膜虫型核酶识别长度为四个碱基的序列，而“锤头”型核酶识别长度为11-18个碱基的碱基序列。识别序列越长，该序列仅出现在目标mRNA种类中的可能性就越大。因此，对于失活特定的mRNA种类而言，锤头型核酶优于四膜虫型核酶，并且18碱基识别序列优于较短的识别序列。
各种递送系统是已知的，并且可用于施用作为治疗剂的siRNA和其他抑制性核酸分子。这样的系统包括，例如，在脂质体、微粒、微胶囊、纳米颗粒、能够表达治疗分子的重组细胞中包封(参见例如Wu et al.,J.Biol.Chem.262,4429,1987)，构建作为逆转录病毒或其他载体一部分的治疗核酸等。
C.小分子
CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2拮抗剂和4-1BB激动剂包括根据本领域已知的方法从天然或合成(或半合成)提取物的大型文库或化学文库鉴定的分子。检测CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2活性降低的筛选方法(例如检测PD-1、PD-L1和PD-L2的细胞死亡)可用于从多种来源鉴定化合物的活性。检测4-1BB活性增加的筛选方法也用于鉴定来自此类来源的化合物。可以使用多样性化合物库、多种其他化合物和化合物库进行初始筛选。因此，可以鉴定结合CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的分子，抑制CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2表达的分子，和抑制CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2活性的分子。也可以鉴定出增加4-1BB的表达和/或活性的分子。这些小分子可以从组合文库、天然产物文库或其他小分子文库中鉴定。另外，可以将CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1和PD-L2拮抗剂以及4-1BB激动剂鉴定为来自商业来源的化合物以及鉴定的抑制剂的可商购类似物。在一些实施方式中，小分子小于900道尔顿，或小于800道尔顿。
测试提取物或化合物的确切来源对鉴定拮抗剂不是关键的。因此，实际上可以从许多化学提取物或化合物中鉴定拮抗剂。可以作为拮抗剂的此类提取物或化合物的实例包括但不限于基于植物、真菌、原核或动物的提取物、发酵液和合成化合物，以及对现有化合物的修饰。还可以使用多种方法来产生随机或定向合成(例如，半合成或全合成)的许多化学化合物，包括但不限于基于糖、脂质、肽和核酸的化合物。合成的化合物文库可商购自Brandon Associates(Merrimack,N.H.)and Aldrich Chemical(Milwaukee,Wis.)。激动剂和拮抗剂可以从合成的化合物文库中鉴定，合成的化合物文库可从商购自许多公司，包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,N.J.)、Brandon Associates(Merrimack,N.H.)和Microsource(New Milford,Conn.)。可以从稀有化学文库(例如可得自Aldrich(Milwaukee,Wis.)的文库)中鉴定CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1和PD-L2拮抗剂或4-1BB激动剂。CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1和PD-L2拮抗剂或4-1BB激动剂可以在细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库中鉴定，其可商购自许多来源，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、HarborBranch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce,Fla.)和PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.)。天然和合成产生的文库和化合物可通过常规化学、物理和生化方法容易地修饰。
有用的化合物可在许多化学类别中找到，尽管通常它们是有机化合物，包括小有机化合物。小有机化合物的分子量大于50但小于约2,500道尔顿，例如可在本文公开的方法中利用小于约750或小于约350道尔顿。示例性的类别包括杂环、肽、糖、类固醇等。可以对化合物进行修饰以增强功效、稳定性、药物相容性等。在一些实施方式中，所使用的化合物对CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的Kd小于InM、小于10nm、小于1μM、小于小于10μM或小于1mM。
D.肽变体
也可以使用与人CTLA-4、人BTLA、人TIM-3、人LAG3、人PD-1、人PD-L1或人PD-L2特异性结合的免疫粘附素。免疫粘附素是一种融合蛋白，其包含与恒定区(如免疫球蛋白分子的Fc区)融合的蛋白的胞外或结合部分。特异性结合PD-1的免疫粘附分子的实例公开于PCT公开号WO2010/027827和WO2011/066342，二者均通过引用并入本文。这些免疫粘附分子包括AMP-224(也称为B7-DCIg)，它是一种PD-L2-FC融合蛋白。其他为融合蛋白的PD-1拮抗剂公开于例如美国公开专利申请号2014/0227262中，其通过引用并入本文。
在一个实施方式中，在所公开的方法中使用的LAG3拮抗剂是IMP321，一种可溶性LAG3，其已被用于激活树突状细胞。在另一个实施方式中，如果在所公开的方法中使用的话，TIM-3拮抗剂是CA-327(Curis)。
CTLA-4拮抗剂可以是显性阴性蛋白或免疫粘附素，参见例如美国公开专利申请号2016/0264643，其通过引用并入本文。其他抗CTLA-4拮抗剂包括可以抑制CTLA-4与其同源配体结合的能力、破坏B7对CTLA-4的能力、破坏CD80与CTLA-4结合的能力、破坏CD86与CTLA-4结合的能力的任何抑制剂。
在一个实施方式中，可以通过筛选CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2蛋白的突变体(例如点突变体或截短突变体)的组合文库以鉴定具有拮抗剂活性的蛋白质，从而鉴定用作拮抗剂的CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2蛋白的变体。在一个实例中，拮抗剂是可溶性蛋白质。
在进一步的实施方式中，可以通过筛选4-1BB突变体(例如点突变或截短突变体)的组合文库以鉴定具有激动剂活性的蛋白，从而鉴定用作激动剂的4-1BB的变体。激动剂可以是可溶性蛋白质。
因此，可通过核酸水平的组合诱变来产生CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB变体的文库，并由杂(variegated)基因文库编码。CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB变体的文库可以通过下述方式产生：例如将合成寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列，使得潜在序列的简并集合可表达为单个多肽，或者表达为包含目标序列集合的较大融合蛋白(例如用于噬菌体展示)的集合。
有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB变体的文库。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，然后将合成基因连接到合适的表达载体中。使用简并的基因集可以在一个混合物中提供所有编码潜在CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB序列的所需集合的序列。合成简并寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如，Narang,et al.,Tetrahedron 39:3,1983；Itakura et al.Annu.Rev.Biochem.53:323,1984；Itakura etal.Science 198:1056,1984)。
另外，CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB蛋白编码序列的片段文库可用于产生片段群，其用于筛选和随后选择特定拮抗剂(或激动剂，在4-1BB的情况下)的变体。在一个实施方式中，可通过用核酸酶在下述条件下处理CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB编码序列的双链PCR片段来产生编码序列片段的文库：每个分子仅产生大约一次切口，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可包括来自不同带切口的产物的有义/反义对的双链DNA，并通过用S1核酸酶处理从重新形成的双链去除单链部分，并将得到的片段文库连接到表达载体中。通过这种方法，可以得到编码CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2或4-1BB的各种大小的N端、C-端和内部片段的表达文库。
在本领域中已知几种用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物的技术，以及用于筛选cDNA文库中具有选定特性的基因产物的技术。这样的技术适用于快速筛选由蛋白质的组合诱变产生的基因文库。最常用的适用于高通量分析的筛选大基因文库的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得的载体文库转化合适的细胞，并在以下条件下表达组合基因：所需活性的检测有助于分离编码检测到其产物的基因的载体。递归集合诱变(Recursive ensemble mutagenesis,REM)可与筛选测定结合使用，以鉴定CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2拮抗剂或4-1BB激动剂(Arkin andYouvan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7811 7815,1992；Delagrave et al.,ProteinEng.6(3):327 331,1993)。
在一个实施方式中，可以利用基于细胞的测定法分析CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2变体的文库。例如，可以将表达载体文库转染到通常合成并分泌CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的细胞系中。然后培养转染的细胞，使得分泌CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2和特定的CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2(分别)变体。突变体表达对细胞或上清液中活性的影响可以通过例如任何功能测定来检测。然后可以从其中内源活性被抑制的细胞中回收质粒DNA，并且进一步鉴定各个克隆。
拟肽也可以用作CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2拮抗剂。肽类似物在制药工业中通常用作具有与模板肽相似性质的非肽药物。这些类型的非肽化合物通常是借助计算机分子模型开发的。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用于产生同等的治疗或预防作用。通常，拟肽在结构上类似于范例多肽(例如，具有PD-1生物活性的多肽)，但具有一个或多个可选地被--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、-CH.＝.CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CH2SO-连接替换的肽连接。这些肽连接可以用本领域已知的方法进行替换(参见，例如，Morley,Trends Pharm.Sci.pp.463 468,1980；Hudson etal.Int.J.Pept.Prot.Res.14:177 185,1979；Spatola,Life Sci.38:1243 1249,1986；Holladay,et al.Tetrahedron Lett.24:4401 4404,1983)。拟肽可以经济地获得，稳定并且可以具有延长的半衰期或吸收。拟肽的标记通常涉及将一个或多个标记直接或通过间隔子(例如通过酰胺基)共价连接到拟肽上的非干扰位置，其由定量结构活性数据和/或分子建模预测。这种非干扰位置通常是不与拟肽结合的大分子形成直接接触以产生治疗效果的位置。拟肽的衍生不应实质上干扰拟肽所需的生物学或药理活性。
在本文公开的方法中也可使用显性阴性蛋白或编码干扰CTLA-4、BTLA、TIM-3、LAG3、PD-1、PD-L1或PD-L2的生物学活性的显性阴性蛋白的核酸。显性阴性蛋白是指这样的氨基酸分子，其具有与显性阴性蛋白所对应的野生型蛋白的至少10、20、35、50、100或多于150个氨基酸具有至少50％、70％、80％、90％、95％或者甚至99％的序列同一性的序列。例如，显性阴性PD-L1具有突变，使得它与PD-1的结合比天然(野生型)PD-1更紧密，但不会激活通过PD-1的任何细胞信号传导。
显性阴性蛋白可以作为表达载体施用。表达载体可以是非病毒载体或病毒载体(例如，逆转录病毒，重组腺相关病毒或重组腺病毒载体)。或者，可以使用例如显微注射技术将显性阴性蛋白直接作为重组蛋白全身施用或施用至感染区域。
多肽拮抗剂可以通过表达编码氨基酸序列的多核苷酸而在原核或真核宿主细胞中产生，通常作为较大多肽的一部分(融合蛋白，例如与ras或酶)。或者，可以通过化学方法合成此类肽。在重组宿主中表达异源蛋白质，多肽的化学合成和体外翻译的方法在本领域中是公知的(参见Maniatis el al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989),2ndEd.,Cold Spring Harbor,N.Y.；Berger and Kimmel,Methods in Enzymology,Volume152,Guide to Molecular Cloning Techniques(1987),Academic Press,Inc.,SanDiego,Calif.；Kaiser et al.,Science 243:187,1989；Merrifield,Science 232:342,1986；Kent,Annu.Rev.Biochem.57:957,1988)。
可以例如通过直接化学合成来产生肽，并将其用作拮抗剂。肽可以作为修饰的肽产生，其非肽部分通过共价键连接到N端和/或C端。在某些优选的实施方式中，羧基末端或氨基末端或两者被化学修饰。最常见的末端氨基和羧基的修饰分别是乙酰化和酰胺化。氨基末端修饰，如酰化(例如，乙酰化)或烷基化(例如，甲基化)和羧基末端修饰(例如酰胺化)以及其他末端修饰(包括环化)可用于各种实施方式中。核心序列的某些氨基末端和/或羧基末端修饰和/或肽延伸可以提供有利的物理、化学、生化和药理特性，例如：增强的稳定性，增强的效能和/或功效，对血清蛋白酶的抗性，理想的药代动力学特性等。
通过以下非限制性实施例说明本公开。
实施例
实施例1
材料和方法
健康供体血液样品和患者血液和组织样品：外周血、无累及的淋巴结(uninvolvedlymph node)、转移性淋巴结和肿瘤样品均来自患有HNSCC、黑素瘤、结肠癌、直肠癌、肺癌、结肠直肠肝转移和卵巢癌的个体。所有受试者均签署了研究所的机构审查委员会(Institutional Review Board)(Providence Portland Medical Center,IRB)批准的书面知情同意书。
在收集样品时，患者未接受治疗。以前，他们经历了范围广泛的疗法，包括化疗、放疗、手术和免疫疗法或以上都不是。
通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)梯度从全血中纯化外周血单核细胞，并在分析前冷冻保存。
如下制备肿瘤标本：简言之，在无菌条件下，将肿瘤切成小片，并在补充有0.5mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原蛋白酶(均为Sigma-Aldrich)和30U/ml DNase(Roche)和最终浓度为1.5％的人血清白蛋白(MP Biomedicals)的RPMI-1640中消化。于室温在磁力搅拌棒的搅拌下将细胞消化1小时。细胞悬液通过70μm过滤器过滤。如上所述，通过Ficoll-PaquePLUS密度离心来富集肿瘤浸润淋巴细胞。将肿瘤单细胞悬液冷冻保存直至进一步分析。
抗体和流式细胞术：荧光标记的抗体购自以下制造商：
Biolegend：CD3(UCHT1)、CD4(OKT-4或RPA-T4)、CD8(RPA-T8)、CD25(BC96)、CD38(HIT2)、CD45RA(HI100)、CD69(FN50)、HLA-DR(L243)、CTLA-4(BNI3)、4-1BB(4B4-1)、CCR7(G043H7)、Granzyme B(GB11)、IFN-g(4S.B3)、TNF-a(Mab11)
BD Bioscience：CD27(M-T271)、CD127(HIL-7R-M21)、PD-1(EH12)、Ki-67(B56)
eBioscience：CD28(CD28.2)、CD39(eBioA1)、CD103(Ber-ACT8和B-Ly7)、FOXP3(PCH101)、ICOS(ISA-3)
R&D：TIM-3(344823)
使用可固定的活/死染料来区分活细胞(Biolegend)。细胞表面染色在FACS缓冲液(PBS，补充有1％FBS和0.01％NaN3)中进行。根据制造商的说明书，使用来自eBioscience的Fix/Perm试剂盒进行胞内染色。为了分析离体外周血单核细胞和TIL的细胞因子产生，将细胞用PMA(0.2μM)和离子霉素(Ionomycin)(1μg/ml)刺激5小时，在最后2 1/2小时存在BFA(10μg/ml)。用BD Bioscience的CytoFix/CytoPerm试剂盒根据制造商的说明书进行胞内细胞因子染色。在LSRII和Fortessa流式细胞仪或FACS Ariall(全BD)上采集染色的细胞用于细胞分选。用Flow Jo软件(Treestar)分析数据。
细胞分选和T细胞扩增：使用Stemcell的T细胞富集试剂盒将冻存的PBMC和TIL解冻并富集T淋巴细胞。为了进行TIL富集，将Epcam磁珠(StemCell)添加到混合物中。然后标记富集的级分，并在FACS Ariall(BD)上将细胞分选至99％的纯度后，纯化目标群。
为了进行TCR测序分析，将细胞团粒(pellets)冷冻直至进一步处理。
为了扩增来自PBMC的DN CD8+、SP CD8+和DP CD8+ TIL以及初始和记忆CD8，对T细胞进行了分选，并在完整的RPMI-1640中培养，所述培养基补充有2mM谷氨酰胺、1％(Vol/Vol)非必需氨基酸、1％(Vol/Vol)丙酮酸钠、青霉素(50U/ml)、链霉素(50ug/ml)和10％胎牛血清(Hyclone)。在经辐射的(4000rad)同种异体饲养细胞(2x105细胞/孔)和10ng/ml的rh IL-15(Biolegend)存在下，在96孔圆底板(Corning/Costar)中用1μg/ml PHA(Sigma)对T细胞(2000-5000细胞/孔)进行多克隆来刺激。1周后，当形成T细胞簇后，在另外的96孔板中将细胞在含有IL-15的完全培养基中分裂，在2天后再次重复，得到4个相同的重复样品。然后在第12天将这四个重复样品合并到24孔板的一个孔中。维持T细胞系直至分析。
微阵列数据采集：用于微阵列的样品以类似于流量分析(flow analysis)的方式处理。在带有磁力搅拌棒的50ml锥形管中在室温下使用在含有0.3％的人白蛋白(MPBiomedicals,823051)和30u/ml DNA酶(Roche 04536282001)的RPMI(Life Technologies，11875-093)中的1mg/ml的胶原蛋白酶(Sigma，C-5138)、0.5mg/ml的halyuronidase(Sigma，H-6254)进行1小时的肿瘤消化。在消化后，样品通过70μm过滤器过滤。然后将样品用RPMI以1:2稀释，并铺在Ficoll(GE，17-1440-02)上，以通过离心步骤富集淋巴细胞。对富集的细胞进行CD3、CD8、CD103、CD39染色，并使用BD FACSAria细胞分选仪分选。裂解分选的细胞，并使用Direct-zol RNA miniprep试剂盒(zymo research)纯化RNA，然后将RNA反转录为cDNA并扩增。扩增的cDNA在Affymetrix Prime-View基因芯片上杂交。
微阵列数据分析：使用BRB Array Tools,Version 4.5.1(可得自互联网，brb_nci.nih.goV/BRB-ArrayTools/)加载由Affymetrix GeneChipCommand Console(AGCC)v3.1.1和来自Affymetrix PrimeView基因表达阵列的Affymetrix Expression Consolev.1.1软件产生的CHP文件，并标注其样品类型(即DN、SP、DP)。运行Affymetrix QualityControl模块来确定表达结果是否在规格范围内(应用BioConductor R模块：affy/affyQCReport)。使用Class Comparison/Between Groups of Arrays BRBarray模块，使用设置的单变量检验显著性阈值(报告按单变量检验的p值分类的最小二乘和KolmogoroV-SmirnoV检验)确定样品类型之间的差异表达。然后使用样品的图形/可视化(Graphics/Visualization of Samples)模块使用选定的基因对3个组进行多维分析(应用BRBarray R模块：MDS.R)。
体外T细胞激活：通过磁性CD8 T细胞富集(Stemcell)分离初始CD8 T细胞亚群，用针对CD4、CD8、CD45RA和CCR7的抗体进行标记并分选。在存在或不存在2ng/ml rh TGF-1(R&D)的情况下，以1:2的珠子:T细胞比率，用抗CD3/CD28 Dynabeads(Life Technologies)培养1x 105初始T细胞。24小时后，对一半实验通过磁捕获除去珠子。在第1、2、3、4、7和9天评估激活和分化标记的表达。
TCR VB基因的深TCR测序和克隆分析：在分选的T细胞群的基因组DNA上进行TCRβ基因的可变V-J或V-D-J区进行深测序。从循环的和肿瘤驻留的CD8 T细胞亚群(范围为1x104–1x 105细胞)中提取DNA(DNeasy Blood and Tissue Kit,Qiagen)。对TCRβCDR3区域进行测序和定位(ImmunoSEQ,AdaptiVe Biotech)。每个样品的覆盖率>10x。仅从ImmunoSEQAnalyzer平台中提取了来自生产性重排的数据，以进行进一步分析。通过每个亚群中500个丰度最高的克隆的核苷酸序列比较来评估不同T细胞亚群的克隆性。
为了比较两个给定群的TCR Vβ重叠(或相似性)，我们使用了Morisita重叠指数。Morisita-Horn相似性指数说明了常见克隆型的数量和克隆型大小的分布，并且对优势克隆型的克隆大小最敏感(参见Venturi et al.,J Immunologi Meth,2008)。
靶细胞识别的评估：4-1BB和CD25上调以及IFN-γ分泌：4-1BB和CD25的上调以及IFN-γ的释放被用作评估扩增自体CD8 T细胞对肿瘤细胞的识别的量度。在开始扩增后17-20天进行共培养实验。前一天，对扩增的T细胞进行计数，并在没有IL-15的培养基中饥饿过夜，以下调4-1BB和CD25的剩余表达。然后将扩增的CD8 T细胞(1×105)单独培养或与肿瘤细胞(自体和同种异体，T细胞：靶细胞之比＝10：1)一起培养。在某些情况下，在添加T细胞之前，将肿瘤细胞与30ug/ml的抗MHC I类封闭抗体(BD Bioscience，克隆W6/32)预温育3小时。作为阳性对照，用抗CD3抗体(OKT3)包被Nunc Maxisorp平板，并添加T细胞。所有条件一式三份铺板。24小时后，收获上清液并通过细胞计数珠阵列(CBA)分析进行分析。收集每种条件下的细胞，并用活性染料标记，然后进行CD39、CD103、CD25和4-1BB细胞表面染色。通过流式细胞仪分析细胞。对于CBA，遵循制造商的规程。特别地，分析了IFN-γ和TNF-α。
活靶细胞杀伤试验：T细胞介导的靶细胞杀伤试验是根据制造商的规程(EssenBioscience)在安置于37℃/5％CO2的细胞培养箱内的Incucyte Zoom System中进行的。为了评估自体肿瘤细胞的T细胞杀伤，将5000-10000肿瘤细胞(自体和同种异体肿瘤细胞系)一式三份接种到96孔平底板中以达到10％融合。对扩增的自体T细胞亚群进行计数并在没有外源的IL-15情况下进行饿死处理。然后在有或没有自体和同种异体肿瘤细胞的情况下培养1×105T细胞(T细胞：肿瘤细胞比率＝10：1)。在一些条件下，添加了抗MHC I类抗体(BDBioscience，克隆W6/32)。在所有条件下，添加NucView 488半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3/7底物(Essen Bioscience)以监测活性半胱氨酸蛋白酶3/7。将板在37℃下温育24小时，每小时使用10X物镜从三个实验重复中捕获四张图像，以观察T细胞杀伤和半胱氨酸蛋白酶3/7活性(绿色荧光)。绿色通道获取时间为400毫秒。对于相位对比(phase contrast)，通过应用掩膜(mask)以排除较小的T细胞来实现细胞分割(cell segmentation)。应用面积过滤器(area filter)以排除低于1000μm2的物体。用背景非均匀性校正的Top-Hat方法(半径为20μm，阈值为2个绿色校正单位)减去绿色背景噪声其。将掩膜应用于实验后，对荧光信号进行定量。通过提供的Zoom软件(Essen Bioscience)计算T细胞杀伤/凋亡的量。
统计分析：使用Prism软件(GraphPad,San Diego CA)进行统计测试。如图例所示，通过用Tukey校正的单向方差分析确定显著性。
实施例2
结果
鉴定肿瘤反应性CD8 T细胞是评估癌症患者抗肿瘤反应的水平和质量以及了解新的癌症治疗策略(例如免疫疗法)的作用方式的关键。最近，已通过在高级浆液性卵巢癌(HGSC)和非小细胞肺癌(NCLC)中共表达CD 103和PD-1鉴定了人肿瘤反应性CD8 T细胞。为了进一步定义其特性和功能，将来自两个人的卵巢肿瘤的肿瘤浸润CD8 T细胞(TIL)分选为CD103阳性和阴性亚群，并通过微阵列确定其基因表达谱。对于此分析，注意力集中在可以通过流式细胞仪容易检测到的差异表达的细胞表面分子上。在满足标准的基因阵列比较中观察到的最大差异之一是ENTPD1，这是一种编码CD39的基因，在细胞表面被发现(表1)。为了证实基因阵列结果并更好地了解肿瘤浸润CD8 T细胞的多样性，对从头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)患者中分离出的CD8 T细胞进行了染色，并对CD 103+群设门。检查了CD39和其他与激活/耗竭(exhaustion)以及发育状态相关的细胞表面标志物。同时分析所有流式细胞术标记物的复杂性需要一种称为t-分布随机邻居嵌入(t-distributed stochasticneighbor embedding,t-SNE)的方法，其广泛用于大规模细胞计数数据。有趣的是，CD39+CD8 T细胞上CD39的高表达与PD-1和CD69的高表达水平重叠。相反，CD 103+CD8 T细胞表达低水平的IL-7R(CD 127)(图1A和IB)，表明存在更多效应子样T细胞表型。此外，CD103和CD39在CD8 T细胞上的联合表达导致鉴定出三个不同的细胞群，包括CD103-CD39-(双阴性(DN)CD8)，CD103+CD39-(单阳性(SP)CD8))和CD103+CD39+(双阳性(DP)CD8)。在包括HNSCC、肺癌、黑素瘤、卵巢癌和直肠癌在内的几种人实体恶性肿瘤中以相对较高的频率检测到DPCD8 T细胞(图1C)，尽管黑素瘤具有最高频率的这些细胞。相反，在HNSCC患者的子集以及大多数患有结肠癌和结肠直肠肝转移(CRLM)的患者中，DP CD8 T细胞的出现频率相当低(图1C和ID)。令人惊讶地，来自一位结肠癌患者的TIL包含非常高频率的DP CD8 T细胞。该患者被诊断患有林奇综合征(Lynch syndrome)，这是一种罕见的遗传失调，由错配修复基因的突变引起，导致更高的突变率。有趣的是，突变频率较高的肿瘤具有大量新抗原的可能性更高，并且这些患者在检查点阻断免疫治疗方面有更好的结果，如延长的无进展生存期所证实(Le DT,N Engl J Med 2015；Snyder A,N Engl J Med 2014；Van Allen EM,Science2015；Rizvi NA,Science 2015)。
然后检查是否仅在存在肿瘤细胞的部位发现了DP CD 8T细胞。为了解决这个问题，分析了几位HNSCC患者，获得了原发性肿瘤、转移性淋巴结(LN)、未受累的LN和外周血。在图1e中显示了来自代表性患者的结果，其中CD8 T细胞的CD39和CD103共表达特异性地存在于原发肿瘤和转移性LN中，但在外周血和未受累的LN中的CD8 T细胞上不存在或以非常低的频率存在。重要的是，在大多数接受分析的HNSCC患者中证实了这种表达谱(图1F)。因此，结果表明，CD103+CD8 T细胞上的CD39表达鉴定出在肿瘤微环境中特异性诱导的CD8 T细胞群。
为了更好地了解DN、SP和DP CD8 T细胞的生物学特性，将这三细胞群直接离体分选，并通过微阵列确定其总体基因表达谱。为了进行该分析，从三个HNSCC和两个卵巢肿瘤中分离出T细胞。DP和DN CD8 T细胞之间的比较确定了这两细胞群之间差异表达的372个基因。在所选基因列表上的主要成分分析(Principal Component Analysis)和无监督分层聚类(unsupervised hierarchical clustering)表明，DP和DN CD8 T细胞具有不同的mRNA谱，而SP CD8 T细胞显示出中间基因标签(intermediate gene signature)(图2a和b)。对这组选定的基因进行的主要成分分析和无监督的层次聚类表明，该基因表达谱是细胞类型特异性的，并未被患者隔离(图2A，2B)。当比较来自DP CD8 T细胞相对于DN CD8 T细胞的转录本时，最大增加中的一些与激活的/耗竭的表型有关，例如MKI67、TNFRSF9、CTLA-4、HAVCR2和GZMB。相反，相对于DN CD8 T细胞，DP CD8 T细胞中下调程度最高的基因参与了T细胞再循环模式，例如KLF2、CCR7、SELL、S1PR1、KLF2。这种基因表达谱让人想起T驻留记忆标签(图2C)。重要的是，这些激活和再循环相关的mRNA的表达谱在所有五个肿瘤中都是一致的(图2D)。因此，DP CD8 T细胞在肿瘤中表现出经历抗原驱动的刺激和激活的细胞的基因表达标签，这也可能导致肿瘤组织外的损失再循环(loss recirculation)。
为了进一步评估肿瘤浸润CD8 T细胞的特定特性，通过流式细胞术分析了蛋白质水平上的分化和激活标志物的表达。与SP或DN CD8 T细胞相比，DP CD8 T细胞表达更高水平的CD69(图3A)。CD69是一种激活分子，在T细胞刺激后被上调，并拮抗鞘氨醇1-磷酸受体1(SlPR1)介导的从组织流出(sphingosine 1-phosphate receptor 1(S1PR1)-mediatedegress from tissues)(Mackay 2015；Skon 2013)。DP CD8 T细胞还表现出较低水平的CCR7、IL7R(CD127)和CD28，表明效应记忆表型(ref)。有趣的是，即使DN和SP CD8 T细胞表达PD-1，DP CD8 T细胞表达这种蛋白质的水平明显更高(图3B)。此外，CTLA-4和TIM-3几乎只在DP CD8 T细胞群中表达。因此，DP CD8 T细胞表现出高度激活的效应记忆表型，尤其是与DN和SP CD8 T细胞相比时。此外，DP CD8 T细胞群中4-1BB和Ki-67的频率增加，表明这些细胞最近在肿瘤中被激活并增殖，这表明了最近的同源抗原识别。
DN、SP和DP CD8 T细胞的效应子功能可通过在单细胞水平上分析其细胞因子的产生直接进行离体评估。当与DN和SP CD8 T细胞相比时，DP CD 8T细胞具有较低频率的能够产生IFN-γ和/或TNF-α的细胞，并且在六名HNSCC患者中获得了相似的结果(图3C，3D)。相比之下，DP CD8 T细胞具有更高的细胞毒性潜能，正如通过明显更高频率的颗粒酶B阳性细胞所证明的那样(图3E)。
鉴于仅在存在肿瘤细胞的部位发现了DP CD8 T细胞，确定造成该特定表型的因素，以更好地了解这些细胞的发育。已经确定TGF-β驱动T细胞上CD 103的表达。TGF-β在肿瘤微环境中产生，并通过诱导导致运动性和侵袭性增强的上皮-间质转化而在癌症进展中起主要作用。在慢性LCMV感染的小鼠模型以及慢性HCV和HIV感染的患者中，在慢性刺激/耗竭的CD8 T细胞上发现了CD39表达(Gupta PK，PLOS Pathogen 2015)，支持持续TCR刺激在其表达中的作用。因此，在存在或不存在TGF-β的情况下，在TCR参与(engagement)后对初始CD8 T细胞进行CD103和CD39上调的动力学分析(图4和补充数据)。为了解决持续TCR刺激在CD39表达中的作用，用CD3/CD28珠子连续刺激T细胞9天，或者在培养开始后24小时去除珠子。在培养的3天内检测到CD39的表达，并且其表达一直增加直到第9天。当在TGF-β存在下刺激T细胞时，CD 103上调，7天后80％以上的细胞为阳性。仅在持续TCR刺激后才发现最佳的CD103和CD39上调。重要的是，在没有持续的TCR刺激的情况下CD39上调的缺乏并不是由于有限的T细胞激活引起的，因为细胞上其他激活标志物如PD-1的表达被迅速诱导(图4)。与CD103表达相反，TGF-β在体外培养系统中对CD39表达没有影响。因此，持续的TCR刺激和TGF-β是促进CD8 T细胞上CD103和CD39表达所需的必要因素。因此，似乎DP CD8 T细胞在重复暴露于其同源抗原后获得其表型，从而导致在富含TGF的环境中肿瘤内的慢性TCR信号传导。
该数据表明，DP CD 8T细胞在肿瘤部位识别其同源抗原。如果这是正确的话，它将导致显性TCR克隆型的选择性扩增，与其他CD8 T细胞群相比，导致克隆性增加。为了解决这个问题，通过对TCRB基因的高度可变CDR3区域进行测序，在来自成对的血液和未受累的LN的DN、SP和DP CD8 T细胞群以及总记忆CD8 T胞内评估TCR克隆型。与分析的任何其他CD8 T细胞群相比，DP CD8 T细胞更具寡克隆性(图5A)。每位患者中30种最常见的克隆型分别占DP CD8 T细胞群的56％、61％和66％，但仅占DN CD8 T细胞的26％、23％和38％，和记忆外周CD 8T细胞的不到20％-分别在HPV+HNSCC肿瘤、HPV-HNSCC肿瘤和卵巢肿瘤中。在DN CD8T细胞群中，扩增度最高的30种DP CD8 T细胞克隆型的发生率要低得多，并且对于这三位患者而言，它们占DN CD8 T细胞库的不到0.06％。有趣的是，DP CD8 T细胞与其他肿瘤浸润CD8 T细胞亚群之间几乎没有共享的TCR克隆型(图5B)。相反，DN CD8 T细胞和SP CD8 T细胞之间共享大量的TCR克隆型。正如常驻记忆标签所预测的(图2D)，存在于DN CD8 T细胞中的大多数TCR克隆型也与未受累的肿瘤LN内的记忆CD8 T细胞以及外周血中的记忆CD8 T细胞共享(分别为R2＝0.7710和0.2022)，这表明DN CD8 T细胞能够再循环，潜在地感测肿瘤环境而没有最终识别其同源抗原(图5C)。相比之下，在未受累的LN或外周血中几乎没有检测到DP CD8 T胞内存在的克隆型。Morisita指数(一种基于丰度的相似性指数，其确定两个群之间的重叠程度)的计算是进一步支持了我们的结果，并显示了在5个患者样品中这一发现的一致性(图5D)。总的来说，这些结果表明DP CD8 T细胞在肿瘤位点内遇到它们的同源抗原，这导致它们激活和肿瘤特异性T细胞克隆的局部扩增。
如果这是正确的，则应该因肿瘤反应性而富集DP CD8 TIL。因此，从四个黑素瘤肿瘤和两个HNSCC肿瘤产生了自体肿瘤细胞系，我们确定是否因肿瘤反应性和杀伤作用而富集DP CD8 TIL。根据CD103和CD39的表达，直接从肿瘤消化物中分选出CD8 T细胞，并在体外扩增3个CD8 T细胞群。扩增后，筛选DN、SP和DP CD8 TIL针对自体肿瘤细胞系的反应性，如通过4-1BB上调以及IFN-γ分泌所评估的。在所有接受测试的六名患者中，发现与DN和SPCD 8TIL相比，DP CD8 T细胞因肿瘤反应性而被高度富集(图6A)。在患者1的最高肿瘤与T细胞比率中，高达87％的反应性T细胞说明了DP CD 8细胞中肿瘤反应性CD 8 TIL的富集。自体肿瘤的识别是特异性的，并且在MHC I类受阻(blockade)后或当细胞与同种异体肿瘤细胞系共培养时检测到因在DP TIL亚组中无反应性而受限制的MHC I类，(图6B)。为了解决肿瘤反应性DP CD8 T细胞是否能够杀死自体肿瘤细胞，将扩增的T细胞亚群与自体肿瘤细胞共培养，并使用Incucyte活细胞分析系统监测肿瘤特异性杀伤。该系统允许通过显微镜在37℃实时观察半胱氨酸蛋白酶3/7依赖性细胞凋亡。与4-1BB上调一致，只有DP CD8 T细胞杀死了自体肿瘤细胞，如半胱氨酸蛋白酶3/7+事件数量的增加所说明的(图6C，6D)。这种杀伤是MHC I类依赖的，因为MHC I类抗体W6/32阻止了这种作用。相反，DN CD 8T细胞几乎没有观察到自体肿瘤细胞杀伤。
最后，在手术样品中评估了DP CD8 TIL的频率与患者存活之间的关系。这项分析关注HNSCC患者的一小群(n＝62)。手术后，通过流式细胞术确定原发性肿瘤中总CD8 TIL中DP CD8 T细胞的频率，然后对患者进行标准护理治疗。根据DP CD8 T细胞的频率对患者进行隔离，相对于该群中DP CD8 T细胞的平均频率，分为高组和低组。使用这种策略，发现在手术时肿瘤中DP CD8 TIL百分比更高的患者与总生存期(OS)的增加相关(图6E)，在HPV阴性亚组中显示出更大的显著性(图6F)。总的来说，已经表明对肿瘤反应性CD8 TIL而言，CD103和CD39共表达强烈富集，并且它们的频率与HNSCC患者的总生存期增加有关。
基于这些结果，解决了以高频率存在于DP CD8 TIL中的TCR克隆型是否确实是肿瘤特异性的。将DP CD8 TIL与自体肿瘤细胞共培养20小时，然后分选4-1BB+CD25+CD8 T细胞。当这些T细胞与自体肿瘤细胞共培养时，发现高频率离体存在的大多数克隆型都位于DPCD8 TIL的4-1BB+CD25+片段中，表明它们有肿瘤反应性(图7A，7B)。数据表明，利用来自DPCD8群的TCR在过继转移环境中将具有治疗作用。值得注意的是，在两个不同的HNSCC样品中，同一患者中的原发性肿瘤和转移性LN之间观察到DP CD8 TIL TCR库有很强的重叠(图7C)。该结果很重要，因为它表明可以从转移性LN或原发性肿瘤中分离出相同的DP CD8 TILTCR，并将其用于TCR治疗。
考虑到可以应用所公开发明的原理的许多可能的实施例，应当认识到，所示的实施例仅是本发明的优选示例，而不应视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的发明。
序列表
<110> 俄勒冈州普罗维登斯健康与服务部
安格诺科斯有限公司
<120> CD39和CD103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性T细胞中的应用
<130> 6727-98940-02
<150> 62/517,612
<151> 2017-06-09
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<170> PatentIn version 3.5
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Claims (38)

1.分离编码特异性结合肿瘤细胞抗原的T细胞受体(TCR)的核酸的方法，包括：
从样品分离CD39+CD103+CD8+T细胞，所述样品来自患有表达肿瘤细胞抗原的肿瘤的受试者，和
从CD8+CD39+CD103+T细胞克隆编码TCR的核酸分子，
由此分离编码TCR的核酸分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中肿瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。
3.如权利要求1所述的方法，其中样品是外周血或肿瘤活检。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，进一步包括：
在克隆T细胞受体之前体外扩增CD8+CD39+CD103+T细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中受试者是人。
6.核酸分子，其编码通过如权利要求1所述的方法产生的TCR。
7.由核酸分子编码的TCR，该核酸分子编码由权利要求1-5中任一项所述的方法产生的TCR。
8.分离的宿主T细胞，其用权利要求6的核酸分子转染。
9.如权利要求8所述的分离的宿主T细胞，其中TCR与受试者是自体同源的。
10.如权利要求8所述的分离的宿主T细胞，其中TCR与受试者是同种异体的。
11.治疗患有肿瘤的受试者的方法，包括对受试者施用治疗有效量的CD8+CD39+CD103+T细胞，由此治疗患有肿瘤的受试者。
12.如权利要求11所述的方法，进一步包括对受试者施用治疗有效量的程序性死亡(PD)-1拮抗剂、程序性死亡配体(PD-L1)拮抗剂、细胞毒性T-淋巴细胞-相关蛋白4(CTLA-4)拮抗剂、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)拮抗剂、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域-3(TIM-3)拮抗剂、淋巴细胞-激活基因3(LAG3)拮抗剂或4-1BB激动剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中a)PD-1拮抗剂是特异性结合PD-1或其抗原结合片段的抗体；b)PD-L1拮抗剂是特异性结合PD-L1或其抗原结合片段的抗体；c)CTLA-4拮抗剂是特异性结合CTLA-4或其抗原结合片段的抗体；d)BTLA拮抗剂是特异性结合BTLA或其抗原结合片段的抗体；e)TIM-3拮抗剂是特异性结合TIM-3或其抗原结合片段的抗体；e)LAG3拮抗剂是特异性结合LAG3或其抗原结合片段的抗体。
14.如权利要求13所述的方法，其中特异性结合PD-1的抗体、特异性结合PD-L1的抗体、特异性结合CTLA-4的抗体、特异性结合BTLA的抗体、特异性结合TIM-3的抗体或特异性结合LAG3的抗体是人单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
15.如权利要求12所述的方法，其中PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、BTLA拮抗剂、TIM-3拮抗剂或LAG3拮抗剂是小抑制RNA、反义RNA、核酶、小分子或显性阴性蛋白。
16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其中肿瘤是实体肿瘤。
17.如权利要求16所述的方法，其中实体肿瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。
18.如权利要求11-17中任一项所述的方法，其中CD8+CD39+CD103+T细胞是自体同源的。
19.如权利要求11-17中任一项所述的方法，进一步包括切除受试者的肿瘤。
20.如权利要求11-19中任一项所述的方法，其中受试者是人。
21.扩增CD8+CD39+CD103+T细胞的方法，包括：
在组织培养基中培养CD8+CD39+CD103+T细胞以形成原代培养物，所述组织培养基包含谷氨酰胺、血清和抗生素；
用有效量的同种异体经辐射的饲养细胞和白介素(IL)-15刺激原代培养物以形成刺激的T细胞；和
在组织培养基和有效量的IL-15中培养刺激的T细胞；
由此扩增CD8+CD39+CD103+T细胞。
22.如权利要求21所述的方法，包括在约5ng/ml至约50ng/ml的IL-15中刺激原代培养物，和/或在约5ng/ml至约50ng/ml的IL-15中培养T细胞簇。
23.如权利要求22所述的方法，包括在约10ng/ml的IL-15中刺激原代培养物，和/或在约10ng/ml的IL-15中培养T细胞簇。
24.如权利要求21-23中任一项所述的方法，其中用有效量的同种异体经辐射的饲养细胞刺激原代培养物包括用约100,000至约300,000同种异体饲养细胞刺激约1,000至约2,000CD8+CD39+CD103+T细胞。
25.如权利要求24所述的方法，用约200,000同种异体饲养细胞刺激约1,000至约2,000CD39+CD103+CD8+细胞。
26.确定患有肿瘤的受试者是否响应于检查点抑制剂或辐射的方法，包括：
检测来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的存在，
其中生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的存在表明检查点抑制剂或辐射对治疗受试者的肿瘤将是有效的。
27.如权利要求所述的方法26，进一步包括对受试者施用检查点抑制剂或辐射。
28.确定患有肿瘤的受试者是否响应于癌症治疗剂的方法，包括：
对受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，和
测定来自受试者的生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的数量，
其中与对照相比生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞数量增加表示第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤有效。
29.治疗患有肿瘤的受试者的方法，包括：
对受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，和
测定来自受试者的生物样品中的CD8+CD39+CD103+T细胞数量，
其中与对照相比生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的数量增加表示第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤有效，
和施用第二剂量的癌症治疗剂，其中第一剂量与第二剂量相同，或者第二剂量低于第一剂量。
30.治疗患有肿瘤的受试者的方法，包括：
对受试者施用第一剂量的癌症治疗剂，和
测定来自受试者的生物样品中的CD8+CD39+CD103+T细胞数量，
其中与对照相比生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的量减少或无变化表示第一剂量的癌症治疗剂对治疗受试者的肿瘤无效，
和施用第二剂量的癌症治疗剂，其中第二剂量高于第一剂量，或者第二剂量与第一剂量相同。
31.如权利要求29或30所述的方法，其中对照是在用癌症治疗剂治疗之前从受试者获得的生物样品中CD8+CD39+CD103+T细胞的数量，或其中对照是标准值。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其中癌症治疗剂是检查点抑制剂。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其中癌症治疗剂是化疗剂。
34.如权利要求28或权利要求33所述的方法，其中检查点抑制剂是施用于受试者的程序性死亡(PD)-1拮抗剂、程序性死亡配体(PD-L1)拮抗剂、细胞毒性T-淋巴细胞-相关蛋白4(CTLA-4)拮抗剂、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)拮抗剂、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域-3(TIM-3)拮抗剂、淋巴细胞-激活基因3(LAG3)拮抗剂，或4-1BB激动剂。
35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其中样品是外周血或肿瘤活检。
36.如权利要求37-35中任一项所述的方法，其中受试者是人。
37.如权利要求27-36中任一项所述的方法，其中肿瘤是实体肿瘤。
38.如权利要求37所述的方法，其中实体肿瘤是头颈部鳞状细胞癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤或直肠癌。
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