PT1503794E

PT1503794E - Métodos de tratamento usando anticorpos contra ctla-4

Info

Publication number: PT1503794E
Application number: PT03728392T
Authority: PT
Inventors: Tibor Keler; Robert Graziano; Alan J Korman
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2002-04-12
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2012-06-21
Also published as: ES2384168T9; MXPA04010013A; ATE552849T1; CA2481207A1; CA2481207C; US8142778B2; BR0309254A; EP1503794B9; JP2005529873A; US20090117037A1; US20040005318A1; CY1113243T1; DK1503794T3; AU2008255203B2; EP1503794A4; EP1503794B1; ES2384168T3; ZA200408732B; SI1503794T1; WO2003086459A1

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODOS DE TRATAMENTO USANDO ANTICORPOS CONTRA CTLA-4" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se geralmente à imunologia molecular e ao tratamento de doenças humanas. Em particular, refere-se a anticorpos contra CTLA-4 humano para utilização em novos métodos de tratamento de cancro. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema imune dos vertebrados requer múltiplos sinais para conseguir a activação imune óptima (veja-se, por exemplo, Janeway, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1989; 54:1-14: Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.,

Fundamental Immunology, 4a edição (1998), particularmente os capítulos 12 e 13, páginas 411 a 478) . As interacções entre linfócitos T (células T) e células apresentadoras de antigénio (APC) são essenciais para a resposta imune. Os níveis de muitas moléculas coesivas encontradas em células T e APCs aumentam durante uma resposta imune (Springer et al, A. Rev. Immunol. 1987; 5:223-252; Shaw e Shimuzu,

Current Opinion in Immunology, 1988 Eds. Kindt e Long, 1:92-97; e Hemler, Immunology Today 1988; 9:109-113). Níveis aumentados destas moléculas podem ajudar a explicar porque as APCs activadas são mais efectivas em estimular a proliferação de células T específicas contra antigénio do que são as APCs em descanso (Kaiuchi et al, J. Immunol. 1983; 131:109-114; Kreiger et al, J. Immunol. 1985; 135:2937-2945; McKenzie, J. Immunol. 1988; 141:2907-2911; e Hawrylowicz e Unanue, J. Immunol., 1988; 141:4083-4088). A resposta imune de célula T é um processo complexo que envolve interacções de célula-célula (Springer et al, A. Rev. Immunol. 1987; 5:223-252), particularmente entre células T e acessórias tais como as APCs, e a produção de mediadores imunes solúveis (citocinas ou linfocinas) 2 (Dinarello, New Engl. J. Med 1987; 317:940-945; Sallusto, J. Exp. Med. 1997; 179:1109- 1118). Esta resposta é regulada por vários receptores de superfície de célula T, incluindo o complexo de receptor de célula T (Weiss, Ann. Rev. Immunol. 1986; 4:593-619) e outras moléculas de superfície "acessórias" (Allison, Curr. Opion. Immunol. 1994; 6:414-419; Springer, 1987, supra). Muitas destas moléculas acessórias são antigénios de diferenciação de superfície (CD) de célula de ocorrência natural definidos pela reactividade de anticorpos monoclonais na superfície de células (McMichael, Ed., Leykocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N.Y., 1987). A resposta antigénica de célula T auxiliar (Th) requer sinais proporcionados pelas APCs. O primeiro sinal é iniciado por interacção do complexo de receptor de célula T (Weiss, J. Clin. Invest. 1990; 86:1015) com antigénio apresentado no contexto de moléculas de complexo de histocompatibilidade (MHC) principal de classe II na APC (Allen, Immunol. Today 1987; 8:270). Este sinal específico contra antigénio não é suficiente para gerar uma resposta completa, e na ausência de um segundo sinal pode realmente levar a inactivação ou anergia clonal (Schwartz, Science 1990; 248:1349). O requisito de um segundo sinal "co-estimulador" proporcionado pelas MHC foi demonstrado num número de sistemas experimentais (Schwartz, supra; Weaver e Unanue, Immunol. Today 1990; 11:49). A natureza molecular deste segundo sinal não é completamente entendida, embora esteja claro em alguns casos que tanto moléculas solúveis tais como interleucina (IL)-l (Weaver e Unanue, supra) quanto receptores de membrana envolvidos em adesão intracelular (Springer, Nature 1990; 346:425) podem proporcionar sinais co-estimuladores. O antigénio CD28, uma glicoproteína homodimérica da superfamília da imunoglobulina (Aruffo e Seed, Proc. Natl. Acad. Sei. 1987; 84:8573-8577), é uma molécula acessória 3 encontrada na maioria das células T humanas maduras (Damle et al, J. Immunol. 1983; 131:2296- 2300) . Evidências actuais sugerem que esta molécula funciona numa via de activação de célula T alternativa distinta daquela iniciada pelo complexo de receptor de célula T (June et al, Mol. Cell. Biol. 1987; 7:4472-4481). Os anticorpos monoclonais (Mabs) reactivos com antigénio CD28 podem aumentar respostas de células T iniciadas por vários estímulos policlonais (revisto por June et al, supra). Estes efeitos estimuladores podem resultar da produção de citocina induzida por Mab (Thompson et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 1989; 86:1333-1337; e Lindsten et al, Science 1989; 244:339-343) como uma consequência de estabilização de ARNm aumentada (Lindsten et al, 1989, supra). mAbs anti-CD28 também podem ter efeitos inibidores, isto é, podem bloquear reacções de linfócitos misturados autólogos (Damle et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 1981; 78:5096-6001) e activação de clones de célula T específicos contra antigénio (Lesslauer et al, Eur. J. Immunol. 1986; 16:1289-1296). O CTLA-4 é uma molécula de superfície de célula T que foi originalmente identificada por selecção diferencial de uma biblioteca de ADNc de célula T citolítica murina (Brunet et al, Nature 328:267-270(1987)). O CTLA-4 também é um membro da superfamília da imunoglobulina (Ig); CTLA-4 compreende um único domínio Ig extracelular. Os transcritos de CTLA-4 foram encontrados em populações de células T tendo actividade citotóxica, o que sugere que CTLA-4 pode funcionar na resposta citolítica (Brunet et al, supra; Brunet et al, Immunol. Rev. 103-21- 36(1988)). Os pesquisadores relataram a clonagem e o mapeamento de um gene para a contraparte humana de CTLA-4 (Dariavach et al, Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988)) para a mesma região cromossómica (2q33-34) como CD28 (Lafage-Pochitaloff et al, Immunogenetics 31:198- 201 (1990)). A comparação de sequências entre este ADN de CTLA-4 humano e as proteínas 4 de CD28 codificantes revela homologia significativa das sequências, com o maior grau de homologia nas regiões justamembrana e citoplasmática (Brunet et al, 1988, supra; Dariavach et al, 1988, supra). 0 CTLA-4 é aceite como se opondo à actividade de CD28 e amortecendo a activação de células T (Krummel, J. Exp. Med. 1995; 182:459-465; Krummel et al, Int'l Immunol. 1996; 8:519-523; Chambers et al, Immunity 1997; 7:885-895). Ratinhos deficientes de CTLA-4 sofrem de linfoproliferação massiva (Chambers et al, supra). Relatou-se que o bloqueio de CTLA-4 aumenta respostas de células T in vitro (Walunas et al, Immunity. 1994; 1:405-413) e in vivo (Kearney, J. Immunol. 1995; 155:1032-1036), exacerba imunidade anti-tumoral (Leach, Science 1996; 271:1734-1736), e intensifica uma doença auto-imune induzida (Luhder, J. Exp. Med. 1998; 187:427- 432). Também se relatou que CTLA-4 tem um impacto alternativo ou adicional no carácter inicial da resposta imune de células T (Chambers, Curr. Opin. Immunol. 1997; 9:396-404; Bluestone, J. Immunol. 1997; 158:1989-1993; Thompson, Immunity 1997; 7:445-450). Isto é consistente com a observação que alguns pacientes auto-imunes têm auto-anticorpos para CTLA-4. É possível que anticorpos que bloqueiem CTLA-4 desempenhem um papel patogénico nestes pacientes (Matsui, J. Immunol. 1999; 162:4328-4335).

Os anticorpos contra CTLA-4 não humana têm sido usados nos vários estudos discutidos acima. Além disso, os anticorpos humanos contra CTLA-4 humano foram descritos como moduladores de imunoestimulação num número de condições de doença, tais como o tratamento ou prevenção de infecção virai e bacteriana e para tratar cancro (por exemplo, Publicação PCT WO 01/14424 e publicação PCT WO 00/37504) . A patente US N° 5.855.887 divulga um método para aumentar a resposta de uma célula T de mamíferos à estimulação antigénica por meio da combinação de uma célula T com um agente bloqueador de CTLA-4. A patente US N° 5 5.811.097 divulga um método para diminuir o desenvolvimento de tumores não de célula T por meio da administração de um agente bloqueador de CTLA-4. Os pedidos de patente US N° 09/644.668 e 09/948.939 divulgam anticorpos contra CTLA-4 humano. Os anticorpos anti-CTLA-4 capazes de co-estimular a proliferação de célula T e a sua utilização no tratamento de distúrbios sensíveis à proliferação de célula T são descritos no documento WO 98/42752 e no documento US 6.207.156. O documento WO 95/33770 descreve anticorpos anti-CTLA-4 capazes de induzir a apoptose de célula T específica a antigénio, e a sua utilização terapêutica, por exemplo, no tratamento de doenças auto-imunes. A citação ou discussão de qualquer referência nesta secção ou em qualquer outro lugar na memória descritiva é feita somente para esclarecer a descrição da presente invenção e não é uma admissão de que qualquer tal referência seja "técnica anterior" contra qualquer invenção descrita no presente documento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos anti-CTLA-4 humanos para utilização no tratamento de um cancro num paciente humano, em que o paciente, antes de administrar o anticorpo, foi tratado com cirurgia de manipulação de tumor, quimioterapia, ou radiação e desenvolveu uma resposta imune ao cancro, em que o anticorpo é para reforçar a resposta imune do paciente, e em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 seja pelo menos 2 pg/ml durante mais de quatro meses. A presente invenção também se refere a anticorpos anti-CTLA-4 humanos para utilização no tratamento de um cancro num paciente humano, em que o paciente, antes de administrar o anticorpo, foi tratado com uma vacina contra o cancro e desenvolveu uma resposta imune ao cancro, em que o anticorpo é para reforçar a resposta imune do paciente, e 6 em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 seja pelo menos 2 pg/ml durante mais de quatro meses.

Também se descrevem no presente documento métodos para promover ou potencializar uma resposta imune secundária ou de memória usando anticorpos anti-CTLA-4. Os anticorpos anti-CTLA-4 demonstram uma capacidade para aumentar a magnitude da imunidade protectora num indivíduo já imunizado para antigénios protectores de um agente patogénico, por exemplo, antigénios de cancro ou antigénios de um agente infeccioso. Tal imunização anterior pode ter ocorrido como um resultado da exposição natural, por exemplo, a células de cancro de um tumor extirpado ou de uma infecção resolvida ou suprimida com um agente infeccioso. Tais pacientes podem ser testados quanto à evidência de tal exposição, isto é, quanto à imunidade para um antigénio protector para o agente patogénico. Alternativamente, o paciente pode ter sido vacinado contra o agente patogénico, em cujo caso a imunidade pode ser presumida ou testada.

Os anticorpos contra CTLA-4 da invenção podem ser usados no tratamento de malignidades, onde o paciente tenha previamente recebido uma vacina contra o cancro ou demonstre algum nível de imunidade protectora natural ao tumor. Os anticorpos podem ser usados como um agente único ou em combinação com um ou mais outros agentes, tais como quimioterapia, terapêutica de radiação, citocinas, quimiocinas e outras moléculas sinalizadoras biológicas, vacinas específicas para tumor, resgate de células estaminais autólogas e alogénicas (por exemplo, para aumentar efeitos de enxerto versus tumor), outros anticorpos terapêuticos, terapias moleculares direccionadas, terapêutica anti-angiogénica, agentes infecciosos com intento terapêutico (tal com bactéria localizadora de tumor) e terapêutica genética. Os 7 anticorpos podem ser administrados como uma dose única ou em múltiplas doses. Os anticorpos podem ser usados em terapêutica adjuvante ou neo-adjuvante, em separado ou em conjunto com as terapêuticas mencionadas anteriormente. 0 tratamento com um anticorpo anti-CTLA4 pode ser usado para activar uma resposta de memória preexistente em pacientes tratados com uma vacina contra o cancro. Assim, pacientes tratados com vacina podem ser seleccionados para o tratamento adicional com um anticorpo anti-CTLA4 para desse modo induzir ou reforçar adicionalmente uma resposta imune.

Numa forma de realização, o antigénio é um antigénio de cancro e o paciente foi previamente tratado com uma vacina anticancro. 0 antigénio de cancro pode ser, por exemplo, um antigénio de melanoma ou antigénio de cancro de próstata. Um anticorpo anti-CTLA-4 humano preferido da invenção é 10D1, mas os métodos da presente invenção podem ser usados com qualquer anticorpo anti-CTLA-4 humano.

Os métodos de tratamento da invenção, os quais são projectados para estimular uma resposta imune secundária ou de memória, podem ser particularmente relevantes no tratamento de pacientes imunossuprimidos que poderiam estar em alto risco de complicações de doença. Exemplos de tais pacientes imunossuprimidos incluem pacientes com infecções retrovirais, incluindo VIH, pacientes com deficácias imunocongénitas, herdadas, Auto-imunes ou induzidas farmaceuticamente, incluindo pacientes diabéticos e idosos, e pacientes com feridas, traumatismos ou queimaduras graves. A invenção também demonstra que pacientes podem ser tratados durante períodos prolongados de tempo com anti-CTLA- 4 sem experimentar efeitos secundários prejudiciais tais como activação de célula T não específica, tal como auto- imunidade.

As concentrações plasmáticas de anti-CTLA-4 podem ser mantidas acima de níveis detectáveis durante pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 meses, ou mais, sem consequências imunológicas não intencionadas. 0 anticorpo anti-CTLA-4 para utilização de acordo com a invenção é para ser administrado ao paciente tal que a concentração plasmática do anticorpo anti-CTLA-4 é pelo menos 2 yg/ml durante mais de quatro ou cinco meses. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é para ser administrado múltiplas vezes tal que a concentração plasmática seja pelo menos 2 yg/ml durante mais de quatro ou cinco meses. Geralmente, o anticorpo anti-CTLA-4 é para ser administrado numa quantidade e em intervalos tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 no paciente seja pelo menos 2 pg/ml durante mais de quatro ou cinco meses. Numa forma de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado numa quantidade e em intervalos tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 no paciente seja pelo menos 5 yg/ml durante mais de quatro ou cinco meses. Em outra forma de realização, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado numa quantidade e em intervalos tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 no paciente seja pelo menos 10 pg/ml durante mais de quatro ou cinco meses. Numa forma de realização preferida, o paciente a ser tratado durante períodos mais extensos de tempo com o anticorpo anti-CTLA-4 está a sofrer de uma malignidade, tal como melanoma ou cancro de próstata. Em outra forma de realização preferida, o paciente foi, ou está a ser, tratado com uma vacina além do tratamento com o anticorpo anti-CTLA-4.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo anti-CTLA-4 da presente invenção é anticorpo monoclonal humano 10D1 como foi revelado no documento WO 01/14424.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra respostas de anticorpo específico de melanoma em animais tratados com uma vacina contra melanoma 9 e o anticorpo anti-CTLA-4 10D1. A reactividade do anticorpo em amostras de plasma agrupado de animais tratados foi medida por citometria de fluxo. A figura 2 mostra o perfil farmacocinético do anticorpo anti-CTLA-4 10D1 durante dosagem crónica de primatas. 0 anticorpo foi administrado nos dias 0, 28, 56, 84 e 140 e as concentrações plasmáticas de 10D1 foram analisadas por ELISA. A média ± SEM de seis animais tratados é mostrada. A figura 3 mostra o perfil farmacocinético do anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em pacientes com cancro de próstata tratados com uma dose única de 10D1 no dia 0. A concentração plasmática (pg/ml) é mostrada. A média ± SEM para 14 pacientes tratados é mostrada. A figura 4 mostra níveis de antigénio específico da próstata (PSA) em ng/ml em dois pacientes humanos em vários pontos no tempo após a infusão de um anticorpo anti- CTLA-4 no dia 0.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Descrevem-se no presente documento novos métodos à base de anticorpo contra CTLA-4 para promover ou potencializar uma resposta imune secundária ou de memória, e para o tratamento mais eficaz do cancro. Além disso, divulgam-se concentrações plasmáticas preferidas de anticorpo anti- CTLA-4. A presente invenção baseia-se, em parte, em observações feitas durante o teste clínico de um anticorpo anti-CTLA-4 de sequência humana em imunoterapia de cancros, como é descrito a seguir. Os testes demonstram a eficácia de anticorpo anti-CTLA-4 no tratamento de indivíduos com exposição anterior ao antigénio de tumor. Além disso, mostra-se a persistência de níveis plasmáticos detectáveis de anticorpo anti-CTLA-4 em seguida a administrações únicas ou múltiplas. A. Teste Clínico de Pacientes Vacinados Anteriormente com 10

Vacina contra o Cancro

Nove pacientes com melanoma avançado ou cancro do ovário avançado participaram num estudo no qual receberam 3 mg/kg de anticorpo monoclonal contra CTLA-4 10D1 (Medarex) intravenosamente. Os pacientes receberam tratamento antes para melanoma de estágio inicial que incluiu imunoterapia (três pacientes receberam α-interferão, um paciente recebeu uma vacina de gangliósido GM2 misturado com QS- 21), cirurgia (4 pacientes), radiação (2 pacientes), quimioterapia (3 pacientes), e inibidor de proteassoma (1 paciente) . As duas pacientes de cancro do ovário receberam múltiplas quimioterapias. Além disso, todos os pacientes participaram de estudos de vacina da Fase I. Três pacientes de melanoma e ambas de cancro do ovário foram imunizados com células autólogas engenheiradas para segregar GM-CSF. Um destes pacientes também recebeu uma vacina de MUC-1. Três pacientes de melanoma foram imunizados com células dendriticas autólogas engenheiradas para expressar gplOO e MART-1. Um paciente de melanoma foi vacinado com péptido de gplOO e IL-2 de alta dosagem.

Três pacientes de melanoma previamente vacinados com célula de tumor segregando GM-CSF tiveram extensiva necrose tumoral seguida ao tratamento com 10D1. Tecido extirpado de histopatologia de todos os três pacientes mostrou vasos sanguíneos de tumor severamente danificados com infiltrados de linfócitos e granulócitos na proximidade do tumor. Um paciente teve uma massa mediastinica completamente extirpada três meses após o tratamento com 10D1. Os quatro pacientes previamente vacinados com antigénios de melanoma tiveram infiltrados linfociticos na proximidade dos tumores, mas não necrose de tumor. As pacientes com cancro do ovário não passaram por extirpação ou biopsia, mas ambos os pacientes tiveram mudanças favoráveis em níveis sanguíneos de CA-125 (um marcador de tumor para cancro do ovário) em seguida ao tratamento de 10D1. 11 B. Teste de Pacientes com Exposição Natural a Antigénio de Tumor

Catorze pacientes com melanoma de Estágio IV receberam anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em conjunto com vacinação com dois péptidos gplOO num ou mais ciclos de tratamento. Todos os pacientes tiveram cirurgia anterior para seu tumor primário. Seis pacientes tiveram quimioterapia anterior. Onze pacientes tiveram imunoterapia anterior. A resposta clinica foi medida por tomografia axial computadorizada (CT) e formação de imagens por ressonância magnética (MR). Um paciente, que teve cirurgia e quimioterapia anteriores, teve resolução completa de tumores do pulmão, cérebro e subcutâneo após 5 ciclos de tratamento. Dois outros pacientes foram respondedores parciais. Dois pacientes foram não respondedores "misturados" porque algumas lesões encolheram enquanto outras cresceram de tamanho. É possível, porque biopsias de tecido não foram executadas, que o aumento das lesões em não respondedores misturados foi não devido a cancro. Um paciente (Paciente 3), por exemplo, teve resolução de várias lesões do pulmão mas um aumento de gânglios linfáticos mediastínicos. Vasos linfáticos da drenagem dos pulmões para dentro de gânglios linfáticos mediastínicos (Schawartz, et al, Principies of Surgery, 1984, 4a ed., pág. 661); e os gânglios linfáticos podem aumentar como resultado da inflamação nos tecidos com bacia de drenagem dos gânglios linfáticos. É possível que o Paciente 3 fosse um respondedor completo com gânglios linfáticos que aumentaram devido à inflamação, não devido ao cancro.

Com base nos resultados discutidos acima, a presente invenção proporciona um número de utilizações vantajosas de anticorpos anti-CTLA-4. Estes anticorpos proporcionam estimulação imune secundária ou de memória, como demonstrado nos pacientes de cancro anteriormente imunizados ou expostos. Assim, anticorpos anti-CTLA-4 podem 12 ser usados como um reforçador, o que é especialmente útil em pacientes imunocomprometidos. A supressão do sistema imune pode ocorrer a partir de um número de causas, incluindo, mas não limitadas a doença (incluindo doenças de imunodeficiência como VIH), envelhecimento, carga de tumor aumentada, terapêutica de cancro (por exemplo, quimioterapia e radiação), bem como outras causas. A terapêutica de anticorpo anti-CTLA-4 é portanto indicada para reforçar a imunidade em indivíduos imunocomprometidos. C. Testes de macacos com anticorpo anti-CTLA-4 e vacina contra melanoma

Macacos cinomolgos foram tratados com vacina contra melanoma em separado ou vacina contra melanoma e anticorpo anti- CTLA-4 10D1 nos dias 0, 28, 56, 84 e 140. A utilização de anticorpo anti-CTLA-4 em combinação com a vacina resultou numa resposta de anticorpo significativamente maior contra células de melanoma do que a utilização da vacina em separado. Além disso, estudos de proliferação de células T demonstraram que o tratamento com anticorpo anti-CTLA-4 e vacina teve como resultado proliferação específica contra antigénio de células CD8+ e CD4+. Os níveis plasmáticos do anticorpo anti-CTLA-4 permaneceram acima de níveis detectáveis para todo o período de 160 dias. A concentração média do plasma permaneceu acima de 20 pg/ml durante o estudo de seis meses.

Este estudo mostrou que a dosagem crónica de anticorpo anti-CTLA-4 em primatas é segura e que níveis plasmáticos detectáveis podem ser mantidos durante um período de seis meses. D. Teste de pacientes com melanoma avançado com anticorpo anti-CTLA-4 A dezassete pacientes com melanoma avançado foi administrada uma dose única de anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em 3 mg/kg intravenosamente. Nove pacientes tiveram 13 imunoterapia anterior, seis tiveram terapêutica de radiação anterior e cinco tiveram quimioterapia anterior. Os níveis plasmáticos de anticorpo anti-CTLA-4 permaneceram detectáveis durante até quatro meses. Dois pacientes tiveram uma resposta parcial, incluindo resolução de três massas de tecido macio e uma redução maior que 50% numa massa de pulmão num paciente vacinado anteriormente. Este estudo mostrou que níveis plasmáticos podem permanecer acima de níveis detectáveis durante até quatro meses num paciente humano seguindo a uma dose única de anticorpo anti-CTLA-4. Além disso, a redução da massa de pulmão vista no paciente vacinado anteriormente demonstrou que o anticorpo contra CTLA-4 pode activar uma resposta de memória preexistente ao tumor. E. Teste de pacientes com cancro de próstata avançado com anticorpo anti-CTLA-4 A catorze pacientes com cancro de próstata avançado foi administrada uma dose única de anticorpo anti-CTLA-4 monoclonal humano 10D1 em 3,0 mg/kg intravenosamente. Os níveis plasmáticos do anticorpo anti-CTLA-4 estiveram presentes durante até quatro meses. As reduções em antigénio específico da próstata (PSA) e alívio sintomático foram notados. Com a excepção de erupção cutânea e prurido, que foram irreversíveis, não houve efeitos imunes adversos.

Estas e outras vantagens da invenção são explicadas em mais pormenores abaixo e nos Exemplos.

Excepto quando for indicado, os termos "paciente" ou "indivíduo" são usados intercambiavelmente e referem-se a mamíferos tais como pacientes humanos e primatas não humanos, bem como animais experimentais tais como coelhos, ratos, e ratinhos, e outros animais. Animais incluem todos vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como ovelha, cães, vacas, galinhas, anfíbios, e répteis. O termo "tratar" inclui a administração dos compostos ou agentes da presente invenção para impedir ou retardar o 14 início dos sintomas, complicações ou indícios bioquímicos de uma doença, aliviando os sintomas ou interrompendo ou inibindo o desenvolvimento adicional da doença, condição, ou distúrbio (por exemplo, doença auto-imune). 0 tratamento pode ser profiláctico (para impedir ou retardar o início da doença, ou para impedir a manifestação de sintomas clínicos ou subclínicos da mesma) ou supressão ou alívio terapêutico de sintomas após a manifestação da doença. 0 termo "cancro avançado" significa cancro que não mais está localizado no sítio do tumor primário, ou um cancro que é Estágio III ou IV de acordo com o Comité da Junta Americana sobre Cancro ([American Joint Committee on Câncer] AJCC).

Em geral, a frase "bem tolerado" refere-se à ausência de mudanças adversas no status de saúde que ocorre como um resultado do tratamento e afectaria decisões de tratamento. 0 termo "linfócito" como é usado no presente documento tem o significado normal na técnica, e refere-se a qualquer um dos leucócitos mononucleares, não fagocíticos, encontrados no sangue, linfa, e tecidos linfóides, isto é, linfócitos B e T. A frase "subpopulações de linfócitos T" ou "subconjunto(s) de células T" refere-se a linfócitos T ou células T caracterizadas pela expressão de marcadores superficiais de célula particulares (veja-se Barclay, A. N. e outros (eds.), 1997, The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a edição, Academic Press, Londres, Reino Unido). 0 termo "estável" em referência a células T refere-se ao facto que a frequência ou percentagem de um subconjunto de células T não muda durante o curso ou duração da administração de um agente.

Os termos "antigénio 4 associado a linfócito T citotóxico", "CTLA-4", "CTLA4", "antigénio de CTLA-4" e "CD152" (veja-se, por exemplo, Murata (1999) Am. J. Pathol. 155:453-460) são usados intercambiavelmente, e incluem variantes, isoformas, espécies homólogas de CTLA-4 humano, 15 e análogos tendo pelo menos um epítopo comum com CTLA-4 (veja-se, por exemplo, Balzano (1992) Int. J. Câncer Suppl. 7:28-32). A sequência completa de CTLA-4 é encontrada no N° de acesso do GenBank L15006. 0 termo "epítopo" significa uma proteína determinante capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos usualmente consistem em agrupamentos superficiais activos quimicamente de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e usualmente têm características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distintos em que a ligação ao anterior, mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.

Um "anticorpo" intacto compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfureto. Cada cadeia pesada está compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada está compreendida de três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve está compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve está compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hiper-variabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR) . Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas a partir de terminal amino para terminal carboxilo na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigénio. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação 16 da imunoglobulina a factores ou tecidos hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efectoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico. 0 termo anticorpo inclui porções de ligação por antigénio de um anticorpo intacto que retenha capacidade para ligar a CTLA-4. Exemplos de ligação incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfureto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste num domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados para genes separados, podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permitam aos mesmos serem produzidos como uma única cadeia de proteína na qual as regiões VL e VH se emparelham para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv); veja-se, por exemplo, Bird et al (1988) Science 242:423-426; e Huston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são incluídos por referência ao termo "anticorpo". Fragmentos podem ser preparados por técnicas recombinantes ou clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos. 0 termo "anticorpo de sequência humana" inclui anticorpos que têm regiões variável e constante (se estiverem presentes) derivados de sequências de imunoglobulina de linhas germinais humanas. Os anticorpos de sequência humana da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhas germinais humanas (por exemplo, 17 mutações introduzidas por mutagénese randómica ou especifica ao local in vitro ou por mutação somática in vivo). Tais anticorpos podem ser gerados em animais transgénicos não humanos, isto é, como foi descrito nas Publicações PCT N WO 01/14424 e WO 00/37504. No entanto, o termo "anticorpo de sequência humana", como é usado no presente documento, não é pretendido que inclua anticorpos nos quais as sequências CDR derivadas das linhas germinais de outras espécies de mamiferos, tais como um ratinho, tenham sido enxertadas em sequências de estrutura humana (isto é, anticorpos humanizados).

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação única para um particular epítopo. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única a qual tem regiões variável e constante (se estiverem presentes) derivadas de sequências de imunoglobulina de linhas germinais humanas. Numa forma de realização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma o qual inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgénico, por exemplo, um ratinho transgénico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada. O termo "anticorpo policlonal" refere-se a uma preparação de mais de 1 (dois ou mais) anticorpos diferentes para CTLA-4 humano. Tal preparação inclui a ligação de anticorpos a uma faixa de diferentes epítopos.

Os anticorpos contra CTLA-4 podem ligar-se a um epítopo em CTLA- 4 humano de modo a inibir CTLA-4 de interagir com contra-receptor B7 humano. Devido à que a interacção de CTLA-4 humano com B7 humano transduz um sinal que leva à 18 inactivação de células T que possuem o receptor de CTLA-4 humano, o antagonismo da interacção efectivamente induz, aumenta ou prolonga a activação de células T que possuem o receptor de CTLA-4 humano, prolongando ou aumentando assim uma resposta imune. Os anticorpos anti-CTLA-4 preferidos são descritos, por exemplo, nas patentes US N° 5.811.097; 5.855.887; 6.051.227; nas publicações PCT N° WO 01/14424 e WO 00/37504; e na publicação US N° 2002/0039581 AI. Em particular, o documento WO 01/14424 revela anticorpos anti-CTLA-4 humanos que compreendem uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2. SEQ ID NO: 1

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFS SYTMH WVRQAPGKGLEWVT FISYDGNNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCAR TGWLGPFDY WGQGTLVTVSS SEQ ID NO:2

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVGSSYLA WYQQKPGQAPRLLIY GAFSRAT

GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYGSSPWT FGQGTKVEIK

Estes e outros anticorpos adequados para utilização na presente invenção podem ser preparados de acordo com os métodos que são bem conhecidos na técnica e/ou são descritos nas referências citadas no presente documento. Em configurações preferidas, anticorpos anti-CTLA-4 usados na invenção são "anticorpos humanos" - isto é, anticorpos isolados de um ser humano - ou são "anticorpos de sequência humana" (definidos supra). Por exemplo, a Publicação de Patente Internacional número WO 01/14424 descreve métodos pelos quais anticorpos anti-CTLA-4 de sequência humana são isolados de um ratinho transgénico que foi modificado com genes de anticorpo humano. Estes anticorpos, portanto, 19 embora isolados de um animal não humano, têm sequências de aminoácidos (incluindo sequências de domínio constante e variável) que correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo particularmente preferido, o qual é usado nos Exemplos, infra, é referido aqui como o anticorpo 10D1. Este anticorpo de sequência humana foi descrito anteriormente e está plenamente caracterizado, por exemplo, no documento WO 01/14424. A frase "resposta de célula imune" refere-se à resposta de células do sistema imune a estímulos externos ou internos (por exemplo, antigénio, citocinas, quimiocinas, e outras células) o que produz mudanças bioquímicas nas células imune que têm como resultado a migração de células imune, destruição de células alvo, fagocitose, produção de anticorpos, outros efectores solúveis da resposta imune, e os similares.

Os termos "resposta de linfócito T" e "actividade de linfócito T" são usados aqui intercambiavelmente para referir-se ao componente da resposta imune dependente de linfócitos T (isto é, a proliferação e/ou diferenciação de linfócitos T em linfócitos T auxiliares, exterminadores citotóxicos, ou supressores, a provisão de sinais por linfócitos T auxiliares para linfócitos B que provoquem ou impeçam a produção de anticorpo, a destruição de células alvo específicas por linfócitos T citotóxicos, e a libertação de factores solúveis tais como citocinas que modulem a função de outras células imune). células 0 termo "resposta imune" refere-se à acção coordenada de células que apresentam antigénio de linfócitos, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) que tem como resultado dano selectivo a, destruição de, ou eliminação do corpo humano de agentes patogénicos invasores, células ou tecidos infectados com agentes patogénicos, 20 cancerosas, ou, em casos de inflamação de auto-imunidade ou patológica, células ou tecidos normais.

Os componentes de uma resposta imune podem ser detectados in vitro por vários métodos que são bem conhecidos pelos peritos ordinários na especialidade. Por exemplo, (1) linfócitos T citotóxicos podem ser incubados com células alvo marcadas radioactivamente e a lise destas células alvo detectada pela libertação de radioactividade, (2) linfócitos T auxiliares podem ser incubados com antigénios e células que apresentam antigénios e a sintese e segregação de citocinas medidas por métodos padrões (Windhagen A, et al, 1995, Immunity 2(4):373-80), (3) células que apresentam antigénio podem ser incubadas com antigénio de proteína completo e a apresentação daquele antigénio em MHC detectada por ensaios de activação de linfócito T ou métodos biofísicos (Harding et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei., 86:4230-4), (4) mastócitos podem ser incubados com reagentes que reticulem seus receptores Fc-epsilon e libertação de histamina medida por imunoensaio enzimático (Siraganian, et al, 1983, TIPS 4:432-437).

Similarmente, os produtos de uma resposta imune num organismo modelo (por exemplo, ratinho) ou num paciente humano também podem ser detectados por vários métodos que são bem conhecidos pelos peritos ordinários na especialidade. Por exemplo, (1) a produção de anticorpos em resposta a vacinação pode ser prontamente detectada por métodos padrões correntemente em utilização em laboratórios clínicos, por exemplo, um ELISA; (2) a migração de células imune para locais de inflamação pode ser detectada por meio da raspagem da superfície da pele e colocação num recipiente estéril para capturar as células que migram através do local da raspagem (Peters et al, 1988, Blood 72:1310-5); (3) a proliferação de células mononucleares de sangue periférico em resposta a reacção de mitogénios ou de linfócitos misturados pode ser medida usando 3H- 21 timidina; (4) a capacidade fagocítica de granulócitos, macrófagos, e outros fagócitos em PBMCs pode ser medida por meio da colocação de PMBCs em poços juntos com partículas marcadas (Peters et al, 1988); e (5) a diferenciação de células do sistema imune pode ser medida por meio da marcação de PBMCs com anticorpos para moléculas CD tais como CD4 e CD8 e medição da fracção dos PBMCs que expressam estes marcadores.

Por conveniência, as respostas imunes são frequentemente descritas na presente invenção como sendo respostas imunes "primárias" ou "secundárias". Uma resposta imune primária, a qual também é descrita como uma resposta imune "protectora", refere-se a uma resposta imune produzida num indivíduo como um resultado de alguma exposição inicial (por exemplo, a "imunização" inicial) a um particular antigénio. Tal imunização pode ocorrer, por exemplo, como o resultado de alguma exposição natural ao antigénio (por exemplo, a partir da infecção inicial por algum agente patogénico que exiba ou apresente o antigénio) ou a partir de antigénio apresentado por células de cancro de algum tumor no indivíduo (por exemplo, um tumor extirpado). Alternativamente, a imunização pode ocorrer como um resultado da vacinação do indivíduo com uma vacina que contém o antigénio. Por exemplo, a vacina pode ser uma vacina contra um agente patogénico particular (por exemplo, contra um vírus, uma bactéria, ou um parasita) ou pode ser uma vacina contra o cancro que compreende um ou mais antigénios de uma célula de cancro.

Uma resposta imune primária pode tornar-se enfraquecida ou atenuada com o tempo e pode até mesmo desaparecer ou pelo menos tornar-se tão atenuada que não possa ser detectada. Consequentemente, a presente invenção também refere-se a uma resposta imune "secundária", a qual também é descrita aqui como uma "resposta imune de memória". 0 termo resposta imune secundária refere-se a uma 22 resposta imune produzida num indivíduo após uma resposta imune primária já ter sido produzida. Assim, a resposta secundária ou imune pode ser produzida, por exemplo, para reforçar uma resposta imune existente que tenha se tornado enfraquecida ou atenuada, ou para recriar uma resposta imune anterior que tenha desaparecido ou não possa mais ser detectada. Um agente que pode ser administrado para produzir uma resposta imune secundária é depois denominado como um "reforçador" uma vez que o agente pode ser dito a "reforçar" a resposta imune primária.

Como um exemplo, e não como uma limitação, uma resposta imune secundária pode ser provocada por meio da reintrodução no indivíduo de um antigénio que tenha provocado a resposta imune primária (por exemplo, por meio da re-administração de uma vacina). No entanto, uma resposta imune secundária para um antigénio pode também ser provocada por meio da administração de outros agentes que possam não conter o antigénio real. Por exemplo, a presente invenção proporciona métodos para potencializar uma resposta imune secundária por meio da administração de um anticorpo anti-CTLA-4 a um indivíduo. Em tais métodos, o antigénio real não precisa necessariamente ser administrado com o anticorpo anti-CTLA-4 e a composição que contém o anticorpo anti-CTLA-4 não precisa necessariamente conter o antigénio. A resposta imune secundária ou de memória pode ser uma resposta humoral (de anticorpo) ou uma resposta celular. Uma resposta humoral secundária ou de memória ocorre mediante estimulação de células B de memória que foram geradas na primeira apresentação do antigénio. As reacções de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) são um tipo de resposta imune secundária ou de memória celular que é mediada por células CD4+. Uma primeira exposição a um antigénio prepara o sistema imune e uma exposição ou exposições adicionais têm como resultado uma DTH.

Como é usado no presente documento, a frase "receptor 23 de superfície celular" inclui moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana de plasma de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície de célula" da presente invenção é o receptor de célula T (TCR) ou os ligandos B7 de CTLA-4. 0 termo "activação de célula T não específica" refere-se à estimulação de células T independente de sua especificidade antigénica.

Como é usado no presente documento, o termo "célula efectora" refere-se a uma célula imune a qual está envolvida na fase efectora de uma resposta imune, em oposição às fases cognitiva e de activação de uma resposta imune. Células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (por exemplo, células B e células T incluindo células T citolíticas (CTLs)), células exterminadoras, células exterminadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulócitos, mastócitos, e basófilos. Células efectoras expressam receptores Fc específicos e executam funções imunes específicas. Uma célula efectora pode induzir citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), por exemplo, um neutrófilo capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, e linfócitos os quais expressam FcaR estão envolvidos na destruição específica de células alvo e apresentação de antigénios a outros componentes do sistema imune, ou ligação a células que apresentem antigénios. Uma célula efectora também pode provocar fagocitose de um antigénio alvo, de uma célula alvo, ou de um microorganismo. "Célula alvo" deve significar qualquer célula indesejável num indivíduo (por exemplo, um ser humano ou animal) que possa ser direccionada por uma composição (por exemplo, um anticorpo de sequência humana ou um anticorpo monoclonal humano da invenção, uma molécula bi-especifica ou multi-especifica da invenção) . A célula alvo pode ser uma célula que expressa ou sobreexpressa CTLA-4 humano. As células que expressam CTLA-4 humano podem incluir células de tumor, por exemplo linfornas.

Também incluídos na invenção estão anticorpos modificados. 0 termo "anticorpo modificado" inclui anticorpos, tais como anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados os quais foram modificados por meio de, por exemplo, eliminação, adição, ou substituição de porções do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo pode ser modificado por meio da eliminação da região constante e substituindo-a com uma região constante pretendida a aumentar a semivida, por exemplo, semivida em soro, estabilidade ou afinidade do anticorpo. Os conjugados de anticorpo da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica ou criar uma resposta biológica (por exemplo, para recrutar células efectoras). A fracção de fármaco não é para ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a fracção de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido que possui uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente activa, ou fragmento activo da mesma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina de difteria; uma proteína tal como um factor de necrose tumoral ou alfa-interferão; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de colónia de macrófago de granulócito ("GM-CSF"), factor estimulante de colónia de granulócito ("G-CSF"), ou outros factores de crescimento. Técnicas para conjugação de tal fracção terapêutica a anticorpos são bem conhecidas, veja-se, por exemplo, Arnon 25 et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al (eds.), págs. 243-256 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al (eds.), págs. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987): Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibodies-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

TRATAMENTO DE CANCRO O bloqueio de anticorpos contra CTLA-4 pode intensificar a resposta imune de memória ou secundária a células cancerosas no paciente. Os anticorpos para CTLA-4 podem ser combinados com um agente imunogénico, tais como células cancerosas, antigénios de tumor purificados (incluindo proteínas, péptidos, e moléculas de hidratos de carbono recombinantes), células, e células transfectadas com genes que codificam citocinas estimuladoras imunes e antigénios de superfície celular tais como B7 (veja-se, por exemplo, Hurwitz, A. et al (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1998; 95:10067-10071), ou usados em separado, para estimular a imunidade.

O bloqueio de CTLA-4 é eficaz ao seguir um protocolo de vacinação. Muitas estratégias experimentais para vacinação contra tumores têm sido imaginadas (veja-se Rosenberg, S., 2000, Development of Câncer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO 26

Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational. Book Spring: 730-738; veja-se também Restifo, N. e Sznol, M., Câncer Vaccines, cap. 61, págs. 3023-3043 em DeVita, V. et al (eds.), 1997, Câncer: Principies and Practice of Oncology, Quinta Edição). Numa destas estratégias, uma vacina é preparada usando células tumorais autólogas ou alogénicas. Estas vacinas celulares mostraram-se a ser o mais efectivas quando as células tumorais sofrem transdução para expressar GM-CSF. GM-CSF mostra-se como sendo um potente activador de apresentação de antigénio para vacinação contra tumor (Dranoff et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1993; 90:3539-43). O bloqueio de anti-CTLA-4 para reforçar vacinas de células de tumor modificadas por GM-CSF melhora a eficácia de vacinas num número de modelos experimentais de tumores tais como carcinoma mamário (Hurwitz et al, 1998, supra), cancro de próstata primário (Hurwitz et al, Câncer Research 2000; 60:2444-8) e melanoma (van Elsas et al, J. Exp. Med. 1999, 190:355-66). Nestes casos, os tumores não imunogénicos, tais como o melanoma B16, foram tornados susceptíveis a destruição pelo sistema imune. A vacina de célula tumoral também pode ser modificada para expressar outros activadores imune tais como IL2, e moléculas co-estimuladoras, entre outras. O estudo da expressão de gene e padrões de expressão de gene em larga escala em vários tumores levou à definição dos denominados "antigénios específicos tumorais" (Rosenberg, Immunity 1999; 10:281-7). Em muitos casos, estes antigénios específicos tumorais são antigénios de diferenciação expressos nos tumores e na célula a partir da qual o tumor surge, por exemplo antigénios de melanócito gplOO, antigénios MAGE, Trp-2. Mais importante, muitos destes antigénios podem ser mostrados como sendo os alvos de células T específicas tumorais encontradas no hospedeiro. O bloqueio de CTLA-4 pode ser usado como um 27 agente reforçador em conjunto com vacinas baseadas em versões recombinantes de proteínas e/ou péptidos descobertos a serem expressos num tumor para potencializar uma resposta imune secundária ou de memória para estas proteínas. Estas proteínas são normalmente vistas pelo sistema imune como auto-antigénios e são portanto tolerantes aos mesmos. 0 antigénio tumoral também pode incluir a telomerase de proteína, a qual é requerida para a síntese de telómeros de cromossomas e a qual é expressa em mais de 85% de cancros humanos e em somente um número limitado de tecidos somáticos (Kim et al, Science 1994; 266:2011-2013). Estes tecidos somáticos podem ser protegidos de ataque imune por vários meios. Antigénio tumoral também pode ser "neo-antigénios" expressos em células de cancro devido a mutações somáticas que alteram a sequência da proteína ou criam proteínas de fusão entre duas sequências não relacionadas (isto é, bcr-abl no cromossoma Philadelphia), ou idiotipo de tumores de célula B. Outras vacinas tumorais podem incluir as proteínas de vírus implicados em cancros humanos tais como um Vírus de Papiloma Humano (HPV), Vírus de Hepatite (HBV e HCV) e Vírus de Sarcoma de Herpes de Kaposi (KHSV) . Uma outra forma de antigénio específico tumoral que pode ser usada em conjunto com bloqueio de CTLA-4 são proteínas de choque térmico purificadas (HSP) isoladas do próprio tecido tumoral. Estas proteínas de choque térmico contêm fragmentos de proteínas das células tumorais e estas HSPs são altamente eficientes na libertação a células que apresentam antigénio para produzir imunidade tumoral (Suot e Srivastava, Science 1995; 269:1585-1588; Tamura et al, Science 1997, 278:117-120.

As células dendríticas (DC) são potentes células que apresentam antigénio que podem ser usadas para preparar respostas específicas contra antigénio. As DCs podem ser produzidas ex vivo e carregadas com vários antigénios de 28 proteína e péptido bem com extractos de célula tumoral (Nestle et al, Nature Medicine 1998; 4:238-332) . As DCs também podem passar por transdução por meios genéticos para expressar estes antigénios tumorais também. As DCs também foram fundidas directamente a células tumorais para os propósitos de imunização (Kugler et al, Nature Medicine 2000; 6:332-336). Como um método de vacinação, imunização com DC pode ser efectivamente intensificada com bloqueio de CTLA-4 para activar resposta anti-tumoral mais potente.

Um outro tipo de vacina contra melanoma que pode ser combinada com bloqueio de CTLA-4 é uma vacina preparada a partir de um lisato de linha de célula de melanoma, em conjunto com um adjuvante imunológico, tal como a vacina MELACINE®, uma mistura de lisatos de duas linhas de células de melanoma humano mais adjuvante imunológico DETOX®. O tratamento com vacina pode ser intensificado com anti-CTLA-4, com ou sem tratamento quimioterápico adicional. O bloqueio de CTLA-4 também pode ser usado para reforçar imunidade induzida através de tratamentos padrões de cancro. Nestes casos, pode ser possível reduzir a dose do reagente quimioterápico administrado (Mokyr et al, Câncer Research, 1998; 58:5301-5304). O racionamento científico por trás da utilização combinada de bloqueio de CTLA-4 e quimioterapia é que a morte celular, que é uma consequência da acção citotóxica da maioria dos compostos quimioterápicos, deve resultar em níveis aumentados de antigénio tumoral na via de apresentação do antigénio. Portanto, CTLA-4 pode reforçar uma resposta imune preparada para libertação quimioterápica de células tumorais. Além disso, a actividade imunoestimuladora de CTLA-4 é útil para superar os efeitos imunossupressores da quimioterapia. Exemplos de agentes quimioterápicos com os quais o tratamento anti-CTLA-4 pode ser combinado incluem, mas não estão limitados a, aldesleucina, altretamina, amifostina, asparaginase, bleomicina, capecitabina, carboplatina, 29 carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorubicina, dronabinol, epoetina alfa, etoposideo, filgrastima, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, granisetron, hidroxiureia, idarubicina, ifosfamida, alfa interferão, irinotecan, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazol, ondansetron, paclitaxel (Taxol®), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, tamoxifen, taxol, hidrocloreto de topotecan, trastuzumab, vinblastina, vincristina e tartrato de vinorelvina. Para o tratamento de cancro de próstata, um agente quimioterápico preferido com o qual anti-CTLA-4 pode ser combinado é paclitaxel (Taxol®). Para o tratamento de cancro de melanoma, um agente quimioterápico preferido com o qual anti-CTLA-4 pode ser combinado é dacarbazina (DTIC).

Outras terapêuticas de combinação que podem ter como resultado a preparação do sistema imune por morte celular são radiação, cirurgia, e privação hormonal (Kwon, E. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1999; 96 (26): 15074- 9). Cada um destes protocolos cria uma fonte de antigénio tumoral no hospedeiro. Por exemplo, qualquer manipulação do tumor no instante da cirurgia pode aumentar muito o número de células de cancro no sangue (Schwartz, et al, Principies of Surgery 1984, 4a ed. pág. 338) . Inibidores de angiogénese também podem ser combinados com bloqueio de CTLA-4. A inibição de angiogénese leva à morte de célula tumoral o que pode alimentar o antigénio tumoral nas vias de apresentação de antigénio do hospedeiro. Todos estes provocam a libertação de tumor e possível preparação do sistema imune que bloqueio de CTLA-4 pode reforçar. Actualmente não existe vacina efectiva, ou agentes patogénicos para os quais vacinas convencionais são menos que completamente efectivas. Isto inclui, mas não está 30 limitado a VIH, Hepatite (A, B e C), Influenza, Herpes, Giardia, Malária, Leishmania, Staphylococcus aureus, e Pseudomonas aeruginosa. O bloqueio de CTLA-4 é particularmente útil para reforçar a imunidade contra infecções estabelecidas por agentes tais como VIH que apresentam antigénios alterados durante o curso das infecções. Estes novos epítopos são reconhecidos como estranhos no instante da administração de anti-CTLA-4 humano, provocando assim uma forte resposta de célula T que não é amortecida por sinais negativos por CTLA-4.

Alguns exemplos de vírus patogénicos que provocam infecções tratáveis por métodos da invenção incluem hepatite (A, B ou C) , vírus de herpes (por exemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV- II, e CMV, vírus de Epstein Barr) , adenovírus, vírus invluenza, flavivírus, ecovírus, rinovírus, vírus coxsackie, cornovírus, vírus sincicial respiratório, vírus da malária, rotavírus, vírus do sarampo, vírus de rubéola, parvovírus, vírus da vaccinia, vírus HTLV, vírus da dengue, papilomavírus, vírus Molluscum, poliovírus, vírus da raiva, vírus JC e vírus de encefalite arboviral.

Alguns exemplos de bactéria patogénica que causa infecções tratáveis por métodos da invenção incluem clamidia, bactéria riquétsia, micobactéria, estafilococo, estreptococo, pneumonococo, meningococo e conococo, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétano, botulismo, antrax, peste, leptospirose, e bactéria de doença de Lyme.

Alguns exemplos de fungos patogénicos que causam infecções tratáveis por métodos da invenção incluem Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Genus Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizophus) , Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis e 31

Histoplasma capsulatum.

Alguns exemplos de parasitas patogénicos que causam infecções tratáveis por métodos da invenção incluem Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp, Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.

Promoção de Reacções "Auto-imune" Benéficas A capacidade de anticorpos anti-CTLA-4 para provocar e amplificar respostas auto-imune tem sido documentada num número de sistemas experimentais (EAE - Experimental Autoimmune encephalomyelitis, um modelo murino para MS (Perrin et al, J. Immunol. 1996; 157:1333-1336); diabetes (Luhder et al, 1998, supra). De facto, a indução de respostas anti-tumorais usando células tumorais e vacinas de péptido revela que muitas respostas anti-tumorais envolvem reactividades anti-auto (despigmentação observada em melanoma de anti-CTLA-4 + B16 modificado por GM-CSF em van Elsas et al, supra; despigmentação em ratinho vacinado com Trp-2 (Overwijk et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 1999 96:2982-2987); prostatite auto-imune provocada por vacinas de célula tumoral de TRAMP (Hurwitz 2000, supra), vacinação de antigénio de péptido de melanoma e vitiligo observados em experiências clínicas humanas (Rosenberg e White, J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 1996; 19:81-4).

Portanto, é possível considerar usar a intensificação de anti-CTLA-4 em conjunto com várias auto-proteínas para idealizar protocolos de vacinação para gerar eficientemente respostas imunes contra estas auto- proteínas para o tratamento de doença. Por exemplo, a resposta neutralizadora de anticorpo a hormonas e outros factores solúveis que são requeridos para o desenvolvimento de tumores particulares podem ser consideradas como possíveis alvos de vacinação. 32

EXEMPLOS A presente invenção também é descrita por meio dos seguintes exemplos. No entanto, a utilização destes ou de outros exemplos em qualquer lugar na memória descritiva é ilustrativa somente e de nenhuma forma limita o âmbito e significado da invenção ou de qualquer termo exemplificado. Do mesmo modo, a invenção não está limitada a quaisquer configurações particulares preferidas descritas no presente documento. De facto, muitas modificações e variações da invenção podem ser aparentes àqueles experientes na técnica mediante a leitura desta memória descritiva e podem ser feitas sem se desviar de seu espirito e âmbito. A invenção deve portanto ser limitada somente pelos termos das reivindicações anexas junto com o âmbito completo de equivalentes aos quais as reivindicações têm direitos. Exemplo 1: Tratamento Anti-CTLA-4 Intensifica Respostas Secundárias de Anticorpo e Célula T a uma Vacina de Célula de Melanoma em Macacos Cinomolgos A capacidade de um anticorpo anti-CTLA-4 humano da invenção para reforçar respostas de anticorpo e de célula T a uma vacina de célula de melanoma foi examinada em macacos cinomolgos (obtidos de Primate Products, Miami, Flórida). Grupos de teste de seis macacos cada (três machos, três fêmeas) foram tratados com 1) uma vacina de célula de melanoma em separado (SK-mel-3, uma linha de célula de tumor melanoma humano transfectada para expressar GM-CSF) ou 2) tanto SK-mel-3 quanto o anticorpo 10D1 de anti-CTLA-4 descrito no documento WO 01/14424. Uma vacina de célula completa permitiria a investigação de reacções auto-imune para uma variedade de tecidos normais neste modelo de animal, a despeito do facto que a vacina celular fosse de origem humana.

Para preparar a vacina, células SK-mel foram cultivadas para confluência e colhidas. As células foram tratadas com mitomicina C, lavadas várias vezes e 33 ressuspensas a 1 x 107/ml em salmoura. 0 anticorpo foi administrado intravenosamente numa dosagem de 10 mg/kg num volume de 1,3 ml/kg. As células SK-mel-3 foram administradas subcutaneamente numa quantidade fixa (5 x 106 células/animal em 0,5 ml/animal). Cada preparação de vacina foi testada quanto a endotoxina (<2 EU/ml) e produção de GM-CSF após 48 horas (2-8 ng/ml por 106 células). O anticorpo e/ou vacina apropriada foi administrado nos dias 0, 28, 56, 84 e 140. As respostas de anticorpo à vacina de célula de melanoma foram avaliadas nos dias 13, 41, 69 e 97 usando citometria de fluxo. O status de saúde dos macacos foi avaliado duas vezes semanalmente e os pesos corporais foram registados semanalmente. Hematologia, análise farmacocinética e ensaios funcionais foram executados antes do inicio do estudo e periodicamente através de todo o estudo. Um exame macroscópico e microscópico completo foi executado no dia 167.

As especificidades de respostas de anticorpo nos animais tratados com a vacina contra melanoma e o anticorpo anti- CTLA-4 foram examinadas. Plasma de 6 macacos cinomolgos tratados com a vacina SK-mel-3 e o mAb 10D1 foi obtido no dia 41 do tratamento e agrupado. O plasma foi diluído 1:1000 e testado quanto à reactividade para uma variedade de linhas de células de melanoma e não melanoma por citometria de fluxo. Os resultados estão mostrados na Figura 1, a qual demonstra que as respostas de anticorpo nos macacos mostram maior especificidade para linhas de célula de melanoma humano se comparado com linhas de célula de não melanoma humano ou linhas de células não humanas. O efeito de dosagem crónica nos macacos tratados com anticorpo e/ou vacina foi avaliado seguindo a administração de uma dose adicional no dia 140. A concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 foi monitorizada por ELISA com CTLA-4 recombinante em vários pontos no tempo durante o curso do estudo até o dia 160. As concentrações plasmáticas 34 de 10D1 foram determinadas a partir de diluições de amostras analisadas contra uma curva padrão. Os dados para a concentração plasmática de 10D1 durante a dosagem crónica são mostrados na Figura 2 onde a média ± SEM de seis animais tratados é apresentada. Os resultados demonstram que os níveis plasmáticos do anticorpo anti-CTLA-4 permaneceram acima de níveis detectáveis durante todo o curso do período de 160 dias, sugerindo que o bloqueio de CTLA-4 foi mantido através de todo o período de tratamento. A concentração plasmática média para mAb 10D1 nos macacos tratados teve picos entre 175 e 315 pg/ml no dia pós-infusão, e permaneceu acima de 2 0 pg/ml durante o estudo de seis meses. Química clínica, observações ao lado da gaiola, e análise completa da histologia não revelaram quaisquer alterações significativas relacionadas à administração do anticorpo ou da vacina. A dosagem crónica não teve como resultado patologia relacionada ao tratamento excepto por leve irritação no local de injecção da vacina de dois macacos, a despeito da potencial capacidade de bloqueio de CTLA-4 em estabelecer respostas anti-melanócito auto-reactivas. Os macacos não desenvolveram qualquer resposta de anticorpo detectável para mAb de 10D1 e altos níveis de anticorpo circulante activo foram mantidos ao longo da duração do estudo. Além disso, esta dosagem crónica com o anticorpo anti-CTLA-4 foi associada à eficácia de tratamento e não foi associada a efeitos secundários prejudiciais (por exemplo, activação de célula T não específica) . Portanto, esta experiência demonstra que primatas podem ser efectivamente tratados durante períodos extensos de tempo com anticorpo anti-CTLA-4 tal que concentrações plasmáticas sejam mantidas acima de níveis detectáveis durante pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 meses ou até mesmo mais tempo sem efeitos secundários sérios.

Exemplo 2: Evidência de proliferação de células T específicas para antiqénio a partir de experiências de 35 hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) em seres humanos

Dezanove pacientes com melanoma Estágio III (2 pacientes) ou IV (17 pacientes) receberam doses escalonadas (0,3, 1 e 3 mg/kg) de anticorpo CTLA-4 10D1 com cada injecção de vacina de péptidos gpl00/tirosinase/MART-1 com adjuvante de Freund incompleto. Cada um dos péptidos de 368-376 (370D) de tirosinase, 26-35 (27L) de MART-1 e 209- 217 (210M) de gplOO diferiu do tipo selvagem por uma modificação de aminoácido para aumentar a ligação de HLA. A vacina foi administrada oito vezes durante doze meses em 1 mg/dose/péptido. As respostas imunes medidas por reactividade de DTH indicaram que quatro de nove pacientes responderam a gplOO e dois de nove pacientes responderam a MART-1. Ensaios ELISPOT mostraram respostas imunes em quatro de dezasseis pacientes testados usando células T CD8 novas.

Exemplo 3: Resultados de ensaios clínicos em seres humanos de Fase I de melanoma de MAb 10D1 (MDXCTLA4-02) MDXCTLA-4-02 foi um ensaio clinico multicêntrico aberto de Fase I para avaliar a segurança e farmacocinéticos de MAb 10D1 em dezassete pacientes com melanoma maligno, não extirpável, progressivo. A idade média era 59 anos (intervalo de 29-79) . Nove pacientes tinham recebido imunoterapia anterior, seis tinham radiação anterior e cinco tinham quimioterapia anterior. Todos os pacientes receberam uma única dose de 3 mg/kg de 10D1 intravenosamente durante 90 minutos e foram então acompanhados quanto à toxicidade, farmacocinética, activação de células T circulantes e resultado clinico. Todas as infusões foram completadas com somente eventos adversos leves. Sete pacientes tiveram erupções cutâneas ou prurido reversível, leve. Os níveis plasmáticos de anticorpo persistiram de um a quatro meses. Não houve aumento significativo em células T periféricas activadas e nenhuma evidência de auto-imunidade clínica além de erupção 36 cutânea leve. Dois pacientes experimentaram resposta parcial incluindo resolução de três massas de tecido mole e mais de 50% de redução de uma massa de pulmão. Além disso, o paciente que experimentou uma redução superior a 50% em massa do pulmão foi um paciente que anteriormente tinha sido tratado com uma vacina contra melanoma, sugerindo que o tratamento de anticorpo anti- CTLA-4 foi capaz de activar uma resposta de memória preexistente ao tumor. Os resultados deste estudo indicam que o tratamento anti-CTLA-4 foi bem tolerado com evidência clara de actividade imunológica e anti-tumoral. As subpopulações de linfócitos em pacientes tratados com 10D1 foram analisadas por citometria de fluxo em vários pontos no tempo após o tratamento de anticorpo. Os resultados estão sumarizados abaixo no Quadro 1, abaixo.

Quadro 1: Análise citométrica de fluxo de subpopulações de linfócitos em indivíduos com cancro de melanoma tratados com 3,0 mg/kg de MAb 10D1.

Sub-pop Avaliação 24 Horas Dia 1 Dia 14 Dia 21 Dia 28 inicial CD3 72,9 ± 3,6 68, 9 ± 4, 1 75, 1 + 3, 6 73,2 ± 4, 3 74, 7 ± 3, 9 74,2 ± 4, 2 CD4 48, 8 ± 3, 0 44, 3 3, 6 49,3 ± 3, 6 50,5 ± 3, 8 49,2 ± 4, 3 50,8 ± 4, 5 CD 8 22,3 ± 2,5 25, 3 ± 3, 0 26,2 ± 2, 5 21,9 ± 1, 8 26,3 ± 2, 9 23, 7 ± 2, 7 CD19 12,2 ± 2,5 12, 7 ± 3, 0 8,7 ± 2,2 11,3 ± 2, 9 9, 4 t 2,2 9, 4 ± 2,1 CD4 + 65, 8 ± 3,4 64, 9 ± 4, 0 60,8 ± 3, 4 61, 7 ± 3, 0 58,3 ± 3, 0 60,9 ± 2, 9 CD25 CD 8 + 14,4 ± 1, 7 13, 4 ± 1, 8 13,1 ± 1, 9 11,9 ± 1, 6 10,9 ± 1, 3 13, 7 ± 2, 1 CD25 CD4 + 11, 8 ± 1,3 12, 4 ± 1, 7 19,7 + 3, 5 20,9 ± 1, 9 18,4 ± 1, 2 17, 1 ± 1, 6 HLA-DR CD 8 + 13,6 ± 2,2 17, 9 ± 2, 8 17, 7 + 2, 9 17,5 ± 2, 3 20,2 ± 2, 9 17,5 ± 2, 6 HLA-DR CD4 + 23,7 ± 3, 4 22, 9 ± 3, 7 19,4 ± 3, 4 17, 9 ± 3, 8 17,3 ± 3, 7 19,2 ± 3, 8 45R0 37

CD 8 + 40,5 ± 3,5 39,1 ± 3,8 37,6 ± 4,1 35,5 ± 4,9 35,1 ± 5,0 35,7 ± 4,3 45RO

Similar aos resultados observados em pacientes com cancro de próstata (veja-se o Exemplo 6 abaixo), os resultados no estudo de melanoma demonstram que o tratamento com 10D1 levou a um aumento de aproximadamente 50% nas subpopulações de CD4/HLA-DR+ com o tempo. As outras subpopulações de linfócitos permaneceram essencialmente constantes com o tempo. Como foi descrito acima, a capacidade de tratamento de anticorpo anti-CTLA4 para aumentar a subpopulação de CD4/HLA-DR+ com o tempo pode ser usada como uma caracteristica selectiva ao avaliar os anticorpos anti-CTLA4 (isto é, um painel de anticorpos anti-CTLA4 pode ser avaliado quanto a sua capacidade para aumentar a subpopulação de CD4/HLA-DR+ e um anticorpo anti-CTLA4 que seja capaz de aumentar esta subpopulação com o tempo pode ser seleccionado) . Além disso, a monitorização de subpopulações de linfócitos com o tempo, em particular a subpopulação de CD4/HLA-DR+, pode ser realizada em indivíduos a serem tratados com anti-CTLA-4 como um marcador da eficácia do anticorpo.

Exemplo 4: Estudo Humano de Bloqueio de Anticorpo Anti-CTLA-4 em Pacientes com Cancro de Melanoma e de Ovário Vacinados Anteriormente A nove pacientes com cancro avançado imunizados anteriormente foi administrado anticorpo anti-CTLA-4 10D1. Os pacientes 1-6 foram inscritos através da experiência MEXCTLA4- 02 de Fase I com critério de elegibilidade de melanoma de estágio III ou IV não extirpável cirurgicamente, progressão da doença, uma expectativa de vida de pelo menos 2 semanas, função final do órgão adequada, terapia com analgésico estável, e um status de performance de Karnofsky de pelo menos 60%. Os pacientes eram excluídos se tivessem uma segunda malignidade (diferente de cancro de pele não de melanoma tratado ou 38 cancro de bexiga superficial), doença auto- imune, infecção activa, hipersensibilidade a kanamicina; ou se usassem corticosteróides. Os pacientes 7-9 foram inscritos através de uma experiência de Fase I para pacientes com melanoma metastático, carcinoma do ovário metastático, carcinoma de pulmão de não pequenas células metastático ou leucemia mielogenosa aguda.

Quatro pacientes foram anteriormente tratados para melanoma de estágio inicial (três pacientes receberam a-interferão, um paciente recebeu uma vacina de gangliósido GM2 misturada com QS-21, um paciente recebeu radiação). Tratamentos não imunológicos anteriores para melanoma metastático incluíram cirurgia (quatro pacientes), radiação (dois pacientes), quimioterapia (três pacientes), e inibidor de proteossoma (um paciente). As duas pacientes com cancro do ovário receberam múltiplas quimioterapias para doenças recidivas através de todos os três a quatro anos anteriores ao estudo.

Todos os pacientes participaram em estudos de vacina de Fase I para doença metastática antes de entrar neste estudo. Três pacientes de melanoma e ambas de cancro do ovário foram imunizados com células tumorais autólogas, irradiadas, engenheiradas para segregar GM-CSF por transferência de gene mediada por adenovírus. Um destes pacientes (Paciente 8) também recebeu uma vacina MUC-1. Três pacientes de melanoma foram imunizados com células dendríticas autólogas engenheiradas para expressar gplOO e MART-1 por transferência de gene mediada por adenovírus. Um paciente de melanoma foi vacinado com um péptido gplOO modificado e interleucina-2 em dose alta.

Inicialmente, 10D1 foi administrado intravenosamente como uma dose teste de 0,2 mg em 10 ml de salmoura normal durante dez minutos para identificar potenciais reacções de hipersensibilidade. O restante da dose de 3 mg/kg de 10D1 foi então libertado intravenosamente durante noventa 39 minutos. Em seguida à administração do anticorpo, os pacientes passaram por avaliação diária clinica, laboratorial e radiográfica por três dias, então semanalmente por quatro semanas e então mensalmente.

Um paciente tinha uma reacção de hipersensibilidade aguda manifestada por hipotensão leve e náusea durante a infusão. A reacção foi facilmente gerenciada com anti-histaminas e a infusão foi completada sem eventos. Cinco pacientes tiveram sintomas constitucionais de Grau I/II incluindo mialgia, artralgia, anorexia, fadiga, congestão nasal, e tosse por dois a sete dias em seguida à infusão. Um paciente teve sintomas intermitentemente recorrentes durante vários meses. Um paciente manifestou uma anormalidade de função do figado Grau III transiente.

Os três pacientes de melanoma anteriormente vacinados com células tumorais segregando GM-CSF autólogas, irradiadas, tiveram extensiva necrose tumoral em seguida ao tratamento com 10D1. 0 Paciente 1 tinha metástases no sistema nervoso central, pulmão, abdómen e tecidos moles na inscrição no estudo. Um mês em seguida à administração de 10D1, o Paciente 1 exibiu mudanças clinicas em seu status neurológico e uma lesão subcutânea tornou-se agudamente inflamada. 0 Paciente 1 morreu seis dias depois. Na /autópsia, necrose tumoral hemorrágica acentuada foi notada das metástases do cérebro, epidural e visceral. 0 exame histopatológico mostrou extensiva destruição de tumor (pelo menos 90%) com hemorragia. Os vasos sanguíneos do tumor foram severamente danificados resultando em extensiva necrose isquémica. Um rebordo de células tumorais viáveis permaneceu em cada lesão acompanhada por uma reacção de granulócitos e linfócitos. 0 Paciente 2 tinha sintomas constitucionais de Grau II recorrentes que começaram um mês após a infusão de 10D1. A biopsia de uma lesão do mediastino mostrou extensiva necrose tumoral com infiltrados de linfócito e granulócito. A imunohistoquímica 40 mostrou a presença de células T CD4+ e CD8+ e linfócitos CD20+B que produzem imunoglobulina. A lesão do mediastino ficou completamente ressecada dois meses depois. A análise patológica da lesão mostrou fibrose densa, necrose extensiva, e uma resposta de linfócitos e granulócitos em progresso. Uma vasculopatia caracterizada por um infiltrado de linfóide circunferencial na parede de um vaso sanguíneo obstruído também foi notada. A necrose do tumor estava espacialmente relacionada ao dano do vaso. O Paciente 7 desenvolveu inflamação numa grande lesão subcutânea três semanas após a infusão de 10D1. A secção foi extirpada dois meses após a infusão. O exame patológico da lesão mostrou extensiva necrose e fibrose tumorais, uma proeminente vasculopatia, e infiltrados de linfócitos e granulócitos.

Efeitos anti-tumorais menos dramáticos foram notados em quatro pacientes com melanoma anteriormente imunizados com antigénios melanossomais definidos. O Paciente 3 passou por ressecção de uma lesão do mediastino crescente sete meses após a infusão. A análise patológica mostrou um infiltrado linfocítico denso sem necrose tumoral. A imunohistoquímica mostrou a presença de células CD8+, mas não células CD4+ ou CD20+. O Paciente 4 tinha um infiltrado de célula CD4+ similar sem necrose tumoral numa metástase de gânglio linfático, a qual foi extirpada dois meses após a infusão do anticorpo. O Paciente 5 não teve infiltrados de linfóide ou necrose tumoral numa lesão subcutânea, a qual foi extirpada dois meses após a infusão do anticorpo. O Paciente 6 não teve uma biopsia e seu tumor progrediu. A infusão de anticorpo teve como resultado mudanças nos níveis de CA-125 nas duas pacientes de carcinoma do ovário. CA-125 desprende-se da superfície de células de carcinoma do ovário e é um marcador útil de status de doença (Jacobs, I. (1994) Byn. Oncol. 55:S22-27). O Paciente 8 teve uma redução de 43% em valores de CA-125 (230 a 132) que começou dois meses após a infusão de 41 anticorpo. Esta resposta não foi mantida, mas uma segunda infusão de 10D1 estabilizou os níveis de CA-125 por dois meses. 0 Paciente 9 teve um desnivelamento de valores de CA-125 um mês em seguida à infusão de anticorpo com uma redução concomitante em ascite. 0 Paciente 9 teve CA-125 crescendo rapidamente antes da infusão.

Baixas titulações de anticorpos (anticorpos anti-nucleares, anticorpos anti-tiroglobulina, factor reumatóide) que persistiram por 1-2 meses foram notadas em quatro pacientes. Não houve evidência clínica de doença auto- imune.

Todos os pacientes de melanoma desenvolveram erupção cutânea reticular e eritomatosa de Grau I assintomática no peito e extremidades entre três dias e três semanas após a infusão de anticorpo. Sete pacientes tiveram uma biopsia de pele. Cinco dos sete pacientes que passaram por biopsia tiveram infiltrados de células T peri-vasculares proeminentes na derme superficial que se estenderam para dentro da epiderme. As células T CD4+ e CD8+ foram descobertas apostas a melanócitos que estavam a morrer. 0 vitiligo não era clinicamente evidente. Hipopigmentação focal, leve, da retina foi notada num paciente, mas a acuidade visual não foi afectada. Uma paciente de carcinoma do ovário desenvolveu uma erupção cutânea eritomatosa na face e peito duas semanas após a infusão. A biopsia da pele mostrou infiltrados de células T peri- vasculares na derme superficial, mas nenhuma reactividade contra melanócitos. 10D1 induziu aumentos significativos em neutrófilos circulantes, e infiltrados de neutrófilo foram associados a necrose tumoral.

Os resultados mostram que uma infusão única de anticorpo anti-CTLA-4 10D1 pode ter efeitos anti-tumorais significativos e pode ser seguramente administrada a pacientes humanos. A geração de baixas titulações de anticorpos mostra que a terapia pode, pelo menos 42 parcialmente, comprometer a tolerância sistémica mas nenhuma evidência clinica de doença auto-imune foi notada. Exemplo 5: Estudo de Administração de Anticorpo Anti- CTLA— 4 lODl em Conjunto com Vacinas de Péptido a Pacientes com Melanoma

Catorze pacientes com melanoma de Estágio IV progressivo receberam anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em conjunto com vacinação com dois péptidos GP100 restritos de HLA-A*0201. As características dos pacientes estão sumarizadas no Quadro 2 abaixo. QUADRO 2

Paciente Idade / Sexo Locais de doença Terapêut. anterior1 N° de ciclos de tratam. Resposta2 (meses) Toxicidade Grau I/II Toxicidade Grau III/IV 1 52/M Pulmão I, S 2 PR(10+) Enterocolite , dermatite 2 40/F Gânglio linfático supraclavicular c, I, S 1 NR Vitiligo Dermatite 3 39/M Pulmão, Mediastino, Subcutâneo S 6 NR (mist.) 4 55/F Pele, Subcutâneo I, s I NR Infiltrados pulmonares 5 67/M Fígado, Retroperitoneu, Subcutâneo C, I, R, S 4 NR A.NA+4 6 59/M Pulmão, Subcutâneo I, s 4 NR Vitiligo 7 48/M Pulmão, cérebro, ad-renal, Subcutâneo c, I, s 2 NR 43 48/Μ Pulmão, Fígado, C, I, S 2 NR Adrenal, Mesentério, Subcutâneo 44 (continuação)

Paciente Idade / Sexo Locais de doença Terapêut. anteriorl N° de ciclos de tratam. Resposta2 (meses) Toxicidade Grau I/II Toxicidade Grau III/IV 9 53/M Mediastino, Mesentério, Pele I, R, S 2 NR 10 62/M Pulmão, Hilo C, I, S 2 NR (mist.) 11 54/M Pulmão, Cérebro, Subcutâneo c, S 5 CR(7+) Hipofisite 12 43/M Subdiafragma, Músculo, Subcutâneo I, s 3 NR ANA+ Hepatite 13 49/F Pulmão, Subcutâneo C, I, s 4 PR(6+) Dermatite 14 63/M Pulmão, Gânglio Linfático Pélvico s 4 NR 1 C = quimioterapia, I = imunoterapia, R = radioterapia, S = cirurgia. 2 Um ciclo de tratamento consiste numa infusão de anticorpo contra CTLA-4 e uma vacinação com péptidos gplOO:209-217 (210M) e gpl00:280-288 (288V). 3 NR = nenhuma resposta, PR = resposta parcial, CR = resposta completa 4 ANA = anticorpo anti-nuclear.

Todos os pacientes eram HLA*0201+ com um status de performance Karnofsky > 60%. Seis pacientes tiveram metástases viscerais. Os pacientes não tiveram evidência de doença auto-imune ou de imunodeficiência. Todos os pacientes tiveram cirurgia anterior para sua lesão primária. Seis pacientes tiveram quimioterapia anterior. Onze pacientes tiveram imunoterapia anterior incluindo interferão-α (Pacientes 2, 5-8, 10, 12 e 13), IL-2 de dose baixa (Pacientes 2, 5 e 13), IL-2 intravenosa de dose alta (Pacientes 4, 7 e 8), vacinas de melanoma de célula completa (Pacientes 1, 2 e 6), vacina de péptido NY-ESO-1 (Pacientes 4 e 5), e GM-CSF (Paciente 9) . Os pacientes não 45 tiveram imunização de gplOO anterior e nenhuma terapia sistémica nas três semanas antes do tratamento.

Um ciclo de tratamento foi administrado a cada três semanas, o qual consistiu em anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em 3 mg/kg administrados intravenosamente durante 90 minutos seguido por 1 mg de péptido gplOO:209-217 (210M) (IMDQVPFSV) emulsificado em adjuvante de Freund incompleto (IFA) injectado subcutaneamente numa extremidade e 1 mg de péptido gplOO:280-288 (288V) (YLEPGPVTV) emulsificado em IFA injectado subcutaneamente numa segunda extremidade (péptidos sintéticos proporcionados pelo Programa de Avaliação de terapêutica de Cancro do Instituto Nacional do Cancro). Os pacientes passaram por aférese antes do tratamento e três semanas em seguida à cada dois ciclos de tratamento. As células mononucleares de sangue periféricas (PBMC) foram isoladas por separação de Ficoll-Hypaque e criopreservadas em soro AB humano inactivado termicamente com 10% de sulfóxido de dimetilo e armazenadas a -180°C até utilização adicional. Os pacientes receberam de 1 a 6 ciclos de tratamento (Quadro 2) . A resposta clinica foi avaliada usando tomografia axial computadorizada (CT) do peito, abdómen e pelve; e formação de imagens por ressonância magnética (MRI) do cérebro. Estes estudos de formação de imagem foram executados dentro de 4 semanas do inicio do tratamento e então após cada dois ciclos de tratamento. Estudos radiológicos adicionais foram usados à medida do necessário para avaliar locais de doença. A soma dos diâmetros mais longos dos tumores em cada paciente (critérios de RECIST da Organização Mundial de Saúde) foi calculada antes e após o tratamento. Uma resposta parcial foi definida como uma diminuição de pelo menos 30%, mas inferior a 100% na soma dos diâmetros mais longos de todas as metástases avaliáveis durando pelo menos um mês, e sem tumores novos ou crescentes. Uma resposta completa foi definida como uma diminuição de 100% na soma dos diâmetros 46 mais longos de todas as metástases avaliáveis durando pelo menos um mês, e nenhum novo tumor. Uma não resposta foi definida como uma resposta que não foi uma resposta parcial ou uma completa. Os pacientes foram avaliados quanto a respostas auto-imunes. Os pacientes receberam um exame oftalmológico antes do tratamento e três meses em seguida ao início do tratamento. Todos os pacientes tiveram testes de sangue de soro negativo antes do início do estudo para tiroglobulina Ab, factor reumatóide e anticorpo anti-nuclear. Ab anti-humano humano (anti-idiotípico), taxa de sedimentação de eritrócitos, Ab anti-nuclear, hormona estimuladora da tiróide e níveis de T4 livre foram medidos a cada três semanas durante o estudo.

As concentrações plasmáticas de 10D1 foram determinadas usando ELISA padrão com poços de micro-titulação revestidos com CTLA-4-Ig (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota). As diluições de amostras de plasma foram incubadas nas placas. Ab anti-CTLA-4 limite foi detectado com sonda específica para IgG F(ab) anti-humano de cabra marcado com fosfatase alcalina, que foi desenvolvido com substrato p-NPP.

Um ensaio de sensibilização in vitro de doze dias, o qual é mais sensível que ensaios de ELISPOT ou tetrámero, foi usado para avaliar reactividade imunológica em todos onze pacientes com PBMC disponível para teste (Rosenberg, S. A. et ai, Nat. Med. 1998; 4:321-327). PBMC criopreservadas foram descongeladas e cultivadas em meio base de Iscove com soro AB humano inactivado termicamente a 10% com 1 μΜ de péptido nativo gplOO: 209-217 ou gpl00:280-288 e 300 IU/ml de IL-2. As células foram colhidas 11 a 13 dias após início da cultura e co-incubadas com células tumorais ou células T2 pulsadas com péptido durante a noite. A libertação de interferão-γ (IFN-γ) no sobrenadante foi medida usando ensaios ELISA comerciais (Pierce-Endogen, Rockford, Illinois). Todos os onze pacientes exibiram 47 imunização com sucesso contra o péptido nativo gpl00:209-217 após um a quatro ciclos de tratamento. Seis pacientes foram imunizados com sucesso contra o péptido nativo gplOO:280-288.

Análises de citometria de fluxo foram executadas após o bloqueio de receptor Fc e coloração com anticorpos (BD Biosciences, San Diego, Califórnia) ou tetrámeros (Beckman Coulter Immunomics, San Diego, Califórnia). A expressão de marcador de superfície em PBMC de nove pacientes antes e após dois ciclos de tratamento foi comparada. A expressão de HLA-DR (um marcador de activação) foi significativamente aumentada em células CD3+CD4+ pós-terapia (P=0,0004; teste t emparelhado) e células CD3+CD4+ (presumivelmente CD8+) (P=0,04). As células CD3+CD4+ também mostraram expressão significativamente aumentada de CD45RO (um marcador de célula de memória) pós-terapia (P=0,04). O percentual de populações de células que expressam CD69, CD25 e CTLA-4 não mudou.

Os Pacientes 1, 11 e 13 foram respondedores (Quadro 15). O Paciente 1 teve encolhimento de uma lesão de pulmão solitária após dois ciclos de tratamento. O Paciente 13 teve encolhimento de uma lesão de pulmão solitária e completa resolução de uma lesão subcutânea após dois ciclos de tratamento. O Paciente 11 tinha 31 lesões de pulmão, duas lesões subcutâneas e uma lesão de cérebro. A lesão de cérebro cresceu de 0,5 cm para aproximadamente 1,0 cm após dois ciclos de tratamento. Em seguida a três ciclos de tratamento adicionais, o Paciente 11 teve resolução completa de todas lesões, incluindo a lesão de cérebro. O Paciente 3 teve uma resposta misturada na qual várias lesões de pulmão se resolveram após quatro ciclos de tratamento mas gânglios linfáticos mediastínicos aumentados. O Paciente 10 teve encolhimento significativo de uma lesão hilar e várias outras lesões de pulmão após dois ciclos de tratamento, mas outras lesões de pulmão 48 aumentadas. Eventos adversos de Grau I/II incluíram diarreia (Pacientes 3, 5 e 14), erupção cutânea (Paciente 14), infiltrados pulmonares e dor no peito pleurítica leve (Paciente 4) e vitiligo (Pacientes 2 e 6). Seis pacientes desenvolveram eventos adversos de Grau III/IV incluindo dermatite (Pacientes 1, 2 e 13), colite/enterocolite (Pacientes 1 e 9), hipofisite (inflamação da glândula hipófise) (Paciente 11), e hepatite (Paciente 12). Todos os pacientes recuperaram-se em seguida à descontinuação do tratamento e a administração de cuidado suporte e/ou terapêutica de esteróides. Não houve eventos auto-imune de relapso ou subsequentes.

Os testes de sangue de filtração auto-imune foram normais excepto para os Pacientes 5 e 12 os quais desenvolveram Ab anti-nuclear.

Este estudo demonstrou evidência objectiva de regressão de tumor de melanoma metastático em pacientes recebendo anticorpo anti-CTLA-4 10D1 em conjunto com duas vacinas de péptido.

Exemplo 6: Um ensaio clínico em seres humanos de Fase I de MAb 10D1 em cancro de próstata (MDXCTLA4-01) MDXCTLA4-01 foi um estudo aberto de anticorpo monoclonal 10D1 (MAb 10D1) de antigénio 4 associado por linfócito T anti-citotóxico (anti-CTLA-4) em pacientes com cancro de próstata refractário a hormona, metastático, progressivo. 0 tratamento foi uma dose única de MAb 10D1 que foi administrado intravenosamente, como uma infusão, numa dosagem de 3,0 mg/kg. Os pacientes com diagnóstico histológico de adenocarcinoma primário da próstata, e carcinoma metastático progressivo da próstata após privação de androgénios e pelo menos uma manipulação não hormonal sistémica, foram seleccionados para participação neste estudo. Os critérios de selecção foram: doença mensurável progressiva, PSA progressivo, PSA > 5 ng/ml, testosterona < 50 ng/dl, supressão de androgénios gonadais primários, 49 expectativa de vida > 12 semanas, e Status de Performance de Karnofsky > 60%.

Devido à importância da monitorização do status imune de pacientes no ensaio e do objectivo específico de monitorizar efeitos generalizados em activação de célula T por anticorpo anti-CTLA-4, o critério de entrada neste estudo incluiu níveis mínimos de células CD4 e CD8 de ^ 500/ml e > 500/ml respectivamente. No entanto, foi observado durante o resultado inicial no estudo que pacientes com cancro de próstata tiveram números de células T significativamente reduzidos embora células T CD4 e CD8 estejam claramente presentes. Muitos pacientes foram inicialmente rejeitados com base nos critérios de entrada acima. As contagens aparentes de células T reduzidas observadas é uma observação previamente não documentada em pacientes com cancro de próstata que pode ter relevância em tratamentos envolvendo vacinação de cancro nestes pacientes. Subsequente a estas observações, os critérios de entrada foram revisados para incluir pacientes que têm contagem de CD4 e CD8 > 300/ml e ^ 200/ml respectivamente.

Os indivíduos passaram por exame físico, ECG, radiografia do tórax, formação de imagens de diagnóstico, e amostras de sangue para avaliações hematológicas, bioquímicas, e de função imune. Mensalmente entrevistas telefónicas foram usadas até seis meses após o tratamento para colher e registar informações num subconjunto de eventos adversos, incluindo eventos adversos auto-imune após progressão da doença. PSA (declínio, duração do declínio, progressão, tempo para progressão) e resposta da doença (completa, parcial, estável, progressiva) foram monitorizados. As concentrações plasmáticas de MAb 10D1 estavam sendo monitorizadas imediatamente antes de, durante, e até dois meses após, infusão.

Catorze pacientes com HRPC foram seleccionados. A idade média foi 69 anos (faixa de 56-79). Sete pacientes 50 receberam quimioterapia anterior. Todos os pacientes receberam uma única dose de 3 mg/kg de 10D1 intravenosamente durante 90 minutos e foram então acompanhadas quanto a toxicidade, farmacocinéticos, activação de células T circulantes e resultado clinico.

Todas as infusões foram completadas como planejado com somente eventos adversos relacionados com infusão leve (AE) . Erupções cutâneas leves e reversíveis responderam a terapêutica de esteróide oral. Nenhum outro AE de grau 3 ou maior foi relacionado a 10D1. O perfil farmacocinético é mostrado na figura 3, a qual apresenta concentração plasmática em pg/ml. A média + SEM é mostrada para os 14 pacientes (n = 14) . Os resultados mostrados na Figura 3 demonstram que os níveis plasmáticos do anticorpo foram detectáveis por até 3 meses e a monitorização adicional descobriu que os níveis plasmáticos podem ser detectáveis durante até mesmo 4 meses. Não houve aumento significativo em células T periféricas activadas, e nenhuma auto-imunidade clínica foi notada. Dois de 7 pacientes que eram puros de quimioterapia tiveram uma resposta de PSA (critério de consenso) durante 3 e 5 meses, um com melhoria sintomática. Outros pacientes experimentaram mudança significativa na inclinação da curva para PSA. Os pacientes foram re-tratados com uma segunda dose de 10D1 (3 mg/kg) e com o re-tratamento, os pacientes que tinham anteriormente respondido novamente experimentaram reduções de PSA sem AE significativo. O tratamento foi bem tolerado com evidência clara de actividade imunológica e anti-tumoral. Portanto, estes estudos demonstram que pacientes humanos podem ser tratados com anticorpo anti- CTLA-4 tal que os níveis plasmáticos do anticorpo permaneçam acima de níveis detectáveis por 1, 2, 3, ou até mesmo 4 meses sem efeitos secundários prejudiciais.

Subpopulações de linfócitos em pacientes tratados com 10D1 foram analisadas por citometria de fluxo em vários 51 pontos no tempo após o tratamento com anticorpo. Os resultados estão sumarizados abaixo no Quadro 3 (os dados são apresentados como média ± SEM).

Quadro 3: Análise citométrica de fluxo de subpopulações de linfócitos em indivíduos com cancro de próstata tratados com 3,0 mg/kg de MAb 10D1

Sub-pop Avaliação 24 horas Dia 7 Dia 14 Dia 21 Dia 28 inicial CD 3 71,7 ± 3,45 85,6 ± 3,53 77, 6 ± 2,4 5 78, 5 ± 2,49 75, 6 ± 2, 42 76, 0 ± 2, 70 CD 4 40,3 ± 3,49 38, 7 ± 3,36 44, 0 ± 3, 20 38, 7 ± 3,36 42, 9 + 2, 98 44, 5 ± 3, 05 CD 8 30, 5 ± 3,91 35,6 ± 4, 54 32, 6 ± 4, 43 30, 8 ± 4,14 31, 5 ± 4, 28 30, 7 ± 4, 32 CD19 7,6 ± 1 ,29 5, 7 t 1, 27 6, 4 t 1 ,24 6, 2 ± 0, 98 6,7 i 1 ,27 6, 8 ± 1 ,15 CD4 + CD2 5 69,2 ± 3,47 65, 0 ± 3,38 66, 0 ± 3, 28 63, 7 ± 3,09 65, 6 ± 2, 97 64, 5 ± 3, 25 CD8 + CD2 5 14,0 ± 2,54 11,2 ± 1,56 13, 8 ± 2, 91 15,4 ± 2,56 14,3 ± 2, 68 15,5 ± 2, 92 CD4 + HLA- 11,3 ± 2, 78 11,4 ± 3,12 14, 2 ± 2, 49 17,1 ± 3,33 17, 3 ± 3, 32 17, 4 ± 3, 81 DR CD8 + HLA- 20, 4 ± 3,44 21,5 ± 3,64 19, 8 ± 3, 87 20,6 ± 4,28 21, 8 ± 3, 82 20, 7 ± 4, 66 DR CD4 + 45R0 68, 0 ± 4,98 72,4 ± 4,37 76, 1 ± 4, 19 76,0 ± 3,58 76, 8 ± 3, 93 76, 9 ± 4, 10 CD8 + 45RO 41,9 ± 6,00 44, 8 ± 5, 83 48, 7 ± 6, 04 48, 4 ± 5,20 50, 7 ± 5, 64 50, 7 ± 5, 43

Os resultados demonstram que o tratamento com 10D1 levou a um aumento de cerca de 50% na subpopulação CD4/HLA-DR+ com o tempo. As outras subpopulações de linfócitos permaneceram essencialmente constantes com o tempo.

Para avaliar se a administração de MAb 10D1 poderia induzir a activação de célula T não específica indesejável, linfócitos de sangue periférico dos indivíduos com cancro de próstata foram analisados por citometria de fluxo quanto a cada um dos seguintes marcadores: CD4, CD8, CD25, CD44, CD69 e HLA-DR. Nenhuma mudança significativa na frequência de qualquer destes marcadores foi observada durante o curso do tratamento para cada um dos indivíduos com cancro de próstata tratados até esse ponto. Um exemplo desta análise é mostrado no Quadro 4 o qual mostra a frequência de células positivas para CD4, CD25, CD69 e células positivas 52 para CD8, CD25, CD69 em instantes antes de, durante, e subsequente à administração de MAb 10D1 em dois dos indivíduos. Estes dados demonstram que MAb 10D1 não tem como resultado a activação de célula T não específica.

Quadro 4: Análise citométrica de fluxo de marcadores de activação de célula T em indivíduos com cancro de próstata tratados com 3,0 mg/kg de MAb 10D1. N2 de Paciente Ponto no tempo CD(4+25+69)% CD(8+25+69)% 3 Selecção 1,7 0, 8 3 -30 min (pré-infusão) 2,6 0, 8 3 40 min 2,5 0,7 3 130 min 1,9 0,9 3 145 min 1,7 0,5 3 160 min 1,7 1 3 190 min 1,5 1,5 3 250 min 2,1 1,2 3 370 min 1,3 0,9 3 24 h 1,6 1,6 3 48 h 2,7 3 3 72 h 0,9 0, 5 3 Dia 7 0,9 0,1 3 Dia 14 0,4 0, 5 3 Dia 21 2,3 1,9 4 Selecção 1,4 0, 8 4 -30 min (pré-infusão) 0,5 0, 3 4 40 min 0,3 0,1 4 130 min 0,3 0,1 4 145 min 0,4 0, 2 4 160 min 0,2 0, 2 4 190 min 0,8 0,3 4 250 min 0,1 0 53 (continuação) de Paciente Ponto no tempo CD (4+25+69)% CD(8+25+69)% 4 370 min 0,3 i—1 O 4 24 h 0,2 0,3 4 48 h 0,4 0,6 4 72 h 00 o 0,3 4 Dia 7 1 0, 7 4 Dia 14 \—1 \—1 co o

Os resultados da experiência clinica MDXCTLA4- 01 demonstraram que as infusões são toleráveis com somente pequenas reacções. A semivida no plasma prolongada do anticorpo foi vista, com o anticorpo permanecendo no plasma por cerca de 3 a 4 meses. Uma evidência clara de efeitos imunes foi observada sem activação de célula T não especifica significativa. Alivio sintomático e reduções nos niveis de antigénio especifico da próstata (PSA) foram observados em pacientes com cancro de próstata tratados com o anticorpo anti-CTLA-4. Os resultados representativos para reduções em niveis de PSA são mostrados na Figura 4, a qual mostra niveis de PSA (em ng/ml) em dois pacientes (um representado pelos círculos fechados, o outro pelos círculos abertos) em vários pontos no tempo após a infusão de 3 mg/kg de anticorpo anti-CTLA-4 no dia 0. Os resultados demonstram que os níveis de PSA diminuíram após a infusão do anticorpo e permaneceram suprimidos por cerca de 3-4 meses após o tratamento, correlacionando com a presença do anticorpo anti-CTLA-4 no plasma. Alguns outros pequenos efeitos imunes também foram observados incluindo erupção cutânea e prurido mediados por imune, seroconversão transiente para auto-anticorpos positivos, mudanças de pigmento de melanina em pacientes com melanoma e reacções inflamatórias em locais tumorais. Excepto pela erupção cutânea e prurido, todos os efeitos imunes potencialmente adversos foram subclínicos. Em resumo, os resultados de 54 avanço dos ensaios clínicos em seres humanos com tratamento de anticorpo anti-CTLA-4 demonstram que o anticorpo é bem tolerado e estimula efeitos imunes nos receptores. Referências Citadas

Numerosas referências, incluindo patentes, pedidos de patente e várias publicações, são citadas e discutidas na descrição desta invenção. A citação e/ou discussão de tais referências é proporcionada meramente para esclarecer a descrição da presente invenção e não é uma admissão que qualquer tal referência seja "técnica anterior" para a invenção descrita no presente documento. 55

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • WO 0114424 A [0008] [0019] [0045] [0046] [0077] • WO 0037504 A [0008] [0042] [0045] • US 5855887 A [0008] [0045] • US 5811097 A [0008] [0045] • US 644668 A [0008] • US 09948939 A [0008] • WO 9842752 A [0008] • US 6207156 B [0008] • WO 9533770 A [0008] • WO 0114424 A [0042] • US 6051227 A [0045] • US 20020039581 AI [0045]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo anti-CTLA-4 humano para utilização no tratamento de um cancro num paciente humano, em que o paciente, antes de administrar o anticorpo, foi tratado com cirurgia de manipulação de tumor, quimioterapia, ou radiação e desenvolveu uma resposta imune ao cancro, em que o anticorpo é para reforçar a resposta imune do paciente, e em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente de modo que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 seja pelo menos 2 pg/ml durante mais de quatro meses.

2. Um anticorpo anti-CTLA-4 humano para utilização no tratamento de um cancro num paciente humano, em que o paciente, antes de administrar o anticorpo, foi tratado com uma vacina para o cancro e desenvolveu uma resposta imune ao cancro, em que o anticorpo é para reforçar a resposta imune do paciente, e em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente de uma maneira tal que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 seja pelo menos 2 pg/ml durante mais de quatro meses.

3. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente múltiplas vezes.

4. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é para ser administrado ao paciente numa dose única.

5. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a administração do anticorpo não tem como resultado efeitos secundários prejudiciais.

6. 0 anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma 2 das reivindicações 1 a 5, em que o efeito da quantidade e intervalo de administração do anticorpo é que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 no paciente seja de pelo menos 5 pg/ml durante mais de quatro meses.

7. 0 anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o efeito da quantidade e intervalo de administração do anticorpo é que a concentração plasmática de anticorpo anti-CTLA-4 no paciente seja de pelo menos 10 pg/ml durante mais de quatro meses.

8. O anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, em que o cancro é um melanoma.

9. O anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o paciente é imunocomprometido.

10. O anticorpo para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2.