CN111615386A - 调节肿瘤相关髓样细胞及增强免疫检查点阻断的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于CD11b在肿瘤微环境中的肿瘤相关髓样细胞(TAMC)上的结合I结构域来调节免疫应答的方法。尤其是，使用抗CD11b‑I结构域抗体结合至CD11b的I结构域，以触发免疫刺激环境，其在该肿瘤微环境中具有以下一种或多种效果：增加该肿瘤微环境中的炎性细胞因子，减少IDO+骨髓抑制细胞的数量，在肿瘤相关巨噬细胞上相较于M2标志物上调M1标志物，提高M1:M2肿瘤相关巨噬细胞比率，促进树突状细胞(DC)、自然杀伤树突状细胞(NKDC)及浆细胞样树突状细胞(pDC)分化，增加4‑1BB+PD‑1+新抗原特异性CD8T细胞的数量。通过抗CD11b‑I结构域抗体结合至CD11b的I结构域使冷的(未发炎的)肿瘤转化为热的(发炎的)肿瘤，以增强免疫应答调节剂的有效性。

Description

调节肿瘤相关髓样细胞及增强免疫检查点阻断的方法
技术领域
本发明涉及调节免疫应答的方法，尤其涉及结合至CD11b的I结构域的方法。
背景技术
整合素αM(CD11b、CR3A或ITGAM)为形成异二聚整合素α-Mβ-2(αMβ2)分子的一种蛋白质亚基，其在多种先天免疫细胞的表面表达，所述先天免疫细胞包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞、自然杀伤树突状细胞、浆细胞样树突状细胞及骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcell，MDSCs)。
CD11b由以下组成：大胞外区、单一疏水性跨膜结构域及短胞质尾部。CD11b的胞外区包含β-螺桨样结构域(β-propellerdomain)、大腿样结构域(thighdomain)、calf–1结构域及calf-2结构域。CD11b的I结构域由约179个插入β-螺旋桨结构域中的氨基酸组成。I结构域为各种配体(例如，iC3b、纤维蛋白原、ICAM-I及CD40L等)的结合位点，且通过调节细胞粘附、迁移、趋化性及吞噬作用介导炎症。
已展示，CD11b的连接可通过抑制T辅助细胞17(Thelper17，Th17)分化而有助于发展周边耐受性。另外，在抗原呈递细胞(树突状细胞及巨噬细胞)上表达的活性CD11b可直接抑制完全T细胞活化。来自近期研究的结果显示，CD11b通过调节Toll样受体(Toll-LikeReceptor，TLR)应答在炎症中起关键作用。通过促进骨髓分化原初反应蛋白88(MyD88)及含有TIR结构域的连接子诱发的干扰素β(TIR-domain-containing adapter-inducinginterferon-β，TRIF)降解，CD11b-I结构域的高亲合力连接导致快速抑制TLR信号传导。因此，整合素αMβ2可充当先天免疫应答的负调节剂。
诸如抗PD1、抗PDL1及抗CTLA4抗体的免疫检查点阻断药物提供肿瘤破坏性免疫应答，且可在癌症患者中引发持久临床反应。然而，这些药物在“热的”肿瘤(即，发炎的、具有高突变负荷且能够吸引新抗原特异性T细胞浸润的肿瘤)中作用最佳。相反，“冷的”肿瘤(即，未发炎的、具有低突变负荷且不能吸引新抗原特异性T细胞浸润的肿瘤)通常对免疫检查点阻断疗法具有较少反应。
肿瘤微环境为肿瘤持续生长、侵入及转移所依赖的复杂环境。许多研究已展示，肿瘤相关髓样细胞(tumor-associated myeloid cell，TAMC)为肿瘤微环境中免疫细胞的主要组分，且TAMC被认为可直接地或间接地促进肿瘤发展。肿瘤微环境中的TAMC由骨髓来源的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)、嗜中性白血球、肥大细胞及树突状细胞构成。这些细胞促进抑制T细胞功能，且该抑制与免疫检查点阻断抗性相关。因此，这些TAMC可为新癌症免疫疗法的靶点。
发明内容
本发明的一方面是关于调节免疫应答的方法。在本发明的一种实施方式中，所述方法包含调节免疫应答，该方法包含向有需要的对象施用医药组合物，其中该医药组合物包含特异性结合至细胞(诸如肿瘤相关骨髓细胞(TAMC)上的CD11b的I结构域的试剂。试剂可为结合CD11b的I结构域的抗体。CD11b的I结构域具有各种粘附配体的主要识别位点(M.S.Diamond等人,J.Cell Biol.,120(4):1031)。结合至已知有粘附功能的CD11b的I结构域可调节免疫应答的事实确实令人意外。
根据本发明的一些实施方式，所述调节免疫应答的医药组合物可进一步包含另一种免疫应答调节剂，诸如免疫检查点阻断药物。所述免疫检查点阻断药物为特异性结合至CTLA4的试剂，如抗CTLA4抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述医药组合物进一步包含免疫检查点阻断药物。所述免疫检查点阻断药物为特异性结合至PD1的试剂，如抗PD1抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述医药组合物进一步包含免疫检查点阻断药物。所述免疫检查点阻断药物为特异性结合至PDL1的试剂，诸如抗PDL1抗体。
根据本发明的一些实施例方式，所述医药组合物进一步包含免疫检查点阻断药物。所述免疫检查点阻断药物为特异性结合至OX40(即，CD134)的试剂，如抗OX40抗体。
根据本发明的一些实施方式，所述医药组合物进一步包含免疫检查点阻断药物。所述免疫检查点阻断药物为特异性结合至CD40的试剂，诸如抗CD40抗体。
本发明的实施方式涉及试剂特异性结合至CD11b的I结构域以调节免疫应答。因此，肿瘤微环境由冷肿瘤的变为热肿瘤的，使肿瘤更易受包括化疗及放射疗法的各种治疗影响。因此，本发明的一些实施方式涉及使用特异性结合至CD11b的I结构域的试剂及另一种癌症治疗模式(例如，化疗剂或放射疗法)的组合疗法。化疗剂的实施例可包括紫杉醇(taxol)或其他化疗剂。
本发明的其他方面将由以下描述及相关附图变得显而易见。
附图说明
图1展示抗CD11b-I结构域抗体治疗后B16F10肿瘤组织液中的细胞因子概况。将C57/BL6小鼠皮下注射2×105个B16F10细胞。当肿瘤体积为大约500mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)。一天后，处死小鼠，且肿瘤组织液中的细胞因子浓度使用BD细胞计数珠阵列(cytometric bead array，CBA)来测量。
图2展示抗CD11b-I结构域抗体治疗后IDO+MDSC的百分比。在对照IgG或抗CD11b-I结构域抗体存在下，用佛波醇12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(phorbol12-myristate-13-acetate，PMA)刺激24小时至72小时的MDSC中的吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase，IDO)表达通过用抗小鼠Gr-1FITC抗体的细胞表面染色及用抗小鼠IDO APC抗体的细胞内染色评估。结果展示，与用对照IgG治疗相比，在抗CD11b-I结构域抗体治疗后IDO+MDSC有时间依赖性的减少。
图3展示在MDSC及对照IgG或抗CD11b-I结构域抗体存在下CD8细胞的活体外增殖指数。MDSCs可与免疫细胞相互作用且抑制免疫细胞，包括T细胞。本文中，MDSC的抑制活性通过其利用抗CD3及抗CD28抗体抑制T细胞活化的能力评估，如用CD8细胞增殖观测。如图3中所示，与用对照IgG治疗相比，在抗CD11b-I结构域抗体存在下MDSC的T细胞抑制能力受抑制，而CD8细胞增殖增加。
图4展示用抗CD11b-I结构域抗体(例如，44aacb及M1/70抗体)治疗对肿瘤相关巨噬细胞表型(M1或M2)极化的效果。结果显示，相对于M2巨噬细胞的情况，抗CD11b-I结构域抗体治疗显著地增加M1巨噬细胞。另外，通过CD11c及DC-SIGN树突状细胞标志物的增加证明，用抗CD11b-I结构域抗体治疗也增加树突状细胞群。
图5展示抗CD11b-I结构域抗体治疗后M1/M2肿瘤相关巨噬细胞在CT26肿瘤中的流式细胞仪分析和定量结果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)或抗PD-L1抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。第四次治疗后，处死小鼠，且分离肿瘤相关巨噬细胞。用流式细胞仪分析肿瘤相关巨噬细胞的M1(MHCII+，CD206-)及M2(MHCII-，CD206+)表型。
图6展示抗CD11b-I结构域抗体治疗后CT26肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上的MHCII的流式细胞仪分析及定量。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)或抗PD-L1抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。第四次治疗后，处死小鼠，且分离肿瘤相关巨噬细胞。用流式细胞仪分析肿瘤相关巨噬细胞上的MHCII的强度。*P<0.05；**P<0.01。
图7展示针对CT26肿瘤的生长，抗CD11b-I结构域抗体及CpG组合疗法的效果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、CpG寡核苷酸(B级，ODN1668)(50μg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+CpG寡核苷酸(B级，ODN1668)(50μg)。第一次治疗后三天重复第二次注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
图8展示针对CT26肿瘤的生长，抗CD11b-I结构域抗体及抗CTLA4抗体组合疗法的效果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、抗CTLA4抗体(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+抗CTLA4抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
图9展示针对CT26肿瘤的生长，抗CD11b-I结构域抗体及抗PD1抗体组合疗法的效果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、抗PD1抗体(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+抗PD1抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
图10展示针对CT26肿瘤的生长，抗CD11b-I结构域抗体及抗OX40抗体组合疗法的效果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、抗OX40抗体(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+抗OX40域抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
图11展示针对CT26肿瘤的生长，抗CD11b-I结构域抗体及抗CD40抗体组合疗法的效果。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、抗CD40抗体(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+抗CD40抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
图12A-12C展示通过FACS分析，抗CD11b-I结构域抗体对携带CT26肿瘤的小鼠中的树突状细胞的效果。图12A：典型树突状细胞(DC)，图12B：自然杀伤树突状细胞(NKDC)，及图12C：浆细胞样树突状细胞(pDC)。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。第四次治疗后，处死小鼠，且分离肿瘤相关巨噬细胞。通过流式细胞仪计数肿瘤中的典型树突状细胞、自然杀伤树突状细胞及浆细胞样树突状细胞的量。
图13展示对来自携带CT26肿瘤的小鼠的肿瘤4-1BB+PD-1+新抗原特异性CD8T细胞数量的FACS分析。在第0天将Balb/c小鼠皮下注射3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠(每组5只)腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)、抗CTLA4抗体(5mg/kg)或抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)+抗CTLA4抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。第四次治疗后，处死小鼠，且分离肿瘤相关巨噬细胞。通过流式细胞仪计数肿瘤中的4-1BB+PD-1+新抗原特异性CD8T细胞的量。
图14展示初始肿瘤接种后77天，用抗CD11b-I结构域抗体及抗CTLA4抗体治疗的存活小鼠(称作免疫小鼠)第二次注射3×105个亲本CT26细胞。以相同方式注射的两个未免疫(未治疗)的小鼠作对照组。肿瘤体积为平均值±SEM。
图15展示抗CD11b抗体及紫杉醇组合疗法对B16F10肿瘤的生长的效果。在第0天将C57BL/6小鼠皮下注射2×105个B16F10细胞。在第7天，将小鼠腹膜内注射对照IgG(5mg/kg)、抗小鼠CD11b-I结构域抗体抗体(5mg/kg)、紫杉醇(10mg/kg)+对照IgG(5mg/kg)或紫杉醇(10mg/kg)+抗CD11b-I结构域抗体(5mg/kg)。每三至四天重复注射。测量肿瘤体积，且结果以平均值±SEM呈现。
定义
术语“CD11b”是指整合素αM(ITGAM)，其为异二聚整合素αMβ2的亚基。整合素αMβ2的另一亚基为称为CD18的常见整合素β2亚基。整合素αMβ2也称为在白细胞表面上表达的巨噬细胞-1抗原(macrophage-1antigen，Mac-1)或补体受体3(complementreceptor3，CR3)，所述白细胞包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞及自然杀伤细胞。
“CD11b-I–结构域域”也称为“CD11b-A-结构域”(冯威里氏因子(Von Willebrandfactor，vWF)A型结构域)，其插入β-螺旋桨结构域中且包含以下氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
DIAFLIDGSGSIIPHDFRRMKEFVSTVMEQLKKSKTLFSLMQYSEEFRIHFTFKEFQNNPNPRSLVKPITQLLGRTHTATGIRKVVRELFNITNGARKNAFKILVVITDGEKFGDPLGYEDVIPEADREGVIRYVIGVGDAFRSEKSRQELNTIASKPPRDHVFQVNNFEALKTIQNQL(SEQ ID NO:1)。
术语“免疫应答调节剂”是指能调节宿主的免疫应答的试剂。术语“免疫检查点阻断药物”是指可通过免疫检查点缓解免疫抑制的“免疫检查点抑制剂”。
具体实施方式
本发明的实施方式涉及调节免疫应答的方法。本发明的实施方式基于在肿瘤微环境中结合至肿瘤相关髓样细胞(TAMC)上的CD11b的I结构域的试剂。根据本发明的实施方式，特异性结合至CD11b的I结构域的试剂可为抗体，包括单克隆抗体或其结合片段。
根据本发明的实施方式，用特异性试剂(例如，抗CD11b-I结构域抗体)结合至CD11b的I结构域可诱发或触发免疫刺激反应。尽管已知CD11b的I结构域涉及粘附，本发明的本发明人意外地发现所述试剂特异性结合至CD11b的I结构域，可在肿瘤微环境中具有以下一种或多种效果：增加肿瘤微环境中的炎性细胞因子，减少IDO+骨髓抑制细胞数量，在肿瘤相关巨噬细胞上相较于M2标志物上调M1标志物，提高M1:M2肿瘤相关巨噬细胞比率，促进树突状细胞(dendritic cell，DC)(包括典型树突状细胞、自然杀伤树突状细胞(naturekiller dendritic cell，NKDC)及浆细胞样树突状细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC))分化，增大4-1BB+PD-1+新抗原特异性CD8T细胞的群体。这些效果提示，试剂(例如，抗CD11b-I-域抗体)特异性结合至CD11b的I结构域可诱发冷的(未发炎的)肿瘤向热的(发炎的)肿瘤的转化，从而增强免疫检查点疗法的功效。
本发明的实施方式将通过以下具体实施例来说明。然而，本领域技术人员将了解，这些具体实施例仅用于说明且可能在不脱离本发明范围的情况下进行其他修改及变化。
抗CD11b-I结构域抗体治疗增强肿瘤微环境中炎性细胞因子的释放
先前研究已确定，CD11b活化作用负向调节TLR触发的炎症反应。由于CD11b在肿瘤相关髓样细胞(TAMC)上表达，发明人推论，若用抗体阻断具有CD11b-I–结构域功能的CD11b，可增加肿瘤微环境中炎性细胞因子的释放。因此，发明人用抗CD11b-I结构域抗体治疗后，评估促炎性细胞因子(例如，TNF-α、IL-6、IL-12、IFN-γ、MCP-1等)在B16F10肿瘤中的分泌。
如图1中所示，来自经抗CD11b-I结构域抗体治疗的肿瘤的组织液中，TNF-α、IL-6及MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)的分泌较高，而IL-10及IL-12p70的分泌较低。这些结果显示，抗CD11b-I结构域抗体治疗可增加促炎性细胞因子产生。换言之，抗CD11b-I结构域抗体治疗可使冷的(未发炎的)肿瘤转为热的(发炎的)肿瘤。
“热的肿瘤”是那些被T细胞侵入而造成炎症微环境的肿瘤。肿瘤微环境中的T细胞容易移动以对抗肿瘤细胞。例如，诸如抗PD1、抗PDL1及抗CTLA4抗体的免疫检查点阻断药物(即，免疫检查点抑制剂)可解除肿瘤施加于T细胞上的制动。这些药物在“热的”肿瘤(即，发炎的、具有高突变负荷且能够吸引新抗原特异性T细胞浸润的肿瘤)中作用最佳。因此，通过将“冷的”肿瘤转化为“热的”肿瘤，本发明的方法可增强免疫检查点阻断疗法的功效。
抗CD11b-I结构域抗体治疗减少小鼠MDSC中IDO+的数量且逆转MDSC诱发的T细胞抑制
骨髓来源的抑制细胞(MDSC)为来自髓系的一组异源免疫细胞。MDSC由于具有强免疫抑制活性而区别于其他骨髓细胞类型，而其他骨髓细胞被发现有免疫刺激特性。尽管其作用机制尚未被充分了解，但临床及实验证据表明具有高MDSC浸润的癌症组织与不良患者预后及对疗法的耐药性相关。
通过一些机制，如产生精氨酸酶I(arginaseI，arg1)及表达吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，MDSC可诱发免疫抑制，导致T细胞抑制。在小鼠肿瘤模型中，发现MDSC为表达高水平CD11b(典型髓系标志物)的骨髓细胞。因此，发明人通过研究CD11b阻断对MDSC免疫抑制功能的效果研究CD11b对MDSC的作用。简言之，从携带LLC1的小鼠分离MDSC且用抗CD11b-I结构域抗体治疗。评估该治疗对MDSC特性的效果。
如图2所示，与用对照IgG的类似治疗相比，抗CD11b–I结构域抗体治疗在用佛波醇12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)刺激后，以时间依赖性方式使IDO+MDSC的数量显著减少。基于IDO+MDSC的减少，人们将期望由MDSC介导的T细胞抑制及免疫抑制应减少。
实际上，如图3所示，与用对照IgG治疗相比，在MDSC存在下的CD8细胞增殖由于用抗CD11b-I结构域抗体治疗而增加。这些结果表明，在MDSC的CD11b被抗CD11b-I结构域抗体阻断时，由MDSC诱发的T细胞抑制被显著逆转。
抗CD11b-I结构域抗体治疗相较于M2标志物上调M1标志物
巨噬细胞是组织驻留的专职吞噬细胞及抗原呈递细胞。巨噬细胞来源于血液单核细胞。在不同组织环境中，巨噬细胞经历特异性分化成不同功能性表型。其通常已分为两个类别：典型激活的(M1)巨噬细胞及别样激活的(M2)巨噬细胞。M1巨噬细胞促进炎症，而M2巨噬细胞减少炎症且促进组织修复。此差异在其代谢中反映：M1巨噬细胞可代谢精氨酸产生氧化氮，而M2巨噬细胞代谢精氨酸产生鸟氨酸。
在表型上，M1巨噬细胞高水平表达II型主要组织相容性复合体(MHCII)，CD36，和共刺激分子CD80及CD86。相反，M2巨噬细胞已表征为CD163+及CD206+。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)显示M2样表型且促进肿瘤进展。为检验抗CD11b-I结构域抗体治疗是否可使肿瘤相关巨噬细胞偏向M1表型，在A549肺癌细胞存在下使人类巨噬细胞在体外从PBMC分化。
如图4所示，与对照IgG治疗组相比，M1标志物的表达在抗CD11b-I结构域抗体治疗组(抗CD11b(44aacb)及抗CD11b(M1/70))中基本上较高。另一方面，与对照IgG治疗组相比，M2标志物的表达在抗CD11b-I结构域抗体治疗组中无或仅有略微增强。另外，抗CD11b-I结构域抗体治疗也上调CD11c及DC-SIGN，这些是树突状细胞标志物。这些结果一起证实CD11b阻断肿瘤相关巨噬细胞偏向M1表型及成熟树突状细胞，产生有利于免疫疗法的炎症性微环境。
此实验使用两种不同抗CD11b-I结构域抗体(即，44aacb及M1/70)，其为商业上可获得的。抗CD11b抗体44aacb可购自多种商业来源，如Novus Biologicals(Littleton,CO,USA)及ATCC。抗CD11b抗体M1/70可购自Thermo Fisher、Abcam、BioLegent等。此外，也可使用其他抗CD11b抗体。来自这些实验的结果表明效果不受限于任何特定抗体。事实上，可结合至CD11bI结构域的任何抗体或其结合片段都可用于本发明的实施方式。
抗CD11b-I结构域抗体治疗将肿瘤相关巨噬细胞的活化从免疫抑制M2样转换为更具炎性的M1样状态
如上所讨论的，在体外CD11b阻断使巨噬细胞偏向M1表型。发明人在CT26肿瘤模型中进一步证实此观测结果。对携带CT26肿瘤的小鼠中的肿瘤浸润白细胞的分析展示，与用对照IgG治疗相比，用抗CD11b-I结构域抗体治疗提高M1/M2巨噬细胞比率，且增加成熟树突状细胞数量(图5)，且显著增加肿瘤相关巨噬细胞中的MHC II(图6)表达。这些结果表明抗原呈递能力增强。这些结果一起展示通过CD11b-I结构域抗体阻断，可实现将肿瘤相关巨噬细胞的抑制表型调节为更具免疫活性。
抗CD11b-I结构域抗体及TLR激动剂治疗在抗肿瘤免疫中的协同作用
来自近期研究的结果展示，CD11b-I结构域的高亲合力连接引起快速抑制Toll样受体(TLR)信号传导。因此，用抗CD11b-I结构域抗体阻断CD11b-I结构域活性可逆转TLR信号传导的抑制。发明人接下来检验用CpG寡核苷酸(TLR9激动剂)及CD11b阻断的组合免疫疗法是否可以增强抗肿瘤功效。将Balb/c雌性小鼠皮下植入3×105个CT26结肠癌细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG、5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体、50μg的CpG寡核苷酸或5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体及50μg的CpG寡核苷酸的组合。
如图7所示，用CpG寡核苷酸的单一疗法可抑制肿瘤生长。用抗CD11b-I结构域抗体及CpG寡核苷酸的组合治疗的小鼠显著地具有最佳抗肿瘤反应。组合疗法的引人注目的效果表明存在协同效应。
虽然以上实验使用CpG寡核苷酸(TLR9激动剂)作为一实施例，其他TLR激动剂也可以类似方式使用。本领域技术人员将了解，本发明的抗CD11b试剂也可与这些其他TLR激动剂一起使用。
抗CD11b-I结构域抗体及免疫检查点治疗在抗肿瘤免疫中的协同作用
如上所述，通过特异性结合至CD11b的I结构域，本发明的方法可将“冷的”肿瘤转化为“热的”肿瘤，从而增强免疫检查点阻断疗法的功效。发明人接下来研究该组合疗法的效果。
CTLA4为由T细胞表达的抑制性受体，在树突状细胞或巨噬细胞上表达的CD80/CD86连接(配体结合)后，CTLA4负调节T细胞反应的效应相。由于抗CD11b-I结构域抗体治疗增强CD80/CD86在肿瘤相关巨噬细胞上的表达，发明人接下来检验用CD11b及CTLA4阻断的组合免疫疗法是否可以增强抗肿瘤功效。将Balb/c雌性小鼠皮下植入3×105个CT26结肠癌细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，将小鼠腹膜内注射对照IgG、5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体、5mg/kg的抗CTLA4抗体、或5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体及5mg/kg的抗CTLA4抗体的组合。
如图8所示，用抗CD11b-I结构域抗体的单一疗法部分地有效，而用抗CTLA4抗体的单一疗法显著地抑制肿瘤生长。用抗CD11b-I结构域抗体及抗CTLA4抗体的组合治疗的小鼠显著地具有最佳抗肿瘤反应，产生60％的消退率。组合疗法的引人注目的效果表明存在协同效应。
虽然以上实验使用CTLA4作为一实施例，其他免疫检查点靶点也可以类似方式使用。举例而言，PD-1及PD-L1已显示涉及免疫检查点调节，且抗PD-1及PD-L1的抗体也显示在逆转免疫抑制中有效。OX40(也称为CD134或肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tumornecrosis factor receptor superfamily member 4，TNFFRSF4))及T细胞免疫球蛋白及粘蛋白结构域3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3，TIM3)为免疫检查点的其他实施例。OX40或TIM3的阻断可缓解肿瘤诱发的免疫抑制。
如图9所示，用抗PD1抗体的单一疗法略微抑制肿瘤生长，而用抗CD11b-I结构域抗体及抗PD1抗体的组合治疗的小鼠具有最佳抗肿瘤反应。类似地，抗OX40或抗CD40抗体与抗CD11b-I结构域抗体组合具有最佳抗肿瘤反应(图10及图11)。本领域技术人员将了解，本发明的抗CD11b试剂也可与其他免疫检查点阻断途径一起使用。
树突状细胞(DC)是有效的抗原呈递细胞，且为改进治疗性疫苗的有前景的选项。如图12A-12C所示，用抗CD11b-I结构域抗体治疗增加肿瘤微环境中典型树突状细胞(DC)(图12A)、自然杀伤树突状细胞(NKDC)(图12B)及浆细胞样树突状细胞(pDC)(图12C)的数量。
另外，如图13所示，单用抗CD11b-I结构域抗体治疗温和地增加肿瘤微环境中效应PD-1+4-1BB+新抗原特异性CD8T细胞的数量，而仅用抗CTLA4抗体治疗几乎无效果。相反，用抗CD11b-I结构域抗体及抗CTLA4抗体的组合治疗明显增加肿瘤微环境中效应PD-1+4-1BB+新抗原特异性CD8 T细胞的数量，展现显著的协同效应(图13)。这些结果一起显示通过CD11b-I结构域阻断(例如，将抗体结合至CD11b-I结构域抗体)，可实现调节肿瘤微环境，即，使免疫抑制肿瘤微环境转向更具免疫刺激性的肿瘤微环境。因此，抗CD11b-I结构域抗体可增强免疫疗法试剂的功效，所述免疫疗法试剂诸如免疫检查点阻断药物：抗PD1、抗PDL1及/或抗CTLA4抗体。
CD11b-I结构域阻断的长期记忆效果
诸如抗PD1、抗PDL1及抗CTLA4抗体的免疫检查点阻断药物可在癌症患者中引发持久临床反应。因此，发明人也研究了抗CD11b-I结构域治疗的长期效果。
简言之，初始肿瘤接种及用抗CD11b-I结构域抗体及抗CTLA4抗体的组合治疗(称作使小鼠免疫)后77天，第二次将存活小鼠注射3×105个亲本CT26细胞(结肠癌细胞)。两只未治疗(先前未免疫及治疗)的小鼠以同样的方式注射作为对照组。监测小鼠，且接种后测量肿瘤体积。
如图14所示，对照组(未治疗的小鼠)肿瘤快速生长。相反，先前免疫及治疗的存活者保留限制肿瘤生长的能力，表明(例如，用抗CD11b-I结构域抗体)阻断CD11bI结构域可引发长期反应。
抗CD11b-I结构域抗体及化疗在抗肿瘤免疫中的协同作用
发明人接下来检验使用化疗及CD11b-I结构域阻断的组合免疫疗法是否可以增强抗肿瘤功效。在第0天将C57BL/6雌性小鼠皮下植入2×105个B16F10黑素瘤癌细胞。在第7天，将小鼠腹膜内注射5mg/kg的对照IgG、5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体、5mg/kg的对照IgG及10mg/kg的紫杉醇的组合、或5mg/kg的抗CD11b-I结构域抗体及10mg/kg的紫杉醇的组合。每三至四天重复注射。用抗CD11b-I结构域抗体及紫杉醇的组合治疗的小鼠显著地具有最佳抗肿瘤反应(图15)。组合疗法的引人注目的效果提示存在协同效应。
紫杉醇(太平洋紫杉醇(paclitaxel))主要通过其结合微管以用作有丝分裂抑制剂的能力来作为化疗试剂。然而，也已发现紫杉醇在活化包括T细胞、B细胞、NK细胞及树突状细胞的淋巴细胞中具有活性。因此，也可将紫杉醇视为免疫应答调节剂。
放射疗法可通过包括诱发肿瘤细胞凋亡的若干机制来强化免疫应答调节剂的功效，从而增加直接T细胞活化和经由APC的肿瘤抗原呈递。放射疗法诱发的肿瘤破坏效果使得更多肿瘤抗原释放，导致活化T细胞克隆扩增，借此，T细胞群的多样性及其活化速率均得到增强。
溶瘤病毒可直接裂解肿瘤细胞，导致可溶性抗原、危险信号及驱动抗肿瘤免疫的I型干扰素释放。另外，一些溶瘤病毒可经工程化以表达治疗基因或可在功能上改变肿瘤相关内皮细胞，进一步增强T细胞向免疫豁免型(immune-excluded)或免疫沙漠型(immune-deserted)肿瘤微环境中的募集。
虽然以上实验使用紫杉醇作为一实施例，其他化疗试剂也可以类似方式使用。本领域技术人员将了解，本发明的抗CD11b试剂也可与其他化疗途径一起使用。
以上实验明确显示，阻断CD11b的I结构域可将肿瘤微环境转化为更具炎性状态，其更有利于免疫疗法途径，如下所证明：增加肿瘤微环境中的炎性细胞因子，减少IDO+骨髓抑制细胞的数量，在肿瘤相关巨噬细胞上相较于M2标志物上调M1标志物，提高M1:M2肿瘤相关巨噬细胞比率，促进树突状细胞(DC)、自然杀伤树突状细胞(NKDC)及浆细胞样树突状细胞(pDC)分化，增加4-1BB+PD-1+新抗原特异性CD8T细胞的数量。这些特性可用于增强免疫治疗功效。实际上，使用抗CD11b抗体及另一种靶向免疫检查点的抗体的组合疗法可实现引人注目的协同效应。这些组合疗法将最有益于癌症治疗。已知CD11bI结构域涉及粘附功能。阻断CD11b的I结构域可将肿瘤微环境转化为有利于诱发免疫应答的更具炎症性状态的结果确实令人意外。
本发明的实施方式可采用本领域已知的任何合适的方法/程序操作。以下将说明本发明的实施方式的具体实施例。然而，本领域技术人员将了解，这些具体实施例仅用于说明且可能在不脱离本发明范围的情况下进行其他修改及变化。
人类细胞分离及细胞株
通过静脉穿刺法，自健康志愿者供体分离人类PBMC。取得书面知情同意书以用于参与研究，其经马偕纪念医院的机构审查委员会(Institutional Review Board of theMackay Memorial Hospital)批准。使用本领域已知的方法分离人类单核细胞。简言之，使用Ficoll-PaquePlus(GE Healthcare)梯度离心法分离外周血单核细胞(PBMC)。
A549肺癌细胞株得自美国菌种保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)且培养于含有10％胎牛血清的F-12K培养基(Hyclone,Inc.,Logan,UT)中。所有细胞株维持在37℃下的完全培养基(含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素(Penicillin)及100μg/mL链霉素(Streptomycin)的RPMI-1640)中。使细胞在组织培养瓶中，在加湿的5％CO2培育箱中生长，且每周采用轻度胰蛋白酶化作用传代2-3次。
动物及肿瘤细胞株
自台湾台北的中国台湾实验室动物中心(National Laboratory Animal Center)(Taipei,Taiwan)购得Balb/c小鼠(6至8周龄)。所有动物实验在无特异性病原体条件下且根据经台湾台北的马偕纪念医院的动物照护及使用委员会(Animal Care and UsageCommittee of Mackay memorial hospital)(Taipei,Taiwan)批准的准则进行。在开始治疗时及治疗期间每日测量各小鼠的体重。CT26细胞为衍生自Balb/c小鼠的鼠类结肠癌细胞。B16F10细胞为衍生自C57/BL6小鼠的鼠类黑素瘤癌细胞。细胞在37℃下在5％CO2潮湿环境中于达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)：10％热不活化胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)及链霉素(100μg/ml)中维持。
抗体及试剂
用于人PBMC研究
单克隆的CD11b-I结构域抗体(44aacb)的杂交瘤购自ATCC。由此杂交瘤产生的抗体使用蛋白A偶联的琼脂糖纯化。用作对照抗体的小鼠IgG2a购自Biolegend(SanDiego,CA)。
用于鼠类癌症模型
对小鼠/人类CD11b-I结构域抗体(克隆M1/70)具特异性的大鼠抗体，对鼠类PD1(克隆RMP1-14)具特异性的大鼠抗体，对鼠类OX40(克隆OX-86)具特异性的大鼠抗体，对鼠类CD40(克隆FGK4.5)具特异性的大鼠抗体，大鼠对照IgG2b抗体(克隆LTF-2)，叙利亚仓鼠(Syrian hamster)抗鼠类CTLA4(克隆9H10)，及叙利亚仓鼠对照IgG购自BioXcell(WestLebanon,NH)。CpG寡核苷酸(B类，ODN1668)购自Invivogen(SanDiego,CA)。紫杉醇获自马偕纪念医院。
肿瘤相关骨髓抑制细胞产生方案
i.诱发
人类PBMC通过静脉穿刺(60mL总体积)从健康志愿者供体分离，然后进行差速密度梯度离心(Ficoll Hypaque，Sigma,St.Louis,MO)。PBMC以与人类肿瘤细胞系的40:1比率在24孔板中的完全培养基(1×106个细胞/毫升)中培养五至六天。针对抗体治疗实验，在存在或不存在抗体(包括抗小鼠/人类CD11b-I结构域抗体(克隆M1/70，BioXcell)、抗人类CD11b-I结构域抗体(克隆44aacb，来自ATCC的杂交瘤)、小鼠IgG2a同型对照(克隆MG2a-53，Biolegend)及大鼠IgG2b同型对照(克隆LTF-2，BioXcell))的情况下重复PBMC-肿瘤细胞株共培养。
ii.分离骨髓抑制细胞
5天后，自肿瘤-PBMC共培养物收集所有细胞。使用非蛋白酶细胞脱离溶液DetachinTM(GenLantis,SanDiego,CA)移除粘附细胞。然后按照制造商的说明书使用抗CD33磁珠及LS柱分离(Miltenyi Biotec,Germany)将骨髓细胞自共培养物中分离得到。通过流式细胞仪发现经分离细胞群的纯度大于90％，且使用台盼蓝染料排除法确认分离的细胞的活力。
iii.抑制分析
肿瘤诱导的骨髓细胞的抑制功能在如下抑制分析中通过其抑制同种异体T细胞的增殖能力测量：使用Pan T分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)分离自健康供体的T细胞经羧基荧光素丁二酰亚胺基酯(Carboxyfluorescein succinimidyl ester，CFSE)标记(2.5μM，Invitrogen)，且与先前分离的骨髓细胞以1:1比率在96孔板中接种，1×105个细胞/孔。由抗CD3/CD28刺激珠粒(Thermo Fisher scientific,Carlsbad,CA)或包被的抗CD3(克隆OKT3)抗体诱发T细胞增殖。三天后用流式细胞仪分析抑制分析孔的T细胞增殖。对照包括阳性T细胞增殖对照(仅具有CD3/CD28刺激的T细胞)及诱发阴性对照(仅培养基)。样品在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,SanJose,CA)上运行，且使用CellQuestPro软件(BD)进行数据采集及分析。
人类骨髓抑制细胞的特征
i.细胞表型的流式细胞仪分析
针对骨髓、抗原呈递及抑制细胞标志物的表达检验体外产生的骨髓抑制细胞的表型。为了染色，使用DetachinTM自24孔板收集细胞以使细胞表面蛋白消化降至最低，用FACS缓冲液(2％FCS/PBS)洗涤两次，然后将106个细胞在100μl FACS缓冲液中重悬。用Fc阻断剂(人类BD Fc嵌段)处理细胞且用荧光偶联单克隆抗体或同型相配对照的混合液染色20分钟。对于细胞内染色，细胞在表面染色后使用固定/渗透试剂盒(BD)固定及渗透。所用抗体购自BD Biosciences：CD11c(克隆Bu15)、CD33(克隆HIM3-4)、HLA-DR(克隆L243)、CD11b(克隆ICRF44)、CD86(克隆2331)、CD80(克隆L307.4)、CD56(克隆B159)、CD206(克隆19.2)、DC-SIGN(克隆DCN46)、7-AAD；或购自Biolegned：HLA-DR(克隆L243)、CD163(克隆RM3/1)、CD68(克隆Y1/82A)；或购自R&D系统：IDO(克隆700838)。这些抗体作为实施例，任何其他适合的抗体都可使用。举例而言，可使用结合I结构域的任何抗CD11b抗体(例如，抗CD11b(44aacb克隆)、抗CD11b(M1/70克隆等)。这样的抗CD11b抗体可包括那些新产生的或已可自商业渠道(例如，BD Biosciences、Abcam、Thermo Fisher Scientific等)获得的。
样品在BD FACSCalibur流式细胞仪上运行，且如上文所描述进行数据获取及分析。数据来自三至六个独立供体。在仅培养基中培养的PBMC平行运行以进行比较。
ii.细胞计数珠阵列检测细胞因子/趋化因子
经抗CD11b-I结构域抗体治疗后，自B16F10肿瘤收集肿瘤组织液，且在-20℃下以等分试样储存。在按照制造商的说明书使用小鼠炎性细胞因子细胞计数珠阵列试剂盒(BD)测量样品中IFN-γ、MCP-1、IL-6、TNFα、IL12p70及IL-10的水平。
癌症治疗方案
皮下肿瘤模型
Balb/c小鼠经皮下接种3×105个CT26细胞。当肿瘤体积为大约50-100mm3时，开始治疗。每周两次用不同抗体腹膜内(ip)治疗携带肿瘤的小鼠。每周两次监测小鼠并对可触肿瘤的形成评分，若肿瘤超过3,000mm3的预定大小，则处死小鼠。肿瘤体积用卡尺测量且用下式计算：A×B2×0.54，其中A为最大直径，且B为最小直径。
肿瘤解离及细胞群分析
将Balb/c肿瘤采集、称重且使用外科解剖刀精细地切成片，且根据制造商的说明书使用肿瘤解离试剂盒(Miltenyi Biotec)及使用Gentle MACS解离剂(MiltenyiBiotech)进一步酶解离。肿瘤的单细胞悬浮液再悬浮于补充有1％FCS的PBS中，且红细胞被溶解。在特异性标记之前用抗CD16/32(Fc Block；BD)阻断非特异性标记。用以下来自BioLegend的大鼠抗小鼠Abs染色细胞：抗CD8a异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)、抗CD8bFITC、抗Gr1FITC、抗CD86 FITC、抗CD206藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、抗CD80PE-Dazzle594、抗CD11b-I结构域PerCP-Cy5.5、抗PDL1异花青素(allophycocyanin，APC)、抗CD45 BV510、抗F4/80Alexa700、抗IAIE APC-Cy7、抗Ly6CPECy7、抗CD11c Alexa700、抗Ly6G PE-Dazzle594、抗IDO AF647、抗CD335 BV421及抗CD3ePE Dazzle。固色染料(eBioscienceTM Fixable Viability Dye eFluorTM 450)用于存活-死亡细胞鉴别。样品使用BECKMAN COULTER Gallios流式细胞仪分析且用
Figure GDA0002598667240000171
软件分析。
小鼠MDSC体外分离及抑制分析
从携带LLC1肿瘤的小鼠收集脾脏。采集脾细胞，且按照制造商的说明书使用骨髓来源的抑制细胞分离试剂盒及LS柱分离(MiltenyiBiotec)分离骨髓来源的抑制细胞(MDSC)。通过流式细胞仪发现经分离细胞群的纯度大于90％，且使用台盼蓝染料排除法确认经分离细胞的活力。用佛波醇12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)刺激24小时至72小时的MDSC中的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)表达通过用抗小鼠Gr-1 FITC抗体的细胞表面染色及用抗小鼠IDO APC抗体的细胞内染色评估。从未治疗的小鼠的脾细胞收集T细胞且使用抗小鼠CD90.2磁性颗粒(BD IMag)分离。在不存在或存在抗体(包括抗小鼠/人类CD11b(克隆M1/70,BioXcell)及大鼠IgG2b同型对照(克隆LTF-2，BioXcell))的情况下，经CFSE标记的T细胞与MDSC以1:1或1:2比率共同培养。T细胞增殖由抗CD3/CD28刺激抗体诱发。
统计分析
使用Prism6.0(GraphPad)进行数据分析，且以平均值±SEM表示。各组的间的比较使用Student t测试进行。相关性使用皮尔森相关系数(Pearson's correlationcoefficient)测定。p值<0.05视为显著的。
SEQUENCE LISTING
<110> 台湾基督长老教会马偕医疗财团法人马偕纪念医院
全福生物科技股份有限公司
<120> 调节肿瘤相关髓样细胞及增强免疫检查点阻断的方法
<130> BRIM141-MAO-PCT
<150> US 62/581,632
<151> 2017-11-03
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 179
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Asp Ile Ala Phe Leu Ile Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ile Pro His Asp
1 5 10 15
Phe Arg Arg Met Lys Glu Phe Val Ser Thr Val Met Glu Gln Leu Lys
20 25 30
Lys Ser Lys Thr Leu Phe Ser Leu Met Gln Tyr Ser Glu Glu Phe Arg
35 40 45
Ile His Phe Thr Phe Lys Glu Phe Gln Asn Asn Pro Asn Pro Arg Ser
50 55 60
Leu Val Lys Pro Ile Thr Gln Leu Leu Gly Arg Thr His Thr Ala Thr
65 70 75 80
Gly Ile Arg Lys Val Val Arg Glu Leu Phe Asn Ile Thr Asn Gly Ala
85 90 95
Arg Lys Asn Ala Phe Lys Ile Leu Val Val Ile Thr Asp Gly Glu Lys
100 105 110
Phe Gly Asp Pro Leu Gly Tyr Glu Asp Val Ile Pro Glu Ala Asp Arg
115 120 125
Glu Gly Val Ile Arg Tyr Val Ile Gly Val Gly Asp Ala Phe Arg Ser
130 135 140
Glu Lys Ser Arg Gln Glu Leu Asn Thr Ile Ala Ser Lys Pro Pro Arg
145 150 155 160
Asp His Val Phe Gln Val Asn Asn Phe Glu Ala Leu Lys Thr Ile Gln
165 170 175
Asn Gln Leu

Claims (18)

1.一种用于通过调节免疫应答来治疗癌症的医药组合物，其包含与细胞上的CD11b的I结构域特异性结合的试剂。
2.如权利要求1所述的医药组合物，其特征在于，该CD11b在肿瘤相关髓样细胞(TAMC)上。
3.如权利要求1或2所述的医药组合物，其特征在于，该试剂为结合该CD11b的I结构域的抗体。
4.如权利要求1或2所述的医药组合物，其特征在于，该医药组合物进一步包含免疫应答调节剂。
5.如权利要求4所述的医药组合物，其特征在于，该免疫应答调节剂为特异性结合PD-1、PD-L1、CTLA4、CD40、OX40或Toll样受体(TLR)的试剂。
6.如权利要求3所述的医药组合物，其特征在于，该免疫应答调节剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、Toll样受体激动剂、溶瘤病毒、放射疗法或化疗剂。
7.如权利要求3所述的医药组合物，其特征在于，该免疫应答调节剂为抗CTLA4抗体。
8.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，该Toll样(TLR)受体激动剂为CpG。
9.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，该化疗剂为紫杉醇。
10.一种调节免疫应答的方法，包括向有需要的对象施用医药组合物，其特征在于，该医药组合物包含与细胞上的CD11b的I结构域特异性结合的试剂。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该CD11b在肿瘤相关髓样细胞(TAMC)上。
12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，该试剂为结合该CD11b的I结构域的抗体。
13.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于，该医药组合物进一步包含免疫应答调节剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，该免疫应答调节剂为特异性结合PD-1、PD-L1、CTLA4、CD40、OX40或Toll样受体(TLR)的试剂。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该免疫应答调节剂为抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、Toll样受体激动剂、溶瘤病毒、放射疗法或化疗剂。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该免疫应答调节剂为抗CTLA4抗体。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该Toll样(TLR)受体激动剂为CpG。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该化疗剂为紫杉醇。
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