KR20040053133A - 세포의 활성화 및 증식 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일반적으로 세포를 활성화시키고 증시시키는 방법 및 보다 특히, 세포의 증식을 최대화하여 급격하게 고밀도가 되도록 세포를 활성화시키고/시키거나 자극시키기 위한 신규 방법에 관한 것이다. 다양한 양태에서, 세포는 단기간내에 활성화되고 매우 고밀도로 증식한다. 특정 양태에서, 세포는 단기간내에 매우 높은 수의 세포로 활성화되고 증식된다. 본 발명은 추가로 본원의 방법에 의해 활성화되고 증식된 세포의 조성물을 제공한다.

Description

세포의 활성화 및 증식{Activation and expansion of cells}
T-세포 항원 수용체(TCR)은 CD3 복합체와 연합된 다수 서브유니트의 면역 인지 수용체이고 항원 제공 세포(APC)의 표면상의 주요 조직적합성 복합체(MHC) 부류 I 및 II 단백질에 의해 제공되는 펩타이드에 결합한다. TCR이 APC상의 항원 펩타이드에 결합하는 반응이 T 세포 활성화에서의 핵심 반응이고 이것은 T세포와 APC 간의 접점의 면역학적 시냅스에서 일어난다.
T-세포 활성화를 지연시키기 위해, T 림프구는 전형적으로 제2 보조 자극 시그날을 요구한다. 보조 자극은 전형적으로 T 헬퍼 세포가 클로날 증식을 유도하기에 충분한 사이토킨 수준을 생산하는데 필요하다[문헌참조: Bretscher, Immunol. Today 13:74, 1992; June et al., Immunol. Today 15:321, 1994]. 주요 보조 자극시그날은, 활성화된 항원 제공 세포(APC)상의 B7 계열의 리간드(CD80(B7.1) 또는 CD86(B7.2))의 구성원이 T 세포상의 CD28과 결합하는 경우 발생한다.
특정 서브세트의 T세포의 증식을 자극하는 방법은 면역치료법에 유용한 다양한 T 세포 조성물을 생성시키기 위한 잠재능을 갖는다. 성공적인 면역치료법은 효율적인 자극에 의해 T 세포의 반응성 및 양을 증가시킴에 의해 도움을 받을 수 있다.
사람 T 세포를 증식시키는데 유용한 다양한 기술은 주로 보조 세포 및/또는 외인성 성장 인자(예를 들어, 인터류킨-2(IL-2))의 사용에 의존한다. IL-2는 항 CD3 항체와 함께 사용하여 T-세포를 자극시키고 주로 T 세포의 CD8+아집단을 증식시킨다. 2개의 APC 시그날은 최적의 T 세포 활성화, 증식 및 재주입시 T 세포의 장기 생존을 위해 요구되는 것으로 사료된다. APC는 비교적 단명하기 때문에, 보조 세포로서 MHC 일치 APC에 대한 요건은 장기 배양 시스템을 위해 상당한 문제점을 일으킨다. 따라서, 장기 배양 시스템에서, APC는 계속적으로 공급원으로부터 수득되어야만 하고 재보충되어야만 한다. 보조 세포를 새롭게 공급해야되는 필요성은 보조 세포가 영향받은 면역 결핍의 치료시 문제가 된다. 추가로, 바이러스 감염을 치료하는 경우, 보조 세포가 바이러스를 함유하는 경우, 당해 세포는 장기 배양 동안에 전체 T 세포 집단을 오염시킨다.
외인성 성장 인자 또는 보조 세포의 부재하에, 동시 자극 시그날은 예를 들어, 세포를 비드와 같은 고형상 표면에 부착된 CD3 리간드 및 CD28 리간드에 노출시켜 T 세포 집단으로 전달될 수 있다[문헌참조: C. June, et al.(미국 특허 제5,858,358호); C. June et al. WO 99/953823]. 이들 방법은 치료학적으로 유용한 T 세포 집단을 성취할 수 있지만 T 세포 집단의 증가된 강인함과 풍부함은 이상적이지 못하다.
추가로, 당해 기술 분야에 현재 유용한 방법은 T 세포의 단기 증식 또는 보다 강한 집단의 T 세포 및 이의 이로운 결과를 수득하려는 의도와는 다르다. 추가로, 증식된 T 세포의 적용은 단지 몇몇 질환 상태로 제한되어 있다. 최대 생체내 효과를 위해서는, 치료학적으로, 생체외 또는 생체내에서 생성되고 활성화된 T 세포 집단이 암, 감염성 질환 또는 기타 질환 상태에 대해 최대한의 면역 반응을 구성할 수 있는 상태에 있어야만 한다는 것이다. 본 발명은, 기타 증식 방법 보다 풍부하고 천연적인 표면 수용체 및 사이토킨 생산 특징을 갖는 고도로 활성화되고 보다 순수한, 증가된 수의 T 세포를 생성하기 위한 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은 임의의 표적 세포의 세포 집단의 조성물을 제공하고, 이것은 T 세포 집단 및 이들 생산하기 위한 성분을 포함할 뿐만 아니라 기타 관련된 잇점을 제공한다.
본 발명의 간단한 요약
본 발명은, a) 적어도 일부가 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, b) 당해 세포 집단을, T 세포의 적어도 일부의 세포 표면 잔기를 연결시키고 T세포(여기서, T 세포는 약 2주 미만에 약 6 x 106세포/ml 및 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식한다)를 자극시키는 하나 이상의 제제에 부착된 특정 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 T 세포의 집단을 활성화시키고 증식시키는 방법을 제공한다. 한 양태에서, T 세포는 단일 개체로부터 유래하고 T 세포는 약 2주 미만에 약 100 내지 500 x 106의 세포 개시수로부터 약 총 100 내지 500 x 109세포로 증식한다. 특허청구범위 제1항의 방법에서, 당해 T 세포는 약 2주 미만에 약 50 x 106세포/ml의 농도에 도달한다. 한 양태에서, T 세포는 약 7일 내지 약 12일에 약 40 내지 60 x 106세포/ml의 농도에 도달한다. 추가의 양태에서, T 세포는 약 5일 내지 약 12일간에 약 24시간에 약 1.5배 이상 증식한다. 또 다른 양태에서, T 세포 집단은 약 0.1ℓ내지 약 200ℓ용적을 갖는 배양 컨테이너에 접종한다. 관련 양태에서, 배양 컨테이너는 하나 이상의 주입구 여과기 및 하나의 배출구 여과기를 포함한다. 또 다른 양태에서, T 세포의 집단은 초기 농도 약 0.2 x 106세포/ml 내지 약 5 x 106세포/ml로 접종한다.
한 양태에서, 본 발명의 세포의 증식은 폐쇄된 시스템에서 일어난다. 한 양태에서, 폐쇄된 시스템은 하나 이상의 주입구 여과기, 하나의 배출구 여과기 및 샘플링 포트를 포함하는 컨테이너를 포함한다. 또 다른 양태에서, 배양 배지는 폐쇄 시스템을 통해 관류된다. 특정 양태에서, 관류는 약 4일 내지 8일째에 분당 약0.5ml 내지 약 3ml로 개시된다. 배지의 예는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가의 양태에서, 배지는 계면활성제, 항체, 플라스마네이트 또는 환원제(예를 들어, N-아세틸-시스테인, 2-마캅토에탄올)를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 폐쇄된 시스템은 진동할 수 있는 플랫폼상에 위치한 생물반응기 배양 컨테이너를 포함한다. 특정 양태에서, 진동 플랫폼의 속도 및 각은 다양할 수 있다. 추가의 양태에서, 당해 플랫폼의 진동은 약 3일째에 약 분당 5 내지 15 진동수로 개시된다. 또 다른 양태에서, 플랫폼은 추가로 다양한 가열 장치, 자기 및 가스 다기관을 포함한다. 특정 양태에서, 폐쇄 시스템은 추가로, 폐쇄된 시스템을 출입하는 주사 펌프 및 멸균물 조절 장치를 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 방법은 T 세포의 제1 T 세포 표면 잔기를 연결하는 제1 제제에 부착된 표면 및 당해 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제에 부착된 동일하거나 제2 표면을 제공하고 이때, 제1 및 제2 제제에 의한 연결은 당해 T 세포의 증식을 유도한다. 관련 양태에서, 동일하거나 제3 표면은 T 세포의 제3 잔기를 연결하는 제3 제제에 부착되어 있고 제1, 제2, 제3 제제에 이ㅡ한 연결은 당해 T 세포의 증식을 유도한다. 특정 양태에서, 하나 이상의 제제는 항체 또는 항체 단편이다. 또 다른 양태에서, 제1 제제는 항체 또는 이의 단편이고 제2 제제는 항체 또는 이의 단편이다. 또 다른 양태에서, 제1 및 제2 제제는 상이한 항체이다. 특정 양태에서, 제1 제제는 항 CD3 항체, 항 CD2 항체 또는 항 CD3 또는 항 CD2 항체의 항체 단편이고, 제2 제제는 항 CD28 항체 또는 이의 항체 단편이다. 또 다른 양태에서, 제1 제제는 항 CD3 항체이고 제2 제제는 항 CD28 항체이다. 추가의 양태에서, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체는 약 1:1 내지 약 1:100의 비율로 존재한다. 특정 양태에서, 제1 제제는 항 CD3 항체이고 제2 제제는 CD28에 대한 리간드(예를 들어, 천연 리간드, B7)이다. 추가의 양태에서, 제3 제제는 항체 또는 이의 항체 단편이다. 또 다른 양태에서, 제3 제제는 항 4-1BB 항체 또는 이의 항체 단편이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 방법에 따라 생산되는 T 세포 집단을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 하나 이상의 배출구 여과기 및 하나의 주입구 여과기를 포함하고 내부 배양 배지 용적이 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 밀도로 증식된 T 세포를 포함하는 폐쇄된 배양 컨테이너를 포함하는 장치를 제공한다. 특정 양태에서, 증식된 T 세포는 밀도가 약 10 내지 50 x 106세포/ml이다. 추가의 양태에서, 장치의 배지는 추가로 T 세포의 제1 세포 표면 잔기를 연결하는 제1 제제에 부착된 표면 및 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제에 부착된 동일하거나 제2 표면을 포함한다.
본 발명의 하나의 측면은 단일 개체로부터 활성화되고 증식된 총 100 x 109의 T 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 세포의 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을 세포중 적어도 일부의 세포 표면 잔기를 연결하고 이를 자극하는 하나 이상의 제제가 부착되어 있는 표면과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 세포 집단을 증식시키는 방법을 제공하고 이때 당해 세포는 약 2주 미만에 약 6 x 106세포/ml 및 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식한다. 당해 방법의 특정 양태에서, 세포 집단중 적어도 일부가 B 세포, NK 세포, 수상 세포, 줄기 세포, 간 세포, 뉴런, 간엽 세포, LAK 세포 또는 폐 세포를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 적어도 일부가 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, 당해 세포 집단을, T 세포의 제1 세포 표면 자기를 연결하는 제1 제제가 부착되어 있는 표면 및 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제가 부착되어 있는 동일하거나 제2 표면과 접촉시키는 단계(여기서, 제1 및 제2 제제에 의한 연결이 T 세포의 증식을 유도한다), 약 0 내지 5일 사이의 기간동안 당해 표면과 접촉시킨 후, 하나 이상의 주입구 여과기 및 하나의 배출구 여과기를 포함하는 1회용 생물반응기 백을 포함하는 폐쇄된 시스템에서 약 0.2 x 106내지 5.0 x 106의 세포/ml 농도로 세포 집단을 접종하는 단계, 폐쇄된 시스템의 배지를 약 1ml/분으로 관류시키는 단계, 진동 플랫폼상에서 약 5 내지 15진동수/분으로 생물반응기 백을 진동시키는 단계를 포함하는, 당해 T 세포가 약 2주 미만에서 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식됨을 특징으로 하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 T 세포의 집단을 증식시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, T 세포가 증식되어 집단의 농도가 약 6 x 106세포/ml 내지약 90 x 106세포/ml인 T 세포 집단을 제공한다. 한 양태에서, T 세포 집단은 이의 총수가 배양 2주 미만에 약 100 x 109내지 약 500 x 109에 도달한다.
본 발명의 당해 측면 및 또 다른 측면은 하기의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해진다.
본 발명은 일반적으로 세포를 자극하고 활성화시키는 방법, 및 보다 특히, 매우 고밀도로 세포를 활성화시키고 증식시키는 방법 및 세포를 매우 높은 수로 증식시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고농도로 및 높은 수로 활성화되고 증식된 T 세포를 포함하는, 세포의 조성물에 관한 것이다.
도 1은, 자기 농축 및 자극의 존재(크셀러레이트(XCELLERATE) IITM) 또는 이의 부재하에 약 0.5 x 109T-세포로 개시한 후 8일째에 측정된, 활성화되고 증식된 T세포의 총수를 비교한 플롯이다.
도 2는 자기 농축 및 자극의 존재(크셀러레이트 IITM) 또는 이의 부재하에 8일째에 측정된, 활성화되고 증식된 T세포의 배수 증식을 비교한 플롯이다.
도 3은 자기 농축 및 자극(크셀러레이트 IITM) 후 또는 자기 농축 및 자극(크셀러레이트 IITM) 없이 8일동안 이전에 배양된 T 세포의 재자극을 비교한 CD154 발현에 대한 유동 세포측정 분석을 나타내는 플롯이다.
도 4는 자기 농축 및 자극(크셀러레이트 IITM) 없이 활성화된 세포와 함께 자기 농축 및 자극(크셀러레이트 IITM)을 비교하면서, 배양한지 3일 후의 CD154 발현에 대한 유동 세포측정 분석을 나타내는 플롯이다.
도 5A 및 5B는 크셀러레이트 IITM과정을 개시하기 위해 동결되고 해동되는 크셀러레이트 IITMPBMC(5A) 또는 PBMC와 함께 T 세포 활성화 및 증식을 도시하는 플롯이다.
도 6A 및 6B는 크셀러레이트 I 또는 크셀러레이트 IITM과정 동안에 하나의 공여 샘플(PC071)에서 T 세포 활성화 후 CD25 발현의 시간 경과 분석을 도시한 플롯이다. 재자극은 생체내 활성화를 모의 실험하기 위해 8일째에 수행한다. 도 6A는 CD4+세포상의 CD25 발현을 나타내고 도 6B는 CD8+세포상의 CD25 발현을 도시한다.
도 7A 및 7B는 크셀러레이트 I 또는 크셀러레이트 IITM과정 동안에 하나의 공여 샘플(PC071)에서 T 세포 활성화 후 CD154 발현의 시간 경과 분석을 도시한 플롯이다. 재자극은 생체내 활성화를 모의 실험하기 위해 8일째에 수행한다. 도 7A는 CD4+세포상의 CD154 발현을 나타내고 도 7B는 CD8+세포상의 CD154 발현을 도시한다.
도 8A 및 8B는 실시예 IX에 제시된 방법을 사용하여, 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 자극 후 사람 말초 혈액 T 세포의 성장을 설명하는 플롯이다.
도 9는 10μ/ml 및 +/- 단핵구 고갈에서 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드 +/- 재조합 사람 IL-2로 자극 후 사람 말초 혈액 T 세포의 성장을 설명하는 플롯이다. 모든 세포를 박스터 라이프셀 플라스크(Baxter Lifecell Flask)(300ml)에서 배양한다. 대량화는 박스터 라이프셀 3ℓ플라스크로 증식된 300ml 플라스크 배양물(IL-2/단핵구 고갈되지 않음)을 언급한다.
도 10은 시간에 따른 전방 산란 유동 세포측정 프로필에 의해 측정되는 바와 같은 세포 크기에 대한 역학적 분석을 입증하는 플롯이다.
도 11A 및 11B는 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 초기 자극 후 시간경과에 따른 CD25 발현을 나타내는 플롯이다. 도 11A는 CD4+세포상의 CD25의 발현 프로필을 나타내는 반면 도 11B는 CD8+세포상의 CD25의 발현 프로필을 나타낸다.
도 12는 1차 및 2차 자극 후 시간 경과에 따른 전방 산란 유동 세포측정 프로필에 의해 측정된 바와 같은 세포 크기의 변화를 설명하는 플롯이다.
도 13A 및 13B는 1차 및 2차 자극 후 시간경과에 따른 CD25 발현을 나타내는 플롯이다. 도 13A는 CD4+세포상의 CD25의 발현 프로필을 나타내는 반면 도 13B는 CD8+세포상의 CD25의 발현 프로필을 나타낸다.
도 14A 및 14B는 2차 자극 후 CD154 발현을 나타내는 유동 세포측정 데이타 플롯이고 1차 및 2차 자극 공급원은 다양하다. 도 14A는 CD4+세포상의 CD154의 발현 프로필을 나타내는 반면 도 14B는 CD8+세포상의 CD154의 발현 프로필을 나타낸다.
도 15는 2차 자극 후 샘플중의 모든 증식된 T 세포상의 CD137의 발현을 나타내는 유동 세포측정 데이타 플롯이다.
도 16A 및 16B는 2차 자극 후 CD54 발현을 나타내는 유동 세포측정 데이타 플롯이고 이때 2차 자극 공급원은 다양하다. 도 16A는 CD4+세포상의 CD54의 발현을 나타내는 반면 도 16B는 CD8+세포상의 CD54의 발현을 나타낸다.
도 17A 내지 17D는 항 CD3 및 항 CD 28이 연결된 비드에 의해, B 세포 만성 림프구성 백혈병의 환자로 부터 수득한 T 세포의 2차 자극 후, 세포 표현형 및 CD154 및 CD137의 발현을 나타내는 유동 세포측정 데이타 플롯이다. 도 17A 및 17B는 항 CD3 및 항 CD28 연결된 비드(17A)로 자극한지 13일 후 및 항 CD3 및 항 CD28 연결된 비드(17B)로 1차 자극한지 18일 후 및 2차 자극한지 7일 후의 샘플에 존재하는 CD4+및 CD8+세포를 나타낸다. 도 17C 및 17D는 B 세포 만성 림프구성 백혈병의 환자로 부터 수득한 세포의 2차 자극 후 CD154 및 CD137 발현을 나타내는 세포측정 데이타 플롯이다.
도 18A 내지 18C는 정상적인 공여자 기원의 T 세포의 1차 및 2차 자극 후 시간경과에 따른 IL-2(18A), 인터페론 감마(IFN-γ) 및 IL-4(18C)의 발현을 나타내는 플롯이다.
도 19A 및 19B는 항 CD3 및 항 CD28 연결된 비드로 자극 후 시간경과에 따른 CD62L의 발현을 나타내는 플롯이다.
도 20은 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 자극 후 CD4 또는 CD8 세포의 %를 도시하는 플롯이다.
도 21A 및 21B는 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 자극 및 실시예 IX의 방법을 사용한 +/- 재자극 후, 각각의 CD25 및 CD154 발현의 평균 형광 강도의 함수로서 유동 세포측정 데이타를 나타내는 플롯이다.
도 22A 및 22B는 항 CD3 및 항 CD28 동시 고정화된 비드 자극전에, CD4 및 CD8 아집단(22A) 또는 CD4 풍부 집단(22B) 둘다와 함께 세포중 CD154 염색 대 대조군 염색(예를 들어, 배경)의 유동 세포측정 분석을 나타내는 플롯이다.
도 23A 및 23B는 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 말초 혈액 림프구의 자극 후 배지에서 TNF-α(23A) 및 IFN-γ(23B)의 ELISA 분석을 나타내는 플롯이다.
도 24A 및 도 24B는 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 말초 혈액 림프구의 자극 후 배지에서 IL-4(24A) 및 IL-2(24B)의 ELISA 분석을 나타내는 플롯이다.
도 25는 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 말초 혈액 림프구를 자극 한 후 전방 산란 분석법을 사용하여 T 세포 크기의 증가를 도시하는 플롯이다.
도 26A 내지 26L은 항 CD3 및 항 CD28이 동시 고정화된 비드로 자극하고 8일째에 동일한 것으로 재자극 시킨 후에, CD62L 발현(평균 형광 강도, MFI)(26A),CD49d(MFI)(26B), CD25(MFI)(26C), CD69(MFI)(26D), CD154(MFI)(26E), 전방 광 산란기(크기)(26F), 생존율(% 생존 게이트)(26G)의 유동 세포측정 데이타를 제공하는 막대 그래프이다. 도 26H 내지 26L은 자극 후 각각 4시간 및 8시간 시점에서의 CD62L, CD69, CD49d, CD154 및 CD25를 도시한다.
도 27은 CD3:CD28의 비율을 다양화하면서 항 CD3 및 항 CD28로 자극 후 시간 경과에 따른 T 세포의 배수 증가를 도시하는 그래프이다.
도 28은 정체 시스템에서 T세포의 증식 대 웨이브 생물 반응기에서 T 세포의 증식을 비교하는 그래프이다.
본 발명을 제시하기 전에, 이후에 시용될 특정 용어에 대한 정의를 제공하는 것이 이를 이해하는데 도움이 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생물적합성"은 생존 세포에 주로 비독성인 성질을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "자극"은 세포 표면 잔기의 연결에 의해 유도된 1차 반응을 언급한다. 예를 들어, 수용체와 관련하여, 당해 자극은 수용체를 후속 시그날 전달 반응과 연결시킨다. T 세포의 자극에 대해, 당해 자극은, 한 양태에서, 후속적인 시그날 전달 반응(예를 들어, TCR/CD3 복합체의 결합)을 유도하는 T 세포 표면 잔기의 연결을 언급한다. 추가로, 자극 반응은 세포를 활성화시킬 수 있고 TGF-β의 하향조절과 같은 분자의 발현 또는 분비를 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 따라서, 직접적인 시그날 전달 반응의 부재하에서도 세포 표면 잔기의 연결은 세포골격 구조를 재구성하거나 세포 표면 잔기를 유착시킬 수 있어 이의 각각은 후속적인 세포 반응을 증진시키거나 변형시키거나 변화시키는 작용을 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화"는 충분한 세포 표면 잔기 연결 후, 명백한 생화학적 또는 형태학적 변화를 유도하는 세포의 상태를 언급한다. T 세포에 대해, 당해 활성화는 세포 증식을 유도하도록 충분히 자극된 T 세포의 상태를 언급한다. T 세포의 활성화는 사이토킨의 생산 및 또한 조절 또는 세포용해 효과인자 기능의 수행을 유도할 수 있다. 기타 세포에 대해, 당해 용어는 특정 물리 화학적 과정의 조절을 상향 또는 하향 조절함을 의미한다.
본원에 사용되는 용어 "힘"은 세포 농축 및 세포 표면 잔기와 결합하는 제제와 세포의 농축을 유도하는 자극될 세포에 적용되는 인공적이거나 외부적인 힘을 언급한다. 예를 들어, 용어 "힘"은 세포 농축 및/또는 세포 표면 잔기 응집을 유도하는 중력(중력 뿐만 아니라 중력 힘을 제외한)보다 큰 임의의 힘을 포함한다. 당해 힘은 여과, 수압력, 전기력, 음파력, 원심분리 또는 자기력와 같은 막관통 압력을 포함한다. 이상적으로, 당해 힘은 목적하는 표적 세포를, 세포 표면 잔기를 연결하는 제제와 농축시킨다. 다양한 관점에서, 힘은 펄스될 수 있는데 즉, 적용되고 재적용될 수 있다(예를 들어, 자기력은 중단되고 가동되어 배합된 상자성 입자로 세포 집단을 펄스할 수 있다).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동시"는 세포 표면 잔기 결합제가 부착되어있는 표면에 고유적으로 세포를 농축시키는 즉시, 서로간에 및 표면(리간드(즉, 제제))과 함께 세포를 농축시킨다는 사실을 언급한다. 그러나, 용어 "동시"의 사용은, 농축 및 추가의 리간드 결합이 농축 표면에 동시에 일어남으로써, 세포 표면 잔기 결합제가 부착된 표면을 갖는 표적 세포의 이전의 결합을 배제하지 않는다. 예를 들어, T 세포 활성화의 범위내에서, T 세포는 항 CD3 및 항 CD28 항체가 부착된 상자성 비드와 같은 표면에 노출될 수 있고 이어서 자기장에 의해 농축된다. 따라서, 이와 관련하여, 세포 및 비드는 사전에 접촉되고 연결되지만 세포의 농축동안에 추가의 연결 반응이 일어난다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 세포"는 세포 표면 잔기 연결에 의해 자극되는 임의의 세포를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 둘다, 영장류화된(예를 들어, 사람화된); 쥐; 마우스-사람; 마우스-영장류 및 키메릭 항체를 포함하고 온전한 분자, 이의 단편(예를 들어, scFv, Fv, Fd, Fab, Fab' 및 F(ab)'2단편) 또는 온전한 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고 천연적으로 존재할 수 있거나 면역화, 합성 또는 유전학적 가공 기술에 의해 제조될 수 있고, 본원에 사용된 바와 같은 "단편"은 항체로부터 또는 이와 관련된 단편이고 이것은 항원과 결합하고 몇몇 양태에서, 예를 들어, 갈락토스 잔기의 혼입으로 유도체화되어 제거 및 흡수를 촉진하는 구조적 특징을 나타낸다. 이것은, 예를 들어, F(ab), F(ab)'2, scFv, 경쇄 가변 영역(VL), 중쇄 가변 영역(VH) 및 이의 조합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하고 온전한 분자이거나 이의 단편 또는 온전한 분자 및 단편의 다량체 또는 응집체일 수 있고 천연적으로 존재하거나 예를 들어, 합성(화학적 및/또는 효소적 합성) 또는 유전학적 가공 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "제제", "리간드" 또는 세포 표면 잔기와 결합하는 제제"는 한정된 집단의 세포에 결합하는 분자를 언급한다. 당해 제제는 수용체, 항원 결정인자 또는 표적 세포 집단상에 존재하는 기타 결합 부위와 같은 임의의 세포 표면 잔기와 결합할 수 있다. 당해 제제는 단백질, 펩타이드, 항체 및 이의 항체 단편, 융합 단백질, 합성 분자, 유기 분자(예를 들어, 소분자)등일 수 있다. 명세서에서 T 세포 자극과 관련하여 항체는 당해 제제의 원형적인 예로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은, "세포 표면 잔기와 결합하는 제제" 및 "세포 표면 잔기"는 리간드/항리간드 쌍과 관련하여 사용된다. 따라서, 이들 분자는 일반적으로 비교적 친화도(친화도 상수 Ka 약 106M-1)가 높은 특이적 결합을 입증하는 상보적/항 상보적 세트의 분자로서 간주되어야만 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "동시 자극 시그날"은 TCR/CD3 연결과 같은 1차 시그날과 조합되어 T 세포 증식을 유도하는 시그날을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 "리간드/항 리간드 쌍"은 일반적으로 친화도(친화도 상수 Ka 약 106M-1)가 높은 특이적 결합을 입증하는 상보적/항상보적 세트의 분자를 언급한다. 예시된 리간드/항 리간드 쌍은 효소/억제제, 합텐/항체, 렉틴/탄수화물, 리간드/수용체 및 비오틴/아비딘 또는 스트렙트아비딘이다. 본 발명의 명세서 범위내에서, 수용체 및 기타 세포 표면 잔기는 항 리간드인 반면 이와 반응하는 제제(예를 들어, 항체 및 항체 단편)는 리간드로서 간주된다.
본원에 사용된 바와 같은 "분리"는 또 다른 성분으로부터 하나의 성분을 실질적으로 정제하는 임의의 수단(예를 들어, 여과 또는 자기 인력)을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "정체"는 세포가 활성적으로 증식하지 않는 세포 상태를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 "표면"은 제제가 부착될 수 있는 임의의 표면을 언급하고 금속, 유리, 플라스틱, 공중합체, 콜로이드, 지질 및 세포 표면등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 필수적으로 임의의 표면은 제제와 결합하거나 부착하여 이를 보유할 수 있다. 본원에 사용되는 표면의 원형적인 예는 비드와 같은 플라스틱이다.
본 발명의 한 측면은, 세포의 농축, 세포 표면 잔기의 연결을 유도하는 힘의 조합 및 세포의 진동 폐쇄 시스템에서의 배양은 이들 세포의 활성화 및 증식을 상당히 증진시킨다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 본원에 제시된 원형적인 예에서, T 세포가 사용된다. 그러나, 당업자라면, 세포 표면 잔기 연결 또는 응집이 요구되거나 당해 결합이 후속적인 세포 시그날 전달 반응(예를 들어, 수용체)을 유도함을 용이하게 판단할 것이다. 본 이론에 얽매이지 않고, 본 발명은 지질 표류(rafting) 및/또는 수용체 편재화(polarization)를 포함하는 현상을 이용하여 작용할 수 있다. 당해 현상은 이들이 세포의 하나 또는 심지어 여러 영역에서 수용체의 국소화(즉, 편재화)로 인해, 세포 표면 잔기를 포함하는 지질 래프트의 응집 또는 증진된 시그날 전달에 의해 시그날 전달을 개시하고 증진시킴을 시사한다는 점에서 유사하다. 따라서, 당해 세포 표년 잔기 연결은 T 세포에서 예상치 않게 강한 세포 활성 및 증식을 유도할 뿐만 아니라 또한 많은 세포 유형의 시그날 전달 반응을 확대시키는데 적용될 수 있다. 추가로, 여전히 본 이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명은 증식 세포에 대해 최적의 통기를 제공하여 작용할 수 있다. 따라서, 진동 및 관류된 배지를 통기시키는 것과 조합된 세포 표면 잔기 연결은 예상치 않게 높은 밀도 및 절대적인 수로 T 세포의 강한 세포 활성화 및 증식을 유도한다. 따라서, T 세포와 관련하여, 본 발명은 다양한 예상치 않은 잇점을 제공하고 첫번째로 이것은 "피복되지 않은" 입자를 사용한 별도의 단핵구-고갈 단계가 필요하지 않아 보다 적은 세포 전달 및 적은 시약, 활성화 과정동안의 증가된 수준의 T 세포 활성화를 요구함에 의해 T 세포의 증식을 단순화시켜 세포 치료에 적당한 세포 수를 성취하기 위한 시간을 감소시키고 세포의 가공에 요구되는 시간 및 노동을 감소시켜 제조 단가를 감소시키고 스케줄에 따른 환자의 처리 및 주입에 대한 융통성을 증가시킨다.
본 발명의 추가의 측면에서, 제1 및 제2 이상의 표면이 결합된 리간드/제제의 부재 또는 존재하에 사용된다. 당해 양태에서, 다양한 표면은 표적 세포의 세포 표면 잔기와 결합하기 위해 부착된 동일하거나 상이한 제제를 가질 수 있다. 예를 들어, 상자성 비드에는 표적 세포의 수용체에 대한 항체가 부착될 수 있고 당해 비드는 표적 세포를 함유하는 세포 집단과 혼합될 수 있다. 추가로, 세포 집단은 동일하거나 상이한 세포 표면 잔기 결합제가 부착된 제2 이상의 비드와 혼합될 수 있다. 힘 유도된 농축시, 비드와 세포는 보다 적은 용적으로 서로 인접하게 되고 따라서 시그날 전달이 확대된다. 또 다른 예에서, 탄수화물에 특이적인 제제 또는 기타 비수용체 세포 표면 잔기가 부착된 상자성 비드가 표적 세포를 함유하는 세포 집단과 혼합된다. 이어서, 자기장을 사용하여 비드 부착된 세포를, 수용체 연결제가 부착된 또 다른 표면으로 유인한다. 따라서, 시그날 전달 유도제는 제2 표면상에 있다. 여전히 또 다른 예에서, 표적 세포의 세포 표면 잔기와 결합하는 제제는 리간드가 부착될 수 있는 메쉬 또는 여과기내에 보유되기에 충분히 큰 입자에 부착될 수 있다.
상기된 바와 같이, 본 발명은 세포 집단내에 세포의 표면상의 결합 잔기에 의해 세포 집단을 자극하기 위한 방법을 제공한다. 세포 집단을, 세포 표면 잔기에 결합하는 제제(예를 들어, 리간드)와 접촉시켜 세포 집단을 자극할 수 있다. 리간드는 용액중에 존재할 수 있지만 또한 표면에 부착될 수 있다. 수용체와 같은 세포 표면 잔기의 연결은 일반적으로 특정 시그날 전달 경로를 유도할 수 있다. 최근 연구는 시그날 전달이 일어나는 동안, 요구되는 수용체를 함유하는 지질이 상당히 농축적으로 표류하여 응집되어야함을 시사한다. 예를 들어, 표류 응집은, 특정 세포 표면 잔기에 대한 리간드를 상자성 입자에 부착시키고 리간드 함유 입자를세포에 노출시키고 이후에 바로 또는 동시에 자기장과 같은 힘을 가하여 연결된 잔기(예를 들어, 수용체)가 편재화되는 것을 돕고 적은 용적내 세포를 농축시킴에 의해 생체내 또는 시험관내에서 촉진될 수 있다. 자기력의 적용은 세포를 농축시킬 뿐만 아니라, 세포 표면 잔기를 연결하는 제제가 부착된 표면을 갖는 세포를 농축시키고 이로써 세포와 리간드의 접촉이 크게 증가하여 보다 강력한 활성화를 가속화시킨다. 예를 들어, 세포가 적은 수의 수용체 및/또는 기능부전 수용체를 갖는 경우, 본 발명의 많은 적용이 가능하고 당해 방법은 지질 표류내 당해 수용체를 충분히 농축시켜 당해 결점을 극복하고 적당한 시그날 전달 활성을 허용할 수 있다. 당해 세포 표면 레퍼토리 보정에 대한 한 예는, 항 CD3 및 항 CD28 항체와 같은 제제로 세포 표면 잔기를 자극하기 전에, 여러 정상적인 세포 표면 마커(예를 들어, CD3/TCR 복합체)가 의외로 낮은 특정 유형의 백혈병을 앓는 환자이다. 이들 세포 집단을 항 CD3 및 항 CD28 항체와 같은 제제로 자극시킴에 의해, 이들 세포의 세포 표면 마커는 정상적인 수준으로 회복되고 이와 같이 환자에게 재투여되는 경우 강하고 보다 신속한 면역 반응을 제공하는 암 치료에 대해 보다 강력한 면역치료 생성물을 제공할 수 있다. 수용체 편재화를 유도하여 이로써 수용체 시그날 전달 반응을 최대화하는 본 발명의 여전히 또 다른 적용에서, 세포는 효율적으로 농축되고 활성화될 수 있다. 당해 적용은 수용체에 대한 스크리닝 분석의 사용을 포함하고 세포 표면상의 세포 표류를 수거하여 종양 세포내에서 Fas 또는 유사 분자를 연결하여 괴사를 유도하는 것과 같은 활성화를 유도함을 포함하는 광범위한 용도를 갖는다.
당해 스크리닝 분석의 한 예에서, G 커플링된 단백질 수용체 함유 세포를 사용할 수 있고 이들을 여기에 결합하는 제제와 접촉시킬 수 있으며 이들 제제는 특정 표면에 결합하여 농축을 유도하는 힘을 부여한다. 따라서, 수용체가 함께 표류함으로써, 시그날 전달 반응은 증폭된다. 이것은 전형적인 실험에서 극히 낮은 수준인 시그날 전달 반응의 연구 및 당해 시그날 전달 반응을 억제하거나 어느정도 개질시키는 약제 화합물의 스크리닝에서 중요할 수 있다.
세포 집단의 자극
본 발명의 방법은 세포 잔기와 결합하는 리간드 또는 제제를 도입하여 세포 반응을 유도하는 표적 세포의 자극에 관한 것이다. 리간드 또는 제제가 세포에 결합하여 시그날 전달 경로를 유도할 수 있고 이어서 이것은 세포내 특정 표현형 또는 생물학적 변화를 활성화시킨다. 본원에 기재된 바와같이 세포 잔기에 결합하는 리가드 또는 제제를 도입함에 의한 표적 세포의 자극은 세포내 표현형 또는 생물학적 변화를 일으키는 다수의 세포 반응을 상향조절하거나 하향조절할 수 있다. 세포의 활성화는 정상적인 세포 기능을 증진시킬 수 있거나 비정상적인 세포내에서 정상적인 세포 기능을 개시할 수 있다. 본원에 기재된 바업은 세포 표면 잔기에 결합하는 리간드 또는 제제와 함께 세포를 농축시킴에 의해 자극을 제공한다. 세포의 자극은 증진될 수 있거나 특정 세포 반응이 제2 세포 표면 잔기를 연결하는 제2 제제 또는 리간드를 도입함에 의해 자극될 수 있다. 당해 방법은 세포 표면 잔기를 연결하여 시그날 전달 반응을 일으키는 임의의 세포에 적용될 수 있다. 본발명은 추가로, 자극된 세포의 선별 또는 배양하기 위한 수단을 제공한다. 기재된 원형적인 예는 T 세포의 자극이고 당업자는 당해 방법이 기타 세포 유형에 적용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들어, 자극되고 선택될 수 있는 세포 유형은 섬유아세포, 신경아세포, 폐 세포, 조혈 줄기 세포 및 간엽 선조 세포, 신경 및 간 선조 세포 및 줄기 세포, 수상세포, 세포용해 T 세포(CD8+), B 세포, NK 세포, 기타 백혈구 집단, 다능성 줄기 세포, 다기능 줄기 세포, 섬세포등을 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 당해 방법으로부터 비롯된 세포 집단을 제공할 뿐만 아니라 특이적 표현형 특성을 갖는 T 세포를 포함하여, 명백한 표현형 특성을 갖는 세포 집단을 제공한다.
상기된 바와 같이, 다양한 세포 유형이 본 발명의 범주내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, B 세포, T 세포, NK 세포, 기타 혈액 세포, 신경 세포, 폐 세포, 선(내분비) 세포, 골 형성 세포(파골 세포등), 생식 세포(예를 들어, 난자), 생식 기관에 배열된 상피 세포와 같은 세포 유형 및 기타 세포 유형이 사용될 수 있다. 세포 표면 잔기 리간드 쌍은 반드시 그렇지는 않지만 T 세포 항원 수용체(TCR) 및 항 CD3 mAb, TCR 및 주요 조직적합성 복합체(MHC) + 항원, TCR 및 펩타이드-MHC 4량체, TCR 및 슈퍼항원(예를 들어, 스타필로코컬 장독소 B(SEB), 독성 쇼크 증후군 독소(TSST)등), B 세포 항원 수용체(BCR) 및 항-Ig, BCR 및 LPS, BCR 및 특이적 항원(1가 또는 다가), NK 수용체 및 항 NK 수용체 항체, FAS(CD95) 수용체 및 FAS 리간드, FAS 수용체 및 항 FAS 항체, CD54 및 항 CD54 항체, CD2 및 항 CD2 항체,CD2 및 LFA-3(백혈구 기능 관련 항원 3), 사이토킨 수용체 및 이의 각각의 사이토킨, 사이토킨 수용체 및 항 사이토킨 수용체 항체, TNF-R(종양 괴사 인자 수용체) 계열 구성원 및 이들에 대해 지시된 항체, TNF-R 계열 구성원 및 이들의 각각의 리간드, 접착/호밍(homing) 수용체 및 이들의 리간드, 접착/호밍 수용체 및 이들에 대한 항체, 난자 또는 수정란 수용체 및 이들의 리간드, 난자 또는 수정란 수용체 및 이들에 대한 항체, 자궁의 내피막상의 수용체 및 이들의 리간드, 호르몬 수용체 및 이들 각각의 호르몬, 호르몬 수용체 및 이들에 대해 지시된 항체 및 기타를 유도할 수 있다.
리간드에 의한 수용체 결합 특성은 수용체를 다량체화하거나 수용체를 응집/배향시켜 시그날 전달 또는 세포 반응을 상향조절하거나 하향조절하거나 개선시키거나 달리 변화시켜 세포 분열, 사이토킨 분비, 세포 이동, 증가된 세포 세포 작용등과 같은 특정 이득을 부여할 수 있다.
세포 표면 잔기의 다량체화, 응집 또는 조절된 배향이 어떻게 실질적인 이득이 될 수 있는지를 설명하기 위해 하기의 2개의 예를 제공한다.
한 예에서, 항원 및 항원 제공 세포에 의한 정상적인 T 세포 활성화는 일반적으로 예를 들어, TCR 표류를 응집시키고 세포골격을 재구성하고 "활성화" 시그날을 편재화하고 세포 분열을 일으킨다. "정상적인" 생체내 T 세포 활성화의 부재하에 본원에 기재된 바와 같은 인공적인 방법을 사용하여, 특히, TCR과 CD28의 가속화되고 조절되고 공간적으로 배향된 연결을 통해 상기된 바와 같은 기능에 영향을 줄 수 있다. 이득은 시험관내에서 세포 증식이 개선되어 치료학적 적용을 위해 주입가능하고 보다 강한 세포 다수를 수득할 수 있다는 것이다. 특히, 본 발명은 T 세포를 매우 고밀도(6 x 106세포/ml 내지 90 x 106세포/ml의 범위)로 활성화시키고 증식시키는 방법을 제공하고 매우 많은 수의 세포(8000억의 많은 세포가 세포의 개시 수 약 0.5 x 109의 세포로부터 시작하여 하나의 개체로부터 증식된다)를 생산한다. 기타 이득은 세포 표면상에 정상 보다 낮은 TCR 밀도와 같은 결점을 갖는 세포에 대해 수용체 "응집"을 개선시킬 수 있다는 것이다. 유사하게, 생체내 적용은 특이적 T 세포 집단(예를 들어, 종양 부위에서 종양 특이적 T 세포)이 활성화될 필요성이 있는 경우 유익할 수 있다. 개선된 수용체 응집 및 배향은 기능적으로 내성화된 T 세포를 수득하기가 어려운 활성화 시그날을 제공할 수 있다. 추가로, 당해 활성화는 항원 특이적 T 세포와 관련하여 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 종양 기원의 T 세포는 분리될 수 있고 증식될 수 있어 환자에게 재주입될 수 있다. 유사하게, 생체내 또는 시험관내의 항원에 노출된 T 세포는 본 발명의 방법에 의해 증식될 수 있다.
또 다른 예에서, 개선된 세포 사멸의 유도는 FAS 경로를 거쳐 일어난다: FAS의 다량체화를 가속화하거나 표적 세포 표면상에 "활성화된" FAS를 공간적으로 배향하거나 달리 성취될 수 없는 누적된 FAS 연결을 촉진하기 위한 능력은 특히, 암, 자가면역 반응 또는 이식 대 숙주 질환을 치료하기 위해 생체내에서 상당한 이득을 제공할 수 있다. 예를 들어, 종양 세포는 생체내에서 저수준의 FAS를 발현할 수 있고 숙주는 종양 부위에서 저수준의 FAS-L을 발현할 수 있다(사이토킨이 억제됨으로 인해). 이들 낮은 수준 때문에, 적당한 FAS 시그날이 생성될 수 없어 종양이 생존하고 증식할 수 있다. 이러한 FAS/FAS 리간드 결힙을 극복하기 위한 한가지 가능한 방법은 상자성 입자에 결합된 FAS(FAS-L, 항체등)에 대한 1가 또는 다가의 리간드를 사용하여 종양/종양 부위를 표적화하는 것이다. 종양 부위(예를 들어, 흑색종, 카포시 육종, 편평 세포 경부암등)에서 본 발명의 방법을 사용한 강한 자기장의 적용은 종양 세포상에 입자 결합된 FAS가 수용체 활성화 및/또는 T 세포 활성화 및 증식을 위해 사용됨으로써 종양 부위에서 상자성 입자가 공간적으로 배향될 수 있도록 한다. 시그날 편재화를 수반하는 증가된 FAS 응집은 적절한 시그날 제공하여 종양 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 하나의 특정 양태에서, T 세포 집단은 T 세포의 표면을 동시에 농축시키고 연결시킴에 의해 자극될 수 있다. 본 발명의 한 측면에서, CD3 및 CD28에 대한 항체는 표면상에 동시 면역화된다. 당해 면역화를 위해 바람직한 표면은 입자 및 특정 측면에서 상자성 비드와 같은 비드를 포함한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, TCR/CD3 복합체와 결합하고 1차 자극 시그날을 개시하는 임의의 리간드는 표면상에 고정화된 1차 활성화 제제로서 사용될 수 있다. CD28과 결합하고 CD28 시그날 전달 경로를 개시함에 이어서 CD3 리간드로 세포를 동시 자극시켜 T 세포의 집단의 활성화를 증진시키는 임의의 리간드는 CD28 리간드이고 따라서 본 발명과 관련하여 동시 자극 제제이다. 본 발명의 추가의 측면에서, T 세포 및 항 CD3 및 항 CD28 접합된 표면의 혼합물에 힘을 적용하여 T 세포를 농축시킴으로써 T 세포 표면 연결을 최대화한다. 하나의 특정 양태에서, 농축력은 항 CD3 및 항CD28 피복된 표면이 상자성 비드인 경우 적용되는 자기력이고 농축된 양상으로 세포 및 리간드를 함께 연결시키는 또 다른 수단이 당해 기술 분야에서 유용하다. T 세포 집단을 자극시키는 당해 방법은 놀랍게도 T 세포의 보다 큰 활성화 및/또는 증식을 유도하는데 중용한 비드-세포 및/또는 세포-세포 접촉을 제공한다. 추가로, 본 발명의 방법은, 처음 질환을 앓는 환자로부터 분리된 경우, 활성화된 T 세포가, T 세포의 프로필과 비교하여, 보다 정상적인 표현형 및 덜 가변적인 최종 생성물임을 지적하는 세포 표면 마커를 발현하는 세포 표면 마커 프로필을 변화시킨다.
1차 시그날
생체외 T 세포 자극에 관여하는 생화학적 반응은 하기에 간략하게 제공된다. TCR/CD3 복합체와, 항원 제공 세포상의 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자와 연계하여 제공되는 항원사이의 상호작용은 항원 특이적 T 세포 활성화로 명명된 일련의 생화학적 반응을 개시한다. 따라서, T 세포의 활성화는 T 세포 TCR/CD3 복합체를 자극시키거나 CD2 표면 단백질을 자극시킴에 의해 성취될 수 있다. 항 CD3 모노클로날 항체를 사용하여 TCR/CD3 복합체를 통해 T 세포의 집단을 활성화시킬 수 있다. 다수의 항 사람 CD3 모노클로날 항체가 시판되고 있고 이의 예는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 입수한 하이브리도마 세포로부터 제조된 OKT3 및 모노클로날 항체 G19-4이다. 유사하게, 자극 형태의 항 CD2 항체가 공지되어 있고 시판되고 있다. 항 CD2 항체를 사용한 CD2를 통한 자극은 전형적으로, 배합된 2개 이상의 상이한 항-CD2 항체를 사용하여 성취된다. 기재된바와 같이 배합된 자극성 항 CD2 항체는 T11.1 또는 T11.2 항체와 배합된 T11.3 항체[문헌참조: Meuer et al., Cell 36:897-906,1984] 및 9-1 항체와 배합된 9.6 항체(T11.1과 동일한 에피토프를 인지하는)[문헌참조: Yang et al., J. Immunol. 137:1097-1100, 1986]를 포함한다. 상기된 항체중 어느 하나와 동일한 에피토프에 결합되는 기타 항체가 또한 사용될 수 있다. 추가의 항체 또는 배합된 항체는 표준 기술에 의해 제조되고 동정될 수 있다.
1차 활성화 시그날은 또한 기타 기작을 통해 T 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 배합물은 포르볼 에스테르(예를 들어, 포르볼 미리스테이트 아세테이트) 및 칼슘 이온수송체(예를 들어, 세포질 칼슘 농도를 증가시키는 이오노마이신)등과 같은 단백질 키나제 C(PKC) 활성화제를 포함한다. 당해 제제의 사용은 TCR/CD3 복합체를 우회하지만 자극 시그날을 T세포에 전달한다. 1차 시그날로서 작용하는 기타 제제는 천연 리간드 및 합성 리간드를 포함할 수 있다. 천연 리간드는 펩타이드가 제공되거나 제공되지 않은 MHC를 포함할 수 있다. 기타 리간드는 펩타이드, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 세포분열촉진제(예를 들어, PHA) 또는 기타 슈퍼항원, 펩타이드 MHC 4량체(문헌참조: Altman, et al., Science. 1996 Oct 4;274(5284):94-6.) 및 가용성 MHC 2량체(문헌참조: Dal Porto, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1993 Jul 15;90)를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 관련하여, 농축 및 자극의 사용은 T 세포의 증식을 유도하는데 어떠한 2차 시그날을 요구하지 않는 고도의 수용체 편재화를 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 임의의 종류의 시그날 전달 반응은 본 발명을 사용하여 증대되거나 분석될 수 있다. 예를 들어, G 단백질 커플링된 수용체는 본 발명의 농축 방법을 사용하여 자극되고 측정될 수 있다.
2차 시그날
TCR/CD3 복합체 또는 CD2 분자의 자극은 T 세포내에서 1차 활성화 시그날의 전달을 위해 요구되는 것으로 나타나지만, 보조 또는 동시 자극 분자로서 명명된 T 세포 표면상의 다수의 분자는 휴지기 T 세포를 급격하게 형질전환시킴에 이어서 증식시키고 분화시키기 위한 이의 전이를 조절하는데 관여한다. 따라서, 1차 활성화 시그날 뿐만 아니라, T 세포 반응의 유도는 2차 동시 자극 시그날을 요구한다. 당해 하나의 동시 자극 또는 보조 분자는 TCR 복합체에 의한 자극과는 구분되는 시그날 전달 경로를 개시하거나 조절하는 것으로 사료된다.
따라서, 외인성 성장 인자 또는 보조 세포의 부재하에 T 세포 집단의 활성화 및 증식을 증진시키기 위해, CD28과 같은 T 세포의 표면사의 보조 분자가 보조 분자와 결합하는 리간드로 자극된다. 하나의 양태에서, 보조 분자 CD28 및 T 세포 활성화의 자극은 T 세포 집단을, CD3와 결합하는 리간드 및 CD28과 결합하는 리간드가 부착된 표면과 접촉시킴에 의해 동시에 일어난다. 예를 들어, 항 CD3 항체를 사용한 T 세포의 활성화 및 CD28 보조 분자의 자극은 CD4+T 세포를 선택적으로 증식시킨다.
따라서, 당업자는 CD28 분자와 가교결합할 수 있는 항 CD28 항체 또는 이의 단편 또는 CD28에 대한 천연 리간드를 포함하는 임의의 제제를 사용하여 T 세포를 자극시킬 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명과 관련하여 유용한 항 CD28 항체 또는 이의 단편의 예는 모노클로날 항체 9.3(IgG2a)(문헌참조: Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ), 모노클로날 항체 KOLT-2(IgG1), 15E8(IgG1), 248.23.2(IgM) 및 EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)를 포함한다. 천연 리간드의 예는 B7 계열의 단백질, 예를 들어, B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)[문헌참조: Freedman et al., J. Immunol. 137:3260-3267, 1987; Freeman et al., J. Immunol. 143:2714-2722, 1989; Freeman et al., J. Exp. Med. 174:625-631, 1991; Freeman et al., Science 262:909-911, 1993; Azuma et al., Nature 366:76-79, 1993; Freeman et al., J. Exp. Med. 178:2185-2192, 1993]을 포함한다. 추가로, 천연 또는 화학적 기술 또는 재조합 기술에 의해 합성되든지 간에 천연 리간드의 결합 동족체는 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 2차 시그날로서 작용하는 기타 제제는 천연 및 합성 리간드를 포함할 수 있다. 제제는 기타 항체 또는 이의 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 성장 인자, 사이토킨, 케모킨, 글리코펩타이드, 가용성 수용체, 스테로이드, 호르몬, 분열촉진제(예를 들어, PHA) 또는 기타 슈퍼항원을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포 집단의 활성화는 기타 T 세포 통합 막 단백질을 동시 자극시켜 증진될 수 있다. 예를 들어, T 세포 인테그린 LFA-1과 이의 천연 리간드인 ICAM-1의 결합은 세포의 활성화를 증진시킬 수 있다. T 세포에 대한 동시 자극제로서 작용할 수 있는 기타 세포 표면 분자는 T 세포상의 매우 늦은 항원-4(VLA-4)와 결합하는 VCAM-1(CD106)이다. 활성화된 T 세포상에서 발현되는 동시 자극 수용체인 4-1 BB의 연결은 또한 본 발명과 관련하여 T 세포 매개 면역을 증폭시키기 위해 유용할 수 있다.
당업자는, T 세포 이외의 세포가 세포 표면 잔기를 연결하고 잔기의 응집을 유도하여 시그날 전달 경로의 활성화를 일으키는 제제의 결합에 의해 자극될 수 있다. 기타 당해 세포 표면 잔기는 GPI 부착된 폴레이트 수용체(CD59), 사람 IgE 수용체(FcεRi 수용체), BCR, EGF 수용체, 인슐린 수용체, 에프린 B1 수용체, 뉴로트로핀, 교종 세포 유래된 신경영양 인자(GNDF), 고슴도치 및 기타 콜레스테롤 연결되고 팔미토일화된 단백질, H-Ras, 인테그린, 내피 산화질소 신타제(eNOS), FAS, TNF 수용체 계열의 구성원, GPI 부착된 단백질, 이중 아실화된 단백질(예를 들어, Src-계열 키나제), 이종삼량체 G 단백질의 알파 서브유니트 및 세포골격 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
T 세포 집단의 증식
본 발명의 한 측면에서, 생체외 T 세포 증식은 T 세포 분리 및 이어서 자극에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, T 세포는 단일 제제에 의해 자극될 수 있다. 또 다른 양태에서, T 세포는 2개의 제제, 즉, 1차 시그날을 유도하는 제1 제제 및 동시 자극 시그날인 제2 제제로 자극된다. 단일 시그날을 자극하거나 1차 시그날을 자극시키는데 유용한 리간드 및 제2 시그날을 자극하는 보조 분자는 본원에 기재된 바와 같이, 가용성 형태, 세포 표면에 부착되거나 표면상에 고정화되어 사용될 수 있다. 표면에 부착된 리간드 또는 제제는 "대용" 항원 제공 세포(APC)로서 작용한다. 바람직한 양태에서, 1차 및 2차 제제는 표면상에 동시 고정화된다. 한 양태에서, 제1 활성화 시그날을 제공하는 분자(예를 들어, CD3 리간드) 및 동시 자극 분자(예를 들어, CD28 리간드)는 예를 들어, 입자와 같은 동일한 표면에 커플링된다. 추가로, 앞서 주지한 바와 같이, 1개 또는 2개 이상의 자극 분자가 동일하거나 상이한 표면상에서 사용될 수 있다.
증식전에, T 세포의 공급원을 대상체로부터 수득한다. 용어 "대상체"란 면역 반응이 유발될 수 있는 생존 유기체(예를 들어, 포유동물)을 포함한다. 대상체의 예는 사람, 개, 고양이, 마우스, 래트 및 이의 형질전환된 종을 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프선 조직, 비장 조직 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 당해 기술 분야에서 유용한 다수의 T 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, T 세포는 피콜 분리법과 같은 당업자에게 공지된 다수의 기술을 사용하여 대상체로부터 수거된 특정 단위의 혈액으로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 개체의 순환 혈액 기원의 세포는 혈액 성분 분리 또는 분반시술에 의해 수득된다. 혈액 성분 분리 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 핵화 백혈구를 포함하는 림프구, 적혈구 및 혈소판을 포함한다. 한 양태에서, 혈액 성분 분리에 의해 수거된 세포는 혈장 분획물을 제거하고 후속 과정 단계동안 세포를적당한 완충액 또는 매질에 첨가하기 위해 세척될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 세포는 인산 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 또 다른 양태에서, 세척 용액에는 칼슘, 마그네슘 또는 모든 2가 양이온은 아닐지라도 많은 양이온이 없다. 다시, 놀랍게도, 칼슘 부재하의 초기 활성화 단계는 활성화를 증대시킨다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 세척 단계는 제조업자의 지침에 따라 반자동화된 "유동-통과" 원심분리(예를 들어, 고베 2991 세포 처리기)을 사용하는 방법과 같은 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 성취될 수 있다. 세척 후, 세포를, 예를 들어, Ca 부재, Mg 부재, PBS와 같은 다양한 생물적합성 완충액중에서 재현탁시킬 수 있다. 또한, 혈액 성분 샘플의 목적하지 않는 성분들은 제거될 수 있고 세포를 직접 배양 배지에 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, T 세포는 예를 들어, PERCOLLTM농도구배를 통한 원심분리에 의해, 적혈구를 용해시키고 단핵구를 고갈시킴에 의해 말초 혈액 림프구로부터 분리된다. CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+및 CD45RO+T 세포와 같은 T 세포의 특정 아집단이 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 분리될 수 있다. 예를 들어, 하나의 바람직한 양태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선별을 위해 충분한 시간동안, DYNABEADSRM-450 CD3/CD28 T와 같은 항 CD3/항 CD28(즉, 3 x 28) 접합된 비드로 항온처리함에 의해 분리된다. 한 양태에서, 시간은 약 30분이다. 추가의 양태에서, 시간의 범위는 30분 내지 36시간 또는 그 이상일 수 있고 모든 정수값 사이에 있다. 추가의 양태에서, 시간은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간 이상이다. 또다른 바람직한 양태에서, 시간은 10 내지 24시간이다. 하나의 바람직한 양태에서, 항온 처리 시간은 24시간이다. 백혈병을 앓는 환자 기원의 T 세포의 분리를 위해, 보다 긴 항온처리 시간(예를 들어, 24시간)이 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 보다 긴 항온처리 시간을 사용하여, 기타 세포 유형과 비교하여 T 세포가 없는 임의의 상황에서, 예를 들어, 종양 조직 또는 면역손상된 개체로부터 종양 침투 림프구(TIL)를 분리하는 것과 같이 T 세포를 분리할 수 있다. 추가로, 보다 긴 항온처리 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효율을 증가시킬 수 있다.
음성 선별에 의한 T 세포 집단의 집적 과정은 음성적으로 선택된 세포에 유일한 표면 마커에 지시된 항체의 조합으로 성취될 수 있다. 바람직한 방법은, 음성적으로 선별된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 지시된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역흡착 또는 유동 세포 측정기를 통해 세포 분류법 및/또는 선별법이다. 예를 들어, 음성 선별에 의해 CD4+세포를 집적시키기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선별에 의해 세포의 목적하는 집단을 분리하기 위해, 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 농축은 다양화될 수 있다. 특정 양태에서, 비드 및 세포를 함께 혼합(즉, 세포의 농도를 증가시킴)하여 세포와 비드가 최대한으로 접촉할 수 있도록 하기 위해 용적을 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, ml당 20억의 세포의 농도가 사용된다. 한 양태에서, ml당 10억개의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1억개 초과의 세포가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 양태에서, ml당 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억개의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1억 2500만 또는 1억5000만의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하여 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 추가로, 고농도의 세포를 사용하여 목적하는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는, 예를 들어, CD28 음성 T 세포와 같은 세포 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈구, 종양 조직등)로부터 세포의 포획을 보다 효율적으로 할 수 있다. 당해 집단의 세포는 치료학적 가치를 가질 수 있고 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하여 정상적으로 CD28을 약하게 발현하는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있다.
관련 양태에서, 저농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석시킴에 의해 입자와 세포간의 상호 반응은 최소화된다. 이것은 입자에 결합된 높은 양의 목적하는 항원을 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 고수준의 CD28을 발현하고 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 효율적으로 포획된다. 한 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106/ml이다. 또 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml일 수 있고 이들 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
경우에 따라, 단핵구 집단(즉, CD14+세포)은 항 CD14 피복된 비드 또는 칼럼, 또는 제거를 촉진하기 위해 당해 세포의 식세포 활성을 사용함을 포함하는 다양한 방법에 의해 생체외 증식전에 혈액 제제로부터 고갈될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 식세포 단핵구에 의해 섭취될 충분한 크기의 상자성 입자를 사용한다. 특정 양태에서, 상자성 입자는 시판되는 비드, 예를 들어, 제조원[Dynal AS]으로부터 상표명 DynabeadsTM으로 시판되는 비드이다. 이와 관련하여 DynabeadsTM의 예는 M-280, M-240 및 M-500이다. 한 측면에서, 또 다른 비특이적 세포는 상자성 입자에 "관련없는" 단백질(예를 들어, 혈청 단백질 또는 항체)을 피복하여 제거된다. 관련없는 단백질 및 항체는 증식될 T 세포를 특이적으로 표적화하지 않는 단백질 및 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 특정 양태에서, 관련없는 비드는 양 항마우스 항체, 염소 항마우스 항체 및 사람 혈청 알부민으로 피복된 비드를 포함한다.
간략하게, 당해 단핵구의 고갈은 전혈 또는 혈액 성분 분리된 말초 혈액으로부터 분리된 PBMC를, 22 내지 37℃에서 약 30분 내지 2시간동안 단핵구를 제거하는 임의의 양(약 20:1의 비드: 세포의 비율)에서 하나 이상의 다양한 관련없거나 비항체 커플링된 상자성 입자로 전처리함에 이어서 상자성 입자가 부착된 세포의 자기 제거 또는 상자성 입자가 섭취되도록 함으로써 수행된다. 당해 분리법은 당해 기술 분야에서 유용한 표준 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 시판되고있는 다양한 제품(예를 들어, DYNALRMagnetic Particle Concentrator(DYNAL MPCR))을 포함하는 임의의 자기 분리 방법을 사용할 수 있다. 요구되는 고갈을 확실히 하기 위해, CD14 양성 세포의 유동 세포측정 분석을 포함하는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 고갈 전후 모니터할 수 있다.
자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있고 단핵구 제거 단계는 요구되지 않는다. 본 이론에 얽매이지 않고, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단중의 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함에 의해 생성물을 보다 균일하게 한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포는 동결 용액중에 현탁될 수 있다. 많은 동결 용액 및 계수가 당해 기술 분야에 공지되어 있고 이와 관련하여 유용하지만 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 사람 혈청 알부민 또는 기타 적합한 세포 동결 배지를 포함하는 PBS를 사용함을 포함하고 이어서 세포는 분당 1℃의 속도로 -80℃로 동결되고 액체 질소 저장 탱크의 증기상에서 저장된다. 조절된 동결의 또 다른 방법이 사용될 수 있을 뿐만 아니라 -20℃ 또는 액체 질소에서 즉시 비조절된 동결시키는 방법이 사용될 수 있다.
세포 집단은, 예를 들어, 표면상에 고정화된 항CD3 항체 또는 항CD2 항체와 접촉시키거나 칼슘 이온수송체와 연계된 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들어, 브리오스타틴)과 접촉시킴에 의해 본원에 기재된 바와 같이 자극될 수 있다. T 세포의 표면상의 보조 분자의 동시 자극을 위해, 보조 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, CD4+세포의 집단은 T 세포의 증식을 자극시키는데 적합한 조건하에 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체와 접촉될 수 있다. 유사하게, 일반적으로 당해 기술 분야에 공지된 기타 방법(문헌참조: Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):1319-1328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999)이 사용될 수 있는 바와 같이 CD8+T 세포, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체, B-T3, XR-CD28(Diaclone, Besancon, France)의 증식을 자극시키는 방법이 사용될 수 있다.
T 세포에 대한 1차 자극 시그날 및 동시 자극 시그날이 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 시그날을 제공하는 제제가 용액중에 존재할 수 있거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형태) 또는 별도의 표면(즉 "트랜스" 형태)으로 커플링될 수 있다. 또한, 하나의 제제는 용액중의 표면 및 기타 제제에 커플링될 수 있다. 하나의 양태에서, 동시 자극 시그날을 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고 1차 활성화 시그날을 제공하는 제제는 용액중에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정 양태에서, 양 제제는 용액중에 존재할 수 있다. 또 다른 양태에서, 제제는 가용성 형태로 존재함에 이어서, 제제와 결합하는 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 항체 또는 기타 결합제와 표면에 가교결합될 수 있다. 바람직한 양태에서, 2개의 제제는 동일한 비드(즉, "시스")에 또는 별도의 비드(즉, "트랜스")에 고정화된다. 예를 들어, 1차 활성화 시그날을 제공하는 제제는 항 CD3 항체이고 동시 자극 시그날을 제공하는 제제는 항 CD28 항체이고 2개의 제제는 동일한 분자량으로 동일한 비드에 동시 고정화된다. 한 양태에서, CD4+T 세포 증및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각각의 항체의 1:1의 비율이 사용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은, T 세포 증식에서의 증가가 1:1의 비율을 사용하여 관찰되는 증식과 비교되어 관찰될 수 있도록 사용된다. 하나의 특정 양태에서, 1:1의 비율을 사용하여 관찰되는 증식과 비교하여 약 0.5 내지 약 3배의 증가가 관찰된다. 한 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율의 범위는 100:1 내지 1:100이고 이들 사이의 모든 정수 값이다. 본 발명의 한 측면에서, 항 CD3 항체 보다 많은 항 CD28 항체가 입자에 결합되어 있고 즉, CD3:CD28의 비율은 1미만이다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1을 초과한다. 하나의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 1:100인 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 1:75인 CD3:CD28이 사용된다. 추가의 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 1:50인 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체 비율이 1:30인 CD3:CD28이 사용된다. 하나의 바람직한 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 1:10인 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 1:3인 CD3:CD28이 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 비율이 3:1인 CD3:CD28이 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 이들 사이의 임의의 정수값인 입자 대 세포의 비율을 사용하여 T 세포 또는 기타 표적 세포를 자극시킬 수 있다. 당업자가 용이하게 인지하는 바와 같이, 입자 대 세포의 비율은 표적 세포에 상대적인 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 소형 비드는 단지 몇개의 세포에 결합할 수 있는 반면에 보다 큰 비드는 많은 세포에 결합할 수 있다. 특정 양태에서, 1:100 내지 100:1 및 이들 사이의 임의의 정수값이고 추가의 양태에서, 1:9 내지 9:1 및 이들 사이의 임의의 정수값을 포함하는 범위로 세포 대 입자의 비율을 사용하여 T 세포를 자극시킬 수 있다. T 세포를 자극하는 항 CD3 및 항 CD28 커플링된 입자의 비율은 상기된 바와 같이 다양할 수 있지만 특정 바람직한 값은 적어도 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1 내지 6:1을 포함하고 바람직한 비율은 T 세포당 입자가 적어도 1:1인 비율이다. 한 양태에서, 1:1 미만의 입자 대 세포의 비율이 사용된다. 추가의 양태에서, 입자 대 세포의 비율은 자극 일수에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 첫번째 날에 입자 대 세포의 비율은 1:1 내지 10:1이고 추가의 입자가 매일 또는 이틀에 한번에 10일까지 첨가되어 최종 비율이 1:1 내지 1:10(첨가한 날의 세포 수를 기준으로)이다. 하나의 특정 양태에서, 자극의 첫째 날상에 입자 대 세포의 비율은 1:1이고 자극의 세번째 및 다섯번째날에 1:5로 조정된다. 또 다른 양태에서, 입자는 매일 또는 이틀에 한번 첨가되어 자극시킨 첫번째 날의 최종 비율은 1:1이고 세번째 날 및 다섯번째 날에는 1:5이다. 또 다른 양태에서, 자극 첫번째 날에 입자 대 세포의 비율은 2:1이고 자극 세번째 및 다섯번째 날에는 1:10으로 조정된다. 또 다른 양태에서, 입자는 매일 또는 이틀에 한번 첨가되어 자극시킨 첫번째 날의 최종 비율은 1:1이고 세번째 날 및 다섯번째 날에는 1:10이다. 당업자는 다양한 또 다른 비율이 본 발명에 사용하기 위해 적합할 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 비율은 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 다양할 것이다.
특정 방법을 사용하여, 약 12일 내지 약 14일 후에 자극제로부터 T 세포를 분리함에 의해, 초기 활성화 및 자극 후 T 세포의 집단을 장기 자극시키는 것이 유리할 수 있다. T 세포 집단의 비율은 주기적으로(예를 들어, 매일), 예를 들어, 쿨터 계수기를 사용하여, T 세포의 크기를 조사하거나 이의 용적을 측정함에 의해 모니터될 수 있다. 이와 관련하여, 휴지기 T 세포는 평균 직경이 약 6.8 마이크론이고 자극 리간드의 존재하에 초기 활성화 및 자극 즉시 T 세포의 평균 직경은 4일까지 약 12 마이크론 이상으로 증가하고 약 6일째에 감소하기 시작한다. 평균 T 세포 직경이 약 8마이크론으로 감소하는 경우, T 세포는 재활성화되고 재자극되어 T 세포의 증식을 추가로 유도할 수 있다. 또한, T 세포 증식의 속도 및 T 세포 재자극을 위한 시간은 활성화된 T 세포상에 유도되는, CD154, CD54, CD25, CD137, CD134와 같은 세포 표면 분자의 존재 유무에 대한 분석에 의해 모니터될 수 있다.
한 양태에서, T 세포 자극은 세포가 정지기(증식이 낮거나 증식되지 않음)(초기 자극 후 약 8 내지 14일)로 복귀하는데 충분한 시간동안 비드(3 x 28 비드)상에 동시 고정화된 항 CD3 및 항 CD28 항체로 수행한다. 이어서, 시그날의 자극은 세포로부터 제거되고 세포는 세척되고 환자에게 다시 주입된다. 자극 단계 말기에 세포는, 실시예에 의해 입증되는 바와 같이, 항원에 응답하는 이들의 능력 및 메모리 유사 표현형을 입증하기 위한 이들 세포의 능력에 의해 입증되는 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 "슈퍼-유도성"이 부여된다. 따라서, 외인적으로 또는 주입 후생체내 항원에 의해 재자극 즉시 활성화된 T 세포는 지연된 CD154 발현 및 증가된 사이토킨 생산과 같은 독특한 표현형 성질에 의해 특징화되는 강력한 반응을 나타낸다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포와 같은 세포는 제제 피복된 비드와 배합되고 비드 및 세포는 이어서 분리되고 이어서 세포를 배양한다. 또 다른 양태에서, 배양하기 전에, 제제 피복된 비드 및 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가의 양태에서, 비드 및 세포는 먼저 힘을 가하여 농축시켜 세포 표면 잔기를 연결시킴으로써 세포 자극을 유도한다.
예를 들어, T 세포가 표적 세포 집단인 경우, 세포 표면 잔기는 항 CD3 및 항 CD28이 부착되어 있는 상자성 비드(3 x 28 비드)가 T 세포와 접촉되도록 하여 연결할 수 있다. 한 양태에서, 세포(예를 들어, 104내지 109T 세포) 및 비드(예를 들어, 1:1 비율의 DYNABEADRM-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 바람직하게 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온이 없는)중에서 배합한다. 다시, 당업자는 사용될 수 있는 임의의 세포 농도를 용이하게 인지할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 샘플중에서 매우 희박할 수 있고 샘플중 단지 0.01%를 차지하거나 전체 샘플(즉 100%)은 목적하는 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수는 본 발명의 범주내에 있다. 특정 양태에서, 입자 및 세포가 함께 혼합되어 세포 및 입자가 최대한으로 접촉될 수 있도록 용적을 상당히 감소시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, ml당 20억의 세포의 농도가 사용된다. 한양태에서, ml당 10억개의 세포의 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1억개 초과의 세포가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1000만, 1500만, 2000만, 2500만, 3000만, 3500만, 4000만, 4500만 또는 5000만의 세포 농도가 사용된다. 또 다른 양태에서, ml당 7500만, 8000만, 8500만, 9000만, 9500만 또는 1억개의 세포 농도가 사용된다. 추가의 양태에서, ml당 1억 2500만 또는 1억5000만의 세포 농도가 사용될 수 있다. 고농도를 사용하여 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증식을 증가시킬 수 있다. 추가로, 고농도의 세포를 사용하여 목적하는 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는, 예를 들어, CD28 음성 T 세포와 같은 세포 또는 많은 종양 세포가 존재하는 샘플(즉, 백혈구, 종양 조직등)로부터 세포의 포획을 보다 효율적으로 할 수 있다. 당해 집단의 세포는 치료학적 가치를 가질 수 있고 수득하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고농도의 세포를 사용하여 정상적으로 CD28을 약하게 발현하는 CD8+ T 세포를 보다 효율적으로 선별할 수 있다.
관련 양태에서, 저농도의 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들어, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 상당히 희석시킴에 의해 입자와 세포간의 상호 반응은 최소화된다. 이것은 입자에 결합된 높은 양의 목적하는 항원을 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 고수준의 CD28을 발현하고 희석 농도의 CD8+ T 세포보다 효율적으로 포획된다. 한 양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5 x 106/ml이다. 또 다른 양태에서, 사용되는 농도는 약 1 x 105/ml 내지 1 x 106/ml일 수 있고 이들 사이의 임의의 정수값일 수 있다.
세포가 현탁되는 완충액은 특정 세포 유형을 위해 적당한 임의의 완충액일 수 있다. 특정 세포 유형을 사용하는 경우, 완충액은 예를 들어, 당해 과정동안에 세포 위상을 유지하기에 충분한 1 내지 5%의 혈청을 함유할 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포 및 비드는 세포 배양 배지에서 배합될 수 있다. 세포 및 비드는 예를 들어, 회전, 진탕 또는 임의의 혼합 수단에 의해, 1분 내지 수시간의 범위에 이르는 시간동안 혼합될 수 있다. 비드 및 세포의 컨테이너는 이어서 자기장에 위치시켜 힘에 의해 농축된다. 배지 및 미결합된 세포는 제거되고 비드에 부착된 세포는, 예를 들어, 연동 펌프를 통해 펌프하여 세척되고 이어서 세포 배양에 적합한 배지에 재현탁된다.
본 발명의 한 양태에서, 혼합물은 수시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 이들 사이의 시간 정수 값동안 배양할 수 있다. 또 다른 양태에서, 혼합물은 21일동안 배양할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 비드 및 T 세포는 약 8일동안 함께 배양된다. 또 다른 양태에서, 비드 및 T 세포는 함께 2 및 3일동안 배양된다. 몇회의 자극 주기는 또한 T 세포의 배양 시간이 60일 이상이 될 수 있도록 하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 증식 및 생존에 필요한 인자, 예를 들어, 혈청(예를 들어, 태아 소 또는 사람 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGF-β및 TNF-α 또는 당업자에게 공지된 세포의 성장을 위한 기타 첨가제를 함유할 수 있는 적당한 배지(예를 들어, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X- 비보 15(BioWhittaker))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 기타 첨가제는 계면활성제, 플라스마네이트 및 환원제(예를 들어, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 배지는 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20을 함유할 수 있고 여기에 아미노산 및 비타민이 첨가되거나 무혈청이거나 적당한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 한정된 세트의 호르몬 및/또는 T 세포의 성장 및 증식을 위해 충분한 양의 사이토킨이 보충된다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험 배양물에 포함되지만 환자에게 주입되어야만 하는 세포 배양물에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필요한 조건, 예를 들어, 적당한 온도(예를 들어, 37℃) 및 기압(예를 들어, 공기 + 5% CO2)하에 유지된다.
농축력으로서 자기장을 사용하는 경우, 세포 배양전에 세포에 적용되는 자기장 강도의 범위는 자기 표면상에서 200 가우스 내지 12,000 가우스일 수 있다. 자기의 형태 및 크기는 혼합 용기 또는 세포 배양 용기의 크기 및 형태 또는 세포 대 세포의 접촉 및 세포의 농축을 촉진시키거나 증가시키는 임의의 기타 계수에 맞게 사용될 수 있다. 자기력은, 자기와 세포와의 혼합물내에 함유되는 상자성 비드 사이에 완충제 또는 스페이서로서 작용할 수 있는 물질을 부과하여 분산될 수 있다. 강한 자기력은 일반적으로 표면에서 7500 가우스 이상인 것으로서 간주되는 반면 약한 자기력은 표면에서 2000 내지 2500 가우스 범위인 것으로 간주된다. 상자성 비드상에 자기에 의해 적용된 대략적인 자기력은 하기의 수학식에 따른 상자성 비드 및 자기장의 용적에 의존한다:
Fmag= (v)(ψ)(B)(dB/dx)
상기식에서,
Fmag는 자기력을 의미하고,
v는 상자성 비드의 용적을 의미하고,
ψ는 상자성 비드의 자기 민감성(제조업자에 의해 제공되는 값)을 의미하고,
B는 자기장 강도를 의미하고
(dB/dx)는 자기장 강도 기울기를 의미한다.
당업자는 수학식의 오른쪽의 인자를 수득하거나 측정할 수 있어 적용된 자기력이 계산될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 방법에 의해 자극된 세포는 시그날 전달, 세포 표면 마커 및/또는 증식의 유도에 의해 나타낸 바와 같이 활성화된다. T 세포 적합한 하나의 당해 마커는 중요한 면역조절 분자인 CD154이다. CD154의 발현은 면역 반응을 증록시키는데 매우 이롭다. CD154는 많은 B 세포, 수상세포, 단핵구 및 몇몇 내피 세포상에 발현된 CD40 분자와 상호작용한다. 따라서, 당해 예상치 않은 놀라운 CD154의 발현은 T 세포 조성물의 효능을 증진시킬 가능성이 있다. 본원에 기재된 바와 같은 CD3+ 세포의 자극은 자극 후 1, 2, 3 또는 4일째에 CD154 발현과 같은 특정 세포 표면 마커의 수준을 1.1 내지 2.2 배 증가시켜 발현하는 T 세포를 제공한다(실시예 V, 표 2 및 도 4 참조). 또 다른 세포 표면 마커인 CD25의 발현은 배양 전의 세포 또는 기타 방법에 의해 자극된 세포에 대해서 보다 농축 및 자극 후 T 세포상에서 보다 크다.
당업자는 세포 표면 잔기 연결에 의해 자극될 수 있는 임의의 표적 세포가 비드와 같은 제제 피복된 표면과 배합될 수 있음을 인지할 것이다. 추가로, 비드와 같은 제제 피복된 표면은 배양 전에, 배양 동안의 임의의 시점에 또는 배양 종결 시점에 세포로부터 분리될 수 있다. 추가로, 표적 세포에 연결된 제제 피복된 표면은 배양 전에 비결합 세포로부터 분리도리 수 있거나 뿐만 아니라 기타 세포는 배양물내에 잔류할 수 있다. 한 양태에서, 배양 전에, 제제 피복된 비드 및 표적 세포는 분리되지 않고 함께 배양된다. 추가의 양태에서, 비드 및 표적 세포는 먼저 힘을 가하여 농축되고 이는 세포 표면 잔기를 연결시킴으로써 자극 및 후속 활성화를 유도한다.
또한 본 발명에 의해 고려되는 것은 예를 들어, 1차 및 2차 자극 분자로 피복된 표면에 결합하는 T 세포 분획물인 표적 세포의 농축을 증가시키는 또 다른 수단이다. 자기력을 적용하는 것 뿐만 아니라, 중력을 초과하는 기타 힘이 적용될 수 있고 예를 들어, 원심력, 막관통 압력 및 수압력을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 농축은 또한 여과에 의해 수행될 수 있다.
당업자는, 제제 피복된 비드와 자극될 세포간의 접촉이 기타 힘을 사용한 농축에 의해 증진될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 세포 표면 잔기 결합 리간드로 세포를 농축시키기 위한 임의의 수단은 농축이 중력 또는 분산력을 초과하는 방식으로 세포 및 제제를 함께 뭉치게 하는 한 충분할 것이다.
다양한 양태에서, 제제 피복된 표면은 세포와 혼합되고 자기장에서 작은 용적으로 농축되어 모든 입자 및 입자 결합 세포를 한정되고 농축된 영역으로 유인하는 입자일 수 있다. 특정 양태에서, 제제 피복된 표면은 표적 세포에 노출된 30초 내지 4시간내 힘에 의해 함께 유인될 수 있다. 또 다른 양태에서, 시간은 1분 내지 2시간 또는 이들 사이의 모든 정수 범위일 수 있다. 하나 이상의 세포 표면 리간드가 부착되어 있는 표면과 혼합된 수용체 함유 세포를 함유하는 세포 집단으로의 힘의 적용은 세포 수용체 편재화, 세포 표면 분자의 응집을 유도할 수 있다. 세포 표면 편재화를 유도하기 위한 당해 수단은 지질 표류를 포함하는 세포 표면 분자를 응집시킴에 의해 세포내에서의 시그날 전달을 증진시킬 수 있다. 당해 응집은 세포 반응을 하향조절하거나 억제할 수 있는 시그날 경로를 유도할 수 있다. 또한, 세포 표면 분자의 응집은 세포 반응을 상향조절하거나 활성화시킬 수 있다.
세포 반응은 예를 들어, 세포 사멸 경로를 포함하는 특정 경로를 유도하거나 억제하는 또는 단백질의 인산화를 유도하거나 성장 시그날을 자극하거나 억제하는 수용체 매개 시그날 전달을 포함할 수 있다. 한 양태에서, 세포는 림프구, 특히, T 세포일 수 있고 세포 표면 리간드는 예를 들어, 입자, 표면에 부착된 항CD3 항체일 수 있다. 입자는 상자성 비드일 수 있고 힘은 자기력이 적용된다. 상자성 비드의 림프구 및 항CD3 피복된 표면의 혼합물로의 자기력의 적용은 T 세포의 CD3 수용체가 외부 힘의 부재하에 일어나는 것 보다 신속하게 편재화될 수 있도록 한다. T 세포를 자극하는 당해 방법은 T 세포 면역 반응 경로의 활성화 및 세포의 증식을 보다 신속하게 촉진한다.
또 다른 양태에서, 항CD3/항CD28(즉, 3 x 28) 피복된 비드와 같은 자극 제제에 대한 노출 시간은 변형되거나 조정되어 목적하는 T 세포 표현형을 수득할 수 있다. 또한, 목적하는 T 세포의 집단은 자극전에 다수의 선별 기술을 사용하여 선별될 수 있다. TH세포의 증식은 전체 면역 반응을 개선시키거나 회복할 수 있기 때문에 CD8+세포독성 또는 조절 T 세포에 반대되는, 전형적으로 CD4+인 헬퍼 T 세포(TH)의 집단을 크게하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 특이적 면역 반응은 직접적으로 표적 세포를 용해시키거나 사멸시킬 수 있는 CD8+항원 특이적 T 세포에 의해 매개되지만 대부분의 면역 반응은, 예를 들어, GM-CSF, CD40L 및 IL-2와 같은 중요한 면역 조절 분자를 발현하는 CD4+T 세포의 도움을 요구한다. CD4 매개 도움이 바람직한 경우, CD4:CD8 비율을 보존하거나 증진시키는 본원에 기재된 바와 같은 방법이 상당히 이로울 수 있다. 증가된 수의 CD4+T 세포가 환자에게 도입된 세포 발현된 CD40L의 양을 증가시켜 잠재적으로 표적 세포 생존력(개선된 APC 기능)을 개선시킬 수 있다. GM-CSF 또는 IL-2(이 모두는 CD4+T 세포에 의해 주로 발현됨)를 발현하는 주입된 세포의 수를 증가시킴에 의해 유사한 효과가 나타날 수 있다. 또한, CD4의 도움이 적게 요구되고 증가된 수의 CD8+T 세포가 요망되는 경우, 본원에 기재된 크셀러레이트가 또한 예를 들어, 자극 및/또는 배양 전에 CD8+세포를 미리 선별함에 의해 사용될 수 있다. 당해 상황은 증가된 수준의 IFN-γ또는 증가된 표적 세포의 세포 용해가 바람직한 경우 존재할 수 있다.
상이한 T 세포 집단의 분리를 수행하기 위한, 입자에 대한 노출 시간은 다양할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 양태에서, T 세포는 목적하는 T 세포의 양성 선별을 위해 충분한 시간동안 Dynabead M-450과 같은 3 x 28 비드와 항온처리함에 의해 분리된다. 한 양태에서, 시간은 약 30분이다. 추가의 양태에서, 시간은 적어도, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 시간은 10시간 내지 24시간 이상이다. 하나의 바람직한 양태에서, 항온처리 시간은 24시간이다. 암 환자로부터 T세포를 분리하기 위해, 보다 긴 항온처리 시간, 예를 들어, 24시간이 세포 수율을 증가시킬 수 있다.
상이한 T 세포 집단의 분리를 수행하기 위해, 노출 시간 대 농축력은 다양할 수 있거나 펄스될 수 있다. 예를 들어, 당해 힘이 자기인 경우, 자기 또는 자기장 강도에 대한 노출은 다양할 수 있고/있거나 노출 시간을 다양화하여 목적하는 특정 표현형을 수득할 수 있다. 다양한 표현형 마커의 발현은 시간 경과에 따라 변화하고 따라서, 특정 시간을 선택하여 특정 집단의 T 세포를 수득할 수 있다. 따라서, 자극될 세포 유형에 따라, 자극 및/또는 증식 시간은 10주 이하, 8주 이하, 4주 이하, 2주 이하, 10일 이하 또는 8일 이하(4주 이하는 4주로부터 1일(24시간)까지의 모든 시간 또는 이들 수치 사이의 값을 포함한다)일 수 있다. 몇몇 양태에서, 예를 들어, 제한 희석법 또는 세포 분류법을 사용하여 T 세포를 클로닝하는 것이 바람직할 수 있고 여기서, 보다 긴 자극 시간이 필요할 수 있다. 몇몇 양태에서, 자극 및 증식은 6일 이하동안, 4일 이하동안, 2일 이하동안 수행할 수 있고 또 다른 양태에서, 24시간 이하 및 바람직하게는 4 내지 6시간 이하(이들 범위는 이들 사이의 정수값을 포함한다)동안 수행할 수 있다. T 세포의 자극이 보다 짧은 기간동안수행되는 경우, T 세포의 집단은 급격하게 숫적으로 증가할 수 없지만 당해 집단은, 생체내에서 계속 증식할 수 있고 천연 효능인자 T 세포 풀과 보다 밀접하게 유사한 보다 강하고 건강한 활성화된 T 세포를 제공한다. T 세포 도움의 유용성이 흔히 단백질 항원에 대한 항체 반응의 제한 인자이기 때문에, CD4+풍부 집단의 T 세포를 선택적으로 증식시키거나 선택적으로 대상체에 주입하는 능력은 매우 이롭다. 당해 집적된 집단의 추가의 이득은 B 림프구에 의해 제공되는 항원을 인지하는 활성화된 헬퍼 T 세포가 물리적 접촉 및 사이토킨 생산과 같은 2개 유형의 자극을 전달하여 B 세포의 증식 및 분화를 일으킬 수 있다는 점에서 명백하다.
수회에 걸친 다양한 자극에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 전형적인 혈액 또는 혈액 성분 분리된 말쵸 혈핵 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 서프레서 T 세포(TCCD8+) 집단보다 많은 헬퍼 T 세포 집단(THCD4+)을 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함에 의한 T 세포의 생체외 증식은 약 8일 또는 9일전에 주로 TH세포로 이루어진 T 세포 집단을 생하지만, 약 8일 또는 9일 후에는 T 세포 집단은 보다 증가된 Tc 세포 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 주로 TH세포를 포함하는 T 세포 집단을 대상체에게 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, 항원 특이적 서브세트의 TC세포가 분리된 경우, 당해 서브세트를 보다 크게 증식시키는 것이 이로울 수 있다.
추가로, CD4 및 CD8 마커 뿐만 아니라, 기타 표현형 마커가 상당히 다양하지만, 대부분, 세포 증식 과정동안에 재생된 것이다. 따라서, 당해 재생력은 특정 목적을 위해 활성화된 T 세포 생성물을 개조할 수 있도록 한다.
당해 실시예에서, 시간 경과에 따라 재생적으로 다양한 중요한 표현형 마커중에는 고친화성의 IL-2 수용체(CD25), CD40 리간드(CD154) 및 CD45RO(TCR과 우선적으로 연합하여 항원 결합에 대한 TCR의 민감성을 증가시킬 수 있는 분자)이 있다. 당업자가 용이하게 인지하는 바와 같이, 당해 분자는 다양한 이유 때문에 중요하다. 예를 들어, CD25는 신속하게 T 세포를 분열시키는 자가분비 루프의 중요한 부분을 담당한다. CD154는 항원 제공 수상세포의 성숙화를 자극시키고, 항체 생산을 위해 B 세포를 활성화시키고, TH세포 증식을 조절하고, TC세포 분화를 증진시키고, TH세포 및 항원 제공 세포 둘다의 사이토킨 분비를 조절하고 CD80, CD86 및 CD154를 포함하는 동시 자극 리간드의 발현을 자극시키는데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.
사이토킨 생산은 생체외 증식 과정의 처음 몇일이내에 최고조에 달한다. 따라서, 사이토킨은 면역반응 조절 뿐만 아니라 T 세포 활성화 및 기능을 매개하는데 중요한 것으로 공지되어 있고 당해 사이토킨은, 추가의 항원과 접촉하는 즉시 재활성화될 수 있는 치료학적 T 세포 생성물의 개발에 중요하다. 이와 관련하여 중요한 사이토킨은 IL-2, IL-4, TNF-α및 IFN-γ를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 따라서, 처음 몇일의 증식동안에 T 세포 집단을 수득하고 이들 세포를 대상체에 주입함에 의해, 생체내에서 T 세포를 추가로 활성화시키고 증식시키는 치료학적 이득을 거둘 수 있다.
이전에 논의된 사이토킨 및 마커에 추가로, T 세포 활성화 및 면역 반응 조절을 위해 중요한 것으로 공지된 접착 분자의 발현은 또한 생체외 증식 과정동안에 급격하게 그러나 재생적으로 변화한다. 예를 들어, CD62L은 T 세포를 림프 조직으로 수용시키고 T 세포를 염증 부위로 이동시키는데 중요하다. 질환 및 손상의 특정 상황하에서, 당해 부위에 활성화된 T 세포의 존재는 불리할 수 있다. CD62L의 하향 조절은 처음에 활성화 후 일어나기 때문에, T 세포는 단기간동안에 증식될 수 있다. 역으로, 배양의 보다 긴 시간은 고수준의 CD62L과 함께 T 세포 집단을 생성시킴에 따라서, 기타 바람직한 조건하에서 당해 부위로 활성화된 T 세포를 표적화사키는 능력이 증가된다. 시간 경과에 따라 발현이 변화하는 폴리펩타이드의 또 다른 예는, 혈액으로부터 림프구를 염증 부위의 조직 공간으로 이동시키는데 관여하는 접착 분자인 CD49d이다. CD49d 리간드의 CD49d로의 결합은 T 세포가, VCAM-1 또는 피르로넥틴 리간드에 의한 결합을 통해 활성화시키고 증식시키기 위한 동시 자극 시그날을 수용하도록 한다. 염증 부위로의 수용 뿐만 아니라 APC 및 T 세포-T 세포 상호작용에 관여하는 접착 분자 CD54의 발현은 증식 과정동안 변화한다. 따라서, T 세포는 목적하는 마커 프로필과 일치하는 선택된 기간동안 자극될 수 있고 이어서 수거되고 주입될 수 있다. 따라서, T 세포 집단은 치료될 증후에 대해서 대부분의 치료학적 이득을 제공하는 것으로 사료되는 마커를 발현하도록 개조될 수 있다.
다양한 양태에서, 당업자는 세포로부터의 자극 시그날의 제거는 사용되는 표면 유형에 의존함을 이해한다. 예를 들어, 상자성 비드가 사용되는 경우, 자기 분리는 실행가능한 선택사항이다. 분리기술은 상자성 비드 제조업자의 지침(예를 들어, CYNAL Inc., Oslo, Norway)에 상세히 기재되어 있다. 추가로, 표면이 세포로부터 분리되기에 충분히 큰 비드인 경우, 여과법이 사용될 수 있다. 추가로, 다양한 수혈 여과기가 20마이크론 및 80마이크론 수혈 여과기(Baxter)를 포함하여 시판되고 있다. 따라서, 비드가 여과기의 메쉬 크기보다 큰 경우에, 당해 여과는 매우 효율적이다. 관련 양태에서, 비드는 여과기를 통과할 수 있지만 세포는 보유되어 분리될 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 사용되는 생물적합성 표면은 노출 기간동안에 배양액중에서 분해된다(즉, 생분해된다).
당업자는 본원에 기재된 세포 자극 방법이 다양한 환경(즉, 컨테이너)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 당해 컨테이너는 바람직하게 멸균된 환경으로서, 배양 플라스크, 배양 백 또는 세포를 유지할 수 있는 임의의 컨테이너일 수 있다. 예를 들어, 몇몇 제조업자는 현재, 세포를 성장시키고 본 발명의 방법과 연계하여 사용될 수 있는 장치를 개발하고 있다. 예를 들어, 제조원[Celdyne Corp., Houston, TX; Unisyn Technologies, Hopkinton, MA; Synthecon, Inc. Houston, TX; Aastrom Biosciences, Inc. Ann Arbor, MI; Wave Biotech LLC, Bedminster, NJ.]을 참조한다. 당해 생물반응기를 포함하는 특허문헌은 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제6,096,532호, 제5,985,653호, 제5,888,807호, 제5,190,878호를 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 세포의 동시 자극 및 세포 농축을 위해 사용되는 자석은 생물반응기 장치(예를 들어, "더 웨이브(The Wave)"(Wave Biotech LLC, Bedminster, NJ))의 기저 진탕기 플랫폼에 내장될 수 있다. 자석 또는 자기성 장치는 또한 표준 생물반응기 용기(예를 들어, 실린더형 적용 단위체)로 밀봉될 수 있다. 이러한 구조적 자석 장치는 세포 배양 과정에서 여러 지점에서 목적하는 바와 같이 차단되고 가동될 수 있다. 통합된 자석 또는 자기성 장치는 자기장이 이로부터 발산하여 배양 용기를 통과하도록 위치한다. 특정 양태에서, 자석 또는 자기성 장치는 벽내에 또는 배양 용기 본체내에 내장된다. 추가의 양태에서, 세포는배양동안에 목적하는 지점에서 자기적으로 농축되고/되거나 활성화될 수 있고 자기적으로 격리되거나 분리될 수 있고 세포를 상이한 배양 또는 자기 분리 단위체로 이동할 필요가 없다. 당해 구조적 자기 장치는 배양, 자극 및 농축 및 분리 과정을 촉진하여 세포 또는 유전자 기반 치료법에서 환자에게 면역치료학적 주입을 위해 특정 기능성 세포 집단을 증식시키고 개조할 수 있다. 추가로, 당해 장치는 세포내 생산 및 세포외 분비로 분자를 특이적으로 생산하기 위한 개선된 수단을 제공한다.
상기된 바와 같은 통합된 자석 또는 자기성 장치를 사용하여 배양물로부터 자기 입자를 제거하여 이들을 배양 용기에 유지시키면서 배양 배지내 존재하는 목적하는 세포 및/또는 목적하는 분자를 제거한다. 또한, 세포 및/또는 목적하는 분자는 배양 백내에 유지되거나 본원에 기재된 바와 같이, 목적하는 세포 및/또는 분자에 결합하는 특이적 분자로 피복된 자기 입자와 상호작용함에 의해 또 다른 적합한 배양 용기에 유지될 수 있다. 구조적 자석 또는 자기성 장치는 자기적으로 특정 입자에 고정화되고/농축되고 백을 통해 배지와 기타 용액과 유동함에 의해 세포 배양 백내에 세포 집단을 세척하고 배지를 대체할 수 있다. 당해 장치는 효과적으로, 완전히 통합된 시스템을 제공함에 의해 별도의 자기 분리 장치가 필요하지 않음으로 공정 시간을 감소시키고 튜브 연결을 위한 손 조작을 감소시키며 공정에 사용되는 컨테이너의 수를 감소시키고 요구되는 많은 튜브 및 컨테이너 연결에 의한 오염 가능성을 감소시킨다. 당해 통합된 자기 또는 자기성 장치 배양 시스템은 도한 배양 공정 및 제형에 요구되는 용적을 감소시킨다.
이전에 언급한 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 세포의 농축, 세포 표면 잔기의 연결을 유도한 힘의 배합 및 진탕 폐쇄된 시스템내에서 세포의 배양은 이들 세포의 활성화 및 증식을 상당히 증진시킨다는 놀라운 발견에 관한 것이다. 따라서, 한 양태에서, 기저 진탕 플랫폼을 갖는 생물반응기(예를 들어, "더 웨이브"(Wave Biotech LLC, Bedminster, NJ) 를 사용하여 진탕 속도 및 다양한 상이한 진탕 각도를 다양하게 할 수 있다. 당업자는 세포의 최적의 증식을 위해 적당히 움직이는 임의의 플랫폼은 본 발명의 범위내에 있음을 인지할 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 자극 및 증식 방법은 분당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20회 진탕 과정동안에 배양 콘테이너를 진탕시키는 방법을 제공한다.
특정 양태에서, 생물반응기 컨테이너의 용량의 범위는 배지 약 0.1ℓ 내지 약 200ℓ이다. 당업자는 배양을 위해 사용되는 용적은 출발 세포의 수 및 목적하는 세포의 최종 수에 다라 다양할 것임을 인지한다. 특정 양태에서, T 세포와 같은 본 발명의 세포는 초기 농도 약 0.2 x 106세포/ml 내지 5 x 106세포/ml 및 이들 사이의 임의의 농도로 접종한다. 하나의 특정 양태에서, 세포는 처음에 정체 환경내에서 배양될 수 있고 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8일 이상의 배양 후에 진탕 플랫폼상의 생물반응기로 옮겨질 수 있다. 관련 양태에서, 자극, 활성화 및 증식의 전체 과정은 상기된 바와 같이, 진탕 플랫폼 및 통합된 자석을 포함하는 생물반응기에서 일어난다. 생물반응기의 예는 "더 웨이브"를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
하나의 특정 양태에서, 본 발명의 세포 자극 방법은 약 0.1ml/분 내지 약 3ml/분과 같은 다양한 속도에서 배지를 관류시키는 생물반응기와 같은 폐쇄된 시스템에서 수행된다. 따라서, 특정 양태에서, 당해 폐쇄된 시스템의 컨테이너는 출구 여과기, 입구 여과기 및 폐쇄된 시스템의 내외부로의 멸균 전달을 위한 샘플링 포트를 포함한다. 또 다른 양태에서, 당해 폐쇄된 시스템의 컨테이너는 폐쇄된 시스템 내외부로의 멸균 전달을 위한 주사기 펌프 및 조절기를 포함한다. 추가의 양태는 생물반응기 컨테이너의 중량을 연속적으로 모니터링함에 의해 배지의 주입 및 배출을 조절하기 위한 부가 셀과 같은 기작을 제공한다. 한 양태에서, 시스템은 가스 다기관을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 주위 공기 및 CO2의 혼합물을 생물반응기 컨테이너에 공급하고 양성 압력으로 컨테이너를 유지하는 CO2가스 혼합 랙을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 생물 반응기는 다양할 수 있는 가열 장치를 포함한다.
한 양태에서, 배지는 목적하는 최종 용적이 성취될때까지 약 0.5 내지 약 5.0ℓ 에서 하루당 2, 3, 4, 5 또는 6일째에 컨테이너를 개시할 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 배지는 용적이 10ℓ에 도달할때까지 4일째부터 시작하여 하루당 2ℓ 컨테이너에 주입된다. 일단 목적하는 용적이 성취되면 배지의 관류를 개시할 수 있다. 특정 양태에서, 시스템을 통한 배지의 관류는 배양한지 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일째에 개시된다. 한 양태에서, 관류는, 용적이 배지당 약 0.1ℓ 내지 약 200ℓ인 경우 개시된다. 하나의 특정 양태에서, 관류는 최종 용적이 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20ℓ인 경우 개시된다.
본 발명의 추가의 양태에서, T 세포와 같은 세포는 폐쇄된 정체 시스템내에서 5일 이하동안 배양하고 이어서 진탕 장치를 포함하여 다양한 속도로 배양 컨테이너의 진탕을 허용하는 폐쇄된 시스템으로 이동한다.
특정 측면에서, 본 발명의 방법은 T 세포와 같은 세포를 약 2주 미만동안 약 6 x 106세포/ml 및 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식시키는 방법을 제공한다. 특히, 본원의 방법은 T 세포를 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85 x 106세포/ml 및 여기의 모든 농도로 증식시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 세포는 배양한지 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일째에 상기 열거된 것 중 어느 하나와 같은 목적하는 농도에 도달한다. 한 양태에서, T 세포는 약 24시간이내 배양의 약 4일째 내지 약 12일째에서 약 1.5배 이상 증식한다. 한 양태에서, T 세포와 같은 세포는 약 2주 미만에 약 100 x 106내지총 약 500 x 109의 개시 세포 수로 증식한다. 추가의 양태에서, T 세포는 약 2주 미만에 약 500 x 106세포 출발 수에서 약 500 x 109세포수로 증식한다. 관련 양태에서, 세포는 약 2주 미만에 약 100 내지 500 x 106의 출발 수에서 총 약 200, 300 또는 400 x 109세포수로 증식한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본원에 기재된 바와 같이 세포 활성화 및 증식 방법 및 이들 방법을 사용하여 생성된 조건화된 배지는 엑소좀의 생산을 위해 사용될 수 있다. 세포에서, 소포체는 칸막이 강으로의 엔도좀 막의 돌출(budding)에 의해 형성될 수 있다. 이러한 과정은 다중소포체(MVB)를 형성시킨다. 혈장 막과의 MVB의 융합은 엑소좀으로 명명되는 소형 내부 소포체를 분비시킨다. 조건화된 배지는 기타 T 세포의 배양 또는 기타 유형의 세포의 배양을 위해 사용될 수 있다.
본원의 방법에 사용되는 항체가 ATCC와 같은 일반 공급원으로부터 용이하게 구입할 수 있지만 T 세포 보조 분자에 대한 항체 및 CD3 복합체는 표준 기술에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 항체를 제조하는 방법은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있고 추가로 상세하게 하기에서 논의된다.
표면상의 리간드 고정화
상기된 바와 같이, 본 발명의 방법은 바람직하게, 표면에 결합된 리간드를 사용한다. 표면은 이에 결합되거나 여기에 통합된 리간드를 가질 수 있고 생물적합성, 즉 자극될 표적 세포에 대해 실질적으로 비독성인 임의의 표면일 수 있다.생물적합성 표면은 생물분해성 또는 비생물적합성일 수 있다. 표면은 천연 또는 합성일 수 있고 합성 표면은 중합체일 수 있다. 표면은 콜라겐, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드, 폴리사카라이드, 글리코사미노글리캔 또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다. 폴리사카라이드는 예를 들어, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 하이알루론산 또는 알기네이트를 포함할 수 있다. 기타 중합체는 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리언하이드라이드, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 폴리비닐아세테이트, 블록 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE) 또는 폴리우레탄을 포함할 수 있다. 중합체는 락트산 또는 공중합체일 수 있다. 공중합체는 락트산 및 글리콜산(PLGA)을 포함할 수 있다. 비분해성 표면은 폴리(디메틸실록산) 및 폴리(에틸렌-비닐 아세테이트)과 같은 중합체를 포함할 수 있다. 생물적합성 표면은 예를 들어, 유리(예를 들어, 생유리), 콜라겐, 금속, 하이드록시애퍼타이드, 알루미네이트, 생세라믹 물질, 하이알루론산 중합체, 알기네이트, 아크릴 에스테르 중합체, 락트산 중합체, 글리콜산 중합체, 락트산/글리콜산 중합체, 정제된 단백질, 정제된 펩타이드 또는 세포외 매트릭스 조성물을 포함할 수 있다. 특정 표면을 포함하는 기타 중합체는 유리, 실리카, 실리콘, 하이드록시애퍼타이트, 하이드로겔, 콜라겐, 아크롤레인, 폴리아크릴아미드, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 나일론, 또는 플라스틱 또는 합성 유기 중합체중 임의의 구성원을 포함할 수 있다. 표면은 리포좀 또는 세포와 같은 생물학적 구조를 포함할 수 있다. 표면은 지질, 플레이트, 백, 펠렛, 섬유, 메쉬 또는 입자 형태일 수 있다. 특정 입자는 콜로이드 입자, 미소구, 나노입자, 비드등을 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 비드 또는 기타 입자와 같은 시판되는 표면이 유용한데 예를 들어, 밀테나이 입자(Miltenyi Particles)(Miltenyi Biotec, Germany), 세파로스 비드(Sepharose bead)(Pharmacia Fine Chemicals, Sweden), 다이나비드(DYNABEADS)TM(Dynal Inc., New York), 푸라비드(Purabead)TM(Prometic Bioscience)이다.
비드가 사용되는 경우, 비드는 표적 세포 자극을 시행하는 임의의 크기일 수 있다. 한 양태에서, 비드는 바람직하게, 크기가 5nm 내지 약 500㎛이다. 따라서, 비드 크기의 선택은 비드가 작용하는 특정 용도에 의존한다. 예를 들어, 비드가 단핵구 고갈에 사용되는 경우, 유사한 크기를 선택하여 단핵구 흡수(예를 들어, 나노입자 크기와 같은 직경 2.8㎛ 및 4.5㎛ 또는 포식될 수 있는 임의의 크기)를 촉진시킨다. 그러나, 여과에 의한 비드의 분리가 바람직한 경우, 50㎛ 이상의 비드 크기가 전형적으로 사용된다. 추가로, 상자성 비드를 사용하는 경우, 비드의 크기 범위는 전형적으로 약 2.8 ㎛ 내지 약 500㎛이고 보다 바람직하게는 약 2.8㎛ 내지 약 50㎛이다. 마지막으로, 당업자는 약 10-5nm 만큼 소형일 수 있는 슈퍼 상자성 나노입자를 사용하도록 선택할 수 있다. 따라서, 당해 논의로부터 용이하게 명백해지는 바와 같이, 실질적으로 임의의 입자 크기가 사용될 수 있다.
제제는 당해 분야에 공지되고 시판되는 다양한 방법에 의해 표면에 부착되거나 커플링되거나 통합될 수 있다. 제제는 천연 리간드, 단백질 리간드 또는 합성 리간드일 수 있다. 부착은 공유 또는 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있고 예를들어, 화학적, 기계적, 효소적, 정전기 또는 리간드가 세포를 자극할 수 있는 기타 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 리간드에 대한 항체는 먼저 표면에 부착될 수 있거나 아비딘 또는 스트렙트아비딘은 비오티닐화된 리간드에 결합하기 위한 표면에 부착될 수 있다. 리간드에 대한 항체는 항-이디오타입 항체를 통해 표면에 부착될 수 있다. 또 다른 예는 단백질 A 또는 단백질 G 또는 항체와 결합하기 위해 표면에 부착된 기타 비 특이적 항체 결합 분자를 포함한다. 또한, 리간드는 시판되는 가교 결합 시약(Pierce, Rockford, IL) 또는 기타 수단을 사용하여 표면으로의 가교 결합과 같은 화학적 수단에 의해 표면에 부착될 수 있다. 특정 양태에서, 리간드는 표면에 공유적으로 결합된다. 추가로, 하나의 양태에서, 에폭시 표면 반응성 그룹을 갖는 시판되는 토실 활성화된 다이나비드TM또는 에폭시 표면 반응성 그룹을 갖는 다이나비드TM은 제조업자의 지침에 따라 목적하는 폴리펩타이드 리간드로 항온처리한다. 간략하게, 당해 조건은 전형적으로 4 내지 37℃ 범위의 온도에서 pH 4 내지 pH 9.5의 인산 완충액중에서의 항온처리를 포함한다.
한 측면에서, 특정 리간드와 같은 제제는 단일 기원 또는 다중 기원일 수 있고 항체 또는 이의 단편일 수 있으며, 다른 측면에서, T 세포를 사용하는 경우, 동시 자극 리간드는 B7 분자(예를 들어, B7-1, B7-2)이다. 이들 리간드는 상기 논의된 상이한 부착 수단중 어느 하나에 의해 표면에 커플링된다. 표면에 커플링될 B7 분자는 동시 자극 분자를 발현하는 세포로부터 분리되거나 본원에 기재된 바와같이 동시 자극 분자의 생산 및 분리를 허용하는 표준 재조합 DNA 기술 및 발현 시스템을 사용하여 수득될 수 있다. 세포의 표면에 커플링되는 경우 T 세포내 동시 자극 시그날을 유발하는 능력을 보유하는 B 7 분자의 단편. 돌연변이체 또는 변이체가 또한 사용될 수 있다. 추가로, 당업자는 서브세트의 T 세포의 활성화 및 증식의 유도에 유용한 임의의 리간드가 비드 또는 배양 용기 표면 또는 임의의 표면상에 고정화될 수 있음을 인지할 것이다. 추가로, 표면으로의 리간드 공유 결합이 바람직한 방법인 경우, 제2 모노클로날 항체에 의한 흡착 또는 포획이 또한 사용될 수 있다. 표면에 부착되는 특정 리간드의 양은 표면이 비드의 표면인 경우 유동 세포측정 분석법에 의해 용이하게 측정되거나 표면이 예를 들어, 조직 배양 디쉬, 메쉬, 섬유, 백인 경우 효소 연결된 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
특정 양태에서, B 7 분자 또는 항 CD28 항체 또는 이의 단편의 자극 형태는 항 CD3 항체와 같은 TCR/CD3 복합체를 자극하는 제제와 동일한 고형상 표면에 부착된다. 추가의 양태에서, 4-1BB 분자 또는 항 4-1BB 항체 또는 이의 단편의 자극 형태는 항 CD3 항체와 같은 TCR/CD3 복합체를 자극하는 제제와 동일한 고형상 표면에 부착된다. 항 CD3 항체에 추가로, 제제 시그날을 모방하는 수용체에 결합하는 기타 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 비드 또는 기타 표면은 항 CD2 항체와 B7 분자 및 특히, 항 CD3 항체와 항 CD28 항체의 배합물로 피복될 수 있다. 추가의 양태에서, 표면은 예를 들어, 항 CD3 항체, 항 CD28 항체 및 항-4-1BB 항체와 같은 본원에 기재된 제제중 임의의 배합물과 같은 3개 이상의 제제로 피복될 수 있다.
표면에 커플링되는 경우, 제제는 동일한 표면(즉, 시스 형태) 또는 분리된 표면(즉, 트랜스 형태)에 커플링될 수 있다. 또한, 하나의 제제는 표면 및 용액중 기타 제제와 커플링될 수 있다. 한 양태에서, 시스 자극 시그날을 제공하는 제제는 세포 표면에 결합되고 제1 활성화 시그날을 제공하는 제제는 용액중에 있거나 표면에 커플링된다. 바람직한 양태에서, 2개의 제제는 동일한 비드상에, 즉, "시스" 또는 별도의 비드, 즉 "트랜스"와 같은 비드상에 고정화된다. 예를 들어, 제1 활성화 시그날을 제공하는 제제는 항 CD3 항체이고 동시 자극 시그날을 제공하는 제제는 항 CD28 항체이고 2개의 제제는 동등한 분자량으로 동일한 비드에 함께 고정화된다. 한 양태에서, 비드에 결합된 각각의 항체 1:1 비율이 CD4+T 세포 증식 및 T 세포 성장을 위해 사용된다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비율은 T 세포 증식의 증가가 1:1의 비율을 사용하여 관측된 증식과 비교하여 관측될 수 있도록 사용된다. 하나의 특정 양태에서, 1:1의 비율을 사용하여 관측된 증식과 비교하여 약 0.5 내지 약 3배의 증가가 관측된다. 하나의 양태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비율은 100:1 내지 1:100 및 이들 사이의 모든 정수값이다. 본 발명의 하나의 측면에서, 항 CD3 항체보다 많은 항 CD28 항체가 결합되는 경우, 즉 CD3:CD28의 비율은 1 미만이다. 본 발명의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항 CD28 항체 대 항 CD3 항체의 비율은 2:1을 초과한다. 하나의 특정 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28 비율은 1:100으로 사용된다.또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:75로 사용된다. 추가의 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:50으로 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:30으로 사용된다. 하나의 바람직한 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:10으로 사용된다. 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 1:3으로 사용된다. 추가의 또 다른 양태에서, 비드에 결합된 항체의 CD3:CD28의 비율은 3:1로 사용된다.
본 발명의 특정 양태에서, 3개 이상의 제제가 표면에 커플링된다. 특정 양태에서, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형태) 또는 별도의 표면(즉, "트랜스" 형태)으로 커플링될 수 있다. 또한 하나 이상의 제제는 표면에 커플링될 수 있고 기타 제제 또는 제제들은 용액중에 존재할 수 있다.
제제
본 발명에 의해 고려되는 제제는 단백질 리간드, 천연 리간드 및 합성 리간드를 포함한다. 특정 조건하에서 세포 표면 잔기에 결합할 수 있는 제제는 연결되고 응집하여 시그날 전달을 유도하고 이들은 렉틴(예를 들어, PHA, 렌틸 렉틴, 콘카나발린 A), 항체, 항체 단편, 펩타이드, 폴리펩타이드, 당펩타이드, 수용체, B 세포 수용체 및 T 세포 수용체 리간드, 세포외 매트릭스 성분, 스테로이드, 호르몬(예를 들어, 성장 호르몬, 코르티코스테로이드, 프로스타글란딘, 테트라-요오드 티로닌), 세균 잔기(예를 들어, 리포폴리사카라이드), 유사 분열 물질, 항원, 슈퍼항원 및 이들의 유도체, 성장 인자, 사이토킨, 바이러스 단백질(예를 들어,HIV gp 120), 접착 분자(예를 들어, L-셀렉틴, LFA-3, CD54, LFA-1), 케목킨 및 소분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제제는 세포, 혈액 생성물 및 조직과 같은 천연 공급원으로부터 분리될 수 있거나 시험관내 증식된 세포로부터 분리되거나 재조합적으로 제조되거나 당업자에게 공지된 기타 방법에 의해 제조된다.
본 발명의 한 측면에서, T 세포의 자극이 요구되는 경우, 유용한 제제는 CD3/TCR 복합체, CD2 및/또는 CD28과 결합할 수 있고 각각의 활성화 또는 증식을 개시할 수 있는 리간드를 포함한다. 따라서, 용어 리간드는 세포 표면 단백질에 대해 지시된 항체와 같은 인공 리간드 뿐만 아니라 CD28에 대한 B7 분자와 같은 세포 표면 단백질에 대해 "천연" 리간드인 단백질을 포함한다. 당해 항체 및 이의 단편은 통상적인 기술, 예를 들어, 하이브리도마 방법 및 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술에 따라 제조될 수 있다. 유용한 항체 및 단편은 사람을 포함하는 임의의 종으로부터 유래할 수 있거나 하나 이상의 종 기원의 서열을 사용하여 키메릭 단백질로서 제조될 수 있다.
당해 기술 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 리간드에 특이적 항체, 폴리클로날 항혈청 또는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 항체는 또한 목적하는 성질을 갖도록 디자인된, 유전학적으로 조작된 면역글로불린(Ig) 또는 이의 Ig 단편으로서 제조될 수 있다. 예를 들어, 비제한적인 예시로서, 항체는 제1 포유동물 종 기원의 하나 이상의 가변(V) 영역 도메인 및 제2의 별개의 포유동물 종 기원의 하나 이상의 불변 영역을 갖는 키메릭 융합 단백질인 재조합 IgG를 포함할 수 있다. 가장 일반적으로, 키메릭 항체 쥐 가변 영역 서열 및 사람 불변 영역 서열을갖는다. 당해 쥐/사람 키메릭 면역글로불린은, 항원에 대한 결합 특이성을 부여하는 쥐 항체로부터 유래하는 상보성 결정 영역(CDR)을 사람 유래 V 영역 골격 영역 및 사람 유래 불변 영역으로 이식함에 의해 사람화될 수 있다. 이들 분자의ㅏ 단편은 단백질 분해 또는 임의로, 단백질 분해 후 디설파이드 결합의 약한 환원 및 알킬화 또는 재조합 유전자 조작 기술에 의해 생성될 수 있다.
항체는, 이들이 특이적으로 약 104M-1이상, 바람직하게는 약 105M-1이상, 보다 바람직하게는 약 106M-1이상, 여전히 보다 바람직하게는 약 107M-1이상의 친화성 상수 Ka로 리간드와 결합하는 경우 "면역특이적"으로 정의된다. 결합 파트너 또는 항체의 친화도는 예를 들어, 문헌[참조: Scatchard et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660, 1949)]에 기재된 통상적인 기술 또는 표면 플라스몬 공명[문헌참조: BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)에 의해 용이하게 결정될 수 있다[문헌참조:Wolff et al., Cancer Res., 53:2560-2565, 1993].
항체는 일반적으로 당업자에게 공지된 다양한 기술[문헌참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory]에 의해 제조될 수 있다. 당해 기술에서, 폴리클로날 항혈청을 생성하기 위해 동물은 항원으로서 리간드와 면역화된다. 적합한 동물은 토끼, 양, 염소, 돼지, 소를 포함하고 보다 작은 포유동물 종, 예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함할 수 있다.
면역원은 리간드, 정제되거나 부분 정제된 리간드 폴리펩타이드 또는 이의변형체 또는 단편으로 이루어진 리간드 또는 리간드 펩타이드를 발현하는 세포로 이루어질 수 있다. 리간드 펩타이드는 단백질 분해 절단에 의해 생성될 수 있거나 화학적으로 합성될 수 있다. 면역화를 위한 펩타이드는, 당업자에게 공지된 방법에 따른 리간드의 1차, 2차 또는 3차 구조를 분석하여 선별하고 숙주 동물에서 항원 반응을 일으킬 가능성이 높은 아미노산 서열을 결정한다[문헌참조: Novotny, Mol. Immunol. 28:201-207, 1991; Berzoksky, Science 229:932-40, 1985].
면역원 제제는 기타 면역원성 단백질(예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌 또는 소 혈청 알부민)과 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편 또는 펩타이드의 공유 커플링을 포함할 수 있다. 추가로, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 세포는 보조제에 유화될 수 있다[문헌참조: Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory]. 일반적으로, 제1 주사 후, 동물은 동물 종에 대해 바람직한 스케줄에 따라 하나 이상의 부스터 면역화를 부여받는다. 면역 반응은 주기적으로 동물을 채혈하고 혈청을 분리하고 당해 혈청을 오우크테로니 분석과 같은 면역분석법으로 분석함에 의해 모니터되어 특이적 항체 역가를 평가할 수 있다. 항체 역가가 일단 설정된 후, 동물로부터 주기적으로 채혈하여 폴리클로날 항혈청을 축적한다. 리간드 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 폴리클로날 항체는 이어서, 단백질 A 또는 적합한 고형 지지체에 커플링된 리간드 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 당해 항혈청으로부터 정제될 수 있다.
리간드 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 변형체와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 예를 들어, 코흘러 및 밀스테인의 기술[문헌참조: Nature, 256:495-497, 1975; Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976] 및 이의 개선된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 불멸의 진핵 세포주이고 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 목적하는 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마가 생성될 수 있다. 래트, 햄스터 또는 바람직하게는 마우스와 같은 동물은 상기된 바와 같이 제조된 리간드 면역원으로 면역화시킨다. 면역화 동물로부터 수득한 림프 세포, 대부분 일반적으로, 비장 세포는 면역화 동물과 유전적 동계인 약물 감작화된 골수 세포 융합 파트너와 융합되어 불멸화될 수 있다. 비장 세포 및 골수 세포는 막 융합 촉진제(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 비이온성 세제)로 몇분동안 배합할 수 있고 저밀도로 하이브리도마 세포의 성장을 지지하지만 골수 세포의 성장은 지지하지 않는 선택 배지에 도말한다. 바람직한 선택 배지는 HAT(하이포산틴, 아미노프테린, 티미딘)이다. 충분한 시간 후(보통 약 1 내지 2주), 세포의 콜로니를 관찰한다. 단일 콜로니를 분리하고 세포에 의해 생성된 항체는 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 대한 결합 활성에 대해 테스트될 수 있다. 리간드 항원에 대해 고도의 친화성 및 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마가 바람직하다. 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마가 본 발명에 의해 고려된다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물의 상등액으로부터 분리될 수 있다. 쥐의 모노클로날 항체의 또 다른 제조 방법은 하이브리도마 세포를 유전적 동계의 복강으로 주사하는 것이다. 마우스는 모노클로날 항체를 포함하는 복수액을 생산한다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 또는 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 항체로부터 오염물이 제거될 수 있다.
사람 모노클로날 항체는 다수의 기술에 의해 제조될 수 있다. 방법은 사람 말초혈 세포의 엡스타인 바르 바이러스(EBV) 형질전환[문헌참조: 미국 특허 제4,464,456호], 사람 B 세포의 시험관내 면역화[문헌참조: Boerner et al., J. Immunol. 147:86-95, 1991], 사람 면역글로불린 유전자를 함유하는 면역화된 형질전환된 마우스 기원의 비장 세포의 융합 및 효모 인공 염색체(YAC)에 의해 삽입된 면역글로불린 유전자를 함유하는 면역화된 형질전환된 마우스 기원의 비장 세포의 융합[문헌참조: 미국 특허 제5,877,397호; Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58, 1997; Jakobovits et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35, 1995] 또는 사람 면역글로불린 V 영역 파아지 라이브러리로부터의 분리를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용하기 위한 키메릭 항체 및 사람화된 항체가 생성될 수 있다. 키메릭 항체는 제1 포유동물 종 기원의 하나 이상의 불변 영역 도메인 및 제2 별개의 포유동물 종 기원의 하나 이상의 가변 영역 도메인을 갖는다[문헌참조: Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-55, 1984]. 가장 일반적으로, 키메릭 항체는 비사람 모노클로날 항체 기원의 하나 이상의 가변 영역 도메인, 예를 들어, 쥐, 래트 또는 햄스터 모노클로날 항체 기원의 가변 영역을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 하나 이상의 사람 불변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 벡터에 클로닝함에 의해 작제될 수 있다[문헌참조: Shin et al., MethodsEnzymol. 178:459-76, 1988; Walls et al., Nucleic Acids Res. 21:2921-29, 1993]. 선택된 사람 불변 영역은 특정 항체에 대해 요구되는 작동인자 기능에 의존할 수 있다. 키메릭 항체를 생성하기 위한 당해 기술 분야에 공지된 또 다른 방법은 상동성 재조합이다[문헌참조: 미국 특허 제5,482,586호]. 바람직하게, 벡터는 키메릭 항체의 안정한 발현을 위해 진핵 세포로 형질감염된다.
비사람/사람 키메릭 항체는 추가로 유전학적으로 조작하여 "사람화된" 항체를 제조할 수 있다. 당해 항체는 비사람 포유동물 종의 면역글로불린 기원의 다수의 CDR, 하나 이상의 사람 가변 골격 영역 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는다. 사람화는 비사람 모노클로날 항체 또는 키메릭 항체와 비교하여 결합 친화성이 감소된 항체를 제조할 수 있다. 따라서, 당업자는 사람화된 항체를 디자인하기 위한 하나이상의 전력을 사용한다.
특정 양태내에서, 항체의 항원 결합 단편의 사용이 바람직할 수 있다. 당해 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2단편을 포함하고 이것은 각각 파파인 또는 펩신으로 단백질 분해하여 제조될 수 있다. 항원 결합 단편은 예를 들어, 고정화된 단백질 A 또는 고정화된 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 Fc 단편으로부터 분리도리 수 있다. Fab 단편을 생성하기 위한 또 다른 방법은 F(ab')2단편을 약하게 환원시킨 후 알킬화시키는 방법을 포함한다[문헌참조: Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston].
상기된 Ig 분자중 어느 하나의 비사람, 사람 또는 사람화된 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 단일쇄 Fv(sFv) 단편(단일쇄 항체)로서 작제될 수 있다. 문헌[참조: Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988]을 참조한다. 다기능성 융합 단백질이, sFv 인-프레임을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 다양한 작동인자 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 연결시킴으로써 생성될 수 있다. 이들 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 예를 들어, EP-B1-0318554, 미국 특허 제5,132,405호, 미국 특허 제5,091,513호 및 미국 특허 제5,476,786호에 기재되어 있다.
리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위한 적당한 방법은 파아지 디스플레이[문헌참조: Winter et al., Annul. Rev. Immunol. 12:433-35, 1994; Burton et al., Adv Immunol. 57:191-280, 1994]법에 의한 것이다. 사람 또는 쥐의 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리는 리간드 폴리펩타이드 또는 이의 변형체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 ig 단편(Fab, Fv, sFv 또는 이의 다량체)을 선별하기 위해 스크리닝될 수 있는 파아지 벡터내에 확립될 수 있다[문헌참조: 미국 특허 제5,223,409호; Huse et al., Science 246:1275-81, 1989; Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66, 1991; Hoogenboom et al., J. Molec. Biol. 227:381-388, 1992; Schlebusch et al., Hybridoma 16:47-52, 1997 and reference cited therein]
세포 집단
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 연결을 위해 바람직한 세포 표면 잔기를 갖는 임의의 세포 유형에 대해 광범위하게 적용된다. 이와 관련하여, 많은 세포 시그날 반응은 본 발명의 방법에 의해 증진될 수 있다. 당해 방법은 생체외 셋팅에서 치료학적으로 사용되어 환자에에 주입을 위해 세포를 활성화시키고 자극시킬 수 있거나 생체내에서 사용되어 표적 세포 집단상의 세포 시그날 전달 반응을 유도할 수 있다. 그러나, 또한 상기 주지된 바와 같이, 본원에 제공된 원형적인 예는 T 세포에 지시되는 것이지만 이에 제한되지 않는다.
T 세포와 관련하여, 본원에 기재된 다양한 증식 방법으로부터 비롯되는 T 세포 집단은 사용되는 조건에 따라 다양한 특이적 표현형 성질을 가질 수 있다. 당해 표현형 성질은 CD25, CD154, IFN-γ 및 GM-CSF의 발현의 증진 뿐만 아니라 CD137, CD134, CD62L 및 CD49d의 발현의 변화를 포함한다. 이들 잔기의 발현을 차등적으로 조절하기 위한 능력은 매우 중요할 수 있다. 예를 들어, 항원 제공 세포(예를 들어, 수상세포, 단핵구 및 심지어 백혈구 B 세포 또는 림프종)상에 발현된 CD40 분자와의 접촉을 통해 "조작된 T 세포"상의 고수준의 표면은 항원 제공 및 면역 기능을 증진시킨다. 당해 전략은 현재 항체 또는 재조합 CD40L을 통해 CD40을 연결하기 위해 다양한 회사에 의해 사용되고 있다. 본원에 기재된 방법은 동일한 시그날이 보다 생리학적 방식으로, 예를 들어, T 세포에 의해 전달되도록 할 수 있다. T 세포 활성화(크셀러레이트(XCELLERATE)) 방법을 조작함에 의해 IFN-γ분비를 증가시키는 능력은 항 종양 및 항 바이러스 반응에 중요한 TH1형 면역 반응 생성의 촉진을 도와줄 수 있다. CD154 처럼, GM-CSF의 발현 증진은 APC선조세포의 보다 기능적으로 능력있는 APC(예를 들어, 수상 세포)로의 성숙화를 촉진시키는 이의 효과를 통해 APC 기능을 증진시키는 작용을 한다. CD137 및 CD134의 발현을 변화시켜 아폽토시스 시그날에 내성이거나 민감한 T 세포의 능력에 영향을 줄 수 있다. 접착/수용 수용체, 예를 들어, CD62L 및/또는 CD49d의 발현을 조절하여 림프 기관, 감염 부위 또는 종양 부위로 주입된 T 세포의 능력을 결정할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 증식 전에 CD8+또는 CD4+세포가 고갈된 T 세포 집단 또는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, CD8+세포는 CD8+마커에 지시된 항체에 의해 고갈된다. 당업자는 CD8+또는 CD4+세포의 샘플을 고갈시키거나 역으로 CD4+또는 CD8+세포 함량을 집적시키기 위한 다양한 특정 방법을 용이하게 동정할 것이다. CD4+세포를 집적시키는 것과 관련하여, 본 발명의 한 측면은 Tc (CD8+) 세포가 고갈되는 T 세포 집단의 자극시 극히 강한 CD154 발현 프로필의 동정에 집중된다. 상기된 바와 같이, CD154는 발현이 면역 반응을 증폭시키는데 극히 이로운 중요한 면역조절 분자이다. 따라서, CD154 발현에서의 증가는 보다 효능적인 T 세포 조성물을 유도할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 증식전에 CD62L, CD45RA 또는 CD45RO, 사이토킨(예를 들어, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10), 사이토킨 수용체(예를 들어, CD25), 퍼포린, 접착 분자(예를 들어, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1) 및/또는 수용 분자(예를 들어, L-셀렉틴)와 같은 다양한 마커를 발현하는 세포 집단을 고갈시키거나 집적시키는 T 세포 집단 또는 조성물을 제공한다. 한 양태에서, 이들 마커중 어느 하나를 발현하는 세포가 당해 마커에 대해 지시된 항체 또는 기타 리간드/결합제에 의해 양성적으로 선택되거나 고갈된다. 당업자는 목적하는 마커를 발현하는 샘플을 고갈시키거나 양성적으로 선택하기 위한 다양한 특정 방법을 용이하게 동정할 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 표현형 성질은 당업자에게 공지된 표준 유동세포측정 방법 및 ELISA 방법에 의해 모니터될 수 있다.
사용 방법
상기된 방법에 추가로, 본원에 기재된 방법에 의해 자극되고/되거나 활성화된 세포는 다양하게 사용될 수 있다. T 세포의 원형적인 예와 관련하여, 본원에 기재된 방법을 사용하여 감염 질환, 암 및 면역치료의 치료시 사용하기 위해 CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+또는 CD45RO+T 세포의 집단을 선택적으로 증식시킨다. 결과로서, 항원 반응성에 대해 폴리클로날이지만 CD4+또는 CD8+에 대해서는 필수적으로 단일성인 표현형적으로 독특한 집단의 T 세포가 생산될 수 있다. 추가로, 당해 방법은 개인의 총 CD4+또는 CD8+T 세포 집단(개인의 림프구 집단은 약 3 내지 5 x 1011)을 차지하기에 충분한 수로 T 세포집단을 증식시킨다. 수득한 T 세포 집단은 또한 유전학적으로 형질도입되고 면역치료에 사용되고 감염제의 시험관내 분석 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 종양 여과 림프구의 집단은 암을 앓는 개인으로부터 수득될 수 있고 T 세포는 충분한 수로 증식하도록 자극된다. 수득한 T 세포 집단은 유전학적으로 형질도입되어 종양 괴사 인자(TNF) 또는 기타 단백질(예를 들어, 임의의 수의 사이토킨, 아폽시토시스의 억제제(예를 들어, Bcl-2), RevM10 또는 인트러킨등과 같은 HIV 감염으로부터 세포를 보호하는 유전자, 표적 분자, 접착 및/또는 수용 분자 및 다양한 항체 또는 이의 단편을 발현할 수 있고 개인에게 투여된다.
본 발명의 CD4+T 세포 집단을 위한 한가지 특정 용도는 개인에서 HIV 감염의 치료이다. HIV를 앓는 지속적인 감염은 궁극적으로 CD4+T 림프구의 수를 급격하게 감소시킨다. 이것은 이어서 면역결핍을 심각한 상태로 만들어 환자가 생명을 위협하는 기회주의적 감염에 민감하게 한다. CD4+T 세포의 수를 정상적인 수준으로 하는 것이 면역 기능을 상당한 정도로 회복시키는데 예상될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법은 HIV 감염된 환자에서 집단을 재구성하는데 충분한 수로 CD4+T 세포를 선택적으로 증식시키는 수단을 제공한다. 또한 장기 자극 동안에 T 세포의 감염을 회피할 필요가 있을 수 있거나 T 세포에게 HIV 감염에 주로 내성을 부여하는 것이 바람직할 수 있다. HIV 감염에 내성이거나 T 세포가 감염된 환자에게 회수되기 전에 바이러스를 생산할 수 없도록 부여될 수 있는 다수의 기술이 있다. 예를 들어, 하나 이상의 항 레트로바이러스 제제는 증식전에 HIV 복제 또는 바이러스 생산을 억제하기 위해 CD4+T 세포와 배양될 수 있다(예를 들어, 바이러스 기구의 역전사 효소 및/또는 기타 성분을 표적화하는 약물(문헌참조: Chow et al. Nature 361:650-653, 1993)).
여러 방법을 사용하여 T세포를 유전학적으로 형질도입하여 HIV 감염 또는 복제를 억제하는 분자를 생산할 수 있다. 예를 들어, 다양한 양태에서, T 세포는 유전학적으로 형질도입되어 트랜스 우성 억제제, "분자 데코이", 안티센스 분자, 인트라킨 또는 독소를 생산할 수 있다. 당해 방법은 전반적으로 본원에 참조문헌으로서 인용되는 미국 특허원 제08/253,964호 및 PCT 공개 번호 제WO 95/33823호에 상세하게 기술되어 있다.
항원 특이적 T 세포의 집단을 자극시키고 증식시키기 위한 방법은 환자에게 T 세포의 투여 즉시 면역 반응을 상향조절하는 것이 바람직한 경우(예를 들어, 반응을 유도하거나 기존의 반응을 증진시키는 것)의 치료학적 상황에 유용하다. 예를 들어, 당해 방법을 사용하여 종양 연관 항원에 대한 T 세포 반응을 증진시킬 수 있다. 환자 기원의 종양 세포는 전형적으로 종양 연관 항원을 발현하지만 T 세포내 동시 자극 시그날을 자극할 수 없다(예를 들어, 이들은 동시 자극 분자의 발현이 결핍되어 있기 때문에). 따라서, 종양 세포는 시험관내 환자 기원의 T 세포 및 본 발명에 따라 증식된 항원 특이적 T 세포 및 환자에게 복귀된 T 세포와 접촉될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 비흡킨스 림프종(NHL) 및 B 세포 만성 림프구백혈병(B-CLL)과 같은 악성 종양이 치료될 수 있다. 증식된 T 세포를 사용한 초기 연구는 NHL에서 시험되었지만(문헌참조: Liebowitz et al., Curr. Opin. Onc. 10: 533-541, 1998), 본 발명의 T 세포 집단은 독특한 표현형 성질을 제공하여 증진된 주입(CD28 시그날의 자극에 의해 제공됨) 및 반응성을 제공함에 의해 면역치료의 성공을 급격하게 증진시킬 수 있다. 그러나, B-CLL을 앓는 환자는 특정 어려움을 제공하고 말초 혈액중에 부과된 과다 백혈 세포와 함께 비교적 낮은 T 세포 수를 포함하고 일반적인 T 세포 면역 억제를 수반한다. 본 발명의 T 세포 집단은 당해 질환을 치료시 및 줄기 세포 이식 치료와 조합되는 경우 급격하게 개선된 효능을 제공할 수 있다. 따라서, 항 CD3 x 항 CD28과 T 세포 기능 및 항 CLL T 세포 활성의 증가는 이로울 수 있다.
예를 들어, B-CLL 환자의 T 세포상에서 CD154에 대한 결핍 발현 및 CD40에 대한 결핍 발현이 질환의 주요 면역학적 결핍으로서 인용될 수 있고 재주입시 높은 수준의 CD154를 지속적으로 발현할 수 있는 본 발명의 T 세포 집단은 이의 치료를 도와줄 수 있다. 연구자는 CLL에서, CD154를 발현하는 환자의 T 세포의 능력은 결핍되어 있을 뿐만 아니라 CD80 및 CD86을 발현하는 백혈병 B 세포의 능력도 결핍되어 있음을 보고한다. 적절히 CD28에 대한 리간드를 발현하기 위한 CLL에서의 백혈병 B 세포의 실패는 종양 반응 T 세포를 완전히 활성화시키는데 실패할 수 있고 따라서 내성의 T 세포의 명백한 상태를 강조하는 기작을 나타낼 수 있다. CD40이 가용성 항 CD40 항체를 통해 또는 CD154 형질도입된 백혈병 B 세포를 통해 CLL B 세포상에 비대해지는 연구는 CD80 및 CD86의 결손을 교정하고 MHC 표면 발현을 상향조절한다[문헌참조: Kato et al., J. Clin Invest. 101:1133-1141, 1998; Ranheim and Kipps, J. Exp. Med. 177:925-935, 1993]. 당해 방식으로 처리된 세포는 특정 T 세포 항 종양 반응을 자극할 수 있다.
본 발명의 T 세포 집단의 표면상의 CD154의 증진된 발현과 함께, 당해 T 세포는 자가 B-CLL 세포와 상호작용하는 것으로 예상되고 따라서 MHC, CD80 및 CD86의 발현을 구동시킴에 의해 종양의 면역원성을 증가시킨다. 이것은 이어서 강한 항종양 반응을 유도해야만 한다. 추가로, 당업자는 본 발명의 생체외 증식된 T세포를 갖는 환자의 치료는 화학적치료법과 같은 통상적인 암 치료법과 조합될 수 있다는 것을 명백하게 이해할 것이다. 이와 관련하여, 예를 들어, 환자는 플루다라빈 또는 캄파쓰(Berlex Laboratories, NJ, USA)와 같은 제제로 본 발명의 T 세포 집단과 함께 또는 둘다를 주입함에 의해 치료될 수 있다.
또한, T 세포는 본원에 기재된 바와 같이 자극되고 증식되어 바이러스(예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스), 세균, 기생충 및 진균류와 같은 병원체에 대한 반응을 유도하거나 증진시킨다.
본 발명은 추가로, T 세포의 혼합 집단으로부터 T 세포의 특이적 아집단을 선택적으로 증식시키기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 특이적으로 양성 T 세포의 2배 보다 높은 비율의 CD4+및 CD8+을 갖는 집적된 T 세포 집단을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 CD4+T 세포의 집단으로부터 TH1세포의 집단을 선택적으로 증식시키는 방법을 제공한다. 당해 방법에서, CD4+T 세포는 모노클로날 항체 9.3과 같은 항 CD28 항체로 동시 자극되어 IFN-γ를 포함하는 TH1-특이적 사이토킨을 유도하여 TH2세포 보다 TH1세포를 집적시킨다.
증식 과정동안에 활성화된 T 세포의 표현형 특성이 시간경과에 따라 다양하다는 관찰은 T 세포가 몇시간 이내에 활성화됨을 입증된 사실과 조합된다[문헌참조: lezzi et al., Immunity 8:89-95, 1995]. 따라서, 본원에 기재된 방법과 조합하여 이것은 짧은 시간내에 T 세포 집단의 서브세트를 만드는 테일러를 증식시키는 능력을 제공한다. 한 양태에서, 신장 투석의 사용과 유사하게 환자의 침대 측면, 외래 환자 양태 또는 환자의 집에서 사용될 수 있다. 예를 들어, T 세포가 활성화 시그날(예를 들어, 항 CD3 및 항 CD28 항체 등)과 접촉 배양되는 방법 또는 장치는 환자에게 연속 유동 또는 몇시간 증식 기간 후에 즉시 환자에게 재투여된다. 하나의 측면에서, 증식의 당해 기술은 필터 성분을 갖는 분리된 챔버를 사용할 수 있고 3 x 28 비드 또는 유사하게 피복된 미세입자는 혈액/농축된 세포의 연속 유동과 혼합된다. 또 다른 양태에서, 하나의 장치내에 고형 표면은 항체 또는 기타 성분과 직접(공유적으로를 포함) 또는 간접적으로(예를 들어, 스트렙트아비딘/비오틴등)으로 피복되거나 접합되어 T 세포 활성화 및 증식을 자극할 수 있다. 예를 들어, 환자에게 세포가 재투여되기 전에 T 세포 활성화를 위해 요구되는 수용체를 자극시키기 위한 2개 이상의 고정화된 항체(예를 들어, 항 CD3 및 항 CD28) 또는 기타 성분을 함유하는 혈액/세포 수거 장치 및/또는 1회용 장치연속 유동 경로를 통해 환자로부터의 연속 유동 경로가 사용될 수 있다(플라스틱 표면 또는 분리 가능한 미세입자상에 고정화됨). 당해 시스템은 기존의 제조업자의 1회용 세트로 독킹된 1회용 세트 멸균된 백혈구 분해 장치르 포함할 수 있거나 제조업자의 1회용 세트(예를 들어, 항체/활성화 성분이 고정화되고 함유된 표면 플랫폼은 성분채집 동안에 말초 혈액 단핵구 세포의 수거를 위한 백/컨테이너내에 있다). 추가로, 고형 표면/표면 플랫폼은 1회용 성분의 하나에 존재하는 장치 챔버중 하나에 삽입된 제거 삽입체의 일부일 수 있다. 상기 논의된 연속 유동 측면의 또 다른 양태에서, 시스템은 세포를 환자에게 유동 경로의 일렬로 설치된 혈액 수거 장치 또는 항온처리 챔버내에 한 챔버를 사용하여 실온에서 또는 생리학적 온도에서 활성화 성분과 세포를 접촉시킴을 포함한다.
또 다른 예에서, 혈액은 2개 이상의 고정화된 항체(예를 들어, 항 CD3 및 항 CD28) 또는 기타 성분을 함유하는 환자로부터 환자에게 세포를 투여하기 전에(예를 들어, 플라스틱 표면 또는 분리가능한 미세입자상에 고정화됨) T 세포 활성화에 요구되는 수용체를 자극하기 위해 단독 1회용 장치에 직접 주입된다. 한 양태에서, 1회용 장치는 주사기 및 살균 독킹 장치를 갖는 배합하고/독킹하기 위해 적합한 적당한 튜브 연결체를 갖는 컨테이너(예를 들어, 플라스틱 백 또는 플라스크)를 포함할 수 있다. 당해 장치는 T 세포 활성화 성분(예를 들어, 항 CD3 및 항 CD28 항체)의 고정화를 위한 고형 표면을 포함하고, 이들은 컨테이너 자체의 표면일 수 있거나 삽입체의 표면일 수 있고 전형적으로 편평한 표면, 에칭된 편평한 표면, 불규칙한 표면, 다공성 패드, 섬유, 임상적으로 허용가능하고/안전한 철 유체, 비드등일 수 있다. 추가로, 단독의 장치를 사용하는 경우, 대상체는 장치에 연결된 채로 유지될 수 있거나 장치는 환자로부터 분리될 수 있다. 추가로, 장치는 실온에서 사용되거나 휴대용 항온처리기를 사용하여 생리학적 온도에서 항온처리한다.
혈액 및 혈액 생성물을 수거하고 가공하기 위한 장치 및 방법으로서, 당업자는 본원에 제공된 교시에 따라 상기 제시된 필요성을 완수하는 다양한 장치가 용이하게 디자인되거나 기존의 장치를 개조할수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 당해 장치 및 방법은 본원에 제시된 특정 양태로 제한되지 않지만 멸균 상태를 유지할 수 있고 보체 활성화가 감소되고 T 세포 활성화를 위해 필요한 성분(예를 들어, 항 CD3 및 항 CD28 항체 또는 이에 대한 리간드)은 대상체에 투여하기 전에 고정화되거나 혈액 또는 혈액 생성물로부터 분리되는 임의의 장치 또는 방법을 포함한다. 추가로, 당업자가 용이하게 인지하는 바와 같이, 다양한 혈액 생성물은 본원에 기재된 장치 및 방법과 연계하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 방법 및 장치를 사용하여 동결 보존된 전혈, 말초 혈액 단핵 세포, 기타 동결보존된 혈액 유래 세포 또는 동결 보존된 T 세포주 기원의 T 세포의 활성화를 해동 즉시 및 대상체에 투여하기 전에 신속하게 수행할 수 있다. 또 다른 예에서, 당해 방법 및 장치를 사용하여 대상체에 투여하기 전에, 이전에 생체외 증식된 T 세포 생성물 또는 T 세포주의 활성을 부스트하여 따라서, 고도로 활성화된 T 세포 생성물을 제공할 수 있다. 마지막으로, 용이하게 인지되는 바와 같이, 당해 방법 및 장치는 대상체 및 공여체와 동시에 자가 또는 동종 세포 치료법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 백신을 사용하여 항원의 반응성을 증진시키고 생체내효과를 증진시킬 수 있다. 추가로, 본 발명에 의해 증식된 T 세포는 비교적 체내에서 장기 반수명을 갖고 이들 세포는 유전자 치료를 위해, 목적하는 핵산 서열을 수송하고 잠재적으로 암, 질환 또는 감염 부위에 수용함에 의해 완전한 소포체로서 작용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 증식된 세포는 백신, 하나 이상의 사이토킨, 하나 이상의 치료학적 항체등과 조합하여 환자에게 전달될 수 있다. 보다 강한 T 세포 집단에 의해 이득이 될 임의의 치료법은 본원에 사용되는 방법의 범주내에 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 T 세포 집단과 같은 표적 세포 집단은 단독으로 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 기타 사이토킨 또는 세포 집단과 같은 기타 성분과 배합된 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다. 간략하게, 본 발명의 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 표적 세포 집단을 포함하고 하나 이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 배합된다. 당해 조성물은 천연 완충 식염수, 인산 완충 식염수등과 같은 하기 성분의 완충액을 포함할 수 있다: 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 글라이신과 같은 아미노산; 항산화제; 킬레이팅제(예를 들어, EDTA 또는 글루타티온); 보조제(예를 들어, 수산화알루미늄) 및 방부제. 본 발명의 조성물은 바람직하게 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료될(또는 예방될) 질환에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 투여 횟수는 환자의 증상 및 환자의 질환의 유형 및중증도와 같은 인자에 의해 결정되지만 적당한 투여방식은 임상의에 의해 결정될 수 있다.
본원에 언급된 모든 문헌은 전반적으로 본원에 참조로서 인용된다. 더욱이, 본원에서 사용되는 모든 수치의 범위는 범위내의 모든 정수값을 포함하고 특정 수치의 선별은 특정 용도에 따라 고려된다. 추가로, 하기의 실시예는 예시적으로 제공된 것이지 이에 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
T 세포 자극
본원에 기재된 특정 실험에서, 크셀러레이트 ITM으로서 언급되는 과정을 사용한다. 간략하게, 당해 방법에서, 크셀러레이트 ITMT 세포는 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC) 성분채집 생성물로부터 제조한다. 임상적 부위에서 환자로부터 수거한 후, PBMC 성분채집물을 세척하고 이어서 "비피복된" 다이나비드RM-450 에폭시 T로 항온처리한다. 이 시간동안에, 단핵구와 같은 포식 세포는 비드를 흡수한다. 항온처리 후, 세포 및 비드는 MaxSep 자석 분리기에 따라 가공하여 비드 및 비드에 부착된 임의의 단핵구성/포식 세포를 제거한다. 당해 단핵구 고갈 단계 후, 총 5 x 108의 CD3+T 세포를 함유하는 용적을 취하고 1.5 x 106다이나비드RM-450CD3/CD28 T를 설치하여 크셀러레이트 ITM과정(약 3:1의 비드 대 T 세포)을 개시한다. 세포 및 다이나비드RM-450 CD3/CD28 T의 혼합물을 이어서 약 8일동안 37℃, 5% CO2에서 항온처리하여 제1 주입동안 크셀러레이트화된 T 세포를 생성한다. 잔류하는 단핵구 고갈된 PBMC를 제2 또는 추가의 세포 생성물 증식 때까지(약 21일 후) 동결 보존하고 증식 후, 이들은 해동되고 세척됨에 이어서 5 x 108의 CD3+T 세포를 함유하는 용적을 취하고 제2 주입을 위한 1.5 x 106다이나비드RM-450 CD3/CD28 T를 설치하여 크셀러레이트 과정을 개시한다. 37℃에서 5% CO2에서 약 8일의 항온 처리 기간동안에, DC3+T 세포는 활성화되고 증식한다. 사용되는 항 CD3 mAb는 BC3(XR-CD3; Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA)이고 항 CD28 mAb(B-T3, XR-CD28)은 제조원[Diaclone, Besancon, France]으로부터 수득한다.
클셀러레이트 IITM으로서 언급되는 개질된 방법과 함께 상기 기재된 방법은 약간 변형되어 사용되고 여기서, 별도의 단핵구 고갈 단계가 사용되고 특정 과정에서 세포는 비드와 처음 접촉하기 전에 동결되고 추가의 농축 및 자극이 수행된다(도 5A 및 5B 참조). 당해 과정의 하나의 버젼으로서, T 세포는 성분채집에 의해 공여자 또는 환자의 순환하는 혈액으로부터 수득한다. 성분채집물의 성분은 전형적으로 림프구, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 핵화된 세포(백혈구 세포), 적혈구 세포 및 혈소판을 포함한다. 전형적인 채집물은 1 내지 2 x 1010핵화된 세포를 함유한다. 세포를 칼슘 부재, 마그네슘 부재 인산 완충 식염수로 세척하여 혈장 단백질 및 혈소판을 제거한다. 세척 단계는 세포를 원심분리하여 상응액 유체를 제거하고 이어서 PBS로 대체한다. 당해 방법은 반자동화된 "유동 통과" 원심분리(COBE 2991 시스템, 박스터)를 사용하여 성취된다. 당해 세포는 가공됨으로써 폐쇄 시스템에 유지한다.
세포는 추가로 단핵구(활성화된 세포에 대해 집적됨)를 포함하는 비결합 세포를 고갈시키고 이어서 계속 자극하여 가공할 수 있다. 또한, 세척된 세포는 이후에 동결되고, 저장되고 가공될 수 있으며 이것은 본원에서 과립구를 고갈시키는 것 뿐만 아니라 증식을 강하게 증가시키는 것으로 입증되었다. 한 예에서, 세포를 동결시키기 위해, 35ml의 세포 현탁액을 동결 용액 35ml과 함께 250ml의 크리오사이트 동결 백에 위치시킨다. 35ml의 세포 현탁액은 전형적으로 PBS중에 3.5 x 109내지 5.0 x 109을 함유한다. 동일 용적의 동결 용액(PBS중의 20% DMSO 및 8% 사람 혈청 알부민)을 첨가한다. 세포의 최종 농도는 50 x 106세포/ml 이다. 크리오사이트 백의 용적 범위는 30 내지 70ml일 수 있고 세포 농도의 범위는 10 내지 200 x 106세포/ml일 수 있다. 크리오사이트 백에 세포 및 동결 용액이 채워진 후, 백은 조절된 속도 동결기에 위치시키고 세포를 분당 1℃로 -80℃로 동결시킨다. 동결된 세포를 이어서 요구될 때까지 액체 질소 저장 시스템에 위치시킨다.
액체 질소 저장 시스템으로부터 세포를 제거하고 37℃에서 해동시킨다.DMSO를 제거하기 위해, 해동된 세포를 이어서 COBE 2991 시스템상에서 칼슘 부재, 마그네슘 부재 PBS로 세척한다. 이어서 세척된 세포를 80마이크론 메쉬 여과기에 통과시킨다.
해동된 세포, 약 0.5 x 109CD3+세포를 칼슘 부재, 마그네슘 부재 PBS 100ml을 함유하는 플라스틱 1L 라이프셀 백에 위치시킨다. PBS는 1% 내지 5% 사람 혈청을 함유한다. 1.5 x 1093 x 28 비드(다이나비드RM-450 CD3/CD28 T)는 또한 세포(3:1의 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T:CD3+T 세포)와 함께 백에 위치시킨다. 비드 및 세포를 약 30분동안 약 1RPM(종점 대 종점 회전)으로 실온에서 혼합한다. 비드 및 세포를 함유하는 백을 MaxSep 자석 분리기(Nexell Therapeutics, Irvine, CAb)상에 위치시킨다. 백과 MaxSeq 사이에, 플라스틱 스페이서(약 6mm 두께)를 위치시킨다. (자기 강도를 증가시키기 위해 스페이서가 제거됨). 비드 및 비드에 부착된 임의의 세포를 자석위에 유지하고 PBS 및 미결합된 세포를 펌프 제거한다.
3 x 28개의 비드 및 비드에 결합된 농축된 세포를 3L 라이프셀 배양 백에서 세포 배양 배지(약 100,000 IU IL-2의 존재 또는 부재하에 50ml 열 불활성화된 풀된 사람 혈청, 20ml의 1M 헤페스, 10ml의 200mM의 L-글루타민과 함께 X-비보 15, 바이오휘태커를 함유하는 1ℓ)로 세정한다. 3 x 28 비드 및 양성적으로 선택된 세포를 라이프셀 백에 이동시킨 후, 백이 1000ml을 함유할때까지 배양 배지를 첨가한다. 세포 함유 백을 배양기(37℃ 및 5% CO2)에 넣고 세포를 증식시킨다.
세포를 3일 및 5일째 각각에 1 내지 4개로 분리한다. T 세포 활성화 및 증식은 배양한지 3일 및 8일 후 세포를 수거하여 측정한다. T 세포의 활성화는 배양 3일째에 세포 크기, 세포 표면 마커 발현의 수준, 특히, CD25 및 CD154의 발현을 측정하여 평가한다. 8일째에, 세포를 MaxSep 자석상에서 중력(약 150ml/분)항에 유동시켜 자기 입자를 제거하고 세포를 상기된 바와 같은 COBE 장치로 세척하고 농축시키며 정맥내 투여용으로 적합한 조정된 전해질 용액(예를 들어, 혈장-Lyte AR(Baxter-Healthcare))에 재현탁시킨다.
명세서에 기술된 바와 같이, 크셀러레이트 ITM은, 자극 및 농축이 수행되지 않고 단핵구 고갈이 자극 전에 수행되는 것을 제외하고는 상기된 바와 유사한 조건을 언급한다.
크셀러레이트 ITM및 IITM과정 둘다를 수행하고 T 세포 증식은 배양 8일 후에 측정한다. 증식된 T 세포의 수율은 CD3+세포가 세포 배양전에 농축되는 경우 보다 크다(표 1 참조). 추가로, 세포 집단은 CD3+세포 90%를 초과한다.
이와 관련된 추가의 실험을 수행하고 증식된 세포의 총수 뿐만 아니라 CD3+농축 부재하에 자극된 9개의 배치의 세포의 배수 증식 및 CD3+농축으로 자극된 5개 배치의 세포의 배수 증식을 나타낸다(도 1 및 2 참조).
배양 전에 자기력을 적용하여 세포를 농축하는 경우 CD154 수준을 증가시킬 뿐만 아니라 CD3+세포의 순도를 증가시킨다(표 2, 도 3 및 4는 CD154 수준을 그래프로 도시한 것이다). 추가로, T 세포 집단이 상이한 강도의 자기에 노출되는 경우의 T 세포 증식의 비교는 강한 자기에 노출이 CD3+세포의 수율을 증가시킴을 보여준다(표 2).
5개 추가의 실험은 크셀러레이트 ITM와 크셀러레이트 IITM의 과정을 비교하기 위해 수행한다. 당해 2개의 과정에 따라 활성화되고 배양 증식된 세포에 대해, 배양의 3일째 및 8일째에 세포 활성화 마커(세포 크기, CD25 발현 및 CD154 발현)는 하기 표 3 및 도 6 및 7에 나타낸다.
표 3의 데이타 및 도 6 및 7은 크셀러레이트 IITM과정은 3일째에 세포 크기 및 CD25 발현 활성화 마커가 평균적으로 유사하지만 전형적으로 보다 크고 자극 후 계속 커지는 세포를 생성함을 보여준다. 그러나, 크셀러레이트 IITM과정의 T 세포에 대한 3일째의 CD154 활성화 마커는 크셀러레이트 ITM과정의 T 세포에 대한 것 보다 크다. 추가로, 상기 입증된 바와 같이, 크셀러레이트 IITM과정은 일정하게 기타 방법보다 공여자당 보다 높은 수준의 CD25 및 CD154를 생성한다.
크셀러레이트 IITM과정의 3일째에 CD154의 발현은 실질적으로 크셀러레이트ITM의 것보다 높다. 이러한 관찰은 T 세포가, 크셀러레이트 ITM과정에서 보다 크셀러레이트 IITM과정동안에 보다 높은 활성화 상태에 있음을 시사한다. 생체내 투여되는 경우, 이것이 보다 효과적인 생성물로 해독될 수 있을 것으로 예상된다.
배양 3일째에 CD3+세포 순도, CD4 세포/CD8 세포 비율 및 세포 생존성은 또한 5명의 환자 샘플에 대해 결정한다. 크셀러레이트 ITM과정 및 크셀러레이트 IITM과정에 적용ehls 사용되는 세포의 표현형 및 생존성은 유동 세포측정기 또는 트립판 블루 염색에 의해 측정된 바와 같이 하기 표 4에 나타낸다.
* = 크셀러레이트 I 과정에서 단핵구 고갈 후 또는 크셀러레이트 II 과정에서 자기 농축 후 0일 째에 CD3+T 세포의 순도
ψ= 크셀러레이트 I 과정에서 단핵구 고갈 후 또는 크셀러레이트 ITM과정에서 자기 농축 후 0일째에 CD8+T 세포의 비율
실시예 II
CD3+T 세포 집적, 단핵구 고갈 및 과립구 고갈의 효능
본 연구를 위해, Xcyte 치료 개발 연구소에서 수령한 즉시, 입수한 PBMC 성분채집물을 세척하고 분리한다:
1. 크셀러레이트 I 과정을 위해, 단핵구-고갈 단계를 수행하고 CD14+단핵구-고갈된 PBMC를 동결보존하고 LN2동결기의 증기상에 저장한다(실시예 I에 주지된 바와 같음). 크셀러레이트 I 과정의 설치 당해 날에 CD14+단핵구 고갈 PBMC를 해동하고 실시예 I에 상세히 기재한 바와 같이, 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T로 크셀러레이트 과정을 개시한다. 이들 초기 단계에서 N = 5인 공여자에 대한 CD3+T 세포 집적, CD14+단핵구-고갈 및 과립구-고갈의 평균 세포 조성물 및 평군 효율은 표 5.1에 나타내고 각각의 개인의 공여자에 대한 데이타는 표 5.2에 나타낸다.
2. 크셀러레이트 II 과정을 위해, PBMC 성분채집물 세포를 동결보존하고 LN2동결기의 증기상에 저장한다. 크셀러레이트 II 과정의 설치 당해 날에 동결보존된 PBMC 성분채집물 세포를 해동하고 실시예 I에 상세히 기재한 바와 같이, 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T로 크셀러레이트 II과정을 개시한다. 이들 초기 단계에서 N = 5인 공여자에 대한 CD3+T 세포 집적, CD14+단핵구-고갈 및 과립구-고갈의 평균 세포 조성물 및 평군 효율은 표 5.1에 나타내고 각각의 개인의 공여자에 대한 데이타는 표 5.2에 나타낸다.
표 5.1 및 5.2에서 입증된 바와 같이, 동결/해동된 PBMC 성분채집물의 배합에 이어서 크셀러레이트 II 과정 배위에서 해동된 PBMC 성분채집물로부터 유래하는 CD3+T 세포의 자기 농축은 CD14+단핵구 및 과립구를 효율적으로 게거한다(표 5.1 및 표 5.2). 크셀러레이트 II 과정에서 CD14+단핵구 및 과립구의 제거 효율은 크셀러레이트 I 과정 만큼 우수하여 추가의 "비피복된" 다이나비드 M-450 T 시약을 사용한 별도의 고갈 단계를 필요하지 않다는 이득을 갖고 일관성 있게 CD4/CD8 비율이 높다.
CD14+단핵구 고갈 단계 및 관련된 시약의 제거에 의해 과정의 단순화 및 합리화 뿐만 아니라, 크셀러레이트 IITM과정에서 자기 농축 단계는 또한 T 세포 활성화 개시 시점에서 고순도의 CD3+T 세포 및 고비율의 CD3+, CD4+:CD3+, CD8+T 세포를 제공한다(표 5.1 및 표 5.2).
크셀러레이트 ITM과정 및 크셀러레이트 IITM과정의 8일째에 활성화된 CD3+T 세포의 수율, 순도, 생존력 및 조성물을 또한 비교한다.
표 5.3에 나타낸 바와 같이, 8일째에 수거하기 전에, CD3+T 세포의 평균 수율, 순도 및 생존력은 전형적으로 크셀러레이트 ITM과정과 비교하여 크셀러레이트 IITM과정에서 개선되었다.
표 5.3에 나타낸 바와 같이, 크셀러레이트 IITM과정은 당해 과정을 거쳐 고비율의 CD3+CD4+:CD3+CD8+T 세포로 유지한다. 이것은 자기 농축 단계동안에 CD3+CD4+세포를 우선적으로 농축시키기 때문일 수 있다(표 5.1 및 표 5.2).
"입수"는 신선하고 세척된 입수 성분채집 세포를 언급한다. 크셀러레이트 ITM과정에 대한 표 5.2에서 열거된 개시 세포는 세척되고, 단핵구 고갈되고/되거나 동결/해동된 성분채집된 세포이다.
* = CD3+CD4+:CD3+CD8+T 세포의 비율
표 5.3은 크셀러레이트 IITM과정은 크셀러레이트 ITM과정 기원의 세포 생성물 보다 순수한(CD3+세포% 측면에서) 세포 생성물을 수득할 수 있도록 함을 보여준다. 즉, 크셀러레이트 IITM과정 기원의 생성물 세포의 평균(±표준 오차) CD3+세포 순도가 96% ± 1%인 반면, 크셀러레이트 ITM과정 기원의 세포의 평균 순도는 93% ±2%이다.
또한, 표 5.3에 보여진 바와 같이, 크셀러레이트 IITM과정은 CD4/CD8 세포를 고비율로 유지한다. 입수 세포는 2.2의 평균 CD4/CD8 세포 비율을 갖고 크셀러레이트 IITM과정에서의 생성물 세포는 1.8의 CD4/CD8의 비율을 갖는 반면 크셀러레이트 IITM과정에서의 생성물 세포는 1.2의 CD4/CD8 비율을 갖는다.
표 5.3의 데이타는 또한 크셀러레이트 IITM과정에서 평균 생존력이 98%인 생성물 세포가 수득되는 반면 크셀러레이트 ITM과정에서는 평균 생존력이 97%인 생성물 세포가 수득됨을 보여준다.
실시예 III
단핵구 고갈
단핵구(CD14+, 포식 세포)는 다양한 "부적절한"(즉, 비항체 피복되거나 비표적 항체 피복된) 다이날 비드를 사용하여 자기 고갈을 통해 T 세포 제제로부터 제거한다. 고갈은 피콜중에서 분리후의 전혈 또는 성분채집된 말초 혈액을 다이날 양 항 마우스 M-450 비드 또는 다이날 사람 혈청 알부민 피복된 비드(M-450) 또는 다이날 에폭시(M-450) 비드로 약 2:1의 비드 대 세포 비율로 사전 항온처리함에 의해 수행한다. 세포 및 비드는 22 내지 37℃에서 1 내지 2시간동안 항온처리하고 비드에 부착되거나 비드를 포식한 세포를 자기 제거한다. 잔류 세포를 비조작된 세포와 함께 배양물에 첨가한다. 고갈 전과 후에 세포 표현형에 대해 유동 세포측정기로 세포의 특징을 밝힌다.
실시예 IV
유동 세포측정 셋팅
벡톤 딕킨슨 FACSCALIBUR 세포측정기를 수거되고 제공된 모든 데이타에 대해 사용한다. 3색 분석을 수행할 수 있는 임의의 유동 세포측정기는 경험있는 작동자가 사용하여 동일한 데이타를 수득할 수 있다. 예를 들어, FACSCAN, 밴테이지(Vantage) 세포 분류기 또는 기타 BD 생성물은 유사한 데이타를 수득하는작용을 한다. 또한, 쿨터 에픽 분류기(Coulter Epic Sorter)와 같은 쿨터 제품이 또한 작용한다.
하기에 주어진 장치 셋팅은 이들 연구에서 수행되는 바와 같이 데이타를 수집하기 위한 장치 적응을 위해 일반적인 치침으로서 사용할 수 있다. 이들 셋팅은 하기에 제공된 실시예에 대해 사용한다. 그러나, 경험있는 장치 취급자는 보상 및 검출기 전압을 적절하게 조정하기 위해 당해 셋팅을 변형시킬 수 있고 변형시켜야만 한다. 또한, 상이한 형광 태그를 갖는 상이한 검출 항체의 사용은 임의의 특정 장치에 요구되는 유일한 조정을 사용하여 또 다른 채널(예를 들어, 보상)로의 최저의 "과출혈"과 함께 최적의 시그날 분리(전압)를 수득한다. 보상 조절, 이소타입 조절을 사용하는데 정통한 기술자이며 T 세포의 생물학을 일반적으로 이해하는 유동 작동자는 하기에 제공된 데이타중 임의의 하나를 재현할 수 있어야만 한다.
추가로, 다양한 셋팅, 특히 전압 셋팅은 장치 레이져의 효율에 따라 다양할 수 있음을 주지해야한다. 예를 들어, 보다 오래된 레이져는 새로운 레이져에 상응하는 시그날을 생성시키는데 보다 많은 전압을 요구할 수 있다. 그러나, 전압이 높거나 낮든지 간에 수득된 데이타는 생물학에 있어서 유사한 패턴을 반영해야만 한다.
FACSCALIBURTM(벡톤 딕킨슨)상에 사용되는 셋팅:
계수 전압은 일반적으로 일정하지만 P3, P4 및 P5는 약간 상향 또는 하향 조정하여 음성 대조군 시그날을 로그 모드의 시그날 강도로서 1 내지 10으로 또는 이 근처로 유지하면서 최대 시그날 분리를 성취한다.
역치:
1차 계수: FSC(정방향 산란기)
값: 52
2차 계수: 부재
보상:
FL1 - 4.0% FL2
FL2 - 21.4% FL1
FL2 - 2.6% FL3
FL3 - 15.2% FL2
제공되는 셋팅은 하기에 제공된 데이타의 대부분을 수거하기 위해 사용되는셋팅에 접근하지만 셋팅은 변형될 수 있고 자극된 T 세포상에 대해 대략적으로 동등한 데이타가 산출되어야만 한다. 상기 열거된 전압에서 보상을 위해 일반적으로 허용가능한 범위는 하기에 나타낸 바와 같다.
FL1-FL2 0.4 - 4%
FL2-FL1 18 - 27%
FL2 - FL3 2 - 8%
FL3 - FL2 10 - 16%
하기의 목표를 갖는 경험있는 유동 세포측정 작동자가 특정 보상값 또는 전압값을 결정해야만 한다:
1) 전압: 양성 및 음성 시그날간의 시그날 분리의 최대화(예를 들어, 표면 항원 마커 음성 대 저수준의 표면 항원 대 고수준의 표면 항원).
2) 보상: 보상 대조군을 사용하여 채널 상호간 간섭(과출혈)의 최소화.
전압의 셋팅이 변화함으로써, 보상 셋팅을 한다.
실시예 V
세포 증식 및 생존력 분석
세포 증식 및 생존력은 표준 트립판 블루 염색 및 혈구세포측정기를 사용한 세포 계수에 의해 측정한다. 도 5A 및 도 5B를 참조한다.
실시예 VI
활성화 마커 분석
CD154는 일시적인 방식으로 활성화된 T 세포상에 발현하고 APC 상에 CD40을 통한 T 세포 상호작용에 있어서 중요한 인자인 것으로 나타난다. 이들 2개의 수용체의 상호작용을 차단하여 면역 반응을 효과적으로 변화시키고 심지어 차단할 수 있다. 3 x 28의 상자성 비드로 농축시킴에 의해 지극되는 T 세포의 적정액은 3, 5 및 8일째에 세포 배양물로부터 제거하고 CD154 발현 수준에 대해 분석한다. CD154 발현 수준은 단핵구가 고갈되었지만 3 x 28 상자성 비드로 항온처리하지 않은 T 세포와 비교한다(즉, T 세포는 배양 초기에 자기적으로 농축되지 않는다). 항 CD3 및 항 CD28 비드로 자기 농축에 의해 자극된 T 세포의 상당한 활성화는 배양 초기에 유사하게 자극되지 않은 세포와 비교하여 배양 3일째의 CD154 발현 수준이 3배 증가함을 보여준다(도 4 및 7). 유사한 방식으로 측정된 CD25 수준은 보다 높은 활성에 대한 경향을 보여준다.
일반적으로, 마커 발현은 다양한 시점에 모니터한다. 이와 관련하여, 세포는 항 사람 CD4(Immunotech, Fullerton, CA), FITC 커플링된 항 사람 CD11a(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD26(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD49d(쿨터), FITC 커플링된 항 사람 CD54(Pharmingen and Becton Dickinson), FITC 커플링된 항 사람 CD95(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD134(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD25 Ab(Becton Dickson, Fullerton, CA), FITC 커플링된 항 사람 CD69 Ab(Becton Dickinson), FITC 또는 PE 피복된 항 사람 CD154 Ab(Becton Dickinson) 또는 FITC 또는 PE 커플링된 IgG1 이소타입 대조군 Ab로 표지시킨다. 2 x 106의 세포는 최종 용적 30㎕중에 2㎕의 각각의 항체와 4℃에서 20분동안 표지시키고 세척하고 1% 파르포름알데하이드(Sigma, St. Louis, MO)중에 재현탁시킨다.
세포 표면 마커 분자 발현 수준의 비교는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있고 따라서 절대값은 상이할 수 있다. 그러나, 2개의 값을 비교하는 경우, 상대적인 배수 값을 용이하게 계산할 수 있다. 예를 들어, 상이한 "활성화" 방법에 의해 생성되는 T 세포상의 CD154 발현 수준은 유동 세포측정 수단에 의해 비교적 정확하게 측정할 수 있다. 벡턴 딕킨슨의 항 CD154 PE 접합체(카탈로그 # 340477)와 같은 시약을 사용하여, 휴지기 또는 활성화 상태의 T 세포를 염색할 수 있고 당해 마커(또는 경험있는 유동 세포측정 작동자에게 널리 공지된 기타 마커)에 대한 발현 수준을 측정한다. 본원은 T 세포상에 CD154, CD4+및 CD8+둘다의 증가된 발현을 제공하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 배양 초기에 T 세포를 동시에 자극하고 농축시킴에 의해, 발현 수준은, 유동 세포측정을 사용한 평균 형광 강도에 의해 측정된 바와 같이 20% 내지 100% 수준의 증가 정도로서 표준 3x28 활성화에 의해 수득되는 값을 초과할 수 있다. 예를 들어, 비자극된 CD4+T 세포는 CD154에 대해 음성일 수 있고 따라서 MFI 수율 값은 1 내지 10이다. 3일 후의 활성화 시점에서 크셀러레이트 ITM에 의한 활성화 즉시, CD4+T 세포에 대한 CD154에 대한 MFI 값의 범위는 20 내지 40일 수 있지만 크셀러레이트 IITM과정에서 CD154MFI 수율 값은 60 내지 200일 수 있다. 이들은 T 세포상에서 발현되는 다수의 CD154 분자 측면에서 절대값이 아니지만 상대적 수준의 증가된 발현을 측정하기에 충분하다. 따라서, 활성화 후 1 내지 4일간의 CD154 수준의 약 1.1 내지 20 배수의 증가는 크셀러레이트 ITM과정과 비교하여 크셀러레이트 IITM에서 입증될 수 있음이 입증되었다.
실시예 VII
사이토킨 분석
세포는 상기된 바와 같이 제조된다. 다양한 시간동안 자극된 세포 기원의 상등액에 제조업자의 지침에 따라 IL-2, IL-4, INF-γ또는 TNF-αELISA를 적용한다.
또 다른 분석에서, IL-2는 유동 세포측정기를 사용하여 CD4 T 세포의 세포간 염색으로 측정한다. IL-2 또는 IFN-γ로 세포내를 표지하기 위해, 세포는 먼저 분석전에 4시간동안 1㎕ 모넨신(Calbiochem)으로 항온처리한다. 이어서 세포를 상기된 바와 같은 표면 단백질로 염색하고 벡턴 딕킨슨 세포내 염색 키트를 사용하여 고정화하고 투여하며 PE 커플링된 항 사람 IL-2 Ab 및 FITC 커플링된 항 사람 IFN-γ또는 제조업자에 의해 기술된 바와 같은 상응하는 대조군 Ab로 표지시킨다. 데이타 획득 및 유동 세포측정 분석은 제조업자의 프로토콜(Becton Dickinson)에 따라 셀쿠에스트 소프트웨어를 사용하여 벡턴 딕킨슨 FACSCalibur 유동 세포측정기로수행한다.
IFN-γ 농도는 크셀러레이트 ITM(데이터는 나타내지 않음)과는 반대로 크셀러레이트 IITM방법을 사용하는 경우 3일째에 약 2, 3, 4배 높고 몇몇 경우에 5배 높다. 추가로, TNF-알파 수준은 또한 크셀러레이트 ITM과 비교하여 자극 후(데이타는 나타내지 않음) 5일 이하까지는 매우 높다(1.5배 내지 3배 높다).
실시예 VIII
재자극후 표현형 세포 분석
재자극 분석을 위해, 약 5 x 106의 세포를 최종일에 배양물로부터 수거한다. 몇몇 실험에서, 종결되는 날은 배양후 8일째이다. 당해 세포는 상기된 바와 같이 6웰 플레이트중 하나의 웰에 상기된 바와 같이 IL-2의 존재 또는 부재하에 혈청을 갖는 X-vivo 15 배지 5ml에 첨가한다. 37℃, 5% CO2배양기에서 세포 및 세포 및 비드를 함유하는 웰에 약 5 x 106의 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T 비드를 첨가한다. 2일 후에, 샘플을 제거하고 생존력에 대해 시험하고 FACS로 분석하여 세포 크기 및 세포 마커 및/또는 사이토킨 발현 수준, 예를 들어, CD25 발현 수준, CD154 발현 수준을 측정한다. 표 6은 크셀러레이트 ITM및 크셀러레이트 IITM의 과정에 적용된 5개의 환자 샘플에 대해 하기의 결과를 입증한다.
실시예 IX
또 다른 세포 수거 및 배양 프로토콜
크셀러레이트TM
사람 혈액으로부터 분리한 세포를 X-vivo 배지(Biowhittaker Inc., Walkersville, MD) 및 사용 목적에 따라 20U/ml의 IL-2(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)이 보충되거나 보충되지 않은 배지 및 5% 사람 혈청(Biowhittaker), 2mM 글루타민(Life Technology, Rockville, MD) 및 20mMHEPES(Life Technology)가 보충된 배지에서 성장시킨다. 유르캣 E6-1 세포(ATCC, Manassas, VA)를 10% FBS(Biowhittaker), 2mM의 글루타민(Life Technologies), 2mM 페니실린(Life Technologies) 및 2mM 스트렙토마이신(Life Technologies)가 보충된 RPMI 1640(Life Technologies)에서 성장시킨다.
건강한 사람 지원 공여자로부터의 연막을 수득한다(American Red Cross, Portland, OR). 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 제조업자의 지침에 따라 림프구 분리 배지(ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA)를 사용하여 수득한다.
말초 혈액 림프구(PBL)은 37℃에서 2시간동안 피복되지 않은 다이나비드(Dynal, Oslo, Norway), 108세포/ml, 2 비드/세포와 함께 배양 플라스크(Costar, Pittsburgh, PA)에서 항온처리하여 PBMC 분획물로부터 수득한다. 단핵구 및 대식세포는 배양 플라스크에 접착시켜 제거할 수 있다. 또한, 이들은 상자성 비드를 포식시키고 이어서 제조업자의 지침(Dynal)에 따라 자기 세포 분리에 의해 이들 세포를 고갈시킴으로써 제거할 수 있다. CD4+세포는 4℃에서 20분동안 CD8(클론 G10-1), CD20(클론 IF5), CD14(클론 F13) 및 CD16(쿨터)에 대한 모노클로날 항체 10㎍/ml를 사용하여 108세포/ml의 당해 세포를 항온처리하여 PBL 분획물로부터 정제한다. 세척 후, 세포를 양 항 마우스 Ig 커플링된 다이나비드(106세포/ml, 6비드/세포, 4℃에서 20분)으로 처리하고 자기 세포 분리를 통해 2회 고갈시킨다. CD4+세포의 순도는 통상적으로 유동 세포측정에 의해 측정되는 바와 같이 91 내지 95%이다.
37℃에서 2시간동안 108세포/ml로 PBMC를 먼저 배양 플라스크(Costar)에 부착하여 수상세포를 생성한다(다이나비드 부재). 강하게 세척한 후, 접착 세포는 500U/ml GM-CSF(Boehinger Mannheim) 및 12.5U/ml IL-4(Boehringer Mannheim)을 함유하는 배지에서 7일동안 배양한다. 수득한 세포 집단을 약하게 접착시키고 수상세포(예를 들어, HLA-DR, CD86, CD11c를 발현하지만 CD4는 발현하지 않음)에 특징인 표면 마커를 발현시킨다.(모든 항체는 Becton, San Jose, CA로부터 구입함)
또 다른 기술은, RPMI, X-Vivo 15로 이루어질 수 있는 배지 또는 몇몇 다른 T 세포 배양 배지의 조직 배양 플레이트 및/또는 조직 배양 플라스크(Baxter Bag) 또는 기타 공통적인 배양 용기에서 배양된 T 세포를 함유하는 사람 말초 혈액 림프구를 사용할 수 있다. T 세포의 활성화 및 성장에는 요구되지 않지만 글루타민 및 HEPES가 배양 배지에 첨가된다. 태아 소 혈청(최종 10%), 사람 A/B 혈청(5%) 또는 자가 사람 혈청(5%)는 배양 배지에 첨가한다. 혈청 %는 T 세포 생물학 또는 배양 결과에 크게 영향을 미치지 않으면서 다양할 수 있다. 몇몇 경우에, 재조합 사람 IL-2를 배양물에 첨가한다. 몇몇 경우에, 포식작용 CD14+세포 및 기타 포식작용 세포는 상기된 바와 같이 자기 고갈에 의해 제거한다. 비드 표면에 동시 고정화된 항 CD3 및 항 CD28(3x28 비드)는 3:1의 비드:세포 비율로 첨가한다. 몇몇 경우에, 3x28 비드는 1:1의 비드:세포 비율로 첨가한다. 다른 경우에, 3x28 비드는 후속적으로 배양한지 처음 5일동안 1일째의 1:1의 최종 비율, 3일째에 1:5의 최종 비율및 5일째에 1:5의 최종 비율로 첨가한다. 14일동안 여러 시점에서 세포를 제거하여 다양한 표면 항원의 유동 세포측정 분석을 통해 측정한 바와 같이 세포 밀도(세포 수), 세포 크기 및 세포 표면 표현형을 결정한다. 상등액은 또한 배양물로부터 수거하여 IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α를 포함하지만 이에 제한되지 않는 사이토킨 분비 프로필을 결정한다. 활성화된 세포는 증식하고 분열함으로써 배양은 0.2 내지 2 x 106CD3+T-세포/ml로 유지한다. T 세포 밀도가 약 1.5 x 106/ml을 초과하는 경우, 배양물을 분리하고 신선한 배지를 가하여 세포밀도의 범위가 0.2 내지 1.4 x 106/ml이 되도록 한다. 초기 자극 후 약 2시간 내지 약 14일째에 활성화된 T 세포가 보다 정지기(예를 들어, CD25 수준이 감소하고 정방향 산란기에 의해 측정된 바와 같은 세포크가 감소하며 세포 분열 속도가 감소함)로 진입하는 것으로 나타나는 경우, 세포를 대상체에 주입하거나 하기 자극중 하나로 재자극시킨다.
1) 자극 부재
2) 식물성혈구응집소(PHA) 2㎍/ml
3) 1:1 비드/세포 비율로 (3 x 28 비드)
다시 세포를 세포 표현형 및 활성화/기능 상태에 대해 시간에 따라 분석한다. 상등액을 다시 분비된 사이토킨 분석을 위해 수거한다. 세포를 3개의 상이한 방법, 즉 1) 제조업자의 지침(Dynal)에 따른 항 CD3(OKT-3) 및 항 CD28(9.3) 항체(3x28 비드)에 공유적으로 커플링된 다이나비드(M-450), 세포당 3개의 비드, 2) 리노마이신(Calbiochem, La Jolla, CA)(100ng/ml) 및 포르볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(PMAj)(Calbiochem)(10ng/ml), 3) 동종계열 수상 세포(25,000 수상세포/200,000 CD4 세포)에 의해 자극시킨다. 모든 세포는 106세포/ml의 농도에서 자극시킨다. 증식 분석은 96웰 평저 플레이트에서 4회 수행한다. 세포는 최종 용적 200㎕로 106세포/ml에서 자극시킨다. 증식은 3일째(자극 방법 1 및 2) 또는 6일째(자극 방법 3)에 MTT 분석(MTT 분석 키트, Chemicon International Inc., Temecula, CA)에 의해 측정하고 결과는 4회 평균치로서 제공된다. PBL 배양물 또는 정제된 CD4+세포 배양물은 3x28 비드, 이오노마이신/PMA 또는 동종계열의 수상 세포로 자극시킨다.
도 8A 내지 8B에 의해 입증된 바와 같이, 세포수(쿨터 계수기)는 PHA, 양 항 마우스(SAM)를 통해 비드에 부착된 3x28 비드(비드상에 동시 고정화된 항 CD3 및 항 CD28), 비드에 공유적으로 부착된 항체 또는 플레이트상에 단일 또는 이중으로 고정화된 항체를 갖는 3x28 비드로 자극시킨 후 급격하게 증가한다. 도 9는 또한 비스상에 공유적으로 고정화된 항 CD3 및 항 CD28 +/- 단핵구 고갈 및 +/- IL-2 20 유니트로 자극시킨 후 세포수가 증가함을 보여준다.
실시예 X
자기 고갈을 통한 단핵구 고갈
단핵구(CD14+포식 세포)는 다양한 "부적절한"(즉, 비 항체 피복되거나 비표적 항체 피복된) 다이날 비드를 사용하여 자기 고갈을 통해 T 세포 제제로부터 제거한다. 22 내지 37℃에서 1 내지 2시간동안 피콜된 전혈 또는 성분채집된 말초 혈액을 다이날 양 항 마우스 M-450 비드 또는 다이날 사람 혈청 알부민 피복된 비드(M-450) 또는 다이날 에폭시(M-450) 비드의 대략 2:1의 비드 대 세포 비율로 사전 항온처리함에 이어서 비드 또는 포식된 비드에 부착된 세포를 자기 제거하여 고갈시킨다. 잔류 세포를 비조작된 세포와 함께 배양물에 첨가한다. 세포의 특징을, 고갈 전후에 세포 표현형에 대한 유동 세포 측정으로 밝힌다. 도 9는 단핵구 부재하에 증식이 증가되었음을 입증한다.
실시예 XI
예비 활성화 및 활성후의 역학적 시간에 따른 연구
전혈 또는 성분채집된 말초 혈액 기원의 사람 T 세포를 다양한 조건하에 배양하는 일련의 실험을 수행한다. 이들 조건은 다음과 같다:
1) 자극 부재
2) 2㎍/ml에서 식물성혈구응집소(PHA)로의 자극
3) 3:1 또는 1:1 비드 대 T 세포 비율에서의 3x28 다이나비드(여기에 접합된 항 CD3 및 항 C28 비드를 갖는 비드)
4) 외래적으로 첨가된 재조합 사람 IL-2의 존재 또는 부재하에 10U/ml(5ng/ml)에서의 자극 또는 항온처리
5) 단핵구(CD14+포식 세포)의 존재하의 배양 또는 다양한 "부적절한" 다이나비드를 사용한 자기 고갈을 통해 상기된 세포의 제거 후의 배양. 고갈은 실시예 II에 기재된 바와 같이 수행한다.
하기의 세포 표면 마커를 유동 세포측정에 의해 분석하여 세포 표현형 및 활성화 상태를 결정한다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD25, CD45RA, CD45RO, CD54, CD62L, CDw137(41BB), CD154. 세포 크기는 또한 유동 세포측정을 통해 정방향 산란기 프로필에 의해 결정된 바와 같이 조사한다.
CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD19, CD20, CD25, CD45RA 및 CD45RO와 같은 마커를 사용하여 T, B 및 단핵구 계열 및 아집단을 결정하고 정배향 산란기, CD25, CD62L, CD54, CD137 및 CD154를 사용하여 세포의 활성화 상태 및 기능 상태를 결정한다.
T세포 함유 사람 말초 혈액 림프구를 실시예 IX에서 기재된 바와 같이 제조한다. 세포를 세포 표현형 및 활성화/기능 상태에 대해 시간에 따라 분석한다. 분비된 사이토킨 분석을 위해 상등액을 수거한다. 도 8 및 9는, 10㎍/ml 및 +/- 단핵구 고갈에서 3x28 비드 +/- 재조합 사람 IL2로 활성화 후 사람 T 세포의 일반적인 성장 특징을 입증한다. 모든 세포는 박스터 라이프셀 플라스크(300ml)중에서 배양한다. "스케일 업"으로 표지된 하나의 플롯은 박스터 라이프셀 3리터 플라스크로 증식된 300ml 플라스크 배양물(어떠한 IL-2/단핵구도 고갈되지 않음)을 언급한다. 그래프는 다양한 조건하에서 사람 T 세포의 약 2 내지 4 로그 증식을 입증한다.
도 10은 시간 경과에 따른 정방향 산란기 유동 세포측정 프로필에 의해 결정되는 바와 같은 세포 크기의 역학적 분석을 보여준다. T 세포는 활성화 후 짧은 시간에 크기가 증가하고 이어서 14일까지는 크기가 감소하여 이들은 보다 작은 정배향 산란기 프로필을 입증하는 것으로 나타나고 이는 보다 정지된 상태를 암시한다.
도 11은 3x28 비드 자극 후 시간 경과에 따른 IL-2 수용체(CD25) 발현을 보여준다. CD4+및 CD8+T 세포 둘다는 수용체 수준에서 조기 증가를 보여준다. 14일까지, CD25 발현 수준은 대다수의 T 세포상에서 크게 감소하고 보다 정지된 상태임을 암시한다.
3x28 자극된 T 세포가 보다 정지된 상태(낮은 CD25, 낮은 정방향 산란기)로 되는 경우, 이들은 하기에 나타낸 바와 같이 재자극시킨다.
1) 자극 부재
2) 2㎍/ml의 PHA
3) 1비드/CD3+T 세포에서 3 x 28(크셀러레이트) 비드 자극
이어서, 세포 크기(정배향 산란기), 표면 표현형, 활성화 마커 발현 및 사이토킨 분비의 역학적 분석을 수행한다. 도 12는 1차 및 2차 자극 후 정배향 산란기(세포 크기)역학을 보여준다. 도 13은 1차 및 2차 자극 후 CD25(IL-2 수용체) 발현 역학을 보여준다. 도 16은 CD4+T 세포(A) 및 CD8+T 세포(B)에 대한 2차자극 후 CD54(I-CAM)을 보여주고 여기서 1차 자극은 PHA 또는 3x28 비드이고 재자극은 부재, PHA 또는 3x28 비드이다. CD4와 CD8 양성 세포사이에 표시된 마커를 또한 사용하여 3x28 항체 비드 활성화동안에 이의 상대적 비율을 결정한다(도 19 및 도 22).
실시예 XII
동시 자극된 T 세포의 사이토킨 발현 패턴의 분석
IL-2, IFN-γ, TNF-α 및 IL-4를 포함하는 다양한 사이토킨의 역할은 이들이 T 세포 유지, 증식 및 분화에 관한 것으로서 광범위하게 연구되었다. 명백하게, IL-2는 T 세포의 유지 및 증식을 지지하는 것으로 나타난다. IFN-γ는 T 세포가 TH1형 면역 응답자로 분화하도록 구동시키는데 관여하는 반면 IL-4는 T 세포를 TH2형 응답을 구동시키는데 관여한다. PHA 또는 3x28 비드에 의해 활성화된 1차 사람 T 세포내 사이토킨 방출 수준은 1차 자극에 대한 반응 및 2차 자극에 대한 반응의 역학적 연구를 포함하여, 실시예 IX에서와 같이 T 세포를 자극시킴에 의해 분석한다. 당해 데이타는 도 18A 내지 C에 나타내고 도 23 및 24는 3x28 비드 자극의 유일한 특징을 입증한다. 초기 자극 후(1일째 평가되지 않음) 2일 내지 4일 사이에, 매우 높은 수준의 IL-2 및 IFN-γ가 관찰된다. PHA로 자극된 세포에서 관찰되는 수준과 비교하여 3x28 비드 자극된 T 세포에 대해 분비된 IL-2 절대 수준이 거의 5배 증가한 것으로 나타난다. PHA 대응체와 비교하여 3x28 자극된 T 세포에서 IFNγ수준이 약 7배 증가함이 관찰된다. IL-4의 경우에, 1차 자극동안 급격하게 증가하지 않는다. 흥미롭게도, 세포가, 1차 자극 후 정지 상태가 된 후 (더 이상 분열하지 않거나 상기 언급된 사이토킨을 분비하지 않음) 이들이 3x28 비드, PHA로 재자극되거나 자극되지 않은 상태로 존재하는 것이 상당히 중요할 수 있다. 3x28 비드를 통해 초기 활성화/증식 시그날을 받은 T 세포는 1차 자극 후 관찰되는 것보다 고수준의 IFN-γ를 분비한다. 대조적으로, PHA 자극된 IFN-γ수준으로 초기에 자극된 세포는 이들의 3x28 대응체에 대해 예상되는 것보다 훨씬 낮은 수준의 IFN-γ를 분비한다. 유사한 차이는 또한 IL-4 수준에 대해 관찰된다.
이들 데이타는 3x2 비드를 통해 매개된 활성화/증식후 수득한 세포가 PHA와 같은 또 다른 증식 수단으로부터 수득한 것과 기능적으로 상이함을 제안한다. 수득한 세포는 TH1형 프로필(IFN-γ)을 가능한한 선호하고 매우 높은 수준의 TH1및 TH2사이토킨 둘다를 촉진하는 변화된 사이토킨 분비 반응을 갖는 것으로 나타난다. 배양중에 이러한 고수준의 사이토킨의 분비는, T 세포를 항종양 및 항바이러스 반응을 선호하는 하나인 TH1분화 경로로 구동시킴을 포함하여 또한 수득한 T 세포의 기본적인 기능(활성화의 역치를 저하시키고 프로그램화된 세포사 경로를 억제하는 것과 같은)을 변화시킴에 의해 많은 효과를 가질 수 있다.
실시예 XIII
동시 자극된 T 세포의 CD54 발현의 분석
도 16은 2차 자극 후에 CD4+T 세포(A) 및 CD8+T 세포(B)에 대한 CD54(I-CAM)의 발현을 보여주고 여기서, 1차 자극은 PHA 또는 3x28 비드이고 재자극은 부재이거나 PHA 또는 3x28 비드이다.
실시예 XIV
단기 활성화 마커 분석
마커 발현은 실시예 IX에 제시된 바와 같은 T 세포의 자극 후 다양한 시간에 따라 모니터한다. 이와 관련하여, 세포에 항 사람 CD4(Immunotech, Fullerton, CA), FITC-커플링된 항사람 CD11a(Pharmingen), FITC 커플링된 항사람 CD26(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD49d(쿨터), FITC 커플링된 항 사람 CD54(Pharmingen and Becton Dickinson), FITC 커플링된 항 사람 CD95(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD134(Pharmingen), FITC 커플링된 항 사람 CD25 Ab(Becton Dickinson, Fullerton, CA), FITC 커플링된 항사람 CD69 Ab(Becton Dickinson), FITC 또는 PE 커플링된 항 사람 CD154 Ab(Becton Dickinson) 또는 FITC 또는 PE 커플링된 IgG1 이소타입 대조군 Ab를 표지한다. 2 x 105의 세포를 최종 용적 30㎕에서 각각의 항체 2㎕로 4℃에서 20분동안 표지시키고 세척하고 1% 파라포름알데하이드(Sigma, St. Louis, MO)중에 재현탁시킨다. 도 21 내지 22 및 26A-26L에 의해 입증된 바와 같이, CD4+와 CD8+세포 사이의 차이 뿐만 아니라 활성화 시간에 대해서는 상당한 차이를 나타낸다.
실시예 XV
다양한 CD3:CD28 비율을 사용한 T 세포 증식
T 세포 증식은 3x28 다이나비드RM-450상에서 CD3:CD28 비율의 농도를 다양화하여 평가한다. 본원에 기재된 실험에서, 실시예 I에 기재된 바와 같이, 크셀러레이트 IITM으로서 언급되는 과정을 사용한다. 도 27에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 배양한지 8일 후에 약 68배 증가한 것으로 관찰되고 비드상의 CD3:CD28의 비율이 1:10이다. T 세포의 35배의 증식은 배양한지 8일 후에 나타나고 비드상의 CD3:CD28의 비율은 1:3이다. 1:1의 비율에서, 약 24배의 증식이 관찰된다.
실시예 XVI
양성 선택을 위한 비드:T 세포의 비율을 다양화하고 이어서 비드의 연속 첨가량을 다양화함을 사용하는 T 세포 증식
당해 실시예는 크셀러레이트 IITM과정(실시예 I 참조)을 변형시켜 자극 후 처음 10일동안 양성 선택 및 최적의 T 세포 증식을 위해 가장 효과적인 비드:T 세포 비율을 결정한다.
제1 실험에서, 비교는 자극 후 처음 10일동안 1:1 비율의 3x28 비드:세포로 양성적으로 선택되고 후속적으로 첨가되는 3x28 비드의 비율을 다양화하여 자극된 세포로 이루어진다. 세포는 비드:T 세포가 3:1 및 1:1인 비율에서 3x28 다이나비드RM-450으로 양성적으로 선택한다. 3:1의 비율을 위해, 20 x 106세포(50 내지 60% T 세포로 추정)는 분리하고 1ml PBS + 5% 사람 혈청중에 재현탁시킨다. 30 x 106세척된 비드를 2ml의 최종 용적으로 첨가한다. 1:1의 비율을 위해, 10 x 106세척된 비드는 10 x 106총 세포에 첨가한다. 세포는 T-25 플라스크에서 배양하고 3일째에 계수하고 5ml의 용적으로 6웰 플레이트에 나누어 첨가한다. 5일째에, 모든 웰을 웰당 1.25 x 106으로 나눈다. 3, 4 및 6 내지 9일째에, 모든 웰은 웰당 2.5 x 106의 세포로 나눈다. 3x28 비드는 이어서 1:1 비율의 비드:세포에서 양성적으로 선택된 세포에 연속적으로 첨가한다. 표 7에 요약된 바와 같이, 10일째 세포 수율은 최종 비율이 0.2:1인 비율에서 3일, 4일 및 5일째에 비드의 연속 첨가와 함께 가장 높다.
제2 실험에서, 양성 선택 시간은 0.5 내지 1.0시간동안 다양하고 비드:세포 비율의 범위는 3:1 내지 1:1이다. 표 8에 요약된 바와 같이, 10일째에 세포 수율이 가장 높고 이때 60분동안은 1:1의 비드:세포 비율을 선택하고 3일 및 5일째에 0.2:1의 비율로 비드를 연속적으로 첨가한다. 그러나, 30분동안 3:1의 비드:세포 비율을 선택하는 것이 가장 높은 양성 선택 수율을 수득할 수 있음을 주지해야만 한다.
실시예 XVII
크셀러레이트 II 및 진탕 생물반응기
당해 실시예는 크셀러레이트 IIb 과정에 이어서 세포를 진탕 생물반응기에 접종하여 T 세포를 증식시키는 방법을 기재한다.
크셀러레이트 과정 0일째 - 실시예 I에 기재된 바와 같이 필수적인 크셀러레이트 과정 1일째에, 동결보존된 CryocteTM컨테이너의 저장 동결기로부터 요구되는 수를 제거하고 해동하고 세척하고 여과한다.
0일째 - 대략 0.5 x 109CD3+세포를 함유하는 세포 용적을 이어서 3:1의 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T:CD3+T 세포 비율에서 다이나비드 M-450 CD3/CD28 T와 혼합하고 진탕 배양한다. 배양 후, CD3+T 세포를 자기적으로 농축시키고 동시에 활성화시킨다. 이어서, CD3+T 세포를 라이프셀 세포 배양 백내에 완전 배지에 재현탁시킨다. 세포 및 비드를 함유하는 백은 이어서 환자 헌신된 배양기(37℃, 5%CO2)에 첨가한다.
3일경 - CD3+세포를, 단일 백의 내용물이 4개의 새로운 라이프셀 백으로 분리되는 지점인 약 3일 동안 배양 증식시킨다. 4개의 백을 이어서 환자 헌신된 배양기(37℃, 5% CO2)에 다시 넣는다.
5일경 - 배양 백의 내용물이 10L 용적의 배지를 함유하는 20L 진탕 생물반응기에 접종되는 시점인 약 2일 추가의 날짜에 CD3+세포를 배양 증식시킨다. 세포를 이어서 1ml/분의 관류와 함께 분당 15회전의 진탕으로 37℃, 5% CO2에서 배양한다.
각각의 날에 세포 계수를 결정하고 정체된 크셀러레이트 II 과정을 사용하여 자극되고 증식된 세포와 비교한다. 도 28에 나타낸 바와 같이, 세포가 진탕 생물반응기에 배양되는 경우, 증식은 급격하게 개선된다. 추가로, 세포 밀도는 정체된 크셀러레이트 II 과정에서 관찰되는 5 x 106의 최대 세포 밀도와 비교하여 진탕 생물 반응기에서 50 x 106세포/ml만큼 높은 밀도에 도달한다. 약 8000억개의 총 세포수는 진탕 생물반응기를 사용한 약 0.5 x 109세포의 개시 세포수로부터 배양 12일째에 성취된다.
따라서, 진탕 생물반응기는 증식 과정을 예상치않게 급격히 개선시킨다. 추가로, 지금까지 관찰되지 않은 세포 밀도 및 최종의 절대 세포 수율은 진탕 생물반응기를 사용하여 성취된다.
실시예 XVIII
진탕 생물반응기를 사용한 T 세포 증식을 위한 또 다른 프로토콜
진탕 생물반응기 또는 상응하는 생물반응기 시스템을 사용한 또 다른 T 세포 자극/활성화 및 증식 전략이, 세포 밀도 및 최종 세포 수율을 높이기 위해 개발된다.
한 전략으로서, 세포를 해동하고 세척하고 양성 선택을 크셀러레이트 II 과정에 기재된 바와 같이 개시한다. 양성적으로 선택된 세포는 진탕 플랫폼상에서 2ℓ의 진탕 백으로 이동시킨다. 완전 배지를 출구 튜브를 통해 백으로 도입함에 의해 용적을 1ℓ로 증가시킨다. 이어서, 백을 진탕 플랫폼상에서 진탕없이 37℃, 5%CO2에서 항온처리한다. 3일째에, 약한 진탕(분당 5 내지 10회전)을 개시한다. 4 내지 5일째에, 내용물을 20ℓ진탕 백으로 이동시키고 용적을 4ℓ로 증가시킨다. 유체 전달 시스템을 설치하여 매일 2ℓ씩 백의 용적을 증가시킨다. 7 및 8일째에, 약 분당 0.5 내지 3ml로 관류시키고 출구 펌프를 설치하여 백의 용적을 10ℓ로 유지시킨다. 9일 내지 12일째에, 세포를 수거한다. 유체 전달 시스템을 해체하고 상등액 5ℓ를 출구 펌프를 통해 제거한다. 각진 자석을 생산 라인에 부착한다. 증식된 세포 생성물이 20ℓ의 백으로부터 이동 팩으로 유동하게 한다. 비드가 탈착된 증식된 세포 생성물을 가공하고 동결보존한다.
또 다른 전략에서, 세포를 해동시키고 세척하고 크셀러레이트 II 과정에서 기술된 바와 같이 양성적으로 선택되지만 비드 및 세포를 2회 농축시킨다. 양성적으로 선택된 세포를 진탕 플랫폼상에 20ℓ 진탕 백으로 이동시킨다. 완전 배지를 출구 튜브에 도입하여 용적을 2ℓ로 증가시킨다. 이어서, 백을 진탕 없이 진탕 플랫폼상에서 37℃, 5% CO2에서 항온처리한다. 3일째에, 약한 진탕(분당 5 내지 10회 회전)을 개시하고 용적을 6ℓ로 증가시킨다. 4일째에, 유체 전달 시스템을 설치하여 매일 2ℓ씩 백의 용적을 증가시킨다. 6일째에, 분당 약 0.5 내지 3ml로 관류시키고 출구 펌프를 설치하여 백의 용적을 10ℓ로 유지시킨다. 9일 내지 12일째에, 세포를 수거한다. 유체 전달 시스템을 해체하고 상등액 5ℓ를 출구 펌프를 통해 제거한다. 각진 자석을 생산 라인에 부착한다. 증식된 세포 생성물이 20ℓ의 백으로부터 이동 팩으로 유동하게 한다. 비드가 탈착된 증식된 세포 생성물을 가공하고 동결보존한다.
본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이타 쉬트에 열거된 상기 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 200년 2월 24일자로 출원된 가출원 번호 제60/184,788호 및 2000년 11월 17일자로 출원된 가출원 번호 제60/249,902호의 우선권을 주장하는, 2001년 2월 26일자로 출원된 미국 특허원 제09/794,230호의 부분 계속 출원인 2001년 9월 20일자로 출원된 미국 특허원 제09/960,264호를 포함하지만 이에 제한되지 않고 이들 모두는 전반적으로 본원에 참조로서 인용된다.
이전에 기재된 것으로부터, 본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 본원에 기재되었지만 다양한 변형이 본 발명의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항을 제외하고는 이에 제한되지 않는다. 상기 인용된 모든 참조문헌, 특허, 특허 출원등은 전반적으로 본원에 인용되는 것이다. 추가로, 본원에 기재된 모든 수치의 범위는 명백하게, 당해 범위내의 모든 정수값을 포함한다.

Claims (92)

  1. a. 적어도 일부가 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계 및
    b. 적어도 일부의 T 세포 표면 잔기를 연결하고 당해 T 세포를 자극하는 하나 이상의 제제가 부착된 표면과 당해 세포 집단을 접촉시켜 T 세포를 2주 미만에 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식시키는 단계를 포함하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 T 세포 집단을 활성화시키고 증식시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 100 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 100 x 109세포로 증식하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 100 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 200 x 109세포로 증식하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 100 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 300 x 109세포로 증식하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수약 100 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 400 x 109세포로 증식하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 100 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 500 x 109세포로 증식하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 500 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 100 x 109세포로 증식하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 500 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 200 x 109세포로 증식하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 500 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 300 x 109세포로 증식하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 500 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 400 x 109세포로 증식하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, T 세포가 단일 개체로부터 유래하고 T 세포가 개시 세포 수 약 500 x 106에서 약 2주 미만에 총 약 500 x 109세포로 증식하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, T 세포가 약 2주 미만에 약 50 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, T 세포가 약 12일에 약 60 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, T 세포가 약 7일에 약 60 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, T 세포가 약 9일에 약 60 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, T 세포가 약 12일에 약 70 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, T 세포가 약 7일에 약 70 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, T 세포가 약 9일에 약 70 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, T 세포가 약 12일에 약 80 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, T 세포가 약 7일에 약 80 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, T 세포가 약 9일에 약 80 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  22. 제1항에 있어서, T 세포가 약 12일에 약 40 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  23. 제1항에 있어서, T 세포가 약 7일에 약 40 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, T 세포가 약 9일에 약 40 x 106세포/ml의 농도에 도달하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, T 세포가 약 5일 내지 약 12일에 걸쳐 약 24시간 이내에 약 1.5배 이상 증식하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, T 세포 집단이, 약 0.1ℓ의 용적 내지 약 200 ℓ의 용적을 갖는 배양 컨테이너로 접종되는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 배양 컨테이너가 하나 이상의 입구 여과기 및 하나의 출구 여과기를 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, T 세포 집단이 약 0.2 x 106세포/ml 내지 약 5 x 106세포/ml의 초기 농도로 접종되는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 증식이 폐쇄된 시스템에서 일어나는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 폐쇄된 시스템이 하나 이상의 입구 여과기, 하나의 출구 여과기 및 샘플 채취 포트를 포함하는 컨테이너를 포함하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 배양 배지가 폐쇄된 시스템을 통해 관류되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 관류가 약 0.5ml/분 내지 약 3.0ml/분의 속도로 약 4일째에 개시되는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 관류가 약 0.5ml/분 내지 약 3.0ml/분의 속도로 약 6일째에 개시되는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 관류가 약 0.5ml/분 내지 약 3.0ml/분의 속도로 약 8일째에 개시되는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 배지가 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 및 X-Vivo 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  36. 제31항에 있어서, 배양 배지가 사이토킨 또는 비타민을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 사이토킨이 IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGFβ 및 TNF-α로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  38. 제31항에 있어서, 배양 배지가 계면활성제를 포함하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 배양 배지가 항체를 포함하는 방법.
  40. 제31항에 있어서, 배양 배지가 플라스마네이트를 포함하는 방법.
  41. 제31항에 있어서, 배양 배지가 환원제를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 환원제가 N-아세틸-시스테인을 포함하는 방법.
  43. 제41항에 있어서, 환원제가 2-머캅토에탄올을 포함하는 방법.
  44. 제29항에 있어서, 폐쇄된 시스템이 진탕할 수 있는 플랫폼상에 위치하는 생물반응기 배양 컨테이너를 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 진탕 플랫폼의 속도 및 각도가 가변성인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 플랫폼의 진탕이 분당 약 5 내지 10회 진탕으로 약 3일째에 개시되는 방법.
  47. 제45항에 있어서, 플랫폼의 진탕이 분당 약 11 내지 15회 진탕으로 약 3일째에 개시되는 방법.
  48. 제45항에 있어서, 플랫폼이 가변 가열 장치를 추가로 포함하는 방법.
  49. 제45항에 있어서, 플랫폼이 자석을 추가로 포함하는 방법.
  50. 제45항에 있어서, 폐쇄된 시스템이 가스 다기관을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제45항에 있어서, 폐쇄된 시스템이 주사기 펌프를 추가로 포함하여 폐쇄된 시스템 내외부로의 멸균 이동을 조절하는 방법.
  52. 제1항에 있어서, 표면이, T 세포의 제1 T 세포 표면 잔기를 연결하는 제1 제제와 부착되어 있고 동일한 표면 또는 제2 표면이 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제와 부착되어 있어, 제1 및 제2 제제에 의한 연결이 당해 T 세포의 증식을유도하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 동일한 표면 또는 제3 표면이 T 세포의 제3 잔기를 연결하는 제3 제제와 부착되어 있고 제1, 제2 및 제3 제제에 의한 연결이 당해 T 세포의 증식을 유도하는 방법.
  54. 제52항에 있어서, 하나 이상의 제제가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  55. 제52항에 있어서, 제1 제제가 항체 또는 이의 단편이고 제2 제제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  56. 제52항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 상이한 항체인 방법.
  57. 제52항에 있어서, 제1 제제가 항 CD3 항체, 항 CD2 항체, 또는 항 CD3 또는 항 CD2 항체의 항체 단편인 방법.
  58. 제52항에 있어서, 제2 제제가 항 CD28 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  59. 제52항에 있어서, 제1 제제가 항 CD3 항체이고 제2 제제가 항 CD28 항체인 방법.
  60. 제59항에 있엇서, 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체가 약 1:1 내지 약 1:100의 비율로 존재하는 방법.
  61. 제52항에 있어서, 제1 제제가 항 CD3 항체이고 제2 제제가 CD28에 대한 리간드인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 리간드가 CD28에 대한 천연 리간드인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 천연 리간드가 B7인 방법.
  64. 제53항에 있어서, 하나 이상의 제제가 항체 또는 항체 단편인 방법.
  65. 제53항에 있어서, 제1 제제가 항체 또는 이의 단편이고 제2 제제가 항체 또는 이의 단편인 방법.
  66. 제53항에 있어서, 제1 및 제2 제제가 상이한 항체인 방법.
  67. 제53항에 있어서, 제1 제제가 항 CD3 항체, 항 CD2 항체, 또는 항 CD3 또는 항 CD2 항체의 항체 단편인 방법.
  68. 제53항에 있어서, 제2 제제가 항 CD28 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  69. 제53항에 있어서, 제1 제제가 항 CD3 항체이고 제2 제제가 항 CD28 항체인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 제3 제제가 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 제3 제제가 항 4-1BB 항체 또는 이의 항체 단편인 방법.
  72. 제1항의 방법에 따라 제조된 T 세포 집단.
  73. a. 하나 이상의 출구 여과기 및 하나의 입구 여과기를 포함하는 폐쇄된 배양 컨테이너를 포함하고,
    b. 상기 폐쇄된 배양 컨테이너는 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 밀도로 증식된 T 세포를 포함하는 배양 배지 용적의 내부를 갖는 장치.
  74. 제73항에 있어서, 증식된 T 세포의 밀도가 10 x 106세포/ml인 장치.
  75. 제73항에 있어서, 증식된 T 세포의 밀도가 20 x 106세포/ml인 장치.
  76. 제73항에 있어서, 증식된 T 세포의 밀도가 30 x 106세포/ml인 장치.
  77. 제73항에 있어서, 증식된 T 세포의 밀도가 40 x 106세포/ml인 장치.
  78. 제73항에 있어서, 증식된 T 세포의 밀도가 50 x 106세포/ml인 장치.
  79. 제73항에 있어서, 배지가, T 세포의 제1 세포 표면 잔기를 연결하는 제1 제제가 부착되어 있는 표면 및 당해 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제가 부착되어 있는 동일한 표면 또는 제2 표면을 추가로 포함하는 장치.
  80. 단일 개체로부터 총 100 x 109의 활성화되고 증식된 T 세포를 포함하는 조성물.
  81. a. 세포 집단을 제공하는 단계 및
    b. 적어도 일부의 세포 표면 잔기를 연결하고 당해 세포를 자극하는 하나 이상의 제제가 부착된 표면과 당해 세포 집단을 접촉시켜 당해 세포를 약 2주 미만에약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식시키는 단계를 포함하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 세포 집단을 증식시키는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 B 세포를 포함하는 방법.
  83. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 NK 세포를 포함하는 방법.
  84. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 수상세포를 포함하는 방법.
  85. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 줄기 세포를 포함하는 방법.
  86. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 간 세포를 포함하는 방법.
  87. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 폐 세포를 포함하는 방법.
  88. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 뉴런을 포함하는 방법.
  89. 제81항에 있어서, 적어도 일부의 세포 집단이 중간엽 세포를 포함하는 방법.
  90. a. 적어도 일부가 T 세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계,
    b. T 세포의 제1 세포 표면 잔기를 연결하는 제1 제제가 부착된 표면 및 T 세포의 제2 잔기를 연결하는 제2 제제가 부착된 동일한 표면 또는 제2 표면과 세포 집단을 접촉시켜 제1 및 제2 제제에 의한 연결에 의해 T 세포의 증식을 유도하는 단계,
    c. 약 0 내지 5일의 기간동안 표면과 접촉시킨 후, 하나 이상의 입구 여과기 및 하나의 출구 여과기를 포함하는 1회용 생물반응기 백을 포함하는 폐쇄된 시스템내에 약 0.2 x 106내지 5.0 x 106의 세포/ml의 농도로 세포 집단을 접종시키는 단계,
    d. 분당 약 1ml로 폐쇄된 시스템을 통해 배지를 관류시키는 단계 및
    e. 분당 약 5 내지 15회 진탕으로, 진탕 플랫폼상의 당해 생물반응기 백을 진탕시키는 단계를 포함하며, T 세포를 약 2주 미만에 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 농도로 증식시킴을 특징으로 하는, 세포 표면 잔기 연결에 의해 T 세포 집단을 증식시키는 방법.
  91. 증식 단계에 있으며 약 6 x 106세포/ml 내지 약 90 x 106세포/ml의 농도로 존재하는 T 세포 집단.
  92. 제91항에 있어서, 배양한지 2주 미만에 총 세포수 약 100 x 109내지 약 500 x 109에 도달하는 T 세포 집단.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200139774A (ko) * 2018-04-04 2020-12-14 사우스웨스트 리서치 인스티튜트 면역요법을 위한 t 세포의 활성화 및 증폭용 3차원 생물반응기
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7541184B2 (en) * 2000-02-24 2009-06-02 Invitrogen Corporation Activation and expansion of cells
US20030235908A1 (en) * 2000-02-24 2003-12-25 Xcyte Therapies, Inc. Activation and expansion of cells
EP2034009B1 (en) * 2002-02-08 2014-01-15 Life Technologies Corporation Compositions and methods for restoring immune responsiveness in patients with immunological defects basing on cd3/cd28 costimulation
US20050084967A1 (en) * 2002-06-28 2005-04-21 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
US20040175373A1 (en) * 2002-06-28 2004-09-09 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for eliminating undesired subpopulations of T cells in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
EP1539929B1 (en) * 2002-06-28 2013-04-10 Life Technologies Corporation Methods for restoring immune repertoire in patients with immunological defects related to autoimmunity and organ or hematopoietic stem cell transplantation
US7651855B2 (en) * 2003-04-17 2010-01-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Regulatory T cells and their use in immunotherapy and suppression of autoimmune responses
JP2006524991A (ja) * 2003-05-08 2006-11-09 エクサイト セラピーズ インコーポレーティッド 抗原特異的ｔ細胞の作製および単離の方法
US7402431B2 (en) * 2004-03-01 2008-07-22 Immunovative Therapies, Ltd. T-cell therapy formulation
US7435592B2 (en) 2003-05-13 2008-10-14 Immunovative Therapies, Ltd. Compositions for allogeneic cell therapy
JP2006527642A (ja) * 2003-06-17 2006-12-07 セントカー・インコーポレーテツド バイオリアクターの組換えタンパク質の濾過のための方法及び装置
WO2005045009A1 (en) * 2003-07-23 2005-05-19 President And Fellows Of Harvard College Methods for isolating t cells and uses thereof
CA2539716A1 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods to accelerate hematologic recovery
CN1953767B (zh) * 2004-01-08 2011-03-16 加利福尼亚大学董事会 调节t细胞抑制自身免疫
US7875448B2 (en) 2004-01-12 2011-01-25 Single Use Brx, Llc Bioreactor systems and disposable bioreactor
US7592431B2 (en) 2004-02-26 2009-09-22 Immunovative Therapies, Ltd. Biodegradable T-cell Activation device
SI2573166T1 (sl) 2004-02-26 2016-09-30 Immunovative Therapies, Ltd. Metode za pripravo T-celic za celično terapijo
JP5144250B2 (ja) * 2004-03-01 2013-02-13 イミュノバティブ セラピーズ， リミテッド 細胞治療処方方法および組成物
KR100735081B1 (ko) * 2005-04-21 2007-07-06 고려대학교 산학협력단 Ｃｄ4 ｔ 세포 활성화 방법
KR100735083B1 (ko) * 2005-04-21 2007-07-06 고려대학교 산학협력단 Ｃｄ8 ｔ 세포 활성화 방법
US8603805B2 (en) 2005-04-22 2013-12-10 Hyclone Laboratories, Inc. Gas spargers and related container systems
US9109193B2 (en) 2007-07-30 2015-08-18 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Continuous perfusion bioreactor system
US20140161782A1 (en) * 2008-06-09 2014-06-12 Targazyme, Inc. Augmentation of cell therapy efficacy including treatment with alpha 1-3 fucoslytransferase
WO2010062742A2 (en) * 2008-11-03 2010-06-03 The Johns Hopkins University Methods for freparation and use of marrow infiltrating lymphocytes (mils)
WO2010099205A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for treating progressive multifocal leukoencephalopathy (pml)
EP2411507B1 (en) * 2009-03-26 2019-09-25 CellProtect Nordic Pharmaceuticals AB Expansion of nk cells
SG194753A1 (en) 2011-05-03 2013-12-30 Immunovative Therapies Ltd Induction of il-12 using immunotherapy
HUE034995T2 (en) * 2011-05-03 2018-05-02 Immunovative Therapies Ltd A method for treating biological agents comprising living cells
US9376655B2 (en) 2011-09-29 2016-06-28 Life Technologies Corporation Filter systems for separating microcarriers from cell culture solutions
CN106635740B (zh) 2011-09-30 2019-03-15 生命科技股份有限公司 具有膜喷洒器的容器
CN104245924B (zh) * 2012-03-06 2020-05-01 塞莱克特生物疗法有限公司 用于选择抗细胞凋亡信号传导细胞的装置和方法及其用途
CN102732480A (zh) * 2012-06-11 2012-10-17 中山大学 N-乙酰半胱氨酸对中央记忆性t细胞的绝对数量在体外扩增上的应用
EP4119662A1 (en) 2013-05-10 2023-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Protein modification of living cells using sortase
CA2952241A1 (en) 2014-06-18 2015-12-23 Medimmune, Llc Cell culture methods and media comprising n-acetylcysteine
US9079690B1 (en) 2014-06-26 2015-07-14 Advanced Scientifics, Inc. Freezer bag, storage system, and method of freezing
CN107532149A (zh) * 2015-02-26 2018-01-02 生物磁溶液有限公司 通过各成分基本上同时孵育和通用载体以分离细胞
GB201509202D0 (en) 2015-05-28 2015-07-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Semi-static cell culture
US9920292B2 (en) 2015-08-31 2018-03-20 General Electric Company System and method for initiating a cell culture
BR112018067522A2 (pt) 2016-03-01 2019-02-05 Univ Of Rijeka Faculty Of Medicine anticorpos específicos para receptor de poliovírus humano (pvr)
US10294454B2 (en) 2016-08-24 2019-05-21 General Electric Company Methods and kits for cell activation
CN107151654B (zh) * 2016-10-11 2020-05-05 深圳宾德生物技术有限公司 一种人源t淋巴细胞的培养基及其制备方法和应用
JP2020524480A (ja) * 2016-11-03 2020-08-20 セル マイクロシステムズ インクＣｅｌｌ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． 特定の数の細胞の自動収集
WO2018102566A1 (en) 2016-12-01 2018-06-07 Life Technologies Corporation Microcarrier filter bag assemblies and methods of use
US11001795B2 (en) * 2016-12-02 2021-05-11 EMULATE, Inc. In vitro gastrointestinal model comprising lamina propria-derived cells
CN107099603A (zh) * 2017-05-31 2017-08-29 成都克里斯博生物科技有限公司 肿瘤免疫t细胞检测试剂盒和检测方法
SG11202102986XA (en) 2018-09-24 2021-04-29 Southwest Res Inst Three-dimensional bioreactors
WO2020191084A1 (en) * 2019-03-18 2020-09-24 The Regents Of The University Of California Augmentation of t-cell activation by oscillatory forces and engineered antigen-presenting cells
WO2021062267A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Nantbio, Inc. Primary t-cell expansion
CN112574952A (zh) * 2019-09-30 2021-03-30 英基生物医药(香港)有限公司 一种工程化人体免疫细胞、其制备方法及应用
CN110643574A (zh) * 2019-10-30 2020-01-03 西南医科大学 用于肿瘤浸润性淋巴细胞快速培养的饲养细胞的制备方法
CN111154648B (zh) * 2019-12-27 2022-10-25 新乡医学院三全学院 一种干细胞源性外泌体培养装置
CN111534489B (zh) * 2020-04-29 2022-07-12 清华大学 一种基于3d打印的t淋巴细胞扩增方法
CN111849919A (zh) * 2020-07-24 2020-10-30 英基生物医药(香港)有限公司 一种具有抗病毒活性的工程化免疫细胞及其构建方法和应用

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5081029A (en) * 1985-09-25 1992-01-14 Oncogen Methods of adoptive immunotherapy for treatment of aids
AU7873187A (en) * 1986-08-08 1988-02-24 University Of Minnesota Method of culturing leukocytes
US6010902A (en) * 1988-04-04 2000-01-04 Bristol-Meyers Squibb Company Antibody heteroconjugates and bispecific antibodies for use in regulation of lymphocyte activity
US6352694B1 (en) * 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5858358A (en) * 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5763266A (en) * 1989-06-15 1998-06-09 The Regents Of The University Of Michigan Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells
DE3923279A1 (de) * 1989-07-14 1990-01-18 Will W Prof Dr Minuth Minusheets ist ein neues produkt, um zellen in beliebigen behaeltnissen in hochdifferenzierter form auf einer moeglichst natuerlichen unterlage zu kultivieren
DE69032484T4 (de) * 1989-10-27 1999-09-16 Arch Dev Corp Zusammensetzungen und deren verwendung zur förderung der immunopotentiation
US5470730A (en) * 1990-09-28 1995-11-28 Immunex Method for producing TH -independent cytotoxic T lymphocytes
US6197298B1 (en) * 1991-04-19 2001-03-06 Tanox, Inc. Modified binding molecules specific for T lymphocytes and their use as in vivo immune modulators in animals
US6129916A (en) * 1991-04-19 2000-10-10 Tanox, Inc. Method of Increasing activation on proliferation of T cells using antibody-microbead conjugates
GB9120508D0 (en) * 1991-09-26 1991-11-06 Nycomed As Diagnostic agents
WO1994007138A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-31 Fodstad Oystein Detection of specific target cells in specialized or mixed cell population and solutions containing mixed cell populations
US5837477A (en) * 1993-01-15 1998-11-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services T cell receptor ligands and methods of using same
WO1994026290A1 (en) * 1993-05-07 1994-11-24 Immunex Corporation Cytokine designated 4-1bb ligand and human receptor that binds thereto
US7211259B1 (en) * 1993-05-07 2007-05-01 Immunex Corporation 4-1BB polypeptides and DNA encoding 4-1BB polypeptides
US5942607A (en) * 1993-07-26 1999-08-24 Dana-Farber Cancer Institute B7-2: a CTLA4/CD28 ligand
US5672505A (en) * 1993-09-27 1997-09-30 Becton, Dickinson And Company Insert for a issue culture vessel
AU1333195A (en) 1994-06-03 1996-01-04 Dana-Farber Cancer Institute Methods for selectively stimulating proliferation of t cells
FR2729570A1 (fr) * 1995-01-24 1996-07-26 Idm Immuno Designed Molecules Procede de preparation de macrophages actives, trousses et compositions pour la mise en oeuvre de ce procede
US5985653A (en) * 1995-06-07 1999-11-16 Aastrom Biosciences, Inc. Incubator apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US6096532A (en) * 1995-06-07 2000-08-01 Aastrom Biosciences, Inc. Processor apparatus for use in a system for maintaining and growing biological cells
US20020182730A1 (en) * 1995-07-26 2002-12-05 Micheal L. Gruenberg Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
DE69723230T2 (de) * 1996-01-17 2004-05-27 Imperial College Innovations Ltd. Immunotherapie mit verwendung von zytotoxischen t lymphozyten (ctl)
ATE476496T1 (de) * 1996-03-04 2010-08-15 Calyx Bio Ventures Inc Modifizierte schnellvermehrungsmethode ('modified-rem') zur in vitro vermehrung von t-lymphozyten
US5972721A (en) * 1996-03-14 1999-10-26 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force Immunomagnetic assay system for clinical diagnosis and other purposes
US5962319A (en) * 1997-05-19 1999-10-05 Bml, Inc. Human-Th1-specific protein, gene encoding the protein, transformants, recombinant vectors, and antibodies related to the gene
US20010031253A1 (en) * 1996-07-24 2001-10-18 Gruenberg Micheal L. Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
US5766944A (en) * 1996-12-31 1998-06-16 Ruiz; Margaret Eileen T cell differentiation of CD34+ stem cells in cultured thymic epithelial fragments
AU738538B2 (en) * 1997-01-31 2001-09-20 Hemosol Inc. Method for the production of selected lymphocytes
JP2004500095A (ja) 2000-02-24 2004-01-08 エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド 細胞の同時の刺激および濃縮
US20020081635A1 (en) * 2000-05-11 2002-06-27 Thomas Terry E. Novel antibody compositions for preparing enriched T cell preparations
US6544788B2 (en) * 2001-02-15 2003-04-08 Vijay Singh Disposable perfusion bioreactor for cell culture
US20030134341A1 (en) * 2001-09-19 2003-07-17 Medcell Biologics, Llc. Th1 cell adoptive immunotherapy
US20030194395A1 (en) * 2001-09-17 2003-10-16 Gruenberg Micheal L. Th1 cell adoptive immunotherapy
WO2003024312A2 (en) * 2001-09-17 2003-03-27 Valeocyte Therapies Llc Cell therapy system
US20030134415A1 (en) * 2001-09-19 2003-07-17 Gruenberg Micheal L. Th1 cell adoptive immunotherapy
US20030175272A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-18 Medcell Biologics, Inc. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US20030170238A1 (en) * 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
KR20200139774A (ko) * 2018-04-04 2020-12-14 사우스웨스트 리서치 인스티튜트 면역요법을 위한 t 세포의 활성화 및 증폭용 3차원 생물반응기

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