MXPA04010013A - Metodos de tratamiento utilizando anticuerpos al antigeno-4 asociado con el linfocito t citotoxico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee un metodo de tratamiento utilizando anticuerpos con secuencia de humano en contra del CTLA-4 de humano; en particular, se proveen los metodos para tratar el cancer.

Description

METODOS DE TRATAMIENTO UTILIZANDO ANTICUERPOS AL ANTIGENO-4 ASOCIADO CON EL LINFOCITO T CITOTOXICO La solicitud reclama prioridad bajo 35 U.S.C. §119(e) a la solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/372,284 presentada el 12 de abril del 2002, y a la solicitud de patente provisional de los E.U.A. número de serie 60/381 ,274 presentada el 17 de mayo del 2002. Los contenidos totales de estas solicitudes provisionales se incorporan en la presente invención como referencias en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente a la inmunología molecular y al tratamiento de enfermedades de humano. En particular, ésta se refiere a los métodos de tratamiento novedosos utilizando anticuerpos en contra del CTLA-4 de humano.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El sistema inmune de vertebrados requiere de múltiples señales para lograr una activación inmune óptima (véase, por ejemplo, Janeway, Coid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1989; 54: 1-14; Paul William E., ed. Raven Press, N. Y., Fundamental Immunology, 4a edición (1998), particularmente los capítulos 12 y 13, páginas 411 a 478). Las interacciones entre los linfocitos T (células T) y las células presentadoras del antígeno (APC) son esenciales para la respuesta inmune. Los niveles de muchas moléculas cohesivas encontradas en las células T y en las APC se incrementan durante una respuesta inmune (Springer et al., A. Rev. Immunol. 1987; 5: 223-252; Shaw y Shimuzu, Current Opinión in Immunology, 1988 Eds. Kindt and Long, 1: 92-97; y Hemler, Immunology Today 1988; 9: 109-113). Los niveles incrementados de estas moléculas pueden ayudar a explicar por qué las APC activadas son más efectivas en la estimulación de la proliferación de la célula T específica del antígeno en comparación con las APC en reposo (Kaiuchi et al., J. Immunol. 1983; 131 : 109-114; Kreiger et al., J. Immunol. 1985; 135: 2937-2945; Mc enzie, J. Immunol. 1988; 141: 2907-2911; y Hawrylowicz y Unanue, J. Immunol. 1988; 141: 4083- 4088). La respuesta inmune de la célula T es un proceso complejo que implica interacciones célula-célula (Springer et al., A. Rev. Immunol. 1987; 5: 223-252), particularmente entre la célula T y las células accesorias tales como las APC, y la producción de mediadores inmunes solubles (citocinas o linfocinas) (Dinarello, New Engl. J. Med 1987; 317: 940-945; Sallusto, J. Exp. Med. 1997; 179: 1109-1118). Esta respuesta es regulada por diversos receptores de la superficie de la célula T, incluyendo el complejo del receptor de la célula T (Weiss, Ann. Rev. Immunol. 1986; 4: 593-619) y otras moléculas de superficie "accesorias" (Allison, Curr. Opin. Immunol. 1994; 6: 414-419; Springer, 1987, anteriormente mencionado). Muchas de estas moléculas accesorias son antígenos para la diferenciación (CD) de la superficie celular que se presentan de manera natural definidos por la reactividad de los anticuerpos monoclonales en la superficie de las células (McMichael, Ed., Leukocyte Typing III, Oxford Univ. Press, Oxford, N. Y., 1987). La respuesta antigénica de la célula auxiliar T (Th) requiere de las señales provistas por las APC. La primera señal se inicia mediante la interacción del complejo de la célula T (Weiss, J. Clin. Invest. 1990, 86: 1015) con el antígeno presentado en el contexto de las moléculas del complejo mayor del histocompatibilidad (MHC) clase II de las APC (Alien, Immunol. Today 1987; 8: 270). Esta señal específica del antígeno no es suficiente para generar una respuesta total, y en la ausencia de una señal secundaria puede efectivamente llevar a una inactivación clonal o anergia (Schwartz, Science 1990; 248: 1349). El requerimiento para una segunda señal "coestimulante" provista por el MHC se ha demostrado en numerosos sistemas experimentales (Schwartz, anteriormente mencionado; Weaver y Unanue, Immunol. Today 1990; 11: 49). La naturaleza molecular de esta segunda señal no está completamente entendida, aunque es evidente en algunos casos que tanto las moléculas solubles tales como la interleucina (IL)-1 (Weaver y Unanue, anteriormente mencionado) y los receptores membranales implicados en la adhesión intercelular (Springer, Nature 1990; 346: 425) pueden proveer señales coestimulantes. El antígeno CD28, una glucoproteína homodimérica de la superfamilia de inmunoglobulinas (Aruffo y Seed, Proc. Nati. Acad. Sci. 1987; 84: 8573-8577), es una molécula accesoria encontrada en la mayoría de las células T maduras de humano (Damle et al., J. Immunol. 1983; 131: 2296-2300). La evidencia actual sugiere que esta molécula funciona en una ruta de activación alternativa de la célula T distinta de aquella iniciada por el complejo receptor de la célula T (June et al., Mol. Cell. Biol. 1987; 7: 4472-4481 ). Los anticuerpos monoclonales (MAbs) reactivos con el antígeno CD28 pueden aumentar las respuestas de la célula T iniciadas por diversos estímulos policlonales (revisado por June et al., anteriormente mencionado). Estos efectos estimulantes pueden resultar a partir de la producción de citocina inducida por el MAb (Thompson et al., Proc. Nati. Acad. Sci 1989; 86: 1333-1337; y Lindsten et al., Science 1989; 244: 339-343) como una consecuencia de la estabilización incrementada del ARNm (Lindsten et al., 1989, anteriormente mencionado). Los mAbs anti-CD28 también pueden tener efectos inhibidores, por ejemplo, éstos pueden bloquear las reacciones de los linfocitos mezclados autólogos (Damle et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 1981; 78: 5096-6001) y la activación de las clonas de la célula T específicas del antígeno (Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 1986; 16: 1289-1296). El CTLA-4 es una molécula de superficie de la célula T que se identificó originalmente por la selección diferencial de una librería de ADNc de célula T citolítica de murino (Brunet et al., Nature 328: 267-270 (1987)). El CTLA-4 también es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas (Ig); el CTLA-4 comprende un dominio Ig extraceiular particular. Los transcritos de CTLA-4 se han encontrado en poblaciones de células T que tienen actividad citotóxica, sugiriendo que CTLA-4 puede funcionar en la respuesta citolítica (Brunet et al., anteriormente mencionado; Brunet et al., Immunol. Rev. 103-21-36 (1988)). Los investigadores han reportado la clonación y el mapeo de un gen para la contraparte en humano del CTLA-4 (Dariavach et al.,Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905 (1988)) en la misma región cromosomal (2q33-34) que CD28 (Lafage-Pochitaloff et al., Immunogenetics 31: 198-201 (1990)). La comparación de secuencia entre este ADN de CTLA-4 de humano y aquel que codifica las proteínas CD28 revela una homología de secuencia significativa, con el mayor grado de homología en las regiones juxtamembranal y citoplásmica (Brunet et a!., 1988, anteriormente mencionado; Dariavach et al.,. 1988, anteriormente mencionado). El CTLA-4 se acepta que es opuesto a la actividad de CD28 y que disminuye la activación de la célula T (Krummel, J. Exp. Med. 1995; 182: 459-465; Krummel et al., Infl Immunol. 1996; 8: 519-523; Chambers et al., Immunity. 1997; 7: 885-895). Los ratones deficientes en CTLA-4 padecen de linfoproliferación masiva (Chambers et al., anteriormente mencionado). Se ha reportado que el bloqueo de CTLA-4 aumenta las respuestas de la célula T in vitro (Walunas et al., Immunity. 1994; 1: 405-413) e in vivo (Kearney, J. Immunol. 1995; 155: 1032-1036), exacerba la inmunidad antitumoral (Leach, Science 1996; 271 : 1734-1736), y mejora una enfermedad autoinmune inducida (Luhder, J Exp. Med. 1998; 187: 427-432). También se ha reportado que CTLA-4 tiene un impacto alternativo o adicional sobre el carácter inicial de la respuesta inmune de la célula T (Chambers, Curr. Opin. Immunol. 1997; 9: 396-404; Bluestone, J. Immunol. 1997; 158: 1989-1993; Thompson, Immunity 1997; 7: 445-450). Esto es consistente con la observación de que algunos pacientes autoinmunes tienen autoanticuerpos a CTLA-4. Es posible que el bloqueo de los autoanticuerpos a CTLA-4 desempeñe un papel patogénico en estos pacientes (Matsui, J. Immunol. 1999; 162: 4328-4335). Los anticuerpos de CTLA-4 no humanos han sido utilizados en diversos estudios discutidos anteriormente. Además, se han descrito a los anticuerpos de humano en contra de CTLA-4 de humano como moduladores de la inmunoestimulación en diversas condiciones de enfermedad, tales como en el tratamiento o la prevención de infecciones virales y bacterianas y para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, publicación PCT WO01/14424 y publicación PCT WO 00/37504). La Patente de E.U.A. No. 5,855,887 describe un método para incrementar la respuesta de una célula T de mamífero a una estimulación antigénica mediante la combinación de una célula T con un agente bloqueador de CTLA-4. La Patente de E.U.A. No. 5,811 ,097 describe un método para disminuir el crecimiento de tumores que no son de células T mediante la administración de un agente bloqueador de CTLA-4. Las solicitudes de patente de E.U.A. Nos. 09/644,668 y 09/948,939 describen anticuerpos de CTLA-4 de humano y se incorporan en la presente invención como referencias. La cita o discusión de cualquier referencia en esta sección o en cualquier otra en la especificación se realiza solamente para aclarar la descripción de la presente invención y no es una admisión de que dicha referencia sea una "técnica precedente" en relación con cualquier invención descrita en la presente invención.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención provee métodos para promover o potenciar una respuesta secundaria o respuesta inmune de memoria utilizando anticuerpos anti-CTLA4. Los anticuerpos anti-CTLA-4 demuestran una capacidad para incrementar la magnitud de la inmunidad protectora en un sujeto ya inmunizado a antígenos protectores a partir de un patógeno, por ejemplo, antígenos de cáncer o antígenos a partir de un agente infeccioso. Antes de que dicha inmunización pueda haber ocurrido como un resultado de la exposición natural, por ejemplo, a las células cancerosas de un tumor disecado o a partir de una infección resuelta o detenida con un agente infeccioso. Dichos pacientes pueden ser evaluados para la evidencia de dicha exposición, por ejemplo, para inmunidad a un antígeno protector a un patógeno. Alternativamente, el paciente puede haber sido vacunado en contra del patógeno, en cuyo caso la inmunidad puede asumirse o se puede evaluar. En una modalidad, los anticuerpos CTLA4 de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de malignidades, en donde el paciente ha recibido previamente una vacuna para el cáncer o demuestra cierto nivel de inmunidad protectora natural hacia el tumor. Los anticuerpos se pueden utilizar como un agente particular o en combinación con uno o más de otros agentes, tales como quimioterapia, terapia por radiación, citocinas, quimocinas y otras moléculas biológicas para señalización, vacunas específicas para tumor, rescate de célula madre autóloga y alogenéica (por ejemplo, para aumentar los efectos del injerto contra el tumor), otros anticuerpos terapéuticos, terapias moleculares dirigidas, terapia anti-angiogénica, agentes infecciosos con intención terapéutica (tal como bacteria para localización del tumor) y terapia génica. Los anticuerpos se pueden administrar como una dosis particular o como dosis múltiples. Los anticuerpos se pueden utilizar en terapia de adyuvante o en terapia de neoadyuvante, ya sea solo o en conjunción con las terapias anteriormente mencionadas. El tratamiento con un anticuerpo anti-CTLA4 se puede utilizar para activar una respuesta pre-existente de memoria en pacientes tratados con una vacuna para el cáncer. Por lo tanto, los pacientes tratados con la vacuna se pueden seleccionar para tratamiento adicional con un anticuerpo anti-CTLA4 para así inducir o mejorar adicionalmente una respuesta inmune. En una modalidad, el antígeno es un antígeno canceroso y el paciente ha sido previamente tratado con una vacuna anti-cáncer. El antígeno canceroso puede ser, por ejemplo, un antígeno de melanoma o un antígeno del cáncer de próstata. En otra modalidad, el antígeno es un antígeno viral y el paciente ha sido previamente tratado con una vacuna viral. El antígeno viral puede ser, por ejemplo, un antígeno de hepatitis. En una modalidad, el paciente es un humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-CTLA4 es un anticuerpo anti-CTLA4 de humano. Un anticuerpo preferido anti-CTLA4 de humano de la invención es 10D1 , pero los métodos de la presente invención se pueden utilizar con cualquier anticuerpo CTLA-4 de humano. En otras modalidades, el anticuerpo anti-CTLA4 es un anticuerpo recombinante tal como un anticuerpo anti-CTLA4 quimérico o humanizado (por ejemplo, CDR-injertado). Los anticuerpos de la invención también se pueden utilizar en el control de infecciones patogénicas por organismos infecciosos, incluyendo, pero no limitados a, bacterias, micobacterias, espiroquetas, hongos, virus, organismos parasitarios, y priones. Los anticuerpos se pueden utilizar como un agente particular o en combinación con uno o más de otros agentes, tales como antibióticos, vacunas, anticuerpos, citocinas, inhibidores de receptor, y agentes bloqueadores de la virulencia. Los anticuerpos se pueden administrar como una dosis particular o como dosis múltiples. Los métodos de tratamiento de la invención, los cuales se diseñan para estimular una respuesta secundaria o respuesta inmune de memoria, pueden ser particularmente relevantes en el tratamiento de pacientes con sistema inmune suprimido los cuales pueden estar en alto riesgo de padecer complicaciones por enfermedad. Los ejemplos de dichos pacientes con sistema inmune suprimido incluyen pacientes con infecciones retrovirales, incluyendo VIH, pacientes con deficiencias congénitas, deficiencias heredables, deficiencias autoinmunes o deficiencias inmunes farmacéuticamente inducidas, incluyendo pacientes diabéticos y ancianos, y pacientes con heridas, traumas o con quemaduras severas.

El método de la invención para estimular una respuesta inmune mediante la administración de un anticuerpo anti-CTLA4 también se puede utilizar en casos de exposición aguda al antígeno (tal como la exposición a un agente para bioterrorismo, tal como el ántrax o la viruela, en donde el paciente expuesto ha sido previamente vacunado en contra del agente), o en lugar de vacunación de refuerzo. La invención también demuestra que los pacientes se pueden tratar por periodos extendidos de tiempo con anti-CTLA4 sin experimentar efectos laterales detrimentales tales como activación no específica de las células T, tal como autoinmunidad. Las concentraciones plasmáticas de anti-CTLA4 se pueden mantener por arriba de los niveles detectables por al menos 1 , 2, 3, 4 0 5 meses, o por más tiempo, sin consecuencias ¡nmunológicas no intencionales. En una modalidad preferida, la invención provee un método para inducir o mejorar una respuesta inmune a un antígeno en un paciente, que comprende administrar al paciente un anticuerpo anti-CTLA4 de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA4 se mantenga por arriba de los niveles detectables por al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco meses. En una modalidad, el anticuerpo anti-CTLA4 se administra múltiples veces de tal manera que la concentración plasmática se mantiene por arriba de los niveles detectables por al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco meses. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CTLA4 se administra en una cantidad y a intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti- CTLA4 en el paciente es de al menos 2 µ9/?t»? por al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco meses. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CTLA4 se administra en una cantidad y a intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA4 en el paciente es de al menos 5 µg/ml por al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco meses. En otra modalidad, el anticuerpo ant¡-CTLA4 se administra en una cantidad y a intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA4 en el paciente es de al menos 10 µ?/ml por al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco meses. En una modalidad preferida, el paciente a ser tratado por periodos extendidos de tiempo con el anticuerpo anti-CTLA4 padece de una malignidad, tal como melanoma o cáncer de próstata. En otra modalidad preferida, el paciente ha sido, o está siendo, tratado con una vacuna además del tratamiento con el anticuerpo anti-CTLA4. Otro aspecto de la invención pertenece a los métodos para utilizar anticuerpos anti-CTLA4 que están unidos a un agente citotóxico. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen fármacos citotóxicos (por ejemplo, doxirubicina, caliqueamicina y los similares) e isótopos radiactivos. Dichos anticuerpos anti-CTLA- 4 unidos a un agente citotóxico se pueden utilizar para disminuir la cantidad de células CTLA4+. Los ejemplos de células CTLA4+ que se pueden deletar incluyen células T CTLA4+ activadas específicas de malignidades y específicas del antígeno que expresan CTLA4 en enfermedades autoinmunes mediadas por la célula T. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención provee un método para tratar un paciente para una malignidad de célula T CTLA4+, que comprende: administrar al paciente un anticuerpo anti-CTLA4 unido a un agente citotóxico de tal manera que el paciente se trata para la malignidad de la célula T. En otra modalidad, la invención provee un método para tratar un paciente para una enfermedad autoinmune mediada por la célula T, que comprende: administrar al paciente un anticuerpo anti-CTLA4 unido a un agente citotóxico de tal manera que el paciente se trata para la enfermedad autoinmune mediada por la célula T. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención es anticuerpo 10D1 monoclonal de humano como se describe en WO 01/14424. Todas las publicaciones, figuras, referencias de acceso al GenBank (secuencias), depósitos en ATCC, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente invención se incorporan expresamente en la presente invención como referencia para todos los propósitos hasta el mismo grado como si cada uno se denotara individualmente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra respuestas del anticuerpo específico al melanoma en animales tratados con una vacuna para melanoma y el anticuerpo anti-CTLA-4 10D1. La reactividad del anticuerpo en muestras de plasma agrupadas a partir de animales tratados se midió mediante citometria de flujo.

La figura 2 muestra el perfil farmacocinético del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 durante la dosificación crónica de primates. El anticuerpo se administró a los días 0, 28, 56, 84 y 140 y se analizaron las concentraciones plasmáticas de 10D1 mediante ELISA. Se muestra la media +/-SEM de seis animales tratados. La figura 3 muestra el perfil farmacocinético del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 en pacientes con cáncer de próstata tratados con una dosis particular de 10D1 al día 0. Se muestra la concentración plasmática ^g/ml). Se muestra la media +/-SEM para 14 pacientes tratados, La figura 4 muestra los niveles del antígeno específico a la próstata (PSA) en ng/ml en dos pacientes humanos a diversos puntos de tiempo después de la infusión de un anticuerpo anti-CTLA4 al día 0.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención provee métodos novedosos basados en el anticuerpo CTLA-4 para promover o potenciar una respuesta inmune secundaria o respuesta inmune de memoria, y para un tratamiento más efectivo del cáncer. Además, se describen las concentraciones plasmáticas preferidas del anticuerpo anti-CTLA-4. Los métodos de la presente invención proveen métodos para tratar el cáncer, infección, y otras enfermedades o condiciones que son responsables de una respuesta inmune. La presente invención se basa, en parte, en las observaciones realizadas durante la prueba clínica de un anticuerpo anti-CTLA-4 con secuencia de humano en inmunoterapia de cánceres, como se describe a continuación. Las pruebas demostraron la efectividad del anticuerpo anti-CTLA en el tratamiento de sujetos con exposición previa al antígeno tumoral. Además, se muestra la persistencia de niveles plasmáticos detectables del anticuerpo anti-CTLA-4 después de ya sea una administración particular o de múltiples administraciones.

A. Evaluación clínica de los pacientes previamente vacunados con vacuna para el cáncer Nueve pacientes con melanoma avanzado o con cáncer ovárico avanzado participaron en un estudio en el cual recibieron 3 mg/kg del anticuerpo monoclonal CTLA-4 10D1 (Medarex) de manera intravenosa. Los pacientes recibieron tratamiento previo para etapas tempranas del melanoma que incluyeron inmunoterapia (tres pacientes recibieron interferón- , un paciente recibió una vacuna del gangliósido GM2 mezclado con QS-21), cirugía (4 pacientes), radiación (2 pacientes), quimioterapia (3 pacientes), e inhibidor del proteosoma (1 paciente). Los dos pacientes con cáncer ovárico recibieron múltiples quimioterapias. Además, todos los pacientes participaron en los estudios de vacuna en fase I. Tres pacientes con melanoma y ambos pacientes con cáncer ovárico fueron inmunizados con células autólogas diseñadas para secretar GM-CSF. Uno de estos pacientes también recibió una vacuna de MUC-1. Tres pacientes con melanoma fueron inmunizados con células dendríticas autólogas diseñadas para expresar gp100 y MART-1. Un paciente con melanoma fue vacunado con el péptido gp100 y con altas dosis de IL-2. Tres pacientes con melanoma previamente vacunados con células tumorales que secretan GM-CSF tuvieron necrosis tumoral extensiva después del tratamiento con 10D1. La histopatología del tejido resecado a partir de los tres pacientes mostró vasos sanguíneos del tumor severamente dañados con infiltrados de linfocitos y granulocitos en la proximidad del tumor. Un paciente tuvo una masa mediastinal completamente resecada tres meses después del tratamiento con 10D1. Los cuatro pacientes previamente vacunados con antígenos melanosomales tuvieron infiltrados linfocíticos en proximidad a los tumores, pero no tuvieron necrosis tumoral. A los pacientes con cáncer ovárico no se les sometió a resección o biopsia, pero ambos pacientes tuvieron cambios favorables en los niveles sanguíneos de CA-125 (un marcador tumoral para el cáncer ovárico) después del tratamiento con 10D1.

B. Evaluación de los pacientes con exposición natural al antígeno tumoral Catorce pacientes con melanoma en etapa IV recibieron anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 en conjunción con la vacunación con dos péptidos gp100 en uno o más ciclos del tratamiento. Todos los pacientes tuvieron cirugía previa para sus tumores primarios. Seis pacientes tuvieron quimioterapia previa. Once pacientes tuvieron inmunoterapia previa. La respuesta clínica se midió mediante tomografía axial computarizada (CT) y formación de imagen mediante resonancia magnética (MR). Un paciente, el cual tuvo cirugía previa y quimioterapia, tuvo una resolución completa de los tumores pulmonares, cerebrales y subcutáneos después de 5 ciclos de tratamiento. Dos pacientes más respondieron de manera parcial. Dos pacientes que no respondieron a la terapia se consideraron "mezclados" debido a que algunas lesiones se encogieron mientras que otras incrementaron su tamaño. Es posible, debido a que no se llevaron a cabo biopsias del tejido, que el agrandamiento de las lesiones en los pacientes que no respondieron a la terapia no se ocasionó por el cáncer. Un paciente (paciente 3), por ejemplo, tuvo resolución de diversas lesiones pulmonares pero un agrandamiento de los nodulos linfáticos mediastinales. Los vasos linfáticos a partir de los pulmones drenan hacia los nodulos linfáticos mediastinales (Schwartz, et al., Principies of Surgery, 1984, 4a edición, p. 661 ); y los nodulos linfáticos se pueden agrandar como un resultado de la inflamación en los tejidos dentro de la depresión de drenaje de los nodulos linfáticos. Es posible que el paciente 3 fuera un paciente que responde completamente a la terapia con nodulos linfáticos que se agrandaron debido a la inflamación, no debido al cáncer. Basándose en los resultados discutidos anteriormente, la presente invención provee diversos usos ventajosos de los anticuerpos anti-CTLA-4. Estos anticuerpos se proveen para la estimulación inmune secundaria o para la estimulación inmune de memoria, como se demostró en los pacientes previamente inmunizados o previamente expuestos al cáncer. Por lo tanto, los anticuerpos anti-CTLA-4 se pueden utilizar como un refuerzo, el cual es especialmente útil en pacientes inmunocomprometidos. La supresión del sistema inmune puede ocurrir a partir de numerosas causas, incluyendo pero no limitadas a enfermedades (incluyendo enfermedades de inmunodeficiencia similares al VIH), envejecimiento, carga tumoral incrementada, terapia del cáncer (por ejemplo, quimioterapia y radiación), así como otras causas. La terapia mediante el anticuerpo anti-CTLA-4 se indica de esta manera para reforzar la inmunidad en sujetos inmunocomprometidos.

C. Evaluación de monos con anticuerpo CTLA-4 y con vacuna para el melanoma Los monos cynomolgus fueron tratados ya sea con vacuna para melanoma sola o con vacuna para melanoma y anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 a los días 0, 28, 56, 84 y 140. El uso del anticuerpo anti-CTLA-4 en combinación con la vacuna produjo una respuesta del anticuerpo en contra de células del melanoma significativamente mayor que con el uso de la vacuna sola. Además, los estudios de proliferación de la célula T demostraron que el tratamiento con el anticuerpo anti-CTLA-4 y con la vacuna produjo proliferación de células CD8+ y CD4+ específica del antígeno. Los niveles plasmáticos del anticuerpo anti-CTLA-4 permanecieron por arriba de los niveles detectables por todo el período de 160 días. La concentración plasmática media permaneció por arriba de 20 µ?/?t?? durante los seis meses del estudio. Este estudio mostró que la dosificación crónica del anticuerpo anti-CTLA-4 en primates es segura y que los niveles plasmáticos detectables se puede mantener durante un periodo de seis meses.

D. Evaluación de pacientes con melanoma avanzado con anticuerpo anti-CTLA-4 A diecisiete pacientes con melanoma avanzado se les administró una dosis particular del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 a 3 mg/kg de manera intravenosa. Nueve pacientes tuvieron inmunoterapia previa, seis tuvieron terapia por radiación previa y cinco tuvieron quimioterapia previa. Los niveles plasmáticos del anticuerpo anti-CTLA-4 permanecieron detectables por hasta cuatro meses. Dos pacientes tuvieron una respuesta parcial, incluyendo resolución de tres masas de tejidos suaves y una reducción mayor del 50% en una masa pulmonar en un paciente previamente vacunado. Este estudio demostró que los niveles plasmáticos pueden permanecer por arriba de los niveles detectables por hasta cuatro meses en un paciente humano después de una dosis particular de anticuerpo anti-CTLA-4. Además, la reducción de la masa pulmonar observada en el paciente previamente vacunado demostró que el anticuerpo CTLA-4 puede activar una respuesta preexistente de memoria al tumor.

E. Evaluación de pacientes con cáncer prostático avanzado con anticuerpo anti-CTLA-4 A catorce pacientes con cáncer prostático avanzado se les administró una dosis particular del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 monoclonal de humano a 3.0 mg/kg de manera intravenosa. Los niveles plasmáticos del anticuerpo anti-CTLA-4 estuvieron presentes por hasta cuatro meses. Se evidenciaron reducciones en el antígeno específico de próstata (PSA) y en la mejoría sintomática. Con la excepción de salpullido y prurito, los cuales fueron reversibles, no se presentaron efectos inmunes adversos, Estas y otras ventajas de la invención se explican con mayor detalle a continuación y en los ejemplos. Excepto cuando se menciona, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales tales como conejos, ratas, y ratones, y otros animales. Los animales incluyen a todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, y reptiles. El término "tratamiento" incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para prevenir o retrasar el inicio de los síntomas, complicaciones, o indicios bioquímicos de una enfermedad, aliviando los síntomas o deteniendo o inhibiendo el desarrollo posterior de la enfermedad, condición, o trastorno (por ejemplo, enfermedad autoinmune). El tratamiento puede ser la supresión o el alivio profiláctico (para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de síntomas clínicos o subclínicos de la misma) o terapéutico de los síntomas después de la manifestación de la enfermedad. El término "cáncer avanzado" significa cáncer que ya no se localiza en el sitio de tumor primario, o un cáncer que se encuentra en la etapa III o IV de conformidad con the American Joint Committee on Cáncer (AJCC). En general, la frase "bien tolerado" se refiere a la ausencia de cambios adversos en el estado de salud que ocurren como resultado del tratamiento y que podrían afectar las decisiones del tratamiento. El término "linfocito" como se utiliza en la presente invención tiene el significado normal en la técnica, y se refiere a cualesquiera de los leucocitos mononucleares, no fagocíticos, que se encuentran en la sangre, linfa, y en tejidos linfoides, por ejemplo, linfocitos B y T. La frase "subpoblaciones de linfocitos T" o "subgrupo(s) de células T" se refiere a linfocitos T o a células T caracterizadas por la expresión de marcadores particulares de superficie celular (véase Barclay, A. N. et al. (eds.), 1997, The Leukocyte Antigen Facts Book, 2a edición, Academíc Press, Londres, Reino Unido). El término "estable" con referencia a las células T se refiere al hecho de que la frecuencia o porcentaje de una subpoblación de células T no cambia durante el curso o duración de la administración de un agente. Los términos "antígeno-4 asociado con el linfocito T citotóxico", "CTLA-4", "CTLA4", "CTLA-antígeno 4" y "CD152" (véase, por ejemplo, Murata (1999) Am. J. Pathol. 155: 453-460) se utilizan de manera intercambiable, e incluyen variantes, isoformas, especies homologas del CTLA-4 de humano, y análogos que tienen al menos un epítope común con CTLA-4 (véase, por ejemplo, Balzano (1992) Int. J. Cáncer Suppl. 7: 28-32). La secuencia completa de CTLA-4 se encuentra en GenBank número de acceso L 5006. El término "epítope" significa un determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítope usualmente consisten de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activas tales como cadenas laterales de aminoácidos o de azúcares y usualmente tienen características específicas de estructura tridimensional, así como características específicas de carga. Los epítopes conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión al primero pero no al último se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes. Un "anticuerpo" intacto comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente invención como HCVR o VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente invención como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y de cuatro FR, arregladas a partir del amino terminal hacia el carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedero, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento. El término anticuerpo incluye porciones para unión al antígeno de un anticuerpo intacto que retiene la capacidad para unir a CTLA-4. Los ejemplos de la unión incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab asociados mediante un enlace disulfuro en la región de charnela; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo particular de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546), el cual consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, no obstante que los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, éstos se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena sencilla de proteína en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Dichos anticuerpos de cadena sencilla se incluyen como referencia al término "anticuerpo". Los fragmentos se pueden preparar mediante técnicas recombinantes o enzimáticas o escisión química de anticuerpos intactos. El término "anticuerpo con secuencia de humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano. Los anticuerpos con secuencia de humano de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis al azar o mutagénesis sitio específica in vitro o mediante mutación somática in vivo). Dichos anticuerpos se pueden generar en animales transgénicos no humanos, por ejemplo, como se describe en las publicaciones PCT Nos. WO01/14424 y WO 00/37504. No obstante, el término "anticuerpo con secuencia de humano", como se utiliza en la presente invención, no se pretende que incluya anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas a partir de la línea germinal de otras especies de mamífero, tales como un ratón, han sido injertadas sobre secuencias armazón de humano (por ejemplo, anticuerpos humanizados). Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo con composición de una sola molécula. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una especificidad de unión y afinidad particular por un epítope particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal de humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una especificidad de unión particular la cual tiene regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas a partir de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal de humano. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales de humano se producen mediante un hibridoma el cual incluye a una célula B obtenida a partir de un animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada de humano y un transgén de la cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. El término "anticuerpo policlonal" se refiere a una preparación de más de 1 (dos o más) anticuerpos diferentes al CTLA-4 de humano. Dicha preparación incluye anticuerpos que se unen a una variedad de epítopes diferentes. Los anticuerpos CTLA-4 se pueden unir a un epítope en CTLA-4 de humano de manera que inhiben que el CTLA-4 interaccione con un contrarreceptor B7 de humano. Debido a que la interacción del CTLA-4 de humano con el B7 de humano transduce una señal que produce la inactivación de las células T que contienen el receptor CTLA-4 de humano, el antagonismo de la interacción induce, aumenta o prolonga efectivamente la activación de las células T que contienen el receptor CTLA-4 de humano, por lo tanto prolongando o aumentando una respuesta inmune. Los anticuerpos anti-CTLA-4 preferidos se describen, por ejemplo, en Patentes de E.U.A. Nos. 5,811 ,097; 5,855,887; 6,051 ,227; en las publicaciones PCT Nos. WO 01/14424 y WO00/37504; y en la publicación de E.U.A. No. 2002/0039581 Al. Estos y otros anticuerpos adecuados para uso en la presente invención se pueden preparar de conformidad con los métodos que se conocen bien en la técnica y/o se describen en las referencias citadas en la presente invención. En modalidades preferidas, los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizados en la invención son "anticuerpos de humano" - por ejemplo, anticuerpos aislados a partir de un humano- o son "anticuerpos con secuencia de humano" (definidos como se mencionó anteriormente). Por ejemplo, la Publicación de Patente Internacional número WO01/14424 describe métodos mediante los cuales los anticuerpos anti-CTLA-4 con secuencia de humano se aislan a partir de un ratón transgénico que ha sido modificado con genes de anticuerpo de humano. Por lo tanto, estos anticuerpos, aunque aislados a partir de un animal no humano, tienen secuencias de aminoácidos (incluyendo secuencias de dominios constantes y variables) que corresponden a éstas de un anticuerpo de humano. Un anticuerpo particularmente preferido, el cual se utiliza en los ejemplos, a continuación, se refiere en la presente invención como el anticuerpo 10D1. Este anticuerpo con secuencia de humano se ha descrito previamente y se ha caracterizado completamente, por ejemplo, en WO 01/14424. La frase "respuesta de célula inmune" se refiere a la respuesta de las células del sistema inmune ocasionada por los estímulos externos o internos (por ejemplo, antígeno, citocinas, quimocinas, y otras células) que producen cambios bioquímicos en las células inmunes que resulte en la migración de la célula inmune, eliminación de las células blanco, fagocitosis, producción de anticuerpos, otros efectores solubles del sistema inmune, y los similares. Los términos "respuesta de linfocito T" y "actividad de linfocito T" se utilizan en la presente invención de manera intercambiable para referirse al componente de la respuesta inmune dependiente de los linfocitos T (por ejemplo, la proliferación y/o diferenciación de linfocitos T dentro de células auxiliares, células eliminadoras citotóxicas, o linfocitos T supresores, la provisión de señales mediante los linfocitos T auxiliares a los linfocitos B que ocasiona o que previene la producción de anticuerpo, la eliminación de células blanco específicas mediante linfocitos T citotóxicos, y la liberación de factores solubles tales como citocinas que modulan la función de otras células inmunes). El término "respuesta inmune" se refiere a la acción concertada de linfocitos, células presentadoras del antígeno, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriormente mencionadas o por el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas, y el complemento) que producen daño selectivo a, destrucción de, o eliminación a partir del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, de células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o de inflamación patológica, de células o tejidos normales de humano. Los componentes de una respuesta inmune se pueden detectar in vitro mediante diversos métodos que se.conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, (1) los linfocitos T citotóxicos se pueden incubar con células blanco marcadas radioactivamente y la lisis de estas células blanco se detecta mediante la liberación de radioactividad, (2) los linfocitos T auxiliares se pueden incubar con antígenos y con células presentadoras del antígeno y se mide la síntesis y secreción de citocinas mediante métodos estándares (Windhagen A; et al., 1995, Immunity 2 (4): 373-80), (3) las células presentadoras del antígeno se pueden incubar con el antígeno de la proteína total y se detecta la presentación de ese antígeno en MHC ya sea mediante un ensayo de activación de linfocito T o por métodos biofísicos (Harding et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci., 86: 4230-4), (4) las células cebadas se pueden incubar con los reactivos que entrecruzan sus receptores Fc-epsilon y se mide la liberación de histamina mediante un inmunoensayo enzimático (Siraganian, et al., 1983, TIPS 4: 432-437). De manera similar, también se pueden detectar los productos de una respuesta inmune ya sea en un organismo modelo (por ejemplo, ratón) o en un paciente humano mediante diversos métodos que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, (1 ) se puede detectar la producción de anticuerpos en respuesta a la vacunación fácilmente mediante métodos estándares actualmente utilizados en laboratorios clínicos, por ejemplo, un ELISA; (2) se puede detectar la migración de las células inmunes a sitios de inflamación mediante el raspado de la superficie de la piel y colocando un contenedor estéril para capturar a las células migrantes sobre el sitio del raspado (Peters et al., 1988, Blood 72: 1310-5); (3) se puede medir la proliferación de las células mononucleares de la sangre periférica en respuesta a los mitógenos o reacción de linfocito mezclado utilizando 3H-timidina; (4) se puede medir la capacidad fagocítica de los granulocitos, macrófagos, y otros fagocitos en las PBMC mediante la colocación de PMBC en pozos junto con partículas marcadas (Peters et al., 1988); y (5) se puede medir la diferenciación de las células del sistema inmune mediante el marcado de las PBMC con anticuerpos a las moléculas CD tales como CD4 y CD8 y midiendo la fracción de las PBMC que expresa estos marcadores. Por conveniencia, las respuestas inmunes se describen frecuentemente en la presente invención ya sea como respuestas inmunes "primarias" o "secundarias". Una respuesta inmune primaria, la cual también se describe como una respuesta inmune "protectora", se refiere a una respuesta inmune producida en un individuo como resultado de cierta exposición inicial (por ejemplo la "inmunización" inicial) a un antígeno particular. Dicha inmunización puede ocurrir, por ejemplo, como el resultado de cierta exposición natural al antígeno (por ejemplo, a partir de la infección inicial por ciertos patógenos que exhiben o que presentan al antígeno) o a partir de antígeno presentado por las células cancerosas de ciertos tumores en el individuo (por ejemplo, un tumor resecado). Alternativamente, la inmunización puede ocurrir como resultado de la vacunación del individuo como una vacuna que contiene el antígeno. Por ejemplo, la vacuna puede ser una vacuna en contra de un patógeno particular (por ejemplo, en contra de un virus, una bacteria, o un parásito) o puede ser una vacuna para el cáncer que comprende uno o más antígenos a partir de una célula cancerosa. Una respuesta inmune primaria se puede debilitar o atenuar durante el tiempo e incluso puede desaparecer o al menos se puede atenuar tanto que no puede ser detectada. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a una respuesta inmune "secundaria", la cual también se describe en la presente invención como una respuesta inmune "de memoria". El término respuesta inmune secundaria se refiere a una respuesta inmune producida en un individuo después de que la respuesta inmune primaria ya ha sido producida. Por lo tanto, se puede producir una respuesta secundaria o inmune, por ejemplo para mejorar una respuesta inmune existente que se ha debilitado o atenuado, o para recrear una respuesta inmune previa que o bien ya ha desaparecido o que no se puede detectar. Un agente que se puede administrar para producir una respuesta inmune secundaria se refiere posteriormente como un "refuerzo" puesto que se puede decir que el agente "refuerza" la respuesta inmune primaria.

Como un ejemplo, y no a manera de limitación, se puede producir una respuesta inmune secundaria mediante la reintroducción al individuo de un antígeno que produjo la respuesta inmune primaria (por ejemplo, mediante la readministración de una vacuna). No obstante, una respuesta inmune secundaria a un antígeno también se puede producir mediante la administración de otros agentes que tal vez no contengan el antígeno efectivo. Por ejemplo, la presente invención provee métodos para potenciar una respuesta inmune secundaria mediante la administración de un anticuerpo anti-CTLA-4 a un individuo. En dichos métodos el antígeno efectivo no tiene necesariamente que ser administrado con el anticuerpo anti-CTLA-4 y la composición que contiene el anticuerpo anti-CTLA-4 no tiene necesariamente que contener al antígeno. La respuesta inmune secundaria o respuesta inmune de memoria puede ser ya sea una respuesta humoral (anticuerpo) o una respuesta celular. Una respuesta humoral secundaria o respuesta humoral de memoria ocurre después de la estimulación de las células B de memoria que se generaron en la primera presentación del antígeno. Las reacciones de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) son un tipo de respuesta inmune secundaria celular o de respuesta inmune de memoria que son mediadas por las células CD4*. Una primera exposición a un antígeno ceba el sistema inmune y la exposición(es) adicional produce una DTH. Como se utiliza en la presente invención, la frase" receptor de superficie celular" incluye moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de la célula T (TCR) o los ligandos B7 de CTLA-4. El término "activación no específica de célula T" se refiere a la estimulación de las células T independiente de su especificidad antigénica. Como se utiliza en la presente invención, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune la cual está implicada en la fase efectora de una respuesta inmune, en oposición a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmune. Las células inmunes ejemplares incluyen una célula de un origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T incluyendo células T citolíticas (CTL)), células eliminatorias, células eliminatorias naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, células cebadas, y basófilos. Las células efectoras expresan los receptores específicos de Fe y llevan a cabo funciones inmunes específicas. Una célula efectora puede inducir la citotoxicidad mediada por célula dependiente del anticuerpo (ADCC), por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, y linfocitos que expresan FcccR están implicados en la eliminación específica de células blanco y la presentación de los antígenos a otros componentes del sistema inmune, o la unión a las células que presentan los antígenos. Una célula efectora también puede fagocitar un antígeno blanco, célula blanco, o microorganismo. "Célula blanco" debe significar cualquier célula no deseable en un sujeto (por ejemplo, un humano o animal) que se puede dirigir mediante una composición (por ejemplo, un anticuerpo con secuencia de humano o un anticuerpo monoclonal de humano de la invención, una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención). La célula blanco puede ser una célula que expresa o que sobre-expresa el CTLA-4. Las células que expresan CTLA-4 de humano pueden incluir células tumorales, por ejemplo linfomas. También se incluyen en la invención los anticuerpos modificados. El término "anticuerpo modificado" incluye anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos humanizados los cuales han sido modificados mediante, por ejemplo, deleción, adición, o sustituyendo porciones del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo se puede modificar mediante la deleción de la región constante y reemplazándola con una región constante que tiene el propósito de incrementar la vida media, por ejemplo, vida media en suero, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada o para crear una respuesta biológica (por ejemplo, para suministrar células efectoras). La porción del fármaco no debe considerarse como limitada a los clásicos agentes terapéuticos químicos. Por ejemplo, la porción del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como un factor de necrosis tumoral o interferón-alpha; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor estimulante de la colonia de macrófagos granulocitos ("GM-CSF"), factor estimulante de la colonia de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a los anticuerpos se conocen bien, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.."Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Edición), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Decker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

Tratamiento para el cáncer El bloqueo de los anticuerpos CTLA-4 puede mejorar la respuesta inmune de memoria o secundaria a las células cancerosas en el paciente. Los anticuerpos a CTLA-4 se pueden combinar con un agente inmunogénico, tales como células cancerosas, antígenos purificados del tumor (incluyendo proteínas recombinantes, péptidos, y moléculas de carbohidrato), células, y células transfectadas con genes que codifican citocinas estimulantes del sistema inmune y antígenos de superficie celular tales como B7 (véase, por ejemplo, Hurwitz, A. et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci U. S. A. 1998; 95: 10067-10071), o se pueden utilizar solas, para estimular la inmunidad. El bloqueo de CTLA-4 es efectivo cuando sigue a un protocolo de vacunación. Se han planeado muchas estrategias experimentales para vacunación en contra de tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cáncer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C, 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, IL. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, ., Cáncer Vaccines, Capítulo 61 , pp. 3023-3043 en DeVita, V. et al. (eds.), 1997, Cáncer: Principies and Practíce of Oncology. quinta edición). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células tumorales autólogas o alogenéicas. Se ha mostrado que estas vacunas celulares son más efectivas cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha mostrado que GM-CSF es un activador potente de la presentación del antígeno para la vacunación tumoral (Dranoff et al. Proc. Nati. Acad. Sci U. S. A. 1993; 90: 3539-43). El bloqueo anti-CTLA-4 para reforzar a las vacunas de células tumorales modificadas por GMCSF mejora la eficiencia de los vacunas en numerosos modelos tumorales experimentales tales como en carcinoma de mama (Hurwitz et al., 1998, anteriormente mencionado), cáncer primario prostético (Hurwitz et al., Cáncer Research 2000; 60: 2444-8) y melanoma (van Elsas et al. J. Exp. Med. 1999, 190: 355-66). En estos casos, los tumores no inmunogénicos, tales como el melanoma B16, se ha vuelto susceptibles a la destrucción por el sistema inmune. La vacuna de célula tumoral también puede modificarse para expresar otros activadores inmunes tales como IL2, y moléculas coestimulantes, entre otros. El estudio de la expresión génica y de los patrones de expresión génica a gran escala en diversos tumores ha llevado a la definición de los denominados "antígenos específicos del tumor" (Rosenberg, Immunity 1999; 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos del tumor son antígenos para diferenciación expresados en los tumores y en la célula a partir de la cual se genera el tumor, por ejemplo los antígenos de melanocito gap100, antígenos MAGE, Trp-2. De manera más importante, se puede mostrar que muchos de estos antígenos son blancos para células T específicas del tumor encontradas en el hospedero. El bloqueo de CTLA-4 se puede utilizar como un agente de refuerzo en conjunción con vacunas basadas en versiones recombinantes de proteínas y/o péptidos que se expresan en un tumor con el objeto de potenciar una respuesta inmune secundaria o de memoria a estas proteínas. Normalmente estas proteínas se ven por el sistema inmune como antígenos propios y por lo tanto son tolerantes a las mismas. El antígeno tumoral también puede incluir a la proteína telomerasa, la cual se requiere para la síntesis de telómeros de cromosomas y la cual se expresa en más del 85% de cánceres de humano y en solamente un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al., Science 1994; 266: 2011-2013). Estos tejidos somáticos se pueden proteger a partir del ataque inmune mediante diversas formas. El antígeno tumoral también puede ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteína o que crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (por ejemplo bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo a partir de células B tumorales. Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas a partir de virus implicados en cánceres de humano tales como los virus del papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (HBV y HCV) y virus del sarcoma del herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico al tumor la cual se puede utilizar en conjunción con el bloqueo de CTLA-4 son las proteínas de choque térmico purificadas (HSP) aisladas a partir del tejido tumoral mismo. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos o proteínas a partir de las células tumorales y estas HSP son altamente eficientes para su administración a células presentadoras del antígeno para la producción de la inmunidad tumoral (Suot y Srivastava, Science 1995; 269: 1585-1588; Tamura et al., Science 1997, 278: 117-120. Las células dendríticas (DC) son células presentadoras del antígeno potentes que pueden ser utilizadas para cebar las respuestas específicas del antígeno. Las DC se pueden producir ex vivo y cargar con diversos antígenos de proteína y de péptido así como con extractos de célula tumoral (Nestle et al., Nature Medicine 998; 4: 328-332). Las DC también se pueden transducir mediante formas genéticas para expresar también estos antígenos tumorales. Las DC también se han fusionado directamente a las células tumorales para los propósitos de inmunización (Kugler et al., Nature Medicine 2000; 6: 332-336). Como un método de vacunación, la inmunización de la DC se puede reforzar efectivamente con el bloqueo de CTLA-4 para activar respuestas anti-tumorales más potentes. Otro tipo de vacuna para melanoma que puede combinarse con el bloqueo de CTLA-4 es una vacuna preparada a partir de un lisado de línea celular de melanoma, en conjunción con un adyuvante inmunológico, tal como la vacuna MELACINE®, una mezcla de lisados a partir de dos líneas celulares de melanoma de humano más el adyuvante inmunológico DETOX™. El tratamiento de vacuna se puede reforzar con anti-CTLA4, con o sin tratamiento quimioterapéutico adicional. El bloqueo de CTLA-4 también se puede utilizar para reforzar la inmunidad inducida a través de tratamientos estándares para el cáncer. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr et al., Cáncer Research, 1998; 58: 5301-5304). La racionalidad científica detrás del uso combinado del bloqueo CTLA-4 y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debe producir niveles incrementados del antígeno tumoral en la ruta para presentación del antígeno. Por lo tanto, CTLA-4 puede reforzar una respuesta inmune cebada para permitir la quimioterapia de las células tumorales. Además, la actividad inmunoestimulante de CTLA-4 es útil para superar los efectos ¡nmunosupresores de la quimioterapia. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos con los cuales el tratamiento anti-CTLA-4 se puede combinar incluyen, pero no se limitan a, aldesleucina, altretamina, amifostina, asparaginasa, bleomicina, capecitabina, carboplatina, carmustina, cladribina, cisaprida, cisplatina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, docetaxel, doxorubicina, dronabinol, epoetina alfa, etopósido, filgrastima, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, granisetron, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, interferón alfa, irinotecano, lansoprazol, levamisol, leucovorina, megestrol, mesna, metotrexato, metoclopramida, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, omeprazol, ondansetron, paclitaxel (Taxo®), pilocarpina, procloroperazina, rituximab, tamoxifen, taxol, clorhidrato de topotecanio, trastuzumab, vinblastina, vincristina y tartrato de vinorelbina. Para el tratamiento del cáncer prostático, un agente quimioterapéutico preferido con el cual se puede combinar el anti-CTLA-4 es paclitaxel (Taxol ®). Para el tratamiento del cáncer tipo melanoma, un agente quimioterapéutico preferido con el cual se puede combinar el anti-CTLA-4 es dacarbazina (DTIC). Otras terapias de combinación que pueden resultar en el cebado del sistema inmune a través de la muerte celular o radiación, y deprivación hormonal (Know, E. et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1999; 96 (26): 15074-9. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el hospedero. Por ejemplo, cualquier manipulación del tumor en el tiempo de la cirugía puede incrementar en gran medida el número de células cancerosas en la sangre (Schartz, et al., Principies of Surgery 984. 4a edición p. 338). Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con el bloqueo de CTLA-4. La inhibición de la angiogénesis lleva a la muerte de la célula tumoral lo cual puede alimentar el antígeno tumoral dentro de las rutas de presentación del antígeno en el hospedero. Todas estas ocasionan liberación tumoral y posiblemente cebado del sistema inmune que el bloqueo al CTLA-4 puede reforzar.

Enfermedades infecciosas Otros métodos de la invención se utilizan para tratar pacientes que han sido expuestos a toxinas o patógenos particulares. De manera similar a su aplicación a los tumores como se discutió anteriormente, el bloqueo de CTLA-4 mediado por el anticuerpo se puede utilizar solo, o como un adyuvante, en combinación con las vacunas, para estimular la respuesta inmune secundaria o de memoria a los patógenos, toxinas, y auto-antígenos. Se ha mostrado que el bloqueo del CTLA-4 es efectivo en la fase aguda de infecciones de Nippostrongylus brasiliensis (McCoy, K. Et al. (1997) 186(2); 183-187) y de Leishmania donovani (murphy, M. et al. (1998) J. Immunol. 161 : 41 53-4160). Los ejemplos de patógenos para los cuales este método terapéutico puede ser particularmente útil incluye patógenos para los cuales no existen actualmente vacunas efectivas, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente efectivas. Estos incluyen, pero no se limitan a VIH, Hepatitis (A, B, y C), Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, y Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de CTLA-4 es particularmente útil en el refuerzo de la inmunidad en contra de infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados durante el curso de las infecciones. Estos epítopes novedosos se reconocen como externos en el momento de la administración de anti-CTLA-4 de humano, provocando así una fuerte respuesta de la célula T que no es amortiguada por las señales negativas a través de CTLA-4. Algunos ejemplos de virus patogénico que ocasionan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la invención incluyen hepatitis (A, B, o C), herpes virus (por ejemplo, VZV, HSV-1 , HAV-6, HSV-II, y CMV, virus Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flaviviruses, ecovirus, rinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus de la vaccina, virus HTLV, virus del dengue, papilomavirus, virus moluscum, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis arboviral.

Algunos ejemplos de bacterias patogénicas que ocasionan infecciones que se pueden tratar mediante los método de la invención incluyen clamidia, bacteria rickettsial, micobacterla, estafilococos, estreptococos, neumonococos, menlngococos y conococos, klebsiela, proteus, serratia, pseudomonas, legionela, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, plaga, leptospirosis, y bacterias de la enfermedad de Lyme. Algunos ejemplos de hongos patogénicos que ocasionan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la invención incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc.), Ctyptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc.), Género Mucorales (Mucor, Absidia, Rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioidesimmitis e Histoplasma capsulatum. Algunos ejemplos de parásitos patogénicos que ocasionan infecciones que se pueden tratar mediante los métodos de la invención incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambía, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesíamicroti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.

Promoción de reacciones benéficas "autoinmunes" La capacidad de los anticuerpos anti-CTLA-4 para provocar y amplificar respuestas autoinmunes ha sido documentada en diversos sistemas experimentales (EAE-Encefalomielitis Autoinmunes Experimental, un modelo para MS de murino (Perrin et al., J Immunol 1996; 157: 1333-1336); diabetes (Luhder et al., 1998, anteriormente mencionado). De hecho, la inducción de las respuestas anti-tumorales utilizando vacunas de célula tumoral y de péptidos tumorales revela que muchas respuestas anti-tumorales implican reactividades anti-propias (la despigmentación observada en melanoma anti-CTLA-4 + GM-CSF B16 modificado en van Elsas et al. anteriormente mencionado; despigmentación en protones vacunados con Trp-2 (Overwijk et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 1999 96: 2982-2987); prostatitis autoinmune provocada por vacunas de célula tumoral de TRAMP (Hurwitz 2000, anteriormente mencionado), vacunación del antígeno del péptido de melanoma y vitíligo observado en ensayos clínicos en humano (Rosenberg y White, J Immunother Emphasis Tumor Immunol 1996; 19: 81-4). Por lo tanto, es posible considerar el uso del refuerzo con anti-CTLA-4 en conjunción con diversas auto-proteínas con el objeto de planear protocolos de vacunación para generar eficientemente respuestas inmunes en contra de estas auto-proteínas para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica una acumulación inapropiada del péptido ?ß en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas del anticuerpo en contra del amiloide son capaces de eliminar estos depósitos de amiloide (Schenk et al., Nature 1999; 400: 173-177). Otras auto-proteínas también pueden ser utilizadas como blancos tales como IgE para el tratamiento de la alergia y del asma, y TNF para la artritis reumatoide. Finalmente, las respuestas del anticuerpo a diversas hormonas pueden ser inducidas por el uso del anticuerpo anti-CTLA-4. La neutralización de las respuestas del anticuerpo a las hormonas reproductoras se puede utilizar para la anticoncepción. La neutralización de las respuestas del anticuerpo a las hormonas y a otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también se puede considerar como blancos posibles de vacunación. Los métodos análogos como se describieron anteriormente para el uso del anticuerpo anti-CTLA-4 se pueden utilizar para la inducción de respuestas terapéuticas autoinmunes para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros auto-antígenos, tales como depósitos de amiloide, incluyendo ?ß en la enfermedad de Alzheimer, citocinas tales como TNFa, e IgE.

EJEMPLOS La presente invención también se describe por medio de los siguientes ejemplos. No obstante, el uso de estos o de otros ejemplos en cualquier lugar en la especificación es ilustrativa solamente y no limita en ningún sentido el alcance y significado de la invención o de cualquier término ejemplificado. Similarmente, la invención no se limita a ninguna de las modalidades particulares preferidas descritas en la presente invención. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden ser evidentes a aquellos expertos en la técnica después de la lectura de esta especificación y se pueden realizar sin apartarse de su espíritu y alcance. Por lo tanto la invención se limita solamente por los términos de las reivindicaciones anexas junto con el alcance total de los equivalentes con respecto a las cuales se titulan las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 El tratamiento anti-CTLA-4 mejora las respuestas del anticuerpo secundario y de célula T a la vacuna de célula de melanoma en monos Cynomolgus La capacidad del anticuerpo anti-CTLA-4 de humano de la invención para mejorar las respuestas del anticuerpo y de la célula T a una vacuna de célula de melanoma se examinó en monos cynomolgus (obtenidos a partir de Primate Products, Miami, Florida). Grupos prueba de seis monos cada uno (tres machos, tres hembras) fueron tratados ya sea con 1) una vacuna de célula de melanoma sola (SK-mel-3, una línea de célula tumoral de melanoma de humano transfectada para expresar G -CSF) o 2) ambos SK-mel-3 y el anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 descrito en WO 01/14424. Una vacuna de célula total pudo permitir la investigación de las reacciones autoinmunes a una variedad de tejidos normales en este modelo animal, sin importar el hecho de que la vacuna celular fue de origen humano. Para preparar la vacuna, las células SK-mel se crecieron hasta confluencia y se cosecharon. Las células se trataron con mitomicina C, se lavaron varias veces y se resuspendieron a 1x 107/ml en solución salina. El anticuerpo se administró de manera intravenosa a una dosis de 10 mg/kg en un volumen de 1.3 ml/kg. Las células SK-mel-3 se administraron subcutáneamente en una cantidad fija (5 x 106 células/animal a 0.5 ml/animal). Cada preparación de vacuna se evaluó para producción de endotoxina (< 2 UE/ml) y de GM-CSF después de 48 horas (2-8 ng/ml por 106 células). El anticuerpo apropiado y/o la vacuna fueron administrados a los días 0, 28, 56, 84 y 140. Las respuestas del anticuerpo a la vacuna de célula de melanoma fueron evaluadas a los días 13, 41 , 69 y 97 utilizando citometría de flujo. El estado de salud de los monos se evaluó dos veces semanalmente y los pesos corporales se registraron semanalmente. Los análisis hematológicos, farmacocinéticos y ensayos funcionales fueron llevados a cabo antes del inicio del estudio y periódicamente a lo largo del estudio. Un examen patológico completo a nivel macroscópico y microscópico se llevó a cabo al día 167. Se examinó la especificidad de las respuestas del anticuerpo en los animales tratados con la vacuna de melanoma y con el anticuerpo anti-CTLA-4. El plasma a partir de 6 monos cynomolgus tratados con la vacuna SK-mel-3 y con el mAb 10D1 se obtuvo al día 41 de tratamiento y se agrupó. El plasma se diluyó 1:1000 y se evaluó para reactividad a una variedad de líneas celulares de melanoma y no de melanoma mediante citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura 1 , la cual demuestra que las respuestas del anticuerpo en los monos mostraron una mayor especificidad para las líneas celulares de melanoma de humano en comparación con las líneas celulares no de melanoma de humano o con las líneas celulares no de humano. El efecto de la dosificación crónica de los monos tratados con el anticuerpo y/o con la vacuna se evaluó después de la administración de una dosis adicional al día 140. La concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 se monitoreó mediante ELISA con CTLA-4 recombinante en diversos puntos de tiempo durante el curso del estudio hasta el día 160. Las concentraciones plasmáticas de 10D1 se determinaron a partir de diluciones de muestras analizadas en contra de una curva estándar. Los datos para la concentración plasmática de 10D1 durante la dosificación crónica se muestran en la figura 2, en donde se presenta la media +/- SEM de los seis animales tratados. Los resultados demuestran que los niveles plasmáticos del anticuerpo anti-CTLA-4 permanecen por arriba de los niveles detectables por todo el curso del periodo de 160 días, sugiriendo que el bloqueo de CTLA4 se mantuvo a lo largo del periodo de tratamiento. La concentración plasmática media para mAb 10D1 en los monos tratados tuvo un pico entre 175 y 315 µg/ml en el día post-infusión, y permaneció por arriba de 20 µg/ml durante los seis meses de estudio. La química clínica, observaciones en caja lateral, y análisis histológico completo no revelaron ninguna alteración significativa relacionada con la administración del anticuerpo o de la vacuna. La dosificación crónica no produjo patología relacionada con el tratamiento excepto por una ligera irritación en el sitio de inyección de la vacuna en dos monos, sin importar la capacidad potencial del bloqueo de CTLA-4 para establecer respuestas autoreactivas anti-melanocito. Los monos no desarrollaron ninguna respuesta detectable del anticuerpo al mAb 10D1 y se mantuvieron niveles altos de anticuerpo en circulación activa por la duración del estudio. Además, esta dosificación crónica con el anticuerpo anti-CTLA-4 estuvo asociada con la eficiencia del tratamiento y no estuvo asociada con los efectos laterales detrimentales (por ejemplo, activación de célula T no especifica). Por lo tanto, este experimento demuestra que los primates se pueden tratar efectivamente por periodos extendidos de tiempo con un anticuerpo anti-CTLA-4 de tal manera que las concentraciones plasmáticas se mantienen por arriba de los niveles detectables por al menos 1 , 2, 3, 4 0 5 meses o incluso más tiempo sin efectos laterales serios.

EJEMPLO 2 Evidencia de proliferación de célula T especifica del antígeno a partir de experimentos de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH) en humanos Diecinueve pacientes con melanoma resecado etapa III (2 pacientes) o IV (17 pacientes) recibieron dosis escalares (0.3, 1 y 3 mg/kg) del anticuerpo CTLA-4 10D1 con cada inyección de la vacuna del péptido gp100/tirosinasa/MART-1 con adyuvante incompleto de Freund. La tirosinasa 368-376 (370D), MART-1 26-35 (27L) y los péptidos gp100209-217 (210M) difirieron cada uno a partir del tipo silvestre por una modificación en un aminoácido para incrementar la unión del HLA. La vacuna se administró ocho veces durante doce meses a 1 mg/dosis/péptido. Las respuestas inmunes medidas por la reactividad de DTH indicaron que cuatro de nueve pacientes respondieron a gp100 y dos de nueve pacientes respondieron a MART-1. Los ensayos ELISPOT mostraron respuestas inmunes en cuatro de 16 pacientes evaluados utilizando células T CD8 recientemente preparadas.

EJEMPLO 3 Resultados a partir de ensayos clínicos en fase I en humano de MAb 10D1 de melanoma (MPXCTLA4-02) DXCTLA4-02 fue un ensayo clínico multicéntrico en fase I de marca abierta, para evaluar la seguridad y farmacocinéticas del MAb 10D1 en diecisiete pacientes con melanoma progresivo, que no se puede resecar, maligno. La edad media fue de 59 años (intervalo de 29-79). Nueve pacientes habían recibido inmunoterapia previa, seis habían recibido radiación previa y cinco habían recibido quimioterapia previa. Todos los pacientes recibieron una dosis particular de 3 mg/kg de 10D1 de manera intravenosa durante 90 minutos y luego fueron seguidos para toxicidad, farmacocinéticas, activación de célula T en circulación y éxito clínico. Todas las infusiones fueron completadas con solamente eventos moderadamente adversos. Siete pacientes tuvieron salpullidos o prurito moderados, reversibles. Los niveles plasmáticos del anticuerpo persistieron de uno a cuatro meses. No hubo un incremento significativo en las células T periféricas activadas y no hubo evidencia de autoinmunidad clínica más allá del salpullido moderado. Dos pacientes experimentaron una respuesta parcial incluyendo la resolución de tres masas de tejido suave y más del 50% en la reducción de una masa pulmonar. Además, el paciente que experimentó la reducción de más del 50% en la masa pulmonar fue un paciente que previamente había sido tratado con una vacuna de melanoma, sugiriendo que el tratamiento con el anticuerpo anti-CTLA-4 fue capaz de activar una respuesta de memoria preexistente al tumor. Los resultados de este estudio indican que el tratamiento con anti-CTLA-4 fue bien tolerado con una clara evidencia de actividad inmunológica y antitumo ral. Las subpoblaciones de linfocitos en pacientes tratados con 10D1 se analizaron mediante citometría de flujo a diversos puntos de tiempo después del tratamiento con el anticuerpo. Los resultados se resumen a continuación en el cuadro 1 , a continuación.

CUADRO 1 Análisis de citometría de flujo de subpobíacíones de linfocitos en sujetos con cáncer tipo melanoma tratados con 3.0 mg/Kg de MAb 10D1 De manera similar a los resultados observados en los pacientes con cáncer de próstata (véase el ejemplo 6 a continuación), los resultados en el estudio del melanoma demostraron que el tratamiento con 10D1 llevó a un incremento de aproximadamente el 50% en la subpoblación de CD4/HLA-DR+ durante el tiempo. Las otras subpobíacíones de linfocitos permanecieron esencialmente constantes durante el tiempo. Como se describió anteriormente, la capacidad del tratamiento con el anticuerpo anti-CTLA4 para incrementar la subpoblación de CD4/HLA-DR+ durante el tiempo se puede utilizar como una característica selectiva cuando se evalúan los anticuerpos anti-CTLA4 (por ejemplo, un panel de anticuerpos anti-CTLA4 se puede evaluar por su capacidad para incrementar a la subpoblación de CD4/HLA-DR+ y se puede seleccionar un anticuerpo anti-CTLA4 que es capaz de incrementar a esta subpoblación durante el tiempo). Además, el monitoreo de las subpoblaciones de linfocitos durante el tiempo, en particular de la subpoblación CD4/HLA-DR+, se puede llevar a cabo en sujetos que son tratados con anti-CTLA4 como un marcador de la efectividad del anticuerpo.

EJEMPLO 4 Estudio en humanos del bloqueo del anticuerpo anti-CTLA-4 en pacientes con cáncer tipo melanoma y con cáncer ovárico previamente vacunados A nueve pacientes con cáncer avanzado previamente inmunizados se les administró el anticuerpo anti-CTLA-4 10D1. Los pacientes 1-6 fueron enrolados a través del ensayo de fase I MDXCTLA4-02 con un criterio de elegibilidad de melanoma que no se puede resecar quirúrgicamente en etapa III o IV, progresión de la enfermedad, una expectativa de vida de al menos 12 semanas, función orgánica terminal adecuada, terapia analgésica estable, y un estado de desempeñó Kamofsky de al menos 60%. Los pacientes fueron excluidos si éstos tenían una segunda malignidad (diferente al cáncer de piel tipo no melanoma tratado o cáncer vesicular superficial), enfermedad autoinmune, infección activa, hipersensibilidad a la canamicina; o si ellos utilizaban corticosteroides. Los pacientes 7-9 fueron enrolados a través de un ensayo de fase I para pacientes con melanoma metastásico, carcinoma ovárico metastásico, carcinoma pulmonar metastásico de células no pequeñas o leucemia mielógena aguda. Cuatro pacientes se trataron previamente para el melanoma en etapa temprana (tres pacientes recibieron interferón-ct, un paciente recibió una vacuna del gangliósido GM2 mezclado con QS-21 , un paciente recibió radiación). Los tratamientos previos no inmunológicos para el melanoma metastásico incluyeron cirugía (cuatro pacientes), radiación (dos pacientes), quimioterapia (tres pacientes), e inhibidor del proteosoma (un paciente). Los dos pacientes con cáncer ovárico recibieron múltiples quimioterapias por enfermedad recurrente durante tres a cuatro años precediendo al estudio. Todos los pacientes participaron en los estudios de vacuna en fase I para enfermedad metastásica antes de entrar en este estudio. Los tres pacientes con cáncer tipo melanoma y ambos pacientes con cáncer ovárico fueron inmunizados con células tumorales autólogas irradiadas, diseñadas para secretar GM-CSF por transferencia de gen mediada por adenovirus. Uno de los pacientes (paciente 8) también recibió una vacuna de MUC-1. Tres pacientes con melanoma fueron inmunizados con células dendríticas autólogas diseñadas para expresar gp100 y MART-1 por transferencia de gen mediada por adenovirus. Un paciente con melanoma fue vacunado con un péptido gp100 modificado y con altas dosis de interleucina-2. Inicialmente, 10D1 se administró de manera intravenosa a una dosis de prueba de 0.2 mg en 10 mi de solución salina normal durante diez minutos para identificar las reacciones de hipersensibilidad potenciales. El remanente de la dosis de 3 mg/kg de 10D1 se administró intravenosamente durante noventa minutos. Después de la administración del anticuerpo, a los pacientes se les sometió a evaluación clínica, de laboratorio y radiográfica diariamente por tres días, luego semanalmente por cuatro semanas y luego mensualmente. Un paciente tuvo una reacción de hipersensibilidad aguda manifestada por hipotensión moderada y náusea durante la infusión. La reacción se manejó fácilmente con anti-histaminas y la infusión se completó sin novedad. Cinco pacientes tuvieron síntomas constitucionales transitorios grado l/ll incluyendo mialgia, artralgia, anorexia, fatiga, congestión nasal, y tos por dos a siete días después de la infusión. Un paciente tuvo síntomas intermitentemente recurrentes por varios meses. Un paciente manifestó una anormalidad de la función hepática transitoria grado III. Los tres pacientes con melanoma previamente vacunados con células tumorales autólogas irradiadas, que secretan GM-CSF tuvieron necrosis tumoral extensiva después del tratamiento con 10D1. El paciente 1 tuvo metástasis en el sistema nervioso central, pulmón, abdomen y tejidos suaves después de ser enrolado en el estudio. Un mes después de la administración de 10D1 , el paciente 1 exhibió cambios químicos en su estado neurológico y una lesión subcutánea se inflamó de manera aguda. El paciente 1 murió seis días después. Durante la autopsia, se evidenció una marcada necrosis tumoral hemorrágica del cerebro, metástasis epidurales y viscerales. El examen histopatológico demostró destrucción tumoral extensiva (al menos 90%) con hemorragia. Dos vasos sanguíneos fueron severamente dañados produciendo necrosis isquémica extensiva. Un borde de células tumorales viables permaneció en cada lesión acompañada por una reacción de granulocitos y de linfocitos. El paciente 2 tuvo síntomas constitucionales recurrentes grado II que empezaron un mes después de la infusión de 10D1. La biopsia de una lesión mediastinal mostró necrosis tumoral extensiva con infiltrados de linfocitos y granulocitos. La inmunohistoquímica mostró la presencia de células T CD4+ y CD8+ y linfocitos B CD20+ productores de inmunoglobulina. La lesión mediastinal fue completamente resecada dos meses después. El análisis patológico de la lesión mostró fibrosis densa, necrosis extensiva, y una respuesta de linfocitos y granulocitos en progreso. También se evidenció una vasculopatía caracterizada por un infiltrado linfoide circunferencial en la pared de un vaso sanguíneo ocluido. La necrosis tumoral estuvo relacionada especialmente al daño de los vasos sanguíneos. El paciente 7 desarrolló inflamación en una lesión subcutánea grande tres semana después de la infusión con 10D1. La lesión se disecó dos meses después de la infusión. El examen patológico de la lesión mostró necrosis tumoral extensiva y fibrosis, una vasculopatía prominente, e infiltrados de linfocitos y granulocitos. Los efectos anti-tumorales menos dramáticos se evidenciaron en los cuatro pacientes con melanoma previamente inmunizados con antígenos definidos melanosomales. El paciente 3 se sometió a resecado de una lesión mediastinal que se agrandó siete meses después de la infusión. El análisis patológico mostró un infiltrado linfocítico denso sin necrosis tumoral. La inmunohistoquímica mostró la presencia de células CD8+, pero no de células CD4+ o CD20+. El paciente 4 tuvo un infiltrado similar de células CD4+ sin necrosis tumoral en una metástasis de nodulo linfático, la cual se disecó dos meses después de la infusión del anticuerpo. El paciente 5 no tuvo infiltrados linfoides o necrosis tumoral en una lesión subcutánea, la cual se resecó dos meses después de la infusión del anticuerpo. El paciente 6 no se sometió a biopsia y su tumor progresó. La infusión del anticuerpo produjo cambios en los niveles de CA-125 en los dos pacientes con carcinoma ovárico. CA-125 se difunde a partir de la superficie de las células del carcinoma ovárico y es un marcador útil del estado de enfermedad. (Jacobs, I. (1994) Gyn. Oncol. 55: S22-27). El paciente 8 tuvo una reducción del 43% en los valores CA-125 (230 a 132) que empezó dos meses después de la infusión del anticuerpo. Esta respuesta no se mantuvo pero una segunda infusión de 10D1 estabilizó los niveles de CA-125 por dos meses. El paciente 9 tuvo una nivelación de los valores de CA-125 un mes después de la infusión del anticuerpo con una reducción concomitante en la ascitis. El paciente 9 tuvo una elevación rápida de CA-125 antes de la infusión. Los bajos títulos de anticuerpos (anticuerpos anti-nucleares, anticuerpos anti-tiroglobulina, factor reumatoide) que persistieron por 1-2 meses fueron evidentes en cuatro pacientes. No hubo evidencia clínica de enfermedad autoinmune. Todos los pacientes con melanoma desarrollaron un prurito reticular y eritematoso asintomático grado I en el tronco y en las extremidades entre los tres días y las tres semanas después de la infusión del anticuerpo. Siete pacientes se sometieron a una biopsia de piel. Cinco de los siete pacientes que se sometieron a biopsia tuvieron infiltrados prominentes de células T peri-vasculares en la dermis superficial que se extendieron hacia la epidermis. Las células T CD4+ y CD8+ se encontraron yuxtapuestos a los melanocitos que estaban muriendo. El vitíligo no fue evidente químicamente. La hipo-pigmentación focal, moderada, de la retina se evidenció en un paciente, pero no se afectó la agudeza visual. Un paciente con carcinoma ovárico desarrolló un prurito eritematoso en la cara y en el tronco dos semanas después de la infusión. La biopsia de piel mostró infiltrados de célula T peri-vasculares en la dermis superficial pero no hubo reactividad hacia los melanocitos. 10D1 indujo un incremento significativo en los neutrófilos circulantes, y los infiltrados de neutrófilos se asociaron con la necrosis tumoral. Los resultados muestran que una infusión particular del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 puede tener efectos anti-tumorales significativos y se puede administrar con seguridad a pacientes humanos. La generación de bajos títulos de autoanticuerpos muestra que la terapia puede, al menos parcialmente, comprometer la tolerancia sistémica pero no hubo evidencia clínica de enfermedad autoinmune.

EJEMPLO 5 Estudio de la administración del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 en conjunción con las vacunas del péptido a los pacientes con melanoma Catorce pacientes con melanoma progresivo en etapa IV recibieron el anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 en conjunción con vacunación con dos péptido gp100 restringidos a HLA-A*0201. Las características del paciente se resumen en el cuadro 2, a continuación.

CUADRO 2 C = quimioterapia, I = inmunoterapia, R = radioterapia, S = cirugía. 2 Un ciclo de tratamiento consiste de una infusión del anticuerpo CTLA-4 y una vacunación con los péptido gp100: 209- 217 (210 ) y gp100 .280-288 (288V). 3NR = sin respuesta, PR = respuesta parcial, CR = respuesta completa. 4ANA = anticuerpo anti-nuclear. Todos los pacientes fueron HLA*0201+ con un estado de desempeño de Karnofsky > 60%. Seis pacientes tuvieron metástasis viscerales. Los pacientes no tuvieron evidencia de enfermedad autoinmune o de inmunodeficiencia. Todos los pacientes tuvieron cirugía previa para sus lesiones primarias. Seis pacientes tuvieron quimioterapia previa. Once pacientes tuvieron inmunoterapia previa incluyendo interferón-a (pacientes 2, 5-8, 10, 12 y 13), IL-2 a baja dosis (pacientes 2, 5 y 13), IL-2 intravenosa a alta dosis (pacientes 4, 7 y 8), vacunas de célula completa de melanoma (pacientes 1 , 2 y 6), vacuna del péptido NY-ESO-1 (pacientes 4 y 5), y GM-CSF (paciente 9). Los pacientes no tuvieron inmunización previa con gp100 y no tuvieron terapia sistémica en las tres semanas antes del tratamiento. Un ciclo de tratamiento se administró cada tres semanas, el cual consistió del anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 a 3 mg/kg administrado de manera intravenosa durante 90 minutos seguido por 1 mg de péptido gp100: 209-217 (210M) (IMDQVPFSV) emulsificado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) inyectado subcutáneamente en una extremidad y 1 mg de péptido gp100: 280-288 (288V) (YLEPGPVTV) emulsificado en IFA inyectado subcutáneamente en una segunda extremidad (los péptidos sintéticos se proveyeron por the National Cáncer Institute Cáncer Therapy Evaluation Program). Los pacientes se sometieron a aféresis antes del tratamiento y tres semanas después de cada dos ciclos de tratamiento. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron mediante separación en Ficoll-Hypaque y se conservaron en congelación en suero AB de humano inactivado mediante calor con 10% de dimetilsulfóxido y se almacenaron a -180°C hasta su uso posterior. Los pacientes recibieron de 1 a 6 ciclos de tratamiento (cuadro 2). La respuesta clínica se evaluó utilizando tomografía axial computarizada (CT) del tórax, abdomen y pelvis; y formación de imagen por resonancia magnética (MRI) del cerebro. Estos estudios de imágenes se llevaron a cabo dentro de las 4 semanas del inicio del tratamiento y luego posteriormente cada dos ciclos de tratamiento. Los estudios radiológicos adicionales se utilizaron como fuera necesario para evaluar los sitio de enfermedad. Se calculó la suma de los diámetros más largo de los tumores en cada paciente (criterios de la World Health Organization RECIST) antes y después del tratamiento. Una respuesta parcial se definió como una disminución de al menos 30%, pero menor al 100%, en la suma de los diámetros más largos de todas las metástasis que se podían evaluar con duración de al menos un mes, y sin formación de tumores nuevos o agrandamiento tumoral. Una respuesta completa se definió como una disminución del 100% en la suma de los diámetros más largo de todas las metástasis que se podían evaluar con duración de al menos un mes, y sin tumores nuevos. Una no respuesta se definió como una respuesta que no fue una respuesta parcial ni una respuesta completa. Los pacientes fueron evaluados para respuestas autoinmunes.

Los pacientes recibieron un examen oftalmológico antes del tratamiento y tres meses después del inicio del tratamiento. Todos los pacientes tuvieron pruebas sanguíneas de suero negativo antes del inicio del estudio para tiroglobulina Ab, factor reumatoide y anticuerpo anti-nuclear. Se midieron los Ab anti-humano de humano (anti-idiotípico), velocidad de sedimentación del eritrocito, Ab anti-nuclear, hormona estimulante de la tiroides y niveles libres de T4 cada tres semanas durante el estudio. Las concentraciones plasmáticas de 10D1 se determinaron utilizando ELISA estándar con pozos para microtitulación revestidos con CTLA-4-lg (R & D Systems, Minnepolis, Minnesota). Las diluciones de las muestras de plasma se incubaron en las placas. La unión del Ab anti-CTLA-4 se detectó con una sonda específica anti-lgG F(ab) humano de cabra marcada con fosfatasa alcalina, la cual se desarrolló con sustrato p-NPP. Un ensayo de sensibilización in vitro por doce días, el cual es más sensible que los ensayos ELISPOT o de tetrámero, se utilizó para evaluar la reactividad inmunológica en los once pacientes con PBMC disponibles para evaluación. (Rosenberg, S. A. et al., Nat. Med. 1998; 4: 321-327). Las PBMC conservadas en congelamiento se descongelaron y se cultivaron en medio basado en medio completo de Iscove con 10% de suero AB de humano inactivado mediante calor con 1 µ? del péptido gp100: 209-217 nativo o el péptido gp100: 280-288 y 300 Ul/ml de IL-2. Las células se cosecharon 11 a 13 días después del inicio del cultivo y se co-incubaron con células tumorales o con células T2 pulsadas con el péptido durante toda la noche. La liberación del interferón-? (IFN-?) en el sobrenadante se midió utilizando ensayos comerciales de ELISA (Pierce-Endogen, Rockford, Illinois). Los once pacientes exhibieron inmunización exitosa en contra del péptido gp 00: 209-217 nativo después de uno a cuatro ciclos de tratamiento. Seis pacientes fueron inmunizados exitosamente en contra del péptido gp100: 280-288 nativo. Los análisis de citometría de flujo se llevaron a cabo después del bloqueo del receptor Fe y de la tinción con los anticuerpos (BD Biosciences, San Diego, California) o con los tetrámeros (Beckman Coulter Immunomics, San Diego, California). Se comparó la expresión del marcador de superficie sobre las PB C de nueve pacientes antes y después de dos ciclos de tratamiento. La activación del HLA-DR (un marcador de activación) se incrementó significativamente en las células CD3+CD4+ después de la terapia (P= 0.0004; prueba-t apareada) y en las células CD3+CD4+ (presumiblemente CD8+) (P= 0.04). Las células CD3+CD4+ también mostraron una expresión significativamente incrementada de CD45RO (un marcador de célula de memoria) post-terapia (P= 0.04). El porcentaje de poblaciones celulares que expresan CD69, CD25 y CTLA-4 no cambió.

Los pacientes 1 , 11 y 13 respondieron a la terapia (cuadro 15). El paciente 1 tuvo un encogimiento de una lesión pulmonar solitaria después de dos ciclos de tratamiento. El paciente 13 tuvo encogimiento de una lesión pulmonar solitaria y resolución completa de una lesión subcutánea después de dos ciclos de tratamiento. El paciente 11 tuvo 31 lesiones pulmonares, dos lesiones subcutáneas y una lesión cerebral. La lesión cerebral creció de 0.5 cm a aproximadamente 1.0 cm después de dos ciclos de tratamiento. Después de tres ciclos de tratamiento adicionales, el paciente 11 tuvo una resolución completa de todas las lesiones, incluyendo la lesión cerebral. El paciente 3 tuvo una respuesta mezclada en la cual diversas lesiones pulmonares se resolvieron después de cuatro ciclos de tratamiento pero los nodulos linfáticos mediastinales se alargaron. El paciente 10 tuvo un encogimiento significativo de una lesión hiliar y de otras varias lesiones pulmonares después de dos ciclos de tratamiento, pero otras lesiones pulmonares se agrandaron. Los eventos adversos grado l/ll incluyeron diarrea (pacientes 3, 5 y 14), prurito de la piel (paciente 14), infiltrados pulmonares y dolor pleurítico moderado del tórax (paciente 4) y vitíligo (pacientes 2 y 6). Seis pacientes desarrollaron siete eventos adversos grado lll/IV incluyendo dermatitis (pacientes 1 , 2 y 13), colitis/entercolitis (pacientes 1 y 9), hipofisitis (inflamación de la glándula pituitaria) (paciente 11), y hepatitis (paciente 12). Todos los pacientes se recuperaron después de la discontinuación del tratamiento y la administración de cuidado sustentador y/o terapia esteroidal. No se presentaron recurrencias o eventos autoinmunes subsecuentes. Las pruebas sanguíneas de selección de autoinmunidad fueron normales excepto para los pacientes 5 y 12 los cuales desarrollaron Ab anti-nuclear. Este estudio demostró la evidencia objetiva de regresión de tumor tipo melanoma metastásico en pacientes que recibieron el anticuerpo anti-CTLA-4 10D1 en conjunción con dos vacunas de péptidos.

EJEMPLO 6 Un ensayo clínico en humano de fase I del MAb 10D1 en cáncer de próstata (MDXCTLA4-01) MDXCTLA4-01 fue un estudio de anticuerpo monoclonal antígeno-4 (anti-CTLA-4) 10D1 (MAb 10D1) asociado al linfocito T anti-citotóxico de marca abierta en pacientes con cáncer prostático progresivo refractario a hormona, metastásico. El tratamiento fue una dosis particular del MAb 10D1 que se administró de manera intravenosa, como una infusión, a una dosis de 3.0 mg/kg. Se seleccionaron para participación en este estudio los pacientes con diagnóstico histológico de adenocarcinoma primario de la próstata, y carcinoma metastásico progresivo de próstata después de la privación de andrógeno y al menos una manipulación no hormonal sistémica. Los criterios para ingreso fueron: enfermedad progresiva que se podía cuantificar, PSA progresivo, PSA > 5 ng/ml, testosterona < 50 ng/dl, supresión de andrógeno gonadal primario, expectativa de vida> 12 semanas, y estado del desempeño de Kamofsky: 60%. Debido a la importancia del monitoreo del estado inmune de los pacientes en el ensayo y el objetivo específico de monitorear los efectos generalizados sobre la activación de la célula T por el anticuerpo anti-CTLA-4, los criterios de ingreso en este estudio incluyeron los niveles mínimos de las células T CD4 y CD8 de 500/ml y > 500/ml respectivamente. No obstante, se observó durante el conteo acumulado inicial en el estudio que los pacientes con cáncer prostético tenían números de células T significativamente reducidos aunque las células T CD4 y CD8 están claramente presentes. Muchos pacientes fueron inicialmente rechazados basándose en los criterios de ingreso anteriormente mencionados. Las cuentas de células T aparentemente reducidas observadas en una observación previamente no documentada en pacientes con cáncer prostático podría tener relevancia en los tratamientos que implican la vacunación contra el cáncer en estos pacientes. De manera subsecuente a estas observaciones, los criterios para ingreso fueron enmendados para incluir a pacientes que tenían cuentas de CD4 y CD8 > 300/ml y > 200/ml respectivamente. Los sujetos fueron sometidos a examen físico, ECG, radiografía de tórax, formación de imagen diagnóstica, y toma de muestra sanguínea para evaluaciones hematológicas, bioquímicas, y de la función inmune. Se utilizaron entrevistas telefónicas mensuales hasta seis meses después del tratamiento para recolectar y registrar la información sobre un sujeto de eventos adversos, incluyendo eventos autoinmunes adversos después de la progresión de la enfermedad. Se monitorearon el PSA (deterioro, duración del deterioro, progresión, tiempo de progresión) y la respuesta a la enfermedad (completa, parcial, estable, progresiva). Las concentraciones plasmáticas del MAb1 OD 1 se evaluaron inmediatamente antes de, durante, y hasta dos meses después de la infusión. Catorce pacientes con HRPC fueron enrolados. La edad media fue de 69 años (intervalos 56-79). Siete pacientes recibieron quimioterapia previa. Todos los pacientes recibieron una dosis particular de 3 mg/kg de 10D1 de manera intravenosa durante 90 minutos y luego fueron seguidos para toxicidad, farmacocinéticas, activación de célula T en circulación y éxito clínico. Todas las infusiones se completaron como se planeó solamente con eventos adversos moderados relacionados con la infusión (AE). El prurito moderado y reversible respondió a la terapia esteroidal oral. Ningún otro AE de grado 3 o mayor estuvo relacionado con 10D1. El perfil farmacocinético se muestra en la figura 3, la cual presenta concentración plasmática en µg/ml. La media +/-SEM se muestra para los 14 pacientes (n=14). Los resultados mostrados en la figura 3 demuestran que los niveles plasmáticos del anticuerpo fueron detectables por hasta 3 meses y el monitoreo adicional encontró que los niveles plasmáticos se pueden detectar por incluso 4 meses. No hubo un incremento significativo en las células T periféricas activadas, y no se presentó autoinmunidad clínica. Dos de 7 pacientes que no tuvieron afección a la quimioterapia tuvieron una respuesta PSA (criterios consenso) que duró 3 y 5 meses, uno con mejoría sintomática. Otros pacientes experimentaron cambios significativos en la pendiente de la curva para PSA. Los pacientes fueron tratados nuevamente con una segunda dosis de 10D1 (3 mg/kg) y después del tratamiento, los pacientes que respondieron previamente al tratamiento experimentaron de nuevo reducciones de PSA sin AE significativo. El tratamiento se toleró bien con una clara evidencia de actividad inmunológica y anti-tumoral. Por lo tanto, estos estudios demuestran que los pacientes humanos pueden ser tratados con un anticuerpo anti-CTLA-4 de tal manera que los niveles plasmáticos del anticuerpo permanecen por arriba de los niveles detectables por 1, 2, 3 o incluso 4 meses sin efectos laterales detrimentales. Las subpoblaciones de linfocitos en pacientes tratados con 10D1 fueron analizadas mediante citometría de flujo a diversos puntos de tiempo después del tratamiento con el anticuerpo. Los resultados se resumen a continuación en el cuadro 3 (los datos se presentan como media +/-SEM).

CUADRO 3 Análisis de citometría de flujo para subpoblaciones de linfocitos en sujetos con cáncer prostético tratados con 3.0 mg/Kg de MAb 10D1.

Los resultados demuestran que el tratamiento con 10D1 produce aproximadamente un incremento del 50% en la subpoblación de CD4/HLA-DR+ durante el tiempo. Las otras subpoblaciones de linfocitos permanecieron esencialmente constantes durante el tiempo. Con el objeto de evaluar si la administración del MAb 10D1 puede inducir activación no deseable de la célula T no especifica, los linfocitos de la sangre periférica a partir de sujetos con cáncer prostético fueron analizados mediante citometría de flujo para cada uno de los siguientes marcadores: CD4, CD8, CD25, CD44, CD69 y HLA-DR. No se observó ningún cambio significativo en la frecuencia de ninguno de estos marcadores durante el curso del tratamiento para cada uno de los sujetos con cáncer prostático tratados hasta ese momento. Un ejemplo de este análisis se muestra en el cuadro 4 el cual muestra la frecuencia de las células positivas a CD4, CD25, CD69 y de las células positivas a CD8, CD25, CD69 en los tiempos antes de, durante, y subsecuentes a la administración del MAb 10D1 en dos de los sujetos. Estos datos demuestran que el MAb 10D1 no produce activación no especifica de célula T.

CUADRO 4 Análisis de citometría de flujo para marcadores de la activación de la célula T en sujetos con cáncer prostático tratados con 3.0 mg/Kg de MAb 10D1.

Número de Punto de tiempo % de CD % de CD paciente (4+25+69) (8+25+69) 3 Evaluación 1.7 0.8 3 -30 MIN (pre- 2.6 0.8 infusión) 3 40 MIN 2.5 0.7 3 130 MIN 1.9 0.9 3 145 MIN 1.7 0.5 3 160 MIN 1.7 1 3 190 MIN 1.5 1.5 3 250 MIN 2.1 1.2 3 370 MIN 1.3 0.9 3 24 HR 1.6 1.6 3 48 HR 2.7 3 Número de Punto de tiempo % de CD % de CD paciente (4+25+69) (8+25+69) 3 72 HR 0.9 0.5 3 Día 7 0.9 0.1 3 Día 14 0.4 0.5 3 Día 21 2.3 1.9 4 Evaluación 1.4 0.8 4 -30 MIN (pre- 0.5 0.3 infusión) 4 40 MIN 0.3 0.1 4 130 MIN 0.3 0.1 4 145 MIN 0.4 0.2 4 160 MIN 0.2 0.2 4 190 MIN 0.8 0.3 4 250 MIN 0.1 0 4 370 MIN 0.3 0.1 4 24 HR 0.2 0.3 4 48 HR 0.4 0.6 4 72 HR 0.8 0.3 4 Día 7 1 0.7 4 Día 14 1.1 0.8 Los resultados a partir del ensayo clínico con MDXCTLA4-01 han demostrado que las infusiones se pueden tolerar solamente con reacciones menores. Se observó una vida media plasmática prolongada del anticuerpo, con el anticuerpo remanente en el plasma por aproximadamente 3 a 4 meses. Se observó evidencia clara de efectos inmunes sin activación significativa no especifica de la célula T. Se observaron alivios y reducciones sintomáticas en niveles de antígenos específicos de la próstata (PSA) en pacientes con cáncer prostático tratados con el anticuerpo anti-CTLA-4. Los resultados representativos para las reducciones en los niveles de PSA se muestran en la figura 4, la cual muestra los niveles de PSA (en ng/ml) en dos pacientes (uno representado por los círculos cerrados, el otro por los círculos abiertos) en diversos puntos de tiempo después de la infusión de 3 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 al día 0. Los resultados demuestran que los niveles de PSA disminuyeron después de la infusión del anticuerpo y permanecieron suprimidos por aproximadamente 3-4 meses después del tratamiento, correlacionando con la presencia del anticuerpo anti-CTLA-4 en el plasma. Algunos otros efectos inmunes menores también se observaron incluyendo erupción cutánea y prurito mediado por el sistema inmune, la seroconversión transitoria a autoanticuerpos positivos, cambios del pigmento de melanina en pacientes con melanoma y reacciones inflamatorias en los sitios del tumor. Excepto por la erupción cutánea y el prurito, todos los efectos inmunes potencialmente adversos fueron subclínicos. En resumen, los resultados en curso a partir de los ensayos clínicos en humano con tratamiento con anticuerpo anti-CTLA-4 demostraron que el anticuerpo es bien tolerados y estimula los efectos inmunes en los recipientes.

Referencias citadas Numerosas referencias, incluyendo patentes, solicitudes de patente y diversas publicaciones, se citan y discuten en la descripción de esta invención. La cita y/o discusión de dichas referencias se proveen meramente para aclarar la descripción de la presente invención y no es una admisión de que cualquiera de dichas referencias es una "técnica precedente" a la invención descrita aquí. Todas las referencias citadas y discutidas en esta especificación se incorporan en la presente invención como referencias en su totalidad y hasta el mismo grado como si cada referencia se incorporara individualmente como referencia.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- El uso de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CTLA-4 en la preparación de un medicamento para potenciar una respuesta inmune secundaria a un antígeno en un paciente, el cual ha desarrollado una respuesta inmune primaria al antígeno de tal manera que la cantidad efectiva de anticuerpo anti-CTLA-4 es suficiente para incrementar una respuesta inmune secundaria a un antígeno en el paciente durante el contacto con el antígeno. 2 - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antígeno es un antígeno de cáncer y el paciente ha sido previamente tratado con una vacuna anti-cáncer. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el antígeno de cáncer es un antígeno de melanoma. 4. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el cáncer es melanoma y el paciente ha sido tratado con una vacuna anti-melanoma que comprende un péptido NY-ESO-1. 5. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el cáncer es melanoma y la vacuna anti-cáncer comprende un antígeno seleccionado a partir de gp100 y MART-1. 6. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el antígeno de cáncer es un antígeno de cáncer de próstata. 7. - Un método para determinar si un paciente puede recibir un anticuerpo anti-CTLA-4 para potenciar una respuesta inmune secundaria, donde el método comprende analizar al paciente en cuanto a la inmunidad al antígeno antes de la administración del anticuerpo anti-CTLA-4, y administrar solamente el anticuerpo antí-CTLA-4 a un paciente el cual ha demostrado inmunidad al antígeno. 8. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el antígeno es un antígeno de cáncer. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el antígeno es un antígeno viral. 10. - El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el antígeno es un antígeno bacteriano. 11. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antígeno es un antígeno viral y el paciente ha sido previamente tratado con una vacuna viral. 1

2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el antígeno viral es un antígeno de hepatitis. 1

3. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el paciente es un humano. 1

4. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 de humano. 1

5. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 humanizado. 1

6.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 con secuencia de humano. 1

7.- Un método para monitorear la eficacia de una respuesta inmune a un antígeno en un paciente tratado mediante la administración al paciente de un anticuerpo anti-CTLA-4, donde el método comprende determinar la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 de. tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 se mantiene arriba de los niveles detectables por al menos cuatro meses. 1

8. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado en una cantidad y en intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 en el paciente es de al menos 2 µ p\\ por al menos cuatro meses. 1

9. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado en una cantidad y en intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 en el paciente es de al menos 5 g/ml por al menos cuatro meses. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es administrado en una cantidad y en intervalos de tal manera que la concentración plasmática del anticuerpo anti-CTLA-4 en el paciente es de al menos 10 µ?/ml por al menos cuatro meses. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el paciente es un humano. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 de humano. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 humanizado. 24. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo anti-CTLA-4 con secuencia de humano. 25. - El uso de un anticuerpo anti-CTLA4 asociado a un agente citotóxico, para preparar un medicamento, donde el medicamento es útil para el tratamiento de una malignidad de célula T CTLA4+ en un paciente tratado por malignidad de célula T. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el agente citotóxico es un fármaco citotóxico. 27.- El uso como se reclama en la reivindicación 25, en donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo. 28.- El uso de un anticuerpo anti-CTLA4 asociado a un agente citotóxico, para preparar un medicamento, donde el medicamento es útil para el tratamiento de una enfermedad autoinmune mediada por célula T en un paciente tratado por la enfermedad autoinmune mediada por célula T. 29. - El uso como se reclama en la reivindicación 28, en donde el agente citotóxico es un fármaco citotóxico. 30. - El uso como se reclama en la reivindicación 28, en donde el agente citotóxico es un isótopo radioactivo.