JP2021517114A - 腫瘍関連骨髄系細胞の調節および免疫チェックポイント遮断の増強のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
「CD11b」という用語はインテグリンアルファM(ITGAM)を指し、これは、ヘテロダイマーのインテグリンαMβ2のサブユニットである。インテグリンαMβ2の他のサブユニットは、CD18として既知の一般的なインテグリンβ2サブユニットである。インテグリンαMβ2は、単球、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、T細胞およびネイチャーキラー細胞を含む白血球の表面上で発現された、マクロファージ−1抗原(Mac−1)または補体受容体3(CR3)とも呼ばれる。
DIAFLIDGSGSIIPHDFRRMKEFVSTVMEQLKKSKTLFSLMQYSEEFRIHFTFKEFQNNPNPRSLVKPITQLLGRTHTATGIRKVVRELFNITNGARKNAFKILVVITDGEKFGDPLGYEDVIPEADREGVIRYVIGVGDAFRSEKSRQELNTIASKPPRDHVFQVNNFEALKTIQNQL(SEQ ID NO:1).
先の研究では、CD11b活性化が、TLRによりトリガーされた炎症反応を負に制御することが確証されていた。CD11bは腫瘍関連骨髄系細胞(TAMC)上で発現されるので、本発明者らは、抗体を使用するCD11b−I−ドメイン機能によるCD11bのブロッキングが腫瘍微小環境内の炎症性サイトカイン放出を増加させ得ると推論した。したがって、本発明者らは、抗CD11b−I−ドメイン抗体による治療後のB16F10腫瘍内の炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IL−6、IL−12、IFN−γ、MCP−1など)の分泌を評価した。
骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)は、骨髄細胞系列からの免疫細胞の異種群である。MDSCは、他の骨髄系細胞に見られる免疫賦活特性の代わりに強い免疫抑制活性をMDSCが持つという点で他の骨髄細胞型とは区別される。その作用機序は十分理解されていないが、臨床的および実験的証拠は、MDSCの高浸潤を伴うがん組織が患者の予後不良および療法抵抗性に関連することを示す。
マクロファージは、組織常在性のプロフェッショナル食細胞および抗原提示細胞である。マクロファージは血中単球に由来する。異なる組織環境において、マクロファージは、別個の機能的表現型へと特異的分化を経る。マクロファージは一般に2つのクラス:古典的活性化(M1)マクロファージおよび選択的活性化(M2)マクロファージに分けられている。M1マクロファージは炎症を助長し、一方、M2マクロファージは、炎症を減少させ、組織修復を助長する。この違いはそれらの代謝に反映されており、M1マクロファージは、アルギニンを代謝して一酸化窒素を発生させることができて、一方、M2マクロファージは、アルギニンを代謝してオルニチンを生成することができる。
上で論じた通り、CD11b遮断は、マクロファージをin vitroでM1表現型に傾ける。本発明者らは、この観察をCT26腫瘍モデルにおいてさらに確認した。担CT26腫瘍マウスにおける腫瘍浸潤性白血球の分析は、抗CD11b−I−ドメイン抗体による治療が、対照IgGによる治療と比較して、腫瘍関連マクロファージ内のM1/M2マクロファージ比を増加させ、成熟樹状細胞集団を増加させ(図5)、MHC IIの発現を著しく増加させた(図6)ことを示す。これらの結果は、抗原提示能の増強を示唆する。まとめると、これらの結果は、腫瘍関連マクロファージの抑制表現型からより免疫活性のあるものへの調節がCD11b−I−ドメイン遮断により実現することができることを示す。
最近の研究による結果は、CD11b−I−ドメインの高結合活性の連結が、Toll様受容体(TLR)シグナル伝達の迅速な阻害をもたらすことを示す。したがって、抗CD11b−I−ドメイン抗体によるCD11b−I−ドメイン活性のブロッキングは、TLRシグナル伝達の阻害を逆転させることができる。次に本発明者らは、CpGオリゴヌクレオチド(TLR9アゴニスト)とCD11b遮断とによる併用免疫療法が抗腫瘍効果を増強させることができるかを検討する。Balb/c雌マウスに、3×105個のCT26結腸がん細胞が皮下移植された。腫瘍体積が約50〜100mm3であったとき、マウスに、対照IgG、5mg/kgの抗CD11b−I−ドメイン抗体、50μgのCpGオリゴヌクレオチド、または5mg/kgの抗CD11b−I−ドメイン抗体と50μgのCpGオリゴヌクレオチドとの組合せがip注射された。
上で述べたように、CD11bのI−ドメインに特異的に結合することにより、本発明の方法は、「低温」腫瘍を「高温」腫瘍に変換することができ、それによって、免疫チェックポイント遮断療法の効果を増強する。次に本発明者らは、そのような併用療法の影響を調べる。
抗PD1抗体、抗PDL1抗体および抗CTLA4抗体などの免疫チェックポイント遮断薬は、がん患者において持続的臨床反応を誘発することができる。したがって、本発明者らは、抗CD11b−I−ドメイン治療の長期的影響も調べる。
次に本発明者らは、化学療法とCD11b−I−ドメイン遮断とによる併用免疫療法が抗腫瘍効果を増強させることができるかを検討する。C57BL/6雌マウスに、0日目に2×105個のB16F10黒色腫がん細胞が皮下移植された。7日目に、マウスに、5mg/kgのCtrl IgG、5mg/kgの抗CD11b−I−ドメイン抗体、5mg/kgのCtrl IgGと10mg/kgのTaxolとの組合せ、または5mg/kgの抗CD11b−I−ドメイン抗体と10mg/kgのTaxolとの組合せがip注射された。注射は3〜4日毎に繰り返された。顕著には、抗CD11b−I−ドメイン抗体とタキソールとの併用により治療されたマウスは、最良の抗腫瘍反応を有していた(図15)。併用療法の劇的な影響は、相乗効果の存在を示唆する。
ヒトPBMCを健康なボランティアドナーから静脈穿刺により単離した。調査への参加に関する書面によるインフォームドコンセントを得、これはマッカイ記念病院の施設内審査委員会により承認された。当技術分野において既知の方法を使用してヒト単球を単離した。簡潔には、Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare)勾配遠心を使用して末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。
Balb/cマウス(6〜8週齢)をNational Laboratory Animal Center(台北、台湾)から購入した。すべての動物実験を特定病原体不在条件下、マッカイ記念病院(台北、台湾)の動物管理使用委員会により承認されたガイドラインに従って実施した。各マウスの体重を治療の始めおよび治療期間中毎日測定した。CT26細胞は、Balb/cマウス由来のマウス結腸がん細胞である。B16F10細胞は、C57/BL6マウス由来のマウス黒色腫がん細胞である。細胞を5% CO2加湿雰囲気中のダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)、10%熱不活性化ウシ胎児血清、2mM L−グルタミン、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100μg/ml)中、37℃で維持した。
ヒトPBMC調査用
モノクローナル抗CD11b−I−ドメイン抗体(44aacb)のハイブリドーマをATCCから購入した。このハイブリドーマから産生された抗体を、プロテインA複合セファロースを使用して精製した。対照抗体として使用されたマウスIgG2aはBiolegend(San Diego、CA)から購入した。
マウス/ヒトCD11b−I−ドメインに対して特異的なラット抗体(クローンM1/70)、マウスPD1に対して特異的なラット抗体(クローンRMP1−14)、マウスOX40に対して特異的なラット抗体(クローンOX−86)、マウスCD40に対して特異的なラット抗体(クローンFGK4.5)、ラット対照IgG2b抗体(クローンLTF−2)、シリアンハムスター抗マウスCTLA4(クローン9H10)およびシリアンハムスター対照IgGをBioXcell(West Lebanon、NH)から購入した。CpGオリゴヌクレオチド(クラスB、ODN 1668)をInvivogen(San Diego、CA)から購入した。Taxolをマッカイ記念病院から入手した。
i.誘導
静脈穿刺(全体積60mL)とその後のディファレンシャル密度勾配遠心(Ficoll Hypaque、Sigma、St.Louis、MO)により、ヒトPBMCを健康なボランティアドナーから単離した。比40:1でヒト腫瘍細胞株を含む24ウェルプレート内の完全培地(1×106細胞/mL)中でPBMCを5〜6日間培養した。抗体治療実験のために、抗マウス/ヒトCD11b−I−ドメイン(クローンM1/70、BioXcell)、抗ヒトCD11b−I−ドメイン(クローン44aacb、ATCCからのハイブリドーマ)、マウスIgG2aアイソタイプ対照(クローンMG2a−53、Biolegend)およびラットIgG2bアイソタイプ対照(クローンLTF−2、BioXcell)を含む抗体ありまたはなしでPBMC−腫瘍細胞株共培養を繰り返した。
5日後、すべての細胞を腫瘍−PBMC共培養から回収した。非プロテアーゼ細胞剥離溶液Detachin(商標)(GenLantis、San Diego、CA)を使用して接着細胞を除去した。次いで、製造者の指示に従って抗CD33磁性マイクロビーズおよびLSカラム分離(Miltenyi Biotec、ドイツ)を使用して、骨髄系細胞を共培養から単離した。単離細胞集団の純度は、フローサイトメトリーにより90%を超えることが明らかになり、単離細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除を使用して確認した。
腫瘍によって教育された骨髄系細胞の抑制機能を、以下の抑制アッセイにおける同種異系T細胞の増殖を阻害するその能力により測定した:Pan T単離キット(Miltenyi Biotec、Auburn、CA)により健康なドナーから単離されたT細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)標識(2.5μM、Invitrogen)し、あらかじめ単離された骨髄系細胞を含む96ウェルプレートに1×105細胞/ウェル、比1:1で播種した。T細胞増殖を抗CD3/CD28刺激ビーズ(ThermoFisher scientific、Carlsbad、CA)または被覆抗CD3(クローンOKT3)抗体により誘導した。3日後に抑制アッセイウェルをT細胞増殖に関してフローサイトメトリーにより分析した。対照は、正のT細胞増殖対照(CD3/CD28刺激ありのT細胞単独)および誘導陰性対照(培地のみ)を含んでいた。サンプルをFACSCaliburフローサイトメーター(BD Biosciences、San Jose、CA)にかけ、CellQuestProソフトウェア(BD)を使用してデータ取得および解析を実施した。
i.細胞表現型のフローサイトメトリー分析
in vitro発生骨髄系サプレッサー細胞の表現型を、骨髄系細胞、抗原提示細胞およびサプレッサー細胞マーカーの発現に関して調べた。染色のために、細胞表面タンパク質分解を最小限にするためにDetachin(商標)を使用して24ウェルプレートから細胞を回収し、FACS緩衝液(PBS中の2% FCS)で2回洗浄した後、106個の細胞をFACS緩衝液100μlに再懸濁させた。細胞をFcブロッカー(Human BD Fc Block)で処理し、蛍光複合モノクローナル抗体またはアイソタイプ適合対照のカクテルで20分間染色した。細胞内染色のために、細胞を固定し、表面染色後、固定/透過処理キット(BD)を使用して透過処理した。使用された抗体は、BD Biosciences(CD11c(クローンBu15)、CD33(クローンHIM3−4)、HLA−DR(クローンL243)、CD11b(クローンICRF44)、CD86(クローン2331)、CD80(クローンL307.4)、CD56(クローンB159)、CD206(クローン19.2)、DC−SIGN(クローンDCN46)、7−AAD)から、またはBiolegned(HLA−DR(クローンL243)、CD163(クローンRM3/1)、CD68(クローンY1/82A))から、またはR&D systems(IDO(クローン700838))から購入した。これらの抗体は例であり、その他の任意の適した抗体を使用することができる。例えば、I−ドメインを結合する任意の抗CD11b抗体を使用することができる(例えば、抗CD11b(44aacbクローン)、抗CD11b(M1/70クローンなど)。そのような抗CD11b抗体には、新たに作成されたもの、または商業的供給源(例えば、BD Biosciences、Abcam、Thermo Fisher Scientificなど)から入手されたものが含まれ得る。
腫瘍組織液を抗CD11b−I−ドメイン抗体治療後のB16F10腫瘍から回収し、−20℃でアリコートで保管した。製造者の指示に従ってマウス炎症性サイトカインcytometric bead arrayキット(BD)を使用して、サンプル中のIFN−ガンマ、MCP−1、IL−6、TNFα、IL12p70およびIL−10のレベルを測定した。
皮下腫瘍モデル
Balb/cマウスに3×105個のCT26細胞を皮下接種した。腫瘍体積が約50〜100mm3であったとき、治療を開始した。担腫瘍マウスを異なる抗体で週2回、腹腔内(ip)治療した。マウスを監視し、毎週2回、触知可能な腫瘍の形成をスコア化し、腫瘍が3,000mm3の所定のサイズを超えたら屠殺した。腫瘍体積をノギスで測定し、以下の式を用いて計算した:A×B2×0.54(式中、Aは最大直径であり、Bは最小直径である)。
Balb/c腫瘍を収集し、秤量し、外科用メスを使用して片に細断し、製造者の指示に従って腫瘍離断キット(Miltenyi Biotec)を使用し、Gentle MACS dissociator(Miltenyi Biotech)を使用して、さらに酵素的に離断した。1% FCSを追加したPBSに腫瘍の単細胞懸濁液を再懸濁させ、赤血球を溶解した。特異的標識前に非特異的標識を抗CD16/32(Fc Block;BD)でブロックした。以下のBioLegend製ラット抗マウスAbsで細胞を染色した:抗CD8aフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、抗CD8b FITC、抗Gr1 FITC、抗CD86 FITC、抗CD206フィコエリトリン(PE)、抗CD80 PE−Dazzle594、抗CD11b−I−ドメインPerCP−Cy5.5、抗PDL1アロフィコシアニン(APC)、抗CD45 BV510、抗F4/80 Alexa 700、抗IAIE APC−Cy7、抗Ly6C PECy7、抗CD11c Alexa 700、抗Ly6G PE−Dazzle594、抗IDO AF647、抗CD335 BV421および抗CD3e PE Dazzle。固定可能な生存率色素(eBioscience(商標)Fixable Viability Dye eFluor(商標)450)を生死細胞の識別のために使用した。サンプルをBECKMAN COULTER Galliosフローサイトメーターを使用して分析し、Kaluza(登録商標)ソフトウェアで解析した。
脾臓を担LLC1腫瘍マウスから回収した。製造者の指示に従って骨髄系由来サプレッサー細胞単離キットおよびLSカラム分離(Miltenyi Biotec)を使用して、脾細胞を収集し、骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)を単離した。単離細胞集団の純度は、フローサイトメトリーにより90%を超えることが明らかになり、単離細胞の生存率は、トリパンブルー色素排除を使用して確認した。ホルボール12−ミリステート−13−アセテート(PMA)で24時間〜72時間刺激されたMDSC内のインドールアミン2,3−ジオキシゲナーゼ(IDO)発現を、抗マウスGr−1 FITC抗体による細胞表面染色および抗マウスIDO APC抗体による細胞内染色により評価した。T細胞をナイーブマウスの脾細胞から回収し、抗マウスCD90.2磁性粒子(BD IMag)を使用して単離した。抗マウス/ヒトCD11b(クローンM1/70、BioXcell)およびラットIgG2bアイソタイプ対照(クローンLTF−2、BioXcell)を含む抗体なしまたはありで、CFSE標識T細胞をMDSCと比1:1または1:2で共培養した。T細胞増殖を抗CD3/CD28刺激抗体により誘導した。
データをPrism 6.0(GraphPad)を使用して解析し、平均±SEMとして表した。群間の比較をスチューデントt検定を使用して実施した。ピアソンの相関係数を用いて相関を判断した。0.05未満のp値は有意であると見なした。
Claims (18)
- 細胞上のCD11bのI−ドメインに特異的に結合する試薬を含む、免疫応答を調節することによるがんの治療における使用のための
医薬組成物。 - 前記CD11bは腫瘍関連骨髄系細胞(TAMC)上にある
請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記試薬は、CD11bのI−ドメインを結合する抗体である
請求項1または2に記載の医薬組成物。 - 免疫応答調節剤をさらに含む
請求項1または2に記載の医薬組成物。 - 前記免疫応答調節剤は、PD−1、PD−L1、CTLA4、CD40、OX40またはToll様受容体(TLR)に特異的に結合する試薬である
請求項4に記載の医薬組成物。 - 前記免疫応答調節剤は、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗CTLA4抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、Toll様受容体アゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法または化学療法剤である
請求項3に記載の医薬組成物。 - 前記免疫応答調節剤は抗CTLA4抗体である
請求項3に記載の医薬組成物。 - 前記Toll様(TLR)受容体アゴニストはCpGである
請求項6に記載の医薬組成物。 - 前記化学療法剤はタキソールである
請求項6に記載の医薬組成物。 - 医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫応答を調節するための方法であって、前記医薬組成物は、細胞上のCD11bのI−ドメインに特異的に結合する試薬を含む
方法。 - 前記CD11bは腫瘍関連骨髄系細胞(TAMC)上にある
請求項10に記載の方法。 - 前記試薬は、CD11bのI−ドメインを結合する抗体である
請求項10または11に記載の方法。 - 前記医薬組成物は免疫応答調節剤をさらに含む
請求項10または11に記載の方法。 - 前記免疫応答調節剤は、PD−1、PD−L1、CTLA4、CD40、OX40またはToll様受容体(TLR)に特異的に結合する試薬である
請求項13に記載の方法。 - 前記免疫応答調節剤は、抗PD−1抗体、抗PD−L1抗体、抗CTLA4抗体、抗CD40抗体、抗OX40抗体、Toll様受容体アゴニスト、腫瘍溶解性ウイルス、放射線療法または化学療法剤である
請求項12に記載の方法。 - 前記免疫応答調節剤は抗CTLA4抗体である
請求項12に記載の方法。 - 前記Toll様(TLR)受容体アゴニストはCpGである
請求項15に記載の方法。 - 前記化学療法剤はタキソールである
請求項15に記載の方法。
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